CN117279671A - 用于在c3安全港位点处敲入的策略 - Google Patents

Abstract

公开提供了包括具有SEQ ID NO:1‑7,046中的任一者中所示的序列中的17个至50个连续核苷酸的引导序列部分的RNA分子以及其组合物、方法和用途。具体地，本公开提供了一种用于在细胞中修饰补体组分3(C3)基因的等位基因的方法，所述方法包括向所述细胞引入组合物，所述组合物包括：至少一种核酸酶和所提供的包括具有17个至50个核苷酸的引导序列的RNA分子。

Description

用于在C3安全港位点处敲入的策略

本申请要求于2021年3月11日提交的美国临时申请第63/159,602号的权益，所述美国临时申请的内容在此通过引用并入。

在整个本申请中，引用了各种公开案，包含括号中引用的公开案。本申请中所提及的所有公开案的公开内容特此以引用的方式整体并入本申请中，以便提供对本发明所涉及的领域和可与本发明一起使用的领域中的特征的额外描述。

序列表的引用

本申请通过引用合并了存在于名为“220310_91702-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt”的文件中的核苷酸序列，所述文件大小为1,526千字节，并且于2022年2月28日以IBM-PC机器格式创建，具有与MS Windows兼容的操作系统，所述文件包含在于2022年3月10日提交的作为本申请的一部分的文本文件中。

背景技术

人基因组中有若干类别的DNA变异，包含插入和缺失、重复序列拷贝数的差异和单核苷酸多态性(SNP)。SNP是当基因组中的单核苷酸(腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G))在人受试者或个体的配对的染色体之间不同时发生的DNA序列变异。多年来，不同类型的DNA变异一直是研究界的焦点，无论是作为确定特征或疾病原因的研究中的标志物，还是作为遗传病症的潜在原因。

DNA变异也可以用于靶向细胞中的特定DNA位点。例如，等位基因特异性补体组分3(C3)安全港位点可以被靶向以将序列引入所述位点而不引起有害破坏。此类靶向策略可以用于使C3启动子介导的引入的序列的表达能够治疗肝脏相关病症。

发明内容

本文公开了使基因或其部分能够在C3启动子的控制下表达的策略，任选地不敲除C3基因表达。

本公开可以利用至少一种天然存在的核苷酸差异或多态性(例如，单核苷酸多态性(SNP))来区分/区别C3基因的两个等位基因。

本公开还提供了一种用于在细胞中修饰补体组分3(C3)基因的等位基因的方法，所述方法包括：

向所述细胞引入组合物，所述组合物包括：

至少一种CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列；以及

RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个核苷酸的引导序列部分或编码所述引导序列部分的核苷酸序列，

其中所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子的复合物影响所述C3基因的所述等位基因中的双链断裂。

在一些实施例中，所述组合物还包括供体分子，其中来自所述供体分子的核苷酸序列在双链断裂位点处或附近插入或拷贝。类似地，在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子，所述供体分子含有在所述双链断裂位点处引入的核苷酸序列，使得引入的序列的表达由所述C3基因的启动子介导。

根据本发明的实施例，提供了第一RNA分子，所述第一RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括CRISPR核酸酶。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。

根据本发明的实施例，提供了通过本文所描述的方法中的任一种修饰的细胞。在一些实施例中，所述细胞是干细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝脏细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝细胞。在一些实施例中，所述细胞是iPS源性肝细胞。

在一些实施例中，将本文所描述的组合物中的任一种递送到所述细胞是在体外、离体或体内进行的。在一些实施例中，所述方法是离体进行的，并且所述细胞是从个体患者提供/移植的。在一些实施例中，所述方法进一步包括将具有修饰的或编辑的C3等位基因的所得细胞引入所述个体患者体内的步骤(例如自体移植)。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗肝脏相关病症的方法，所述方法包括向患有肝脏相关病症的受试者的细胞递送包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ IDNO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。

根据本发明的一些实施例，提供了包括RNA分子的组合物的用途，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸，包括向所述细胞递送包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。

根据本发明的实施例，提供了一种包括RNA分子的药物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸，其中所述药物通过向所述细胞递送包括RNA分子的组合物施用，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述药物进一步包括供体分子。

根据本发明的一些实施例，提供了包括RNA分子的组合物的用途，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和用于治疗、改善或预防肝脏相关病症CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸，包括向患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞递送包括RNA分子的所述组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。在一些实施例中，所述方法是离体进行的，并且所述细胞是从所述受试者提供/移植的。在一些实施例中，所述方法进一步包括将具有修饰的或编辑的C3等位基因的所述所得细胞引入所述受试者体内的步骤(例如自体移植)。

根据本发明的一些实施例，提供了一种包括包含RNA分子的组合物的药物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和用于治疗、改善或预防肝脏相关病症CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸，其中所述药物通过向患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞递送包括RNA分子的所述组合物施用，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述药物进一步包括供体分子。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的试剂盒，所述试剂盒包括RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸；以及用于将所述RNA分子；CRISPR核酸酶和/或所述tracrRNA递送到所述细胞的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括供体分子。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗受试者的肝脏相关病症的试剂盒，所述试剂盒包括RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸；以及用于将所述RNA分子；CRISPR核酸酶和/或所述tracrRNA递送到患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞的说明书。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括供体分子。

附图说明

图1：靶向HeLa细胞中的C3基因的内含子1的RNA引导分子的编辑活性。在DNA转染后72小时采集细胞，提取基因组DNA，并且通过下一代测序(NGS)扩增和分析靶向的区的突变。所述图表示三个独立转染的编辑±标准偏差的％。

图2：“g6”和“g11”引导分子的活性，每个所述引导分子的C3基因的内含子1。将OMNI-79引导转染到HeLa细胞中。将具有OMNI-50蛋白和OMNI-50合成RNA引导分子的RNP电穿孔到HepG2细胞中。在DNA转染后72小时采集细胞，提取基因组DNA，并且通过下一代测序(NGS)扩增和分析靶向的区的突变。所述图表示三个独立转染或两个独立RNP电穿孔的编辑±标准偏差的％。

图3：与对照样品相比，编辑的样品中C3 mRNA的相对量。在电穿孔后七(7)天采集细胞。然后提取RNA并处理以进行RT-qPCR。所述图表示与对照样品相比，编辑的样品中的C3mRNA的相对量，两个独立RNP电穿孔的±标准偏差。

图4：通过同源定向修复(HDR)将GFP插入C3内源性基因座。外显子1编码在分泌前被切割的信号肽。GFP与要分泌的外显子1信号肽剪接在一起。在示意图中，“左HA”和“右HA”分别指左同源臂和右同源臂，“SA”是指剪接受体位点，并且“PolyA”是指聚腺苷酸化信号。

图5：通过流式细胞术测量感染后72小时的GFP表达。用指示的AAV病毒颗粒感染HepG2细胞，所述病毒颗粒含有CRISPR核酸酶(OMNI-79V5570)和引导(C3 g11)或GFP同源定向修复(HDR)模板。使用在组成型启动子下含有编码GFP的DNA分子的AAV作为感染效率评估的阳性对照。在仅用HDR模板感染的细胞中未检测到GFP表达，这表明没有脱靶整合。图表示GFP阳性细胞％的平均值±标准偏差(n＝3)。

图6：通过流式细胞术测量感染后十五(15)天HepG2细胞中的GFP表达。值得注意的是，GFP阳性细胞的群体的频率增加。

图7：处理后十五(15)天HepG2细胞中GFP分泌的读板仪测量。感染后十四(14)天，将细胞培养基更换为以减少自体荧光，并且在第15天收集细胞培养基以测量GFP荧光。在所有HDR阳性条件下，GFP荧光高于未处理的(NT)细胞的背景。

图8：在电穿孔后编辑后的GFP整合如通过处理后八(8)天的GFP表达的流式细胞术检测所测量的。用包括OMNI-50核酸酶和引导(C3 g11)的RNP对HepG2细胞进行电穿孔，并且在电穿孔后两(2)小时用含有GFP HDR模板的AAV感染。使用在组成型启动子下含有编码GFP的DNA分子的AAV作为感染效率评估的阳性对照。在用RNP电穿孔并用HDR模板感染的细胞中检测GFP。所述图表示GFP阳性细胞％的平均值±标准偏差(n＝2)。

图9：处理后八(8)天HepG2细胞中GFP分泌的读板仪测量。感染后七(7)天，将细胞培养基更换为以减少自体荧光，并且在第8天收集细胞培养基以测量GFP荧光。从所有样品中减去未处理的(NT)样品中的非特异性荧光。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和/或科学术语的含义与本发明涉及的领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述的方法和材料类似或同等的材料和方法可以用于本发明的实施例的实践或测试，但下文描述了示例性方法和/或材料。在有冲突的情况下，以包含定义的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不意在是必然进行限制。

应当理解的是，如本文上述和本文其它地方所使用的术语“一个(a)”和“一种(an)”是指所列举的组分中的“一个或多个/一种或多种”。本领域的普通技术人员将清楚，除非另有特别说明，否则单数的使用包含复数。因此，术语“一个(a)”、“一种(an)”或“至少一个/种(at least one)”在本申请中可互换使用。

为了更好地理解本教导，并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则本说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其它数值应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非相反指出，否则以下说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，所述近似值可以根据寻求获得的期望性质而改变。至少，每个数值参数至少应该根据所报告的有效数字的数量并通过应用常规的舍入技术来解释。

除非另有说明，否则形容词如“基本上”和“约”修饰本发明的实施例的一个或多个特征的条件或关系特性被理解为意味着所述条件或特性被限定在所述实施例针对其预期应用的操作可接受的公差范围内。除非另有说明，否则说明书和权利要求中的词语“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的“或”，并且表示其结合的条目中的至少一个或任何组合。

在本申请的描述和权利要求中，动词“包括”、“包含”和“具有”及其同源词中的每一个用于指示动词的一个或多个宾语不一定是动词的一个或多个主语的组分、要素或部分的完整列表。如本文所使用的其它术语旨在由其在本领域中已知的含义来定义。

术语“同源定向修复”或“HDR”是指修复细胞中的DNA损伤的机制，例如，在修复DNA中的双链和单链断裂期间。HDR需要核苷酸序列同源性，并且使用“核酸模板”(本文可互换使用的核酸模板或供体模板)来修复发生双链或单链断裂的序列(例如，DNA靶序列)。此使得遗传信息从例如核酸模板转移到DNA靶序列。如果核酸模板序列不同于DNA靶序列并且部分或全部核酸模板多核苷酸或寡核苷酸并入DNA靶序列中，那么HDR可引起DNA靶序列的改变(例如插入、缺失、突变)。在一些实施例中，整个核酸模板多核苷酸、核酸模板多核苷酸的一部分或核酸模板的拷贝在DNA靶序列的位点处整合。

术语“核酸模板”和“供体”是指插入或复制到基因组中的核苷酸序列。核酸模板包括例如一或多种核苷酸的核苷酸序列，其将添加到靶核酸中或将模板化靶核酸中的变化或可用于修饰靶序列。核酸模板序列可以是任何长度，例如长度在介于2个与10,000个核苷酸之间。核酸模板可以是单链核酸、双链核酸。在一些实施例中，核酸模板包括核苷酸序列，例如一个或多个核苷酸的核苷酸序列，其对应于靶核酸的野生型序列(例如，靶位置的)。在一些实施例中，核酸模板包括核苷酸序列，例如一个或多个核糖核苷酸的核苷酸序列，其对应于靶核酸的野生型序列(例如，靶位置的)。在一些实施例中，核酸模板包括经修饰的核苷酸。

也可以插入外源序列(也称为“供体序列”、“供体模板”、“供体分子”或“供体”)。例如，供体序列可以含有侧接两个同源区的非同源序列，以允许在所关注的位置处进行有效的同源定向修复(HDR)。另外，供体序列可以包括含有与细胞染色质中所关注的区不同源的序列的载体分子。供体分子可含有与细胞染色质同源的若干不连续区。举例来说，为了靶向插入通常不存在于所关注区中的序列，所述序列可存在于供体核酸分子中并且侧接与所关注区中的序列的同源的区。供体分子可以是任何长度，例如范围为若干个碱基，例如10个至20个碱基至几千个碱基的长度。

供体多核苷酸可以是DNA或RNA、单链和/或双链并且可以以线性或环状形式引入到细胞中。参见例如，美国专利公开第2010/0047805号；第2011/0281361号；第2011/0207221号；以及第2019/0330620号。还参见Anzalone等人,(2019)。如果以线性形式引入，那么供体序列的端可通过所属领域的技术人员已知的方法来保护(例如免于核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3'端和/或将自互补寡核苷酸连接到一个或两个末端。参见例如，Chang等人,(1987)以及Nehls等人,(1996)。用于保护外源多核苷酸免于降解的另外的方法包含但不限于添加末端氨基以及使用经过修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

供体序列可以是寡核苷酸，并且可以用于内源性序列的靶向改变。寡核苷酸可以在载体上引入到细胞中，可以电穿孔到细胞中，或可以通过所属领域中已知的其它方法引入。供体多核苷酸可以作为裸核酸、作为与如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer)等药剂复合的核酸引入，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷慢病毒(IDLV))递送。

如本文所使用的，术语“经修饰的细胞”是指由于与靶序列杂交，即靶上杂交，其中双链断裂受到RNA分子和CRISPR核酸酶的复合物影响的细胞。术语“经修饰的细胞”可以进一步涵盖在双链断裂后编辑或修饰(包含外源序列的引入)受到影响的细胞。

本发明提供了通过使用本文所描述的任何方法获得的经修饰的一个细胞或多个细胞。在一个实施例中，这些经修饰的一个细胞或多个细胞能够产生子代细胞。在一个实施例中，这些经修饰的一个细胞或多个细胞能够在植入后产生子代细胞。作为非限制性实例，经修饰的细胞可以是造血干细胞(HSC)，或适于同种异体细胞移植或自体细胞移植的任何细胞。作为非限制性实例，经修饰的细胞可以是干细胞、肝脏细胞、肝细胞或iPS源性肝细胞。

本发明还提供一种组合物，其包括这些经修饰的细胞和药学上可接受的载剂。还提供一种制备此组合物的体外或离体方法，其包括将细胞与药学上可接受的载剂混合。

如本文所使用的，术语“靶向序列”或“靶向分子”是指包括能够与特定靶序列杂交的核苷酸序列的核苷酸序列或分子，例如靶向序列具有与沿靶向序列的长度被靶向的序列至少部分互补的核苷酸序列。靶向序列或靶向分子可以是RNA分子的一部分，所述RNA分子可以单独或与其它RNA分子组合与CRISPR核酸酶形成复合物，其中靶向序列用作CRISPR复合物的靶向部分。当具有靶向序列的分子与CRISPR分子同时存在时，RNA分子单独或与另外的一个或多个RNA分子(例如tracrRNA分子)组合，能够将CRISPR核酸酶靶向特定靶序列。作为非限制性实例，CRISPR RNA分子或单引导RNA分子的引导序列部分可以用作靶向分子。每种可能性代表单独的实施例。靶向序列可以被定制设计为靶向任何期望的序列。

如本文所使用的，术语“靶向”是指优先将靶向分子的靶向序列与具有靶向的核苷酸序列的核酸杂交。应理解，术语“靶向”涵盖可变杂交效率，使得存在对具有被靶向的核苷酸序列的核酸的优先靶向，但也可能发生除靶上杂交之外的无意脱靶杂交。应理解，在RNA分子靶向序列的情况下，RNA分子与CRISPR核酸酶分子的复合物靶向所述序列以供核酸酶活性。

RNA分子的“引导序列部分”是指能够与特定靶DNA序列杂交的核苷酸序列，例如引导序列部分具有与沿引导序列部分的长度被靶向的DNA序列部分或完全互补的核苷酸序列。在一些实施例中，引导序列部分的长度为17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个核苷酸，或长度为大约17个至50个、17个至49个、17个至48个、17个至47个、17个至46个、17个至45个、17个至44个、17个至43个、17个至42个、17个至41个、17个至40个、17个至39个、17个至38个、17个至37个、17个至36个、17个至35个、17个至34个、17个至33个、17个至31个、17个至30个、17个至29个、17个至28个、17个至27个、17个至26个、17个至25个、17个至24个、17个至22个、17个至21个、18个至25个、18个至24个、18个至23个、18个至22个、18个至21个、19个至25个、19个至24个、19个至23个、19个至22个、19个至21个、19个至20个、20个至22个、18个至20个、20个至21个、21个至22个或17个至20个核苷酸。优选地，引导序列部分的整个长度与沿着引导序列部分的长度被靶向的DNA序列完全互补。引导序列部分可以是可与CRISPR核酸酶形成复合物的RNA分子的一部分，其中引导序列部分充当CRISPR复合物的DNA靶向部分。当具有引导序列部分的RNA分子与CRISPR分子同时存在时，单独或与另外的一个或多个RNA分子(例如tracrRNA分子)组合，RNA分子能够将CRISPR核酸酶靶向特定靶DNA序列。因此，CRISPR复合物可以通过具有引导序列部分的RNA分子与CRISPR核酸酶的直接结合，或者通过具有引导序列部分的RNA分子和另外的一个或多个RNA分子与CRISPR核酸酶的结合而形成。每种可能性代表单独的实施例。引导序列部分可以被定制设计为靶向任何期望的序列。因此，包括“引导序列部分”的分子是一种类型的靶向分子。在一些实施例中，引导序列部分包括与本文所描述的引导序列部分相同或相差不超过1个、2个、3个、4个或5个核苷酸的序列，例如SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的引导序列。每种可能性代表单独的实施例。在这些实施例中的一些实施例中，引导序列部分包括与SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列相同的序列。在整个本申请中，术语“引导分子”、“RNA引导分子”，“引导RNA分子”和“gRNA分子”与包括引导序列部分的分子同义。

如本文所使用的，术语“无差别”是指靶向特定DNA序列的RNA分子的引导序列部分，所述特定DNA序列在基因的两个等位基因中都是常见的。例如，无差别引导序列部分能够靶向细胞中存在的基因的两个等位基因。

在本发明的实施例中，RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

RNA分子和或RNA分子的引导序列部分可以含有经修饰的核苷酸。对核苷酸或多核苷酸的示例性修饰可以是合成的，并且涵盖含有核苷酸的多核苷酸，所述核苷酸包括除天然存在的腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶或鸟嘌呤碱基之外的碱基。对多核苷酸的修饰包含含有合成的非天然存在的核苷(例如，锁定核酸)的多核苷酸。对多核苷酸的修饰可以用于增加或减少RNA的稳定性。经修饰的多核苷酸的实例是含有1-甲基假尿苷的mRNA。关于经修饰的多核苷酸以及其用途的实例，参见美国专利8,278,036、PCT国际公开第WO/2015/006747号以及Weissman和Kariko(2015)，所述文献中的每一个特此通过引用并入。

如本文所使用的，SEQ ID NO中所述的“连续核苷酸”是指在没有任何中间核苷酸的情况下，按SEQ ID NO中所述的顺序排列的核苷酸序列中的核苷酸。

在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是25个核苷酸，并且在SEQ IDNO:1-7,046中的任一者中所示的序列中含有20个至22个连续核苷酸。在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以小于22个核苷酸。例如，在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是17个、18个、19个、20个或21个核苷酸。在此类实施例中，引导序列部分可以分别由SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的17个至22个连续核苷酸的序列中的17个、18个、19个、20个或21个核苷酸组成。例如，在SEQ ID NO:7,047中所述的17个连续核苷酸的序列中具有17个核苷酸的引导序列部分可以由以下核苷酸序列中的任一者组成(从连续序列中排除的核苷酸被标记为穿透)：

AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:7,047)

17核苷酸引导序列1：AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:7,048)

17核苷酸引导序列2：AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:7,049)

17核苷酸引导序列3：AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:7,050)

17核苷酸引导序列4：AAAAAAAUGUACUUGGUUCC(SEQ ID NO:7,051)

在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以大于20个核苷酸。例如，在本发明的实施例中，引导序列部分的长度可以是21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。在此类实施例中，引导序列部分包括17个至50个核苷酸，所述核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的20个、21个或22个连续核苷酸的序列，以及与邻近靶序列的3'端、靶序列的5'端或两者的核苷酸或核苷酸的序列完全互补的另外的核苷酸。

在本发明的实施例中，CRISPR核酸酶和包括引导序列部分的RNA分子形成与靶DNA序列结合以实现靶DNA序列的切割的CRISPR复合物。CRISPR核酸酶，例如Cpf1可以形成CRISPR复合物，所述复合物包括CRISPR核酸酶和RNA分子，而没有另外的tracrRNA分子。可替代地，CRISPR核酸酶，例如Cas9可以在CRISPR核酸酶、RNA分子和tracrRNA分子之间形成CRISPR复合物。包括能够与特定靶DNA序列杂交的核苷酸序列的引导序列部分和参与CRIPSR核酸酶结合的序列部分(例如tracrRNA序列部分)可以位于相同的RNA分子上。可替代地，引导序列部分可以位于一个RNA分子上，并且参与CRIPSR核酸酶结合的序列部分(例如tracrRNA部分)可以位于单独的RNA分子上。包括引导序列部分(例如靶向DNA的RNA序列)和至少一个CRISPR蛋白结合RNA序列部分(例如tracrRNA序列部分)的单个RNA分子可以与CRISPR核酸酶形成复合物并用作靶向DNA的分子。在一些实施例中，包括靶向DNA的RNA部分(其包含引导序列部分)的第一RNA分子和包括CRISPR蛋白结合RNA序列的第二RNA分子通过碱基配对相互作用以形成将CRISPR核酸酶靶向DNA靶位点的RNA复合物，或可替代地，融合在一起以形成与CRISPR核酸酶复合并将CRISPR核酸酶靶向DNA靶位点的RNA分子。

在本发明的实施例中，包括引导序列部分的RNA分子可以进一步包括tracrRNA分子的序列。此类实施例可以被设计为RNA分子的引导部分和反式激活crRNA(tracrRNA)的合成融合。(参见Jinek等人,2012)。在此类实施例中，RNA分子是单引导RNA(sgRNA)分子。本发明的实施例还可利用单独的tracrRNA分子和包括引导序列部分的单独RNA分子形成CRISPR复合物。在此类实施例中，tracrRNA分子可以通过碱基配对与RNA分子杂交，并且在本文所描述的本发明的某些应用中可能是有利的。

术语“tracr配对序列”是指与tracrRNA分子充分互补的序列，以便通过碱基配对与tracrRNA杂交并促进CRISPR复合物的形成。(参见美国专利第8,906,616号)。在本发明的实施例中，RNA分子可以进一步包括具有tracr配对序列的部分。

用于本公开的目的，“基因”包含编码基因产物的DNA区以及调控基因产物的产生的所有DNA区，无论此类调控序列是否与编码序列和/或转录序列相邻。因此，基因包含但不必限于：启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。

“真核”细胞包含但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞。

如本文所使用的，术语“核酸酶”是指能够使核酸的核苷酸亚基之间的磷酸二酯键裂解的酶。核酸酶可以从天然来源分离或衍生。天然来源可以是任何活生物体。可替代地，核酸酶可以是保留磷酸二酯键裂解活性的修饰或合成的蛋白质。基因修饰可以使用核酸酶，例如CRISPR核酸酶来实现。

根据本发明的实施例，提供了一种RNA分子，其包括引导序列部分(例如靶向序列)，所述引导序列部分包括与靶序列完全或部分互补的核苷酸序列，所述靶序列包括位于或靠近C3基因的等位基因的SNP位置(REF/SNP序列)。在一些实施例中，RNA分子的引导序列部分由16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个或多于26个核苷酸组成。在一些实施例中，引导序列部分被配置成将CRISPR核酸酶靶向靶序列并通过与其复合的CRISPR核酸酶提供切割事件，所述切割事件选自C3靶位点的500个、400个、300个、200个、100个、50个、25个或10个核苷酸内的双链断裂和单链断裂。在一些实施例中，RNA分子是引导RNA分子，如crRNA分子或单引导RNA分子

如本文所使用的，术语“HSC”是指造血干细胞和造血干祖细胞两者。干细胞的非限制性实例包含骨髓细胞、骨髓祖细胞、多能祖细胞和谱系限制性祖细胞。

如本文所使用的，“祖细胞”是指源自干细胞并保持有丝分裂能力和多能性的谱系细胞(例如，可以分化或发育成多于一种但不是所有类型的成熟谱系的细胞)。如本文所使用的，“造血(hematopoiesis)”或“造血(hemopoiesis)”是指各种类型的血细胞(例如，红细胞、巨核细胞、髓细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞)和淋巴细胞)以及身体中(例如，骨髓中)其它形成的元件的形成和发育。

如本文所使用的，术语“单核苷酸多态性(SNP)位置”是指在物种的成员之间或个体中的配对的染色体之间发生单核苷酸DNA序列变异的位置。在个体中的配对的染色体上存在SNP位置的情况下，其中一条染色体上的SNP是“杂合SNP”术语SNP位置是指发生特定变异的特定核酸位置，并且涵盖包含从特定核酸位置的最频繁出现的碱基变异的序列(也称为“SNP”或替代性“ALT”)和包含在特定核酸位置上的最频繁出现的碱基的序列(也称为参考或“REF”)两者。因此，SNP位置的序列可以反映SNP(即相对于群体内的一致参考序列的替代性序列变体)或参考序列本身。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于在细胞中修饰补体组分3(C3)基因的等位基因的方法，所述方法包括：

向所述细胞引入组合物，所述组合物包括：

至少一种CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列；以及

RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个核苷酸的引导序列部分或编码所述引导序列部分的核苷酸序列，

其中所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子的复合物影响所述C3基因的所述等位基因中的双链断裂。

在一些实施例中，所述组合物还包括供体分子。在一些实施例中，来自供体分子的核苷酸的序列在双链断裂位点处或附近插入或拷贝。

在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子，所述供体分子含有在所述双链断裂位点处引入的核苷酸的序列，使得引入的序列的表达由所述C3基因的启动子介导。

在一些实施例中，引入的序列是来自以下的序列：ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶和N-乙酰谷氨酸合成酶基因。

在一些实施例中，RNA分子将CRISPR核酸酶靶向C3等位基因的SNP位置。

在一些实施例中，SNP位置是rs17030、rs199713383和rs35473940中的任一者。

在一些实施例中，第一RNA分子的引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有靶向C3等位基因的SNP位置的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

在一些实施例中，SNP位置含有杂合SNP。

在一些实施例中，SNP位置在C3等位基因的外显子或内含子中。

在一些实施例中，RNA分子包括靶向两个C3等位基因的无差别引导部分。

在一些实施例中，RNA分子包括靶向靶向C3的内含子1的无差别引导部分或C3的3'非翻译区(3'UTR)中的任一者的无差别引导部分。

在一些实施例中，RNA分子包括无差别引导部分，所述无差别引导部分靶向位于选自19:6677732-6677881和19:6719404-6720515中任一者的基因组范围内的序列。

RNA分子的引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有SEQID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

在一些实施例中，RNA分子的引导序列部分包括相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配。

在一些实施例中，RNA分子的引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有被修饰以含有相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

在一些实施例中，相对于对C3基因的等位基因具有更高互补性的引导序列部分，引导序列部分对CRISPR核酸酶和RNA分子的复合物提供更高的靶向特异性。

根据本发明的实施例，提供了通过本文所呈现的任一实施例的方法获得的经修饰的细胞。

根据一些实施例，细胞是干细胞、肝脏细胞、肝细胞或iPS源性肝细胞。

根据本发明的实施例，提供了RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

根据本发明的实施例，提供了一种包括RNA分子和至少一种CRISPR核酸酶的组合物。

在一些实施例中，RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046或被修饰以含有相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

在一些实施例中，组合物进一步包括供体分子。

在一些实施例中，供体分子含有来自以下的序列：ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶和N-乙酰谷氨酸合成酶基因。

根据本发明的实施例，提供了一种用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的方法，所述方法包括向所述细胞递送本文所呈现任一实施例的组合物。

根据本发明的实施例，提供了一种用于治疗肝脏相关病症的方法，所述方法包括向患有肝脏相关病症的受试者的细胞递送所述组合物或向所述受试者递送本文所呈现的任一实施例的经修饰的细胞。

根据本发明的实施例，提供了用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的本文所呈现的任一种组合物的用途，包括向所述细胞递送本文所呈现任一实施例的组合物。

根据本发明的实施例，提供了一种药物，所述药物包括本文所呈现任一实施例的组合物，用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因，其中所述药物通过向所述细胞递送本文所呈现任一实施例的组合物来施用。

根据本发明的实施例，提供了本文所呈现任一实施例的组合物或经修饰的细胞用于治疗、改善或预防肝脏相关病症的用途，包括向患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞递送本文所呈现任一实施例的组合物，或向所述受试者递送通过本文所呈现的任一方法修饰的细胞。

根据本发明的实施例，提供了一种药物，所述药物包括本文所呈现任一实施例的组合物，用于治疗、改善或预防肝脏相关疾病，其中所述药物通过向患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞递送本文所呈现任一实施例的组合物来施用。

根据本发明的实施例，提供了一种用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的试剂盒，所述试剂盒包括本文所呈现的任一实施例的RNA分子、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子；以及用于将所述RNA分子；CRISPR核酸酶和/或所述tracrRNA递送到细胞的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包括供体分子和用于将所述供体分子递送到细胞的说明书。

根据本发明的实施例，提供了一种用于治疗受试者的肝脏相关病症的试剂盒，所述试剂盒包括本文所呈现的任一实施例的RNA分子、CRISPR核酸酶和/或tracrRNA分子；以及用于将所述RNA分子；CRISPR核酸酶和/或所述tracrRNA递送到患有肝脏相关病症或具有患有肝脏相关病症的风险的受试者的细胞的说明书。在一些实施例中，试剂盒进一步包括供体分子和用于将所述供体分子递送到细胞的说明书。

根据本发明的实施例，提供了一种包括RNA分子的基因编辑组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，RNA分子进一步包括具有与CRISPR核酸酶结合的序列的部分。在一些实施例中，与CRISPR核酸酶结合的序列是tracrRNA序列。

在一些实施例中，RNA分子进一步包括具有tracr配对序列的部分。

在一些实施例中，RNA分子可以进一步包括一个或多个接头部分。

根据本发明的实施例，RNA分子的长度可以是至多1000个、900个、800个、700个、600个、500个、450个、400个、350个、300个、290个、280个、270个、260个、250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个或100个核苷酸。每种可能性代表单独的实施例。在本发明的实施例中，RNA分子可以是长度为17个到至多300个核苷酸，长度为100个到至多300个核苷酸，长度为150个到至多300个核苷酸，长度为100个到至多500个核苷酸，长度为100个到至多400个核苷酸，长度为200个到至多300个核苷酸，长度为100个到至多200个核苷酸或长度为150个到至多250个核苷酸。每种可能性代表单独的实施例。

根据本发明的一些实施例，所述组合物进一步包括tracrRNA分子。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于修饰或编辑细胞中的C3等位基因的方法，所述方法包括向所述细胞递送包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于治疗病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者的细胞递送包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。在一些实施例中，所述病症是肝脏相关病症。在一些实施例中，所述病症是溶酶体贮积病症。

根据本发明的一些实施例，提供了一种用于修饰受试者的肝脏细胞中的DNA靶位点的方法，其中所述DNA靶位点的修饰诱导所述肝脏细胞分泌由所述修饰编码的期望的蛋白质，所述方法包括向所述受试者的细胞递送包括RNA分子的组合物，所述RNA分子包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分和CRISPR核酸酶，所述连续核苷酸含有SEQ IDNO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。在一些实施例中，所述组合物进一步包括供体分子。

根据本发明的实施例，至少一种CRISPR核酸酶和一个RNA分子或多个RNA分子基本上在同一时间或在不同时间递送到受试者和/或细胞。

在一些实施例中，tracrRNA分子与CRISPR核酸酶和一个RNA分子或多个RNA分子基本上在同一时间或在不同时间递送到受试者和/或细胞。

根据本发明的实施例，RNA分子靶向外显子中的SNP、内含子中的SNP、C3基因的第一编码外显子之后的第一内含子中的SNP、内含子中的两个等位基因共有的序列、C3基因的第一编码外显子之后的第一内含子中的两个等位基因共有的序列、启动子区中的SNP、起始密码子、终止密码子或非翻译区(UTR)，或存在于两个C3等位基因中的序列。

根据本发明的实施例，RNA分子靶向C3等位基因的外显子与内含子之间的替代性剪接信号序列。

根据本发明的实施例，RNA分子是无差别的，并且靶向存在于两个C3等位基因中的序列。在一些实施例中，所述序列存在于两个C3等位基因中。在一些实施例中，所述序列存在于C3基因的内含子中。在一些实施例中，内含子是C3基因的第一编码外显子之后的第一内含子。

本公开的组合物和方法可以用于治疗、预防、改善或减缓病症(如遗传病症)的进展。例如，此类病症的非限制性实例是肝脏相关病症或溶酶体贮积病症。

用于修饰或编辑C3等位基因的上述策略中的任一种或其组合可以用于本发明的上下文中。

根据一些实施例，本公开提供了一种RNA序列(也称为‘RNA分子’)，所述RNA序列与RNA引导的DNA核酸酶(例如，CRISPR核酸酶)结合或缔合和/或引导其靶向包括在所关注的基因的等位基因(例如，SNP)之间不同的至少一个核苷酸的序列(例如，一个C3等位基因的序列，所述序列不存在于其它C3等位基因中)。

在一些实施例中，所述方法包括使所关注的基因的至少一个等位基因与无差别RNA分子接触，例如，包括能够靶向基因的两个等位基因的引导序列部分的RNA分子和CRISPR核酸酶(例如，Cas9蛋白)，其中所述无差别RNA分子和所述CRISPR核酸酶与所述所关注的基因的所述至少一个等位基因的核苷酸序列缔合，由此修饰或编辑所述至少一个等位基因。值得注意的是，尽管双等位基因切割可能在将无差别RNA分子引入细胞时发生，在切割位点处插入核苷酸序列可能仅发生在单个等位基因中，而不是两个等位基因中。因此，用靶向C3基因的内含子的无差别RNA分子诱导双等位基因切割可以引起来自一个等位基因的内源性C3基因的表达的保留，并且在其它等位基因中引入核苷酸序列，例如来自供体分子的核苷酸序列。在C3等位基因中引入核苷酸序列可能会或可能不破坏C3编码的基因产物在C3等位基因处的表达。

在一些实施例中，所述方法包括使所关注的基因的等位基因与等位基因特异性RNA分子和CRISPR核酸酶(例如，Cas9蛋白)接触，其中所述等位基因特异性RNA分子和所述CRISPR核酸酶与和所述所关注的不同等位基因的核苷酸序列相差至少一个核苷酸的所关注的基因的等位基因的核苷酸序列缔合，由此修饰或编辑靶向的等位基因。

在一些实施例中，将等位基因特异性或无差别RNA分子和CRISPR核酸酶引入编码所关注的基因的细胞。在一些实施例中，编码所关注的基因的细胞位于哺乳动物受试者体内。

在一些实施例中，RNA分子靶向SNP，所述SNP在群体中高度流行并且存在于待治疗的个体受试者的至少一个C3等位基因中。

在一些实施例中，SNP位于所关注的基因的外显子内。在此类实施例中，RNA分子的引导序列部分被设计为与所关注的基因的外显子的序列缔合。

在一些实施例中，SNP在位于所关注的基因的内含子或外显子内。在一些实施例中，SNP紧邻内含子与外显子之间的剪接位点。在一些实施例中，与剪接位点紧邻是剪接位点的上游或下游的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。每种可能性都表示本发明的单独实施例。在此类实施例中，RNA分子的引导序列部分可以被设计为与包括剪接位点的所关注的基因的序列缔合。

在一些实施例中，所公开的发明的方法用于治疗患有病症或疾病的受试者。在此类实施例中，所述方法引起疾病表型的改进、改善或预防。在一些实施例中，所述疾病或病症是肝脏相关病症。在一些实施例中，所述疾病或病症是溶酶体贮积病症。

本文所描述的组合物的实施例包含至少一种CRISPR核酸酶、包括引导序列部分的RNA分子和tracrRNA分子，其可以分离或与包括引导序列部分的RNA分子附接，同时在受试者或细胞中有效。所述至少一种CRISPR核酸酶、包括引导序列部分的RNA分子和tracrRNA可以基本上同时递送，或者可以在不同时间递送但同时具有效果。例如，这包含在包括引导序列部分和/或tracrRNA的RNA分子基本上存在于受试者或细胞中之前将CRISPR核酸酶递送到受试者或细胞。

在一些实施例中，所述细胞是干细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝脏细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝细胞。在一些实施例中，所述细胞是iPS源性肝细胞。

基因C3安全港敲入以治疗肝脏相关病症

在一些实施例中，本发明的方法可以用于在C3安全港位点处敲入序列，其中敲入的序列的C3介导的表达参与病症或疾病的治疗或与其相关。

作为非限制性实例，敲入的序列的表达可能参与肝脏相关病症的治疗或与其相关。例如，敲入的序列可以是ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶和N-乙酰谷氨酸合成酶序列，或其一部分。

在另一个实例中，肝脏细胞中的C3 DNA靶位点被修饰，使得肝脏细胞表达并分泌由所述修饰编码的蛋白质产物。例如，这些经修饰的肝脏细胞可以用于治疗溶酶体贮积疾病或其它病症。因此，这些经修饰的细胞用作传统酶替代疗法的替代品。作为非限制性实例，肝脏细胞可以被修饰以表达α半乳糖苷酶A、凝血因子IX、凝血因子VII、溶酶体α葡糖苷酶、纤维蛋白原、苯丙氨酸4羟化酶、碱性磷酸酶、葡糖神经酰胺酶、β半乳糖苷酶、胆色素原脱氨酶、芳基硫酸酯酶B、β葡糖醛酸酶、αN乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶体α,αL-艾杜糖醛酸酶、甘露糖苷酶、磷脂酰胆碱固醇酰基转移酶、N-磺基葡糖胺磺酰水解酶、凝血因子X、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、A1AT、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、溶酶体α葡糖苷酶、细胞周期蛋白依赖性激酶样5、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、苯丙氨酸解氨酶、蛋白质谷氨酰胺γ谷氨酰转移酶K、溶酶体保护蛋白或其一部分。

C3编辑策略包含能够在C3启动子的控制下表达期望的序列的策略，任选地不敲除编辑的C3等位基因。这可以通过以下策略实现：(1)敲入C3等位基因的第一内含子中，或者C3等位基因的第一编码外显子之后的第一内含子中；(2)等位基因特异性敲入C3等位基因的第一内含子中，或者C3等位基因的第一编码外显子之后的第一内含子中；(3)通过替换C3等位基因的终止密码子来敲入；或(4)通过以等位基因特异性方式替换C3等位基因的终止密码子来敲入。

CRISPR核酸酶与PAM识别

在一些实施例中，序列特异性核酸酶选自CRISPR核酸酶或其功能变体。在一些实施例中，序列特异性核酸酶是RNA引导的DNA核酸酶。在此类实施例中，引导RNA引导的DNA核酸酶(例如，Cpf1)的RNA序列与RNA引导的核酸酶结合和/或将其引导到靶序列，所述靶序列包括C3基因(例如，SNP)的等位基因之间不同的至少一个核苷酸。在一些实施例中，CRISPR复合物不进一步包括tracrRNA。在非限制性实例中，其中RNA引导的DNA核酸酶是CRISPR蛋白，在C3等位基因之间不同的至少一个核苷酸可以位于PAM位点内和/或在RNA分子设计杂交的区内接近PAM位点。本领域技术人员将理解，RNA分子可以通过本领域普遍知晓的方法被工程化以与基因组中的选择靶标结合。

如本文所使用的，术语“PAM”是指位于靶向的DNA序列附近并被CRISPR核酸酶复合物识别的靶DNA的核苷酸序列。PAM序列可能因核酸酶同一性而异。另外，具有可以靶向几乎所有的PAM的CRISPR核酸酶。在本发明的一些实施例中，CRISPR系统利用具有引导序列部分的一个或多个RNA分子，通过引导序列部分与靶DNA位点上的原间隔子之间的沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base-pairing)将CRISPR核酸酶引导到靶DNA位点，所述靶DNA位点接近原间隔子邻近基序(PAM)，这是对靶识别的另外的要求。然后CRISPR核酸酶介导靶DNA位点的切割，以在原间隔子内产生双链断裂。在非限制性实例中，II型CRISPR系统利用成熟的crRNA:tracrRNA复合物，所述复合物通过crRNA的引导序列部分与接近原间隔子邻近基序(PAM)的靶DNA上的原间隔子之间的沃森-克里克碱基配对将CRISPR核酸酶(例如Cas9)引导到靶DNA靶DNA。本领域技术人员将理解，本发明的每个工程化的RNA分子被进一步设计为与接近原间隔子相邻基序(PAM)的所关注的靶基因组DNA序列缔合，例如与所使用的CRISPR核酸酶的类型相关的序列相匹配的PAM，例作为非限制性实例，NGG或NAG，其中“N”是任何核碱基，用于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9 WT(SpCAS9)；NNGRRT用于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(SaCas9)；NNNVRYM用于Jejuni Cas9 WT的；NGAN或NGNG用于SpCas9-VQR变体；NGCG用于SpCas9-VRER变体；NGAG用于SpCas9-EQR变体；NRRH用于SpCas9-NRRH变体，其中N是任何核碱基，R是A或G，并且H是A、C或T；NRTH用于SpCas9-NRTH变体，其中N是任何核碱基，R是A或G，并且H是A、C或T；NRCH用于SpCas9-NRCH变体，其中N是任何核碱基，R是A或G，并且H是A、C或T；NG用于SpCas9的SpG变体，其中N是任何核碱基；NG或NA用于SpCas9的SpCas9-NG变体，其中N是任何核碱基；NR或NRN或NYN用于SpCas9的SpRY变体，其中N是任何核碱基，R是A或G，并且Y是C或T；NNG用于狗链球菌(Streptococcus canis)Cas9变体(ScCas9)，其中N是任何核碱基；NNNRRT用于金黄色葡萄球菌(SaCas9)的SaKKH-Cas9变体，其中N是任何核碱基，并且R是A或G；NNNNGATT用于脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)(NmCas9)，其中N是任何核碱基；TTN用于嗜酸环酸芽胞杆菌(Alicyclobacillus acidiphilus)Cas12b(AacCas12b)，其中N是任何核碱基；或TTTV用于Cpfl，其中V是A、C或G。本发明的RNA分子各自被设计为与一种或多种不同的CRISPR核酸酶结合以形成复合物，并且被设计为利用与所使用的CRISPR核酸酶相应的一种或多种不同的PAM序列靶向所关注的多核苷酸序列。

在一些实施例中，RNA引导的DNA核酸酶，例如CRISPR核酸酶可以用于在细胞的基因组中的期望的位置处引起DNA断裂(在自然界中是双链或单链)。最常用的RNA引导的DNA核酸酶源自CRISPR系统，然而，其它RNA引导的DNA核酸酶也被设想用于本文所描述的基因组编辑组合物和方法。例如，参见美国专利公开第2015/0211023号，所述美国专利公开通过引用并入本文。

可以用于实施本发明的CRISPR系统变化极大。CRISPR系统可以是I型、II型或III型系统。合适的CRISPR蛋白的非限制性实例包含Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(或CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8al、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9、Casl0、Casl Od、CasF、CasG、CasH、Csyl、Csy2、Csy3、Csel(或CasA)、Cse2(或CasB)、Cse3(或CasE)、Cse4(或CasC)、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csxl0、Csxl6、CsaX、Csx3、Cszl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3、Csf4和Cul966。

在一些实施例中，RNA引导的DNA核酸酶是源自II型CRISPR系统(例如，Cas9)的CRISPR核酸酶。CRISPR核酸酶可以源自酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcuspyogenes)、链球菌(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsi dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿产色链霉菌、链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、硒化芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、戟叶鹅绒藤微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极地单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌(Cyanothecesp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、艰难梭菌(Clostridium difjicile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、丙酸降解菌(Pelotomaculumthermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)、节旋藻(Arthrospira sp.)、林氏藻(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻(Oscillatoria sp.)、移动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、深海单细胞蓝细菌(Acaryochloris marina)或编码具有已知PAM序列的CRISPR核酸酶的任何物种。由未培养的细菌编码的CRISPR核酸酶也可以用于本发明的上下文中。(参见Burstein等人,《自然(Nature)》,2017)。具有已知PAM序列的CRIPSR蛋白的变体，例如SpCas9 D1135E变体、SpCas9 VQR变体、SpCas9 EQR变体或SpCas9VRER变体也可以用于本发明的上下文中。

因此，CRISPR系统的RNA引导的DNA核酸酶，如Cas9蛋白或经修饰的Cas9或Cas9的同源物或直系同源物，或者属于其它类型的CRISPR系统(如Cpf1以及其同源物和直系同源体)的其它RNA引导的DNA核酸酶可以用于本发明的组合物中。还可以使用另外的CRISPR核酸酶，例如PCT国际申请公开第WO2020/223514号和第WO2020/223553号中所描述的核酸酶，所述文献中的每一个特此通过引用并入。

在某些实施例中，CRIPSR核酸酶可以是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽共同的定性生物性质的化合物。“功能衍生物”包含但不限于天然序列的片段、天然序列多肽的衍生物以及其片段，前提是其与对应的天然序列多肽具有共同的生物活性。本文所设想的生物活性是功能衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、共价修饰两者以及其融合。Cas多肽或其片段的合适的衍生物包含但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合、共价修饰。衍生物包含但不限于CRISPR切口酶、催化无活性或“死亡”CRISPR核酸酶，以及CRISPR核酸酶或其衍生物与其它酶(如碱基编辑子或逆转录转座子)的融合。参见例如，Anzalone等人,(2019)和PCT国际申请第PCT/US2020/037560号。

包含Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段的衍生物的Cas蛋白可以从细胞获得，或者通过化学合成的或通过这两种程序的组合合成。细胞可以是自然产生Cas蛋白的细胞，或者是自然产生Cas蛋白并经基因工程以产生更高表达水平的内源性Cas蛋白或从外源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞，所述核酸编码与内源性Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，细胞不自然产生Cas蛋白，并且被基因工程化以产生Cas蛋白。

在一些实施例中，CRISPR核酸酶是Cpf1。Cpf1是单RNA引导的核酸内切酶，其利用富含T的原间隔子邻近基序。Cpf1通过交错的DNA双链断裂来切割DNA。来自氨基酸球菌属(Acidaminoccus)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)的两种Cpf1酶已被证明在人细胞中具有有效的基因组编辑活性。(参见Zetsche等人,2015)。

因此，II型CRISPR系统的RNA引导的DNA核酸酶，如Cas9蛋白或经修饰的Cas9或Cas9的同源物、直系同源物或变体，或属于其它类型的CRISPR系统(如Cpf1以及其同源物、直系同源物或变体)的其它RNA引导的DNA核酸酶可以用于本发明。

在一些实施例中，引导分子包括一个或多个赋予新的或改进的性质(例如，改进的降解稳定性、改进的杂交能量学或改进的与RNA引导的DNA核酸酶的结合性质)的化学修饰。合适的化学修饰包含但不限于：经修饰的碱基、经修饰的糖部分或经修饰的核苷间键。合适的化学修饰的非限制性实例包含：4-乙酰基胞苷、5-(羧羟甲基)尿苷、2'-O-甲基胞苷、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷、5-羧甲氨基甲基尿苷、二氢尿苷、2'-O-甲基假尿苷、“β,D-半乳糖基辫苷”、2'-O甲基鸟苷、肌苷、N6-异戊烯基腺苷、1-甲基腺苷、1-甲基假尿苷、1-甲基鸟苷、1-甲基肌苷、“2,2-二甲基鸟苷”、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、3-甲基胞苷、5-甲基胞苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲基氨基甲基尿苷、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿苷、“β,D-甘露糖基辫苷”、5-甲氧基羰基甲基-2-硫尿苷、5-甲氧基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基-2-甲基硫代嘌呤-6-基)氨基甲酰基)苏氨酸、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)N-甲基氨基甲酰基)苏氨酸、尿苷-5-氧基乙酸-甲酯、尿苷-5-氧乙酸、怀丁氧苷、辫苷、2-硫代胞苷、5-甲基-2-硫尿苷、2-硫尿苷、4-硫尿苷、5-甲基尿苷、N-((9-β-D-呋喃核糖基嘌呤-6-基)-氨基甲酰基)苏氨酸、2'-O-甲基-5-甲基尿苷、2'-O-甲基尿苷、怀丁苷、“3-(3-氨基-3-羧基-丙基)尿苷,(acp3)u”、2'-0-甲基(M)、3'-硫代磷酸酯(MS)、3'-硫代PACE(MSP)、假尿苷或1-甲基假尿苷。每种可能性都表示本发明的单独实施例。

靶向C3等位基因的引导序列

任何给定的RNA分子，包括用于靶向DNA位点的引导序列部分都可能导致RNA分子的降解、有限活性、无活性或脱靶效应。因此，合适的引导序列部分对于靶向基因中的给定DNA位点是必要的。

通过本发明，已经鉴定了一组新的引导序列部分，用于靶向至少一个C3等位基因，向所述至少一个等位基因引入在C3启动子控制下表达的核苷酸的序列，并且由此治疗病症或疾病。优选地，能够靶向两个C3等位基因的无差别RNA分子用于靶向。

然而，也设想了能够靶向特定C3等位基因的RNA分子。例如，RNA分子的引导序列部分可以靶向一个C3等位基因中存在的特定SNP。值得注意的是，给定的基因可以含有数千个SNP。利用二十五个碱基对的靶向窗口靶向基因中的每个SNP将需要数十万个引导序列。

本公开提供了能够特异性靶向C3等位基因的引导序列部分。在一些实施例中，C3等位基因是靶向的，而使其它非靶向的C3等位基因未被修饰。本发明的一些引导序列被设计为并且最有可能在C3等位基因之间特异性区分。在一些实施例中，两个C3等位基因都是被靶向的。在靶向C3序列的所有可能的引导序列中，本文所公开的特定引导序列对于与所公开的实施例一起起作用是特别有效的。

简而言之，引导序列可以具有如下性质：(1)在普通群体，在特定种族群体或在患者群体中具有高患病率的靶SNP/插入/缺失/插入缺失高于1％，并且在同一群体中SNP/插入/确实/插入缺失杂合率高于1％；以及(2)靶向SNP/插入/缺失/插入缺失在基因的一部分附近的位置，例如在基因的任何部分的5k碱基内，例如启动子、UTR、外显子或内含子。在一些实施例中，在普通群体，在特定群体或在患者群体中，SNP/插入/缺失/插入缺失的患病率高于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，并且在相同群体中SNP/插入/缺失/插入缺失杂合率高于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％，14％或15％。每种可能性代表单独的实施例，并且可以任意组合。

在本发明的一些实施例中，RNA分子用于靶向C3基因中的位点，以将外源核苷酸序列引入或敲入C3基因中。在一些实施例中，所述位点是SNP位置。在一些实施例中，位点的位置在预期的敲入位点附近，优选地在起始密码子或终止密码子附近，优选地在起始密码子或终止密码子的150个碱基对内。在一些实施例中，所述位点位于靶向的一个C3等位基因或多个等位基因的第一编码外显子之后的第一内含子内。在一些实施例中，所述位点位于靶向的C3等位基因的内含子1内。

本发明的引导序列部分可以：(1)靶向所述靶向的C3基因的杂合SNP；(2)靶向基因的上游或下游的位置(公共序列或SNP)；(3)靶向在普通群体中，特定种族群体中或患者群体中的SNP/插入/缺失/插入缺失的患病率高于1％的SNP；(4)具有大于30％且小于85％的鸟嘌呤-胞嘧啶含量；(5)没有七个或更多个胸腺嘧啶/尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶或腺嘌呤的重复；以及(6)在基因组中没有与相同PAM序列零错配的另外的靶标。本发明的引导序列可以满足以上标准中的任一者，并且最有可能在靶向的等位基因与其对应的非靶向的等位基因之间进行区分。

递送到细胞

本文所描述的组合物可以通过任何合适的手段递送到靶细胞。本发明的组合物可以靶向含有和/或表达C3等位基因的任何细胞，包含任何哺乳动物细胞，优选地肝脏细胞。例如，在一个实施例中，特异性靶向C3等位基因的RNA分子被递送到靶细胞，并且所述靶细胞是HSC、肝细胞或其它肝脏细胞。递送到细胞可以体外、离体或体内进行。进一步地，本文所描述的核酸组合物可以作为DNA分子、RNA分子、核糖核蛋白(RNP)、核酸载体或其任何组合中的一种或多种递送。

在一些实施例中，本文所描述的组合物的体内递送方法包含通过慢病毒、腺相关病毒(AAV)或纳米颗粒递送。在一些实施例中，本文所描述的组合物的体内递送方法包含通过慢病毒、腺相关病毒(AAV)或纳米颗粒递送。所述组合物可以呈RNP组合物的形式。因此，递送可以在体内递送到受试者体内的肝脏细胞，例如，患有肝脏相关病症的受试者。

在一些实施例中，将本文所描述的组合物中的任一种离体递送到细胞。在一些实施例中，所述细胞是干细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝脏细胞。在一些实施例中，所述细胞是肝细胞。在一些实施例中，所述细胞是iPS源性肝细胞。所述组合物可以通过任何已知的离体递送方法递送到细胞，包含但不限于电穿孔、病毒转导、纳米颗粒递送、脂质体等。所述组合物可以呈RNP组合物的形式。本部分中描述了另外的详细的递送方法。

在一些实施例中，从受试者获得肝叶或肝细胞，例如通过进行活检。然后可以通过离体递送本文所描述的组合物对获得的细胞进行基因修饰。可以通过进行肝叶移植或肝细胞移植将经修饰的细胞重新引入受试者。

在一些实施例中，本文所描述的组合物的RNA分子包括化学修饰。合适的化学修饰的非限制性实例包含2'-0-甲基(M)、2'-0-甲基、3'硫代磷酸酯(MS)或2'-0-甲基，3'硫代PACE(MSP)、假尿苷和1-甲基假尿苷。每种可能性都表示本发明的单独实施例。

任何合适的病毒载体系统都可以用于递送核酸组合物，例如本主题发明的RNA分子组合物。常规基于病毒和非基于病毒的基因转移方法可以用于引入核酸和靶组织。在某些实施例中，施用核酸用于体内或离体基因疗法用途i。非病毒载体递送系统包含裸核酸和与如脂质体或泊洛沙姆等递送媒剂复合的核酸。关于基因疗法程序的综述，参见Anderson(1992)；Nabel和Felgner(1993)；Mitani和Caskey(1993)；Dillon(1993)；Miller(1992)；Van Brunt(1988)；Vigne(1995)；Kremer和Perricaudet(1995)；Haddada等人,(1995)；以及Yu等人,(1994)。

核酸和/或蛋白质的非病毒递送方法包含电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、粒子枪加速、病毒体、脂质体、免疫脂质体、脂质纳米颗粒(LNP)、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、人工病毒粒子以及核酸的药剂增强摄取，或者可以通过细菌或病毒(例如，农杆菌(Agrobacterium)、根瘤菌(Rhizobium sp.)、NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboiummeliloti)、洛蒂中慢生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、烟草花叶病毒、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒)递送到植物细胞。(参见例如，Chung等人,2006)。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可以用于递送核酸。阳离子脂质介导的蛋白质和/或核酸的递送也被设想为体内、离体或体外递送方法。(参见Zuris等人,(2015)；还参见Coelho等人,(2013)；Judge等人,(2006)；以及Basha等人,(2011))。

非病毒载体，如基于转座子的系统(例如重组睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统或重组PiggyBac转座子系统)也可以递送到靶细胞，并且用于在靶细胞中转座组合物的分子的多核苷酸序列或编码组合物的分子的多核苷酸序列。

另外的示例性核酸递送系统包含由以下提供的那些：德国科隆的Amaxa.RTM.生物系统公司(Amaxa.RTM.Biosystems,Cologne,Germany)、马里兰州洛克维尔的马克赛特公司(Maxcyte,Inc.,Rockville,Md.)、马萨诸塞州霍利斯顿的BTX分子递送系统公司(BTXMolecular Delivery Systems,Holliston,Mass.)以及哥白尼治疗公司(CopernicusTherapeutics Inc.)(参见例如，美国专利第6,008,336号)。脂质转染在例如美国专利第5,049,386号、美国专利第4,946,787号；以及美国专利第4,897,355号中进行了描述，并且脂质转染试剂是商业销售的(例如Transfectam.TM.、Lipofectin.TM.和Lipofectamine.TM.RNAiMAX)。适于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包含PCT国际公开第WO/1991/017424号和第WO/1991/016024号中公开的那些。递送可以是到细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。

脂质:核酸复合物的制备，包含靶向的脂质体(如免疫脂质复合物)是本领域技术人员所熟知的(参见例如，Crystal,《科学(Science)》(1995)；Blaese等人,(1995)；Behr等人,(1994)；Remy等人,(1994)；Gao和Huang(1995)；Ahmad和Allen(1992)；美国专利第4,186,183号；第4,217,344号；第4,235,871号；第4,261,975号；第4,485,054号；第4,501,728号；第4,774,085号；第4,837,028号；以及第4,946,787号)。

另外的递送方法包含将待递送的核酸包装到EnGeneIC递送媒剂(EDV)中的使用。这些EDV使用双特异性抗体特异性递送到靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性并且另一个臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，并且随后通过内吞作用将EDV带入细胞。一旦进入细胞，内容物就会被释放(参见MacDiarmid等人,2009)。

递送媒剂包含但不限于细菌，优选地非致病性媒剂、纳米颗粒、外泌体、微囊泡、基因枪递送(例如，通过将组合物附着到使用通过“基因枪”发射到细胞中的金颗粒上)、病毒媒剂(包含但不限于慢病毒、AAV和逆转录病毒)、病毒样颗粒(VLP)、大VLP(LVLP)、慢病毒样颗粒、转座子、病毒载体、裸载体、DNA或RNA，以及本领域已知的其它递送媒剂。

CRISPR核酸酶和/或编码CRIPSR核酸酶的多核苷酸，以及任选地另外的核苷酸分子和/或另外的蛋白质或肽的递送可以通过利用单个递送媒剂或方法或不同递送媒剂或方法的组合来进行。例如，可以利用LNP将CRISPR核酸酶递送到细胞，并且可以利用AAV将crRNA分子和tracrRNA分子递送到细胞。可替代地，CRISPR核酸酶可以利用AAV颗粒递送到细胞，并且crRNA分子和tracrRNA分子可以利用单独的AAV颗粒递送到细胞，由于大小限制，这可能是有利的。

使用基于RNA或DNA病毒的系统来进行核酸的病毒介导的递送利用了高度进化的过程来将病毒靶向到体内的特定细胞，并且将病毒有效负载运输到细胞核。病毒载体可以直接向患者施用(体内)或其可用于体外处理细胞并且向患者施用经修饰的细胞(离体)。用于递送核酸的常规基于病毒的系统包含但不限于用于基因转移的重组逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘和单纯疱疹病毒载体。RNA病毒可以用于递送本文所描述的RNA组合物。另外，已在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。本发明的核酸可以通过非整合慢病毒递送。任选地，利用慢病毒递送RNA。任选地，慢病毒包含核酸酶的mRNA、引导序列的RNA。任选地，慢病毒包含核酸酶的mRNA、引导序列的RNA和供体模板。任选地，慢病毒包含核酸酶蛋白、引导RNA。任选地，慢病毒包含核酸酶蛋白、引导RNA和/或用于通过例如同源定向修复进行基因编辑的供体模板。任选地，慢病毒包含核酸酶的mRNA、靶向DNA的RNA和tracrRNA。任选地，慢病毒包含核酸酶的mRNA、靶向DNA的RNA和tracrRNA以及供体模板。任选地，慢病毒包含核酸酶蛋白、靶向DNA的RNA和tracrRNA。任选地，慢病毒包含核酸酶蛋白、靶向DNA的RNA和tracrRNA以及用于通过例如同源定向修复进行基因编辑的供体模板。

如上所述，本文所描述的组合物可以使用非整合慢病毒颗粒方法(例如，系统)递送到靶细胞。此类方法可以用于将mRNA或其它类型的RNA递送到靶细胞中，使得将RNA递送到靶细胞引起本文所描述的组合物在靶细胞的内部组装。还参见PCT国际公开第WO/2013/014537号、第WO/2014/016690号、第WO/2016/185125号、第WO/2017/194902号和第WO/2017/194903号。

逆转录病毒的嗜性可以通过掺入外源包膜蛋白来改变，从而扩大靶细胞的潜在靶标群体。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包括具有至多6-10kb外源序列包装能力的顺式作用长末端重复序列。最小顺式作用LTR对于载体的复制和包装是足够的，其随后用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包含基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和其组合的那些逆转录病毒载体(参见例如Buchschacher等人,(1992)；Johann等人,(1992)；Sommerfelt等人,(1990)；Wilson等人,(1989)；Miller等人,(1991)；PCT国际公开第WO/1994/026877A1号)。

目前，至少六种病毒载体方法可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入到辅助细胞系中的基因来补充缺陷载体以产生转导剂的方法。

pLASN和MFG-S是已在临床试验中使用的逆转录病毒载体的实例(参见Dunbar等人,1995；Kohn等人,1995；Malech等人,1997)。PA317/pLASN是基因疗法试验中使用的第一治疗载体(Blaese等人,1995)。对于MFG-S包装的载体，已经观察到50％或更高的转导效率。(Ellem等人,(1997)；Dranoff等人,1997)。

包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞包含包装腺病毒、AAV和Psi-2细胞的293细胞或包装逆转录病毒的PA317细胞。用于基因疗法的病毒载体通常由将核酸载体包装到病毒颗粒中的生产细胞系产生。载体典型地含有包装和随后整合到宿主(如果适用)中所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒替换。缺失病毒功能由包装细胞系反式供应。举例来说，用于基因疗法的AAV载体典型地仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，所述序列是包装和整合到宿主基因组中所需的。病毒DNA包装于细胞系中，所述细胞系含有辅助质粒，其编码其它AAV基因，即rep和cap，但缺乏ITR序列。细胞系还感染作为辅助物的腺病毒。辅助病毒促进AAV载体复制和从辅助质粒表达AAV基因。由于缺乏ITR序列，辅助质粒不大量包装。可以通过例如热处理来减少腺病毒污染，腺病毒比AAV对热处理更敏感。另外，AAV可以使用杆状病毒系统以临床规模产生(参见美国专利第7,479,554号)。

在许多基因疗法应用中，需要对特定组织类型以高度特异性递送基因疗法载体。因此，病毒载体可以通过以与病毒的外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来修饰以对给定细胞类型具有特异性。配体选择为对已知存在于所关注的细胞类型上的受体具有亲和力。例如，Han等人,(1995)报道了莫洛尼鼠(Moloney murine)白血病病毒可以被修饰以表达与gp70融合的人调节蛋白，并且重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。此原理可以延伸到其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体并且病毒表达包括细胞表面受体的配体的融合蛋白。举例来说，丝状噬菌体可以经工程改造以显示对几乎任何所选择的细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管以上描述主要适用于病毒载体，相同的原理也可应用于非病毒载体。此类载体可以经工程化以含有有利于特定靶细胞摄取的特定摄取序列。

基因疗法载体可以通过向个体患者施用进行体内递送，通常通过全身施用(例如，玻璃体内、静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部应用，如下文所描述的。可替代地，可以将载体离体递送到细胞，如从个体患者(例如淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检)或通用供体造血干细胞移植的细胞，然后任选地在选择并入载体的细胞之后将细胞重新植入患者体内。非限制性示例性离体方法可以涉及从患者去除组织(例如，外周血、骨髓和脾脏)进行培养，将核酸转移到培养的细胞(例如，造血干细胞)，然后将细胞移植到患者的靶组织(例如，骨髓和脾脏)。在一些实施例中，干细胞或造血干细胞可以进一步用活力增强剂处理。

用于诊断、研究或基因疗法的离体细胞转染(例如，通过将经转染的细胞再输注到宿主生物体中)是本领域技术人员众所周知的。在优选的实施例中，从受试者生物体中分离细胞，用核酸组合物转染，并且重新输注回受试者生物体(例如，患者)体内。适于离体转染的各种细胞类型是本领域技术人员众所周知的(参见例如，Freshney,《动物细胞的培养，基本技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells,A Manual of Basic Technique andSpecialized Applications)》(第6版,2010)以及其中引用的讨论如何从患者中分离和培养细胞的参考文献)。

合适的细胞包含但不限于真核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包含COS、CHO(例如CHO--S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NSO、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞、任何植物细胞(分化的或未分化的)以及昆虫细胞，如草地贪夜蛾(Spodopterafugiperda，Sf)或真菌细胞，如酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。在某些实施例中，细胞系为CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。另外，可以分离原代细胞，并且在用引导的核酸酶系统(例如CRISPR/Cas)处理后离体用于将其重新引入待治疗的受试者体内。合适的原代细胞包含外周血单核细胞(PBMC)和其它血细胞子集，如但不限于CD4+T细胞或CD8+T细胞。合适的细胞还包含干细胞，例如胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞(CD34+)、神经元干细胞和间充质干细胞。

在一个实施例中，干细胞用于细胞转染和基因疗法的离体程序中。使用干细胞的优势在于其可以在体外分化成其它细胞类型或可以引入哺乳动物(如细胞的供体)中，在那里其将在骨髓中植入。使用细胞因子(如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α)在体外将CD34+细胞分化为临床上重要的免疫细胞类型的方法是已知的(作为非限制性实例，参见Inaba等人,1992)。

使用已知方法分离干细胞以用于转导和分化。例如，通过用与不需要的细胞(如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和Iad(分化的抗原呈递细胞))结合的抗体筛选骨髓细胞，从骨髓细胞中分离干细胞(作为非限制性实例，参见Inaba等人,1992)。在一些实施例中，还可使用已经修饰的干细胞。

含有治疗核酸组合物的载体(例如，逆转录病毒、脂质体等)也可以直接施用于生物体，用于体内细胞转导。施用是通过正常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径，包含(但不限于)注射、输注、局部施用(例如，滴眼液或霜)和电穿孔。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。根据一些实施例，组合物通过IV注射递送。

适于将转基因引入到免疫细胞(例如，T细胞)中的载体包含非整合慢病毒载体。参见例如美国专利公开第2009/0117617号。

药学上可接受的载剂部分地由所施用的特定组合物以及通过用于施用组合物的特定方法来确定。因此，存在多种合适的药物组合物的调配物，如下文所描述的(参见例如，《雷明顿氏药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第17版,1989)。

根据一些实施例，提供了一种RNA分子，所述RNA分子与RNA引导的DNA核酸酶结合/缔合和/或将其引导到包括至少一个核苷酸的序列，所述核苷酸在所关注的基因的等位基因(例如，SNP)之间不同(即一个C3等位基因的序列，所述序列不存在于其它C3等位基因中)。C3等位基因之间的任何序列差异都可以被本发明的RNA分子靶向，以修饰或编辑单个C3等位基因。

所公开的组合物和方法也可以用于制造用于治疗患者的显性遗传病症的药物。

C3安全港敲入方法的作用机制

在不受任何理论或机制约束的情况下，本发明可以用于应用CRISPR核酸酶来处理C3等位基因，以便将序列引入C3等位基因内的安全港位点，并且由此通过C3等位基因的启动子控制引入的序列的表达。引入的序列的表达由此预防或治疗肝脏相关病症。基于所使用的CRISPR核酸酶的靶向的位置和类型(例如根据所需的PAM序列)，可以从表1中选择特定的引导序列。

C3基因位于染色体19上，并且编码补体组分3蛋白。供体分子可以用于通过敲入将期望的核苷酸的序列引入C3安全港位点。因此，编码预防或治疗肝脏相关疾病的表达产物的任何序列都可以在C3安全港位点处引入。因此，由供体分子编码的序列的非限制性实例包含ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、OTC-鸟氨酸转氨甲酰酶、ASD-精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶和N-乙酰谷氨酸合成酶或其部分。

一种策略是在C3基因的第一编码外显子之后的第一内含子或第一内含子中敲入核苷酸序列。此策略利用RNA分子将CRISPR核酸酶靶向C3基因的内含子1，并且由此介导双链断裂。由于断裂是在非调控区中介导的，预期不会影响基因的表达。对于没有敲除C3的序列的敲入，通过将剪接受体(SA)和剪接供体(SD)元件添加到敲入供体盒中，将所述序列作为新外显子(即外显子2)插入。另外，为了防止C3基因的表达的中断，供体盒在插入的基因的C末端处包含至少一种2A自切割肽和/或C3的信号肽，其在内质网中被切割并且能够将插入的序列蛋白表达产物与C3蛋白分离。

另一种策略是将核苷酸序列敲入特定C3等位基因的第一内含子中。根据gnomAD，存在具有C3移码突变的健康的个体，这表明单倍型不足并不令人担忧。因此，核苷酸序列的敲入可以作为具有翻译终止信号的新外显子插入到单个C3等位基因中，由此仅敲除一个C3等位基因的表达，而其它C3等位基因保持不受影响。C3等位基因特异性编辑事件可以通过例如靶向位于内含子1中的高度频繁的SNP(如rs199713383)来实现。

另一种策略是通过替换终止密码子来将核苷酸序列敲入C3基因中。在这种情况下，双等位基因断裂将在3'UTR区中介导，所述区在终止密码子的下游至多150个核苷酸，或在终止密码子的上游但在内含子区中。这些区中的断裂的位置不影响C3的表达。插入敲入的核苷酸序列代替终止密码子，并且敲入供体盒在插入的核苷酸序列的N末端处含有至少一个2A自切割肽，从而能够将插入的序列蛋白表达产物与C3蛋白分离。

另一种策略是通过替换终止密码子来将核苷酸序列敲入特定C3等位基因中。这可以通过利用RNA分子将CRISPR核酸酶靶向位于终止密码子上游150个核苷酸内的SNP位置来实现，如位于C3等位基因的外显子41中的rs17030。

特异性靶向C3基因的等位基因的RNA引导序列的实例

尽管可以设计大量的引导序列来靶向C3等位基因，但表1中所描述的由下面的SEQID NO:1-7,046鉴定的核苷酸序列被特别选择以有效地实施本文所述的方法并有效地区分等位基因。

表1示出了设计用于如以上实施例中所描述与C3等位基因缔合的引导序列。每个工程化的引导分子被进一步设计为与位于原间隔子邻近基序(PAM)旁边的所关注的靶基因组DNA序列缔合，例如与序列NGG或NAG匹配的PAM，其中“N”是任何核碱基。引导序列被设计为与一种或多种不同的CRISPR核酸酶协同工作，包含但不限于例如SpCas9WT(PAM SEQ:NGG)、SpCas9.VQR.1(PAM SEQ:NGAN)、SpCas9.VQR.2(PAM SEQ:NGNG)、SpCas9.EQR(PAMSEQ:NGAG)、SpCas9.VRER(PAM SEQ:NGCG)、SaCas9WT(PAM SEQ:NNGRRT)、SpRY(PAM SEQ:NRN或NYN)、NmCas9WT(PAM SEQ:NNNNGATT)、Cpf1(PAM SEQ:TTTV)或JeCas9WT(PAM SEQ:NNNVRYM)。本发明的RNA分子各自被设计成为一种或多种不同的CRISPR核酸酶结合形成复合物，并且被设计为利用与所使用的CRISPR核酸酶相应的一种或多种不同的PAM序列靶向所关注的多核苷酸序列。

表1：设计用于与特定C3基因靶标缔合的引导序列部分

表1的第1列中列出的指示的位置基于gnomAD v3数据库和UCSC基因组浏览器组装ID：hg38，测序/组装提供者ID：基因组参考联盟人类GRCh38.p12(GCA_000001405.27)。组装日期：2013年12月首次发布；2017年12月补丁发布12。

SNP详细信息由列出的SNP ID编号(“rs编号”)表示，所述编号基于单核苷酸多态性的NCBI 2018数据库(dbSNP)。指示的DNA突变与从NCBI RefSeq基因获得的转录结果NM_001256054相关。

下面提供了实例，以促进更全面地理解本发明。以下实例展示了制备和实践本发明的示例性模式。然而，本发明的范围不限于这些实例中公开的具体实施例，所述实施例仅用于说明的目的。

实验细节

实例1：C3靶上活性分析

在HeLa细胞中使用SpCas9筛选包括17个至50个连续核苷酸的引导序列，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。靶上活性通过DNA毛细管电泳分析确定。

实例2：C3靶向RNA引导分子的活性

C3基因被选择作为靶向肝脏细胞的基因组安全港位点，因为其在靶组织中有丰富的表达，并且能够以确保分泌和保持C3表达的方式适应新序列的整合。插入位点被工程化到C3的第一内含子中，与在第一外显子处编码的分泌肽非常接近，并且最终从最终蛋白质产物中切割出来。在HeLa细胞中进行使用OMNI-50和OMNI-79CRISPR核酸酶的引导筛选。简而言之，使用jetOPTIMUS试剂(波利普斯公司(Polyplus))以96孔板型将编码质粒(64ng)的OMNI-50或OMNI-79核酸酶与每个引导编码DNA质粒(20ng)共转染。在DNA转染后72小时采集细胞，提取基因组DNA，并且然后用于下一代测序(NGS)分析。图1中的图表示三(3)个独立实验的编辑％的平均值±标准偏差(STDV)。NGS分析显示，两种核酸酶在8％至86％编辑的范围之间。值得注意的是，与基于DNA的组合物相比，OMNI-50RNP组合物通常表现出增加的活性，因此在HeLa细胞中的DNA筛选具有较低的概念验证截止。

CRISPR核酸酶和HDR模板可以通过腺相关病毒(AAV)递送到靶细胞。由于其小体积，OMNI-79核酸酶可以与引导分子一起包装在AAV中。将引导“g6”和“g11”克隆到具有OMNI-79V5570核酸酶的AAV载体中，以测试HeLa细胞中的活性(图2)。简而言之，使用jetOPTIMUS试剂(波利普斯公司)以96孔板型转染AAV质粒(150ng)。转染后72小时提取基因组DNA并通过NGS进行分析。图2中的图表示三(3)个独立实验的编辑％的平均值±STDV。

通过RNP电穿孔在HepG2细胞中评估OMNI-50引导“g6”和“g11”的活性。简而言之，将4×10⁵个HepG2细胞与由105pmole OMNI-50蛋白和120pmole sgRNA组成的预组装的RNP混合，并且然后与100pmole电穿孔增强剂(IDT-1075916)混合。然后使用SF Cell 4D-Nucleofector X Kit S(PBC2-00675，龙沙公司(Lonza))通过应用DS-123程序将混合物电穿孔到细胞中。在电穿孔后72小时收获一部分细胞，并且提取基因组DNA以通过NGS测量靶上活性。根据NGS分析，两种引导都表现出高插入缺失形成活性(图2)。

为了评估OMNI-50引导组合物编辑对C3表达的影响，在电穿孔后七(7)天从HepG2细胞提取总RNA，并且通过qRT-PCR测量C3的mRNA水平。结果表明C3的表达得以保留，因为仅检测到对C3 mRNA的水平的轻微影响(图3)。

为了验证HDR在C3基因座处的可行性，克隆了同源臂长度为500个核苷酸(SEQ IDNO:7054)、800个核苷酸(SEQ ID NO:7053)和927个核苷酸(SEQ ID NO:7052)的三个构建体。同源臂被定位在“g11”引导分子的切割位点处。使用编码具有poly-A尾部的GFP的序列作为HDR模板中的报告基因。将长度为32个核苷酸的剪接受体位点添加到GFP序列的上游(图4)。在这种情况下，剪接位点序列取自pmaxGFP载体(龙沙公司)，尽管也可以使用其它剪接序列。这种特异性HDR模板插入被用作概念验证，并且干扰C3内源性蛋白表达。其它供体模板可以用P2A肽序列设计，以避免使用“STOP”密码子并允许C3蛋白表达。

OMNI-79V5570核酸酶和靶向C3的“g11”引导分子或GFP HDR模板被包装在AAV DJ病毒颗粒中。HepG2细胞以10⁵的感染复数(MOI)用每一种指示的AAV颗粒感染。在处理后72小时和15天，通过流式细胞术分析细胞的GFP表达(图5和图6)。通过读板仪评估GFP分泌(图7)。72小时后通过DNA提取后的NGS分析编辑水平。单独用核酸酶和引导分子感染的细胞显示出42.24±4.4％的编辑。编辑水平与HDR速率之间存在相关性，这表明HDR非常有效。

GFP荧光也在细胞培养基中检测到(图7)，表明HDR模板的正确整合和剪接。

通过使用OMNI-50核酸酶和靶向C3的“g11”引导的RNP编辑，使用电穿孔和AAV递送HDR模板，也证明了类似的HDR水平(图8，图9)。在仅RNP处理的细胞中的编辑水平为53.6±1.05％。

表2：靶向C3的内含子1的22个核苷酸的引导序列部分。

表3：OMNI CRISPR核酸酶序列、PAM要求和sgRNA支架序列

OMNI-79CRISPR核酸酶和OMNI-50CRISPR核酸酶分别在PCT国际申请公开第WO/2021/248016号和第WO/2020/223513号中进行了描述，所述文献中的每一个的内容特此通过引用并入。

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Claims (26)

1.一种用于在细胞中修饰补体组分3(C3)基因的等位基因的方法，所述方法包括：

向所述细胞引入组合物，所述组合物包括：

至少一种CRISPR核酸酶或编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列；以及

RNA分子，所述RNA分子包括具有17个至50个核苷酸的引导序列部分或编码所述引导序列部分的核苷酸序列，

其中所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子的复合物影响所述C3基因的所述等位基因中的双链断裂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物进一步包括供体分子，所述供体分子含有在双链断裂位点处引入的核苷酸序列，使得引入的核苷酸序列的表达由所述C3基因的启动子介导。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述引入的序列是来自以下的序列：ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶和N-乙酰谷氨酸合成酶、α半乳糖苷酶A、凝血因子IX、凝血因子VII、溶酶体α葡糖苷酶、纤维蛋白原、苯丙氨酸4羟化酶、碱性磷酸酶、葡糖神经酰胺酶、β半乳糖苷酶、胆色素原脱氨酶、芳基硫酸酯酶B、β葡糖醛酸酶、αN乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶体α,αL-艾杜糖醛酸酶、甘露糖苷酶、磷脂酰胆碱固醇酰基转移酶、N-磺基葡糖胺磺酰水解酶、凝血因子X、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、A1AT、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、溶酶体α葡糖苷酶、细胞周期蛋白依赖性激酶样5、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、苯丙氨酸解氨酶、蛋白质谷氨酰胺γ谷氨酰转移酶K或溶酶体保护蛋白编码基因。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述RNA分子的所述引导序列部分将所述CRISPR核酸酶靶向C3等位基因的SNP位置。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述SNP位置是rs17030、rs199713383和rs35473940中的任一者。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述RNA分子的所述引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有靶向C3等位基因的SNP位置的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述SNP位置含有杂合SNP。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述RNA分子包括靶向C3的内含子1或C3的3'非翻译区(3'UTR)的无差别引导序列部分。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述RNA分子包括无差别引导部分，所述无差别引导部分靶向位于选自19:6677732-6677881和19:6719404-6720515中的任一者的基因组范围内的序列。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子的所述引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子的所述引导序列部分包括相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述RNA分子的所述引导序列部分包括17个至50个连续核苷酸，所述连续核苷酸含有被修饰以含有相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中相对于对所述C3基因的等位基因具有更高互补性的引导序列部分，所述引导序列部分对所述CRISPR核酸酶和所述RNA分子的所述复合物提供更高的靶向特异性。

14.一种通过根据权利要求1至13中任一项所述的方法获得的经修饰的细胞。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述经修饰的细胞是干细胞、肝脏细胞、肝细胞或iPS源性肝细胞。

16.一种RNA分子，其包括具有17个至50个连续核苷酸的引导序列部分，所述连续核苷酸含有SEQ ID NO:1-7,046或被修饰以含有相对于完全互补的C3靶序列的1个、2个、3个、4个或5个核苷酸错配的SEQ ID NO:1-7,046中的任一者中所示的序列中的核苷酸。

17.一种组合物，其包括根据权利要求16所述的RNA分子以及至少一种CRISPR核酸酶。

18.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包括供体分子。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述供体分子含有来自以下的序列：ATP7B、A1AT、G6PC、SERPINA、LDLR、TTR、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸酶、精氨琥珀酸酶、氨基甲酰基磷酸合成酶、N-乙酰谷氨酸合成酶、α半乳糖苷酶A、凝血因子IX、凝血因子VII、溶酶体α葡糖苷酶、纤维蛋白原、苯丙氨酸4羟化酶、碱性磷酸酶、葡糖神经酰胺酶、β半乳糖苷酶、胆色素原脱氨酶、芳基硫酸酯酶B、β葡糖醛酸酶、αN乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶体α,αL-艾杜糖醛酸酶、甘露糖苷酶、磷脂酰胆碱固醇酰基转移酶、N-磺基葡糖胺磺酰水解酶、凝血因子X、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶、鞘磷脂磷酸二酯酶、A1AT、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、溶酶体α葡糖苷酶、细胞周期蛋白依赖性激酶样5、低密度脂蛋白受体相关蛋白1、苯丙氨酸解氨酶、蛋白质谷氨酰胺γ谷氨酰转移酶K或溶酶体保护蛋白编码基因。

20.一种用于修饰细胞中的C3等位基因的方法，所述方法包括向所述细胞递送根据权利要求17至19中任一项所述的组合物。

21.一种用于治疗病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者的细胞递送根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，或向所述受试者递送根据权利要求14至15所述的经修饰的细胞。

22.一种药物，其包括根据权利要求17至19中任一项所述的组合物，所述药物用于修饰细胞中的C3等位基因，其中所述药物通过向所述细胞递送根据权利要求17至19中任一项所述的组合物来施用。

23.一种根据权利要求17至19中任一项所述的组合物或根据权利要求14至15所述的经修饰的细胞的用途，其用于治疗、改善或预防病症，所述用途包括向患有所述病症或有风险患有所述病症的受试者的细胞递送根据权利要求17至19中任一项所述的组合物或向所述受试者递送根据权利要求14至15所述的经修饰的细胞。

24.一种药物，其包括根据权利要求17至19中任一项所述的组合物或根据权利要求14至15所述的经修饰的细胞，所述药物用于治疗、改善或预防病症，其中所述药物通过向患有所述病症或有风险患有所述病症的受试者的细胞递送根据权利要求17至19中任一项所述的组合物或向所述受试者递送根据权利要求14至15所述的经修饰的细胞来施用。

25.根据权利要求21所述的方法、根据权利要求23所述的用途或根据权利要求24所述的药物，其中所述病症是肝脏相关病症或溶酶体贮积病症。

26.根据权利要求24所述的药物，其中所述药物是酶替代疗法。