JP2023514450A - Ｍｒｎａ担持脂質ナノ粒子を調製する改善された方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、脂質ナノ粒子製剤およびｍＲＮＡ封入のための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、予め形成された脂質ナノ粒子の懸濁液とメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を混合する工程を含む、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／９８１，４２５号に対する優先権を主張するものであり、全ての目的に対し、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本明細書は、配列表（「ＭＲＴ－２１２６ＷＯ＿ＳＬ＿ＳＴ２５」という名称のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして２０２１年２月２５日に電子的に提出された）を参照する。当該テキストファイルは、２０２１年２月２４日に作成されたものであり、１８ＫＢのサイズである。配列表の全内容が、参照によって本明細書に援用される。
メッセンジャーＲＮＡ療法（ＭＲＴ）は、様々な疾患の治療にますます重要なアプローチとなっている。ＭＲＴは、療法を必要とする患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するために、患者にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を投与することを伴う。脂質ナノ粒子は、一般的に、ｍＲＮＡの効率的なインビボ送達のためにｍＲＮＡを封入するために使用される。
脂質ナノ粒子送達を改善するために、多くの試みは、例えば、様々な種類の哺乳動物組織、器官および／または細胞（例えば、哺乳動物肝細胞）において、ｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現に影響し得る新規の脂質または特定の脂質組成物を識別することに焦点を当てている。しかしながら、これらのアプローチは、費用がかかり、時間がかかり、予測不可能である。
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を調製するための改善された方法を提供する。特に本発明は、図１に示されるように、予め形成された脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを装填する間にＮ／Ｐ比を変更することにより、ｍＲＮＡのインビボ送達において予想外の効率を呈し、およびｍＲＮＡがコードするタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドが驚くほどに強力に発現する、製剤化脂質ナノ粒子が得られるという驚くべき発見に基づいている。
したがって、従来的な方法と比較し、本発明の方法を採用することで、得られる脂質ナノ粒子の治療指数をポジティブな方向にシフトさせることができる。関連する利点としては、コストが低いこと、患者のコンプライアンスが優れていること、そして患者にとってより親切な投薬レジメンであることが挙げられ得る。本発明の方法により、効率的な封入と、均質な粒子サイズも得られる。特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明の方法は特に、全身送達用の脂質ナノ粒子組成物の調製に有用であり、非常に優れた標的細胞へのインビボ送達効率と、ｍＲＮＡにコードされたタンパク質の発現が観察された。いくつかの実施形態では、全身送達は、肝臓、特に肝細胞への送達を含む。
本発明の方法は、ポンプシステムを使用して実施され得、したがって拡張可能であり、例えば、臨床試験および／または商業販売の実施に十分な量の改善された粒子形成／製剤を可能にする。
第一の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に封入する方法を提供するものであり、この場合において当該ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含み、またはこれらからなり、当該方法は、（ａ）ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積を、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液に添加し、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含有する混合液を形成させる工程、および（ｂ）望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまで、前工程で得られた混合液に、ｍＲＮＡを含有する溶液の一つ以上の追加体積を添加する工程、を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積の添加は、ｍＲＮＡに対して、少なくとも１０倍モル過剰なカチオン性脂質をもたらす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積の添加は、ｍＲＮＡに対して、少なくとも１５倍モル過剰なカチオン性脂質をもたらす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積の添加は、約１０～２０（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比をもたらす。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積の添加は、約１６（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比をもたらす。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積、および一つ以上の追加体積は、等しい体積である。
いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積は、四つの体積以下、または八つの体積以下である。いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積は、一、二、三、四、五、六、七または八つの追加体積である。
いくつかの実施形態では、混合期間は、ｍＲＮＡを含有する溶液の一つ以上の追加体積の各々を添加する前に発生する。いくつかの実施形態では、各期間の長さは、等しい。いくつかの実施形態では、各期間は、５分を超えない。いくつかの実施形態では、各期間は、約３～５分である。いくつかの実施形態では、各期間は、約４分である。
いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積の最後の体積の添加の後に、さらなる混合期間が続く。いくつかの実施形態では、当該さらなる期間は、先行する期間の各々と長さが等しい。他の実施形態では、当該さらなる期間は、先行する期間の各々よりも長い。いくつかの実施形態では、当該さらなる期間は、先行する期間の各々よりも、少なくとも１．５～２倍長い。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の第一の体積、および一つ以上の追加体積は、連続して添加される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の連続的添加は、２０分を超えない期間で行われる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の連続的添加は、一定の流量で発生する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の連続的添加は、経時的に増加する、または減少する流量で行われる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含有する溶液の連続的添加の期間の後に、混合期間が続く。いくつかの実施形態では、連続的添加の期間、および連続的添加の後の混合期間は、２０分を超えない。
第二の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ：ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）に封入する方法を提供するものであり、この場合において当該ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含み、またはこれらからなり、当該方法は、（ａ）ｍＲＮＡを含有する溶液に、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の第一の体積を添加し、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含有する混合液を形成させる工程、および（ｂ）望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまで、前工程で得られた混合液に、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の一つ以上の追加体積を添加する工程、を含む。
いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の第一の体積の添加によって、カチオン性脂質とｍＲＮＡが、およそ等しいモル比となる。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の一つ以上の追加体積の添加によって、ｍＲＮＡに対してカチオン性脂質がモル過剰となる。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の一つ以上の追加体積の添加によって、ｍＲＮＡに対してカチオン性脂質がおよそ２倍～４倍モル過剰となる。
いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁物の第一の体積、および一つ以上の追加体積は、等しい体積である。
いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積は、四つの体積以下、または八つの体積以下である。いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積は、一、二、三、四、五、六、七または八つの追加体積である。
いくつかの実施形態では、混合期間が、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の一つ以上の追加体積の各々を添加する前に発生する。いくつかの実施形態では、各期間の長さは、等しい。いくつかの実施形態では、当該期間は、５分を超えない。いくつかの実施形態では、当該期間は、約３～５分である。いくつかの実施形態では、当該期間は、約４分である。
いくつかの実施形態では、一つ以上の追加体積の最後の体積の添加の後に、さらなる混合期間が続く。いくつかの実施形態では、当該さらなる混合期間は、先行する期間の各々と長さが等しい。他の実施形態では、当該さらなる期間は、先行する期間の各々よりも長い。いくつかの実施形態では、当該さらなる期間は、先行する期間の各々よりも、少なくとも１．５～２倍長い。
いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の第一の体積、および一つ以上の追加体積は、連続して添加される。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の連続的添加は、２０分を超えない期間で行われる。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の連続的添加は、一定の流量で発生する。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の連続的添加は、経時的に増加する、または減少する流量で発生する。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液の連続的添加の期間の後に、混合期間が続く。いくつかの実施形態では、連続的添加の期間、および連続的添加の後の混合期間は、２０分を超えない。
本発明のこれらの態様では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液は、約６０℃～約７０℃であってもよく、ｍＲＮＡを含有する溶液は周囲温度であってもよい。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰを含有する懸濁液は、約６５℃である。いくつかの実施形態では、混合は、ＬＮＰとｍＲＮＡを組み合わせた混合液を、約６０℃～約７０℃に加熱することを含む。いくつかの実施形態では、混合は、ＬＮＰとｍＲＮＡを組み合わせた混合液を、約６５℃に加熱することを含む。
本発明のこれらの態様では、望ましいモル比は、約３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）であってもよい。いくつかの実施形態では、望ましいモル比は、約４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である。
本発明のこれらの態様では、空のＬＮＰは、脂質溶液と水溶液と混合することにより形成されてもよく、この場合において当該脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質のエタノール溶液を含む。いくつかの実施形態では、水溶液は、クエン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、エタノールおよび／またはクエン酸塩は、接線流ろ過によって除去されて、空のＬＮＰを含有する溶液が形成される。
本発明のこれらの態様のいずれかにおいて、予め形成された空のＬＮＰの約９０％超は、７５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する。典型的には、本発明の第一の態様および第二の態様に記載される方法によって、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰが得られ、当該ＬＮＰの約９０％超は、予め形成された空のＬＮＰよりも少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％）大きいサイズを有する。ｍＲＮＡ封入率は、典型的には、約８０％超、例えば、約９０％超である。
本発明のこれらの態様のいずれかでは、予め形成された空のＬＮＰ、およびｍＲＮＡは、ポンプシステムを使用して混合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポンプシステムは、パルスレスフローポンプ、例えばギアポンプまたは遠心ポンプを含む。
本発明の第一の態様および第二の態様に記載される方法を使用して、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の組成物を調製することができ、この場合においてＬＮＰの平均サイズは、封入中にカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を変更することなく、予め形成された空のＬＮＰとｍＲＮＡを混合することによって調製されたＬＮＰよりも、５％～１０％大きい。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約７５ｎｍ～１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約０．２５未満～０．１６未満のＰＤＩを含む。
本発明の第一の態様および第二の態様の方法によって調製されたｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む組成物は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の欠損に罹患する対象を治療する方法における用途が見いだされ、この場合において当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含み、当該ｍＲＮＡは、当該ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）から選択される。
本発明の第一の態様および第二の態様の方法によって調製されたｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む組成物は、ｍＲＮＡを送達して、インビボでタンパク質を産生させる方法における用途が見いだされる。かかる方法は、当該組成物を対象に投与することを含む。ｍＲＮＡは、典型的には、対象タンパク質をコードする。
第三の態様では、本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を作製する方法を提供するものであり、この場合において当該方法は、（ａ）第一のカチオン性脂質、第一の非カチオン性脂質、第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含有する予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の第一のセットと、ｍＲＮＡを、当該ｍＲＮＡの封入が可能となる条件下で混合すること、（ｂ）工程（ａ）で形成されたｍＲＮＡ封入ＬＮＰと、第二のカチオン性脂質、第二の非カチオン性脂質、第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含有する予め形成された空のＬＮＰの第二のセットを組み合わせ、ＬＮＰ組成物を得ること、を含む。典型的には、ｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰの第一のセット、および予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、同じ脂質組成を有する。いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰの第一のセット、および予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、異なる脂質組成を有する。いくつかの実施形態では、第一のカチオン性脂質と第二のカチオン性脂質は、異なっている。いくつかの実施形態では、第一の非カチオン性脂質と第二の非カチオン性脂質は、異なっている。いくつかの実施形態では、第一のカチオン性脂質と第二のカチオン性脂質は同一であり、第一の非カチオン性脂質と第二の非カチオン性脂質は異なっている。いくつかの実施形態では、第一の非カチオン性脂質はＤＯＰＥであり、第二の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであるか、または第一の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであり、第二の非カチオン性脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、方法はさらに、（ｉ）第一のカチオン性脂質、第一の非カチオン性脂質、第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを最初に混合して、工程（ａ）の前に予め形成された空のＬＮＰの第一のセットを形成させる工程、および／または（ｉｉ）第二のカチオン性脂質、第二の非カチオン性脂質、第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを最初に混合して、工程（ｂ）の前に予め形成された空のＬＮＰの第二のセットを形成させる工程、を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ、および予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３、または２：１～１：２の範囲の比率で組み合わされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ、および予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、２０：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、または１：２０以上の比率で組み合わされる。
いくつかの実施形態では、第一のセット、および第二のセットのｍＲＮＡ封入ＬＮＰならびに予め形成された空のＬＮＰは各々、直径約７５～１５０ｎｍの範囲の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、第一のセット、および第二のセットのｍＲＮＡ封入ＬＮＰならびに予め形成された空のＬＮＰは各々、直径１００ｎｍの未満の平均サイズを有する。
いくつかの実施形態では、組成物は、２０：１～１：１、１０：１～１：１、５：１～１：１、５：１～２：１、もしくは４：１～２：１の範囲の、または１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１５：１、もしくは２０：１よりも大きい総脂質：総ｍＲＮＡの比率を有する。
第四の態様では、本発明は、第一のカチオン性脂質、第一の非カチオン性脂質、第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含有するｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の第一のセット、ならびに第二のカチオン性脂質、第二の非カチオン性脂質、第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含有する空のＬＮＰの第二のセット、を含む組成物に関するものであり、この場合において当該第一のＬＮＰのセットおよび第二のＬＮＰのセットは、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３、または２：１～１：２の範囲の比率で存在する。典型的には、ｍＲＮＡは、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。
いくつかの実施形態では、第一のＬＮＰのセット、および第二のＬＮＰのセットは、同じ脂質組成を有する。いくつかの実施形態では、第一のＬＮＰのセット、および第二のＬＮＰのセットは、異なる脂質組成を有する。いくつかの実施形態では、第一のカチオン性脂質と第二のカチオン性脂質は、第一のＬＮＰのセットと第二のＬＮＰのセットの間で異なっている。いくつかの実施形態では、第一の非カチオン性脂質と第二の非カチオン性脂質は、第一のＬＮＰのセットと第二のＬＮＰのセットの間で異なっている。いくつかの実施形態では、第一のＬＮＰのセットと第二のＬＮＰのセットの間で、第一のカチオン性脂質と第二のカチオン性脂質は、同じであり、第一の非カチオン性脂質と第二の非カチオン性脂質は、異なっている。いくつかの実施形態では、第一の非カチオン性脂質はＤＯＰＥであり、第二の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであるか、または第一の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであり、第二の非カチオン性脂質はＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、第一のＬＮＰのセット、および第二のＬＮＰのセットは各々、直径約７５～１５０ｎｍの範囲の平均サイズを有する。いくつかの実施形態では、第一のＬＮＰのセット、および第二のＬＮＰのセットは各々、直径１００ｎｍ未満の平均サイズを有する。
本発明の第三の態様および第四の態様の組成物は、対象においてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の欠損を治療する方法における用途が見いだされ、この場合において当該方法は、当該組成物を当該対象に投与することを含み、当該ｍＲＮＡは、当該対象において欠損しているペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、組成物を対象に投与した後に、ｍＲＮＡによってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルは、同一のｍＲＮＡ封入ＬＮＰを含むが、第二の空のＬＮＰのセットを含まずに投与された同量のｍＲＮＡによってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルと比較して増加し、肝酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の発現レベルは同等である。特定の実施形態では、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現レベルは、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍増加する。
第五の態様では、本発明は、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含有する第一の液体と、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含有する第二の液体を混合することにより、予め形成された空のＬＮＰ内に、ｍＲＮＡを封入する方法を提供するものであり、この場合においてＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質を含み、当該方法は、（ａ）第一の期間、流量ｎ１の第一の液体と、流量ｎ２の第二の液体の第一の部分とを混合して、第一のモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡを有する混合液を作製すること、（ｂ）第二の期間、ｎ１より大きい流量の混合液と、流量ｎ２の第二の液体の第二の部分とを混合して、得られた混合液のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を、第一のモル比よりも少なくとも２０％低くすること、および（ｃ）得られた混合液の流量を増加させることにより、工程（ｂ）を反復して、各反復は、望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまでとすること、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、４回以下、例えば、３回または２回反復される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの望ましいモル比は、３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの望ましいモル比は、約４：１である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの第一のモル比は、３０：１～１０：１、例えば、約１６：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が一度実施された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、２４：１～８：１、例えば、約１２：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が一度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、２０：１～６：１、例えば、約８：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が二度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、１６：１～４：１、例えば、約４：１である。
いくつかの実施形態では、任意の工程における混合は、第一の液体を、混合接合部にポンプ注入すること、および第二の液体の一部を、混合接合部にポンプ注入すること、を含み、任意でこの場合において当該混合接合部は、Ｔ型接合部である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の混合は、第一の液体と、第二の液体の第一の部分を、第一の期間の第一の部分の間、混合すること、および第一の期間の第二の部分の間、混合液を中間容器に保管すること、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の混合は、（ｉ）混合液と、第二の液体の第二の部分を、第二の期間の第一の部分の間、混合すること、および（ｉｉ）第二の期間の第二の部分の間、工程（ｂ）（ｉ）で得られた混合液を、中間容器または当該中間容器に保管すること、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の第五の態様による方法は、工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を最終容器に保管することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の生成物を加熱し、その後に生成物を、中間容器もしくは当該中間容器に保管すること、またはさらに混合することであって、任意で工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｂ）の生成物は、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度まで加熱されること、をさらに含む。そのような実施形態では、方法はさらに、工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を冷却し、その後に最終容器に保管することであって、任意で工程（ｂ）または（ｃ）の生成物は、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度まで冷却されることを含んでもよい。
第六の態様では、本発明は、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含有する第一の液体と、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含有する第二の液体を混合することにより、予め形成された空のＬＮＰ内に、ｍＲＮＡを封入する方法を提供するものであり、この場合においてＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質を含み、当該方法は、（ａ）第一の期間、流量ｎ１の第一の液体の第一の部分と、流量ｎ２の第二の液体とを混合して、第一のモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡを有する混合液を作製すること、（ｂ）第二の期間、ｎ１より大きい流量の混合液と、流量ｎ２の第一の液体の第二の部分とを混合して、得られた混合液のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を、第一のモル比よりも少なくとも２０％大きくすること、および（ｃ）得られた混合液の流量を増加させることにより、工程（ｂ）を反復して、各反復は、望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまでとすること、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、４回以下、例えば、３回または２回反復される。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの望ましいモル比は、３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの望ましいモル比は、約４：１である。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質とｍＲＮＡの第一のモル比は、１：１０～１：１、例えば、約１：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が一度実施された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、１：５～２：１、例えば、約２：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が一度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、１：２～３：１、例えば、約３：１である。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）が二度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、１：１～４：１、例えば、約４：１である。
いくつかの実施形態では、任意の工程における混合は、第一の液体を、混合接合部にポンプ注入すること、および第二の液体を、混合接合部にポンプ注入すること、を含み、任意でこの場合において当該混合接合部は、Ｔ型接合部である。いくつかの実施形態では、工程（ａ）の混合は、第一の液体の第一の部分と、第二の液体を、第一の期間の第一の部分の間、混合すること、および第一の期間の第二の部分の間、混合された液体を中間容器に保管すること、を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）の混合は、（ｉ）混合液と、第一の液体の第二の部分を、第二の期間の第一の部分の間、混合すること、および（ｉｉ）第二の期間の第二の部分の間、工程（ｂ）（ｉ）で得られた混合された液体を、中間容器または当該中間容器に保管すること、を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の第六の態様による方法は、工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を最終容器に保管することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の生成物を加熱し、その後に生成物を、中間容器もしくは当該中間容器に保管すること、またはさらに混合することであって、任意で工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｂ）の生成物は、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度まで加熱されること、をさらに含む。そのような実施形態では、方法はさらに、工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を冷却し、その後に最終容器に保管することであって、任意で工程（ｂ）または（ｃ）の生成物は、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度まで冷却されることを含んでもよい。
以下の実施形態は、本発明の第五または第六の態様による方法に適用され得る。いくつかの実施形態では、第一の期間は、５分を超えない。いくつかの実施形態では、第二の期間は、５分を超えない。いくつかの実施形態では、第一の期間の第一の部分は、２分を超えず、例えば、第一の期間は、約１分である。いくつかの実施形態では、第二の期間の第一の部分は、２分を超えず、例えば、第二の期間は、約１分である。
いくつかの実施形態では、ｎ１およびｎ２は、２０ｍＬ／分～２０Ｌ／分の範囲内である。いくつかの実施形態では、第一の液体は、４０ｍＬ～１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、第二の液体は、４０ｍＬ～１００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、第二の液体中のｍＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する。
いくつかの実施形態では、第一の液体は、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液である。いくつかの実施形態では、第二の液体は、注射用の水のｍＲＮＡ溶液である。
第七の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、予め形成された空のＬＮＰを含有する第一の液体と、ｍＲＮＡを含有する第二の液体を混合することにより封入するための装置を提供するものであり、当該装置は、第一のポンプ、第二のポンプ、混合接合部、中間容器、第一の熱交換器、第一のポンプを介して第一の液体を混合接合部へと誘導するよう構成されたＬＮＰ導管の配置、第二のポンプを介して第二の液体を混合接合部へと誘導するように構成されたｍＲＮＡ導管の配置、リサイクルループ、とを備え、この場合において第一の液体と第二の液体は、混合接合部で混合液を形成し、リサイクルループは、混合液を混合接合部から第一の熱交換器へと誘導し、および第一の熱交換器から中間容器へと誘導するように構成され、およびこの場合においてリサイクルループは、混合液を、中間容器から、第一のポンプの上流のＬＮＰ導管の配置へと、または第二のポンプの上流のｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成可能である。
第八の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、予め形成された空のＬＮＰを含有する第一の液体と、ｍＲＮＡを含有する第二の液体を混合することにより封入するための装置を提供するものであり、当該装置は、第一のポンプ、第二のポンプ、第一の液体の供給源、第二の液体の供給源、混合接合部、第一のポンプを介して第一の液体を第一の液体の供給源から混合接合部へと誘導するように構成されたＬＮＰ導管の配置、第二のポンプを介して第二の液体を第二の液体の供給源から混合接合部へと誘導するように構成されたｍＲＮＡ導管の配置、リサイクルループ、とを備え、この場合において第一の液体と第二の液体は、混合接合部で混合液を形成し、リサイクルループは、混合液を、第一のポンプの上流のＬＮＰ導管の配置へと、または第二のポンプの上流のｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成可能である。
いくつかの実施形態では、リサイクルループは、混合液を、第一のポンプの上流の第一の導管の配置へと誘導するように構成される。いくつかの実施形態では、リサイクルループは、混合液を、第二のポンプの上流の第二の導管の配置へと誘導するように構成される。
いくつかの実施形態では、第一のポンプは、第一の液体を流量ｎ１でポンプ注入するよう構成され、第二のポンプは、第二の液体を流量ｎ２でポンプ注入するよう構成され、この場合において、ｎ１は、ｎ２よりも大きい。いくつかの実施形態では、第一のポンプは、混合液を流量ｎ３でポンプ注入するよう構成され、この場合においてｎ３は、ｎ１よりも大きい。いくつかの実施形態では、第一のポンプは、混合液がリサイクルループを通過するたびに、混合液の流量を増加させるように構成される。
いくつかの実施形態では、第一のポンプは、第一の液体を流量ｍ１でポンプ注入するよう構成され、第二のポンプは、第二の液体を流量ｍ２でポンプ注入するよう構成され、この場合において、ｍ２は、ｍ１よりも大きい。いくつかの実施形態では、第二のポンプは、混合液を流量ｍ３でポンプ注入するよう構成され、この場合においてｍ３は、ｎ２よりも大きい。いくつかの実施形態では、第二のポンプは、混合液がリサイクルループを通過するたびに、混合液の流量を増加させるように構成される。
以下の実施形態は、本発明の第七または第八の態様による方法に適用され得る。いくつかの実施形態では、リサイクルループはさらに、混合液を、混合接合部から、中間容器または当該中間容器へと誘導し、その後、混合液を、ＬＮＰ導管の配置またはｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成される。
いくつかの実施形態では、装置はさらに、第一の熱交換器を備え、この場合においてリサイクルループはさらに、混合液を、混合接合部から、第一の熱交換器または当該第一の熱交換器へと誘導し、その後、混合液を、ＬＮＰ導管の配置またはｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成される。いくつかの実施形態では、リサイクルループはさらに、混合液を当該第一の熱交換器へと誘導し、その後、混合液を、当該中間容器へと誘導するように構成される。いくつかの実施形態では、第一の熱交換器は、混合液を、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度に加熱するように構成される。
いくつかの実施形態では、装置はさらに、第一の液体を保管するように構成され、第一のポンプの上流に配置され、およびＬＮＰ導管の配置と流体連結された、第一の保管容器、ならびに第二の液体を保管するように構成され、第二のポンプの上流に配置され、およびｍＲＮＡ導管の配置と流体連結された、第二の保管容器、を備える。いくつかの実施形態では、第一の保管容器は、第一の液体を、６０℃～７０℃、６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度で保管するよう構成される。
いくつかの実施形態では、装置はさらに、混合液を、混合接合部から最終保管容器へと誘導するように構成された、導管のアウトプット配置を備える。いくつかの実施形態では、装置はさらに、第二の熱交換器を備え、この場合において導管のアウトプット配置はさらに、混合液を、第二の熱交換器を通るように誘導し、その後、混合液を、最終保管容器へと誘導するように構成される。いくつかの実施形態では、第二の熱交換器は、混合液を、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度に冷却するように構成される。
いくつかの実施形態では、第一および／または第二のポンプは、パルスレスフローポンプであり、この場合において当該第一および／または第二のポンプは、ギアポンプまたは遠心ポンプである。
いくつかの実施形態では、混合接合部は、Ｔ型接合部である。
第九の態様では、本発明は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、予め形成された空のＬＮＰを含有する第一の液体と、ｍＲＮＡを含有する第二の液体を混合することにより封入するための装置を提供するものであり、当該装置は、第一のポンプ、第二のポンプ、混合接合部、第一のポンプを介して第一の液体を混合接合部へと誘導するように構成されたＬＮＰ導管の配置、第二のポンプを介して第二の液体を混合接合部へと誘導するように構成されたｍＲＮＡ導管の配置、リサイクルループ、およびプロセッサーとを備え、この場合において第一の液体と第二の液体は、混合接合部で混合液を形成し、リサイクルループは、混合液を、第一のポンプの上流のＬＮＰ導管の配置へと、または第二のポンプの上流のｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成され、プロセッサーは、第一の期間、第一の流量で第一のポンプを駆動させ、および第二の流量で第二のポンプを駆動させるように構成され、ならびにリサイクルループが混合液をＬＮＰ導管の配置へと誘導するように構成されている場合には、第二の期間、第一の流量のｎ１倍で第一のポンプを駆動させ、第二の流量で第二のポンプを駆動させるように構成されるか、またはリサイクルループが混合液をＬＮＰ導管の配置へと誘導するように構成されている場合には、第二の期間、第一の流量で第一のポンプを駆動させ、第一の流量のｎ１倍で第二のポンプを駆動させるように構成される。
いくつかの実施形態では、方法は、本発明の第七、第八または第九の態様に従う装置を使用して、本発明の第五または第六の態様に従い実施され、当該方法はさらに、ＲＮａｓｅ非含有水の第一の流れを当該装置に通すこと、水酸化ナトリウム溶液の流れを当該装置に通すこと、およびＲＮａｓｅ非含有水の第二の流れを当該装置に通すこと、を含む。
本発明の様々な態様では、カチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ターゲット２４を含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ＩＣＥを含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２を含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０を含む。一部の実施形態では、一種以上のカチオン性脂質は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２を含む。
本発明の様々な態様では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＥＰＥ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））からなる群から選択されてもよい。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＥＰＥまたはＤＯＰＥである。
本発明の様々な態様では、ＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）である。
本発明の様々な態様では、ｍＲＮＡは、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。あるいは、ｍＲＮＡは、非修飾である。
本出願において、「または」の使用は、別段明記されない限り、「および／または」を意味する。本開示において使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、ならびにこの用語の変化形、例えば、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、整数、または工程を除外することを意図するものではない。本出願において使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、同義語として使用される。両方の用語は、関連技術分野の当業者によって理解される任意の通常の変動を網羅することを意味する。
本発明の他の特徴、目的、および利点は、以下の発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲において明らかになる。しかしながら、発明を実施するための形態、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を指しているが、単に例示として与えられるものあり、限定するものでないことを理解されたい。本発明の範囲内の様々な変更および修正は、当業者には明らかになるであろう。
図面は、例示の目的のみのためであり、限定のためではない。
図１は、脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ封入プロセスの概略図を示しており、当該プロセスは、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液と、水性緩衝液中に溶解されたｍＲＮＡの溶液とを混合することを含む（パネルＡを参照）。このプロセスは、本明細書において、従来的な「リミックス」プロセスまたは「プロセスＢ」と呼称される。パネルＢに示されるように、混合プロセスの間、カチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比（口語的にＮ／Ｐ比とも呼称される）は一定を維持する。パネルＣに示されるように、予め形成された空の脂質ナノ粒子を含有する懸濁液は、６５℃であり、一方でｍＲＮＡ溶液は周囲温度である。二つの液体はポンプシステムを使用して混合され、組み合わされた混合液は６５℃に加熱されて、ΔＴで示されるように温度差がなくなる。 図２は、従来的な「リミックス」プロセスに基づく改善プロセスを示す。パネルＡは、脂質ナノ粒子ｍＲＮＡ封入プロセスの概略図を示しており、当該プロセスは、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液と、ｍＲＮＡの溶液のバッチとを混合することを含み、当該バッチは連続的に添加される。パネルＡに示される例示的プロセスでは、四つのｍＲＮＡのバッチが添加されている。各添加によって、中間混合液が生じる。中間混合液は異なるモル比（Ｎ／Ｐ）のカチオン性脂質とｍＲＮＡを含み、１６（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）から始まり、最終製剤中では４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）にまで減少する。Ｎ／Ｐ比のこの段階的な減少を、パネルＢに示す。このタイプのプロセスは、本明細書において、「ステップダウンリミックス」プロセスと呼称される。パネルＣは、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液をバッチでｍＲＮＡ溶液に添加する、対応するプロセスを示しており、カチオン性脂質とｍＲＮＡが等しい比率で始まっている。パネルＣに示される例示的なプロセスでは、例えば、４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）の比に達するまで、四つの予め形成された空の脂質ナノ粒子のバッチが添加される。Ｎ／Ｐ比のこの段階的な増加を、パネルＤに示す。このタイプのプロセスは、本明細書において、「ステップアップリミックス」プロセスと呼称される。 図３は、図２に示される例示的なステップダウンリミックスプロセス、およびステップアップリミックスプロセスの代替的なバージョンを示す。例えば、パネルＡおよびＢは、これらのプロセスのバリエーションを示しており、予め形成された脂質ナノ粒子またはｍＲＮＡのいずれかのバッチが、三つの異なる状況で添加されており、添加の都度、混合期間が続く。最終混合期間は、他の混合期間と比較して延長される。パネルＣおよびＤは、ステップダウンリミックスプロセスおよびステップアップリミックスプロセスの他のバリエーションを示しており、予め形成された脂質ナノ粒子またはｍＲＮＡのいずれかが、一定期間にわたって連続的に添加され、カチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比（Ｎ／Ｐ比）は、望ましいＮ／Ｐ比に到達するまで当該期間の間、減少または増加する。パネルＥおよびＦは、ステップダウンリミックスプロセス、およびステップアップリミックスプロセスを組み合わせたさらなるバリエーションを示す。これらの変形プロセスは、予め形成された脂質ナノ粒子の添加とｍＲＮＡの添加を交互に行うものであり、Ｎ／Ｐ比の段階的な増加と減少の両方がもたらされ、その後、望ましい最終Ｎ／Ｐ比に到達する。 図４は、カチオン性脂質が、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０（図４Ａ）またはｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２（図４Ｂ）のいずれかである点で異なっている二種の脂質製剤について、野生型ＣＤ１マウスの肝臓におけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡからのインビボタンパク質発現を示している。図１および図２に示される例示的なリミックスプロセス、ステップダウンリミックスプロセス、およびステップアップリミックスプロセスを使用して、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子中で製剤化された。６～８週齢のオスマウスに、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のｈＯＴＣ ｍＲＮＡで、脂質ナノ粒子製剤の単回ボーラス尾静脈注射を行った。肝臓ホモジネートをＥＬＩＳＡにより分析し、総タンパク質に対するｈＯＴＣの量（単位ｎｇ／ｍｇ）を決定した。各図において、破線は、治療有効性のおよその最小発現レベル（総タンパク質ｍｇ当たり約４５０ｎｇのｈＯＴＣ）を表す。 図５は、例示的なステップダウンリミックスプロセスおよびステップアップリミックスプロセスを用いて製剤化された脂質ナノ粒子が、従来的なリミックスプロセスを用いて製剤化された脂質ナノ粒子と比較して、たとえ最適な脂質ナノ粒子製剤が使用されたときでさえ、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ発現を改善し得ることを示している。６～８週齢のオスマウスに、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のｈＯＴＣ ｍＲＮＡで、脂質ナノ粒子製剤の単回ボーラス尾静脈注射を行った。ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２をベースにし、非カチオン性脂質成分としてＤＯＰＥまたはＤＥＰＥのいずれかを含む４成分リポソームを、被験物質として使用した。ＭＣ３をベースにした脂質ナノ粒子は、対照としての役割を果たした。肝臓ホモジネートをＥＬＩＳＡにより分析し、総タンパク質に対するｈＯＴＣの量（単位ｎｇ／ｍｇ）を決定した。 図６は、例示的なステップダウンリミックスプロセスおよびステップアップリミックスプロセスにおける、工程数の調整（図６Ａ）またはバッチ添加のタイミングの調整（図６Ｂ）を行うことによって、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ発現が改善され得ることを示す。６～８週齢のオスマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの用量のｈＯＴＣ ｍＲＮＡで、様々な脂質ナノ粒子製剤の単回ボーラス尾静脈注射を行った。肝臓ホモジネートをＥＬＩＳＡにより分析し、総タンパク質に対するｈＯＴＣの量（単位ｎｇ／ｍｇ）を決定した。各図において、破線は、治療有効性のおよその最小発現レベル（総タンパク質ｍｇ当たり約４５０ｎｇのｈＯＴＣ）を表す。 同上。 図７は、ｍＲＮＡの単回ボーラス注射から２４時間後のＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡの用量依存性のインビボ活性を示す。パネルＡは、試験プロトコルの概略図である。ｈＯＴＣ ｍＲＮＡは、図２Ａに示される例示的なステップダウンリミックスプロセスを使用して、４成分脂質ナノ粒子（ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）中に封入された。ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、指定される用量でＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスに投与された。生理食塩水で処理された野生型マウスおよびＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスは、対照としての役割を果たした。投与から２４時間後、動物はＮＨ４Ｃｌでチャレンジされ、チャレンジから４０分後に血漿ＮＨ３レベルが測定された。肝臓ホモジネートをＥＬＩＳＡにより分析して、ｈＯＴＣタンパク質発現レベルを決定した。パネルＢは、総タンパク質に対するｈＯＴＣの量（単位ｎｇ／ｍｇで示される）が、用量依存性に増加したことを示す。パネルＣは、血漿ＮＨ３レベルが用量依存性に減少したことを示す。 同上。 図８は、ｍＲＮＡの単回ボーラス注射から最大で３週間後のＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスにおける、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ活性の持続性を示す。パネルＡは、試験プロトコルの概略図である。ｈＯＴＣ ｍＲＮＡは、図２Ａに示される例示的なステップダウンリミックスプロセスを使用して、４成分脂質ナノ粒子（ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）中に封入された。ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子は、０．３ｍｇ／ｋｇの用量でＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスに投与された。生理食塩水で処理された野生型マウスおよびＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスは、対照としての役割を果たした。投与から１、２、および３週間後、動物はＮＨ４Ｃｌでチャレンジされ、チャレンジから４０分後に血漿ＮＨ３レベルが測定された。パネルＢは、投与されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡからのＯＴＣタンパク質の量が、投与から少なくとも１５日間、生理食塩水で処置された野生型マウスと近いレベル、または区別することができないレベルにまで、血漿ＮＨ３レベルを低下させるのに適切であったことを示す。 図９は、図１Ａに概略的に示された「リミックス」プロセスのバリエーションを示す。予め形成された空の脂質ナノ粒子を、水性緩衝液中に溶解されたｍＲＮＡと混合して、ｍＲＮＡを封入する。封入および精製を行った後、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を、空の脂質ナノ粒子と混合して、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子と空の脂質ナノ粒子との混合液（再ブレンド製剤）を生成する。このプロセスを本明細書において、「再ブレンド」プロセスを呼称する。 図１０は、図１Ａに示される「リミックス」プロセスを用いて調製されたｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子に、空の脂質ナノ粒子を添加することで、野生型マウスでのｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ活性をどのようにブーストし得るかを示す。パネルＡは、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子を単回ボーラス注射した後、６時間後および２４時間後に血清中に発現されたヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）タンパク質の量を示す。生理食塩水で処置されたマウスは対照としての役割を果たした。従来的な「リミックス」プロセスを用いて調製されたＭＬ２をベースとした脂質ナノ粒子（ＭＬ２リミックス）で処置されたマウスにおけるｈＥＰＯ発現レベルは、ベンチマークとしての役割を果たした。試験された三種すべての「再ブレンド」製剤が、６時間の時点で、ｈＥＰＯ発現のブーストを示した。パネルＢは、「再ブレンド」製剤の忍容性が、「リミックス」製剤ベンチマークと同等であったことを示す。試験動物の肝臓におけるＡＬＴおよびＡＳＴの発現レベルに基づいて、忍容性を評価した。ＡＬＴおよびＡＳＴの発現レベルの増加は、肝毒性を指標である。破線は、「ＭＬ２リミックス」ベンチマーク製剤で処置されたマウスのｈＥＰＯ、ＡＬＴおよびＡＳＴの平均発現レベルをそれぞれ示す。 図１１は、本明細書に記載される方法での使用を目的として、予め形成された空のＬＮＰ内にメッセンジャーｍＲＮＡを、予め形成された空のＬＮＰを含有する第一の液体とｍＲＮＡを含有する第二の液体を混合することにより封入するための装置を示している。 図１２Ａは、リサイクルループが、第一のポンプの上流に混合液を誘導するように構成された、図１１の装置の構造を示す。装置が稼働しているとき、リサイクルループ２６０は、混合液を混合接合部２０５から、第一のポンプ２０３の上流のＬＮＰ導管の配置中の位置に誘導するように構成される。図１２Ｂは、リサイクルループが、第二のポンプの上流に混合液を誘導するように構成された、図１１の装置の構造を示す。装置が稼働しているとき、リサイクルループ２６０は、混合液を混合接合部２０５から、第二のポンプ２０４の上流のｍＲＮＡ導管の配置中の位置に誘導するように構成される。 図１３は、本明細書に記載の方法での使用を目的とした中間保管容器を含む装置を示す。 図１４は、本明細書に記載の方法での使用を目的とした第一の熱交換器を含む装置を示す。 図１５は、本明細書に記載の方法での使用を目的とした中間保管容器と第一の熱交換器を含む装置を示す。 図１６は、本明細書に記載の方法での使用を目的とした最終保管容器を含む装置を示す。 図１７は、本明細書に記載の方法での使用を目的とした最終保管容器と第二の熱交換器を含む装置を示す。 図１８は、本明細書に記載の方法での使用に関し、中間保管容器、最終保管容器、第一の熱交換器、および第二の熱交換器を含む装置を示しており、リサイクルループは、第一または第二のポンプの上流に混合液を誘導するように構成可能である。 図１９は、本明細書に記載の方法での使用に関し、リサイクルループが、第一のポンプの上流に混合液を誘導するように構成された、請求項１７に記載の装置を示す。
定義
本発明がより容易に理解されるように、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、本明細書全体に記載される。本発明の背景を説明し、かつその実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。
アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」とは、天然に存在するペプチドに一般に見られる２０個の標準Ｌ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」とは、それが合成的に調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換を含むが、これらに限定されない化学的に修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはそれらの活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基との置換によって修飾され得る。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。アミノ酸は、一つ以上の化学的実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との会合などの一つ以上の翻訳後修飾を含み得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。この用語が遊離アミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、それが使用される文脈から明らかになるであろう。
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階のヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」とは、任意の発育段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物には、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、昆虫、および／または寄生虫が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子操作された動物、および／またはクローンであり得る。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、目的とする一つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、明記された参照値と同様の値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別途提示されない限り、または文脈から明らかではない限り（かかる数が可能な値の１００％を超える場合を除く）、提示される参照値のいずれか（それよりも大きいまたは小さい）の方向で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内に収まる値の範囲を指す。
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な」という用語は、生物系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に生物学的影響を及ぼす薬剤は、生物学的に活性であるとみなされる。
送達：本明細書で使用される際に、「送達」という用語は、局所送達および全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、標的組織内で保持される状況（「局所分布」または「局所送達」とも称される）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされたタンパク質またはペプチドが発現され、患者の循環系（例えば、血清）に分泌され、全身に分布し、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分布」または「全身送達」とも称される）を包含する。
有効性：本明細書で使用される場合、「有効性」という用語、またはその文法的均等は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。いくつかの実施形態では、生物学的エンドポイントは、投与後のある特定の時点での塩化アンモニウム負荷に対する保護である。
封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、またはその文法的均等は、ナノ粒子内に核酸分子（例えば、個々のｍＲＮＡ分子）を封入するプロセスを指す。
発現：本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡの「発現」は、ペプチド（例えば、抗原）、ポリペプチド、またはタンパク質（例えば、酵素）へのｍＲＮＡの翻訳を指し、また文脈によって示されるように、ペプチド、ポリペプチド、または完全に組み立てられたタンパク質（例えば、酵素）の翻訳後修飾も含み得る。この用途において、「発現」および「産生」という用語、ならびにそれらの文法的等価物は、互換的に使用される。
機能性：本明細書で使用される場合、「機能性」生体分子は、それが特徴付けられる特性および／または活性を呈する形態での生体分子である。
半減期：本明細書で使用される場合、「半減期」という用語は、核酸またはタンパク質濃度または活性等の量が、ある期間の最初に測定されたその値の半分に下がるのに必要な時間である。
改善する、増加する、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加する」、もしくは「低減する」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される治療の不在下での対照試料もしくは対象（または複数の対照試料もしくは対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を指す。「対照試料」は、試験物品を除き、試験試料と同じ条件に供された試料である。「対照対象」は、治療されている対象と同じ疾患形態に罹患しており、治療されている対象とほぼ同じ年齢である対象である。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内というよりむしろ、人工環境下で、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養下などで生じる事象を指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースの系の文脈では、この用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生きている細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
単離された：本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、（１）（自然界および／または実験的環境にかかわらず）最初に産生されたときに会合していた成分のうちの少なくともいくつかから分離しており、かつ／または（２）人工的に産生、調製、および／もしくは製造された物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらが最初に会合していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された薬剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体の純度パーセントの計算は、賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）を含むべきではない。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）：本発明での使用に対し、ＬＮＰは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥ）、コレステロール系脂質（例えば、コレステロール）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）から選択される三種または四種の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、三種以下の別個の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、一つの別個の脂質成分は、ステロール系カチオン性脂質である。例示的なＬＮＰは、ステロール系カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＯＰＥまたはＤＥＰＥ）およびＰＥＧ修飾脂質（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）の三種の脂質成分を含む。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも一つのペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるｍＲＮＡは、修飾されたＲＮＡおよび修飾されていないＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、一つ以上のコード領域および非コード領域を含有し得る。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製され得、組換え発現系を使用して産生され得、任意に、精製、化学合成などが行われ得る。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、ｍＲＮＡは、化学修飾された塩基または糖、骨格修飾などを有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。ｍＲＮＡ配列は、別段指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、シュードウリジン、および５－メチルシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基、修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、および／もしくは修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれらを含む。
多量体コード核酸（ＭＣＮＡ）：上記に定義されるｍＲＮＡは、ＭＣＮＡを含んでもよい。ＭＣＮＡ化合物が二つ以上の５’末端を含むように、例えば自身の３’末端を介して連結された二つ以上のコードポリヌクレオチドを含んでもよい。様々なＭＣＮＡ構造、および同構造を作製する方法が、公開済みの米国特許出願ＵＳ２０１７／０３１４０４１に記載されており、当該出願は、その全体で参照により本明細書に組み込まれる。
Ｎ／Ｐ比：本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」という用語は、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の、当該脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡに対するモル比を指す。したがって、Ｎ／Ｐ比は、典型的には、脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡのモルに対する、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質のモルの比率として計算される。例えば、１モルのｍＲＮＡ当たり、カチオン性脂質が４倍モル過剰であれば、「Ｎ／Ｐ比」は４となる。本発明の様々な態様は、望ましい比率に到達するまで、封入プロセスの間、Ｎ／Ｐ比を増加（「漸増させる」、「ステップアップ」）または減少（「漸減させる」、「ステップダウン」）させることを含む。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、その最も広範な意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る任意の化合物および／または物質を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」とは、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ、ならびに一本鎖および／もしくは二本鎖のＤＮＡならびに／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当該技術分野で公知であり、骨格中のホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内であると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。核酸は、天然源から精製され、組換え発現系を使用して産生され、任意に精製され、化学的に合成などされ得る。必要に応じて、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学修飾された塩基または糖類、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含み得る。核酸は、別途指示されない限り、５’から３’の方向に提示される。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化塩基）、介在塩基（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ ｂａｓｅ）、修飾された糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）、ならびに／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホルアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、送達を促進または達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する、「非修飾核酸」に特異的に向けられる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドＴおよびＵは、配列記述において互換的に使用される。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、例えば、実験、診断、予防、美容、および／または治療目的のために、提供される組成物が投与され得る任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。特定の実施形態では、患者は、ヒトである。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。
薬学的に許容される：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、妥当な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、炎症刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、合理的なベネフィット／リスクの比率に見合う、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に好適な物質を指す。
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１－１９において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、好適な無機酸および有機酸ならびに無機塩基および有機塩基に由来するものが挙げられる。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸と形成されるか、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸などの有機酸と形成されるか、またはイオン交換などの当該技術分野で使用される他の方法を使用して形成される、アミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。適切な塩基に由来する塩としては、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、およびＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４塩が挙げられる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等が挙げられる。さらなる薬学的に許容可能な塩には、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、スルホン酸塩、およびアリールスルホン酸塩等の対イオンを使用して形成された非毒性アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンが挙げられる。さらなる薬学的に許容される塩は、適切な求電子剤、例えば、四級化アルキル化アミノ塩を形成するためのハロゲン化アルキルを使用して、アミンの四級化から形成された塩を含む。
効力：本明細書で使用される場合、用語「効力」または文法的等価物は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質もしくはペプチドの発現、および／または得られた生物学的効果を指す。
プロセッサー：本明細書で使用される場合、「プロセッサー」という用語は、マイクロプロセッサー、本明細書に記載の装置のデータを処理する、および／または構成要素を制御するように構成されるマイクロエレクトロニクス、仮想プロセッサー、および／または集積回路を含む。
タンパク質：本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、ペプチド（例えば、ジペプチド）、タンパク質、ポリペプチド、および／または複数のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の集合を含む。いくつかの実施形態では、「タンパク質」という用語は、ペプチドを除外する場合がある。本発明に関連するタンパク質は、生物学的および／または治療的に妥当性のあるタンパク質であり得る。
全身分布または全身送達：本明細書で使用される場合、「全身分布」、「全身送達」という用語、または文法的均等は、全身または生物全体に影響する送達または分布機構またはアプローチを指す。典型的には、全身分布または全身送達は、身体の循環系、例えば、血流を介して成し遂げられる。「局所分布または送達」の定義と比較される。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、または霊長類）を指す。ヒトには、出生前形態および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象は、ヒトである。対象は、患者であり得、疾患の診断または治療のために医療提供者を受診するヒトを指す。「対象」という用語は、本明細書で「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患し得るか、またはそれに罹り易いが、疾患または障害の症状を呈する場合も呈さない場合もある。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的とする特徴または特性の全またはほぼ全範囲または程度を呈する質的状態を指す。生物学分野の当業者であれば、生物学的および化学的現象が、完了すること、および／または完了に至ること、または絶対的結果を達成もしくは回避することが、仮にあったとしてもめったにないことを理解するであろう。したがって、用語「実質的に」は、多くの生物学的および化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、治療される疾患に影響される任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。
治療有効量：本明細書で使用される場合、治療薬の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているか、またはそれに罹り易い対象に投与されたときに、その疾患、障害、および／または状態の症状を治療する、診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。当業者であれば、治療有効量が、典型的には、少なくとも一つの単位用量を含む投薬レジメンにより投与されることを理解する。
治療すること：本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療」、または「治療すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／もしくは状態の一つ以上の症状もしくは特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を低減する、および／またはその発生率を低減するために使用される任意の方法を指す。治療は、疾患の兆候を呈せず、かつ／または疾患の初期の兆候のみを呈する対象に、その疾患に関連する病態を発症させるリスクを減少させる目的のために投与され得る。
収率：本明細書で使用される場合、用語「収率」は、開始材料としての総ｍＲＮＡと比較して、封入後に回収されたｍＲＮＡのパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、用語「回収」は、用語「収率」と互換的に使用される。
本発明は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤およびｍＲＮＡ封入のための改善された方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、脂質ナノ粒子中にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法を提供するものであり、予め形成された脂質ナノ粒子（すなわち、ｍＲＮＡを含まず形成された）内に脂質を形成させる工程、次いで予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡを組み合わせる工程を含む。いくつかの実施形態では、新規製剤方法は、脂質ナノ粒子を予め成形する工程を伴わずに調整された（例えば、脂質をｍＲＮＡと直接組み合わせる工程）同ｍＲＮＡの製剤と比較して、インビトロおよびインビボの両方で、効力（ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現）が高く、および有効性が高い（生物学的に関連性のあるエンドポイントの改善）ために潜在的に忍容性良好なｍＲＮＡ製剤をもたらす。このような製剤のより高い効力および／または有効性は、医薬品のより低い用量および／またはより少ない頻度の投与を提供し得る。いくつかの実施形態では、本発明は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、およびＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質を含む改善された脂質製剤を特徴とする。
いくつかの実施形態では、本発明の脂質ナノ粒子製剤および製造方法について、結果として得られる封入効率は、少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％である。核酸の送達に関して、多くの場合、封入を行うことは、インビボで医薬成分を保護し、活性喪失を低下させるために重要であると考えられている。典型的には、封入効率が高くなると、標的細胞へ送達される封入核酸（例えばｍＲＮＡ）の量も多くなる。
本発明の様々な態様は、以下のセクションで詳細に記載される。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
本発明は、任意のｍＲＮＡを封入するために使用され得る。ｍＲＮＡは、典型的には、ＤＮＡからリボソームに情報を運ぶＲＮＡの種類と考えられている。典型的には、真核生物において、ｍＲＮＡプロセシングは、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。典型的なキャップは、７－メチルグアノシンキャップであり、これは、最初に転写されたヌクレオチドへの５’－５’－三リン酸結合を介して連結されたグアノシンである。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。尾部の付加は、典型的にはポリアデニル化事象であり、これによりポリアデニリル部分がｍＲＮＡ分子の３’末端に付加される。この「尾部」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からｍＲＮＡを保護する役割を果たす。メッセンジャーＲＮＡは、タンパク質を構成する一連のアミノ酸にリボソームによって翻訳される。
ｍＲＮＡの合成と性能
ｍＲＮＡは、様々な既知の方法のうちのいずれかによって合成され得る。様々な方法が、公開された米国特許出願第２０１８／０２５８４２３号に記載され、本発明の実施に使用され得、それら全てが参照により本明細書に組み込まれる。例えば、本発明での使用に対し、ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成されてもよい。簡潔には、ＩＶＴは、典型的には、プロモーター、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含み得る緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む線状または環状ＤＮＡ鋳型を用いて行われる。正確な条件は、特定の用途により異なるであろう。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本発明での使用を目的として、さらに精製されてもよい。いくつかの実施形態では、インビトロで合成されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ合成中に使用された様々な酵素および他の試薬を含む望ましくない不純物を除去するために、製剤および封入前に精製され得る。
本発明での使用を目的として、様々な方法を使用して、ｍＲＮＡを精製してもよい。例えば、ｍＲＮＡの精製は、遠心分離、濾過、および／またはクロマトグラフィー法を使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、またはゲル精製もしくは任意の他の好適な手段により精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣにより精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の標準的なフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液で抽出される。
特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、接線流濾過（ＴＦＦ）を使用して精製される。好適な精製方法は、公開された米国特許出願第２０１６／００４０１５４号、公開された米国特許出願第２０１５／０３７６２２０号、公開された米国特許出願第２０１８／０２５１７５５号、公開された米国特許出願第２０１８／０２５１７５４号、２０１８年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７５７，６１２号、および２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，７８１号に記載されるものを含み、それらの全ては、参照により本明細書に組み込まれ、本発明を実施するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前および後に精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離により、キャッピングとテーリングの前もしくは後のいずれか、またはキャッピングとテーリングの前および後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過により、キャッピングとテーリングの前もしくは後のいずれか、またはキャッピングとテーリングの前および後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＴＦＦにより、キャッピングとテーリングの前もしくは後のいずれか、またはキャッピングとテーリングの前および後の両方で精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーにより、キャッピングとテーリングの前もしくは後のいずれか、またはキャッピングとテーリングの前および後の両方で精製される。
本発明を使用して、様々な長さのｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、または５０ｋｂ以上のインビトロ合成ｍＲＮＡを製剤化および封入し得る。いくつかの実施形態では、本発明を使用して、長さ約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、約８～１５ｋｂ、または約８～５０ｋｂの範囲のインビトロで合成されたｍＲＮＡを製剤および封入し得る。
ｍＲＮＡ修飾
本発明を使用して、修飾されていないｍＲＮＡ、または典型的に安定性を強化する一つ以上の修飾を含むｍＲＮＡを製剤および封入し得る。いくつかの実施形態では、修飾は、修飾ヌクレオチド、修飾糖リン酸骨格、ならびに５’および／または３’非翻訳領域から選択される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシド（または非修飾ヌクレオシド、すなわち、アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン）を含み、または天然に存在するヌクレオシドからなる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡの修飾は、ＲＮＡのヌクレオチドの修飾（例えば、アデノシンアナログ、グアノシンアナログ、シチジンアナログ、ウリジンアナログ）を含んでもよい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、非修飾ヌクレオシドと修飾ヌクレオシドの両方を含む。本発明による修飾されたｍＲＮＡは、例えば、骨格修飾、糖修飾、または塩基修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、ヌクレオシド類似体である。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖、および修飾核酸塩基から選択される少なくとも一つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾核酸塩基、例えば、化学修飾された塩基、生物学的に修飾された塩基（例えば、メチル化された塩基）、または中間塩基を含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、限定されないが、プリン類（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））もしくはピリミジン類（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））を含むがこれらに限定されない、天然に生じるヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよく、例えば、１－メチルアデニン、２－メチルアデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、プソイドウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－プソイドウラシル、キューオシン、ベータ－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、ならびにホスホロアミデート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシン、シュードウリジン（例えば、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン）、２－チオウリジン、２－チオシチジン、５－メチルシチジン、イノシン、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、ジアミノプリン、および２－クロロ－６－アミノプリンシトシンを含む天然ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチドアナログ（修飾ヌクレオチド）から合成されてもよい。そのような類似体の調製は、例えば、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号、および同第５，７００，６４２号から当業者に既知であり、その開示は、参照によりその全範囲が本明細書に含まれる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＲＮＡであり得、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンである。そのような修飾ＲＮＡの使用に関する教示は、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号および国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示されており、それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、一つ以上のヌクレオシド類似体の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが天然に存在するヌクレオシドのみを含有する対照ｍＲＮＡよりも、より安定かつ／またはより少ない免疫原性にすることができる。例えば、５－メチル－シチジン、シュードウリジン、および２－チオ－ウリジン、およびｍＲＮＡへのそれらの組み込みについての検討は、米国特許第８，２７８，０３６号またはＷＯ２０１１／０１２３１６を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例えば、本発明のｍＲＮＡを産生するために使用される修飾ヌクレオチドのうちの一つ以上は、修飾リン酸基を含んでもよい。したがって、ｍＲＮＡにおいて、一つ以上のホスホジエステル結合が、別のアニオン性、カチオン性、または中性基で置換される。例えば、いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオチドは、メチルホスホネート、メチルホスホラミダート、ホスホラミダート、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオリン酸））、ボラノリン酸、および正に荷電されたグアニジニウム基から選択される修飾リン酸基を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシド間結合は、５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合である。
いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、修飾糖を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、フラノース環への修飾を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）から選択される修飾糖を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、２’－Ｏ－アルキル修飾またはロック核酸（ＬＮＡ）から選択される修飾糖を含む。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾であるいくつかの実施形態では、このような修飾には、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾、および２’－デオキシ修飾を含み得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、一つ以上の修飾ヌクレオシドは、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソースから選択される修飾糖を含む。
いくつかの実施形態では、これらの修飾のいずれかは、ヌクレオチドの０～１００％で、例えば、構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または１００％超を個別にまたは組み合わせて存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズされてもよい。
典型的には、ｍＲＮＡ合成は、５’末端上に「キャップ」を、３’末端上に「尾部」を付加することを含む。キャップの存在は、大半の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護する役割を果たす。本明細書に記載されるように、キャッピング及び／又はテーリングを伴わない場合には、早期に中止したｍＲＮＡ転写物のサイズが小さすぎて検出できないため、５’キャップ及び／又は３’テールを付加することで、インビトロ合成中に生成された不全型転写物の検出が容易になる。したがって、いくつかの実施形態では、５’キャップおよび／または３’テールは、ｍＲＮＡが純度（例えば、ｍＲＮＡ中に存在する不全型転写物のレベル）について試験される前に、合成ｍＲＮＡに加えられる。いくつかの実施形態では、５’キャップおよび／または３’テールは、本明細書に記載されるようにｍＲＮＡが精製される前に合成ｍＲＮＡに付加される。いくつかの実施形態では、５’キャップおよび／または３’テールは、本明細書に記載されるようにｍＲＮＡが精製された後に合成ｍＲＮＡに付加される。
したがって、いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。５’キャップは、典型的には、以下のように付加される。最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが、５’ヌクレオチドから末端リン酸基のうちの一つを除去し、二つの末端リン酸を残す。次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）が、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸に付加され、５’５’５三リン酸結合をもたらす。次いで、グアニンの７－窒素が、メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。２’－Ｏ－メチル化はまた、７－メチルグアノシン三リン酸残基の後の第１の塩基および／または第２の塩基で生じ得る。キャップ構造の例としては、限定されないが、ｍ７ＧｐｐｐＮｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐ－ＲＮＡ、ｍ７ＧｐｐｐＮｍｐＮｍｐ－ＲＮＡ（式中、ｍは、２’－Ｏメチル残基を示す）、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、公開済みの米国特許出願ＵＳ２０１６／００３２３５６、および公開済みの米国特許出願ＵＳ２０１８／０１２５９８９に記載されている。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’および／または３’非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、ｍＲＮＡの安定性または翻訳に影響を及ぼす一つ以上の要素、例えば、鉄応答性要素を含む。いくつかの実施形態では、５’非翻訳領域は、約５０～５００ヌクレオチド長であり得る。
いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、細胞におけるｍＲＮＡの位置安定性に影響するタンパク質の結合部位、またはｍｉＲＮＡの一つ以上の結合部位のうちの一つ以上を含む。いくつかの実施形態では、３’非翻訳領域は、５０～５００ヌクレオチド長以上であり得る。テール構造は典型的には、ポリ（Ａ）テールおよび／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡテールまたはポリＣテールは、典型的には、少なくとも５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチドをそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、ポリＡテールまたはポリＣテールはそれぞれ、約１０～８００個のアデノシンヌクレオチドまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンヌクレオチドもしくはシトシンヌクレオチド）であり得る。いくつかの実施形態では、テール構造は、本明細書に記載の様々な長さを有するポリ（Ａ）テールおよびポリ（Ｃ）テールの組み合わせを含む、または当該組み合わせである。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
インビトロ転写反応からもたらされたｍＲＮＡが、いくつかの実施形態で望ましい場合があるが、細菌、真菌、植物、および／または動物から産生されたｍＲＮＡを含むｍＲＮＡの他の供給源が、本発明の範囲内であることが企図されている。
ｍＲＮＡにコードされたタンパク質
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、ヒト細胞の効率的な発現のために最適化されたコドンである。コドン最適化は、典型的にはペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする天然型または野生型の核酸配列を改変して、可能な限り最高のＧ／Ｃ含量を達成し、コドンの使用を調整して、希少もしくは速度制限コドンを回避し、不安定化核酸配列もしくはモチーフを除去し、かつ／またはｍＲＮＡコードされたペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、一時停止部位またはターミネーター配列を除去することを含む。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、天然由来または野生型の配列である。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ配列は、アミノ酸配列に一つ以上の変異を含有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
本発明は、多様なタンパク質をコードするｍＲＮＡを製剤および封入するために使用され得る。本発明に好適なｍＲＮＡの非限定的な例としては、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、および嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）をコードするｍＲＮＡが挙げられる。本明細書に開示される例示的なｍＲＮＡ配列を以下に挙げる：
コドン最適化ヒトＯＴＣコード配列
ＡＵＧＣＵＧＵＵＣＡＡＣＣＵＵＣＧＧＡＵＣＵＵＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＧＣＵＧＣＧＵＵＣＣＧＧＡＡＵＧＧＵＣＡＣＡＡＣＵＵＣＡＵＧＧＵＣＣＧＧＡＡＣＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＣＵＣＣＡＧＡＡＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＧＡＣＣＵＣＣＵＣＡＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＣＵＵＣＡＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＣＡＵＧＣＵＧＵＧＧＣＵＧＵＣＡＧＣＣＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＵＣＣＧＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＧＧＣＧＡＡＵＡＣＣＵＵＣＣＵＵＵＧＣＵＧＣＡＧＧＧＡＡＡＧＵＣＣＣＵＧＧＧＧＡＵＧＡＵＣＵＵＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＡＧＣＡＣＵＣＧＣＡＣＵＡＧＡＣＵＧＵＣＡＡＣＵＧＡＡＡＣＣＧＧＣＵＵＣＧＣＧＣＵＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＣＡＣＣＣＣＵＧＣＵＵＣＣＵＧＡＣＣＡＣＣＣＡＡＧＡＵＡＵＣＣＡＵＣＵＧＧＧＵＧＵＧＡＡＣＧＡＡＵＣＣＣＵＣＡＣＣＧＡＣＡＣＡＧＣＧＣＧＧＧＵＧＣＵＧＵＣＧＵＣＣＡＵＧＧＣＡＧＡＣＧＣＧＧＵＣＣＵＣＧＣＣＣＧＣＧＵＧＵＡＣＡＡＧＣＡＧＵＣＵＧＡＵＣＵＧＧＡＣＡＣＵＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＵＣＣＡＵＵＣＣＵＡＵＣＡＵＵＡＡＵＧＧＡＵＵＧＵＣＣＧＡＣＣＵＣＵＡＣＣＡＵＣＣＣＡＵＣＣＡＧＡＵＵＣＵＧＧＣＣＧＡＵＵＡＵＣＵＧＡＣＵＣＵＧＣＡＡＧＡＡＣＡＵＵＡＣＡＧＣＵＣＣＣＵＧＡＡＧＧＧＧＣＵＵＡＣＣＣＵＵＵＣＧＵＧＧＡＵＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＡＣＡＵＵＣＵＧＣＡＣＡＧＣＡＵＵＡＵＧＡＵＧＡＧＣＧＣＵＧＣＣＡＡＧＵＵＵＧＧＡＡＵＧＣＡＣＣＵＣＣＡＡＧＣＡＧＣＧＡＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＵＡＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＧＣＣＵＣＣＧＵＧＡＣＧＡＡＧＣＵＧＧＣＵＧＡＧＣＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＵＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＵＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＣＵＣＵＣＧＡＡＧＣＣＧＣＣＣＡＣＧＧＵＧＧＣＡＡＣＧＵＧＣＵＧＡＵＣＡＣＣＧＡＵＡＣＣＵＧＧＡＵＣＵＣＣＡＵＧＧＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＵＧＣＡＡＧＣＡＵＵＵＣＡＧＧＧＧＵＡＣＣＡＧＧＵＧＡＣＵＡＵＧＡＡＡＡＣＣＧＣＣＡＡＧＧＵＣＧＣＣＧＣＣＵＣＧＧＡＣＵＧＧＡＣＣＵＵＣＵＵＧＣＡＣＵＧＵＣＵＧＣＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＧＵＧＧＡＣＧＡＣＧＡＧＧＵＧＵＵＣＵＡＣＡＧＣＣＣＧＣＧＧＵＣＧＣＵＧＧＵＣＵＵＵＣＣＧＧＡＧＧＣＣＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＵＧＧＡＣＵＡＵＣＡＵＧＧＣＣＧＵＧＡＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＣＵＣＣＣＣＧＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡ（配列番号１）
コドン最適化ヒトＡＳＳ１コード配列
ＡＵＧＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＡＧＣＧＵＧＧＵＧＣＵＧＧＣＣＵＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＡＣＡＣＣＡＧＣＵＧＣＡＵＣＣＵＧＧＵＧＵＧＧＣＵＧＡＡＧＧＡＧＣＡＧＧＧＣＵＡＣＧＡＣＧＵＧＡＵＣＧＣＣＵＡＣＣＵＧＧＣＣＡＡＣＡＵＣＧＧＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＵＵＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡＡＧＣＵＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＵＧＵＵＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＧＡＧＧＡＧＵＵＣＡＵＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＵＧＵＡＣＧＡＧＧＡＣＣＧＣＵＡＣＣＵＧＣＵＧＧＧＣＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＧＵＧＧＡＧＡＵＣＧＣＣＣＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＡＡＧＵＡＣＧＵＧＡＧＣＣＡＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＧＵＧＣＧＣＵＵＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＵＧＣＵＡＣＡＧＣＣＵＧＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＵＣＡＡＧＧＵＧＡＵＣＧＣＣＣＣＣＵＧＧＣＧＣＡＵＧＣＣＣＧＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＡＣＣＵＧＡＵＧＧＡＧＵＡＣＧＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＣＡＵＣＣＣＣＡＵＣＣＣＣＧＵＧＡＣＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＡＵＧＧＡＣＧＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＧＣＡＣＡＵＣＡＧＣＵＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＵＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＵＣＧＡＧＵＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＣＧＵＧＣＣＣＧＵＧＡＡＧＧＵＧＡＣＣＡＡＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＣＡＧＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＵＵＣＡＵＧＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＡＧＧＵＧＧＣＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＧＧＣＧＵＧＧＧＣＣＧＣＡＵＣＧＡＣＡＵＣＧＵＧＧＡＧＡＡＣＣＧＣＵＵＣＡＵＣＧＧＣＡＵＧＡＡＧＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＵＣＵＡＣＧＡＧＡＣＣＣＣＣＧＣＣＧＧＣＡＣＣＡＵＣＣＵＧＵＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＵＣＧＡＧＧＣＣＵＵＣＡＣＣＡＵＧＧＡＣＣＧＣＧＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＧＡＵＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＵＧＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＵＧＵＡＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＵＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＵＧＣＧＡＧＵＵＣＧＵＧＣＧＣＣＡＣＵＧＣＡＵＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＵＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＵＧＣＡＧＧＵＧＡＧＣＧＵＧＣＵＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＧＵＧＵＡＣＡＵＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣＣＣＣＣＵＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＵＧＧＵＧＡＧＣＡＵＧＡＡＣＧＵＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＡＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＡＵＣＡＡＣＡＵＣＡＡＣＡＧＣＣＵＧＣＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＣＣＡＣＣＧＣＣＵＧＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＵＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＵＧＡ（配列番号２）
コドン最適化ヒトＣＦＴＲコード配列
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比較コドン最適化ヒトＣＦＴＲ ｍＲＮＡコード配列
ＡＵＧＣＡＧＣＧＧＵＣＣＣＣＧＣＵＣＧＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＵＧＵＣＧＵＧＵＣＣＡＡＡＣＵＣＵＵＣＵＵＣＵＣＡＵＧＧＡＣＵＣＧＧＣＣＵＡＵＣＣＵＵＡＧＡＡＡＧＧＧＧＵＡＵＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＵＵＧＡＧＵＵＧＵＣＵＧＡＣＡＵＣＵＡＣＣＡＧＡＵＣＣＣＣＵＣＧＧＵＡＧＡＵＵＣＧＧＣＧＧＡＵＡＡＣＣＵＣＵＣＧＧＡＧＡＡＧＣＵＣＧＡＡＣＧＧＧＡＡＵＧＧＧＡＣＣＧＣＧＡＡＣＵＣＧＣＧＵＣＵＡＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＣＡＵＣＡＡＣＧＣＡＣＵＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＵＵＣＵＵＣＵＧＧＣＧＧＵＵＣＡＵＧＵＵＣＵＡＣＧＧＵＡＵＣＵＵＣＵＵＧＵＡＵＣＵＣＧＧＧＧＡＧＧＵＣＡＣＡＡＡＡＧＣＡＧＵＣＣＡＡＣＣＣＣＵＧＵＵＧＵＵＧＧＧＵＣＧＣＡＵＵＡＵＣＧＣＣＵＣＧＵＡＣＧＡＣＣＣＣＧＡＵＡＡＣＡＡＡＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＡＵＣＧＣＧＡＵＣＵＡＣＣＵＣＧＧＧＡＵＣＧＧＡＣＵＧＵＧＵＵＵＧＣＵＵＵＵＣＡＵＣＧＵＣＡＧＡＡＣＡＣＵＵＵＵＧＵＵＧＣＡＵＣＣＡＧＣＡＡＵＣＵＵＣＧＧＣＣＵＣＣＡＵＣＡＣＡＵＣＧＧＵＡＵＧＣＡＧＡＵＧＣＧＡＡＵＣＧＣＵＡＵＧＵＵＵＡＧＣＵＵＧＡＵＣＵＡＣＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＵＧＡＡＡＣＵＣＵＣＧＵＣＧＣＧＧＧＵＧＵＵＧＧＡＵＡＡＧＡＵＵＵＣＣＡＵＣＧＧＵＣＡＧＵＵＧＧＵＧＵＣＣＣＵＧＣＵＵＡＧＵＡＡＵＡＡＣＣＵＣＡＡＣＡＡＡＵＵＣＧＡＵＧＡＧＧＧＡＣＵＧＧＣＧＣＵＧＧＣＡＣＡＵＵＵＣＧＵＧＵＧＧＡＵＵＧＣＣＣＣＧＵＵＧＣＡＡＧＵＣＧＣＣＣＵＵＵＵＧＡＵＧＧＧＣＣＵＵＡＵＵＵＧＧＧＡＧＣＵＧＵＵＧＣＡＧＧＣＡＵＣＵＧＣＣＵＵＵＵＧＵＧＧＣＣＵＧＧＧＡＵＵＵＣＵＧＡＵＵＧＵＧＵＵＧＧＣＡＵＵＧＵＵＵＣＡＧＧＣＵＧＧＧＣＵＵＧＧＧＣＧＧＡＵＧＡＵＧＡＵＧＡＡＧＵＡＵＣＧＣＧＡＣＣＡＧＡＧＡＧＣＧＧＧＵＡＡＡＡＵＣＵＣＧＧＡＡＡＧＡＣＵＣＧＵＣＡＵＣＡＣＵＵＣＧＧＡＡＡＵＧＡＵＣＧＡＡＡＡＣＡＵＣＣＡＧＵＣＧＧＵＣＡＡＡＧＣＣＵＡＵＵＧＣＵＧＧＧＡＡＧＡＡＧＣＵＡＵＧＧＡＧＡＡＧＡＵＧＡＵＵＧＡＡＡＡＣＣＵＣＣＧＣＣＡＡＡＣＵＧＡＧＣＵＧＡＡＡＣＵＧＡＣＣＣＧＣＡＡＧＧＣＧＧＣＧＵＡＵＧＵＣＣＧＧＵＡＵＵＵＣＡＡＵＵＣＧＵＣＡＧＣＧＵＵＣＵＵＣＵＵＵＵＣＣＧＧＧＵＵＣＵＵＣＧＵＵＧＵＣＵＵＵＣＵＣＵＣＧＧＵＵＵＵＧＣＣＵＵＡＵＧＣＣＵＵＧＡＵＵＡＡＧＧＧＧＡＵＵＡＵＣＣＵＣＣＧＣＡＡＧＡＵＵＵＵＣＡＣＣＡＣＧＡＵＵＵＣＧＵＵＣＵＧＣＡＵＵＧＵＡＵＵＧＣＧＣＡＵＧＧＣＡＧＵＧＡＣＡＣＧＧＣＡＡＵＵＵＣＣＧＵＧＧＧＣＣＧＵＧＣＡＧＡＣＡＵＧＧＵＡＵＧＡＣＵＣＧＣＵＵＧＧＡＧＣＧＡＵＣＡＡＣＡＡＡＡＵＣＣＡＡＧＡＣＵＵＣＵＵＧＣＡＡＡＡＧＣＡＡＧＡＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＡＧＵＡＣＡＡＵＣＵＵＡＣＵＡＣＵＡＣＧＧＡＧＧＵＡＧＵＡＡＵＧＧＡＧＡＡＵＧＵＧＡＣＧＧＣＵＵＵＵＵＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＵＵＵＵＧＧＡＧＡＡＣＵＧＵＵＵＧＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＡＵＡＡＣＡＡＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＣＣＵＣＡＡＡＵＧＧＧＧＡＣＧＡＵＵＣＣＣＵＧＵＵＵＵＵＣＵＣＧＡＡＣＵＵＣＵＣＣＣＵＧＣＵＣＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＵＧＵＵＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＡＵＵＵＣＡＡＧＡＵＵＧＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＵＵＣＵＣＧＣＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＡＧＣＡＣＵＧＧＵＧＣＧＧＧＡＡＡＡＡＣＵＡＧＣＣＵＣＵＵＧＡＵＧＧＵＧＡＵＵＡＵＧＧＧＧＧＡＧＣＵＵＧＡＧＣＣＣＡＧＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧＡＵＵＡＡＡＣＡＣＵＣＣＧＧＧＣＧＵＡＵＣＵＣＡＵＵＣＵＧＵＡＧＣＣＡＧＵＵＵＵＣＡＵＧＧＡＵＣＡＵＧＣＣＣＧＧＡＡＣＣＡＵＵＡＡＡＧＡＧＡＡＣＡＵＣＡＵＵＵＵＣＧＧＡＧＵＡＵＣＣＵＡＵＧＡＵＧＡＧＵＡＣＣＧＡＵＡＣＡＧＡＵＣＧＧＵＣＡＵＵＡＡＧＧＣＧＵＧＣＣＡＧＵＵＧＧＡＡＧＡＧＧＡＣＡＵＵＵＣＵＡＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＵＡＡＣＡＵＣＧＵＣＵＵＧＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＧＵＡＵＵＡＣＡＵＵＧＵＣＧＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＧＡＵＣＡＧＣＣＵＣＧＣＧＡＧＡＧＣＧＧＵＡＵＡＣＡＡＡＧＡＵＧＣＡＧＡＵＵＵＧＵＡＵＣＵＧＣＵＵＧＡＵＵＣＡＣＣＧＵＵＵＧＧＡＵＡＣＣＵＣＧＡＣＧＵＡＵＵＧＡＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＡＵＣＵＵＣＧＡＧＵＣＧＵＧＣＧＵＧＵＧＵＡＡＡＣＵＵＡＵＧＧＣＵＡＡＵＡＡＧＡＣＧＡＧＡＡＵＣＣＵＧＧＵＧＡＣＡＵＣＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＣＡＣＣＵＵＡＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＣＡＡＧＡＵＣＣＵＧＡＵＣＣＵＣＣＡＣＧＡＡＧＧＡＵＣＧＵＣＣＵＡＣＵＵＵＵＡＣＧＧＣＡＣＵＵＵＣＵＣＡＧＡＧＵＵＧＣＡＡＡＡＣＵＵＧＣＡＧＣＣＧＧＡＣＵＵＣＵＣＡＡＧＣＡＡＡＣＵＣＡＵＧＧＧＧＵＧＵＧＡＣＵＣＡＵＵＣＧＡＣＣＡＧＵＵＣＡＧＣＧＣＧＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＡＣＵＣＧＡＵＣＵＵＧＡＣＧＧＡＡＡＣＧＣＵＧＣＡＣＣＧＡＵＵＣＵＣＧＣＵＵＧＡＧＧＧＵＧＡＵＧＣＣＣＣＧＧＵＡＵＣＧＵＧＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＵＣＧＵＵＵＡＡＧＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＡＡＵＵＵＧＧＵＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＧＵＡＵＣＵＵＧＡＡＵＣＣＵＡＵＵＡＡＣＵＣＡＡＵＵＣＧＣＡＡＧＵＵＣＵＣＡＡＵＣＧＵＣＣＡＧＡＡＡＡＣＵＣＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＧＡＡＵＧＧＡＡＵＵＧＡＡＧＡＧＧＡＵＵＣＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＧＣＡＧＧＣＵＵＡＧＣＣＵＣＧＵＧＣＣＧＧＡＵＵＣＡＧＡＧＣＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＡＵＵＣＵＵＣＣＣＣＧＧＡＵＵＵＣＧＧＵＧＡＵＵＵＣＡＡＣＣＧＧＡＣＣＵＡＣＡＣＵＵＣＡＧＧＣＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＡＵＣＣＧＵＧＣＵＣＡＡＣＣＵＣＡＵＧＡＣＧＣＡＵＵＣＧＧＵＡＡＡＣＣＡＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＵＵＣＡＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＵＣＡＡＣＧＡＧＡＡＡＡＧＵＧＵＣＡＣＵＵＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＧＡＡＵＵＵＧＡＣＵＧＡＡＣＵＣＧＡＣＡＵＣＵＡＣＡＧＣＣＧＵＡＧＧＣＵＵＵＣＧＣＡＡＧＡＡＡＣＣＧＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＵＣＡＡＵＧＡＡＧＡＡＧＡＵＵＵＧＡＡＡＧＡＧＵＧＵＵＵＣＵＵＵＧＡＵＧＡＣＡＵＧＧＡＡＵＣＡＡＵＣＣＣＡＧＣＧＧＵＧＡＣＡＡＣＧＵＧＧＡＡＣＡＣＡＵＡＣＵＵＧＣＧＵＵＡＣＡＵＣＡＣＧＧＵＧＣＡＣＡＡＧＵＣＣＵＵＧＡＵＵＵＵＣＧＵＣＣＵＣＡＵＣＵＧＧＵＧＵＣＵＣＧＵＧＡＵＣＵＵＵＣＵＣＧＣＵＧＡＧＧＵＣＧＣＡＧＣＧＵＣＡＣＵＵＧＵＧＧＵＣＣＵＣＵＧＧＣＵＧＣＵＵＧＧＵＡＡＵＡＣＧＣＣＣＵＵＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＡＵＵＣＵＡＣＡＣＡＣＵＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＵＵＣＣＵＡＵＧＣＣＧＵＧＡＵＵＡＵＣＡＣＵＵＣＵＡＣＡＡＧＣＵＣＧＵＡＵＵＡＣＧＵＧＵＵＵＵＡＣＡＵＣＵＡＣＧＵＡＧＧＡＧＵＧＧＣＣＧＡＣＡＣＵＣＵＧＣＵＣＧＣＧＡＵＧＧＧＵＵＵＣＵＵＣＣＧＡＧＧＡＣＵＣＣＣＡＣＵＣＧＵＵＣＡＣＡＣＧＣＵＵＡＵＣＡＣＵＧＵＣＵＣＣＡＡＧＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡＵＡＡＧＡＵＧＣＵＵＣＡＵＡＧＣＧＵＡＣＵＧＣＡＧＧＣＵＣＣＣＡＵＧＵＣＣＡＣＣＵＵＧＡＡＵＡＣＧＣＵＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＧＧＵＡＵＵＵＵＧＡＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＡＡＡＡＧＡＵＡＵＵＧＣＡＡＵＵＵＵＧＧＡＵＧＡＣＣＵＵＣＵＧＣＣＣＣＵＧＡＣＧＡＵＣＵＵＣＧＡＣＵＵＣＡＵＣＣＡＧＵＵＧＵＵＧＣＵＧＡＵＣＧＵＧＡＵＵＧＧＧＧＣＵＡＵＵＧＣＡＧＵＡＧＵＣＧＣＵＧＵＣＣＵＣＣＡＧＣＣＵＵＡＣＡＵＵＵＵＵＧＵＣＧＣＧＡＣＣＧＵＵＣＣＧＧＵＧＡＵＣＧＵＧＧＣＧＵＵＵＡＵＣＡＵＧＣＵＧＣＧＧＧＣＣＵＡＵＵＵＣＵＵＧＣＡＧＡＣＧＵＣＡＣＡＧＣＡＧＣＵＵＡＡＧＣＡＡＣＵＧＧＡＧＵＣＵＧＡＡＧＧＧＡＧＧＵＣＧＣＣＵＡＵＣＵＵＵＡＣＧＣＡＵＣＵＵＧＵＧＡＣＣＡＧＵＵＵＧＡＡＧＧＧＡＵＵＧＵＧＧＡＣＧＵＵＧＣＧＣＧＣＣＵＵＵＧＧＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＵＡＣＵＵＵＧＡＡＡＣＡＣＵＧＵＵＣＣＡＣＡＡＡＧＣＧＣＵＧＡＡＵＣＵＣＣＡＵＡＣＧＧＣＡＡＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＧＵＡＵＵＵＧＡＧＵＡＣＣＣＵＣＣＧＡＵＧＧＵＵＵＣＡＧＡＵＧＣＧＣＡＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＵＵＵＵＧＵＧＡＵＣＵＵＣＵＵＵＡＵＣＧＣＧＧＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＣＵＣＣＡＵＣＵＵＧＡＣＣＡＣＧＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＧＡＣＧＧＧＵＣＧＧＵＡＵＵＡＵＣＣＵＧＡＣＡＣＵＣＧＣＣＡＵＧＡＡＣＡＵＵＡＵＧＡＧＣＡＣＵＵＵＧＣＡＧＵＧＧＧＣＡＧＵＧＡＡＣＡＧＣＵＣＧＡＵＵＧＡＵＧＵＧＧＡＵＡＧＣＣＵＧＡＵＧＡＧＧＵＣＣＧＵＵＵＣＧＡＧＧＧＵＣＵＵＵＡＡＧＵＵＣＡＵＣＧＡＣＡＵＧＣＣＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＡＣＡＡＡＡＡＧＵＡＣＧＡＡＡＣＣＣＵＡＵＡＡＧＡＡＵＧＧＧＣＡＡＵＵＧＡＧＵＡＡＧＧＵＡＡＵＧＡＵＣＡＵＣＧＡＧＡＡＣＡＧＵＣＡＣＧＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＵＧＡＣＡＵＣＵＧＧＣＣＵＡＧＣＧＧＧＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＣＣＧＵＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＣＧＧＣＡＡＡＡＵＡＣＡＣＣＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡＣＧＣＡＡＵＣＣＵＵＧＡＡＡＡＣＡＵＣＵＣＧＵＵＣＡＧＣＡＵＵＡＧＣＣＣＣＧＧＵＣＡＧＣＧＵＧＵＧＧＧＧＵＵＧＣＵＣＧＧＧＡＧＧＡＣＣＧＧＧＵＣＡＧＧＡＡＡＡＵＣＧＡＣＧＵＵＧＣＵＧＵＣＧＧＣＣＵＵＣＵＵＧＡＧＡＣＵＵＣＵＧＡＡＵＡＣＡＧＡＧＧＧＵＧＡＧＡＵＣＣＡＧＡＵＣＧＡＣＧＧＣＧＵＵＵＣＧＵＧＧＧＡＵＡＧＣＡＵＣＡＣＣＵＵＧＣＡＧＣＡＧＵＧＧＣＧＧＡＡＡＧＣＧＵＵＵＧＧＡＧＵＡＡＵＣＣＣＣＣＡＡＡＡＧＧＵＣＵＵＵＡＵＣＵＵＵＡＧＣＧＧＡＡＣＣＵＵＣＣＧＡＡＡＧＡＡＵＣＵＣＧＡＵＣＣＵＵＡＵＧＡＡＣＡＧＵＧＧＵＣＡＧＡＵＣＡＡＧＡＧＡＵＵＵＧＧＡＡＡＧＵＣＧＣＧＧＡＣＧＡＧＧＵＵＧＧＣＣＵＵＣＧＧＡＧＵＧＵＡＡＵＣＧＡＧＣＡＧＵＵＵＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＵＣＧＡＣＵＵＵＧＵＣＣＵＵＧＵＡＧＡＵＧＧＧＧＧＡＵＧＣＧＵＣＣＵＧＵＣＧＣＡＵＧＧＧＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＵＣＡＵＧＵＧＣＣＵＧＧＣＧＣＧＡＵＣＣＧＵＣＣＵＣＵＣＵＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＵＵＣＵＵＣＵＣＵＵＧＧＡＵＧＡＡＣＣＵＵＣＧＧＣＣＣＡＵＣＵＧＧＡＣＣＣＧＧＵＡＡＣＧＵＡＵＣＡＧＡＵＣＡＵＣＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＵＵＡＡＧＣＡＧＧＣＧＵＵＵＧＣＣＧＡＣＵＧＣＡＣＧＧＵＧＡＵＵＣＵＣＵＧＵＧＡＧＣＡＵＣＧＵＡＵＣＧＡＧＧＣＣＡＵＧＣＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＧＣＡＡＵＵＵＣＵＵＧＵＣＡＵＣＧＡＡＧＡＧＡＡＵＡＡＧＧＵＣＣＧＣＣＡＧＵＡＣＧＡＣＵＣＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＣＵＧＣＵＵＡＡＵＧＡＧＡＧＡＵＣＡＵＵＧＵＵＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＡＵＵＵＣＡＣＣＡＵＣＣＧＡＵＡＧＧＧＵＧＡＡＡＣＵＵＵＵＵＣＣＡＣＡＣＡＧＡＡＡＵＵＣＧＵＣＧＡＡＧＵＧＣＡＡＧＵＣＣＡＡＡＣＣＧＣＡＧＡＵＣＧＣＧＧＣＣＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＧＡＣＡＣＧＣＧＵＣＵＵＵＡＡ（配列番号４）
コドン最適化ヒトＰＡＨコード配列
ＡＵＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＣＵＧＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＵＧＡＧＣＧＡＣＵＵＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧＡＣＣＡＧＣＵＡＣＡＵＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＧＧＣＧＣＣＡＵＣＡＧＣＣＵＧＡＵＣＵＵＣＡＧＣＣＵＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＵＧＧＧＣＧＣＣＣＵＧＧＣＣＡＡＧＧＵＧＣＵＧＣＧＣＣＵＧＵＵＣＧＡＧＧＡＧＡＡＣＧＡＣＧＵＧＡＡＣＣＵＧＡＣＣＣＡＣＡＵＣＧＡＧＡＧＣＣＧＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＣＵＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＵＡＣＧＡＧＵＵＣＵＵＣＡＣＣＣＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＣＣＣＧＣＣＣＵＧＡＣＣＡＡＣＡＵＣＡＵＣＡＡＧＡＵＣＣＵＧＣＧＣＣＡＣＧＡＣＡＵＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＧＵＧＣＡＣＧＡＧＣＵＧＡＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＣＧＵＧＣＣＣＵＧＧＵＵＣＣＣＣＣＧＣＡＣＣＡＵＣＣＡＧＧＡＧＣＵＧＧＡＣＣＧＣＵＵＣＧＣＣＡＡＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＡＧＣＵＡＣＧＧＣＧＣＣＧＡＧＣＵＧＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＵＵＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＵＧＵＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＡＡＧＣＡＧＵＵＣＧＣＣＧＡＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＡＡＣＵＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＡＵＣＣＣＣＣＧＣＧＵＧＧＡＧＵＡＣＡＵＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＣＣＵＧＧＧＧＣＡＣＣＧＵＧＵＵＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＡＡＧＡＧＣＣＵＧＵＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＣＵＧＣＵＡＣＧＡＧＵＡＣＡＡＣＣＡＣＡＵＣＵＵＣＣＣＣＣＵＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＵＡＣＵＧＣＧＧＣＵＵＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＣＡＵＣＣＣＣＣＡＧＣＵＧＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＣＣＡＧＵＵＣＣＵＧＣＡＧＡＣＣＵＧＣＡＣＣＧＧＣＵＵＣＣＧＣＣＵＧＣＧＣＣＣＣＧＵＧＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＧＣＧＧＣＣＵＧＧＣＣＵＵＣＣＧＣＧＵＧＵＵＣＣＡＣＵＧＣＡＣＣＣＡＧＵＡＣＡＵＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＡＵＧＵＡＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＣＡＵＣＵＧＣＣＡＣＧＡＧＣＵＧＣＵＧＧＧＣＣＡＣＧＵＧＣＣＣＣＵＧＵＵＣＡＧＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＵＵＣＧＣＣＣＡＧＵＵＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＡＵＣＧＧＣＣＵＧＧＣＣＡＧＣＣＵＧＧＧＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＧＵＡＣＡＵＣＧＡＧＡＡＧＣＵＧＧＣＣＡＣＣＡＵＣＵＡＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＧＧＡＧＵＵＣＧＧＣＣＵＧＵＧＣＡＡＧＣＡＧＧＧＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＣＵＧＣＵＧＡＧＣＡＧＣＵＵＣＧＧＣＧＡＧＣＵＧＣＡＧＵＡＣＵＧＣＣＵＧＡＧＣＧＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＧＣＵＧＣＵＧＣＣＣＣＵＧＧＡＧＣＵＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＵＣＣＡＧＡＡＣＵＡＣＡＣＣＧＵＧＡＣＣＧＡＧＵＵＣＣＡＧＣＣＣＣＵＧＵＡＣＵＡＣＧＵＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＵＵＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＵＧＣＧＣＡＡＣＵＵＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＣＣＣＣＣＧＣＣＣＣＵＵＣＡＧＣＧＵＧＣＧＣＵＡＣＧＡＣＣＣＣＵＡＣＡＣＣＣＡＧＣＧＣＡＵＣＧＡＧＧＵＧＣＵＧＧＡＣＡＡＣＡＣＣＣＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＵＣＣＵＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＡＡＣＡＧＣＧＡＧＡＵＣＧＧＣＡＵＣＣＵＧＵＧＣＡＧＣＧＣＣＣＵＧＣＡＧＡＡＧＡＵＣＡＡＧＵＡＡ（配列番号５）
いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一なヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に適したｍＲＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、または配列番号５と同一なヌクレオチド配列を含む。
ｍＲＮＡ溶液
ｍＲＮＡ溶液の性質
ｍＲＮＡは、ＬＮＰ中にｍＲＮＡが封入され得るように、溶液として提供されて、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液と混合されてもよい。好適なｍＲＮＡ溶液は、様々な濃度で封入されるべきｍＲＮＡを含有する任意の水溶液であり得る。例えば、好適なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、または１．０ｍｇ／ｍｌより高い濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約０．０１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０１～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．７ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．６ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．４ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．３ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０５～０．１ｍｇ／ｍｌ、０．１～１．０ｍｇ／ｍｌ、０．２～０．９ｍｇ／ｍｌ、０．３～０．８ｍｇ／ｍｌ、０．４～０．７ｍｇ／ｍｌ、または０．５～０．６ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、最高約５．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、０．０９ｍｇ／ｍｌ、０．０８ｍｇ／ｍｌ、０．０７ｍｇ／ｍｌ、０．０６ｍｇ／ｍｌ、または０．０５ｍｇ／ｍｌの濃度でｍＲＮＡを含有してもよい。
好適なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩を含有しなくてもよい。例えば特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば注射用水などのＲＮａｓｅ非含有水中にあってもよい。
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩を含んでもよい。一般に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、緩衝剤の好適な濃度は、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、４ｍＭ、６ｍＭ、８ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、または５０ｍＭ以上である。
例示的な塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の好適な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であり得る。好適なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭ以上である。
いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有してもよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、および６．５以下のｐＨを有してもよい。
ｍＲＮＡ溶液の調製
本発明に好適なｍＲＮＡ溶液を調製するために、様々な方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、本明細書に記載される緩衝溶液中に直接溶解されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液と混合されて、封入される前に、ｍＲＮＡストック溶液と緩衝溶液とを混合することにより作製されてもよい。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液と混合されて、封入される直前に、ｍＲＮＡストック溶液と緩衝溶液とを混合することにより作製されてもよい。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、または１．６ｍｇ／ｍＬ、２．０ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬ、３．０ｍｇ／ｍＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、４．０ｍｇ／ｍＬ、４．５ｍｇ／ｍＬ、または５．０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水中にｍＲＮＡを含有してもよい。
脂質ナノ粒子
本明細書に開示される方法での使用を目的に対し、様々なプロセスを使用して、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液、またはｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の懸濁液を調製することができる。典型的には、かかる懸濁液を調製する第一の工程は、脂質溶液を提供することである。本明細書で使用される場合、脂質溶液は、ｍＲＮＡの封入のための脂質ナノ粒子を形成するのに好適な脂質の混合物を含有する。
脂質溶液
いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液はエタノール系である。例えば、好適な脂質溶液は、純エタノール（すなわち、１００％エタノール）に溶解された所望の脂質の混合物を含有してもよい。別の実施形態では、好適な脂質溶液はイソプロピルアルコール系である。別の実施形態では、好適な脂質溶液はジメチルスルホキシド系である。別の実施形態では、好適な脂質溶液は、エタノール、イソプロピルアルコール、およびジメチルスルホキシドを含むがこれらに限定されない好適な溶媒の混合物である。
好適な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有してもよい。例えば、好適な脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌ以上の総濃度の所望の脂質の混合物を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．５～９０ｍｇ／ｍＬ、１．０～８０ｍｇ／ｍＬ、１．０～７０ｍｇ／ｍＬ、１．０～６０ｍｇ／ｍＬ、１．０～５０ｍｇ／ｍＬ、１．０～４０ｍｇ／ｍＬ、１．０～３０ｍｇ／ｍＬ、１．０～２０ｍｇ／ｍＬ、１．０～１５ｍｇ／ｍＬ、１．０～１０ｍｇ／ｍＬ、１．０～９．０ｍｇ／ｍＬ、１．０～８．０ｍｇ／ｍＬ、１．０～７．０ｍｇ／ｍＬ、１．０～６．０ｍｇ／ｍＬ、または１．０～５．０ｍｇ／ｍＬの範囲の総濃度の所望の脂質を含有してもよい。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、最高約１００ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、または１０ｍｇ／ｍＬの総濃度の所望の脂質の混合物を含有してもよい。
任意の所望の脂質は、ｍＲＮＡの封入に好適な任意の比率で混合され得る。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）および／またはＰＥＧ修飾脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。いくつかの実施形態では、好適な脂質溶液は、カチオン性脂質、一つ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質、および任意でコレステロール系脂質）およびＰＥＧ修飾脂質を含む、所望の脂質の混合物を含有する。
カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という語句は、例えば生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで、または例えば組成物が製剤化される、および／もしくは組成物が投与される条件などの選択された条件下で、正味の負電荷を有する多数の脂質種のいずれかを指す。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載されており、それらの多くは市販されている。本発明の組成物および方法での使用に特に好適なカチオン性脂質には、いずれも参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開第ＷＯ２０１０／０５３５７２号（特に、段落［００２２５］に記載されるアミノアルコールリピドイド、特にＣ１２～２００として記載されるカチオン性脂質）および同第ＷＯ２０１２／１７０９３０号に記載のものが含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、例えば、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（ＨＧＴ５０００）、（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（ＨＧＴ５００１）、および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（ＨＧＴ５００２）などの、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号（国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１４９１４０に対応する。両方とも本明細書に参照により組み込まれる）に記載のイオン化可能なカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３，６－ビス（４－（ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）－２－ヒドロキシオクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン（ＯＦ－０２）などのカチオン性脂質を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／１４４７４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル ４－（ジメチルアミノ）ブタノエート：
Figure 2023514450000002
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／１４９１４０号に記載のイオン化可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のうちの一つのカチオン性脂質：
Figure 2023514450000003
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２が各々独立して、水素、任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ１－Ｃ２０アルキル、および任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、Ｌ１およびＬ２が各々独立して、水素、任意に置換されるＣ１－Ｃ３０アルキル、任意に置換される可変不飽和Ｃ１－Ｃ３０アルケニル、および任意に置換されるＣ１－Ｃ３０アルキニルからなる群から選択され、ｍおよびｏが各々独立して、ゼロおよび任意の正の整数（例えば、ｍが３である）からなる群から選択され、ｎがゼロまたは任意の正の整数（例えば、ｎが１である）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－ｌ－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）：
Figure 2023514450000004
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－ｌ－アミン（「ＨＧＴ５００１」）：
Figure 2023514450000005
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）：
Figure 2023514450000006
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000007
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000008
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／１１８７２４号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000009
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が挙げられる。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１３／０６３４６８号および同第２０１６／２０５６９１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000010
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、ＲＬの各事例が独立して、任意に置換されるＣ６－Ｃ４０アルケニルである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000011
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000012
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000013
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000014
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１８４２５６号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000015
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｘが各々独立して、ＯまたはＳであり、Ｙが各々独立して、ＯまたはＳであり、ｍが各々独立して、０～２０であり、ｎが各々独立して、１～６であり、ＲＡが各々独立して、水素、任意に置換されるＣ１－５０アルキル、任意に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意に置換される３～１４員ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６－１４アリール、任意に置換される５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンであり、ＲＢが各々独立して、水素、任意に置換されるＣ１－５０アルキル、任意に置換されるＣ２－５０アルケニル、任意に置換されるＣ２－５０アルキニル、任意に置換されるＣ３－１０カルボシクリル、任意に置換される３～１４員ヘテロシクリル、任意に置換されるＣ６－１４アリール、任意に置換される５～１４員ヘテロアリール、またはハロゲンである。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質、「ターゲット２３」：
Figure 2023514450000016
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１６／００４２０２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000017
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000018
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000019
 またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号、および２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，５１０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000020
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｒ１およびＲ２が各々独立して、ＨまたはＣ１－Ｃ６脂肪族であり、ｍが各々独立して、１～４の値を有する整数であり、Ａが各々独立して、共有結合またはアリーレンであり、Ｌ１が各々独立して、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり、Ｌ２が各々独立して、Ｃ２－Ｃ１０脂肪族であり、Ｘ１が各々独立して、ＨまたはＯＨであり、Ｒ３が各々独立して、Ｃ６－Ｃ２０脂肪族である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000021
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000022
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000023
 またはその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000024
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000025
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ，Ｃｅｌｌ ２０１０，１４１，２１０－２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000026
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１５／１９９９５２号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000027
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000028
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000029
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000030
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000031
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000032
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000033
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000034
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000035
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000036
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000037
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000038
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000039
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／００４１４３号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000040
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000041
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000042
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000043
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000044
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000045
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000046
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000047
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000048
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000049
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000050
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000051
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000052
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000053
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000054
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000055
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000056
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０７５５３１号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000057
 またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、Ｌ１またはＬ２の一方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり、Ｌ１またはＬ２の他方が、－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、もしくは－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－、または直接結合であり、Ｇ１およびＧ２が各々独立して、非置換Ｃ１－Ｃ１２アルキレンまたはＣ１－Ｃ１２アルケニレンであり、Ｇ３が、Ｃ１－Ｃ２４アルキレン、Ｃ１－Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３－Ｃ８シクロアルケニレンであり、Ｒａが、ＨまたはＣ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ１およびＲ２が各々独立して、Ｃ６－Ｃ２４アルキルまたはＣ６－Ｃ２４アルケニルであり、Ｒ３が、Ｈ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４、または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり、Ｒ４が、Ｃ１－Ｃ１２アルキルであり、Ｒ５が、ＨまたはＣ１－Ｃ６アルキルであり、ｘが、０、１、または２である。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１１７５２８号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000058
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000059
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000060
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／０４９２４５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式のうちの一つの化合物：
Figure 2023514450000061
 およびその薬学的に許容される塩を含む。これら四つの式のうちのいずれか一つにおいて、Ｒ４は、独立して、－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから選択され、Ｑは、－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され、ｎは、１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000062
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000063
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000064
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000065
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１７／１７３０５４号および同第２０１５／０９５３４０号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000066
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000067
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000068
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000069
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の医薬組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／８６５，５５５号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000070
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の医薬組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／８６４，８１８号に記載のカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の式に従う化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000071
 またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の各々は独立して、Ｃ６－Ｃ３０アルキル、Ｃ６－Ｃ３０アルケニル、またはＣ６－Ｃ３０アルキニルであり、Ｌ１はＣ１－Ｃ３０アルキレン、Ｃ２－Ｃ３０アルケニレン、またはＣ２－Ｃ３０アルキニレンであり、およびＢ１は、イオン化可能な窒素含有基である。複数の実施形態では、Ｌ１は、Ｃ１－Ｃ１０アルキレンである。複数の実施形態では、Ｌ１は、非置換Ｃ１－Ｃ１０アルキレンである。複数の実施形態では、Ｌ１は、（ＣＨ２）２、（ＣＨ２）３、（ＣＨ２）４、または（ＣＨ２）５である。複数の実施形態では、Ｌ１は、（ＣＨ２）、（ＣＨ２）６、（ＣＨ２）７、（ＣＨ２）８、（ＣＨ２）９、または（ＣＨ２）１０である。複数の実施形態では、Ｂ１は独立して、ＮＨ２、グアニジン、アミジン、モノもしくはジアルキルアミン、５～６員窒素含有ヘテロシクロアルキル、または５～６員窒素含有ヘテロアリールである。複数の実施形態では、Ｂ１は、
Figure 2023514450000072
 である。複数の実施形態では、Ｂ１は、
Figure 2023514450000073
 である。複数の実施形態では、Ｂ１は、
Figure 2023514450000074
 である。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々独立して、非置換直鎖状Ｃ６－Ｃ２２アルキル、非置換直鎖状Ｃ６－Ｃ２２アルケニル、非置換直鎖状Ｃ６－Ｃ２２アルキニル、非置換分岐状Ｃ６－Ｃ２２アルキル、非置換分岐状Ｃ６－Ｃ２２アルケニル、または非置換分岐状Ｃ６－Ｃ２２アルキニルである。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々、非置換Ｃ６－Ｃ２２アルキルである。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、－Ｃ６Ｈ１３、－Ｃ７Ｈ１５、－Ｃ８Ｈ１７、－Ｃ９Ｈ１９、－Ｃ１０Ｈ２１、－Ｃ１１Ｈ２３、－Ｃ１２Ｈ２５、－Ｃ１３Ｈ２７、－Ｃ１４Ｈ２９、－Ｃ１５Ｈ３１、－Ｃ１６Ｈ３３、－Ｃ１７Ｈ３５、－Ｃ１８Ｈ３７、－Ｃ１９Ｈ３９、－Ｃ２０Ｈ４１、－Ｃ２１Ｈ４３、－Ｃ２２Ｈ４５、－Ｃ２３Ｈ４７、－Ｃ２４Ｈ４９、または－Ｃ２５Ｈ５１である。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々独立して、－Ｏ（ＣＯ）Ｒ５または－Ｃ（Ｏ）ＯＲ５によって置換されるＣ６－Ｃ１２アルキルであり、式中、Ｒ５は非置換Ｃ６－Ｃ１４アルキルである。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々、非置換Ｃ６－Ｃ２２アルケニルである。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々、－（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）５ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）９ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１０ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１１ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１２ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１３ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１４ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１５ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１６ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１７ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）１８ＣＨ＝ＣＨ２、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）５ＣＨ３、－（ＣＨ２）４ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）８ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、－（ＣＨ２）６ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３、－（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３、
－（ＣＨ２）３ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３、
－（ＣＨ２）１１ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、または
－（ＣＨ２）２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ３である。
複数の実施形態では、当該Ｃ６－Ｃ２２アルケニルは、モノアルケニル、ジエニル、またはトリエニルである。複数の実施形態では、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は各々、以下である。
Figure 2023514450000075
 いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000076
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000077
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000078
 およびその薬学的に許容される塩を含む。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000079
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するための他の好適なカチオン性脂質としては、参照により本明細書に組み込まれる、国際特許公開第２０１２／１７０８８９号に記載の切断可能なカチオン性脂質が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式のカチオン性脂質：
Figure 2023514450000080
 およびその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、Ｒ１は、イミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、任意に置換されるアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）、およびピリジルからなる群から選択され、Ｒ２は、以下の二つの式のうちの一つからなる群：
Figure 2023514450000081
 ならびにその薬学的に許容可能な塩から選択され、式中、Ｒ３およびＲ４は各々独立して、任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アルキルおよび任意に置換される可変飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ２０アシルからなる群から選択され、ｎは、０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上）である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００１」：
Figure 2023514450000082
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００２」：
Figure 2023514450000083
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００３」：
Figure 2023514450000084
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００４」：
Figure 2023514450000085
 およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有するカチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」：
Figure 2023514450000086
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法で使用するための他の好適なカチオン性脂質には、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許出願公開ＷＯ２０１９／２２２４２４に記載される切断可能なカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、一般式のうちのいずれか、または国際特許出願公開ＷＯ ２０１９／２２２４２４に記載の構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）ならびに（２２）～（２３７）のうちのいずれかである、カチオン性脂質を含む。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質：
Figure 2023514450000087
 およびその薬学的に許容される塩を含み、式中、
ＲＸが独立して、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３が各々独立して、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
Ｌ４ＡおよびＬ５Ａが各々独立して、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり、
Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂが各々独立して、Ｃ１－Ｃ２０アルキレン、Ｃ２－Ｃ２０アルケニレン、またはＣ２－Ｃ２０アルキニレンであり、
ＢおよびＢ’が各々、ＮＲ４Ｒ５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３が各々独立して、Ｃ６－Ｃ３０アルキル、Ｃ６－Ｃ３０アルケニル、またはＣ６－Ｃ３０アルキニルであり、
Ｒ４およびＲ５が各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ１０アルキル、Ｃ２－Ｃ１０アルケニル、またはＣ２－Ｃ１０アルキニルであり、
ＲＬが各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、Ｃ２－Ｃ２０アルケニル、またはＣ２－Ｃ２０アルキニルである、カチオン性脂質を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の化合物構造を有する特許出願ＷＯ２０１９／２２２４２４の化合物（１３９）であるカチオン性脂質：
Figure 2023514450000088
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物および方法は、以下の化合物構造を有するＴＢＬ－００７０（ＲＬ３－ＤＭＡ－０７Ｄ）であるカチオン性脂質：
Figure 2023514450000089
 およびその薬学的に許容される塩を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）などの名称「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」のＷＯ２０１５／１８４２５６Ａ２（参照により本明細書に援用される）に記載されるカチオン性脂質を含む。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法に適したカチオン性脂質は、名称「Ｌｉｐｉｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」のＷＯ２０１３／０６３４６８と米国仮出願に記載される、およびＷＯ ２０１５／０６１４６７に記載されるカチオン性脂質を含み、当該文献は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ－ｃ１－ａの化合物：
Figure 2023514450000090
 またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、
各Ｒ２は、独立して、水素またはＣ１－３アルキルであり、
各ｑは、独立して、２～６であり、
各Ｒ’は、独立して、水素またはＣ１－３アルキルであり、
各ＲＬは、独立して、Ｃ８－１２アルキルである。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、水素、メチルまたはエチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ２は、水素である。
いくつかの実施形態では、各ｑは、独立して、３～６である。いくつかの実施形態では、各ｑは、独立して、３～５である。いくつかの実施形態では、各ｑは、４である。
いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素、メチル、またはエチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素またはメチルである。いくつかの実施形態では、各Ｒ’は、独立して、水素である。
いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ８－１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ－Ｃ８－１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ９－１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ－Ｃ９－１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ－Ｃ１０アルキルである。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は独立して水素またはメチルであり、各ｑは独立して３～５であり、各Ｒ’は独立して水素またはメチルであり、各ＲＬは独立してＣ８－１２アルキルである。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは独立して３～５であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８－１２アルキルである。
いくつかの実施形態では、各Ｒ２は水素であり、各ｑは４であり、各Ｒ’は水素であり、各ＲＬは独立してＣ８－１２アルキルである。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉ－ｇの化合物：
Figure 2023514450000091
 またはその薬学的に許容可能な塩を含み、式中、各ＲＬは独立してＣ８－１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ－Ｃ８－１２アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ９－１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、ｎ－Ｃ９－１１アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、独立して、Ｃ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、各ＲＬは、ｎ－Ｃ１０アルキルである。
特定の実施形態では、好適なカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２または（３，６－ビス（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）ピペラジン－２，５－ジオン）、およびその薬学的に許容可能な塩である。ｃＫＫ－Ｅ１２の構造を以下に示す。
Figure 2023514450000092
さらなる例示的なカチオン性脂質は、式Ｉのカチオン性脂質：
Figure 2023514450000093
 （例えば、Ｆｅｎｔｏｎ，Ｏｗｅｎ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．“Ｂｉｏｉｎｓｐｉｒｅｄ Ａｌｋｅｎｙｌ Ａｍｉｎｏ Ａｌｃｏｈｏｌ Ｉｏｎｉｚａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｈｉｇｈｌｙ Ｐｏｔｅｎｔ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”Ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌｓ（２０１６）を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、本発明に適した一つ以上のカチオン性脂質は、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド、または「ＤＯＴＭＡ」であり得る。（Ｆｅｉｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，７４１３（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号、それらは参照により本明細書に援用される）。他の好適なカチオン性脂質は、例えば、５－カルボキシスペルミルグリジンジオクタデシルアミド（ｃａｒｂｏｘｙｓｐｅｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ）もしくは「ＤＯＧＳ」、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムもしくは「ＤＯＳＰＡ」（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号、米国特許第５，３３４，７６１号）、ｌ，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパンもしくは「ＤＯＤＡＰ」、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパンもしくは「ＤＯＴＡＰ」を含む。
追加の例示的カチオン性脂質としては、ｌ，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、１，２－ジリノレイロキシオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭＡ」、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤＡＢ」、Ｎ－（ｌ，２－ジミリチルチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２－［５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチｌ－ｌ－（シス，シス－９’，ｌ－２’－オクタデカジエンオキシ）プロパンまたは「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３－ジリノレオイロイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソランまたは（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）、２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）、（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）、（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスト－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ、ｆｓｌ－ジメチ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］－ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」、および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエン－１－イル）－ｌ，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）（参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ ２０１０／０４２８７７号、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２－１７６（２０１０））を参照のこと）またはそれらの混合物も挙げられる。（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６－２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３－１００７（２００５）；国際特許出願公開ＷＯ２００５／１２１３４８）。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質のうちの一つ以上は、イミダゾール部分、ジアルキルアミノ部分、またはグアニジニウム部分のうちの少なくとも一つを含む。
いくつかの実施形態では、一つ以上のカチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）、ＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ－１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン））、ＮＣ９８－５（４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザへキサデカン－１，１６－ジアミド）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＨＧＴ４００３（ＷＯ２０１２／１７０８８９、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＩＣＥ（ＷＯ２０１１／０６８８１０、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＨＧＴ５０００（米国仮特許出願第６１／６１７，４６８号および国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１４９１４０、その教示は、その全体が参照により本明細書に援用される）またはＨＧＴ５００１（シスまたはトランス）（仮特許出願第６１／６１７，４６８号および国際特許出願公開ＷＯ２０１３／１４９１４０）、ＷＯ２０１０／０５３５７２に開示されるものなどのアミノアルコールリピドイド、ＤＯＴＡＰ（１，２－ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（１，２－ジ－Ｏ－オクタデセニル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＬｉｎＤＭＡ（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．；Ｐａｌｍｅｒ，Ｌ．；Ｂｒｅｍｎｅｒ，Ｋ．；ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，Ｉ．“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ”Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．２００５，１０７，２７６－２８７）、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ（Ｓｅｍｐｌｅ，Ｓ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．“Ｒａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０１０，２８，１７２－１７６）、Ｃ１２－２００（Ｌｏｖｅ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．“Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｌｏｗ－ｄｏｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ”ＰＮＡＳ ２０１０，１０７，１８６４－１８６９）、Ｎ１ＧＬ、Ｎ２ＧＬ、Ｖ１ＧＬ、およびそれらの組み合わせから選択され得る。
いくつかの実施形態では、一つ以上のカチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明における使用に適したアミノ脂質は、ＷＯ２０１７１８０９１７に記載されるものを含み、これは参照により本明細書に援用される。ＷＯ２０１７１８０９１７における例示的なアミノ脂質は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（Ｌ６０８）、および化合物１８などの段落［０７４４］に記載されるものを含む。他のアミノ脂質は、化合物２、化合物２３、化合物２７、化合物１０、および化合物２０を含む。本発明における使用に適したさらなるアミノ脂質は、ＷＯ２０１７１１２８６５に記載されるものを含み、これは参照により本明細書に援用される。ＷＯ２０１７１１２８６５における例示的なアミノ脂質は、式（Ｉ）、（Ｉａｌ）－（Ｉａ６）、（ｌｂ）、（ＩＩ）、（Ｉｌａ）、（ＩＩＩ）、（Ｉｌｉａ）、（ＩＶ）、（１７－１）、（１９－１）、（１９－１１）、および（２０－１）のうちの一つに従う化合物と、段落［０１８５］、［０２０１］、［０２７６］の化合物とを含む。いくつかの実施形態では、本発明における使用に適したカチオン性脂質は、ＷＯ２０１６１１８７２５に記載されるものを含み、これは参照により本明細書に援用される。ＷＯ２０１６１１８７２５における例示的なカチオン性脂質は、ＫＬ２２およびＫＬ２５などのものを含む。いくつかの実施形態では、本発明における使用に適したカチオン性脂質は、ＷＯ２０１６１１８７２４に記載されるものを含み、これは参照により本明細書に援用される。ＷＯ２０１６１１８７２５における例示的なカチオン性脂質は、ＫＬ１０、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、およびＫＬ２５などのものを含む。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、重量またはモルで、総脂質混合物の約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
非カチオン性脂質／ヘルパー脂質
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という語句は、例えば生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで、または例えば組成物が製剤化される、および／もしくは組成物が投与される条件などの選択された条件下で、中性、両性イオン性またはアニオン性の任意の脂質を指す。本明細書で使用される場合、語句「アニオン性脂質」は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負電荷を運ぶ多数の脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質として、以下に限定されないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、適切な脂質溶液は、非カチオン性脂質成分としてＤＯＰＥを含む。他の実施形態では、適切な脂質溶液は、非カチオン性脂質成分としてＤＥＰＥを含む。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％を構成しうる。いくつかの実施形態では、合計した非カチオン性脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
コレステロール系脂質
好適な脂質溶液は、典型的には、少なくとも一つのコレステロール系脂質を含む。例えば、好適なコレステロール系カチオン性脂質としては、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９，２８０（１９９１）、Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，１３９（１９９７）、米国特許第５，７４４，３３５号）、または以下の構造を有する、国際特許出願公開ＷＯ２０１１／０６８８１０に開示されるイミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）を含む。
Figure 2023514450000094
複数の実施形態では、コレステロール系脂質は、コレステロールである。他の実施形態では、コレステロール系脂質は、ＩＣＥである。特定の実施形態では、ＩＣＥは、本明細書に開示される脂質ナノ粒子のコレステロール系脂質成分およびカチオン性脂質成分の両方である。
いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成する。いくつかの実施形態では、コレステロール系脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
ＰＥＧ修飾脂質
脂質ナノ粒子中にＰＥＧ修飾脂質が存在することで、複合体の凝集を阻止することができ、また循環寿命を増加させ、脂質－核酸組成物の標的組織への送達を増加させるための手段を提供することができる（Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６８（１）：２３５－２３７）。あるいは、これらの成分はインビボで製剤の外へと速やかに交換されるように選択され得る（米国特許第５，８８５，６１３号を参照のこと）。
例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質、およびＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの誘導体化脂質の使用も、本発明によって企図される。企図されるＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０の鎖長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大２ｋＤａ、最大３ｋＤａ、最大４ｋＤａ、または最大５ｋＤａの鎖長のポリエチレングリコール鎖を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ修飾脂質は、ＰＥＧ修飾コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。いくつかの実施形態では、特定の有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧセラミドである。
ＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化した脂質は、重量またはモルで、好適な脂質溶液中の総脂質の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、または７０％を構成し得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾脂質は、重量またはモルで、適切な脂質溶液中の合計脂質の約３０～５０％（例えば、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。
本発明での使用に好適な脂質溶液は、典型的には、例えば１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）などのＰＥＧ修飾脂質を含む。
例示的な脂質製剤
予め形成された脂質ナノ粒子を調製するために使用され得、かつそれらに含まれる脂質、すなわち、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意にコレステロールの様々な組み合わせが、文献および本明細書に記載される。好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ＤＥＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。別の好ましい脂質溶液は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含む。
しかし他の脂質製剤も予期され、例えば、好適な脂質溶液は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ｃＫＫ－Ｅ１２、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５０００、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ５００１、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを含み得る。脂質の追加的な組み合わせは当分野において、例えば米国特許出願６２／４２０，４２１（２０１６年１１月１０日に出願され、対応する国際特許出願公開はＷＯ２０１８／０８９７９０である）、米国特許出願６２／４２１，０２１（２０１６年１１月１１日に出願され、対応する国際特許出願公開はＷＯ２０１８／０８９７９０である）、米国特許出願６２／４６４，３２７（２０１７年２月２７日に出願され、対応する国際特許出願公開はＷＯ２０１８／０８９７９０である）、および「Ｎｏｖｅｌ ＩＣＥ－ｂａｓｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍＲＮＡ」という名称の２０１７年１１月１０日に出願されたＰＣＴ出願に記載されている。それらの開示内容は、参照によりその全範囲で本明細書に含まれる。
脂質混合物を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の選択、ならびにこのような脂質の相互の相対的モル比は、選択される脂質の特徴、ならびに封入されるｍＲＮＡの性質および特徴に基づく。追加の考慮すべき事項は、例えば、選択される脂質のアルキル鎖の飽和度、ならびに大きさ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、融合性、および毒性を含む。したがって、モル比率はそれらに応じて調節され得る。
ｍＲＮＡの封入
本明細書で使用される場合、「プロセスＡ」とは、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合することによりｍＲＮＡを封入する従来的な方法を指し、この場合において当該ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合を行う前に周囲温度よりも高い温度まで加熱され、最初に脂質ナノ粒子内に脂質を予め形成させることもない（２０１５年７月２日に出願され、「Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ」という名称の米国特許出願１４／７９０，５６２、および２０１４年７月２日に出願されたその米国仮特許出願６２／０２０，１６３、および国際特許出願ＷＯ２０１６／００４３１８、およびＵＳ ２０１６／００３８４３２に記載される）。
本明細書で使用される場合、「リミックスプロセス」（または「プロセスＢ」）とは、ＵＳ ２０１８／０１５３８２２に記載される、予め形成された脂質ナノ粒子の懸濁液とｍＲＮＡ溶液を混合することによりｍＲＮＡを封入する別の従来的な方法を指す。
本発明は、ｍＲＮＡ含有脂質ナノ粒子を製剤化する新規方法に関する。「リミックスプロセス」の場合、このプロセスには、予め形成された空の脂質ナノ粒子とｍＲＮＡを組み合わせることを含む。発明者らは驚くべきことに、予め形成された空の脂質ナノ粒子とｍＲＮＡを組み合わせる間にＮ／Ｐ比を変更することで、その結果得られるｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の効力と有効性が改善されることを見出した。
空の脂質ナノ粒子は、溶解した脂質を含有する脂質溶液と、水溶液または緩衝液を混合することによって形成される。次いで得られた予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液を、ｍＲＮＡ溶液に添加して、ｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、空の脂質ナノ粒子は、溶媒中に溶解した脂質を含有する脂質溶液と、水溶液を混合することによって形成される。いくつかの実施形態では、溶媒はエタノールであり得る。いくつかの実施形態では、水溶液は、クエン酸緩衝液であり得る。
いくつかの実施形態では、エタノール、クエン酸緩衝液、および他の不安定化剤は、ｍＲＮＡの添加中に存在せず、そのため製剤は、さらなる下流処理は何も必要としない。特定の実施形態では、予め形成された空の脂質ナノ粒子の形成の後に、緩衝液は、適切な保管緩衝液と交換される。いくつかの実施形態では、保管緩衝液は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％の二糖（ｗ／ｖ）を含む水溶液を含むか、またはそれからなる。適切な二糖類としては、スクロースおよびトレハロースが挙げられる。いくつかの実施形態では、保管緩衝液中の空の脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを添加すると、下流の精製または処理を必要としない最終製剤が得られ、凍結形態で安定的に保管することができる。典型的な実施形態では、保管緩衝液は、約１０％のトレハロースを含む水溶液を含むか、またはそれからなる。
封入中の加熱
本明細書で使用される場合、「周囲温度」という用語は、部屋の温度、あるいは加熱または冷却なしに、関心対象の物体（例えば、予め形成された空の脂質ナノ粒子懸濁液、ｍＲＮＡ溶液、もしくはｍＲＮＡを含む脂質ナノ粒子懸濁液）を囲む温度を意味する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含む溶液は、任意の混合工程の前は周囲温度である。いくつかの実施形態では、周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃または１６℃であるか、またはそれよりも低い。いくつかの実施形態では、周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃、または約２０～２５℃の範囲である。いくつかの実施形態では、周囲温度は、２０～２５℃である。いくつかの実施形態では、周囲温度は、約１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃の範囲であり、例えば約２１℃である。
特定の実施形態では、空のＬＮＰを含む懸濁液は、ｍＲＮＡ溶液と組み合わされる前は、周囲温度よりも高い温度である。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と空のＬＮＰを含む懸濁液を組み合わせた混合液は、周囲温度よりも高い温度まで加熱される。周囲温度よりも高い温度は、典型的には、約２５℃よりも高い。いくつかの実施形態では、周囲温度よりも高い温度は、約３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、または７０℃よりも高い。いくつかの実施形態では、周囲温度よりも高い温度は、約２５～７０℃、約３０～７０℃、約３５～７０℃、約４０～７０℃、約４５～７０℃、約５０～７０℃、または約６０～７０℃の範囲である。特定の実施形態では、周囲温度よりも高い温度は、約６０～７０℃である。特定の実施形態では、周囲温度よりも高い温度は、約６５℃である。
典型的な実施形態では、合計した加熱時間は、２０分以下（例えば、１６分、１５分、１４分以下）に制限される。いくつかの実施形態では、合計した加熱時間は、１０分～２０分、例えば、約１５分である。
いくつかの実施形態では、予め形成された脂質ナノ粒子を含む懸濁液、ｍＲＮＡを含む溶液、および懸濁液と溶液の組み合わせのうちの一つ以上を加熱することは、製剤プロセスの前または後には発生しない。
体積の追加および混合
一つの態様では、本発明は、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）にｍＲＮＡを封入する方法に関する。かかる方法には、ｍＲＮＡを含む溶液と、予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液を組み合わせて、ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む混合物（「混合液」とも本明細書において呼称される）が形成されるようにすること、を含む。その後の工程では、ｍＲＮＡを含む溶液または予め形成された空のＬＮＰの一つ以上の追加体積を、望ましいモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡに到達するまで、前の工程で取得された混合液に加える。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを含む溶液、または予め形成された空のＬＮＰの一つ以上の追加体積を加えるその後の工程は、混合期間を含むか、または混合期間からなる。一つ以上の追加体積は、連続して加えられても、または段階的に加えられてもよい。いくつかの実施形態では、追加体積の数は、３、４または５である。特定の実施形態では、追加体積の数は、３である。
混合期間は、一つ以上の追加体積のうちのいずれか一つを加えた後、または一つ以上の追加体積の各々を加えた後に実施されてもよい。第一の体積、および一つ以上の追加体積は、各々の先行する体積と同じであってもよく、それより多くてもよく、または少なくてもよい。典型的には、第一の体積と一つ以上の追加体積は、同じである。混合期間の各期間は、各々の先行する期間と同じであってもよく、それより長くてもよく、または短くてもよい。典型的には、各混合時間は、同じである。
混合期間は、５分を超えなくてもよい。例えば、１～５分の期間でも高い封入効率を実現するのに充分な場合もある。いくつかの実施形態では、混合期間（例えば、１分）に続いて、インキュベーション期間（例えば、４分）が続く。インキュベーション期間では、混合液が、例えば中間保管レベルで保管される。予め形成されたＬＮＰの懸濁液、混合液、またはその両方が、封入プロセス中に加熱される場合、混合期間および／またはその後のインキュベーション期間を最小化することにより、封入されたｍＲＮＡの熱暴露も最小化され、ｍＲＮＡ（特に例えば４ｋｂ以上のｍＲＮＡ、例えば５ｋｂ以上のｍＲＮＡなどの大きなｍＲＮＡ）の分解を回避または低下させるのに有益であり得る。
いくつかの実施形態では、予め形成された空のＬＮＰ中にｍＲＮＡを封入することは、ｍＲＮＡを含む第一の液体と、予め形成された空のＬＮＰを含む第二の液体を、第一の液体と第二の液体が混合される混合接合部へとポンプ注入することにより実施されてもよい。典型的には、ｍＲＮＡは、混合接合部で混合された時に、ＬＮＰ内に封入される。混合後の一定期間、混合液をインキュベートすることによって、封入効率が増大される場合がある。これは、以下に詳細に記載されるように、中間保管容器において行うことができる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および予め形成された空のＬＮＰの懸濁液は、一つ以上のポンプを使用して混合されてもよい。封入手順は、広範囲のスケールで発生させることができるため、異なるタイプのポンプを使用して、望ましいスケールに順応させてもよい。典型的には、パルスレスフローポンプを使用することが望ましい。本明細書で使用される場合、パルスレスフローポンプは、安定した流量とともに連続的な流れを確立できる任意のポンプを指す。好適なポンプの種類としては限定されないが、ギアポンプ、容積型ポンプ、および遠心ポンプが挙げられ得る。例示的なギアポンプとしては、Ｃｏｌｅ－ＰａｒｍｅｒまたはＤｉｅｎｅｒギアポンプが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な遠心ポンプとしては、ＧｒａｉｎｇｅｒまたはＣｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒによって製造されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
表１（以下）は、本発明の実施形態による、予め形成された空のＬＮＰにｍＲＮＡを封入する方法を示す。流量Ｘは、ｍＬ／分の単位で測定されてもよい（または表されてもよい）。第一の工程で、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体を、４Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、ｍＲＮＡを含む第二の液体の一部を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第二の工程で、工程１で生成された混合液を、５Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、ｍＲＮＡを含む第二の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第三の工程で、工程２で生成された混合液を、６Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、ｍＲＮＡを含む第二の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第四の工程で、工程３で生成された混合液を、７Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、ｍＲＮＡを含む第二の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。いくつかの実施形態では、第二の液体の各部分は、およそ同じ体積である。
各工程後の、Ｎ／Ｐ比、またはＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡに対するＬＮＰ中のカチオン性脂質のモル比を、表１の一番右側の列に示す。いくつかの実施形態では、Ｙは、約４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比であってもよい。表１に見られるように、得られた液体のＮ／Ｐ比は、各工程の後に低下する。ゆえに当該方法は本明細書において「ステップダウンプロセス」または「ステップダウンリミックス」プロセスと呼称される。
Figure 2023514450000095
表２（以下）は、本発明の実施形態による、予め形成された空のＬＮＰにｍＲＮＡを封入する方法を示す。Ｘは、ｍＬ／分の単位で測定されてもよい（または表されてもよい）。第一の工程で、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体の一部を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、ｍＲＮＡを含む第二の液体を、４Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第二の工程で、工程１で生成された混合液を、５Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第三の工程で、工程２で生成された混合液を、６Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。第四の工程で、工程３で生成された混合液を、７Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよく、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体の追加的な部分を、Ｘの流量で混合接合部へとポンプ注入してもよい。いくつかの実施形態では、第一の液体の各部分は、およそ同じ体積である。
各工程後の、Ｎ／Ｐ比、またはＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡに対するＬＮＰ中のカチオン性脂質のモル比を、表２の一番右側の列に示す。いくつかの実施形態では、Ｙは、約４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比であってもよい。表２に見られるように、得られた液体のＮ／Ｐ比は、各工程の後に増加する。ゆえに当該方法は本明細書において「ステップアッププロセス」または「ステップアップリミックス」プロセスと呼称される。
Figure 2023514450000096
ｍＲＮＡ溶液は、２０ｍＬ／分～２０Ｌ／分の流量でポンプ注入されてもよい。予め形成された空のＬＮＰの懸濁液は、２０ｍＬ／分～２０Ｌ／分の流量でポンプ注入されてもよい。本発明の商業スケールの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液、および予め形成された空のＬＮＰの懸濁液は、１Ｌ／分～２０Ｌ／分、例えば、５Ｌ／分～１５Ｌ／分、例えば、１０Ｌ／分の流量でポンプ注入されてもよい。本発明の実験室スケールの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液、および予め形成された空のＬＮＰの懸濁液は、２０ｍＬ／分～１Ｌ／分、例えば、５０ｍＬ／分～５００ｍＬ／分、例えば、２５０ｍＬ／分の流量でポンプ注入されてもよい。
いくつかの実施形態では、混合期間は、１分間～５分間、継続されてもよい。いくつかの実施形態では、２～４回の混合期間がある。したがって、ｍＲＮＡ溶液、および／または予め形成された空のＬＮＰの懸濁液をポンプ注入する合計時間は２～２０分間であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、４０ｍＬ～１００Ｌの初期合計体積のｍＲＮＡ溶液、および４０ｍＬ～１００Ｌの初期合計体積の予め形成された空のＬＮＰの懸濁液であってもよい。混合液の合計体積は、８０ｍＬ～２００Ｌであってもよい。
本発明の商業スケールの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の初期合計体積は、５Ｌ～１００Ｌであってもよく、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液の初期合計体積は、５Ｌ～１００Ｌであってもよく、混合液の合計体積は、１０Ｌ～２００Ｌであってもよい。本発明の実験室スケールの実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の初期合計体積は１００ｍＬ～５Ｌであってもよく、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液の初期合計容量は１００ｍＬ～５Ｌであってもよく、混合液の合計体積は、２００ｍＬ～１０Ｌであってもよい。
封入に使用される装置
本明細書に記載される方法を実施するために構成される装置を以下に記載する。いくつかの実施形態では、装置は、ステップダウンリミックス法またはステップアップリミックス法のいずれかを実行するように構成可能であり、装置の構成要素は、あるときにはステップアップリミックス方法を実行し、ステップダウンリミックス法は実行しないように構成されてもよく、別のときには、ステップダウンリミックス法を実行し、ステップアップリミックス法を実行しないように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、装置は、ステップアップリミックス法またはステップダウンリミックス法のいずれかを選択的に実行するように構成される。いくつかの実施形態では、装置は、ステップアップリミックス法またはステップダウンリミックス法のいずれかを実行するように構成される。
本明細書に記載される装置は例示であり、したがって、特許請求の範囲を限定するものではない。本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に記載される装置に対して特定の修正、置換、および追加を行い得ることは、当業者には明らかであろう。
図１１は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。ｍＲＮＡを含む第一の液体は、第一の保管容器１０１に保管されてもよく、予め形成された空のＬＮＰを含む第二の液体は、第二の保管容器１０２に保管されてもよい。第一の液体は、第一のポンプ１０３によって、混合接合部１０５にポンプ注入されてもよく、第二の液体は、第二のポンプ１０４によって、混合接合部１０５にポンプ注入されてもよい。第一の液体が第一の保管容器１０１から混合接合部１０５へ輸送される導管は、ＬＮＰ導管の配置と呼称され得る。第二の液体が第二の保管容器１０２から混合接合部１０５へ輸送される導管は、ｍＲＮＡ導管の配置と呼称され得る。装置の動作中、第一および第二の液体が同時に混合接合部へとポンプ注入されるときに、混合接合部１０５は、混合液を生成し得る。リサイクルループ１２０は、装置が動作しているとき、混合液を、第一のポンプ１０３の上流のＬＮＰ導管の配置中の位置に誘導するように構成可能であり、または混合液を、第二のポンプの上流のｍＲＮＡ導管の配置中の位置に誘導するように構成可能である。
図１２Ａは、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１１に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得る。装置が稼働しているとき、リサイクルループ２６０は、混合液を混合接合部２０５から、第一のポンプ２０３の上流のＬＮＰ導管の配置中の位置に誘導するように構成される。リサイクルループ２６０が、混合液を混合接合部２０５から、第一のポンプ２０３の上流のＬＮＰ導管の配置中の位置に誘導するように構成されるとき、装置は、ステップダウンリミックスの動作モードで動作すると言ってもよい。装置がステップダウンリミックスの動作モードで動作するよう構成されるとき、混合液中のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、混合液が混合接合部２０５を通過するたびに減少する。
図１２Ｂは、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１１に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得る。装置が稼働しているとき、リサイクルループ２６０は、混合液を混合接合部２０５から、第二のポンプ２０４の上流のｍＲＮＡ導管の配置中の位置に誘導するように構成される。リサイクルループ２６０が、混合液を混合接合部２０５から、第二のポンプ２０４の上流のＬＮＰ導管の配置中の位置に誘導するように構成されるとき、装置は、ステップアップリミックスの動作モードで動作すると言ってもよい。装置がステップアップリミックスの動作モードで動作するよう構成されるとき、混合液中のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比は、混合液が混合接合部２０５を通過するたびに増加する。
図１３は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１１に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、中間保管容器３０８を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部３０５から中間保管容器３０８へと誘導されてもよく、当該容器中で、混合液は保管され、その後にリサイクルループ３２０に誘導される。中間保管容器３０８に保管された混合液は、ポンプ（示さず）によりリサイクルループにポンプ注入されてもよく、またはリサイクルループ３２０がステップダウンリミックスまたはステップアップリミックスの動作モードで構成されるときには、それぞれ第一または第二のポンプにより、リサイクルループにポンプ注入されてもよい。
図１４は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１１に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、第一の熱交換器４０９を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部４０５から第一の熱交換器４０９へと誘導されてもよく、当該熱交換器中で、混合液は加熱され、その後にリサイクルループ４２０に誘導される。熱交換器は、混合液を望ましい温度に加熱するように構成されてもよく、その後、混合液はリサイクルループ４２０に誘導される。
図１５は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１４に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、中間保管容器５０８を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部５０５から第一の熱交換器５０９へ、および第一の熱交換器５０９から中間保管容器５０８へと誘導されてもよい。中間保管容器５０８は、図１３に関連して記載される中間保管容器と実質的に同じ方法で動作し得る。任意選択的に、混合液は、混合接合部５０５から中間保管容器５０８へと誘導されてもよく、その後、第一の熱交換器５０９へと誘導される。
図１６は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１１に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、最終保管容器６１０を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部６０５から最終保管容器６１０へと誘導されてもよい。装置は、混合液がリサイクルループ６２０を望ましい回数通過した後に、混合液が混合接合部６０５から最終保管容器６１０へと誘導されるように構成されてもよい。特定の実施形態では、合計で３回、リサイクルループ６２０を通過するよう混合液が誘導された後、混合液は、最終保管容器６１０へと誘導される。
図１７は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１６に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、第二の熱交換器７１１を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部７０５から第二の熱交換器７１１へ、および第二の熱交換器７１１から最終保管容器７１０へと誘導されてもよい。装置は、混合液がリサイクルループ７２０を望ましい回数通過した後に、混合液が混合接合部７０５から第二の熱交換器７１１へと誘導されるように構成されてもよい。特定の実施形態では、合計で３回、リサイクルループ７２０を通過するよう混合液が誘導された後、混合液は、第二の熱交換器７１１へと誘導される。
図１８は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１７に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、第一の熱交換器８０９および中間保管容器８０８を組み込む場合もある。装置が動作中のとき、混合液は、混合接合部８０５から第一の熱交換器８０９へ、および第一の熱交換器８０９から中間保管容器８０８へと誘導されてもよい。装置が混合液をリサイクルするように構成される場合、混合液は、中間保管容器８０８からリサイクルループ８２０へと誘導されてもよい。装置が混合液をアウトプットするよう構成される場合、混合液は、中間保管容器８０８から第二の熱交換器８１１へ、および第二の熱交換器８１１から最終保管容器８１０へと誘導されてもよい。特定の実施形態では、合計で３回、リサイクルループ８２０を通過するよう混合液が誘導された後、混合液は、第二の熱交換器８１１へと誘導される。
図１９は、本明細書に記載されるｍＲＮＡ封入プロセスでの使用を目的として構成された装置を示す。装置は、図１８に示される装置と実質的に同じ方法で動作し得るが、リサイクルループ９０６は、混合液を中間保管容器９０８から、第一のポンプ９０３の上流のＬＮＰ導管の配置内の位置へと誘導するよう構成される。
動作の実行、または異なる生産の実行（例えば、異なる治療用途のために、異なるタンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する）のサイクルの間、本明細書に記載される装置は、例えば、（ｉ）ＲＮａｓｅ非含有水の第一の流れを装置に通すこと、（ｉｉ）水酸化ナトリウム溶液の流れを装置に通すこと、および（ｉｉｉ）ＲＮａｓｅ非含有水の第二の流れを装置に通すこと、によって清浄化されてもよい。ＲＮａｓｅ非含有水は、注射用水であってもよい。
本明細書に記載される装置のいずれか一つでは、任意選択的に、第一の熱交換器は、中間保管容器内に組み込まれてもよい。任意選択的に、第二の熱交換器は、最終保管容器内に組み込まれてもよい。
本明細書に記載される装置のいずれか一つでは、任意選択的に、第一のポンプは、ＬＮＰ導管の配置内に組み込まれてもよく、および／または第一の保管容器内に組み込まれてもよい。任意選択的に、第二のポンプは、ｍＲＮＡ導管の配置内に組み込まれてもよく、および／または第二の保管容器内に組み込まれてもよい。
本明細書に記載される装置のいずれか一つでは、任意選択的に、導管の配置は、装置の構成要素部品の間に液体を誘導するように、およびそれらを通して液体を誘導するように構成される一つの導管であってもよい。任意選択的に、導管の配置は、装置の構成要素部分の間に液体を誘導するように、およびそれらを通して液体を誘導するように動作可能に、および／または流体的に連結された複数の導管を含んでもよい。
精製
いくつかの実施形態では、予め形成された空の脂質ナノ粒子、またはｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子は、精製され、および／または濃縮される。様々な精製方法を使用してもよい。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、接線流ろ過（ＴＦＦ、直交流ろ過とも呼称される）を使用して精製される。ＴＦＦは、ある種のろ過であり、ろ過される物質は、フィルターを通り抜けずに、フィルターに沿って接線方向に通過する。ＴＦＦでは、望ましくない透過物はフィルターを通過し、一方で望ましい保持物はフィルターに沿って通過し、下流で収集される。ＴＦＦにおいて、望ましい物質は、典型的には保持物中に含有される。これは、従来的な「行き止まり型」ろ過において通常直面するものとは反対であることに注意することが重要である。
ろ過されるべき物質に応じて、ＴＦＦは通常、微量ろ過または限外ろ過のいずれかに使用される。微量ろ過は、典型的には、フィルターがすべて含んで０．０５μｍ～１．０μｍの孔径を有する場合として定義され、一方で、限外ろ過は、典型的には、０．０５μｍ未満の孔サイズを有するフィルターを伴う。孔サイズはまた、特定のフィルターについて分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）とも呼ばれる公称分画分子量（ＮＭＷＬ）を決定し、微量ろ過膜は、典型的に、１，０００キロダルトン（ｋＤａ）を超えるＮＭＷＬを有し、限外ろ過フィルターは、１ｋＤａ～１，０００ｋＤａのＮＭＷＬを有する。
接線流ろ過の主な利点は、従来的な「全量」ろ過の間にフィルターに凝集してフィルターを塞ぎ、代わりにフィルターの表面に沿って運ばれる非透過性粒子（ときに、「ろ過ケーク」と呼ばれる）である。この利点により、フィルターは一般に除去および掃除される必要がないため、中断時間が顕著に低減されるので、連続的な操作を必要とする工業プロセスにおいて接線流ろ過を広く使用できるようになる。
接線流ろ過は、特に濃縮及び透析ろ過を含むいくつかの目的に使用することができる。濃縮は、溶媒が溶液から除去される一方で溶質分子が保持される、プロセスである。試料を効果的に濃縮するために、保持されるべき溶質分子の分子量よりも実質的に小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有する膜が使用される。一般に、当業者は、標的分子の分子量よりも３～６倍小さいＮＭＷＬまたはＭＷＣＯを有するフィルターを選択し得る。
透析ろ過は分画プロセスであり、それによって小さな望ましくない粒子がフィルターを通り抜け、一方で、より大きな所望のナノ粒子は、溶液中のそれらのナノ粒子の濃度を変化させることなく、保持物内に維持される。透析濾過は、溶液から塩または反応緩衝液を除去するためにしばしば使用される。透析濾過は、連続または不連続のいずれかであり得る。連続透析濾過では、透析濾過溶液は、濾液が生成されるのと同じ速度で試料供給に添加される。不連続透析ろ過では、溶液は、まず希釈され、次いで開始濃度まで濃縮される。不連続透析ろ過は、所望のナノ粒子濃度に達するまで繰り返されてもよい。
精製および／または濃縮された脂質ナノ粒子は、例えば、ＰＢＳなどの望ましい緩衝液中で製剤化されうる。
ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子
本発明に従うプロセスは、より高い効力および有効性をもたらし、より低い用量で治療指数を正の方向にシフトさせる。いくつかの実施形態では、本発明による方法は、従来の技術の方法と比較して、均質かつ小さな粒子サイズ（例えば、１５０ｎｍ未満）、ならびに有意に改善された封入効率および／またはｍＲＮＡ回収率をもたらす。
脂質ナノ粒子集団の寸法決定に関し、当分野において様々な公知の方法が利用可能である。こうした寸法決定方法の一つは、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されており、この文献は参照によって本明細書に組み込まれる。バス超音波処理またはプローブ超音波処理のいずれかによるリポソーム懸濁液の超音波処理によって、直径が約０．０５マイクロメートル未満の小さいＵＬＶまでサイズ漸減する。ホモジナイゼーションは別の方法であり、大きいリポソームをより小さいものに断片化するのに剪断エネルギーを利用する。典型的なホモジナイゼーション手順において、ＭＬＶは、選択されたリポソームの大きさ、典型的には約０．１～０．５マイクロメートルの大きさが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジナイザーを用いて再循環される。リポソームの大きさは、Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０：４２１－４５０（１９８１）（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載された準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって算出され得る。平均リポソーム直径を、形成されたリポソームを超音波処理することによって低減させることができる。断続的な超音波処理サイクルをＱＥＬＳ評価と交互に行って、効率的なリポソーム合成を導くことができる。
いくつかの実施形態では、組成物中の精製されたナノ粒子の大部分、すなわち、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、約１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべては、約１５０ｎｍ（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、または約８０ｎｍ）のサイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１２０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、９０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、８０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、７０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、６０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、３０ｎｍ未満の平均サイズを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、２０ｎｍ未満の平均サイズを有する。
さらに、細い粒径範囲を有するより均質なナノ粒子が、本発明の方法によって達成される。例えば、本発明により提供される組成物中の精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より多くが、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９５ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。いくつかの実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的にすべてが、約７５～１５０ｎｍ（例えば、約７５～１４５ｎｍ、約７５～１４０ｎｍ、約７５～１３５ｎｍ、約７５～１３０ｎｍ、約７５～１２５ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、約７５～１１５ｎｍ、約７５～１１０ｎｍ、約７５～１０５ｎｍ、約７５～１００ｎｍ、約７５～９５ｎｍ、約７５～９０ｎｍ、または７５～８５ｎｍ）の範囲のサイズを有する。
一部の実施形態では、本発明により提供されるｍＲＮＡを封入するナノ粒子の分子サイズにおける分散度または不均一性の測定値（ＰＤＩ）は、約０．５未満である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．４未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．３未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２８未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２５未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約０．２３未満（例えば、約０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１０、０．０９、または０．０８未満）のＰＤＩを有する。特定の実施形態では、ＰＤＩは約０．１６未満である。
いくつかの実施形態では、本発明により提供される組成物中の精製された脂質ナノ粒子の約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より多くが、各々個別粒子内にｍＲＮＡを封入する。いくつかの実施形態では、組成物中の精製された脂質ナノ粒子の実質的にすべてが、各々個々の粒子内にｍＲＮＡを封入する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、５０％～９９％の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約６０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約６５％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約７０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約７５％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約８０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約８５％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９０％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９２％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９５％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９８％超の封入効率を有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、約９９％超の封入効率を有する。典型的には、本発明での使用を目的とした脂質ナノ粒子は、少なくとも９０％～９５％の封入効率を有する。
いくつかの実施形態では、本発明に従う組成物は、用量を対象に投与するために製剤化される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ脂質ナノ粒子の組成物は、１．０ｍｇ／ｋｇ ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子（例えば、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．０１６ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、および０．０１６ｍｇ／ｋｇ）未満の用量濃度で製剤化される。いくつかの実施形態では、用量は、より低い用量が高い効力および有効性を生じるという予想外の知見に起因し、減少される。いくつかの実施形態では、用量は、約７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％または４０％減少される。
いくつかの実施形態では、ステップアップリミックスプロセスおよび／またはステップダウンリミックスプロセスにより産生されたｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の効力は、プロセスＢと比較して、ステップアップリミックスプロセスおよび／またはステップダウンリミックスプロセスによって調製されたとき、１００％より高い（すなわち、２００％より高い、３００％より高い、４００％より高い、５００％より高い、６００％より高い、７００％より高い、８００％より高い、または９００％より高い）効力から、１０００％より高い効力までである。
組成物の治療用途
本発明は、例えばヒト対象、またはヒト対象の細胞、または治療され、ヒト対象に送達される細胞などの対象の治療における使用を目的とした、本発明の組成物の送達も提供するものである。
本発明の組成物の製剤化および薬物投与の技法は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（最新版）で見つけることができる。
提供されるｍＲＮＡ担持ナノ粒子、およびそれを含有する組成物は、対象の臨床状態、投与の部位および投与方法、投与スケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当該技術分野の臨床医に関連する他の要因を考慮して、現在の医療行為に従い投与および投薬され得る。本明細書における目的に適う「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床、および医療分野の当業者に既知のこうした関連する考慮すべき事項により決定され得る。いくつかの実施形態では、投与される量は、症状や、当業者によって疾患の進行、退行、または改善の適切な基準として選択される他の指標を、少なくともいくらか安定化、改善、または排除するのに有効である。例えば、好適な量および投薬レジメンは、少なくとも一過性タンパク質（例えば、酵素）の産生をもたらすものである。
送達方法
本発明は、インビボでタンパク質を産生するためのｍＲＮＡの送達方法を提供し、方法は、送達を必要とする対象にｍＲＮＡを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、経眼送達、気管内注射肺送達（例えば、噴霧）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される。
好適な投与経路には、例えば、経口投与、直腸投与、膣投与、経粘膜投与、気管内投与もしくは吸入投与を含む肺投与、または腸投与、皮内注射、経皮（局所）注射、筋肉内注射、皮下注射、髄内注射を含む非経口送達、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、もしくは鼻腔内が含まれる。いくつかの実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋、および心筋からなる群から選択される筋肉に行われる。いくつかの実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。いくつかの実施形態では、投与の結果、ｍＲＮＡが肝細胞（すなわち肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与の結果、ｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
投与経路の選択は、標的細胞または標的組織に依存する。ｍＲＮＡにコードされたタンパク質またはペプチドの全身送達は、例えばｍＲＮＡの静脈内投与、筋肉内投与または肺投与を介して、典型的には脂質ナノ粒子（例えば、リポソーム）中に封入されて実現されてもよい。静脈内送達を使用して、効率的に肝細胞を標的とすることができる。筋肉内投与は典型的には、免疫原性のタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡ（例えば、ワクチンとしての使用を目的としている）を送達するための選択方法である。肺送達は、肺上皮を標的とするために普遍的に使用されている。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ装填脂質ナノ粒子は、典型的には適切な噴霧化装置（例えば、メッシュネブライザー）を含む噴霧化を介した肺送達により投与される。肺送達および噴霧の追加的な教示は、公開された米国特許出願第２０１８／０１２５９８９号および公開された米国特許出願第２０１８／０３３３４５７号に記載されており、その各々は、参照によりその全体が組み込まれる。
あるいはまたは加えて、本発明のｍＲＮＡ担持ナノ粒子および組成物は、全身的にではなく局所的に、例えば、好ましくは徐放性製剤中で、医薬組成物を標的組織内へ直接注射することによって投与され得る。局所送達は、標的とされる組織に応じて様々な方式で達成され得る。例えば、本発明の組成物を含むエアロゾルが吸引され得（鼻送達、気管送達、または気管支送達の場合）、本発明の組成物が、例えば、損傷、疾患兆候、または疼痛の部位に注射され得、組成物が、経口、気管、または食道用のトローチ剤で提供され得るか、胃もしくは腸への投与用に液体、錠剤、もしくはカプセル形態で供給され得るか、直腸もしくは膣用に坐剤形態で供給され得るか、またはクリーム、液滴、もしくはさらには注射を使用することにより眼にも送達され得る。治療用の分子またはリガンドと複合体を形成した提供される組成物を含む製剤は、例えば、組成物を移植部位から周囲細胞に拡散させることができるポリマーまたは他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することもできる。あるいは、これらは、ポリマーまたは支持体を使用することなく外科的に適用され得る。
投薬レジメン
本発明の提供される方法は、本明細書に記載される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態の性質、重症度、および程度によって規則的な間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、本発明の治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の治療有効量を、規則的な間隔で（例えば、年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月（２か月に１回）、毎月（毎月１回）、隔週（２週間に１回）、月２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、週２回、毎日、または連続して）、周期的に髄腔内に投与することができる。
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療薬の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、疾患または障害を治療、調節、治癒、防止、および／または寛解する）のに十分な量である。例えば、治療有効量は、所望の治療的および／または予防的効果を達成するのに十分な量であり得る。通常、治療剤を必要とする対象に投与される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の量は、対象の特徴によって決まることになる。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
いくつかの実施形態では、治療有効投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～４００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～３００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～２００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～１００ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～９０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～８０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～７０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～６０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～５０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～４０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～２０ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～１５ｍｇ／ｋｇ（体重）、約０．００５ｍｇ／ｋｇ（体重）～１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。
いくつかの実施形態では、治療有効投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５．０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約６０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約７０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約８０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約９０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約１５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約２５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約３５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４００ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約４５０ｍｇ／ｋｇ（体重）超、約５００ｍｇ／ｋｇ（体重）超である。特定の実施形態では、治療有効投与量は１．０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇの治療有効投与量は筋肉内または静脈内に投与される。
様々な実施形態によると、送達されるｍＲＮＡの発現の時期を、特定の医学的要求に合うように調整することができる。いくつかの実施形態では、送達されるｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソームおよび／または組成物の投与の１時間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間および／または９６時間後に検出可能である。いくつかの実施形態では、送達されるｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現は、投与の１週間、２週間、および／または１か月後に検出可能である。
本発明の組成物の相対的な効力および有効性
いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、本明細書に記載される「ステップアップリミックス」プロセスおよび／または「ステップダウンリミックス」プロセスを使用して製剤化された同等の組成物と比較して、対象からの生体サンプルにおけるｍＲＮＡの発現レベルの上昇がもたらされる。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、尿、および組織試料（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、提供される組成物を投与することにより、本明細書に記載される「ステップアップリミックス」プロセスおよび／または「ステップダウンリミックス」プロセスを使用して製剤化された同等の組成物と比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％まで、ｍＲＮＡの発現レベルの上昇がもたらされる。
本発明での使用を目的とした特定のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肺または肺細胞への送達、またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を含む、治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー３タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸中間鎖１タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ダイニン軸糸重鎖５（ＤＮＡＨ５）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－１－アンチトリプシンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フォークヘッドボックスＰ３（ＦＯＸＰ３）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、一つ以上のサーファクタントタンパク質、例えば、サーファクタントＡタンパク質、サーファクタントＢタンパク質、サーファクタントＣタンパク質、およびサーファクタントＤタンパク質のうちの一つ以上をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の肝臓または肝臓細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。かかるペプチドおよびポリペプチドは、尿素サイクル障害に関連するもの、リソソーム貯蔵障害に関連するもの、グリコーゲン貯蔵障害に関連するもの、アミノ酸代謝障害に関連するもの、脂質代謝もしくは線維性障害に関連するもの、メチルマロン酸血症に関連するもの、または濃縮されたｍＲＮＡ分子の肝臓または肝臓細胞への送達またはそれでの治療が治療的利益を提供する任意の他の代謝性障害に関連するものを含み得る。
ある特定の実施形態では、本発明は、尿素サイクル障害に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸シンテターゼ１タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、カルバモイルリン酸シンテターゼＩタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギニノコハク酸リアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルギナーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、リソソーム貯蔵障害に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アルファ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコセレブロシダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロン酸－２－スルファターゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、イズロニダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｎ－アセチル－アルファ－Ｄ－グルコサミニダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヘパランＮ－スルファターゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ガラクトサミン－６スルファターゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－ガラクトシダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、リソソームリパーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、アリールスルファターゼＢ（Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写因子ＥＢ（ＴＦＥＢ）をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン貯蔵障害に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、酸アルファ－グルコシダーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋ホスホグリセリン酸ムターゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グリコーゲン脱分岐酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸代謝に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、グルタリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、オキサラーゼ（ｏｘａｌａｓｅ）アラニン－グリオキシルアミノトランスフェラーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、脂質代謝または線維性障害に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ｍＴＯＲ阻害剤をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰａｓｅリン脂質輸送８Ｂ１（ＡＴＰ８Ｂ１）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、一つ以上のＮＦ－カッパＢ阻害剤、例えば、Ｉ－カッパＢアルファ、インターフェロン関連発生制御因子１（ＩＦＲＤ１）、およびサーチュイン１（ＳＩＲＴ１）のうちの一つ以上をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＰＰＡＲ－ガンマタンパク質または活性バリアントをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロン酸血症に関連するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡムターゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メチルマロニルＣｏＡエピメラーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、肝臓への送達またはその治療が治療的利益を提供することができる全長ｍＲＮＡを有する治療用組成物を産生するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ７Ｂタンパク質、別名、ウィルソン病タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子などの一つまたは複数の凝固酵素をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトヘモクロマトーシス（ＨＦＥ）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心臓血管構造または心臓血管細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、血管内皮成長因子Ａタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レラキシンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－９タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、骨形成タンパク質－２受容体タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の筋肉または筋肉細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象の心筋または心筋細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるカリウムチャネルおよびナトリウムチャネルの一方または両方を調節するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＫｖ７．１チャネルを調節するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、筋肉組織または筋肉細胞におけるＮａｖ１．５チャネルを調節するタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の神経系または神経系細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン１タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、生存運動ニューロン２タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、フラタキシンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー１（ＡＢＣＤ１）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＬＮ３タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の血液もしくは骨髄または血液もしくは骨髄細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ベータ－グロビンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、一つまたは複数の凝固酵素、例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、および第Ｘ因子をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の腎臓または腎臓細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＶ型コラーゲンアルファ５鎖（ＣＯＬ４Ａ５）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象の眼または眼細胞への送達またはその治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＡメンバー４（ＡＢＣＡ４）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、レチノスキシンタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａ（ＲＰＥ６５）タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、２９０ｋＤａ中心体タンパク質（ＣＥＰ２９０）をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象または対象の細胞用のワクチンの送達またはそれでの治療に使用するためのペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明は、ウイルスなどの感染病原体由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、狂犬病ウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、サイトメガロウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ロタウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパピローマウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、単純ヘルペスウイルス１型または単純ヘルペスウイルス２型などの単純ヘルペスウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス１型またはヒト免疫不全ウイルス２型などのヒト免疫不全ウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトメタニューモウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ヒトパラインフルエンザウイルス１型、ヒトパラインフルエンザウイルス２型、またはヒトパラインフルエンザウイルス３型などのヒトパラインフルエンザウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、マラリアウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ジカウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、チクングンヤウイルス由来の抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、対象のがんに関連する抗原または対象のがん細胞から特定された抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、対象自身のがん細胞から決定された抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。すなわち、個別化がんワクチンを提供するための方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、変異ＫＲＡＳ遺伝子から発現した抗原をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、二重特異性抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗体は、融合タンパク質の一部であり得る。ある特定の実施形態では、本発明は、ＯＸ４０に対する抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦに対する抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、組織壊死因子アルファに対する抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、ＣＤ１９に対する抗体をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、免疫調節因子をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン１２をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン２３をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、インターロイキン３６ガンマをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、一つ以上のインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）タンパク質の構成的に活性なバリアントをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本発明は、エンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、Ｃａｓ ９タンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、メガヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、亜鉛フィンガーヌクレアーゼタンパク質をコードするｍＲＮＡ分子を有する治療用組成物の作製方法を提供する。
一部の実施形態では、治療用のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを対象に送達するための本発明の組成物および方法が提供され、この場合において当該対象は、当該対象において当該ｍＲＮＡによりコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質における欠損が原因の疾患または障害に罹患している。当該欠損は、当該ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質が発現しないこと、非機能性のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質が発現すること、機能不全のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質であること、または機能が低下したペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質であること、または当該ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に対する他の機能的障害が原因であってもよい。この性質を有する疾患または障害は一般的に、「タンパク質欠損症」と呼称される。典型的には、これらの疾患または障害は、対象において当該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の一つ以上の変異によりもたらされる。ｍＲＮＡによりコードされる交換ペプチド、交換ポリペプチドまたは交換タンパク質は、タンパク質欠損症の根本原因である当該一つ以上の変異を含まない。タンパク質欠損症が原因である疾患または障害としては、嚢胞性線維症、リソソーム蓄積症、代謝障害（例えば尿素サイクル異常症）などが挙げられる。
他の実施形態では、治療用のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡの送達用の本発明の組成物および方法が提供される。そうした治療用のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質としては、抗体、免疫原、サイトカイン、アレルゲンなどが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、治療用タンパク質（例えば、細胞質、膜貫通型、または分泌型）をコードするｍＲＮＡの送達を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、上記に列記される疾患または障害、またはそれらに列記されるタンパク質に関連する疾患または障害に罹患している対象を予防、治療、および／または治癒するために使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、第ＩＸ因子、生存運動ニューロン１（ＳＭＮ１）、またはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）のうちの一つ以上をコードする。一部の実施形態では、本発明は、嚢胞性線維症、シトルリン血症、血友病Ｂ、脊髄性筋萎縮症、およびフェニルケトン尿症のうちのいずれか一つに罹患する対象の予防、治療および／または回復に使用される。
本発明のある特定の化合物、組成物、および方法について、ある特定の実施形態に従って具体的に説明してきたが、以下の実施例は、本発明を単に説明するという役割を果たすものであり、それを制限することを意図するものではない。
実施例１．予め形成された脂質ナノ粒子を用いた脂質ナノ粒子の製剤プロセス
カチオン性脂質、非カチオン性脂質（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）をエタノール中に溶解し、ポンプシステムを使用してクエン酸緩衝液と混合した。二つの流れを即時混合することにより、空の４成分脂質ナノ粒子が自己アセンブリプロセスを介して形成された。次いで、製剤にＴＦＦ精製プロセスを行い、クエン酸緩衝液およびアルコールを除去して、保管緩衝液（１０％トレハロース）と交換した。その結果得られた予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液を、以下に記載される三つのプロセスのうちの一つに従いｍＲＮＡと混合した。
第一の実験では、予め形成された空の脂質ナノ粒子の懸濁液を６５℃に加熱し、タンパク質オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）をコードするｍＲＮＡの室温の溶液と混合した。ｍＲＮＡ１モル当たり、４倍モル過剰なカチオン性脂質であることで、高い割合の封入ｍＲＮＡが得られるため、有益であることが過去に観察された。この比率は、封入されるｍＲＮＡ分子中の負に荷電されたリン酸（Ｐ）に対する、正に荷電された窒素（Ｎ）の実際の数とは無関係に適切であることが分かっているが、それでも４の「Ｎ／Ｐ比」と口語的に呼称される。この「リミックス」プロセスによって、図１Ａに概略的に示されるように、ＯＴＣ ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の懸濁液が得られた。製剤プロセス時間と比較したＮ／Ｐ比を図１Ｂに示す。加熱された脂質ナノ粒子と、室温のｍＲＮＡ溶液を、図１Ｃに示されるポンプシステムを使用して混合した。
望ましいＮ／Ｐ比を実現するために、予め形成された空の脂質ナノ粒子の全てと、ｍＲＮＡの全てを一つの工程で混合する代わりに、望ましい比率が達成されるまで、Ｎ／Ｐ比を段階的な様式で増加（ステップアップ）または減少（ステップダウン）させて、ｍＲＮＡまたは予め形成された空の脂質ナノ粒子を混合させることもできる。したがって、第二の実験では、ｍＲＮＡの第一の体積を、（上記のリミックス実験で使用された）予め形成された空の脂質ナノ粒子に加えて、Ｎ／Ｐ比が１６（すなわち、予め形成された空の脂質ナノ粒子が過剰）の中間懸濁液が得られた。次いで、追加の体積を加えて、１２のＮ／Ｐ比を有する新たな中間懸濁液を得た。これらの工程を、最終的なＮ／Ｐ比の４が達成されるまで、さらに２回繰り返した。この「ステップダウンリミックス」プロセスによって、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の懸濁液が得られた。当該プロセスを、図２Ａに概略的に示す。このプロセスに関し、製剤プロセス時間と比較したＮ／Ｐ比を図２Ｂに示す。
第三の実験では、予め形成された空の脂質ナノ粒子（上記のリミックスおよびステップダウン実験で使用された）の第一の体積を、ｍＲＮＡの溶液に添加し、Ｎ／Ｐ比が１の中間体懸濁液を得た。次いで、予め形成された空の脂質ナノ粒子の追加体積を、ｍＲＮＡの溶液に加えて、Ｎ／Ｐ比が２の中間体懸濁液を得た。これらの工程を、最終的なＮ／Ｐ比の４が達成されるまで、さらに２回繰り返した。この「ステップアップリミックス」プロセスによって、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の懸濁液が得られた。当該プロセスを、図２Ｃに概略的に示す。このプロセスに関し、製剤プロセス時間と比較したＮ／Ｐ比を図２Ｄに示す。
従来的な「リミックス」プロセスでは、予め形成された空の脂質ナノ粒子を６５℃に加熱してから混合を行い、ｍＲＮＡの室温溶液と組み合わせることが有益であることが判明していた。混合中、組み合わせた懸濁液は６５℃に加熱される。典型的には、混合は少なくとも１５分間実行されて、最大量のｍＲＮＡが脂質ナノ粒子中に封入されるようにする。混合中の加熱は、封入効率を劇的に高めることが示された。
したがって「ステップダウンリミックス」プロセスおよび「ステップアップリミックス」プロセスの両方について、予め形成された空の脂質ナノ粒子を含有する懸濁液を６５℃に加熱した後に混合を行った。ｍＲＮＡ（ステップダウンリミックス）または空の脂質ナノ粒子（ステップアップリミックス）の各バッチを加えた後、組み合わせた懸濁液は、混合中に６５℃に加熱された。ｍＲＮＡの完全性を確保するために、ｍＲＮＡ溶液への熱曝露は最小限に抑えることが望ましい。各バッチを添加した後、４分間の混合および加熱で、従来的な「リミックス」プロセスで調製された製剤と比較して改善された特性を有するｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子製剤を得るには充分であることが判明した。特に「ステップダウンリミックス」に関しては、従来的な「リミックス」プロセスとほぼ同じ長さの時間、４分の１のｍＲＮＡのみを熱暴露することで、熱暴露の結果としての分解を最小限に抑えることができる点が有益であると考えられる。この利点は、ｍＲＮＡがいくつかの体積に分けられて脂質ナノ粒子に加えられ、その後に一定期間混合される（したがって、図３Ａに示されるように段階的にＮ／Ｐ比を調整する）、または望ましいＮ／Ｐ比が達成されるまで、ある期間にわたって混合する間に継続的に脂質ナノ粒子に添加される（図３Ｃに図示される）、のいずれかで実現される。
実施例２．野生型ＣＤ１マウスにおけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡからのインビボタンパク質発現
本実施例は、予め形成された脂質ナノ粒子とｍＲＮＡを混合する間、Ｎ／Ｐ比を段階的にどのように変化させると、封入ｍＲＮＡからのタンパク質発現の誘導においてより強力な脂質ナノ粒子を得ることができるかを示す。
二つの例示的な４成分脂質ナノ粒子の静脈内（ＩＶ）投与が行われた。ナノ粒子は両方とも、非カチオン性脂質（ＤＯＰＥ）、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、ならびにｈＯＴＣ ｍＲＮＡを含む。第一の製剤はｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２のカチオン性脂質を含有し、一方で第二の製剤はｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０のカチオン性脂質を含有した。両製剤を用いた実験を行い、ｍＲＮＡの送達、および得られたｈＯＴＣタンパク質発現を試験した。６～８週齢のオスのＣＤ１マウスに、以下の６種の製剤のうち一つを単回ボーラスで尾静脈注射した：ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０またはｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２のナノ粒子のいずれか。各々、リミックスプロセス、ステップダウンプロセス、またはステップアッププロセスのいずれか一つで形成された（すなわち、合計で６種の製剤）。これらは、１．０ｍｇ／ｋｇのｈＯＴＣ ｍＲＮＡの用量で実施例１に記載されるように調製された。マウスを安楽死させ、投与後２４時間、生理食塩水でかん流した。肝臓組織を採取し、ｈＯＴＣタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより肝臓ホモジネートで測定された。
図４に示されるように、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０に関して試験された三種すべての脂質ナノ粒子製剤（図４Ａ）、およびｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２に関して試験された三種すべての脂質ナノ粒子製剤（図４Ｂ）が、インビボでの肝臓へのｍＲＮＡの送達において有効であり、送達されたｍＲＮＡにコードされたＯＴＣタンパク質を発現させた。しかし驚くべきことに、「ステップアップリミックス」プロセス、および「ステップダウンリミックス」プロセスは、タンパク質の発現において、「リミックス」プロセスにより調製された製剤よりも約６倍強力な製剤をもたらした。各図において、破線は、治療有効性のおよその最小発現レベル（総タンパク質ｍｇ当たり約４５０ｎｇのｈＯＴＣ）を表す。
両製剤は、ステップアップリミックスまたはステップダウンリミックスによって製剤化されたとき、発現の改善を呈しながら、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２（１２炭素アルキル鎖を有するカチオン性脂質）は、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０（１０炭素アルキル鎖を有するカチオン性脂質）と比較して、発現の改善を示した。任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、ステップアップリミックスプロセス、およびステップダウンリミックスプロセスは、より長いアルキル鎖を有するカチオン性脂質を用いて脂質製剤が調製されたときに、より効率的に封入ｍＲＮＡの効力を増加させる（インビボタンパク質発現により評価）と考えている。
実施例３．最適化された脂質ナノ粒子製剤を用いた静脈内送達後のｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ発現の改善
本実施例は、予め形成された脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを装填する間に、Ｎ／Ｐ比を段階的に変化させることで、たとえ脂質組成物が既にタンパク質発現を最大化するように最適化されていたとしても、さらに脂質ナノ粒子製剤の効力を増強し得ることを示す。
カチオン性脂質は、４成分脂質ナノ粒子製剤のインビボでの効力を決定する上で決定的な役割を果たす。したがって、この脂質成分を最適化することで、得られる脂質ナノ粒子の効力を劇的に増加させることができる。さらに、４成分脂質ナノ粒子の効力は、非カチオン性脂質成分のＤＯＰＥをＤＥＰＥに置き換えることによってさらに強化され得ることが実証されている（２０１９年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８７１，５１３号を参照のこと。当該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
第一の４成分脂質ナノ粒子は、最適化されたカチオン性脂質のｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＯＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋを用いて調製された。第二の４成分脂質ナノ粒子は、ｃｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ（すなわち、非カチオン性脂質成分としてＤＯＰＥがＤＥＰＥで置き換えられた点を除き、第二の製剤と同一である）で調製された。
第一および第二の脂質ナノ粒子を、実施例１に記載されるように、「リミックス」プロセス、「ステップダウンリミックス」プロセス、または「ステップアップリミックス」プロセスのいずれかを使用して調製し、６種の脂質ナノ粒子製剤を得た。これらの脂質ナノ粒子製剤を、実施例２に記載されるようにオスＣＤ－１マウスに投与した。以下の表に概要を示す。
Figure 2023514450000097
図５に示されるように、試験された６種すべての脂質ナノ粒子製剤は、インビボでの肝臓へのｍＲＮＡ送達において有効であり、送達されたｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質が発現された。実施例２で観察されたように、ステップアップリミックスおよびステップダウンリミックスにより得られた製剤は、「リミックス」によって調製されたものよりも何倍も強力であった。驚くべきことに、カチオン性脂質のｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２と、ＤＯＰＥの代わりに非カチオン性脂質ＤＥＰＥを含む、高度に最適化された脂質ナノ粒子製剤であっても、効力の増加が依然として観察された。このように高度に最適化された製剤では、効力の増加はあまり顕著ではなかったが、それでも「ステップダウンリミックス」プロセスまたは「ステップアップリミックス」プロセスを、「リミックス」プロセスの代わりに使用した場合、ＯＴＣ発現はほぼ２倍になった。統計的有意差は得られなかったが、おそらくｍＲＮＡへの熱曝露が減少した結果として、ｍＲＮＡの完全性が増加したために、「ステップダウンリミックス」製剤のほうが、「ステップアップリミックス」製剤よりも優れていた傾向があった。したがって、「ステップダウンリミックス」プロセスを、次の実験に選択した。
実施例４．異なる工程数を使用して調製された脂質ナノ粒子製剤を用いた静脈内送達後のｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ発現の改善
本実施例は、予め形成された脂質ナノ粒子内にｍＲＮＡを封入する間、より小さな段階的変化で徐々にＮ／Ｐ比を調整することで、Ｎ／Ｐ比を大きく段階的変化させたプロセスにより調製された脂質ナノ粒子製剤よりも、封入ｍＲＮＡからのタンパク質発現の誘導において、さらに強力な脂質ナノ粒子が得られることを示す。
カチオン性脂質のｃＫＫ－Ｅ１２（ＴＢＬ－０３４６またはＭＬ－（ＤＯＰＥ）としても知られる）、コレステロール、およびＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、ならびにｈＯＴＣ ｍＲＮＡを含む４成分脂質ナノ粒子を、表４に要約するように調製した。工程数の差を別として、当該調製方法は、実施例１に記載される「ステップアップリミックス」プロセス、および「ステップダウンリミックス」プロセスと同じであった。合計プロセス時間は、ｍＲＮＡが高温に曝露される期間を最小限に抑えるために１６分とした。６～８週齢のオスＣＤ１マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのｈＯＴＣ ｍＲＮＡ用量で、四種の製剤を単回ボーラス尾静脈注射した。マウスを安楽死させ、投与から２４時間、生理食塩水でかん流した。肝臓組織を採取し、ｈＯＴＣタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより肝臓ホモジネートで測定された。
Figure 2023514450000098
図６Ａに示されるように、試験された４種すべての脂質ナノ粒子製剤は、インビボでの肝臓へのｍＲＮＡ送達において有効であり、送達されたｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質が発現された。ステップアップリミックス製剤とステップダウンリミックス製剤の両方において、４回から８回への工程数の増加により、ＯＴＣの発現が改善された。
本実施例は、予め決められたＮ／Ｐ比を達成するために行われる工程数を増やすことで、得られる脂質ナノ粒子の効力がさらに改善されることを示した。このことから、予め形成された脂質ナノ粒子内へのｍＲＮＡの封入中に、より小さな段階的変化でＮ／Ｐ比を徐々に調整することが有益であり得ることが示される。
実施例５．異なる添加のタイミングを使用して調製された脂質ナノ粒子製剤を用いた静脈内送達後のｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ発現の改善
本実施例は、予め形成された脂質ナノ粒子内へのｍＲＮＡの封入中に、一定期間、Ｎ／Ｐ比を連続的に変化させることで、封入ｍＲＮＡからのタンパク質発現の誘導において、効果が高いｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子が得られることを示す。
カチオン性脂質のｃＫＫ－Ｅ１２（ＴＢＬ－０３４６またはＭＬ－２）としても知られる）、およびＰＥＧ修飾脂質（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）、ならびにｈＯＴＣ ｍＲＮＡを含む４成分脂質ナノ粒子を、表５に要約するように調製した。段階的な添加のタイミングを別として、当該調製方法は、実施例１に記載される「ステップアップリミックス」プロセス、および「ステップダウンリミックス」プロセスと同じであった。合計プロセス時間は、ｍＲＮＡが高温に曝露される期間を最小限に抑えるために１６分とした。６～８週齢のオスＣＤ１マウスに、０．５ｍｇ／ｋｇのｈＯＴＣ ｍＲＮＡ用量で、四種の製剤を単回ボーラス尾静脈注射した。マウスを安楽死させ、投与から２４時間、生理食塩水でかん流した。肝臓組織を採取し、ｈＯＴＣタンパク質の発現レベルは、ＥＬＩＳＡにより肝臓ホモジネートで測定された。
Figure 2023514450000099
図６Ｂに示されるように、試験された四種すべての脂質ナノ粒子製剤は、インビボでの肝臓へのｍＲＮＡ送達において有効であり、送達されたｍＲＮＡによりコードされるＯＴＣタンパク質が発現された。各工程の添加後の混合および加熱を省略することによって、ステップアップリミックス製剤およびステップダウンリミックス製剤の両方でＯＴＣ発現が改善された。製剤力価に対するこの有益な効果は、各製剤に対する封入効率とは無関係であった。
本実施例は、予め形成された脂質ナノ粒子内へのｍＲＮＡの封入中に、Ｎ／Ｐ比を連続的に段階的変化させることによって、封入ｍＲＮＡからのタンパク質発現の誘導において効果が高いｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子を得るための混合および加熱の介在期間を必要としないことを示す。むしろ、非常に強力なｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡを予め形成された脂質ナノ粒子に連続的に添加することによって調製することができる。これらの結果から、ｍＲＮＡの封入は急速に発生するが、封入プロセス中のＮ／Ｐ比を徐々に変化させることによって、最終的なｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の効力は劇的に改善され得ることを示唆している。
実施例６．２４時間後のＯＴＣ ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ活性
本実施例は、製剤化プロセスの最適化を行うことによって、ｍＲＮＡの用量レベルが低くても、タンパク質をコードするｍＲＮＡの送達を介した欠損タンパク質の提供において非常に効果的で強力な脂質ナノ粒子製剤が得られることを示す。
本実施例では、実施例１に記載されるように、「ステップダウンリミックス」プロセスによって調製された脂質ナノ粒子中に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡを、５匹のＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスに単回投与した。その脂質組成は、実施例３で試験された第二の４成分脂質ナノ粒子の脂質組成と同一であった（ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ＤＥＰＥ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）。生理食塩水で処置された野生型マウス、およびＯＴＣ ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、対照として使用された。投与から２４時間後、動物は、ＮＨ４Ｃｌでチャレンジされ、血漿ＮＨ３レベルは、図７Ａに示されるようにチャレンジから４０分後に測定された。実験の終了時に、マウスは処理され、マウスの肝臓組織を単離して、ＥＬＩＳＡを使用してＯＴＣタンパク質産生について分析した。
図７Ｂは、動物に投与されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡに関し、用量依存的な様式で、ＯＴＣ ｓｐｆ／ａｓｈマウスの肝臓において、検出可能なＯＴＣタンパク質の量が増加したことを示す。図７Ｃに示される結果から、発現したＯＴＣタンパク質が肝臓で活性であり、用量依存的に、血漿ＮＨ３レベルの低下に効果的であることが確認される。０．４ｍｇ／ｋｇの用量から開始したとき、処置されたマウスの血漿ＮＨ３レベルは、生理食塩水処置された野生型マウスで観察された血漿ＮＨ３レベルと区別できないものであった。
実施例７．投与から数週間後のＯＴＣ ｓｐｆ／ａｓｈマウスにおけるｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ活性
本実施例は、「ステップアップリミックス」プロセスまたは「ステップダウンリミックス」プロセスにより脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡが、少なくとも投与から１５日間、インビボでの活性を維持したことを示す。
本実施例では、実施例３に記載されるように調製された脂質ナノ粒子中に封入されたｈＯＴＣ ｍＲＮＡの０．３ｍｇ／ｋｇの単回用量を、８匹のＯＴＣｓｐｆ／ａｓｈマウスに投与した。生理食塩水で処置した野生型マウスおよびＯＴＣ ｓｐｆ／ａｓｈマウスは、対照とした。動物は、投与から１、２、３、および４週後にＮＨ４Ｃｌでチャレンジされ、血漿ＮＨ３レベルは、図８Ａに示されるように、チャレンジから４０分後に測定された。
図８Ｂに示されるように、投与から少なくとも１５日間、０．３ｍｇ／ｋｇの低用量であっても脂質ナノ粒子製剤は充分な量のｈＯＴＣ ｍＲＮＡをマウスの肝臓に送達させて、血漿ＮＨ３レベルを低下させるのに充分な量のＯＴＣタンパク質を産生させるのに有効であった。そのレベルは、生理食塩水で処置された野生型マウスと近い、または区別できないレベルであった。従来的な「リミックス」プロセスにより調製された脂質ナノ粒子中に封入されて送達された、３倍高い用量（１．０ｍｇ／ｋｇ）のｈＯＴＣ ｍＲＮＡの過去の研究結果でも同様の結果が得られていたことから、これらの結果は、過去の研究結果に比肩するものである（国際特許出願公開ＷＯ２０１８／０８９８０１の実施例１５を参照のこと）。
実施例８．空の脂質ナノ粒子の添加は、野生型マウスにおいて、ｈＯＴＣ ｍＲＮＡのインビボ活性をブーストする
本実施例は、空の脂質ナノ粒子を、従来的な「リミックス」プロセスで調製されたｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子に加えることでも、得られた製剤の効力をブーストすることができることを示す。
任意の特定の理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、ｍＲＮＡを予め形成された空の脂質ナノ粒子と混合して望ましいＮ／Ｐ比を実現するときに、Ｎ／Ｐ比を段階的に増加（ステップアップ）または減少（ステップダウン）することで、各ｍＲＮＡ分子と関連付けられるカチオン性脂質が少なくなると考えている。したがって、細胞取込み後のエンドソーム膜との融合に対して、より多くの非結合カチオン性脂質が利用可能となり、その結果、ｍＲＮＡ搭載物がより効率的に細胞質内に放出されるようになる。
したがって、エンドソーム区画内に「フリーの」カチオン性脂質が存在しているだけで、エンドソーム脱出の可能性を高めることができ、その「フリーの」カチオン性脂質が、ｍＲＮＡと関連付けられたカチオン性脂質を含有する同じ脂質ナノ粒子と関連付けられているかには関係なく、またはその「フリーの」カチオン性脂質が、ｍＲＮＡ担持脂質ナノ粒子と共にエンドソーム区画に入る「空の」脂質ナノ粒子によって提供されるかにも関係ない。
（追加の）空の脂質ナノ粒子をシンプルに添加することでも、より効率的なｍＲＮＡ送達をもたらすかを調査するために、ヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）をコードするｍＲＮＡを、実施例１に記載される従来的な「リミックス」プロセスを使用して、ＭＬ２－系４成分脂質ナノ粒子に封入した。封入後、装填された脂質ナノ粒子に、接線流ろ過を使用して精製および緩衝液交換を行った。精製され、緩衝された脂質ナノ粒子製剤を、図９に概略的に示されるように、１：１の比率で空の脂質ナノ粒子と混合した（ＭＬ２で「再ブレンド」）。空の脂質ナノ粒子を添加せず、従来的な「リミックス」プロセスで調製された脂質ナノ粒子は、対照とした（ＭＬ２リミックス）。
６～８週齢のオスのＣＤ１マウスに、１．０ｍｇ／ｋｇの用量のｈＥＰＯ ｍＲＮＡの脂質ナノ粒子を、または生理食塩水を単回ボーラス尾静脈注射した。生理食塩水で処置された動物は、無処置対照とした。ｈＥＰＯ発現は、ＥＬＩＳＡを使用して、投与から６時間後、および２４時間後に、被験動物の血清中で評価された。二種の脂質ナノ粒子製剤間で忍容性に何らかの差異があるかを評価するために、ＡＬＴおよびＡＳＴ（肝毒性に対するバイオマーカー）のレベルも決定された。
図１０Ａから分かるように、従来的な「リミックス」プロセスで調製された対照脂質ナノ粒子製剤（ＭＬ２リミックス）では、投与から６時間後および２４時間後の両方で、約２０μｇ／ｍＬのｈＥＰＯタンパク質の血清レベルを得た。同じ脂質ナノ粒子製剤を「空の」脂質ナノ粒子と混合した場合（「ＭＬ２で再ブレンド」）、６時間の時点で血清中に検出可能なｈＥＰＯタンパク質レベルは２倍より高かった。２４時間の時点では、より小さな増加が見られた。ＭＬ２リミックス対照製剤に対する、６時間と２４時間の平均ＥＰＯタンパク質発現は、破線で示されている。試験動物の肝臓におけるＡＬＴおよびＡＳＴの発現レベルに基づいて、忍容性を評価した。ＡＬＴおよびＡＳＴの発現レベルの増加は、肝毒性を指標である。図１０Ｂから分かるように、「再ブレンド」製剤で処置されたマウスは、「ＭＬ２リミックス」ベンチマークと同等のＡＬＴ／ＡＳＴ発現レベルを示した。「ＭＬ２リミックス」対照製剤の平均のＡＬＴ発現およびＡＳＴ発現のレベルは、破線で示されている。
インビボでの脂質ナノ粒子送達に使用される場合、カチオン性脂質が強力になると（またはカチオン性脂質が多量になると）、忍容性は低くなる、という一般的な傾向が観察されている。したがって、より強力なカチオン性脂質を使用することによって、またはより大量の脂質ナノ粒子製剤を投与することによって、タンパク質発現を改善しようとする試みは、典型的には忍容性と負に相関する。よって、ｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の製剤組成物に空の脂質ナノ粒子を添加すると、忍容性に変化なく、ｍＲＮＡからのタンパク質発現を増加させることができるという結果は驚くべきものである。
均等物
当業者は、日常的な実験作業を越えない手法を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態の多くの均等物を認識するか、又は確認できるものとなる。本発明の範囲は、上記の記載を限定することを意図しないが、むしろ以下の特許請求の範囲に記述されるとおりである。

Claims (163)

  1. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、前記ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含み、またはこれらからなり、前記方法が、
    （ａ）前記ｍＲＮＡを含む溶液の第一の体積を、前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液に加えて、前記ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む混合液を形成させる工程、
    （ｂ）前記ｍＲＮＡを含む溶液の一つ以上の追加体積を、望ましいモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡに到達するまで、前の工程で取得された前記混合液に加える工程、を含む、方法。
  2. 前記ｍＲＮＡを含む前記第一の体積の溶液の添加は、ｍＲＮＡに対して、少なくとも１０倍モル過剰なカチオン性脂質をもたらす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｍＲＮＡを含む前記第一の体積の溶液の添加は、ｍＲＮＡに対して、少なくとも１５倍モル過剰なカチオン性脂質をもたらす、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ｍＲＮＡを含む前記第一の体積の溶液の添加は、約１０～２０（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比をもたらす、請求項２に記載の方法。
  5. 前記ｍＲＮＡを含む前記第一の体積の溶液の添加は、約１６（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）のモル比をもたらす、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記第一の体積、および前記一つ以上の追加体積は、等しい体積である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記一つ以上の追加体積は、四つの体積以下、または八つの体積以下である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記一つ以上の追加体積は、一、二、三、四、五、六、七または八つの追加体積である、請求項７に記載の方法。
  9. 混合期間が、前記ｍＲＮＡを含む前記一つ以上の追加体積の溶液の各々を添加する前に発生する、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 各期間が、長さが等しい、請求項９に記載の方法。
  11. 各期間が５分を超えない、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 各期間が約３～５分である、請求項１１に記載の方法。
  13. 各期間が約４分である、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記一つ以上の追加体積の最後の体積の添加の後に、さらなる混合期間が続く、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記さらなる期間が、先行する期間の各々と長さが等しいか、または前記さらなる期間が、先行する期間の各々の長さを超える、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記さらなる期間は、先行する期間の各々よりも、少なくとも１．５～２倍長い、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記第一の体積、および前記一つ以上の追加体積は、連続して添加される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記連続的添加は、２０分を超えない期間で行われる、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記連続的添加は、一定の流量で発生する、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記連続的添加は、経時的に増加する、または減少する流量で発生する、請求項１７または１８に記載の方法。
  21. 前記ｍＲＮＡを含む溶液の前記連続的添加の期間の後に、混合期間が続く、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記連続的添加の期間、および連続的添加の後の前記混合期間は、２０分を超えない、請求項２１に記載の方法。
  23. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、前記ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含み、またはこれらからなり、前記方法が、
    （ａ）前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の第一の体積を、前記ｍＲＮＡを含む溶液に加えて、前記ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む混合液を形成させる工程、
    （ｂ）前記予め形成された空のＬＮＰを含む前記懸濁液の一つ以上の追加体積を、望ましいモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡに到達するまで、前の工程で取得された前記混合液に加える工程、を含む、方法。
  24. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記第一の体積の添加によって、およそ等しいモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡが得られる、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記一つ以上の追加体積の添加によって、ｍＲＮＡに対してカチオン性脂質がモル過剰となる、請求項２３に記載の方法。
  26. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記一つ以上の追加体積の添加によって、ｍＲＮＡに対してカチオン性脂質がおよそ２～４倍モル過剰となる、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記第一の体積、および前記一つ以上の追加体積は、等しい体積である、請求項２３～２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記一つ以上の追加体積は、四つの体積以下、または八つの体積以下である、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記一つ以上の追加体積は、一、二、三、四、五、六、七または八つの追加体積である、請求項２８に記載の方法。
  30. 混合期間が、前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記一つ以上の追加体積の各々を添加する前に発生する、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 各期間が、長さが等しい、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記期間が５分を超えない、請求項３０または３１に記載の方法。
  33. 前記期間が約３～５分である、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記期間が約４分である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記一つ以上の追加体積の最後の体積の添加の後に、さらなる混合期間が続く、請求項３０～３４のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記さらなる混合期間が、先行する期間の各々と長さが等しいか、または前記さらなる期間が、先行する期間の各々の長さを超える、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記さらなる期間は、先行する期間の各々よりも、少なくとも１．５～２倍長い、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記第一の体積、および前記一つ以上の追加体積は、連続して添加される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記連続的添加は、２０分を超えない期間で行われる、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記連続的添加は、一定の流量で発生する、請求項３８または３９に記載の方法。
  41. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記連続的添加は、経時的に増加する、または減少する流量で発生する、請求項３８または３９に記載の方法。
  42. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液の前記連続的添加の期間の後に、混合期間が続く、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記連続的添加の期間、および連続的添加の後の前記混合期間は、２０分を超えない、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液は、約６０℃～約７０℃であり、前記ｍＲＮＡを含む溶液は周囲温度である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記予め形成された空のＬＮＰを含む懸濁液が、約６５℃である、請求項４４に記載の方法。
  46. 混合することが、ＬＮＰとｍＲＮＡを組み合わせた混合液を約６０℃～約７０℃に加熱することを含む、請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 混合することが、ＬＮＰとｍＲＮＡを組み合わせた混合液を約６５℃に加熱することを含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 前記望ましいモル比が、約３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記望ましいモル比が、約４（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である、請求項４８に記載の方法。
  50. 前記空のＬＮＰは、脂質溶液を水溶液と混合することにより形成され、前記脂質溶液は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質のエタノール溶液を含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の方法。
  51. 前記水溶液が、クエン酸塩を含む、請求項５０に記載の方法。
  52. エタノールおよび／またはクエン酸塩が、接線流ろ過によって除去されて、前記空のＬＮＰを含む懸濁液を形成する、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記カチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２、ＯＦ－０２、Ｃ１２－２００、ＭＣ３、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎｋＣ２ＤＭＡ、ＩＣＥ（イミダゾール系）、ＨＧＴ５０００、ＨＧＴ５００１、ＨＧＴ４００３、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＤＭＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＬｅｎＤＭＡ、ＤＭＲＩＥ、ＣＬｉｎＤＭＡ、ＣｐＬｉｎＤＭＡ、ＤＭＯＢＡ、ＤＯｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ、ＤＬｉｎＣＤＡＰ、ＫＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ、３－（４－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ブチル）－６－（４－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ブチル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２３）、３－（５－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－６－（５－（（２－ヒドロキシドデシル）（２－ヒドロキシウンデシル）アミノ）ペンタン－２－イル）－１，４－ジオキサン－２，５－ジオン（ターゲット２４）、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１０、ｃＤＤ－ＴＥ－４－Ｅ１２、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記一つ以上のカチオン性脂質は、ターゲット２４を含む、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記一つ以上のカチオン性脂質は、ＩＣＥを含む、請求項５３に記載の方法。
  56. 前記一つ以上のカチオン性脂質は、ｃＫＫ－Ｅ１２を含む、請求項５３に記載の方法。
  57. 前記非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＰＰＣ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン）、ＤＥＰＥ（１，２－ジエルコイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＥ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＣ（１，２－ジオレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホチジルコリン）、ＤＰＰＥ（１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＭＰＥ（１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール））から選択される、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記カチオン性脂質が、ＤＥＰＥまたはＤＯＰＥである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、Ｃ６－Ｃ２０の長さのアルキル鎖を有する脂質に共有結合された、長さが最大５ｋＤａのポリ（エチレン）グリコール鎖を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. 前記ＰＥＧ修飾脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ）である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記予め形成された空のＬＮＰの約９０％超が、７５～１５０ｎｍの範囲のサイズを有する、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
  62. 前記ｍＲＮＡを封入するＬＮＰの約９０％超は、前記予め形成された空のＬＮＰの大きさよりも少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％）大きいサイズを有する、請求項６１に記載の方法。
  63. ｍＲＮＡ封入率が、約８０％超、例えば約９０％超である、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記予め形成された空のＬＮＰおよびｍＲＮＡが、ポンプシステムを使用して混合される、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記ポンプシステムは、パルスレスフローポンプ、例えばギアポンプまたは遠心ポンプを含む、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ｍＲＮＡが、一つ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記ｍＲＮＡは、非修飾である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  68. 請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法により作製された、ｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の組成物であって、前記ＬＮＰの平均サイズは、封入中にカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を変更することなく、予め形成された空のＬＮＰとｍＲＮＡを混合することによって調製されたＬＮＰよりも、５％～１０％大きい、組成物。
  69. 前記ナノ粒子が約７５ｎｍ～１５０ｎｍのサイズを有する、請求項６８に記載の組成物。
  70. 前記ナノ粒子が、約０．２５未満～０．１６未満のＰＤＩを含む、請求項６８または６９に記載の組成物。
  71. ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の欠損を患う対象を治療する方法であって、
    前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードするｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、
    前記ｍＲＮＡを封入するＬＮＰを含む組成物は、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法によって生成された、方法。
  72. 前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、脊髄運動ニューロン１（ＳＭＮ）、アルファ－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）、アルギニノコハク酸シンテターゼ（ＡＳＳ１）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、嚢胞性線維症膜貫通型コンダクタンス受容体（ＣＦＴＲ）から選択される、請求項７１に記載の方法。
  73. インビボでのタンパク質産生のために、ｍＲＮＡを送達する方法であって、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法により作製されたｍＲＮＡを封入する脂質ナノ粒子の組成物を、対象に投与することを含み、前記ｍＲＮＡは、対象タンパク質をコードする、方法。
  74. インビボでのタンパク質産生のために、ｍＲＮＡを送達する方法であって、請求項６８～７０のいずれか一項に記載の組成物を、対象に投与することを含む、方法。
  75. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物を作製する方法であって、
    （ａ）第一のカチオン性脂質、第一の非カチオン性脂質、第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含む、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の第一のセットと、ｍＲＮＡを、前記ｍＲＮＡの封入が可能となる条件下で混合すること、
    （ｂ）工程（ａ）で形成された前記ｍＲＮＡ封入ＬＮＰを、第二のカチオン性脂質、第二の非カチオン性脂質、第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含む、予め形成された空のＬＮＰの第二のセットと組み合わせて、前記ＬＮＰ組成物を得ること、を含む、方法。
  76. 前記予め形成された空のＬＮＰの第一のセット、および前記予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、同じ脂質組成を有する、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記予め形成された空のＬＮＰの第一のセット、および前記予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、異なる脂質組成を有する、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記第一のカチオン性脂質と前記第二のカチオン性脂質は、異なっている、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記第一の非カチオン性脂質と前記第二の非カチオン性脂質は、異なっている、請求項７７または７８に記載の方法。
  80. 前記第一のカチオン性脂質と前記第二のカチオン性脂質は同一であり、前記第一の非カチオン性脂質と前記第二の非カチオン性脂質は異なっている、請求項７７または７８に記載の方法。
  81. 前記第一の非カチオン性脂質はＤＯＰＥであり、前記第二の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであるか、または前記第一の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであり、前記第二の非カチオン性脂質はＤＯＰＥである、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記方法はさらに、（ｉ）前記第一のカチオン性脂質、前記第一の非カチオン性脂質、前記第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを最初に混合して、工程（ａ）の前に前記予め形成された空のＬＮＰの第一のセットを形成させる工程、および／または（ｉｉ）前記第二のカチオン性脂質、前記第二の非カチオン性脂質、前記第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを最初に混合して、工程（ｂ）の前に前記予め形成された空のＬＮＰの第二のセットを形成させる工程、を含む、請求項７５～８１のいずれか一項に記載の方法。
  83. 前記ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ、および前記予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３、または２：１～１：２の範囲の比率で組み合わされる、請求項７５～８２のいずれか一項に記載の方法。
  84. 前記ｍＲＮＡ封入ＬＮＰ、および前記予め形成された空のＬＮＰの第二のセットは、２０：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、または１：２０以上の比率で組み合わされる、請求項７５～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 前記第一のセット、および第二のセットの前記ｍＲＮＡ封入ＬＮＰならびに前記予め形成された空のＬＮＰは各々、直径約７５～１５０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、請求項７５～８４のいずれか一項に記載の方法。
  86. 前記第一のセット、および第二のセットの前記ｍＲＮＡ封入ＬＮＰならびに前記予め形成された空のＬＮＰは各々、直径１００ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項７５～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 前記組成物が、２０：１～１：１、１０：１～１：１、５：１～１：１、５：１～２：１、もしくは４：１～２：１の範囲の、または１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１２：１、１５：１、もしくは２０：１よりも大きい総脂質：総ｍＲＮＡの比率を有する、請求項７５～８６のいずれか一項に記載の方法。
  88. 前記ｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、請求項７５～８７のいずれか一項に記載の方法。
  89. 第一のカチオン性脂質、第一の非カチオン性脂質、第一のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含むｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の第一のセット、ならびに第二のカチオン性脂質、第二の非カチオン性脂質、第二のＰＥＧ修飾脂質、および任意でコレステロールを含む空のＬＮＰの第二のセット、を含む組成物であって、前記ＬＮＰの第一のセットおよび前記ＬＮＰの第二のセットは、２０：１～１：２０、１０：１～１：１０、５：１～１：５、３：１～１：３、または２：１～１：２の範囲の比率で存在する、組成物。
  90. 前記ＬＮＰの第一のセット、および前記ＬＮＰの第二のセットは、同じ脂質組成を有する、請求項８９に記載の組成物。
  91. 前記ＬＮＰの第一のセット、および前記ＬＮＰの第二のセットは、異なる脂質組成を有する、請求項８９に記載の組成物。
  92. 前記第一のカチオン性脂質と前記第二のカチオン性脂質は、異なっている、請求項９１に記載の組成物。
  93. 前記第一の非カチオン性脂質と前記第二の非カチオン性脂質は、異なっている、請求項９１または９２に記載の組成物。
  94. 前記第一のカチオン性脂質と前記第二のカチオン性脂質は同一であり、前記第一の非カチオン性脂質と前記第二の非カチオン性脂質は異なっている、請求項９１または９２に記載の組成物。
  95. 前記第一の非カチオン性脂質はＤＯＰＥであり、前記第二の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであるか、または前記第一の非カチオン性脂質はＤＥＰＥであり、前記第二の非カチオン性脂質はＤＯＰＥである、請求項９４に記載の組成物。
  96. 前記ＬＮＰの第一のセット、および前記ＬＮＰの第二のセットは各々、直径約７５～１５０ｎｍの範囲の平均サイズを有する、請求項８９～９５のいずれか一項に記載の組成物。
  97. 前記ＬＮＰの第一のセット、および前記ＬＮＰの第二のセットは各々、直径約１００ｎｍ未満の平均サイズを有する、請求項８９～９６のいずれか一項に記載の組成物。
  98. 前記ｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、請求項８９～９７のいずれか一項に記載の組成物。
  99. インビボでのタンパク質発現のためのｍＲＮＡを送達する方法であって、請求項８９～９８のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、方法。
  100. 対象においてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の欠損を治療する方法であって、請求項８９～９８のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、前記ｍＲＮＡは、前記対象において欠損している前記ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする、方法。
  101. 前記組成物を前記対象に投与した後に、前記ｍＲＮＡによってコードされる前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルは、同一のｍＲＮＡ封入ＬＮＰを含むが、前記第二の空のＬＮＰのセットを含まずに投与された同量のｍＲＮＡによってコードされる前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルと比較して増加し、肝酵素アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）および／またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の発現レベルは同等である、請求項９９または１００に記載の方法。
  102. 前記タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現レベルは、少なくとも２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、または５倍増加する、請求項９９または１００または１０１に記載の方法。
  103. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体とｍＲＮＡを含む第二の液体を混合することにより、封入する方法であって、前記ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質を含み、前記方法が、
    （ａ）第一の期間、流量ｎ１の前記第一の液体と、流量ｎ２の前記第二の液体の第一の部分とを混合して、第一のモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡを有する混合液を作製すること、
    （ｂ）第二の期間、ｎ１より大きい流量の前記混合液と、流量ｎ２の前記第二の液体の第二の部分とを混合して、得られた混合液のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を、前記第一のモル比よりも少なくとも２０％少なくすること、および
    （ｃ）前記得られた混合液の流量を増加させることにより、工程（ｂ）を反復して、各反復は、望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまでとすること、を含む、方法。
  104. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記望ましいモル比は、３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である、請求項１０３に記載の方法。
  105. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記望ましいモル比は、約４：１である、請求項１０４に記載の方法。
  106. 工程（ｂ）が、４回以下、例えば３回または２回、反復される、請求項１０３～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記第一のモル比が、３０：１～１０：１、例えば、約１６：１である、請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 工程（ｂ）が一度実施された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、２４：１～８：１、例えば、約１２：１である、請求項１０３～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 工程（ｂ）が一度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、２０：１～６：１、例えば、約８：１である、請求項１０３～１０８のいずれか一項に記載の方法。
  110. 工程（ｂ）が二度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、１６：１～４：１、例えば、約４：１である、請求項１０３～１０９のいずれか一項に記載の方法。
  111. 任意の工程における混合が、
    前記第一の液体を、混合接合部にポンプ注入すること、および
    前記第二の液体の一部を、前記混合接合部にポンプ注入すること、を含み、任意で前記混合接合部が、Ｔ型接合部である、請求項１０３～１１０のいずれか一項に記載の方法。
  112. 工程（ａ）における混合が、
    前記第一の液体と、前記第二の液体の第一の部分を、前記第一の期間の第一の部分の間、混合すること、および、
    中間容器中に、前記混合液を、前記第一の期間の第二の部分の間、保管すること、を含む、請求項１０３～１１１のいずれか一項に記載の方法。
  113. 工程（ｂ）における混合が、
    （ｉ）前記混合液と、前記第二の液体の第二の部分を、前記第二の期間の第一の部分の間、混合すること、および、
    （ｉｉ）中間容器中に、または前記中間容器中に、工程（ｂ）（ｉ）の結果得られた混合液を、前記第二の期間の第二の部分の間、保管すること、を含む、請求項１０３～１１２のいずれか一項に記載の方法。
  114. 前記方法がさらに、
    工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を、最終容器に保管することを含む、請求項１０３～１１３のいずれか一項に記載の方法。
  115. さらに、
    工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の生成物を加熱し、その後、前記生成物は、中間容器中に、もしくは前記中間容器中に保管されるか、またはさらに混合されること、を含み、任意で工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の前記生成物は、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度に加熱される、請求項１０３～１１４のいずれか一項に記載の方法。
  116. さらに、
    工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を冷却し、その後、それを前記最終容器中に保管すること、を含み、任意で工程（ｂ）または（ｃ）の前記生成物は、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度に冷却される、請求項１１４または１１５に記載の方法。
  117. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）内に、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体とｍＲＮＡを含む第二の液体を混合することにより、封入する方法であって、前記ＬＮＰの脂質成分は、カチオン性脂質を含み、前記方法が、
    （ａ）第一の期間、流量ｎ１の前記第一の液体の第一の部分と、流量ｎ２の前記第二の液体とを混合して、第一のモル比のカチオン性脂質とｍＲＮＡを有する混合液を作製すること、
    （ｂ）第二の期間、ｎ１より大きい流量の前記混合液と、流量ｎ２の前記第一の液体の第二の部分とを混合して、得られた混合液のカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比を、前記第一のモル比よりも少なくとも２０％大きくすること、および
    （ｃ）前記得られた混合液の流量を増加させることにより、工程（ｂ）を反復して、各反復は、望ましいカチオン性脂質とｍＲＮＡのモル比に到達するまでとすること、を含む、方法。
  118. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記望ましいモル比は、３～５（カチオン性脂質）：１（ｍＲＮＡ）である、請求項１１７に記載の方法。
  119. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記望ましいモル比は、約４：１である、請求項１１８に記載の方法。
  120. 工程（ｂ）が、４回以下、例えば３回または２回、反復される、請求項１１７に記載の方法。
  121. カチオン性脂質とｍＲＮＡの前記第一のモル比が、１：１０～１：１、例えば、約１：１である、請求項１１７～１２０のいずれか一項に記載の方法。
  122. 工程（ｂ）が一度実施された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、１：５～２：１、例えば、約２：１である、請求項１１７～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 工程（ｂ）が一度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、１：２～３：１、例えば、約３：１である。、請求項１１７～１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 工程（ｂ）が二度反復された後のカチオン性脂質とｍＲＮＡの前記モル比は、１：１～４：１、例えば、約４：１である。、請求項１１７～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 任意の工程における混合が、
    前記第一の液体の一部を、混合接合部にポンプ注入すること、および
    前記第二の液体を、前記混合接合部にポンプ注入すること、を含み、任意で前記混合接合部が、Ｔ型接合部である、請求項１１７～１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 工程（ａ）における混合が、
    前記第一の液体の第一の部分と、前記第二の液体を、前記第一の期間の第一の部分の間、混合すること、および、
    中間容器中に、前記混合液を、前記第一の期間の第二の部分の間、保管すること、を含む、請求項１１７～１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 工程（ｂ）における混合が、
    （ｉ）前記混合液と、前記第一の液体の第二の部分を、前記第二の期間の第一の部分の間、混合すること、および、
    （ｉｉ）中間容器中に、または前記中間容器中に、工程（ｂ）（ｉ）の結果得られた混合液を、前記第二の期間の第二の部分の間、保管すること、を含む、請求項１１７～１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記方法がさらに、
    工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を、最終容器に保管することを含む、請求項１１７～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. さらに、
    工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の生成物を加熱し、その後、前記生成物は、中間容器中に、もしくは前記中間容器中に保管されるか、またはさらに混合されること、を含み、任意で工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の前記生成物は、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度に加熱される、請求項１１７～１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. さらに、
    工程（ｂ）または（ｃ）の生成物を冷却し、その後、それを前記最終容器中に保管すること、を含み、任意で工程（ｂ）または（ｃ）の前記生成物は、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度に冷却される、請求項１２８または１２９に記載の方法。
  131. 前記第一の期間が、５分を超えない、請求項１０３～１３０のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記第二の期間が、５分を超えない、請求項１０３～１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記第一の期間の第一の部分が、２分を超えず、例えば、前記第一の期間は、約１分である、請求項１１２～１１６、または請求項１２６～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記第二の期間の第一の部分が、２分を超えず、例えば、前記第二の期間が、約１分である、請求項１１３～１１６、または請求項１２７～１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. ｎ１およびｎ２が、２０ｍＬ／分～２０Ｌ／分の範囲内である、請求項１０３～１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記第一の液体が、４０ｍＬ～１００Ｌの体積を有する、請求項１０３～１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記第二の液体が、４０ｍＬおよび１００Ｌの体積を有する、請求項１０３～１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記第二の液体中の前記ｍＲＮＡが、０．０１ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬの濃度を有する、請求項１０３～１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記第一の液体が、予め形成された空のＬＮＰの懸濁液である、請求項１０３～１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記第二の液体が、ｍＲＮＡの注射用水の溶液である、請求項１０３～１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体と、ｍＲＮＡを含む第二の液体とを混合することによって封入するための装置であって、
    第一のポンプ、
    第二のポンプ、
    混合接合部、
    中間容器、
    第一の熱交換器、
    前記第一の液体を、前記第一のポンプを介して前記混合接合部に誘導するよう構成されたＬＮＰ導管の配置、
    前記第二の液体を、前記第二のポンプを介して前記混合接合部に誘導するよう構成されたｍＲＮＡ導管の配置であって、前記第一および第二の液体が、前記混合接合部で混合液を形成する、配置、
    リサイクルループであって、
    前記混合液を、前記混合接合部から前記第一の熱交換器に、および前記第一の熱交換器から前記中間容器に誘導するよう構成されたリサイクルループであって、前記リサイクルループは、前記混合液を、前記中間容器から、
    前記第一のポンプの上流の前記ＬＮＰ導管の配置に誘導するよう、または
    前記第二のポンプの上流の前記ｍＲＮＡ導管の配置に誘導するよう構成可能である、リサイクルループ、を備えた、装置。
  142. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体と、ｍＲＮＡを含む第二の液体とを混合することによって封入するための装置であって、
    第一のポンプ、
    第二のポンプ、
    前記第一の液体の供給源、
    前記第二の液体の供給源、
    混合接合部、
    前記第一の液体を、前記第一のポンプを介して、前記第一の液体の供給源から、前記混合接合部に誘導するよう構成されたＬＮＰ導管の配置、
    前記第二の液体を、前記第二のポンプを介して、前記第二の液体の供給源から、前記混合接合部に誘導するよう構成されたｍＲＮＡ導管の配置であって、前記第一および第二の液体が、前記混合接合部で混合液を形成する、配置、
    リサイクルループであって、前記混合液を、
    前記第一のポンプの上流の前記ＬＮＰ導管の配置に誘導するよう、または
    前記第二のポンプの上流の前記ｍＲＮＡ導管の配置に誘導するよう構成可能である、リサイクルループ、を備えた、装置。
  143. 前記リサイクルループは、前記混合液を、前記第一のポンプの上流の第一の導管の配置へと誘導するように構成される、請求項１４１または１４２に記載の装置。
  144. 前記リサイクルループは、前記混合液を、前記第二のポンプの上流の第二の導管の配置へと誘導するように構成される、請求項１４１または１４２に記載の装置。
  145. 前記第一のポンプは、前記第一の液体を流量ｎ１でポンプ注入するよう構成され、前記第二のポンプは、前記第二の液体を流量ｎ２でポンプ注入するよう構成され、前記ｎ１は、ｎ２よりも大きい、請求項１４１～１４３のいずれか一項に記載の装置。
  146. 前記第一のポンプが、前記混合液を、流量ｎ３でポンプ注入するよう構成され、ｎ３は、ｎ１よりも大きい、請求項１４５に記載の装置。
  147. 前記第一のポンプは、前記混合液が前記リサイクルループを通過するたびに、前記混合液の流量を増加させるように構成される、請求項１４６に記載の装置。
  148. 前記第一のポンプは、前記第一の液体を流量ｍ１でポンプ注入するよう構成され、前記第二のポンプは、前記第二の液体を流量ｍ２でポンプ注入するよう構成され、前記ｍ２は、ｍ１よりも大きい、請求項１４１、１４２、または１４４に記載の装置。
  149. 前記第二のポンプが、前記混合液を、流量ｍ３でポンプ注入するよう構成され、ｍ３は、ｍ２よりも大きい、請求項１４８に記載の装置。
  150. 前記第二のポンプは、前記混合液が前記リサイクルループを通過するたびに、前記混合液の流量を増加させるように構成される、請求項１４９に記載の装置。
  151. 前記リサイクルループがさらに、
    前記混合液を、前記混合接合部から、中間容器または前記中間容器へと誘導し、その後、前記混合液を、前記ＬＮＰ導管の配置またはｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成される、請求項１４１～１５０のいずれか一項に記載の装置。
  152. さらに、
    第一の熱交換器または前記第一の熱交換器を備え、前記リサイクルループはさらに、前記混合液を、前記混合接合部から、前記第一の熱交換器へと誘導し、その後、前記混合液を、前記ＬＮＰ導管の配置またはｍＲＮＡ導管の配置へと誘導するように構成される、請求項１４１～１５１のいずれか一項に記載の装置。
  153. 前記リサイクルループがさらに、
    前記混合液を、前記第一の熱交換器へと誘導し、その後、前記混合液を、前記中間容器へと誘導するように構成される、請求項１５１または１５２に記載の装置。
  154. 前記第一の熱交換器は、前記混合液を、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度に加熱するように構成される、請求項１４１～１５３のいずれか一項に記載の装置。
  155. さらに、
    前記第一の液体を保管するように構成され、前記第一のポンプの上流に配置され、および前記ＬＮＰ導管の配置と流体連結された、第一の保管容器、ならびに
    前記第二の液体を保管するように構成され、前記第二のポンプの上流に配置され、および前記ｍＲＮＡ導管の配置と流体連結された、第二の保管容器、を備える、請求項１４１～１５４のいずれか一項に記載の装置。
  156. 前記第一の保管容器は、前記第一の液体を、６０℃～７０℃、例えば６３℃～６７℃、例えば約６５℃の温度で保管するように構成される、請求項１５５に記載の装置。
  157. さらに、
    前記混合液を、前記混合接合部から最終保管容器へと誘導するように構成された、導管のアウトプット配置を備える、請求項１４１～１５６のいずれか一項に記載の装置。
  158. さらに、
    第二の熱交換器を備え、前記導管のアウトプット配置はさらに、前記混合液が前記第二の熱交換器を通るように誘導し、その後、前記混合液を、前記最終保管容器へと誘導するように構成される、請求項１５７に記載の装置。
  159. 前記第二の熱交換器は、前記混合液を、１９℃～２３℃、例えば２０℃～２２℃、例えば約２１℃の温度に冷却するように構成される、請求項１５８に記載の装置。
  160. 前記第一および／または第二のポンプは、パルスレスフローポンプであり、例えば前記第一および／または第二のポンプは、ギアポンプまたは遠心ポンプである、請求項１４１～１５９のいずれか一項に記載の装置。
  161. 前記混合接合部が、Ｔ型接合部である、請求項１４１～１６０のいずれか一項に記載の装置。
  162. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、予め形成された空の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に、予め形成された空のＬＮＰを含む第一の液体と、ｍＲＮＡを含む第二の液体とを混合することによって封入するための装置であって、
    第一のポンプ、
    第二のポンプ、
    混合接合部、
    前記第一の液体を、前記第一のポンプを介して前記混合接合部に誘導するよう構成されたＬＮＰ導管の配置、
    前記第二の液体を、前記第二のポンプを介して前記混合接合部に誘導するよう構成されたｍＲＮＡ導管の配置であって、前記第一および第二の液体が、前記混合接合部で混合液を形成する、配置、
    リサイクルループであって、前記混合液を、
    前記第一のポンプの上流の前記ＬＮＰ導管の配置に誘導するよう、または
    前記第二のポンプの上流の前記ｍＲＮＡ導管の配置に誘導するよう構成される、リサイクルループ、ならびに
    プロセッサーであって、
    第一の期間、第一の流量で前記第一のポンプを駆動させ、および第二の流量で前記第二のポンプを駆動させるように構成され、および
    前記リサイクルループが、前記混合液を前記ＬＮＰ導管の配置へと誘導するように構成されている場合には、第二の期間、前記第一の流量のｎ１倍で前記第一のポンプを駆動させ、前記第二の流量で前記第二のポンプを駆動させるように構成されるか、または
    前記リサイクルループが、前記混合液を前記ＬＮＰ導管の配置へと誘導するように構成されている場合には、第二の期間、前記第一の流量で前記第一のポンプを駆動させ、前記第一の流量のｎ１倍で前記第二のポンプを駆動させるように構成される、プロセッサー、を備える、装置。
  163. 前記方法が、請求項１４１～１６２のいずれか一項に記載の装置を使用して実施され、前記方法がさらに、
    ＲＮａｓｅ非含有水の第一の流れを、前記装置に通すこと、
    水酸化ナトリウム溶液の流れを、前記装置に通すこと、および
    ＲＮａｓｅ非含有水の第二の流れを、前記装置に通すこと、を含む、請求項１０３～１４０のいずれか一項に記載の方法。
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