CN109475646A - 用于crispr/cas成分的脂质纳米颗粒制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供基于脂质纳米颗粒的组合物和用于递送CRISPR/Cas基因编辑成分的方法。

Description

用于CRISPR/CAS成分的脂质纳米颗粒制剂

本申请要求2016年3月30日提交的美国临时专利申请号62/315,602、2016年8月16日提交的美国临时专利申请号62/375,776、2016年12月12日提交的美国临时专利申请号62/433,228和2017年3月7日提交的美国临时专利申请号62/468,300的优先权；每个专利申请的全部内容在此引入作为参考。

递送生物活性剂(包括治疗相关化合物)至个体常受阻于活性剂到达靶细胞或组织的困难。具体而言，许多生物活性剂运输进入活细胞可受限于细胞的膜系统。

一类尤其难以递送至细胞的生物活性剂是生物制品，包括蛋白质、基于核酸的药物，及其衍生物。某些核酸和蛋白质在细胞或血浆中仅稳定有限的时期，且有时高度带电荷，这可以使跨细胞膜递送变复杂。可以稳定和递送这类活性剂进入细胞的组合物因此尤其有意义。可以用脂质载体、生物降解聚合物和多种缀合系统来改善这些生物活性剂向细胞的递送。

现在存在许多用于在体内编辑细胞中的基因的成分和组合物，提供了治疗遗传性、病毒性、细菌性、自身免疫性、癌症、衰老相关和炎性疾病的巨大潜能。这些编辑技术中的若干种利用用于修复由诸如大范围核酸酶、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR)相关(“Cas”)核酸酶、锌指核酸酶(“ZFN”)和转录激活因子样效应核酸酶(“TALEN”)的酶产生的双链断裂(“DSB”)的细胞机制。在细胞中产生DSB时，细胞可通过若干过程之一修复断裂。一个这种过程涉及DNA切割末端的非同源末端连接(“NHEJ”)。在NHEJ过程中，细胞可加入或取出核苷酸，导致序列从所切割的序列改变。在其他情况下，细胞通过同源性指导修复(“HDR”)或同源重组(“HR”)机制修复DSB，其中用例如与DSB的各端具有同源性的内源或外源模板来指导断裂的修复。这些编辑技术中的若干种利用用于修复单链断裂或双链断裂(“DSB”)的细胞机制。

CRISPR/Cas基因编辑系统在细胞中作为核糖核蛋白复合物具有活性。需要用于将CRISPR/Cas的蛋白质和核酸成分递送至细胞(如患者中的细胞)的组合物。

我们在本文中提供用于递送CRISPR/Cas基因编辑成分的基于脂质纳米颗粒的组合物。

在一些实施方案中，我们在本文中提供产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒(LNP)接触：2类Cas核酸酶mRNA、向导RNA核酸、CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质(stealth lipid)。还提供包含2类Cas核酸酶mRNA、向导RNA核酸、CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质的脂质纳米颗粒(LNP)。

其他实施方案提供基因编辑方法，其包括将2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸递送至肝细胞，其中将2类Cas mRNA和向导RNA核酸配制为至少一种LNP组合物包含以下：CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。进一步的实施方案提供了向肝细胞施用CRISPR-Cas复合物的方法，其包括使细胞与LNP接触，该LNP包含：2类Cas核酸酶mRNA；向导RNA核酸；CCD脂质；辅助脂质；中性脂质和隐形脂质。

在某些实施方案中，提供改变肝细胞中基因表达的方法，其包括对个体施用治疗有效量的作为一种或多种LNP制剂的2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸，其中至少一种LNP制剂包含：向导RNA核酸或2类Cas核酸酶mRNA、CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。

在一些实施方案中，产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒(LNP)接触：2类Cas核酸酶mRNA、单向导RNA(sgRNA)的向导RNA核酸,或编码单向导RNA(sgRNA)的向导RNA核酸、CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。

在某些方面，将2类Cas核酸酶mRNA配制在第一LNP组合物中，将向导RNA核酸配制在第二LNP组合物中。在其他方面，将2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸一起配制在LNP组合物中。

附图简述

图1显示按每孔100ng和500ng eGFP mRNA的量递送多种LNP制剂至小鼠肝细胞(Hepa1.6)后GFP的表达。

图2显示按不同剂量施用多种LNP制剂后小鼠中的gLUC表达，产生剂量依赖性反应。

图3A显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向因子VII的编辑效率。

图3B显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率。

图4A显示按照多种给药方案递送多种LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率，其中gRNA和Cas9 mRNA分开配制。

图4B显示递送LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率，其中gRNA和Cas9 mRNA分开配制。

图5显示施用多种LNP制剂后细胞中靶向因子VII或TTR的编辑效率，其中gRNA和Cas9 mRNA分开配制。

图6显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向因子VII或TTR的编辑效率，其中gRNA和Cas9 mRNA分开配制。

图7显示施用多种LNP制剂后细胞中的编辑效率，其中gRNA和Cas9mRNA配制在一起，并按多种浓度递送。

图8A显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率。

图8B显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向因子VII的编辑效率。

图9显示从施用多种LNP制剂的动物收集的切除位点DNA的PCR扩增。

图10显示施用多种LNP制剂的小鼠的血清TTR水平，其中gRNA和Cas9 mRNA配制在一起。

图11显示动物施用多种LNP制剂后小鼠中的相对因子VII活性，其中gRNA和Cas9mRNA配制在一起。

图12A显示按多种剂量施用LNP-169后小鼠中靶向TTR的编辑效率，产生剂量依赖性反应。

图12B显示按多种剂量施用LNP-169后不同天小鼠中的血清TTR水平，产生剂量依赖性反应。

图13A显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率，其中改变Cas9 mRNA与sgRNA的比值。

图13B显示施用多种LNP制剂后两个不同天小鼠中的血清TTR水平，其中改变Cas9mRNA与sgRNA的比值。

图14A显示按一个或两个剂量施用LNP-169后小鼠中靶向TTR的编辑效率。

图14B显示按一个或两个剂量施用LNP-169后9天小鼠中的血清TTR水平。

图15显示施用多种LNP制剂后小鼠脾中靶向TTR的编辑效率。

图16显示施用多种LNP制剂后小鼠中靶向TTR的编辑效率。

图17显示在小鼠血清存在下按多种浓度递送LNP-169至细胞后原代小鼠肝细胞中靶向TTR的编辑效率。

图18显示ApoE对LNP的结合随着所存在的ApoE的量增加而增加。

图19显示多种LNP制剂的编辑效率，其中向导RNA作为DNA表达盒递送。

图20显示编辑效率在原代肝细胞培养物和小鼠体内肝细胞之间相关。

图21显示Neuro 2A体外细胞系和原代小鼠肝细胞中不同的编辑修复谱。

图22显示原代小鼠肝细胞和体内小鼠肝细胞中相似的编辑修复谱。

图23作为时间的函数显示Cas9 mRNA和向导RNA的血浆浓度。

图24作为时间的函数显示肝组织中Cas9 mRNA和向导RNA的浓度。

图25作为时间的函数显示脾组织中Cas9 mRNA和向导RNA的浓度。

图26A作为时间的函数显示血浆中和组织中Cas9 mRNA和向导RNA的相对浓度。

图26B作为时间的函数显示血浆中和组织中脂质A的浓度。

图27作为时间的函数显示施用LNP后血浆细胞因子水平的变化。

图28显示施用LNP后小鼠血清TTR水平随时间的变化。

图29A显示施用LNP后小鼠中TTR编辑随时间的变化。

图29B显示施用LNP后小鼠中TTR编辑和血清TTR水平随时间的变化。

图30显示施用含不同mRNA制备物的LNP后的小鼠血清细胞因子水平。

图31显示施用含不同mRNA制备物的LNP后的小鼠血清TTR浓度水平。

图32显示施用含不同mRNA制备物的LNP后小鼠中TTR编辑水平随时间的变化。

图33显示施用保存在-80℃或4℃的LNP后的小鼠血清TTR浓度水平。

图34显示施用保存在-80℃或4℃的LNP后的小鼠TTR编辑水平。

图35显示施用多种制剂后的小鼠血清浓度水平。

图36显示施用多种制剂后的小鼠肝TTR编辑水平。

发明详述

本公开提供用于递送至细胞的CRISPR/Cas成分(“负荷(cargo)”)的脂质纳米颗粒(LNP)组合物的实施方案及其使用方法。LNP可以包含(i)CCD脂质、(ii)中性脂质、(iii)辅助脂质和(iv)隐形脂质。在某些实施方案中，该负荷包括编码Cas核酸酶如Cas9的mRNA和向导RNA或编码向导RNA的核酸。

CRISPR/Cas负荷

通过LNP制剂递送的CRISPR/Cas负荷包括允许在细胞中表达Cas核酸酶的编码Cas核酸酶的mRNA分子。该负荷进一步包含一种或多种向导RNA或编码向导RNA的核酸。该负荷可进一步包含用于修复或重组的模板核酸。

Cas核酸酶

所公开的制剂的一种成分是编码Cas核酸酶的mRNA，也称为Cas核酸酶mRNA。可以修饰该mRNA来改善稳定性和/或免疫原性特性。该修饰可以对mRNA内的一个或多个核苷进行。对mRNA核碱基(nucleobase)进行的化学修饰的实例包括假尿苷、1-甲基-假尿苷和5-甲基-胞苷。考虑改善稳定性、表达和免疫原性的其他已知的修饰。可针对在具体细胞类型(如真核细胞、哺乳动物细胞或更具体而言人细胞)中的表达对编码Cas核酸酶的mRNA进行密码子优化。在一些实施方案中，该mRNA编码人密码子优化的Cas9核酸酶或人密码子优化的Cpf核酸酶作为Cas核酸酶。在一些实施方案中，该mRNA是纯化的。在一些实施方案中，用沉淀方法(例如LiCl沉淀、醇沉淀或等同方法，例如，如本文中所述)纯化该mRNA。在一些实施方案中，用基于层析的方法纯化该mRNA，如基于HPLC的方法或等同方法(例如，如本文中所述)。在一些实施方案中，用沉淀方法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法二者纯化该mRNA。

除Cas核酸酶编码序列外，该mRNA可包含3’或5’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，该3’或5’UTR可源自人基因序列。示例性3’和5’UTR包括α-和β-珠蛋白、白蛋白、HSD17B4和真核延伸因子1α。此外，还可以使用病毒来源的5’和3’UTR，包括正痘病毒和巨细胞病毒UTR序列。在某些实施方案中，该mRNA包括5’帽，如m7G(5')ppp(5')N。此外，此帽可以是其中核苷酸N不包含2'OMe的帽-0、或其中核苷酸N包含2'OMe的帽-1、或其中核苷酸N和N+1包含2'OMe的帽-2。此帽还可以具有通过抗反向帽类似物(ARCA)掺入的结构m₂ ^7,3'-OG(5')N，且还可以包括相似的帽-0、帽-1和帽-2等结构。在一些实施方案中，该5’帽可以调节核输出、防止外切核酸酶降解、促进翻译和促进5’近端内含子切除。帽的稳定化元件包括硫代磷酸酯键、boranophosphate修饰和亚甲基桥。此外，帽还可以包含作为真核翻译起始因子4E(eIF4E)的结合元件发挥作用的非核酸实体。在某些实施方案中，该mRNA包含poly(A)尾。此尾长度可以是约40至约300个核苷酸。在一些实施方案中，该尾长度可以是约40至约100个核苷酸。在一些实施方案中，此尾长度可以是约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，此尾长度可以是约100至约300个核苷酸。在一些实施方案中，此尾长度可以是约50至约200个核苷酸。在一些实施方案中，此尾长度可以是约50至约250个核苷酸。在一些实施方案中，此尾长度可以是约100、150或200个核苷酸。poly(A)尾可以包含防止外切核酸酶降解的修饰，包括硫代磷酸酯(phosphorotioate)键和核碱基修饰。此外，poly(A)尾可以包含3’“帽”，其可包含修饰的或非天然的核碱基或其他合成部分。

本文所述mRNA可以包含至少一个能够改变RNA的胞内半衰期的元件。在一些实施方案中，RNA的半衰期可以增加。在一些实施方案中，RNA的半衰期可以减少。在一些实施方案中，该元件可以能够提高RNA的稳定性。在一些实施方案中，该元件可以能够降低RNA的稳定性。在一些实施方案中，该元件可以促进RNA衰变。在一些实施方案中，该元件可以激活翻译。在一些实施方案中，该元件可以在RNA的3’UTR内。例如，该元件可以是mRNA衰变信号。在一些实施方案中，该元件可以包含聚腺苷酸化信号(PA)。在一些实施方案中，PA可以在RNA的3’UTR内。在一些实施方案中，该RNA可以不包含PA，使得它在转录后在细胞中更快降解。在一些实施方案中，该元件可以包含至少一个富含AU的元件(ARE)。在一些实施方案中，该元件不包含ARE。ARE结合蛋白(ARE-BP)可以以依赖于组织类型、细胞类型、时间、细胞定位和环境的方式结合ARE。在一些实施方案中，ARE可以包含长度50至100个核苷酸。在一些实施方案中，ARE可以包含至少一个拷贝的序列AUUUA。在一些实施方案中，可将至少一个ARE加至RNA的3'UTR。在一些实施方案中，该元件可以是土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后调节元件(WPRE)，其产生三级结构来增强来自转录物的表达。在一些实施方案中，可将WPRE加至RNA的3'UTR。在一些实施方案中，该元件可以选自存在于快速或缓慢衰变的转录物中的其他RNA序列基序。在一个实施方案中，各元件可以单独使用。在一些实施方案中，元件可以与一个或多个元件组合使用。

在一些实施方案中，由所递送的mRNA编码的核酸酶可以包含来自CRISPR/Cas系统的Cas蛋白质。Cas蛋白质可以包含至少一个与向导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。此外，Cas蛋白质可由向导RNA指导至靶序列。向导RNA与Cas蛋白质以及靶序列相互作用，使得它指导与靶序列的结合。在一些实施方案中，向导RNA为靶向切割提供特异性，Cas蛋白质可以是通用的，与不同向导RNA配对来切割不同的靶序列。在某些实施方案中，Cas蛋白质可以切割单链或双链DNA。在某些实施方案中，Cas蛋白质可以切割RNA。在某些实施方案中，Cas蛋白质可使RNA产生切口。在一些实施方案中，Cas蛋白质包含至少一个DNA结合结构域和至少一个核酸酶结构域。在一些实施方案中，核酸酶结构域对DNA结合结构域而言可以是异源的。在某些实施方案中，可以修饰Cas蛋白质来降低或消除核酸酶活性。Cas蛋白质可用于结合和调节DNA的表达或活性。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统可以包含1类或2类系统成分，包括核糖核酸蛋白质复合物。参见例如Makarova等,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等,Molecular Cell,60:385-397(2015)。2类CRISPR/Cas系统具有单蛋白质效应物。II、V和VI型Cas蛋白质可以是单蛋白质、RNA向导核酸酶，本文中称为“2类Cas核酸酶”。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白质。Cpf1蛋白质(Zetsche等,Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源，包含RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以其整体引入作为参考。参见例如Zetsche,表S1和S3。

在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自II型CRISPR/Cas系统(即来自CRISPR/Cas9系统的Cas9蛋白质)或V型CRISPR/Cas系统(例如Cpf1蛋白质)。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自2类CRISPR/Cas系统，即单蛋白质Cas核酸酶如Cas9蛋白质或Cpf1蛋白质。2类Cas核酸酶家族蛋白质是具有DNA内切核酸酶活性的酶，可通过设计本文中进一步描述的适当的向导RNA来指导它们切割所希望的核酸靶标。

2类CRISPR/Cas系统成分可以来自IIA型、IIB型、IIC型、V型或VI型系统。涵盖Cas9及其直向同源物。Cas9蛋白质或其他成分可以来自的非限制性示例性物种包括：酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、戈氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手巴斯德氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogenes)、Sutterellawadsworthensis、Gamma proteobacterium、脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomycespristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假真菌样芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、Bacillusselenitireducens、Exiguobacterium sibiricum、德氏杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克氏菌目细菌(Burkholderiales bacterium)、Polaromonas naphthalenivorans、极地单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、Crocosphaera watsonii、蓝丝菌属物种(Cyanothecesp.)、铜绿微囊蓝细菌(Microcystis aeruginosa)、聚球蓝细菌属物种(Synechococcussp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、Ammonifex degensii、Caldicelulosiruptor becscii、Candidatus Desulforudis、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、Finegoldia magna、Natranaerobius thermophilus、Pelotomaculum thermopropionium、Acidithiobacilluscaldus、Acidithiobacillus ferrooxidans、Allochromatium vinosum、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、Nitrosococcuswatsoni、Pseudoalteromonas haloplanktis、Ktedonobacter racemifer、Methanohalobium evestigatum、多变鱼腥蓝细菌(Anabaena variabilis)、产泡沫节球蓝细菌(Nodularia spumigena)、念珠蓝细菌属物种(Nostoc sp.)、最大节螺菌(Arthrospiramaxima)、盘状节螺蓝细菌(Arthrospira platensis)、节螺蓝细菌属物种(Arthrospirasp.)、鞘丝蓝细菌属物种(Lyngbya sp.)、土质体微鞘蓝细菌(Microcoleuschthonoplastes)、颤蓝细菌属物种(Oscillatoria sp.)、Petrotoga mobilis、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、Streptococcus pasteurianus、灰烬奈氏球菌(Neisseriacinereal)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、Parvibaculum lavamentivorans、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheria)或Acaryochloris marina。在一些实施方案中，该Cas9蛋白质可以来自酿脓链球菌。在一些实施方案中，该Cas9蛋白质可以来自嗜热链球菌。在一些实施方案中，该Cas9蛋白质可以来自金黄色葡萄球菌。在其他实施方案中，Cpf1蛋白质可以来自土拉热巴斯德氏菌(Francisella tularensis)、Lachnospiraceaebacterium、Butyrivibrio proteoclasticus、Peregrinibacteria bacterium、Parcubacteria bacterium、Smithella、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)、CandidatusMethanoplasma termitum、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、Moraxella bovoculi、稻田氏钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔红棕色单胞菌(Porphyromonascrevioricanis)、解糖胨拟杆菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacacae)。在某些实施方案中，该Cpf1蛋白质可以来自氨基酸球菌属或毛螺菌科(Lachnospiraceae)。

在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可以包含至少一个RuvC样核酸酶结构域，如Cas9或Cpf1蛋白质。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可以包含超过一个核酸酶结构域。例如，2类Cas核酸酶可以包含至少一个RuvC样核酸酶结构域和至少一个HNH样核酸酶结构域。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可以能够在靶序列中引入DSB。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可修饰为仅包含一个功能性核酸酶结构域。例如，可以这样修饰2类Cas核酸酶，使得核酸酶结构域之一突变或完全或部分缺失，以降低其核酸切割活性。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可以修饰为不包含功能性RuvC样核酸酶结构域。在其他实施方案中，2类Cas核酸酶(例如Cas9蛋白质)可以修饰为不包含功能性HNH样核酸酶结构域。在仅一个核酸酶结构域具有功能的一些实施方案中，2类Cas核酸酶可以是能够在靶序列中引入单链断裂(“切口”)的切口酶。在一些实施方案中，取代2类Cas核酸酶的核酸酶结构域内的保守氨基酸，以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，该核酸酶结构域突变可以失活DNA切割活性。在一些实施方案中，该核酸酶结构域突变可以失活2类Cas核酸酶的一个核酸酶结构域，产生切口酶。在一些实施方案中，该切口酶可以在RuvC样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质，参见例如UniProtKB-Q99ZW2(CAS9_STRP1))。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手巴斯德氏菌U112Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。在一些实施方案中，该切口酶可以在HNH样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。示例性突变改变核酸酶结构域中的保守催化残基，并改变结构域的核溶解活性。在一些实施方案中，本文所述核酸酶系统可以包含切口酶及一对分别与靶序列的有义和反义链互补的向导RNA。向导RNA可以指导切口酶至靶标，并通过在靶序列的相反链上产生切口(即双切口)来引入DSB。还可以使用嵌合2类Cas核酸酶，其中将蛋白质的一个结构域或区域替换为不同蛋白质的部分。例如，可以用来自不同核酸酶如Fok1的结构域替换核酸酶结构域。在某些实施方案中，可以修饰2类Cas核酸酶以降低或消除核酸酶活性。它可以用于结合和调节DNA序列的表达或活性。

在备选实施方案中，Cas蛋白质可以是I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的成分。例如，Cas蛋白质可以是Cas3蛋白质。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自II型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自IV型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自V型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以来自VI型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可以具有RNA切割活性。

在一些实施方案中，核酸酶可以与至少一个异源蛋白质结构域融合。至少一个蛋白质结构域可以定位在N端、C端或核酸酶的内部位置。在一些实施方案中，两个或多个异源蛋白质结构域处于核酸酶上的一个或多个位置。

在一些实施方案中，该蛋白质结构域可便于核酸酶转运入细胞的细胞核。例如，该蛋白质结构域可以是核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，核酸酶可以与1-10个NLS融合。在一些实施方案中，核酸酶可以与1-5个NLS融合。在一些实施方案中，核酸酶可以与一个NLS融合。在使用一个NLS时，NLS可以在核酸酶的N端或C端。在其他实施方案中，核酸酶可以与超过一个NLS融合。在一些实施方案中，核酸酶可以与2、3、4或5个NLS融合。在一些实施方案中，核酸酶可以与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可以是相同的(例如SV40NLS)或不同的。在一些实施方案中，核酸酶在羧基端与两个SV40NLS序列融合。在一些实施方案中，核酸酶可以与两个NLS融合，一个在N端，一个在C端。在一些实施方案中，核酸酶可以与3个NLS融合。在一些实施方案中，核酸酶可以不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可以是单份序列，例如SV40NLS PKKKRKV或PKKKRRV。在一些实施方案中，NLS可以是双份序列，如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK。在具体实施方案中，单PKKKRKV NLS可以在核酸酶的C端。

在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以能够改变核酸酶的胞内半衰期。在一些实施方案中，核酸酶的半衰期可以增加。在一些实施方案中，核酸酶的半衰期可以减少。在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以能够提高核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以能够降低核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以作为蛋白质降解的信号肽发挥作用。在一些实施方案中，该蛋白质降解可以由蛋白水解酶(例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶)介导。在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以包含PEST序列。在一些实施方案中，该核酸酶可通过加入泛蛋白或多聚泛蛋白链来修饰。在一些实施方案中，该泛蛋白可以是泛蛋白样蛋白质(UBL)。泛蛋白样蛋白质的非限制性实例包括小泛蛋白样修饰因子(SUMO)、泛蛋白交叉反应性蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛蛋白相关修饰因子-1(URM1)、神经元前体细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中也称为Rub1)、人白细胞抗原F相关(FAT10)、自体吞噬-8(ATG8)和-12(ATG12)、Fau泛蛋白样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛蛋白折叠修饰因子-1(UFM1)和泛蛋白样蛋白-5(UBL5)。

在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以是标记结构域。标记结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标记、表位标记和报道基因序列。在一些实施方案中，该标记结构域是荧光蛋白。适宜的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-单体、HcRed-串联、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、单体Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任意其他适宜的荧光蛋白。在其他实施方案中，该标记结构域可以是纯化标记和/或表位标记。非限制性示例性标记包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、多聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标记、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、多聚His和钙调蛋白。非限制性示例性报道基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、荧光素酶或荧光蛋白。

在其他实施方案中，该蛋白质结构域可以使核酸酶靶向特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施方案中，该蛋白质结构域可以使核酸酶靶向线粒体。

在其他实施方案中，该蛋白质结构域可以是效应子结构域。在指导核酸酶至其靶序列时，例如在通过向导RNA指导Cas9蛋白质至靶序列时，效应子结构域可以修饰或影响靶序列。在一些实施方案中，该效应子结构域可以选自核酸结合结构域、核酸酶结构域、表观遗传修饰结构域、转录激活结构域、甲基化结构域或转录阻遏结构域。在某些实施方案中，该DNA修饰结构域是甲基化结构域，如去甲基化或甲基转移酶结构域。在某些实施方案中，该效应子结构域是DNA修饰结构域，如碱基编辑结构域。在具体实施方案中，该DNA修饰结构域是将具体修饰引入DNA中的核酸编辑结构域，如脱氨酶结构域。参见WO 2015/089406、US2016/0304846。WO 2015/089406和US 2016/0304846中所述的核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体在此引入作为参考。

向导RNA

在本公开的一些实施方案中，LNP制剂的负荷包含至少一种向导RNA。该向导RNA可以指导2类Cas核酸酶至靶核酸分子上的靶序列，其中向导RNA与靶序列杂交，Cas核酸酶切割或调节靶序列。在一些实施方案中，向导RNA与2类核酸酶结合并提供2类核酸酶切割的特异性。在一些实施方案中，向导RNA和Cas蛋白质可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物。在一些实施方案中，CRISPR复合物可以是II型CRISPR/Cas复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可以是V型CRISPR/Cas复合物，如Cpf1/向导RNA复合物。在一些实施方案中，Cas核酸酶可以是单蛋白质Cas核酸酶，例如Cas9蛋白质或Cpf1蛋白质。在一些实施方案中，向导RNA靶向Cas9蛋白质的切割。

用于CRISPR/Cas9核酸酶系统的向导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)和tracr RNA(tracr)。在一些实施方案中，crRNA可以包含与靶核酸分子上的靶序列互补和杂交的靶向序列。crRNA还可以包含与tracrRNA的部分互补和杂交的旗杆。在一些实施方案中，crRNA可以与从细菌CRISPR基因座转录的天然存在的crRNA的结构平行，其中靶向序列作为CRISPR/Cas9系统的间隔区，旗杆对应于CRISPR基因座上间隔区侧翼的一部分重复序列。

向导RNA可以通过crRNA的靶向序列靶向任何目的序列。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列之间的互补程度可以是约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以100％互补。在其他实施方案中，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以包含至少一个错配。例如，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以包含1-6个错配。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列和靶核酸分子上的靶序列可以包含5或6个错配。

靶向序列的长度可取决于所使用的CRISPR/Cas系统和成分。例如，来自不同细菌物种的不同Cas蛋白质具有不同的最优靶向序列长度。此外，靶向序列可以包含长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或超过50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列可以包含长度18-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列可以包含长度19-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列可以包含长度20个核苷酸。

旗杆可以包含与tracr RNA的互补性足以促进功能性CRISPR/Cas复合物的形成的任何序列。在一些实施方案中，旗杆可以包含与同一CRISPR/Cas系统中的tracr RNA互补的天然存在的crRNA的全部或部分序列(也称为“标记”或“把手”)。在一些实施方案中，旗杆可以包含来自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分重复序列。在一些实施方案中，旗杆可以包含截短或修饰的标记或把手序列。在一些实施方案中，tracr RNA和与tracr RNA杂交的旗杆部分之间沿两个序列中较短者的互补程度可以是约40％、50％、60％、70％、80％或更高，但低于100％。在一些实施方案中，tracr RNA和与tracr RNA杂交的旗杆部分之间沿两个序列中较短者的并非100％互补，因为tracr和旗杆间的tracr和/或摆动碱基配对上存在一个或多个凸起结构。旗杆的长度可取决于所使用的CRISPR/Cas系统或tracr RNA。例如，旗杆可以包含长度10-50个核苷酸或超过50个核苷酸。在一些实施方案中，旗杆可以包含长度15-40个核苷酸。在其他实施方案中，旗杆可以包含长度20-30个核苷酸。还在其他实施方案中，旗杆可以包含长度22个核苷酸。在使用双向导RNA时，例如，旗杆的长度可以没有上限。

在一些实施方案中，tracr RNA可以包含来自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分野生型tracr RNA序列。在一些实施方案中，tracr RNA可以包含野生型tracr RNA的截短或修饰变体。tracr RNA的长度可取决于所使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，tracr RNA可以包含长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超过100个核苷酸。在某些实施方案中，tracr长度为至少26个核苷酸。在其他实施方案中，tracr长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，tracr RNA可以包含二级结构，例如一个或多个发夹或茎-环结构、或一个或多个凸起结构。

在一些实施方案中，向导RNA可以包含两个RNA分子，在本文中称为“双向导RNA”或“dgRNA”。在一些实施方案中，dgRNA可以包含含有crRNA的第一RNA分子和含有tracr RNA的第二RNA分子。该第一和第二RNA分子可通过crRNA和tracr RNA上的旗杆之间的碱基配对形成RNA双链体。

在其他实施方案中，向导RNA可以包含单个RNA分子，在本文中称为“单向导RNA”或“sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA可以包含与tracr RNA共价连接的crRNA。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可以通过接头共价连接。在一些实施方案中，单分子向导RNA可以通过crRNA和tracr RNA上的旗杆间的碱基配对包含茎-环结构。在一些实施方案中，sgRNA是能够介导通过Cas9蛋白质进行的RNA指导的DNA切割的“Cas9sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA是能够介导通过Cpf1蛋白质进行的RNA指导的DNA切割的“Cpf1sgRNA”。在某些实施方案中，向导RNA包含足以与Cas9蛋白质形成活性复合物并介导RNA指导的DNA切割的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，向导RNA包含足以与Cpf1蛋白质形成活性复合物并介导RNA指导的DNA切割的crRNA。参见Zetsche 2015。

本发明的某些实施方案还提供编码本文所述向导RNA的核酸，例如表达盒。本文中用“向导RNA核酸”来指向导RNA(例如sgRNA或dgRNA)和向导RNA表达盒，向导RNA表达盒是编码一个或多个向导RNA的核酸。

在一些实施方案中，该核酸可以是DNA分子。在一些实施方案中，该核酸可以包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含侧翼为来自天然存在的CRISPR/Cas系统的全部或部分重复序列的靶向序列。在一些实施方案中，该核酸可以包含编码tracr RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可以由两个分开的核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可以由单个核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可以由单个核酸的相反链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可以由单个核酸的同一条链编码。在一些实施方案中，该表达盒编码sgRNA。在一些实施方案中，该表达盒编码Cas9核酸酶sgRNA。在一些实施方案中，该表达盒编码Cpf1核酸酶sgRNA。

编码向导RNA的核苷酸序列可以与至少一个转录或调控序列(如启动子、3’UTR或5’UTR)有效连接。在一个实例中，该启动子可以是tRNA启动子(例如tRNA^Lys3)或tRNA嵌合体。参见Mefferd等,RNA.201521:1683-9；Scherer等,Nucleic Acids Res.2007 35:2620-2628。在某些实施方案中，该启动子可以由RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例还包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码向导RNA的核苷酸序列可以与小鼠或人U6启动子有效连接。在一些实施方案中，该表达盒是修饰核酸。在某些实施方案中，该表达盒包含修饰核苷或核苷酸。在一些实施方案中，该表达盒包含5’端修饰，例如修饰核苷或核苷酸，以稳定表达盒和防止表达盒整合。在一些实施方案中，该表达盒包含在每条链的5’端具有修饰的双链DNA。在某些实施方案中，该表达盒包含反向双脱氧T或反向脱碱基核苷或核苷酸作为5’端修饰。在一些实施方案中，该表达盒包含标记，如生物素、脱硫生物素-TEG、洋地黄毒苷和荧光标记，包括例如FAM、ROX、TAMRA和AlexaFluor。

在某些实施方案中，可以将超过一个向导RNA用于CRISPR/Cas核酸酶系统。每个向导RNA可以包含不同的靶向序列，使得CRISPR/Cas系统切割超过一个靶序列。在一些实施方案中，一个或多个向导RNA可以具有相同或不同的特性，如活性或在CRISPR/Cas复合物中的稳定性。在使用超过一个向导RNA时，每个向导RNA可以在相同或不同的表达盒上编码。用于驱动该超过一个向导RNA表达的启动子可以是相同的或不同的。

化学修饰的RNA

向导RNA或mRNA中可以存在修饰核苷或核苷酸。将含有一个或多个修饰核苷或核苷酸的向导RNA或Cas核酸酶编码mRNA称为“修饰”RNA，以描述替换或附加至规范A、G、C和U残基使用的一个或多个非天然和/或天然存在的成分或配置的存在。在一些实施方案中，用非规范核苷或核苷酸(本文中称为“修饰的”)合成修饰RNA。修饰核苷和核苷酸可以包含以下一种或多种：i)改变(例如替换)一个或两个非连接磷酸氧和/或主链磷酸二酯键中的一个或多个连接磷酸氧(示例性主链修饰)；(ii)改变(例如替换)核糖的组分，例如核糖上的2’羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头广泛取代磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)修饰或替换天然存在的核碱基，包括用非规范核碱基替换(示例性碱基修饰)；(v)替换或修饰磷酸核糖主链(示例性主链修饰)；(vi)修饰寡核苷酸的3’端或5’端，例如去除、修饰或替换末端磷酸基团或缀合部分、帽或接头(如3’或5’帽修饰可以包含糖和/或主链修饰)；和(vii)修饰或替换糖(示例性糖修饰)。

可以组合上文所列修饰，以提供包含可以具有两个、三个、四个或多个修饰的核苷和核苷酸(统称“残基”)的修饰RNA。例如，修饰残基可以具有修饰糖和修饰核碱基。在一些实施方案中，修饰gRNA的每个碱基，例如，所有碱基都具有修饰磷酸基团，如硫代磷酸基团。在某些实施方案中，用硫代磷酸基团替换sgRNA分子的全部或基本全部磷酸基团。在一些实施方案中，修饰RNA在RNA的5’端或在RNA的5’端附近包含至少一个修饰残基。在一些实施方案中，修饰RNA在RNA的3’端或在RNA的3’端附近包含至少一个修饰残基。

在某些实施方案中，可将修饰残基掺入向导RNA。在某些实施方案中，可将修饰残基掺入mRNA。在一些实施方案中，向导RNA包含一个、两个、三个或多个修饰残基。在一些实施方案中，向导RNA在向导RNA的5’和3’端的每一端包含一个、两个、三个或多个修饰残基。在一些实施方案中，mRNA包含5、10、15、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多个修饰残基。在一些实施方案中，修饰向导RNA或mRNA中至少5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或约100％)的位置是修饰核苷或核苷酸。

非修饰核酸可倾向于由例如细胞核酸酶降解。例如，核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。因此，一方面，本文所述向导RNA可以包含一个或多个修饰核苷或和核苷酸，例如以引入对核酸酶的稳定性。在某些实施方案中，本文所述mRNA可以包含一个或多个修饰核苷或核苷酸，例如以引入对核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，在引入体内和离体细胞群体时，本文所述修饰RNA分子可以显示减少的先天免疫反应。术语“先天免疫反应”包括对外源核酸(包括单链核酸)的细胞反应，其涉及细胞因子表达和释放(尤其是干扰素)及细胞死亡的诱导。

在主链修饰的一些实施方案中，可以通过用不同取代基替换一个或多个氧来修饰修饰残基的磷酸基团。此外，修饰残基(例如存在于修饰核酸中的修饰残基)可以包括用本文所述修饰磷酸基团广泛替换非修饰磷酸部分。在一些实施方案中，磷酸主链的主链修饰可以包括产生不带电荷接头或具有不对称电荷分布的带电荷接头的改变。

修饰磷酸基团的实例包括硫代磷酸、硒代磷酸、borano磷酸、borano磷酸酯、氢膦酸酯、磷酰胺、烷基或芳基磷酸和磷酸三酯。非修饰磷酸基团中的磷原子是非手性的。但是，用以上原子或原子团之一替换非桥连氧之一可以使磷原子成为手性的。产生立体构型的磷原子可具有“R”构型(本文中称为Rp)或“S”构型(本文中称为Sp)。还可以通过用氮(桥连磷酰胺)、硫(桥连硫代磷酸)和碳(桥连亚甲磷酸)替换桥连氧(即使磷酸与核苷连接的氧)来修饰主链。替换可以发生在任一连接氧处或两个连接氧处。

在某些主链修饰中，可以用含有非磷的连接子替换磷酸基团。在一些实施方案中，可以用中性部分替换带电荷的磷酸基团。可以替换磷酸基团的部分的实例可以非限制性地包括例如甲基磷酸、羟氨基、硅氧烷、碳酸、羧甲基、氨基甲酸、酰胺、硫醚、氧化乙烯接头、磺酸、磺酰胺、thioformacetal、formacetal、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧甲基亚氨基。

也可以构建可以模拟核酸的支架，其中用核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物替换磷酸接头和核糖。这类修饰可以包括主链和糖修饰。在一些实施方案中，该核碱基可束缚于替代主链。实例可非限制性地包括吗啉基、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。

修饰核苷和修饰核苷酸可以包含一个或多个对糖基团的修饰，即在糖修饰处。例如，可以修饰2’羟基(OH)，例如用许多不同的“氧”或“脱氧”取代基替换。在一些实施方案中，对2’羟基的修饰可以增强核酸的稳定性，因为羟基可以不再去质子化形成2’-醇盐离子。

2’羟基修饰的实例可以包括：烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)O(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂OR，其中R可以是例如H或可选地取代的烷基，n可以是从2至20(例如从0至4、从0至8、从0至10、从0至16、从1至4、从1至8、从1至10、从1至16、从1至20、从2至4、从2至8、从2至10、从2至16、从2至20、从4至8、从4至10、从4至16和从4至20)的整数。在一些实施方案中，2’羟基修饰可以是2'-O-Me。在一些实施方案中，2’羟基修饰可以是2’-氟修饰，其用氟替换2’羟基。在一些实施方案中，2’羟基修饰可以包括“锁定”核酸(LNA)，其中可以使2’羟基例如通过C_1-6亚烷基或C_1-6杂亚烷基桥与同一核糖的4’碳连接，其中示例性桥可以包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可以是例如NH₂、烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基、乙二胺或多聚氨基)和氨基烷氧基O(CH₂)_n-氨基(其中氨基可以是例如NH₂、烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基、乙二胺或多聚氨基)。在一些实施方案中，2’羟基修饰可以包括“非锁定”核酸(UNA)，其中核糖环缺乏C2'-C3'键。在一些实施方案中，2’羟基修饰可以包括甲氧基乙基(MOE)(OCH₂CH₂OCH₃，例如PEG衍生物)。

“脱氧”2’修饰可以包括：氢(即脱氧核糖，例如在部分dsRNA的突出部分)；卤素(例如溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可以是例如例如-NH₂、烷基氨基、二烷基氨基、杂环、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、或二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH₂CH₂NH)_nCH2CH₂-氨基(其中氨基可以是例如上文所述)、-NHC(O)R(其中R可以是例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫-烷基；硫代烷氧基；及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以可选地用例如本文所述氨基取代。

糖修饰可以包含糖基，其还可以包含一个或多个与核糖中相应碳的构型相比具有相反立体化学构型的碳。因此，修饰核酸可以包含含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。修饰核酸还可以包含脱碱基糖。这些脱碱基糖还可以进一步在一个或多个组成糖原子处修饰。修饰核酸还可以包含一个或多个处于L形式的糖，例如L-核苷。

可以掺入修饰核酸的本文所述修饰核苷和核苷酸可以包含修饰碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。可以修饰或完全取代这些核碱基，以提供可以掺入修饰核酸的修饰残基。核苷酸的核碱基可以独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可以包含例如天然存在和合成的碱基衍生物。

在利用双向导RNA的实施方案中，crRNA和tracr RNA中的每一个都可以包含修饰。这类修饰可以在crRNA和/或tracr RNA的一端或两端。在包含sgRNA的实施方案中，可以化学修饰sgRNA一端或两端的一个或多个残基，或这化学修饰整个sgRNA。某些实施方案包含5’端修饰。某些实施方案包含3’端修饰。在某些实施方案中，向导RNA分子的单链突出端的一个或多个或全部核苷酸是脱氧核苷酸。修饰mRNA可以包含5’端和/或3’端修饰。

模板核酸

本文公开的制剂可以包含模板核酸。模板可用于在Cas核酸酶的靶位点处或附近改变或插入核酸序列。

在一些实施方案中，模板可用于同源重组。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或部分模板序列整合入靶核酸分子。在一些实施方案中，可以提供单个模板。在其他实施方案中，可以提供两个或多个模板，使得可以在两个或多个靶位点发生同源重组。例如，可以提供不同模板来修复细胞中的单个基因或细胞中的两个不同基因。在一些实施方案中，为细胞提供至少一个模板的多个拷贝。在一些实施方案中，可以按独立的拷贝数或独立的量提供不同模板。

在其他实施方案中，模板可用于同源性指导修复，其涉及核酸中切割位点处的DNA链侵入。在一些实施方案中，同源性指导修复可以导致在所编辑的靶核酸分子中包含模板序列。在一些实施方案中，可以提供单个模板。在其他实施方案中，同源性指导修复可以在两个或多个位点使用具有不同序列的两个或多个模板。例如，可提供不同模板来修复细胞中的单个基因或细胞中的两个不同基因。在一些实施方案中，为细胞提供至少一个模板的多个拷贝。在一些实施方案中，可以按独立的拷贝数或独立的量提供不同模板。

还在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与切割位点附近的核酸序列无相似性。在一些实施方案中，掺入模板或部分模板序列。在一些实施方案中，可以提供单个模板。在其他实施方案中，非同源末端连接可以在两个或多个位点插入具有不同序列的两个或多个模板。例如，可提供不同模板来在细胞中插入单个模板或细在胞中插入两个不同模板。在一些实施方案中，可以按独立的拷贝数提供不同模板。在一些实施方案中，模板包含侧翼反向末端重复(ITR)序列。

在一些实施方案中，模板序列可对应于靶细胞的内源序列。本文所用的术语“内源序列”指细胞的天然序列。术语“外源序列”指对细胞而言并非天然的序列，或其在细胞基因组中的天然位置是在不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可以是细胞的质粒序列。在一些实施方案中，模板序列可以与细胞中切割位点处或附近的部分内源序列基本相同，但包含至少一个核苷酸改变。在一些实施方案中，用模板修复所切割的靶核酸分子可以产生包括插入、缺失或取代靶核酸分子的一个或多个核苷酸的突变。在一些实施方案中，该突变可以在从包含靶序列的基因表达的蛋白质中产生一个或多个氨基酸改变。在一些实施方案中，该突变可以在从靶基因表达的RNA中产生一个或多个核苷酸改变。在一些实施方案中，该突变可以改变靶基因的表达水平。在一些实施方案中，该突变可以导致靶基因的表达提高或降低。在一些实施方案中，该突变可以导致基因敲减。在一些实施方案中，该突变可以导致基因敲除。在一些实施方案中，该突变可以导致基因功能恢复。在一些实施方案中，用模板修复所切割的靶核酸分子可以在外显子序列、内含子序列、调节序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或靶基因的非编码序列中产生改变。

在其他实施方案中，模板序列可以包含外源序列。在一些实施方案中，外源序列可以包含与外源启动子序列有效连接的蛋白质或RNA编码序列，使得在外源序列整合入靶核酸分子时，细胞能够表达由整合序列编码的蛋白质或RNA。在其他实施方案中，在外源序列整合入靶核酸分子时，整合序列的表达可以受内源启动子序列调节。在一些实施方案中，外源序列可以是染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，外源序列可以提供编码蛋白质或部分蛋白质的cDNA序列。还在其他实施方案中，外源序列可以包含外显子序列、内含子序列、调节序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列。在一些实施方案中，外源序列的整合可以导致基因功能恢复。在一些实施方案中，外源序列的整合可以导致基因敲入。在一些实施方案中，外源序列的整合可以导致基因敲除。

模板可以具有任何适宜的长度。在一些实施方案中，模板可以包含长度10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000或更多个核苷酸。模板可以是单链核酸。模板可以是双链或部分双链核酸。在某些实施方案中，单链模板长度为20、30、40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一些实施方案中，模板可以包含与靶核酸分子的含有靶序列的部分互补的核苷酸序列(即“同源臂”)。在一些实施方案中，模板可以包含与靶核酸分子上位于切割位点上游或下游的序列互补的同源臂。在一些实施方案中，模板可以包含分别与位于切割位点上游和下游的序列互补的第一同源臂和第二同源臂(也称为第一和第二核苷酸序列)。在模板包含两个同源臂时，每个臂可以是相同长度或不同长度，同源臂之间的序列可以与同源臂之间的靶序列基本相似或相同，或者它可以完全不相关。在一些实施方案中，模板上的第一核苷酸序列和切割位点上游序列之间以及模板上的第二核苷酸序列和切割位下游序列之间的互补程度可允许模板和靶核酸分子之间的同源重组，如高保真同源重组。在一些实施方案中，互补程度可以是约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补程度可以是约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补程度可以是至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补程度可以是100％。

在一些实施方案中，模板包含含有侧翼反向末端重复(ITR)序列的ssDNA或dsDNA。在一些实施方案中，模板作为质粒、小环、纳米环或PCR产物提供。

核酸纯化

在一些实施方案中，纯化核酸。在一些实施方案中，用沉淀方法(例如LiCl沉淀、醇沉淀或等同方法，例如，如本文中所述)纯化核酸。在一些实施方案中，用基于层析的方法纯化核酸，如基于HPLC的方法或等同方法(例如，如本文中所述)。在一些实施方案中，用沉淀方法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法二者纯化核酸。

靶序列

在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统可指导至并切割靶核酸分子上的靶序列。例如，Cas核酸酶可以识别和切割靶序列。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可由向导RNA指导至靶核酸分子的靶序列，其中向导RNA与靶序列杂交，Cas蛋白质切割靶序列。在一些实施方案中，向导RNA与包含其关联PAM的靶序列杂交，Cas蛋白质切割包含其关联PAM的靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以与向导RNA的靶向序列互补。在一些实施方案中，向导RNA的靶向序列和相应靶序列的与向导RNA杂交的部分之间的互补程度可以是约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，靶标的同源区与关联PAM序列相邻。在一些实施方案中，靶序列可以包含与向导RNA的靶向序列100％互补的序列。在其他实施方案中，与向导RNA的靶向序列相比，靶序列可以包含至少一个错配、缺失或插入。例如，靶序列和向导RNA的靶向序列可以可选地在与PAM相邻的靶序列部分中包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，靶序列和向导RNA的靶向序列可以包含1-9个错配。在一些实施方案中，靶序列和向导RNA的靶向序列可以包含3-9个错配。在一些实施方案中，靶序列和向导RNA的靶向序列可以包含5或6个错配。

靶序列的长度可取决于所使用的核酸酶系统。例如，用于CRISPR/Cas系统的向导RNA的靶向序列可以包含长度5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或超过50个核苷酸，可选地与PAM序列相邻的靶序列为相应长度。在一些实施方案中，靶序列可以包含长度15-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列可以包含长度17-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列可以包含长度20个核苷酸。在使用切口酶时，靶序列可以包含一对由切割DNA分子的相反链的一对切口酶识别的靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以包含一对由切割DNA分子同一条链的一对切口酶识别的靶序列。在一些实施方案中，靶序列可以包含由一种或多种Cas核酸酶识别的靶序列的部分。

靶核酸分子可以是细胞内源或外源的任何DNA或RNA分子。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是来自细胞或处于细胞中的附加型DNA、质粒、基因组DNA、病毒基因组、线粒体DNA或染色体。在一些实施方案中，靶核酸分子的靶序列可以是来自细胞或处于细胞中的基因组序列。在其他实施方案中，该细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是人细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是肝细胞。在某些实施方案中，该细胞可以是人肝细胞。在一些实施方案中，该肝细胞是肝细胞(hepatocyte)。在一些实施方案中，该肝细胞是人肝细胞。在一些实施方案中，该肝细胞是干细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝窦内皮细胞(LSEC)。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是Kupffer细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝星状细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肿瘤细胞。在其他实施方案中，该细胞包含ApoE结合受体。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝干细胞。参见例如Wang等Nature,2015；Font-Burgada等Cell,2015,162:766-799。

在其他实施方案中，靶序列可以是病毒序列。在其他实施方案中，靶序列可以是病原体序列。还在其他实施方案中，靶序列可以是合成序列。在其他实施方案中，靶序列可以是染色体序列。在某些实施方案中，靶序列可以包含易位接点，例如癌症相关易位。在一些实施方案中，靶序列可以在真核染色体如人染色体上。在某些实施方案中，靶序列是肝特异性序列，因为它在肝细胞中表达。

在一些实施方案中，靶序列可以定位在基因的编码序列、基因的内含子序列、调节序列、基因的转录控制序列、基因的翻译控制序列、剪接位点或基因间的非编码序列中。在一些实施方案中，基因可以是蛋白质编码基因。在其他实施方案中，基因可以是非编码RNA基因。在一些实施方案中，靶序列可以包含疾病相关基因的全部或部分。在某些情况下，基因在肝中表达。

在一些实施方案中，靶序列可以定位在基因组中控制染色质组织方面的非基因功能位点如支架位点或基因座控制区中。

在涉及Cas核酸酶如2类Cas核酸酶的实施方案中，靶序列可以与原间隔区邻近基序(“PAM”)相邻。在一些实施方案中，PAM可以与靶序列3’端相邻或在靶序列3’端的1、2、3或4个核苷酸之内。PAM的长度和序列可取决于所使用的Cas蛋白质。例如，PAM可以选自具体Cas9蛋白质或Cas9直向同源物的共有或具体PAM序列，包括Ran等,Nature,520:186-191(2015)的图1和Zetsche 2015的图S5中公开的那些，每篇文献的相关公开内容在此引入作为参考。在一些实施方案中，PAM长度可以是2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。非限制性示例性PAM序列包括NGG、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA、TTN和NNNNGATT(其中N定义为任意核苷酸，W定义为A或T)。在一些实施方案中，PAM序列可以是NGG。在一些实施方案中，PAM序列可以是NGGNG。在一些实施方案中，PAM序列可以是TTN。在一些实施方案中，PAM序列可以是NNAAAAW。

脂质制剂

本文公开用于CRISPR/Cas负荷的LNP制剂的多种实施方案。这类LNP制剂可以包含CCD脂质，连同辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。“脂质纳米颗粒”意指包含多个(例如超过一个)通过分子间力相互物理结合的脂质分子的颗粒。LNP可以是例如微球(包括单层和多层小脂泡，例如“脂质体”——层状相脂双层，在一些实施方案中，其基本为球形，在更具体的实施方案中，其可以包含水性核心，例如包含RNA分子的实质部分)、乳剂中的分散相、微团或悬剂中的内相。乳剂、微团和悬剂可以是用于局部和/或外部递送的适宜组合物。

本文提供的LNP组合物优先由肝细胞(例如肝细胞(hepatocyte))摄取。此外，LNP组合物可生物降解，因为它在治疗有效剂量下不在体内累积至细胞毒性水平。在一些实施方案中，LNP组合物在治疗剂量水平不引起在导致实质性副作用的先天免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的LNP组合物在治疗剂量水平不引起毒性。LNP组合物特异性结合血液中的载脂蛋白如载脂蛋白E(ApoE)。载脂蛋白是在血浆中循环的调节脂质转运的关键蛋白质。ApoE是一类载体蛋白，其在脂蛋白摄取期间在肝中与细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖相互作用。(参见例如Scherphof和Kamps,The role of hepatocytes in the clearance ofliposomes from the blood circulation.Prog Lipid Res.2001年5月；40(3):149-66)

CCD脂质

用于递送生物活性剂的脂质组合物可以调整为优先靶向肝细胞或器官。在某些实施方案中，脂质组合物优先靶向载脂蛋白E(ApoE)结合细胞，如表达ApoE受体的细胞。用于递送CRISPR/Cas mRNA和向导RNA成分至肝细胞的脂质组合物包含CCD脂质。

在一些实施方案中，该CCD脂质是脂质A，其是(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧)甲基)丙基十八碳-9,12-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯。脂质A可以描绘为：

脂质A可以按照WO2015/095340(例如84-86页)合成。

在一些实施方案中，该CCD脂质是脂质B，其是((5-((二甲氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧))双(辛烷-8,1-亚基)双(葵酸酯)，也称为((5-((二甲氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧))双(辛烷-8,1-亚基)双(葵酸酯)。脂质B可以描绘为：

脂质B可以按照WO2014/136086(例如107-09页)合成。

在一些实施方案中，该CCD脂质是脂质C，其是2-((4-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧)十六酰)氧)丙烷-1,3-亚基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)。脂质C可以描绘为：

在一些实施方案中，该CCD脂质是脂质D，其是3-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧)-13-(辛酰基氧)三葵基3-辛基十一酸酯。

脂质D可以描绘为：

脂质C和脂质D可以按照WO2015/095340合成。

CCD脂质也可以是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D的等同物。在某些实施方案中，CCD脂质是脂质A的等同物或脂质B的等同物。

适合用于本文所述LNP的CCD脂质在体内可生物降解。CCD脂质具有低毒性(例如，按大于或等于10mg/kg的量在动物模型中可耐受而无副作用)。在某些实施方案中，包含CCD脂质的LNP包括其中至少75％的CCD脂质在8、10、12、24或48小时、或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除的那些。在某些实施方案中，包含CCD脂质的LNP包括其中至少50％的mRNA或向导RNA在8、10、12、24或48小时、或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除的那些。在某些实施方案中，包含CCD脂质的LNP包括其中至少50％的LNP在8、10、12、24或48小时、或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除的那些，例如通过测量脂质(例如CCD脂质)、RNA(例如mRNA)或蛋白质成分。在某些实施方案中，测量LNP的包封脂质和游离脂质、RNA或蛋白质成分。

脂质清除可以按文献中所述测量。参见Maier,M.A.等Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics.Mol.Ther.2013,21(8),1570-78(“Maier”)。例如，在Maier中，通过经侧尾静脉进行的静脉推注按0.3mg/kg对6至8周龄雄性C57Bl/6小鼠施用包含靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时采集血液、肝和脾样品。组织采集前用盐水灌注小鼠，处理血液样品以获得血浆。处理所有样品并通过LC-MS分析。另外，Maier描述了用于评估施用LNP-siRNA制剂后的毒性的方法。例如，按5mL/kg给药体积经单次静脉推注按0、1、3、5和10mg/kg(5动物/组)对雄性Sprague-Dawley大鼠施用靶向荧光素酶的siRNA。24小时后，从有意识的动物的颈静脉获得约1mL血液，并分离血清。给药后72小时，将所有动物安乐死进行剖检。进行临床病征、体重、血清化学、器官重量和组织病理学评估。虽然Maier描述用于评估siRNA-LNP制剂的方法，但这些方法可适用于评估施用本公开的制剂的清除、药代动力学和毒性。

CCD脂质导致清除率提高。在一些实施方案中，该清除率是脂质清除率，例如CCD脂质从血液、血清或血浆清除的速率。在一些实施方案中，该清除率是RNA清除率，例如mRNA或向导RNA从血液、血清或血浆清除的速率。在一些实施方案中，该清除率是LNP从血液、血清或血浆清除的速率。在一些实施方案中，该清除率是LNP从组织如肝组织或脾组织清除的速率。在某些实施方案中，高速率的清除率产生无实质性副作用的安全性特征。CCD脂质减少循环中和组织中的LNP累积。在一些实施方案中，循环中和组织中LNP累积的减少产生无实质性副作用的安全性特征。

取决于它们所处介质的pH，本公开的CCD脂质可以是可离子化的。例如，在弱酸性介质中，CCD脂质可质子化，从而带正电。相反，在弱碱性介质例如pH约7.35的血液中，CCD脂质可以不质子化，从而不带电荷。在一些实施方案中，本公开的CCD脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施方案中，本公开的CCD脂质可以在至少约9的pH下质子化。在一些实施方案中，本公开的CCD脂质可以在至少约10的pH下质子化。

CCD脂质带电荷的能力与其固有pKa相关。例如，本公开的CCD脂质可以各独立地具有从约5.8至约6.2范围内的pKa。这可以是有利的，因为已发现pKa在从约5.1至约7.4范围内的阳离子脂质对递送负荷至肝有效。另外，已发现pKa在从约5.3至约6.4范围内的阳离子脂质对递送至肿瘤有效。参见例如WO 2014/136086。

其他脂质

适合用于本公开的脂质组合物的“中性脂质”包括例如多种中性、不带电荷或两性离子脂质。适合用于本公开的中性磷脂的实例包括但不限于：5-十七烷基苯-1,3-二酚(间苯二酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰-2-豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生四烯酰(diarachidoyl)-锡-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二二十碳烯酰(dieicosenoyl)-锡-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺及其组合。在一个实施方案中，中性磷脂可以选自二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一实施方案中，中性磷脂可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。中性脂质发挥功能来稳定和改善LNP的处理。

“辅助脂质”是增强转染(包含生物活性剂的纳米颗粒的转染)的脂质。辅助脂质增强转染的机制包括增强颗粒稳定性。在某些实施方案中，辅助脂质增强膜的融合(fusogenicity)。辅助脂质包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适合用于本公开的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，辅助脂质可以是胆固醇。在一个实施方案中，辅助脂质可以是胆固醇半琥珀酸酯。

“隐形脂质”是改变纳米颗粒可以在体内(例如在血液中)存在的时间长度的脂质。隐形脂质可以通过例如减少颗粒聚集和控制颗粒大小来辅助配制过程。本文所用的隐形脂质可以调节LNP的药代动力学特性。适合用于本公开的脂质组合物的隐形脂质包括但不限于具有与脂质部分连接的亲水性首基的隐形脂质。适合用于本公开的脂质组合物的隐形脂质和关于这类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等,Pharmaceutical Research,第25卷,第1期,2008,55-71页和Hoekstra等,Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52中。其他适宜的PEG脂质公开于例如WO 2006/007712中。

在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性首基包含选自基于PEG的聚合物(有时称为聚(环氧乙烷))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。

隐形脂质可以包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质的脂质部分可以源自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺，包括含有二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，该二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长，其中链可以包含一个或多个官能团，例如酰胺或酯。该二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可以进一步包含一个或多个取代烷基。

除非另有说明，本文所用的术语“PEG”指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物。在一个实施方案中，PEG是乙二醇或氧化乙烯的可选地取代的线性或分支聚合物。在一个实施方案中，PEG是非取代的。在一个实施方案中，PEG例如由一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一个实施方案中，该术语包括PEG共聚物，如PEG-聚氨基甲酸酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnicaland biomedical applications(1992))；在另一实施方案中，该术语不包括PEG共聚物。在一个实施方案中，该PEG具有从约130至约50,000的分子量，在子实施方案中，约150至约30,000，在子实施方案中，约150至约20,000，在子实施方案中，约150至约15,000，在子实施方案中，约150至约10,000，在子实施方案中，约150至约6,000，在子实施方案中，约150至约5,000，在子实施方案中，约150至约4,000，在子实施方案中，约150至约3,000，在子实施方案中，约300至约3,000，在子实施方案中，约1,000至约3,000，在子实施方案中，约1,500至约2,500。

在某些实施方案中，该PEG(例如与脂质如隐形脂质缀合)是“PEG-2K”，也称为“PEG2000”，其具有约2,000道尔顿的平均分子量。PEG-2K在本文中表示为以下式(I)，其中n为45，意指数值平均聚合度包含约45个亚单位但是，可以使用本领域已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数值平均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可以在从约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可以在从约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可以在从约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可以在从约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可以是45。在一些实施方案中，R可以选自H、取代烷基和非取代烷基。在一些实施方案中，R可以是非取代烷基。在一些实施方案中，R可以是甲基。

在本文所述实施方案的任一个中，隐形脂质可以选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(来自日本东京NOF的目录#GM-020)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(来自日本东京NOF的目录#DSPE-020CN)、PEG-二月桂酰甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺、PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧)酰胺-3',6'-二噁辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)(来自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA的目录#880150P)、1,2-二硬脂酰-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(来自Avanti Polar Lipids,Alabaster,Alabama,USA的目录#880120C)、1,2-二硬脂酰-锡-甘油、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020,NOFTokyo,日本)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-DSG。在一个实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-DSPE。在一个实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-DMA。在一个实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-DSA。在一个实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-C11。在一些实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-C14。在一些实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-C16。在一些实施方案中，隐形脂质可以是PEG2k-C18。

LNP制剂

LNP可以包含：(i)用于包封和用于内体逃逸的CCD脂质；(ii)用于稳定化的中性脂质；(iii)同样用于稳定化的辅助脂质；和(iv)隐形脂质。

在某些实施方案中，负荷包括编码Cas核酸酶如Cas9的mRNA和向导RNA或编码向导RNA的核酸。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质，如脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在一些方面，CCD脂质是脂质A。在一些方面，CCD脂质是脂质B。在多种实施方案中，LNP组合物包含CCD脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质。在某些实施方案中，辅助脂质是胆固醇。在某些实施方案中，中性脂质是DSPC。在具体实施方案中，隐形脂质是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，LNP组合物可以包含脂质A、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含CCD脂质、DSPC、胆固醇和隐形脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含含有PEG的隐形脂质。在某些实施方案中，CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在其他实施方案中，LNP组合物包含选自脂质A或脂质B的CCD脂质、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质和编码Cas核酸酶的mRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、编码Cas核酸酶的mRNA和至少一种其他脂质成分。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，LNP包含至少一种选自辅助脂质、中性脂质或隐形脂质的其他脂质成分。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，隐形脂质是PEG2k-DMG。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和编码Cas核酸酶的mRNA。在包含编码Cas核酸酶的mRNA的具体组合物中，CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C或脂质D，辅助脂质是胆固醇，中性脂质是DSPC，隐形脂质是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质A。在一些实施方案中，包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质B。在一些实施方案中，包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质C。在一些实施方案中，包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质D。

在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质和2类Cas核酸酶mRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、2类Cas核酸酶mRNA和至少一种其他脂质成分。在一些包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中，LNP包含至少一种选自辅助脂质、中性脂质或隐形脂质的其他脂质成分。在某些包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在其他包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在其他包含2类Cas核酸酶mRNA的实施方案中，隐形脂质是PEG2k-DMG。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和2类Cas核酸酶mRNA。在包含2类Cas核酸酶mRNA的具体组合物中，CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在其他包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中，CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C或脂质D，辅助脂质是胆固醇，中性脂质是DSPC，隐形脂质是PEG2k-DMG。在一些实施方案中，包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质A。在一些实施方案中，包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质B。在一些实施方案中，包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质C。在一些实施方案中，包含2类Cas核酸酶mRNA的组合物中的CCD脂质是脂质D。

在一些实施方案中，LNP组合物可以包含向导RNA。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、向导RNA、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些包含向导RNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在其他包含向导RNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在其他包含向导RNA的实施方案中，隐形脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，LNP组合物包含脂质A、脂质B、脂质C或脂质D；辅助脂质；中性脂质；隐形脂质；和向导RNA。在某些包含向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质A。在某些包含向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质B。在某些包含向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质C。在某些包含向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质D。在其他包含向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D；辅助脂质是胆固醇；中性脂质是DSPC；隐形脂质是PEG2k-DMG。

在某些实施方案中，LNP制剂包含比值在从约25:1至约1:25范围内的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。在某些实施方案中，LNP制剂包含比值在从约10:1至约1:10范围内的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。如本文中所测量，该比值按重量计。在一些实施方案中，LNP制剂包含比值在从约5:1至约1:5范围内的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。在一些实施方案中，LNP制剂包含比值为约1:1的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。在一些实施方案中，LNP制剂包含比值从约1:1至约1:5的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。在一些实施方案中，LNP制剂包含比值为约10:1的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。在一些实施方案中，LNP制剂包含比值为约1:10的2类Cas核酸酶mRNA和gRNA核酸。该比值可以是约25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。

在一个实施方案中，LNP组合物可以包含sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含Cas9sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含Cpf1sgRNA。在一些包含sgRNA的组合物中，LNP包含CCD脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些包含sgRNA的LNP组合物中，辅助脂质是胆固醇。在其他包含sgRNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在其他包含sgRNA的实施方案中，隐形脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、辅助脂质、中性脂质、隐形脂质和sgRNA。在包含sgRNA的具体组合物中，CCD脂质是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在其他包含sgRNA的组合物中，CCD脂质是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D；辅助脂质是胆固醇；中性脂质是DSPC；隐形脂质是PEG2k-DMG。

在某些实施方案中，LNP组合物包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA，该向导RNA可以是sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、编码Cas核酸酶的mRNA、向导RNA、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA的组合物中，辅助脂质是胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA的组合物中，中性脂质是DSPC。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA的实施方案中，隐形脂质是PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含CCD脂质、辅助脂质、中性脂质、隐形脂质、编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA。在包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA的具体组合物中，CCD脂质是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA的组合物中，CCD脂质是脂质A、脂质B、脂质C或脂质D；辅助脂质是胆固醇；中性脂质是DSPC；隐形脂质是PEG2k-DMG。

本文公开的LNP组合物可以包含模板核酸。模板核酸可以与编码Cas核酸酶的mRNA如2类Cas核酸酶mRNA一起配制。在一些实施方案中，模板核酸可以与向导RNA一起配制。在一些实施方案中，模板核酸可以与编码Cas核酸酶的mRNA和向导RNA二者一起配制。在一些实施方案中，模板核酸可以与编码Cas核酸酶的mRNA或向导RNA分开配制。在这类制剂中，取决于所希望的修复机制，模板核酸可以是单链或双链。模板可以与靶DNA或与靶DNA邻近序列具有同源区。

本公开的实施方案还提供按照成分脂质在制剂中的各摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施方案中，CCD脂质的mol-％可以从约30mol-％至约60mol-％。在一个实施方案中，CCD脂质的mol-％可以从约35mol-％至约55mol-％。在一个实施方案中，CCD脂质的mol-％可以从约40mol-％至约50mol-％。在一个实施方案中，CCD脂质的mol-％可以从约42mol-％至约47mol-％。在一个实施方案中，CCD脂质的mol-％可以是45mol-％。在一些实施方案中，LNP批次的CCD脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批间变异将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以从约30mol-％至约60mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以从约35mol-％至约55mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以从约40mol-％至约50mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以从约41mol-％至约46mol-％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol-％可以是约44mol-％。在一些实施方案中，LNP批次的辅助脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批间变异将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，中性脂质的mol-％可以从约1mol-％至约20mol-％。在一个实施方案中，中性脂质的mol-％可以从约5mol-％至约15mol-％。在一个实施方案中，中性脂质的mol-％可以从约7mol-％至约12mol-％。在一个实施方案中，中性脂质的mol-％可以是约9mol-％。在一些实施方案中，LNP批次的中性脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批间变异将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，隐形脂质的mol-％可以从约1mol-％至约10mol-％。在一个实施方案中，隐形脂质的mol-％可以从约1mol-％至约5mol-％。在一个实施方案中，隐形脂质的mol-％可以从约1mol-％至约3mol-％。在一个实施方案中，隐形脂质的mol-％可以是约2mol-％。在一个实施方案中，隐形脂质的mol-％可以是约1mol-％。在一些实施方案中，LNP批次的隐形脂质mol-％将是目标mol-％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批间变异将小于15％、小于10％或小于5％。

本公开的实施方案还提供按照CCD脂质的带正电荷胺基(N)和所要包封的核酸的带负电荷磷酸基团(P)之间的比值描述的脂质组合物。这可以在数学上表示为方程N/P。在一个实施方案中，N/P比值可以从约0.5至约100。在一个实施方案中，N/P比值可以从约1至约50。在一个实施方案中，N/P比值可以从约1至约25。在一个实施方案中，N/P比值可以从约1至约10。在一个实施方案中，N/P比值可以从约1至约7。在一个实施方案中，N/P比值可以从约3至约5。在一个实施方案中，N/P比值可以从约4至约5。在一个实施方案中，N/P比值可以是约4。在一个实施方案中，N/P比值可以是约4.5。在一个实施方案中，N/P比值可以是约5。

在一些实施方案中，通过将水性RNA溶液与基于有机溶剂的脂质溶液(例如100％乙醇)混合来形成LNP。适宜的溶液或溶剂包括或可以包含：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可以使用例如用于体内施用LNP的可药用缓冲液。在某些实施方案中，用缓冲液来将包含LNP的组合物的pH维持在pH7.0或高于pH 7.0。在其他实施方案中，组合物具有从约7.3至约7.7范围内或从约7.4至约7.6范围内的pH。在其他实施方案中，组合物具有约7.3、7.4、7.5、7.6或7.7的pH。组合物的pH可以用微型pH探头测量。在某些实施方案中，组合物中包含冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可以包含至多10％冷冻保护剂，例如蔗糖。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％冷冻保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可以包含约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可以包含缓冲液。在一些实施方案中，该缓冲液可以包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液及其混合物。在某些示例性实施方案中，该缓冲液包含NaCl。NaCl的示例性量可以在从约40mM至约50mM的范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，该缓冲液是Tris缓冲液。Tris的示例性量可以在从约40mM至约60mM的范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，该缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案包含含有5％蔗糖和45mM NaCl的Tris缓冲液。在其他示例性实施方案中，组合物可以按约5％w/v的量包含蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris。盐、缓冲液和冷冻保护剂的量可以改变，使得维持总体制剂的重链摩尔渗透压浓度。例如，最终重量摩尔渗透压浓度可以维持在小于450mOsm/L。在其他实施方案中，重量摩尔渗透压浓度在350和250mOsm/L之间。某些实施方案具有300+/-20mOsm/L的最终重量摩尔渗透压浓度。

在一些实施方案中，使用微流体混合、T混合或交叉混合。在某些方面，可以改变流速、接合点大小、接合点几何形状、接合点形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度。LNP或LNP组合物可以是例如经透析或层析浓缩或纯化的。LNP可以作为例如悬剂、乳剂或冻干粉剂保存。在一些实施方案中，将LNP组合物保存于2-8℃，在某些方面，将LNP组合物保存于室温。在其他实施方案中，将LNP组合物在例如-20℃或-80℃冷冻保存。在其他实施方案中，将LNP组合物保存在从约0℃至约-80℃范围内的温度。冷冻的LNP组合物可以在使用前例如在冰上、在室温下或在25℃融化。

可以用动态光散射(“DLS”)来表征本公开的LNP的多分散指数(“pdi”)和大小。DLS测量光源照射样品产生的光散射。从DLS测量结果测定的PDI代表群体中颗粒大小的分布(平均颗粒大小附近)，完全均一的群体具有0的PDI。在一些实施方案中，pdi可以在从约0.005至约0.75的范围内。在一些实施方案中，pdi可以在从约0.01至约0.5的范围内。在一些实施方案中，pdi可以在从约0.02至约0.4的范围内。在一些实施方案中，pdi可以在从约0.03至约0.35的范围内。在一些实施方案中，pdi可以在从约0.1至约0.35的范围内。

本文公开的LNP具有约1至约250nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约10至约200nm的大小。在其他实施方案中，LNP具有约20至约150nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约50至约150nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约50至约100nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约50至约120nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约75至约150nm的大小。在一些实施方案中，LNP具有约30至约200nm的大小。除非另有说明，本文提到的所有大小是在Malvern Zetasizer上通过动态光散射测量的完全形成的纳米颗粒的平均大小(直径)。将纳米颗粒样品稀释在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，使得计数速率为约200-400kcts。数据呈现为强度测量的加权平均值。在一些实施方案中，LNP以从约50％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以从约50％至约70％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以从约70％至约90％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以从约90％至约100％范围内的平均包封效率形成。在一些实施方案中，LNP以从约75％至约95％范围内的平均包封效率形成。

改造细胞的方法；改造细胞

本文公开的LNP组合物可以用于在体内和在体外通过基因编辑改造细胞的方法。在一些实施方案中，该方法涉及使细胞与本文所述LNP组合物接触。在一些实施方案中，该细胞可以是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是啮齿动物细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是人细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是肝细胞。在一些实施方案中，该细胞可以是人肝细胞。在一些实施方案中，该肝细胞可以是肝细胞(hepatocyte)。在一些实施方案中，该肝细胞是人肝细胞。在一些实施方案中，该肝细胞是干细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝窦内皮细胞(LSEC)。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是Kupffer细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝星状细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肿瘤细胞。在一些实施方案中，该人肝细胞可以是肝干细胞。在其他实施方案中，该细胞包含ApoE结合受体。

在一些实施方案中，提供改造的细胞，例如源自前一段落中的细胞类型中任一种的改造细胞。按照本文所述方法产生这类改造细胞。在一些实施方案中，该改造细胞驻留在个体内的组织或器官例如肝内。

在本文所述的一些方法和细胞中，细胞在靶序列中包含修饰，例如插入或缺失(“插入/缺失”)或取代核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中插入1、2、3、4或5或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中插入1或2个核苷酸。在其他实施方案中，该修饰包含在靶序列中缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中缺失1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中产生移码突变的插入/缺失。在一些实施方案中，该修饰包含取代靶序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含取代靶序列中的1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含掺入模板核酸(例如本文所述任意模板核酸)产生的核苷酸插入、缺失或取代中的一种或多种。

在一些实施方案中，提供包含改造细胞的细胞群体，例如包含按照本文所述方法改造的细胞的细胞群体。在一些实施方案中，该群体包含体外培养的改造细胞。在一些实施方案中，该群体驻留在个体内的组织或器官例如肝内。在一些实施方案中，群体内至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多的细胞是改造的。在某些实施方案中，本文公开的方法产生至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的编辑效率(或“百分比编辑”)(定义为检测到插入/缺失)。在其他实施方案中，本文公开的方法产生至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的DNA修饰效率(定义为在序列中检测到无论是通过插入、缺失、取代还是通过其他方式发生的改变)。在某些实施方案中，本文公开的方法产生约5％至约100％、约10％至约50％、约20％至约100％、约20％至约80％、约40％至约100％、或约40％至约80％之间的编辑效率水平或DNA修饰效率水平。

在本文公开的一些方法和细胞中，群体内的细胞在靶序列处包含修饰，例如插入/缺失或取代。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中插入1、2、3、4或5或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中插入1或2个核苷酸。在其他实施方案中，该修饰包含在靶序列中缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中缺失1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含在靶序列中产生移码突变的插入/缺失。在一些实施方案中，群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的改造细胞包含移码突变。在一些实施方案中，该修饰包含取代靶序列中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含取代靶序列中的1或2个核苷酸。在一些实施方案中，该修饰包含掺入模板核酸(例如本文所述任意模板核酸)产生的核苷酸插入、缺失或取代中的一种或多种。

治疗方法

本文公开的LNP组合物可以用于体内和体外基因编辑。在一个实施方案中，可以对有需要的个体施用本文所述的一种或多种LNP组合物。在一个实施方案中，可以使治疗有效量的本文所述组合物与有需要的个体的细胞接触。在一个实施方案中，可通过使细胞与本文所述LNP组合物接触来产生遗传改造的细胞。

在一些实施方案中，该方法涉及对肝障碍相关细胞施用LNP组合物。在一些实施方案中，该方法涉及治疗肝障碍。在某些实施方案中，该方法涉及使肝细胞与LNP组合物接触。在某些实施方案中，该方法涉及使肝细胞与LNP组合物接触。在一些实施方案中，该方法涉及使ApoE结合细胞与LNP组合物接触。

在一个实施方案中，可以对细胞如ApoE结合细胞施用包含编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA和模板的LNP组合物。在某些情况下，可以对细胞如ApoE结合细胞施用包含Cas核酸酶和sgRNA的LNP组合物。在一个实施方案中，可以对肝细胞施用包含编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA和模板的LNP组合物。在某些情况下，可以对肝细胞施用包含Cas核酸酶和sgRNA的LNP组合物。在一些情况下，该肝细胞在个体中。在某些实施方案中，个体可以接受单剂量的LNP组合物。在其他实例中，个体可以接受多个剂量的LNP组合物。在施用超过一个剂量时，剂量可以间隔约1、2、3、4、5、6、7、14、21或28天、间隔约2、3、4、5或6个月、或间隔约1、2、3、4或5年施用。

在一个实施方案中，可以对肝细胞(也称为肝细胞)施用包含编码Cas核酸酶的mRNA的LNP组合物，然后施用包含gRNA和可选的模板的组合物。在一个实施方案中，可以对肝细胞施用包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的LNP组合物，然后对细胞施用包含模板的组合物。在一个实施方案中，可以对肝细胞施用包含编码Cas核酸酶的mRNA的LNP组合物，然后顺次对细胞施用包含gRNA的LNP组合物，然后对细胞施用包含模板的LNP组合物。在包含gRNA的LNP组合物之前施用包含编码Cas核酸酶的mRNA的LNP组合物的实施方案中，施用可以间隔约4、6、8、12或24小时；或2、3、4、5、6或7天。

在一个实施方案中，LNP组合物可以用于编辑基因，产生基因敲除。在一个实施方案中，LNP组合物可以用于编辑基因，产生基因矫正。在一个实施方案中，LNP组合物可以用于编辑细胞，产生基因插入。

在一个实施方案中，施用LNP组合物可以导致产生持久反应的基因编辑。例如，施用可以产生一天、一个月、一年或更长的反应持续时间。本文所用的“反应持续时间”是指，在用本文公开的LNP组合物编辑细胞后，所产生的修饰在施用LNP组合物后仍存在某个时期。可通过测量靶蛋白水平来检测修饰。可通过检测靶DNA来检测修饰。在一些实施方案中，反应持续时间可以是至少1周。在其他实施方案中，反应持续时间可以是至少2周。在一个实施方案中，反应持续时间可以是至少1个月。在一些实施方案中，反应持续时间可以是至少2个月。在一个实施方案中，反应持续时间可以是至少4个月。在一个实施方案中，反应持续时间可以是至少6个月。在某些实施方案中，反应持续时间可以是约26周。在一些实施方案中，反应持续时间可以是至少1年。在一些实施方案中，反应持续时间可以是至少5年。在一些实施方案中，反应持续时间可以是至少10年。通过测量靶蛋白水平或通过检测靶DNA，在至少6个月后可检测到持久反应。

LNP组合物可以胃肠外施用。LNP组合物可以直接施用进入血流、进入组织、进入肌肉或进入内部器官。施用可以是全身的，例如注射或输注。施用可以是局部的。适宜的施用手段包括静脉内、动脉内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、视网膜下、玻璃体内、前房内、肌内、滑膜内和皮下。适宜的施用器械包括针头(包括显微操作针头)注射器、无针头注射器和输注技术。

LNP组合物通常但并非必然将作为与一种或多种可药用赋形剂结合的制剂施用。术语“赋形剂”包括除本公开的一种或多种化合物(一种或多种其他脂质成分和生物活性剂)之外的任何成分。赋形剂可赋予制剂功能性(例如药物释放速率控制)和/或非功能性(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如具体施用方式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响及剂型性质的因素。

胃肠外制剂通常是水性或油性溶液或悬液。在制剂为水性时，赋形剂如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选达到3至9的pH)，但对于一些应用，它们更适宜用无菌非水性溶液配制，或者配制为将与合适载体(如无菌无热源水(WFI))结合使用的干燥形式。

在一些实施方案中，基因编辑方法修饰因子VII靶基因。在某些实施方案中，对肝细胞施用LNP组合物来修饰因子VII基因。LNP组合物可用于治疗肝障碍，如因子VII缺乏。该方法可调节异常因子VII活性。在某些实施方案中，可以施用LNP组合物来治疗或预防血友病或凝血控制失能。参见例如Lapecorella,M.和Mariani,G.Factor VII deficiency: defining the clinical picture and optimizing therapeutic options.Haemophilia(2008),14,1170-1175。在某些实施方案中，可以施用LNP组合物来治疗或预防血栓形成倾向，血栓形成倾向是其中血液形成凝块的倾向提高的病症。

在发生组织损伤时，因子VII酶原和组织因子之间形成等摩尔复合物，导致在因子VII序列的152位切割，导致形成活化因子VII或因子VIIa。因子VIIa/组织因子复合物导致凝血。治疗因子VII相关障碍的方法包括提高因子VIIa凝血的方法、改善凝血的方法、或改善凝血特征的方法。在某些实施方案中，该方法对患有因子VII缺乏的个体施用LNP组合物。在一些实施方案中，该方法对之前例如用重组因子VIIa针对因子VII缺乏进行过治疗的个体施用LNP组合物。

在一些实施方案中，基因编辑方法修饰TTR靶基因。在某些实施方案中，LNP组合物可以用于治疗与肝中TTR表达相关的障碍，如淀粉状蛋白病。在一些实施方案中，可以施用LNP组合物来治疗或预防淀粉状蛋白病，包括运甲状腺素蛋白型淀粉状蛋白病。参见例如Patel,K.和Hawkins,P.Cardiac amyloidosis:where are we today？J.Intern.Med.(2008),278,126-144。

TTR相关障碍可以导致淀粉状蛋白沉积物的累积。因此，治疗或预防TTR相关障碍的方法包括降低TTR水平的方法、减少TTR产生的方法、减少淀粉状蛋白沉积物的方法、治疗遗传性运甲状腺素蛋白型淀粉状蛋白病的方法、治疗非遗传性运甲状腺素蛋白型淀粉状蛋白病的方法、或影响心脏及自主和外周神经中淀粉状蛋白沉积物的方法。在一些实施方案中，治疗或预防TTR相关障碍的方法包括对诊断为淀粉状蛋白沉积物的个体施用LNP组合物。在某些实施方案中，该方法对需要减少TTR产生的个体施用LNP组合物。

在一些实施方案中。基因编辑方法靶向选自SERPINA1、FVIII、FIX、SERPING1、KLKB1、KNG1、FXII、ASS1、ASL、BCKDHA、BCKDHB、G6PC、GO/HAO1、AGXT、PCCA、PCCB、OTC、LIPA、ABCB11、GALT、ATP7B和PAH的基因。在一些实施方案中，基因编辑方法可以用于治疗患有选自α1抗胰蛋白酶缺乏、血友病A、血友病B、HAE、1型瓜氨酸血症、精氨基琥珀酸尿症、枫糖尿病、糖原贮积病、1型原发性高草酸尿症、丙酸血症、鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症、胆固醇酯贮积病、进行性家族性肝内胆汁淤积、半乳糖血症、威尔逊病和苯丙酮尿症的疾病的个体。

在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”结合使用时，词语“一”、“一个”或“该”可以指“一个”，但均还与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义一致。除非另有说明，“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”和“包含”以及其他形式的使用是非限制性的。除非另有说明，申请中给出的所有范围涵盖终点。

实施例

实施例1.材料和方法

脂质纳米颗粒(“LNP”)制剂

按CCD脂质胺与RNA磷酸(N:P)摩尔比为约4.5配制LNP。按以下摩尔比将脂质纳米颗粒成分溶解在100％乙醇中：45mol-％(12.7mM)CCD脂质(例如脂质A或脂质B)；44mol-％(12.4mM)辅助脂质(例如胆固醇)；9mol-％(2.53mM)中性脂质(例如DSPC)；和2mol-％(.563mM)PEG(例如PEG2k-DMG或PEG2k-C11)。将RNA负荷溶解在50mM醋酸缓冲液(pH 4.5)中，得到约0.45mg/mL的RNA负荷浓度。

按照厂家的流程用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM BenchtopInstrument通过脂质和RNA溶液的微流体混合形成LNP。混合期间用差异流速维持水性溶剂与有机溶剂的比值为2:1。混合后，收集LNP，稀释在磷酸缓冲盐溶液(PBS，约1:1)中，然后用10kDa Slide-a-Lyzer^TM G2Dialysis Cassette(ThermoFisher Scientific)在4℃轻轻搅拌过夜，将剩余缓冲液更换为PBS(100倍过量的样品体积)。然后用0.2μm无菌滤器过滤所得到的混合物。将得到的滤液保存于2-8℃。按下文所述表征所分离的LNP，以测定包封效率、多分散指数和平均颗粒大小。

核酸酶mRNA和单向导RNA(sgRNA)的体外转录(“IVT”)

用线性化质粒DNA模板和T7RNA聚合酶通过体外转录产生含有N1-甲基假U的帽化和聚腺苷酸化Cas9 mRNA。通过按以下条件用XbaI在37℃孵育2小时来线性化包含T7启动子和100nt聚(A/T)区的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃加热反应20分钟来失活XbaI。用silica maxi spin column(Epoch Life Sciences)从酶和缓冲液盐纯化线性化质粒，并通过琼脂糖凝胶分析来确认线性化。产生Cas9修饰mRNA的IVT反应按以下条件在37℃孵育4小时：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假-UTP(Trilink)各2mM；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL Inorganic大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。4小时孵育后，加入TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL终浓度，再孵育反应30分钟，以去除DNA模板。按照厂家的流程(ThermoFisher)用MegaClear Transcription Clean-up试剂盒从酶和核苷酸纯化Cas9 mRNA。备选地，例如如实施例15中所示，通过沉淀流程纯化mRNA，在一些情况下，沉淀流程后进行基于HPLC的纯化。简言之，DNA酶消化后，通过加入0.21x体积的7.5MLiCl溶液并混合来沉淀mRNA，通过离心沉淀所沉淀的mRNA。去除上清后，将mRNA重新溶解在水中。用醋酸铵和乙醇再次沉淀mRNA。向mRNA溶液加入5M醋酸铵至2M终浓度，同时加入2x体积的100％乙醇。混合溶液，-20℃孵育15分钟。通过离心再次沉淀所沉淀的mRNA，去除上清，将mRNA重新溶解在水中。作为最后一步，用醋酸钠和乙醇沉淀mRNA。向溶液加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.5)，同时加入2x体积的100％乙醇。混合溶液，-20℃孵育15分钟。通过离心再次沉淀所沉淀的mRNA，去除上清，用70％冷乙醇洗涤沉淀，并使其空气干燥。将mRNA重新溶解在水中。对于HPLC纯化的mRNA，在LiCl沉淀和重新溶解之后，通过RP-HPLC纯化mRNA(参见例如Kariko等Nucleic Acids Research,2011,第39卷,第21期e142)。组合所选择进行合并的级分，并通过上文所述醋酸钠/乙醇沉淀来脱盐。

对于所有方法，通过测量260nm(Nanodrop)光吸收来测定转录物浓度，并通过Bioanlayzer(Agilent)毛细管电泳来分析转录物。

还用IVT来在相似的过程中产生sgRNA。通过使仅由T7RNA聚合酶启动子序列组成的上寡核苷酸与包含sgRNA模板和启动子位点的互补序列的下链退火来产生sgRNA的DNA模板。退火模板按以下条件直接用于IVT反应：125nM模板；GTP、ATP、CTP和UTP各7.5mM；5U/μLT7RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL Inorganic大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。在37℃孵育反应8小时，然后加入TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL终浓度，再孵育反应30分钟，以去除DNA模板。按照厂家的流程(ThermoFisher)通过MegaClear Transcription Clean-up试剂盒纯化sgRNA转录物。通过260nm吸光度测定转录物浓度(Nanodrop)，通过PAGE分析转录物。

制剂分析

针对平均颗粒大小、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率分析LNP制剂。用Malvern Zetasizer DLS仪器通过动态光散射(DLS)测量平均颗粒大小和多分散性。将LNP样品30X稀释在PBS中，然后通过DLS测量。报告Z平均直径(其是基于强度的平均颗粒大小测量)连同pdi。

用基于荧光的测定来测定总RNA浓度和包封效率。用1x TE缓冲液75X稀释LNP至染料(ThermoFisher Scientific,目录号R11491)的线性范围内。将50μl稀释LNP进一步与50μl 1x TE缓冲液或含0.2％Triton X-100的1x TE缓冲液混合，一式两份。37℃孵育样品10分钟，使Triton完全破坏LNP，暴露出总RNA与染料相互作用。利用用于制备LNP的起始RNA溶液，按照与上文相同的步骤，制备标准曲线样品。然后向各样品加入Diluted染料(100μL，100X于1xTE缓冲液中，按照厂家说明书)，室温避光孵育10分钟。用SpectraMax M5酶标仪(Molecular Devices)读取样品，激发、自动截止和发射波长分别设为488nm、515nm和525nm。用以下方程计算包封效率(％EE)：

其中荧光@525nm-triton是针对不含Triton的样品读出的平均荧光，荧光@525nm+triton是针对含Triton的样品读出的平均荧光。用线性标准曲线和含triton样品的平均荧光读数值测定总RNA浓度。

可用相同的方法测定基于DNA的负荷成分的包封效率。对于单链DNA，可以使用Oligreen Dye，对于双链DNA，可以使用Picogreen Dye。

下文表1中报道多种LNP组合物的平均颗粒大小、多分散性和％EE。

表1.LNP制剂数据总结

T7E1测定

一些实施例中用T7E1测定来检测基因组DNA中的突变事件，如Cas9切割DNA后通过非同源末端连接(NHEJ)产生的插入、缺失和取代(参见例如Cho等,Targeted genomeengineering in human cells with the Cas9RNA-guided endonuclease.NatureBiotechnology.2013；31,230–232)。

通过PCR扩增CRISPR/Cas9所靶向的基因组DNA区域，95℃变性10分钟，然后通过使温度按0.5℃/秒的速率从95℃下降至25℃来重新退火。DNA组合形成异源双链体指示所扩增的区域中存在突变。然后用噬菌体解离酶T7E1(New England Biolabs)在37℃消化重新退火的异源双链体25分钟或更长时间以产生双链断裂，其中T7E1核酸酶识别错配。用Fragment Analyzer分析所得到的DNA片段并定量，以测定编辑效率的近似值。对于编辑效率的定量分析，按本文所述使用下一代测序。

下一代测序(“NGS”)和中靶切割效率分析

为了定量测定基因组中靶位置处的编辑效率，利用深度测序来鉴定由基因编辑引入的插入和缺失的存在。

在靶位点(例如TTR、FVII)附近设计PCR引物，扩增目的基因组区域。下文提供引物序列。按照厂家流程(Illumina)进行附加PCR以为测序加入必要的化学品。在IlluminaMiSeq仪器上测序扩增子。在消除具有低质量得分的那些读出之后，将读出与人参考基因组(例如hg38)比对。将所得到的包含读出的文件定位至参考基因组(BAM文件)，其中选择与目的靶区域重叠的读出，计算野生型读出的数目和包含插入、取代或缺失的读出的数目。

编辑百分比(例如“编辑效率”或“百分比编辑”)定义为含有插入或缺失的序列读出总数除以包括野生型的序列读出总数。

体外LNP递送

小鼠细胞系(Neuro2A和Hepa1.6)培养在补充10％胎牛血清的DMEM培养基中，按15,000细胞/孔的密度接种孔板，24小时后用LNP转染，18-24小时后按本文所述进行裂解和分析(例如报道基因表达、T7E1测定、NGS)。小鼠原代肝细胞(Invitrogen)用胶原包被的96孔板按15,000细胞/孔培养在肝细胞接种培养基(Invitrogen)中。5小时后，去除接种培养基，替换为含有LNP和3％小鼠血清的肝细胞维持培养基(37℃预孵育5分钟)。转染细胞，42-48小时后按本文所述进行裂解和分析(例如T7E1测定、NGS)。对于细胞系和原代肝细胞二者，稀释LNP并加至细胞，从每孔100ng Cas9 mRNA和约30nM向导RNA开始，以半对数方式向下进行系列稀释至每孔0.1ng Cas9 mRNA和0.03nM向导RNA。

体内LNP递送

每项研究中使用6-10周龄范围内的CD-1雌性小鼠。将动物称重并按体重分组，根据组平均体重配制给药溶液。LNP按0.2mL/动物(约10mL/千克体重)的体积经侧尾静脉给药。给药后针对副作用观察动物约6小时。施用后24小时测量体重，在多种时间点在异氟烷麻醉下通过心脏穿刺放血对动物实施安乐死。按本文所述将血液收集入血清分离管或收集入用于血浆的含有缓冲柠檬酸钠的管。对于涉及体内编辑的研究，从每只动物的中叶或从三个独立叶(例如右中、左中和左侧叶)采集肝组织进行DNA提取和分析。对于一些研究，还采集了脾组织。

基因组DNA分离

按照厂家的流程用Invitrogen PureLink基因组DNA试剂盒(目录号K1820-02)从10mg组织提取基因组DNA，其包括在裂解缓冲液(约200μL/10mg组织)中匀浆组织和沉淀DNA。将所有DNA样品归一化至100ng/μL浓度用于本文所述PCR和随后的NGS分析。

运甲状腺素蛋白(TTR)ELISA分析

按所示采集血液并分离血清。用Mouse Prealbumin(Transthyretin)ELISA试剂盒(Aviva Systems Biology,目录号OKIA00111)测定总TTR血清水平。按照厂家流程配制试剂盒试剂和标准品。用1x测定稀释液稀释小鼠血清至10,000倍最终稀释度。这是通过进行产生2,500倍稀释度的两次连续50倍稀释来进行。进行最终的4倍稀释步骤来使总样品稀释度为10,000倍。将标准曲线稀释液(各100μL)和稀释血清样品加至捕获抗体预包被的ELISA平板的各孔。室温孵育平板30分钟，然后洗涤。加入酶-抗体缀合物(100μL/孔)进行20分钟孵育。去除未结合的抗体缀合物，再次洗涤平板，然后加入生色底物溶液。孵育平板10分钟，然后加入100μL终止液，例如硫酸(约0.3M)。在SpectraMax M5酶标仪上按450nm吸光度读板。通过SoftMax Pro软件6.4.2版计算血清TTR水平，用四参数逻辑曲线拟合标准曲线。针对测定稀释度调整最终血清值。

因子VII(FVII)活性测定

按所示采集血液进行血浆分离。用BIOPHEN FVII测定试剂盒(AnariaDiagnostics,目录号A221304)测量血浆因子VII活性水平。按照厂家的流程配制试剂盒试剂。通过进行产生2,500倍稀释度的两次连续50倍稀释来用试剂盒样品稀释缓冲液将血浆稀释10,000倍。进行最终的4倍稀释步骤来使总样品稀释度为10,000倍。将稀释样品(30μL)加至试剂盒试剂1(30μL)。然后，将试剂盒试剂2(60μL)加至平板，然后37℃孵育平板7分钟。然后将试剂盒试剂3(60μL)加至平板，再37℃孵育平板5分钟，然后加入乙酸(20％v/v于水中，60μL)来终止酶促反应。在SoftMax M5酶标仪上405nm读板。基于从对照动物血浆制备的校正曲线计算FVII活性的相对值，并报告为载体对照的百分比。

实施例2.eGFP mRNA包封LNP的体外递送

按实施例1中所述制备包含编码eGFP的mRNA(TriLink,目录号L-6101)的LNP组合物。各LNP制备物的成分包含CCD脂质(45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG或PEG2k-C11(2mol-％)。LNP-002、-006、-007、-010和-011包含脂质A作为CCD脂质，而LNP-012和-013包含脂质B作为CCD脂质。LNP-002、-010和-012包含PEG2k-DMG，LNP-006、-007、-011和-013包含PEG2k-C11。表1中提供LNP详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。对于每种LNP，按实施例1中所述将LNP递送至小鼠肝细胞系(Hepa1.6)，所递送的eGFP mRNA的总量是100ng或500ng/孔。用LNP孵育细胞约18小时，用CytoFLEX CellAnalyzer(Beckman Coulter)测量eGFP表达。

如图1中所示，针对每种制剂观察到了eGFP表达。包含脂质A的LNP制剂(LNP-002、-006、-007、-010和-011)成功递送eGFP mRNA。包含脂质B的LNP制剂(LNP-012和-013)也递送eGFP mRNA。包含PEG2k-C11和PEG2k-DMG隐形脂质的LNP在这些实验中都有效递送mRNA，证明用LNP在体外递送mRNA至小鼠肝细胞系。

实施例3.gLUC mRNA包封LNP的体内递送

按实施例1中所述制备包含编码Gaussia荧光素酶(gLUC)的mRNA(TriLink,目录号L-6123)的LNP，并针对mRNA在体内递送至动物进行测试。各LNP制备物的成分包含CCD脂质(45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。LNP-014包含脂质A，而LNP-015包含脂质B。表1中提供这些制剂的详情，如平均颗粒大小、多分散性和包封效率。用各LNP制剂递送0.1mg/kg和0.3mg/kg的gLUC mRNA剂量。24小时后对动物实施安乐死，按实施例1中所述进行血液采集和血清分离。按照厂家的流程用Pierce^TMGaussia荧光素酶快速测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，目录号16158)测量血清荧光素酶表达。

如图2中所示，与PBS对照相比，针对各动物(每组n＝5)观察到了gLUC表达的剂量依赖性提高。包含脂质A或脂质B的LNP显示有效的体内递送和通过荧光素酶活性测量的mRNA表达。

实施例4.使用Cas9 mRNA包封LNP(mRNA-LNP)和双向导RNA包封LNP(dgRNA-LNP)的体内递送和编辑

在CD-1小鼠中测试了用于递送CRISPR/Cas RNA成分(例如gRNA和编码Cas9的mRNA)在肝中进行体内编辑的LNP。在这些实验中，将dgRNA和mRNA分开配制。

按实施例1中所述用体外转录的Cas9 mRNA和化学修饰的dgRNA(靶向TTR或FVII)分开配制LNP。此实施例中所用的dgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，在组成双向导的crRNA和trRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸之间具有硫代磷酸酯键。各LNP制备物(LNP-093、-094、-095、-096和-097)的成分包含CCD脂质(脂质A)(45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。表1中提供这些制剂的详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。利用了两种不同给药方案：(1)将mRNA-LNP制剂(LNP-097)和dgRNA-LNP制剂(LNP-093、-094、-095或-096)按等比例(按RNA的重量计)组合在一起，并在连续两天施用组合制剂(每天按1mg/kg各RNA成分制剂施用，总计2mg/kg)；或(2)在连续两天，施用mRNA-LNP(LNP-097)，4小时后施用dgRNA-LNP(LNP-093、-094、-095和-096)(每种制剂按1mg/kg施用)。各组中第一个剂量后5天对动物实施安乐死。除对照组比较(动物接受PBS)外，各实验组具有内部测序对照，对每只动物中的两个靶标运行实施例1中所述的用于NGS分析的PCR反应(每组n＝3)。按实施例1中所述分离来自肝的基因组DNA并通过NGS分析。

如图3A和3B中所示，在用共同给药(A1(LNP-093/-097)或A2(LNP-094/-097))或预给药(A3(LNP-093/-097))给药方案接受靶向FVII的LNP的动物肝中观察到了体内编辑(约1.8％编辑-2.8％编辑)。在接受与Cas9 mRNA共同给药的dgRNA(B1(LNP-095/LNP-097)或B2(LNP-096/-097))的动物肝中或在预给药时(B3(LNP-095/-097)或B4(LNP-096/-097))，接受靶向TTR的LNP的动物显示约2％-4.5％编辑。按实施例1中所述对所有动物进行了血清和血浆分析，没有动物显示总血清TTR水平或血浆FVII活性的统计上显著的差异(与施用PBS的动物相比)(未显示)。

实施例5.使用dgRNA-LNP和IVT sgRNA-LNP的体外和体内递送和编辑

在与Cas9 mRNA-LNP共同给药的背景中测试了包含化学修饰的dgRNA的LNP和包含体外转录(IVT)的sgRNA的LNP的功效。

按照实施例1配制LNP-115、-116、-117、-120、-121和-123，表1中提供关于具体制剂的详情。使用实施例1中所述的方法，针对递送至Neuro2A细胞测试了此实施例的制剂。

将LNP-121(gRNA)和LNP-120(Cas9 mRNA)混合在一起，并分别按每孔gRNA浓度152nM、76nM和38nM加mRNA 570ng、285ng和142ng施用；将LNP-123(gRNA)和LNP-120混合在一起，并分别按每孔gRNA浓度156nM、78nM和39nM加mRNA 528ng、264ng和132ng施用；将LNP-116(gRNA)与LNP-120(Cas9 mRNA)混合，并分别按每孔gRNA浓度124nM、62nM和31nM加mRNA460ng、229ng和114ng施用。LNP-121按gRNA浓度198nM、99nM和49.5nM施用；LNP-123按gRNA浓度189nM、94.5nM和47nM施用；LNP-116按gRNA浓度124nM、62nM和31nM施用，按照厂家说明书通过LF2K将Cas9 mRNA(100ng/孔)加至实验。在涉及IVT sgRNA-LNP(LNP-123)与使用LNP(LNP-120)或LF2K的Cas9 mRNA、以及与测试gRNA浓度下的化学修饰dgRNA(LNP-121)共同给药的样品中都观察到了编辑。

然后在体内测试此实施例中的制剂。动物按实施例1中所述连续两天施用Cas9mRNA-LNP和gRNA-LNP之一的混合物(动物每天施用1mg/kg各制剂)，一种制剂仅在一天给药(每组n＝5)。第一个剂量后6天(或仅接受单个剂量的组为7天)对动物实施安乐死，按实施例1中所述采集肝组织并通过NGS分析。

如图4A中所示，单剂量和双剂量对递送有效。在Cas9 mRNA-LNP与化学修饰的dgRNA-LNP共同给药(LNP-116和LNP-120，图4A中的A；LNP-121和LNP-120，图4B中的B)时，在单天接受一个剂量(LNP-121和LNP-120；图4A中的C)的组和在连续天接受两个剂量的组之间无统计学差异。与此实施例中所用dgRNA-LNP相比，接受与未修饰的IVT sgRNA-LNP共同给药的Cas9 mRNA-LNP的动物(LNP-123和LNP-120，图4B中的D)显示相对低的编辑水平(图4B)。这些实验确定，在与Cas9mRNA-LNP共同给药时，包含修饰dgRNA或IVT sgRNA的LNP允许进行体外和体内编辑。在此实验中使用包含IVT sgRNA的LNP时观察到的体内编辑水平可以受分离的IVT sgRNA纯度影响。

实施例6.使用修饰dgRNA-LNP或修饰sgRNA-LNP的体外和体内递送和编辑

还通过与Cas9 mRNA-LNP共同给药来测试了包含化学修饰的dgRNA的LNP和包含化学修饰的sgRNA的LNP。

按实施例1中所述用化学修饰的dgRNA(靶向TTR或FVII)、化学修饰的sgRNA(靶向TTR或FVII)和IVT Cas9 mRNA配制LNP。此实施例中的dgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，在组成双向导的crRNA和trRNA二者的5’和3’两端的三个末端核苷酸之间具有硫代磷酸酯键。此实施例中的sgRNA也是化学合成的，来源于商业供应商，在sgRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸处和之间具有2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键。各LNP制备物的成分包含CCD脂质(脂质A,45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。这些实验中使用LNP-136、-137、-138、-139和-140。表1中提供详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。

按实施例1中所述，针对递送至Neuro2A细胞测试了此实施例的制剂。通过将各制剂直接加至细胞培养基，用向导LNP和Cas9 mRNA LNP共转染细胞，得到表2中所列的浓度，按实施例1中所述用T7E1测定来测定百分比编辑。在图5中，标记代表表2中所述的制剂。

表2.实施例6中所利用的制剂

与所测试的dgRNA-LNP制剂相比，在用化学修饰的sgRNA-LNP与Cas9 mRNA-LNP共转染时，针对两个靶标测量到了编辑的大幅提高(图5)。在靶向FVII和TTR时，化学修饰的sgRNA-LNP与Cas9 mRNA-LNP共转染(LNP-138和-139，图5)分别在细胞中产生约35-50％和65-70％的编辑。

然后在体内测试了此实施例中的制剂。动物按实施例1中所述施用Cas9 mRNA-LNP(LNP-140)和所测试的gRNA-LNP(LNP-136、-137、-138和-139)之一的混合物，其中每种组成制剂按1mg/kg/天(总计2mg/kg/天)在连续两天给药(每组n＝5)。第一个剂量后6天对动物实施安乐死，按实施例1中所述采集肝组织并通过NGS分析。

在图6中，A1和A2代表施用制剂LNP-136和LNP-140的混合物；B1和B2代表施用制剂LNP-139和LNP-140的混合物；C1和C2代表施用制剂LNP-137和LNP-140的混合物；D1和D2代表施用制剂LNP-138和LNP-140的混合物。如图6中所示，与使用dgRNA-LNP制剂所产生的编辑量(约2％编辑-5％编辑)相比，在使用与Cas9 mRNA-LNP共同给药的化学修饰sgRNA-LNP时，针对两种靶标测量到了编辑的提高(约10％编辑-32％编辑)。接受靶向TTR的dgRNA-LNP制剂的动物在两个肝活检组织上产生小于5％的编辑，而sgRNA-LNP制剂产生超过20％的平均百分比编辑(在一只动物中峰值超过30％)。相似地，接受靶向FVII的dgRNA-LNP制剂的动物在两个肝活检组织上显示小于3％的编辑，而sgRNA-LNP制剂产生约10％的平均百分比编辑(在一只动物中峰值超过12％)。

这些结果确定，用Cas9 mRNA和gRNA(dgRNA和sgRNA二者)分开配制的LNP一起共同给药时达到体内编辑，且LNP在Cas9 mRNA-LNP先于gRNA-LNP给药时达到体内编辑。

实施例7.使用包含与Cas9 mRNA共同配制的sgRNA的LNP的体外和体内递送和编辑

配制用于递送一起包封在LNP组合物中的Cas9 mRNA和sgRNA的LNP也有效递送CRISPR/Cas成分。

按实施例1中所述用IVT Cas9 mRNA与化学修饰的sgRNA(靶向TTR或FVII)一起配制LNP。按RNA成分的重量计，mRNA:sgRNA的比值约为1:1。此实施例中的sgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，在sgRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸处和之间分别具有2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键。各LNP制备物的成分包含CCD脂质(脂质A,45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。这些实验中使用LNP-152、-153、-154和-155，表1中提供这些制剂的详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。

按实施例1中所述，针对递送至Neuro2A细胞测试了此实施例的制剂。按实施例1中所述，用制剂转染细胞，并用NGS测定百分比编辑。

在图7中，A代表施用LNP-152；B代表施用LNP-153；C代表施用LNP-154；D代表施用LNP-155；E代表施用LNP-152和LNP-153的组合。每种制剂按300ng Cas9 mRNA和93nM gRNA、100ng Cas9 mRNA和31nM gRNA、30ng Cas9 mRNA和10nM gRNA，及10ng Cas9 mRNA和3nMgRNA施用。如图7中所示，各LNP制剂的施用产生稳健的编辑效率，一些制剂使超过80％的细胞产生编辑(LNP-153和-155)。用靶向FVII的两种LNP制剂(LNP-152和LNP-153)的组合处理细胞，这也产生有效编辑(约70-90％编辑)，以及FVII基因的位于所递送的两种sgRNA之间的部分的切除(图7，数据未显示)。

还在体内测试了此实施例中的制剂。动物按实施例1中所述给药(每组n＝4)。接受靶向FVII的LNP的治疗组接受单剂量(按2mg/kg)，治疗组之一接受2mg/kg(例如LNP-152和LNP-153各1mg/kg)的单个组合剂量(LNP-152和LNP-153)。接受靶向TTR的LNP的治疗组接受两个剂量(各按2mg/kg)，其中第二个剂量在第一个剂量后四天递送(即第1天第1个剂量，第5天第2个剂量)。第一个剂量后8天对所有组的动物实施安乐死，按实施例1中所述采集并分析血液和肝组织。每种制剂对四只动物施用。

在图8A、8B和9中，A代表施用LNP-152；B代表施用LNP-153；C代表施用LNP-152和LNP-153的组合。每种制剂在四只动物中测试。如图8A和8B中所示，所测试的各LNP制剂在体内产生稳健的编辑效率。对于用靶向TTR序列的LNP制剂治疗的动物，来自一些动物的各活检组织的超过50％的肝细胞显示靶位点处的插入/缺失，各治疗组的总体平均值(所有动物的所有活检组织)为45.2±6.4％(LNP-154)和51.1±3.7％(LNP-155)(图8A)。

用靶向FVII序列的LNP治疗的动物在肝活检组织中显示一系列百分比编辑，观察到的最大编辑是来自一只接受两种靶向FVII序列的LNP制剂的动物的活检组织样品的超过70％的肝细胞编辑(例如在一个或多个靶位点处或之间具有插入/缺失或切除事件)。各治疗组(LNP-152、LNP-153及LNP-152和LNP-153)的总体平均值(所有动物的所有活检组织)分别为16.9±6.5％、38.6±13.2％和50.7±15.0％(图8B)。对于接受两种靶向FVII的LNP的动物，通过PCR检测了各sgRNA的靶位点之间的间插基因组DNA的切除，正如一个或两个靶位点处的插入/缺失(图9)。

在图10和11中，A代表施用LNP-152；B代表施用LNP-153；C代表施用LNP-154；D代表施用LNP-155；E代表施用LNP-152和LNP-153的组合。在施用LNP制剂时观察到的稳健体内编辑在此实施例中还导致表型改变。如图10中所示，在用靶向TTR序列的LNP治疗的动物中观察到了血清TTR水平的大幅降低(至多约75％)(而对照或用靶向FVII的LNP治疗的动物中则不然)。相似地，在用靶向FVII的LNP治疗的动物中观察到了血浆FVII活性水平降低(而对照或用靶向TTR的LNP治疗的动物中则不然)(图11)。

实施例8.制剂参数的变动

针对以下测试了配制用于在一种制剂中一起递送Cas9 mRNA和gRNA的LNP：(1)一系列剂量；(2)改变mRNA:gRNA比值；(3)单剂量对比两个剂量的功效；和(4)LNP是否由脾摄取并产生编辑。

按实施例1中所述，用IVT Cas9 mRNA与化学修饰的sgRNA(靶向TTR)一起配制LNP。所测试的mRNA:sgRNA比值(按RNA成分的重量计)是约1:1(LNP-169)、约10:1(LNP-170)或约1:10(LNP-171)。此实施例中使用的sgRNA在sgRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸处和之间分别包含2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键。各LNP制备物的成分包含脂质A(45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。这些实验中使用LNP-169、-170和LNP-171。表1中提供详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。

剂量反应研究

在此研究中，动物在第1天按实施例1中所述用LNP-169按0.1mg/kg、0.5mg/kg或2mg/kg的剂量给药(每组n＝5)。在第5和9天采集血液进行TTR血清水平分析。按实施例1中所述，在第9天剖检时采集肝和脾进行NGS分析。

如图12A中所示，全部三种剂量的施用都在肝中产生显著的编辑效率，所观察到的线性剂量反应具有0.9441的r²值。在最高剂量组(2mg/kg)中，一只动物中近60％的肝细胞在TTR靶位点处产生编辑，该组平均约50％的肝细胞的产生编辑。在施用后第5和9天测量时，施用最高剂量的每只动物还显示统计上显著的血清TTR水平降低，血清TTR水平平均降低75％(与施用PBS的动物相比；图12B)。

改变mRNA:gRNA比值

动物在第1天按实施例1中所述施用mRNA:gRNA比值为1:1的LNP-169(即1mg/kgmRNA，1mg/kg gRNA，总RNA剂量2mg/kg)、比值为10:1的LNP-170(即1.8mg/kg的mRNA,0.18mg/kg的gRNA，总RNA剂量1.98mg/kg)或比值为1:10的LNP-171(即0.18mg/kg mRNA，1.8mg/kg gRNA，总RNA剂量1.98mg/kg)(每组n＝5)。(注：接受具有1:1mRNA:gRNA比值的剂量的组和数据是与此实施例中的剂量反应研究中所述相同的组和数据，上文)。在第5和9天采集血液，测量血清TTR水平。按实施例1中所述，在第9天剖检时采集肝和脾进行NGS分析。

如图13A中所示，LNP-169(mRNA:gRNA比值为1:1)的施用在一只动物中在TTR靶位点处产生近60％的编辑，该组平均值为约50％编辑。在此实验中，接受1:10和10:1LNP制剂的动物也显示编辑，平均百分比编辑为：接受LNP-171的组显示约32％编辑，接受LNP-170的组显示约17％编辑。此外，如图13B中所示，在第5天针对每个治疗组检测到统计上显著的血清TTR水平降低(与PBS对照相比)。至第9天，接受1:1mRNA:sgRNA和1:10mRNA:sgRNA的组保持统计上显著的血清TTR水平降低。

单剂量对比两个剂量

在此研究中，按实施例1中所述施用，一组动物在第1天接受单剂量的LNP-169(按2mg/kg)，而另一组动物接受两个剂量的LNP-169(各按2mg/kg)，第一个剂量在第1天施用，第二个剂量在第5天施用(两组均为n＝5)。(注：接受单剂量LNP-169的组和数据是与此实施例中的剂量反应和mRNA:gRNA比值研究中所述相同的组和数据，上文)。按实施例1中所述，在第5天(对于接受第二个剂量的组，在施用第二个剂量之前)从两个组都采集血液进行TTR血清水平测定，同样在第9天剖检。

如图14A中所示，在接受单剂量LNP-169的组中，在一只动物中观察到近60％的TTR靶位点编辑，该组平均值为约50％编辑。在接受两个剂量LNP-169的动物中达到了相似的平均值，标准差更低，组平均值为约55％的TTR靶位点编辑。如图14B中所示，两个组都显示血清TTR水平显著降低。

评价脾中摄取和编辑

剖检时从以上研究(此实施例内)中的每只动物采集脾，以确定LNP是否指导至脾并由脾摄取，从而产生基因编辑。按实施例1中所述从脾组织提取基因组DNA并进行NGS分析。

在图15A中，A代表按2mg/kg施用LNP-169两个剂量；B代表按0.1mg/kg作为单剂量施用mRNA:gRNA比值为1:1的LNP-169；C代表按0.5mg/kg作为单剂量施用mRNA:gRNA比值为1:1的LNP-169；D代表按2mg/kg作为单剂量施用mRNA:gRNA比值为1:1的LNP-169；E代表按2mg/kg作为单剂量施用mRNA:gRNA比值为10:1的LNP-170；F代表按2mg/kg作为单剂量施用mRNA:gRNA比值为1:10的LNP-171。如图15中所示，与它们的肝相比，在这些动物的脾中观察到了显著少的编辑(少于约2％的细胞)。在这些研究中观察到了肝中约50％的编辑(例如在接受LNP-169的那些组中)。这些结果表明，本文提供的LNP大部分靶向至肝，而不是脾。

实施例9.(1)修饰dgRNA-LNP与Cas9 mRNA-LNP共同给药和(2)一种制剂中将Cas9mRNA和修饰dgRNA包含在一起的LNP之间的体内比较研究

配制用于作为分开的LNP或在一种制剂中一起递送Cas9 mRNA和修饰dgRNA的LNP有效递送CRISPR/Cas成分。

按实施例1中所述，与化学修饰的dgRNA(靶向TTR)一起(LNP-174、-175)或分开(LNP-172、-173)，用IVT Cas9 mRNA配制LNP。此实施例中组成dgRNA的crRNA和trRNA二者都在各RNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸之间包含硫代磷酸酯键。各LNP制备物的成分包含CCD脂质(脂质A,45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。这些实验中使用LNP-172、-173、-174和-175。除组成LNP-175中的dgRNA的crRNA和trRNA在与LNP配制之前首先相互预退火之外，LNP-174和LNP-175的组成相同。这是通过按之前所述先将crRNA和trRNA一起在95℃孵育10分钟、然后冷却至室温并进行配制来达到。表1中提供关于LNP的其他详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。

动物按实施例1中所述按2mg/kg用各LNP给药(每组n＝5)。按实施例1中所述，在施用后第8天剖检时采集肝，分离基因组DNA并进行NGS分析。

在图16中，A代表施用dgRNA分开制剂(LNP-172和LNP-173；B代表施用dgRNA共同制剂(LNP-174)；C代表施用其中dgRNA预退火的制剂(LNP-175)。如图16中所示，在来自各组的肝中检测到了编辑(约4-6％编辑)。接受用Cas9 mRNA和dgRNA一起共同配制的LNP的动物和接受来自分开配制的LNP的mRNA和dgRNA的动物显示编辑。用以dgRNA(与Cas9 mRNA一起或分开)配制的LNP测量的编辑效率实质性低于用以sgRNA配制的LNP检测到的那些(参见例如实施例6-8)。

实施例10.LNP的ApoE结合和原代肝细胞的转染

如实施例8中所证明，本文提供的LNP由肝有效摄取，仅以很小的程度由脾摄取。此实施例提供关于原代肝细胞中ApoE介导的摄取的数据，并提供用于测试LNP-ApoE结合的测定，其证明LNP结合ApoE。

LNP递送至原代肝细胞

除其他蛋白质外，血清提供了培养基中ApoE的来源，因此测试了LNP摄取进入原代肝细胞是否需要血清(例如作为ApoE的来源)。这是通过在存在和不存在血清的情况下将LNP加至体外原代肝细胞来达到。

按实施例1中所述将LNP递送至小鼠原代肝细胞。在缺乏任何血清的情况下，未通过T7E1测定针对所测试的任何LNP检测到编辑(数据未显示)。但是，在转染前使LNP与3％小鼠血清孵育时，肝细胞摄取LNP，产生编辑。图17中显示代表性数据集。在此实验中，在3％小鼠血清中预孵育LNP-169(靶向TTR)，然后按多种浓度加至小鼠原代肝细胞。图17中的标记在表3中定义，并描述施用的LNP-169的浓度。如图17中所示，血清的加入导致通过NGS测量的TTR靶位点处的编辑的剂量依赖性提高。这些结果表明，存在于血清中的ApoE介导肝细胞中的LNP摄取。

表3.施用的LNP-169的浓度

标记	nM gRNA	ng Cas9 mRNA
			A	30.8	99.9
B	10.3	33.3
			C	3.4	11.1
D	1.1	3.7
			E	0.4	1.2
F	0.1	0.4
			G	0.0	0.1

ApoE结合测定

用重组ApoE3(最常见的ApoE形式)孵育LNP，然后在HPLC上使用盐梯度，用肝素亲和柱分开。HPLC运行中存在对应于与ApoE3结合的LNP和未结合的LNP的两个峰群。未结合的是不与ApoE3结合并自由流过肝素柱的LNP。结合的是具有更长保留时间的峰，代表结合肝素柱并在盐梯度中洗脱的LNP/ApoE3复合物。为了计算结合，通过积分对应于结合ApoE3的LNP的峰面积并将该值除以两个峰的总面积来计算结合峰面积百分比。

按实施例1中所述，用Cas9 mRNA和化学修饰的sgRNA配制LNP。此实施例中使用的sgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，在sgRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸处和之间分别具有2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键。各LNP制备物(LNP-169和LNP-171)的成分包含脂质A(45mol-％)、胆固醇(44mol-％)、DSPC(9mol-％)和PEG2k-DMG(2mol-％)。表1中提供这些制剂的详情，包括平均颗粒大小、多分散性和包封效率。使用0.5mg/mL的ApoE3母液(Recombinant Human Apolipoprotein E3,R&D Systems,cat#4144-AE-500)，将ApoE3按25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和300μg/mL加至LNP样品。将样品室温过夜孵育。

配制两种缓冲液(各500mL)；缓冲液A为20mM Tris缓冲液，调节至pH 8.0，缓冲液B为含1M NaCl的20mM Tris，调节至pH 8.0。用于HPLC分析的梯度和流速如下文所述。

过夜孵育样品后，通过HPLC分析各样品，按之前所述计算结合峰面积百分比。

如图18中所示，随着ApoE3的量逐渐提高，更多的LNP(LNP-169(表示为虚线)和-171(表示为实线)二者)例如由于结合于ApoE3而结合肝素柱。这些结果表明，LNP结合ApoE3。

实施例11.使用含有从DNA表达盒表达的sgRNA的LNP的体外和体内递送和编辑

此实施例证明使用加载Cas9 mRNA和编码sgRNA的表达盒的LNP的基因编辑。

体外LNP递送

通过PCR扩增包含与靶向小鼠TTR的sgRNA连接的U6启动子的DNA序列来制备编码sgRNA的扩增子。各引物在5’端包含反向双脱氧T核苷酸，以防止DNA扩增子整合入基因组DNA。通过酚/氯仿提取后进行乙醇沉淀来纯化PCR产物。干燥DNA沉淀并重悬在TE缓冲液中。

按实施例1中所述，用IVT Cas9 mRNA(“mRNA-LNP”或LNP-178)或sgRNA表达盒(“DNA-LNP”或LNP-176)配制LNP。还按照厂家说明书用Lipofectamine 2000(ThermoFisher)分开配制IVT Cas9 mRNA和sgRNA表达盒(分别为“mRNA LF2K”或“DNA LF2K”)。通过按照以下方案直接稀释入各孔中的细胞培养基来将制剂加至小鼠Neuro2A细胞(100ngCas9 mRNA和100ng sgRNA表达盒)：

●Cas9 mRNA和sgRNA表达盒共同递送；

●施用sgRNA表达盒后2小时施用Cas9 mRNA；和

●施用Cas9 mRNA后2小时施用sgRNA表达盒。

转染后孵育细胞48小时，按实施例1中所述通过T7E1分析来分析细胞裂解物。如图19中所示，与用Lipofectamine 2000配制一种成分或另一种成分时相比，在将mRNA和DNA成分都配制在LNP中时，观察到了更高百分比的TTR编辑。

实施例12.体外对比体内编辑

按实施例1中所述配制Cas9 mRNA和靶向不同的小鼠TTR序列的化学修饰sgRNA，并对小鼠给药(2mg/kg)。用相同的LNP制备物在体外转染小鼠原代肝细胞。此实施例中的sgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，在sgRNA的5’和3’两端的三个末端核苷酸处和之间分别具有2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键。

表4.实施例12中所利用的制剂

＊＊＊＝在5’和3’端的三个末端核苷酸处和之间具有2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键的单向导型式

对于体外研究，进行了7个点的半对数剂量反应研究(始于100ng/孔)。转染后48小时，收集基因组DNA并通过NGS测量编辑百分比。图20显示这些体外和体内实验的编辑百分比，证明编辑效率在培养的原代肝细胞和体内之间相关。

由于NGS除总体编辑效率之外还提供具体的测序结果，所以将序列特异性编辑模式与Neuro 2A细胞进行了比较。图21显示代表性数据，证明插入和缺失模式在小鼠Neuro2A细胞(用Cas9 mRNA和gRNA转染)和小鼠原代肝细胞(用包含Cas9 mRNA和gRNA的LNP转染)之间显著不同。小鼠原代肝细胞产生与在体内观察到的那些(用包含Cas9 mRNA和gRNA的LNP转染)非常相似的编辑模式(图22)。如图22中所示，在小鼠原代肝细胞中测量到的编辑中的53.2％是缺失(主要为1bp缺失)，16.8％是插入(主要为1bp插入)，总计70％编辑。在总计70％编辑中，64.5％的编辑产生移码突变，其代表了所测量到的总编辑的～92％(未显示)。相似地，显示了从基于LNP的Cas9 mRNA和gRNA在体内递送至肝细胞观察到的编辑百分比和编辑类型的代表性数据：在体内小鼠肝细胞中测量到的编辑中的46.6％是缺失(同样，主要为1bp缺失)，12.9％是插入(同样，主要为1bp插入)，总计59.5％编辑。在总计59.5％编辑中，57.4％的编辑产生移码突变，其代表了在体内测量到的总编辑的～96％(未显示)。

实施例13.通过LNP递送的CRISPR/Cas9成分的药代动力学

按实施例1中所述配制包含Cas9 mRNA和靶向小鼠TTR的sgRNA的LNP-294。通过HPLC确认mRNA与向导RNA的比值。动物按实施例1中所述用2mg/kg的各LNP给药(每组n＝3)，在以下时间点采血(take down)：5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、72小时和7天。剖检时，采集血浆、肝和脾进行Cas9mRNA和向导RNA的qPCR分析。图23显示这些成分的血浆浓度，图24显示肝中的浓度，图25显示脾中的浓度。针对血浆浓度计算了以下药代动力学参数：

表5.药代动力学参数

参数	sg009(sgRNA)	Cas9(mRNA)
			剂量(mg/kg)	1(25mcg/ms)	1(25mcg/ms)
C<sub>max</sub>(mcg/mL)	39.049	18.15
			T<sub>max</sub>(hr)	0.083	0.5
T<sub>1/2</sub>(hr)	2.32	2.54
			Vd(mL/kg)	195.6	208.4
Cl(mL/hr＊kg)	58.4	56.7
			AUC<sub>last</sub>(mcg＊hr/mL)	21.99	18.39

图26A显示血浆和组织中sgRNA与Cas9 mRNA的相对比值。

还测量了所治疗的小鼠中的细胞因子诱导。对于此分析，通过尾静脉切口采集约50-100μL血液进行血清细胞因子测量。使血液室温凝固约2小时，然后1000xg离心10分钟，然后收集血清。用测量IL-6、TNF-α、IFN-α和MCP-1的基于Luminex的磁珠多重测定(Affymetrix ProcartaPlus,目录号Exp040-00000-801)进行所收集的样品中的细胞因子分析。试剂盒试剂和标准品按厂家流程中的指导配制。小鼠血清用所提供的样品稀释液稀释4倍，将50μL加至含有50μL稀释的抗体包被磁珠的孔中。室温孵育平板2小时，然后洗涤。将稀释的生物素抗体(50μL)加至磁珠，室温孵育1小时。再次洗涤磁珠，然后向每孔加入50μL稀释的链霉抗生物素蛋白-PE，然后孵育30分钟。再次洗涤磁珠，然后悬浮在100μL洗涤缓冲液中，在Bio-Plex 200仪器(Bio-Rad)上读数。用Bioplex Manager 6.1版分析软件包分析数据，从使用五参数逻辑曲线拟合的标准曲线计算出细胞因子浓度。图27显示所治疗的小鼠血浆细胞因子水平随时间的变化。如图27中所示，各细胞因子在治疗后2-4小时之间有可测量到的提高，12-24小时后各回到基线。

按照实施例1分开配制了三种不同的向导序列，并注入小鼠(n＝3)来测定脂质A的药代动力学特征。通过LC/MS测量小鼠肝和血浆中的脂质A水平。图26B显示脂质A血浆和肝浓度随时间的变化。肝中的T_max在施用30分钟内达到，而血浆和肝中的T_1/2在LNP施用约5-6小时内达到。

实施例14.体内编辑的反应持续时间

按实施例1中所述配制Cas9 mRNA和靶向小鼠TTR序列的化学修饰sgRNA：

表6.LNP 402制剂信息

按实施例1中所述对小鼠施用LNP(3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg单剂量)。在给药后1、2、4、9、13和16周测量小鼠群组的血清TTR水平，在给药后1、2、9和16周测量TTR编辑。为了测量肝TTR编辑，从具体群组的每只动物的中叶采集肝组织样品进行DNA提取和分析。按照厂家的流程用基于磁珠的提取试剂盒MagMAX-96DNA Multi-Sample Kit(ThermoFisher,目录号4413020)从10mg组织提取基因组DNA，该流程包括在裂解缓冲液(约400μL/10mg组织)中匀浆组织和沉淀DNA。将所有DNA样品归一化至100ng/μL浓度用于PCR和随后的NGS分析。

此实施例中的sgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，具有下文所示的2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键(m＝2’-OMe；＊＝硫代磷酸酯键)：

sg282:

图28显示小鼠血清TTR水平随时间的变化，图29A显示通过NGS测量的相应编辑百分比。图29B显示小鼠血清TTR水平随时间的变化和通过NGS测量的相应编辑百分比二者，直至给药后16周。

实施例15.使用mRNA制备物的制剂

使用仅沉淀和HPLC纯化流程二者，按实施例1中所述制备Cas9mRNA。用HPLC纯化的mRNA配制LNP(LNP492)，与用仅沉淀处理的mRNA配制的LNP(LNP490、LNP494)比较。用不同合成批次的仅沉淀mrNA制备LNP494的Cas9 mRNA负荷。

表7.实施例15中所利用的制剂

小鼠按实施例1，体内LNP递送中所述用0.5或1mg/kg的各制剂给药。此实施例中使用的sgRNA是实施例14中所述的sg282。

图30显示给药后4小时的小鼠血清细胞因子活性。图31显示小鼠血清TTR浓度水平，图32显示小鼠肝TTR编辑水平。

表8.图30、31和32中的附图标记。

实施例16.冷冻制剂

按脂质A与RNA磷酸(N:P)摩尔比为约4.5配制LNP。按以下摩尔比将脂质纳米颗粒成分溶解在100％乙醇中：45mol-％(12.7mM)脂质A、44mol-％(12.4mM)胆固醇、9mol-％(2.53mM)DSPC和2mol-％(0.563mM)PEG2k-DMG。将RNA负荷溶解在50mM醋酸缓冲液pH 4.5中，得到约0.45mg/mL的RNA负荷浓度。对于此研究，使用实施例14中所述的sg282。

表9.实施例16中所利用的LNP制剂

按照厂家的流程用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM BenchtopInstrument通过脂质和RNA溶液的微流体混合形成LNP(LNP493、LNP496)。混合期间用差异流速维持水性溶剂与有机溶剂的比值为2:1。混合后，收集LNP，稀释在50mM Tris缓冲液pH7.5中。用0.2μm无菌滤器过滤所配制的LNP。将得到的滤液与在50mM Tris缓冲液pH 7.5中配制的10％w/v蔗糖、90mM NaCl 1:1混合。将5％w/v蔗糖、45mM NaCl、50mM Tris缓冲液的最终LNP制剂保存在4℃和-80℃1.5天，直至给药当天。

按0.5和1mg/kg对小鼠施用LNP(施用前1小时在25℃融化冷冻制剂)。图33显示小鼠血清TTR浓度水平，图34显示给药后小鼠肝TTR编辑水平。

图10.图33和34中的附图标记。

此实施例中的sgRNA是化学合成的，来源于商业供应商，具有下文所示的2’-O-甲基修饰和硫代磷酸酯键(m＝2’-OMe；＊＝硫代磷酸酯键)：

sg396:

实施例17.备选LNP制剂方法

按脂质A与RNA磷酸(N:P)摩尔比为约4.5配制LNP。按以下摩尔比将脂质纳米颗粒成分溶解在100％乙醇中：45mol-％(12.7mM)脂质A、44mol-％(12.4mM)胆固醇、9mol-％(2.53mM)DSPC和2mol-％(0.563mM)PEG2k-DMG。将RNA负荷溶解在醋酸缓冲液(终浓度25mM醋酸钠，pH 4.5)或柠檬酸缓冲液(终浓度25mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH5)中，得到约0.45mg/mL的RNA负荷浓度。对于此研究，使用实施例14中所述的sg282。

通过按照厂家的流程用Precision Nanosystems NanoAssemblr^TM BenchtopInstrument进行脂质和RNA溶液的微流体混合或交叉流混合形成LNP。LNP563和LNP564用NanoAssemblr制备物制备，其中混合期间用差异流速维持水性溶剂与有机溶剂的比值为2:1，水相流速8mL/分钟，有机相流速4mL/分钟。混合后，收集LNP，1:1稀释在50mM Tris缓冲液pH 7.5中。在50mM Tris pH 7.5中过夜透析LNP，第二天用0.2μm无菌滤器过滤。将得到的滤液浓缩，并与在50mM Tris缓冲液pH 7.5中配制的10％w/v蔗糖、90mM NaCl 1:1混合。将5％w/v蔗糖、45mM NaCl、50mM Tris缓冲液的最终LNP制剂保存在4℃和-80℃1.5天，直至给药当天。

表11.实施例17中所使用的LNP的制剂信息。

＊Cas9 1xNLS,无HA标记

用交叉流技术制备LNP561和LNP562，使用了注射泵，两个注射器为0.45mg/mL的RNA，一个注射器为包含脂质的有机相，一个注射器为水。用可变管路长度将这些按40mL/分钟混合，推动水相和有机相通过0.5mm聚醚醚酮四通(peek cross)，将此输出引入与水管路连接的1mm三通(tee)。LNP在室温孵育1小时，然后用水1:1稀释。简言之，通过注射泵将LNP和水按25mL/分钟引入1mm三通。

对于纯化和浓缩，使用了切向流过滤。通常，对于此方法，用500mL水处理来自Sartorius的Vivaflow 50膜包(Vivaflow 50cartridge)，然后用Pall Minimate系统按60mL/分钟进料速率引入LNP。夹住透过液管路以保持约1.7mL/分钟的固定流速。浓缩LNP后，按80mL/分钟的进料速率在真空下引入15倍体积的PBS或5％蔗糖、45mM NaCl、50mMTris、pH 7.5。夹住透过液管路以保持约1.9mL/分钟的流速。渗滤完成后，浓缩LNP，收集在无菌无DNA酶无RNA酶的收集管中，PBS制剂保存在4℃，TSS(即Tris、蔗糖和盐)制剂保存在4℃或-80℃，直至给药当日。

按1.0和2.0mg/kg对小鼠施用LNP(施用前1小时在25℃融化冷冻制剂)。图35显示小鼠血清TTR浓度水平，而图36显示用不同制剂给药后小鼠肝TTR编辑水平。

表12.图35和36中的附图标记。

实施例18.递送LNP至高等物种

与实施例14中所述的那些类似地制备制剂。在某些实验中，用与sg282中相同的化学修饰来修饰sgRNA，但靶向序列对大鼠TTR序列特异。在大鼠肝中观察到了有效的编辑。2mg/kg(总负荷)剂量和5mg/kg(总负荷)剂量在实验中被良好耐受。包含编码GFP的mRNA的相似制剂在1mg/kg和3mg/kg剂量下也被非人灵长类良好耐受。

序列

以上实施例中所述的序列列出如下(多核苷酸序列从5’至3’)：

Cas9 mRNA(Cas9编码序列为黑体；HA标记为黑体下划线；2xNLS下划线)：

表11中引用和实施例17中使用的“Cas9 1xNLS，无HA标记”：

tr001(trRNA)：

cr002(靶向FVII的crRNA；靶向序列下划线)：

sg001(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

cr003(靶向TTR的crRNA；靶向序列下划线)：

sg006(通过IVT制备的靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg003(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg007(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg002(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg004(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg005(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

＊＝硫代磷酸酯键

m＝2'OMe

tr002(trRNA)：

cr004(靶向FVII的crRNA；靶向序列下划线)：

cr005(靶向TTR的crRNA；靶向序列下划线)：

sg008(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg009(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg010(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg002(靶向FVII的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg011(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

sg012(靶向TTR的sgRNA；靶向序列下划线)：

ec001(表达盒-用于表达靶向TTR的sgRNA的扩增子；U6启动子为黑体，靶向序列下划线；构建体在每个5’端包含反向双脱氧T)：

用于cr001所靶向的FVII靶位点的NGS分析的引物对：

正向：

反向：

用于cr002和sg001所靶向的FVII靶位点的NGS分析的引物对：

正向：

反向：

用于sg002所靶向的FVII靶位点的NGS分析的引物对：

反向：

用于cr003和sg003所靶向的TTR靶位点的NGS分析的引物对：

正向：

反向：

用于sg004所靶向的TTR靶位点的NGS分析的引物对：

正向：

反向：

用于sg005所靶向的TTR靶位点的NGS分析的引物对：

正向：

反向：

用于sg004表达盒PCR扩增的引物对：

/5InvddT/＝反向双脱氧T

正向：

反向：

表13.小鼠TTR向导序列

表14.人TTR向导序列

Claims (136)

1.产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒(LNP)接触：

2类Cas核酸酶mRNA；

向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

2.基因编辑方法，其包括递送2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸至肝细胞，其中将2类Cas mRNA和向导RNA核酸配制为至少一种LNP组合物包含以下：

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

3.基因编辑方法，其包括对个体中的ApoE结合细胞施用2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸，其中将2类Cas mRNA和向导RNA核酸配制为至少一种LNP组合物包含以下：

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

4.基因编辑方法，其包括使肝细胞与包含以下的LNP接触：

编码Cas核酸酶的mRNA；

向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

5.改变肝细胞中基因表达的方法，其包括作为一种或多种LNP制剂对个体施用治疗有效量的2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸，其中至少一种LNP制剂包含：

向导RNA核酸或2类Cas核酸酶mRNA；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

6.产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒(LNP)接触：

2类Cas核酸酶mRNA；

单向导RNA(sgRNA)的向导RNA核酸,或编码单向导RNA(sgRNA)的向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

7.产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的LNP接触：

2类Cas核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA核酸，或编码sgRNA的向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

8.产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒组合物接触：

2类Cas核酸酶mRNA；

向导RNA核酸；

用于以肝特异性方式递送RNA的工具(means)。

9.产生遗传改造的肝细胞的方法，其包括使细胞与包含以下的脂质纳米颗粒接触：

2类Cas核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA核酸，或编码sgRNA的向导RNA核酸；

用于递送RNA至肝细胞的工具。

10.对肝细胞施用CRISPR-Cas复合物的方法，其包括对个体施用包含以下的用于肝细胞中基因编辑的LNP组合物：

Cas9核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA，或编码sgRNA的向导RNA；

用于递送RNA至肝细胞的可生物降解工具。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中肝细胞是肝细胞(hepatocyte)。

12.权利要求11的方法，其中肝细胞是原代肝细胞。

13.权利要求11的方法，其中肝细胞是干细胞。

14.权利要求1-13中任一项的方法，其中细胞在个体中。

15.权利要求14的方法，其中个体是人。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中mRNA配制在第一LNP组合物中，向导RNA核酸配制在第二LNP组合物中。

17.权利要求16的方法，其中第一和第二LNP组合物同时施用。

18.权利要求16的方法，其中第一和第二LNP组合物顺次施用。

19.权利要求1-15中任一项的方法，其中mRNA和向导RNA核酸配制在单个LNP组合物中。

20.权利要求1-19中任一项的方法，其进一步包括至少一个模板。

21.权利要求1-20中任一项的方法，其中mRNA是Cas9核酸酶mRNA。

22.权利要求16的方法，其中Cas9mRNA是人密码子优化的Cas9核酸酶。

23.权利要求1-22中任一项的方法，其中向导RNA核酸是编码向导RNA的表达盒。

24.权利要求23的方法，其中表达盒进一步包含调节元件。

25.权利要求1-22中任一项的方法，其中向导RNA核酸是向导RNA。

26.权利要求23-25中任一项的方法，其中向导RNA是sgRNA。

27.权利要求23-25中任一项的方法，其中向导RNA是双向导RNA(dgRNA)。

28.权利要求1-27中任一项的方法，其中向导RNA核酸包含修饰残基。

29.权利要求28的方法，其中修饰残基包含选自主链修饰、糖修饰和碱基修饰的修饰。

30.权利要求1-29中任一项的方法，其中CCD脂质是脂质A。

31.权利要求1-29中任一项的方法，其中CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C和脂质D。

32.权利要求1-31中任一项的方法，其中辅助脂质选自胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。

33.权利要求32的方法，其中辅助脂质是胆固醇。

34.权利要求1-33中任一项的方法，其中中性脂质选自DSPC和DMPE。

35.权利要求34的方法，其中中性脂质是DSPC。

36.权利要求1-35中任一项的方法，其中隐形脂质选自PEG2k-DMG和PEG2k-C11。

37.权利要求36的方法，其中隐形脂质是PEG2k-DMG。

38.权利要求1-37中任一项的方法，其中至少一种LNP包含脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

39.权利要求1-37中任一项的方法，其中至少一种LNP包含脂质B、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

40.权利要求1-39中任一项的方法，其中组合物按从约30mol-％至约60mol-％范围内的量包含CCD脂质。

41.权利要求1-40中任一项的方法，其中组合物按从约30mol-％至约60mol-％范围内的量包含辅助脂质。

42.权利要求1-41中任一项的方法，其中组合物按从约1mol-％至约20mol-％范围内的量包含中性脂质。

43.权利要求1-42中任一项的方法，其中组合物按从约1mol-％至约10mol-％范围内的量包含隐形脂质。

44.权利要求1-43中任一项的方法，其中组合物按约45mol-％的量包含CCD脂质。

45.权利要求1-44中任一项的方法，其中组合物按约44mol-％的量包含辅助脂质。

46.权利要求1-45中任一项的方法，其中组合物按约9mol-％的量包含中性脂质。

47.权利要求1-46中任一项的方法，其中组合物按约2mol-％的量包含隐形脂质。

48.权利要求1-47中任一项的方法，其中2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸按从约10:1至约1:10范围内的重量比值存在。

49.权利要求1-48中任一项的方法，其中2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA按约1:1的重量比值存在。

50.权利要求1-49中任一项的方法，其中CCD脂质胺与DNA磷酸的比值在从约3至约5的范围内。

51.权利要求1-50中任一项的方法，其中CCD脂质胺与DNA磷酸的比值为约4.5。

52.权利要求1-51中任一项的方法，其中组合物的颗粒大小在从约50nm至约120nm的范围内。

53.权利要求1-52中任一项的方法，其中组合物的颗粒大小在从约75nm至约150nm的范围内。

54.权利要求1-53中任一项的方法，其中组合物的包封效率在从约70％至约100％的范围内。

55.权利要求1-54中任一项的方法，其中组合物的多分散指数在从约.005至约0.5的范围内。

56.权利要求1-55中任一项的方法，其中组合物的多分散指数在从约0.02至约0.35的范围内。

57.权利要求1-56中任一项的方法，其中组合物的施用产生基因编辑。

58.权利要求57的方法，其中基因编辑导致基因敲除。

59.权利要求58的方法，其中基因编辑导致基因矫正。

60.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生持久反应。

61.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生从约1天至约1年的反应持续时间。

62.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生至少1周的反应持续时间。

63.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生至少2周的反应持续时间。

64.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生至少1个月的反应持续时间。

65.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生至少4个月的反应持续时间。

66.权利要求57-59中任一项的方法，其中基因编辑产生至少1年的反应持续时间。

67.LNP组合物，其包含：

编码Cas核酸酶的mRNA；

向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

68.LNP组合物，其包含：

2类Cas核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA核酸，或编码sgRNA的向导RNA核酸；

CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

69.用于肝细胞中基因编辑的LNP组合物，其包含：

2类Cas核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA核酸，或编码sgRNA的向导RNA核酸；CCD脂质；

辅助脂质；

中性脂质；和

隐形脂质。

70.LNP组合物，其包含：

2类Cas核酸酶mRNA；

向导RNA核酸；

用于以肝特异性方式递送RNA的工具。

71.LNP组合物，其包含：

2类Cas核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA核酸，或编码sgRNA的向导RNA核酸；

用于递送RNA至肝细胞的工具。

72.用于肝细胞中基因编辑的LNP组合物，其包含：

Cas9核酸酶mRNA；

sgRNA的向导RNA，或编码sgRNA的向导RNA；

用于递送RNA至肝细胞的可生物降解工具。

73.权利要求67-72中任一项的组合物，其中mRNA和向导RNA核酸分开包封在LNP中，组合LNP形成LNP组合物。

74.权利要求67-72中任一项的组合物，其中mRNA和向导RNA核酸一起包封在LNP组合物中。

75.权利要求67-74中任一项的组合物，其进一步包含至少一个模板。

76.权利要求67-75中任一项的组合物，其中mRNA是Cas9核酸酶mRNA。

77.权利要求76的组合物，其中Cas9核酸酶mRNA是人密码子优化的Cas9核酸酶。

78.权利要求67-77中任一项的组合物，其中向导RNA核酸是编码向导RNA的表达盒。

79.权利要求78的组合物，其中表达盒进一步包含调节序列。

80.权利要求67-77中任一项的组合物，其中向导RNA核酸是向导RNA。

81.权利要求78-80中任一项的组合物，其中向导RNA是sgRNA。

82.权利要求73-80中任一项的组合物，其中向导RNA是双向导RNA(dgRNA)。

83.权利要求67-82中任一项的组合物，其中向导RNA核酸包含修饰残基。

84.权利要求83的组合物，其中修饰残基包含选自主链修饰、糖修饰和碱基修饰的修饰。

85.权利要求67-74中任一项的组合物，其中CCD脂质是脂质A。

86.权利要求67-85中任一项的组合物，其中CCD脂质选自脂质A、脂质B、脂质C和脂质D。

87.权利要求67-86中任一项的组合物，其中辅助脂质选自胆固醇、5-十七烷基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。

88.权利要求87的组合物，其中辅助脂质是胆固醇。

89.权利要求67-88中任一项的组合物，其中中性脂质选自DSPC和DMPE。

90.权利要求89的组合物，其中中性脂质是DSPC。

91.权利要求67-90中任一项的组合物，其中隐形脂质选自PEG2k-DMG和PEG2k-C11。

92.权利要求91的组合物，其中隐形脂质是PEG2k-DMG。

93.权利要求67-92中任一项的组合物，其中至少一种LNP包含脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

94.权利要求67-93中任一项的组合物，其中至少一种LNP包含脂质B、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

95.权利要求67-94中任一项的组合物，其中组合物按从约30mol-％至约60mol-％范围内的量包含CCD脂质。

96.权利要求67-95中任一项的组合物，其中组合物按从约30mol-％至约60mol-％范围内的量包含辅助脂质。

97.权利要求67-96中任一项的组合物，其中组合物按从约1mol-％至约20mol-％范围内的量包含中性脂质。

98.权利要求67-97中任一项的组合物，其中组合物按从约1mol-％至约10mol-％范围内的量包含隐形脂质。

99.权利要求67-98中任一项的组合物，其中组合物按约45mol-％的量包含CCD脂质。

100.权利要求67-99中任一项的组合物，其中组合物按约44mol-％的量包含辅助脂质。

101.权利要求67-100中任一项的组合物，其中组合物按约9mol-％的量包含中性脂质。

102.权利要求67-101中任一项的组合物，其中组合物按约2mol-％的量包含隐形脂质。

103.权利要求67-102中任一项的组合物，其中2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸按从约10:1至约1:10范围内的重量比值存在。

104.权利要求67-103中任一项的组合物，其中2类Cas核酸酶mRNA和向导RNA核酸按约1:1的重量比值存在。

105.权利要求67-104中任一项的组合物，其中CCD脂质胺与DNA磷酸的比值在从约3至约5的范围内。

106.权利要求67-105中任一项的组合物，其中CCD脂质胺与DNA磷酸的比值为约4.5。

107.权利要求67-106中任一项的组合物，其中组合物的颗粒大小在从约50nm至约120nm的范围内。

108.权利要求67-107中任一项的组合物，其中组合物的颗粒大小在从约75nm至约150nm的范围内。

109.权利要求67-108中任一项的组合物，其中组合物的包封效率在从约70％至约100％的范围内。

110.权利要求67-109中任一项的组合物，其中组合物的多分散指数在从约.005至约0.5的范围内。

111.权利要求67-110中任一项的组合物，其中组合物的多分散指数在从约.02至约0.35的范围内。

112.权利要求67-111中任一项的组合物，其中组合物是肝选择性的。

113.权利要求112的组合物，其中组合物是肝细胞选择性的。

114.权利要求112的组合物，其中组合物是ApoE受体选择性的。

115.遗传改造的肝细胞，其通过权利要求1-59中任一项的方法制备。

116.遗传改造的肝细胞，其用权利要求67-114中任一项的组合物制备。

117.权利要求115或116的遗传改造的肝细胞，其中肝细胞是原代肝细胞。

118.权利要求67-114中任一项的组合物，其进一步包含冷冻保护剂。

119.权利要求118的组合物，其中冷冻保护剂按从约1％至约10％w/v范围内的量存在。

120.权利要求118或119的组合物，其中冷冻保护剂选自蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。

121.权利要求118-120中任一项的组合物，其中冷冻保护剂是蔗糖。

122.权利要求67-114或118-121中任一项的组合物，其进一步包含缓冲液。

123.权利要求122的组合物，其中缓冲液选自磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液及其混合物。

124.权利要求122或123的组合物，其进一步包含NaCl。

125.权利要求124的组合物，其中：

冷冻保护剂是蔗糖；

蔗糖按从约1％至约10％w/v范围内的量存在；

缓冲液是Tris缓冲液和NaCl缓冲液的混合物；

NaCl缓冲液按从约40mM至约50mM范围内的量存在；和

Tris缓冲液按从约40mM至约60mM范围内的量存在。

126.权利要求125的组合物，其中：

蔗糖按约5％w/v的量存在；

NaCl缓冲液按约45mM的量存在；和

Tris缓冲液按约50mM的量存在。

127.权利要求125或126的组合物，其中组合物具有从约7.3至约7.7范围内的pH。

128.权利要求127的组合物，其中组合物具有约7.3、约7.4、约7.5或约7.6的pH。

129.权利要求127或128的组合物，其中组合物具有从约7.4至约7.6范围内的pH。

130.权利要求129的组合物，其中组合物具有约7.5的pH。

131.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少20％编辑效率。

132.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少50％编辑效率。

133.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少80％编辑效率。

134.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少20％DNA修饰效率。

135.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少50％DNA修饰效率。

136.权利要求1-66中任一项的方法，其进一步包括达到至少80％DNA修饰效率。