CN115515559A

CN115515559A - 信使rna的直肠递送

Info

Publication number: CN115515559A
Application number: CN202080096344.0A
Authority: CN
Inventors: S·卡尔威; F·德罗莎; A·萨罗德
Original assignee: Translation Bio Co
Current assignee: Translation Bio Co
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2022-12-23
Also published as: AU2020408059A1; JP2023508882A; EP4076393A2; CA3162368A1; MX2022007756A; WO2021127394A2; IL294073A; KR20220142432A; CO2022010079A2; US20230051811A1; BR112022012085A2; WO2021127394A3

Abstract

本发明尤其提供了经由直肠递送来递送信使RNA(mRNA)的有效方法和组合物。本发明部分基于出人意料的观察，即尽管存在许多屏障，如RNA酶和粘膜层，但可以将mRNA经由直肠递送有效地递送至循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠。

Description

信使RNA的直肠递送

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月20日提交的美国序列号62/951,844的权益和优先权，将该文献的内容并入本文。

背景技术

将核酸(尤其是信使RNA(mRNA))递送至靶细胞和组织仍然是一项技术挑战。将mRNA递送至目的细胞会遇到各种困难，包括例如物理和化学屏障。使用肠胃外和口服递送途径等多种递送方法会遇到这些困难。直肠递送(rectal delivery)特别具有挑战性，至少部分原因在于直肠(rectum)和结肠的独特组成，如直肠中存在RNA酶。

发明内容

本发明尤其提供了经由直肠递送来递送信使RNA(mRNA)的有效方法和组合物。本发明部分基于令人惊讶的发现，即尽管存在许多屏障，如RNA酶和粘膜层，但可以将脂质封装的mRNA经由粘膜递送(包括直肠递送)有效地递送至循环、肝脏、肾脏、肠、结肠和/或直肠。

在一些方面，本发明提供了一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过直肠递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的循环中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的循环中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的循环中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的循环中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的循环中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的肾脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的肾脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的肾脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的肾脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的肾脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的结肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的结肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的结肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的结肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的结肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。I

在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中。因此，在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的循环中。在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的肝脏中。在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的肾脏中。在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的结肠中。在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生是在受试者的直肠中。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质以及一种或多种PEG修饰的脂质。因此，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含胆固醇。

在一些实施例中，直肠递送是通过栓剂、灌肠剂、导管或球形注射器进行的。因此，在一些实施例中，直肠递送是通过栓剂进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过灌肠剂进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过导管进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过球形注射器进行的。

在一些实施例中，直肠递送是通过栓剂进行的。

在一些实施例中，该组合物不包含基于脂质的栓剂组分。

在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。因此，在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可豆油。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成脂肪。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成碱。

在一些实施例中，该组合物包含渗透性增强剂。

在一些实施例中，渗透性增强剂选自胆盐、表面活性剂、脂肪酸和衍生物、甘油酯、螯合剂、水杨酸盐、或聚合物。因此，在一些实施例中，渗透性增强剂是胆盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是脂肪酸和衍生物。在一些实施例中，渗透性增强剂是甘油酯。在一些实施例中，渗透性增强剂是螯合剂。在一些实施例中，渗透性增强剂是水杨酸盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是聚合物。

在一些实施例中，脂肪酸和衍生物选自山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖、棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠或棕榈酰肉碱。因此，在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是山梨糖醇月桂酸酯。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括癸酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是蔗糖。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是棕榈酸酯。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是月桂酰胆碱。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是肉豆蔻酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是棕榈酰肉碱

在一些实施例中，渗透性增强剂是癸酸盐的形式。

在一些实施例中，基于癸酸盐的渗透性增强剂是癸酸钠。

在一些实施例中，渗透性增强剂是

在一些实施例中，该组合物包含基于水的栓剂组分。

在一些实施例中，基于水的栓剂组分选自甘油、明胶或聚乙二醇(PEG)、或其组合。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是甘油。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是明胶。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是聚乙二醇(PEG)。

在一些实施例中，该组合物进一步包含明胶。

在一些实施例中，唯一的基于水的栓剂组分是明胶。

在一些实施例中，该组合物包含在水中的约5％或更多的明胶、在水中的10％或更多的明胶、在水中的20％或更多的明胶、在水中的30％或更多的明胶、或在水中的50％或更多的明胶。因此，在一些实施例中，该组合物包含在水中的约5％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，该组合物包含约5％、6％、7％、8％或9％或更多的明胶。在一些实施例中，该组合物包含在水中的约10％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，该组合物包含在水中的约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％或更多的明胶。在一些实施例中，该组合物包含在水中的约20％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，该组合物包含在水中的约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％或更多的明胶。在一些实施例中，该组合物包含在水中的约30％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，该组合物包含在水中的约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、或49％或更多的明胶。在一些实施例中，该组合物包含在水中的约50％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，该组合物包含在水中的约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的明胶。

在一些实施例中，该组合物进一步包含0.25mg/mL或更高的mRNA、0.5mg/mL或更高的mRNA、0.75mg/mL或更高的mRNA、或1mg/mL或更高的mRNA。因此，在一些实施例中，该组合物进一步包含0.25mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.5mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.75mg/mL或更高的mRNA。

在一些实施例中，该组合物包含1mg/mL或更高的mRNA。

在一些实施例中，该组合物包含0.5mg或更高的mRNA、0.75mg或更高的mRNA、1mg或更高的mRNA、1.25mg或更高的mRNA、1.5mg或更高的mRNA、或1.75mg或更高的mRNA。因此，在一些实施例中，该组合物包含0.5mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.75mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.25mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.5mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.75mg或更高的mRNA。

在一些实施例中，该组合物配制成约3克、约2克、或约1克的栓剂。因此，在一些实施例中，该组合物配制成约3克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约2克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约1克的栓剂。

在一些实施例中，该组合物配制成体积为约2.0mL、约3.5mL、约7.5mL、或约10.0mL的栓剂。因此，在一些实施例中，该组合物配制成体积为约2.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约3.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约7.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约10.0mL的栓剂。

在一些实施例中，栓剂在施用前被冷藏。

在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前，首先对受试者施用渗透性增强剂。

在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约30分钟、约1小时、约2.5小时、约5小时、或约12小时向受试者施用渗透性增强剂。因此，在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约30分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约1小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约2.5小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约5.0小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约12小时向受试者施用渗透性增强剂。

在一些方面，本发明提供了一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过粘膜递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时可在该受试者中检测到该表达。在一些实施例中，该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约48小时可在该受试者中检测到该表达。在一些实施例中，该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约72小时可在该受试者中检测到该表达。在一些实施例中，该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约96小时可在该受试者中检测到该表达。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到该mRNA。因此，在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的循环中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的循环中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的循环中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的循环中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的肝脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的肝脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的肝脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的肝脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的肾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的肾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的肾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的肾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的结肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的结肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的结肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的结肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的直肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的直肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的直肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的直肠中检测到该mRNA。

在一些实施例中，粘膜递送是直肠的、阴道的、眼的、口服的或胃肠的。因此，在一些实施例中，粘膜递送是直肠的。在一些实施例中，粘膜递送是阴道的。在一些实施例中，粘膜递送是眼的。在一些实施例中，粘膜递送是口服的。在一些实施例中，粘膜递送是胃肠的。

在一些实施例中，口服递送是颊的或舌下的。因此，在一些实施例中，口服递送是颊的。在一些实施例中，口服递送是舌下的。

在一些方面，本发明提供了一种用于直肠施用mRNA的栓剂，该栓剂包含：封装在脂质纳米颗粒内的mRNA，其中该mRNA编码蛋白质或肽；和明胶。

在一些实施例中，栓剂包含在水中的约5％或更多的明胶、在水中的10％或更多的明胶、在水中的20％或更多的明胶、在水中的30％或更多的明胶、或在水中的50％或更多的明胶。因此，在一些实施例中，栓剂包含在水中的约5％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，栓剂包含约5％、6％、7％、8％或9％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约10％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，栓剂包含在水中的约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％或19％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约20％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，栓剂包含在水中的约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％或29％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约30％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，栓剂包含在水中的约30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、或49％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约50％或更多的明胶。例如，在一些实施例中，栓剂包含在水中的约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的明胶。

在一些实施例中，栓剂不包含基于脂质的栓剂组分。

在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。因此，在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可豆油。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成脂肪。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成碱。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基、或其任何组合。

在一些实施例中，栓剂包含渗透性增强剂。

在一些实施例中，栓剂包含渗透性增强剂，该渗透性增强剂选自胆盐、表面活性剂、脂肪酸和衍生物、甘油酯、螯合剂、水杨酸盐、或聚合物。因此，在一些实施例中，渗透性增强剂是胆盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是脂肪酸和衍生物。在一些实施例中，渗透性增强剂是甘油酯。在一些实施例中，渗透性增强剂是螯合剂。在一些实施例中，渗透性增强剂是水杨酸盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是聚合物。

在一些实施例中，栓剂包含脂肪酸和衍生物，这些脂肪酸和衍生物选自山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖、棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠或棕榈酰肉碱。因此，在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括癸酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是蔗糖。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是棕榈酸酯。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是月桂酰胆碱。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是肉豆蔻酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是棕榈酰肉碱

在一些实施例中，栓剂包含渗透性增强剂，该渗透性增强剂是癸酸盐的形式。

在一些实施例中，基于癸酸盐的渗透性增强剂是癸酸钠。

在一些实施例中，渗透性增强剂是

在一些实施例中，栓剂进一步包含甘油和/或PEG。因此，在一些实施例中，栓剂进一步包含甘油。在一些实施例中，栓剂进一步包含PEG。

在一些实施例中，栓剂在约36℃至37℃软化或融化。因此，在一些实施例中，栓剂在约36.0℃、36.1℃、36.2℃、36.3℃、36.4℃、36.5℃、36.6℃、36.7℃、36.8℃、36.9℃、或37.0℃软化。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在受试者的肝脏中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

附图说明

下面的图仅用于说明目的，并非用于限制。

图1描绘了包含mRNA的示例性栓剂，该mRNA封装在脂质纳米颗粒内。栓剂可以经直肠递送。

图2A描绘了在直肠施用作为阴性对照的盐水24小时后小鼠的示例性成像。图2B描绘了在直肠施用作为阴性对照的盐水24小时后各个组织的示例性成像。当盐水经直肠施用时未检测到信号。

图3A描绘了在直肠施用FFLuc mRNA-LNP 24小时后小鼠的示例性成像。图3B描绘了在直肠施用FFLuc mRNA-LNP 24小时后各个组织的示例性成像。在小鼠中检测到荧光素酶活性的信号。结肠示出了强烈的发光。

图4描绘了在以0.2mg剂量(组1)或0.05mg剂量(组2)直肠施用FFLuc mRNA-LNP 24小时后小鼠的示例性成像。在施用mRNA-LNP之前，用癸酸钠对组2中的小鼠预先给药。

图5是在施用盐水(阴性对照)、0.2mg剂量的mRNA-LNP(组1)、或0.05mg剂量的mRNA-LNP和癸酸钠(组2)后24小时处针对小鼠检测到的发光的示例性图示。

图6A描绘了在直肠施用包含FFLuc mRNA-LNP的栓剂后24小时处小鼠的示例性成像。图6B描绘了在直肠施用栓剂24小时后小鼠各个组织的示例性成像。

图7是在施用组合物后x小时处在大鼠中检测到的血清中的hEPO蛋白的示例性图示。

定义

为了使本发明更容易理解，下面首先定义某些术语。以下术语和其他术语的额外定义在整个说明书中阐述。

术语“或更多”、“至少”、“多于”等，例如“至少一个/一种”理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000或比规定值更大。还包括任何更大的数字或介于两者之间的分数。

相反，术语“不超过”包括小于规定值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、和0个核苷酸。还包括任何更小的数字或介于两者之间的分数。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的人。在一些实施例中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施例中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施例中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼、昆虫和/或蠕虫。在一些实施例中，动物可以是转基因动物、遗传工程化动物和/或克隆。

大约或约：如本文所用，应用于一个或多个目的值的术语“大约”或“约”是指与规定的参考值相似的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”是指落入任一方向的(大于或小于)规定参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内的值的范围，除非另有说明或以其他方式从上下文中明显看出(除了这样的数字将超过可能值的100％的情况)。

包含：如本文所用，术语“包含(comprising)”或变体(如“包含(comprises或comprising)”)将理解为暗示包括规定的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

递送：如本文所用，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送。例如，mRNA的递送涵盖将mRNA递送至靶组织并且编码的蛋白质在该靶组织内表达并保留的情况(也称为“局部分布”或“局部递送”)。其他示例性情况包括这样一种情况，其中将mRNA递送至靶组织，并且编码的蛋白质被表达并分泌到患者的循环系统(例如，血清)中并且经全身分布并被其他组织吸收(也称为“全身分布”或“全身递送”)。在其他示例性情况中，mRNA被全身递送并在体内被多种细胞和组织吸收。在一些示例性情况中，该递送是静脉内的、肌内的或皮下的。

给药间隔：如本文所用，在用于治疗疾病的方法的上下文中，给药间隔是在有需要的受试者(哺乳动物)中以有效剂量的mRNA施用治疗性组合物(例如mRNA组合物)的频率，使得一个或多个与该疾病相关的症状减轻；或一个或多个与该疾病相关的生物标志物减少，至少持续该给药间隔的时间段。在本披露中，给药频率和给药间隔可以互换地使用。

功效：如本文所用，术语“功效”或语法等同物是指如与编码相关蛋白质或肽的mRNA的递送有关的生物学相关终点的改善。在一些实施例中，生物学终点是在施用后的某些时间点保护免受氯化铵激发。

封装：如本文所用，术语“封装”或其语法等同物是指将核酸分子局限在纳米颗粒内的过程。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指mRNA翻译成多肽、多个多肽(例如，抗体的重链或轻链)组装成完整的蛋白质(例如，抗体)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如，抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及它们的语法等同物互换地使用。

有效剂量：如本文所用，有效剂量是药物组合物中的mRNA的剂量，当根据本发明的方法向有需要的受试者(特此为哺乳动物受试者)施用时，该药物组合物在该受试者中有效地产生预期的结果，例如减轻与疾病相关的症状。

功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是呈以下形式的生物分子，其中它展现出表征它的特性和/或活性。

改善、增加、或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同物指示相对于基线测量值的值，该基线测量值如在启动本文所述的治疗之前在相同个体中的测量值、或在不存在本文所述的治疗下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量值。“对照受试者”是患有与正在治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与该正在治疗的受试者的年龄大致相同。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中(例如，在试管或反应容器中、在细胞培养物中等)而不是在多细胞生物内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物(如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞(相对于例如体外系统)内发生的事件。

脂质体：如本文所用，术语“脂质体”是指任何层状、多层或固体纳米颗粒囊泡。典型地，如本文所用的脂质体可以通过混合一种或多种脂质或通过混合一种或多种脂质和一种或多种聚合物来形成。在一些实施例中，适用于本发明的脂质体含有一种或多种阳离子脂质和任选的一种或多种非阳离子脂质、任选的一种或多种基于胆固醇的脂质、和/或任选的一种或多种PEG修饰的脂质。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一个多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖修饰的RNA和未修饰的RNA。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。mRNA可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并且任选地经纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如，在化学合成分子的情况下，mRNA可以包含核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖的类似物、具有骨架修饰的类似物等。除非另有说明，否则mRNA序列以5'至3'方向呈现。

N/P比率：如本文所用，术语“N/P比率”是指脂质纳米颗粒中阳离子脂质中带正电荷的分子单元相对于封装在该脂质纳米颗粒内的mRNA中带负电荷的分子单元的摩尔比率。照此，N/P比率典型地计算为脂质纳米颗粒中阳离子脂质中胺基团的摩尔相对于封装在该脂质纳米颗粒内的mRNA中的磷酸基团的摩尔的比率。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指并入或可以并入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，核酸是经由或可以经由磷酸二酯键并入多核苷酸链中的化合物和/或物质。在一些实施例中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施例中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即不具有磷酸二酯骨架的类似物。例如，本领域已知并且在骨架中具有肽键而非磷酸二酯键的所谓“肽核酸”被认为在本发明的范围内。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此呈简并版本和/或编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和/或RNA的核苷酸序列可以包括内含子。核酸可以从天然来源纯化，使用重组表达系统产生并且任选地经纯化、化学合成等。在适当的情况下，例如，在化学合成分子的情况下，核酸可以包含核苷类似物，如具有化学修饰的碱基或糖的类似物、具有骨架修饰的类似物等。除非另有说明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施例中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷、和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。在一些实施例中，本发明特别地涉及“未修饰的核酸”，意指未经化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。在一些实施例中，核苷酸T和U在序列描述中可互换地使用。

患者：如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指可以例如针对实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的向其施用提供的组合物的任何生物。典型的患者包括动物(例如，哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物、和/或人)。在特定的实施例中，患者是人。人包括出生前和出生后的形式。

多肽：如本文所用，“多肽”一般而言是通过肽键附接至彼此的至少两个氨基酸的串。在一些实施例中，多肽可以包括至少3-5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽键附接至其他氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽有时任选地包括能整合到多肽链中的“非天然”氨基酸或其他实体。

蛋白质：如本文所用，术语“治疗性蛋白”中的“蛋白”是指多肽(即，通过肽键连接至彼此的至少两个氨基酸的串)。蛋白质可以包括除氨基酸以外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)和/或可以以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可以是其特征部分。普通技术人员将理解，蛋白质有时可以包括例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式结合的多于一条的多肽链。多肽可以含有l-氨基酸、d-氨基酸、或两者，并且可以含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一者。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施例中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸、及其组合。术语“肽”通常用于指长度小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸、或小于10个氨基酸的多肽。在一些实施例中，蛋白质是抗体、抗体片段、其生物活性部分、和/或其特征部分。

全身分布或递送：如本文所用，术语“全身分布”、“全身递送”、或语法等同物是指影响整个身体或整个生物的递送或分布机制或方法。典型地，全身分布或递送是经由身体的循环系统(例如，血流)完成的。与“局部分布或递送”的定义相比。

受试者：如本文所用，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后的形式。在多个实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，其是指到医疗提供者处进行疾病诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中可与“个体”或“患者”互换地使用。受试者可以患有或易患疾病或障碍，但可以表现出或不表现出疾病或障碍的症状。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指展现出目的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象罕见(如果有的话)会完成和/或进行至完成或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”在本文中用于捕捉许多生物学和化学现象中固有的完成性的潜在缺乏。

靶组织：如本文所用，术语“靶组织”是指受待治疗疾病影响的任何组织。在一些实施例中，靶组织包括表现出与疾病相关的病理、症状或特征的那些组织。

治疗有效量：如本文所用，术语治疗剂的“治疗有效量”意指当向患有或易患疾病、障碍和/或病症的受试者施用时足以治疗、诊断、预防和/或延迟该疾病、障碍和/或病症的一个或多个症状的发作的量。本领域普通技术人员将理解，治疗有效量典型地经由包含至少一个单位剂量的给药方案施用。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treat、treatment、或treating)”是指用于部分或完全缓和、缓解、减轻、抑制、预防特定疾病、障碍和/或病症的一个或多个症状或特征，延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的任何方法。出于减少发展出与疾病相关的病理的风险的目的，可以向未展现出疾病迹象和/或仅展现出疾病早期迹象的受试者施用治疗。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的和本申请所属领域中常用的相同的含义；将这样的技术通过引用以其全文并入。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

具体实施方式

本发明尤其提供了经由粘膜途径(例如通过直肠递送)来向受试者递送信使RNA(mRNA)和/或其蛋白质或多肽产物的有效方法和组合物。本发明部分基于令人惊讶的发现，即尽管存在许多化学和物理屏障，但可以将mRNA和/或其蛋白质或多肽产物经由直肠递送有效地递送至受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠。

在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。

脂质封装的mRNA的粘膜递送

本发明提供了将mRNA递送至靶组织的多种方法。这些递送方法包括跨任何粘膜组织施用脂质封装的mRNA。例如，脂质封装的mRNA经由直肠、阴道、眼、口服、和/或胃肠途径递送。

在一些方面，本发明尤其提供了一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过粘膜递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，脂质封装的mRNA的粘膜递送经由直肠进行。

直肠递送

在一些实施例中，本发明提供了一种用于直肠递送编码目的蛋白质或肽的脂质封装的mRNA的方法。

直肠递送的优点包括易于施用，允许患者留在家庭环境中。直肠递送不需要住院环境和静脉内施用所需的无菌药物的特殊配制品。治疗性组合物可以经由栓剂、灌肠剂、球形注射器、和导管进行直肠施用。使用专门的直肠导管进行直肠施用可由临床医生在家中进行。可以将多种口服形式的药物压碎并悬浮在待经由直肠导管给予的水中。因此，直肠施用对婴儿和老年人尤其安全和方便，并且可用于厌恶针头或具有任何干扰药物通过消化道的消化道运动问题(如吞咽困难、肠梗阻、或肠阻塞)的患者。此外，与口服药物施用相比，经直肠施用的药物通常起效更快，生物利用度更高，并且更不容易出现恶心。经直肠施用的药物绕过了约三分之二的首过代谢，导致药物在患者循环系统中的改变更少并且浓度更高。然而，经由直肠途径递送mRNA极具挑战性。直肠区域(即，直肠和结肠)具有大量会立即降解mRNA的RNA酶。此外，直肠和/或结肠中的粘液层将充当吸收屏障。此外，粪便嵌塞可阻碍药物的直肠递送。

尽管存在这些挑战，但本文提供的方法允许经由直肠途径递送信使RNA(mRNA)。本发明部分基于令人惊讶的发现，即尽管存在许多屏障，如存在RNA酶、粘膜层和粪便嵌塞，但可以将脂质封装的mRNA经由直肠递送有效地递送至受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠。这样的非侵入性的递送途径出乎意料地提供了一种方便地递送脂质封装的治疗性组合物的有效方式。

本发明尤其提供了一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过直肠递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。该方法允许经由直肠途径递送脂质封装的mRNA，其导致由该mRNA编码的蛋白质或肽在受体受试者的各个组织中表达。例如，该方法允许由该mRNA编码的蛋白质或肽在受试者的肝脏、肾脏、循环、结肠或直肠中表达。

本文所述的方法适用于在家庭环境中施用脂质封装的mRNA。在一些实施例中，直肠递送是通过栓剂、灌肠剂、导管或球形注射器进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过栓剂进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过灌肠剂进行的。在一些实施例中，直肠递送是通过导管进行的。各种专用导管可以与本文披露的方法一起使用，例如，一种这样的专用导管是Macy Catheter。在一些实施例中，直肠递送是通过球形注射器进行的。

在一些实施例中，本发明的组合物被递送至受试者的各个靶组织。因此，本发明可用作促进所希望的蛋白质或肽的递送和/或由其编码的蛋白质或肽在靶组织处的产生的非侵入性手段。本文所述的方法和组合物可用于管理和治疗大量由分泌性和非分泌性蛋白质和/或酶缺陷引起的疾病。

在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在循环、肝脏、肾脏、结肠、直肠、心脏和/或脾脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在循环中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在肝脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在肾脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在结肠中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在直肠中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在心脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA导致在脾脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在循环、肝脏、肾脏、结肠、直肠、心脏、和/或脾脏中产生所希望的由该mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约120小时、约144小时或约168小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约12小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约18小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约24小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约36小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约60小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约120小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约144小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约168小时，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约1天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约2天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约3天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约4天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约5天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约7天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约8天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约9天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约10天，在受试者中产生由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在循环、肝脏、肾脏、结肠、直肠、心脏和/或脾脏中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。因此，在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在循环中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在肝脏中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在肾脏中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在结肠中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在直肠中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在心脏中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，脂质封装的mRNA的直肠递送导致在脾脏中检测到所希望的由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、约120小时、约144小时或约168小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约12小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约18小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约36小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约60小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约120小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约144小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约168小时可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约1天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约2天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约3天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约4天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约5天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约7天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约8天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约9天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约10天可在受试者中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时或约120小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约12小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约18小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约36小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约60小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约120小时可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，在施用后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约1天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约2天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约3天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约4天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约5天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约6天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约7天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约8天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约9天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。在一些实施例中，在施用后至少约10天可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到由mRNA编码的蛋白质或肽。

在一些实施例中，脂质封装的mRNA能够在直肠递送(例如，通过主动或被动方式完整移动)后转运至全身血液供应并随后到达不同的细胞或靶组织。

因此，在一些方面，本发明提供了一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过粘膜递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，蛋白质或肽的体内产生发生在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中。因此，在一些实施例中，直肠递送的、脂质封装的mRNA的体内产生发生在受试者的循环中。在一些实施例中，直肠递送的、脂质封装的mRNA的体内产生发生在受试者的肝脏中。在一些实施例中，直肠递送的、脂质封装的mRNA的体内产生发生在受试者的肾脏中。在一些实施例中，直肠递送的、脂质封装的mRNA的体内产生发生在受试者的结肠中。在一些实施例中，直肠递送的、脂质封装的mRNA的体内产生发生在受试者的直肠中。

在一些实施例中，可在受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠、直肠、心脏和/或脾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的循环中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的肝脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的肾脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的结肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的直肠中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的心脏中检测到该mRNA。在一些实施例中，可在受试者的脾脏中检测到该mRNA。

在一些实施例中，在施用后至少约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约60小时、约72小时、约96小时、或约120小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约6小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约12小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约18小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约24小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约36小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约48小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约60小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约72小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约96小时可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约120小时可在受试者中检测到该mRNA。

在一些实施例中，在施用后至少约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约1天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约2天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约3天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约4天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约5天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约6天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约7天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约8天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约9天可在受试者中检测到该mRNA。在一些实施例中，在施用后至少约10天可在受试者中检测到该mRNA。

配制品的组合物

本发明尤其提供了经由直肠递送来递送信使RNA(mRNA)的有效组合物。本文所述的组合物适用于经由粘膜组织(如经由直肠)递送mRNA。

在一些实施例中，该组合物包含mRNA，该mRNA编码蛋白质或肽、被封装在脂质纳米颗粒内。在一些实施例中，该组合物进一步包含栓剂组分。在一些实施例中，该组合物进一步包含渗透性增强剂。

栓剂

用于直肠或阴道(例如，经阴道)施用的组合物典型地是栓剂，该栓剂可以通过将组合物与合适的非刺激性赋形剂(如可可脂、聚合物、水凝胶、甘油、明胶、聚乙二醇或栓剂蜡)混合来制备，这些非刺激性赋形剂在环境温度下是固体但在体温下是液体并因此在直肠或阴道腔中融化并释放活性成分。使用的材料类型取决于栓剂的类型、药物的类型以及栓剂的储存条件。

本发明尤其提供了一种栓剂，该栓剂用于经由粘膜途径(如例如直肠、阴道、眼、口服和/或胃肠途径)有效递送封装在脂质纳米颗粒中的mRNA。在一些实施例中，脂质封装的mRNA经由直肠或阴道途径递送。本文所述的包含脂质纳米颗粒和mRNA的栓剂在室温下是固体并且一旦经直肠或阴道施用就会融化。栓剂一旦置于直肠或阴道中就熔化，这允许有效释放载有mRNA的脂质纳米颗粒。

在一些实施例中，栓剂在施用前被冷藏。

在一些实施例中，栓剂在约30℃至42℃软化或融化。在一些实施例中，栓剂在约32℃至40℃软化或融化。在一些实施例中，栓剂在约34℃至38℃软化或融化。在一些实施例中，栓剂在约36℃至37℃软化或融化。在一些实施例中，栓剂在约36℃软化或融化。在一些实施例中，栓剂在约37℃软化或融化。

在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在30分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在20分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在15分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在10分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在5分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在3分钟内软化或融化。在一些实施例中，一旦施用于受试者，栓剂在1分钟内软化或融化。

作为非限制性实例，用于直肠和/或阴道施用的配制品可以通过将药物与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该非刺激性赋形剂在常温下是固体但在直肠温度下是液体并因此将在直肠和/或阴道中融化以释放该药物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。

用于直肠或阴道施用的药物组合物可以包含至少一种非活性成分。任一种或没有一种使用的非活性成分可以是已获得美国食品药品管理局(FDA)的批准。用于在用于直肠或阴道施用的药物组合物中使用的非穷举性非活性成分列表包括甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟甲基纤维素、泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、改性淀粉、己二酸、变性的醇、尿囊素、无水乳糖、杏仁油peg-6酯、硫酸钡、蜂蜡、膨润土、苯甲酸、苯甲醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、乳酸钙、卡波姆934、卡波姆934p、纤维素、微晶、鲸蜡醇聚醚-20、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、棕榈酸鲸蜡酯、胆固醇、胆甾醇(choleth)、柠檬酸、柠檬酸一水合物、椰子油/氢化棕榈仁油甘油酯、交聚维酮、依地酸二钠、乙基纤维素、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(28％醋酸乙烯酯)、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物(9％醋酸乙烯酯)、脂肪醇、fd&c黄色5号、明胶、谷氨酸、dl-甘油、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、硬脂酸甘油酯、瓜尔豆胶、高密度聚乙烯、水凝胶聚合物、氢化棕榈油、羟丙甲纤维素2208(15000mpa.s)、羟丙甲纤维素、肉豆蔻酸异丙酯、乳酸、乳酸、dl-乳糖、乳糖一水合物、乳糖、含水羊毛脂、无水羊毛脂、卵磷脂、卵磷脂、大豆、轻质矿物油、硅酸铝镁、水合硅酸铝镁、硬脂酸镁、硬脂酸甲酯、对羟基苯甲酸甲酯、微晶蜡、矿物油、硝酸、辛基十二烷醇、花生油、peg 6-32硬脂酸酯/乙二醇硬脂酸酯、peg-100硬脂酸酯、peg-120甘油硬脂酸酯、peg-2硬脂酸酯、peg-5油酸酯、聚乙二醇7硬脂酸酯、白凡士林、醋酸苯汞、磷酸脂蛋白90g(phospholipon90g)、磷酸、哌嗪六水合物、二甲基乙烯基或二甲基羟基或三甲基封端的聚(二甲基硅氧烷/甲基乙烯基硅氧烷/甲基氢硅氧烷)、聚卡波非、聚酯、聚乙二醇1000、聚乙二醇3350、聚乙二醇400、聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚甘油-3油酸酯、聚甘油-4油酸酯、聚氧基棕榈酸酯、聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯60、聚山梨酸酯80、聚氨酯、钾明矾、氢氧化钾、聚维酮k29/32、聚维酮、promulgen d、丙二醇、丙二醇单棕榈硬脂酸酯、对羟基苯甲酸丙酯、顺式季铵盐-15、二氧化硅、胶体二氧化硅、硅酮、碳酸氢钠、柠檬酸钠、氢氧化钠、月桂基硫酸钠、焦亚硫酸钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸氢钠、山梨酸、山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨糖醇、山梨糖醇溶液、鲸蜡、2-乙基己酸亚锡、淀粉、预胶化淀粉1500、玉米淀粉、硬脂酰胺乙基二乙胺、硬脂酸、硬脂醇、酒石酸、dl-叔丁基对苯二酚、原硅酸四丙酯、三乙醇胺、尿素、氢化植物油、wecobee fs、白地蜡和白蜡。

在一些实施例中，在配制品中使用明胶水系统以使脂质纳米颗粒保持完整。明胶水溶液具有粘膜粘附性并可有助于栓剂与粘液接触。因此，明胶的存在将有助于载有mRNA的脂质纳米颗粒转运到全身循环中。此外，明胶溶液在室温下是凝胶，这反过来又防止了载有mRNA的纳米颗粒从直肠滴出。明胶在生理温度下进一步逐渐融化，使载有mRNA的脂质纳米颗粒能够与粘膜接触。

在一些实施例中，栓剂包含在水中的约1％或更多的明胶、在水中的3％或更多的明胶、在水中的5％或更多的明胶、在水中的10％或更多的明胶、在水中的15％或更多的明胶、在水中的20％或更多的明胶、在水中的30％或更多的明胶、在水中的40％或更多的明胶、在水中的50％或更多的明胶、在水中的60％或更多的明胶、在水中的70％或更多的明胶、在水中的80％或更多的明胶、在水中的90％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约1％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约3％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约5％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约10％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约15％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约20％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约30％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约40％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约50％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约60％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约70％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约80％或更多的明胶。在一些实施例中，栓剂包含在水中的约90％或更多的明胶。

在一些实施例中，栓剂不会不利地影响脂质纳米颗粒的完整性。

在一些实施例中，该组合物不包含基于脂质的栓剂组分。在一些实施例中，该组合物包含基于脂质的栓剂组分。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可脂。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是可可豆油。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成脂肪。在一些实施例中，基于脂质的栓剂组分是合成碱基。

在一些实施例中，该组合物包含基于水的栓剂组分。在一些实施例中，基于水的栓剂组分选自甘油、明胶或聚乙二醇(PEG)、或其组合。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是甘油。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是明胶。在一些实施例中，基于水的栓剂组分是聚乙二醇(PEG)。在一些实施例中，唯一的基于水的栓剂组分是明胶。

在一些实施例中，栓剂包含甘油和/或PEG。在一些实施例中，栓剂包含甘油。在一些实施例中，栓剂包含PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约10％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约8％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约6％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约4％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约2％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约1％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约0.1％的甘油。在一些实施例中，栓剂包含少于约10％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约8％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约6％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约4％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约2％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约1％的PEG。在一些实施例中，栓剂包含少于约0.1％的PEG。

在一些实施例中，栓剂进一步包含丙三醇。在一些实施例中，存在于栓剂中的丙三醇的量不会破坏脂质纳米颗粒。在一些实施例中，栓剂不包含丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约30％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约20％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约15％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约10％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约8％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约6％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约4％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约2％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约1％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约0.5％的丙三醇。在一些实施例中，栓剂包含少于约0.1％的丙三醇。

本发明尤其提供了一种用于直肠施用mRNA的栓剂。在一些实施例中，栓剂包含封装在脂质纳米颗粒内的mRNA，其中该mRNA编码蛋白质或肽和明胶。

本文所述的栓剂经配制以容纳各种浓度的mRNA，其大小允许经由直肠或阴道递送的方便且非侵入性的施用。这样的非侵入性的递送途径出乎意料地提供了一种方便地递送治疗性组合物的有效方式。

在一些实施例中，该组合物包含0.25mg/mL或更高的mRNA、0.5mg/mL或更高的mRNA、0.75mg/mL或更高的mRNA、或1mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，组合物包含0.1mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，组合物包含0.25mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.5mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.75mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，组合物包含2mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含2.5mg/mL或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含5mg/mL或更高的mRNA。

在一些实施例中，该组合物包含0.5mg或更高的mRNA、0.75mg或更高的mRNA、1mg或更高的mRNA、1.25mg或更高的mRNA、1.5mg或更高的mRNA、或1.75mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.1mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.25mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.5mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含0.75mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.25mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.5mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含1.75mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含2mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含2.5mg或更高的mRNA。在一些实施例中，该组合物包含5mg或更高的mRNA。

在一些实施例中，该组合物配制成约3克、约2克、或约1克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约20克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约10克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约5克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约3克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约2克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约1克的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成约0.5克的栓剂。

在一些实施例中，该组合物配制成体积为约2.0mL、约3.5mL、约7.5mL、或约10.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约1.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约2.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约2.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约3.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约3.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约4.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约5.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约7.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约10.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约12.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约15.0mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约17.5mL的栓剂。在一些实施例中，该组合物配制成体积为约20.0mL的栓剂。

渗透性增强剂

为了改善跨粘膜途径(例如，直肠、阴道、眼、口服或胃肠)吸收差的药物的生物利用度，已使用渗透或渗透性增强剂。在针对直肠或阴道施用的一些实施例中，栓剂进一步包含渗透性增强剂。在一些实施例中，栓剂不包含渗透性增强剂。在一些实施例中，渗透性增强剂不会不利地影响脂质纳米颗粒的完整性。

在一些实施例中，渗透性增强剂选自胆盐、表面活性剂、脂肪酸和衍生物、甘油酯、螯合剂、水杨酸盐、或聚合物。在一些实施例中，渗透性增强剂是胆盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是脂肪酸及其衍生物。在一些实施例中，渗透性增强剂是甘油酯。在一些实施例中，渗透性增强剂是螯合剂。在一些实施例中，渗透性增强剂是水杨酸盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是聚合物。

在一些实施例中，脂肪酸和衍生物选自山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖、棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠或棕榈酰肉碱。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括山梨糖醇月桂酸酯。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括癸酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物是蔗糖。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括棕榈酸酯。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括月桂酰胆碱。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括肉豆蔻酸钠。在一些实施例中，脂肪酸和衍生物包括棕榈酰肉碱。

在一些实施例中，渗透性增强剂是癸酸盐的形式。在一些实施例中，基于癸酸盐的渗透性增强剂是癸酸钠。

在一些实施例中，渗透性增强剂包括胆酸盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是柠檬酸。在一些实施例中，渗透性增强剂是乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施例中，渗透性增强剂是油酸。在一些实施例中，渗透性增强剂是癸酸盐。在一些实施例中，渗透性增强剂是表面活性剂。在一些实施例中，渗透性增强剂是十二烷基硫酸钠(SDS)。在一些实施例中，渗透性增强剂是

在一些实施例中，渗透性增强剂是

80。在一些实施例中，渗透性增强剂是

在一些实施例中，渗透性增强剂是自微乳化药物递送系统(SMEDDS)。在一些实施例中，渗透性增强剂是天然生物增强剂。在一些实施例中，渗透性增强剂是大蒜素。在一些实施例中，渗透性增强剂是胡椒碱。在一些实施例中，渗透性增强剂是姜黄素。在一些实施例中，渗透性增强剂是槲皮素。

已经设计了脂质封装的mRNA组合物的几种不同配制品以促进向受试者的递送，包括在施用包含mRNA的组合物之前施用渗透性增强剂。施用渗透性增强剂促进载有mRNA的脂质纳米颗粒从结肠转移至全身循环。

在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前，首先对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约30分钟、约1小时、约2.5小时、约5小时、或约12小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约1分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约3分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约5分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约10分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约15分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约20分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约25分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约30分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约45分钟向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约1小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约1.5小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约2小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约2.5小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约5小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约12小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约18小时向受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物之前约24小时向受试者施用渗透性增强剂。

在一些实施例中，向受试者同时施用渗透性增强剂和包含mRNA的组合物。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约5分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约10分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约15分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约20分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约30分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约45分钟，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约1小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约2小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约2.5小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约5小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约12小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约18小时，对受试者施用渗透性增强剂。在一些实施例中，在施用包含mRNA的组合物后约24小时，对受试者施用渗透性增强剂。

mRNA合成

根据本发明的mRNA可以根据各种已知方法中的任一种来合成。各种方法在已公布的美国申请号US 2018/0258423中进行了描述，并且可以用于实施本发明，所有这些都通过引用并入本文。例如，根据本发明的mRNA可以经由体外转录(IVT)合成。简言之，IVT典型地用以下进行：含有启动子的线性或环状DNA模板、核糖核苷酸三磷酸的池、可包括DTT和镁离子的缓冲系统、以及适当的RNA聚合酶(例如T3、T7或SP6 RNA聚合酶)、DNA酶I、焦磷酸酶、和/或RNA酶抑制剂。确切的条件将根据特定应用而变化。

在一些实施例中，合适的mRNA序列是编码蛋白质或肽的mRNA序列。在一些实施例中，合适的mRNA序列经密码子优化以高效表达人细胞。在一些实施例中，合适的mRNA序列是天然存在的或野生型序列。在一些实施例中，合适的mRNA序列编码蛋白质或肽，该蛋白质或肽含有在氨基酸序列中的一个或多个突变。

本发明可用于递送多种长度的mRNA。在一些实施例中，本发明可用于递送长度为以下或大于以下的体外合成的mRNA：约0.5kb、1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb 6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb、20kb、30kb、40kb、或50kb。在一些实施例中，本发明可用于递送长度为以下范围的体外合成的mRNA：约1-20kb、约1-15kb、约1-10kb、约5-20kb、约5-15kb、约5-12kb、约5-10kb、约8-20kb、或约8-50kb。

在一些实施例中，为了制备根据本发明的mRNA，将DNA模板在体外转录。合适的DNA模板典型地具有用于体外转录的启动子，例如T3、T7或SP6启动子，随后是针对所希望的mRNA的所希望的核苷酸序列和终止信号。

核苷酸

根据本发明，可以使用各种天然存在的或修饰的核苷来产生mRNA。在一些实施例中，mRNA是或包含天然存在的核苷(或未修饰的核苷酸；例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷、假尿苷(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷、和2-硫代胞苷)；化学修饰的碱基；生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯和5'-N-亚磷酰胺连接)。

在一些实施例中，合适的mRNA可以含有骨架修饰、糖修饰和/或碱基修饰。例如，修饰的核苷酸可以包括但不限于修饰的嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))以及修饰的核苷酸嘌呤和嘧啶的类似物或衍生物，如例如1-甲基-腺嘌呤、2-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基-腺嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、N6-异戊烯基-腺嘌呤、2-硫代-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤、2-甲基-鸟嘌呤、2,2-二甲基-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-(羧基羟甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-甲基-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基-假尿嘧啶、辫苷(queosine)、β-D-甘露糖基-辫苷、怀丁苷(wybutoxosine)、和磷酰胺、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。本领域技术人员例如从以下知道此类类似物的制备：美国专利号4,373,071、美国专利号4,401,796、美国专利号4,415,732、美国专利号4,458,066、美国专利号4,500,707、美国专利号4,668,777、美国专利号4,973,679、美国专利号5,047,524、美国专利号5,132,418、美国专利号5,153,319、美国专利号5,262,530和5,700,642，将这些文献的披露内容通过引用以其全文并入。

在一些实施例中，mRNA包含一个或多个非标准核苷酸残基。非标准核苷酸残基可包括例如5-甲基-胞苷(“5mC”)、假尿苷(“ψU”)和/或2-硫代-尿苷(“2sU”)。针对此类残基及它们掺入mRNA的讨论，参见例如美国专利号8,278,036或WO 2011/012316。mRNA可以是定义为以下的RNA，其中25％的U残基为2-硫代-尿苷且25％的C残基为5-甲基胞苷的RNA。针对使用RNA的教导披露于美国专利公开US 2012/0195936和国际公开WO 2011/012316，将这两个文献特此通过引用以其全文并入。非标准核苷酸残基的存在可以使mRNA比具有相同序列但仅含有标准残基的对照mRNA更稳定和/或免疫原性更低。在另外的实施例中，mRNA可以包含一个或多个非标准核苷酸残基，这些非标准核苷酸残基选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤胞嘧啶、以及这些修饰和其他核碱基修饰的组合。一些实施例可进一步包括对呋喃糖环或核碱基的额外的修饰。额外的修饰可以包括例如糖修饰或取代(例如，一个或多个2'-O-烷基修饰、锁核酸(LNA))。在一些实施例中，RNA可以与额外的多核苷酸和/或肽多核苷酸(PNA)复合或杂交。在糖修饰是2'-O-烷基修饰的一些实施例中，这样的修饰可以包括但不限于2'-脱氧-2'-氟修饰、2'-O-甲基修饰、2'-O-甲氧基乙基修饰和2'-脱氧修饰。在一些实施例中，这些修饰中的任一种修饰可以以单独或组合的形式存在于的0-100％的核苷酸中——例如，多于0％、1％、10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或100％的组成性核苷酸。

在一些实施例中，mRNA可以含有RNA骨架修饰。典型地，主链修饰是其中RNA中含有的核苷酸骨架的磷酸盐被化学修饰的修饰。示例性骨架修饰典型地包括但不限于来自由以下组成的组的修饰：甲基膦酸酯、甲基磷酰胺、磷酰胺、硫代磷酸酯(例如，胞苷5'-O-(1-硫代磷酸酯))、硼酸磷酸酯、带正电荷的胍基团等(这意指通过用其他阴离子、阳离子或中性基团替代磷酸二酯连接)。

在一些实施例中，mRNA可以含有糖修饰。典型的糖修饰是其含有的核苷酸的糖的化学修饰，包括但不限于选自由以下组成的组的糖修饰：2'-脱氧-2'-氟-寡核苷酸(2'-氟-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氟-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-脱氧-2'-脱氨-寡核糖核苷酸(2'-氨基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-氨基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)、2'-O-烷基寡核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-C-烷基寡核糖核苷酸(2'-O-甲基胞苷5'-三磷酸、2'-甲基尿苷5'-三磷酸)、2'-C-烷基寡核糖核苷酸、及其异构体(2'-芳胞苷(aracytidine)5'-三磷酸、2'-芳尿苷5'-三磷酸)、或叠氮基三磷酸(2'-叠氮基-2'-脱氧胞苷5'-三磷酸、2'-叠氮基-2'-脱氧尿苷5'-三磷酸)。

合成后加工

典型地，合成后可以添加5'帽和/或3'尾。帽的存在对于提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性很重要。“尾”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。

典型地如下添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基团，留下两个末端磷酸；然后经由鸟苷酸转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)添加到末端磷酸上，产生5'5'5三磷酸连接；然后通过甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮进行甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。额外的帽结构描述于公开的美国申请号US 2016/0032356和公开的美国申请号US 2018/0125989中，将这些文献通过引用并入本文。

典型地，尾结构包括聚(A)和/或聚(C)尾。mRNA的3'末端的聚A或聚C尾典型地分别包括至少50个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少250个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少350个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少450个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少650个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少700个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少750个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少800个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少850个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少900个腺苷或胞嘧啶核苷酸、至少950个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或至少1kb腺苷或胞嘧啶核苷酸。在一些实施例中，聚A或聚C尾可以分别是约10至800个腺苷或胞嘧啶核苷酸(例如，约10至200个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至300个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至400个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至500个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至550个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约50至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约100至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约150至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约200至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约250至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约300至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约350至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约400至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约450至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约500至600个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至150个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约10至100个腺苷或胞嘧啶核苷酸、约20至70个腺苷或胞嘧啶核苷酸、或约20至60个腺苷或胞嘧啶核苷酸)。在一些实施例中，尾结构包括具有本文所述的各种长度的聚(A)和聚(C)尾的组合。在一些实施例中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的腺苷核苷酸。在一些实施例中，尾结构包括至少50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的胞嘧啶核苷酸。

如本文所述，添加5'帽和/或3'尾有助于检测体外合成期间生成的流产性转录物(abortive transcript)，因为如果不加帽和/或加尾，那些过早流产的mRNA转录物的大小可能太小而无法检测到。因此，在一些实施例中，在测试mRNA的纯度(例如，mRNA中存在的流产性转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在一些实施例中，在如本文所述纯化mRNA之前将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。在其他实施例中，在如本文所述纯化mRNA之后将5'帽和/或3'尾添加至合成的mRNA。

根据本发明合成的mRNA无需进一步纯化即可使用。特别地，根据本发明合成的mRNA无需去除短聚物的步骤即可使用。在一些实施例中，可以进一步纯化根据本发明合成的mRNA。可以使用各种方法纯化根据本发明合成的mRNA。例如，可以使用离心、过滤和/或色谱法进行mRNA的纯化。在一些实施例中，合成的mRNA通过乙醇沉淀或过滤或色谱法、或凝胶纯化或任何其他合适的手段纯化。在一些实施例中，mRNA通过HPLC纯化。在一些实施例中，mRNA在本领域技术人员熟知的标准苯酚:氯仿:异戊醇溶液中提取。在一些实施例中，使用切向流过滤来纯化mRNA。合适的纯化方法包括描述于以下中的那些：公开的美国申请号US2016/0040154、公开的美国申请号US 2015/0376220、公开的美国申请号US 2018/0251755、公开的美国申请号US 2018/0251754、2018年11月8日提交的美国临时申请号62/757,612号、和2019年8月26日提交的美国临时申请号62/891,781，将所有这些文献通过本文引用并入并且可以用于实施本发明。

在一些实施例中，在加帽和加尾之前纯化mRNA。在一些实施例中，在加帽和加尾之后纯化mRNA。在一些实施例中，在加帽和加尾之前和之后均纯化mRNA。

在一些实施例中，在加帽和加尾之前或之后、或之前和之后通过离心纯化mRNA。

在一些实施例中，在加帽和加尾之前或之后、或之前和之后通过过滤纯化mRNA。

在一些实施例中，在加帽和加尾之前或之后、或之前和之后通过切向流过滤(TFF)来纯化mRNA。

在一些实施例中，在加帽和加尾之前或之后、或之前和之后通过色谱法纯化mRNA。

纯化的mRNA的表征

本文所述的mRNA组合物基本上无污染物，这些污染物包含短流产性RNA种类、长流产性RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残余质粒DNA、残余体外转录酶、残余溶剂和/或残余盐。

本文所述的mRNA组合物具有约60％至约100％的纯度。因此，在一些实施例中，纯化的mRNA具有约60％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约65％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约70％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约75％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约80％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约85％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约90％的纯度。

在一些实施例中，纯化的mRNA具有约91％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约92％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约93％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约94％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约95％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约96％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约97％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约98％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约99％的纯度。在一些实施例中，纯化的mRNA具有约100％的纯度。

在一些实施例中，本文所述的mRNA组合物具有小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、和/或小于0.1％的非全长mRNA杂质。这些杂质包括IVT污染物，例如蛋白质、酶、DNA模板、游离核苷酸、残余溶剂、残余盐、双链RNA(dsRNA)、过早流产的RNA序列(“短聚物”或“短流产性RNA种类”)、和/或长流产性RNA种类。在一些实施例中，纯化的mRNA基本上无加工酶。

在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约1pg/mg、少于约2pg/mg、少于约3pg/mg、少于约4pg/mg、少于约5pg/mg、少于约6pg/mg、少于约7pg/mg、少于约8pg/mg、少于约9pg/mg、少于约10pg/mg、少于约11pg/mg、或少于约12pg/mg。因此，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约1pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约2pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约3pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约4pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约5pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约6pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约7pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约8pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约9pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约10pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约11pg/mg。在一些实施例中，纯化的mRNA中的残余质粒DNA少于约12pg/mg。

在一些实施例中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上所有过早流产的RNA序列(也称为“短聚物”)。在一些实施例中，mRNA组合物基本上无过早流产的RNA序列。在一些实施例中，mRNA组合物含有少于约5％(例如，少于约4％、3％、2％、或1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施例中，mRNA组合物含有少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％)的过早流产的RNA序列。在一些实施例中，如通过例如高效液相色谱(HPLC)(例如，肩峰或分离峰)、溴化乙锭、考马斯染色、毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳(例如，存在分离的较低条带)确定的，mRNA组合物检测不到过早流产的RNA序列)。如本文所用，术语“短聚物”、“短流产性RNA种类”、“过早流产的RNA序列”或“长流产性RNA种类”是指小于全长的任何转录物。在一些实施例中，“短聚物”、“短流产性RNA种类”或“过早流产的RNA序列”的长度小于100个核苷酸，长度小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、长度小于40、小于30、小于20、或小于10个核苷酸。在一些实施例中，在添加5'-帽和/或3'-聚A尾后检测或量化短聚物。在一些实施例中，过早流产的RNA转录物包含少于15个碱基(例如，少于14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、或3个碱基)。在一些实施例中，过早流产的RNA转录物含有约8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、或8-10个碱基。

在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA基本上无用于体外合成的酶试剂，这些酶试剂包括但不限于T7 RNA聚合酶、DNA酶I、焦磷酸酶、和/或RNA酶抑制剂。在一些实施例中，根据本发明的纯化的mRNA含有少于约5％(例如，少于约4％、3％、2％、或1％)的用于体外合成的酶试剂。在一些实施例中，纯化的mRNA含有少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、或0.1％)的用于体外合成的酶试剂。在一些实施例中，包括如通过例如银染、凝胶电泳、高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UPLC)、和/或毛细管电泳、溴化乙锭和/或考马斯染色确定的，纯化的mRNA含有检测不到的用于体外合成的酶试剂。

在多个实施例中，本发明的纯化的mRNA保持高度的完整性。如本文所用，术语“mRNA完整性”通常是指纯化后mRNA的质量。可以使用本领域熟知的方法，例如通过RNA琼脂糖凝胶电泳来确定mRNA完整性。在一些实施例中，mRNA完整性可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳的条带模式来确定。在一些实施例中，与RNA琼脂糖凝胶电泳的参考条带相比，本发明的纯化的mRNA显示很少的条带或没有显示条带。在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA具有大于约95％(例如，大于约96％、97％、98％、99％或更多)的完整性。在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA具有大于98％的完整性。在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA具有大于99％的完整性。在一些实施例中，本发明的纯化的mRNA具有大约100％的完整性。

在一些实施例中，评估纯化的mRNA的以下一个或多个特征：外观、身份、数量、浓度、杂质的存在、微生物评估、pH水平和活性。在一些实施例中，可接受的外观包括澄清、无色的溶液，基本上无可见的颗粒。在一些实施例中，mRNA的身份通过测序方法评估。在一些实施例中，浓度通过合适的方法(如UV分光光度法)评估。在一些实施例中，合适的浓度为约90％至110％标称值(0.9-1.1mg/mL)。

在一些实施例中，评估mRNA的纯度包括评估mRNA完整性、评估残余质粒DNA、和评估残余溶剂。在一些实施例中，可接受的mRNA完整性的水平通过琼脂糖凝胶电泳评估。分析凝胶以确定条带模式和表观核苷酸长度是否与分析性参考标准一致。评估RNA的完整性的额外的方法包括例如使用毛细管凝胶电泳(CGE)评估纯化的mRNA。在一些实施例中，由CGE确定的纯化的mRNA的可接受纯度是纯化的mRNA组合物具有不大于约55％的长流产性/降解种类。在一些实施例中，残余质粒DNA通过本领域的方法(例如通过使用qPCR)评估。在一些实施例中，小于10pg/mg(例如，小于10pg/mg、小于9pg/mg、小于8pg/mg、小于7pg/mg、小于6pg/mg、小于5pg/mg、小于4pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg、或小于1pg/mg)是可接受的残余质粒DNA水平。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过10,000ppm、9,000ppm、8,000ppm、7,000ppm、6,000ppm、5,000ppm、4,000ppm、3,000ppm、2,000ppm、1,000ppm。因此，在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过10,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过9,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过8,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过7,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过6,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过5,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过4,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过3,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过2,000ppm。在一些实施例中，可接受的残余溶剂水平不超过1,000ppm。

在一些实施例中，对纯化的mRNA进行微生物测试，包括例如评估细菌内毒素。在一些实施例中，细菌内毒素为<0.5EU/mL、<0.4EU/mL、<0.3EU/mL、<0.2EU/mL或<0.1EU/mL。因此，在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.5EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.4EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.3EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.2EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA中的细菌内毒素为<0.1EU/mL。在一些实施例中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL、1CFU/25mL、1CFU/50mL、1CFU/75mL、或不超过1CFU/100mL。因此，在一些实施例中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL。在一些实施例中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/25mL。在一些实施例中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/50mL。在一些实施例中，纯化的mRNA具有不超过1CFR/75mL。在一些实施例中，纯化的mRNA具有1CFU/100mL。

在一些实施例中，评估了纯化的mRNA的pH。在一些实施例中，纯化的mRNA的可接受pH为5至8。因此，在一些实施例中，纯化的mRNA的pH为约5。在一些实施例中，纯化的mRNA的pH为约6。在一些实施例中，纯化的mRNA的pH为约7。在一些实施例中，纯化的mRNA的pH为约7。在一些实施例中，纯化的mRNA的pH为约8。

在一些实施例中，评估了纯化的mRNA的翻译保真度。翻译保真度可以通过各种方法进行评估，并且包括例如转染和蛋白质印迹分析。纯化的mRNA的可接受特征包括蛋白质印迹上的条带模式，其迁移的分子量与参考标准相似。

在一些实施例中，评估了纯化的mRNA的导电性。在一些实施例中，纯化的mRNA的可接受特征包括导电性为参考标准的约50％至150％。

还评估了纯化的mRNA的帽百分比和聚A尾长度。在一些实施例中，可接受的帽百分比包括帽1，％面积：NLT90。在一些实施例中，可接受的聚A尾长度为约100-1500个核苷酸(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、和1000、1100、1200、1300、1400、或1500个核苷酸)。

在一些实施例中，还评估了纯化的mRNA的任何残余PEG。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于10ng PEG/mg纯化的mRNA至1000ng PEG/mg mRNA。因此，在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约10ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约100ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约250ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约500ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约750ng PEG/mg纯化的mRNA。在一些实施例中，纯化的mRNA具有少于约1000ng PEG/mg纯化的mRNA。

检测和量化mRNA纯度的各种方法是本领域已知的。例如，这样的方法包括印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染、光谱、紫外(UV)、或UPLC、或其组合。在一些实施例中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前，首先通过乙二醛染料使mRNA变性。在一些实施例中，在加帽或加尾之前表征合成的mRNA。在一些实施例中，在加帽和加尾之后表征合成的mRNA。

递送媒介物

根据本发明，如本文所述编码蛋白质或肽(例如，蛋白质或肽的全长、片段或部分)的mRNA或MCNA可以作为裸RNA(未包装)或经由递送媒介物递送。如本文所用，术语“递送媒介物”、“转移媒介物”、“纳米颗粒”或语法等同物可互换地使用。

递送媒介物可以与一种或多种额外的核酸、运载体、靶向配体或稳定化试剂组合配制，或配制在与合适的赋形剂混合的药理学组合物中。药物的配制和施用技术可见于最新版本的“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],”麦克出版公司(Mack Publishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)中。特定的递送载体基于其促进将核酸转染至靶细胞的能力来选择。

在一些实施例中，编码至少一个蛋白质或肽的mRNA或MCNA可以经由单个递送媒介物递送。在一些实施例中，编码至少一个蛋白质或肽的mRNA或MCNA可以经由一个或多个递送媒介物递送，每个递送媒介物具有不同的组成。在一些实施例中，一个或多个mRNA和/或MCNA被封装在相同的脂质纳米颗粒内。在一些实施例中，一个或多个mRNA被封装在分离的脂质纳米颗粒内。

根据多个实施例，合适的递送媒介物包括但不限于基于聚合物的运载体如聚乙烯亚胺(PEI)，脂质纳米颗粒和脂质体，纳米脂质体，含神经酰胺的纳米脂质体，蛋白脂质体，天然和合成衍生的外泌体，天然、合成和半合成层状体，纳米粒子，磷酸钙-二氧化硅纳米粒子，磷酸钙纳米粒子，二氧化硅纳米粒子，纳米晶体粒子，半导体纳米粒子，聚(D-精氨酸)，溶胶-凝胶，纳米树枝状聚合物(nanodendrimer)，基于淀粉的递送系统，胶束，乳液，非离子表面活性剂囊泡(niosomes)，多结构域嵌段聚合物(乙烯基聚合物、聚丙基丙烯酸聚合物、动态聚缀合物)，干粉配制品，质粒，病毒，磷酸钙核苷酸，适配体，肽和其他载体性标签。还考虑使用生物纳米胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装体作为合适的转移媒介物。(Hum.GeneTher.[人类基因疗法]2008年9月；19(9):887-95)。

脂质体递送媒介物

在一些实施例中，合适的递送媒介物是脂质体递送媒介物，例如脂质纳米颗粒。如本文所用，脂质体递送媒介物(例如脂质纳米颗粒)通常表征为具有内部水性空间的微观囊泡，该内部水性空间通过一个或多个双层的膜与外部介质隔离。脂质体的双层膜典型地由两亲性分子形成，如合成或天然来源的脂质，其包含空间上分离的亲水性和疏水性结构域(Lasic,Trends Biotechnol.[生物技术趋势],16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可以由两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合体、非离子表面活性剂囊泡等)形成。在本发明的上下文中，脂质体递送媒介物典型地用于将所希望的核酸(例如，mRNA或MCNA)转运至靶细胞或组织。在一些实施例中，纳米颗粒递送媒介物是脂质体。在一些实施例中，脂质体包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质、一种或多种基于胆固醇的脂质、或一种或多种PEG修饰的脂质。在一些实施例中，脂质体包含不超过三种不同的脂质组分。在一些实施例中，一种不同的脂质组分是基于甾醇的阳离子脂质。

阳离子脂质

如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选择的pH(如生理pH)下具有净正电荷的多种脂质种类中的任一种。

用于本发明的组合物和方法中的合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2010/144740中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基4-(二甲氨基)丁酸酯：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/149140中所述的可离子化的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式之一的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R₁和R₂各自独立地选自由以下组成的组：氢，任选取代的、可变饱和的或不饱和的C₁-C₂₀烷基和任选取代的、可变饱和的或不饱和的C₆-C₂₀酰基；其中L₁和L₂各自独立地选自由以下组成的组：氢、任选取代的C₁-C₃₀烷基、任选取代的可变不饱和的C₁-C₃₀烯基、和任选取代的C₁-C₃₀炔基；其中m和o各自独立地选自由零和任何正整数(例如，其中m是三)组成的组；并且其中n是零或任何正整数(例如，其中n是一)。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基)二十四碳-15,18-二烯-1-胺(“HGT5000”)：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-l-基)二十四碳-4,15,18-二烯-1-胺(“HGT5001”)：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基)二十四碳-5,15,18-三烯-1-胺(“HGT5002”)：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括在国际专利公开WO2010/053572中描述为氨基醇类脂质的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118725中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/118724中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括具有下式的阳离子脂质：14,25-双十三烷基15,18,21,24-四氮杂-三十八烷，及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2013/063468和WO 2016/205691中所述的阳离子脂质，将各文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中R^L的每个实例独立地为任选取代的C₆-C₄₀烯基。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/184256中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地为O或S；每个Y独立地为O或S；每个m独立地为0至20；每个n独立地为1至6；每个R_A独立地为氢、任选取代的C1-50烷基、任选取代的C2-50烯基、任选取代的C2-50炔基、任选取代的C3-10碳环基、任选取代的3-14元杂环基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个R_B独立地为氢、任选取代的C1-50烷基、任选取代的C2-50烯基、任选取代的C2-50炔基、任选取代的C3-10碳环基、任选取代的3-14元杂环基、任选取代的C6-14芳基、任选取代的5-14元杂芳基或卤素。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“靶23”：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2016/004202中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如美国临时专利申请序列号62/758,179中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中每个R¹和R²独立地为H或C₁-C₆脂肪族；每个m独立地为具有1至4的值的整数；每个A独立地为共价键或亚芳基；每个L¹独立地为酯、硫酯、二硫化物、或酸酐基团；每个L²独立地为C₂-C₁₀脂肪族；每个X¹独立地为H或OH；并且每个R³独立地为C₆-C₂₀脂肪族。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如J.McClellan,M.C.King,Cell[细胞]2010,141,210-217和Whitehead等人,Nature Communications[自然通讯](2014)5:4277中所述的阳离子脂质，将这些文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法中的阳离子脂质包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2015/199952中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/004143中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/075531中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

或其药学上可接受的盐，其中L¹或L²中的一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-、或-NR^aC(＝O)O-；并且L¹或L²中的另一者为-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)_x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NR^aC(＝O)-、-C(＝O)NR^a-、NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)NR^a-或-NR^aC(＝O)O-或直接键；G¹和G²各自独立地为未取代的C₁-C₁₂亚烷基或C₁-C₁₂亚烯基；G³为C₁-C₂₄亚烷基、C₁-C₂₄亚烯基、C₃-C₈环亚烷基、C₃-C₈环亚烯基；R^a为H或C₁-C₁₂烷基；R¹和R²各自独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³为H、OR⁵、CN、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵ C(＝O)R⁴；R⁴为C₁-C₁₂烷基；R⁵为H或C₁-C₆烷基；并且x为0、1或2。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/117528中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/049245中所述的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法中的阳离子脂质包括具有下式之一的化合物：

及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一个，R₄独立地选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)、和杂环；并且n为1、2或3。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2017/173054和WO 2015/095340中所述的阳离子脂质，将各文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际专利公开WO2012/170889中所述的可切割的阳离子脂质，将该文献通过引用并入本文。在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有下式的阳离子脂质：

其中R₁选自由以下组成的组：咪唑、胍鎓、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基，如二甲基氨基)和吡啶基；其中R₂选自由以下两个式之一组成的组：

并且其中R₃和R₄各自独立地选自由以下组成的组：任选取代的、可变饱和的或不饱和的C₆-C₂₀烷基和任选取代的、可变饱和的或不饱和的C₆-C₂₀酰基；并且其中n为零或任何正整数(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十个或更大)。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4001”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4002”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4003”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4004”：

及其药学上可接受的盐。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有以下化合物结构的阳离子脂质“HGT4005”：

及其药学上可接受的盐。

用于本发明的组合物和方法中的其他合适的阳离子脂质包括如国际申请号PCT/US 2019/032522中所述的可切割的阳离子脂质，并将该文献通过引用并入本文。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，该阳离子脂质是国际申请号PCT/US2019/032522中描述的任一通式或结构(1a)-(21a)和(1b)-(21b)以及(22)-(237)中的任一结构。在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括具有根据式(I’)的结构的阳离子脂质，

其中：

R^X独立地为-H、-L¹-R¹、或-L^5A-L^5B-B’；

L¹、L²、和L³中的每一个独立地为共价键、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)S-、或-C(O)NR^L-；

每个L^4A和L^5A独立地为-C(O)-、-C(O)O-、或-C(O)NR^L-；

每个L^4B和L^5B独立地为C₁-C₂₀亚烷基、C₂-C₂₀亚烯基、或C₂-C₂₀亚炔基；

每个B和B’为NR⁴R⁵或5至10元含氮杂芳基；

每个R¹、R²、和R³独立地为C₆-C₃₀烷基、C₆-C₃₀烯基、或C₆-C₃₀炔基；

每个R⁴和R⁵独立地为氢、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀亚烯基、或C₂-C₁₀炔基；并且

每个R^L独立地为氢、C₁-C₂₀烷基、C₂-C₂₀烯基、或C₂-C₂₀炔基。

在某些实施例中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质，该阳离子脂质是国际申请号PCT/US 2019/032522的化合物(139)，具有以下化合物结构：

(“18:1碳尾-核糖脂质”)。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法包括阳离子脂质N-[l-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTMA”)。(Feigner等人Proc.Nat’l Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]84,7413(1987)；美国专利号4,897,355，将文献通过引用并入本文)。适用于本发明的组合物和方法的其他合适的阳离子脂质包括例如，5-羧基精氨酰甘氨酸双十八烷基酰胺(“DOGS”)；2,3-二油基氧基-N-[2(精胺-甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-丙胺鎓(“DOSPA”)(Behr等人Proc.Nat.’l Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]86,6982(1989)，美国专利号5,171,678；美国专利号5,334,761)；l,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(“DODAP”)；l,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(“DOTAP”)。

适用于本发明的组合物和方法的额外的示例性阳离子脂质还包括：l,2-二硬脂基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DSDMA”)；1,2-二油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DODMA”)；1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLinDMA”)；l,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(“DLenDMA”)；N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)；3-二甲基氨基-2-(胆甾基-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-l-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(“CLinDMA”)；2-[5’-(胆甾基-5-烯-3-β-氧基)-3’-氧杂戊氧基)-3-二甲基l-l-(顺式,顺式-9’,l-2’-十八碳二烯氧基)丙烷(“CpLinDMA”)；N,N-二甲基-3,4-二油基氧基苄胺(“DMOBA”)；1,2-N,N’-二油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DOcarbDAP”)；2,3-二亚油基氧基-Ν,Ν-二甲基丙胺(“DLinDAP”)；l,2-N,N’-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLincarbDAP”)；l,2-二亚油基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(“DLinCDAP”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[l,3]-二氧杂环戊烷(“DLin-K-DMA”)；2-((8-[(3P)-胆甾基-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“Octyl-CLinDMA”)；(2R)-2-((8-[(3β)-胆甾基-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“Octyl-CLinDMA(2R)”)；(2S)-2-((8-[(3P)-胆甾基-5-烯-3-基氧基]辛基)氧基)-N,fsl-二甲基3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙烷-1-胺(“Octyl-CLinDMA(2S)”)；2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[l,3]-二氧杂环戊烷(“DLin-K-XTC2-DMA”)；以及2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,l2-二烯-1-基)-l,3-二氧杂环戊烷-4-基)-N,N-二甲基乙胺(“DLin-KC2-DMA”)(参见WO 2010/042877，将该文献通过引用并入本文；Semple等人,Nature Biotech.[自然生物技术]28:172-176(2010))。(Heyes,J.等人,J ControlledRelease[控释杂志]107:276-287(2005)；Morrissey,DV.等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]23(8):1003-1007(2005)；国际专利公开WO 2005/121348)。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质包含咪唑、二烷基氨基或胍鎓部分中的至少一者。

在一些实施例中，适用于本发明的组合物和方法的一种或多种阳离子脂质包括2,2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1,3]-二氧杂环戊烷(“XTC”)；(3aR,5s,6aS)-N,N-二甲基-2,2-二((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)四氢-3aH-环戊[d][1,3]二氧戊环-5-胺(“ALNY-100”)和/或4,7,13-三(3-氧代-3-(十一烷基氨基)丙基)-N1,N16-双十一烷基-4,7,10,13-四氮杂十六烷-1,16-二酰胺(“NC98-5”)。

在一些实施例中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，这些阳离子脂质占该组合物(例如脂质纳米颗粒)中总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％。在一些实施例中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，这些阳离子脂质占该组合物(例如脂质纳米颗粒)中总脂质含量的至少约5％、10％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、或70％。在一些实施例中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按重量测量，这些阳离子脂质占该组合物(例如脂质纳米颗粒)中总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％、或约35％-40％)。在一些实施例中，本发明的组合物包括一种或多种阳离子脂质，按mol％测量，这些阳离子脂质占该组合物(例如脂质纳米颗粒)中总脂质含量的约30％-70％(例如，约30％-65％、约30％-60％、约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％、或约35％-40％)。

非阳离子/辅助脂质

在一些实施例中，脂质体含有一种或多种非阳离子(“辅助”)脂质。如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性脂质、两亲离子脂质或阴离子脂质。如本文所用，短语“阴离子脂质”是指在选择的pH(如生理pH)下携带净负电荷的多种脂质种类中的任一种。非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰基油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰基-乙醇胺(DSPE)、磷脂酰丝氨酸、鞘脂、脑苷脂、神经节苷脂、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、或其混合物。

在一些实施例中，非阳离子脂质是中性脂质，即在配制和/或施用组合物的条件下不携带净电荷的脂质。

在一些实施例中，这样的非阳离子脂质可以单独使用，但优选地与其他脂质(例如，阳离子脂质)组合使用。

在一些实施例中，非阳离子脂质可以按以下摩尔比率(mol％)存在：组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％、或约10％至约40％。在一些实施例中，总非阳离子脂质可以按以下摩尔比率(mol％)存在：组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％、或约10％至约40％。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％、或大于约40mol％。在一些实施例中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％、或大于约40mol％。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％、或不超过约40mol％。在一些实施例中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％、或不超过约40mol％。

在一些实施例中，非阳离子脂质可以按以下重量比率(wt％)存在：组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％、或约10％至约40％。在一些实施例中，总非阳离子脂质可以按以下重量比率(wt％)存在：组合物中存在的总脂质的约5％至约90％、约5％至约70％、约5％至约50％、约5％至约40％、约5％至约30％、约10％至约70％、约10％至约50％、或约10％至约40％。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％、或大于约40wt％。在一些实施例中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％、或大于约40wt％。在一些实施例中，脂质体中非阳离子脂质的百分比为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％、或不超过约40wt％。在一些实施例中，脂质体中总非阳离子脂质的百分比可以为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％、或不超过约40wt％。

基于胆固醇的脂质

在一些实施例中，脂质体包含一种或多种基于胆固醇的脂质。例如，合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括例如DC-Choi(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺胆固醇)、l,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao等人Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理研究通讯]179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques[生物技术]23,139(1997)；美国专利号5,744,335)、或具有以下结构的咪唑胆固醇酯(ICE)：

在实施例中，基于胆固醇的脂质是胆固醇。

在一些实施例中，基于胆固醇的脂质可包含以下摩尔比率(mol％)：脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％、或约5％至约20％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于约5mol％、大于约10mol％、大于约20mol％、大于约30mol％、或大于约40mol％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为不超过约5mol％、不超过约10mol％、不超过约20mol％、不超过约30mol％、或不超过约40mol％。

在一些实施例中，基于胆固醇的脂质可以按以下重量比率(wt％)存在：脂质体中存在的总脂质的约1％至约30％、或约5％至约20％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为大于约5wt％、大于约10wt％、大于约20wt％、大于约30wt％、或大于约40wt％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒中基于胆固醇的脂质的百分比可以为不超过约5wt％、不超过约10wt％、不超过约20wt％、不超过约30wt％、或不超过约40wt％。

PEG修饰的脂质

在一些实施例中，脂质体包含一种或多种PEG化的脂质。

例如，本发明还考虑单独或优选地与包含转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)的其他脂质配制品一起组合使用聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生的脂质，如衍生的神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[丁二酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)。

考虑的PEG修饰的脂质包括但不限于与具有C₆-C₂₀长度的一条或多条烷基链的脂质共价附接的、长度长达5kDa的聚乙二醇链。在一些实施例中，PEG修饰的或PEG化的脂质是PEG化的胆固醇或PEG-2K。添加这样的组分可以防止复杂的聚集，并且还可以提供一种用于增加循环寿命和增强脂质-核酸组合物向靶组织递送的手段(Klibanov等人(1990)FEBSLetters[欧洲生化学会联合会快报],268(1):235-237)，或者可以选择它们以在体内快速换出配制品(参见美国专利号5,885,613)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C₁₄或C₁₈)的PEG-神经酰胺。

本发明的PEG修饰的磷脂和衍生的脂质可以包含以下摩尔比率：脂质体转移媒介物中存在的总脂质的约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％、或约2％。在一些实施例中，一种或多种PEG修饰的脂质按摩尔比率计占总脂质的约4％。在一些实施例中，一种或多种PEG修饰的脂质按摩尔比率计占总脂质的约5％。在一些实施例中，一种或多种PEG修饰的脂质按摩尔比率计占总脂质的约6％。

两亲性嵌段共聚物

在一些实施例中，合适的递送媒介物含有两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。

各种两亲性嵌段共聚物可用于实施本发明。在一些实施例中，两亲性嵌段共聚物也称为表面活性剂或非离子表面活性剂。

在一些实施例中，适用于本发明的两亲性聚合物选自泊洛沙姆

泊洛沙胺

聚乙二醇山梨糖醇烷基酯(聚山梨酯)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

泊洛沙姆

在一些实施例中，合适的两亲性聚合物是泊洛沙姆。例如，合适的泊洛沙姆具有以下结构：

其中a为10至150的整数，并且b为20至60的整数。例如，a为约12且b为约20，或a为约80且b为约27，或a为约64且b为约37，或a为约141且b为约44，或a为约101且b为约56。

在一些实施例中，适用于本发明的泊洛沙姆具有从约10至约150的环氧乙烷单元。在一些实施例中，泊洛沙姆具有从约10至约100的环氧乙烷单元。

在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆84。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆101。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆105。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆108。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆122。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆123。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆124。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆181。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆182。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆183。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆184。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆185。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆188。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆212。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆215。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆217。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆231。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆234。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆235。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆237。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆238。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆282。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆284。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆288。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆304。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆331。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆333。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆334。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆335。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆338。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆401。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆402。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆403。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是泊洛沙姆407。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆是其组合。

在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约4,000g/mol至约20,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约1,000g/mol至约50,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约1,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约2,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约3,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约4,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约5,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约6,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约7,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约8,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约9,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约10,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约20,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约25,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约30,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约40,000g/mol。在一些实施例中，合适的泊洛沙姆的平均分子量为约50,000g/mol。

其他两亲性聚合物

在一些实施例中，两亲性聚合物是泊洛沙胺，例如tetronic 304或tetronic 904。

在一些实施例中，两亲性聚合物是聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，如分子量为3kDa、10kDa、或29kDa的PVP。

在一些实施例中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、聚山梨酯、山梨糖醇、及其衍生物。在一些实施例中，两亲性聚合物是聚山梨酯，如PS 20。

在一些实施例中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚(Brij)、泊洛沙姆、聚山梨酯、山梨糖醇、或其衍生物。

在一些实施例中，两亲性聚合物是聚乙二醇醚。在一些实施例中，合适的聚乙二醇醚是具有式(S-l)的化合物：

或其盐或异构体，其中：

t为1至100的整数；

R^1BRIJ独立地为C_10-40烷基、C_10-40烯基、或C_10-40炔基；并且任选地，R^5PEG的一个或多个亚甲基基团独立地被以下替代：C_3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C_6-10亚芳基、4至10元杂亚芳基、-N(R^N)-、-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)N(R^N)-、-NR^NC(O)-、-NR C(O)N(R)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(R^N)-、-NR^NC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NR^N)-、—C(＝NR)N(R)—、-NRNC(＝NR^N)-、-NR^NC(＝NR^N)N(R^N)-、-C(S)-、-C(S)N(R^N)-、-NR^NC(S)-、-NR^NC(S)N(R^N)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)₂-、-S(O)₂O-、-OS(O)₂O-、-N(R^N)S(O)-、-S(O)N(R^N)-、-N(R^N)S(O)N(R^N)-、-OS(O)N(R^N)-、-N(R^N)S(O)0-、-S(O)₂-、-N(R^N)S(O)₂-、-S(O)₂N(R^N)-、-N(R^N)S(O)₂N(R^N)-、-OS(O)₂N(R^N)-或-N(R^N)S(O)₂O-；并且

R^N的每个实例独立地为氢、C_1-6烷基、或氮保护基团。

在一些实施例中，R^1BRIJ是C是烷基。例如，聚乙二醇醚是具有式(S-la)的化合物：

或其盐或异构体，其中s为1至100的整数。

在一些实施例中，R^1BRIJ是C是烯基。例如，合适的聚乙二醇醚是具有式(S-lb)的化合物：

或其盐或异构体，其中s为1至100的整数。

典型地，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以低于其临界胶束浓度(CMC)的量存在于配制品中。在一些实施例中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以比其CMC低约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、或约50％的量存在于混合物中。在一些实施例中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以比其CMC低约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％的量存在于混合物中。在一些实施例中，两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)以比其CMC低约55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、或95％的量存在于混合物中。

在一些实施例中，在去除后，仍剩余有小于约0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、或0.01％的原始量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)存在于配制品中。在一些实施例中，在去除后，残余量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)仍剩余在配制品中。如本文所用，残余量意指在去除组合物中的基本上所有物质(本文所述的两亲性聚合物，如泊洛沙姆)之后的剩余量。残余量可以使用已知的技术定性或定量地检测。使用已知的技术可能检测不到残余量。

在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于3％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于2.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于2％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于1.5％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于1％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于0.5％(例如，少于0.4％、0.3％、0.2％、0.1％)的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、或0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物包含少于0.01％的两亲性嵌段共聚物(例如，泊洛沙姆)。在一些实施例中，合适的递送媒介物含有残余量的两亲性聚合物(例如，泊洛沙姆)。如本文所用，残余量意指在去除组合物中的基本上所有物质(本文所述的两亲性聚合物，如泊洛沙姆)之后的剩余量。残余量可以使用已知的技术定性或定量地检测。使用已知的技术可能检测不到残余量。

聚合物

在一些实施例中，合适的递送媒介物使用聚合物作为运载体配制，该聚合物是单独的或与包括本文所述的各种脂质的其他运载体组合。因此，在一些实施例中，如本文所用的脂质体递送媒介物也涵盖包含聚合物的纳米颗粒。合适的聚合物可以包括例如聚丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原蛋白、壳聚糖、环糊精、鱼精蛋白、PEG化的鱼精蛋白、PLL、PEG化的PLL和聚乙烯亚胺(PEI)。当PEI存在时，它可以是分子量范围为10至40kDa的支链PEI，例如25kDa的支链PEI(西格玛公司(Sigma)编号408727)。

根据多个实施例，以下这些的选择基于所选择的一种或多种脂质的特征、预期的靶细胞的性质、待递送的核酸的特征：阳离子脂质、非阳离子脂质、PEG修饰的脂质、基于胆固醇的脂质、和/或两亲性嵌段共聚物(包含脂质纳米颗粒)，以及这样的组分(脂质)彼此的相对摩尔比率。额外的考虑包括例如，烷基链的饱和度以及所选择的一种或多种脂质的大小、电荷、pH、pKa、融合性和毒性。因此，可以相应地调整摩尔比。

不同的脂质组分的比率

用于本发明的合适的脂质体可以包括以下的一种或多种：各种比率的本文所述的阳离子脂质、非阳离子脂质、胆固醇脂质、PEG修饰的脂质、两亲性嵌段共聚物和/或聚合物中的任一者。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含五种且不超过五种不同的纳米颗粒组分。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含四种且不超过四种不同的纳米颗粒组分。在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含三种且不超过三种不同的纳米颗粒组分。作为非限制性实例，合适的脂质体配制品可以包括选自以下的组合：cKK-E12、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；C12-200、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；HGT4003、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；ICE、DOPE、胆固醇和DMG-PEG2K；或ICE、DOPE和DMG-PEG2K。

在多个实施例中，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE、和/或HGT4003)按摩尔比率计占脂质体的约30％-60％(例如，约30％-55％、约30％-50％、约30％-45％、约30％-40％、约35％-50％、约35％-45％、或约35％-40％)。在一些实施例中，按摩尔比率计，阳离子脂质(例如，cKK-E12、C12-200、ICE、和/或HGT4003)的百分比为或大于脂质体的约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％或约60％。

在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质比一种或多种非阳离子脂质比一种或多种基于胆固醇的脂质比一种或多种PEG修饰的脂质的比率可以分别为约30-60:25-35:20-30:1-15。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质比一种或多种非阳离子脂质比一种或多种基于胆固醇的脂质比一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:30:20:10。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质比一种或多种非阳离子脂质比一种或多种基于胆固醇的脂质比一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:30:25:5。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质比一种或多种非阳离子脂质比一种或多种基于胆固醇的脂质比一种或多种PEG修饰的脂质的比率分别为大约40:32:25:3。在一些实施例中，一种或多种阳离子脂质比一种或多种非阳离子脂质比一种或多种基于胆固醇的脂质比一种或多种PEG修饰的脂质的比率为大约50:25:20:5。

在脂质纳米颗粒包含三种和不超过三种不同的脂质组分的实施例中，总脂质含量的比率(即，脂质组分(1):脂质组分(2):脂质组分(3)的比率)可以表示为x:y:z，其中

(y+z)＝100-x。

在一些实施例中，“x”、“y”和“z”中的每一个表示脂质的三种不同组分的摩尔百分比，并且该比率是摩尔比率。

在一些实施例中，“x”、“y”和“z”中的每一个表示脂质的三种不同组分的重量百分比，并且该比率是重量比率。

在一些实施例中，由变量“x”表示的脂质组分(1)是基于甾醇的阳离子脂质。

在一些实施例中，由变量“y”表示的脂质组分(2)是辅助脂质。

在一些实施例中，由变量“z”表示的脂质组分(3)是PEG脂质。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％、或约10％。在实施例中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的摩尔百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施例中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为不超过约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约40％、约30％、约20％、或约10％。在实施例中，变量“x”不超过约65％、约60％、约55％、约50％、约40％。

在一些实施例中，表示脂质组分(1)(例如，基于甾醇的阳离子脂质)的重量百分比的变量“x”为：至少约50％但小于约95％；至少约50％但小于约90％；至少约50％但小于约85％；至少约50％但小于约80％；至少约50％但小于约75％；至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。在实施例中，变量“x”为至少约50％但小于约70％；至少约50％但小于约65％；或至少约50％但小于约60％。

在一些实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、或25％。在实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的摩尔百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％、或约5％至约10％。

在一些实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为不超过约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、或25％。在实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％。在实施例中，表示脂质组分(3)(例如，PEG脂质)的重量百分比的变量“z”为约1％至约10％、约2％至约10％、约3％至约10％、约4％至约10％、约1％至约7.5％、约2.5％至约10％、约2.5％至约7.5％、约2.5％至约5％、约5％至约7.5％、或约5％至约10％。

对于具有三种且仅三种不同的脂质组分的组合物，变量“x”、“y”和“z”可以是任何组合，只要这三个变量的总和为总脂质含量的100％。

封装mRNA的脂质体的形成

可通过本领域目前已知的各种技术来制备用于本发明组合物中的脂质体转移媒介物。例如，多层囊泡(MLV)可根据常规技术制备，如通过以下将所选择的脂质沉积在合适容器或器皿的内壁上：将该脂质溶解在适当的溶剂中，然后蒸发该溶剂以留下在器皿内侧的薄膜；或通过喷雾干燥。然后可以伴随涡旋运动将水相添加到器皿中，这导致MLV的形成。然后可以通过将多层囊泡匀浆、超声或挤出来形成单层囊泡(ULV)。此外，单层囊泡可通过洗涤剂去除技术形成。

各种方法描述于公开的美国申请号US 2011/0244026、公开的美国申请号US2016/0038432、公开的美国申请号US 2018/0153822、公开的美国申请号US 2018/0125989和2019年7月23日提交的美国临时申请号62/877,597，并且可用于实施本发明，将所有这些文献通过引用并入本文。如本文所用，工艺A是指如US 2016/0038432中所述，通过将mRNA与脂质的混合物混合来封装mRNA的常规方法，该方法不需要首先使脂质预形成为脂质纳米颗粒。如本文所用，工艺B是指如US 2018/0153822中所述，通过将预形成的脂质纳米颗粒与mRNA混合来封装信使RNA(mRNA)的工艺。

简言之，制备载有mRNA或MCNA的脂质脂质体的工艺包括以下步骤：将一种或多种溶液加热(即，从热源向溶液施加热)至大于环境温度的温度(或维持温度)，该一种多种溶液是包含预形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒封装的mRNA的混合溶液。在一些实施例中，该工艺包括以下步骤：在混合步骤之前，加热mRNA溶液和预形成的脂质纳米颗粒溶液中的一者或两者。在一些实施例中，该工艺包括在混合步骤期间，加热一种或多种包含预形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含mRNA的溶液和包含脂质纳米颗粒封装的mRNA的溶液中的一者或多者。在一些实施例中，该工艺包括以下步骤：在混合步骤之后，加热脂质纳米颗粒封装的mRNA。在一些实施例中，将一种或多种溶液加热到(或将一种或多种溶液维持在)以下温度或大于以下温度：约30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃。在一些实施例中，将一种或多种溶液加热到以下温度范围：约25℃-70℃、约30℃-70℃、约35℃-70℃、约40℃-70℃、约45℃-70℃、约50℃-70℃、或约60℃-70℃。在一些实施例中，将一种或多种溶液加热到大于环境温度的温度，该温度为约65℃。

可以使用各种方法制备适用于本发明的mRNA溶液。在一些实施例中，mRNA可以直接溶解在本文所述的缓冲溶液中。在一些实施例中，可以通过以下生成mRNA溶液：在与用于封装的脂质溶液混合之前，将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。在一些实施例中，可以通过以下生成mRNA溶液：在紧接与用于封装的脂质溶液混合之前，将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。在一些实施例中，合适的mRNA储备溶液可以含有以下浓度或大于以下浓度的在水中的mRNA：约0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、或1.6mg/ml、2.0mg/ml、2.5mg/ml、3.0mg/ml、3.5mg/ml、4.0mg/ml、4.5mg/ml、或5.0mg/ml。

在一些实施例中，使用泵将mRNA储备溶液与缓冲溶液混合。示例性泵包括但不限于齿轮泵、蠕动泵和离心泵。

典型地，缓冲溶液的混合速率大于mRNA储备溶液的混合速率。例如，缓冲溶液的混合速率可以比mRNA储备溶液的混合速率大至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍或20倍。在一些实施例中，将缓冲溶液在范围为约100-6000ml/分钟(例如，约100-300ml/分钟、300-600ml/分钟、600-1200ml/分钟、1200-2400ml/分钟、2400-3600ml/分钟、3600-4800ml/分钟、4800-6000ml/分钟、或60-420ml/分钟)的流速下混合。在一些实施例中，将缓冲溶液在以下流速或大于以下流速下混合：约60ml/分钟、100ml/分钟、140ml/分钟、180ml/分钟、220ml/分钟、260ml/分钟、300ml/分钟、340ml/分钟、380ml/分钟、420ml/分钟、480ml/分钟、540ml/分钟、600ml/分钟、1200ml/分钟、2400ml/分钟、3600ml/分钟、4800ml/分钟、或6000ml/分钟。

在一些实施例中，将mRNA储备溶液在范围为约10-600ml/分钟(例如，约5-50ml/分钟、约10-30ml/分钟、约30-60ml/分钟、约60-120ml/分钟、约120-240ml/分钟、约240-360ml/分钟、约360-480ml/分钟、或约480-600ml/分钟)的流速下混合。在一些实施例中，将mRNA储备溶液在以下流速或大于以下流速下混合：约5ml/分钟、10ml/分钟、15ml/分钟、20ml/分钟、25ml/分钟、30ml/分钟、35ml/分钟、40ml/分钟、45ml/分钟、50ml/分钟、60ml/分钟、80ml/分钟、100ml/分钟、200ml/分钟、300ml/分钟、400ml/分钟、500ml/分钟、或600ml/分钟。

根据本发明，脂质溶液含有适于形成用于封装mRNA的脂质纳米颗粒的脂质混合物。在一些实施例中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可含有溶解在纯乙醇(即，100％乙醇)中的所希望的脂质的混合物。在另一实施例中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一实施例中，合适的脂质溶液是基于二甲基亚砜的。在另一实施例中，合适的脂质溶液是合适溶剂的混合物，这些溶剂包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲基亚砜。

合适的脂质溶液可以含有各种浓度的所希望的脂质的混合物。例如，合适的脂质溶液可以含有总浓度为以下或大于以下的所希望的脂质的混合物：约0.1mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、3.0mg/ml、4.0mg/ml、5.0mg/ml、6.0mg/ml、7.0mg/ml、8.0mg/ml、9.0mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、或100mg/ml。在一些实施例中，合适的脂质溶液可以含有以下总浓度范围的所希望的脂质的混合物：约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml、或1.0-5mg/ml。在一些实施例中，合适的脂质溶液可以含有总浓度高达约100mg/ml、90mg/ml、80mg/ml、70mg/ml、60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、或10mg/ml的所希望的脂质的混合物。

可以以适用于封装mRNA的任何比率混合任何所希望的脂质。在一些实施例中，合适的脂质溶液含有所希望的脂质的混合物，这些脂质包括阳离子脂质、辅助脂质(例如非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)、两亲性嵌段共聚物(例如泊洛沙姆)和/或PEG化的脂质。在一些实施例中，合适的脂质溶液含有所希望的脂质的混合物，这些脂质包括一种或多种阳离子脂质、一种或多种辅助脂质(例如非阳离子脂质和/或胆固醇脂质)和一种或多种PEG化的脂质。

在某些实施例中，提供的组合物包含脂质体，其中mRNA结合在该脂质体的表面上并封装在相同的脂质体内。例如，在制备本发明的组合物期间，阳离子脂质体可以通过静电相互作用与mRNA或MCNA结合。

在一些实施例中，本发明的组合物和方法包含封装在脂质体中的mRNA。在一些实施例中，可将一个或多个mRNA种类封装在相同的脂质体中。在一些实施例中，可将一个或多个mRNA种类封装在不同的脂质体中。在一些实施例中，将mRNA封装在一个或多个脂质体中，这些脂质体的不同之处在于它们的脂质组成、脂质组分的摩尔比率、大小、电荷(ζ电位)、靶向配体、和/或其组合。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有以下的不同组成：基于甾醇的阳离子脂质、中性脂质、PEG修饰的脂质，和/或其组合。在一些实施例中，一种或多种脂质体可具有以下的不同摩尔比率：用于产生脂质体的基于胆固醇的阳离子脂质、中性脂质、和PEG修饰的脂质。

将所希望的核酸(例如，mRNA或MCNA)并入脂质体的过程通常称为“加载”。示例性方法描述于Lasic等人FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报],312:255-258,1992，将该文献通过引用并入本文。并入脂质体的核酸可以完全或部分位于脂质体的内部空间、脂质体的双层膜内、或与脂质体膜的外表面结合。将核酸并入脂质体在本文中也称为“封装”，其中核酸完全包含在脂质体的内部空间内。将mRNA并入转移媒介物(如脂质体)的目的通常是保护核酸免受环境的影响，该环境可能含有降解核酸的酶或化学物质和/或导致核酸快速排泄的系统或受体。因此，在一些实施例中，合适的递送媒介物能够增强其中含有的mRNA的稳定性和/或促进治疗(例如，mRNA或MCNA)向靶细胞或组织的递送。

根据本发明的合适的脂质体可以制成各种大小。在一些实施例中，提供的脂质体可以制成比先前已知的脂质体更小。在一些实施例中，减小的脂质体大小与更高效地递送治疗剂(例如，mRNA或MCNA)相关。合适的脂质体大小的选择可以考虑靶细胞或组织的部位，并在一定程度上考虑正在制备的脂质体的应用。

在一些实施例中，选择适当大小的脂质体以促进由mRNA编码的抗体的全身分布。在一些实施例中，可能希望将mRNA的转染限制至某些细胞或组织。例如，为了靶向肝细胞，可以调整脂质体的大小，使其尺寸小于肝脏中衬于肝窦的内皮层的窗孔；在这样的情况下，脂质体可以很容易地穿透这样的内皮窗孔以到达靶肝细胞。

可替代地或额外地，可以调整脂质体的大小，使脂质体的尺寸具有足够的直径以限制或明确地避免分布到某些细胞或组织中。

本领域已知的多种可替代方法可用于调整脂质体群的大小。一种这样的调整大小的方法描述于美国专利号4,737,323中，将该文献通过引用并入本文。通过水浴或探针超声对脂质体悬浮液进行超声会导致大小逐渐减小至直径小于约0.05微米的小ULV。匀浆是依靠剪切能量使大脂质体片段化为较小脂质体的另一方法。在典型的匀浆程序中，将MLV通过标准乳液匀浆器再循环，直到观察到所选择的脂质体大小，典型地为约0.1至0.5微米。脂质体的大小可以通过如Bloomfield,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.[生物物理学和生物工程年度回顾],10:421-450(1981)中所述的准电光散射(QELS)来确定，将该文献通过引用并入本文。可通过对形成的脂质体进行超声来减少平均脂质体直径。间歇性超声循环可与QELS评估交替进行以指导高效的脂质体合成。

提供的封装mRNA的纳米颗粒

在一些实施例中，组合物中大部分的纯化的纳米颗粒(即大于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的纳米颗粒)的大小为约150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、或约80nm)。在一些实施例中，基本上所有的纯化的纳米颗粒的大小为约150nm(例如，约145nm、约140nm、约135nm、约130nm、约125nm、约120nm、约115nm、约110nm、约105nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、或约80nm)。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于150nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于120nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于100nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于90nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于80nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于70nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于60nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于50nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于30nm。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的平均大小为小于20nm。

在一些实施例中，本发明提供的组合物中纳米颗粒的分散度、或分子大小异质性的量度(PDI)小于约0.5。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.5。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.4。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.3。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.28。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.25。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.23。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.20。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.18。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.16。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.14。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.12。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.10。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的PDI为小于约0.08。

在一些实施例中，本发明提供的组合物中大于约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的纯化的脂质纳米颗粒将mRNA封装在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，组合物中基本上所有的纯化的脂质纳米颗粒将mRNA封装在每个单独的颗粒内。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为50％至99％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约60％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约65％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约70％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约75％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约80％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约85％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约90％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约92％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约95％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约98％。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的封装效率为大于约99％。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为1至10。如本文所用，术语“N/P比率”是指脂质纳米颗粒中阳离子脂质中带正电荷的分子单元相对于封装在该脂质纳米颗粒内的mRNA中带负电荷的分子单元的摩尔比率。照此，N/P比率典型地计算为脂质纳米颗粒中阳离子脂质中胺基团的摩尔相对于封装在该脂质纳米颗粒内的mRNA中的磷酸基团的摩尔的比率。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为大于1。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约1。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约2。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约3。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约4。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约5。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约6。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约7。在一些实施例中，脂质纳米颗粒的N/P比率为约8。

在一些实施例中，根据本发明的组合物含有至少约0.5mg、1mg、5mg、10mg、100mg、500mg、或1000mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有约0.1mg至1000mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约0.5mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约0.8mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约1mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约5mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约8mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约10mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约50mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约100mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约500mg的封装的mRNA。在一些实施例中，组合物含有至少约1000mg的封装的mRNA。

组合物的治疗性用途

为了促进体内mRNA的表达，递送媒介物(如脂质体)可以与一种或多种额外的核酸、运载体、靶向配体或稳定化试剂组合配制，或配制在与合适的赋形剂混合的药理学组合物中。药物的配制和施用技术可见于最新版本的“Remington’s Pharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],”麦克出版公司(Mack Publishing Co.),宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,Pa.)中。

在一些实施例中，组合物包含与递送媒介物一起封装或复合的mRNA。在一些实施例中，递送媒介物选自由以下组成的组：脂质体、脂质纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、聚合物、病毒、溶胶-凝胶、和纳米凝胶。

提供的载有mRNA的纳米颗粒及含有其的组合物可以根据当前的医疗实践在考虑以下的情况下进行施用和给药：受试者的临床病症，施用的部位和方法，施用的时间安排，受试者的年龄、性别、体重，以及与本领域普通技术临床医生相关的和其他因素。用于本文目的的“有效量”可以通过如实验临床研究、药理学、临床和医学领域的普通技术人员已知的此类相关考虑来确定。在一些实施例中，施用的量有效实现症状和其他指标的至少一些稳定、改善或消除，这些指标如被本领域技术人员选择为疾病进展、消退或改善的适当度量。例如，合适的量和给药方案是导致至少瞬时蛋白质(例如，酶)产生的方案。

本发明提供了递送用于体内蛋白质生产的mRNA的方法，这些方法包括向需要递送的受试者施用mRNA。在一些实施例中，经由选自由以下组成的组的递送途径施用mRNA：静脉内递送、皮下递送、口服递送、真皮下递送、眼递送、气管内注射肺部递送(例如雾化)、肌内递送、鞘内递送、或关节内递送。

合适的施用途径包括例如，口服、直肠、阴道、经粘膜、肺包括气管内或吸入、或肠施用；肠胃外递送，包括真皮内、经真皮(局部)、肌内、皮下、髓内注射，以及鞘内、直接脑室内、静脉内、腹膜内、或鼻内。在一些实施例中，肌内施用是对选自由骨骼肌、平滑肌和心肌组成的组的肌肉。在一些实施例中，施用导致将mRNA递送至肌肉细胞。在一些实施例中，施用导致将mRNA递送至肝细胞(hepatocyte)(即，肝脏细胞(liver cell))。在特定的实施例中，肌内施用导致将mRNA递送至肌肉细胞。

肺递送和雾化的额外的教导描述于公开的美国申请号US2018/0125989和公开的美国申请号US 2018/0333457中，将各个文献通过引用以其全文并入。

可替代地或额外地，本发明的载有mRNA的纳米颗粒和组合物可以以局部方式而非全身方式施用，例如，经由将药物组合物直接注射到靶组织中，优选地在持续释放配制品中。取决于要靶向的组织，局部递送可以以各种方式实现。例如，含有本发明组合物的气雾剂可以被吸入(针对鼻、气管、或支气管递送)；例如，可以将本发明的组合物注射到损伤、疾病表现、或疼痛部位；组合物可以以锭剂形式提供，用于口服、气管、或食道应用；可以以液体、片剂或胶囊形式提供，用于向胃或肠施用；可以以栓剂形式提供，用于直肠或阴道应用；或者甚至可以通过使用乳膏、滴剂或甚至注射液递送至眼睛。含有与治疗性分子或配体复合的所提供的组合物的配制品甚至可以经手术施用，例如与能够允许该组合物从植入部位扩散至周围细胞的聚合物或其他结构或物质结合。可替代地，它们可以在不使用聚合物或支持物的情况下经手术应用。

本发明提供的方法考虑单次和多次施用治疗有效量的本文所述的治疗剂(例如，mRNA)。取决于受试者病症的性质、严重性和程度，可以以规律的间隔施用治疗剂。在一些实施例中，治疗有效量的本发明的治疗剂(例如，mRNA)可以以规律的间隔周期性地经鞘内施用(例如，每年一次、每六个月一次、每五个月一次、每三个月一次、每两个月(每两个月一次)、每月(每个月一次)、每两周(每两周一次)、每月两次、每30天一次、每28天一次、每14天一次、每10天一次、每7天一次、每周、每周两次、每天或连续)。

在一些实施例中，配制提供的脂质体和/或组合物，使得它们适用于延长释放其中包含的mRNA。这样的延长释放组合物可以以延长的给药间隔方便地向受试者施用。例如，在一个实施例中，每天两次、每天或每隔一天向受试者施用本发明的组合物。在优选的实施例中，每周两次、每周一次、每7天一次、每10天一次、每14天一次、每28天一次、每30天一次、每两周一次、每三周一次、或更优选地每四周一次、每个月一次、每个月两次、每六周一次、每八周一次、每隔一个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每六个月一次、每八个月一次、每九个月一次、或每年向受试者施用本发明的组合物。还考虑了配制用于贮存施用(depotadministration)(例如，肌内、皮下、玻璃体内)以在延长的时间段内递送或释放治疗剂(例如，mRNA)的组合物和脂质体。优选地，所采用的延长释放手段与对mRNA进行的增强稳定性的修饰结合。

如本文所用，术语“治疗有效量”主要基于本发明的药物组合物中含有的治疗剂的总量确定。通常，治疗有效量足以实现对受试者有意义的益处(例如，治疗、调节、治愈、预防和/或缓解疾病或障碍)。例如，治疗有效量可以是足以实现所希望的治疗性和/或预防性效果的量。通常，向有需要的受试者施用的治疗剂(例如，mRNA)的量将取决于该受试者的特征。这样的特征包括受试者的病症、疾病严重性、一般健康状况、年龄、性别和体重。本领域普通技术人员将能够根据这些和其他相关因素容易地确定适当的剂量。此外，可以任选地采用客观测定法和主观测定法来鉴定最佳剂量范围。

治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的治疗性蛋白，治疗有效量(和/或有效给药方案中的适当单位剂量)可以变化，例如，取决于施用途径、取决于与其他药剂的组合。此外，针对任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于多种因素，包括正在治疗的障碍和该障碍的严重性；采用的特定药剂的活性；采用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；采用的特定蛋白的施用时间、施用途径、和/或排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域熟知的类似因素。

在一些实施例中，治疗有效剂量的范围为从约0.005mg/kg体重至500mg/kg体重，例如，从约0.005mg/kg体重至400mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至300mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至200mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至100mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至90mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至80mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至70mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至60mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至50mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至40mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至30mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至25mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至20mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至15mg/kg体重、从约0.005mg/kg体重至10mg/kg体重。

在一些实施例中，治疗有效剂量为大于约0.1mg/kg体重、大于约0.5mg/kg体重、大于约1.0mg/kg体重、大于约3mg/kg体重、大于约5mg/kg体重、大于约10mg/kg体重、大于约15mg/kg体重、大于约20mg/kg体重、大于约30mg/kg体重、大于约40mg/kg体重、大于约50mg/kg体重、大于约60mg/kg体重、大于约70mg/kg体重、大于约80mg/kg体重、大于约90mg/kg体重、大于约100mg/kg体重、大于约150mg/kg体重、大于约200mg/kg体重、大于约250mg/kg体重、大于约300mg/kg体重、大于约350mg/kg体重、大于约400mg/kg体重、大于约450mg/kg体重、大于约500mg/kg体重。在特定的实施例中，治疗有效剂量是1.0mg/kg。在一些实施例中，1.0mg/kg的治疗有效剂量经肌内或静脉内施用。

本文还考虑了包含一种或多种本文披露的脂质体的冻干药物组合物和使用此类组合物的相关方法，如例如在2011年6月8日提交的美国临时申请号61/494,882中披露的，将该文献的教导通过引用以其全文并入本文。例如，根据本发明的冻干药物组合物可以在施用前重构或者可以在体内重构。例如，可以将冻干药物组合物配制成适当的剂型(例如，皮内剂型，如圆盘、棒或膜)并施用，使得该剂型随时间推移在体内被个体的体液再水合。

可以向任何所希望的组织施用提供的脂质体和组合物。在一些实施例中，由提供的脂质体或组合物递送的mRNA在施用这些脂质体和/或组合物的组织中表达。在一些实施例中，递送的mRNA在不同于施用这些脂质体和/或组合物的组织的组织中表达。可以递送和/或表达递送的mRNA的示例性组织包括但不限于肝脏、肾脏、心脏、脾脏、血清、脑、骨骼肌、淋巴结、皮肤、和/或脑脊液。

在一些实施例中，与治疗之前的基线表达水平相比，施用提供的组合物导致来自受试者的生物样品中的mRNA表达水平增加。典型地，在紧接治疗之前测量基线水平。生物样品包括例如全血、血清、血浆、尿液和组织样品(例如，肌肉、肝脏、皮肤成纤维细胞)。在一些实施例中，与紧接治疗之前的基线表达水平相比，施用提供的组合物导致mRNA表达水平增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或95％。在一些实施例中，与未治疗的受试者中的mRNA表达水平相比，施用提供的组合物导致mRNA表达水平增加

根据多个实施例，可以调节递送的mRNA的表达时机以适应特定的医学需要。在一些实施例中，在施用提供的脂质体和/或组合物后1、2、3、6、12、24、48、72、和/或96小时可检测到由递送的mRNA编码的蛋白质的表达。在一些实施例中，在施用后一周、两周、和/或一个月可检测到由递送的mRNA编码的蛋白质的表达。

本发明还提供了递送具有编码目的肽或多肽的mRNA分子的组合物，用于治疗受试者，例如人受试者、或人受试者的细胞、或被治疗并递送至人受试者的细胞。

实例

在已经根据某些实施例特定地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法的同时，以下实例仅用于说明本发明的化合物，并且不旨在对其进行限制。

实例1.用于直肠递送的mRNA-LNP组合物的配制

本实例说明了制作包含mRNA的组合物的示例性工艺，该mRNA封装在适用于直肠递送的脂质纳米颗粒(LNP)内。

使用工艺B将信使RNA封装在包含ML-2:DOPE:胆固醇:DMG-PEG(40:30:25:5)的脂质纳米颗粒内。如本文所用，工艺B是指如US 2018/0153822中所述，通过将预形成的脂质纳米颗粒与mRNA混合来封装mRNA的工艺，将该文献以其全文并入本文。在LNP中以10％w/v浓度的明胶制备栓剂。简言之，在5分钟内将明胶在65℃下直接溶解在LNP中，并倒入一次性模具中。然后将这些模具在-80℃冷冻。包含封装mRNA的LNP的栓剂保持完整。包含mRNA-LNP的示例性栓剂在图1中示出。

通过将153mg Labrasol溶解在1mL的水中来制备Labrasol(渗透性增强剂)溶液。

不同量的明胶可用于控制栓剂的融化速度，从而控制一旦向受试者施用后封装在LNP内的mRNA的释放时间。额外地，可以添加粘度调节赋形剂来控制释放时间。

实例2.将FFLuc mRNA-LNP直肠递送至小鼠

本实例说明了成功直肠递送脂质纳米颗粒中的mRNA。

将封装在脂质纳米颗粒(0.2mg/动物)内的萤火虫荧光素酶(FFLuc)mRNA或盐水在小鼠中经直肠给药。在直肠施用24小时后对全身和单个组织进行成像，如图2和图3中所示出。

如图2A和图2B中所示例，如所预期的，经直肠给药盐水的小鼠没有示出任何发光。经直肠施用FFLuc mRNA-LNP的小鼠展现出发光，尤其是直肠区域处的高发光(图3A)。在组织中，克隆示出了出强烈的发光，如图3B所说明。

本实例说明了mRNA-LNP可以成功地经直肠递送用于在体内表达蛋白质。检测到直肠和结肠的表达。

实例3.直肠递送FFLuc mRNA-LNP和渗透性增强剂

本实例说明了成功递送脂质纳米颗粒中的mRNA和癸酸钠(一种渗透性增强剂)。直肠施用mRNA-LNP和癸酸钠显著增加了蛋白质的体内表达。

如实例2中所述，对一组小鼠施用0.2mg FFLuc mRNA-LNP(组1)。第二组小鼠在直肠施用0.05mg的FFLuc mRNA-LNP之前预先给药癸酸钠(200mg/ml溶液-50ult注射)(组2)。在直肠施用24小时后对全身和单个组织进行成像。

如图4所示出，与施用0.2mg的FFLuc mRNA-LNP的小鼠相比，经直肠给药0.05mgFFLuc mRNA-LNP和癸酸钠的小鼠示出了显著更高的信号。图5示出了尽管mRNA-LNP的剂量是组1中剂量的25％，但组2的发光几乎增加了2倍。

本实例说明了渗透性增强剂可以增加由mRNA-LNP递送的蛋白质的表达。

实例4.将栓剂中的FFLuc mRNA-LNP直肠递送至小鼠和大鼠

本实例说明了成功直肠递送栓剂配制品中的mRNA-LNP。直肠施用栓剂中的mRNA-LNP显著增加了蛋白质的体内表达，并且在各个组织中检测到蛋白质表达。

对小鼠或大鼠直肠给药30μl的Labrasol溶液(153mg/ml)。在30分钟后，经直肠施用FFLuc mRNA-LNP的栓剂配制品。在直肠施用24小时后对全身和单个组织进行成像。

图6A示出了与在没有栓剂的情况下直肠施用mRNA-LNP的小鼠相比，直肠施用栓剂中的FFLuc mRNA-LNP的小鼠示出了显著更高的发光。此外，在不同组织(例如直肠结肠、肝脏、肾脏等)中观察到强烈的发光信号。如图6B所示例，四只大鼠中有两只在肝脏、结肠和直肠中示出了发光。与大鼠相比，在小鼠中观察到较小的变异性。

本实例说明了当mRNA-LNP以栓剂的形式递送时，观察到蛋白质表达显著增加。该实例还支持栓剂可以帮助mRNA-LNP在RNA酶和粘液屏障中存活，并且还可以控制一旦递送后mRNA-LNP在受试者体内的释放。此外，在包括肾脏在内的各个组织中检测到体内蛋白质表达。这是显著的，因为已知将药剂靶向递送到小鼠肾脏内是费力的并且可能需要剖腹手术。额外地，肝脏中FFL的表达表明全身循环中LNP的摄取。

实例5.将栓剂中的EPO mRNA-LNP直肠递送至大鼠

本实例说明了成功直肠递送针对分泌性蛋白质的、栓剂中的mRNA-LNP。

对大鼠直肠给药30μl的Labrasol溶液(153mg/ml)。在30分钟后，经直肠施用hEPOmRNA-LNP的栓剂配制品。在施用24小时后，测量血清中的hEPO水平。如图7所示，经直肠给药栓剂中的hEPO mRNA-LNP的大鼠示出了在血清中可检测到的hEPO水平。这些水平远高于EPO的正常生理水平。

本实例示出了，栓剂形式的mRNA-LNP的直肠递送可以成功地在全身循环中提供表达的蛋白质。

等同物和范围

本领域技术人员仅使用常规实验将认识到或能确定本文所述本发明的具体实例的许多等效形式。并不旨在将本发明的范围限于上述说明，而是将其在以下权利要求中陈述：

Claims

1.一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过直肠递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

2.如权利要求1所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的循环中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

3.如权利要求1所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的肝脏中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

4.如权利要求1所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的肾脏中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

5.如权利要求1所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的结肠中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

6.如权利要求1所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的直肠中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

7.如权利要求1所述的方法，其中该蛋白质或该肽的体内产生是在该受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该脂质纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、一种或多种非阳离子脂质以及一种或多种PEG修饰的脂质。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该脂质纳米颗粒包含胆固醇。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该直肠递送是通过栓剂、灌肠剂、导管或球形注射器进行的。

11.如权利要求10所述的方法，其中该直肠递送是通过栓剂进行的。

12.如权利要求11所述的方法，其中该组合物不包含基于脂质的栓剂组分。

13.如权利要求12所述的方法，其中该基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物包含渗透性增强剂。

15.如权利要求14所述的方法，其中该渗透性增强剂选自胆盐、表面活性剂、脂肪酸和衍生物、甘油酯、螯合剂、水杨酸盐、或聚合物。

16.如权利要求15所述的方法，其中这些脂肪酸和衍生物选自山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖、棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠或棕榈酰肉碱。

17.如权利要求14所述的方法，其中该渗透性增强剂是癸酸盐的形式。

18.如权利要求18所述的方法，其中该基于癸酸盐的渗透性增强剂是癸酸钠。

19.如权利要求14所述的方法，其中该渗透性增强剂是

20.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物包含基于水的栓剂组分。

21.如权利要求20所述的方法，其中该基于水的栓剂组分选自甘油、明胶或聚乙二醇(PEG)、或其组合。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含明胶。

23.如权利要求22所述的方法，其中唯一的基于水的栓剂组分是明胶。

24.如权利要求23所述的方法，其中该组合物包含在水中的约5％或更多的明胶、在水中的10％或更多的明胶、在水中的20％或更多的明胶、在水中的30％或更多的明胶、或在水中的50％或更多的明胶。

25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中该组合物进一步包含0.25mg/mL或更高的mRNA、0.5mg/mL或更高的mRNA、0.75mg/mL或更高的mRNA、或1mg/mL或更高的mRNA。

26.如权利要求25所述的方法，其中该组合物包含0.5mg或更高的mRNA、0.75mg或更高的mRNA、1mg或更高的mRNA、1.25mg或更高的mRNA、1.5mg或更高的mRNA、或1.75mg或更高的mRNA。

27.如权利要求11-26中任一项所述的方法，其中该组合物配制成约3克、约2克、或约1克的栓剂。

28.如权利要求27所述的方法，其中该组合物配制成约3克的栓剂。

29.如权利要求11-26中任一项所述的方法，其中该组合物配制成体积为约2.0mL、约3.5mL、约7.5mL、或约10.0mL的栓剂。

30.如权利要求11-29中任一项所述的方法，其中该栓剂在施用前被冷藏。

31.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中在施用该包含mRNA的组合物之前，首先对该受试者施用渗透性增强剂。

32.如权利要求31所述的方法，其中在施用该包含mRNA的组合物之前约30分钟、约1小时、约2.5小时、约5小时、或约12小时向该受试者施用该渗透性增强剂。

33.如权利要求32所述的方法，其中在施用该包含mRNA的组合物之前约30分钟施用该渗透性增强剂。

34.一种将信使RNA(mRNA)递送至受试者用于在该受试者中的蛋白质或肽的体内产生的方法，该方法包括通过粘膜递送向该受试者施用包含mRNA的组合物，该mRNA编码蛋白质或肽并且被封装在脂质纳米颗粒内，并且其中该组合物的施用导致由该mRNA编码的蛋白质或肽的表达，在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者中检测到由该mRNA编码的蛋白质或肽。

35.如权利要求34所述的方法，其中在施用后至少约24小时、约48小时、约72小时或约96小时可在该受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中检测到该mRNA。

36.如权利要求34或35所述的方法，其中该粘膜递送是直肠的、阴道的、眼的、口服的或胃肠的。

37.如权利要求36所述的方法，其中该口服递送是颊的或舌下的。

38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中该粘膜递送是直肠的。

39.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中该蛋白质或肽的体内产生是在该受试者的循环、肝脏、肾脏、结肠和/或直肠中。

40.一种用于直肠施用mRNA的栓剂，该栓剂包含：

a.封装在脂质纳米颗粒内的mRNA，其中该mRNA编码蛋白质或肽；和

b.明胶。

41.如权利要求40所述的栓剂，该栓剂包含在水中的约5％或更多的明胶、在水中的10％或更多的明胶、在水中的20％或更多的明胶、在水中的30％或更多的明胶、或在水中的50％或更多的明胶。

42.如权利要求40或41中任一项所述的栓剂，其中该栓剂不包含基于脂质的栓剂组分。

43.如权利要求42所述的栓剂，其中该基于脂质的栓剂组分是可可脂、可可豆油、合成脂肪或合成碱基。

44.如权利要求40-43中任一项所述的栓剂，该栓剂进一步包含渗透性增强剂。

45.如权利要求44所述的栓剂，其中该渗透性增强剂选自胆盐、表面活性剂、脂肪酸和衍生物、甘油酯、螯合剂、水杨酸盐、或聚合物。

46.如权利要求40-45中任一项所述的栓剂，其中这些脂肪酸和衍生物选自山梨糖醇月桂酸酯、癸酸钠、蔗糖、棕榈酸酯、月桂酰胆碱、肉豆蔻酸钠或棕榈酰肉碱。

47.如权利要求40-45中任一项所述的栓剂，其中该渗透性增强剂是癸酸盐的形式。

48.如权利要求47所述的栓剂，其中该基于癸酸盐的渗透性增强剂是癸酸钠。

49.如权利要求44所述的栓剂，其中该渗透性增强剂是

50.如权利要求40-49中任一项所述的栓剂，该栓剂进一步包含甘油和/或PEG。

51.如权利要求40-50中任一项所述的栓剂，其中该栓剂在约36℃至37℃软化或融化。