JP2024506608A - Ｏｍｎｉ－１０３ ｃｒｉｓｐｒヌクレアーゼ - Google Patents

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Abstract

本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、天然に存在しない組成物を提供する。

Description

本出願は、2021年12月6日に出願された米国仮出願第63/286,855号、2021年6月24日に出願された米国仮出願第63/214,506号、及び2021年2月8日に出願された米国仮出願第63/147,166号の利益を主張し、これらの各々の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願全体を通して、括弧内で参照されているものを含む様々な刊行物が参照される。本出願で言及される全ての刊行物のそれらの全体における開示は、本発明が属する技術分野及び本発明とともに用いることができる技術分野の特色の追加の説明を提供するために、参照により本出願に組み込まれる。
配列表の参照
本出願は、８６キロバイトのサイズであり、本出願の一部として2022年2月7日に出願されたテキストファイルに含まれる、MS-Windows（登録商標）とのオペレーティングシステムの互換性を有する、ＩＢＭ－ＰＣマシンフォーマットで2022年2月6日に作成された、「220207_91677-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」という名称のファイルに存在するヌクレオチド配列を参照により組み込む。
技術分野
本発明は、とりわけ、ゲノム編集のための組成物及び方法を対象とする。
細菌及び古細菌適応免疫のクラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、タンパク質組成及びゲノム遺伝子座アーキテクチャの極めて高い多様性を示す。ＣＲＩＳＰＲシステムは、研究及びゲノム操作のための重要なツールとなっている。それにもかかわらず、ＣＲＩＳＰＲシステムの多くの詳細は、決定されておらず、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの適用可能性は、配列特異性要件、発現、又は送達における困難によって限定され得る。異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、サイズ、ＰＡＭ部位、オンターゲット活性、特異性、切断パターン（例えば、ブラントエンド、付着末端）、及び切断に続くインデル形成の卓越したパターンなどの多様な特徴を有する。異なる特徴の組は、異なる用途に有用であり得る。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＰＡＭ部位の限定に起因して他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが標的化することができない特定のゲノム遺伝子座を標的化することが可能であり得る。加えて、現在使用されているいくつかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、インビボでの適用可能性を限定し得る前免疫を呈する。Charlesworth et al., Nature Medicine (2019)及びWagner et al., Nature Medicine (2019)を参照されたい。したがって、新規のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの発見、操作、及び改善は、重要である。
本明細書で開示されるのは、ゲノム操作、エピゲノム操作、ゲノム標的化、細胞のゲノム編集、及び／又はインビトロ診断のために利用することができる組成物及び方法である。
開示の組成物は、ゲノムＤＮＡ配列を修飾するために利用することができる。本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡは、目的の１つの細胞又は複数の細胞に存在する線状及び／若しくは染色体ＤＮＡ、並びに／又はプラスミド、又は他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムＤＮＡ配列内の所定の標的部位で二重鎖分解（ＤＳＢ）を生じ、ゲノム内の標的部位におけるＤＮＡ配列の変異、挿入、及び／又は欠失を生じる。
したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。
ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
本発明の実施形態は、表１に提供される「ＯＭＮＩ－１０３」ヌクレアーゼとして指定されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを提供する。
本発明は、哺乳動物細胞のゲノムにおける標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、細胞に、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は配列が配列番号２～３の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む組成物と、（ｉｉ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を導入することを含む、方法を提供する。
本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）直接リピート配列に連結されたガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子であって、ガイド配列が、標的配列とハイブリダイゼーションすることが可能である、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連系を含み、
１つ以上のＲＮＡ分子が、標的配列にハイブリダイズし、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の相補的配列に隣接しており、１つ以上のＲＮＡ分子が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、組成物を提供する。
本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、
ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合することが可能なヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列、及び
ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的な配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化して、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能な複合体を形成することが可能である、組成物を提供する。
ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ－ＲＮＡ複合体
本発明はまた、天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、ＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含み、ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の存在下で、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に標的化し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、ＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分又は第２のＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分によってコードされる、組成物を提供する。
本発明はまた、天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ足場部分を含み、ＲＮＡ足場部分が、
ｃｒＲＮＡリピート配列部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有し、
ＲＮＡ足場部分が、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ＲＮＡ分子のガイド配列部分と相補性を有するＤＮＡ標的部位に標的化する、組成物を提供する。
本明細書では、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに特異的に結合し、これを活性化して、ＲＮＡ分子の、ＲＮＡスペーサー部分とも称される、ガイド配列部分に基づいてＤＮＡ標的部位を標的化することができる足場部分を含む、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び天然に存在しないＲＮＡ分子を使用する、細胞のゲノム操作、エピゲノム操作、ゲノム標的化、ゲノム編集、及び／又はインビトロ診断に利用され得る組成物及び方法が開示される。
開示の組成物は、ゲノムＤＮＡ配列を修飾するために利用することができる。本明細書で使用される場合、ゲノムＤＮＡは、目的の１つの細胞又は複数の細胞に存在する線状及び／若しくは染色体ＤＮＡ、並びに／又はプラスミド、又は他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムＤＮＡ配列内の所定の標的部位で二重鎖分解（ＤＳＢ）を生じ、ゲノム内の標的部位におけるＤＮＡ配列の変異、挿入、及び／又は欠失を生じる。
図１は、ｓｇＲＮＡ１２、ＯＭＮＩ－１０３に適合する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ）の予測される二次構造である。ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分が示された、ＯＭＮＩ－１０３ Ｖ１のｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の表現（表２を参照されたい）。 ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ部分が示された、ＯＭＮＩ－１０３ Ｖ２のｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の表現（表２を参照されたい）。 図２は、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－１０３活性及びスペーサー最適化に関する。ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼを過剰発現させ、精製した。精製したタンパク質を合成ｓｇＲＮＡと複合体化させて、ＲＮＰを形成した。図２Ａは、インビトロアッセイについて、スペーサー長２０～２５ｂｐｓ（表６に列挙される）を有する低減する量のＲＮＰ（４、２、１、及び０．５ｐｍｏｌ）を、４０ｎｇのＰＤＣＤ１ ＤＮＡ標的テンプレートとインキュベートした。線状テンプレートを切断する能力によって活性を検証した。 インビボアッセイ。図２Ｂは、ＰＤＣＤ１ Ｓ４０のスペーサー長（２０～２５ヌクレオチド）を有するＲＮＰをＵ２ＯＳ細胞株にエレクトロポレートし、編集レベル（インデル）をＮＧＳによって測定した。 インビボアッセイ。図２Ｃは、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－１０３についての活性アッセイであり、ＰＤＣＤ１Ｓ４０、ＴＲＡＣＳ３５、ＴＲＡＣＳ３３、及びＢ２Ｍ Ｓ１２（２２ｂｐスペーサー長、表６）を有するＲＮＰをＵ２ＯＳ細胞株にエレクトロポレートし、編集レベル（インデル）を次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって測定した。 図３は、不偏生化学アッセイ（guide-seq）によるＯＭＮＩ－１０３オフターゲット分析である。ＰＤＣＤ１ Ｓ４０及びＴＲＡＣ Ｓ３５ガイド分子（表６）を有するＲＮＰをｄｓＯＤＮと混合し、Ｕ２ＯＳ細胞株にエレクトロポレートした。図３Ａは、編集レベル（インデル）及びｄｓＯＤＮ統合をＮＧＳによって測定した。 図３Ｂは、ガイド配列分析は、ＰＤＣＤ１ Ｓ４０部位（配列番号１３３）又はＴＲＡＣ Ｓ３５部位（配列番号１３４）でいかなるオフターゲットも示さなかった。 図４は、ＯＭＮＩヌクレアーゼについてのインビトロＴＸＴＬ ＰＡＭ枯渇結果である。ＰＡＭロゴは、枯渇部位の比の概略図である（上パネル）。ＴＸＴＬ反応のＮＧＳ後、ＰＡＭプラスミドライブラリからの特定のＰＡＭ配列（下パネル、左）の枯渇比（下パネル、右）を計算した。各ＯＭＮＩの計算は、ＰＡＭライブラリの８ｂｐ配列に沿った４Ｎウィンドウに基づく。試験されたＯＭＮＩの必要なＰＡＭ及び反応条件下でのヌクレアーゼ活性のレベルは、枯渇比から推定される。インビトロＰＡＭ枯渇結果：図４Ａは、ｓｇＲＮＡ １２を有するＯＭＮＩ－１０３。 図４Ｂは、ｓｇＲＮＡ ３２を有するＯＭＮＩ－１０３。 図５は、ＯＭＮＩ－１０３ ｓｇＲＮＡバージョンはＨｅＬａ細胞における編集を示す。ＯＭＮＩ－１０３についてｓｇＲＮＡを短縮するために、足場の４つの異なるバージョンを試験した。これらのバージョンには、上部ステム及び／又は末端ヘアピンでの欠失が含まれた。図５Ａは、ＯＭＮＩ－１０３のために設計された異なるｓｇＲＮＡの多重配列アラインメントである。具体的には、ＯＭＮＩ－１０３ ｓｇＲＮＡ ｖ２足場（１０７ヌクレオチド、配列番号１６として列挙されるＲＮＡ）と、より短いｓｇＲＮＡ足場バージョンＯＭＮＩ－１０３．１（１０１ヌクレオチド、配列番号３３として列挙されるＲＮＡ）、ＯＭＮＩ－１０３．２（８５ヌクレオチド、配列番号３４として列挙されるＲＮＡ）、ＯＭＮＩ－１０３．３（７９ヌクレオチド、配列番号３５として列挙されるＲＮＡ）、及びＯＭＮＩ－１０３．４（９５ヌクレオチド、配列番号３６として列挙されるＲＮＡ）とのアラインメントである。 図５Ｂは、より短いバージョンを作製するテンプレートとして使用された、ｓｇＲＮＡ １０３．ｖ２の予測される構造（より短いバージョンを作製するために使用された欠失が示される）である。 図５Ｃは、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって決定される異なる足場を有するＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの編集活性である。２つの部位、ＴＲＡＣ Ｓ９１及びＰＤＣＤ Ｓ４０を試験した。トランスフェクション効率は、プラスミドがレポーター蛍光タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ）を発現するため、ＦＡＣＳによって決定した。 図６は、表３に列挙されるｓｇＲＮＡの予測される二次構造である。図６Ａ：足場Ｖ２。 図６Ｂ：足場Ｖ２．１。 図６Ｃ：足場Ｖ２．２。 図６Ｄ：足場Ｖ２．３。 図６Ｅ：足場Ｖ２．４。 図６Ｆ：足場Ｖ２．５。 異なるｓｇＲＮＡ足場を有するＨｅＬａ細胞におけるＯＭＮＩ－１０３編集活性である（表３）。Ｈｅｌａ細胞を、ＴＲＡＣ－Ｓ９１又はＰＤＣＤ－Ｓ４０を標的化するＯＭＮＩ－１０３及びｓｇＲＮＡプラスミドでトランスフェクトした。編集活性を次世代シーケンシング結果（棒）に基づいて計算し、トランスフェクション効率をｍＣｈｅｒｒｙ発現のＦＡＣＳ分析に基づいて計算した。３つの技術的複製の平均及び標準偏差が示される。 Ｕ２ＯＳにおける活性である。Ｕ２ＯＳ細胞を、ＴＲＡＣ Ｓ３５及びＢ２Ｍ Ｓ１２を標的化するＯＭＮＩ－１０３及びｓｇＲＮＡ（ＲＮＰ）でエレクトロポレートした。編集活性を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）結果に基づいて計算した。３つの技術的複製の平均及び標準偏差が示される。 初代Ｔ細胞における活性である。初代Ｔ細胞を、ＰＢＭＣから単離し、製造業者のプロトコル（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－０９６－５３５、＃１３０－０９１－４４１）に従って活性化した。活性化Ｔ細胞を、ＴＲＡＣ－ｓ３５及びＢ２Ｍ－ｓ１２を標的化するＯＭＮＩ－１０３及びｓｇＲＮＡ（ＲＮＰ）でエレクトロポレートした。８日後、細胞を、ＴＣＲ及びＢ２Ｍ発現レベルについてフローサイトメトリーによって測定した。分析のために、生細胞及びＣＤ３陽性細胞のみを計数した。提示された結果は、代表的であり、全てが同様の結果を示した３つのＴ細胞ドナーのうちの１つである。 Ｔ細胞活性化アッセイである。切断活性アッセイにおいて使用されるドナー試料細胞は、ビーズで７２時間活性化し、ＦＡＣＳ（ＣＤ３＋ＣＤ２５＋細胞）によって測定されるように８５％の初代Ｔ細胞活性化率を示した。 ＲＮＡ足場の代表的な例である。例示的なＲＮＡ足場部分は、テトラループによってｔｒａｃｒＲＮＡ部分と連結されたｃｒＲＮＡ部分を含む。ｃｒＲＮＡ部分は、ｃｒＲＮＡリピート配列を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列及び追加のｔｒａｃｒＲＮＡ区画を含む。ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子が単一ガイドＲＮＡ分子として機能するように、ｃｒＲＮＡリピート配列と連結されたガイド配列部分（すなわち、ＲＮＡスペーサー）を更に含み得る。
詳細な説明
発明のいくつかの態様によれば、開示の組成物は、クラスター化された規則的な間隔の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼ及び／又はそれをコードする配列を含む核酸分子を含む。
表１は、新規ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びヌクレアーゼをニッカーゼ又は触媒的に不活性なヌクレアーゼに変換する各ヌクレアーゼ内の１つ以上の位置での置換を列挙する。
表２は、各列挙されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと適合する、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列、並びにｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｓｇＲＮＡ配列の部分を提供する。したがって、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一部として表２に列挙されるＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し、標的化することができるｃｒＲＮＡ分子は、表２に列挙される任意のｃｒＲＮＡ配列を含み得る。同様に、ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体の一部として表２に列挙されるＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し、標的化することができるｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、表２に列挙される任意のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み得る。また、表２に列挙されるＯＭＮＩヌクレアーゼに結合し、標的化することができる単一ガイドＲＮＡ分子は、表２に列挙される任意の配列を含み得る。
例えば、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼのｃｒＲＮＡ分子（配列番号１）は、配列番号４～７及び１８～２１のうちのいずれか１つの配列を含み得、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼのｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、配列番号８～１４、１７、２２～２８、及び３２のうちのいずれか１つの配列を含み得、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼのｓｇＲＮＡ分子は、配列番号４～３６のうちのいずれか１つの配列を含み得る。各ＯＭＮＩヌクレアーゼについての他のｃｒＲＮＡ分子、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子、又はｓｇＲＮＡ分子は、同じ様式で表２に列挙される配列から誘導され得る。
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、天然に存在しない組成物を提供する。核酸分子は、例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、完全な触媒活性を有するか、ニッカーゼであるか、又は触媒的に不活性であり、ＤＮＡ相互作用タンパク質又は修飾タンパク質に融合される。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、塩基編集方法における使用のためにデアミナーゼタンパク質に融合され得る。別の例では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、プライム編集方法における使用のために逆転写酵素に融合され得る。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子のうちのいずれか１つをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、１つ以上のＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、一緒に天然に存在せず、１つ以上のＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように、かつ／又は複合体を標的部位に標的化するように構成されている。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、配列番号４～３６からなる群から選択される配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分と、配列番号４～７及び１８～２１からなる群から選択される配列と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号８～１４、１７、２２～２８、及び３２からなる群に示される配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分と、配列番号４～３６からなる群から選択される配列と、を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子は、ガイド配列部分と、少なくとも７９個のヌクレオチドの長さである足場部分と、を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置でのアミノ酸置換によって作製された不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置でのアミノ酸置換によって作製された不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列７においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置での置換によって作製された不活性化ＲｕｖＣドメイン及び不活性化ＨＮＨドメインを有する触媒的に不活性なヌクレアーゼである。
例えば、ニッカーゼは、ＯＭＮＩ－１０３のアミノ酸配列（配列番号１）の１２位のアスパラギン酸残基（Ｄ）を別のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）に置換することによって、そのＲｕｖＣドメインを不活性化することによって、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼについて生成され得る。表１の列５～７に示されるアミノ酸位置の各々について、アミノ酸位置の後にアスタリスクが続く場合を除き、任意の他のアミノ酸への置換が許容され、これはアスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ又はグルタミン酸（Ｅ）からアスパラギン酸（Ｄ）へ以外の任意の置換が不活性化をもたらすことを示す。例えば、ニッカーゼは、ＯＭＮＩ－１０３のアミノ酸配列（配列番号１）の８５６位のアスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸残基（Ｅ）以外のアミノ酸、例えば、アラニン（Ａ）に置換することによって、そのＨＮＨドメインを不活性化することによって、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼについて生成され得る。他のニッカーゼ又は触媒的に不活性のヌクレアーゼは、表１における同じ表記を使用して生成することができる。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼである。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｄ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位のうちのいずれか１つでのアミノ酸置換、及びＤ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位のうちのいずれか１つでのアミノ酸置換によって作製された触媒的に不活性なヌクレアーゼであり、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２又は列３においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を利用する。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位でヌクレオチド配列を修飾するための方法であって、細胞に、以上に記載される組成物のうちのいずれか１つを導入することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表３の列２又は列３におけるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するＤＮＡ鎖におけるＤＮＡ切断をもたらし、ＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖におけるＤＮＡ切断をもたらす。例えば、適切な標的化ｓｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を有するＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、ＮＮＲＲＨＹ、ＮＮＲＡＣＴ、又はＮＮＲＶＣＴ配列に隣接する鎖において、及びＮＮＲＲＨＹ、ＮＮＲＡＣＴ、又はＮＮＲＶＣＴ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖においてＤＮＡ切断を形成することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ鎖は、細胞の核内にある。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列５においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置でのアミノ酸置換によって作製された不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖におけるＤＮＡ切断をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列６においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置でのアミノ酸置換によって作製された不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖におけるＤＮＡ切断をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１の列７においてＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて提供される位置での置換によって作製された不活性化ＲｕｖＣドメイン及び不活性化ＨＮＨドメインを有する触媒的に不活性なヌクレアーゼであり、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖におけるＤＮＡ切断をもたらす。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、細胞に、本明細書に提供される組成物のうちのいずれか１つを導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＮＮＲＲＨＹ、ＮＮＲＡＣＴ、又はＮＮＲＶＣＴプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらし、かつ／又はＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらす。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｄ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、ＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらし、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である。
いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞又は原核細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、又は８２％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２～３からなる群から選択される核酸配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、又は８２％の同一性を有する。
本発明はまた、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む天然に存在しない組成物を提供し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１のドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、
ａ）ドメインＡは、配列番号１のアミノ酸１～４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｂ）ドメインＢは、配列番号１のアミノ酸４６～８３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｃ）ドメインＣは、配列番号１のアミノ酸８４～１５８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｄ）ドメインＤは、配列番号１のアミノ酸１５９～３０２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｅ）ドメインＥは、配列番号１のアミノ酸３０３～５１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｆ）ドメインＦは、配列番号１のアミノ酸５１６～７２７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｇ）ドメインＧは、配列番号１のアミノ酸７２８～７７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｈ）ドメインＨは、配列番号１のアミノ酸７７９～９２３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｉ）ドメインＩは、配列番号１のアミノ酸９２４～１０６８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
ｊ）ドメインＪは、配列番号１のアミノ酸１０６９～１３４８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む。
発明のいくつかの態様によれば、開示の組成物は、ＤＮＡ構築物、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ若しくはバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むベクター系を含む。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、目的の細胞で操作可能であるプロモーターに操作可能に連結されている。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸配列は、特定の生物からの細胞で使用するためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、Ｅ．ｃｏｌｉにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、真核細胞にコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードする核酸配列は、哺乳動物細胞にコドン最適化されている。
いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結した異種プロモーターを含む、組換え核酸を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。
組成物の一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％、若しくは９７％の同一性を有するか、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列は、配列番号２及び３からなる群から選択されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％、８０％、８５、９０％、９５％、若しくは９７％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態によれば、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、操作された又は天然に存在しない組成物が提供される。各可能性は、別個の実施形態を表す。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作されているか、又は天然に存在しない。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、組換えであり得る。そのようなＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、複数の源からの遺伝子材料を結び付け、そうでなければ生物に見られないであろう配列を作製する、実験室方法（例えば、分子クローニング）を使用して生成される。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子（ｇＲＮＡ）と相互作用することが可能なＲＮＡ結合部分と、部位指向性酵素活性を呈する活性部分とを更に含む。
一実施形態では、組成物は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、ガイド配列部分、すなわち、標的領域における配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、一緒に天然に存在しない。
一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を更に含む。
本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）直接リピート配列に連結されたガイド配列部分を含む１つ以上のＲＮＡ分子であって、ガイド配列が、標的配列とハイブリダイゼーションすることが可能である、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ関連系を含み、
１つ以上のＲＮＡ分子が、標的配列にハイブリダイズし、標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接しており、１つ以上のＲＮＡ分子が、ＲＮＡガイドヌクレアーゼと複合体を形成する、組成物を提供する。
一実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子をコードする配列を含むＤＮＡポリヌクレオチドを更に含む。
一実施形態では、組成物は、相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートを更に含む。
一実施形態では、組成物は、細胞のゲノム内の標的領域を編集することが可能である。
いくつかの実施形態によれば、天然に存在しない組成物であって、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドであって、
ＲＮＡ結合部分、及び
部位特異的酵素活性を示す活性部分を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１と少なくとも１００％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％の同一性を有する、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドと、
（ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列、及び
ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部分と相互作用することが可能なタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとが、一緒に天然に存在しない、組成物が提供される。各可能性は、別個の実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列及びタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む単一ＲＮＡ分子が提供され、ＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、最大１０００塩基長、９００塩基長、８００塩基長、７００塩基長、６００塩基長、５００塩基長、４００塩基長、３００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、５０塩基長を有する。各可能性は、別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列を含む第１のＲＮＡ分子、及びタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子は、塩基対合によって相互作用するか、又は代替的に一緒に融合して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能する１つ以上のＲＮＡ分子を形成する。
本発明はまた、天然に存在しない組成物であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子と、
ｂ）１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドであって、
ｉ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用／結合することが可能なヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列、及び
ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的な配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列、のうちの少なくとも１つを含む、１つ以上のＲＮＡ分子、又は１つ以上のＲＮＡ分子をコードする１つ以上のＤＮＡポリヌクレオチドと、を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、１つ以上のＲＮＡ分子と複合体化して、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイゼーション可能な複合体を形成することが可能である、組成物を提供する。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び１つ以上のＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断をもたらすことが可能なＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと１つ以上のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つとは、一緒に天然に存在しない。
一実施形態では、
ａ）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＲＮＡ結合部分と、部位指向性酵素活性を呈する活性部分とを含み、
ｂ）ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、標的ＤＮＡ配列内の配列に相補的なヌクレオチド配列を含み、
ｃ）ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＲＮＡ結合部分と相互作用する配列を含む。
一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列及びＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、単一ガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）上にあり、ｓｇＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる。
一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列は、第１のＲＮＡ分子上にあり、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、第２のＲＮＡ分子上にあり、第１及び第２のＲＮＡ分子は、塩基対合によって相互作用するか、又は一緒に融合して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能するＲＮＡ複合体又はｓｇＲＮＡを形成する。
一実施形態では、ｓｇＲＮＡは、最大１０００塩基長、９００塩基長、８００塩基長、７００塩基長、６００塩基長、５００塩基長、４００塩基長、３００塩基長、２００塩基長、１００塩基長、５０塩基長を有する。
一実施形態では、組成物は、相同性指向修復（ＨＤＲ）のためのドナーテンプレートを更に含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然に存在しない。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作され、非天然又は合成アミノ酸を含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、操作され、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列、及び／又は親和性タグのうちの１つ以上を含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、真核細胞の核において検出可能な量でのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ複合体の蓄積を推進するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列を含む。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法であって、発明の組成物のうちのいずれかを細胞に導入することを含む、方法を提供する。
一実施形態では、細胞は、真核細胞である。
別の実施形態では、細胞は、原核細胞である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡ分子は、ＲＮＡヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド分子を含むＲＮＡ配列（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるヌクレオチド配列を含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、アミノ末端若しくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳを含むか、カルボキシ末端若しくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳを含むか、又はアミノ末端若しくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳとカルボキシ末端若しくはその付近に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のＮＬＳとの組み合わせを含む。一実施形態では、１～４個のＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと融合される。一実施形態では、ＮＬＳは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に位置する。
ＮＬＳをアミノ末端若しくはその付近、カルボキシ末端若しくはその付近、又は発現したタンパク質のＯＲＦ内で融合させる方法は、当該技術分野において周知である。例として、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ末端に融合させるためには、ＮＬＳ融合ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする核酸上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの開始コドンの直後にＮＬＳの核酸配列が配置される。逆に、ＮＬＳをＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのカルボキシ末端に融合させるためには、ＮＬＳの核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの最後のアミノ酸をコードするコドンの後、及び終止コドンの前に配置される。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＯＲＦに沿った任意の位置における、ＮＬＳ、細胞透過性ペプチド配列、及び／又は親和性タグの任意の組み合わせが、本発明では企図される。
本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸配列及び核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの連続アミノ酸配列又は核酸配列を中断するように挿入されたＮＬＳ及び／又はＴＡＧを含み得る。
一実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、タンデムリピートである。
一実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、ＮＬＳの最も近いアミノ酸が、ポリペプチド鎖に沿ってＮ末端又はＣ末端から約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個以上のアミノ酸内にあると、Ｎ末端又はＣ末端に近接しているとみなされる。
上述したように、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、核局在化配列（ＮＬＳ）、細胞透過性ペプチド配列、及び／又は親和性タグのうちの１つ以上を含むように操作され得る。
一実施形態では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含むヌクレオチド酸分子に操作可能に連結した異種プロモーターを含む組換え核酸分子を更に含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子は、天然に存在しないか、又は操作されている。
本発明はまた、発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのうちのいずれかをコードする配列を含む核酸分子を含むベクター系を含む、天然に存在しないか、又は操作された組成物を提供する。
本発明はまた、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾することを含む、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するための、発明の組成物のうちのいずれかの使用を提供する。
本発明は、哺乳動物細胞のゲノムにおける標的部位でヌクレオチド配列を修飾する方法であって、細胞に、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は配列が配列番号２～３の核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む組成物と、（ｉｉ）標的ＤＮＡにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドと、を導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法のいくつかのステップは、エクスビボで実施され、いくつかのステップは、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
一実施形態では、方法は、細胞に、（ｉｉｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子、又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子をコードするＤＮＡポリヌクレオチドを導入することを更に含む。
一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡリピート配列を含む。
一実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子に結合することができる。
一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、相互作用してＲＮＡ複合体を形成し、ＲＮＡ複合体は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成することができる。
一実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子及びヌクレアーゼ結合ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと活性複合体を形成するのに好適な単一ガイドＲＮＡ分子の形態で融合される。
一実施形態では、ガイド配列部分は、プロトスペーサー配列に相補的な配列を含む。
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子と複合体を形成し、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’又は５’である領域における二重鎖切断をもたらす。
本明細書に記載の方法のうちのいずれかの一実施形態では、方法は、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するためのものであり、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾することを含む。
一実施形態では、方法は、まず、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を選択し、対象から細胞を得ることを含む。
本発明はまた、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって得られる修飾された１つの細胞又は複数の細胞を提供する。一実施形態では、これらの修飾された１つの細胞又は複数の細胞は、子孫細胞を生じさせることが可能である。一実施形態では、これらの修飾された１つの細胞又は複数の細胞は、生着後に子孫細胞を生じさせることが可能である。
本発明はまた、これらの修飾された細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。提供されるのはまた、細胞を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、組成物を調製するインビトロ又はエクスビボ方法である。
本発明はまた、天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、ＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含み、ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の存在下で、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に標的化し、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、ＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分又は第２のＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分によってコードされる、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、最大１７個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１４～１７個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、配列番号１１４又は１１５と少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、配列番号１１４又は１１５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列は、配列番号１１５以外である。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含むＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を更に含む。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、ポリヌクレオチドリンカー部分によってｔｒａｃｒＲＮＡ部分と共有結合する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む第２のＲＮＡ分子を含む。
いくつかの実施形態では、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７～３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである。
本発明はまた、天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列部分を含み、ＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分の存在下で、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に標的化し、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分が、ＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子によってコードされる、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、８５個未満のヌクレオチドの長さ、好ましくは８４～８０、７９～７５、７４～７０、６９～６５、又は６４～６０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも３０～４０％、４１～５０％、５１～６０％、６１～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１５又は１６のｔｒａｃｒ部分以外である。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、最大１９個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１６～１９個のヌクレオチドの長さであるｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１１７以外の配列を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を更に含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ポリヌクレオチドリンカー部分によってｃｒＲＮＡリピート配列と共有結合する。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドリンカー部分は、４～１０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、ＧＡＡＡの配列を有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含む第２のＲＮＡ分子を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性である。
いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７～３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである。
本発明はまた、天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ足場部分を含み、ＲＮＡ足場部分が、
ｃｒＲＮＡリピート配列部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有し、
ＲＮＡ足場部分が、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、ＲＮＡ分子のガイド配列部分と相補性を有するＤＮＡ標的部位に標的化する、組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、１１０～１０５、１０４～１００、９９～９５、９４～９０、８９～８５、８４～８０、７９～７５、又は７４～７０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、１０７、１０１、９５、８５、又は７９個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つと少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、最大１７個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１４～１７個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、配列番号１１４又は１１５と少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列部分は、配列番号１１４又は１１５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡリピート配列は、配列番号２３以外である。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、８５個未満のヌクレオチドの長さ、好ましくは８４～８０、７９～７５、７４～７０、６９～６５、又は６４～６０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも３０～４０％、４１～５０％、５１～６０％、６１～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１５又は１６のｔｒａｃｒＲＮＡ部分以外である。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、ｃｒＲＮＡリピート配列部分とｔｒａｃｒＲＮＡ部分との間にリンカー部分を更に含み、その結果、ＲＮＡ足場は、
ｃｒＲＮＡリピート配列部分－リンカー部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含み、ｃｒＲＮＡリピート配列及びｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分は、リンカー部分によって共有結合する。
いくつかの実施形態では、リンカー部分は、４～１０個のヌクレオチドの長さであるポリヌクレオチドリンカーである。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドリンカーは、ＧＡＡＡの配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、最大１９個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１６～１９個のヌクレオチドの長さであるｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列は、配列番号１１７以外である。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート部分と結合した第１のヌクレオチドの区画を含み、第１のヌクレオチドの区画は、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、第１のヌクレオチドの区画と結合した第２のヌクレオチドの区画を含み、第２のヌクレオチドの区画は、配列番号１２１～１２４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、Ｖ２、Ｖ２．１、Ｖ２．２、Ｖ２．３、Ｖ２．４、又はＶ２．５ ＲＮＡ足場のうちのいずれか１つの予測される構造を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ足場部分は、配列番号１５又は１６以外の配列を有する。
いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、ＲＮＡ分子のｃｒＲＮＡリピート配列部分と共有結合して、
ガイド配列部分－ｃｒＲＮＡリピート配列部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有する単一ガイドＲＮＡ分子を形成する。
いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７～３０個のヌクレオチド、より好ましくは２０～２３個のヌクレオチド、より好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを更に含み、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、インビトロ転写（ＩＶＴ）又は固相人工オリゴヌクレオチド合成によって形成される。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、修飾ヌクレオチドを含む。
本発明はまた、上記実施形態のうちのいずれか１つのＲＮＡ分子をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾する方法であって、系又は細胞に、本明細書に提示されるＲＮＡ分子のうちのいずれか１つ及び配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを導入することを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞又は原核細胞である。
いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞又は植物細胞である。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾するためのキットであって、系又は細胞に、上記実施形態のうちのいずれか１つの組成物、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを細胞に送達するための説明書を導入することを含む、キットを提供する。
本発明の実施形態では、天然に存在しないＲＮＡ分子は、「スペーサー」又は「ガイド配列」部分を含む。ＲＮＡ分子の「スペーサー部分」又は「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、ガイド配列部分の長さに沿って標的化されるＤＮＡ配列に完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０個のヌクレオチドの長さ、又は約１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１８～２２、１９～２２、１８～２０、１７～２０、若しくは２１－２２個のヌクレオチドの長さである。好ましくは、ガイド配列部分の全長は、ガイド配列部分の長さに沿って標的化されるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成して活性化することができる「足場部分」を有するＲＮＡ分子の一部であり得、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分として機能する。足場部分及びガイド配列部分を有するＲＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列に標的化することができる。各可能性は、別個の実施形態を表す。ＲＮＡ分子のスペーサー部分は、任意の所望の配列を標的化するようにカスタム設計することができる。
一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列及びＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列（例えば、スペーサー又はガイド配列部分）は、単一ガイドＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）上にあり、ｓｇＲＮＡ分子は、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化モジュールとして機能することができる。
一実施形態では、ヌクレアーゼ結合ＲＮＡヌクレオチド配列は、第１のＲＮＡ分子上にあり、ＤＮＡ標的化ＲＮＡヌクレオチド配列は、第２のＲＮＡ分子上にあり、第１及び第２のＲＮＡ分子は、塩基対形成によって相互作用し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、標的化モジュールとして機能する。
発明のいくつかの態様によれば、開示の方法は、無細胞系又は細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法であって、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つの組成物を細胞に導入することを含む、方法を含む。
本発明はまた、細胞内のＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾するための本発明の組成物又は方法のいずれかの使用を提供する。
本発明は、真核細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法を提供する。
本発明は、哺乳動物細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法を提供する。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
本発明は、植物細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、方法は、エクスビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、方法のいくつかのステップは、エクスビボで実施され、いくつかのステップは、インビボで実施される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
本発明はまた、本明細書に記載の方法のうちのいずれかによって得られる修飾された１つの細胞又は複数の細胞を提供する。一実施形態では、これらの修飾された１つの細胞又は複数の細胞は、子孫細胞を生じさせることが可能である。一実施形態では、これらの修飾された１つの細胞又は複数の細胞は、生着後に子孫細胞を生じさせることが可能である。
本発明はまた、これらの修飾された細胞及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。提供されるのはまた、細胞を薬学的に許容可能な担体と混合することを含む、組成物を調製するインビトロ又はエクスビボ方法である。
本発明はまた、無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾するためのキットであって、系又は細胞に、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように、かつ／又は複合体を標的部位に標的化するように構成されている１つ以上のＲＮＡ分子、及びＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを細胞に送達するための説明書を導入することを含む、キットを提供する。例えば、キットは、細胞中又は試験管中のヌクレオチド分子における標的部位（例えば、ＤＮＡ配列）の存在を検出するための診断キットとして使用され得る。
ＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子
ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、ガイド配列部分の長さに沿って標的化されるＤＮＡ配列と部分的又は完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、ガイド配列部分は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０個のヌクレオチドの長さ、又は約１７～５０、１７～４９、１７～４８、１７～４７、１７～４６、１７～４５、１７～４４、１７～４３、１７～４２、１７～４１、１７～４０、１７～３９、１７～３８、１７～３７、１７～３６、１７～３５、１７～３４、１７～３３、１７～３１、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２２、１７～２１、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２２、１８～２０、２０～２１、２１～２２、若しくは１７～２０個のヌクレオチドの長さである。ガイド配列部分の全長は、ガイド配列部分の長さに沿って標的化されるＤＮＡ配列に完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができるＲＮＡ分子の一部であり得、ガイド配列部分がＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分として機能する。ガイド配列部分を有するＤＮＡ分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在するとき、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の標的ＤＮＡ配列に標的化することができる。各可能性は、別個の実施形態を表す。任意の所望の配列を標的化するように、ＲＮＡ分子をカスタム設計することができる。したがって、「ガイド配列部分」を含む分子は、標的化分子の一種である。本出願全体を通して、「ガイド分子」、「ＲＮＡガイド分子」、「ガイドＲＮＡ分子」、及び「ｇＲＮＡ分子」という用語は、ガイド配列部分を含む分子と同義であり、「スペーサー」という用語は、ガイド配列部分と同義である。
本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子とともに使用されるとき、その最大の切断活性を有する。
単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを所望の標的部位に誘導するために使用され得る。単一ガイドＲＮＡは、ガイド配列部分及び足場部分を含む。足場部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと相互作用し、ガイド配列部分と一緒に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを活性化し、所望の標的部位に標的化する。足場部分は、例えば、縮小されたサイズを有するように、更に操作され得る。例えば、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＰＳＲヌクレアーゼは、７９個のヌクレオチドのみの長さである操作された足場部分を有するｓｇＲＮＡ分子でのオンターゲットヌクレアーゼ活性を示す。
発明のいくつかの態様によれば、開示の方法は、無細胞系又は細胞のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾する方法であって、本明細書に記載の実施形態のうちのいずれか１つの組成物を細胞に導入することを含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞又は植物細胞である。
発明のいくつかの態様によれば、開示の方法は、ゲノム変異関連疾患に罹患している対象を治療するための、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つの使用であって、対象のゲノム内の標的部位におけるヌクレオチド配列を修飾することを含む、使用を含む。
発明のいくつかの態様によれば、開示の方法は、変異障害を有する対象を治療する方法であって、本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つを、変異障害に関連する対立遺伝子に標的化することを含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、変異障害は、新生物、加齢関連黄斑変性、統合失調症、神経学的、神経変性、又は運動障害、脆弱Ｘ症候群、分泌酵素関連障害、プリオン関連障害、ＡＬＳ、中毒、自閉症、アルツハイマー病、好中球減少症、炎症関連障害、パーキンソン病、血液及び凝固疾患及び障害、ベータサラセミア、鎌状赤血球症、細胞調節不全及び腫瘍疾患及び障害、炎症及び免疫関連疾患及び障害、代謝性、肝臓、腎臓、及びタンパク質疾患及び障害、筋肉及び骨格疾患及び障害、皮膚疾患及び障害、神経学的及び神経疾患及び障害、並びに眼疾患及び障害のうちのいずれかから選択される疾患又は障害に関連する。
ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの特徴的な標的化ヌクレアーゼ活性は、その特異的ドメインの様々な機能によって付与される。本出願では、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインは、ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、及びドメインＪとして定義される。
各ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインの活性は、本明細書に記載されており、各ドメイン活性は、ヌクレアーゼの有利な特徴の態様を提供する。
具体的には、ドメインＡ、ドメインＧ、及びドメインＩは、ＤＮＡ鎖切断に関与するヌクレアーゼ活性部位を含有する、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの構造単位を形成する。ドメインＡ、ドメインＧ、及びドメインＩによって形成された構造単位は、二本鎖ＤＮＡ標的部位に結合するガイドＲＮＡ分子によって置き換えられるＤＮＡ鎖を切断する。
ドメインＢは、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＤＮＡ部位の標的への結合後、ＤＮＡ切断活性を開始することに関与する。
ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、及びドメインＦは、ガイドＲＮＡ分子に結合し、標的部位認識のための特異性を提供することに関与する。
ドメインＨは、ＤＮＡ鎖切断に関与するヌクレアーゼ活性部位を含有する。ドメインＨは、ガイドＲＮＡ分子がＤＮＡ標的部位に結合するＤＮＡ鎖を切断する。
ドメインＪは、ＰＡＭ部位照合及び認識の態様を含む、ＰＡＭ部位特異性をＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに提供することに関与する。ドメインＪはまた、トポイソメラーゼ活性を行う。
他のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン及びそれらの一般機能の更なる説明は、とりわけ、参照により本明細に組み込まれる、Mir et al., ACS Chem. Biol. (2019), Palermo et al., Quarterly Reviews of Biophysics (2018), Jiang and Doudna, Annual Review of Biophysics (2017), Nishimasu et al., Cell (2014)及びNishimasu et al., Cell (2015)に見出すことができる。
本発明の一態様では、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメインと類似性を有するアミノ酸配列は、ペプチドが、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン活性の有利な特徴を示すように、天然に存在しないペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの設計及び製造に利用され得る。
一実施形態では、そのようなペプチド、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、又は７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、及びドメインＪのアミノ酸配列と１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、又は７０％の同一性を有するアミノ酸配列から選択される、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、又は少なくとも１１個のアミノ酸配列を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。一実施形態では、ペプチドは、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも１００％、９９．５％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、又は７０％の同一性を有するアミノ酸配列外の完全長ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼアミノ酸配列に対する広範なアミノ酸変動性を示す。一実施形態では、ペプチドは、２つのドメイン配列間に介在するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、介在するアミノ酸配列は、１～１０個、１０～２０個、２０～４０個、４０～５０個、５０～６０個、８０～１００個、１００～１５０個、１５０～２００個、２００～２５０個、最大１００個、最大２００個、又は最大３００個のアミノ酸長である。各可能性は、別個の実施形態を表す。一実施形態では、介在する配列は、リンカー配列である。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼからの複数のドメインを含み、ドメインは、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのＮ末端からＣ末端まで、アルファベット順に整理される。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ－１０３のドメインＡ、ドメインＥ、及びドメインＩを含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ配列におけるそれらのドメインの順序は、ドメインＡ、ドメインＥ、及び最後にドメインＩであり、各ドメインのいずれかの末端又は両端に介在配列の可能性がある。
本発明の一態様では、本明細書に記載されるＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインのうちのいずれか１つをコードするアミノ酸配列は、元のＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。アミノ酸置換は、保存的置換、すなわち、元のアミノ酸と同様の化学的特性を有するアミノ酸との置換であり得る。例えば、正に荷電したアミノ酸は、交互に正に荷電したアミノ酸と置換され得、例えば、アルギニン残基が、リジン残基と置換され得るか、又は極性アミノ酸が、異なる極性アミノ酸と置換され得る。保存的置換は、より許容性が高く、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインのうちのいずれか１つをコードするアミノ酸配列は、１０％ほどのそのような置換を含有し得る。アミノ酸置換は、ラジカル置換、すなわち、元のアミノ酸とは異なる化学的特性を有するアミノ酸との置換であり得る。例えば、正に荷電したアミノ酸は、負に荷電したアミノ酸と置換され得、例えば、アルギニン残基が、グルタミン酸残基と置換され得るか、又は極性アミノ酸が、非極性アミノ酸と置換され得る。アミノ酸置換は、半保存的置換であり得るか、又はアミノ酸置換は、任意の他のアミノ酸に対してであり得る。置換は、元のＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼドメイン機能と比較して活性を改変させ得、例えば、触媒ヌクレアーゼ活性を低減し得る。
本発明のいくつかの態様によれば、開示される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む天然に存在しない組成物を含み、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含む。そのそれぞれのＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼアミノ酸配列内の各ドメインのアミノ酸範囲は、補足表１に提供される。本発明のいくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つのアミノ酸配列を含み、各アミノ酸配列は、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのアミノ酸配列ドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちのいずれか１つに対応する。したがって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちのいずれかに対応するアミノ酸配列の任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸配列は、少なくとも１００～２５０、２５０～５００、５００～１０００、１０００～１５００、１０００～１７００、又は１０００～２０００アミノ酸長である。
疾患及び療法
発明のある特定の実施形態では、遺伝子編集の形態、治療する方法、又は療法として、ヌクレアーゼを、疾患又は障害に関連する特定の遺伝子座に標的化する。例えば、遺伝子の編集又はノックアウトを誘導するために、本明細書に開示される新規ヌクレアーゼは、カスタム設計されたガイドＲＮＡ分子を使用して遺伝子の病原性変異対立遺伝子に特異的に標的化され得る。ガイドＲＮＡ分子は、好ましくは、まず、本明細書に示されるように、遺伝子編集が実施されている系にも依存する、ヌクレアーゼのＰＡＭ要件を考慮することによって設計される。例えば、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼを標的部位に標的化するように設計されたガイドＲＮＡ分子は、ＯＭＮＩ－１０３ ＰＡＭ配列、例えば、「ＮＮＲＲＨＹ」又は「ＮＮＲＡＣＴ」又は「ＮＮＲＶＣＴ」に隣接するＤＮＡ二重鎖領域のＤＮＡ鎖に相補的なスペーサー領域を含有するように設計される。ガイドＲＮＡ分子は、更に、好ましくは、ヌクレアーゼの特異的活性を増加させ、オフターゲット効果を低減するために、十分であり、好ましくは最適な長さのスペーサー領域（すなわち、標的対立遺伝子に相補性を有するガイドＲＮＡ分子の領域）を含有するように設計される。
非限定的な例として、ガイドＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ損傷の際に、非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路が誘導され、フレームシフト変異の導入による変異対立遺伝子のサイレンシングをもたらすように、ヌクレアーゼを変異対立遺伝子の特定領域に標的化するように設計され得る。ガイドＲＮＡ分子設計に対するこのアプローチは、ドミナントネガティブ変異の効果を変化させ、それによって対象を治療するために特に有用である。別個の非限定的な例として、ガイドＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼによって引き起こされるＤＮＡ損傷の際に、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が誘導され、変異対立遺伝子のテンプレート媒介性補正をもたらすように、変異対立遺伝子の特定の病原性変異を標的化するように設計され得る。ガイドＲＮＡ分子に対するこのアプローチは、変異対立遺伝子のハプロ不全効果を変化させ、それによって対象を治療するために特に有用である。
疾患又は障害を治療するための変化のために標的化され得る特定の遺伝子の非限定的な例を本明細書で以下に提示する。変異障害を誘導する特定の疾患関連遺伝子及び変異は、文献に記載されている。そのような変異は、ＣＲＩＳＰＲ組成物を疾患関連遺伝子の対立遺伝子に標的化するようにＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子を設計するために使用することができ、ＣＲＩＳＰＲ組成物が、ＤＮＡ損傷を引き起こし、ＤＮＡ修復経路を誘導して対立遺伝子を変化させ、それによって変異障害を治療する。
ＥＬＡＮＥ遺伝子の変異は、好中球減少症に関連している。したがって、限定されないが、ＥＬＡＮＥを標的化する発明の実施形態は、好中球減少症に罹患している対象を治療する方法で使用され得る。
ＣＸＣＲ４は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）感染症の共受容体である。したがって、限定されないが、ＣＸＣＲ４を標的化する発明の実施形態は、ＨＩＶ－１に罹患している対象を治療する方法、又はＨＩＶ－１感染に対する耐性を対象に付与する方法で使用され得る。
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）破壊は、腫瘍細胞のＣＡＲ－Ｔ細胞媒介性殺傷を向上させ、ＰＤ－１は、他のがん療法における標的であり得る。したがって、限定されないが、ＰＤ－１を標的化する発明の実施形態は、がんに罹患している対象を治療する方法で使用され得る。一実施形態では、治療は、ＰＤ－１欠損となるように発明に従って修飾されたＴ細胞を用いたＣＡＲ－Ｔ細胞療法である。
加えて、ＢＣＬ１１Ａは、ヘモグロビン産生の抑制において役割を果たす遺伝子である。グロビン産生は、ＢＣＬ１１Ａを阻害することによって、サラセミア又は鎌状赤血球貧血などの疾患を治療するために増加され得る。例えば、国際公開第2017/077394号、米国特許出願公開第2011/0182867号、Humbert et al. Sci. Transl. Med. (2019)及びCanver et al. Nature (2015)を参照されたい。したがって、限定されないが、ＢＣＬ１１Ａのエンハンサーを標的化する発明の実施形態は、ベータサラセミア又は鎌状赤血球貧血に罹患している対象を治療する方法で使用され得る。
発明の実施形態はまた、任意の疾患関連遺伝子を標的化するために、以下の表Ａ又は表Ｂに列挙される疾患又は障害のうちのいずれかを研究、変化、又は治療するために使用され得る。実際、遺伝子座に関連する任意の疾患は、本明細書に開示のヌクレアーゼを、適切な疾患関連遺伝子、例えば、米国特許出願公開第2018/0282762号及び欧州特許第3079726号に列挙されているものを標的化することによって、研究、変化、又は治療することができる。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／又は科学用語は、発明が関連する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、発明の実施形態の実施又は試験で使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先されるであろう。加えて、材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、必ずしも限定することを意図しない。
別途記載されない限り、考察における発明の実施形態の１つの特色又は複数の特色の条件又は関係特徴を修正する「実質的に」及び「約」などの形容詞は、条件又は特徴が、それが意図される用途のための実施形態の操作に対して許容可能な許容範囲内に定義されることを意味すると理解される。別途示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲における「又は」という単語は、排他的な又はではなく、包括的な「又は」であるとみなされ、それが結合する項目のうちの少なくとも１つ及び任意の組み合わせを示す。
上及び本明細書の他の箇所で使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、列挙された構成要素のうちの「１つ以上」を指すことが理解されるべきである。別途特別に記載されない限り、単数形の使用が複数形を含むことは当業者には明らかであろう。したがって、「ａ」、「ａｎ」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本出願において同義に使用される。
本教示のより良好な理解、及び教示の範囲を決して限定しないことを目的とするために、別途示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される量、割合、又は比率、及び他の数値を表す全ての数は、「約」という用語によって全ての事例で修正されるものと理解されるものである。したがって、別途逆の意味が示されない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、得ることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。最低限でも、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有意な桁の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって解釈されるべきである。
本明細書で数値範囲が列挙される場合、本発明は、別途記載されない限り、上限と下限との間の各整数、並びに上限及び下限を含む各整数を企図することが理解される。
本出願の記載及び特許請求の範囲では、動詞「含む（comprise）」、「含む（include）」、及び「有する」、及びそれらの活用形の各々は、必ずしも動詞の１つの目的語又は複数の目的語が、構成要素、要素、又は動詞の１つの対象又は複数の対象の一部の完全な列挙ではないことを示すために使用される。本明細書で使用される他の用語は、当該技術分野において周知の意味によって定義されることを意味する。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同義に使用される。これらは、任意の長さのヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はそれらの類似体のポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し得、既知又は未知の任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連結分析から定義される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、鉄におけるエクソン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転写ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーである、ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識構成要素とのコンジュゲーションなどによる重合後に、更に修飾され得る。
「ヌクレオチド類似体」又は「修飾ヌクレオチド」という用語は、ヌクレオシドの窒素塩基（例えば、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、又はグアニン（Ｇ））の中若しくは上に、ヌクレオシドの糖部分（例えば、リボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、６員糖類似体、又は開鎖糖類似体）、又はリン酸塩の中若しくは上に、１つ以上の化学的修飾（例えば、置換）を含有するヌクレオチドを指す。本明細書に記載のＲＮＡ配列の各々は、１つ以上のヌクレオチド類似体を含み得る。
本明細書で使用される場合、以下のヌクレオチド識別子は、参照されるヌクレオチド塩基を表すために使用される。
本明細書で使用される場合、「標的化配列」又は「標的化分子」という用語は、特定の標的配列にハイブリダイズすることが可能なヌクレオチド配列又はヌクレオチド配列を含む分子を指し、例えば、標的化配列は、標的化配列の長さに沿って標的化される配列に少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的化配列又は標的化分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成することができる、標的化ＲＮＡ分子の一部であり得、標的化配列がＣＲＩＳＰＲ複合体の標的化部分として機能する。標的化配列を有する分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在すると、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特異的標的配列に標的化させることが可能である。各可能性は、別個の実施形態を表す。任意の所望の配列に標的化するように、標的化ＲＮＡ分子をカスタム設計することができる。
本明細書で使用される場合、「標的化する」という用語は、標的化配列又は標的化分子を、標的ヌクレオチド配列を有する核酸に優先的にハイブリダイゼーションすることを指す。「標的化する」という用語は、標的ヌクレオチド配列を有する核酸を優先的に標的化するが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加えて、意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じ得るように、可変的なハイブリダイゼーション効率を包含することが理解される。ＲＮＡ分子が配列を標的化する場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子との複合体は、ヌクレアーゼ活性によりその配列を標的化することが理解される。
複数の細胞に存在するＤＮＡ配列を標的化する背景では、標的化は、ＲＮＡ分子のガイド配列部分と、細胞のうちの１つ以上の配列とのハイブリダイゼーションを包含し、また、ＲＮＡ分子と、複数の細胞において全ての細胞よりも少ない標的配列とのハイブリダイゼーションを包含することが理解される。したがって、ＲＮＡ分子が複数の細胞内の配列を標的化する場合、ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体は、１つ以上の細胞内の標的配列とハイブリダイズすると理解され、また、全ての細胞よりも少ない標的配列とハイブリダイゼーションし得ることが理解される。したがって、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体は、１つ以上の細胞の標的配列とのハイブリダイゼーションと関連して二重鎖分解を導入し、また、全ての細胞よりも少ない標的配列とのハイブリダイゼーションと関連して二重鎖分解を導入し得ることが理解される。本明細書で使用される場合、「修飾細胞」という用語は、二重鎖分解が、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわち、オンターゲットハイブリダイゼーションの結果として、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとの複合体によって影響を受ける細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、変異形態又はバリアント形態とは区別される、天然に存在する生物、株、遺伝子、又は特徴の典型的な形態を意味する。したがって、本明細書で使用される場合、アミノ酸又はヌクレオチドの配列が野生型配列を指す場合、バリアントは、例えば、置換、欠失、挿入を含む、その配列のバリアントを指す。本発明の実施形態では、操作されたＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、表１に示されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのうちのいずれかのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、欠失、及び／又は挿入）を含むバリアントＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。
「天然に存在しない」又は「操作」という用語は、同義に使用され、ヒトの操作を示す。核酸分子又はポリペプチドを指す場合、これらの用語は、核酸分子又はポリペプチドが、それらが天然で自然に関連し、天然で見出される少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まないことを意味し得る。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、及びＤ又はＩの両方、光学異性体、及びアミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を含む。
本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡ」は、目的の１つの細胞又は複数の細胞に存在する線状及び／若しくは染色体ＤＮＡ、並びに／又はプラスミド、又は他の染色体外ＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、目的の細胞は、原核細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムＤＮＡ配列内の所定の標的部位で二重鎖分解（ＤＳＢ）を生じ、ゲノム内の標的部位におけるＤＮＡ配列の変異、挿入、及び／又は欠失を生じる。
「真核生物」細胞としては、限定されないが、真菌細胞（酵母など）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断することが可能な酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然源から単離されていても、又は天然源に由来してもよい。天然源は、任意の生物であり得る。代替的に、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を保持する修飾タンパク質又は合成タンパク質であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＰＡＭ」という用語は、標的化されたＤＮＡ配列に近接して位置し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって認識される標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を指す。ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼの同一性に応じて異なり得る。
本明細書で使用される場合、「変異障害」又は「変異疾患」という用語は、変異によって引き起こされる遺伝子の機能不全に関連する任意の障害又は疾患を指す。変異障害として現れる機能不全遺伝子は、その対立遺伝子のうちの少なくとも１つに変異を含有し、「疾患関連遺伝子」と称される。変異は、疾患関連遺伝子の任意の部分、例えば、調節部分、コード部分、又は非コード部分にあり得る。変異は、置換、挿入、又は欠失などの任意のクラスの変異であり得る。疾患関連遺伝子の変異は、劣性、ドミナントネガティブ、機能獲得、機能喪失、又は遺伝子産物のハプロ不全をもたらす変異などの任意のタイプの変異のメカニズムによる障害又は疾患として現れ得る。
本発明の実施形態が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する目的の標的ゲノムＤＮＡ配列と会合するためなどの、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化することが可能なＲＮＡ分子を開示していることを当業者は理解するであろう。次いで、ヌクレアーゼは標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二重鎖分解を作り出す。
本発明の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び標的化分子は、標的ＤＮＡ配列に結合して標的ＤＮＡ配列の切断をもたらすＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、更なる別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。代替的に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子、及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。
「タンパク質結合配列」又は「ヌクレアーゼ結合配列」という用語は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することが可能な配列を指す。当業者は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合してＣＲＩＳＰＲ複合体を形成することが可能なｔｒａｃｒＲＮＡが、タンパク質又はヌクレアーゼ結合配列を含むことを理解するであろう。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「ＲＮＡ結合部分」は、ＲＮＡ分子に結合してＣＲＩＳＰＲ複合体、例えばｔｒａｃｒＲＮＡ分子のヌクレアーゼ結合配列を形成し得るＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分を指す。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの「活性部分（activity portion）」又は「活性部分（active portion）」は、例えばＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子と複合体を形成すると、ＤＮＡ分子内の二重鎖分解をもたらすＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの部分を指す。
ＲＮＡ分子は、塩基対形成を介してｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイゼーションし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子に十分に相補的な配列を含み得る。（米国特許第8,906,616号を参照されたい）。本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含み得る。
本発明の実施形態では、標的化分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を更に含み得る。そのような実施形態は、ＲＮＡ分子のガイド部分（ｇＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）と、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との合成融合として設計され得、一緒に単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成する。（Jinek et al., Science (2012)を参照されたい）。本発明の実施形態はまた、別個のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む別個のＲＮＡ分子を利用して、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成し得る。そのような実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、塩基対形成を介してＲＮＡ分子とハイブリダイゼーションし得、本明細書に記載の発明のある特定の用途において有利であり得る。
本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子の構造を更に定義し得る「ネクサス」領域及び／又は「ヘアピン」領域を含み得る。（Briner et al., Molecular Cell (2014)を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「直接リピート配列」という用語は、ヌクレオチド配列の特定のアミノ酸配列の２つ以上のリピートを指す。
本明細書で使用される場合、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと「相互作用する」又は「結合する」ことが可能なＲＮＡ配列又は分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するＲＮＡ配列又は分子の能力を指す。
本明細書で使用される場合、「操作可能に連結した」という用語は、２つの配列間又は分子間の関係（すなわち、融合、ハイブリダイゼーション）が、それらが意図された様式で機能することを可能にする関係を指す。本発明の実施形態では、ＲＮＡ分子がプロモーターに操作可能に連結されていると、ＲＮＡ分子とプロモーターとの両方が、意図された様式で機能することが可能になる。
本明細書で使用される場合、「異種プロモーター」という用語は、促進される分子又は経路が一緒に天然に存在しないプロモーターを指す。
本明細書で使用される場合、分子の配列間の塩基又はアミノ酸のＸ％が同じであり、同じ相対位置にある場合、配列又は分子は、別の配列又は分子とＸ％の「配列同一性」を有する。例えば、第２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する第１のヌクレオチド配列は、他の配列と同じ相対位置において少なくとも９５％同一の塩基を有するであろう。
核局在化配列
「核局在化配列」及び「ＮＬＳ」という用語は、核エンベロープバリアを越えて細胞の細胞質からのタンパク質と会合するタンパク質の輸送を指示するアミノ酸配列／ペプチドを示すために同義に使用される。「ＮＬＳ」という用語は、特定のペプチドの核局在化配列だけでなく、核エンベロープバリアを超えて細胞質ポリペプチドのトランスロケーションを指示することが可能なその誘導体も包含することが意図される。ＮＬＳは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端とＣ末端との両方に結合すると、ポリペプチドの核トランスロケーションを指示することが可能である。加えて、そのＮ末端又はＣ末端によってポリペプチドのアミノ酸配列に沿ってランダムに位置するアミノ酸側鎖に結合したＮＬＳを有するポリペプチドは、トランスロケーションされるであろう。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面に露出している正に荷電したリジン又はアルギニンの１つ以上の短い配列からなるが、他のタイプのＮＬＳが知られている。ＮＬＳの非限定的な例としては、ＳＶ４０ウイルス大型Ｔ抗原、ヌクレオプラズミン、ｃ－ｍｙｃ、ｈＲＮＰａｌ Ｍ９ ＮＬＳ、インポーチン－アルファからのＩＢＢドメイン、筋腫Ｔタンパク質、ヒトｐ５３、マウスｃ－ａｂｌ ＩＶ、インフルエンザｖｉｍｓ ＮＳ１、肝炎ウイルスデルタ抗原、マウスＭｘ１タンパク質、ヒトポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ、及びステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。
送達
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲ組成物は、タンパク質、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター、又はそれらの任意の組み合わせとして送達され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、化学的修飾を含む。好適な化学的修飾の非限定的な例には、２’－０－メチル（Ｍ）、２’－０－メチル、３’ホスホロチオエート（ＭＳ）又は２’－０－メチル、３’チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、シュードウリジン、及び１－メチルシュード－ウリジンが含まれる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／若しくはそれをコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択的に追加のタンパク質（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥＮ、転写因子、制限酵素）、並びに／又はガイドＲＮＡなどのヌクレオチド分子は、任意の好適な手段によって標的細胞に送達され得る。標的細胞は、任意の環境の、例えば、単離された若しくは単離されていない、培養中の、インビトロ、エクスビボ、インビボ、又は植物体内で維持されている、任意のタイプの細胞、例えば、真核細胞又は原核細胞であり得る。
いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ及びガイドのＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡ、及びドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、及び例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ、及びドナーテンプレートを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼＤＮＡ標的化ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、送達される組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ、及び例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。
任意の好適なウイルスベクター系を使用して、ＲＮＡ組成物を送達することができる。従来のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子転写方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞、植物細胞など）及び標的組織に核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを導入することができる。そのような方法はまた、インビトロで細胞に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質をコードする核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼタンパク質を投与するために使用され得る。ある特定の実施形態では、核酸及び／又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、インビボ又はエクスビボ遺伝子療法を使用するために投与される。非ウイルスベクター送達系は、裸の核酸、及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸を含む。遺伝子療法手順の概説については、Anderson, Science (1992)；Nabel and Felgner, TIBTECH (1993)；Mitani and Caskey, TIBTECH (1993)；Dillon, TIBTECH (1993)；Miller, Nature (1992)；Van Brunt, Biotechnology (1988)；Vigne et al., Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)；Kremer and Perricaudet, British Medical Bulletin (1995)；Haddada et al., Current Topics in Microbiology and Immunology (1995)及びYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照されたい。
核酸及び／又はタンパク質の非ウイルス送達の方法としては、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティックス、パーティクルガン加速、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン若しくは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン、及び核酸の薬剤で増強された取り込みが挙げられるか、又は細菌若しくはウイルス（例えば、Agrobacterium、Rhizobium sp.NGR234、Sinorhizoboiummeliloti、Mesorhizobium loti、タバコモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス、及びキャッサバ静脈モザイクウイルスによって植物細胞に送達され得る。例えば、Chung et al. Trends Plant Sci. (2006)を参照されたい。例えば、Sonitron 2000系（Rich-Mar）を使用するパルス超音波照射も、核酸の送達に使用され得る。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性脂質媒介送達は、インビボ、エクスビボ、又はインビトロ送達方法としても企図される。Zuris et al., Nat. Biotechnol. (2015), Coelho et al., N. Engl. J. Med. (2013)；Judge et al., Mol. Ther. (2006)及びBasha et al., Mol. Ther. (2011)を参照されたい。
トランスポゾンベースのシステム、例えば、組換えSleeping Beautyトランスポゾンシステム又は組換えPiggyBacトランスポゾンシステムなどの、非ウイルスベクターはまた、標的細胞に送達され、標的細胞における組成物の分子のポリヌクレオチド配列又は組成物の分子をコードするポリヌクレオチド配列のトランスポジションに利用され得る。
追加の例示的な核酸送達系としては、Amaxa（登録商標）Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）、及びCopernicus Therapeutics Inc.、（例えば、米国特許第6,008,336を参照されたい）によって提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号、及び米国特許第4,897,355号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Transfectam（商標）、Lipofectin（商標）、及びLipofectamine（商標）RNAiMAX）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性及び中性脂質としては、国際公開第91/17424号及び同第91/16024号に開示のものが挙げられる。送達は、細胞（エクスビボ投与）又は標的組織（インビボ投与）へのものであり得る。
免疫脂質複合体などの標的化されたリポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当業者には周知である（例えば、Crystal, Science (1995)；Blaese et al., Cancer Gene Ther. (1995)；Behr et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Remy et al., Bioconjugate Chem. (1994)；Gao and Huang, Gene Therapy (1995)；Ahmad and Allen, Cancer Res., (1992)、米国特許第4,186,183号、同第4,217,344号、同第4,235,871号、同第4,261,975号、同第4,485,054号、同第4,501,728号、同第4,774,085号、同第4,837,028号、及び同第4,946,787号を参照されたい）。
追加の送達の方法としては、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）に送達される核酸のパッケージングの使用が挙げられる。これらのＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を使用して標的組織に特異的に送達される。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いでＥＤＶは、エンドサイトーシスによって細胞内に運び込まれる。細胞内に入ると、内容物が放出される（MacDiamid et al., Nature Biotechnology (2009)）を参照されたい）。
送達ビヒクルとしては、当該技術分野で既知の他の送達ビヒクルの中でも、細菌、好ましくは、非病原性ビヒクル、ナノ粒子、エクソソーム、マイクロベシクル、遺伝子銃送達、例えば、「遺伝子銃」を介して使用して細胞に発射される金粒子への組成物の付着によるもの、レンチウイルス、ＡＡＶ、及びレトロウイルスを含むが、これらに限定されない、ウイルスビヒクル、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、大型ＶＬＰ（ＬＶＬＰ）、レンチウイルス様粒子、トランスポゾン、ウイルスベクター、裸のベクター、ＤＮＡ、又はＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び／又はＣＲＩＰＳＲヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、並びに任意選択的に追加のヌクレオチド分子及び／又は追加のタンパク質若しくはペプチドの送達は、単一の送達ビヒクル若しくは方法、又は異なる送達ビヒクル若しくは方法の組み合わせを利用することによって行われ得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＬＮＰを利用する細胞に送達され得、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ＡＡＶを利用する細胞に送達され得る。代替的に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＡＡＶ粒子を利用する細胞に送達され得、ｃｒＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、別個のＡＡＶ粒子を利用する細胞に送達され得、これはサイズ制限のために有利であり得る。
核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与され得る（インビボ）か、又は細胞をインビトロで治療するために使用され得、修飾細胞は、患者に投与される（エクスビボ）。核酸を送達するための従来のウイルスに基づくシステムとしては、限定されないが、遺伝子転写のための組換えレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア、及び単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。しかしながら、ＲＮＡウイルスが、本明細書に記載のＲＮＡ組成物の送達に好ましい。追加的に、多くの異なる細胞型及び標的組織での高い形質導入効率が観察されている。発明の核酸は、非統合レンチウイルスによって送達され得る。任意選択的に、レンチウイルスを用いるＲＮＡ送達が利用される。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ガイドのＲＮＡ、及びドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡ、及び／又は例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼのｍＲＮＡ、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ、及びドナーテンプレートを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。任意選択的に、レンチウイルスは、ヌクレアーゼタンパク質、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ、及び例えば、相同性指向修復を介した遺伝子編集のためのドナーテンプレートを含む。
上に言及した本明細書に記載の組成物は、非統合レンチウイルス粒子方法、例えば、LentiFlash（登録商標）システムを使用して、標的細胞に送達され得る。標的細胞へのＲＮＡの送達が標的細胞内部で本明細書に記載の組成物の組み立てを生じるようにそのような方法を使用して、ｍＲＮＡ又は他のタイプのＲＮＡを標的細胞内に送達することができる。また、国際公開第2013/014537号、同第2014/016690号、同第2016/185125号、同第2017/194902号、及び同第2017/194903号を参照されたい。
外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大することによって、レトロウイルスのトロピズムを変化させることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入又は感染させることが可能なレトロウイルスベクターであり、典型的には、高いウイルス力価を生成する。レトロウイルス遺伝子転写系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂの外来配列のパッケージング能力を有する、シス作用型の長い末端リピートから構成される。最小のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、次いで、療法的遺伝子を標的細胞に統合して永続的な導入遺伝子発現を提供するために使用される。広く使用されているレトロウイルスベクターとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、及びそれらの組み合わせに基づくものが挙げられる（例えば、Buchscher Panganiban, J. Virol. (1992)；Johann et al., J. Virol. (1992)；Sommerfelt et al., Virol. (1990)；Wilson et al., J. Virol. (1989)；Miller et al., J. Virol. (1991)、国際公開第94/26877号を参照されたい）。
現在、ヘルパー細胞株に挿入された遺伝子による欠陥ベクターの相補性を伴うアプローチを利用して、形質導入物質を生成する臨床試験における遺伝子転写には、少なくとも６つのウイルスベクターアプローチが利用可能である。
ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されているレトロウイルスの例である（Dunbar et al., Blood (1995)；Kohn et al., Nat. Med. (1995)；Malech et al., PNAS (1997)）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法試験で使用された最初の療法的ベクターであった（Blaese et al., Science (1995)）。ＭＦＧ－Ｓをパッケージングしたベクターでは、５０％以上の形質導入効率が観察されている（Ellem et al., Immunol Immunother. (1997)；Dranoff et al., Hum. Gene Ther. (1997)）。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。そのような細胞としては、アデノウイルス、ＡＡＶ、及びｐｓｉ．２細胞をパッケージングする２９３細胞、又はレトロウイルスをパッケージングするＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子療法に使用されるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子内にパッケージングするプロデューサー細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージング及びその後の宿主への統合に必要な最小限のウイルス配列を含有し（該当する場合）、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法に使用されるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージング及び宿主ゲノムへの統合に必要な、ＡＡＶゲノムからの逆位末端配列（ＩＴＲ）配列のみを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわちｒｅｐ及びｃａｐをコードするが、ＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞株にパッケージングされる。細胞株はまた、ヘルパーとしてのアデノウイルスに感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くことに起因して、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶよりも感受性が高い熱処理によって低減することができる。追加的に、ＡＡＶは、バキュロウイルス系を使用して臨床規模で産生することができる（米国特許第7,479,554号を参照されたい）。
多くの遺伝子療法用途において、遺伝子療法ベクターは、特定の組織タイプに対して高い程度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面上にウイルスコートタンパク質を有する融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように修飾することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが知られている受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995)は、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０に融合したヒトヘレグリンを発現するように修飾することができ、組換えウイルスは、ヒト表皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス標的細胞対に拡大することができる。例えば、糸状ファージは、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢ又はＦｖ）を表示するように操作することができる。上の説明は、主にウイルスベクターに適用されるが、同じ原理を非ウイルスベクターに適用することができる。そのようなベクターは、特異的標的細胞による取り込みに有利な特異的取り込み配列を含有するように操作され得る。
遺伝子療法ベクターは、以下に記載されるように、個々の患者への投与によって、典型的には、全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、又は頭蓋内注入）、又は局所適用によって、インビボで送達され得る。代替的に、ベクターは、個々の患者から摘出された細胞（例えば、リンパ球、骨髄穿刺液、組織生検）、又はユニバーサルドナー造血幹細胞などの細胞にエクスビボで送達され、続いて、通常、ベクターを組み込んだ細胞の選択後に、患者への細胞の再移植が行われ得る。いくつかの実施形態では、インビボ及びエクスビボでのｍＲＮＡの送達、並びにＲＮＰ送達が利用され得る。
診断、研究、又は遺伝子療法のための（例えば、宿主生物へのトランスフェクト細胞の再注入を介した）エクスビボ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施形態では、細胞は、対象生物から単離され、ＲＮＡ組成物でトランスフェクトされ、対象生物（例えば、患者）に再注入される。エクスビボトランスフェクションに好適な様々な細胞型は、当業者に周知である（例えば、患者から細胞を単離及び培養する方法の考察については、Freshney, “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th edition, 2010)）、及びこれに列挙されている参考文献を参照されたい）。
好適な細胞としては、限定されないが、真核細胞及び原核細胞、並びに／又は細胞株が挙げられる。そのような細胞又はそのような細胞から生成される細胞株の非限定的な例としては、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ－Ｓ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－ＤＧ４４、ＣＨＯ－ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ－ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８－Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０－Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３－Ｆ、ＨＥＫ２９３－Ｈ、ＨＥＫ２９３－Ｔ）、及びＰｅｒＣ６細胞、任意の植物細胞（分化又は未分化）、並びにSpodopterafugiperda（Ｓｆ）などの昆虫細胞、又はSaccharomyces、Pichia、及びSchizosaccharomycesなどの真菌細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１、ＭＤＣＫ、又はＨＥＫ２９３細胞株である。追加的に、初代細胞は、単離され、ヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ又はＴＡＬＥＮ）、又はヌクレアーゼ系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）での処理に続いて、治療される対象への再導入のためにエクスビボで使用され得る。好適な初代細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、並びに限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞などの他の血液細胞サブセットが挙げられる。また、好適な細胞としては、例としては、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）、神経幹細胞、及び間葉系幹細胞などの幹細胞が挙げられる。
一実施形態では、幹細胞は、細胞トランスフェクション及び遺伝子療法のためのエクスビボ手順で使用される。幹細胞を使用する利点は、それらがインビトロで他の細胞型に分化することができるか、又はそれらが骨髄に移植される場合、哺乳動物（細胞のドナーなど）に導入することができることである。ＣＤ３４＋細胞をインビトロでＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮ－ガンマ、及びＴＮＦ－アルファなどのサイトカインを使用して臨床的に重要な免疫細胞型に分化させるための方法が知られている（非限定的な例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照されたい）。
幹細胞は、既知の方法を使用して形質導入及び分化のために単離される。例えば、幹細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、ＧＲ－１（顆粒球）、並びにＩａｄ（分化抗原提示細胞）などの不要な細胞に結合する抗体で骨髄細胞を選別することによって、骨髄細胞から単離される（非限定的な例として、Inaba et al., J. Exp. Med. (1992)を参照されたい）。いくつかの実施形態では、修飾された幹細胞も使用され得る。
とりわけ、本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼのいずれか１つは、有糸分裂後の細胞又は活動的に分裂していない任意の細胞、例えば、休止細胞におけるゲノム編集に好適であり得る。本発明のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して編集され得る有糸分裂後の細胞の例としては、限定されないが、筋細胞、心筋細胞、肝細胞、骨細胞、及びニューロンが挙げられる。
療法的ＲＮＡ組成物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。代替的に、裸のＲＮＡ又はｍＲＮＡが投与され得る。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液又は組織細胞との根本的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、利用可能かつ当業者に周知であり、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与することができるが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時的かつ効果的な反応を提供し得る。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）への導入遺伝子の導入に好適なベクターとしては、非統合レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、米国特許公開第2009/0117617号を参照されたい。
薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物によって、並びに組成物を投与するために使用される特定の方法によって部分的に決定される。したがって、以下に記載されるように、利用可能な薬学的組成物の多様な好適な製剤が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989を参照されたい）。
相同組換えによるＤＮＡ修復
「相同性指向修復」又は「ＨＤＲ」という用語は、例えば、ＤＮＡにおける二重鎖及び一本鎖分解の修復中に、細胞におけるＤＮＡ損傷を修復するための機構を指す。ＨＤＲは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「核酸テンプレート」（本明細書で同義に使用される核酸テンプレート又はドナーテンプレート）を使用して、二重鎖又は一本鎖分解が生じた配列（例えば、ＤＮＡ標的配列）を修復する。これにより、例えば、核酸テンプレートからＤＮＡ標的配列への遺伝子情報の転写が生じる。核酸テンプレート配列がＤＮＡ標的配列と異なり、核酸テンプレートポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの一部又は全てがＤＮＡ標的配列に組み込まれる場合、ＨＤＲは、ＤＮＡ標的配列の変化（例えば、挿入、欠失、変異）を生じ得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートポリヌクレオチド全体、核酸テンプレートポリヌクレオチドの一部分、又は核酸テンプレートのコピーは、ＤＮＡ標的配列の部位に統合される。
「核酸テンプレート」及び「ドナー」という用語は、ゲノムに挿入又はコピーされるヌクレオチド配列を指す。核酸テンプレートは、標的核酸に付加されるか、又は標的核酸の変化をテンプレートするか、又は標的配列を修飾するために使用され得るであろう、例えば、１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。核酸テンプレート配列は、任意の長さ、例えば２～１０，０００個のヌクレオチドの長さ（又はそれらの間若しくはそれらの上の任意の整数値）、好ましくは約１００～１，０００個のヌクレオチドの長さ（又はそれらの間の任意の整数値）、より好ましくは約２００～５００個のヌクレオチドの長さであり得る。核酸テンプレートは、一本鎖核酸、二重鎖核酸であり得る。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、例えば、標的位置の標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、例えば、標的位置の標的核酸の野生型配列に対応する、例えば１つ以上のリボヌクレオチドのリボヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、修飾されたリボヌクレオチドを含む。
外因性配列（「ドナー配列」、「ドナーテンプレート」、又は「ドナー」とも呼ばれる）の、例えば、変異遺伝子の補正のための、又は野生型遺伝子の発現増加のための挿入も行うことができる。ドナー配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではないことが容易に明らかであろう。ドナー配列は、目的の位置で効率的なＨＤＲを可能にするために、相同性の２つの領域に隣接する非相同配列を含有し得る。追加的に、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域に相同ではない配列を含有するベクター分子を含み得る。ドナー分子は、細胞クロマチンと相同性のいくつかの非連続的な領域を含有し得る。例えば、目的の領域に通常存在しない配列の標的化された挿入のために、当該配列が、ドナー核酸分子内に存在し、目的の領域内の配列と相同性の領域に隣接してもよい。
ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖及び／又は二重鎖であり得、線状又は環状形態で細胞に導入され得る。例えば、米国特許出願公開第2010/0047805号、同第2011/0281361号、同第2011/0207221号、及び同第2019/0330620号を参照されたい。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が線状分子の３’末端に付加され、及び／又は自己相補性オリゴヌクレオチドが１つ又は両方の末端にライゲーションされる。例えば、Chang and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987)；Nehls et al., Science (1996)を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法としては、限定されないが、末端アミノ基の付加、並びに修飾ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、及びＯ－メチルリボース、又はデオキシリボース残基などの使用が挙げられる。
したがって、修復のためにドナーテンプレートを使用する本発明の実施形態は、線状又は環状形態で細胞に導入され得るＤＮＡ又はＲＮＡ、一本鎖及び／又は二重鎖ドナーテンプレートが使用され得る。本発明の実施形態では、遺伝子編集組成物は、（１）修復前の遺伝子内の二重鎖分解に影響を及ぼすためのガイド配列を含むＲＮＡ分子、及び（２）修復のためのドナーＲＮＡテンプレートを含み、ガイド配列を含むＲＮＡ分子が、第１のＲＮＡ分子であり、ドナーＲＮＡテンプレートが、第２のＲＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ分子及びテンプレートＲＮＡ分子は、単一分子の一部として接続されている。
ドナー配列はまた、オリゴヌクレオチドであり得、内因性配列の遺伝子補正又は標的遺伝子の変化のために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、ベクター上で細胞に導入され得るか、細胞内にエレクトロポレートされ得るか、又は当該技術分野において既知の他の方法を介して導入され得る。オリゴヌクレオチドは、内因性遺伝子の変異配列（例えば、ベータグロビンの鎌状変異）を「補正」するために使用することができるか、又は所望の目的を有する配列を内因性遺伝子座に挿入するために使用することができる。
ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの物質と複合体化された核酸として導入され得るか、又は組換えウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））によって送達され得る。
ドナーは、一般に、その発現が、統合部位の内因性プロモーター、すなわち、ドナーが挿入される内因性遺伝子の発現を推進するプロモーターによって推進されるように挿入される。しかしながら、ドナーは、プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、又は誘導性若しくは組織特異的プロモーターを含み得ることが明らかであろう。
ドナー分子は、内因性遺伝子の全て、一部を発現するか、又は全く発現しないように、内因性遺伝子に挿入され得る。例えば、本明細書に記載の導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子との融合体として、内因性配列の一部（導入遺伝子に対するＮ末端及び／又はＣ末端）を発現するか、又は内因性配列のいずれも発現しないように、内因性遺伝子座に挿入され得る。他の実施形態では、（例えば、内因性遺伝子などための追加のコード配列を有するか又は有さない）導入遺伝子は、任意の内因性遺伝子座、例えば、セーフハーバー遺伝子座、例えば、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られている）遺伝子、アルブミン遺伝子、又はＲｏｓａ遺伝子に統合される。例えば、米国特許第7,951,925号、及び同第8,110,379号、米国特許出願公開第2008/0159996号、同第2010/0218264号、同第2010/0291048号、同第2012/0017290号、同第2011/0265198号、同第2013/0137104号、同第2013/0122591号、同第2013/0177983号、及び同第２013/0177960号、並びに米国仮出願第61/823,689号を参照されたい）。
内因性配列（内因性又は導入遺伝子の一部）が導入遺伝子を伴って発現される場合、内因性配列は、完全長配列（野生型又は変異型）又は部分配列であり得る。好ましくは、内因性配列は、機能的である。これらの全長配列又は部分配列の機能の非限定的な例としては、導入遺伝子によって発現されるポリペプチドの血清半減期を増加させること（例えば、療法的遺伝子）、及び／又は担体として作用することが挙げられる。
更に、発現には必要ではないが、外因性配列としてはまた、転写又は翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、及び／又はポリアデニル化シグナルを挙げることができる。
ある特定の実施形態では、ドナー分子は、タンパク質をコードする遺伝子（例えば、細胞内若しくは個体に欠けているタンパク質をコードするコード配列、又はタンパク質をコードする遺伝子の代替バージョン）、調節配列、及び／又はマイクロＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡなどの構造的核酸をコードする配列からなる群から選択される配列を含む。
前述の実施形態では、本明細書に開示の各実施形態は、他の開示の実施形態の各々に適用可能であることが企図される。例えば、本発明のＲＮＡ分子又は組成物のうちのいずれかを、本発明の方法のうちのいずれかに利用することができることが理解される。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単に組織についての見出しであり、いかなる様式でも開示を限定することを意図しない。任意の個々の段落の内容は、全ての段落に同等に適用可能であり得る。
本発明の追加の目的、利点、及び新規の特色は、限定することを意図しない以下の実施例を考察することによって、当業者に明らかになるであろう。追加的に、本明細書に上述され、以下の特許請求の範囲の段落で特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様の各々により、以下の実施例において実験的裏付けが見出される。
明確にするために、別個の実施形態の文脈で記載される本発明の特定の特徴はまた、組み合わせられて単一の実施形態で提供され得ることが理解される。むしろ、簡潔にするために、単一の実施形態の背景で記載される発明の様々な特色はまた、別個に、又は任意の好適な部分的な組み合わせで、又は発明の任意の他の記載の実施形態で好適なものとして提供され得る。様々な実施形態の文脈で記載される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは動作しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴とみなされるべきではない。
一般に、本明細書で使用される命名法、及び本発明で利用される実験手順は、分子、生化学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法を含む。そのような技法は、文献において丁寧に説明されている。例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1989)；Ausubel, R. M. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (1994)；Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)；Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York；Birren et al. (Eds.), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第4,666,828号、同第4,683,202号、同第4,801,531号、同第5,192,659号、及び同第5,272,057号に記載される方法論、Cellis, J. E. (Ed.), "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III (1994)；Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" Third Edition, Wiley-Liss, N. Y. (1994)；Coligan J. E. (Ed.), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III (1994)；Stites et al. (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell and Shiigi (Eds.), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)；Clokie and Kropinski (Eds.), "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (2009)を参照されたく、これらの全ては参照によって組み込まれる。他の一般的な参考文献は、本文書全体を通して提供される。
発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例は、発明の作製及び実施の例示的なモードを示している。しかしながら、発明の範囲は、これらの実施例に開示の特定の実施形態に限定されず、該実施形態は例示のみを目的とするものである。
実験の詳細
発明のより完全な理解を容易にするために、実施例を以下に提供する。以下の実施例は、発明の作製及び実施の例示的なモードを示している。しかしながら、発明の範囲は、これらの実施例に開示の特定の実施形態に限定されず、該実施形態は例示のみを目的とするものである。
実施例１：ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ
環境試料の配列の異なるメタゲノムデータベースから、ＣＲＩＳＰＲリピート（ｃｒＲＮＡ）、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ヌクレアーゼポリペプチド（ＯＭＮＩ）、及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を予測した。
ＯＭＮＩヌクレアーゼポリペプチドの構築
新規ヌクレアーゼポリペプチド（ＯＭＮＩ）の構築のために、いくつかの特定されたＯＭＮＩのオープンリーディングフレームを、ヒト細胞株発現のためにコドン最適化した。ＯＲＦを、細菌発現プラスミドｐＥＴ９ａ及び哺乳動物発現プラスミドｐｍＯＭＮＩにクローニングした（表４）。
ｓｇＲＮＡの予測及び構築
各ＯＭＮＩについて、それぞれの細菌ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲリピートアレイ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡの検出によって、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を予測した。ナイーブ成熟前ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、テトラループ「ｇａａａ」配列を用いてインシリコで接続し、二重鎖の二次構造要素を、ＲＮＡ二次構造予測ツールを使用して予測した。
完全二重鎖ＲＮＡ要素（ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡキメラ）の予測される二次構造を、ｓｇＲＮＡの設計のための可能なｔｒａｃｒＲＮＡ配列の特定に使用した。上部ステムの異なる位置で二重鎖を短縮することによって、いくつかの可能なｓｇＲＮＡ足場バージョンを構築した（ＯＭＮＩ－１０３ ｓｇＲＮＡ設計が表２に列挙される）。追加的に、潜在的転写及び構造的制約を克服するため、ヒト細胞環境文脈でのｓｇＲＮＡ足場の可塑性を評価するため、いくつかの場合において可能なｓｇＲＮＡのヌクレオチド配列における小さな変更を行った（図１、表２）。最後に、可能な設計された足場の最大３つのバージョンを、各ＯＭＮＩについて合成し、２２ヌクレオチドの普遍的な固有のスペーサー配列（Ｔ２、配列番号１３５）の下流に接続し、哺乳動物発現のためのＵ６プロモーターと組み合わせた誘導性Ｔ７プロモーター下で細菌発現プラスミドにクローニングした（ｐＳｈｕｔｔｌｅＧｕｉｄｅ、表４）。
Ｔ２－ＧＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣ（配列番号１３５）
ＴＸＴＬによるインビトロ枯渇アッセイ
インビトロでのＰＡＭ配列の枯渇を、Maxwell et al, Methods. 2018によって記載されるように追跡した。簡潔には、Ｔ７プロモーター下でＯＭＮＩヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを発現する線状ＤＮＡを、無細胞転写－翻訳インビトロシステム（ＴＸＴＬミックス、Arbor Bioscience）に、Ｔ７ポリメラーゼを発現する線状構築物と一緒に付加した。ＴＸＴＬミックスによるＲＮＡ発現及びタンパク質翻訳は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の形成をもたらす。線状ＤＮＡが使用されたので、Ｃｈｉ６ ＤＮＡ配列をＴＸＴＬ反応ミックスに付加して、ＲｅｃＢＣＤのエキソヌクレアーゼ活性を阻害し、それによって線状ＤＮＡを分解から保護した。ｓｇＲＮＡスペーサーは、潜在的なＰＡＭ配列の８Ｎランダム化セットに隣接される標的プロトスペーサー（ｐｂＰＯＳ Ｔ２ライブラリ、表４）を含有するプラスミドのライブラリを標的化するように設計される。ライブラリからのＰＡＭ配列の枯渇を、ＰＣＲを使用して、必要なアダプター及びインデックスを切断されたライブラリ及び非標的化ｇＲＮＡを発現する対照ライブラリの両方に付加するハイスループットシーケンシングによって測定した。ディープシーケンシング後、インビトロ活性は、対象におけるそれらの発生と比較して、同じＰＡＭ配列を有する枯渇した配列の画分によって確認され、ＯＭＮＩヌクレアーゼにより機能的ＤＮＡ切断を示す（図４Ａ～４Ｂ及び表３）。
ヒト細胞内の内因性ゲノム標的における活性
ＯＭＮＩ－１０３を、ヒト細胞における特定のゲノム位置上での編集を促進するその能力についてもアッセイした。ＯＭＮＩ－１０３のヒトゲノム標的に対する編集活性を、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼ及び各々異なるゲノム位置を標的化するように設計された固有のｓｇＲＮＡ分子のパネルと共トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞上でのＮＧＳ切断分析によって評価した。この目的のために、ヒト最適化ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをインフレームＰ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（ｐｍＯＭＮＩ、表４）にクローニングし、ＯＭＮＩ－１０３ ｓｇＲＮＡ分子配列の各々をシャトルガイドベクター（pShuttle Guide、表４）にクローニングした。ｓｇＲＮＡ分子は、対応するＯＭＮＩ－１０３ ＰＡＭの選好に従って、ヒトゲノムにおける特定の位置を標的化する２２ヌクレオチドのガイド配列部分（表５）、続いてＴＸＴＬによって発見されたｓｇＲＮＡ足場配列（表３）を含有するように設計された。トランスフェクション後７２時間で、細胞を採取した。採取された細胞の半分を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光をマーカーとして使用するＦＡＣＳによるＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼ発現の定量化に使用した。細胞の残りを溶解し、それらのゲノムＤＮＡ内容物を抽出し、対応するゲノム標的のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。アンプリコンを、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）に供し、次いで得られたリードを使用して、それらの標的部位における編集イベントのパーセンテージを計算した。切断部位の周囲の短い挿入又は欠失（インデル）は、ヌクレアーゼ誘導ＤＮＡ切断に続くＤＮＡ末端の修復の典型的な結果である。編集％の計算は、各アンプリコン内のアラインされたリード合計に対するインデルリードの分数から推測した。表５（列５、「編集％」）に見ることができるように、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、ほとんどのゲノム部位上で高く有意な編集レベルを示した。
ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼのタンパク質精製
ＲＮＰアセンブリにおける使用のためのヌクレアーゼタンパク質産生及び合成ガイド産生のための発現方法は、米国仮出願第63/286,855号に記載された。簡潔には、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼオープンリーディングフレームを細菌についてコドン最適化し（表１）、以下の要素－ＳＶ４０ ＮＬＳ－ＯＭＮＩ－１０３ ＯＲＦ細菌最適化（第２のアミノ酸から）－ＨＡタグ－ＳＶ４０ ＮＬＳ－８ Ｈｉｓタグを有する修飾ｐＥＴ９ａプラスミドにクローニングした（表４）。ＯＭＮＩ－１０３構築物をＫＲＸ細胞（ＰＲＯＭＥＧＡ）において発現させた。細胞を、６．６６ｍＭのラムノース（０．５Ｍストックからの２６．４ｍｌ）、及び０．０５％のグルコース（０．５Ｍからの２ｍｌ）の添加を有するＴＢ＋０．４％グリセロール中で増殖させ、２０℃まで温度低下後、４時間にわたる対数期中期において発現させた。化学溶解を使用して細胞を溶解させ、清浄された溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂上で精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ溶出画分をＣＥＸ（SO3 fractogel）樹脂上で精製し、続いてSuperdex（登録商標）200 Increase 10/300 GL、AKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）上でのＳＥＣ精製を行った。ＯＭＮＩ－１０３タンパク質を含む画分をプールし、３０ｍｇ／ｍｌストックに濃縮して、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。
インビトロでのＲＮＰのＯＭＮＩ－１０３切断活性
３’及び５’末端の３つの２’－Ｏ－メチル３’－ホスホロチオエート（Agilent）を用いて、ＯＭＮＩ－１０３の合成ｓｇＲＮＡを合成した。
ＯＭＮＩ－１０３ ＲＮＰの活性を、ガイドＰＤＣＤ１ Ｓ４０と同じ標的部位を標的化する異なるスペーサー長（２０～２５ヌクレオチド）を有するガイド分子を用いてインビトロでアッセイした（表６、図２Ａ）。簡単には、１０ｐｍｏｌのＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼを、２０ｐｍｏｌの合成ガイドと混合した。室温で１０分のインキュベーション後、ＲＮＰ複合体を、４、２、１、０．５ｐｍｏｌに段階希釈し、抽出されたゲノムＤＮＡからのＰＤＣＤ１ Ｓ４０標的部位の増幅によって調製された４０ｎｇの線状ＤＮＡテンプレートと反応させた。全てのスペーサー長（２０～２５ヌクレオチド）は、高い切断活性を示す全てのＲＮＰ濃度でＰＤＣＤ１テンプレートの完全な切断を示した（図２Ａ）。
Ｕ２ＯＳ細胞におけるＲＮＰの編集活性を測定することによるＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼのガイド最適化
スペーサー長最適化を、哺乳動物細胞の文脈でも試験した。１００ｕＭのＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼを、１２０ｕＭの異なるスペーサー長（２０～２５個のヌクレオチド、表６）の合成ガイド及び１００ｕＭのＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）と混合することによって、ＲＮＰを組み立てた。室温での１０分のインキュベーション後、ＲＮＰ複合体を、２００，０００個の予め洗浄されたＵ２ＯＳ細胞と混合し、ＤＮ１００を備えたLonza SE Cell Line 4D-Nucleofector（商標）X Kitを製造業者のプロトコルに従って使用してエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を溶解し、それらのゲノムＤＮＡ内容物を抽出した。次いで、対応するゲノム標的部位をＰＣＲによって増幅した。アンプリコンをＮＧＳに供し、次いで得られた配列を使用して、編集イベントのパーセンテージを計算した。図２Ｂ及び表７に見ることができるように、２２個のヌクレオチドのスペーサー長は、最も高い編集レベルを示した。
ヒト細胞におけるＯＭＮＩ－１０３ ＲＮＰ編集活性
哺乳動物細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－１０３タンパク質の活性は、Ｕ２ＯＳにおいて観察され（表７、図２Ｃ）、同等の活性は、Ｔ細胞においても観察された（表８）。ＲＮＰを、１００ｕＭのヌクレアーゼを１２０ｕＭの合成ガイド（表６）及び１００ｕＭのＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）と混合することによって組み立てた。室温での１０分のインキュベーション後、ＲＮＰ複合体を、２００，０００個のＵ２ＯＳ細胞と混合し、ＤＮ１００を備えたLonza SE Cell Line 4D-Nucleofector（商標）X Kitを製造業者のプロトコルに従って使用してエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を溶解し、それらのゲノムＤＮＡ内容物を抽出した。次いで、対応するゲノム標的部位をＰＣＲによって増幅した。アンプリコンをＮＧＳに供し、次いで得られた配列を使用して、編集イベントのパーセンテージを計算した。ＯＭＮＩ－１０３ ＲＮＰを、ＰＤＣＤ１ Ｓ４０、ＴＲＡＣ Ｓ３５、ＴＲＡＣ Ｓ３６、及びＢ２Ｍ Ｓ１２ガイドで試験した。試験された４つのガイドは全て、７０～９０％の編集レベルを示した（図２Ｃ）。
Guide-seq不偏分析方法を使用してオフターゲット効果を評価する
ガイド配列は、生細胞中のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって引き起こされるオフターゲットゲノム編集イベントの不偏インビトロ検出を可能にする。生ヒト細胞のゲノムにおける平滑末端ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）誘導ＤＳＢは、ＮＨＥＪと一致する末端結合プロセスを介して、これらの切断での平滑二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）の統合によってタグ付けされる。ゲノムＤＮＡにおけるｄｓＯＤＮ統合部位は、不偏増幅及びディープＮＧＳを使用してヌクレオチドレベルで正確にマッピングされる。ゲノムＤＮＡ超音波処理及び一連のアダプターライゲーション後、オリゴヌクレオチド含有ライブラリをハイスループットＤＮＡシーケンシングに供し、出力をデフォルトGuide-seqソフトウェアで処理して、オリゴヌクレオチド捕捉の部位を特定する。
ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼの特異性を評価するために、Guide-seqを使用して、ＰＤＣＤ１ Ｓ４０及びＴＲＡＣ Ｓ３５部位を使用するヒトＵ２ＯＳ細胞のゲノムにわたるオフターゲット切断の不偏調査を生成した（表６）。
ＲＮＰを、１００ｕＭのヌクレアーゼを１２０ｕＭの合成ガイド及び１００ｕＭのＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）と混合することによって組み立てた。室温での１０分のインキュベーション後、ＲＮＰ複合体を、１００ｕＭのｄｓＯＤＮ及び２００，０００個の予め洗浄されたＵ２ＯＳ細胞と混合した。ＤＮ１００を備えたLonza SE Cell Line 4D-Nucleofector（商標）X Kitを、製造業者のプロトコルに従って使用して、細胞をエレクトロポレートした。エレクトロポレーションの７２時間後、細胞を溶解し、それらのゲノムＤＮＡ内容物を抽出した。次いで、対応するゲノム標的部位をＰＣＲによって増幅した。アンプリコンをＮＧＳに供し、次いで得られた配列を使用して、編集イベント及びｄｓＯＤＮ統合のパーセンテージを計算した（図３Ａ）。ＯＭＮＩ－１０３は、ＰＤＣＤ１ Ｓ４０及びＴＲＡＣ Ｓ３５部位でいかなるオフターゲット効果も示さなかった（図３Ｂ）。
表１．ＯＭＮＩヌクレアーゼ配列
表１は、ＯＭＮＩ名、その対応するヌクレアーゼタンパク質配列、そのＤＮＡ配列、そのヒト最適化ＤＮＡ配列、不活性化ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを生成するために置換される代替位置、不活性化ＨＮＨドメインを有するニッカーゼを生成するために置換される代替位置、並びに不活性化ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインを有する触媒的に不活性なヌクレアーゼを生成するために置換される代替位置を列挙する。列５～７に示されるアミノ酸位置の各々について、アスタリスクが続く場合を除き、任意の他のアミノ酸への置換が許容され、これはアスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ又はグルタミン酸（Ｅ）からアスパラギン酸（Ｄ）へ以外の任意の置換が不活性化をもたらすことを示す。
補足表１．ＯＭＮＩドメイン
補足表１は、ＯＭＮＩ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼについて特定された各ドメインのアミノ酸範囲を列挙する。例えば、ＯＭＮＩ－１０３のドメインＧは、配列番号１のアミノ酸７２８～７７８によって特定される。列挙されたアミノ酸範囲は、Smith-Watermanアルゴリズムを使用して生成された局所アラインメントの好ましい分析に基づくが、各ドメイン範囲の始め又は終わりは、最大５つのアミノ酸によって増加又は減少し得る。
表５．哺乳動物細胞における内因性の背景でのヌクレアーゼ活性
ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼは、ｓｇＲＮＡ発現プラスミドと一緒にＤＮＡトランスフェクションによって哺乳動物細胞系（ＨｅＬａ）において発現させた。部位特異的ゲノムＤＮＡ増幅及びＮＧＳに、細胞溶解物を使用した。インデルの割合を測定し、分析して編集レベルを決定した。
表７．ＯＭＮＩ－１０３ ＲＮＰを合成ｓｇＲＮＡ（Agilent）で組み立て、Ｕ２ＯＳ細胞にエレクトロポレートした。遺伝子名、スペーサー配列、及びスペーサー長は、ＮＧＳによって測定された編集レベル（インデル％）の横に示される。
表８．ＴＲＡＣ又はＢ２Ｍのいずれかを標的化する特定の合成ｓｇＲＮＡ分子（Agilent）でのＯＭＮＩ－１０３のエレクトロポレーションの３日後の、初代Ｔ細胞におけるＴＣＲ及びＢ２Ｍのタンパク質発現レベル。
実施例２：代替ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ－ＲＮＡ複合体
方法
ＯＭＮＩ－１０３タンパク質発現
簡潔には、上述のタンパク質発現方法と同様に、ヌクレアーゼオープンリーディングフレームをヒト細胞についてコドン最適化し、以下の要素－ＳＶ４０ ＮＬＳ－ＯＭＮＩ－１０３ ＯＲＦ（第２のアミノ酸ヒト最適化から）－ＨＡタグ－ＳＶ４０ ＮＬＳ－８ Ｈｉｓタグを有する修飾ｐＥＴ９ａプラスミドにクローニングした。この配列は、表４に見出すことができる。ＯＭＮＩ－１０３構築物をＫＲＸ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）において発現させた。細胞を、６．６６ｍＭのラムノース（０．５Ｍストックからの２６．４ｍｌ）及び０．０５％のグルコース（０．５Ｍからの２ｍｌ）の添加を有するＴＢ＋０．４％グリセロール中で増殖させた。タンパク質を、２０℃まで温度低下後４時間にわたる対数期中期において発現させた。化学溶解を使用して細胞を溶解させ、清浄された溶解物をＮｉ－ＮＴＡ樹脂上で精製した。Ｎｉ－ＮＴＡ溶出画分をＣＥＸ（SO3 fractogel）樹脂上で精製し、続いてSuperdex 200 Increase 10/300 GL、AKTA Pure（GE Healthcare Life Sciences）上でのＳＥＣ精製を行った。ＯＭＮＩ－１０３タンパク質を含む画分をプールし、３０ｍｇ／ｍｌストックに濃縮して、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。
使用される合成ｓｇＲＮＡ
ＯＭＮＩ－１０３の全ての合成ｓｇＲＮＡを、３’及び５’末端の３つの２’－Ｏ－メチル ３’－ホスホロチオエートを用いて合成した（Agilent又はSynthego）。
哺乳動物細胞株における活性
より短いｓｇＲＮＡバージョンでの編集を促進するＯＭＮＩ－１０３の能力を、ヒト細胞における特定のゲノム位置で試験した（表１０）。ＨｅＬａ細胞について、ＯＭＮＩ－１０３－Ｐ２Ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ発現ベクター（ｐｍＯＭＮＩ、表４）をｓｇＲＮＡ（ｐＳｈｕｔｔｌｅガイド－表４、スペーサー配列－表１０）と一緒にトランスフェクトした。
Ｕ２ＯＳ細胞について、ＲＮＰを、１００ｕＭのヌクレアーゼを１２０ｕＭの合成ガイド及び１００ｕＭのＣａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（ＩＤＴ）と混合することによって組み立てた。室温での１０分のインキュベーション後、ＲＮＰ複合体を、２００，０００個の予め洗浄されたＵ２ＯＳ細胞と混合し、ＤＮ１００プログラムを備えたLonza SE Cell Line 4D-Nucleofector（商標）X Kitを製造業者のプロトコルに従って使用してエレクトロポレートした。７２時間で細胞を溶解し、それらのゲノムＤＮＡ内容物をＰＣＲ反応に使用し、対応する推定ゲノム標的を増幅した。アンプリコンにＮＧＳを施し、次いで生じた配列を使用して、編集イベントの割合を計算した。
Ｔ細胞について、ＲＮＰを、１１３ｕＭのヌクレアーゼ及び１６０ｕＭの合成ガイドを混合し、室温で１０分間インキュベートすることによって組み立て、ＲＮＰ複合体を、２００，０００個の初代活性化Ｔ細胞と混合し、ＥＨ－１１５パルスコードで、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector TM X Kitを使用してエレクトロポレートした。３日及び８日後、細胞を採取し、ＣＤ３及び編集されたタンパク質発現をフローサイトメトリーによって測定した。
結果
ゲノム部位及び細胞型にわたる短いガイドの活性
ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼ活性を、より短いｓｇＲＮＡ足場での使用のために最適化した。５つの短いｓｇＲＮＡ足場を、テトラループ「ＧＡＡＡ」及びターミネーター領域の周りに最大４つの欠失を含有した、「Ｖ２」二本鎖バージョンに基づいて設計した（表９、図６Ａ～６Ｆ）。設計されたＶ２足場で表示された活性ＯＭＮＩ－１０３のレベルを試験するために、「ＴＲＡＣ－ｓ９１」又は「ＰＤＣＤ－ｓ４０」のガイド配列部分を有するｓｇＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。編集活性をＮＧＳ結果に基づいて計算した（図７）。全ての場合において、設計されたｓｇＲＮＡは、編集活性を可能にした。次のステップは、Ｕ２ＯＳ及び初代Ｔ細胞におけるＲＮＰとしてのＯＭＮＩ－１０３活性を試験することであった。ＯＭＮＩ－１０３を、Ｖ２、ｖ２．２、又はＶ２．３足場を有し、「ＴＲＡＣ－ｓ３５」又は「Ｂ２Ｍ－ｓ１２」のガイド配列部分を有するｓｇＲＮＡでエレクトロポレートした。編集活性は、ＮＧＳ結果に基づいて計算され、実証されたように、ＯＭＮＩ－１０３活性のレベルは、足場バリアントのいずれかと使用されるとき損なわれなかった（図８）。初代Ｔ細胞において、短い足場バリアントが利用されたとき、改善された活性が示された。
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Claims (81)

  1. 配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする配列を含む核酸分子を含む、天然に存在しない組成物。
  2. １つ以上のＲＮＡ分子、又は前記１つ以上のＲＮＡ分子のうちのいずれか１つをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを更に含み、前記１つ以上のＲＮＡ分子及び前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、一緒に天然に存在せず、前記１つ以上のＲＮＡ分子が、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成するように、かつ／又は前記複合体を標的部位に標的化するように構成されている、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子が、配列番号４～３６からなる群から選択される配列を含む、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子が、ガイド配列部分と、配列番号４～７及び１８～２１からなる群から選択される配列と、を含む、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子である、請求項３に記載の組成物。
  5. 配列番号８～１４、１７、２２～２８、及び３２からなる群に示される配列を含むトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子を更に含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子が、ガイド配列部分と、配列番号４～３６からなる群から選択される配列と、を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
  7. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、少なくとも１つのＲＮＡ分子が、ガイド配列部分と、少なくとも７９個のヌクレオチドの長さである足場部分と、を含む、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である、請求項２に記載の組成物。
  8. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｄ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換が、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位のうちのいずれか１つでのアミノ酸置換、及びＤ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位のうちのいずれか１つでのアミノ酸置換によって作製された触媒的に不活性なヌクレアーゼであり、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換が、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  11. ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む天然に存在しない組成物であって、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１のドメインＡ、ドメインＢ、ドメインＣ、ドメインＤ、ドメインＥ、ドメインＦ、ドメインＧ、ドメインＨ、ドメインＩ、又はドメインＪのうちの少なくとも１つのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を含み、
    ａ）ドメインＡが、配列番号１のアミノ酸１～４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｂ）ドメインＢが、配列番号１のアミノ酸４６～８３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｃ）ドメインＣが、配列番号１のアミノ酸８４～１５８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｄ）ドメインＤが、配列番号１のアミノ酸１５９～３０２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｅ）ドメインＥが、配列番号１のアミノ酸３０３～５１５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｆ）ドメインＦが、配列番号１のアミノ酸５１６～７２７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｇ）ドメインＧが、配列番号１のアミノ酸７２８～７７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｈ）ドメインＨが、配列番号１のアミノ酸７７９～９２３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｉ）ドメインＩが、配列番号１のアミノ酸９２４～１０６８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含み、
    ｊ）ドメインＪが、配列番号１のアミノ酸１０６９～１３４８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含む、組成物。
  12. 無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記細胞に、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物を導入することを含む、方法。
  13. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ＮＮＲＲＨＹ、ＮＮＲＡＣＴ、又はＮＮＲＶＣＴプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらし、かつ／又は前記ＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらす、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｄ１２、Ｅ７７６、Ｈ９８８、又はＤ９９１位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、前記ＰＡＭ配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらす、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、Ｄ８５６、Ｈ８５７、又はＮ８８０位でのアミノ酸置換によって作製されたニッカーゼであり、前記ＰＡＭ配列に相補的である配列に隣接するＤＮＡ鎖切断をもたらし、Ｄ８５６位でのアミノ酸置換が、アスパラギン酸（Ｄ）からグルタミン酸（Ｅ）へ以外の置換である、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記細胞が、ヒト細胞である、請求項１７に記載の方法。
  19. 天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記ＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含み、前記ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の存在下で、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に標的化し、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、前記ＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分又は第２のＲＮＡ分子のｔｒａｃｒＲＮＡ部分によってコードされる、組成物。
  20. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、最大１７個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１４～１７個のヌクレオチドの長さである、請求項１９に記載の組成物。
  21. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、配列番号１１４又は１１５と少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する、請求項１９又は２０に記載の組成物。
  22. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、配列番号１１４又は１１５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１９～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列が、配列番号１１５以外である、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分及び前記ガイド配列部分を含む前記ＲＮＡ分子が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を更に含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、ポリヌクレオチドリンカー部分によって前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分と共有結合している、請求項２４に記載の組成物。
  26. 前記組成物が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含む第２のＲＮＡ分子を含む、請求項１９～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１９～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ガイド配列部分が、１７～３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである、請求項１９～２７のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、前記ＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分の存在下で、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に標的化し、前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分及び前記ガイド配列部分が、前記ＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子によってコードされる、組成物。
  30. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、８５個未満のヌクレオチドの長さ、好ましくは８４～８０、７９～７５、７４～７０、６９～６５、又は６４～６０個のヌクレオチドの長さである、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも３０～４０％、４１～５０％、５１～６０％、６１～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する、請求項２９又は３０に記載の組成物。
  32. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１５又は１６のｔｒａｃｒ部分以外である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、最大１９個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１６～１９個のヌクレオチドの長さであるｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の組成物。
  35. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項２９～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項２９～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１１７以外の配列を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項２９～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記ＲＮＡ分子が、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分を含み、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を更に含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、ポリヌクレオチドリンカー部分によって前記ｃｒＲＮＡリピート配列と共有結合している、請求項２９～３８のいずれか一項に記載の組成物。
  40. 前記ポリヌクレオチドリンカー部分が、４～１０個のヌクレオチドの長さである、請求項３９に記載の組成物。
  41. 前記ポリヌクレオチドリンカーが、ＧＡＡＡの配列を有する、請求項４０に記載の組成物。
  42. 前記組成物が、ｃｒＲＮＡリピート配列部分及びガイド配列部分を含む第２のＲＮＡ分子を更に含む、請求項２９～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性である、請求項２９～４２のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記ガイド配列部分が、１７～３０個のヌクレオチドの長さ、好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである、請求項２９～４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 天然に存在しないＲＮＡ分子を含む組成物であって、前記ＲＮＡ分子が、ＲＮＡ足場部分を含み、前記ＲＮＡ足場部分が、
    ｃｒＲＮＡリピート配列部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有し、
    前記ＲＮＡ足場部分が、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、前記ＲＮＡ分子のガイド配列部分と相補性を有するＤＮＡ標的部位に標的化する、組成物。
  46. 前記ＯＭＮＩ－１０３ヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５に記載の組成物。
  47. 前記ＲＮＡ足場部分が、１１０～１０５、１０４～１００、９９～９５、９４～９０、８９～８５、８４～８０、７９～７５、又は７４～７０個のヌクレオチドの長さである、請求項４５又は４６に記載の組成物。
  48. 前記ＲＮＡ足場部分が、１０７、１０１、９５、８５、又は７９個のヌクレオチドの長さである、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記ＲＮＡ足場部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つと少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の組成物。
  50. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、最大１７個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１４～１７個のヌクレオチドの長さである、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、配列番号１１４又は１１５と少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分が、配列番号１１４又は１１５のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５～５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記ｃｒＲＮＡリピート配列が、配列番号１１５以外である、請求項４５～５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、８５個未満のヌクレオチドの長さ、好ましくは８４～８０、７９～７５、７４～７０、６９～６５、又は６４～６０個のヌクレオチドの長さである、請求項４５～５３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも３０～４０％、４１～５０％、５１～６０％、６１～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有する、請求項４５～５４のいずれか一項に記載の組成物。
  56. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのｔｒａｃｒＲＮＡ部分と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５～５５のいずれか一項に記載の組成物。
  57. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１５又は１６のｔｒａｃｒＲＮＡ部分以外である、請求項４５～５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. 前記ＲＮＡ足場部分が、前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分との間にリンカー部分を更に含み、その結果、前記ＲＮＡ足場が、
    ｃｒＲＮＡリピート配列部分－リンカー部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有する、請求項４５～５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含み、前記ｃｒＲＮＡリピート配列及び前記ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分が、前記リンカー部分によって共有結合している、請求項４５～５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記リンカー部分が、４～１０個のヌクレオチドの長さであるポリヌクレオチドリンカーである、請求項５９に記載の組成物。
  61. 前記ポリヌクレオチドリンカーが、ＧＡＡＡの配列を有する、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、最大１９個のヌクレオチドの長さ、好ましくは１６～１９個のヌクレオチドの長さであるｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項４５～６１のいずれか一項に記載の組成物。
  63. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも６０～７０％、７１～８０％、８１～９０％、９１～９５％、又は９６～９９％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項４５～６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、配列番号１１６又は１１７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列部分を含む、請求項４５～６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート配列が、配列番号１１７以外である、請求項４５～６４のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、前記ｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート部分と連結された第１のヌクレオチドの区画を含み、前記第１のヌクレオチドの区画が、配列番号１１８～１２０のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５～６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ部分が、第１のヌクレオチドの区画と連結された第２のヌクレオチドの区画を含み、前記第２のヌクレオチドの区画が、配列番号１２１～１２４のうちのいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項４５～６６のいずれか一項に記載の組成物。
  68. 前記ＲＮＡ足場部分が、配列番号１０９～１１３のうちのいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４５～６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. 前記ＲＮＡ足場部分が、Ｖ２、Ｖ２．１、Ｖ２．２、Ｖ２．３、Ｖ２．４、又はＶ２．５ ＲＮＡ足場のうちのいずれか１つの予測される構造を有する、請求項４５～６８のいずれか一項に記載の組成物。
  70. 前記ＲＮＡ足場部分が、配列番号１５又は１６以外の配列を有する、請求項４５～６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. ガイド配列部分が、前記ＲＮＡ分子の前記ｃｒＲＮＡリピート配列部分と共有結合して、
    ガイド配列部分－ｃｒＲＮＡリピート配列部分－ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の構造を有する単一ガイドＲＮＡ分子を形成する、請求項４５～７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 前記ガイド配列部分が、１７～３０個のヌクレオチド、より好ましくは２０～２３個のヌクレオチド、より好ましくは２２個のヌクレオチドの長さである、請求項４５～７１のいずれか一項に記載の組成物。
  73. ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを更に含み、前記ＯＭＮＩ－１０３ ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項４５～７２のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 前記ＲＮＡ分子が、インビトロ転写（ＩＶＴ）又は固相人工オリゴヌクレオチド合成によって形成される、請求項１～７３のいずれか一項に記載の組成物。
  75. 前記ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項７４に記載の組成物。
  76. 請求項１～７５のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子をコードする、ポリヌクレオチド分子。
  77. 無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾する方法であって、前記系又は細胞に、請求項１～７５のいずれか一項に記載の組成物を導入することを含む、方法。
  78. 前記細胞が、真核細胞又は原核細胞である、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記真核細胞が、ヒト細胞又は植物細胞である、請求項７８に記載の方法。
  80. 無細胞系又は細胞のゲノムにおけるＤＮＡ標的部位のヌクレオチド配列を修飾するためのキットであって、前記系又は細胞に、請求項２～７５のいずれか一項に記載の組成物、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びＲＮＡ分子及び前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを前記細胞に送達するための説明書を導入することを含む、キット。
  81. 本出願において開示される１つ以上の要素によって特徴付けられる、組成物、方法、生成物、プロセス、システム、キット、又は使用。
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