JP6782171B2 - メッセンジャーrnaのカプセル化 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示がその全体において参照により本明細書に組み込まれる、2014年7月2日に出願された、米国仮特許出願第62/020,163号に対する優先権を主張する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液と脂質溶液を混合するステップを含み、前記mRNA溶液及び/または前記脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、前記プロセス。
(項目2)
前記所定の温度が、約30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、または70℃であるかそれを超える、項目1に記載のプロセス。
(項目3)
前記所定の温度が、約25〜70℃、約30〜70℃、約35〜70℃、約40〜70℃、約45〜70℃、約50〜70℃、または約60〜70℃の範囲である、項目1または2に記載のプロセス。
(項目4)
前記所定の温度が、約65℃である、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目5)
前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に前記所定の温度まで加熱される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目6)
前記混合の前に、前記mRNA溶液が前記所定の温度まで加熱され、前記脂質溶液が周囲温度である、項目1〜4のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目7)
周囲温度のmRNA原液を加熱された緩衝液に加えて前記所定の温度にすることによって、前記mRNA溶液が前記所定の温度まで加熱される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目8)
前記緩衝液が、約4.5以下のpHを有する、項目7に記載のプロセス。
(項目9)
前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、低パルス流ポンプにより混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目10)
前記ポンプが、ギアポンプである、項目9に記載のプロセス。
(項目11)
前記ポンプが、渦巻きポンプである、項目9に記載のプロセス。
(項目12)
前記mRNA溶液が、約150〜250ml/分、250〜500ml/分、500〜1000ml/分、1000〜2000ml/分、2000〜3000ml/分、3000〜4000ml/分、または4000〜5000ml/分の範囲の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目13)
前記mRNA溶液が、約200ml/分、約500ml/分、約1000ml/分、約2000ml/分、約3000ml/分、約4000ml/分、または約5000ml/分の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目14)
前記脂質溶液が、約25〜75ml/分、約75〜200ml/分、約200〜350ml/分、約350〜500ml/分、約500〜650ml/分、約650〜850ml/分、または約850〜1000ml/分の範囲の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目15)
前記脂質溶液が、約50ml/分、約100ml/分、約150ml/分、約200ml/分、約250ml/分、約300ml/分、約350ml/分、約400ml/分、約450ml/分、約500ml/分、約550ml/分、約600ml/分、約650ml/分、約700ml/分、約750ml/分、約800ml/分、約850ml/分、約900ml/分、約950ml/分、または約1000ml/分の流速で混合される、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目16)
前記プロセスが、クエン酸塩緩衝液をmRNA原液と混合することにより前記mRNA溶液をまず生成するステップを含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目17)
前記クエン酸塩緩衝液が、約10mMクエン酸塩、約150mM NaCl、約4.5のpHを含む、項目16に記載のプロセス。
(項目18)
前記mRNA原液が、前記mRNAを、約1mg/ml、約10mg/ml、約50mg/ml、約100mg/ml以上の濃度で含む、項目16または17に記載のプロセス。
(項目19)
前記クエン酸塩緩衝液が、約100〜300ml/分、300〜600ml/分、600〜1200ml/分、1200〜2400ml/分、2400〜3600ml/分、3600〜4800ml/分、または4800〜6000ml/分の間の範囲の流速で混合される、項目16〜18のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目20)
前記クエン酸塩緩衝液が、約220ml/分、約600ml/分、約1200ml/分、約2400ml/分、約3600ml/分、約4800ml/分、または約6000ml/分の流速で混合される、項目16〜19のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目21)
前記mRNA原液が、約10〜30ml/分、約30〜60ml/分、約60〜120ml/分、約120〜240ml/分、約240〜360ml/分、約360〜480ml/分、または約480〜600ml/分の間の範囲の流速で混合される、項目16〜20のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目22)
前記mRNA原液が、約20ml/分、約40ml/分、約60ml/分、約80ml/分、約100ml/分、約200ml/分、約300ml/分、約400ml/分、約500ml/分、または約600ml/分の流速で混合される、項目16〜21のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目23)
前記脂質溶液が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目24)
前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、20%エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目25)
前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、項目24に記載のプロセス。
(項目26)
前記精製されたナノ粒子の約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、100nm未満のサイズを有する、項目25に記載のプロセス。
(項目27)
実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、100nm未満のサイズを有する、項目26に記載のプロセス。
(項目28)
前記精製されたナノ粒子の約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%超が50〜80nmの範囲のサイズを有する、項目25〜27のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目29)
実質的に全ての前記精製されたナノ粒子が、50〜80nmの範囲のサイズを有する、項目25〜28のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目30)
前記精製されたナノ粒子が、約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるカプセル化率を有する、項目25〜29のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目31)
前記プロセスが、約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えるmRNAの回収をもたらす、先行項目のいずれか一項に記載のプロセス。
(項目32)
脂質ナノ粒子内にメッセンジャーRNA(mRNA)をカプセル化するプロセスであって、a.mRNA溶液及び/または脂質溶液を、周囲温度を超える所定の温度まで別々に加熱すること;
b.脂質ナノ粒子の懸濁液を生成するために前記加熱したmRNA溶液及び/または前記加熱した脂質溶液を混合すること;及び
c.前記脂質ナノ粒子を精製することを含む、前記プロセス。
(項目34)
先行項目のいずれか一項に記載のプロセスにより生成された脂質ナノ粒子の組成物。
(項目35)
精製された脂質ナノ粒子を含む組成物であって、前記精製された脂質ナノ粒子の約90%超が約100nm未満のサイズの個別の粒子を有し、前記精製された脂質ナノ粒子の約70%超が各個別の粒子内にmRNAをカプセル化している、前記組成物。
(項目36)
前記精製された脂質ナノ粒子の約95%、96%、97%、98%、または99%超が、約100nm未満の個別粒子サイズを有する、項目35に記載の組成物。
(項目37)
実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、約100nm未満の個別の粒子サイズを有する、項目35または36のいずれか一項に記載の組成物。
(項目38)
前記精製された脂質ナノ粒子の約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%超が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する、項目35〜37のいずれか一項に記載の組成物。
(項目39)
実質的に全ての前記精製された脂質ナノ粒子が、各個別の粒子内にmRNAをカプセル化する、項目35〜38のいずれか一項に記載の組成物。
(項目40)
前記組成物が、少なくとも1mg、5mg、10mg、100mg、500mg、または1000mgのカプセル化されたmRNAを含む、項目35〜39のいずれか一項に記載の組成物。
(項目41)
各個別の脂質ナノ粒子が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質を含む、項目35〜40のいずれか一項に記載の組成物。
(項目42)
前記1つ以上のカチオン性脂質が、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾール系)、、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin−K−DMA、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、項目24に記載のプロセスまたは項目41に記載の組成物。
(項目43)
前記1つ以上の非カチオン性脂質が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−(ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(、2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される、項目24に記載のプロセスまたは項目41に記載の組成物。
(項目44)
前記1つ以上のコレステロール系脂質が、コレステロールまたはPEG化コレステロールである、項目24に記載のプロセスまたは項目41に記載の組成物。
(項目45)
1つ以上のPEG修飾された脂質が、C 6 −C 20 長さのアルキル鎖(複数可)を有する脂質に共有付着した最大で5kDaまでの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含む、項目24に記載のプロセスまたは項目41に記載の組成物。
(項目46)
前記mRNAが、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、先行項目のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。
(項目47)
前記mRNAが、未修飾である、先行項目のいずれか一項に記載のプロセスまたは組成物。
本発明がより容易に理解されるために、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語及び他の用語に対する追加の定義は、本明細書全体を通して明記する。
本発明は、任意のmRNAをカプセル化するために使用されてよい。mRNAは、典型的には、DNAからリボソームへと情報を運ぶRNAのタイプであると考えられる。mRNAの存在は、典型的には、非常に短く、プロセシング及び翻訳を含み、それに分解が続く。典型的には、真核生物では、mRNAプロセシングは、N末端(5’)端への「キャップ」の付加、及びC末端(3’)端への「尾部」の付加を含む。典型的なキャップは、7−メチルグアノシンキャップであり、これは、5’−5’−三リン酸結合を通して第一の転写されたヌクレオチドに結合するグアノシンである。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞において見いだされるヌクレアーゼに対する耐性の提供において重要である。尾部は、典型的には、ポリアデニル化事象であり、それによりポリアデニル部分はmRNA分子の3’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エクソヌクレアーゼ分解からmRNAを保護する役割を果たす。メッセンジャーRNAは、リボソームによりタンパク質を構成する一連のアミノ酸へと翻訳される。
mRNAは、mRNAが脂質ナノ粒子内にカプセル化され得るように脂質溶液と混合される溶液中で提供されてよい。好適なmRNA溶液は、様々な濃度でカプセル化されるmRNAを含有する任意の水溶液であってよい。例えば、好適なmRNA溶液は、mRNAを、約0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、または1.0mg/ml以上の濃度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、mRNAを、約0.01〜1.0mg/ml、0.01〜0.9mg/ml、0.01〜0.8mg/ml、0.01〜0.7mg/ml、0.01〜0.6mg/ml、0.01〜0.5mg/ml、0.01〜0.4mg/ml、0.01〜0.3mg/ml、0.01〜0.2mg/ml、0.01〜0.1mg/ml、0.05〜1.0mg/ml、0.05〜0.9mg/ml、0.05〜0.8mg/ml、0.05〜0.7mg/ml、0.05〜0.6mg/ml、0.05〜0.5mg/ml、0.05〜0.4mg/ml、0.05〜0.3mg/ml、0.05〜0.2mg/ml、0.05〜0.1mg/ml、0.1〜1.0mg/ml、0.2〜0.9mg/ml、0.3〜0.8mg/ml、0.4〜0.7mg/ml、または0.5〜0.6mg/mlの範囲の濃度で含有してよい。いくつかの実施形態では、好適なmRNA溶液は、mRNAを、最大で約5.0mg/ml、4.0mg/ml、3.0mg/ml、2.0mg/ml、1.0mg/ml、.09mg/ml、0.08mg/ml、0.07mg/ml、0.06mg/ml、または0.05mg/mlまでの濃度で含有してよい。
本発明に従い、脂質溶液は、mRNAをカプセル化するための脂質ナノ粒子を形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノールをベースとする。例えば、好適な脂質溶液は、純エタノール(すなわち、100%エタノール)中に溶解された所望の脂質の混合物を含有し得る。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、イソプロピルアルコールをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、ジメチルスルホキシドをベースとする。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、限定されないが、エタノール、イソプロピルアルコール及びジメチルスルホキシドを含む好適な溶媒の混合物である。
本明細書で用いるとき、「カチオン性脂質」という語句は、生理的pHなどの、選択されたpHで実効正電荷を有する多くの脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は、文献において記載されており、その多くが市販されている。本発明の組成物及び方法において使用するのに特に好適なカチオン性脂質には、その両方が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開WO2010/053572(及び特に、段落[00225]で記載されるC12−200)及びWO2012/170930において記載されるものが含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法に好適なカチオン性脂質には、2012年3月29日に出願された、米国仮特許出願第61/617,468号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載のイオン化可能なカチオン性脂質、例えば、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−15,18−ジエン−1−アミン(HGT5000)、(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−4,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5001)、及び(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−((9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエン−1−イル)テトラコサ−5,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5002)が含まれる。
各qは、独立して、2〜6であり;
各R’は、独立して、水素またはC1−3アルキルであり;
各RLは、独立して、C8−12アルキルである、
の化合物またはその医薬的に許容され得る塩を含む。
本明細書で用いるとき、「非カチオン性脂質」という語句は、任意の中性、双性イオンまたはアニオン性の脂質を指す。本明細書で用いるとき、「アニオン性脂質」という語句は、生理学的pHなどの選択されたpHで、正味負電荷を持つ多くの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−1−カルボキシレート(DOPE−mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、1−ステアロイル−2−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、1つ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、DC−Choi(N,N−ジメチル−N−エチルカルボキサミドコレステロール)、1,4−ビス(3−N−オレイルアミノ−プロピル)ピペラジン(Gaoら、Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991);Wolfら、BioTechniques 23,139(1997);米国特許第5,744,335号)、またはICEを含む。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、または70%を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質(複数可)は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約30〜50%(例えば、約30〜45%、約30〜40%、約35〜50%、約35〜45%、または約35〜40%)を構成する。
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、1つまたは複数のPEG化脂質を含む。ポリエチレングリコール(PEG)修飾されたリン脂質及び誘導化された脂質、例えば、N−オクタノイル−スフィンゴシン−1−[スクシニル(メトキシポリエチレングリコール)−2000](C8PEG−2000セラミド)を含む、誘導体化されたセラミド(PEG−CER)の使用も本発明により企図される。企図されるPEG修飾された脂質は、C6−C20長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有付着する最大で5kDaまでの長さのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、PEG修飾されたまたはPEG化脂質は、PEG化コレステロールまたはPEG−2Kである。いくつかの実施形態では、特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖(例えば、C14またはC18)を有するPEG−セラミドである。
本発明は、mRNAカプセル化効率及び回収率に及ぼす温度の予期しない効果の発見に基づく。ゆえに、いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の、mRNA溶液と脂質溶液を混合することによって脂質ナノ粒子中にメッセンジャーRNA(mRNA)をカプセル化するプロセスであって、mRNA溶液及び/または脂質溶液が周囲温度を超える所定の温度まで加熱される前記プロセスを提供する。本明細書で用いるとき、「周囲温度」という用語は、室温の温度、または加熱または冷却無しに、対象となる目的物(例えば、mRNA溶液または脂質溶液)を囲む温度を指す。いくつかの実施形態では、周囲温度は、約20〜25℃の範囲の温度を指す。
典型的には、製剤及びカプセル化の後、脂質ナノ粒子は、精製される及び/または濃縮される。様々な精製技術を使用してよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、タンジェンシャルフローろ過を使用して精製される。クロスフローろ過とも称される、タンジェンシャルフローろ過(TFF)は、ろ過される材料が、フィルタを通り抜けるよりむしろ接線的に通過するろ過の種類である。TFFでは、望ましくない透過水はフィルタを通り抜ける一方で、所望の被保持物はフィルタに沿って通り下流に集められる。従来のデッドエンドろ過において通常遭遇するものと反対に、TFFでは、典型的には、所望の材料が被保持物中に含有されていることに留意することが重要である。
本発明に係るプロセスは、従来技術のプロセスと比較して、より均質で小さい粒子サイズ(例えば、100nm未満)、ならびに、著しく改善されたカプセル化効率及び/またはmRNA回収率をもたらす。
この実施例は、ナノ粒子カプセル化プロセス中の温度の増加が、収率及び/またはカプセル化効率の増加をもたらすことを実証する。
以下の実施例に記載する製剤は、別段の指定がない限り、様々な核酸材料をカプセル化するように設計された1つ以上のカチオン性脂質、ヘルパー脂質(例えば、非カチオン性脂質及び/またはコレステロール脂質)及びPEG化脂質を採用する様々な比率の多成分の脂質混合物を含有する。本プロセスのためのカチオン性脂質は、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.ら、“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172−176)、C12−200(Love,K.T.ら、“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS 2010,107,1864−1869)、cKK−E12(3,6−ビス(4−(ビス(2−ヒドロキシドデシル)アミノ)ブチル)ピペラジン−2,5−ジオン)、HGT5000、HGT5001、HGT4003、ICE、ジアルキルアミノ系、イミダゾール系、グアニジウム系等を含むことができるが、これらに限定されない。ヘルパー脂質は、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))、コレステロール等を含むことができるが、これらに限定されない。PEG化脂質は、C6−C20長さのアルキル鎖(複数可)で脂質に共有付着する最大で5kDaまでの長さのポリ(エチレン)グリコール鎖を含むことができるが、これに限定されない。
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン1(SMN)メッセンジャーRNA、アルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)メッセンジャーRNA、修飾嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(SNIM(登録商標)CFTR、25%シュードウリジン、25%5−メチル−シチジン)メッセンジャーRNA、ホタルルシフェラーゼ(FFL)メッセンジャーRNA、第IX因子(FIX)メッセンジャーRNA、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(phelyalanine hydroxylase)(PAH)メッセンジャーRNA及びアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)メッセンジャーRNAを、遺伝子をコードするプラスミドDNA鋳型からのインビトロ転写により合成し、その後、5‘キャップ構造(キャップ1)(Fechter,P.;Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239−1249)及びゲル電気泳動により決定されたおおよそ250ヌクレオチドの長さの3’ポリA尾部が付加された。各mRNA生成物中に存在する5’及び3’非翻訳領域は、それぞれX及びYとして表され、(下に)記載のように定義される。
コドン最適化ヒト脊髄運動ニューロン1(SMN)mRNA:
XAUGGCCAUGAGCAGCGGAGGCAGCGGCGGAGGAGUGCCCGAGCAGGAGGACAGCGUGCUGUUCAGGAGAGGCACCGGCCAGAGCGAUGACAGCGAUAUCUGGGACGAUACCGCUCUGAUCAAGGCCUACGACAAGGCCGUGGCCAGCUUCAAGCACGCCCUGAAAAACGGCGACAUCUGCGAGACCAGCGGCAAGCCCAAGACAACCCCCAAGAGAAAGCCCGCCAAGAAGAAUAAGAGCCAGAAAAAGAACACCGCCGCCAGCCUGCAGCAGUGGAAGGUGGGCGACAAGUGCAGCGCCAUCUGGAGCGAGGACGGCUGCAUCUACCCCGCCACCAUCGCCAGCAUCGACUUCAAGAGAGAGACCUGCGUGGUCGUGUACACCGGCUACGGCAACAGAGAGGAGCAGAACCUGAGCGACCUGCUGAGCCCCAUUUGUGAGGUGGCCAAUAACAUCGAACAGAACGCCCAGGAGAACGAGAAUGAAAGCCAGGUGAGCACCGACGAGAGCGAGAACAGCAGAUCUCCUGGCAACAAGAGCGACAACAUCAAGCCUAAGUCUGCCCCUUGGAACAGCUUCCUGCCCCCUCCUCCACCCAUGCCCGGACCCAGACUGGGACCCGGAAAACCUGGCCUGAAGUUCAACGGACCACCUCCCCCUCCACCUCCUCCCCCACCUCAUCUCCUGAGCUGCUGGCUGCCACCCUUCCCCAGCGGACCCCCUAUCAUCCCACCACCCCCUCCCAUCUGCCCCGACAGCCUGGACGACGCCGAUGCCCUGGGCAGCAUGCUGAUCAGCUGGUACAUGAGCGGCUACCACACAGGAUACUACAUGGGCUUCAGACAGAACCAGAAGGAGGGCAGAUGCUCCCACUCCCUGAACUGAY
ヒトアルファ−ガラクトシダーゼ(GLA)mRNA:
XAUGCAGCUGAGGAACCCAGAACUACAUCUGGGCUGCGCGCUUGCGCUUCGCUUCCUGGCCCUCGUUUCCUGGGACAUCCCUGGGGCUAGAGCACUGGACAAUGGAUUGGCAAGGACGCCUACCAUGGGCUGGCUGCACUGGGAGCGCUUCAUGUGCAACCUUGACUGCCAGGAAGAGCCAGAUUCCUGCAUCAGUGAGAAGCUCUUCAUGGAGAUGGCAGAGCUCAUGGUCUCAGAAGGCUGGAAGGAUGCAGGUUAUGAGUACCUCUGCAUUGAUGACUGUUGGAUGGCUCCCCAAAGAGAUUCAGAAGGCAGACUUCAGGCAGACCCUCAGCGCUUUCCUCAUGGGAUUCGCCAGCUAGCUAAUUAUGUUCACAGCAAAGGACUGAAGCUAGGGAUUUAUGCAGAUGUUGGAAAUAAAACCUGCGCAGGCUUCCCUGGGAGUUUUGGAUACUACGACAUUGAUGCCCAGACCUUUGCUGACUGGGGAGUAGAUCUGCUAAAAUUUGAUGGUUGUUACUGUGACAGUUUGGAAAAUUUGGCAGAUGGUUAUAAGCACAUGUCCUUGGCCCUGAAUAGGACUGGCAGAAGCAUUGUGUACUCCUGUGAGUGGCCUCUUUAUAUGUGGCCCUUUCAAAAGCCCAAUUAUACAGAAAUCCGACAGUACUGCAAUCACUGGCGAAAUUUUGCUGACAUUGAUGAUUCCUGGAAAAGUAUAAAGAGUAUCUUGGACUGGACAUCUUUUAACCAGGAGAGAAUUGUUGAUGUUGCUGGACCAGGGGGUUGGAAUGACCCAGAUAUGUUAGUGAUUGGCAACUUUGGCCUCAGCUGGAAUCAGCAAGUAACUCAGAUGGCCCUCUGGGCUAUCAUGGCUGCUCCUUUAUUCAUGUCUAAUGACCUCCGACACAUCAGCCCUCAAGCCAAAGCUCUCCUUCAGGAUAAGGACGUAAUUGCCAUCAAUCAGGACCCCUUGGGCAAGCAAGGGUACCAGCUUAGACAGGGAGACAACUUUGAAGUGUGGGAACGACCUCUCUCAGGCUUAGCCUGGGCUGUAGCUAUGAUAAACCGGCAGGAGAUUGGUGGACCUCGCUCUUAUACCAUCGCAGUUGCUUCCCUGGGUAAAGGAGUGGCCUGUAAUCCUGCCUGCUUCAUCACACAGCUCCUCCCUGUGAAAAGGAAGCUAGGGUUCUAUGAAUGGACUUCAAGGUUAAGAAGUCACAUAAAUCCCACAGGCACUGUUUUGCUUCAGCUAGAAAAUACAAUGCAGAUGUCAUUAAAAGACUUACUUUAAY
コドン最適化ヒトアルギニノコハク酸合成酵素(ASS1)mRNA:
XAUGAGCAGCAAGGGCAGCGUGGUGCUGGCCUACAGCGGCGGCCUGGACACCAGCUGCAUCCUGGUGUGGCUGAAGGAGCAGGGCUACGACGUGAUCGCCUACCUGGCCAACAUCGGCCAGAAGGAGGACUUCGAGGAGGCCCGCAAGAAGGCCCUGAAGCUGGGCGCCAAGAAGGUGUUCAUCGAGGACGUGAGCCGCGAGUUCGUGGAGGAGUUCAUCUGGCCCGCCAUCCAGAGCAGCGCCCUGUACGAGGACCGCUACCUGCUGGGCACCAGCCUGGCCCGCCCCUGCAUCGCCCGCAAGCAGGUGGAGAUCGCCCAGCGCGAGGGCGCCAAGUACGUGAGCCACGGCGCCACCGGCAAGGGCAACGACCAGGUGCGCUUCGAGCUGAGCUGCUACAGCCUGGCCCCCCAGAUCAAGGUGAUCGCCCCCUGGCGCAUGCCCGAGUUCUACAACCGCUUCAAGGGCCGCAACGACCUGAUGGAGUACGCCAAGCAGCACGGCAUCCCCAUCCCCGUGACCCCCAAGAACCCCUGGAGCAUGGACGAGAACCUGAUGCACAUCAGCUACGAGGCCGGCAUCCUGGAGAACCCCAAGAACCAGGCCCCCCCCGGCCUGUACACCAAGACCCAGGACCCCGCCAAGGCCCCCAACACCCCCGACAUCCUGGAGAUCGAGUUCAAGAAGGGCGUGCCCGUGAAGGUGACCAACGUGAAGGACGGCACCACCCACCAGACCAGCCUGGAGCUGUUCAUGUACCUGAACGAGGUGGCCGGCAAGCACGGCGUGGGCCGCAUCGACAUCGUGGAGAACCGCUUCAUCGGCAUGAAGAGCCGCGGCAUCUACGAGACCCCCGCCGGCACCAUCCUGUACCACGCCCACCUGGACAUCGAGGCCUUCACCAUGGACCGCGAGGUGCGCAAGAUCAAGCAGGGCCUGGGCCUGAAGUUCGCCGAGCUGGUGUACACCGGCUUCUGGCACAGCCCCGAGUGCGAGUUCGUGCGCCACUGCAUCGCCAAGAGCCAGGAGCGCGUGGAGGGCAAGGUGCAGGUGAGCGUGCUGAAGGGCCAGGUGUACAUCCUGGGCCGCGAGAGCCCCCUGAGCCUGUACAACGAGGAGCUGGUGAGCAUGAACGUGCAGGGCGACUACGAGCCCACCGACGCCACCGGCUUCAUCAACAUCAACAGCCUGCGCCUGAAGGAGUACCACCGCCUGCAGAGCAAGGUGACCGCCAAGUGAY
コドン最適化ホタルルシフェラーゼmRNA:
XAUGGAAGAUGCCAAAAACAUUAAGAAGGGCCCAGCGCCAUUCUACCCACUCGAAGACGGGACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAAGCCAUGAAGCGCUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUUACCGACGCACAUAUCGAGGUGGACAUUACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUUCGGCUGGCAGAAGCUAUGAAGCGCUAUGGGCUGAAUACAAACCAUCGGAUCGUGGUGUGCAGCGAGAAUAGCUUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGUUGGGUGCCCUGUUCAUCGGUGUGGCUGUGGCCCCAGCUAACGACAUCUACAACGAGCGCGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCCACCGUCGUAUUCGUGAGCAAGAAAGGGCUGCAAAAGAUCCUCAACGUGCAAAAGAAGCUACCGAUCAUACAAAAGAUCAUCAUCAUGGAUAGCAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAAAGCAUGUACACCUUCGUGACUUCCCAUUUGCCACCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGAGCUUCGACCGGGACAAAACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGUAGUGGCAGUACCGGAUUGCCCAAGGGCGUAGCCCUACCGCACCGCACCGCUUGUGUCCGAUUCAGUCAUGCCCGCGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAUCAUCCCCGACACCGCUAUCCUCAGCGUGGUGCCAUUUCACCACGGCUUCGGCAUGUUCACCACGCUGGGCUACUUGAUCUGCGGCUUUCGGGUCGUGCUCAUGUACCGCUUCGAGGAGGAGCUAUUCUUGCGCAGCUUGCAAGACUAUAAGAUUCAAUCUGCCCUGCUGGUGCCCACACUAUUUAGCUUCUUCGCUAAGAGCACUCUCAUCGACAAGUACGACCUAAGCAACUUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGGGCGCCGCUCAGCAAGGAGGUAGGUGAGGCCGUGGCCAAACGCUUCCACCUACCAGGCAUCCGCCAGGGCUACGGCCUGACAGAAACAACCAGCGCCAUUCUGAUCACCCCCGAAGGGGACGACAAGCCUGGCGCAGUAGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCGAGGCUAAGGUGGUGGACUUGGACACCGGUAAGACACUGGGUGUGAACCAGCGCGGCGAGCUGUGCGUCCGUGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGCUACGUUAACAACCCCGAGGCUACAAACGCUCUCAUCGACAAGGACGGCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCACUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAAUACAAGGGCUACCAGGUAGCCCCAGCCGAACUGGAGAGCAUCCUGCUGCAACACCCCAACAUCUUCGACGCCGGGGUCGCCGGCCUGCCCGACGACGAUGCCGGCGAGCUGCCCGCCGCAGUCGUCGUGCUGGAACACGGUAAAACCAUGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUAUGUGGCCAGCCAGGUUACAACCGCCAAGAAGCUGCGCGGUGGUGUUGUGUUCGUGGACGAGGUGCCUAAAGGACUGACCGGCAAGUUGGACGCCCGCAAGAUCCGCGAGAUUCUCAUUAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUAAY
ヒト第IX因子(FIX)mRNA:
XAUGCAGCGCGUGAACAUGAUCAUGGCAGAAUCACCAGGCCUCAUCACCAUCUGCCUUUUAGGAUAUCUACUCAGUGCUGAAUGUACAGUUUUUCUUGAUCAUGAAAACGCCAACAAAAUUCUGAGGCGGAGAAGGAGGUAUAAUUCAGGUAAAUUGGAAGAGUUUGUUCAAGGGAACCUUGAGAGAGAAUGUAUGGAAGAAAAGUGUAGUUUUGAAGAAGCACGAGAAGUUUUUGAAAACACUGAAAGAACAACUGAAUUUUGGAAGCAGUAUGUUGAUGGAGAUCAGUGUGAGUCCAAUCCAUGUUUAAAUGGCGGCAGUUGCAAGGAUGACAUUAAUUCCUAUGAAUGUUGGUGUCCCUUUGGAUUUGAAGGAAAGAACUGUGAAUUAGAUGUAACAUGUAACAUUAAGAAUGGCAGAUGCGAGCAGUUUUGUAAAAAUAGUGCUGAUAACAAGGUGGUUUGCUCCUGUACUGAGGGAUAUCGACUUGCAGAAAACCAGAAGUCCUGUGAACCAGCAGUGCCAUUUCCAUGUGGAAGAGUUUCUGUUUCACAAACUUCUAAGCUCACCCGUGCUGAGGCUGUUUUUCCUGAUGUGGACUAUGUAAAUUCUACUGAAGCUGAAACCAUUUUGGAUAACAUCACUCAAAGCACCCAAUCAUUUAAUGACUUCACUCGGGUUGUUGGUGGAGAAGAUGCCAAACCAGGUCAAUUCCCUUGGCAGGUUGUUUUGAAUGGUAAAGUUGAUGCAUUCUGUGGAGGCUCUAUCGUUAAUGAAAAAUGGAUUGUAACUGCUGCCCACUGUGUUGAAACUGGUGUUAAAAUUACAGUUGUCGCAGGUGAACAUAAUAUUGAGGAGACAGAACAUACAGAGCAAAAGCGAAAUGUGAUUCGAAUUAUUCCUCACCACAACUACAAUGCAGCUAUUAAUAAGUACAACCAUGACAUUGCCCUUCUGGAACUGGACGAACCCUUAGUGCUAAACAGCUACGUUACACCUAUUUGCAUUGCUGACAAGGAAUACACGAACAUCUUCCUCAAAUUUGGAUCUGGCUAUGUAAGUGGCUGGGGAAGAGUCUUCCACAAAGGGAGAUCAGCUUUAGUUCUUCAGUACCUUAGAGUUCCACUUGUUGACCGAGCCACAUGUCUUCGAUCUACAAAGUUCACCAUCUAUAACAACAUGUUCUGUGCUGGCUUCCAUGAAGGAGGUAGAGAUUCAUGUCAAGGAGAUAGUGGGGGACCCCAUGUUACUGAAGUGGAAGGGACCAGUUUCUUAACUGGAAUUAUUAGCUGGGGUGAAGAGUGUGCAAUGAAAGGCAAAUAUGGAAUAUAUACCAAGGUAUCCCGGUAUGUCAACUGGAUUAAGGAAAAAACAAAGCUCACUUAAY
コドン最適化ヒトフェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)mRNA:
XAUGAGCACCGCCGUGCUGGAGAACCCCGGCCUGGGCCGCAAGCUGAGCGACUUCGGCCAGGAGACCAGCUACAUCGAGGACAACUGCAACCAGAACGGCGCCAUCAGCCUGAUCUUCAGCCUGAAGGAGGAGGUGGGCGCCCUGGCCAAGGUGCUGCGCCUGUUCGAGGAGAACGACGUGAACCUGACCCACAUCGAGAGCCGCCCCAGCCGCCUGAAGAAGGACGAGUACGAGUUCUUCACCCACCUGGACAAGCGCAGCCUGCCCGCCCUGACCAACAUCAUCAAGAUCCUGCGCCACGACAUCGGCGCCACCGUGCACGAGCUGAGCCGCGACAAGAAGAAGGACACCGUGCCCUGGUUCCCCCGCACCAUCCAGGAGCUGGACCGCUUCGCCAACCAGAUCCUGAGCUACGGCGCCGAGCUGGACGCCGACCACCCCGGCUUCAAGGACCCCGUGUACCGCGCCCGCCGCAAGCAGUUCGCCGACAUCGCCUACAACUACCGCCACGGCCAGCCCAUCCCCCGCGUGGAGUACAUGGAGGAGGAGAAGAAGACCUGGGGCACCGUGUUCAAGACCCUGAAGAGCCUGUACAAGACCCACGCCUGCUACGAGUACAACCACAUCUUCCCCCUGCUGGAGAAGUACUGCGGCUUCCACGAGGACAACAUCCCCCAGCUGGAGGACGUGAGCCAGUUCCUGCAGACCUGCACCGGCUUCCGCCUGCGCCCCGUGGCCGGCCUGCUGAGCAGCCGCGACUUCCUGGGCGGCCUGGCCUUCCGCGUGUUCCACUGCACCCAGUACAUCCGCCACGGCAGCAAGCCCAUGUACACCCCCGAGCCCGACAUCUGCCACGAGCUGCUGGGCCACGUGCCCCUGUUCAGCGACCGCAGCUUCGCCCAGUUCAGCCAGGAGAUCGGCCUGGCCAGCCUGGGCGCCCCCGACGAGUACAUCGAGAAGCUGGCCACCAUCUACUGGUUCACCGUGGAGUUCGGCCUGUGCAAGCAGGGCGACAGCAUCAAGGCCUACGGCGCCGGCCUGCUGAGCAGCUUCGGCGAGCUGCAGUACUGCCUGAGCGAGAAGCCCAAGCUGCUGCCCCUGGAGCUGGAGAAGACCGCCAUCCAGAACUACACCGUGACCGAGUUCCAGCCCCUGUACUACGUGGCCGAGAGCUUCAACGACGCCAAGGAGAAGGUGCGCAACUUCGCCGCCACCAUCCCCCGCCCCUUCAGCGUGCGCUACGACCCCUACACCCAGCGCAUCGAGGUGCUGGACAACACCCAGCAGCUGAAGAUCCUGGCCGACAGCAUCAACAGCGAGAUCGGCAUCCUGUGCAGCGCCCUGCAGAAGAUCAAGUAAY
コドン最適化嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)mRNA:
AUGCAGCGGUCCCCGCUCGAAAAGGCCAGUGUCGUGUCCAAACUCUUCUUCUCAUGGACUCGGCCUAUCCUUAGAAAGGGGUAUCGGCAGAGGCUUGAGUUGUCUGACAUCUACCAGAUCCCCUCGGUAGAUUCGGCGGAUAACCUCUCGGAGAAGCUCGAACGGGAAUGGGACCGCGAACUCGCGUCUAAGAAAAACCCGAAGCUCAUCAACGCACUGAGAAGGUGCUUCUUCUGGCGGUUCAUGUUCUACGGUAUCUUCUUGUAUCUCGGGGAGGUCACAAAAGCAGUCCAACCCCUGUUGUUGGGUCGCAUUAUCGCCUCGUACGACCCCGAUAACAAAGAAGAACGGAGCAUCGCGAUCUACCUCGGGAUCGGACUGUGUUUGCUUUUCAUCGUCAGAACACUUUUGUUGCAUCCAGCAAUCUUCGGCCUCCAUCACAUCGGUAUGCAGAUGCGAAUCGCUAUGUUUAGCUUGAUCUACAAAAAGACACUGAAACUCUCGUCGCGGGUGUUGGAUAAGAUUUCCAUCGGUCAGUUGGUGUCCCUGCUUAGUAAUAACCUCAACAAAUUCGAUGAGGGACUGGCGCUGGCACAUUUCGUGUGGAUUGCCCCGUUGCAAGUCGCCCUUUUGAUGGGCCUUAUUUGGGAGCUGUUGCAGGCAUCUGCCUUUUGUGGCCUGGGAUUUCUGAUUGUGUUGGCAUUGUUUCAGGCUGGGCUUGGGCGGAUGAUGAUGAAGUAUCGCGACCAGAGAGCGGGUAAAAUCUCGGAAAGACUCGUCAUCACUUCGGAAAUGAUCGAAAACAUCCAGUCGGUCAAAGCCUAUUGCUGGGAAGAAGCUAUGGAGAAGAUGAUUGAAAACCUCCGCCAAACUGAGCUGAAACUGACCCGCAAGGCGGCGUAUGUCCGGUAUUUCAAUUCGUCAGCGUUCUUCUUUUCCGGGUUCUUCGUUGUCUUUCUCUCGGUUUUGCCUUAUGCCUUGAUUAAGGGGAUUAUCCUCCGCAAGAUUUUCACCACGAUUUCGUUCUGCAUUGUAUUGCGCAUGGCAGUGACACGGCAAUUUCCGUGGGCCGUGCAGACAUGGUAUGACUCGCUUGGAGCGAUCAACAAAAUCCAAGACUUCUUGCAAAAGCAAGAGUACAAGACCCUGGAGUACAAUCUUACUACUACGGAGGUAGUAAUGGAGAAUGUGACGGCUUUUUGGGAAGAGGGUUUUGGAGAACUGUUUGAGAAAGCAAAGCAGAAUAACAACAACCGCAAGACCUCAAAUGGGGACGAUUCCCUGUUUUUCUCGAACUUCUCCCUGCUCGGAACACCCGUGUUGAAGGACAUCAAUUUCAAGAUUGAGAGGGGACAGCUUCUCGCGGUAGCGGGAAGCACUGGUGCGGGAAAAACUAGCCUCUUGAUGGUGAUUAUGGGGGAGCUUGAGCCCAGCGAGGGGAAGAUUAAACACUCCGGGCGUAUCUCAUUCUGUAGCCAGUUUUCAUGGAUCAUGCCCGGAACCAUUAAAGAGAACAUCAUUUUCGGAGUAUCCUAUGAUGAGUACCGAUACAGAUCGGUCAUUAAGGCGUGCCAGUUGGAAGAGGACAUUUCUAAGUUCGCCGAGAAGGAUAACAUCGUCUUGGGAGAAGGGGGUAUUACAUUGUCGGGAGGGCAGCGAGCGCGGAUCAGCCUCGCGAGAGCGGUAUACAAAGAUGCAGAUUUGUAUCUGCUUGAUUCACCGUUUGGAUACCUCGACGUAUUGACAGAAAAAGAAAUCUUCGAGUCGUGCGUGUGUAAACUUAUGGCUAAUAAGACGAGAAUCCUGGUGACAUCAAAAAUGGAACACCUUAAGAAGGCGGACAAGAUCCUGAUCCUCCACGAAGGAUCGUCCUACUUUUACGGCACUUUCUCAGAGUUGCAAAACUUGCAGCCGGACUUCUCAAGCAAACUCAUGGGGUGUGACUCAUUCGACCAGUUCAGCGCGGAACGGCGGAACUCGAUCUUGACGGAAACGCUGCACCGAUUCUCGCUUGAGGGUGAUGCCCCGGUAUCGUGGACCGAGACAAAGAAGCAGUCGUUUAAGCAGACAGGAGAAUUUGGUGAGAAAAGAAAGAACAGUAUCUUGAAUCCUAUUAACUCAAUUCGCAAGUUCUCAAUCGUCCAGAAAACUCCACUGCAGAUGAAUGGAAUUGAAGAGGAUUCGGACGAACCCCUGGAGCGCAGGCUUAGCCUCGUGCCGGAUUCAGAGCAAGGGGAGGCCAUUCUUCCCCGGAUUUCGGUGAUUUCAACCGGACCUACACUUCAGGCGAGGCGAAGGCAAUCCGUGCUCAACCUCAUGACGCAUUCGGUAAACCAGGGGCAAAACAUUCACCGCAAAACGACGGCCUCAACGAGAAAAGUGUCACUUGCACCCCAGGCGAAUUUGACUGAACUCGACAUCUACAGCCGUAGGCUUUCGCAAGAAACCGGACUUGAGAUCAGCGAAGAAAUCAAUGAAGAAGAUUUGAAAGAGUGUUUCUUUGAUGACAUGGAAUCAAUCCCAGCGGUGACAACGUGGAACACAUACUUGCGUUACAUCACGGUGCACAAGUCCUUGAUUUUCGUCCUCAUCUGGUGUCUCGUGAUCUUUCUCGCUGAGGUCGCAGCGUCACUUGUGGUCCUCUGGCUGCUUGGUAAUACGCCCUUGCAAGACAAAGGCAAUUCUACACACUCAAGAAACAAUUCCUAUGCCGUGAUUAUCACUUCUACAAGCUCGUAUUACGUGUUUUACAUCUACGUAGGAGUGGCCGACACUCUGCUCGCGAUGGGUUUCUUCCGAGGACUCCCACUCGUUCACACGCUUAUCACUGUCUCCAAGAUUCUCCACCAUAAGAUGCUUCAUAGCGUACUGCAGGCUCCCAUGUCCACCUUGAAUACGCUCAAGGCGGGAGGUAUUUUGAAUCGCUUCUCAAAAGAUAUUGCAAUUUUGGAUGACCUUCUGCCCCUGACGAUCUUCGACUUCAUCCAGUUGUUGCUGAUCGUGAUUGGGGCUAUUGCAGUAGUCGCUGUCCUCCAGCCUUACAUUUUUGUCGCGACCGUUCCGGUGAUCGUGGCGUUUAUCAUGCUGCGGGCCUAUUUCUUGCAGACGUCACAGCAGCUUAAGCAACUGGAGUCUGAAGGGAGGUCGCCUAUCUUUACGCAUCUUGUGACCAGUUUGAAGGGAUUGUGGACGUUGCGCGCCUUUGGCAGGCAGCCCUACUUUGAAACACUGUUCCACAAAGCGCUGAAUCUCCAUACGGCAAAUUGGUUUUUGUAUUUGAGUACCCUCCGAUGGUUUCAGAUGCGCAUUGAGAUGAUUUUUGUGAUCUUCUUUAUCGCGGUGACUUUUAUCUCCAUCUUGACCACGGGAGAGGGCGAGGGACGGGUCGGUAUUAUCCUGACACUCGCCAUGAACAUUAUGAGCACUUUGCAGUGGGCAGUGAACAGCUCGAUUGAUGUGGAUAGCCUGAUGAGGUCCGUUUCGAGGGUCUUUAAGUUCAUCGACAUGCCGACGGAGGGAAAGCCCACAAAAAGUACGAAACCCUAUAAGAAUGGGCAAUUGAGUAAGGUAAUGAUCAUCGAGAACAGUCACGUGAAGAAGGAUGACAUCUGGCCUAGCGGGGGUCAGAUGACCGUGAAGGACCUGACGGCAAAAUACACCGAGGGAGGGAACGCAAUCCUUGAAAACAUCUCGUUCAGCAUUAGCCCCGGUCAGCGUGUGGGGUUGCUCGGGAGGACCGGGUCAGGAAAAUCGACGUUGCUGUCGGCCUUCUUGAGACUUCUGAAUACAGAGGGUGAGAUCCAGAUCGACGGCGUUUCGUGGGAUAGCAUCACCUUGCAGCAGUGGCGGAAAGCGUUUGGAGUAAUCCCCCAAAAGGUCUUUAUCUUUAGCGGAACCUUCCGAAAGAAUCUCGAUCCUUAUGAACAGUGGUCAGAUCAAGAGAUUUGGAAAGUCGCGGACGAGGUUGGCCUUCGGAGUGUAAUCGAGCAGUUUCCGGGAAAACUCGACUUUGUCCUUGUAGAUGGGGGAUGCGUCCUGUCGCAUGGGCACAAGCAGCUCAUGUGCCUGGCGCGAUCCGUCCUCUCUAAAGCGAAAAUUCUUCUCUUGGAUGAACCUUCGGCCCAUCUGGACCCGGUAACGUAUCAGAUCAUCAGAAGGACACUUAAGCAGGCGUUUGCCGACUGCACGGUGAUUCUCUGUGAGCAUCGUAUCGAGGCCAUGCUCGAAUGCCAGCAAUUUCUUGUCAUCGAAGAGAAUAAGGUCCGCCAGUACGACUCCAUCCAGAAGCUGCUUAAUGAGAGAUCAUUGUUCCGGCAGGCGAUUUCACCAUCCGAUAGGGUGAAACUUUUUCCACACAGAAAUUCGUCGAAGUGCAAGUCCAAACCGCAGAUCGCGGCCUUGAAAGAAGAGACUGAAGAAGAAGUUCAAGACACGCGUCUUUAA
5’及び3’UTR配列
X=
GGACAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG
Y=
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUCAAGCU
脂質の混合物(カチオン性脂質、ヘルパー脂質、双生イオン脂質、PEG脂質等)のエタノール性溶液を調製して、報告された容量にし、選択された温度まで加熱した。個別に、mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を、1mg/mLの原液から調製し、選択された温度まで5〜10分間加熱した。
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FFL mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を、1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FFL mRNA(カプセル化)。Zave=91nm PDI(0.16)。
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FIX mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FIX mRNA(カプセル化)。Zave=64nm;PDI(0.12)。
cKK−E12、DOPE、Chol及びDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール性溶液の一定分量を混合し、エタノールで希釈して3mLの最終容量とした。個別に、FIX mRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)を1mg/mLの原液から調製した。脂質溶液を、mRNA水溶液に迅速に注入し、振とうして20%エタノールの最終懸濁液を得た。結果得られたナノ粒子懸濁液をろ過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルトレーションし、濃縮し、2〜8℃で保管した。最終濃度=0.20mg/mL FIX mRNA(カプセル化)。Zave=73nm;PDI(0.13)。
エタノール脂質溶液及びmRNAの緩衝水溶液(10mMクエン酸塩/150mM NaCl、pH4.5)の両方を、製剤プロセスの前に異なる選択温度で加熱して、製剤の最終収率及びカプセル化効率に及ぼす温度の効果を決定した。
本実施例は、増加した温度でmRNAをカプセル化するための例示的な規模を大きくした製剤プロセスを例証する。
上記ステップから得た製剤の精製及び緩衝液交換を、Spectrum labsからのKrosFlo(登録商標)Research IIiタンジェンシャルフローろ過システムで、修飾ポリエーテルスルホン中空糸フィルタモジュールを使用して行う。緩衝液交換は、6倍容量の滅菌PBS(pH7.4)で、連続ダイアフィルトレーション形態において行う。図2を参照されたい。製剤を、サイズ(PDI)及びカプセル化(収率)について分析する。例示的なデータを表2に表す。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を、認識するだろう、または通常の実験のみを使用して確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の説明により制限されることを意図しないが、以下の特許請求の範囲に明記される。
Claims (35)
- メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、80%以上のカプセル化率での脂質ナノ粒子内のmRNAのカプセル化をもたらすように、低パルス流ポンプによりmRNA溶液と脂質溶液を、混合の間1を超える一定のN/P比で混合するステップを含み、前記ナノ粒子が、100nm以下の平均サイズおよび0.19以下の均質性の尺度(PDI)を有する、前記プロセス。
- 前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に所定の温度まで加熱される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記ポンプが、ギアポンプである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記ポンプが、渦巻きポンプである、請求項1に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液が、約150〜250ml/分、250〜500ml/分、500〜1000ml/分、1000〜2000ml/分、2000〜3000ml/分、3000〜4000ml/分、または4000〜5000ml/分の範囲の流速で混合される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、約25〜75ml/分、約75〜200ml/分、約200〜350ml/分、約350〜500ml/分、約500〜650ml/分、約650〜850ml/分、または約850〜1000ml/分の範囲の流速で混合される、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、20%以下のエタノールを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、請求項8に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、C12−200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK−E12、ICE(イミダゾール系)、HGT5000、HGT5001、DDAB、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA及びDMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin−K−DMA、DLin−K−XTC2−DMA、HGT4003、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される1つ以上のカチオン性脂質を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、DSPC(1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−(ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPC(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−フォスホチジルコリン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、およびDOPG(1、2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1’−rac−グリセロール))から選択される1つ以上の非カチオン性脂質を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記mRNAが、1つ以上の修飾されたヌクレオチドを含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液および/または前記脂質溶液が、25〜70℃の範囲の所定の温度である、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、PEG修飾された脂質を含む、請求項1に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液中の総脂質の少なくとも5%が、PEG修飾された脂質である、請求項13に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液および前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に37℃以上の温度まで加熱され、前記脂質ナノ粒子が、0.12以下のPDIを有する、請求項5に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液および前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に65℃以上の温度まで加熱され、前記脂質ナノ粒子が、0.10以下のPDIを有する、請求項5に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液および前記脂質溶液が、前記混合の前に別々に65℃以上の温度まで加熱され、前記脂質ナノ粒子が、90%を超えるカプセル化率を有する、請求項5に記載のプロセス。
- 前記N/P比が約2〜約6である、請求項1に記載のプロセス。
- メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、
約220ml/分〜約6000ml/分の流速で、クエン酸塩緩衝液をmRNA原液と混合することにより、mRNA溶液を生成するステップと
低パルス流ポンプによりmRNA溶液と脂質溶液を混合するステップであって、前記mRNA溶液および/または前記脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、ステップと
を含む、前記プロセス。 - 前記所定の温度が約65℃である、請求項20に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液が、約200ml/分の流速で混合される、請求項20に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、約50ml/分の流速で混合される、請求項20に記載のプロセス。
- 前記mRNA原液が、1mg/ml以上の濃度で前記mRNAを含む、請求項20に記載のプロセス。
- メッセンジャーRNA(mRNA)を脂質ナノ粒子内にカプセル化するプロセスであって、
約20ml/分〜約600ml/分の流速で、mRNA原液をクエン酸塩緩衝液と混合することにより、mRNA溶液を生成するステップと
低パルス流ポンプによりmRNA溶液と脂質溶液を混合するステップであって、前記mRNA溶液および/または前記脂質溶液が、周囲温度を超える所定の温度である、ステップと
を含む、前記プロセス。 - 前記脂質溶液が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含む、請求項20に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、20%エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす、請求項20に記載のプロセス。
- 前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、請求項27に記載のプロセス。
- 前記所定の温度が約65℃である、請求項25に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液が約200ml/分の流速で混合される、請求項25に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が約50ml/分の流速で混合される、請求項25に記載のプロセス。
- 前記mRNA原液が、1mg/ml以上の濃度で前記mRNAを含む、請求項25に記載のプロセス。
- 前記脂質溶液が、1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上のヘルパー脂質、1つ以上のコレステロール系脂質及びPEG脂質をエタノール中に含む、請求項25に記載のプロセス。
- 前記mRNA溶液及び前記脂質溶液が、20%エタノール中へと混合され、脂質ナノ粒子の懸濁液を結果もたらす、請求項25に記載のプロセス。
- 前記脂質ナノ粒子が、タンジェンシャルフローろ過によりさらに精製される、請求項34に記載のプロセス。
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