ES2931832T3 - Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos - Google Patents

Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

Se proporcionan compuestos que tienen la siguiente estructura: o una de sus sales, tautómeros o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables, en los que R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R<4a>, R<4b>, R<5>, R<6>, R<7>, R<8>, R<9>, L<1>, L<2>, a, b, c , d y c son como se definen aquí. También se proporciona el uso de los compuestos como un componente de formulaciones de nanopartículas lipídicas para la administración de un agente terapéutico, composiciones que comprenden los compuestos y métodos para su uso y preparación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos Antecedentes
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a lípidos catiónicos novedosos que pueden usarse en combinación con otros componentes lipídicos, tales como lípidos neutros, colesterol y lípidos conjugados con polímeros, para formar nanopartículas lipídicas con oligonucleótidos, para facilitar la entrega intracelular de ácidos nucleicos terapéuticos (por ejemplo, oligonucleótidos, ARN mensajero) tanto in vitro como in vivo.
Descripción de la técnica relacionada
Hay muchos desafíos asociados a la entrega de ácidos nucleicos para efectuar una respuesta deseada en un sistema biológico. La terapia basada en ácidos nucleicos tiene un enorme potencial, pero sigue siendo necesaria una entrega más eficaz de los ácidos nucleicos a los sitios adecuados dentro de una célula u organismo con el fin de desarrollar este potencial. Los ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), oligonucleótidos antisentido, ribozimas, ADNzimas, plásmidos, ácidos nucleicos inmunoestimuladores, antagomir, antimir, mimético, supermir y aptámeros. Algunos ácidos nucleicos, tales como el ARNm o los plásmidos, puede usarse para efectuar la expresión de productos celulares específicos como sería útil en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades relacionadas con una deficiencia de una proteína o enzima. Las aplicaciones terapéuticas de la entrega de nucleótidos traducibles son sumamente amplias, ya que pueden sintetizarse construcciones para producir cualquier secuencia de proteína elegida, sea o no autóctona del sistema. Los productos de expresión del ácido nucleico pueden aumentar los niveles existentes de proteína, reemplazar las versiones faltantes o no funcionales de una proteína, o introducir una nueva proteína y funcionalidad asociada en una célula u organismo. Algunos ácidos nucleicos, tales como los inhibidores de miARN, pueden usarse para efectuar la expresión de productos celulares específicos que están regulados por miARN como sería útil en el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades relacionadas con una deficiencia de proteína o enzima. Las aplicaciones terapéuticas de la inhibición de miARN son sumamente amplias, ya que pueden sintetizarse construcciones para inhibir uno o más miARN que, a su vez, regularían la expresión de productos de ARNm. La inhibición del miARN endógeno puede aumentar su expresión de proteínas endógenas diana en dirección 3' y restablecer la función adecuada en una célula u organismo como medio para tratar enfermedades asociadas a un miARN específico o a un grupo de miARN.
Otros ácidos nucleicos pueden regular negativamente los niveles intracelulares de ARNm específicos y, como resultado, regular negativamente la síntesis de las proteínas correspondientes a través de procesos tales como la interferencia de ARN (iARN) o la unión complementaria del ARN antisentido. Las aplicaciones terapéuticas del oligonucleótido antisentido y de la iARN son también sumamente amplias, puesto que pueden sintetizarse construcciones de oligonucleótidos con cualquier secuencia de nucleótidos dirigida contra un ARNm diana. Las dianas pueden incluir ARNm de células normales, ARNm asociados a patologías, tales como el cáncer, y ARNm de agentes infecciosos, tales como virus. Hasta ahora, las construcciones de oligonucleótidos antisentido han demostrado la capacidad de regular negativamente y específicamente las proteínas diana a través de la degradación del ARNm afín tanto en modelos in vitro como in vivo. Además, las construcciones de oligonucleótidos antisentido actualmente se están evaluando en estudios clínicos.
Sin embargo, el uso de oligonucleótidos en contextos terapéuticos se enfrenta actualmente a dos problemas. En primer lugar, los ARN libres son susceptibles de digestión por nucleasas en el plasma. En segundo lugar, los ARN libres tienen una capacidad limitada para acceder al compartimento intracelular donde reside la maquinaria de traducción pertinente. Se han utilizado nanopartículas lipídicas formadas a partir de lípidos catiónicos con otros componentes lipídicos, tales como lípidos neutros, colesterol, PEG, lípidos PEGilados y oligonucleótidos, para bloquear la degradación de los ARN en el plasma y facilitar la captación celular de los oligonucleótidos.
Sigue existiendo la necesidad de lípidos catiónicos y nanopartículas lipídicas mejorados para la entrega de oligonucleótidos. Preferentemente, estas nanopartículas lipídicas proporcionarían relaciones fármaco:lípido óptimas, protegerían el ácido nucleico de la degradación y el aclaramiento en suero, serían adecuadas para la entrega sistémica y proporcionarían una entrega intracelular del ácido nucleico. Además, estas partículas de lípido-ácido nucleico deben ser bien toleradas y proporcionar un índice terapéutico adecuado, de manera que el tratamiento del paciente a una dosis eficaz del ácido nucleico no se asocie a una toxicidad inaceptable y/o un riesgo para el paciente. La presente invención proporciona estas ventajas y otras relacionadas.
El documento WO 2016/176330 A1 se refiere a composiciones para inducir una respuesta inmunitaria adaptativa en un sujeto, comprendiendo la composición al menos un ARN modificado con nucleósidos que codifica al menos un antígeno. Ansell, S. M. et al. (Bioconjugate Chem. 1999, 10, 653 - 666) se refiere a conjugados de lípidos de ácido oligo-(14-amino-3,6,9,12-tetraoxatetradecanoico). Lee, JB et al. (Int. J. Cancer 2012, 131, E781-E790) se relaciona con sistemas de nanopartículas de lípidos para la administración de siRNA. Marchi-Artzner, V. et al. (Langmuir 2003, 19, 835-841) estudia la adhesión de vesículas peptídicas Arg-Gly-Asp sobre una superficie de integrina.
Breve sumario
En resumen, la presente invención proporciona compuestos lipídicos, incluyendo estereoisómeros, sales farmacéuticamente aceptables o tautómeros de los mismos, que pueden usarse solos o en combinación con otros componentes lipídicos tales como lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides (incluyendo, por ejemplo, todos los esteroles) y/o sus análogos, y/o lípidos conjugados con polímeros para formar nanopartículas lipídicas para la entrega de agentes terapéuticos. En algunos casos, las nanopartículas lipídicas se usan para entregar ácidos nucleicos tales como ARN antisentido y/o mensajero.
El objeto de la invención es el expuesto en las reivindicaciones adjuntas.
La invención se refiere a un lípido pegilado que tiene la siguiente estructura (II):
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o una sal, tautómero o estereoisómero farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde R10, R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene de 12 a 16 átomos de carbono; y z tiene un valor medio que oscila entre 30 y 60.
La invención también proporciona una composición que comprende el compuesto de la invención y un lípido catiónico.
Las realizaciones preferidas de la presente invención se exponen en las reivindicaciones dependientes.
Breve descripción de las diversas vistas de los dibujos
En las figuras, números de referencia idénticos identifican elementos similares. Los tamaños y las posiciones relativas de los elementos en las figuras no se dibujan necesariamente a escala y algunos de esos elementos se amplían y posicionan arbitrariamente para mejorar la legibilidad de la figura. Además, las formas particulares de los elementos tal como están dibujados no pretenden transmitir ninguna información con respecto a la forma real de los elementos particulares, y se han seleccionado únicamente para facilitar su reconocimiento en las figuras.
La Figura 1 muestra el curso temporal de la expresión de luciferasa en hígado de ratón.
La Figura 2 ilustra el cálculo de pKa para MC3 como ejemplo representativo pertinente para los lípidos divulgados.
La Figura 3 proporciona datos comparativos de la actividad de la luciferasa para diferentes lípidos.
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra datos comparativos para composiciones que comprenden dos lípidos pegilados diferentes.
Descripción detallada
En la siguiente descripción, se exponen ciertos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de varias realizaciones de la invención. Sin embargo, un experto en la materia comprenderá que la invención puede practicarse sin estos detalles.
La presente divulgación se refiere a (amino) lípidos catiónicos que proporcionan ventajas cuando se usan en nanopartículas lipídicas para la entrega in vivo de un agente activo o terapéutico, tal como un ácido nucleico, en una célula de un mamífero. En particular, las composiciones de nanopartículas de ácido nucleico-lípido que comprenden uno o más de los lípidos catiónicos que se describen en el presente documento y que proporcionan una actividad aumentada del ácido nucleico y una tolerabilidad aumentada de las composiciones in vivo, dando como resultado un aumento significativo del índice terapéutico en comparación con las composiciones de nanopartículas de ácido nucleico-lípido descritas anteriormente.
En particular, los lípidos catiónicos permiten la formulación de composiciones mejoradas para el suministro in vitro e in vivo de ARNm y/u otros oligonucleótidos. Estas composiciones mejoradas de nanopartículas de lípidos son útiles para la expresión de proteínas codificadas por ARNm. Además, estas composiciones de nanopartículas lipídicas mejoradas son útiles para la regulación positiva de la expresión de proteínas endógenas mediante la entrega de inhibidores de miARN dirigidos a un miARN específico o a un grupo de miARN que regulan un ARNm diana o varios ARNm. Además, estas composiciones de nanopartículas lipídicas mejoradas son útiles para regular negativamente (por ejemplo, silenciar) los niveles de proteína y/o los niveles de ARNm de los genes diana. Es más, las nanopartículas lipídicas también son útiles para la entrega de ARNm y plásmidos para la expresión de transgenes. En otras divulgaciones más, las composiciones de nanopartículas lipídicas son útiles para inducir un efecto farmacológico resultante de la expresión de una proteína, por ejemplo, una producción aumentada de glóbulos rojos a través de la entrega de un ARNm de eritropoyetina adecuado, o la protección contra la infección a través de la entrega de ARNm que codifica un anticuerpo adecuado.
Las nanopartículas lipídicas y las composiciones pueden usarse para una diversidad de fines, incluyendo la entrega de agentes terapéuticos, tales como ácidos nucleicos, encapsulados o asociados (por ejemplo, formando complejos) a las células, tanto in vitro como in vivo.
Como se describe en el presente documento, las nanopartículas lipídicas son particularmente útiles para la entrega de ácidos nucleicos, incluyendo, por ejemplo, ARNm, oligonucleótido antisentido, ADN plasmídico, microARN (miARN), inhibidores de miARN (antagomirs/antimirs), ARN complementario que interfiere con el ARN mensajero (ARNcim), ADN, ARN multivalente, ARN sustrato de Dicer, ADN complementario (ADNc), etc. Por tanto, las nanopartículas lipídicas y las composiciones pueden usarse para inducir la expresión de una proteína deseada tanto in vitro como in vivo poniendo en contacto células con una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos que se describen en el presente documento, en donde la nanopartícula lipídica encapsula o se asocia a un ácido nucleico que se expresa para producir la proteína deseada (por ejemplo, un ARN mensajero o un plásmido que codifica la proteína deseada). Como alternativa, las nanopartículas lipídicas y las composiciones pueden usarse para disminuir la expresión de genes diana y proteínas tanto in vitro como in vivo poniendo en contacto células con una nanopartícula lipídica que comprende uno o más lípidos catiónicos novedosos que se describen en el presente documento, en donde la nanopartícula lipídica encapsula o se asocia a un ácido nucleico que reduce la expresión de genes diana (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o ARN de interferencia pequeño (ARNip)). Las nanopartículas lipídicas y las composiciones de la presente invención también pueden usarse para la entrega conjunta de diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm y ADN plasmídico) por separado o en combinación, tal como puede ser útil para proporcionar un efecto que requiere la colocalización de diferentes ácidos nucleicos (por ejemplo, ARNm que codifica una enzima modificadora de genes adecuada y un segmento o segmentos de ADN para su incorporación en el genoma del hospedador).
Los ácidos nucleicos pueden prepararse de acuerdo con cualquier técnica disponible. Para el ARNm, la metodología primaria de preparación es, pero sin limitación, la síntesis enzimática (también denominada transcripción in vitro) que actualmente representa el método más eficiente para producir ARNm específico de secuencia larga. La transcripción in vitro describe un proceso de síntesis dirigida por moldes de moléculas de ARN a partir de un molde de ADN modificado por ingeniería genética compuesto por una secuencia promotora de bacteriófago en dirección 5' (por ejemplo, incluyendo, pero sin limitación, la del copolífago T7, T3 y SP6) unida a una secuencia en dirección 3' que codifica el gen de interés. El ADN molde puede prepararse para la transcripción in vitro a partir de varias fuentes con técnicas adecuadas que son bien conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa y ADN plasmídico (véase Linpinsel, J.L y Conn, G.L., General protocols for preparation of plasmid DNA témplate y Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P. y Williams, L.D. en RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE en Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2012)
La transcripción del ARN se produce in vitro usando el molde de ADN linealizado en presencia de la correspondiente ARN polimerasa y trifosfatos de ribonucleósido (rNTPs) de adenosina, guanosina, uridina y citidina en condiciones que favorecen la actividad de la polimerasa minimizando al mismo tiempo la posible degradación de los transcritos de ARNm resultantes. La transcripción in vitro puede realizarse usando una diversidad de equipos disponibles en el mercado, incluyendo, pero sin limitación, el Sistema de Producción de ARN a Gran Escala RiboMax (Promega), Kits de Transcripción MegaScript (Life Technologies), así como con reactivos disponibles en el mercado, incluyendo polimerasas de ARN y rNTP. La metodología para la transcripción in vitro de ARNm es bien conocida en la técnica. (véase, por ejemplo, Losick, R., 1972, In vitro transcription, Ann Rev Biochem v. 41 409-46; Kamakaka, R. T. y Kraus, W. L. 2001. In Vitro Transcription. Current Protocols in Cell Biology. 2:11.6:11.6.1-11.6.17; Beckert, B. y Masquida, B., (2010) Synthesis of RNA by In Vitro Transcription in RNA en Methods in Molecular Biology v. 703 (Neilson, H. Ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2010; Brunelle, J.L. y Green, R., 2013, Capítulo cinco - In vitro transcription from plasmid or PCR-amplified DNA, Methods in Enzymology v. 530, 101-114; todos los cuales se incorporan en el presente documento como referencia).
El ARNm transcrito in vitro deseado después se purifica de los componentes no deseados de la transcripción o reacciones asociadas (incluyendo los rNTP no incorporados, enzima proteínica, sales, oligómeros de ARN cortos, etc.). Las técnicas para el aislamiento de los transcritos de ARNm son bien conocidas en la técnica. Los procedimientos bien conocidos incluyen la extracción con fenol/cloroformo o la precipitación con alcohol (etanol, isopropanol) en presencia de cationes monovalentes o cloruro de litio. Los ejemplos no limitantes adicionales de procedimientos de purificación que pueden usarse incluyen cromatografía de exclusión por tamaño (Lukavsky, P.J. y Puglisi, J.D., 2004, Large-scale preparation and purification of polyacrylamide-free RNA oligonucleotides, RNA v. 10, 889-893), cromatografía de afinidad a base de sílice y electroforesis en gel de poliacrilamida (Bowman, J.C., Azizi, B., Lenz, T.K., Ray, P. y Williams, L.D. en RNA in vitro transcription and RNA purification by denaturing PAGE en Recombinant and in vitro RNA syntheses Methods v. 941 Conn G.L. (ed), Nueva York, N.Y. Humana Press, 2012 ). La purificación puede realizarse usando una diversidad de kits disponibles en el mercado, incluyendo, pero sin limitación, el Sistema de Aislamiento Total SV (SV Total Isolation System, Promega) y el Kit de Limpieza y Concentración de Transcripción In Vitro (In Vitro Transcription Cleanup and Concentration Kit, Norgen Biotek).
Además, aunque la transcripción inversa puede producir grandes cantidades de ARNm, los productos pueden contener varias impurezas de ARN aberrantes asociadas a la actividad polimerasa no deseada que puede ser necesario retirar de la preparación de ARNm de longitud completa. Éstas incluyen ARN cortos que son resultado de la iniciación abortiva de la transcripción, así como ARN bicatenario (ARNbc) generado por la actividad ARN polimerasa dependiente de ARN, transcripción cebada con ARN a partir de moldes de ARN y extensión 3' autocomplementaria. Se ha demostrado que estos contaminantes con estructuras de ARNbc pueden conducir a una actividad inmunoestimuladora no deseada a través de la interacción con diversos sensores inmunitarios innatos en las células eucarióticas que actúan reconociendo estructuras de ácidos nucleicos específicas e induciendo respuestas inmunitarias potentes. Esto, a su vez, puede reducir drásticamente la traducción del ARNm, puesto que la síntesis de proteínas se reduce durante la respuesta inmunitaria celular innata. Por tanto, se han desarrollado, y se conocen en la técnica, técnicas adicionales para retirar estos contaminantes de ARNbc, incluyendo, pero sin limitación, la purificación por HPLC escalable (véase, por ejemplo, Kariko, K., Muramatsu, H., Ludwig, J. y Weissman, D., 2011, Generating the optimal mRNA for therapy: HPLC purification eliminates immune activation and improves translation of nucleoside-modified, protein-cncoding mRNA, Nucl Acid Res, v. 39 cl42; Weissman, D., Pardi, N., Muramatsu, H. y Kariko, K., HPLC Purification of in vitro transcribed long RNA in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation en Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013). Se ha publicado que el ARNm purificado por HPLC se traduce a niveles mucho mayores, particularmente en células primarias e in vivo.
Se ha descrito en la técnica una diversidad significativa de modificaciones que se usan para alterar propiedades específicas del ARNm transcrito in vitro y mejorar su utilidad. Éstas incluyen, pero sin limitación, modificaciones de los extremos 5' y 3' del ARNm. Los ARNm eucariotas endógenos contienen normalmente una estructura de capuchón en el extremo 5' de una molécula madura que desempeña una función importante en la mediación de la unión de la proteína de unión al capuchón (CBP) del ARNm, que a su vez es responsable de potenciar la estabilidad del ARNm en la célula y la eficiencia de la traducción del ARNm. Por tanto, los niveles más altos de expresión de proteínas se consiguen con transcripciones de ARNm con capuchón. El capuchón en 5' contiene un enlace 5'-5'-trifosfato entre el nucleótido más hacia el extremo 5' y un nucleótido de guanina. El nucleótido de guanina conjugado está metilado en la posición N7. Las modificaciones adicionales incluyen la metilación de los nucleótidos último y penúltimo más hacie el extremo 5' en el grupo 2'-hidroxilo.
Pueden usarse múltiples estructuras de capuchón distintas para generar el capuchón en 5' de ARNm sintético transcrito in vitro. La colocación del capuchón en 5' del ARNm sintético puede realizarse cotranscripcionalmente con análogos químicos de capuchón (es decir, colocación del capuchón durante la transcripción in vitro). Por ejemplo, el capuchón Anti-Análogo de Capuchón Inverso (ARCA) contiene un enlace de 5'-5'-trifosfato guanina-guanina donde una guanina contiene un grupo metilo N7 así como un grupo 3'-O-metilo. Sin embargo, hasta el 20 % de los transcritos permanecen sin capuchón durante este proceso cotranscripcional y el análogo de capuchón sintético no es idéntico a la estructura de tapón 5' de un ARNm celular auténtico, reduciendo potencialmente la traducibilidad y la estabilidad celular. Como alternativa, a las moléculas de ARNm sintéticas también se les puede poner el capuchón enzimáticamente después de la transcripción. Esto puede generar una estructura de capuchón 5' más auténtica que imita más estrechamente, ya sea estructural o funcionalmente, el capuchón 5' endógeno que tiene una unión potenciada de las proteínas de unión al capuchón, una semivida aumentada, una susceptibilidad reducida a las endonucleasas 5' y/o una eliminación del capuchón 5' reducida. Se han desarrollado numerosos análogos sintéticos de capuchón 5' y se sabe la técnica que potencian la estabilidad y la traducibilidad del ARNm (véase, por ejemplo, Grudzien-Nogalska, E., Kowalska, J., Su, W., Kuhn, A.N., Slepenkov, S.V., Darynkiewicz, E., Sahin, U., Jemielity, J. y Rhoads, R.E., Synthetic mRNAs with superior translation and stability properties in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation en Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
En el extremo 3', normalmente se añade una cadena larga de nucleótidos de adenina (cola poli-A) a las moléculas de ARNm durante el procesamiento del ARN. Inmediatamente después de la transcripción, el extremo 3' del transcrito se escinde para liberar un hidroxilo 3' al que la poli-A polimerasa le añade una cadena de nucleótidos de adenina al ARN en un proceso denominado poliadenilación. Se ha demostrado ampliamente que la cola poli-A potencia tanto la eficiencia de la traducción como la estabilidad del ARNm (véase Bernstein, P. y Ross, J., 1989, Poly (A), poly (A) binding protein and the regulation of mRNA stability, Trends Bio Sci v. 14373-377; Guhaniyogi, J. y Brewer, G., 2001, Regulation of mRNA stability in mammalian cells, Gene, v. 265, 11-23; Dreyfus, M. y Regnier, P., 2002, The poly (A) tail of mRNAs: Bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria, Cell, v.111,611-613).
La cola poli (A) del ARNm transcrito in vitro puede conseguirse usando diversos enfoques, incluyendo, pero sin limitación, la clonación de una extensión poli (T) en el molde de ADN o mediante adición post-transcripcional usando Poli (A) polimerasa. El primer caso permite la transcripción in vitro del ARNm con colas poli (A) de longitud definida, dependiendo del tamaño de la extensión poli (T), pero requiere una manipulación adicional del molde. El último caso implica la adición enzimática de una cola poli (A) al ARNm transcrito in vitro usando poli (A) polimerasa que cataliza la incorporación de restos adenina en los extremos 3' del ARN, lo que no requiere ninguna manipulación adicional del molde de ADN, pero da como resultado un ARNm con colas poli(A) de longitud heterogénea. La incorporación de capuchón 5' y cola poli (A) 3' puede realizarse usando una diversidad de kits disponibles en el mercado, incluyendo, pero sin limitación, el kit de colas poli (A) polimerasa (Poly (A) Polymerase Tailing, EpiCenter), el kit mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra el kit de cola Poli (A) (Life Technologies) así como con reactivos disponibles en el mercado, diversos capuchones ARCA, Poli (A) polimerasa.
Además del capuchón 5' y la poli-adenilación 3', se ha publicado que otras modificaciones de las transcritos in vitro proporcionan beneficios con respecto a la eficiencia de la traducción y la estabilidad. Es bien sabido en la técnica que el ADN y el ARN patógenos pueden reconocerse mediante una diversidad de sensores dentro de los eucariotas y desencadenan potentes respuestas inmunitarias innatas. Se ha demostrado que la capacidad de discriminar entre el ADN y el ARN patógenos y los propios se basa, al menos en parte, en modificaciones de la estructura y los nucleósidos, puesto que la mayoría de los ácidos nucleicos de fuentes naturales contienen nucleósidos modificados. Por el contrario, el ARN sintetizado in vitro carece de estas modificaciones, lo que lo convierte en inmunoestimulador, lo que a su vez puede inhibir la traducción eficaz del ARNm como se ha esbozado anteriormente. La introducción de nucleósidos modificados en el ARNm transcrito in vitro puede usarse para impedir el reconocimiento y la activación de los sensores de ARN, mitigando de este modo esta actividad inmunoestimuladora no deseada y potenciando la capacidad de traducción (véase, por ejemplo, Kariko, K. y Weissman, D. 2007, Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development, Curr Opin Drug Discov Devel, v.10523-532; Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation en Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013); Kariko, K., Muramatsu, H., Welsh, F.A, Ludwig, J., Kato, H., Akira, S., Weissman, D., 2008, Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Mol Ther v.16, 1833-1840. Los nucleósidos y nucleótidos modificados utilizados en la síntesis de ARN modificados pueden prepararse, controlarse y utilizarse usando métodos y procedimientos generales conocidos en la técnica. Se dispone de una gran diversidad de modificaciones de nucleósidos que pueden incorporarse solos o en combinación con otros nucleósidos modificados en cierto grado en el ARNm transcrito in vitro (véase, por ejemplo, el documento US2012/0251618). Se ha publicado que la síntesis in vitro de ARNm con nucleósidos modificados ha reducido la capacidad de activar los sensores inmunitarios, con la consiguiente capacidad de traducción potenciada.
Otros componentes del ARNm que pueden modificarse para proporcionar beneficios en términos de traducibilidad y estabilidad incluyen las regiones de 5' y 3' sin traducir (UTR). Se ha demostrado que la optimización de las UTR (las UTR favorables 5' y 3' pueden obtenerse a partir de ARN celulares o víricos), ya sea ambas o independientemente, aumenta la estabilidad del ARNm y la eficiencia de traducción del ARNm transcrito in vitro (véase, por ejemplo, Pardi, N., Muramatsu, H., Weissman, D., Kariko, K., In vitro transcription of long RNA containing modified nucleosides in Synthetic Messenger RNA and Cell Metabolism Modulation en Methods in Molecular Biology v.969 (Rabinovich, P.H. Ed), 2013).
Además del ARNm, pueden usarse otras cargas útiles de ácido nucleico para la presente invención. Para los oligonucleótidos, los métodos de preparación incluyen, pero sin limitación, la síntesis química y la escisión química y enzimática de un precursor más largo, la transcripción in vitro como se ha descrito anteriormente, etc. Los métodos de síntesis de nucleótidos de ADN y ARN se usan ampliamente y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Gait, M. J. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, D.C.: iRl Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: methods and applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, N.J.) Totowa, N.J.: Humana Press, 2005).
Para el ADN plasmídico, la preparación utiliza habitualmente, pero sin limitación, la expansión y aislamiento del ADN plasmídico in vitro en un cultivo líquido de bacterias que contienen el plásmido de interés. La presencia de un gen en el plásmido de interés que codifica la resistencia a un antibiótico particular (penicilina, kanamicina) permite que las bacterias que contienen el plásmido de interés crezcan selectivamente en cultivos que contienen antibióticos. Los métodos de aislamiento de ADN plasmídico se usan ampliamente y son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Heilig, J., Elbing, K. L. y Brent, R (2001) Large-Scale Preparation of Plasmid DNA. Current Protocols in Molecular Biology. 41:11:1.7:1.7.1-1.7.16; Rozkov, A., Larsson, B., Gillstrom, S., Bjornestedt, R. y Schmidt, S. R. (2008), Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol. Bioeng., 99: 557-566; y el documento US6197553B1). El aislamiento de los plásmidos puede realizarse usando una diversidad de kits disponibles en el mercado, incluyendo, pero sin limitación, Plasmid Plus (Qiagen), los kits GenJET plasmid MaxiPrep (Thermo) y PureYield MaxiPrep (Promega), así como con reactivos disponibles en el mercado.
Como se usan en el presente documento, los siguientes términos tienen el significado que se les atribuye, a menos que se especifique otra cosa.
A menos que el contexto requiera otra cosa, a lo largo de la presente memoria descriptiva y de las reivindicaciones, la palabra "comprender" y variaciones de la misma, tales como, "comprende" y "que comprende" deben interpretarse en un sentido abierto e inclusivo, es decir, como "incluyendo, pero sin limitación".
La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a "una sola realización" o "una realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones de las expresiones "en una sola realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente otra cosa.
La expresión "inducir la expresión de una proteína deseada" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico de aumentar la expresión de la proteína deseada. Para examinar el alcance de la expresión de proteínas, una muestra de ensayo (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresan la proteína deseada) o un mamífero de ensayo (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un modelo animal tal como un roedor (por ejemplo, un ratón) o un modelo en primate no humano (por ejemplo, un mono)) se ponen en contacto con un ácido nucleico (por ejemplo, ácido nucleico en combinación con un lípido de la presente invención). La expresión de la proteína deseada en la muestra de ensayo o el animal de ensayo se compara con la expresión de la proteína deseada en una muestra de control (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresa la proteína deseada) o un mamífero de control (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un modelo animal tal como un modelo en roedor (por ejemplo, un ratón) o un primate no humano (por ejemplo, un mono)) que no se ponen en contacto o a los que no se les administra el ácido nucleico. Cuando la proteína deseada está presente en una muestra de control o un mamífero de control, a la expresión de una proteína deseada en una muestra de control o un mamífero de control se le puede asignar un valor de 1,0. En divulgaciones particulares, la inducción de la expresión de una proteína deseada se consigue cuando la relación entre la expresión de la proteína deseada en la muestra de ensayo o el mamífero de ensayo y el nivel de expresión de la proteína deseada en la muestra de control o el mamífero de control es superior a 1, por ejemplo, aproximadamente 1,1, 1,5, 2,0, 5,0 o 10,0. Cuando una proteína deseada no está presente en una muestra de control o un mamífero de control, la inducción de la expresión de una proteína deseada se consigue cuando se detecta cualquier nivel medible de la proteína deseada en la muestra de ensayo o el mamífero de ensayo. Un experto habitual en la materia comprenderá los ensayos adecuados para determinar el nivel de expresión de proteína en una muestra, por ejemplo, transferencias puntuales, trasferencias Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática y ensayos fenotípicos, o ensayos basados en proteínas indicadoras que pueden producir fluorescencia o luminiscencia en condiciones adecuadas.
La expresión "inhibir la expresión de un gen diana" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para silenciar, reducir o inhibir la expresión de un gen diana. Para examinar el alcance del silenciamiento génico, una muestra de ensayo (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresa el gen diana) o un mamífero de ensayo (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un modelo animal tal como un roedor (por ejemplo, un ratón) o un modelo en primate no humano (por ejemplo, un mono)) se ponen en contacto con un ácido nucleico que silencia, reduce o inhibe la expresión del gen diana. La expresión del gen diana en la muestra de ensayo o el animal de ensayo se compara con la expresión del gen diana en una muestra de control (por ejemplo, una muestra de células en cultivo que expresa el gen diana) o un mamífero de control (por ejemplo, un mamífero tal como un ser humano o un modelo animal tal como un modelo en roedor (por ejemplo, un ratón) o un primate no humano (por ejemplo, un mono)) que no se ponen en contacto o a los que no se les administra el ácido nucleico. A la expresión del gen diana en una muestra de control o un mamífero de control se le puede asignar un valor del 100 %. En divulgaciones particulares, el silenciamiento, la inhibición o la reducción de la expresión de un gen diana se consigue cuando el nivel de expresión de un gen diana en la muestra de ensayo o el mamífero de ensayo con respecto al nivel de expresión de un gen diana en la muestra de control o el mamífero de control es aproximadamente del 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 %, el 55 %, el 50 %, el 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 5 % o el 0 %. En otras palabras, los ácidos nucleicos son capaces de silenciar, reducir o inhibir la expresión de un gen diana en al menos aproximadamente el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 25 %, el 30 %, el 35 %, el 40 %, el 45 %, el 50 %, el 55 %, el 60 %, el 65 %, el 70 %, el 75 %, el 80 %, el 85 %, el 90 %, el 95 % o el 100 % en una muestra de ensayo o un mamífero de ensayo con respecto al nivel de expresión del gen diana en una muestra de control o un mamífero de control que no se ponen en contacto o a los que no se les administra el ácido nucleico. Los ensayos adecuados para determinar el nivel de expresión de genes diana incluyen, sin limitación, el examen de los niveles de proteína o ARNm usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como, por ejemplo, transferencias puntuales, trasferencias Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, así como ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la materia.
Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente activo o un agente terapéutico, tal como un ácido nucleico terapéutico, es una cantidad suficiente para producir el efecto deseado, por ejemplo, un aumento o inhibición de la expresión de una secuencia diana en comparación con el nivel de expresión normal detectado en ausencia del ácido nucleico. Se consigue un aumento de la expresión de una secuencia diana cuando se detecta cualquier nivel medible en el caso de un producto de expresión que no está presente en ausencia del ácido nucleico. En el caso de que el producto de la expresión esté presente en algún nivel antes del contacto con el ácido nucleico, se consigue un aumento de la expresión cuando el múltiplo del aumento del valor obtenido con un ácido nucleico como el ARNm con respecto a el control es de aproximadamente 1,05, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,75, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 5000, 10000 o más. La inhibición de la expresión de un gen o secuencia diana se consigue cuando el valor obtenido con un ácido nucleico tal como un oligonucleótido antisentido con respecto al control es aproximadamente del 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 %, el 55 %, el 50 %, el 45 %, el 40 %, el 35 %, el 30 %, el 25 %, el 20 %, el 15 %, el 10 %, el 5 % o el 0 %. Los ensayos adecuados para medir la expresión de un gen o secuencia diana incluyen, por ejemplo, el examen de los niveles de proteína o RNA usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, tales como transferencias puntuales, trasferencias Northern, hibridación in situ, ELISA, inmunoprecipitación, función enzimática, fluorescencia o luminiscencia de proteínas indicadoras adecuadas, así como ensayos fenotípicos conocidos por los expertos en la materia.
La expresión "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero que contiene al menos dos desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos en forma monocatenaria o bicatenaria e incluye el ADN, el ARN e híbridos de los mismos. El ADN puede tener la forma de moléculas antisentido, ADN plasmídico, ADNc, productos de PCR o vectores. El ARN puede tener la forma de un ARN en horquilla corto (ARNhc), ARN mensajero (ARNm), ARN antisentido, miARN, micARN, ARN multivalente, ARN sustrato de Dicer o ARN vírico (ARNv), y combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos incluyen los ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o restos o enlaces de la cadena principal modificados, que son sintéticos, de origen natural y de origen no natural, y que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. Los ejemplos de dichos análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metilo, fosfonatos de metilo quirales, 2'-O-metil ribonucleótidos y ácidos nucleicos peptídicos (PNA). A menos que se limite específicamente, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia. A menos que se indique otra cosa, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes modificadas conservadoramente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados), alelos, ortólogos, polimorfismos de un solo nucleótido y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. Específicamente, pueden conseguirse sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye por restos de base mixta y/o desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem, 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98 (1994)). Los "nucleótidos" contienen un azúcar desoxirribosa (ADN) o ribosa (ARN), una base y un grupo de fosfato. Los nucleótidos están unidos entre sí a través de los grupos fosfato. Las "bases" incluyen las purinas y las pirimidinas, que además incluyen los compuestos naturales adenina, timina, guanina, citosina, uracilo, inosina y análogos naturales, y derivados sintéticos de purinas y pirimidinas, que incluyen, pero sin limitación, modificaciones que colocan nuevos grupos reactivos tales como, pero sin limitación, aminas, alcoholes, tioles, carboxilatos y alquilhaluros.
El término "gen" se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias codificantes de longitud parcial o total necesarias para la producción de un polipéptido o un polipéptido precursor.
"Producto génico", como se usa en el presente documento, se refiere a un producto de un gen tal como un transcrito de ARN o un polipéptido.
El término "lípido" se refiere a un grupo de compuestos orgánicos que incluyen, pero sin limitación, ésteres de ácidos grasos, y se caracterizan generalmente por ser poco solubles en agua, pero solubles en muchos disolventes orgánicos. Por lo general se dividen en al menos tres clases: (1) "lípidos simples", que incluyen grasas y aceites, así como ceras; (2) "lípidos compuestos", que incluyen fosfolípidos y glicolípidos; y (3) "lípidos derivados" tale como los esteroides.
Un "esteroide" es un compuesto que comprende la siguiente cadena principal de carbono:
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Los ejemplos no limitantes de esteroides incluyen el colesterol y similares.
Un "lípido catiónico" se refiere a un lípido capaz de tener carga positiva. Los lípidos catiónicos de ejemplo incluyen
uno o más grupos amina que llevan la carga positiva. Los lípidos catiónicos preferidos son ionizables de manera que pueden existir en una forma con carga positiva o neutra dependiendo del pH. La ionización del lípido catiónico afecta
a la carga superficial de la nanopartícula lipídica en diferentes condiciones de pH. Este estado de carga puede influir en la absorción de proteínas plasmáticas, el aclaramiento de la sangre y la distribución tisular (Semple, S.C., et al.,
Adv. Drug Deliv Rev 32: 3-17 (1998)), así como en la capacidad de formar estructuras no de bicapa endosomolíticas
(Hafez, I.M., et al., Gene Ther 8: 1188-1196 (2001)) críticas para la entrega intracelular de ácidos nucleicos.
La expresión "nanopartícula lipídica" se refiere a partículas que tienen al menos una dimensión del orden de nanómetros (por ejemplo, 1-1000 nm) que incluyen uno o más de los compuestos de fórmula (I) u otros lípidos catiónicos especificados. Las nanopartículas de lípidos se incluyen en una formulación que se puede usar para administrar un agente activo o un agente terapéutico, como un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) a un sitio objetivo de interés (por ejemplo, célula, tejido, órgano, tumor y similares). Las nanopartículas lipídicas pueden comprender un ácido nucleico. Tales nanopartículas lipídicas normalmente comprenden un compuesto de fórmula (I) y uno o más excipientes seleccionados de lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y lípidos conjugados con polímeros. El agente activo o agente terapéutico, tal como un ácido nucleico, puede estar encapsulado en la porción
lipídica de la nanopartícula lipídica o en un espacio acuoso envuelto por parte o la totalidad de la porción lipídica de
la nanopartícula lipídica, protegiéndola así de la degradación enzimática u otros efectos indeseables inducidos por los mecanismos del organismo huésped o las células, por ejemplo, una respuesta inmune adversa.
Las nanopartículas lipídicas pueden tener un diámetro medio de aproximadamente 30 nm a aproximadamente
150 nm, de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm, de aproximadamente 50 nm a aproxi 150 nm, de aproximadamente 60 nm a aproximadamente 130 nm, de aproximadamente 70 nm a aproxi 110 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 80 nm a aproxi 100 nm, de aproximadamente 90 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 70 a aproximadamente
90 nm, de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 90 nm, de aproximadamente 70 nm a aproximadamente
80 nm, o aproximadamente 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm,
85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm o
150 nm, y son sustancialmente atóxicas. En algunos casos, los ácidos nucleicos, cuando están presentes en las nanopartículas lipídicas, son resistentes en solución acuosa a la degradación con una nucleasa. Se divulgan nanopartículas lipídicas que comprenden ácidos nucleicos y su método de preparación en, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los EE.UU. N.° 2004/0142025, 2007/0042031 y las Pub. PCT. N.° WO 2013/016058 y
WO 2013/086373.
Como se usa en el presente documento, "encapsulado en lípidos" se refiere a una nanopartícula lipídica que proporciona un agente activo o terapéutico, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm), con encapsulación
total, encapsulación parcial, o ambas. El ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) puede estar totalmente encapsulado
en la nanopartícula lipídica.
La expresión "lípido conjugado con polímero" se refiere a una molécula que comprende tanto una porción lipídica
como una porción polimérica. Un ejemplo de un lípido conjugado con polímero es un lípido pegilado. La expresión
"lípido pegilado" se refiere a una molécula que comprende tanto una porción de lípido como una porción de polietilenglicol. Se conocen en la técnica lípidos pegilados e incluyen 1-(monometoxipolietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol (PEG-DMG) y similares.
La expresión "lípido neutro" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que existen en una forma zwitteriónica sin carga o neutra a un pH seleccionado. A pH fisiológico, dichos lípidos incluyen, pero sin limitación, fosfatidilcolinas tales como 1,2-Diestearoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-Palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfatidiletanolaminas tales como 1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), esfingomielinas (SM), ceramidas, esteroides tales como esteroles y sus derivados. Los lípidos neutros pueden ser sintéticos o de origen natural.
La expresión "lípido cargado" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que existen en una forma
con carga positiva o negativa independientemente del pH dentro de un intervalo fisiológico útil, por ejemplo, pH ~3 a pH ~9. Los lípidos cargados pueden ser sintéticos o de origen natural. Los ejemplos de lípidos cargados incluyen fosfatidilserinas, ácidos fosfatídicos, fosfatidilgliceroles, fosfatidilinositoles, hemisuccinatos de esterol, dialquil trimetilamoniopropanos, (por ejemplo, DOTAP, DOTMA), dialquil dimetilaminopropanos, etil fosfocolinas, dimetilaminoetano carbamoil esteroles (por ejemplo, DC-Col).
Como se usa en el presente documento, la expresión "solución acuosa" se refiere a una composición que comprende agua.
"Estable en suero" con respecto a nanopartículas de ácido nucleico-lípido significa que el nucleótido no se degrada significativamente después de la exposición a un ensayo en suero o de nucleasa que degradaría significativamente el ADN o el ARN libres. Los ensayos adecuados incluyen, por ejemplo, un ensayo en suero convencional, un ensayo de ADNasa o un ensayo de ARNasa.
"Entrega sistémica", como se usa en el presente documento, se refiere a la entrega de un producto terapéutico que puede dar como resultado una amplia exposición de un agente activo dentro de un organismo. Algunas técnicas de administración pueden conducir a la entrega sistémica de determinados agentes, pero no de otros. La entrega sistémica significa que una cantidad útil, preferentemente terapéutica, de un agente se expone a la mayoría de las partes del cuerpo. La entrega sistémica de nanopartículas lipídicas puede ser por cualquier medio conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, entrega intravenosa, intraarterial, subcutánea e intraperitoneal. Por ejemplo, la entrega sistémica de nanopartículas lipídicas es por entrega intravenosa.
"Entrega local", como se usa en el presente documento, se refiere a la entrega de un agente activo directamente en un sitio diana dentro de un organismo. Por ejemplo, un agente puede entregarse localmente por inyección directa en un sitio patológico tal como un tumor, otro sitio diana tal como un sitio de inflamación, o un órgano diana tal como el hígado, el corazón, el páncreas, el riñón y similares. La entrega local también puede incluir aplicaciones tópicas o técnicas de inyección localizada tales como la inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. La entrega local no excluye un efecto farmacológico sistémico.
"Alquilo" se refiere un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que está saturado o insaturado (es decir, contiene uno o más enlaces dobles y/o triples), que tiene de uno a veinticuatro átomos de carbono (alquilo C1-C24), de uno a doce átomos de carbono (alquilo C1-C12), de uno a ocho átomos de carbono (alquilo C1-C8) o de uno a seis átomos de carbono (alquilo C1-C6) y que está unido al resto de la molécula por un enlace simple, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, 1-metiletilo (isopropilo), n-butilo, npentilo, 1,1-dimetiletilo (t-butilo), 3-metilhexilo, 2-metilhexilo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, penta-1,4-dienilo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la memoria descriptiva, un grupo alquilo está opcionalmente sustituido.
"Cicloalquilo" o "anillo carbocíclico" se refiere a un radical hidrocarbonado monocíclico o policíclico estable no aromático que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que puede incluir sistemas de anillos condensados o unidos, que tiene de tres a quince átomos de carbono, que tiene preferentemente de tres a diez átomos de carbono, y que está saturado o insaturado y unido al resto de la molécula por un enlace simple. Los radicales monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los radicales policíclicos incluyen, por ejemplo, adamantilo, norbornilo, decalinilo, 7,7-dimetilbiciclo[2.2.1]heptanilo y similares. A menos que se indique específicamente lo contrario en la memoria descriptiva, un grupo cicloalquilo está opcionalmente sustituido.
"Heterociclilo" o "anillo heterocíclico" se refiere a un radical de anillo no aromático estable de 3 a 18 miembros que consiste en de dos a doce átomos de carbono y de uno a seis heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. A menos que se indique específicamente otra cosa en la memoria descriptiva, el radical heterociclilo puede ser un sistema de anillos monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas de anillos condensados o unidos; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre del radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidado; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o totalmente saturado. Los ejemplos de dichos radicales heterociclilo incluyen, pero sin limitación, dioxolanilo, tienil[1,3]ditianilo, decahidroisoquinolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, oxazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazolidinilo, quinuclidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrofurilo, tritianilo, tetrahidropiranilo, tiomorfolinilo, tiamorfolinilo, 1-oxo-tiomorfolinilo y 1,1-dioxotiomorfolinilo. A menos que se indique específicamente lo contrario en la memoria descriptiva, un grupo heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido.
El término "sustituido" usado en el presente documento significa cualquiera de los grupos anteriores (por ejemplo, alquilo, cicloalquilo o heterociclilo) en donde al menos un átomo de hidrógeno se reemplaza por un enlace a átomos que no son de hidrógeno tales como, entre otros: un átomo de halógeno, tales como F, Cl, Br e I; grupos oxo (=O); grupos hidroxilo (-OH); grupos alcoxi (-ORa, en donde Ra es alquilo o cicloalquilo C1-C12); grupos carboxilo (-OC(=O)Ra o -C(=O)ORa, en donde Ra es H, alquilo C1-C12 o cicloalquilo); grupos amina (-NRaRb, en donde Ra y Rb son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o cicloalquilo); grupos alquilo C1-C12; y grupos cicloalquilo. El sustituyente puede ser un grupo alquilo C1-C12. El sustituyente puede ser un grupo cicloalquilo. El sustituyente puede ser un grupo de halo, tal como flúor. El sustituyente puede ser un grupo oxo. El sustituyente puede ser un grupo hidroxilo. El sustituyente puede ser un grupo alcoxi. El sustituyente puede ser un grupo carboxilo. El sustituyente puede ser un grupo amina.
"Opcional" u "opcionalmente" (por ejemplo, opcionalmente sustituido) significa que el evento de circunstancias descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye instancias en donde dicho evento o circunstancia ocurre e instancias en las que no ocurre. Por ejemplo, "alquilo opcionalmente sustituido" significa que el radical alquilo puede estar sustituido o no y que la descripción incluye tanto radicales alquilo sustituidos como radicales alquilo que no tienen sustitución.
"Profármaco" pretende indicar un compuesto que puede convertirse en condiciones fisiológicas o mediante solvólisis en un compuesto biológicamente activo. Por tanto, el término "profármaco" se refiere a un precursor metabólico de un compuesto que es farmacéuticamente aceptable. Un profármaco puede estar inactivo cuando se administra a un sujeto que lo necesita, pero se convierte in vivo en un compuesto activo. Los profármacos normalmente se transforman rápidamente in vivo para producir el compuesto original, por ejemplo, mediante hidrólisis en la sangre. El compuesto profármaco a menudo ofrece ventajas de solubilidad, compatibilidad tisular o liberación retardada en un organismo mamífero (véase, Bundgard, H., Design of Prodrugs (1985), págs. 7-9, 21-24 (Elsevier, Ámsterdam)). Se proporciona una discusión de profármacos en Higuchi, T., et al., A.C.S. Serie de simposios, vol. 14, y en Biorreversible Carriers in Drug Design, Ed. Edward B. Roche, Asociación Farmacéutica Estadounidense y Pergamon Press, 1987.
El término "profármaco" también pretende incluir cualquier vehículo unido covalentemente, que libera el compuesto activo in vivo cuando dicho profármaco se administra a un sujeto mamífero. Los profármacos de un compuesto se pueden preparar modificando los grupos funcionales presentes en el compuesto de tal manera que las modificaciones se escindan, ya sea en la manipulación rutinaria o in vivo, en el compuesto original. Los profármacos incluyen compuestos en los que un grupo hidroxi, amino o mercapto está unido a cualquier grupo que, cuando el profármaco del compuesto se administra a un sujeto mamífero, se escinde para formar un grupo hidroxi libre, amino libre o mercapto libre, respectivamente. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados de acetato, formiato y benzoato de alcohol o derivados de amida de grupos funcionales amina en los compuestos y similares. La divulgación también se refiere a compuestos de fórmula (I) como se define a continuación.
La divulgación abarca todos los compuestos farmacéuticamente aceptables del compuesto de Fórmula (I) o (II) que se marcan isotópicamente al tener uno o más átomos reemplazados por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente. Los ejemplos de isótopos que pueden incorporarse en los compuestos divulgados incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor, cloro y yodo, tales como 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F, 36Cl, 123I y 125I, respectivamente. Estos compuestos radiomarcados podrían ser útiles para ayudar a determinar o medir la eficacia de los compuestos, caracterizando, por ejemplo, el sitio o el modo de acción, o la afinidad de unión con el sitio de acción farmacológicamente importante. Determinados compuestos isotópicamente marcados de estructura (I) o (II), por ejemplo, aquellos que incorporan un isótopo radioactivo3 son útiles en estudios de distribución tisular de fármaco y/o sustrato. Los isótopos radioactivos tritio, es decir, 3H, y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente útiles para este fin en vista de su facilidad de incorporación y de los medios de detección disponibles.
La sustitución por isótopos más pesados tales como deuterio, es decir, 2H, puede ofrecer determinadas ventajas terapéuticas derivadas de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o necesidades de dosis reducidas y, por tanto, puede preferirse en algunas circunstancias.
11 1 q 1 r n
La sustitución con isótopos de emisión de positrones, tales como C, F, O y N, puede resultar útil en estudios de Topografía de Emisión de Positrones (PET) para examinar la ocupación del receptor de sustrato. Los compuestos marcados isotópicamente de estructura (I) o (II) pueden prepararse generalmente mediante técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia o mediante procesos análogos a los descritos en las Preparaciones y Ejemplos que se exponen a continuación usando un reactivo marcado isotópicamente adecuado en lugar del reactivo no marcado empleado previamente.
Por "compuesto estable" y "estructura estable" se entiende un compuesto que es suficientemente robusto como para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción y a su formulación en un agente terapéutico eficaz.
"Mamífero" incluye seres humanos y tanto animales domésticos, tales como animales de laboratorio y mascotas domésticas (por ejemplo, gatos, perros, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, conejos), como animales no domésticos tales como vida silvestre y similares.
"Vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente" incluye, sin limitación, cualquier adyuvante, vehículo, excipiente, sustancia de deslizamiento, agente edulcorante, diluyente, conservante, tinte/colorante, potenciador de aroma, tensioactivo, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, estabilizante, agente isotónico, disolvente o emulsionante que haya sido aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos como aceptable para su uso en seres humanos o animales domésticos.
"Sal farmacéuticamente aceptable" incluye sales de adición de ácido y sales de adición de base.
"Sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia y las propiedades biológicas de las bases libres, que no son biológicamente o de otra forma no deseables y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, pero sin limitación, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como, pero sin limitación, ácido acético, ácido 2,2-didoroacético, ácido adípico, ácido algínico, ácido ascórbico, ácido aspártico, ácido bencenosulfónico, ácido benzoico, ácido 4-acetamidobenzoico, ácido alcanfórico, ácido alcanfor-10-sulfónico, ácido cáprico, ácido caproico, ácido caprílico, ácido carbónico, ácido cinámico, ácido cítrico, ácido ciclámico, ácido dodecilsulfúrico, ácido etano-1,2-disulfónico, ácido etanosulfónico, ácido 2-hidroxietanosulfónico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido galactárico, ácido gentísico, ácido glucoheptónico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido glutámico, ácido glutárico, ácido 2-oxo-glutárico, ácido glicerofosfórico, ácido glicólico, ácido hipúrico, ácido isobutírico, ácido láctico, ácido lactobiónico, ácido láurico, ácido málcico, ácido málico, ácido malónico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido múcico, ácido naftaleno-1,5-disulfónico, ácido naftaleno-2-sulfónico, ácido 1-hidroxi-2-naftoico, ácido nicotínico, ácido oleico, ácido orótico, ácido oxálico, ácido palmítico, ácido pamoico, ácido propiónico, ácido piroglutámico, ácido pirúvico, ácido salicílico, ácido 4-aminosalicílico, ácido sebácico, ácido esteárico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido tiociánico, ácido p-toluenosulfónico, ácido trifluoroacético, ácido undecilénico y similares.
"Sales de adición de base farmacéuticamente aceptables" se refiere a aquellas sales que conservan la eficacia y las propiedades biológicas de los ácidos libres, que no son biológicamente o de otra forma no deseables. Estas sales se preparan a partir de la adición de una base inorgánica o una base orgánica al ácido libre. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen, pero sin limitación, las sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso y aluminio y similares. Son sales inorgánicas preferidas las sales de amonio, sodio, potasio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas incluyen, pero sin limitación, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como resinas de amoníaco, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, dietanolamina, etanolamina, deanol, 2-dimetilaminoetanol, 2-dietilaminoetanol, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, benetamina, benzatina, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, trietanolamina, trometamina, purinas, piperazina, piperidina, /V-etilpiperidina, poliamina y similares. Son bases orgánicas particularmente preferidas isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetilamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.
Con frecuencia las cristalizaciones producen un solvato del compuesto de la invención. Como se usa en el presente documento, el término "solvato" se refiere a un agregado que comprende una o más moléculas de un compuesto de la invención con una o más moléculas de disolvente. El disolvente puede ser agua, en cuyo caso el solvato puede ser un hidrato. Como alternativa, el disolvente puede ser un disolvente orgánico. Por tanto, los compuestos de la presente invención pueden existir como un hidrato, incluyendo un monohidrato, dihidrato, hemihidrato, sesquihidrato, trihidrato, tetrahidrato y similares, así como las correspondientes formas solvatadas. El compuesto de la invención puede ser un solvato verdadero, mientras que en otros casos, el compuesto de la invención puede simplemente retener agua adventicia o ser una mezcla de agua más algún disolvente adventicio.
Una "composición farmacéutica" se refiere a la formulación de un compuesto de la invención y un medio generalmente aceptado en la técnica para la entrega del compuesto biológicamente activo a mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Un medio de este tipo incluye todos los vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables para ello.
"Cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto de la invención que, cuando se administra a un mamífero, preferentemente un ser humano, es suficiente para efectuar el tratamiento en el mamífero, preferentemente un ser humano. La cantidad de una nanopartícula lipídica de la invención que constituye una "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo del compuesto, la afección y su gravedad, la forma de administración y la edad del mamífero que ha de tratarse, pero puede determinarse rutinariamente por un experto habitual en la materia teniendo en cuenta su propio conocimiento y la presente divulgación.
"Tratamiento" o "tratamiento" como se usa en el presente documento abarca el tratamiento de la enfermedad o afección de interés en un mamífero, preferentemente un ser humano, que tiene la enfermedad o afección de interés, e incluye:
(i) prevenir que la enfermedad o afección se produzca en un mamífero, en particular, cuando dicho mamífero está predispuesto a la afección pero aún no se le ha diagnosticado;
(ii) inhibir la enfermedad o afección, es decir, deterner su desarrollo;
(iii) aliviar la enfermedad o afección, es decir, provocar una regresión de la enfermedad o afección; o
(iv) aliviar los síntomas resultantes de la enfermedad o afección, es decir, aliviar el dolor sin abordar la enfermedad o afección subyacente. Como se usan en el presente documento, los términos "enfermedad" y "afección" pueden usarse indistintamente o pueden ser diferentes en el sentido de que la enfermedad o afección concreta puede no tener un agente causal conocido (de manera que aún no se ha determinado su etiología) y, por tanto, no se reconoce aún como una enfermedad sino solamente como una afección o síndrome no deseable, en donde los médicos han identificado un conjunto más o menos específico de síntomas.
Los compuestos de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables, pueden contener uno o más centros asimétricos y pueden, por tanto, originar enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estequiometría absoluta, como (R)- o (S)- o, como (D)- o (L)- para los aminoácidos.
La presente invención pretende incluir todos esos isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras. Pueden prepararse isómeros (R)- y (S)-, o (D)- y (L)-, ópticamente activos (+) y (-), usando sintones quirales o reactivos quirales, o pueden resolverse usando técnicas convencionales, por ejemplo, cromatografía y cristalización fraccionada. Las técnicas convencionales para la preparación/aislamiento de enantiómeros individuales incluyen la síntesis quiral a partir de un precursor ópticamente puro adecuado o la resolución del racemato (o el racemato de una sal o derivado) usando, por ejemplo, cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC) quiral. Cuando los compuestos que se describen en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica y, a menos que se especifique otra cosa, se pretende que los compuestos incluyan los isómeros geométricos tanto E como Z. Análogamente, también se pretende incluir todas las formas tautoméricas. Un "estereoisómero" se refiere a un compuesto constituido por los mismos átomos unidos por los mismos enlaces pero que tienen estructuras tridimensionales diferentes, que no son intercambiables. La presente invención contempla diversos estereoisómeros y mezclas de los mismos e incluye "enantiómeros", que se refiere a dos estereoisómeros cuyas moléculas son imágenes especulares no superponibles entre sí.
Un "tautómero" se refiere a un desplazamiento de protón de un átomo de una molécula a otro átomo de la misma molécula. La presente invención incluye tautómeros de cualquiera de dichos compuestos.
Compuestos
En un aspecto, la invención proporciona nuevos compuestos lipídicos que son capaces de combinarse con otros componentes lipídicos tales como lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides y/o lípidos conjugados con polímero para formar nanopartículas lipídicas con oligonucleótidos. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que estas nanopartículas lipídicas protegen a los oligonucleótidos de la degradación en el suero y proporcionan una entrega eficaz de oligonucleótidos a células in vitro e in vivo.
La divulgación se refiere a compuestos lipídicos que tienen la estructura de fórmula (I):
Figure imgf000013_0001
o una sal, tautómero, profármaco o estereoisómero farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde:
L1 y L2 son cada uno independientemente -O(C=O)-, -(C=O)O- o un doble enlace carbono-carbono;
R1a y R1b son, en cada aparición, independientemente (a) H o alquilo C1-C12, o (b) R1a es H o alquilo C1-C12, y R1b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R1b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono;
R2a y R2b son, en cada aparición, independientemente (a) H o alquilo C1-C12, o (b) R2a es H o alquilo C1-C12, y R2b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R2b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono;
R3a y R3b son, en cada aparición, independientemente, ya sea (a) H o alquilo C1-C12, o (b) R3a es H o alquilo C1-C12, y R3b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R3b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono;
R4a y R4b son, en cada aparición, independientemente, ya sea (a) H o alquilo C1-C12, o (b) R4a es H o alquilo C1-C12, y R4b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R4b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono;
R5 y R6 son cada uno independientemente metilo o cicloalquilo;
R7 es, en cada aparición, independientemente H o alquilo C1-C12;
R8 y R9 son cada uno independientemente alquilo C1-C12 sin sustituir; o R8 y R9, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 5, 6 o 7 miembros que comprende un átomo de nitrógeno; a y d son cada uno independientemente un número entero de 0 a 24;
b y c son cada uno independientemente un número entero de 1 a 24 y
e es 1 o 2.
Por ejemplo, en la Fórmula (I) al menos uno de R 1a , R 2a , R 3a o R 4a es alquilo C1-C12, o al menos uno de L 1 o L 2 es -O(C=O)- o -(C=O )O-. Alternativamente, R1a y R1b no son isopropilo cuando a es 6 o n-butilo cuando a es 8.
Aún en otras divulgaciones, al menos uno de R 1a , R 2a , R 3a o R 4a es alquilo Ci-C 12 , o al menos uno de L 1 o 2 L es -O(C=O)- o -(C=O)O -; y
R1a y R1b no son isopropilo cuando a es 6 o n-butilo cuando a es 8.
En el compuesto de Fórmula I, cualquiera de L1 o L2 puede ser -O(C=O)- o un doble enlace carbono-carbono. L1 y L2 pueden ser cada uno -O(C=O)- o pueden ser cada uno un doble enlace carbono-carbono.
En algunas divulgaciones, uno de L1 o L2 es -O(C=O)-. En otras divulgaciones, tanto L1 como L2 son -O(C=O)-. En algunas divulgaciones, uno de L1 o L2 es -(C=O)O-. En otras divulgaciones, tanto L1 como L2 son -(C=O)O-. En algunas divulgaciones, uno de L1 o L2 es un doble enlace carbono-carbono. En otras divulgaciones, tanto L1 como L2 son un doble enlace carbono-carbono.
Aún en otras divulgaciones, uno de L1 o L2 es -O(C=O)- y el otro de L1 o L2 es -(C=O)O-. En otras divulgaciones, uno de L1 o L2 es -O(C=O)- y el otro de L1 o L2 es un doble enlace carbono-carbono. En aún más divulgaciones, uno de L1 o L2 es -(C=O)O- y el otro de L1 o L2 es un doble enlace carbono-carbono.
Se entiende que el doble enlace "carbono-carbono" se refiere a una de las siguientes estructuras:
Figure imgf000014_0001
o
en donde Ra y Rb son, en cada aparición, independientemente H o un sustituyente. Por ejemplo, en algunas realizaciones Ra y Rb son, en cada aparición, independientemente H, alquilo C1-C12 o cicloalquilo, por ejemplo H o alquilo C1-C12.
Los compuestos lipídicos desvelados en el presente documento pueden tener la siguiente estructura (la):
Figure imgf000014_0002
o la siguiente estructura (Ib):
Figure imgf000014_0003
o la siguiente estructura (Ic):
Figure imgf000015_0001
En determinadas divulgaciones de lo anterior, a, b, c y d son cada uno independientemente un numero entero de 2 a 12 o un número entero de 4 a 12. En otras divulgaciones, a, b, c y d son cada uno independientemente un número entero de 8 a 12 o de 5 a 9. En algunas divulgaciones determinadas, a es 0. En algunas divulgaciones, a es 1. En otras divulgaciones, a es 2. En más divulgaciones, a es 3. En otras divulgaciones más, a es 4. En algunas divulgaciones, a es 5. En otras divulgaciones, a es 6. En más divulgaciones, a es 7. En otras divulgaciones más, a es 8. En algunas divulgaciones, a es 9. En otras divulgaciones, a es 10. En más divulgaciones, a es 11. En otras divulgaciones más, a es 12. En algunas divulgaciones, a es 13. En otras divulgaciones, a es 14. En más divulgaciones, a es 15. En otras divulgaciones más, a es 16.
En algunas divulgaciones, b es 1. En otras divulgaciones, b es 2. En más divulgaciones, b es 3. Aún en otras divulgaciones, b es 4. En algunas divulgaciones, b es 5. En otras divulgaciones, b es 6. En más divulgaciones, b es 7. En otras divulgaciones más, b es 8. En algunas divulgaciones, b es 9. En otras divulgaciones, b es 10. En más divulgaciones, b es 11. En otras divulgaciones más, b es 12. En algunas divulgaciones, b es 13. En otras divulgaciones, b es 14. En más divulgaciones, b es 15. En otras divulgaciones, b es 16.
En algunas divulgaciones, C es 1. En otras divulgaciones, c es 2. En más divulgaciones, c es 3. Aún en otras divulgaciones, c es 4. En algunas divulgaciones, c es 5. En otras divulgaciones, c es 6. En más divulgaciones, c es 7. En otras divulgaciones más, c es 8. En algunas divulgaciones, c es 9. En otras divulgaciones, c es 10. En más divulgaciones, c es 11. En otras divulgaciones más, c es 12. En algunas divulgaciones, c es 13. En otras divulgaciones, c es 14. En más divulgaciones, c es 15. En otras divulgaciones, c es 16.
En algunas divulgaciones determinadas, d es 0. En algunas divulgaciones, d es 1. En otras divulgaciones, d es 2. En más divulgaciones, d es 3. En otras divulgaciones más, d es 4. En algunas divulgaciones, d es 5. En otras divulgaciones, d es 6. En más divulgaciones, d es 7. En otras divulgaciones más, d es 8. En algunas divulgaciones, d es 9. En otras divulgaciones, d es 10. En más divulgaciones, d es 11. En otras divulgaciones más, d es 12. En algunas divulgaciones, d es 13. En otras divulgaciones, d es 14. En más divulgaciones, d es 15. En otras divulgaciones más, d es 16.
En algunas otras divulgaciones diversas, a y d son iguales. En algunas otras divulgaciones, b y c son iguales. En algunas otras divulgaciones específicas a y d son iguales, y b y c son iguales.
La suma de a y b y la suma de c y d son factores que pueden variarse para producir un lípido que tenga las propiedades deseadas. En una divulgación, a y b se eligen de manera que su suma sea un número entero que varíe de 14 a 24. En otras divulgaciones, c y d se eligen de manera que su suma sea un número entero que varíe de 14 a 24. En una divulgación adicional, la suma de a y b y la suma de c y d son iguales. Por ejemplo, en algunas divulgaciones la suma de a y b y la suma de c y d son ambas el mismo entero que puede variar de 14 a 24. En aún más divulgaciones, a, b, c y d se seleccionan de manera que la suma de a y b y la suma de c y d sea 12 o más. En algunas divulgaciones, e es 1. En otras divulgaciones, e es 2.
Los sustituyentes en R , R , R y R no se limitan particularmente. En determinadas divulgaciones R , R , R y R4a son H en cada aparición. En algunas otras divulgaciones al menos uno de entre R1a, R2a, R3a y R4a es alquilo C1-C12. En algunas otras divulgaciones al menos uno de entre R1a, R2a, R3a y R4a es alquilo C1-C8. En algunas otras divulgaciones al menos uno de entre R1a, R2a, R3a y R4a es alquilo C1-C6. En algunas de las divulgaciones anteriores, el alquilo C1-C8 es metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, tere-butilo, n-hexilo o n-octilo.
En determinadas divulgaciones de lo anterior, R1a, R1b, R4a y R4b son alquilo C1-C12 en cada aparición.
En divulgaciones adicionales de lo anterior, al menos uno de entre R1b, R2b, R3b y R4b es H o R1b, R2b, R3b y R4b son H en cada aparición.
En determinadas divulgaciones de lo anterior, R1b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R1b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono. En otras divulgaciones de lo anterior, R4b junto con el átomo de carbono al que está unido se toma junto con un R4b adyacente y el átomo de carbono al que está unido para formar un doble enlace carbono-carbono.
Los sustituyentes en R5 y R6 no se limitan particularmente en las divulgaciones anteriores. En determinadas divulgaciones, uno o ambos de R5 o R6 es metilo. En algunas otras divulgaciones, uno o ambos de R5 o R6 es cicloalquilo, por ejemplo, ciclohexilo. En estas divulgaciones, el cicloalquilo puede estar sustituido o sin sustituir. En algunas otras divulgaciones, el cicloalquilo está sustituido con alquilo C1-C12, por ejemplo, tere-butilo.
Los sustituyentes en R7 no se limitan particularmente en las divulgaciones anteriores. En determinadas divulgaciones, al menos un R7 es H. En otras divulgaciones, R7 es H en cada aparición. En algunas otras divulgaciones, R7 es alquilo C1-C12.
En algunas otras de las divulgaciones anteriores, uno de entre R8 o R9 es metilo. En otras divulgaciones, tanto R 8 como R9 son metilo.
En algunas divulgaciones diferentes, R8 y R9, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 5, 6 o 7 miembros. En algunas divulgaciones de lo anterior, R8 y R9, junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos, forman un anillo heterocíclico de 5 miembros, por ejemplo, un anillo de pirrolidinilo. En divulgaciones adicionales del compuesto de Fórmula (I), el compuesto tiene una de las estructuras que se exponen en la Tabla 1 a continuación.
Tabla 1
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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(continuación)
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Se entiende que cualquiera de los compuestos de Fórmula (I), como se establece anteriormente, y cualquier sustituyente específico y/o variable en el compuesto de Fórmula (I), como se establece anteriormente, pueden combinarse independientemente con otras divulgaciones y/o sustituyentes y/o variables de compuestos de Fórmula (I).
Se entiende que en la presente descripción, las combinaciones de sustituyentes y/o variables de las fórmulas representadas son permisibles solo si dichas contribuciones dan como resultado compuestos estables.
Se entiende que los siguientes compuestos no están incluidos dentro del alcance de la invención:
Figure imgf000023_0002
Los compuestos de la presente invención tienen la siguiente estructura (II):
Figure imgf000023_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable, tautómero o estereoisómero del mismo, en donde:
Ra y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo saturada, lineal, que contiene de 12 a 36 átomos de carbono, y z tiene un valor medio que varía de 30 a 60.
En algunas de las realizaciones anteriores del lípido pegilado (II), R10 y R11 no son ambos n-octadecilo cuando z es 42.
En algunas realizaciones, R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 12 átomos de carbono. En algunas realizaciones, cada uno de R10 y R11 es independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 14 átomos de carbono. En otras realizaciones, R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 16 átomos de carbono.
Aún en otras realizaciones, R10 es una cadena de alquilo saturada lineal que contiene 12 átomos de carbono y R11 es una cadena de alquilo saturada lineal que contiene 14 átomos de carbono.
En algunas realizaciones, el z promedio es 45.
En otras realizaciones, el lípido pegilado tiene una de las siguientes estructuras:
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También se proporcionan composiciones que comprenden (II) y un lípido catiónico. El lípido catiónico se puede seleccionar de cualquier lípido catiónico. En varias realizaciones, el lípido catiónico es un compuesto que tiene la estructura (I) como se describe anteriormente, que incluye cualquiera de las subestructuras y compuestos específicos de la Tabla 1.
Las composiciones pueden comprender un agente terapéutico y uno o más excipientes seleccionados entre lípidos neutros, esteroides y lípidos pegilados. También se incluyen otros excipientes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables en diversas realizaciones de las composiciones.
En determinadas realizaciones, el agente terapéutico comprende un ácido nucleico, por ejemplo, un oligonucleótido antisentido o ARN mensajero. En algunas realizaciones, el lípido neutro se selecciona entre DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE y SM. En diversas realizaciones, la relación molar entre el compuesto y el lípido neutro varía de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 8:1.
En diversas realizaciones, las composiciones comprenden además un esteroide o un análogo de esteroide. En determinadas realizaciones, el esteroide o análogo de esteroide es colesterol. En algunas de estas realizaciones, la relación molar entre el compuesto y el colesterol varía de aproximadamente 2:1 a 1:1.
En algunas realizaciones de la composición anterior, el agente terapéutico comprende un ácido nucleico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el ácido nucleico se selecciona entre antisentido, ADN plasmídico y ARN mensajero.
Con fines de administración, los compuestos de la presente divulgación (normalmente en forma de nanopartículas lipídicas en combinación con un agente terapéutico) pueden administrarse como un producto químico en bruto o pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Las composiciones farmacéuticas comprenden un compuesto de Fórmula (I) y uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El compuesto de Fórmula (I) está presente en la composición en una cantidad que es eficaz para formar una nanopartícula lipídica y entregar el agente terapéutico, por ejemplo, para el tratamiento de una enfermedad o afección particular de interés. Un experto en la materia puede determinar fácilmente las concentraciones y dosis adecuadas.
La administración de las composiciones de la invención puede realizarse a través de cualquiera de los modos de administración aceptados de agentes que sirvan para utilidades similares. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse en preparaciones en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, suspensiones, supositorios, inyecciones, inhaladores, geles, microesferas y aerosoles. Las vías típicas de administración de dichas composiciones farmacéuticas incluyen, sin limitación, oral, tópica, transdérmica, por inhalación, parenteral, sublingual, bucal, rectal, vaginal e intranasal. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraesternal o técnicas de infusión. Las composiciones farmacéuticas de la invención se formulan de manera que los principios activos contenidos en ellas estén biodisponibles tras la administración de la composición a un paciente. Las composiciones que se administrarán a un sujeto o paciente toman la forma de una o más unidades de dosificación, donde, por ejemplo, un comprimido puede ser una unidad de dosificación única, y un recipiente de un compuesto de la invención en forma de aerosol puede contener una pluralidad de unidades de dosificación. Los expertos en esta materia conocen métodos reales de preparación de dichas formas farmacéuticas, o les resultan evidentes; por ejemplo, véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edición (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000). La composición que ha de administrarse, en cualquier caso, contendrá una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el tratamiento de una enfermedad o afección de interés de acuerdo con las enseñanzas de la presente divulgación.
La composición farmacéutica de la invención puede estar en forma de un sólido o líquido. En un aspecto, el vehículo o vehículos son partículas, de manera que las composiciones estén, por ejemplo, en forma de comprimido o polvo. El vehículo o vehículos pueden ser líquidos, siendo las composiciones, por ejemplo, un jarabe oral, un líquido inyectable o un aerosol, que es útil en, por ejemplo, la administración por inhalación.
Cuando se destina a la administración oral, la composición farmacéutica está preferentemente en forma sólida o líquida, donde las formas semisólidas, semilíquidas, en suspensión y en gel se incluyen dentro de las formas consideradas en el presente documento sólidas o líquidas.
Como composición sólida para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse en forma de polvo, gránulo, comprimido por compresión, píldora, cápsula, chicle u oblea y similares. Una composición sólida de este tipo normalmente contendrá uno o más diluyentes inertes o vehículos comestibles. Además, puede estar presente uno o más de los siguientes: aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, etilcelulosa, celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; excipientes tales como almidón, lactosa o dextrinas, agentes disgregantes tales como ácido algínico, alginato de sodio, Primogel, almidón de maíz y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio o Sterotex; sustancias de deslizamiento tales como dióxido de silicio coloidal; agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina; un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma a naranja; y un agente colorante.
Cuando la composición farmacéutica está en forma de cápsula, por ejemplo, una cápsula de gelatina, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un vehículo líquido tal como polietilenglicol o aceite.
La composición farmacéutica puede estar en forma de líquido, por ejemplo, un elixir, jarabe, solución, emulsión o suspensión. El líquido puede ser para la administración oral o para la entrega por inyección, como dos ejemplos. Cuando se destina a la administración oral, las composiciones preferidas contienen, además de los presentes compuestos, uno o más de entre un agente edulcorante, conservantes, tinte/colorante y potenciador del aroma. En una composición destinada a ser administrada por inyección, puede incluirse uno o más de entre un tensioactivo, conservante, agente humectante, agente dispersante, agente de suspensión, tampón, estabilizante y agente isotónico.
Las composiciones farmacéuticas líquidas de la invención, ya sean soluciones o suspensiones, pueden incluir uno o más de los siguientes adyuvantes: diluyentes estériles tales como agua para inyecciones, suero salino, preferentemente solución salina fisiológica, solución de Ringer, cloruro de sodio isotónico, aceites no volátiles tales como mono o diglicéridos sintéticos que pueden servir como disolvente o medio de suspensión, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabeno; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como el ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa; agentes que actúan como crioprotectores tales como sacarosa o trehalosa. La preparación parenteral puede estar encerrada en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico. La solución salina fisiológica es un adyuvante preferido. Una composición farmacéutica inyectable es preferentemente estéril.
Una composición farmacéutica líquida de la invención destinada a la administración parenteral u oral debe contener una cantidad de un compuesto de la invención de manera que se obtenga una dosis adecuada.
La composición farmacéutica de la invención puede estar destinada a la administración tópica, en cuyo caso el vehículo puede comprender adecuadamente una solución, emulsión, pomada o base de gel. La base, por ejemplo, puede comprender uno o más de los siguientes: vaselina, lanolina, polietilenglicoles, cera de abeja, aceite mineral, diluyentes tales como agua y alcohol, y emulsionantes y estabilizadores. Puede haber presentes agentes espesantes en una composición farmacéutica de administración tópica. Si está destinada a la administración transdérmica, la composición puede incluir un parche transdérmico o un dispositivo de iontoforesis.
La composición farmacéutica de la invención puede estar destinada a la administración rectal, en forma, por ejemplo, de un supositorio, que se derretirá en el recto y liberará el fármaco. La composición para la administración rectal puede contener una base oleaginosa como excipiente no irritante adecuado. Dichas bases incluyen, sin limitación, lanolina, manteca de cacao y polietilenglicol.
La composición farmacéutica de la invención puede incluir diversos materiales, que modifican la forma física de una unidad de dosificación sólida o líquida. Por ejemplo, la composición puede incluir materiales que formen una capa de recubrimiento alrededor de los principios activos. Los materiales que forman la capa de recubrimiento son normalmente inertes, y pueden seleccionarse entre, por ejemplo, azúcar, goma laca y otros agentes de recubrimiento entérico. Como alternativa, los principios activos pueden estar encerrados en una cápsula de gelatina. La composición farmacéutica de la invención en forma sólida o líquida puede incluir un agente que se una al compuesto de la invención y, de este modo, ayude a la entrega del compuesto. Los agentes adecuados que pueden actuar con esta capacidad incluyen un anticuerpo monoclonal o policlonal, o una proteína.
La composición farmacéutica de la invención puede consistir en unidades de dosificación que pueden administrarse en forma de aerosol. El término aerosol se usa para designar una diversidad de sistemas que varían desde los de naturaleza coloidal hasta los sistemas que consisten en envases presurizados. La entrega puede ser mediante un gas licuado o comprimido o mediante un sistema de bomba adecuado que dispense los principios activos. Los aerosoles de los compuestos de la invención pueden entregarse en sistemas monofásicos, bifásicos o trifásicos con el fin de entregar el o los principios activos. La entrega del aerosol incluye el recipiente necesario, activadores, válvulas, subrecipientes y similars, que juntos pueden formar un kit. Un experto en la materia, puede determinar sin experimentación indebida los aerosoles preferidos.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden prepararse mediante una metodología bien conocida en la técnica farmacéutica. Por ejemplo, una composición farmacéutica destinada a ser administrada por inyección puede prepararse combinando las nanopartículas lipídicas de la invención con agua destilada estéril u otro vehículo para formar una solución. Puede añadirse un tensioactivo para facilitar la formación de una solución o suspensión homogénea. Los tensioactivos son compuestos que interactúan de forma no covalente con el compuesto de la invención para facilitar la disolución o suspensión homogénea del compuesto en el sistema de entrega acuoso. Las composiciones de la invención, o sus sales farmacéuticamente aceptables, se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz, que variará en función de una diversidad de factores, incluyendo la actividad del agente terapéutico específico empleado; la estabilidad metabólica y la duración de la acción del agente terapéutico; la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del paciente; el modo y el momento de administración; la tasa de excreción; la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o afección particular; y el sujeto que se somete a la terapia.
Las composiciones de la invención también pueden administrarse simultáneamente con, antes o después de la administración de uno o más agentes terapéuticos. Dicha terapia de combinación incluye la administración de una única formulación de dosificación farmacéutica de una composición de la invención y uno o más agentes activos adicionales, así como la administración de la composición de la invención y cada agente activo en su propia formulación de dosificación farmacéutica. Por ejemplo, una composición de la invención y el otro agente activo pueden administrarse al paciente juntos en una única composición de dosificación oral tal como un comprimido o cápsula, o cada agente se administra en formulaciones de dosificación oral separadas. Cuando se usan formulaciones de dosificación separadas, los compuestos de la invención y uno o más agentes activos adicionales pueden administrarse esencialmente al mismo tiempo, es decir, simultáneamente, o en momentos escalonados por separado, es decir, secuencialmente; se entiende que la terapia de combinación incluye todas estas pautas posológicas.
Se describen a continuación en el presente documento métodos de preparación para los compuestos y composiciones anteriores y/o se conocen en la técnica.
Los expertos en la materia apreciarán que en el proceso que se describe en el presente documento puede ser necesario proteger los grupos funcionales de los compuestos intermedios mediante grupos protectores adecuados. Dichos grupos funcionales incluyen hidroxi, amino, mercapto y ácido carboxílico. Los grupos protectores adecuados para hidroxi incluyen trialquilsililo o diarilalquilsililo (por ejemplo, t-butildimetilsililo, t-butildifenilsililo o trimetilsililo), tetrahidropiranilo, bencilo y similares. Los grupos de protección adecuados para amino, amidino y guanidino incluyen t-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo y similares. Los grupos de protección adecuados para mercapto incluyen -C(O)-R" (donde R" es alquilo, arilo o arilalquilo), p-metoxibencilo, tritilo y similares. Los grupos protectores adecuados para el ácido carboxílico incluyen alquilo, ésteres de arilo o arilalquilo. Pueden añadirse o retirarse grupos protectores de acuerdo con técnicas convencionales, que los expertos en la materia conocen y que se describen en el presente documento. El uso de los grupos protectores se describe en detalle en Green, T.W. y P.G.M. Wutz, Protective Groups in Organic Synthesis (1999), 3a ed., Wiley. Como apreciará un experto en la materia, el grupo protector también puede ser una resina polimérica como una resina Wang, resina Rink o una resina de cloruro de 2-clorotritilo. Los expertos en la materia también apreciarán que, aunque tales derivados protegidos de los compuestos de esta invención pueden no poseer actividad farmacológica como tales, pueden administrarse a un mamífero y después metabolizarse en el cuerpo para formar compuestos que son farmacológicamente activos. Por lo tanto, tales derivados pueden describirse como "profármacos".
Además, todos los compuestos de la invención que existen en forma de base o ácido libre pueden convertirse en sus sales farmacéuticamente aceptables mediante tratamiento con la base o el ácido inorgánicos u orgánicos adecuados mediante métodos conocidos por un experto en la materia. Las sales de los compuestos de la invención pueden convertirse en su forma de base o de ácido libre mediante técnicas convencionales.
El siguiente Esquema de Reacción ilustra métodos para preparar compuestos de fórmula (I):
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en donde R1a, R1b, R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, R1b, R5, R6, R7, R8, R9, a, b, c, d y e son como se definen en el presente documento. Se entiende que un experto en la materia puede ser capaz de preparar estos compuestos mediante métodos similares o combinando otros métodos conocidos por un experto en la materia. También se entiende que un experto en la materia sería capaz de preparar, de manera similar a la que se describe a continuación, otros compuestos de Fórmula (I) que no se ilustran específicamente a continuación, mediante el uso de los componentes de partida adecuados y modificando los parámetros de la síntesis según sea necesario. En general, pueden obtenerse componentes de partida de fuentes tales como Sigma Aldrich, Lancaster Synthesis, Inc., Maybridge, Matrix Scientific, TCI y Fluorochem USA, etc. o bien pueden sintetizarse de acuerdo con fuentes conocidas por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5a edición (Wiley, diciembre de 2000)) o pueden prepararse como se describe en la presente invención.
ESQUEMA GENERAL DE REACCION 1
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El compuesto de estructura (I) (por ejemplo, el compuesto A-5) se puede preparar de acuerdo con el Esquema de reacción general 1 ("Método A"), en donde R es un alquilo C1-C24 saturado o insaturado o un cicloalquilo saturado o insaturado, m es 0 o 1 y n es un número entero de 1 a 24. Con referencia al Esquema de reacción general 1, los compuestos de estructura A-1 pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse de acuerdo con métodos familiares para un experto en la materia. Una mezcla de A-1, A-2 y DMAP se trata con DCC para dar el bromuro A-3. Una mezcla del bromuro A-3, una base (por ejemplo, N,N-diisopropiletilamina) y la N,N-dimetildiamina A-4 se calienta a una temperatura y tiempo suficientes para producir A-5 después de cualquier tratamiento necesario y o etapa de purificación.
ESQUEMA DE REACCIÓN GENERAL 2
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El compuesto de estructura (I) (por ejemplo, B-5) puede prepararse de acuerdo con el Esquema de Reacción General 2 ("Método B"), en donde R es un alquilo C1-C24 saturado o insaturado o cicloalquilo saturado o insaturado, m es 0 o 1 y n es un número entero de 1 a 24. Como se muestra en el Esquema de Reacción General, los compuestos de estructura B-1 pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse de acuerdo con métodos familiares para los expertos habituales en la materia. Una solución de B-1 (1 equivalente) se trata con cloruro de ácido B-2 (1 equivalente) y una base (por ejemplo, trietilamina). El producto en bruto se trata con un agente oxidante (por ejemplo, clorocromato de piridinio) y se recupera el producto intermedio B-3. Una solución de B-3 en bruto, un ácido (por ejemplo, ácido acético) y N,N-dimetilamina B-4 se trata después con un agente reductor (por ejemplo, triacetoxiborohidruro de sodio) para producir B-5 después de cualquier tratamiento y/o purificación necesarios.
Cabe señalar que aunque los materiales de partida A-1 y B-1 se describen anteriormente como que incluyen solo carbonos de metileno saturados, los materiales de partida que incluyen dobles enlaces carbono-carbono también pueden emplearse para la preparación de compuestos que incluyen dobles enlaces carbono-carbono.
ESQUEMA DE REACCIÓN GENERAL 3
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El compuesto de estructura (I) (por ejemplo., compuesto C-7 o C9) se puede preparar de acuerdo con el Esquema de reacción general 3 ("Método C"), en donde R es un alquilo C1-C24 saturado o insaturado o cicloalquilo saturado o insaturado, m es 0 o 1 y n es un número entero de 1 a 24. Haciendo referencia al Esquema de reacción general 3, los compuestos de estructura C-1 pueden adquirirse de fuentes comerciales o prepararse de acuerdo con métodos familiares para un experto en la materia.
Los siguientes ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no de limitación.
Ejemplo 1 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 1
Se preparó Compuesto 1 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de octano-1,8-diol (9,8 g) en cloruro de metileno (100 ml) y tetrahidrofurano (60 ml) se trató con cloruro de 2-etilhexanoílo (10 g). Se añadió lentamente trietilamina (15 ml) y la solución se agitó durante tres días. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se lavó con salmuera (2x). La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El producto en bruto se filtró a través de gel de sílice (20 g) usando cloruro de metileno, produciendo 15,8 g de producto en bruto. El aceite resultante se disolvió en cloruro de metileno (100 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (13 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (400 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (77 g) usando un gradiente de acetato de etilo/hexano (0-6 %). Se recuperó 8-O-(2'-etilhexanoiloxi)octanal (6,7 g) en forma de un aceite.
Una solución de 8-O-(2'-etilhexanoiloxi)octanal (6,7 g), ácido acético (25 gotas) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,54 g) en cloruro de metileno (40 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (1,5 g) durante la noche. La solución se lavó con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, seguido de salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de metanol/cloruro de metileno (0-10 %), seguida de una segunda columna (20 g), para producir el compuesto 1 (1 g) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo 2 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 2
Se preparó Compuesto 2 de acuerdo con el método A de la siguiente manera:
En una atmósfera de argón, a un matraz de fondo redondo cargado con fitol (593 mg, 2 mmol), ácido 6-bromohexanoico (780 mg, 4 mmol) y 4-(dimetilamino)piridina (60 mg) en diclorometano (20 ml) se añadió diciclohexilcarbodiimida (908 mg, 4,4 mmol). El precipitado se descartó por filtración. El filtrado se concentró y el residuo resultante se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluida con una mezcla en gradiente (0 % a 3 %) de acetato de etilo en hexanos. Esto dio un aceite incoloro (0,79 g 1,67 mmol, 83 %) de 6-bromohexanoato de (E)-3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-enilo.
Una solución de 6-bromohexanoato de (E)-3,7,11,15-tetrametilhexadec-2-enilo (0,42 g, 0,887 mmol), N,N-diisopropiletilamina (1,5 mol equiv., 1,33 mmol, PM 129,25, 171 mg ) y N,N-dimetiletilendiamina (39 mg, 0,44 mmol) en DMF (4 ml) se calentó a 77 °C durante 18 h. Después, la mezcla de reacción se enfrió y se extrajo con hexanos (3 x 20 ml). Los extractos de hexano se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se concentraron. Esto se combina con la segunda reacción (un total de aproximadamente 0,7 g). El producto en bruto se purificó varias veces mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice eluida con una mezcla en gradiente (0 % a 5 %) de metanol en DCM. Esto dio un aceite de color ligeramente amarillo (39 mg) del producto deseado. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 5,33 (m, 2H), 4,59 (m, 4H), 2,85-2,25 (m, 18H).
Ejemplo 3 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 3
El compuesto 3 se preparó de una manera análoga al compuesto 2 a partir de ácido bromoacético, en lugar de ácido 6-bromohexanoico, para producir 22 mg de un aceite incoloro espeso, 0,029 mmol, 6 %. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 5,32 (m, 2H), 4,62 (m, 4H), 3,62 (s, 2H), 3,60 (s, 2H), 3,28-2,33 (m, 10H), 2,09-2,00 (m, 4H), 1,76 (s, 3H), 1,70 (s, 3H), 1,60-1,47 (m, 6H), 1,47-0,97 (32H), 0,89-0,84 (m, 24H).
Ejemplo 4 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 4
Se preparó Compuesto 4 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de dodecano-1,12-diol (10 g) en cloruro de metileno (100 ml) y tetrahidrofurano (50 ml) se trató con ácido 2-etilhexanoico (7,2 g), DCC (10,5 g), DMAP (3,5 g) y trietilamina (10 ml). La solución se agitó durante cuatro días. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se lavó con ácido clorhídrico diluido. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se disolvió en cloruro de metileno (50 ml), se dejó reposar durante la noche y se filtró. El disolvente se retiró para producir 12,1 g de producto en bruto. El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (100 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (8 g) durante la noche. Se añadió dietil éter (400 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de acetato de etilo/hexano (0-6 %). Se recuperó 12-0-(2'-etilhexanoiloxi)dodecanal (3,5 g) en bruto en forma de un aceite.
Una solución del producto en bruto (3,5 g), ácido acético (60 gotas) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,30 g) en cloruro de metileno (20 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (0,86 g) durante la noche. La solución se lavó con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, seguido de salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente de metanol/cloruro de metileno (0-8 %), seguida de una segunda columna (20 g), para producir el producto deseado (0,6 g) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo 5 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 5
Se preparó Compuesto 5 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de hexano-1,6-diol (10 g) en cloruro de metileno (40 ml) y tetrahidrofurano (20 ml) se trató con cloruro de 2-hexil-decanoílo (10 g) y trietilamina (10 ml). La solución se agitó durante una hora y el disolvente se retiró. La mezcla de reacción se suspendió en hexano, se filtró y el filtrado se lavó con agua. El disolvente se retiró y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando hexano, seguido de cloruro de metileno, como eluyente, produciendo 6-(2'-hexildecanoiloxi)hexan-1-ol en forma de un aceite (7,4 g).
El producto purificado (7,4 g) se disolvió en cloruro de metileno (50 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (5,2 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (200 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente de acetato de etilo/hexano (0-5 %). Se recuperó 6-(2'-hexildecanoiloxi)dodecanal (5,4 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto (4,9 g), ácido acético (0,33 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,40 g) en cloruro de metileno (20 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (2,1 g) durante dos horas. La solución se lavó con hidróxido de sodio acuoso. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente de metanol/cloruro de metileno (0-8 %) para producir el producto deseado (1,4 g) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo 6 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 6
Se preparó Compuesto 6 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (12,6 g) en cloruro de metileno (80 ml) se trató con ácido 2-hexildecanoico (10,0 g), DCC (8,7 g) y DMAP (5,7 g). La solución se agitó durante dos horas. La mezcla de reacción se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se disolvió en hexano calentado (250 ml) y se dejó cristalizar. La solución se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se disolvió en cloruro de metileno y se lavó con ácido clorhídrico diluido. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un 0-12 % de acetato de etilo/hexano como eluyente, produciendo 9-(2'-hexildecanoiloxi)nonan-1-ol (9,5 g) en forma de un aceite.
El producto se disolvió en cloruro de metileno (60 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (6,4 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (200 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de acetato de etilo/hexano (0-12 %), produciendo 9-(2'-etilhexanoiloxi)nonanal (6,1 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto en bruto (6,1 g), ácido acético (0,34 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,46 g) en cloruro de metileno (20 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (2,9 g) durante dos horas. La solución se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con hidróxido de sodio acuoso, seguido de agua. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de metanol/cloruro de metileno (0-8 %), seguida de una segunda columna (20 g) usando un gradiente de cloruro de metileno/ácido acético/metanol. Las fracciones purificadas se disolvieron en cloruro de metileno, se lavaron con una solución acuosa diluida de hidróxido de sodio, se secaron sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el disolvente se retiró, para producir el producto deseado (1,6 g) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo 7 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 7
El compuesto 7 se preparó a partir de 10-bromodecanoato de 3,5,5-trimetilhexilo y N,N-dimetiletano-1,2-diamina de acuerdo con el método A para producir 144 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,21 mmol, 11 %). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 4,09 (similar a t, 6,6 Hz, 4H), 2,58-2,51 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 6H), 2,29 (similar a t, 7,5 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,67-1,57 (m, 8H), 1,52-1,39 (m, 6H), 1,36-1,21 (m, 24H), 0,95 (d, 6,6 Hz, 6H), 0,90 (s, 18H).
Ejemplo 8 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 8
El compuesto 8 se preparó por el método A con un rendimiento del 15 %. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 5,11-5,04 (m, 2H), 2,60-2,54 (m, 2H), 2,47-2,36 (m, 6H), 2,27 (similar a t, 7,4 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,66-1,40 (m, 16H), 1,34­ 1,23 (m, 24H), 0,91 (d, 6,5 Hz, 24H).
Ejemplo 9 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 9
Se preparó Compuesto 9 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (10,0 g) en cloruro de metileno (100 ml) se trató con cloruro de citroneloílo (10,1 g, preparado a partir de ácido citronélico y cloruro de oxalilo) y trietilamina (10 ml) y la mezcla se agitó durante tres días. La mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con ácido clorhídrico diluido. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se recogió en hexano, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una serie de columnas de gel de sílice (60-70 g) usando hexano seguido de cloruro de metileno como eluyente, produciendo 9-(citroneloiloxi)nonan-1-ol (7,6 g) en forma de un aceite.
El producto se disolvió en cloruro de metileno (50 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (6,4 g) durante 90 minutos. Se añadió dietil éter (200 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El residuo se disolvió en hexano y se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando hexano como eluyente, produciendo 9-(citroneloiloxi)nonanal (5 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto en bruto (5 g), ácido acético (0,33 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,48 g) en cloruro de metileno (40 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (1,2 g) durante la noche. La solución se diluyó con cloruro de metileno y se lavó con hidróxido de sodio acuoso. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente del 0-12 % de metanol/cloruro de metileno, seguida de una segunda columna de gel de sílice (20 g) usando el mismo gradiente, para producir el producto deseado (0,6 g) en forma de un aceite incoloro.
Ejemplo 10 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 10
El compuesto 10 se preparó de acuerdo con el método A para producir 147 mg de aceite incoloro, 0,23 mmol, 17 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,11 (t, 6,9 Hz, 4H), 2,56-2,52 (m, 2H), 2,44-2,35 (m, 6H), 2,29 (similar a t, 7,5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,75-1,66 (m, 8H), 1,66-1,57 (m, 4H), 1,52 (similar a c, 6,9 Hz, 4H), 1,46-1,38 (m, 4H), 1,38-1,13 (m, 30H), 0,98-0,87 (m, 4H).
Ejemplo 11 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 11
El compuesto 11 se preparó de acuerdo con el método A para producir 154 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,22 mmol, 14 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,88 (quinteto, 6,2 Hz, 2H), 3,20-2,40 (m, 8H), 2,39 (s, 6H), 2,29 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,67-1,56 (m, 4H), 1,56-1,48 (m, 8H), 1,38-1,21 (m, 44H), 0,92-0,86 (m, 12H).
Ejemplo 12 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 12
El compuesto 12 se preparó de acuerdo con el método A para producir 169 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,26 mmol, 17 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,03-3,95 (patrón ABX, 4H), 2,54 (m, 2H), 2,44-2,35 (m, 6H), 2,30 (similar a t, 7,5 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,66-1,54 (m, 6H), 1,47-1,23 (m, 40H), 0,92-0,88 (m, 12H).
Ejemplo 13 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 13
El compuesto 13 se preparó de acuerdo con el método A para producir 152 mg de una pasta de color blanco, 0,23 mmol, 16 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,03 (t, 6,7 Hz, 4H), 3,10-2,41 (muy amplio, 8H), 2,34 (s, 6H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,66-1,46 (m, 12H), 1,39-1,21 (m, 40H), 0,89 (similar a t, 6,9 Hz, 6H).
Ejemplo 14 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 14
El compuesto 14 se preparó de acuerdo con el método A para producir 111 mg de un aceite incoloro, 0,16 mmol, 11 %. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 5,09 (m, 2H), 4,16-4,05 (m, 4H), 3,10-2,40 (muy amplio, 8H), 2,31 (s, 6H), 2,29 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,06-1,89 (m, 4H), 1,69 (d, 0,8 Hz, 6H), 1,61 (s, 6H), 1,73-1,13 (m, 50H), 0,92 (d, 6,6 Hz, 6H).
Ejemplo 15 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 15
El compuesto 15 se preparó de acuerdo con el método A para producir 116 mg de una pasta de color blanco, 0,16 mmol, 10 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,06 (t, 6,7 Hz, 4H), 2,62-2,51 (amplio, 2H), 2,48-2,33 (a, 6H), 2,29 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,69 (quinteto, 7,0 Hz, 8H), 1,48-1,38 (a, 4H), 1,38-1,21 (m, 52H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplo 16 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 16
El compuesto 16 se preparó de acuerdo con el método A para producir 118 mg de un aceite incoloro 0,17 mmol, 12 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,06 (t, 6,8 Hz, 4H), 2,57-2,52 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 6H), 2,29 (t, 7,6 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,62 (similar a quinteto, 7,0 Hz, 8H), 1,47-1,39 (m, 4H), 1,37-1,22 (m, 44H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplo 17 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 17
El compuesto 17 se preparó de acuerdo con el método A para producir 145 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,21 mmol, 13 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 5,01 (m, 0,27H de isómero cis), 4,63 (tt, 11,2 Hz, 4,5 Hz, 1,73H de isómero trans), 2,61-2,24 (18H), 2,01 (m, 4H), 1,81 (m, 4H), 1,61 (similar a quinteto, 7,2 Hz, 4H), 1,44 (m, 4H), 1,36-1,21 (24H), 1,11 (m, 4H), 1,01 (m, 2H), 0,87 (s, 2,7H de isómero cis), 0,86 (s, 15,3H de isómero trans). Ejemplo 18 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 18
El compuesto 18 se preparó de acuerdo con el método A para producir 111 mg de un aceite incoloro, 0,17 mmol, 14 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,88 (quinteto, 6,2 Hz, 2H), 2,61-2,51 (a, 2H), 2,48-2,34 (a, 6H), 2,29 (t, 7,6 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,62 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,55-1,48 (m, 8H), 1,47-1,39 (m, 4H), 1,37-1,21 (m, 32H), 0,91-0,86 (m, 12H).
Ejemplo 19 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 19
El compuesto 19 se preparó de acuerdo con el método A para producir 76 mg de un aceite incoloro, 0,11 mmol, 6 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 5,77 (similar a dt, 14,4 Hz, 6,6 Hz, 2H), 5,55 (similar a dtt, 14,4 Hz, 6,5 Hz, 1,4 Hz, 2H), 4,51 (dd, 6,6 Hz, 0,6 Hz, 4H), 2,61-2,50 (a, 2H), 2,50-2,34 (a 6H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 2,04 (c, 7,1 Hz, 4H), 1,62 (quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,48-1,21 (40H), 0,88 (similar a t, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplo 20 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 20
El compuesto 20 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 157 mg de un aceite incoloro, 0,22 mmol, 14 %. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,57-2,51 (m, 2H), 2,44-2,33 (m, 6H), 2,30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,63 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 6H), 1,43 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,36-1,21 (44H), 0,93-0,86 (m, 12H).
Ejemplo 21 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 21
El compuesto 21 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 164 mg de un aceite incoloro, 0,21 mmol, 14 %. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,57-2,51 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 6H), 2,30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,62 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 6H), 1,43 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,36-1,21 (52H), 0,93-0,86 (m, 12H).
Ejemplo 22 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 22
Se preparó Compuesto 22 de acuerdo con el método A de la siguiente manera:
Etapa 1.
A una solución de ácido 6-bromohexanoico (20 mmol, 3,901 g), 2-hexil-1-decanol (1,8 equiv., 36 mmol, 8,72 g) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP 0,5 equiv., 10 mmol, 1,22 g) en DCM (80 ml) se le añadió DCC (1,1 equiv., 22 mmol, 4,54 g). La mezcla resultante se agitó a TA durante 16 h. El precipitado se descartó por filtración. El filtrado se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice eluida con una mezcla de gradiente de acetato de etilo en hexanos (0 a 2 %). Esto dio el producto deseado en forma de un aceite incoloro (7,88 g, 18,8 mmol, 94 %).
Etapa 2.
Una mezcla del bromuro de la etapa step 1 (1,34 equiv., 7,88 g, 18,8 mmol), N,N-diisopropiletilamina (1,96 equiv., 27,48 mmol, 4,78 ml) y N,N-dimetiletilendiamina (1 equiv., 14,02 mmol, 1,236 g, 1,531 ml) en acetonitrilo (70 ml) en un matraz de 250 ml equipado con un condensador, se calentó a 79 °C (baño de aceite) durante 16 h. La mezcla de reacción se enfrió a y se concentró. El residuo se recogió en una mezcla de acetato de etilo y hexanos (1:9) y agua. Las fases se separaron, se lavaron con agua (100 ml) y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio y se concentró (8,7 g de aceite). El producto en bruto (8,7 g de aceite) se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice (MeOH del 0 al 3 % en cloroformo). Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se concentraron. El residuo se disolvió en 1 ml de hexano y se filtró a través de una capa de gel de sílice (3-4 mm, se lavó con 8 ml de hexano). El filtrado se secó con una corriente de Ar y se secó bien al vacío durante la noche (1,30 g, mmol, %, aceite incoloro, producto deseado). RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8: 3,96 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,55-2,50 (m, 2H), 2,43-2,39 (m, 4H), 3,37-3,32 (m, 2H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,23 (s, 6H), 1,63 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 6H), 1,48-1,40 (m, 4H), 1,34-1,20 (52H), 0,88 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 23 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 23
El compuesto 23 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 200 mg de un aceite incoloro, 0,24 mmol, 16 %. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,57-2,51 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 6H), 2,30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,67-1,58 (m, 6H), 1,43 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,36-1,21 (60H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 24 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 24
El compuesto 24 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 138 mg de un aceite incoloro, 0,18 mmol, 12 %. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) 8: 4,90 (similar a sextete, 6,3 Hz, 2H), 2,63-2,33 (a 8H), 2,27 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,26 (s, 6H), 1,66-1,57 (m, 4H), 1,51-1,39 (m, 6H), 1,35-1,21 (54H), 1,20 (d, 6,2 Hz, 6H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplo 25 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 25
El compuesto 25 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 214 mg de un aceite incoloro, 0,24 mmol, 17 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,58-2,52 (m, 2H), 2,45-2,35 (m, 6H), 2,30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2,25 (s, 6H), 1,62 (similar a quinteto, 7,0 Hz, 6H), 1,43 (similar a quinteto, 7,0 Hz, 4H), 1,36-1,21 (68H), 0,89 (similar a t, 6,7 Hz, 12H).
Ejemplo 26 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 26
El compuesto 26 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 170 mg de un aceite incoloro, 0,21 mmol, 13 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 5,42-5,29 (m, 8H), 4,05 (t, 6,8 Hz, 4H), 2,77 (t, 6,5 Hz, 4H), 2,55-2,50 (m, 2H), 2,43-2,39 (m, 4H), 2,37-2,32 (m, 2H), 2,29 (t, 7,6 Hz, 4H), 2,23 (s, 6H), 2,05 (c, 6,8 Hz, 8H), 1,63 (similar a quinteto, 7,5 Hz, 8H), 1,48-1,40 (m, 4H), 1,39-1,23 (36H), 0,90 (similar a t, 6,8 Hz, 6H).
Ejemplo 27 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 27
El compuesto 27 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 255 mg de un aceite incoloro, 0,29 mmol, 18 %. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 3,96 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,55-2,50 (m, 2H), 2,43-2,39 (m, 4H), 3,37-3,32 (m, 2H), 2,30 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,23 (s, 6H), 1,63 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 6H), 1,48-1,40 (m, 4H), 1,34-1,20 (68H), 0,88 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 28 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 28
El compuesto 28 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 248 mg de un aceite incoloro, 0,27 mmol, 19 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,57-2,52 (m, 2H), 2,44-2,34 (m, 6H), 2,30 (t, 7.5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,67-1,58 (m, 6H), 1,43 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,36-1,21 (76H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 29 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 29
El compuesto 29 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 181 mg de un aceite incoloro, 0,23 mmol, 17 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,87 (quinteto, 6,3 Hz, 4H), 2,56-2,51 (m, 2H), 2,43-2,34 (m, 6H), 2,27 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,61 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,55-1,46 (m, 8H), 1,46-1,37 (m, 4H), 1,36­ 1,08 (52H), 0,88 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 30 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 30
El compuesto 30 se preparó de acuerdo con el procedimiento general A para producir 88 mg de un aceite incoloro, 0,11 mmol, 3 %. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 3,97 (d, 5,5 Hz, 4H), 2,58-2,51 (m, 2H), 2,49-2,44 (m, 4H), 2,38-2,30 (m, 6H), 2,24 (s, 6H), 1,75 (similar a quinteto, 7,3 Hz, 4H), 1,66-1,54 (m, 2H), 1,35-1,06 (64H), 0,89 (similar a t, 6,4 Hz, 12H).
Ejemplo 31 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 31
El compuesto 31 se preparó de acuerdo con el procedimiento general C para producir 275 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,30 mmol, rendimiento total del 35 % durante tres etapas. RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,63-2,47 (m, 8H), 2,45-2,41 (m, 4H), 2,31 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,82-1,74 (m, 4H), 1,64 (similar a quinteto, 7.6 Hz, 6H), 1,46 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 4H), 1,36-1,18 (68H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 32 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 32
Se preparó Compuesto 32 de acuerdo con el método C de la siguiente manera:
Etapa 1.
A una solución de 2-aminoetanol (116 mg, 1,9 mmol, 115 pl, PM 61,08, d 1,012) en 15 ml de THF anhidro, se le añadieron 6-bromohexanoato de 2-hexildecilo (1,9 equiv., 1,52 g, 3,62 mmol), carbonato de potasio (1,9 equiv., 3,62 mmol, 500 mg), carbonato de cesio (0,3 equiv., 0,57 mmol, 186 mg,) y yoduro de sodio (10 mg) y se calentó a reflujo durante 6 días en Ar.
El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se recogió en hexanos y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se separó, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó a reducción para obtener un aceite incoloro. El producto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice (gel de sílice de malla 230-400, MeOH en cloroformo, 0 a 4 %) para producir 936 mg de un aceite incoloro (1,27 mmol, 70 %).
Etapa 2.
A una solución agitada magnéticamente y enfriada con hielo de 936 mg (1,27 mmol) del producto de la etapa 1 en 2 ml de CHC13, se le añadió cloruro de tionilo (2,9 equiv., 3,70 mmol, 440 mg, 270 pl) en 15 ml de cloroformo gota a gota en una atmósfera de Ar. Una vez completada la adición de SOCh, se retiró el baño de hielo y la mezcla de reacción se agitó durante 16 h a temperatura ambiente en una atmósfera de Ar. La retirada de CHC13 y SOCl2 a presión reducida dio un aceite espeso de color amarillo.
Etapa 3.
El producto en bruto de la etapa 2 se disolvió en THF (20 ml). A la solución de THF se le añadió pirrolidina (1,6 ml, 1,36 g, 19 mmol). La mezcla cerrada herméticamente se calentó a 64 C durante una noche. La mezcla de reacción se concentró (aceite de color pardo oscuro). El residuo se purificó por cromatografía en columna de secado instantáneo sobre gel de sílice (MeOH en cloroformo, 0 a 4 %). Esto dio el producto deseado en forma de un aceite de color ligeramente amarillo (419 mg, 0,53 mmol, 83 %). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,65­ 2,47 (m, 8H), 2,45-2,41 (m, 4H), 2,31 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,81-1,74 (m, 4H), 1,64 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 6H), 1,46 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 4H), 1,36-1,21 (52H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 33 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 33
El compuesto 33 se preparó de acuerdo con el procedimiento general C para producir 419 mg de un aceite de color ligeramente amarillo, 0,54 mmol, rendimiento total del 60 % durante tres etapas. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 3,97 (d, 5,8 Hz, 4H), 2,57-2,53 (m, 2H), 2,46-2,40 (m, 8H), 2,31 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,23 (s, 3H), 1,64 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 6H), 1,46 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 4H), 1,36-1,20 (52H), 1,06 (t, 7,2 Hz, 3H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 34 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 34
Se preparó Compuesto 34 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (10 g) en cloruro de metileno (250 ml) se trató con ácido 2-etilhexanoico (4,5 g), DCC (7,7 g) y DMAP (4,2 g). La solución se agitó durante tres días. La mezcla de reacción se filtró y se añadió hexano (200 ml) al filtrado. La mezcla se agitó y se dejó que los precipitados se asentaran. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró, el residuo se suspendió en hexano (70 ml) y se dejó asentar. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró. El residuo se disolvió en hexano, se dejó reposar a temperatura ambiente y después se filtró. El disolvente se retiró y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente del 0-10 % de acetato de etilo/hexano, seguida de un gradiente del 0-8 % de metanol/cloruro de metileno, produciendo 5,6 g de 9-(2'etilhexanoiloxi)nonan-1-ol en forma de un aceite incoloro.
El producto se disolvió en cloruro de metileno (70 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (5 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (250 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se disolvió en hexano. La suspensión se filtró a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se retiró, produciendo 9-(2'-etilhexanoiloxi)nonanal en bruto (3,4 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto en bruto (3,4 g), ácido acético (0,52 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,33 g) en cloruro de metileno (50 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (1,86 g) durante la noche. La solución se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 34 en forma de un aceite (0,86 g).
Ejemplo 35 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 35
Se preparó Compuesto 35 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de dodecan-1,12-diol (18,1 g) en cloruro de metileno (90 ml) se trató con ácido citronélico (7,5 g), DCC (10,0 g) y DMAP (9,5 g). La solución se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y el filtrado se lavó con ácido clorhídrico diluido. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró para producir 12,2 g de 12-citroneloiloxidodecan-1-ol en bruto.
El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (60 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (6,8 g) durante tres horas. Se añadió dietil éter (200 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de acetato de etilo/hexano (0-12 %). El 12-citroneloiloxidodecanal en bruto (6,2 g) se recuperó en forma de un aceite.
Una solución del producto en bruto (6,2 g), ácido acético (0,44 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,50 g) en cloruro de metileno (40 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (2,9 g) durante la noche. La solución se lavó con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, seguido de salmuera. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 35 (1,68 g) en forma de un aceite.
Ejemplo 36 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 36
El compuesto 36 se preparó de acuerdo con el procedimiento general C para producir 108 mg de un aceite incoloro (0,14 mmol). RMN 1H (400 MHz, CDCh) 8: 4,87 (quinteto, 6,3 Hz, 2H), 2,56-2,51 (m, 2H), 2,45-2,40 (m, 4H), 2,38­ 2,33 (m, 2H), 2,29 (t, 7,5 Hz, 4H), 2,24 (s, 6H), 1,64 (similar a quinteto, 7,7 Hz, 4H), 1,55-1,41 (m, 12H), 1,35-1,18 (m, 52H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 37 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 37
El compuesto 37 se preparó de acuerdo con el procedimiento general C para producir 330 mg de un aceite incoloro (0,40 mmol, rendimiento total del 80 % durante tres etapas). RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 4,87 (quinteto, 6,5 Hz, 2H), 2,64-2,47 (m, 8H), 2,45-2,40 (m, 4H), 2,29 (t, 7,5 Hz, 4H), 1,81-1,74 (m, 4H), 1,64 (similar a quinteto, 7,6 Hz, 4H), 1,55-1,41 (m, 12H), 1,35-1,18 (m, 50H), 0,89 (similar a t, 6,8 Hz, 12H).
Ejemplo 38 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 38
Se preparó Compuesto 38 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (16 g) en cloruro de metileno (100 ml) se trató con ácido 2-butiloctanoico (10 g), DCC (10,3 g) y DMAP (6,7 g). La solución se agitó durante tres días. La mezcla de reacción se filtró y se añadió hexano (250 ml) al filtrado. La mezcla se agitó y se dejó que los precipitados se asentaran. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró. El residuo se suspendió en hexano y se dejó asentar. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró (se repitió dos veces). El residuo se disolvió en hexano, se dejó reposar a temperatura ambiente y después se filtró. El disolvente se retiró y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (18 g) usando cloruro de metileno, produciendo 9-(2'-butiloctanoiloxi)nonan-1-ol en bruto (17,7 g) en forma de un aceite.
El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (250 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (11,2 g) durante la noche. Se añadió dietil éter (750 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se disolvió en hexano (150 ml). La suspensión se filtró a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se retiró. El producto en bruto se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (80 g) usando un gradiente del 0-6 % de acetato de etilo/hexano, produciendo 9-(2'-butiloctanoiloxi)nonanal (5,3 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto (5,3 g), ácido acético (0,37 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,47 g) en cloruro de metileno (50 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (3,35 g) durante la noche. La solución se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (60 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 38 en forma de un aceite (2,3 g).
Ejemplo 39 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 39
Se preparó Compuesto 39 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de hexano-1,6-diol (12 g) en cloruro de metileno (250 ml) se trató con ácido 2-deciltetradecanoico (17,5 g), DCC (11,3 g) y DMAP (6,8 g), La solución se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y se añadió hexano al filtrado. La mezcla se agitó y se dejó que los precipitados se asentaran. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (80 g) usando hexano seguido del 0-1 % de metanol/cloruro de metileno, produciendo 6-(2'-deciltetradecanoiloxi)hexan-1-ol en bruto (5,8 g) en forma de un aceite.
El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (70 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (2,9 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (250 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se disolvió en hexano. La suspensión se filtró a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se retiró, El producto en bruto se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (10 g) usando un gradiente del 0-5 % de acetato de etilo/hexano, produciendo 6-(2'-deciltetradecanoiloxi)hexanal (3,2 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto (3,2 g), ácido acético (0,28 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,15 g) en cloruro de metileno (20 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (0,98 g) durante la noche. La solución se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 39 en forma de un aceite (1,2 g).
Ejemplo 40 (Referencia)
SÍNTESIS DE COMPUESTO 40
Se preparó Compuesto 40 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (10,1 g) en cloruro de metileno (200 ml) se trató con ácido 2-octildodecanico (10,0 g), DCC (8,3 g) y DMAP (5,0 g). La solución se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y se añadió hexano (200 ml) al filtrado. La mezcla se agitó y se dejó que los precipitados se asentaran. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró. Este proceso se repitió dos veces. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando hexano seguido del 4-10 % de metanol/cloruro de metileno, produciendo 9-(2'-octildodecanoiloxi)nonan-1-ol en bruto (~11 g) en forma de un aceite.
El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (70 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (8 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (400 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se disolvió en hexano. La suspensión se filtró a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se retiró, produciendo 9-(2'-octildodecanoiloxi)nonanal en bruto (8,4 g) en forma de un aceite. Una solución del producto (8,4 g), ácido acético (0,84 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,55 g) en cloruro de metileno (60 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (2,9 g) durante dos horas. La solución se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 40 en forma de un aceite (3,2 g).
Ejemplo 41
SÍNTESIS DE COMPUESTO 41
Se preparó Compuesto 41 de acuerdo con el método B de la siguiente manera:
Una solución de nonano-1,9-diol (9,6 g) en cloruro de metileno (200 ml) se trató con ácido 2-deciltetradecanoico (8,4 g), DCC (8,6 g) y DMAP (5,0 g). La solución se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se filtró y se añadió hexano (200 ml) al filtrado. La mezcla se agitó y se dejó que los precipitados se asentaran. El sobrenadante se decantó y el disolvente se retiró. Este proceso se repitió dos veces. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (75 g) usando hexano seguido del 4-10 % de metanol/cloruro de metileno, produciendo 9-(2'-deciltetradecanoiloxi)nonan-1-ol en bruto (6,4 g) en forma de un aceite.
El producto en bruto se disolvió en cloruro de metileno (50 ml) y se trató con clorocromato de piridinio (5,7 g) durante dos horas. Se añadió dietil éter (200 ml) y el sobrenadante se filtró a través de un lecho de gel de sílice. El disolvente se retiró del filtrado y el aceite resultante se disolvió en hexano. La suspensión se filtró a través de un tapón de gel de sílice y el disolvente se retiró, produciendo 9-(2'-deciltetradecanoiloxi)nonanal en bruto (5 g) en forma de un aceite.
Una solución del producto (5 g), ácido acético (0,45 g) y 2-N,N-dimetilaminoetilamina (0,32 g) en cloruro de metileno (20 ml) se trató con triacetoxiborohidruro de sodio (1,6 g) durante dos horas. La solución se lavó con una solución acuosa de hidróxido de sodio. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (50 g) usando un gradiente de ácido acético/metanol/cloruro de metileno (2-0 %/0-12 %/98-88 %). Las fracciones purificadas se lavaron con hidrogenocarbonato de sodio acuoso, se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y el disolvente se retiró, produciendo compuesto 41 en forma de un aceite (2,2 g).
Ejemplo 42
SÍNTESIS DEL LÍPIDO PEGILADO 42-6
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Se preparó lipido pegilado 42-6 ("PEG-DMA") de acuerdo con el esquema de reacción anterior, en donde n se aproxima al centro del intervalo de unidades de repetición de óxido de etileno en el lípido pegilado.
Síntesis de 42-1 y 42-2
A una solución de ácido mirístico (6 g, 26 mmol) en tolueno (50 ml) se le añadió cloruro de oxalilo (39 mmol, 1,5 eq.
5 g) a TA. Después de que la mezcla resultante se calentase a 70 °C durante 2 h, la mezcla se concentró. El residuo se recogió en tolueno y se concentró de nuevo. El aceite residual se añadió a través de una jeringa a una solución concentrada de amoníaco (20 ml) a 10 °C. La mezcla de reacción se filtró y se lavó con agua. El sólido de color blanco se secó al vacío. El producto deseado se obtuvo en forma de un sólido de color blanco (3,47 g, 15 mmol, 58,7 %).
Síntesis de 42-3
A la suspensión de 20-2 (3,47 g, 15 mmol) en THF (70 ml) se le añadió en porciones hidruro de aluminio y litio (1,14 g, 30 mmol) a TA durante un período de tiempo de 30 min, Después la mezcla se calentó a reflujo suave (baño de aceite a 65 °C) durante la noche. La mezcla se enfrió a 5 °C y se añadió hidrato de sulfato de sodio 9. La mezcla se agitó durante 2 h, se filtró a través de una capa de celite y se lavó con MeOH al 15 % en DCM (200 ml). El filtrado y los lavados se combinaron y se concentraron. El sólido residual se secó al vacío. El producto deseado se obtuvo en forma de un sólido de color blanco (2,8613,4 mmol, 89,5 %).
Síntesis de 42-4
A una solución de ácido mirístico (3,86 g, 16,9 mmol) en benceno (40 ml) y DMF (1 gota) se le añadió cloruro de oxalilo (25,35 mmol, 1,5 eq. 3,22 g) a TA. La mezcla se agitó a TA durante 1,5 h. Se calentó a 60 °C durante 30 min. La mezcla se concentró. El residuo se recogió en tolueno y se concentró de nuevo. El aceite residual (de color amarillo claro) se recogió en 20 ml de benceno y se añadió a través de una jeringa a una solución de 20-3 (2,86 13,4 mmol) y trietilamina (3,53 ml, 1,5 eq) en benceno (40 ml) a 10 °C. Después de la adición, la mezcla resultante se agitó a TA durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se ajustó a pH 6-7 con H2SO4 al 20 %. La mezcla se filtró y se lavó con agua. Se obtuvo un sólido pálido. El producto en bruto se recristalizó en metanol. Esto proporcionó el producto deseado en forma de un sólido de color blanquecino (5,65 g, 13 mmol, 100 %).
Síntesis de 42-5
A la suspensión de 20-4 (5,65 g, 13 mmol) en THF (60 ml) se le añadió en porciones hidruro de aluminio y litio (0,99 g, 26 mmol) a TA durante un período de tiempo de 30 min. Después la mezcla se calentó a reflujo suave durante la noche. La mezcla se enfrió a 0 °C y se añadió hidrato de sulfato de sodio 9. La mezcla se agitó durante 2 h, después se filtró a través de un lecho de celite y gel de sílice y se lavó en primer lugar con éter. El filtrado se volvió turbio y se formó precipitación. La filtración proporcionó un sólido de color blanco. El sólido se recristalizó en MeOH y un sólido cristalino incoloro (2,43 g).
El lecho de celite y gel de sílice se lavó después con un 5 % de MeOH en DCM (400 ml) y después con un 10 % de MeOH en DCM con un 1 % de trietilamina (300 ml). Las fracciones que contenían el producto deseado se combinaron y se concentraron. Se obtuvo un sólido de color blanco. El sólido se recristalizó en MeOH y un sólido cristalino incoloro (0,79 g). Los dos sólidos anteriores (2,43 g y 0,79 g) se combinaron y se secaron al vacío (3,20 g, 60 %). RMN de 1H (CDCl3 a 7,27 ppm) 8: 2,58 (tipo t, 7,2 Hz, 4H), 1,52-1,44 (m, 4H), 1,33-1,24 (m, 44H), 0,89 (tipo t, 6,6 Hz, 6H), 2,1-1,3 (muy ancho, 1H).
Síntesis de 42-6
A una solución de 20-5 (7 mmol, 2,87 g) y trietilamina (30 mmol, 4,18 ml) en DCM (100 ml) se le añadió una solución de mPEG-NHS (de No F, 5,0 mmol, 9,97 g, PM de PEG aprox. 2.000, n = aproximadamente 45) en DCM (120 ml,). Después de 24 h la solución de reacción se lavó con agua (300 ml). La fase acuosa se extrajo dos veces con DCM (100 ml x 2). Los extractos de DCM se combinaron y se lavaron con salmuera (100 ml). La fase orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró parcialmente. La solución concentrada (aproximadamente 300 ml) se enfrió a aproximadamente -15 °C. La filtración proporcionó un sólido de color blanco (1,030 g, la amina de partida sin reaccionar). A la filtración se le añadieron Et3N (1,6 mmol, 0,222 ml, 4 eq) y anhídrido acético (1,6 mmol, 164 mg). La mezcla se agitó a TA durante 3 h y después se concentró en un sólido. El sólido residual se purificó mediante cromatografía en columna sobre gel de sílice (0-8 % de metanol en DCM). Esto proporcionó el producto deseado en forma de un sólido de color blanco (9,211 g). RMN de 1H (CDCl3 a 7,27 ppm) 8: 4,19 (s, 2H), 3,83-3,45 (m, 180-200H), 3,38 (s, 3H), 3,28 (tipo t, 7,6 Hz, 2H, CH2N), 3,18 (tipo t, 7,8 Hz, 2H, CH2N), 1,89 (s, 6,6 H, agua), 1,58-1,48 (m, 4H), 1,36-1,21 (m, 48-50H), 0,88 (tipo t, 6,6 Hz, 6H).
Ejemplo 43
SÍNTESIS DEL LÍPIDO PEGILADO
Figure imgf000039_0001
Una suspensión de ácido palmítico (10 g) en benceno (50 ml) se trató con cloruro de oxalilo (5 ml) durante tres horas. El disolvente se retiró y el residuo se disolvió en diclorometano (40 ml). La solución se añadió lentamente a amoníaco concentrado (100 ml) con agitación. La suspensión resultante se filtró y se lavó con agua. El precipitado se suspendió en metanol, se calentó a 50 C para disolver el sólido y después se enfrió a temperatura ambiente. El producto en bruto recristalizado se filtró y se secó, produciendo una hexadecanoilamida en forma de un sólido de color blanco (8,7 g).
El producto en bruto se suspendió en THF (50 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (1,1 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se agitó durante una hora. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de agua (2 ml). Se añadió diclorometano (200 ml) y la mezcla se filtró. El disolvente se retiró del filtrado, produciendo hexadecilamina en bruto (7 g)
Una solución de cloruro de hexadecianoílo (10,5 g) preparada como se anteriormente, en diclormetano (40 ml) se añadió lentamente a una solución de la hexadecilamina en bruto en diclormetano (40 ml) con agitación. Se añadió trietilamina (15 ml) y la solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se filtró y el precipitado recogido (N-(hexadecanoil)hexadecilamida, aproximadamente 10,7 g) se secó al vacío.
El producto en bruto se suspendió en THF (60 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (1,1 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de agua (3 ml). Se añadió diclorometano (250 ml) y la solución se filtró. El disolvente se retiró, produciendo dihexadecilamina en bruto (7,6 g) en forma de un polvo de color blanco.
Una solución de dihexadecilamina (3 g) y éster de N-hidroxisuccinimida de monometoxi-PEG-2000-acetoílo (10 g) en diclorometano (60 ml) se trató con trietilamina (3 ml) y se agitó durante la noche. Se añadió anhídrido acético (1 ml) y la solución se agitó durante 30 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con salmuera. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de columnas de gel de sílice (75 g) usando un gradiente del 0-8 % de metanol/diclorometano para producir 43-1 en forma de un polvo de color blanco (5,2 g).
Ejemplo 44
SÍNTESIS DEL LÍPIDO PEGILADO
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Una suspensión de ácido esteárico (6,5 g) en benceno (20 ml) se trató con cloruro de oxalilo (7 ml) durante tres días. El disolvente se retiró y el residuo se disolvió en benceno (40 ml). Se añadió lentamente amoníaco concentrado (50 ml) con agitación. La suspensión resultante se filtró y se lavó con agua. El precipitado se suspendió en metanol y se filtró. El precipitado recogido se lavó con metanol y se secó, produciendo una octadecanoilamida en forma de un polvo de color blanco (6,5 g).
El producto en bruto se suspendió en THF (80 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio en exceso (1,6 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se agitó durante una hora. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de ácido clorhídrico concentrado hasta que el precipitado se disolvió. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se dejó recristalizar. La solución se filtró y el precipitado recogido se secó, produciendo octadecilamina en bruto (5,9 g) Una solución de cloruro de octadecianoílo (8 g) preparada como anteriormente, en diclorometano (40 ml) se trató con la octadecilamina en bruto con agitación. Se añadieron trietilamina (15 ml) y hexano (100 ml) y la solución se agitó a 45 C durante una hora. La solución se enfrió, se filtró, y el precipitado recogido se lavó con metanol. El precipitado se recristalizó en diclorometano, produciendo N-(octadecanoil)octadecilamida (6,8 g) en forma de un polvo de color blanco.
El producto se suspendió en THF (150 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (1,5 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante la noche. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de ácido clorhídrico concentrado hasta que el precipitado se disolvió. La solución se diluyó con agua y se dejó cristalizar. La solución se filtró y el precipitado recogido se lavó con agua (4x). El precipitado se secó al vacío, produciendo dioctadecilamina (6,2 g) en forma de un polvo de color blanco.
Una solución de dioctadecilamina (4,5 g) y éster de N-hidroxisuccinimida de monometoxi-PEG-2000-acetoílo (9 g) en cloroformo (90 ml) se trató con trietilamina (40 ml) y se agitó a 50 °C durante 30 minutos. La solución se filtró. Se añadió anhídrido acético (1 ml) al filtrado y la solución se agitó durante 15 minutos. Se añadió amoníaco (150 ml), seguido de salmuera (150 ml). La mezcla de reacción se extrajo con diclorometano y la fase orgánica se lavó con ácido clorhídrico diluido. La fracción orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el disolvente se retiró. El residuo se hizo pasar a través de columnas de gel de sílice (75 g) usando un gradiente del 0-8 % de metanol/diclorometano para producir 44-1 en forma de un polvo de color blanco (7,4 g).
Ejemplo 45
SÍNTESIS DEL LÍPIDO PEGILADO
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45-1
Una suspensión de ácido láurico (10 g) en benceno (20 ml) se trató con cloruro de oxalilo (10 ml) durante una hora. El disolvente se retiró y el residuo se disolvió en diclorometano (50 ml). La solución se añadió lentamente a amoníaco concentrado (150 ml) con agitación. La mezcla de reacción se lavó con diclorometano. La fase orgánica se secó sobre sulfato de magnesio, se filtró y el disolvente se retiró, produciendo dodecanoilamida en bruto en forma de un polvo de color blanco (10 g).
El producto se suspendió en THF (150 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (3 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se agitó durante una hora. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de solución acuosa de hidróxido de sodio (5 ml). Se añadió diclorometano (100 ml) y la suspensión resultante se filtró. El disolvente se retiró del filtrado y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (80 g) usando un gradiente de metanol/diclorometano, produciendo dodecanilamina (4,5 g).
Una solución de ácido láurico (7,3 g), tetradecilamina en bruto (4,5 g) y N-hidroxisuccinimida (4,2 g) en diclorometano (200 ml) se trató con EDC (7,0 g) seguido de trietilamina (15 ml), y la solución se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se filtró produciendo N-dodecanoildodecanilamida en bruto (1 g) en polvo. El disolvente se retiró del filtrado, el residuo se suspendido en metanol y se filtró, produciendo otros 2 g de N-dodecanoil-dodecanilamida en bruto.
El producto en bruto (3 g) se suspendió en THF (60 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (en exceso, añadido lentamente) durante dos horas. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de agua (1 ml). Se añadió diclorometano (100 ml) y la suspensión se filtró. El disolvente se retiró del filtrado y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente del 0-12 % de metanol/diclorometano produciendo N-dodecanoildodecanilamina (1,4 g) en forma de un sólido ceroso.
Una solución de N-dodecanildodecanilamina (0,52 g) y éster de N-hidroxisuccinimida de monometoxi-PEG-2000-acetoílo (1,5 g) en diclorometano (10 ml) se trató con trietilamina (0,2 ml) y se agitó durante la noche. El disolvente se retiró y el producto se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente del 0-6 % de metanol/diclorometano. Se añadieron anhídrido acético (5 gotas) y trimetilamina (10 gotas) a una solución del producto recuperado en diclorometano y la mezcla se dejó agitar durante una hora. El disolvente retirado y el residuo se hicieron pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente del 0-4 % de metanol/diclorometano para producir MePEGA-2000-DLA en forma de un polvo de color blanco (0,44 g).
Ejemplo 46
SÍNTESIS DEL LÍPIDO PEGILADO
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Una suspensión de ácido mirístico (30 g) en benceno (100 ml) se trató con cloruro de oxalilo (15 ml) durante la noche. El disolvente se retiró y el residuo se disolvió en diclorometano (100 ml). La solución se añadió lentamente a amoníaco concentrado (70 ml) con agitación. La suspensión resultante se filtró y se lavó con agua. El precipitado se secó, produciendo tetradecanoilamida en bruto en forma de un sólido de color blanco (27 g).
El producto se suspendió en THF (200 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (4,5 g, añadido lentamente). La mezcla de reacción se agitó durante una hora. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de agua (10 ml). Se añadió diclorometano (250 ml) y la suspensión resultante se filtró. El disolvente se retiró del filtrado, produciendo tetradecilamina en bruto (17,6 g).
Una solución de ácido láurico (3,5 g), tetradecilamina en bruto (3 g) y N-hidroxisuccinimida (1,9 g) en diclorometano (40 ml) se trató con EDC (3,3 g) seguido de trietilamina (4 ml), y la solución se agitó a temperatura ambiente durante tres días. La solución se filtró y el precipitado recogido se secó, produciendo N-lauroiltetradecanilamina en bruto (2,6 g) en polvo.
El producto en bruto se suspendió en THF (60 ml) y se trató con hidruro de aluminio y litio (0,8 g, añadido lentamente) durante una hora. Se añadió metanol en exceso lentamente, seguido de agua (2 ml). Se añadió diclorometano y la suspensión se filtró. El disolvente se retiró y el residuo se disolvió en metanol caliente (100 ml). La solución se enfrió y se filtró para producir 0,5 g de N-dodecaniltetradecanilamina. El disolvente se retiró del filtrado y el proceso se repitió con 20 ml de metanol para producir una segunda recogida de N-dodecaniltetradecanilamina (0,9 g)
Una solución de N-dodecaniltetradecanilamina (0,5 g) y éster de N-hidroxisuccinimida de monometoxi-PEG-2000-acetoílo (1,5 g) en diclorometano (10 ml) se trató con trietilamina (0,2 ml) y se agitó durante la noche. El disolvente se retiró y el producto se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente del 0-6 % de metanol/diclorometano. Se añadieron anhídrido acético (5 gotas) y trimetilamina (10 gotas) a una solución del producto recuperado en diclorometano y la mezcla se dejó agitar durante una hora. El disolvente se retiró y el residuo se hizo pasar a través de una columna de gel de sílice (20 g) usando un gradiente del 0-4 % de metanol/diclorometano para producir MePEGA-2000-LMA en forma de un polvo de color blanco (0,76 g).
Ejemplo 47
EVALUACIÓN DE ARNm DE LUCIFERASA IN VIVO USANDO LA COMPOSICIÓN DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS
Se solubilizaron lípido catiónico (MC3), DSPC, colesterol y PEG-lípido en etanol en una relación molar de 50:10:38,5:1,5. Se prepararon nanopartículas lipídicas (NPL) con una relación total en peso entre el lípido y el ARNm de aproximadamente 10:1 a 30:1. Brevemente, el ARNm se diluyó a 0,2 mg/ml en tampón de citrato de 10 a 50 mM, pH 4. Se usaron bombas de jeringa para mezclar la solución lipídica etanólica con la solución acuosa de ARNm en una relación aproximada de 1:5 a 1:3 (vol/vol) con caudales totales superiores a 15 ml/min. Después, se retiró el etanol y el tampón externo se reemplazó por PBS mediante diálisis. Por último, las nanopartículas lipídicas se filtraron a través de un filtro estéril de poro de 0,2 pm. El tamaño de partícula de las nanopartículas lipídicas era de 70-90 nm de diámetro, determinada mediante dispersión de la luz cuasielástica usando un clasificador por tamaño de partículas submicrómétricas Nicomp 370 (Santa Bárbara, CA).
Se realizaron estudios en ratones C57BL/6 hembras de 6-8 semanas de edad (Charles River) de acuerdo con las directrices establecidas por un comité institucional de cuidado animal (ACC, por sus siglas en inglés) y el Consejo Canadiense de Cuidado Animal (CCAC, por sus siglas en inglés). Se administraron sistemáticamente dosis variables de nanopartículas de ARNm-lípido mediante inyección en la vena de la cola y se sacrificaron los animales en puntos temporales específicos (1, 2, 4, 8 y 24 horas) después de la administración. Se recogieron el hígado y el bazo en tubos pesados previamente, se determinaron los pesos, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta el procesamiento para su análisis.
Para el hígado, se disecaron aproximadamente 50 mg para su análisis en un tubo FastPrep de 2 ml (MP Biomedicals, Solon OH). Se añadió esfera de cerámica de 6,35 mm (%") (MP Biomedicals) a cada tubo y se añadieron 500 pl de tampón de lisis Glo - GLB (Promega, Madison WI) equilibrado a temperatura ambiente al tejido hepático. Los tejidos hepáticos se homogeneizaron con el instrumento FastPrep24 (MP Biomedicals) a 2 x 6,0 m/s durante 15 segundos. El homogeneizado se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos antes de una dilución 1:4 en GLB y se evaluó usando el sistema de ensayo de luciferasa SteadyGlo (Promega). Específicamente, Se hicieron reaccionar 50 pl de homogeneizado de tejido diluido con 50 pl de sustrato SteadyGlo, la mezcla se agitó durante 10 segundos seguido de 5 minutos de incubación y después se cuantificó con un luminómetro CentroXS3 LB 960 (Berthold Technologies, Alemania). La cantidad de proteína sometida a ensayo se determinó usando el kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford IL). Las unidades de luminiscencia relativa (ULR) se normalizaron después a los ug de proteína total ensayada. Para convertir ULR a ng de luciferasa se generó una curva patrón con luciferasa recombinante QuantiLum (Promega). Basándose en los datos proporcionados en la Figura 1, se eligió el punto temporal de cuatro horas para la evaluación de la eficacia de las formulaciones de lípidos (véase el Ejemplo 48).
El ARNm de FLuc (L-6107) de Trilink Biotechnologies expresará una proteína luciferasa, originalmente aislada de la luciérnaga, Photinus pyralis. FLuc se usa habitualmente en el cultivo de células de mamíferos para medir tanto la expresión de los genes como la viabilidad de las células. Emite bioluminiscencia en presencia del sustrato, luciferina. Este ARNm con capuchón y poliadenilado está totalmente sustituido con 5-metilcitidina y pseudouridina.
Ejemplo 48
DETERMINACIÓN DE LA EFICACIA DE LAS FORMULACIONES DE NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS QUE CONTIENEN DIVERSOS LÍPIDOS CATIÓNICOS USANDO UN MODELO EN ROEDORES DE LA EXPRESIÓN IN VIVO DE ARNm DE LUCIFERASA MRNA
Los lípidos catiónicos que se muestran en la Tabla 2 se han sometido a ensayo previamente con ácidos nucleicos. Con fines comparativos, estos lípidos también se usaron para formular nanopartículas lipídicas que contenían el ARNm de FLuc (L-6107) usando un método de mezcla en línea, como se describe en el Ejemplo 47 y en el documento PCT/US10/22614. Las nanopartículas lipídicas se formularon usando la siguiente relación molar: 50 % de Lípido catiónico/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de Colesterol/ 1,5 % de lípido PEGilado ("PEG-DMG", es decir, (1-(monometoxi-polietilenglicol)-2,3-dimiristoilglicerol, con un peso molecular promedio de PEG de 2000). Se determinó la actividad relativa midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de su administración a través de inyección en la vena de la cola, como se describe en el Ejemplo 47. La actividad se comparó a una dosis de 0,3 y 1,0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 47.
Tabla 2
Figure imgf000043_0001
Los lípidos que se muestran en la Tabla 3 se formularon usando la siguiente relación molar: 50 % de lípido catiónico/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de colesterol/1,5 % de lípido PEGilado (compuesto "PEG-DMA" 42-6). Se determinó la actividad relativa midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de su administración a través de inyección en la vena de la cola, como se describe en el Ejemplo 47. La actividad se comparó a una dosis de 0,3 y 1,0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 47.
Tabla 3
Figure imgf000044_0001
(continuación)
Figure imgf000045_0001
(continuación)
Figure imgf000046_0001
(continuación)
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 49
DETERMINACIÓN DEL PKa DE LOS LÍPIDOS FORMULADOS
Como se describe en otra parte, el pKa de los lípidos catiónicos formulados se correlaciona con la eficacia de las NPL para la entrega de ácidos nucleicos (véase Jayaraman et al., Angewandte Chemie, Edición Internacional (2012), 51 (34), 8529-8533; Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)). El intervalo preferido de pKa es de -5 a -7. El pKa de cada lípido catiónico se determinó en nanopartículas lipídicas usando un ensayo basado en la fluorescencia del ácido 2-(p-toluidino)-6-naftaleno sulfónico (TNS). Se preparan nanopartículas lipídicas que comprenden lípidos catiónicos/DSPC/colesterol/PEG-lípido (50/10/38,5/1,5 % en moles) en PBS a una concentración de 0,4 mM total. Se preparan lípidos usando el proceso en línea que se describe en el Ejemplo 47. Se preparó TNS en forma de una solución madre 100 pM en agua destilada. Se diluyeron vesículas a 24 pM de lípido en 2 ml de soluciones tamponadas que contenían, HEPES 10 mM, MES 10 mM, acetato de amonio 10 mM, NaCl 130 mM, donde el pH varió de 2,5 a 11. Se añadió una alícuota de la solución de TNS para proporcionar una concentración final de 1 pM y, después de mezclar con formación de vórtice, se midió la intensidad de fluorescencia a temperatura ambiente en un espectrofotómetro de luminiscencia SLM Aminco Serie 2 usando longitudes de onda de excitación y emisión de 321 nm y 445 nm. Se aplicó un análisis de mejor ajuste sigmoideo a los datos de fluorescencia y se midió el pKa como el pH que origen a la intensidad de fluorescencia semimáxima (véase la Figura 2).
Ejemplo 50
ACTIVIDAD COMPARATIVA DE AMINO LÍPIDOS Y EFECTO DE LA ESTRUCTURA DE LA CADENA HIDROCARBONADA
Los lípidos catiónicos que se muestran en la Tabla 5 se formularon usando la siguiente relación molar: 50 % de Lípido catiónico/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de Colesterol/1,5 % de PEG-lípido (42-6). Se determinó la actividad relativa midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de su administración a través de inyección en la vena de la cola, como se describe en el Ejemplo 18. La actividad se comparó a una dosis de 0,1, 0,3 y 1,0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 48. Los datos se representan en la Figura 3 (de arriba a abajo: diamante = compuesto 6; cuadrado = compuesto 5; triángulo = MC3; y círculo = compuesto A). Los compuestos A, 5 y 6 tienen un grupo principal común pero diferentes estructuras de cadena hidrocarbonada.
Tabla 5
Figure imgf000048_0001
Ejemplo 51
ACTIVIDAD COMPARATIVA DE LÍPIDOS CATIÓNICOS Y EFECTO DE LA LONGITUD DE LA CADENA DEL GRUPO PRINCIPAL
Los lípidos catiónicos que se muestran en la Tabla 6 se formularon usando la siguiente relación molar: 50 % de Lípido catiónico/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de Colesterol/1,5 % de PEG-lípido (42-6). Se determinó la actividad relativa midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de su administración a través de inyección en la vena de la cola, como se describe en el Ejemplo 48. La actividad se comparó a una dosis de 0,1, 0,3 y 1,0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 48. Los compuestos A, B y C tienen una estructura de la cadena hidrocarbonada común pero una longitud de la cadena del grupo principal diferente. El compuesto 6 comparte un grupo principal preferido con el compuesto A y demuestra la ventaja inesperada de la combinación del grupo principal y la estructura de la cadena hidrocarbonada.
Tabla 6
Figure imgf000049_0001
Ejemplo 52
ACTIVIDAD COMPARATIVA DE LOS LÍPIDOS PEG-DMG Y PEG-DMA
La actividad comparativa de los lípidos PEG-DMG y PEG-DMA se muestra en la Figura 4. Las NPL se formularon usando la siguiente relación molar: 50 % de lípido de MC3/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de colesterol/ 1,5 % de PEG-lípido (PEG-DMG o PEG-DMA). Se determinó la actividad relativa midiendo la expresión de luciferasa en el hígado 4 horas después de su administración a través de inyección en la vena de la cola, como se describe en el Ejemplo 48. La actividad se comparó a una dosis de 0,1, 0,3 y 1,0 mg de ARNm/kg y se expresó como ng de luciferasa/g de hígado medida 4 horas después de la administración, como se describe en el Ejemplo 48.
Los datos se presentan en forma de gráfico de barras en la Figura 4.
Ejemplo 53
ACTIVIDAD DE NPL USANDO EL ARNm DE UNA PROTEÍNA ROJA FLUORESCENTE DENOMINADA ROJO CEREZA (CR)
Las NPL que usan compuesto 6 se formulan como se describe en el Ejemplo 47 con ARNm que codifica una proteína fluorescente roja denominada rojo cereza (CR, por sus siglas en inglés, por ejemplo, el producto L-6113 de TriLink Biotechnologies). Se realizan estudios in vivo como se describe en el Ejemplo 47 y se procesan y observan secciones de tejido hepático mediante microscopía de fluorescencia confocal 4, 6 y 24 horas después de la administración. Los niveles de expresión alcanzaron su punto máximo aproximadamente a las 6 horas y se mantuvieron al menos hasta 24 horas. Las secciones de tejido observadas muestran una expresión homogénea en todo el hígado.
Ejemplo 54
LA ENTREGA DE NPL DE ARNm DE FIX HUMANO A HEPATOCITOS IN VIVO DA COMO RESULTADO NIVELES TERAPÉUTICOS DE PROTEÍNA HFIX EN PLASMA DE RATÓN
Las NPL con lípidos catiónicos que se muestran en la Tabla 7 se formulan ARNm que codifica FIX humano (por ejemplo, producto de L-6110 TriLink Biotechnologies) usando la siguiente relación molar de lípidos: 50 % de lípido/10 % de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC)/38,5 % de colesterol/1,5 % de PEG-lípido como se describe en el Ejemplo 47. La proteína plasmática se analiza mediante ELISA usando un kit disponible en el mercado (por ejemplo, Abcam ab108831) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los niveles medidos de expresión de hFiX que se proporcionan en la Tabla 7 para las NPL de compuesto 5 y compuesto 6 son clínicamente pertinentes y la administración de estas NPL de ARNm de hFIX a una dosis de 1 mg/kg da como resultado concentraciones de proteína hFIX que serían suficientes para que los pacientes con enfermedad grave pasen a un estado de enfermedad leve. La duración del hFIX a estos niveles es de -15 horas o más.
Tabla 7
Figure imgf000050_0001

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto que tiene la siguiente fórmula (II):
Figure imgf000051_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable, tautómero o estereoisómero del mismo, en donde:
R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene de 12 a 16 átomos de carbono; y z tiene un valor medio que oscila de 30 a 60.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde z es 45.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 12 átomos de carbono.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 14 átomos de carbono.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R10 y R11 son cada uno independientemente una cadena de alquilo lineal saturada que contiene 16 átomos de carbono.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R10 es una cadena de alquilo saturada lineal que contiene 12 átomos de carbono y R11 es una cadena de alquilo saturada lineal que contiene 14 átomos de carbono.
7. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000051_0002
en donde n tiene un valor medio que oscila de 40 a 50.
8. El compuesto de la reivindicación 1, que tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000051_0003
en donde n tiene un valor medio que oscila de 40 a 50.
9. Una composición que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y un lípido catiónico.
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