KR20240043792A - 조작된 고충실도 omni-50 뉴클레아제 변이체 - Google Patents

조작된 고충실도 omni-50 뉴클레아제 변이체 Download PDF

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KR20240043792A
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라피 엠마누엘
리아트 록카
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에멘도바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 특히 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 포함하는 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)을 갖는 비-천연 OMNI-50 뉴클레아제 변이체: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, V981, K965 및 K1036.

Description

조작된 고충실도 OMNI-50 뉴클레아제 변이체
본 출원은 2022년 4월 20일자로 출원된 미국 가출원 제63/333,037호, 2022년 4월 18일자로 출원된 미국 가출원 제63/332,214호, 및 2021년 8월 12일자로 출원된 미국 가출원 제63/232,571호의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 내용은 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 출원 전반에 걸쳐, 괄호 안에 언급된 것을 포함하여, 다양한 간행물이 언급된다. 본 출원에서 그 전체로 언급된 모든 간행물의 개시는 본 발명이 속하는 기술 분야 및 본 발명과 함께 이용될 수 있는 당해 기술 분야의 특징에 대한 추가적인 설명을 제공하기 위해 본 출원에 참조에 의해 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 파일의 크기가 288 킬로바이트이고, MS-윈도우와 운영 시스템 호환성을 갖는 IBM-PC 머신 형식으로 2022년 8월 12일자로 작성된, 파일명이 "220812_91722-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.xml"인 파일에 존재하는 뉴클레오티드 서열을 참조에 의해 포함하고, 이는 본 출원의 일부로 2022년 8월 12일자로 제출된 텍스트 파일에 포함되어 있다.
표적화 게놈 변형(targeted genome modification)은 병원성 유전적 변이의 효과를 역전시키는 데 사용할 수 있는 강력한 도구이므로 인간 유전 질환에 대한 새로운 치료법을 제공할 수 있는 잠재력을 갖는다. 조작된 ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease), 및 가장 최근에는 CRISPR/Cas와 같은 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제를 포함한 현재의 게놈 조작(genome engineering) 도구는 게놈에서 서열 특이적 DNA 절단을 생성한다. 게놈 서열의 변형은 다음 단계에서 발생하며 새로 형성된 DNA 절단에 반응하여 촉발된 세포 DNA 복구 메커니즘(cellular DNA repair mechanism)의 활성의 산물이다. 이러한 메커니즘은 예를 들어, (1) 절단의 양 말단이 신속하지만 부정확한 방식으로 함께 라이게이션되는 고전적 비상동성 말단 연결(non-homologous end-joining: NHEJ)(즉, 종종 작은 삽입 또는 결실의 형태로 절단(cleavage) 부위에서 DNA의 돌연변이를 초래함) 또는 (2) 온전한(intact) 상동성 DNA 공여체를 사용하여 절단 부위 주변의 DNA를 정확한 방식으로 교체하는 상동성 기반 복구(homology directed repair: HDR)를 포함한다. 효율적이고 안전한 게놈 편집을 위해서는 초기 DNA 손상 유도자(inducer)의 최소 오프타겟(off-target) 활성이 요구된다.
발명의 요약
변경되고 개선된 표적 특이성을 갖는 조작된 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/CRISPR-관련 OMNI-50 뉴클레아제 및 게놈 공학, 후성유전체 공학(epigenomic engineering), 게놈 표적화, 게놈 편집 및 시험관 내 진단에서의 그의 용도가 본원에 개시된다.
일부 구체예에서, 야생형 OMNI-50 뉴클레아제와 비교하여 증가된 특이성을 갖는 OMNI-50 뉴클레아제의 변이체 및 개선된 변이체를 사용하는 방법이 제공된다. 유리하게는, 조작된 변이체 OMNI-50 뉴클레아제가 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성인 경우, CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제가 활성인 야생형 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 감소된 오프타겟(off-target) 편집 활성 및 유지된 온타겟(on-target) 편집 활성을 나타낸다. 예를 들어, 조작된 변이체 OMNI-50 뉴클레아제는 개선된 대립유전자 특이적 구별(allele-specific discrimination), 예를 들어 표적화된 대립유전자에만 존재하고 비표적화된 대립유전자에는 존재하지 않는 이형접합성 SNP를 함유하는 표적 영역에서 특이적 결합 및 활성을 나타낼 수 있다.
일부 구체예에서, 야생형 OMNI-50 닉카아제(nickase)와 비교하여 특이성이 증가된 OMNI-50 닉카아제의 변이체가 제공된다. 일부 구체예에서, 야생형 OMNI-50 데드 뉴클레아제(OMNI-50 dead nuclease)와 비교하여 특이성이 증가된 OMNI-50 데드 뉴클레아제의 변이체가 제공된다. 예를 들어, 본원에 제공된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 중 어느 하나의 촉매 부위는 변이체가 닉카아제 활성을 갖고, 단일 가닥 DNA 절단을 수행할 수 있도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 본원에 제공된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 중 어느 하나의 촉매 부위는 변이체가 뉴클레아제 활성을 갖지 않도록, 즉 데드 뉴클레아제가 되도록 변형될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 OMNI-50 뉴클레아제 단백질의 변이체가 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 하기 위치: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981 및 K1036 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 비-천연(non-naturally occurring) OMNI-50 뉴클레아제 변이체가 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, DNA 표적 부위를 표적으로 하는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한(complexed) 본원에 개시된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 중 어느 하나를 포함하는 CRISPR 시스템으로서, 상기 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질과 가이드 RNA 분자를 포함하는 야생형 CRISPR 시스템와 비교하여 감소된 오프타겟 편집 활성을 나타내는 것인 CRISPR 시스템이 제공된다.
일부 구체예에서, 상기 OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제(서열번호 1)와 비교하여 OMNI-50 변이체를 표적 부위로 표적화하는 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 표적 부위에 대한 증가된 특이성을 나타낸다.
일부 구체예에서, 상기 OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 하기 표의 컬럼 1에 CRISPR 뉴클레아제에 대해 제공된 위치에서 아미노산 치환에 의해 생성된 불활성화된 RuvC 도메인을 갖는 닉카아제이다. 일부 구체예에서, 닉카아제는 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 추가로 포함한다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981 및 K1036.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 하기 표의 컬럼 2에서 CRISPR 뉴클레아제에 대해 제공된 위치에서 아미노산 치환에 의해 생성된 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 닉카아제이다. 일부 구체예에서, 닉카아제는 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 추가로 포함한다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981 및 K1036.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 하기 표의 컬럼 3에서 CRISPR 뉴클레아제에 대해 제공된 위치에서 치환에 의해 생성된 불활성화된 RuvC 도메인 및 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 촉매 활성이 상실된 데드 뉴클레아제(catalytically dead nuclease)이다. 일부 구체예에서, 촉매 활성이 상실된 데드 뉴클레아제는 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 포함한다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981, 및 K1036.
전술된 표는 불활성화된 RUVC 도메인을 갖는 닉카아제를 생성하기 위해 치환될 대안적 위치, 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 닉카아제를 생성하기 위해 치환될 대안적 위치, 및 불활성화된 RUVC 및 HNH 도메인을 갖는 촉매 활성이 상실된 데드 뉴클레아제를 생성하기 위해 치활될 대안적 위치를 열거한다. 아스파르트산(D)의 글루탐산(E)으로의 치환, 또는 글루탐산(E)의 아스파르트산(D)으로의 치환이 아닌 치환은 불활성화를 초래한다는 것을 나타내는 별표가 이어진 경우를 제외하고, 컬럼 1-3에 표시된 아미노산 위치 각각에 대해 임의의 다른 아미노산으로의 치환이 허용된다.
본문 전반에 걸쳐, OMNI-50 뉴클레아제 변이체가 언급되나, 이들 변이체는 닉카아제 활성(즉, 이중 가닥 절단과 대조적으로, 단일 가닥 DNA 절단을 생성하는 뉴클레아제)을 갖거나 뉴클레아제 활성을 갖지 않도록(즉, 촉매 활성이 상실된 데드 뉴클레아제) 변형될 수 있다.
따라서, sgRNA-프로그래밍된 방식(sgRNA-programmed manner)으로 DNA에 특이적으로 결합하는 능력을 여전히 유지하면서 뉴클레아제 활성을 변형하거나 제거하기 위해 본원에 기술된 변이체 중 어느 하나에 점 돌연변이가 도입될 수 있다. 이러한 변이체 중 어느 하나는 가이드 RNA 분자를 통해 원하는 DNA 표적 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 변이체-가이드 복합체(variant-guide complex)는 또한 복합체에 부착된 모든 분자를 표적 부위로 운반할 것이다. 따라서, 본 개시내용은 또한 이러한 변이체 및 DNA 변형 도메인(예를 들어, 데아미나아제, 뉴클레아제, 닉카아제, 재조합효소, 메틸트랜스퍼라아제, 메틸라아제, 아세틸라아제, 아세틸트랜스퍼라아제, 전사 활성자(transcriptional activator), 또는 전사 억제자 도메인)을 포함하는 융합 단백질, 및 질병과 관련된 게놈(예를 들면, 인간 대상체의 게놈)의 돌연변이를 교정하거나 유전자의 발현을 감소시키거나 막기 위해 게놈(예를 들면, 인간 게놈)에 돌연변이를 생성하는데 있어서 이러한 융합 단백질의 용도를 고려한다.
일부 구체예에서, 본원에 제공된 임의의 변이체는 효소 활성을 갖는 단백질에 융합될 수 있다. 일부 구체예에서, 효소 활성은 표적 DNA를 변형시킨다. 일부 구체예에서, 효소 활성은 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라아제 활성, 데메틸라아제(demethylase) 활성, DNA 복구 활성, DNA 손상 활성, 탈아민화(deamination) 활성, 디스뮤타아제(dismutase) 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라아제 활성, 트랜스포사아제(transposase) 활성, 재조합효소 활성, 폴리머라아제 활성, 리가아제 활성, 헬리카아제 활성, 포토리아제(photolyase) 활성 또는 글리코실라아제 활성이다. 일부 경우에, 효소 활성은 뉴클레아제 활성이다. 일부 경우에, 뉴클레아제 활성은 표적 DNA에 이중 가닥 절단을 도입한다. 일부 경우에, 효소 활성은 표적 DNA와 연관된 표적 폴리펩티드를 변형시킨다. 일부 경우에, 효소 활성은 메틸트랜스퍼라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 아세틸트랜스퍼라아제 활성, 탈아세틸화효소 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성, 탈아데닐화 활성, SUMO일화(SUMOylating) 활성, 탈SUMO일화(deSUMOylating) 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화(demyristoylation) 활성이다. 일부 경우에, 표적 폴리펩티드는 히스톤이고, 효소 활성은 메틸트랜스퍼라아제 활성, 데메틸라아제 활성, 아세틸트랜스퍼라아제 활성, 데아세틸라아제 활성, 키나아제 활성, 포스파타아제 활성, 유비퀴틴 리가아제 활성 또는 탈유비퀴틴화 활성이다.
따라서, OMNI-50 뉴클레아제, 닉카아제 또는 데드 뉴클레아제(dead-nuclease) 변이체 중 임의의 하나는 데아미나제와 같은 염기교정 유전자가위(base editor), 역전사효소(예를 들면, 프라임 편집(prime editing)에서의 용도를 위한 역전사 효소, Anzaolone et al.(2019) 참조), DNA의 메틸화 상태를 변형하는 효소(예를 들면, 메틸트랜스퍼라아제) 또는 히스톤 변형제(예를 들면, 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제)를 포함하나, 이에 한정되지 않는 또 다른 DNA 조정(modulating) 또는 DNA 변형 효소에 융합될 수 있다(예를 들면, 직접 융합되거나 링커를 통해 융합될 수 있다). 실제로, 본원에 기술된 OMNI-50 뉴클레아제, 닉카아제, 불활성 변이체는 DNA 변형 효소 또는 그의 이펙터(effector) 도메인에 융합될 수 있다. DNA 변형제(DNA modifier)의 예는 데아미나아제, 뉴클레아제, 닉카아제, 재조합효소, 메틸트랜스퍼라아제, 메틸라아제, 아세틸라아제, 아세틸트랜스퍼라아제, 역전사효소, 헬리카아제, 인테그라아제, 리가아제, 트랜스포사아제, 데메틸라아제, 포스파타아제, 전사 활성자 또는 전사 억제자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 본원에 제공된 임의의 OMNI-50 변이체는 효소 활성을 갖는 단백질에 융합된다. 일부 구체예에서, 효소 활성은 표적 DNA 분자를 변형시킨다. 본원에 기술된 OMNI-50 변이체 또는 그의 융합 단백질은 질병과 관련된 유전자에서 하나 이상의 돌연변이를 교정 또는 생성하기 위해, 또는 유전자 발현을 증가, 교정, 감소 또는 방지하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, DNA 표적 부위를 본원에 기술된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 단백질 중 어느 하나를 포함하는 활성 CRISPR 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 오프타겟 편집 활성이 감소된 유전자 편집 방법이 제공된다.
일부 구체예에 따르면, 표적 부위 유전자좌(target site locus)를 본원에 기술된 변이체 중 어느 하나의 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질을 포함하는 활성 CRISPR 시스템과 접촉시키는 단계로서, 상기 활성 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질을 갖는 야생형 CRISPR 시스템과 비교하여 감소된 오프타겟 편집 활성 및 유지된 온타겟 편집 활성을 나타내는 것인 단계를 포함하는, 감소된 오프타겟 편집 활성 및/또는 증가된 온타겟 편집 활성을 갖는 유전자 편집 방법이 제공된다.
본 발명의 추가적인 실시예 및 적용 가능성의 전체 범위는 하기에 주어지는 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 이 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 발명의 바람직한 구체예를 나타내나, 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1: 뉴클레아제 최적화 플랫폼을 보여주는 개략도가 표시된다. 합리적인 설계와 무작위 돌연변이 유발의 조합을 이용하여 뉴클레아제 변이체의 라이브러리를 생성하고, 뒤이어 특화된 선택 분석(specialized selection assay)을 이용하여 활성, 특이성, 다중화(multiplexing)(및 기타 원하는 특성)에 대한 선택을 수행한다.
도 2: 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 및 그의 변이체의 활성 및 충실도(fidelity)를 테스트하는 데 사용된 ELANE 유전자 및 표적 부위의 개략도이다. "Alt" 및 "ref"는 각각 SNP의 "alt" 버전 또는 SNP의 "ref" 버전을 갖는 대립유전자의 SNP 위치로 뉴클레아제를 표적화하는 가이드 RNA 분자를 나타낸다.
도 3a-3b: OMNI-50 뉴클레아제가 최적화에 의해 개선될 수 있다는 것을 보여주는, 야생형 OMNI-50 뉴클레아제의 대립유전자 특이성 및 오프타겟 효과. 도 3a: 야생형 OMNI-50 alt 조성물로 편집된 HSC가 대체 대립유전자(alternative allele)의 제거를 보였으나, 대조 대립유전자(reference allele)는 그대로 유지되었다는 것을 보여준다. 그러나, 야생형 OMNI-50 ref 조성물에 의한 편집은 대조 대립유전자의 감소 및 대체 대립유전자의 부분적인 보존을 초래하여, 차등적이나, 완전하지는 않은 대립유전자 특이적 편집을 제공했다. 도 3b: 불변(constant) 가이드(Sg(constant)), 대조 가이드(Sg(ref)) 및 대체 가이드(Sg(alt))에 대해 확인된 오프타겟에 대한 HD(healthy donor) 및 ESCN-2(환자)의 편집된 HSC(RNP(ref) 또는 RNP(alt))의 rhAmpseq 분석. 결과는 야생형 OMNI-50이 표적-특이적 편집을 보장하기 위해 제거되어야 하는 각 가이드에 대한 하나의 오프타겟(off-target)을 갖는다는 것을 나타낸다. RNPref 처리된 HSC의 % 편집이 상단 패널에 표시되고; RNPalt 처리된 HSC의 % 편집이 하단 패널에 표시된다. 통계적 유의성은 **P<.01, ****P<.0001로 표시된다.
도 4a-4c: 최적화된 변이체는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제와 비교하여 개선된 대립유전자 특이성 및 유사한 활성을 나타낸다. 도 4a: 야생형 OMNI-50 또는 최적화된 변이체로 편집된 건강한 HSC에서 대립유전자 특이성을 결정했다. 변이체는 야생형 OMNI-50에 비해 탁월한 대립유전자 구별(discrimination)을 나타낸다. 구체적으로, ddPCR로 측정한 sgRNA-564DS-ref 또는 sgRNA-564DS-alt를 사용한 대립유전자 특이적 편집을 나타내는 그래프가 표시된다. 편집 특이성은 대체 대립유전자를 결합하는 FAM 프로브와 대조 대립유전자를 결합하는 HEX 프로브라는 2종의 경쟁적 프로브에 의해 결정되며, 편집된 대립유전자의 감소 신호를 좌우한다. 이형접합체 미처리 세포(heterozygote untreated cell)의 대체 대립유전자에 대한 대조 대립유전자의 농도 사이의 비율은 1이다. 그래프는 각 gDNA 샘플에 대한 내인성 유전자 대조군 RPP30 및 STAT1에 대해 정규화된 대조 대립유전자(HEX), 대체 대립유전자(FAM)의 평균 농도를 나타낸다. 도 4b: 야생형 OMNI-50(WT OMNI-50) 또는 최적화된 변이체로 편집된 건강한 HSC에서 % 절제(excision)을 측정하였다. 변이체 3795는 WT OMNI-50과 비교하여 유사한 활성을 보인다. 변이체 3795는 활성을 저하시키지 않으면서 가장 높은 대립유전자 특이성을 나타냈다. 도 4c: 알려진 OMNI-50 뉴클레아제 오프표적에 특이적인 차세대 서열(NGS) 분석을 통해 변이체 충실도(variant fidelity)를 측정했다. 모든 변이체는 높은 충실도를 나타냈다는 것이 주목된다.
도 5a-5b: 불변(constant) 가이드(Sg(constant)), 대조 가이드(Sg(ref))(RNP(ref), 도 5a) 및 대체 가이드(Sg(alt)) 분자(RNP(alt)), 도 5b) 에 대해 확인된 오프표적에 대한 WT OMNI-50 또는 변이체 3795 뉴클레아제를 사용하여 편집된 건강한 HSC의 rhAmpSeq 분석. 도 5c는 WT OMNI-50 또는 변이체 3795 뉴클레아제를 포함하는 HSC 샘플에서 3개의 서로 다른 가이드 분자(g35, g62Ref 또는 g62Alt)를 사용한 경우 오프표적을 검사하여 변이체 3795 뉴클레아제의 충실도가 입증된다는 것을 검증하는 추가 결과를 보여준다(도 5c). 이러한 결과는 WT OMNI-50 뉴클레아제를 사용할 때 각 가이드에 대해 강력한 검증된 오프타겟 효과가 있지만 변이체 3795 뉴클레아제에서는 오프타겟 효과가 검증되지 않았다는 것을 보여주어, 변이체 3795 뉴클레아제가 WT OMNI-50 뉴클레아제 대비 오프타겟을 제거한다는 것을 나타낸다.
도 6a-6c: ELANE의 단일 대립유전자 절제(mono-allelic excision)는 호중구 분화를 회복시킨다. 도 6a: 호중구 분화를 회복시키기 위한 유전자 편집 처리의 개략도. 도 6b: 표적 돌연변이 대립유전자에서만 생체 외 편집되고 성숙한 호중구로 분화된 건강한 공여자(HD-2) 및 환자 유래(ESCN-2) HSC를 보여주는 유세포 분석. 도 6c: 도 6b에 표시된 데이터의 정량화.
도 7a: 흑색 역삼각형으로 도시된 SCN과 연관된 대표적인 이형접합성 돌연변이의 위치를 보여주는 ELANE의 5개 엑손 및 4개 인트론의 선형 표현. Makaryan 등에 기반한다(도 7b, I-III). 대부분의 ELANE 돌연변이 및 공통 절단 부위(common cut site)(회색 역삼각형)와 연관된 3개의 확인된 SNP(백색 역삼각형)의 개략도로, 이를 기반으로 3개의 대립유전자 특이적 sgRNA 가이드 및 불변 가이드가 설계되어, 3개의 단일 대립유전자 절제 전략을 나타낸다.
도 8a-8g: OMNI 변이체 3795 뉴클레아제 조성물의 대립유전자 특이성 및 절제 효율. 도 8a: 실험 작업 흐름(workflow)을 묘사하는 개략도(scheme). 건강한 공여자 및 SCN 환자로부터의 HSC를 RNP로 전기천공하거나 또는 처리하지 않고, 뒤이어 CD34+ 확장 배지에서 3일 동안 회복시켰다. 그후, 세포를 증식 및 골수 전구세포 분화를 위해 IL-3, SCF, GMCSF 및 GCSF와 함께 7일 동안 배양하고, 뒤이어 호중구 분화를 위해 GCSF에서 7일 동안 배양하여 분화시켰다. 도 8b: ddPCR로 측정한, RNP(ref) 조성물로 처리하거나 또는 처리하지 않은(NT) 건강한 공여자(HD-V3) 또는 SCN 환자(SCN-P41)로부터 채취한 HSC의 분화 6일 차에 미편집(un-editied) 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. 각 대립유전자 농도의 평균은 내인성 유전자 대조군 RPP30 및 STAT1에 대해 정규화되었고, 미처리(non-treated: NT) 세포에 대해 상대적으로 제시되었다. (n=HD-V3 건강한 공여자/SCN-P41 환자 공여자로부터의 세포 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음(not statistically significant)으로 표시된다. 도 8c: ddPCR로 측정한, 건강한 공여자(HD-V3)(미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref) 처리(회색)), 또는 SCN 환자(SCN-P41)(미처리(NT, 백색) 또는 RNP(ref) 처리(진한 사선(dark oblique lines))로부터 채취한 HSC에서 분화 6일 및 14일차의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프(n=HD-V3 건강한 공여자/SCN-P41 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 **P<.01, ****P<.0001로 표시된다. 도 8d: 돌연변이 부위를 표적으로 하는 차세대 염기서열 분석(NGS)으로 측정된, RNP(ref) 조성물로 처리되거나 처리되지 않은(NT) SCN-P41 환자 HSC로부터 채취한 cDNA의 야생형(흑색) 및 돌연변이(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=SCN-P41 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001로 표시된다. 도 8e: ddPCR로 측정한, RNP(alt) 조성물로 처리되거나 처리되지 않은(NT) SCN 환자(SCN-P55)로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차에 미편집 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. 각 대립유전자 농도의 평균은 내인성 유전자 대조군 RPP30 및 STAT1에 대해 정규화되었으며, 미처리 세포에 대해 상대적으로 제시되었다. (n=SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 도 8f: ddPCR로 측정한, SCN 환자(SCN-P55)로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차 및 14일차 절제의 백분율을 나타내는 막대 그래프: 미처리(NT, 백색) 또는 RNP(alt) 처리(진한 사선). (n=SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001,****P<.0001로 표시된다. 도 8g: 돌연변이 부위를 표적으로 하는 NGS에 의해 측정한, RNP(alt) 조성물로 처리되거나 처리되지 않은(NT) SCN-P55 환자 HSC로부터 채취한 cDNA의 야생형(흑색) 및 돌연변이(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=SCN-P55 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001로 표시된다. 도 8h: 각각 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref)/RNP(alt) 처리된(절제(Excised), 회색) SCN-P41 및 SCN-P55 환자의 분화된 HSC 6일차에서 ELANE mRNA 수준을 나타내는 막대 그래프. 데이터는 NT 그룹과 관련하여 제시된다. (n=SCN-P41 및 SCN-P55 환자의 세포 3개 그룹). 통계적 유의성은 *P<.05로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 9a-9k: OMNI Variant 3795-촉진 편집은 시험관 내에서 호중구 분화 및 성숙을 증진시킨다. 도 9a: 호중구(CD66b+) 및 단핵구(CD14+/CD66b-) 서브세트에 대해 분석한, 미처리(NT, 왼쪽 패널) 및 RNP(ref) 처리(오른쪽 패널) 건강한 공여자(HD-V3, 상부 패널) 및 SCN-P41 환자(하부 패널) 분화 HSC의 대표적인 FACS 플롯. 도 9b: 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref)로 처리된(회색) 건강한 공여자(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P41) 분화된 HSC에서 호중구(CD66b+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V3 건강한 공여자/SCN-P41 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 도 9c: 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref)로 처리된(회색) 건강한 공여자(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P41) 분화된 HSC에서 단핵구(CD14+/CD66b- 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V3 건강한 공여자/SCN-P41 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 도 9d: 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref)로 처리된(회색) 건강한 공여자(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P41) 분화된 HSC에 의한 자이모산 그린(Zymosan Green) 흡수의 백분율의 정량화. ns = 통계적으로 유의하지 않음. 도 9e: 그래프는 박테리아 세포 단독 대조군(대장균, 원) 대비, 건강한 미처리(HD-V3, NT; 정사각형) 또는 환자 RNP(Ref) 처리(SCN-P41, RNP(ref); 삼각형) HSC로부터의 분화된 호중구와 함께 인큐베이션된 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포로부터의 발광, RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 나타낸다. RLU 수준이 안정기(plateau)에 도달했을 때 제시된 마지막 시점에서 대장균 대조군 대비 각 그룹에 대한 통계적 유의성이 *P<.05, **P<.01로 표시된다. 도 9f: 호중구(CD66b+) 및 단핵구(CD14+/CD66b-) 서브세트에 대해 분석된, 미처리 건강한 공여자(HD-V4 NT, 왼쪽 패널), 미처리 SCN 환자(SCN-P55 NT, 중간 패널) 및 RNP(alt) 처리 SCN 환자(오른쪽 패널)로부터의 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. 도 9g: 미처리 건강한 공여자(HD-V4, NT; 흑색) 및 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(alt)(회색)로 처리된 SCN 환자(SCN-P55)로부터의 분화된 HSC에서 호중구(CD66b+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V4 건강한 공여자/SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 도 9h: 미처리 건강한 공여자(HD-V4, NT; 흑색) 및 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(alt)(회색)로 처리된 SCN 환자(SCN-P55)로부터의 분화된 HSC에서 단핵구(CD14+/CD66b- 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V4 건강한 공여자/SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 도 9i: RNP(alt)로 처리되거나 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(SCN-P55 Mock) P55 SCN 환자 유래 분화된 HSC의 Diff-Quik 염색. Nikon DSLR 디지털 카메라를 사용하여 400X 배율로 LEITZ LABORLUX S 편광 현미경에서 현미경 사진을 촬영했다. 도 9j: 미처리 건강한 공여자(HD-V4, NT; 흑색) 및 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(alt)(회색)로 처리된 SCN 환자(SCN-P55)로부터의 분화된 HSC에 의한 자이모산 그린(Zymosan Green) 흡수의 백분율의 정량화. (n=HD-V4 건강한 공여자/SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 *P<.05로 표시된다. 도 9k: 그래프는 박테리아 세포 단독 대조군(대장균, 원) 대비, 건강한 미처리(HD-V4, NT; 정사각형) HSC 및 환자 RNP(alt) 처리(SCN-P55, RNP(alt); 삼각형) HSC로부터의 분화된 호중구와 함께 인큐베이션된 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포로부터의 발광, RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 나타낸다. RLU 수준이 안정기에 도달했을 때 제시된 마지막 시점에서 대장균 대조군 대비 각 그룹에 대한 통계적 유의성이 *P<.05, **P<.001로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 10a-10b: 3개의 SNP에 의한 환자 및 건강한 (공여자) 집단의 이형접합성 빈도 및 커버리지(coverage). 도 10a: 건강한(왼쪽) 집단 또는 환자(오른쪽) 집단에서 3개의 선택된 SNP 각각의 이형접합성 빈도. 이형접합성 빈도는 3개의 SNP 각각에서 건강한 집단과 환자 집단 간에 유사했다. rs10414837, p 값=0.126, 오즈비(Odds ratio)= 0.653; rs3761005, p 값=0.9615, 오즈비=1.014; rs1683564, p 값=0.9475, 오즈비=1.019, 모두 카이제곱(Chi-square)으로 분석되었다. 도 10b: 건강한(왼쪽) 또는 환자(오른쪽) 집단에서 3개의 선택된 SNP(회색) 중 적어도 하나에 대해 이형접합성인 집단의 비율을 나타내는 파이 차트(pie chart). 3개의 SNP에 의한 건강한 집단과 환자 집단의 유사한 커버리지(75% 초과, p 값= 0.1285, 오즈비= 0.56, 카이제곱).
도 11: SCN-P41 및 SCN-P55 환자에서의 돌연변이-SNP 연관 결정. 돌연변이 부위 및 rs1683564 SNP의 시퀀싱 분석에 대한 전기영동도. SCN-P41 환자는 SNP의 대조 형태(C, 시토신)와 동일한 대립유전자에 돌연변이가 있는 반면, SCN-P55 환자는 SNP의 대체 형태(A, 아데노신)와 동일한 대립유전자에 돌연변이가 있다.
도 12: RNP(ref) 및 RNP(alt) 조성물에 의한 동일한 편집 결과. ELANE 유전자는 두 위치에서 절단된다: 1) sgRNA(constant) 가이드에 의해 가이드되는 이중대립유전자 부위(biallelic site)인 인트론 4 및 2) 돌연변이 부위에 대한 연관에 따라, sgRNA(ref) 또는 sgRNA(alt)에 의해 가이드되는 단일 대립유전자 부위인 이형접합 SNP 부위, rs1683564. 돌연변이가 SNP의 대조 형태(C, 시토신)를 갖는 대립유전자에 위치하는 경우, 뉴클레아제, sgRNA(ref) 및 sgRNA(constant)를 포함하는 RNP(ref) 조성물이 선택되고, 돌연변이를 포함하는 섹션이 대조 대립유전자(환자 A, 상단 패널)로부터 절단된다. 돌연변이가 SNP의 대체 형태(A, 아데노신)를 갖는 대립유전자에 위치하는 경우, 뉴클레아제, sgRNA(alt) 및 sgRNA(constant)를 포함하는 RNP(alt) 조성물이 선택되고, 돌연변이를 포함하는 섹션이 대체 대립유전자(환자 B, 하단 패널)에서 절단된다. BioRender.com으로 작성된 삽화.
도 13a-13c: 절제 후 역위(inversion) 사건. 도 13a: 반전 사건 검출의 개략도: 절제된 단편의 역위된 변이를 증폭시키기 위해 특이적 프라이머를 설계하였다. dsDNA에 결합하는 형광 DNA-결합 염료인 EvaGreen 염료를 ddPCR 분석에 사용하여 모든 역위 이벤트를 측정했다. BioRender.com으로 작성된 삽화. 도 13b: 미편집(un-edited)(흑색) 및 RNP(ref) 처리된(회색) HD-V3 건강한 공여자 및 SCN-P41 환자 유래 분화된 HSC에서 EvaGreen 기반 ddPCR 분석으로 측정한 전체 역위 사건의 정량화. 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. 도 13c: 미편집 HD-V4 건강한 공여자 및 SCN-P55 환자 유래 분화된 HSC(흑색) 및 RNP(alt) 처리된(회색) SCN-P55 환자 유래 분화된 HSC에서 EvaGreen 기반 ddPCR 분석으로 측정한 전체 역위 사건의 정량화. 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다. (n=HD-V3 또는 HD-V4 건강한 공여자/SCN-P41 또는 SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3-4개 그룹).
도 14a-14b: 추가적인 건강한 공여자의 절제 수준 및 대립유전자 특이성. 도 14a: ddPCR에 의해 측정한, 미처리(NT, 흑색), RNP(ref) 처리(회색) 또는 RNP(alt) 처리(백색) 건강한 공여자로부터 채취한 HSC에서 절제(excision)의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n= 각 그룹당 2명의 건강한 공여자로부터의 세포의 4개의 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. 도 14b: ddPCR에 의해 측정한, 미처리(NT), RNP(ref) 또는 RNP(alt) 처리된 건강한 공여자로부터 채취한 HSC에서 미편집 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. 각 대립유전자 농도의 평균은 내인성 유전자 대조군 RPP30 및 STAT1에 대해 정규화되었고, 미처리 세포에 대해 상대적으로 제시되었다. (n=각 그룹당 2명의 건강한 공여자로부터의 세포의 4개의 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 15a-15c: 장기 HSC 집단의 절제 수준. 도 15a: 분류(sorting) 전(전체, 왼쪽 패널) 및 CD90-(중간 패널) 및 CD90+(오른쪽 패널) 집단으로의 분류 후, 건강한 공여자 유래 CD34+ HSC의 대표적인 FACS 플롯. (도 15b 및 도 15c) ddPCR에 의해 측정된, 분류 전(전체, 흑색) 및 CD90+(연회색) 및 CD90-(진회색) 집단으로의 분류 후, 2명의 건강한 공여자(MLP1; 도 15b - SNP의 대체 형태에 대한 이형접합성 및 MLP2, 도 15c - SNP의 대체 형태에 대한 동형접합성)로부터 채취한 HSC로부터의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프. 분류 전 미처리 HSC가 대조군(NT)으로 작용했다(n=각 그룹의 각 건강한 공여자로부터의 세포의 2개의 그룹). 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 16a-16d: CD11b+/CD15+ 호중구로의 분화. 도 16a: 호중구(CD11b+/CD15+) 서브세트에 대해 분석된, 미처리(NT, 왼쪽 패널) 및 RNP(ref) 처리(오른쪽 패널) 건강한 공여자(HD-V3, 상부 패널) 및 SCN-P41 환자(하부 패널) 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. 도 16b: 미처리(NT, 흑색) 또는 RNP(ref)로 처리된(회색) 건강한 공여자(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P41)의 분화된 HSC에서 호중구(CD11b+/CD15+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V3 건강한/SCN-P41 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001 및 ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 도 16c: 호중구(CD11b+/CD15+) 서브세트에 대해 분석된, 미처리 건강한 공여자(HD-V4 NT, 왼쪽 패널), 미처리 SCN 환자(SCN-P55 NT, 중간 패널) 및 RNP(alt) 처리 SCN 환자(오른쪽 패널)의 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. 도 16d: 미처리 건강한 공여자(HD-V4, NT; 흑색) 및 미처리(NT, 검정) 또는 RNP(alt)로 처리(회색)된 SCN 환자(SCN-P55)로부터의 분화된 HSC에서 호중구(CD11b+/CD15+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V4 건강한 공여자/SCN-P55 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 17a-17b. LCL 세포에서 OMNI-50 변이체에 의한 g62의 ref 및 alt 대립유전자의 편집 활성. 편집 활성은 NGS 분석에 의해 결정하였다. 3회 반복실험에 대한 평균 및 표준 편차가 표시된다.
도 18a-18b: OMNI -50 변이체의 g62 오프타겟의 편집 활성. 두 가지 상이한 오프타겟 g62 OT1 및 g62 OT2를 테스트하였다. 3회 반복실험에 대한 평균 및 표준 편차가 표시된다.
도 19a-19b: 프로브 및 가이드의 특이성. 도 19a: SNP의 대조 형태 또는 대체 형태에 대해 동형접합성인 건강한 공여자(HD) 세포로부터 추출된 DNA에 대한 각 프로브(FAM, 흑색; HEX, 회색)의 결합을 ddPCR로 측정했다. 막대 그래프는 양성 사건(positive event)의 농도를 나타낸다. (n=3개의 세포 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. 도 19b: ddPCR로 측정한, rs1683564 SNP의 대조 형태에 동형접합이고 미처리(NT), RNP(alt) 또는 RNP(ref)로 처리된 건강한 공여자 HSC에서의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=3개의 세포 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 20a-20b: OMNI 변이체 3795 뉴클레아제 및 각각의 sgRNA의 편집 후 오프타겟은 검출되지 않았다. (도 20a-c) 표적 서열의 모든 리드(read) 및 검출된 오프타겟 부재(4개의 불일치)를 보여주는, OMNI 변이체 3795 뉴클레아제 및 각각의 불변 가이드(도 20a, SgRNA(constant)), 대조 가이드(도 20b, SgRNA(ref)) 및 대체 가이드(도 20c, SgRNA(alt))를 사용한 전체 게놈 오프타겟 절단의 불편 서베이(unbiased survey) (GUIDE-seq). 분석은 rs1683564 SNP의 대조 형태와 동형접합성인 U2OS 세포에서 수행되었다. OMNI 변이체 3795 뉴클레아제는 대립유전자 구분성이 매우 높기 때문에(allele discriminatory), sgRNA(alt)를 사용할 때 대조 대립유전자의 온타겟(on-target) 편집은 미미하며(대조 시토신 유전자형의 13개 리드) 오프타겟 검출은 없다. (도 20d) 일부 잠재적인 오프타겟을 나타내는, 불변, 대체 및 대조 가이드에 대한 인실리코 오프타겟 분석 결과를 요약한 표. 이러한 오프 타겟 중 어느 것도 각각 RNP(ref) 및 RNP(alt)로 편집된 SCN-P41 및 SCN-P55 환자로부터 유래된 HSC에서 수행된 rhAmpSeq 분석에 의해 검증되지 않았다. 두 개의 오른쪽 열을 참조한다. rhAmpSeq 검증 임계값(validation threshold)은 ≥0.2% 편집으로 설정되었다.
도 21A-21J. SCN-P42 및 HD-V5에서 RNP(ref)를 사용한 절제. (도 21A) ddPCR로 측정한, RNP(ref) 조성물로 처리되거나 또는 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(Mock) 건강한 공여자(HD-V5) 또는 SCN 환자(SCN-P42)으로부터 채취된 HSC에서 분화 6일차의 미편집(un-edited) 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n= HD-V5 건강한/SCN-P42 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 21B) ddPCR로 측정한, 건강한 공여자(HD-V5)(Mock 처리(Mock, 검정색) 또는 RNP(ref) 처리(회색)), 또는 SCN 환자(SCN-P42)(Mock 처리(Mock, 백색) 또는 RNP(ref) 처리(진한 사선))로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차 및 14일차의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=HD-V5 건강한 공여자/SCN-P42 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. (도 21C) Mock 처리(흑색) 또는 RNP(ref) 처리(회색)된 SCN-P42 환자의 6일차 분화 HSC에서 ELANE mRNA 수준을 나타내는 막대 그래프. 데이터는 mock 그룹에 상대적으로 표시된다. (n=SCN-P42 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 **P<.01로 표시된다. (도 21D) 돌연변이 부위를 표적화하는 NGS에 의해 측정한, RNP(ref) 처리 또는 Mock 처리(Mock)된 SCN-P42 환자 HSC로부터 채취한 cDNA의 야생형(흑색) 및 돌연변이(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=SCN-P42 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 *P<.05로 표시된다. (도 21E) 호중구(CD66b+) 및 단핵구(CD14+/CD66b-) 서브세트에 대해 분석된, Mock 처리(Mock, 왼쪽 패널) 및 RNP(ref) 처리된(오른쪽 패널) 건강한 공여자(HD-V5, 상부 패널) 및 SCN-P42 환자(하부 패널)로부터의 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. (도 21F) Mock 처리되거나(Mock, 흑색), RNP(ref)로 처리된(회색) 건강한(HD-V5) 및 SCN 환자(SCN-P42)로부터의 분화된 HSC에서 호중구(CD66b+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V5 건강한 공여자/SCN-P42 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 21G) Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(ref)(회색)로 처리된 건강한 공여자(HD-V5) 및 SCN 환자 공여자(SCN-P42)로부터의 분화된 HSC에서 단핵구(CD14+/CD66b- 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V5 건강한 공여자/SCN-P42 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 21H) RNP(ref)로 처리되거나 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(SCN-P42 Mock) P42 SCN 환자 유래 분화된 HSC의 Diff-Quik 염색. Nikon DSLR 디지털 카메라를 사용하여 400X 배율의 LEITZ LABORLUX S 편광 현미경에서 현미경 사진을 촬영했다. (도 21I) Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(ref) 처리(회색)된 건강한 공여자(HD-V5) 및 SCN 환자(SCN-P42)로부터의 분화된 HSC에 의한 자이모산 그린(Zymosan Green) 흡수의 백분율의 정량화. 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 21J) 그래프는 박테리아 세포 단독 대조군(대장균, 원) 대비, 건강한 mock 처리(HD-V3, Mock; 백색 정사각형) 또는 환자 mock 처리(SCN-P42, Mock; 십자표시 원(crossed circle)) 또는 환자 RNP(ref) 처리 (SCN-P42 RNP(ref); 삼각형) HSC로부터의 분화된 호중구와 함께 인큐베이션된 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포로부터의 발광, RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 나타낸다. RLU 수준이 안정기(plateau)에 도달했을 때 제시된 마지막 시점에서 대장균 대조군 대비 각 그룹에 대한 통계적 유의성이 ****P<.0001로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 22A-22I: SCN-P12 및 HD-V1에서 RNP(alt)를 사용한 절제. (도 22A) ddPCR로 측정한, RNP(alt) 조성물로 처리되거나 또는 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(Mock), 건강한 공여자(HD-V1) 또는 SCN 환자(SCN-P12)로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차에 미편집 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=HD-V1 건강한/SCN-P12 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 22B) ddPCR로 측정한, 건강한 공여자(HD-V1)(Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(alt) 처리(회색)), 또는 SCN 환자(SCN-P42)(Mock 처리(Mock, 백색) 또는 RNP(alt) 처리(진한 사선))로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차 및 14일차의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=HD-V1 건강한/SCN-P12 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001, ****P<.0001로 표시된다. (도 22C) Mock 처리(흑색) 또는 RNP(alt) 처리(회색)된 SCN-P12 환자의 6일차 분화된 HSC에서 ELANE mRNA 수준을 나타내는 막대 그래프. 데이터는 mock 그룹에 상대적으로 표시된다. (n=SCN-P12 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 *P<.05로 표시된다. (도 22D) 돌연변이 부위를 표적화하는 NGS에 의해 측정한, RNP(alt) 처리 또는 Mock 처리(Mock)된 SCN-P12 환자 HSC로부터 채취한 cDNA의 야생형(흑색) 및 돌연변이(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=SCN-P42 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001로 표시된다. (도 22E) 호중구(CD66b+) 및 단핵구(CD14+/CD66b-) 서브세트에 대해 분석된, Mock 처리(Mock, 왼쪽 패널) 및 RNP(alt) 처리된(오른쪽 패널) 건강한 공여자(HD-V1, 상부 패널) 및 SCN-P12 환자(하부 패널)로부터의 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. (도 22F) Mock 처리되거나(Mock, 흑색), RNP(alt)로 처리된(회색) 건강한(HD-V1) 및 SCN 환자(SCN-P12)로부터의 분화된 HSC에서 호중구(CD66b+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V1 건강한 공여자/SCN-P12 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 **P<.01, ***P<.001로 표시된다. (도 22G) Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(alt)(회색)로 처리된 건강한 공여자(HD-V1) 및 SCN 환자 공여자(SCN-P12)로부터의 분화된 HSC에서 단핵구(CD14+/CD66b- 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V1 건강한 공여자/SCN-P12 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 22H) Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(alt) 처리(회색)된 건강한 공여자(HD-V1) 및 SCN 환자(SCN-P12)로부터의 분화된 HSC에 의한 자이모산 그린(Zymosan Green) 흡수의 백분율의 정량화. 통계적 유의성은 ***P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 22I) 그래프는 박테리아 세포 단독 대조군(대장균, 원) 대비, 건강한 mock 처리(HD-V1, Mock; 백색 정사각형) 또는 mock 처리 환자(SCN-P12, Mock; 십자표시 원) 또는 RNP(alt) 처리 (SCN-P12 RNP(alt); 삼각형) HSC로부터의 분화된 호중구와 함께 인큐베이션된 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포로부터의 발광, RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 나타낸다. RLU 수준이 안정기(plateau)에 도달했을 때 제시된 마지막 시점에서 대장균 대조군 대비 각 그룹에 대한 통계적 유의성이 *P<.05, **P<.01, ***P<.001로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
도 23A-23I: SCN-P56 및 HD-V3에서 RNP(alt)를 사용한 절제. (도 23A) ddPCR로 측정한, RNP(alt) 조성물로 처리되거나 또는 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(Mock) 건강한 공여자(HD-V3) 또는 SCN 환자(SCN-P56)로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차에 미편집 대조(흑색) 및 대체(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=HD-V3 건강한 공여자/SCN-P56 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 23B) ddPCR로 측정한, 건강한 공여자(HD-V3)(Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(alt) 처리(회색)), 또는 SCN 환자(SCN-P56)(Mock 처리(Mock, 백색) 또는 RNP(alt) 처리(진한 사선))로부터 채취한 HSC에서 분화 6일차 및 14일차의 절제 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=HD-V3 건강한/SCN-P56 환자 공여자로부터의 세포의 3개의 그룹). 통계적 유의성은 ***P<.001로 표시된다. (도 23C) 돌연변이 부위를 표적화하는 NGS에 의해 측정한, RNP(alt) 처리 또는 Mock 처리(Mock)된 SCN-P56 환자 HSC로부터 채취한 cDNA의 야생형(흑색) 및 돌연변이(회색) 대립유전자의 백분율을 나타내는 막대 그래프. (n=SCN-P56 환자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001로 표시된다. (도 23D) 호중구(CD66b+) 및 단핵구(CD14+/CD66b-) 서브세트에 대해 분석된, Mock 처리(Mock, 왼쪽 패널) 및 RNP(alt) 처리된(오른쪽 패널) 건강한 공여자(HD-V3, 상부 패널) 및 SCN-P56 환자(하부 패널)로부터의 분화된 HSC의 대표적인 FACS 플롯. (도 23E) Mock 처리되거나(Mock, 흑색), RNP(alt)로 처리된(회색) 건강한(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P56)로부터의 분화된 HSC에서 호중구(CD66b+ 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석. (n=HD-V3 건강한/SCN-P56 환자 공여자로부터의 세포의 3개 그룹). 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 23F) Mock 처리된(Mock, 흑색) 건강한(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P56) 분화된 HSC에서 단핵구(CD14+/CD66b- 세포)의 백분율에 대한 각각의 FACS 데이터의 정량 분석 또는 RNP(alt)(회색)로 처리됨. (n=HD-V3 건강한/SCN-P56 환자 공여자의 세포 3개 그룹). 통계적 유의성은 P=0.04, ****P<.0001로 표시된다. (도 23G) RNP(alt)로 처리되거나 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된(SCN-P56 Mock) P56 SCN 환자 유래 분화된 HSC의 Diff-Quik 염색. Nikon DSLR 디지털 카메라를 사용하여 400X 배율의 LEITZ LABORLUX S 편광 현미경에서 현미경 사진을 촬영했다. (도 23H) Mock 처리(Mock, 흑색) 또는 RNP(alt) 처리(회색)된 건강한 공여자(HD-V3) 및 SCN 환자(SCN-P56)로부터의 분화된 HSC에 의한 자이모산 그린(Zymosan Green) 흡수의 백분율의 정량화. 통계적 유의성은 ****P<.0001, ns = 통계적으로 유의하지 않음으로 표시된다. (도 23I) 그래프는 박테리아 세포 단독 대조군(대장균, 원) 대비, 건강한 mock 처리(HD-V3, Mock; 백색 정사각형) 또는 환자 mock 처리(SCN-P56, Mock; 십자표시 원(crossed circle)) 또는 환자 RNP(ref) 처리 (SCN-P56 RNP(alt); 삼각형) HSC로부터의 분화된 호중구와 함께 인큐베이션된 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포로부터의 발광, RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 나타낸다. RLU 수준이 안정기(plateau)에 도달했을 때 제시된 마지막 시점에서 대장균 대조군 대비 각 그룹에 대한 통계적 유의성이 ****P<.01로 표시된다. 막대는 표준편차와 함께 평균값을 나타낸다.
본 개시는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제(서열번호 1)에 비해 표적 부위에 대한 증가된 특이성을 나타내는 조작된 OMNI-50 뉴클레아제를 제공한다. 야생형 OMNI-50 뉴클레아제는 본원에 참조에 의해 포함된, PCT 국제 출원 공개 번호 WO/2020-030782에 개시된다. 조작된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체가 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템에서 활성인 경우, CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성 및 유지된 온타겟 활성을 나타낸다. 일부 구체예에서, 조작된 OMNI-50 뉴클레아제는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제에 비해 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 OMNI-50 뉴클레아제 변이체이다. 일부 구체예에서, 조작된 OMNI-50 뉴클레아제는 야생형 OMNI-50 뉴클레아제와 비교하여 복수의 아미노산 치환을 포함한다.
　일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 비한정적인 예로서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 서열번호 1과 비교하여 그의 잔기의 최대 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 또는 20%의 아미노산 서열 차이를 가질 수 있다. 이러한 서열 차이는 서열 정렬을 통해 밝혀질 수 있다. OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 OMNI-50 야생형 뉴클레아제의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로, 예를 들어 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환으로 대체하고 및/또는 OMNI-50 야생형 뉴클레아제의 아미노산 잔기를 삽입 또는 결실함으로써 생성될 수 있다. 본원에 기술된 임의의 다른 돌연변이에 더해, 치환, 삽입 또는 결실을 포함하나 이에 제한되지 않는 그러한 임의의 돌연변이, 또는 본원에 기술된 돌연변이에 더한 돌연변이를 이용하여 OMNI-50 야생형 뉴클레아제로부터 OMNI-50 변이체 뉴클레아제를 생성할 수 있다. 일부 구체예에서, OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 모체(parent) 야생형 OMNI-50 뉴클레아제의 원하는 활성, 예를 들어, 가이드 RNA 및 표적 DNA와 상호작용하는 능력 및/또는 뉴클레아제의 활성(예를 들어, 이중 가닥 DNA 절단, 단일 가닥 DNA 절단, 또는 뉴클레아제나 닉카아제 활성 부족을 유발하는 능력)을 유지한다. 일부 구체예에서, 변이체는 모체의 원하는 활성, 예를 들어 뉴클레아제 활성을 모체의 활성 수준보다 높거나 동일한 수준으로 유지한다. 일부 구체예에서, 변이체는 모체의 활성 수준의 적어도 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30% 수준에서 모체의 원하는 활성을 유지한다. 일부 구체예에서, OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 OMNI-50 야생형 뉴클레아제에 비해 감소된 오프표적 효과를 나타낸다.
일부 구체예에서, 야생형 OMNI-50(서열번호 1)의 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 OMNI-50 뉴클레아제 단백질의 변이체가 제공된다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 양성, 음성, 전하를 띠지 않는, 친수성, 소수성, 극성 또는 비극성 아미노산으로의 아미노산 잔기 치환을 포함한다. 일부 구체예에서, 아미노산 치환은 아미노산을 R, K, H, D, E, S, T, N, Q, C, U, G, P, A, I, L, M, F, W, Y 및 V로 구성된 군으로부터 선택된 상이한 아미노산으로 교체하는 것으로부터 선택된다.
양성 아미노산은 양전하를 띤 R-기를 갖는 임의의 아미노산, 예를 들어 라이신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)을 포함한다. 음성 아미노산은 음전하를 띤 R-기를 갖는 임의의 아미노산, 예를 들어 아스파르트산(D) 또는 글루탐산(E)을 포함한다. 전하를 띠지 않는 아미노산 또는 중성 아미노산은 R 기가 일반적으로 전하를 띠지 않는 아미노산을 포함한다. 극성 아미노산은 극성 R-기를 갖는 임의의 아미노산, 예를 들어 세린(S), 트레오닌(T), 티로신(Y), 아스파라긴(N) 또는 글루타민(Q)을 포함한다. 비극성 아미노산은 비극성 R-기를 갖는 임의의 아미노산, 예를 들어 글리신(G), 알라닌(A), 발린(V), 시스테인(C), 프롤린(P), 류신(L), 이소류신(I), 메티오닌(M), 트립토판(W) 또는 페닐알라닌(F)을 포함한다.
주어진 위치에서 원래의(original) 아미노산 치환을 갖는 원래의 변이체 단백질의 특성은, 상이한 아미노산 치환이 원래의 아미노산 치환과 유사한 특성을 갖는 R-기를 갖는 경우, 동일한 위치에서 상이한 아미노산 치환을 갖는 상이한 변이체로 확장될 수 있다. 예를 들어, 변이체 단백질이 라이신(K) 잔기를 글루탐산(E) 잔기로 치환함으로써 야생형 단백질에 비해 더 높은 특이성을 갖는 것으로 나타나는 경우, 라이신(K)과 아르기닌(R)이 유사한 특성을 공유하므로(예를 들면, 그들은 모두 양전하를 띤 R-기를 가지므로), 아르기닌(R) 잔기를 글루탐산 잔기(E)로 치환하는 유사한 변이체도 더 높은 특이성을 나타낼 것으로 간주하는 것이 타당하다. 반대로, 글루탐산(E)과 아스파르트산(D)이 모두 음전하를 띤 R-기를 포함하는 유사한 특성을 공유하므로, 글루탐산(E) 잔기의 아스파르트산(D)으로의 치환을 갖는 변이체는 더 높은 특이성을 나타낼 가능성이 더 낮다.
일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)의 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 포함한다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981 및 K1036. 각각의 가능성은 본 개시의 별도의 구체예를 나타낸다. 일부 구체예에서, 야생형 OMNI-50 뉴클레아제의 아미노산 서열(서열번호 1)과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하고, 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치 중 적어도 하나에 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질이 제공된다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, K965, V981 및 K1036. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나를 포함한다: R478I, Y545H, Q803V, L805I, R61A, Y437W, R788K, L844N, V981M, G606P, L690V, E695Q, R478T, A493G, K688E, L718C, K965V 및 K1036V. 각각의 가능성은 본 개시의 별도의 구체예를 나타낸다. 일부 구체예에서, 치환은 표 1에 나열된 돌연변이에 상응한다.
일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: R478, Y545, Q803 및 L805. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 아미노산 치환을 포함한다: R478, Y545, Q803 및 L805. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열로부터 하기 아미노산 치환을 포함한다: R478I, Y545H, Q803V, 및 L805I.
일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: R61, Y437, R788, L844 및 V981. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 아미노산 치환을 포함한다: R61, Y437, R788, L844 및 V981. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열로부터 하기 아미노산 치환을 포함한다: R61A, Y437W, R788K, L844N 및 V981M.
일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: G606, L690 및 E695. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 아미노산 치환을 포함한다: G606, L690 및 E695. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열로부터 하기 아미노산 치환을 포함한다: G606P, L690V 및 E695Q.
일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다: R478, A493, K688, L718, K965, 및 K1036. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열의 하기 위치에 아미노산 치환을 포함한다: R478, A493, K688, L718, K965V 및 K1036. 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제 단백질은 야생형 OMNI-50 단백질 서열로부터 하기 아미노산 치환을 포함한다: R478T, A493G, K688E, L718C, K965V 및 K1036V.
일부 구체예에서, OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 핵 국소화 서열(nuclear localization sequence: NLS), 세포 침투 펩티드 서열 및/또는 친화성 태그(affinity tag) 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 구체예에서, OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 복합체의 축적을 유도하기에 충분한 강도의 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 표 1에서 야생형 OMNI-50에 대해 표시된 치환에 상응하는 아미노산 치환으로부터 선택된 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에 따르면, 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 서열과 비교하여 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 포함하는, 단리된 OMNI-50 변이체 뉴클레아제 단백질로서, 상기 단리된 OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 CRISPR 시스템에서 활성이고, 상기 CRISPR 시스템은 야생형 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성 및 유지된 온타겟 편집 활성을 나타내는 것인 단리된 OMNI-50 변이체 뉴클레아제 단백질이 제공된다.
일부 구체예에 따르면, 본원에 기술된 OMNI-50 변이체 뉴클레아제에 대한 추가적인 돌연변이가 구현될 수 있다. 예는 PAM 인식 서열을 변경하는 돌연변이, 효소의 뉴클레아제 활성을 변경하는 돌연변이, 뉴클레아제 일부의 절단 또는 제거를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구체예에 따르면, 변이체 OMNI-50 변이체 뉴클레아제는 변이체의 원하는 아미노산 서열을 생성하는 임의의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열은 박테리아 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 세포에 대해 코돈 최적화될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, CRISPR 뉴클레아제 및 표적화 분자는 표적 DNA 서열에 결합하여 표적 DNA 서열의 절단을 수행하는 CRISPR 복합체를 형성한다. CRISPR 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제 및 단일 가이드 RNA(sgRNA) 분자를 포함하는 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제, crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함하는 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 표적 부위 유전자좌를 적합한 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 복합체와 복합체를 형성한 변이체 OMNI-50 단백질을 갖는 활성 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 감소된 오프타겟 편집 활성 및/또는 증가된 온타겟 편집 활성을 갖는 유전자 편집 방법으로서, 상기 활성 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템은 야생형 OMNI-50 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성 및 유지된 온타겟 편집 활성을 나타내는 것인 유전자 편집 방법이 제공된다.
일부 구체예에 따르면, 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 포함하는 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)을 갖는 비-천연 OMNI-50 뉴클레아제 변이체가 제공된다: R61, Y437, R478, A493, Y545, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, V981, K965 및 K1036.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478 및/또는 위치 Y545, 바람직하게는 위치 R478 및 위치 Y545 모두에서의 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478 및 Y545 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 위치 R478에서의 아미노산 치환은 하기 치환 중 어느 하나이다: R478D, R478E, R478S, R478T, R478N, R478Q, R478G, R478P, R478C, R478A, R478V, R478I, R478L, R478M, R478F, R478Y 또는 R478W, 바람직하게는 R478V, R478H, R478L, R478M, R478P, R478F, R478W, R478Y, R478S, R478C, R478T, R478N 또는 R478Q.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 음전하를 띤 R-기 또는 전하가 없는 R-기를 갖는 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 극성 아미노산이다.
일부 구체예에서, 위치 Y545에서의 아미노산 치환은 하기 치환 중 어느 하나이다: Y545D, Y545E, Y545S, Y545T, Y545N, Y545Q, Y545G, Y545P, Y545C, Y545A, Y545V, Y545I, Y545L, Y545M, Y545F, Y545R, Y545K, Y545H, 또는 Y545W, 바람직하게는, Y545W, Y545F, Y545H, Y545V 또는 Y545G.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 음으로 하전된 R-기 또는 양으로 하전된 R-기를 갖는 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 비극성 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 페닐 고리가 없거나 페닐알라닌이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I 및 Y545H이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 하기 치환 중 어느 하나이다: R478I, Y545H, Q803V, L805I, R61A, Y437W, R788K, L844N, V981M, G606P, L690V, E695Q, R478T, A493G, K688E, L718C, K965V, 및 K1036V.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478, Y545, Q803 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I, Y545H, Q803V 및 L805I이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R61, Y437, R788, L844, 및 V981 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R61A, Y437W, R788K, L844N 및 V981M이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 G606, L690 및 E695 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 G606P, L690V 및 E695Q이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478, A493, K688, L718, K965 및 K1036 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478T, A493G, K688E, L718C, K965V, 및 K1036V이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 Q803에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 Q803V이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 Y545에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 Y545H이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 L805에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 L805I이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478, Y545 및 Q803 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I, Y545H 및 Q803V이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478, Y545 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I, Y545H 및 L805I이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478, Q803 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I, Q803V 및 L805I이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 Y545, Q803 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I, Y545H 및 L805I이다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478 및/또는 위치 Y545에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 위치 R478에서의 아미노산 치환은 하기 치환 중 어느 하나이다: R478D, R478E, R478S, R478T, R478N, R478Q, R478G, R478P, R478C, R478A, R478V, R478I, R478L, R478M, R478F, R478Y 또는 R478W.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 음전하를 띤 R-기 또는 전하가 없는 R-기를 갖는 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 비극성 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산은 큰 소수성 아미노산(예를 들어, 류신, 메티오닌, 프롤린, 발린), 방향족 아미노산(예를 들어, 히스티딘, 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신) 및 극성 비하전 아미노산(예를 들어, 세린, 시스테인, 트레오닌, 아스파라긴 및 글루타민)으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 위치 Y545에서의 아미노산 치환은 하기 치환 중 어느 하나이다: Y545D, Y545E, Y545S, Y545T, Y545N, Y545Q, Y545G, Y545P, Y545C, Y545A, Y545V, Y545I, Y545L, Y545M, Y545F, Y545R, Y545K, Y545H 또는 Y545W.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 음으로 하전된 R-기 또는 양으로 하전된 R-기를 갖는 아미노산이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 양으로 하전된 R-기를 갖는 아미노산이다. 양전하를 띤 아미노산의 비한정적 예는 히스티딘, 라이신 및 아르기닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 비극성 아미노산이다. 비극성 아미노산의 비한정적 예는 글리신, 알라닌, 발린, 프롤린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 트립토판 및 페닐알라닌을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 페닐 고리가 없거나 페닐알라닌이다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산은 페닐 고리를 포함한다(예를 들어, 페닐알라닌).
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 위치 R478 및 Y545 각각에 아미노산 치환을 포함한다.
일부 구체예에서, 아미노산 치환은 R478I 및 Y545H이다. 그러나, R478 및 Y545 위치에서의 다른 아미노산 치환도 고려된다. 비한정적 예로서, 이소류신과 유사한 비극성 특성을 갖는 R-기를 갖는 아미노산, 예를 들면, 알라닌(A), 발린(V) 및 류신(L)이 R478 위치에서의 치환으로 고려된다. 또 다른 비한정적 예에서, 이소류신과 유사한 비극성 특성을 갖는 R-기를 갖는 아미노산, 예를 들면, 메티오닌(M), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)이 R478 위치에서의 치환으로 고려된다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 서열번호 2-5, 63-70 및 89-97로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, OMNI-50 뉴클레아제 변이체는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한 야생형 OMNI-50 뉴클레아제에 비해, DNA 표적 부위로 변이체를 표적화하는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성할 때 상기 DNA 표적 부위에 대한 증가된 특이성을 나타낸다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, DNA 표적 부위를 표적화하는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한 본원에 기술된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 중 어느 하나를 포함하는 CRISPR 시스템으로서, 상기 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질 및 가이드 RNA 분자를 포함하는 야생형 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성을 나타내는 것인 CRISPR 시스템이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, DNA 표적 부위를 본원에 기술된 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 단백질 중 어느 하나를 포함하는 활성 CRISPR 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 감소된 오프타겟 편집 활성을 갖는 유전자 편집 방법이 제공된다.
일부 구체예에서, 활성 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질을 포함하는 야생형 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성을 나타낸다.
일부 구체예에서, 유전자 편집은 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 일어난다.
일부 구체예에서, 진핵 세포는 식물 세포 또는 포유동물 세포이다.
일부 구체예에서, 포유동물 세포는 인간 세포이다.
일부 구체예에서, DNA 표적 부위는 유전자의 병원성 대립유전자 내에 또는 그에 근접하여 위치한다.
일부 구체예에서, DNA 표적 부위는 ELANE, CXCR4, EMX, RyR2, KNCQ1, KCNH2, SCN5a, GBA1, GBA2, Rhodopsin, GUCY2D, IMPDH1, FGA, BEST1, PRPH2, KRT5, KRT14, ApoA1, STAT3, STAT1, ADA2, RPS19, SBDS, GATA2, RPE65, LDLR, ANGPTL3, B2M, TRAC, TCF4, TGFBi, PAX6, C3, LRRK2, SARM1, SAMD9, SAMD9L, HAVCR2, CD3E, APLP2, CISH, TIGIT, TNNT2, TNN, MYH7 및 HLA-E로 구성된 군으로부터 선택된 유전자에 위치한다.
일부 구체예에서, DNA 표적은 외인성 공여체 분자에 의해 복구된다.
일부 구체예에서, 오프타겟 편집 활성은 적어도 2배, 10배, 102배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 감소된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 수득된 변형된 세포가 제공된다.
일부 구체예에서, 세포는 생착(engraftment)이 가능하다.
일부 구체예에서, 세포는 생착 후에 자손 세포를 생성할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 자가 생착 후에 자손 세포를 생성할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 생착 후 적어도 12개월 또는 적어도 24개월 동안 자손 세포를 생성할 수 있다.
일부 구체예에서, 세포는 조혈 줄기 세포, 전구 세포, CD34+ 조혈 줄기 세포, 골수 세포 및 말초 단핵 세포로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본원에 기술된 변형된 세포 중 어느 하나와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 제공된다. 본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 세포를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 시험관내(in vitro) 또는 생체외에서(ex vivo) 조성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본원에 기술된 OMNI-50 변이체 단백질 중 어느 하나를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자가 제공된다.
전달
본원에 기술된 OMNI-50 변이체 조성물은 단백질, DNA 분자, RNA 분자, 리보핵단백질(ribonucleoprotein: RNP), 핵산 벡터, 또는 이들의 임의의 조합으로서 전달될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA 분자는 화학적 변형을 포함한다. 적합한 화학적 변형의 비-한정적 예는 2'-0-메틸(M), 2'-0-메틸, 3'-포스포로티오에이트(MS) 또는 2'-0-메틸, 3'-티오PACE(MSP), 슈도우리딘, 및 1-메틸 슈도-우리딘을 포함한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별개의 구체예를 나타낸다.
본원에 기술된 OMNI-50 변이체 및/또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및/또는 단일-가이드 RNA 분자, crRNA 분자, tracrRNA 분자 또는 이들 중 어느 하나를 코딩하는 뉴클레오티드 분자와 같은 추가적인 분자는 임의의 적합한 수단에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 표적 세포는 임의의 환경에서, 예를 들어 단리되거나 단리되지 않은, 배양물, 인 비트로, 엑스 비보, 인 비보, 또는 인 플랜타(in planta)로 유지되는, 임의의 유형의 세포, 예를 들어 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다. 표적 세포의 표적 부위는 세포의 핵 내에 존재할 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 예를 들어 복제 기원, 프로모터 및 항생제 내성을 코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 더욱이, 조성물은 네이키드(naked) 핵산 또는 단백질로서, 리포좀, 엑소좀 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화되거나 그 내부에 패키징된 핵산 또는 단백질로서 세포 내로 도입될 수 있거나, 재조합 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라아제 결함 렌티바이러스(integrase defective lentivirus: IDLV)) 또는 바이러스 유사 입자에 의해 전달될 수 있다. 비-한정적 예로서, 조성물은 아데노-연관 바이러스(AAV), 또는 렌티바이러스, 예를 들어 비통합 렌티바이러스(non-integrating lentivirus) 또는 역전사 능력이 결여된 렌티바이러스로 패키징될 수 있다. 추가의 비-한정적 예에는 조성물을 리포좀, 세포외 소포 또는 엑소좀으로 패키징하는 것이 포함되며, 이는 VSVG(vesicular stomatitis glycoprotein)로 위유형화(pseudotyped)되거나 세포 침투 펩티드, 항체, 표적화 모이어티 또는 이들의 임의의 조합에 접합될 수 있다.
일부 구체예에서, 전달될 조성물은 뉴클레아제의 mRNA 및 가이드의 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 전달될 조성물은 뉴클레아제의 mRNA, 가이드의 RNA 및 공여체 주형을 포함한다. 일부 구체예에서, 전달될 조성물은 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구체예에서, 전달될 조성물은 CRISPR 뉴클레아제, 가이드 RNA, 및 예를 들어, 상동성 기반 복구(HDR)를 통한, 유전자 편집을 위한 공여체 주형을 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제의 mRNA 및 가이드 RNA 분자, 예를 들어 단일 가이드 RNA 분자 또는 crRNA 분자를 포함하며, 이는 뉴클레아제를 표적 부위로 표적화하는 데 사용된다. 일부 구체예에서, 세포에 전달되는 조성물은 뉴클레아제의 mRNA, 가이드 RNA 분자 및 공여체 주형 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 단백질 변이체와 가이드 RNA 분자를 포함한다. 선택적으로, 세포에 전달될 조성물은 뉴클레아제 단백질 변이체, 가이드 RNA 분자 및/또는 상동성 기반 복구를 위한 공여체 주형을 포함한다. 선택적으로, 세포에 전달될 조성물은 뉴클레아제 변이체의 mRNA, DNA 표적화 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함한다. 세포에 전달될 조성물은 뉴클레아제 변이체의 mRNA, DNA 표적화 crRNA 분자, tracrRNA 분자, 및 공여체 주형 분자를 포함한다. 세포에 전달될 조성물은 뉴클레아제 단백질 변이체, DNA 표적화 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함한다. 선택적으로, 세포에 전달될 조성물은 뉴클레아제 단백질 변이체, DNA-표적화 crRNA 분자, tracrRNA 분자, 및 상동성 기반 복구를 위한 DNA 공여체 주형 분자를 포함한다.
임의의 적합한 바이러스 벡터 시스템이 이러한 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 세포(예를 들어, 포유동물 세포, 식물 세포 등) 및 표적 조직에서 핵산 및/또는 OMNI-50 변이체 단백질을 도입하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 OMNI-50 변이체 단백질을 코딩하는 핵산 및/또는 OMNI-50 변이체 단백질을 인 비트로에서 세포에 투여하는 데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 및/또는 OMNI-50 변이체 단백질은 생체내(in vivo) 또는 생체외(ex vivo) 유전자 치료법 용도를 위해 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 네이키드 핵산, 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 유전자 치료법 절차에 대한 검토를 위해, Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne et al.,, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)을 참조한다.
핵산 및/또는 단백질의 비-바이러스 전달의 방법은 전기천공, 리포펙션, 미세주사, 바이올리스틱(biolistic), 입자 총 가속화(particle gun acceleration), 비로좀(virosome), 바이러스-유사 입자, 엑소좀, 리포좀, 면역리포좀(immunoliposome), 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 인공비리온, 및 핵산의 작용체-증강 흡수(agent-enhanced uptake)를 포함하거나 박테리아 또는 바이러스(예를 들어, 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움 종 NGR234(Rhizobium sp. NGR234), 시노리조보이움멜릴로티(Sinorhizoboiummeliloti), 메조리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 및 카싸바 베인 모자이크 바이러스(cassava vein mosaic virus))에 의해 식물 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, Chung et al. Trends Plant Sci. (2006)을 참조한다. 예를 들어, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 초음파천공(sonoporation)이 또한 핵산의 전달에 사용될 수 있다. 단백질 및/또는 핵산의 양이온성-지질 매개 전달이 또한 생체내, 또는 시험관내 전달 방법으로서 고려된다. Zuris et al., Nat. Biotechnol. (2015), Coelho et al., N. Engl. J. Med. (2013); Judge et al., Mol. Ther. (2006); 및 Basha et al., Mol. Ther. (2011)을 참조한다.
비-바이러스 벡터, 예컨대, 트랜스포존-기반 시스템(transposon-based system), 예를 들어 재조합 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템 또는 재조합 PiggyBac 트랜스포존 시스템이 또한 표적 세포로 전달될 수 있고, 표적 세포에서 조성물의 분자의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 조성물의 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전위(transposition)에 이용될 수 있다.
추가적인 예시적 핵산 전달 시스템은 Amaxa® Biosystems(독일 쾰른 소재), Maxcyte, Inc.(미국 메릴랜드주 록빌 소재), BTX Molecular Delivery Systems(미국 매사추세츠주 홀리스턴 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc.,(예를 들어, 미국 특허 제6,008,336호 참조)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 리포펙션은, 예를 들어 미국 특허 제5,049,386호, 미국 특허 제4,946,787호; 및 미국 특허 제4,897,355호에 기재되어 있으며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예를 들어, Transfectam.TM., Lipofectin.TM. 및 Lipofectamine.TM. RNAiMAX). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 PCT 국제 공개 WO/1991/017424 및 WO/1991/016024에 개시된 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함한, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao and Huang,et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad and Allen,et al., Cancer Res.,. 52:4817-4820 (1992); 미국특허 4,186,183;, 4,217,344;, 4,235,871;, 4,261,975;, 4,485,054;, 4,501,728;, 4,774,085;, 4,837,028;, 및 4,946,787 참조).
추가적인 전달 방법은 전달될 핵산을 EnGeneIC 전달 비히클(EDV) 내로 패키징하는 것의 사용을 포함한다. 이들 EDV는 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직으로 특이적으로 전달되며, 상기 항체의 하나의 암(arm)은 표적 조직에 대한 특이성을 갖고, 나머지 암은 EDV에 대한 특이성을 갖는다. 항체가 EDV를 표적 세포 표면으로 가져간 다음, EDV가 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 들어간다. 일단 세포 안에 들어가면, 내용물이 방출된다(MacDiamid et al., (2009) Nature Biotechnology (2009)).27(7) p. 643 참조).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 신체의 특정 세포에 바이러스를 표적화하고 바이러스 페이로드(viral payload)를 핵으로 수송하기 위한 고도로 진화된 프로세스를 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체내) 시험관내에서 세포를 치료하는 데 사용될 수 있고, 변형된 세포가 환자에게 투여된다(생체외). 핵산의 전달을 위한 종래 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스 및 단순 포진 바이러스(herspes simplex virus) 벡터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 유전자 전달 방법을 사용하면 숙주 게놈에 통합이 가능하며, 종종 삽입된 이식유전자의 장기간 발현을 초래한다. 추가적으로, 높은 형질도입(transduction) 효율이 다수의 다양한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다. OMNI-50 변이체, 또는 상기 변이체를 발현하는 핵산, 및 연관된 핵산은 비-통합 렌티바이러스(non-integrating lentivirus)에 의해 전달될 수 있다. 선택적으로, 렌티바이러스를 이용한 RNA 전달이 이용된다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제의 mRNA 및 뉴클레아제를 표적 부위에 표적화하는 데 사용되는 가이드 RNA 분자, 예를 들어 단일 가이드 RNA 분자 또는 crRNA 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제의 mRNA, 가이드 RNA 분자 및 공여체 주형 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 단백질 변이체와 가이드 RNA 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 단백질 변이체, 가이드 RNA 분자 및/또는 상동성 기반 복구를 위한 공여체 주형 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 변이체의 mRNA, DNA 표적화 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함한다. 선택적으로 렌티바이러스는 뉴클레아제 변이체의 mRNA, DNA 표적화 crRNA 분자, tracrRNA 분자 및 공여체 주형 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 단백질 변이체, DNA 표적화 crRNA 분자 및 tracrRNA 분자를 포함한다. 선택적으로, 렌티바이러스는 뉴클레아제 단백질 변이체, DNA 표적화 crRNA 분자, tracrRNA 분자, 상동성 기반 복구를 위한 DNA 공여체 주형 분자를 포함한다.
전술된 바와 같이, 본원에 기재된 조성물은 비-통합 렌티바이러스 입자 방법, 예를 들어 LentiFlash®시스템을 사용하여 표적 세포로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 표적 세포로의 RNA의 전달이 표적 세포 내부에서 본원에 기재된 조성물의 조립을 초래하도록, 표적 세포 내로 mRNA 또는 다른 유형의 RNA를 전달하기 위해 이용될 수 있다. 또한 PCT 국제 공개 WO2013/014537, WO2014/016690, WO2016185125, WO2017194902, 및 WO2017194903을 참조한다.
레트로바이러스의 향성(tropism)은 외래 외피 단백질을 포함시킴으로써 변경되어, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키거나 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터이고, 일반적으로 높은 바이러스 역가를 가져온다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 따라 다르다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6 내지 10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력을 갖는 시스-작용 장형 말단 반복부(cis-acting long terminal repeat)로 구성된다. 최소 시스-작용 LTR이 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 그 후, 표적 세포 내로 치료용 유전자를 통합시켜 영구적인 이식유전자(transgene) 발현을 제공하기 위해 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 MuLv(murine leukemia virus), GaLV(gibbon ape leukemia virus), SIV(Simian Immunodeficiency virus), HIV(Human Immunodeficiency virus), 및 이들의 조합에 기반한 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher Panganiban, J. Virol. (1992); Johann et al., J. Virol. (1992); Sommerfelt et al., Virol. (1990); Wilson et al., J. Virol. (1989); Miller et al., J. Virol. (1991); PCT 국제 공개 WO/1994/026877A1 참조).
적어도 6개의 바이러스 벡터 접근법이 현재 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 이용 가능하며, 이는 형질도입체(transducing agent)를 생성하기 위해 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터(defective vector)의 보완을 포함하는 접근법을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar et al., Blood (1995); Kohn et al., Nat. Med. (1995); Malech et al., PNAS (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료법 시험에서 사용된 최초의 치료용 벡터이었다 (Blaese et al., Science (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에서 관찰되었다 (Ellem et al., Immunol Immunother. (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. (1997)).
패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는 데 사용된다. 이러한 세포는 아데노바이러스, AAV를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료법에서 사용되는 바이러스 벡터는 일반적으로 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생산자 세포주(producer cell line)에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합(적용 가능한 경우)을 위해 요구되는 최소 바이러스 서열을 포함하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 코딩하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 결여된(missing) 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료법에서 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합을 위해 요구되는 AAV 게놈으로부터의 ITR(inverted terminal repeat) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 세포주에서 패키징되며, 이는 나머지 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 코딩하나, ITR 서열은 없는 헬퍼 플라스미드를 포함한다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부재로 인해 유의한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 추가적으로, AAV는 바큘로바이러스(baculovirus) 시스템을 사용하여 임상 규모로 생산될 수 있다(미국 특허 번호 제7,479,554호 참조).
여러 유전자 치료법 적용에서, 유전자 치료법 벡터는 특정 조직 유형으로 고도의 특이성으로 전달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 리간드를 바이러스의 외부 표면 상의 바이러스 코트(viral coat) 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킴으로써 주어진 세포 유형에 대해 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 목적 세포 유형의 세포 상에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대해 친화도를 갖도록 선택된다. 예를 들어, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751(1995)은 MMLV(Molony murine leukemia virus)가 gp70에 융합된 인간 헤레귤린(heregulin)을 발현하도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다는 것을 보고하였다. 이 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확장될 수 있고, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 사상 파아지(filametous phage)는 실질적으로 임의의 선택된 세포성 수용체에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항체 단편(예를 들어, FAB 또는 Fv)을 표시하도록 조작될 수 있다. 전술된 내용은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수에 유리한 특정 흡수 서열을 포함하도록 조작될 수 있다.
유전자 치료법 벡터는 하기 기재된 바와 같이, 전형적으로 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 진피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해, 개별 환자에 대한 투여에 의해 생체내 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검)와 같은 생체외 세포 또는 범용 공여체 조혈 줄기 세포(universal donor hematopoietic stem cell)와 같은 세포로 생체 외에서 전달된 후, 보통 벡터를 내포하는 세포에 대한 선택 후에, 환자 내로의 세포의 재이식이 이어질 수 있다.
진단, 연구, 또는 유전자 치료법(예를 들어, 숙주 유기체 내로의 형질감염된 세포의 재주입을 통한 유전자 치료법)을 위한 생체외 세포 형질감염은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 구체예에서, 세포를 대상 유기체로부터 단리하고, RNA 조성물로 형질감염시키고, 대상 유기체(예를 들어, 환자) 내로 다시 재주입한다. 생체외 형질감염에 적합한 다양한 세포 유형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, 환자로부터 세포를 어떻게 단리하고 배양하는지의 논의에 대해, Freshney, et al., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 및 그에서 인용된 참조문헌 참조).
적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비-한정적 예는 COS, CHO(예를 들어, CHO--S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포, 임의의 식물 세포(분화 또는 미분화)뿐만 아니라, 곤충 세포, 예컨대, 스포돕테라푸기페르다(Spodopterafugiperda(Sf)), 또는 진균 세포, 예컨대, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)를 포함한다. 특정 구체예에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 추가적으로, 1차 세포가 단리되고, 뉴클레아제 시스템(예를 들어, CRISPR/Cas)에 의한 처리 후 치료될 대상체 내로의 재도입을 위해 생체외에서 이용될 수 있다. 적합한 1차 세포는 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 및 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포와 같은 기타 혈액 세포 서브세트를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 세포는 또한 예로서, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(CD34+), 신경 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포를 포함한다.
일 구체예에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 치료법을 위한 생체외 절차에서 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 장점은 줄기 세포가 인 비트로에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나 골수에서 생착될 포유동물(예컨대, 세포의 공여체) 내로 도입될 수 있다는 것이다. 인 비트로에서 CD34+ 세포를 GM-CSF, IFN-감마 및 TNF-알파와 같은 사이토카인을 사용하여 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법이 알려져 있다(비한정적인 예로서, Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참조).
줄기 세포는 알려진 방법을 이용하여 형질도입 및 분화를 위해 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 원치 않는 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화 항원 제시 세포)에 결합하는 항체로 골수 세포를 패닝(panning)함으로써 골수 세포로부터 단리된다(비한정적 예로서, Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992) 참조). 변형된 줄기 세포가 또한 일부 구체예에서 사용될 수 있다.
특히, 본원에 기재된 OMNI-50 변이체 중 어느 하나는 유사분열-후(post-mitotic) 세포 또는 활발히 분열 중이 아닌 임의의 세포, 예를 들어 정지된(arrested) 세포에서 게놈 편집에 적합할 수 있다. 본 발명의 OMNI-50 변이체를 사용하여 편집될 수 있는 유사분열-후 세포의 예는 근육세포, 심근세포, 간세포, 골세포 및 신경세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
치료 RNA 조성물을 포함하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 리포좀 등)가 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 RNA 또는 mRNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉으로 도입하기 위해 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에게 잘 알려져 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 이용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
면역 세포(예를 들어, T-세포) 내로의 이식유전자의 도입에 적합한 벡터는 비-통합 렌티바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2009/0117617호를 참조한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물 및 조성물을 투여하는 데 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 하기 기재된 바와 같이, 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 이용 가능하다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조)
상동 재조합에 의한 DNA 복구
본 발명의 일부 구체예에서, 변이체 OMNI-50 뉴클레아제는 예를 들면, 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성 기반 복구(HDR)을 포함하나, 그에 한정되지 않는 세포 복구 메커니즘(cellular repair mechanism)을 유도하기 위해 표적 부위에서 DNA 절단을 생성하기 위해 이용된다.
용어 "상동성 기반 복구(homology-directed repair)" 또는 "HDR"은, 예를 들어 DNA에서 이중-가닥 및 단일-가닥 절단의 복구 동안, 세포 내에서 DNA 손상을 복구하기 위한 메커니즘을 지칭한다. HDR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하며 이중-가닥 또는 단일 절단이 일어난 서열(예를 들어, DNA 표적 서열)을 복구하기 위해 "핵산 주형"(핵산 주형 또는 공여체 주형은 본 명세서에서 호환적으로 사용됨)을 사용한다. 이는, 예를 들어 핵산 주형으로부터 DNA 표적 서열로 유전 정보의 전달을 초래한다. HDR은 핵산 주형 서열이 DNA 표적 서열과 상이하고 핵산 주형 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 DNA 표적 서열 내로 포함되는 경우, DNA 표적 서열의 변경(예를 들어, 삽입, 결실, 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 구체예에서, 전체 핵산 주형 폴리뉴클레오티드, 핵산 주형 폴리뉴클레오티드의 일부, 또는 핵산 주형의 카피가 DNA 표적 서열의 부위에서 통합된다.
용어 "핵산 주형(nucleic acid template)" 및 "공여체(donor)"는 게놈 내로 삽입되거나 카피되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 핵산 주형은, 표적 핵산에 부가되거나, 표적 핵산에서 변화의 주형이 되거나, 또는 표적 서열을 변형하기 위해 사용될 수 있는, 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵산 주형 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이 또는 초과의 임의의 정수 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이의 임의의 정수), 더 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산 주형은 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 주형은, 예를 들어 표적 위치의 표적 핵산의 야생형 서열에 상응하는, 예를 들어 하나 이상의 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 주형은, 예를 들어 표적 위치의, 표적 핵산의 야생형 서열에 상응하는, 예를 들어 하나 이상의 리보뉴클레오티드의, 리보뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 주형은 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들어, 돌연변이체 유전자의 교정을 위한 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위한, 외인성 서열(또한 "공여체 서열", "공여체 주형" 또는 "공여체"로도 불림)의 삽입이 또한 수행될 수 있다. 공여체 서열은 전형적으로 이것이 배치되는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것이 용이하게 명백할 것이다. 공여체 서열은 목적 위치에서 효율적인 HDR을 가능하게 하기 위해 2개의 상동성 영역에 의해 측접된(flanked) 비-상동성 영역을 포함할 수 있다. 추가적으로, 공여체 서열은 세포 염색질 중 목적 영역과 상동성이 아닌 서열을 포함하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포 염색질과 상동성인 수개의 불연속 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 목적 영역에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재하고, 목적 영역 내 서열과 상동성인 영역에의해 측접될 수 있다.
공여체 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고, 선형 또는 환형 형태로 세포 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제2010/0047805호; 제2011/0281361호; 제2011/0207221호; 및 제2019/0330620호를 참조한다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 핵산말단 가수분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고 및/또는 자가-상보성 올리고뉴클레오티드가 일 말단 또는 양 말단에 라이게이션된다. 예를 들어, Chang and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987); Nehls et al., Science (1996)을 참조한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가적인 방법은 말단 아미노기(들)의 부가 및, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보오스 또는 데옥시리보오스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결(internucleotide linkage)의 이용을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
따라서, 복구를 위해 공여체 주형을 사용하는 본 발명의 구체예는 선형 또는 환형 형태로 세포 내에 도입될 수 있는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 공여체 주형을 사용할 수 있다. 본 발명의 구체예에서 유전자-편집 조성물은 (1) 복구 전에 유전자에서 이중 가닥 절단을 생성하는(affect) 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자 및 (2) 복구를 위한 공여체 RNA 주형을 포함하고, 상기 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자는 제1 RNA 분자이고 공여체 RNA 주형은 제2 RNA 분자이다. 일부 구체예예에서, 가이드 RNA 분자와 주형 RNA 분자는 단일 분자의 일부로서 연결된다.
공여체 서열은 또한 올리고뉴클레오티드일 수 있고 내인성 서열의 유전자 교정 또는 표적화된 변경에 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 벡터 상에서 세포로 도입될 수 있거나, 세포 내로 전기천공될 수 있거나, 당업계에 알려진 기타 방법을 통해 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 내인성 유전자 내의 돌연변이된 서열(예를 들어, 베타 글로빈 내 겸상(sickle) 돌연변이)을 '교정'하는 데 사용될 수 있거나, 내인성 유전자좌 내로 원하는 목적을 갖는 서열을 삽입하는 데 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 복제 원점, 프로모터 및 항생제 내성을 코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여체 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입될 수 있거나, 재조합 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(integrase defective lentivirus: IDLV)) 또는 바이러스-유사 입자에 의해 전달될 수 있다. 트랜스포존-기반 시스템, 예를 들면, 재조합 Sleeping Beauty 트랜스포존 시스템, 또는 재조합 PiggyBac 트랜스포존 시스템과 같은 비-바이러스 벡터가 또한 표적 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전위를 위해 이용될 수 있다.
공여체는 일반적으로 그 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 공여체가 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 구동하는 프로모터에 의해 구동되도록 삽입된다. 그러나, 공여체가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 항시적(constitutive) 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다.
공여체 분자는 내인성 유전자의 전부, 일부가 발현되거나 전혀 발현되지 않도록 내인성 유전자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 이식유전자는, 예를 들어 이식유전자와의 융합체로서, 내인성 서열의 일부(이식유전자에 대해 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되거나 전혀 발현되지 않도록, 내인성 유전자좌 내로 삽입될 수 있다. 다른 구체예에서, 이식유전자(예를 들어, 내인성 유전자를 위한 코딩 서열과 같은 추가적인 코딩 서열을 갖거나 갖지 않음)는 임의의 내인성 유전자좌, 예를 들어 세이프-하버(safe-harbor) 유전자좌, 예를 들어 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12c(또한 AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 또는 Rosa 유전자 내로 통합된다. 예를 들어, 미국 특허 제7,951,925호 및 제8,110,379호; 미국 공개 제2008/0159996호; 제20100/0218264호; 제2010/0291048호; 제2012/0017290호; 제2011/0265198호; 제2013/0137104호; 제2013/0122591호; 제2013/0177983호 및 제2013/0177960호 및 미국 가출원 제61/823,689호를 참조한다.
내인성 서열(내인성 또는 이식유전자의 일부)이 이식유전자와 함께 발현되는 경우, 내인성 서열은 전장 서열(야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분적 서열일 수 있다. 바람직하게는, 내인성 서열은 기능적이다. 이러한 전장 또는 부분적 서열의 기능의 비-한정적 예는 이식유전자(예를 들어, 치료용 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩티드의 혈청 반감기 증가 및/또는 담체로서의 작용을 포함한다.
또한, 발현을 위해 요구되지는 않지만, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터(insulator), 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 공여체 분자는 단백질을 코딩하는 유전자(예를 들어, 세포에 또는 개체에 부재하는 단백질을 코딩하는 코딩 서열 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 대안적 버전), 조절 서열 및/또는 마이크로RNA 또는 siRNA와 같은 구조적 핵산을 코딩하는 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
DNA 표적화 RNA 분자
본 발명의 구체예에서, DNA 표적화 RNA 서열은 가이드 서열 부분을 포함한다. RNA 분자의 "가이드 서열 부분(guide sequence portion)"은 특정 표적 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 예를 들어 가이드 서열 부분은 가이드 서열 부분의 길이를 따라 표적화되는 DNA 서열에 완전히 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서, 상기 가이드 서열 부분은 길이가 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 뉴클레오티드, 또는 길이가 대략 17 내지 30, 17 내지 29, 17 내지 28, 17 내지 27, 17 내지 26, 27 내지 25, 17 내지 24, 18 내지 22, 19 내지 22, 18 내지 20, 17 내지 20, 또는 21 내지 22개 뉴클레오티드이다. 가이드 서열 부분의 전체 길이는 가이드 서열 부분의 길이를 따라 표적화된 DNA 서열에 완전히 상보적이다. 가이드 서열 부분은 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 RNA 분자의 일부일 수 있으며, 상기 가이드 서열 부분은 CRISPR 복합체의 DNA 표적화 부분으로 작용한다. 가이드 서열 부분을 갖는 RNA 분자가 CRISPR 분자와 동시에 존재할 때, RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제를 특정 표적 DNA 서열에 표적화할 수 있다. 각각의 가능성은 별개의 구체예를 나타낸다. RNA 분자는 원하는 서열을 표적화하도록 맞춤 설계될 수 있다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시된 방법은 본원에 기재된 구체예 중 어느 하나의 조성물을 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 무세포 시스템 또는 세포의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 식물 세포이다. 일부 구체예에서, 게놈 변형은 세포의 핵 내에서 일어난다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시된 방법은 대상체의 게놈 내의 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형시키는 단계를 포함하는, 게놈 돌연변이와 연관된 질환을 앓고 있는 대상체의 치료를 위한 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나의 용도를 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시된 방법은 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나를 돌연변이 장애와 연관된 대립유전자에 표적화하는 단계를 포함하는, 돌연변이 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 돌연변이 장애는 신생물, 연령-관련 황반 변성, 조현병, 신경학적, 신경변성, 또는 운동 장애, 취약 X 증후군, 세크레타제-관련 장애, 프리온-관련 장애, ALS, 중독, 자폐증, 알츠하이머병, 호중구감소증, 염증-관련 장애, 파킨슨병, 혈액 및 응고 질환 및 장애, 베타 탈라세미아(beta thalassemia), 겸상 적혈구 빈혈, 세포 조절장애 및 종양 질환 및 장애, 염증 및 면역-관련 질환 및 장애, 대사, 간, 고콜레스테롤혈증, 신장 및 단백질 질환 및 장애, 근육 및 골격 질환 및 장애, 피부 질환 및 장애, 신경학적 및 신경 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 각막 질환 및 장애, 망막 질환 및 장애, 및 안구 질환 및 장애 중 임의의 것으로부터 선택되는 질환 또는 장애와 관련된다.
질환 및 치료법
본 발명의 특정 구체예는 유전자 편집, 치료 방법, 또는 치료법의 형태로서 질환 또는 장애와 연관된 특정 유전자좌로 뉴클레아제를 표적화한다. 예를 들어, 유전자의 편집 또는 녹아웃(knockout)을 유도하기 위해, 본원에 개시된 신규 뉴클레아제는 맞춤 설계된 가이드 RNA 분자를 사용하여 유전자의 병원성 돌연변이 대립유전자로 특이적으로 표적화될 수 있다. 가이드 RNA 분자는 바람직하게는 먼저 뉴클레아제의 PAM 요건을 고려하여 설계되며, 이는 또한 본원에서 확인된 바와 같이, 유전자 편집이 수행되는 시스템에 따라 달라진다. 예를 들어, 표적 부위로 OMNI-50 뉴클레아제를 표적화하도록 설계된 가이드 RNA 분자는 OMNI-140 PAM 서열, 예를 들어 "NGG"의 근처에 있는 DNA 이중-가닥 영역의 DNA 가닥에 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 가이드 RNA 분자는 또한 바람직하게는 뉴클레아제의 특이적 활성을 증가시키고 오프타겟 효과를 감소시키기 위해 충분하고 바람직하게는 최적의 길이의 스페이서 영역(즉, 표적 대립유전자에 대해 상보성을 갖는 가이드 RNA 분자의 영역)을 포함하도록 설계된다.
비-한정적인 예로서, 가이드 RNA 분자는 뉴클레아제에 의해 유발되는 DNA 손상 시 비-상동성 말단 연결(non-homologous end joining; NHEJ) 경로가 유도되고 프레임시프트(frameshift) 돌연변이의 도입에 의해 돌연변이 대립유전자의 침묵을 초래하도록, 돌연변이 대립 유전자의 특정 영역, 예를 들어 개시 코돈 근처에 대해 뉴클레아제를 표적화하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 분자 설계에 대한 이러한 접근법은 우성 음성 돌연변이의 효과를 변경하고 이에 의해 개체를 치료하는 데 특히 유용하다. 별개의 비-한정적 예로서, 가이드 RNA 분자는, 뉴클레아제에 의해 유발된 DNA 손상 시 상동성 기반 복구(HDR) 경로가 유도되고 돌연변이 대립유전자의 주형 매개 교정을 초래하도록, 돌연변이된 대립유전자의 특정 병원성 돌연변이를 표적화하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 분자 설계에 대한 이러한 접근법은 돌연변이된 대립유전자의 반수체 기능부전(haploinsufficiency) 효과를 변경하고 이에 의해 개체를 치료하는 데 특히 유용하다.
질환 또는 장애를 치료하기 위한 변경을 위해 표적화될 수 있는 특정 유전자의 비-한정적 예가 본원에서 하기에 제시되어 있다. 돌연변이 장애를 유도하는 특정 질환-연관 유전자 및 돌연변이는 문헌에 기재되어 있다. 이러한 돌연변이는 질환 연관 유전자의 대립유전자에 대해 CRISPR 조성물을 표적화하기 위해 DNA-표적화 RNA 분자를 설계하기 위해 이용될 수 있으며, 상기 CRISPR 조성물은 DNA 손상을 유발하고, DNA 복구 경로를 유도하여 대립유전자를 변경하고 이에 의해 돌연변이 장애를 치료한다.
ELANE 유전자의 돌연변이는 호중구감소증과 연관된다. 따라서, 한정 없이, ELANE를 표적화하는 본 발명의 구체예는 호중구감소증을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 이용될 수 있다. ELANE 유전자를 표적화하고, 호중구감소증의 치료에 유용한 가이드 RNA 분자가 본원에 참조에 의해 포함된, PCT 국체출원 PCT/US2020/059186에 개시된다.
CXCR4는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 감염에 대한 공동 수용체(co-receptor)이다. 따라서, 한정 없이, CXCR4를 표적화하는 본 발명의 구체예는 HIV-1를 앓고 있는 대상체를 치료하거나 대상체에서 HIV-1 감염에 대한 내성을 부여하는 방법에서 이용될 수 있다.
PD-1(programmed cell death protein 1) 파괴는 종양 세포의 CAR-T 세포 매개 사멸을 증가시키고 PD-1은 다른 암 치료법에서 표적일 수 있다. 따라서, 한정 없이, PD-1을 표적화하는 본 발명의 구체예는 암을 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법에서 이용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 치료는 PD-1 결핍이 되도록 본 발명에 따라 변형된 T 세포를 이용한 CAR-T 세포 요법이다.
추가적으로, BCL11A는 헤모글로빈 생산의 억제에서 역할을 하는 유전자이다. 글로빈 생산은 BCL11A를 억제함으로써 탈라세미아 또는 겸상 적혈구 빈혈과 같은 질환을 치료하기 위해 증가될 수 있다. 예를 들어, PCT 국제 공개 WO 2017/077394A2; 미국출원 공개 US2011/0182867A1; Humbert et al. Sci. Transl. Med. (2019); 및 Canver et al. Nature (2015)를 참조한다. 따라서, 한정 없이, BCL11A의 인핸서를 표적화하는 본 발명의 구체예는 베타 탈라세미아 또는 겸상 적혈구 빈혈을 앓고 있는 개체를 치료하는 방법에서 이용될 수 있다.
본 발명의 구체예는 또한, 하기 표 A 또는 표 B에 열거된 질환 또는 장애를 연구, 변경, 또는 치료하기 위해, 임의의 질환-연관 유전자를 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 실제로, 유전자좌와 연관된 임의의 질환은 본원에 개시된 뉴클레아제를 사용하여 적절한 질환-연관 유전자, 예를 들어 미국출원 공개 2018/0282762A1 및 유럽 특허 EP3079726B1에 열거된 것을 표적화함으로써 연구, 변경, 또는 치료될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및/또는 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 균등한 방법 및 물질이 본 발명의 구체예의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질이 하기에 기재된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 추가적으로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것일 뿐이며, 반드시 한정하려는 것이 아니다.
본 논의에서 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 구체예의 특징 또는 특징들의 특징적인 조건 또는 관계를 수식하는 "실질적으로" 및 "약"과 같은 형용사는 조건 또는 특징이 의도된 적용에 대한 구체예의 작동에 허용 가능한 허용 오차 내에서 정의됨을 의미하는 것으로 이해된다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 단어 "또는"은 배타적인 "또는"이 아닌 포괄적인 "또는"인 것으로 간주되며, 그것이 연결시키는 항목들 중 적어도 하나 또는 임의의 조합을 나타낸다.
본원에서 앞서 및 다른 곳에 사용되는 바와 같이 용어 "하나("a" 및 "an")"는 열거된 구성요소 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 단수의 사용은 복수를 포함한다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 용어 "하나" 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 호환 가능하게 사용된다.
달리 표시되지 않는 한, 본 교시를 더 잘 이해하기 위해 및 교시의 범위를 한정하지 않는 방식으로, 양, 백분율 또는 비율을 표현하는 모든 숫자, 및 본 명세서 및 청구범위에서 사용되는 다른 수치는 모든 경우에 용어 "약"으로 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 제시된 수치 파라미터는 얻고자 하는 원하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 개수에 비추어 및 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 출원의 설명 및 청구범위에서, 동사 "포함하다(comprise)", "함유하다(include)" 및 "갖다" 각각 및 이들의 활용어는 동사의 목적어 또는 목적어들이 반드시 동사의 주어 또는 주어들의 구성요소, 요소 또는 부분의 완전한 열거가 아니라는 것을 나타내는 데 사용된다. 본원에서 사용되는 다른 용어는 당업계에 잘 알려진 의미로 정의되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된, 용어 "표적화 서열(targeting sequence)" 또는 "표적화 분자"는 특정 표적 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 분자를 의미하고, 예를 들어, 표적화 서열은 표적화 서열의 길이에 따라 표적화되는 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 표적화 서열 또는 표적화 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 RNA 분자의 일부일 수 있으며, 상기 표적화 서열은 CRISPR 복합체의 표적화 부분(targeting portion)으로 작용한다. 표적화 서열을 갖는 분자가 CRISPR 분자와 동시에 존재하는 경우, RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제를 특정 표적 서열로 표적화할 수 있다. 각각의 가능성은 별개의 구체예를 나타낸다. RNA 분자는 임의의 원하는 서열을 표적화하도록 맞춤 설계될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "표적화(target)"는 표적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 대한 표적화 서열 또는 표적화 분자의 우선적인 혼성화를 의미한다. 용어 "표적화"는, 표적화된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 우선적인 표적화가 존재하지만, 온타겟 혼성화 외에, 의도하지 않은 오프타겟 혼성화가 또한 일어날 수 있도록, 가변 혼성화 효율(variable hybridization efficiency)을 포괄하는 것으로 이해된다. RNA 분자가 서열을 표적화하는 경우, RNA 분자와 CRISPR 뉴클레아제 분자의 복합체는 뉴클레아제 활성을 위해 상기 서열을 표적화하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된, 용어 "야생형(wild type)"은 당업자에 의해 이해되는 당업계의 용어이며 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되는 자연에서 발생하는 유기체, 스트레인(strain), 유전자 또는 특징의 전형적인 형태를 의미한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드의 서열이 야생형 서열을 지칭하는 경우, 변이체는, 예를 들어 치환, 결실, 삽입을 포함하는, 해당 서열의 변이체를 지칭한다, 본 발명의 구체예에서, 조작된 CRISPR 뉴클레아제는 서열번호 1의 야생형 OMNI-50 뉴클레아제와 비교하여, "돌연변이"로도 지칭되는, 적어도 하나의 아미노산 변형(예를 들어, 치환, 결실, 및/또는 삽입)을 포함하는 변이체 CRISPR 뉴클레아제이다.
용어 "비-천연(non-naturally occurring)" 또는 "조작된(engineered)"은 호환적으로 사용되며 인간 조작을 나타낸다. 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 지칭할 때 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 자연에서 자연적으로 회합되고 자연에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의 다른 구성요소가 적어도 실질적으로 없다는 것을 의미할 수 있다.
용어 "돌연변이체(mutant)" 또는 "변이체(variant)"는 호환적으로 사용되며 비-천연이거나 또는 조작된 분자를 나타낸다.
본원에서 사용된, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L형, 광학 이성질체를 포함한 천연 및/또는 비-천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱(peptidomimetic)을 포함한다.
본원에서 사용된, "게놈 DNA"는 목적 세포 또는 세포들에 존재하는 선형 및/또는 염색체 DNA 및/또는 플라스미드 또는 기타 염색체외(extrachromosomal) DNA 서열을 지칭한다. 일부 구체예에서, 상기 목적 세포는 진핵 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 목적 세포는 원핵 세포이다. 일부 구체예에서, 방법은 게놈 DNA 서열의 미리-결정된 표적 부위에서 이중-가닥 절단(DSB)을 생성하여, 게놈의 표적 부위(들)에서 DNA 서열의 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실을 초래한다.
"진핵" 세포는 진균 세포(예컨대, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "변형된 세포(modified cell)"는 표적 서열과의 혼성화, 즉 온타겟 혼성화의 결과로 RNA 분자와 CRISPR 뉴클레아제 변이체의 복합체에 의해 이중가닥 절단이 수행된 세포를 의미한다. 용어 "변형된 세포"는 또한, 변이체에 의해 유도된 이중가닥 절단 후, 돌연변이의 복구(repair) 또는 교정(correction)이 수행된 세포를 포함할 수 있다. 변형된 세포는 임의의 환경, 예를 들면, 단리되거나, 또는 단리되지 않거나, 배양물에 유지되거나, 인 비트로, 엑스 비보, 또는 태반 내(in placenta)의 임의의 타입의 세포, 예를 들면, 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.
본 발명은 본원에 기술된 임의의 변이체 또는 방법을 사용하여 수득된 변형된 세포 또는 세포들을 제공한다. 일 구체예에서, 이들 변형된 세포 또는 세포들은 자손(progeny) 세포를 생성할 수 있다. 일 구체예에서, 이들 변형된 세포 또는 세포들은 생착(engraftment) 후에 자손 세포를 생성할 수 있다. 비-한정적인 예로서, 변형된 세포는 조혈 줄기 세포(HSC), 또는 동종 세포 이식 또는 자가 세포 이식에 적합한 임의의 세포일 수 있다. 본원에 기술된 변이체 및 방법은 또한 CAR-T(chimeric antigen receptor T) 세포를 생성하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 이들 변형된 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 세포를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 이를 제조하는 시험관내 또는 생체외 방법도 제공된다.
본원에서 사용된, 용어 "뉴클레아제"는 핵산의 뉴클레오티드 서브유닛 사이의 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소를 지칭한다. 뉴클레아제는 천연 공급원으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 천연 공급원은 임의의 살아있는 유기체일 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제는 포스포디에스테르 결합 절단 활성을 유지하는 변형된 또는 합성 단백질일 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif)" 또는 "PAM"은 표적화된 DNA 서열에 근접하게 위치하고 CRISPR 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. PAM 서열은 뉴클레아제 정체(identity)에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 야생형 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9는 "NGG" PAM 서열을 인식한다. 숙련된 기술자는 단일 가이드 RNA 분자 또는 crRNA:tracrRNA 복합체가 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성하여 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 옆의 목적 표적 게놈 DNA 서열과 회합할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그 후, 뉴클레아제는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중 가닥 절단을 생성한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 서열 또는 분자는 서열 또는 분자간에 염기 또는 아미노산의 X%가 동일하고 동일한 상대적 위치에 있는 경우, 또 다른 서열 또는 분자에 대해 X% "서열 동일성"을 갖는다. 예를 들어, 제2 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 제1 뉴클레오티드 서열은 동일한 상대적 위치에서 나머지 서열과 동일한, 적어도 95%의 염기를 가질 것이다.
용어 "핵 국소화 서열(nuclear localization sequence)" 및 "NLS"는 세포의 세포질로부터 그와 결합된 단백질의 핵 외피 장벽을 가로지르는 수송을 지시하는 아미노산 서열/펩티드를 나타내기 위해 호환적으로 사용된다. 용어 "NLS"는 특정 펩티드의 핵 국소화 서열뿐만 아니라 핵 외피 장벽을 통과하는 세포질 폴리펩티드의 이동을 지시할 수 있는 그의 유도체를 포함하는 것으로 의도된다. NLS는 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단과 C-말단 둘 다에 부착될 때 폴리펩티드의 핵 이동(nuclear translocation)을 지시할 수 있다. 추가적으로, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 따라 무작위로 위치한 아미노산 측쇄에 N-말단 또는 C-말단에 의해 커플링된 NLS를 갖는 폴리펩티드는 이동될 것이다. 전형적으로, NLS는 단백질 표면에 노출된 양전하를 띤 라이신 또는 아르기닌의 하나 이상의 짧은 서열로 구성되나, 다른 유형의 NLS가 알려져 있다. NLS의 비-한정적 예는 SV40 바이러스 거대 T-항원(SV40 virus large T-antigen), 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin), c-myc, hRNPAl M9 NLS, 임포틴-알파(importin-alpha) 유래 IBB, 근종 T 단백질, 인간 p53, 마우스 c-abl IV, 인플루엔자 바이러스 NS1, 간염 바이러스 델타 항원, 마우스 Mx1 단백질, 인간 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제, 및 스테로이드 호르몬 수용체 (인간) 글루코코르티코이드로부터 유래된 NLS 서열을 포함한다.
용어 "CRISPR 시스템"은 CRISPR 뉴클레아제 단백질, 예를 들면, 본원에 기술된 돌연변이체 또는 변이체, 및 적합한 가이드 RNA 분자 또는 가이드 RNA 복합체, 예를 들면, 단일 가이드 RNA 또는 crRNA:tracrRNA 복합체를 포함하는, 가이드 RNA 분자 또는 가이드 RNA 복합체의 일부와 표적 DNA 서열 사이의 상보성을 기반으로 CRISPR 뉴클레아제 단백질을 원하는 표적 DNA 서열로 표적화하기 위한 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템을 의미한다. 용어 "야생형 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템"은 야생형 CRISPR 단백질 및 적합한 가이드 RNA 분자 또는 가이드 RNA 복합체, 예를 들면, 단일 가이드 RNA 또는 crRNA:tracrRNA 복합체를 포함하는, 가이드 RNA 분자 또는 가이드 RNA 복합체의 일부와 표적 DNA 서열 사이의 상보성을 기반으로 야생형 CRISPR 뉴클레아제 단백질을 원하는 표적 DNA 서열로 표적화하기 위한 CRISPR 엔도뉴클레아제 시스템을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, "유지된 온타겟 편집 활성(maintained on-target editing activity)"은 OMNI-50 변이체가 OMNI-50 변이체와 연관되고, 그에 의해 프로그래밍된 가이드 RNA 분자에 의해 표적화되는 DNA 표적 부위를 표적화하는 능력을 의미한다. 일부 구체예에서, OMNI-50 변이체는 DNA 표적에 대한 야생형 OMNI-50 뉴클레아제의 퍼센트 편집 수준보다 크거나 동일한 퍼세트 편집 수준에서 DNA 표적의 온타겟 편집 활성을 유지한다. 일부 구체예에서, OMNI-50 변이체는 DNA 표적에 대한 야생형 OMNI-50 뉴클레아제의 퍼센트 편집의 적어도 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 30%의 DNA 표적의 온타겟 편집 활성을 유지한다.
전술된 구체예에 있어서, 본원에 개시된 각각의 구체예는 각각의 다른 개시된 구체예에 적용 가능한 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 RNA 분자 또는 조성물이 본 발명의 임의의 방법에서 이용될 수 있다는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된, 모든 표제는 단순히 구성을 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 개시를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 임의의 개별 섹션의 내용은 모든 섹션에 동일하게 적용 가능할 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 장점, 및 신규한 특징은 하기 실시예의 검토 시 당업자에게 명백해질 것이며, 이는 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 추가적으로, 본원에서 상술되고, 하기 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 각각의 다양한 구체예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 뒷받침을 얻는다.
명확성을 위해 별개의 구체예의 상황에서 기재되는, 본 발명의 특정 특징이 또한 단일 구체예에서 조합되어 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 구체예의 상황에서 기재되는 본 발명의 다양한 특징은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합(sub-combination)으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 구체예에서 적합한 바와 같이 제공될 수 있다. 다양한 구체예의 상황에서 기재되는 특정한 특징들은 구체예가 이들 요소 없이 작동되지 않는 경우가 아닌 한, 이들 구체예의 필수적 특징으로 간주되어서는 안 된다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 명명법, 및 본 발명에서 이용되는 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법을 포함한다. 이러한 기법은 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1989); Ausubel, R. M. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (Eds.), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 제시된 바와 같은 방법론; Cellis, J. E. (Ed.), "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III (1994); Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" Third Edition, Wiley-Liss, N. Y. (1994); Coligan J. E. (Ed.), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III (1994); Stites et al. (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (Eds.), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); Clokie and Kropinski (Eds.), "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (2009)]을 참조하며, 이들 모두 참조에 의해 원용된다. 다른 일반 참조문헌이 본 문헌 전체를 통해 제공된다.
본 발명의 보다 완전한 이해를 촉진하기 위해 실시예가 하기에 제공된다. 하기 실시예는 본 발명의 제조 및 실시의 예시적 방식을 예시한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 개시된 특정 구체예에 제한되지 않으며, 이는 단지 예시 목적을 위한 것이다.
실시예
실시예 1: 변이체 선택
표적 부위에 대한 증가된 특이성(예를 들면, 온타겟 절단과 오프타겟 절단 간의 증가된 비율)을 갖는 OMNI-50 뉴클레아제 변이체를 선택하기 위해, 표 1에 표시된 바와 같이, 아미노산 치환을 야생형 OMNI-50 서열(서열번호 1)의 개방 해독 프레임(ORF)에 도입했다.
표 1: 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 및 그의 변이체의 아미노산 위치의 요약. 블랭크 박스는 OMNI-50 변이체가 표시된 위치에 야생형 OMNI-50 뉴클레아제와 동일한 아미노산을 갖는다는 것을 나타낸다.
표 2: SNP를 구별하기 위해 설계되고, OMNI-50 뉴클레아제 변이체 활성 및 대립유전자 특이적 편집을 테스트하기 위해 사용되는 가이드.
실시예 2: OMNI -50 변이체는 ELANE 하류 조성물의 대립유전자 특이적 편집을 보여준다.
야생형 OMNI-50 뉴클레아제과 비교하여 OMNI-50 변이체 뉴클레아제의 개선된 특이성을 g62alt 및 g62ref RNA 가이드 서열을 활용하여 rs1683564의 대체 서열과 대조 서열을 구별하는 뉴클레아제의 능력을 조사하여 입증하였다. 도 1-6c 참조.
sgRNA-564DS-alt를 사용한 편집은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제에 의한 높은 수준의 특이성을 보여주나, sgRNA-564DS-ref는 대조 대립유전자와 대체 대립유전자 모두의 편집에 의해 나타난 구별(discrimination)의 부재를 보였다. HSC에서 4개의 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 v3942, v2902, v3954 및 v3795에 의한 절제에 의해 대립유전자 특이성을 테스트했다.
OMNI-50의 모든 변이체는 ddPCR에 의해 결정된 sgRNA-564DS-alt 대립유전자 구별을 유지하면서, OMNI-50과 비교하여 sgRNA-564DS-ref에 대한 개선된 특이성을 나타냈다(도 4a). 대립유전자 구별 외에, sgRNA-564DS-ref, sgRNA-564DS-alt 및 sg-constant에 대한 하나의 오프타겟이 검증되었고, <0.5% 편집 활성을 특징으로 하는 OMNI-50과 비교하여 높은 수준의 변이체 충실도(variant fidelity)를 보였다(도 4b 및 도 4c).
이러한 결과는 OMNI-50 뉴클레아제 변이체의 상대적으로 높은 충실도를 강조한다.
실시예 3: 신규한 CRISPR 뉴클레아제에 의한 돌연변이 대립유전자 녹아웃은 ELANE 호중구 감소증에서 골수 생성을 촉진한다.
대표적인 ELANE 돌연변이 및 각각의 치료 전략.
중증 선천성 호중구감소증(SCN)은 ELANE 유전자의 많은 이형접합성 돌연변이와 연관된다(도 7a). 현재 연구는 각 병원성 돌연변이를 독립적으로 편집하는 대신, 대다수의 ELANE-매개 SCN 돌연변이에 인접한 SNP의 이형접합 부위를 표적화하는 것에 의해 돌연변이된 ELANE 대립유전자를 제거하기 위한 새로운 접근법을 제시한다. ELANE 유전자에 있는 수백 개의 잠재적 SNP 중에서, 건강한 개체 데이터베이스(healthy database) 1000 Genomes Project Consortium에서 검색된 3개의 SNP가 건강한 집단에서 흔히 이형접합성인 것으로 확인되었고, 본원에서 rs1683564, rs10414837 및 rs3761005로 지칭된다(도 7b 상단 및 도 10a). 건강한 집단과 환자 집단의 분석은 각 SNP에서 두 집단 사이의 유사한 이형접합성 빈도를 밝혔다. 각 집단(각각 건강한 개체 집단 및 환자 집단)의 약 76-85%가 상기 SNP 중 적어도 하나에 대해 이형접합성이었고, 이는 SCN 환자 집단의 약 75% 이상에 대한 본 발명자들의 전략의 적용 가능성을 나타낸다. (도 10b, 보충 표(Supplemental Table) 1). 3개의 SNP 각각에 대해, 본 발명자들은 두 가지 서로 다른 가이드와 OMNI 변이체 3795로 지칭되는 신규한 최적화 CRISPR/Cas9 뉴클레아제를 포함하는 편집 RNP(ribonucleoprotein) 조성물을 개발했다. 하나의 가이드(본원에서 sgRNA 불변(sgRNA constant)로 지칭됨)는 3개의 조성물 모두에 공통적이며 인트론 4에서 두 ELANE 대립유전자를 모두 절단한다. 제2 가이드는 3개의 SNP 중 하나의 이형접합성 형태를 표적화하고, 따라서, 단 하나의 대립유전자만 절단한다. SNP rs1683564를 표적화하는 조성물은 엑손 5 및 전체 3' UTR을 절제하여, 불안정화된 mRNA 전사체의 분해를 유발한다(도 7b, I). SNP rs10414837 또는 SNP rs3761005를 표적으로 하는 조성물은 대부분의 코딩 영역과 프로모터의 절제를 초래하여, 돌연변이된 대립유전자의 전사를 방지한다(도 7b, II 및 III). 현재 연구는 rs1683564 SNP를 표적으로 하는 조성물 I에 중점을 두고 있다. rs1683564 SNP의 보다 일반적인 형태는 시토신이고, 본원에서 대조(ref) 대립유전자로 지칭된다. 아데노신은 이 SNP의 덜 일반적인 형태이고, 본원에서 대체(alt) 대립유전자로 지칭된다. 처리에 앞서, 연관 결정(linkage determination)이라는 과정에서 돌연변이와 SNP가 동일한 대립유전자 또는 상이한 대립유전자에 존재하는지를 결정하기 위해 환자 세포의 유전자형을 분석한다(도 11). 병원성 돌연변이가 대조 대립유전자와 연관된 경우, SNP의 시토신 형태를 표적으로 하는 가이드(sgRNA(ref))를 포함하는 뉴클레아제-가이드 RNA 조성물(본원에서 RNP(ref)로 지칭됨)이 선택된다. 병원성 돌연변이가 대체 대립유전자에 연관된 경우, SNP의 아데노신 형태를 표적으로 하는 가이드(sgRNA(alt))를 포함하는 조성물이 선택된다(본원에서 RNP(alt)로 지칭됨). 가이드는 단 하나의 뉴클레오티드만 다르며 sgRNA 불변(sgRNA constant)과 함께 사용되면, 동일한 편집 결과를 가져온다(도 12).
SNP 기반 녹아웃 전략에서 OMNI 변이체 3795 뉴클레아제를 사용한 대립유전자 특이성 및 절제 효율성. 두 대립유전자 모두에서 표적 유전자를 절단하는 대부분의 CRISPR 관련 편집 전략과 달리, 본 발명자들의 접근 방식은 야생형 기능성 대립유전자를 온전하게 유지하면서, 돌연변이된 대립유전자를 제거하는 것이다. 본 발명자들의 단일 대립유전자 편집(mono-allelic editing) 전략의 타당성을 입증하기 위해, 건강한 공여자와 SCN 환자로부터 채취한, SNP rs1683564에 이형접합성인 HSC를 (그들의 연관에 따라) RNP(ref) 또는 RNP(alt)를 사용하여 절제하거나 미처리 상태로 두었다(NT). HSC는 CD34+ 확장 배지에서 3일 동안 회복시키고, 증식 및 골수 전구세포 분화를 위해 IL-3, SCF, GM-CSF 및 G-CSF의 존재 하에서 7일 동안 배양하고, 뒤이어 호중구 분화를 위해 추가적인 7일 동안 G-CSF로 자극했다(도 8a).
게놈 DNA 또는 RNA 추출을 위해 분화의 6일차 및 14일차에 세포의 일부를 채취했다. 대립유전자 특이성은 대체 대립유전자 또는 대조 대립유전자에 결합하는 2개의 경쟁적 프로브에 의해 결정했다. (프로브의 특이성에 대해서는 보충 방법 및 도 19a 및 도 19b를 참조한다.) RNP(ref) 조성물을 테스트하기 위해, 본 발명자들은 대조 대립유전자에 돌연변이를 갖는 P41 SCN 환자(SCN-P41)로부터의 HSC와 V3 건강한 공여자(HD-V3)로부터의 HSC를 사용했고, 둘 모두 SNP의 대조 형태에 이형접합성이었다. ddPCR은 HD-V3 및 SCN-P41의 HSC에서 각각 대조 대립유전자의 약 40% 및 약 20%만이 온전하게 유지되어서, RNP(ref)를 사용한 편집이 특이적이라는 것을 보여주었다(도 8b). 그러나, 미처리 세포(NT)와 유사한 높은 수준에 의해 표시된 바와 같이, 대체 대립유전자는 RNP(ref) 조성물에 의해 영향을 받지 않았다(도 8b). 이러한 결과는 RNP(ref) 조성물에 의한 처리가 대립유전자 특이적 편집으로 이어진다는 것을 입증했다.
다음으로, 본 발명자들은 호중구 분화의 6일차 및 14일차에 절제 효율을 평가했다. 두 개의 상이하게 표지된 프로브, 현재의 절제 전략에 의해 영향을 받지 않는 엑손 1에 대한 프로브와 절제 시 분해되는 엑손 5에 대한 제2 프로브를 사용하여 ELANE 유전자의 두 영역을 증폭시켜 절제를 결정했다(도 6B, I). 두 프로브의 신호 사이의 비율을 절제 효율로 변환시켰다. RNP(ref)에 의한 처리는 HD-V3의 HSC에서 약 13%의 절제를 가져왔고, SCN-P41의 HSC에서는 약 25%의 절제를 가져왔다(도 8c). 뉴클레아제의 높은 특이성을 고려할 때(도 8b), 이 절제는 SCN-P41의 HSC에서 대조 대립유전자에서 절제가 일어난 세포 집단의 약 50%와 상관되었다. RNP(ref) 처리는 또한, EvaGreen 염색으로 측정된 바와 같이, SCN-P41의 HSC에서 약 6%의 역위 사건을 포함했다(도 13a 및 도 13b). 주목되는 것은, 건강한 공여자의 HSC에서 RNP(ref) 매개 절제 수준을 평가하는 다른 실험에서는 위에 보고된 것보다 더 높은 절제 수준이 나타났으며, 이는 SCN-P41의 HSC에서 측정된 것과 유사했다(도 14). 또한, 엑손 4-존재 돌연변이(exon 4-harboring mutation)를 표적으로 하는 SCN-P41 세포로부터의 cDNA에 대한 NGS 분석에서는 미처리 세포에서 야생형과 돌연변이된 대립유전자 간의 비율이 1:1인 것으로 나타났다. RNP(ref) 처리는 돌연변이된 대립유전자 전사체를 차등적으로 감소시켜, 야생형 대립유전자를 풍부하게 함으로써 야생형 대립유전자 대 돌연변이된 대립유전자 비율을 3:1로 변경시켰다(도 8d).
RNP(alt) 조성물의 특이성 및 효율성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 대체 대립유전자에 돌연변이가 있고, SNP의 대체 형태에 이형접합성인 P55 SCN 환자(SCN-P55)의 HSC를 사용했다.
RNP(alt) 기반 처리는 대체 대립유전자의 약 90%의 편집을 초래했고(단지 10%만 온전하게 유지됨), 대조 대립유전자는 분화 6일차에 온전하게 유지되었다(도 8e). SCN-P55 HSC의 절제 수준은 호중구 분화 6일차 및 14일차에 약 23%였고(도 8f), 이는 세포 집단의 약 46%가 대체 대립유전자에서 절제가 일어났다는 것을 나타낸다. RNP(alt) 처리는 EvaGreen 염색으로 측정된 바와 같이, SCN-P55 HSC에서 7.6%의 역위 사건을 초래했다(도 13c). 건강한 공여자의 RNP(alt) 편집 HSC의 특이성 및 절제 효율을 테스트하였고, 환자 유래 세포에서 수득된 것과 유사한 것으로 나타났다(도 14). 또한, 엑손 5-존재 돌연변이를 표적으로 하는 SCN-P55 세포의 cDNA에 대한 NGS 분석은 야생형 대립유전자의 농축(enrichment)을 보여주었다(도 8g). ELANE mRNA 수준은 SCN-P41 및 SCN-P55 환자로부터의 세포에서 절제 후 감소했다(도 8h). 절제 후 수득된, WT:돌연변이 대립유전자 비율의 증가를 고려할 때(도 8d 및 도 8g), 감소된 mRNA 수준은 주로 돌연변이된 전사체의 분해의 결과였다.
다음으로, 본 발명자들은 다계통 생착(multilineage engraftment) 및 조혈 재구성(hematopoietic reconstitution)에 필수적인 것으로 간주되는 HSC의 하위 집단(CD34+/CD90+ 세포)에서 RNP(alt) 기반 절제가 발생했음을 확인했다(도 15a-15c).
각각 RNP(ref) 및 RNP(alt)를 사용하여 편집된 P41 및 P55로부터의 HSC를 Amplicon NGS로 분석하여 불변 가이드(SgRNA(constant)), 대조 가이드(SgRNA(ref)) 및 대체 가이드(SgRNA(alt))에 대해 확인된 오프타겟에 대한 편집을 측정했다.
구체적으로, 변이체 3795 뉴클레아제와 각각의 불변 가이드(SgRNA(constant)), 대조 가이드(SgRNA(ref)) 및 대체 가이드(SgRNA(alt))를 이용한 전체-게놈 오프타겟 절단의 불편 서베이(unbiased survey)(GUIDE-seq)는 확인된 오프타겟(≤ 4 불일치)을 초래하지 않았다(도 20a-20c).
또한, 각 가이드에 대해 인실리코(in silico) 오프타겟 분석을 수행하여 수개의 잠재적인 오프타겟을 확인했다. 환자 SCN-P41 및 SCN-P55의 편집된 HSC에 대해 수행된 rhAmpSeq 분석에 의해 이러한 오프타겟 중 어느 것도 검증되지 않아(도 20d), 신규한 뉴클레아제 조성물의 높은 충실도를 입증했다.
종합하면, 위에 제공된 결과는 야생형 기능성 대립유전자를 온전하게 보존하면서 돌연변이 대립유전자를 표적화할 수 있는 활성의 고도로 정확한 뉴클레아제를 제시한다.
OMNI 변이체 3795 촉진 편집은 시험관 내에서 호중구 분화 및 성숙을 촉진한다. SNP 기반 단일 대립유전자 편집 접근법의 기능적 결과를 입증하기 위해, 본 발명자들은 분화 14일차에 시험관 내에서 RNP(ref)-편집 및 미처리 건강한 공여자 및 환자 유래 HSC의 호중구 분화 및 성숙 능력을 평가했다. 유세포 분석 결과는, SCN-P41 유래 HSC의 단 36%와 비교하여, 분화 프로토콜을 거친 HD-V3 HSC의 약 74%가 호중구(CD66b+, 도트 플롯의 오른쪽 2개의 분기(quarter)(Q2+Q3))로 분화되었다는 것을 보여주었다. 반대로, SCN-P41 유래 HSC의 38% 대비, HD-V3 HSC의 약 15%만이 단핵구(CD14+/CD66b-, 도트 플롯의 왼쪽 상단 분기(Q1))로 분화되었다. 이러한 관찰은 SCN 환자의 특징적인 조혈 결함과 일치한다. (도 9a-9c; NT: HD-V3 대 SCN-P41). RNP(ref)로 처리된 SCN-P41 유래 HSC는 호중구(CD66b+ 세포)의 74% 증가 및 단핵구 서브세트(CD14+/CD66b-)의 2배 감소를 보였다 (도 9a-9c; SCN-P41: NT). 대 RNP(ref)). CD11b+/CD15+ 세포의 유세포 분석에 의해 SCN-P41-유래 편집된 HSC에서 호중구 수의 유사한 증가가 관찰되었다(도 16a 및 16b). HD-V3의 HSC에서 RNP(ref) 매개 편집은 단핵구 및 호중구 서브세트에 영향을 미치지 않아서, 이 조성물의 안전성을 뒷받침했다(도 9a-9c; HD-V3: NT 대 RNP(ref)).
본 발명자들의 대립유전자 특이적 편집 접근법이 SCN과 관련된 세포 이상을 크게 개선했다는 것을 입증한 후, 본 발명자들은 다음으로 RNP(ref) 처리 및 미처리 건강한 공여자(V3) 및 환자(P41) HSC 유래 호중구의 호중구 기능을 평가했다. 상이한 그룹으로부터의 호중구에 의한 자이모산 그린(zymosan green) 입자의 식세포성 흡수(phagosomal uptake)를 측정하여 시험관 내 식세포 능력을 테스트했다. 유세포 분석은 HD-V3 및 SCN-P41 모두의 RNP(ref) 처리 및 미처리 호중구에서 동등한 수준의 식균작용을 보여주었다(도 9d). 또한, 미처리 건강한 공여자 HSC(HD-V3, NT) 및 RNP(ref) 처리된 환자 HSC(SCN-P41, RNP(ref))에서 유래된 호중구를 박테리아 루시퍼라아제를 발현하는 대장균과 인큐베이션하고, RLU(relative light unit)로 표현된 발광의 실시간 변화를 추적하여, 항균 살상 능력(anti-bacterial killing capacity)을 조사했다. 두 그룹을 박테리아 단독(호중구가 없는 대장균 대조군)과 비교하였다. 건강한 공여자 및 RNP(ref) 처리 환자 유래 호중구는 박테리아 단독 대조군과 비교하여 박테리아 유닛(RLU)의 23-25% 감소로 나타난 바와 같이 효율적인 박테리아 살상을 나타냈다. 실험은 50,000 및 100,000개의 HSC로 수행되었다(도 9e).
RNP(ref) 조성물을 사용한 실험은 다른 환자(SCN-P42)의 세포에서 수행되었고, 호중구 분화의 회복을 입증하는 조직학적 염색을 포함한 유사한 절제, 분화 및 기능적 결과를 나타냈다(도 21A-21J). 따라서, RNP(ref) 조성물에 의한 ELANE 돌연변이 대립유전자의 특이적 절제는 호중구에 대한 약화된 분화의 비정상적인 표현형을 개선하고 호중구 기본 기능을 보존했다. RNP(alt) 조성물에 대해서 유사한 분석을 수행했다. 유세포 분석은 HD-V4 유래 HSC의 약 83%가 호중구(CD66b+, 도트 플롯의 오른쪽 2개 분기(Q2+Q3))로 분화되었고 약 7%가 단핵구(CD14+/CD66b-, 도트 플롯의 왼쪽 상단 분기(Q1))로 분화되었다는 것을 보여주었다. SCN-P55 유래 HSC는 호중구로의 더 낮은 분화(약 53%)와 단핵구로의 더 높은 분화(약 29%)를 보여(도 9f-9h; NT: HD-V4 대 SCN-P55), 전형적인 SCN 조혈 결함을 나타냈다. RNP(alt)로 처리된 SCN-P55 유래 HSC는 호중구(CD66b+ 세포)의 1.5배 증가 및 단핵구 서브세트(CD14+/CD66b-)의 3배 감소를 보였다(도 9f-9h; SCN-P41: NT 대 RNP(alt)). CD11b+/CD15+ 세포의 유세포 분석에 의해 SCN-P55-유래 편집된 HSC에서 호중구 서브세트의 유사한 증가가 관찰되었다(도 16c 및 16d). RNP(alt)로 처리되거나 뉴클레아제 조성물 없이 전기천공된 SCN-P55 유래 HSC(SCN-P55 Mock)의 Diff-Quik 염색은 Mock 그룹 대비 RNP(alt) 처리 그룹에서 더 높은 개수의 고전적인 다형핵 호중구 형태를 갖는 세포를 보여주었다 (도 9i). 자이모산 그린 입자의 유세포 분석은 SCN-P55로부터의 미처리 호중구에 비해 RNP(alt) 처리 호중구에서 약간 더 높은 수준의 식균 작용을 보여주었다(도 9j). 또한, 건강한 미처리(HD-V4, NT) 및 환자 RNP(alt) 처리(SCN-P55, RNP(alt)) 호중구는 박테리아 단독 대조군과 비교하여 박테리아 유닛(RLU)의 유의한 30% 감소에 의해 나타난 바와 같이 효율적인 박테리아 살상을 나타냈다 (도 9k).
RNP(alt) 조성물을 사용한 실험은 다른 환자(SCN-P12)의 세포에서 수행되었고, 유사한 절제, 분화 및 기능적 결과를 보여주었다(도 22A-22I). 또한, 이전 환자에서 발견된 돌연변이(엑손 4 및 5)의 상류에 위치한 엑손 2에 돌연변이가 있는 환자 세포(SCN-P56)에 대해 수행된 또 다른 실험에서도 유사한 결과가 나타났다(도 23A-23I). 본원에 기술된 결과는 RNP(ref) 및 RNP(alt) 신규 뉴클레아제 조성물을 사용한, ELANE 돌연변이 대립유전자의 단일 대립유전자 녹아웃이 호중구 분화를 촉진하고 필수 호중구 핵심 기능을 유지하는 데 모두 안전하고 효과적이라는 것을 나타낸다.
OMNI 변이체 3795는 추적가능한 오프타겟 없이 높은 충실도를 보였다. 이는 PAM 서열의 획득(gain)에 의해 매개되지 않는 특이적 단일 대립유전자 유전자 편집을 입증하는 첫 번째 보고이다. 본 발명자들의 신규한 뉴클레아제의 이러한 독특한 특징은 다른 기술로 해결할 수 없는 대부분의 유전 질환을 포함한 우성, 우성 음성(dominant negative), 및 복합 이형접합성(compound heterozygous)인 다양한 적응증에서 구현될 수 있다.
OMNI 변이체 3795 조성물은 약 25%의 절제 효율을 나타냈다. 특히, 이 뉴클레아제 조성물의 높은 대립유전자 특이성을 고려할 때, 세포 집단의 약 50%가 돌연변이 대립유전자에서 절제를 겪었던 것으로 추정된다. 기능적 측면과 관련하여, ELANE 단일 대립유전자 절제는 시험관 내에서 호중구 분화를 크게 증진시켰다. 이는 또한 SCN 환자의 조혈 결함과 일치하는, 단핵구의 비정상적인 개수를 감소시켰다. 절제된 호중구는 정상적인 식세포 및 박테리아 살상 능력을 보여, 편집이 효과적이고 안전했다는 것을 나타냈다.
따라서, 이 실시예는 특이적 단일 대립유전자 절제의 신규한 CRISPR/Cas9 기반 전략을 제시한다. 이러한 전략은 효율적이고 기능적이며 정확하고 안전한 것으로 확인되었다.
실시예 3: 재료 및 방법
인간 HSC 단리: HSC는 SCN 환자의 골수 및 건강한 공여자의 동원된(mobilized) 말초 혈액에서 단리하였다.
CRISPR / Cas9 OMNI 변이체 3795 ELANE 유전자 편집: 1:2.5 몰비(OMNI 변이체 3795 뉴클레아제:sgRNA)의 리보핵단백질(RNP) 시스템을 사용했다. 인간 CD34+ 세포를 CA-137 프로그램(Lonza 4D, NucleofectorTM)을 이용하여 전기청공시켰다.
ddPCR(Digital Droplet PCR) (절제, 대립유전자 특이성): 게놈 DNA에 대해 Digital Droplet PCR™을 사용하여 절제 및 대립유전자 특이성을 측정했다. 절제 반응을 위해, 두 개의 상이한 프로브 FAM(X1) 및 HEX(X1)을 각각 사용하여 ELANE 유전자의 두 영역인 엑손 1 및 엑손 5의 증폭을 수행했다. 프로브 신호 사이의 비율을 절제 효율로 변환시켰다. 대립유전자 특이성을 위해, FAM 프로브(대체 대립유전자에 결합함) 및 HEX 프로브(대조 대립유전자에 결합함)를 사용했다(FAM+HEX). 두 프로브 사이의 비율은 내인성 유전자에 대해 정규화시켰다.
돌연변이:야생형 대립유전자 비율의 평가: 각각 환자 41 및 55에서 S126L 및 R220Q 돌연변이가 존재하는 엑손 4 및 5를 표적으로 하는 차세대 시퀀싱(NGS)을 이용하여 cDNA를 맵핑하였다. 처리된 세포에서 돌연변이:야생형 대립유전자의 상대적 비율을 계산하고, 미처리 세포에서의 비율과 비교했다.
분화 분석: 편집된 미처리 HSC를 Nasri et al.에서 채택한 분화 프로토콜에 적용시켰다. 14일차에, 세포를 단핵구(CD14+/CD66b-) 및 호중구(CD66b+) 서브세트에 대해 유세포 분석법으로 분석했다.
박테리아 사멸 분석(bacterial killing assay): 13일차 분화된 HSC를 J. T. Atosuo에 기술된 바와 같이 박테리아 사멸능에 대해 평가했다. RLU(relative light unit)를 5시간에 걸쳐 측정하였다. 제시된 마지막 시점은 RLU 수준이 안정기에 도달한 때이다. 분화된 HSC가 없는 (대장균 단독) 웰과 식세포작용(phagocytosis) 억제제인 시토칼라신(Cytochalasin) D(데이터는 표시되지 않음)를 포함하는 웰이 대조군으로 사용되었다.
식세포작용 분석: 식세포 능력은 EZCell™ Phagocytosis Assay Kit(Green Zymosan)(BioVision, Cat no. K397)를 이용하여 평가했다. 옵소닌화 형광 자이모산 그린(Zymosan Green) 입자의 내재화에 대해 유세포 분석법으로 세포를 분석했다.
FACS 항체, 프로브, 서열, 분석, 프로토콜 및 추가 방법에 대한 상세한 내용은 보충 방법에 제공된다.
실시예 3: 보충 방법(Supplemental Methods)
인간 SCN 환자 HSC 분리: 새로 수집한 골수 3 내지 6ml를 주변 온도에서 밤새 수송했다. 조혈 줄기 및 전구 세포인 HSPC를 먼저 제조사의 프로토콜에 따라 RosetteSep Human Bone Marrow Progenitor Cell Pre-Enrichment Cocktail(Cat. No. 15027) 및 Lymphoprep(Cat.no. 07801)을 사용하여 처음에 농축시켰다. 1% Penn Strep(Cat.no 03-031-1B, Biological Industries), 1x StemSpan CD34 Expansion Supplement(10x)(Cat.no. 02691) 및 1.0μM UM729(Cat.no.72332)가 보충된 CD34+ 확장 배지(StemSpan SFEMII 배지(Cat.no. 09655))에서 37℃, 5% CO2하에 4일 동안 배양하여 HSC 농축 세포 집단(HSC enriched cell population)을 확장했다. 확장 후, 제조사의 프로토콜에 따라 EasySep Human CD34 Positive Selection Kit II(Cat.no. 17856)를 사용하여 CD34+ 세포를 추가로 농축했다. 농축된 CD34+ 세포를 Cryostor CS10(Cat.no. 07931)에 1x106개 세포/ml로 냉동보존했다. 세포를 증기상 액체 질소에 보관했다. 달리 명시하지 않는 한, 모든 카탈로그 번호는 StemCell Technologies로부터의 재료를 지칭한다.
인간 건강한 공여체 HSC 단리: 동원된 말초 혈액으로부터의 냉동보존된 건강한 인간 CD34+ 전구 세포를 Lonza(Cat no. 4Y-101C)로부터 수득했다. 세포를 50,000개 세포/ml로 CD34+ 확장 배지에 현탁시키고 전기천공 전에 37℃, 5% CO2에서 4일 동안 확장시켰다.
CRISPR / Cas9 OMNI 변이체 3795 ELANE 유전자 편집: HSC 편집은 17㎍ 뉴클레아제 및 262pmol의 각 가이드를 포함하는, 1:2.5(뉴클레아제:sgRNA)의 몰비의 리보핵단백질(RNP) 시스템을 사용하여 수행되었다. 뉴클레아제와 sgRNA 복합체를 25℃에서 10분간 인큐베이션했다. 인간 CD34+ 세포를 PBS로 1회 세척했다. 2x105 CD34+ 세포를 20㎕의 P3 전기천공 완충액(Lonza P3 키트 S)에 현탁하고 RNP 믹스에 첨가했다. 전기천공 후 CA-137 프로그램(Lonza 4D, Nucleofector™)을 사용하여 세포를 미리 가온된 CD34+ 확장 배지로 1.25.0 x 105 세포/ml의 농도로 옮겼다. 가이드는 Agilent에서 제조되었다. 가이드 서열이 하기 표에 요약된다.
절단율 및 대립유전자 특이성을 위한 Digital Droplet PCR: 제조사의 프로토콜에 따라, QIAamp DNA Micro Kit, Qiagen(Cat no. 56304)을 사용하여 추출한 게놈 DNA에 대해 Digital Droplet PCR™(ddPCR™, Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 절단율(percentage excision) 및 대립유전자 특이성을 측정했다.
ddPCR 반응에는 dUTP가 없는 프로브용 1× ddPCR Supermix(#1863024), HindIII를 사용하여 소화된 DNA(X1 Cutsmart 완충액에서 4U/㎕로 희석됨) 25-100ng 및 적합한 프라이머/프로브가 포함되어 있습니다.　절제 반응을 위해, 각각 FAM(X1) 및 HEX(X1)로 표지된 2개의 서로 다른 프로브를 사용하여 ELANE 유전자의 두 영역인 엑손 1 및 엑손 5의 증폭을 수행했습니다. HEX 신호와 FAM 신호 사이의 비율은 절제 효율로 변환되었습니다.
대립유전자 특이성을 위해 대체 대립유전자를 결합하는 FAM 프로브와 참조 대립유전자를 결합하는 HEX 프로브라는 두 가지 경쟁 프로브를 사용했습니다(FAM+HEX). 이형접합체 비처리 세포에서 두 농도 사이의 비율은 1이며, 이는 각 gDNA 샘플에 대한 내인성 유전자 RPP30 및 STAT1에 대해 표준화되었습니다. 반응 총 부피는 22㎕였습니다. SNP의 참조 형태 또는 대체 형태에 대해 동형접합성인 건강한 공여체 세포로부터 추출된 DNA에 대한 각 프로브의 결합을 ddPCR로 측정하여 프로브가 교차 반응하지 않음을 확인했습니다(도 19A). 더욱이, SNP의 참조 형태에 대해 동형접합성인 건강한 공여체 세포는 RNP(ref) 조성물로 치료할 때 효율적인 절제를 나타내었으며, RNP(alt) 조성물을 사용한 치료와 비교하여 비처리 세포에 필적하는 절제 수준을 초래하였다. 이는 sgRNA의 특정 표적화를 추가로 입증합니다(그림 19B).
ddPCR 혼합물의 게놈 DNA는 QX100 Droplet Generator를 사용하여 개별 액적으로 분할되었고, 96-deep Well PCR 플레이트로 옮겨지고 Bio-Rad PCR 열순환기에서 증폭되었습니다. Bio-Rad 액적 판독기 및 QuantaSoft 소프트웨어를 사용하여 제조업체 지침(Bio-Rad)에 따라 실험을 읽고 분석했습니다.
프라이머와 프로브는 Bio-Rad에서 제조되었으며 아래 표에 자세히 설명되어 있습니다.
돌연변이:야생형 대립유전자 비율 평가: RNP(ref) 또는 RNP(alt)로 처리된 HSC의 cDNA는 환자 41 및 55에서 S126L 및 R220Q 돌연변이가 있는 엑손 4 및 5를 표적으로 하는 차세대 시퀀싱(NGS)을 사용하여 매핑되었습니다. , 각각. 원시 FASTQ 파일을 분석하고 FASTQ to BAM 스크립트를 사용하여 BAM 파일(생물학적 서열을 저장하기 위한 텍스트 기반 형식)을 생성했습니다. 야생형 대립유전자에 대한 돌연변이된 대립유전자의 상대적 비율을 계산하고 두 환자 모두에서 처리되지 않은 세포와 비교했습니다. 프라이머는 아래 표에 자세히 설명되어 있습니다.
분화 분석: 편집된 미처리 HSC를 CD34+ 확장 배지에서 3일 동안 회복시키고 Nasri et al.23에서 채택한 분화 프로토콜에 적용시켰다. 요약하면, HSC를 모두 PeproTech 제품인 1% Glutamax(Cat.no 35050061, Gibco™), 10% FBS(Cat.no 04-001-1A, Biological Industries), 5ng/ml IL-3(Cat.no 200-03), SCF(Cat.no 300-07), GM-CSF(Cat.no 300-03) 및 10ng/ml G-CSF(Cat.no 300-23)가 보충된 RPMI(Cat.no 11875093, Gibco™)에서 증식 및 골수 전구세포 분화를 위해 7일 동안 배양하고, 뒤이어, 호중구 분화 및 성숙을 위해, RPMI, 1% Glutamax, 10% FBS, 1% Penn Strep(Cat.no 03-031-1B, Biological Industries), 10ng/ml G-CSF에서 7일-배양을 수행했다. 14일차에, 단핵구(CD14+/CD66b-) 및 호중구(CD66b+) 서브세트에 대해 유세포 분석으로 세포를 분석했다. CD66b 항-인간, Pacific Blue(Cat No. 305112, Biolegend) 및 CD14, 항-인간, APC(Cat No. 130-110-520, Miltenyi Biotec)를 사용했다.
Cytospin 염색: 분화의 15일차에 8x104 HSC를 Cytospin 4 저속 세포원심분리기(cytocentrifuge)(Thermo Scientific)를 사용하여 Cytoslide 현미경 슬라이드(ThermoFisher)에 스피닝시키고, 제조사의 권장 사항에 따라, Diff-Quick 염색 시스템(MilliporeSigma)으로 염색했다. Nikon DSLR 디지털 카메라를 사용하여 400X 배율에서 LEITZ LABORLUX S 편광 현미경에서 현미경 사진을 촬영했다.
박테리아 사멸 분석: (RNP(ref), RNP(alt)에 의해 편집되거나 또는 미처리된) 건강한 공여자 및 SCN 환자로부터의 13일차 분화 HSC(Nasri 등에서 채택한 분화 프로토콜 적용)를 J. T. Atosuo에 기술된 바와 같이 그들의 박테리아 사멸능에 대해 평가했다. 요약하면, 100,000개의 분화된 HSC를 웰당 200,000개의 루시퍼라아제 발현 박테리아 세포, pAKLUX2(Addgene, Cat No. 14080)의 존재 하에 인큐베이션시켰다. 세포를 200 ㎕ HBSS++, 10% FBS에서 37℃에서 배양했다. 30분 간격으로, 플레이트를 Luminometer(Berthold CentroXS3 LB960)로 옮기고 웰당 0.5초 동안 발광을 측정하여 발광(luminescence)을 측정했다. 발광(light emission), RLU(relative light unit)의 실시간 변화를 5시간에 걸쳐 측정했다. 제시된 마지막 시점은 RLU 수준이 안정기에 도달한 때이다. 분화된 HSC가 없는 (대장균 단독) 웰과 10 ng/ml 식세포작용 억제제인 시토칼라신(Cytochalasin) D(Santa Cruz Biotec, Cat No. sc-20144)를 포함하는 웰이 대조군으로 사용되었다.
식세포작용 분석: 식세포 능력은 EZCell™ Phagocytosis Assay Kit(Green Zymosan)(BioVision, Cat no. K397, 제조사의 프로토콜에 따라)를 이용하여 평가했다. (RNP(ref), RNP(alt)에 의해 편집되거나 또는 미처리된) 건강한 공여자 및 SCN 환자로부터의 14일차 분화 HSC(Nasri 등에서 채택한 분화 프로토콜 적용)를 HBSS++/10% FBS(0.5X106 세포/ml)에 재현탁하고, 200ml 현탁 세포당 5ml 옵소닌화 Alexa Fluor 488-접합 자이모산 입자의 존재 하에 37℃에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 음성 대조군으로서, 세포를 자이모산 그린 시약과의 인큐베이션 1시간 전 및 자이모산 그린 시약과의 인큐베이션 동안 식세포작용 억제제인 시토칼라신 D(Santa Cruz Biotec, Cat No. sc-201442) 10ng/ml와 함께 인큐베이션했다. 그 후, 키트의 설명서에 따라, 세포를 세척하고 소광제(quencher) 용액에서 인큐베이션하여, 내재화되지 않은 입자에서 형광을 제거했다. 그 후, 세포를 옵소닌화 형광 자이모산 그린 입자의 내재화에 대해 유세포 분석법으로 분석했다.
역위(inversion): 역위 사건은 Droplet Digital PCR(ddPCR) 돌연변이 분석에 의해 검출하고 정량화했다. 먼저, SnapGene 소프트웨어를 사용하여 완벽한 역위를 모사하고, NGS로 검증했다. 그 후, dsDNA에 결합하는 형광 DNA-결합 염료인 EvaGreen 염료(BIO-RAD, 카탈로그 번호 186-4034, 제조사의 프로토콜에 따라)를 사용하여 ddPCR로 전체 역위 사건을 정량화했다. 절제된 단편의 역위된 변형을 증폭시키기 위해 특이적 프라이머를 설계했다(도 11의 그림 참조). 형광 신호는 절제에 의해 영향을 받지 않은 ELANE 엑손(Exon) 1 영역의 증폭으로 정규화했다(2개의 상이한 프라이머 세트로 수행함. 평균 정규화된 데이터가 제공됨). 프라이머가 하기 표에 상술된다:
장기 HSC 집단의 절제 수준: AllCells에서 구입한 류코팩(leukopak)으로부터 단리된, 백혈구에서 분리된 두 명의 건강한 공여자(MLP1(3055934); SNP의 대체 형태에 대해 이형접합성 및 MLP2(3055940), SNP의 대체 형태에 동형접합성)의 HSC를 사소한 변경으로, 전술된 'CRISPR/Cas9 OMNI 변이체 3795 ELANE 유전자 편집' 섹션에 따라, 해동 후 1일차에 편집했다. 세포 수는 2M 세포/전기천공이었다. 이에 따라 가이드와 뉴클레아제의 업스케일(upscale)을 수행했다.　85㎍ 뉴클레아제와 1310 pmol의 각 가이드를 포함하는 1:2.5의 몰비(뉴클레아제:sgRNA)를 이용했다. 뉴클레오펙션(nucleofection)은 P3 뉴클레오펙션 용액(Lonza) 및 Lonza 4D-Nucleofector™ X Kit L(프로그램 CA-137)에서 수행했다. 편집 후 3일차에, 인간용 CD90-APC-Vio770(130-114-863 Milteny)을 사용하여 FACS ARIA™ II SORP Flow Cytometer Cell(BD)에서 세포를 분류했다.　Nasri et al.에 따라, 분류된 세포를 증식 배지에서 7일 동안 인큐베이션했다. CD90+, CD90- 및 전체 집단의 절제 수준은 ddPCR 섹션에 설명된 대로 ddPCR을 사용하여 평가하였다.
돌연변이-SNP 연관(Mutation-SNP linkage): 먼저, ELANE 돌연변이 및 가능한 SNP를 표적화된 짧은 리드 NGS에 의해 SCN 환자로부터의 세포에서 확인하였다. 그 후, 돌연변이와 SNP를 모두 포함하는 유전자의 일부를 연관 프라이머(linkage primer)를 이용한 PCR 반응으로 증폭시키고 박테리아에 클로닝했다. 각 클론은 하나의 대립유전자로부터의 앰플리콘을 보유했다. 돌연변이 및 SNP 영역에 대해 여러 클론의 플라스미드를 Sanger 시퀀싱했다(T7 및 SP6 프라이머 사용). 돌연변이와 SNP가 시스(cis)로 존재하는 경우, 그들은 동일한 클론에서 발견되고, 트랜스(trans)로 존재하는 경우, 돌연변이와 SNP는 상이한 클론에서 발견되었다. 프라이머가 하기 표에 상술된다:
건강한 공여자 집단과 환자 집단에서 SNP의 이형접합 빈도: ELANE 유전자 영역(ELANE 유전자의 ± 3kb)을 포함하는 변이체 콜 파일(call file)을 Data Slicer 툴을 사용하여 1000 Genomes Project Consortium(3 단계)에서 다운로드하고 R 통계컴퓨팅 환경(statistical computing environment)에서 분석했다. 3501명의 개체로부터 3501개의 유전자형을 얻을 수 있었다. 분석에서 가족 관계는 제외했고, 결과적으로, 혈연이 아닌(unrelated) 개체로부터 2407개의 유전자형을 얻었다. 모든 공통 다형성(>1% MAF)에 대한 대립유전자 빈도를 계산했다. 대립유전자 특이적 ELANE 녹아웃에 대한 집단 커버리지(coverage)를 최적화하기 위해 3개의 SNP(rs3761005, rs1683564 및 rs10414837 다형성)가 선택되었다. 선택된 3개의 SNP 중 적어도 하나에 대해 이형접합성인 집단의 백분율을 계산했다.
53명 환자의 샘플을 병원성 돌연변이 및 선택된 3개의 SNP에 대해 서열 분석했다. 총 46개의 골수 샘플과 7개의 iPSC 계통(line)을 이용했다. 샘플 중 44개는 SCN 환자로부터 유래되고, 그 중 9개는 주기성 호중구감소증 환자로부터 유래했다. 선택된 3개의 SNP 각각의 이형접합성 빈도 및 이들 중 적어도 하나에 대해 이형접합성인 집단의 백분율을 계산했다.
통계적 방법: 독립 표본에 대한 2-표본 T-검정 또는 ANOVA 모델을 적절하게 적용하여 처리 그룹 간 연속 변수의 차이의 통계적 유의성을 테스트했다. 반복 측정을 통한 이원 분산 분석을 이용하여 사멸 분석(killing assay)을 분석했다. 건강한 (공여자) 집단과 환자 집단 사이의 이형접합성 차이의 통계적 유의성을 테스트하기 위해 카이제곱 검정 또는 Fisher's Exact 검정을 적절하게 적용했다. 모든 테스트는 양측(two-tailed)이었고, 5% 이하의 p-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주했다. 데이터는 Prism 소프트웨어(GraphPad 버전 9.0.2)를 사용하여 분석했다.
보충 표 1
보충 표 1. 환자 집단에 의한 3개의 SNP의 커버리지. SCN 및 주기성 호중구감소증(CyN) 환자로부터 수득된 샘플에서 ELANE 유전자의 3개 SNP의 시퀀싱 결과. ELANE 유전자의 병원성 돌연변이도 시퀀싱을 통해 확인되었다. 녹색 세포는 이형접합성 SNP를 나타낸다.
실시예 4: 뉴클레아제의 특이성 및 충실도에 대한 변이체 3795 돌연변이 각각의 기여
변이체 3795는 오프타겟 활성(<0.05%)이 매우 낮고 단일 불일치가 있는 동일한 유전자의 두 대립 유전자를 구별하는 능력을 갖는, CRISPR 기반 뉴클레아제의 특이성 변이체이다. 이 변이체는 4개의 돌연변이, R478I, Y545H, Q803V 및 L805I를 포함한다. OMNI-50 V3795에서 발견된 각 돌연변이의 활성 및 특이성에 대한 효과 및 기여를 조사하기 위해, 4개의 단일 돌연변이 변이체 중 3개, 및 각 변이체에서 4개의 돌연변이 중 1개가 누락된 것인 4개의 삼중 돌연변이 변이체(triple mutant variant)를 발현시키고, 정제했다(표 A). WT OMNI-50 뉴클레아제, V3795 변이체, 및 sgRNA g62-Ref와의 조립에 의한 7개의 변이체를 이용하여 RNP 복합체를 제조했다. 이들 RNP 복합체를 가이드 서열의 표적에 대한 이형접합성인 LCL 세포에 전기천공했다(표 B). 표적화된 대립유전자(REF) 및 비-표적화 대립유전자(ALT)의 편집 수준을 NGS로 측정했다. 도 17a-17b에서 알 수 있는 바와 같이, V3795의 표적화된 대립유전자(REF)에 대한 구별은 주로 R478I 돌연변이에 의해 기여된다(표 E). R478I 돌연변이를 포함하는 변이체(예를 들면, V6864, V6865, V6866, V3795)만이 표적화된 대립유전자에 대한 명확한 선호를 보였고, 이 돌연변이를 제거하면 구별성이 상실되었다(예를 들면, V6867).
특이성 효과는 NGS에 의해 g62의 2개의 공지된 오프타겟 부위에서 편집 수준을 측정하여 검증하였다(g62OT1 및 g62OT2, 표 C). OMNI-50 V3795는 WT OMNI-50 뉴클레아제와 비교하여 이들 부위에서 매우 낮은 편집 수준을 갖는다(도 18a-18b, 표 F). 모든 3개의 단일 돌연변이체에서, 오프타겟 부위의 WT보다 낮은 편집 수준이 관찰되어, 오프타겟의 감소에 대한 3개의 돌연변이의 기여를 나타냈다. 그러나 Y545H 돌연변이가 오프타겟 편집에서 가장 유의한 감소를 보였다(OT1 0.5% 및 OT2 0.04%, 표 F). 또한 모든 삼중 변이체는 V3795 변이체 뉴클레아제와 유사하게, 매우 낮은 오프타겟 활성을 나타냈다. 주목할 만한 것은, Y545H 돌연변이가 돌연변이 세트에서 제외되었을 때(예를 들면, V6866), 오프타겟 편집이 약간 증가했다는 것이다(OT1 1.90%, OT2 0.2%, 도 18a-18b, 표 F). 종합적으로, 이러한 결과는 V3795 변이 뉴클레아제의 높은 수준의 특이성이 R478I 및 Y545H 돌연변이에 기인한다는 결론을 도출했다.
R478I 및 Y545H가 V3795 변이체 뉴클레아제의 관찰된 특이성을 초래한다는 것이 확립된 후, 다른 치환의 효과를 테스트했다. 이들 위치 각각에 대해, g62-Ref sgRNA 및 나머지 돌연변이의 배경에서 상이한 생화학적 그룹으로부터의 치환을 포함하는 여러 변이체 뉴클레아제를 사용하여 RNP를 생성했다(표 A). 구별성 및 오프타겟에 대한 효과를 전술된 바와 같이 측정했다(도 17a-17b 및 18a-18b).
위치 478에 대해: 변이체 V7087의 아스파르트산(D)과 같은 하전된 아미노산은 구별성을 없애고 오프타겟 편집을 증가시킨다(도 18b). 삼중 변이체 V6867의 아르기닌(R, 대조 아미노산)에 대해서도 구별성에 대한 유사한 효과가 나타난다(도 17a-17b). 그러나, V7086의 발린(V) 및 V3795의 이소류신(I)과 같은 큰 소수성 아미노산은 높은 구별성 및 감소된 오프타겟을 유지한다. V7085의 히스티딘(H)과 같은 방향족 아미노산과 V7088의 세린(S)과 같은 극성 비하전 아미노산도 OMNI-50 V3795와 유사한 표현형을 지원한다.
위치 545에 대해: V7093의 페닐알라닌(F) 및 V3795의 히스티딘(H)과 같은 아미노산으로의 치환은 변이체 V3795와 유사하게 높은 구별성 및 낮은 오프타겟을 유지한다(도 17a-17b 및 18a-18b). 알라닌(A)은 작은 소수성 잔기이고, V7094에서 대체물(substitute)로 사용되며, 이는 또한 V3795와 유사한 표현형을 보였다(도 17b 및 18b).
실시예 4: 재료 및 방법
HTP 단백질 발현 및 정제
야생형 OMNI-50 뉴클레아제 및 그의 변이체를 자가-유도 TB 배지(auto-induction TB media)에서 37℃, 350rpm 교반으로 3.5시간 동안 배양하고, 그 후, 18℃에서 17-20시간 동안 배양했다. 세포를 4000xg에서 원심분리하여 수확하고 -80℃에 보관했다. OMNI-50 변이체와 WT OMNI-50 세포 펠릿을 해동하고 용해 완충액에서 30분 동안 인큐베이션했다. 미정제 용해물(crude lysate)을 4℃, 4000xg에서 1시간 동안 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 단백질 용해물을 Sepharose 6 Ni-NTA 수지(Cytiva)와 함께 인큐베이션했다. 단백질이 결합된 Ni-NTA 수지를 96 Filter 웰 플레이트에 로딩하고, 완충액(HEPES 20 mM, NaCl 0.6 M, 이미다졸 60 mM)으로 세척하여 오염물질을 제거했다. 고농도의 이미다졸 완충액(HEPES 20mM, NaCl 0.6M, 이미다졸 0.4M)을 사용하여 수지로부터 단백질을 용출시켰다. 용출된 단백질을 저장 완충액(storage buffer)으로 평형화된 G-25 Sephadex 수지 1800㎕를 포함하는 96개의 필터 플레이트를 사용하여 탈염시켰다. 그 후, 탈염된 단백질을 농축하고(Amicon-ultra 0.5 ml 50kDa, Millipore) 멸균 여과시켰다(Ultrafree-MC 0.22 ㎛ PVDF 필터). 그 후, 정제된 변이체를 -80℃에 보관하고 세포에 형질감염시키기 전에 농도, 순도 및 시험관 내 활성을 분석했다.
LCL 세포의 RNP 전기천공
124 pmol의 sgRNA와 105 pmol의 뉴클레아제를 혼합하여 RNP 혼합물을 제조했다. LCL 세포를 실온에서 300xg로 5분간 원심분리하고 PBS로 세척했다. 펠릿을 적절한 부피의 Lonza Nucleofection SG 전기천공 용액에 재현탁시키고, RNP 혼합물로 옮겼다. 전기천공은 4D-Nucleofector 장치(Lonza Bioscience)를 사용하여 수행하였다. 전기천공 직후 미리 가온된 BLCL 배지를 큐벳에 첨가했다. 세포를 2-4일 동안 인큐베이션시켰다(37℃, 5% CO2).
NGS 분석
72시간에, 세포를 수확하고, 그들의 게놈 DNA 함량을 상응하는 추정(putative) 게놈 DNA 표적을 증폭시키는 PCR 반응에서 사용했다. 앰플리콘을 차세대 시퀀싱(NGS)에 적용하고, 결과적으로 수득된 서열을 이용하여 각 표적 부위에서 편집 사건(editing event)의 비율을 계산했다. 절단 부위 주위의 짧은 삽입 또는 삭제(인델(indel))이 뉴클레아제 유도 DNA 절단 후 DNA 복구의 전형적인 결과이다. 따라서, 퍼센트 편집(percent editing)의 계산은 각 앰플리콘 내의 인델-함유 서열의 분율(fraction)로부터 추론되었다.
참조문헌
1. Ahmad and Allen (1992) "Antibody-mediated Specific Binging and Cytotoxicity of Lipsome-entrapped Doxorubicin to Lung Cancer Cells in Vitro", Cancer Research 52:4817-20.
2. Anderson (1992) "Human gene therapy", Science 256:808-13.
3. Atosuo JT, Lilius E-M. The Real-Time-Based Assessment of the Microbial Killing by the Antimicrobial Compounds of Neutrophils. Scientific World Journal. 2011;11:2382-2390.
4. Basha et al. (2011) "Influence of Cationic Lipid Composition on Gene Silencing Properties of Lipid Nanoparticle Formulations of siRNA in Antigen-Presenting Cells", Mol. Ther. 19(12):2186-200.
5. Behr (1994) "Gene transfer with synthetic cationic amphiphiles: Prospects for gene therapy", Bioconjuage Chem 5:382-89.
6. Blaese et al. (1995) "Vectors in cancer therapy: how will they deliver", Cancer Gene Ther. 2:291-97.
7. Blaese et al. (1995) "T lympocyte-directed gene therapy for ADA-SCID: initial trial results after 4 years", Science 270(5235):475-80.
8. Briner et al. (2014) "Guide RNA functional modules direct Cas9 activity and orthognality", Molecular Cell 56:333-39.
9. Buchschacher and Panganiban (1992) "Human immunodeficiency virus vectors for inducible expression of foreign genes", J. Virol. 66:2731-39.
10. Burstein et al. (2017) "New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes", Nature 542:237-41.
11. Canver et al., (2015) "BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis", Nature Vol. 527, Pgs. 192-214.
12. Chang and Wilson (1987) "Modification of DNA ends can decrease end-joining relative to homologous recombination in mammalian cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963.
13. Charlesworth et al. (2019) "Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans", Nature Medicine, 25(2), 249.
14. Chung et al. (2006) "Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria", Trends Plant Sci. 11(1):1-4.
15. Coelho et al. (2013) "Safety and efficacy of RNAi therapy for transthyretin amyloidosis" N. Engl. J. Med. 369, 819-829.
16. Crystal (1995) "Transfer of genes to humans: early lessons and obstacles to success", Science 270(5235):404-10.
17. Dillon (1993) "Regulation gene expression in gene therapy" Trends in Biotechnology 11(5):167-173.
18. Dranoff et al. (1997) "A phase I study of vaccination with autologous, irradiated melanoma cells engineered to secrete human granulocyte macrophage colony stimulating factor", Hum. Gene Ther. 8(1):111-23.
19. Dunbar et al. (1995) "Retrovirally marked CD34-enriched peripheral blood and bone marrow cells contribute to long-term engraftment after autologous transplantation", Blood 85:3048-57.
20. Ellem et al. (1997) "A case report: immune responses and clinical course of the first human use of ganulocyte/macrophage-colony-stimulating-factor-tranduced autologous melanoma cells for immunotherapy", Cancer Immunol Immunother 44:10-20.
21. Gao and Huang (1995) "Cationic liposome-mediated gene transfer" Gene Ther. 2(10):710-22.
22. Haddada et al. (1995) "Gene Therapy Using Adenovirus Vectors", in: The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Biology and Pathogenesis, ed. Doerfler and Bφhm, pp. 297-306.
23. Han et al. (1995) "Ligand-directed retro-viral targeting of human breast cancer cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92(21):9747-51.
24. Humbert et al., (2019) "Therapeutically relevant engraftment of a CRISPR-Cas9-edited HSC-enriched population with HbF reactivation in nonhuman primates", Sci. Trans. Med., Vol. 11, Pgs. 1-13.
25. Inaba et al. (1992) "Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor", J Exp Med. 176(6):1693-702.
26. Jinek et al. (2012) "A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 337(6096):816-21.
27. Johan et al. (1992) "GLVR1, a receptor for gibbon ape leukemia virus, is homologous to a phosphate permease of Neurospora crassa and is expressed at high levels in the brain and thymus", J Virol 66(3):1635-40.
28. Judge et al. (2006) "Design of noninflammatory synthetic siRNA mediating potent gene silencing in vivo", Mol Ther. 13(3):494-505.
29. Kohn et al. (1995) "Engraftment of gene-modified umbilical cord blood cells in neonates with adnosine deaminase deficiency", Nature Medicine 1:1017-23.
30. Kremer and Perricaudet (1995) "Adenovirus and adeno-associated virus mediated gene transfer", Br. Med. Bull. 51(1):31-44.
31. Macdiarmid et al. (2009) "Sequential treatment of drug-resistant tumors with targeted minicells containing siRNA or a cytotoxic drug", Nat Biotehcnol. 27(7):643-51.
32. Makaryan V. et al. The diversity of mutations and clinical outcomes for ELANE-associated neutropenia. Curr. Opin. Hematol. 2015;22(1):3-11.
33. Malech et al. (1997) "Prolonged production of NADPH oxidase-corrected granulocyes after gene therapy of chronic granulomatous disease", PNAS 94(22):12133-38.
34. Maxwell et al. (2018) "A detailed cell-free transcription-translation-based assay to decipher CRISPR protospacer adjacent motifs", Methods 14348-57
35. Miller et al. (1991) "Construction and properties of retrovirus packaging cells based on gibbon ape leukemia virus", J Virol. 65(5):2220-24.
36. Miller (1992) "Human gene therapy comes of age", Nature 357:455-60.
37. Mitani and Caskey (1993) "Delivering therapeutic genes - matching approach and application", Trends in Biotechnology 11(5):162-66.
38. Nabel and Felgner (1993) "Direct gene transfer for immunotherapy and immunization", Trends in Biotechnology 11(5):211-15.
39. Nasri M. et al. CRISPR/Cas9-mediated ELANE knockout enables neutrophilic maturation of primary hematopoietic stem and progenitor cells and induced pluripotent stem cells of severe congenital neutropenia patients. Haematologica. 2020;105(3):598-609.
40. Nehls et al. (1996) "Two genetically separable steps in the differentiation of thymic epithelium" Science 272:886-889.
41. Remy et al. (1994) "Gene Transfer with a Series of Lipphilic DNA-Binding Molecules", Bioconjugate Chem. 5(6):647-54.
42. Sentmanat et al. (2018) "A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing", Scientific Reports 8:888, doi:10.1038/s41598-018-19441-8.
43. Sommerfelt et al. (1990) "Localization of the receptor gene for type D simian retroviruses on human chromosome 19", J. Virol. 64(12):6214-20.
44. Van Brunt (1988) "Molecular framing: transgenic animals as bioactors" Biotechnology 6:1149-54.
45. Vigne et al. (1995) "Third-generation adenovectors for gene therapy", Restorative Neurology and Neuroscience 8(1,2): 35-36.
46. Wagner et al. (2019) "High prevalence of Streptococcus pyogenes Cas9-reactive T cells within the adult human population" Nature Medicine, 25(2), 242
47. Wilson et al. (1989) "Formation of infectious hybrid virion with gibbon ape leukemia virus and human T-cell leukemia virus retroviral envelope glycoproteins and the gag and pol proteins of Moloney murine leukemia virus", J. Virol. 63:2374-78.
48. Yu et al. (1994) "Progress towards gene therapy for HIV infection", Gene Ther. 1(1):13-26.
49. Zetsche et al. (2015) "Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRIPSR-Cas system" Cell 163(3):759-71.
50. Zuris et al. (2015) "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein based genome editing in vitro and in vivo" Nat Biotechnol. 33(1):73-80.

Claims (58)

  1. 하기 위치 중 적어도 하나에 아미노산 치환을 포함하는 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)을 갖는 비-천연 OMNI-50 뉴클레아제 변이체: R478, Y545, R61, Y437, A493, G606, K688, L690, E695, L718, R788, Q803, L805, L844, V981, K965 및 K1036.
  2. 청구항 1에 있어서, 위치 R478 및/또는 위치 Y545, 바람직하게는 위치 R478 및 위치 Y545 모두에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 위치 R478 및 Y545 각각에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 위치 R478에서의 아미노산 치환은 R478D, R478E, R478S, R478T, R478N, R478Q, R478G, R478P, R478C, R478A, R478V, R478I, R478L, R478M, R478F, R478Y 또는 R478W, 바람직하게는 R478V, R478H, R478L, R478M, R478P, R478F, R478W, R478Y, R478S, R478C, R478T, R478N 또는 R478Q 중 어느 하나인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산이 음전하를 띤 R-기 또는 전하가 결여된 R-기를 갖는 아미노산인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산이 극성 아미노산 또는 비극성 아미노산인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 위치 R478에 있고, 아르기닌을 치환하는 아미노산이 비극성 아미노산인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 위치 Y545에서의 아미노산 치환이 Y545D, Y545E, Y545S, Y545T, Y545N, Y545Q, Y545G, Y545P, Y545C, Y545A, Y545V, Y545I, Y545L, Y545M, Y545F, Y545R, Y545K, Y545H, 또는 Y545W, 바람직하게는 Y545W, Y545F, Y545H, Y545V 또는 Y545G 중 어느 하나인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산이 음전하를 띤 R-기 또는 양전하를 띤 R-기를 갖는 아미노산인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  10. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산이 비극성 아미노산인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 아미노산 치환이 위치 Y545에 있고, 티로신을 치환하는 아미노산이 페닐 고리가 없거나 또는 페닐알라닌인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478I 및 Y545H인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 치환은 R478I, Y545H, Q803V, L805I, R61A, Y437W, R788K, L844N, V981M, G606P, L690V, E695Q, R478T, A493G, K688E, L718C, K965V 및 K1036V 중 어느 하나인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  14. 청구항 1에 있어서, 위치 R478, Y545, Q803, 및 L805 각각에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478I, Y545H, Q803V 및 L805I인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  16. 청구항 1에 있어서, 위치 R61, Y437, R788, L844 및 V981 각각에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R61A, Y437W, R788K, L844N, 및 V981M인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  18. 청구항 1에 있어서, 위치 G606, L690 및 E695 각각에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 아미노산 치환이 G606P, L690V 및 E695Q인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  20. 청구항 1에 있어서, 위치 R478, A493, K688, L718, K965, 및 K1036 각각에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478T, A493G, K688E, L718C, K965V, 및 K1036V인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  22. 청구항 1에 있어서, 위치 Q803에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 아미노산 치환이 Q803V인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  24. 청구항 1에 있어서, 위치 Y545에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 아미노산 치환이 Y545H인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  26. 청구항 1에 있어서, 위치 L805에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 아미노산 치환이 L805I인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  28. 청구항 1에 있어서, 위치 R478, Y545 및 Q803 각각에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478I, Y545H 및 Q803V인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  30. 청구항 1에 있어서, 위치 R478, Y545, 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  31. 청구항 30에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478I, Y545H 및 L805I인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  32. 청구항 1에 있어서, 위치 R478, Q803 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 아미노산 치환이 R478I, Q803V 및 L805I인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  34. 청구항 1에 있어서, 위치 Y545, Q803 및 L805 각각에 아미노산 치환을 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  35. 청구항 34에 있어서, 아미노산 치환이 R478I, Y545H 및 L805I인 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  36. 청구항 1에 있어서, 서열번호 2-5, 63-70 및 89-97로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  37. 청구항 1 내지 36 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 OMNI-50 단백질 서열(서열번호 1)과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  38. 청구항 1 내지 37 중 어느 한 항에 있어서, 핵 국소화 서열(NLS)을 추가로 포함하는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  39. 청구항 1 내지 38 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체는, 상기 변이체를 DNA 표적 부위로 표적화하는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한 경우, 상기 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 변이체와 비교하여 상기 DNA 표적 부위에 대해 증가된 특이성을 나타내는 것인 OMNI-50 뉴클레아제 변이체.
  40. DNA 표적 부위를 표적화하는 가이드 RNA 분자와 복합체를 형성한 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항의 OMNI-50 뉴클레아제 변이체를 포함하는 CRISPR 시스템으로서, 상기 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질 및 가이드 RNA 분자를 포함하는 야생형 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟(off-target) 편집 활성을 나타내는 것인 CRISPR 시스템.
  41. DNA 표적 부위를 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항의 OMNI-50 뉴클레아제 변이체 단백질을 포함하는 활성 CRISPR 시스템과 접촉시키는 단계를 포함하는, 감소된 오프타겟 편집 활성을 갖는 유전자 편집 방법.
  42. 청구항 41에 있어서, 상기 활성 CRISPR 시스템은 야생형 OMNI-50 뉴클레아제 단백질을 포함하는 야생형 CRISPR 시스템에 비해 감소된 오프타겟 편집 활성을 나타내는 것인 방법.
  43. 청구항 41 또는 42에 있어서, 상기 유전자 편집이 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 일어나는 것인 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 진핵 세포가 식물 세포 또는 포유동물 세포인 것인 방법.
  45. 청구항 44에 있어서, 상기 포유동물 세포가 인간 세포인 것인 방법.
  46. 청구항 41 내지 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 표적 부위가 유전자의 병원성 대립유전자(pathogenic allele) 내에 또는 그에 근접하여 위치하는 것인 방법.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 DNA 표적 부위는 ELANE, CXCR4, EMX, RyR2, KNCQ1, KCNH2, SCN5a, GBA1, GBA2, Rhodopsin, GUCY2D, IMPDH1, FGA, BEST1, PRPH2, KRT5, KRT14, ApoA1, STAT3, STAT1, ADA2, RPS19, SBDS, GATA2, RPE65, LDLR, ANGPTL3, B2M, TRAC, TCF4, TGFBi, PAX6, C3, LRRK2, SARM1, SAMD9, SAMD9L, HAVCR2, CD3E, APLP2, CISH, TIGIT, TNNT2, TNN, MYH7 및 HLA-E로 구성된 군으로부터 선택된 유전자에 위치하는 것인 방법.
  48. 청구항 41 내지 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 표적이 외인성 공여체 분자를 이용하여 복구되는 방법.
  49. 청구항 41 내지 48 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오프타겟 편집 활성이 적어도 2배, 10배, 102배, 103배, 104배, 105배 또는 106배 감소되는 것인 방법.
  50. 청구항 41 내지 49 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 변형된 세포.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 세포가 생착이 가능한 것인 변형된 세포.
  52. 청구항 50 또는 51에 있어서, 상기 세포가 생착 후에 자손 세포를 생성할 수 있는 것인 변형된 세포.
  53. 청구항 50 내지 52 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 자가 이식 후에 자손 세포를 생성할 수 있는 것인 변형된 세포.
  54. 청구항 50 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 생착 후 적어도 12개월 또는 적어도 24개월 동안 자손 세포를 생성할 수 있는 것인 변형된 세포.
  55. 청구항 50 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 조혈 줄기 세포, 전구 세포, CD34+ 조혈 줄기 세포, 골수 세포 및 말초 단핵 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 변형된 세포.
  56. 청구항 50 내지 55 중 어느 한 항의 변형된 세포 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
  57. 세포를 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 청구항 56의 조성물을 제조하는 시험관내 또는 생체외 방법.
  58. 청구항 1 내지 39 중 어느 한 항의 OMNI-50 변이체 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자.
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