KR102011048B1 - 아민 양이온성 지질 및 그것의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지질 화합물 및 그것의 용도에 관한 것이다. 특히, 상기 화합물은 아민 부분, 예컨대 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 부분을 가지는 양이온성 지질 부류를 포함한다. 지질 화합물은 하나 또는 그 이상의 제제 (예컨대 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드, 예컨대 RNAi 제제)의 생체 내 또는 시험관 내 전달에 유용하다.

Description

아민 양이온성 지질 및 그것의 용도{AMINE CATIONIC LIPIDS AND USES THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2011년 10월 18일에 출원된 미국 가 특허출원 제61/548,598호의 이익을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
본 발명은 부분적으로, 아민 양이온성 지질 화합물, 및 그것의 제형, 그리고 치료제, 예컨대 핵산 분자의 세포로의 전달에 사용되는 그것들의 용도에 관한 것이다.
핵산 분자는 그것의 크기 및 친수성 때문에 세포막을 쉽게 가로지를 수 없다. 그러므로 전달은 핵산 치료학, 예를 들어, 안티센스 페이로드(antisense payloads) 및 RNAi 기술에 대한 주요 도전과제 중 하나였다. 전신 투여 후 RNase H 활성 또는 RNAi 활성을 촉발(trigger)시키기 위해, 핵산 분자를 함유하는 제형은 (1) 효소 및 비-효소적 분해로부터 페이로드를 보호하고 (2) 제형의 적당한 생체분포를 제공할 뿐만 아니라, (3) 제형의 세포 흡수 또는 내재화를 허용하고 (4) 핵산 페이로드의 세포의 세포질로의 전달도 촉진해야 한다. 상기 기준 1 및 2의 관점에서 우수한 많은 제형은 기준 3 및 4의 관점에서 부족하고, 따라서 많은 핵산 제형은 우수한 생체분포를 나타내지만 전신 전달 및 국소 전달의 부족으로 인하여 표적 유전자를 녹다운(knock down) 시키지 못한다.
따라서, RNAi 제제와 같은 치료제의 전달을 위한 새로운 화합물이 필요하다. 특히, 양이온성 지질로서 작용할 수 있는 화합물은 지질 입자 제형에 사용되어 핵산 페이로드를 세포로 전달할 수 있다.
본 발명자들은 하나 또는 그 이상의 치료제의 전달을 위한, 아미노-아민 및 아미노-아마이드 양이온성 지질, 및 그것들의 제형을 포함하는, 신규 아민-기초 지질 화합물을 개발하였다. 특히, 본 발명의 화합물(예를 들어, 식 (I) 또는 II(a) 내지 II(k)의 화합물)은 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드(예를 들어, 핵산 분자 또는 RNAi 제제)를 세포에 전달하고 표적 유전자를 침묵(silence)시키기 위해 사용될 수 있다.
한 양태에서, 본 발명은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00001
(I)로 표시되는 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 특징으로 하고, 여기서
각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이며, 여기서 R1 및 R2는 >CHNR3R4에 인접한 탄소 상에서 옥소로 치환되지 않고;
R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며;
R4는 -NR4aR4b로 치환되는 비치환 C1 -6 알킬, -NR4aR4b로 더 치환되는 치환된 C1 -6 알킬, 또는 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일이고, 여기서 각 R4a 및 R4b는, 독립적으로, H, C(=NH)NH2, 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이거나, 또는 R4a 및 R4b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일을 형성하며; 여기서 R3 및 R4는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일을 형성할 수 있고,
여기서 R3 및 R4는 함께 조합되지 않고 임의로 치환된 이미다졸일 또는 임의로 치환된 벤즈이미다졸일 또는 임의로 치환된 석신이미딜을 형성하며; 여기서 한 개, 및 단지 한 개의, 일차 아민이 R3 또는 R4 상에 존재할 수 있거나 또는 어떤 일차 아민도 R3 또는 R4 상에 존재하지 않고; 여기서 R3 또는 R4는 둘 다 임의로 치환된 아마이드가 아니며;
여기서 R1 또는 R2가 포화된 C11 알킬 또는 포화된 C15 알킬일 때, R3는 H가 아니고; R1 또는 R2가 포화된 C16 알킬 또는 포화된 C17 알킬일 때, R1 및 R2는 하이드록시로 치환되지 않으며; R1 또는 R2가 포화된 C17 알킬일 때, R3 또는 R4는 하이드록시로 치환되지 않고; R1 또는 R2가 포화된 C18 알킬일 때, R4는 임의로 치환된 이미다졸일로 치환되지 않는다.
일부 구체예에서, R3는 -NR3aR3b로 치환된 C1 -6 알킬이고, 여기서 각 R3a 및 R3b는, 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다. 특정 구체예에서, 각 R3a 및 R3b는 독립적으로 H 또는 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, R4는 -NR4aR4b로 치환되는 비치환 C1 -6 알킬이다. 특정 구체예에서, R4는 치환된 C1 -6 알킬(예를 들어, 치환된 C1 -3 알킬, 치환된 C1 -2 알킬, 치환된 C1 알킬, 치환된 C2 알킬, 또는 치환된 C3 알킬), 또는 -NR4aR4b로 더 치환되는 C1-6 아미노알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 옥소로 치환된 C1 -6 알킬이고 -NR4aR4b로 더 치환된다. 일부 구체예에서, R4a 및 R4b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 또는 임의로 치환된 피라졸일)을 형성한다. 일부 구체예에서, 각 R4a 및 R4b는 독립적으로 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 것)로 치환되는 비치환 C1 -6 알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 (예를 들어, 옥소로) 치환된 C1 -6 알킬 또는 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐)로 더 치환되는 C1 -6 아미노알킬이다.
일부 구체예에서, R3 및 R4는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐 또는 임의로 치환된 피리다지닐)을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00002
(IIa), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는, 독립적으로, 0 내지 2의 정수이며(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임); R5는 H, 임의로 치환된 C1 -6 알킬, 및 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 비치환된 C1 -6 알킬 또는 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐로 치환된 C1 -6 알킬)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 화합물은 L-2, L-5, L-6, L-22, L-23, L-24, L-25, L-26, L-28, L-29, L-45, 및 L-48, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00003
(IIb), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는 독립적으로 0 내지 2의 정수이며(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임); 및 R5는 H, 임의로 치환된 C1 -6 알킬, 및 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 비치환된 C1 -6 알킬 또는 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐로 치환된 C1 -6 알킬)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 화합물은 L-27 및 L-47, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I), (IIa) 및 (IIb))에 대한 일부 구체예에서, R5는 NR5aR5b로 치환된 C1 -6 알킬이고, 여기서 각 R5a 및 R5b는, 독립적으로, H, 임의로 치환된 C1 -6 알킬(예를 들어, 임의로 치환된 C1 -6 알킬)이며, 여기서 R5a 및 R5b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, R5는 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐)이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00004
(IIc), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는 독립적으로 0 내지 2의 정수이다(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임). 일부 구체예에서, 화합물은 L-46, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00005
(IId), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이고; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는, 독립적으로, H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이거나, 또는 R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00006
(IIe), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1 -6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이거나, 또는 R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 C3 -7 헤테로사이클일을 형성한다.
식 (IId) 또는 (IIe)의 일부 구체예에서, R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 또는 임의로 치환된 아제파닐을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-1, L-3, L-4, L-7, L-9, L-10, L-11, L-12, L-15, L-16, L-17, L-18, L-19, L-30, L-31, L-32, L-33, L-34, L-42, L-43, 및 L-49, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00007
(IIf) 또는
Figure 112014046675715-pct00008
(IIg), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1 -6 알킬렌이고; 각 n3 및 n4는 독립적으로 0 내지 2의 정수이고; R5는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-14, L-21 및 L-36, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIj), 예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIg))의 일부 구체예에서, R3는 -NR3aR3b로 치환된 C1 -6 알킬이고, 여기서 각 R3a 및 R3b는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 구체예에서, R3는 비치환된 C1 -6 알킬이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIj), 예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIg))의 일부 구체예에서, L1은 메틸, 에틸, 프로필, 또는 -NRLaRLb로 치환된 C1 -6 알킬렌이고, 여기서 각 RLa 및 RLb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00009
(IIh), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1 -6 알킬렌이고; R5는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, L1은 4-위치에서 이미다졸일기에 연결된다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-8, L-13, L-20, L-35, 및 L-44, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 식:
Figure 112014046675715-pct00010
(IIi) 또는
Figure 112014046675715-pct00011
(IIj), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1 -6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112014046675715-pct00012
(IIk), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이며; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIk), 예를 들어, 식 (IIi) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, 각 R5 및 R6는 독립적으로 -NR5aR5b로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 각 R5a 및 R5b는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-37, L-38, L-39, L-40, 및 L-41, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, L1은 임의로 치환된 C1 -6 알킬렌이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로 비치환된 C11 -24 알켄일 또는 비치환된 C11 -24 헤테로알켄일이고, 직선의 및 분지된 형태(예를 들어, 각 R1 및 R2는 독립적으로 하나 또는 그 이상의 이중 결합을 포함하는 비치환된 C11 -24 알켄일 또는 비치환된 C11 -24 헤테로알켄일)를 포함한다. 일부 구체예에서, R1 또는 R2 중 하나는 포화된 C11 -24 알킬이 아니다. 일부 구체예에서, R1 및 R2는 둘 다 포화된 C11 -24 알킬이 아니다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2), 리놀레오일(C18:2), 올레일(C18:1), 올레일옥시(18:1), 올레일옥시메틸렌(18:1), 올레오일(C18:1), 올레오일메틸렌(C18:1), 스테아릴(C18:0), 스테아릴옥시(C18:0), 스테아로일(C18:0), 팔미틸(C16:0), 팔미틸옥시(C16:0), 팔미토일(C16:0), 팔미토일메틸렌(C16:0), 미리스틸(C14:0), 미리스틸옥시(C14:0), 미리스토일(C14:0), 라우릴(C12:0), 라우릴옥시(C12:0) 및 라우로일(C12:0), 예를 들어, 리놀레일(C18:2) 또는 올레일(C18:1)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1 및 R2는 같거나 또는 상이하다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3 및 R4 둘 다는 아니지만, R3 또는 R4는 일차 아민으로 치환된다. 일부 구체예에서, R3 및 R4는 둘 다 일차 아민으로 치환되지 않는다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3 및 R4는 그것들이 부착된 N과 함께, 표 2 및 3으로부터의 H-1 내지 H-52 중 하나의 헤드기(head group)를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로, 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2), 리놀레오일(C18:2), 올레일(C18:1), 올레일옥시(18:1), 올레일옥시메틸렌(18:1), 올레오일(C18:1), 올레오일메틸렌(C18:1), 스테아릴(C18:0), 스테아릴옥시(C18:0), 스테아로일(C18:0), 팔미틸(C16:0), 팔미틸옥시(C16:0), 팔미토일(C16:0), 팔미토일메틸렌(C16:0), 미리스틸(C14:0), 미리스틸옥시(C14:0), 미리스토일(C14:0), 라우릴(C12:0), 라우릴옥시(C12:0), 및 라우로일(C12:0)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예를 들어, 각 R1 및 R2는 독립적으로 리놀레일(C18:2) 또는 올레일(C18:1)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 R1R2-CH-A를 포함하고, 여기서 R1 및 R2는 테일기(tail group) (예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 4에 기술된 어떤 것)이고 A는 헤드기(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 2 및 3에 기술된 어떤 것)이다. 일부 구체예에서, 헤드기는 H-1 내지 H-52 중 하나, 예를 들어, H-2, H-5, H-6, H-19, H-26 또는 H-43(예를 들어, H-5 또는 H-43)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 표 1에 제공된 어떤 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염이다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제형을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 제형은 2가지 또는 그 이상의 화합물, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7가지, 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 제형은 약 10% 내지 약 80%의 화합물, 예를 들어, 약 10% 내지 약 15%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 25%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 35%, 약 15% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 25%, 약 20% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 35%, 약 20% 내지 약 40%, 약 25% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 35%, 약 25% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 30% 내지 약 40% 또는 약 35% 내지 약 40%의, 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 제형은 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, DPePC, DODAP 또는 DOTAP), 중성 지질(예를 들어, DSPC, POPC, DOPE 또는 SM), 그리고 임의로, 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤; 콜레스타논; 콜레스테논; 코프로스타놀; 3β-[-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤); 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC); (2S,3S)-2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐아미노)에틸 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-1); (2S,3S)-((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-2); 비스((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4-트라이하이드록시펜탄다이오에이트(DPC-3); 또는 6-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)옥시도포스포릴옥시)-2,3,4,5-테트라하이드록시헥사노에이트(DPC-4))를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 제형은 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DMG, PEG-DMPE, PEG-DPPE, PEG-DPG, PEG-DOPE 또는 PEG-DOG)를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 제형은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 하나 또는 그 이상의 어떤 화합물), 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 하나 또는 그 이상의 어떤 화합물), 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다.
특정 구체예에서, 제형은 약 10 mol% 내지 약 80 mol%(예를 들어 약 40 mol% 내지 약 55 mol%, 예컨대 약 48 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같이 본 발명의 화합물 및/또는 다른 양이온성 지질), 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 제형은 약 10 mol% 내지 약 30 mol%(예를 들어, 약 22 mol%)의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, L-6, L-30, 및/또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 15 mol% 내지 약 35 mol%(예를 들어, 약 26 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA 또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 3 mol% 내지 약 9 mol%(예를 들어, 약 6 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DSPE, PEG-DMPE, 및/또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 10 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 14 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC 또는 본원에 기술된 어떤 것) 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어 약 29 mol% 내지 약 33 mol%, 예컨대 약 33 mol%)의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤, 그것의 유도체 또는 본원에 기술된 어떤 것)를 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%, 예를 들어 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol% 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol%, 22 mol%, 25 mol%, 26 mol%, 26 mol%, 30 mol%, 35 mol% 또는 40 mol%)의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물은 약 10 mol% 내지 약 80 mol%, 예를 들어 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 10 mol% 내지 약 40 mol%, 약 10 mol% 내지 약 45 mol%, 약 10 mol% 내지 약 50 mol%, 약 10 mol% 내지 약 55 mol%, 약 10 mol% 내지 약 60 mol%, 약 10 mol% 내지 약 65 mol%, 약 10 mol% 내지 약 70 mol%, 약 10 mol% 내지 약 75 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 15 mol% 내지 약 45 mol%, 약 15 mol% 내지 약 50 mol%, 약 15 mol% 내지 약 55 mol%, 약 15 mol% 내지 약 60 mol%, 약 15 mol% 내지 약 65 mol%, 약 15 mol% 내지 약 70 mol%, 약 15 mol% 내지 약 75 mol%, 약 15 mol% 내지 약 80 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 45 mol%, 약 20 mol% 내지 약 50 mol%, 약 20 mol% 내지 약 55 mol%, 약 20 mol% 내지 약 60 mol%, 약 20 mol% 내지 약 65 mol%, 약 20 mol% 내지 약 70 mol%, 약 20 mol% 내지 약 75 mol%, 약 20 mol% 내지 약 80 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 45 mol%, 약 25 mol% 내지 약 50 mol%, 약 25 mol% 내지 약 55 mol%, 약 25 mol% 내지 약 60 mol%, 약 25 mol% 내지 약 65 mol%, 약 25 mol% 내지 약 70 mol%, 약 25 mol% 내지 약 75 mol%, 약 25 mol% 내지 약 80 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 50 mol%, 약 30 mol% 내지 약 55 mol%, 약 30 mol% 내지 약 60 mol%, 약 30 mol% 내지 약 65 mol%, 약 30 mol% 내지 약 70 mol%, 약 30 mol% 내지 약 75 mol%, 약 30 mol% 내지 약 80 mol%, 약 35 mol% 내지 약 40 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 약 35 mol% 내지 약 50 mol%, 약 35 mol% 내지 약 55 mol%, 약 35 mol% 내지 약 60 mol%, 약 35 mol% 내지 약 65 mol%, 약 35 mol% 내지 약 70 mol%, 약 35 mol% 내지 약 75 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 80 mol%, 약 40 mol% 내지 약 45 mol%, 약 40 mol% 내지 약 50 mol%, 약 40 mol% 내지 약 55 mol%, 약 40 mol% 내지 약 60 mol%, 약 40 mol% 내지 약 65 mol%, 약 40 mol% 내지 약 70 mol%, 약 40 mol% 내지 약 75 mol%, 약 40 mol% 내지 약 80 mol%, 약 45 mol% 내지 약 50 mol%, 약 45 mol% 내지 약 55 mol%, 약 45 mol% 내지 약 60 mol%, 약 45 mol% 내지 약 65 mol%, 약 45 mol% 내지 약 70 mol%, 약 45 mol% 내지 약 75 mol%, 또는 약 45 mol% 내지 약 80 mol%, 약 50 mol% 내지 약 55 mol%, 약 50 mol% 내지 약 60 mol%, 약 50 mol% 내지 약 65 mol%, 약 50 mol% 내지 약 70 mol%, 약 50 mol% 내지 약 75 mol% 또는 약 50 mol% 내지 약 80 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol%, 22 mol%, 25 mol%, 26 mol%, 26 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 48 mol%, 49 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 70 mol% 또는 75 mol%)의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 25.1 mol%, 25.2 mol%, 25.3 mol%, 25.4 mol%, 25.5 mol%, 25.6 mol%, 25.7 mol%, 25.8 mol%, 25.9 mol%, 26.0 mol%, 26.2 mol%, 26.4 mol%, 26.6 mol%, 26.8 mol% 또는 27 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA 또는 표 1에서와 같이, 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체는 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 1 mol% 내지 약 5 mol%, 약 1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 1 mol% 내지 약 15 mol%, 약 2 mol% 내지 약 5 mol%, 약 2 mol% 내지 약 10 mol%, 약 2 mol% 내지 약 15 mol%, 약 2 mol% 내지 약 20 mol%, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 2.5 mol%, 2.6 mol%, 2.7 mol%, 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3 mol%, 3.5 mol%, 4 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 5 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 6 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol%, 7 mol%, 7.5 mol%, 8 mol%, 8.5 mol% 또는 9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DSPE, PEG-DMPE 및/또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 중성 지질은 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 7 mol% 내지 약 10 mol%, 약 7 mol% 내지 약 15 mol%, 약 7 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 13.0 mol%, 13.2 mol%, 13.4 mol%, 13.6 mol%, 13.8 mol%, 14 mol%, 14.1 mol%, 14.3 mol%, 14.5 mol%, 14.7 mol% 또는 14.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC 또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체는 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 28.4 mol%, 28.6 mol%, 28.8 mol%, 29.0 mol%, 30 mol%, 31 mol%, 32 mol%, 33 mol%, 33.2 mol%, 33.4 mol%, 33.6 mol%, 33.8 mol%, 34 mol%, 34.4 mol%, 34.7 mol% 또는 34.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤 또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 제형은 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 지질 입자를 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 또는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물 및 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질을 포함하고; 여기서 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 추가 제형 및 백분율은 본원에 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 제형은 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 다중음이온성 페이로드는 RNAi 제제(예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ptgsRNA 또는 DsiRNA, 예를 들어, DsiRNA)이다. 일부 구체예에서, RNAi 제제는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 10 내지 25개의 뉴클레오타이드, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드, 15 내지 25개의 뉴클레오타이드, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드, 15 내지 40개의 뉴클레오타이드, 16 내지 20개의 뉴클레오타이드, 16 내지 25개의 뉴클레오타이드, 16 내지 30개의 뉴클레오타이드, 16 내지 35개의 뉴클레오타이드, 16 내지 40개의 뉴클레오타이드, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드, 18 내지 20개의 뉴클레오타이드, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드, 18 내지 30개의 뉴클레오타이드, 18 내지 35개의 뉴클레오타이드, 18 내지 40개의 뉴클레오타이드, 19 내지 20개의 뉴클레오타이드, 19 내지 25개의 뉴클레오타이드, 19 내지 30개의 뉴클레오타이드, 19 내지 35개의 뉴클레오타이드, 19 내지 40개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드, 20 내지 40개의 뉴클레오타이드, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드, 25 내지 40개의 뉴클레오타이드, 30 내지 35개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 또는 35 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 16 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 19 내지 29 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 일부 구체예에서, 안티센스 페이로드는 8 내지 50 뉴클레오타이드의 길이(예를 들어, 8 내지 10개의 뉴클레오타이드, 8 내지 15개의 뉴클레오타이드, 8 내지 15개의 뉴클레오타이드, 8 내지 20개의 뉴클레오타이드, 8 내지 25개의 뉴클레오타이드, 8 내지 30개의 뉴클레오타이드, 8 내지 35개의 뉴클레오타이드, 8 내지 40개의 뉴클레오타이드, 또는 8 내지 45 뉴클레오타이드의 길이), 예를 들어, 14 내지 35개의 뉴클레오타이드의 길이(예를 들어, 14 내지 15개의 뉴클레오타이드, 14 내지 20개의 뉴클레오타이드, 14 내지 25개의 뉴클레오타이드 또는 14 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이), 예를 들어, 17 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 17 내지 20 뉴클레오타이드 길이를 가진다.
일부 구체예에서, 제형은 제형에 존재하는 약 1:10(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비율의 다중음이온성 페이로드 대 전체 지질, 예를 들어, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:15(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:20(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:40(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:40(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:80(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:80(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 또는 약 1:80(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비의 제형에 존재하는 다중음이온성 페이로드 대 전체 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 제형은 리포솜(예를 들어, 지질 나노입자), 리포플렉스 또는 마이셀을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 본원에 기술된 어떤 제형; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상의 질환을 치료하는 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 특징으로 하고, 그 방법은 대상에게 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 본원에 기술된 어떤 제형, 또는 기술된 어떤 조성물을 질환(예를 들어, 간암 (예를 들어, 간세포암종, 간모세포종, 담관암종, 혈액육종 또는 혈액내피종), 폐암 (예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암), 전립선암 또는 신경모세포종))을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 종양 질환 및 관련 합병증, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 암종(예를 들어, 폐, 유방, 췌장, 결장, 간세포, 신장, 여성생식기, 전립선, 편평세포, 제자리 암종), 림프종(예를 들어, 조직구 림프종, 비-호지킨 림프종), MEN2 증후군, 신경섬유종증(시반세포 종양 포함), 골수이형성 증후군, 백혈병, 종양맥관형성, 갑상선, 간, 뼈, 피부, 뇌, 중추신경계, 췌장, 폐(예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암), 유방, 결장, 방광, 전립선, 위장관, 자궁내막, 나팔관, 고환 및 난소의 암, 위장관 기질 종양(GIST), 전립선종, 비만세포종(개 비만세포종 포함), 급성 골수성 골수섬유증, 백혈병, 급성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 만성 림프성백혈병, 다발성 골수종, 악성 흑색종, 비만세포증, 신경교종, 악성 뇌교종, 성상세포종, 신경모세포종, 육종(예를 들어, 신경외배엽 기원의 육종 또는 평활근육종), 종양의 다른 조직으로의 전이, 및 화학요법-유발된 저산소증을 치료하거나 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 대상에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법을 특징으로 하는데, 그 방법은 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 본원에 기술된 어떤 제형, 또는 기술된 어떤 조성물을 표적 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 것, 예를 들어 ABL1, AR, β-카테닌 (CTNNB1), BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA1, ERBA2, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MET, MDM2, MLL1, MLL2, MLL3, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TAL2, TCL3, TCL5, YES, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53, WT1, ApoB100, CSN5, CDK6, ITGB1, TGFβ1, 사이클린 D1, 헵시딘, PCSK9, TTR, PLK1, 및 KIF1-결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 표적 유전자)의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 대상에 투여하는 것을 포함한다(예를 들어, 여기서 방법은 대상에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함함).
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드의 투약량을 대상에게 1일에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회)의 투여를 특징으로 한다. 대상은 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드의 투약량을 약 0.0001 내지 약 10 mg/kg, 예를 들어, 약 0.0001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.0001 내지 약 5 mg/kg, 약 0.001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.001 내지 약 5 mg/kg, 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 1 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 1 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 1 내지 약 10 mg/kg의 범위로, 어떤 투약량 요법(예를 들어, 1일에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회))으로 받을 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 제형을 대상에게 1일 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회)의 투여를 특징으로 한다. 대상은 제형의 투약량을 약 0.001 내지 약 200 mg/kg, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 약 0.001 내지 약 20 mg/kg, 약 0.001 내지 약 50 mg/kg, 약 0.001 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 내지 약 1 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 50 mg/kg, 약 0.01 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 내지 약 200 mg/kg, 약 0.1 내지 약 1 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 100 mg/kg, 약 0.1 내지 약 200 mg/kg, 약 1 내지 약 10 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 100 mg/kg, 약 1 내지 약 200 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 100 mg/kg, 약 10 내지 약 200 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 20 내지 약 200 mg/kg의 범위로, 어떤 투약량 요법(예를 들어, 1일에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회))으로 받을 수 있다.
다른 양태로, 본 발명은 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드를 특정 유형의 조직에 전달하는 방법을 특징으로 한다. 페이로드가 전달될 수 있는 특정 유형의 조직의 예는, 간, 췌장, 폐, 전립선, 콩팥, 골수, 비장, 흉선, 림프절, 뇌, 척수, 심장, 골격근, 피부, 구강 점막, 식도, 위, 회장, 소장, 결장, 방광, 자궁경부, 난소, 고환, 유선, 부신, 지방조직(흰색 및/또는 갈색), 혈액(예를 들어, 사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, CD4+ 세포와 같은 조혈세포), 림프구, 및 다른 혈액 계통 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 2개의 불포화된 지질 테일기(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일, 임의로 치환된 C11 -24 알킨일, 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C11 -24 헤테로알킨일이다)를 포함한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 지질 테일기를 포함하고, 여기서 이들 기는 -CHR3R4에 인접한 산소를 포함하지 않는다(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 임의로 치환된 C11 -24 알켄일 또는 임의로 치환된 C11 -24 알킨일임).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 지질 테일기를 포함하고, 여기서 이들 기는 하나 또는 그 이상의 생분해성 기(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 에스터기)를 포함하지 않는다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 2개의 지질 테일기를 포함한다(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C17 -24 알켄일, 임의로 치환된 C15 -24 알킨일, 임의로 치환된 C15 -24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C15 -24 헤테로알킨일이고; 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C16 -24 알켄일, 임의로 치환된 C16 -24 알킨일, 임의로 치환된 C16 -24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C16 -24 헤테로알킨일이고; 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C17 -24 알켄일, 임의로 치환된 C17 -24 알킨일, 임의로 치환된 C17 -24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C17 -24 헤테로알킨일이고; 또는 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C18 -24 알켄일, 임의로 치환된 C18 -24 알킨일, 임의로 치환된 C18 -24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C18 -24 헤테로알킨일이다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 유레아기를 함유하지 않는다(예를 들어, R3 또는 R4는 둘 다 임의로 치환된 아마이드가 아니다). 일부 구체예에서, 화합물은 카바밀기를 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 화합물은 하나 이상의 일차 아민기를 함유하지 않는다(예를 들어, 2개의 일차 아민기를 함유하지 않거나 또는 R1 내지 R6 중 하나 또는 그 이상에서, 예를 들어, R3 또는 R4에 어떤 일차 아민기를 함유하지 않음). 특정 구체예에서, 화합물은 단지 하나의 일차 아민을 포함하거나 또는 어떤 일차 아민도 포함하지 않는다(예를 들어, 단지 하나의 일차 아민이 하나 또는 그 이상의 R1내지 R6에, 예를 들어, R3 또는 R4에 존재하거나 또는 어떤 일차 아민도 존재하지 않는다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 하이드록시기를 함유하지 않는다(예를 들어, 어떤 R1 또는 R2는 둘 다 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않거나; 또는 어떤 R3 또는 R4는 둘 다 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다). 일부 구체예에서, R1 또는 R2가 포화된 C11 -24 알킬기(예를 들어, 포화된 C15 알킬, 포화된 C16 알킬, 포화된 C17 알킬 또는 포화된 C18 알킬)일 때, R1 및/또는 R2는 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다. 일부 구체예에서, R1 또는 R2가 포화된 C11 -24 알킬기(예를 들어, 포화된 C15 알킬, 포화된 C16 알킬, 포화된 C17 알킬 또는 포화된 C18 알킬)일 때, R3 및/또는 R4는 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 2개 이하의 아마이드기를 포함한다(예를 들어, 화합물의 헤드기에는 2개 이하 또는 1개의 아마이드기가 있다). 다른 구체예에서, 화합물은 하나 또는 그 이상의 R1 내지 6에서 0, 1 또는 2개의 아마이드기를 포함한다(예를 들어, R3 또는 R4에서 0, 1 또는 2개의 아마이드기). 또 다른 구체예에서, 화합물은 1개, 및 단지 1개의, 아마이드기를 포함할 수 있다(예를 들어, R3 또는 R4에서 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함할 수 있다). 추가의 구체예에서, 화합물은 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함하거나 또는 아마이드기를 포함하지 않는다(예를 들어, R3 또는 R4에서 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함하거나 또는 아마이드기를 포함하지 않는다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민 또는 N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민, 또는 그것의 염을 제외한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민 또는 N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민, 또는 그것의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, 또는 이들의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((3-(다이메틸아미노)프로파노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(다이메틸아미노)뷰타노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((5-(다이메틸아미노)펜타노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 또는 이들의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 6.2 미만 및 6.5 이상의 pKa 값(예를 들어, 4.0 내지 6.2, 예컨대 4.0 내지 5.2, 4.0 내지 5.6, 또는 4.0 내지 5.8; 또는 6.5 내지 8.5, 예를 들면 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 또는 6.5 내지 8.0의 pKa 값)을 가진다. 특정 구체예에서, pKa 값은 약 5.0 내지 약 6.0(예를 들어, 5.0 내지 5.5, 5.0 내지 5.6, 5.0 내지 5.7, 5.0 내지 5.8, 5.0 내지 5.9, 5.0 내지 6.0, 5.2 내지 5.5, 5.2 내지 5.6, 5.2 내지 5.7, 5.2 내지 5.8, 5.2 내지 5.9, 5.2 내지 6.0, 5.4 내지 5.5, 5.4 내지 5.6, 5.4 내지 5.7, 5.4 내지 5.8, 5.4 내지 5.9, 5.4 내지 6.0, 5.6 내지 5.7, 5.6 내지 5.8, 5.6 내지 5.9 또는 5.6 내지 6.0)이다. pKa 값은 어떤 유용한 방법, 예를 들어, 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광의 측정, 제타 전위 측정, 등에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, pKa 값은 하전된 양이온성 지질의 농도 및 비하전된 지질의 농도의 비이다(예를 들어, 제자리 TNS 형광 적정에 의해 측정된 바와 같이, 여기서 pKa는 절반-최대 형광 강도에서의 pH로서 정의됨).
정의
본원에 사용된, 용어 "약"은 열거된 값의 ±10%를 의미한다.
"알켄일"은, 달리 명시되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지쇄 기를 의미한다. 알켄일기는 에텐일, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 2-메틸-1-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 올레일, 리놀레일, 리놀레닐 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx -y 알켄일"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알켄일기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 3, 4, 5, 6, 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20, 또는 18 내지 20이다. 일부 구체예에서, 알켄일은 알킬기에 대해 본원에 한정된 1, 2, 3, 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 1 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지된 포화된 기를 의미한다. 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-뷰틸, 이소-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 라우릴, 미리스틸, 팔미틸, 스테아릴 등에 의해 예시되고, (1) 알콕시; (2) 본원에서 규정된 것과 같은 아미노; (3) F, Cl, Br, 또는 I와 같은 할로; (4) (헤테로사이클일)옥시; (5) 헤테로사이클일; (6) 알킬; (7) 알켄일; (9) 알킨일; (10) 사이클로알킬; (11) 하이드록시; (12) 나이트로; 또는 (13) 옥소(예를 들어, 카복시알데하이드 또는 아실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3개의 치환기, 또는 2 또는 그 이상의 탄소의 알킬기의 경우에는 4개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 기는 각각 본원에 기술된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 용어 "Cx -y 알킬"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킬기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 2, 3, 4, 5, 6, 및 24이고; x 내지 y에 대해서는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다.
본원에 사용된 용어 "알킬렌" 및 접두사 "알크-"는, 2개의 수소 원자의 제거에 의해 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소로부터 유도된 다가(예를 들어, 2가) 탄화수소기를 나타낸다. 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 이소프로필렌 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx -y 알킬렌"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4 및 5이고, y에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5 및 6이다. 일부 구체예에서, 알킬렌은 알킬기에 대해 본원에 기술된 바와 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알킨일"은, 달리 명시되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지쇄 기를 의미한다. 알킨일기는 에틴일, 1-프로핀일 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx -y 알킨일"을 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킨일기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 3, 4, 5, 6, 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다. 일부 구체예에서, 알킨일은 알킬기에 대해 본원에서 규정된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"아마이드"는 카보닐기를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정되는 것과 같은 아민기를 의미한다.
본원에 사용된 "아미노"는 N(RN1)2를 의미하고, 여기서 각 RN1은 독립적으로 H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, N-보호기, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 아릴, 알카릴, 사이클로알킬, 알크사이클로알킬, 헤테로사이클일(예를 들어, 헤테로아릴), 알크헤테로사이클일(예를 들어, 알크헤테로아릴)이거나, 또는 2개의 RN1이 조합되어 헤테로사이클일 또는 N-보호기를 형성하고, 여기서 각 RN2는, 독립적으로, H, 알킬 또는 아릴이다. 바람직한 구체예에서, 아미노는 NH2 또는 NHRN1이고, 여기서 RN1은 독립적으로 OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, 알킬 또는 아릴이며, 각 RN2는 H, 알킬 또는 아릴일 수 있다. "일차 아민"은 구조 -NH2를 갖는 기를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "아미노알킬"은 본원에서 규정된 것과 같이, 아미노기에 의해 치환된, 본원에서 규정된 것과 같은 알킬기를 나타낸다. 알킬 및 아미노 각각은 각각의 기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "카바밀"은 구조 -NRN1C(=O)OR 또는 -OC(=O)N(RN1)2를 갖는 카바메이트기를 말하고, 여기서 각 RN1의 의미는 본원에 제공된 "아미노"의 정의와 같으며, R은 본원에 규정된 것과 같이, 알킬, 사이클로알킬 , 알크사이클로알킬, 아릴, 알카릴, 헤테로사이클일(예를 들어, 헤테로아릴) 또는 알크헤테로사이클일(예를 들어, 알크헤테로아릴)이다.
본원에 사용된 용어 "카보닐"은 C(O)기를 나타내는데, 이것은 또한 C=O로서 표시될 수 있다.
"사이클로알킬"은 1가의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 3- 내지 10-원 단일환형 또는 다환형(예를 들어, 이환형 또는 삼환형) 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 예를 들면 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로헵틸을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "할로"는 브로민, 염소, 아이오딘 또는 플루오린으로부터 선택된 할로겐을 나타낸다.
"헤테로알켄일"은 하나 또는 그 이상의 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알켄일기를 나타낸다. 예시적인 헤테로알켄일기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 알켄일기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알켄일기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"헤테로알킬"은 하나 또는 그 이상의 구성성분 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킬기를 의미한다. 예시적인 헤테로알킬기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에 기술된 것과 같은 알킬기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킬기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 것과 같이, 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬렌"은 1 또는 2개의 구성 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킬렌기를 말한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킬렌기는 알킬렌기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다. 용어 "Cx -y 헤테로알킬렌"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 헤테로알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5 및 11이고; y에 대해서는 2, 3, 4, 5, 6 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다.
"헤테로알킨일"은 하나 또는 그 이상의 구성 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킨일기를 의미한다. 예시적인 헤테로알킨일기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에 기술된 것과 같은 알킨일기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킨일기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 방향족인, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일의 하위집합을 나타낸다: 즉, 이것은 단일- 또는 다중환형 고리 시스템 내에 4n+2개의 파이(pi) 전자를 함유한다. 일부 구체예에서, 헤테로아릴은 헤테로사이클일기에 대해 정의된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클일"은, 달리 명시되지 않는 한, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 고리를 나타낸다. 헤테로사이클일은 포화되거나 또는 불포화될 수 있고 0 내지 3개의 불포화된 결합을 함유할 수 있다. 예를 들어서, 5-원 고리는 0 내지 2개의 이중 결합을 가지고, 6- 및 7-원 고리는 0 내지 3개의 이중 결합을 가진다. 특정 헤테로사이클일기는 2 내지 9개의 탄소 원자, 예를 들어, 3 내지 7개의 탄소 원자를 포함한다. 다른 이러한 기들은 12개까지의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 용어 "헤테로사이클일"은 또한 하나 또는 그 이상의 탄소 및/또는 헤테로원자가 단일환형 고리의 2개의 비-인접한 구성원과 연결된, 가교가 형성된 다중환형 구조를 갖는 헤테로환형 화합물, 예를 들어, 퀴뉴클리다이닐기를 나타낸다. 헤테로환형 기의 예는 아지리다이닐, 아제티다이닐, 피롤리닐, 피롤일, 피롤리다이닐, 피라졸일, 피라졸리닐, 피라졸리다이닐, 이미다졸일, 이미다졸리닐, 이미다졸리다이닐, 피리딜, 피리미디닐, 피페리디닐, 아제파닐, 피라지닐, 피페라지닐, 다이아제파닐, 모폴리닐, 테트라하이드로퓨라닐, 다이하이드로퓨라닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "(헤테로사이클일)옥시"는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 헤테로사이클일기는 본원에서 규정된 것과 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "(헤테로사이클일)오일"은 카보닐기를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 헤테로사이클일기는 본원에서 규정된 것과 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "하이드록시"는 -OH기를 나타낸다.
"링커"는 하나 또는 그 이상의 원자를 함유하는 임의로 치환된 다가(예를 들어 2가)기를 의미한다. 링커의 예를 들면 본원에 기술된 것과 같이, 임의로 치환된 알킬렌 및 헤테로알킬렌기를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "N-보호기"는 합성 과정 동안 바람직하지 않은 반응에 대해 아미노기를 보호하기 위해 의도된 그런 기들을 나타낸다. 흔히 사용된 N-보호기는 문헌: Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999)에 개시되고, 이것은 참고자료로 본원에 포함된다. N-보호기로는 아실, 아릴오일 또는 카바밀기, 예컨대 포밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, t-부틸아세틸, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 트라이플루오로아세틸, 트라이클로로아세틸, 프탈일, o-니트로페녹시아세틸, α-클로로부티릴, 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, 4-니트로벤조일, 및 보호된 또는 비보호된 D, L 또는 D, L-아미노산, 예를 들면 알라닌, 루신, 페닐알라닌 등과 같은 키랄 보조물질; 설포닐-함유기, 예컨대 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐 등; 카바메이트 형성기, 예컨대 벤질옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-나이트로벤질옥시카보닐, 2-나이트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, 3,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,5-다이메톡시벤질 옥시카보닐, 2,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-나이트로-4,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,4,5-트라이메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-바이페닐일)-1-메틸에톡시카보닐, α,α-다이메틸-3,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈하이드릴옥시 카보닐, t-뷰틸옥시카보닐, 다이아이소프로필메톡시카보닐, 아이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 메톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2,2,2,-트라이클로로에톡시카보닐, 페녹시카보닐, 4-나이트로페녹시 카보닐, 플루오레닐-9-메톡시카보닐, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐, 페닐티오카보닐 등; 알카릴기, 예컨대 벤질, 트라이페닐메틸, 벤질옥시메틸 등; 및 실릴기, 예컨대 트라이메틸실릴 등이 있다. 바람직한 N-보호기는 포밀, 아세틸, 벤조일, 피발로일, t-뷰틸아세틸, 알라닐, 페닐설포닐, 벤질, t-부틸옥시카보닐(Boc), 및 벤질옥시카보닐(Cbz)이다.
본원에 사용된 용어 "옥소"는 =O를 나타낸다.
용어 "유레아"는 구조 NRN1C(=O)NRN1을 갖는 기를 말하고, 여기서 각 RN1의 의미는 본원에 제공된 "아미노"의 정의와 같다.
제제의 "충분한 양"은 이로운 또는 원하는 결과, 예컨대 임상적 결과를 이루기에 충분한 제제의 양을 의미하고, 이런 이유로, 충분한 양은 그것이 적용되는 상황에 따라 좌우된다. 예를 들어서, 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 제형의 투여와 관련하여, 제형의 충분한 양은 제형의 투여 없이 얻어진 반응과 비교해 표적 유전자의 발현 수준의 감소를 달성하기에 충분한 양이다.
"음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 갖는 어떤 지질 분자를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 페이로드"는, 그 중에서도, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드(DNA, DNA-유사, RNA, RNA-유사) 또는 안티센스 배향 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 PNA, 라이보자임 및 외부의 가이드 서열(예를 들어, 문헌: Guerrier-Takada et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 94:8468, 1997에 기술된, RNase P를 충당하는 서열)을 포함하는 특정 이중-가닥 또는 자체-혼성화 구성물을 포함한다. 안티센스 화합물은 다양한 수단에 의해 그것의 효과를 발휘할 수 있다. 그런 한 가지 수단은 진핵생물의 RNase H 또는 원핵생물의 RNase P와 같은 내인성 뉴클레아제의 안티센스-중재된 방향이다(Chiang et al., J. Biol . Chem . 1266:18162, 1991; Forster et al., Science , 249:783, 1990).
"양이온성 지질"은 생리학적 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 갖는 어떤 지질 분자를 의미한다. 예시적인 양이온성 지질은 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 어떤 것을 포함한다.
"다이서-기질 RNA" 또는 "DsiRNA"는 유전자를 침묵시킬 수 있는 25-35개(예를 들어 25-27개, 예컨대 27개)의 뉴클레오타이드 이중-가닥 분자의 부류를 의미한다. 다른 RNAi 제제와 비교해 DsiRNA는 그것의 더 긴 길이로 인하여, 다이서의 기질과 비슷하다.
"이중-가닥 분자"는 RNA 간섭을 통해 유전자 생성물을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 이중-가닥 RNA:RNA 또는 RNA:DNA 분자를 의미한다.
"발현"은 본 분야에 공지된 방법에 의한 유전자 또는 폴리펩타이드의 검출을 의미한다. 예를 들어서, DNA 발현은 써던 블롯팅(Southern blotting) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 자주 검출되고, RNA 발현은 노던 블롯팅(Northern blotting), RT-PCR, 유전자 배열 기술 또는 RNAse 보호 분석법에 의해 자주 검출된다. 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 일반적으로 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 면역블롯팅, 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 면역침강법, 면역형광, 표면 플라즈몬 공명, 화학발광, 형광 분극, 인광, 면역조직화학적 분석, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간(MALDI-TOF) 질량분석법, 마이크로 세포계수법, 현미경관찰, 형광 활성화 세포 선별법(FACS), 및 유동세포계수법, 및 단백질의 특성, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다른 단백질 파트너와의 효소 활성 또는 상호작용을 토대로 한 분석법을 포함한다.
"혼성화하다"는 긴축성의 다양한 조건 하에서, 본원에서 규정된 것과 같이, 충분히 상보하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그것의 부분들 사이에서 짝을 이루어 이중-가닥 분자를 형성하는 것을 의미한다(예를 들어, Wahl et al., Methods Enzymol. 152:399 (1987); Kimmel, Methods Enzymol . 152:507 (1987) 참조). 예를 들어서, 고긴축성 염 농도는 일반적으로 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM의 시트르산 3나트륨, 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM의 시트르산 3나트륨, 또는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM 시트르산 3나트륨일 것이다. 저긴축성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 폼아마이드의 부재하에 얻어질 수 있는 한편, 고긴축성 혼성화는 적어도 약 35% 폼아마이드 또는 적어도 약 50% 폼아마이드의 존재하에 얻어질 수 있다. 고긴축성 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30℃, 37℃ 또는 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가의 변수, 예컨대 혼성화 시간, 계면활성제, 예를 들어, 도데실 황산나트륨(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제를 다양하게 다르게 하는 것은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 다양한 수준의 긴축성은 필요에 따라 이들 다양한 조건들을 조합함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 혼성화는 30℃에서 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨 및 1% SDS에서 일어날 것이다. 다른 구체예에서, 혼성화는 50℃ 또는 70℃에서 400 mM NaCl, 40 mM PIPES, 및 1 mM EDTA에서, pH 6.4에서 일어날 것이고, 12 내지 16시간 동안 혼성화된 후, 세척될 것이다. 추가의 바람직한 혼성화 조건은 70℃에서 1×SSC에서 또는 50℃에서 1×SSC, 50% 폼아마이드에서 혼성화된 후 70℃에서 0.3×SSC에서 세척되거나, 또는 70℃에서 4×SSC에서 또는 50℃에서 4×SSC, 50% 폼아마이드에서 혼성화된 후, 67℃에서 1×SSC에서 세척되는 것을 포함한다. 이들 조건에서 유용한 변동은 당업자들에게 쉽게 드러날 것이다. 그런 하나의 예시적인 변동은 생리학적 세포내 상태를 모방하도록 설계된 조건하에서의 혼성화를 평가하는 것을 포함하는데, 이때 양이온 및 음이온은 하기 비율: 양이온에 대해서, 10:160:2:26의 나트륨:칼륨:칼슘:마그네슘; 및 음이온에 대해서, 3:10:100:20:65의 염화물:중탄산염:인산염:황산염:글루콘산염으로 분류된다.
"지질 벡터"는 리포솜, 리포플렉스, 마이셀, 지질 나노입자, 코어-기초 입자, 형질주입 지질(들)과 조합된 RNA 결합제-RNA 응집체를 포함하는 입자, 또는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물을 포함하는 소포(vesicle)-기초 입자를 의미한다.
"마이크로RNA(miRNA)"는 RNA 간섭을 통해 유전자 생성물을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 단일-가닥 RNA 분자를 의미한다.
"조절하다"는 유전자의 발현, 또는 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코드화하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상향-조절되거나 또는 하향-조절됨으로써, 발현, 수준 또는 활성이 조절제의 부재하에 관찰했던 것보다 크거나 또는 적은 것을 의미한다. 예를 들어서, 용어 조절하다는 억제 또는 유전자 침묵을 포함할 수 있고, 유전자의 발현 수준 또는 RNA 분자, 또는 그것의 동등물의 수준은, 대조군과 비교하여, 적어도 10%(예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 감소된다.
"중성 지질"은 생리학적 pH에서 비하전된 또는 중성 양성이온성 형태로 존재하는 어떤 지질 분자를 의미한다.
"다중음이온성 페이로드"는 제형에 포함될 수 있는 다중 음하전된 원자를 포함하는 화학적 부분을 의미한다. 다중음이온성 페이로드의 예는 핵산, RNAi 제제, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, 및 안티센스 페이로드를 포함한다.
"RNA-결합제"는 핵산, 예를 들어, 치료 제형의 핵산 페이로드를 결합하거나 또는 혼성화할 수 있는 어떤 제제 또는 제제들의 조합을 의미한다. RNA-결합제는 본원에 기술된 어떤 지질(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 본원에 또는 표 1에 기술된 것들과 같은, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들의 조합, 그뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들 및 중성 지질 또는 PEG-지질 포합체와 같은, 어떤 다른 지질의 조합)을 포함한다. RNA-결합제는 제형 내에 어떤 유용한 구조, 예컨대, 내부 응집체를 형성할 수 있다.
"RNAi 제제"는 표적 핵산을 혼성화함으로써 유전자 침묵 효과를 발휘하는 어떤 제제 또는 화합물을 의미한다. RNAi 제제는 (예를 들어, 엄격한 조건하에서) 서열-특이적 RNAi를 중재할 수 있는 어떤 핵산 분자, 예를 들어서, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오타이드, 짧은 간섭 핵산, 짧은 간섭 변형 올리고뉴클레오타이드, 화학적으로-변형된 siRNA, 전사후 유전자 침묵화 RNA(ptgsRNA) 및 다이서-기질 RNA(DsiRNA)를 포함한다.
"짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 팽팽한 헤어핀 회전을 만들고 유전자를 침묵시킬 수 있는 RNA의 서열을 의미한다.
"센스 영역"은 다른 핵산의 안티센스 영역에 충분한 상보성을 갖는 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 또한, 본 발명의 핵산의 센스 영역은 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열과 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. "안티센스 영역"은 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열에 충분한 상보성을 갖는 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
"침묵" 또는 "유전자 침묵"은 유전자의 발현 또는 하나 또는 그 이상의 단백질을 코드화하는 RNA 분자의 수준이 제어 조건하에서(예를 들어, RNAi 제제의 부재하에 또는 스크램블된(scrambled) 서열을 갖거나 또는 미스매치된 서열을 가지는 RNAi 분자와 같은 비활성 또는 감쇠된 분자의 존재하에) 관찰했던 것보다 낮은 수준으로 RNAi 제제의 존재하에 감소된다는 것을 의미한다. 유전자 침묵은 유전자 생성물 발현을 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(즉, 완전 억제)만큼 감소시킬 수 있다.
"작은 억제 RNA", "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 유전자를 침묵시킬 수 있는 10-40개(예를 들어 15-25개, 예컨대 21개)의 뉴클레오타이드 이중-가닥 분자의 부류를 의미한다. 가장 두드러지는 것은, siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 전형적으로 포함되고 이것에 의해 siRNA는 특정 유전자 생성물의 발현을 간섭한다.
"실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 각각, 참조 서열로서, 동일한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖거나 또는, 각각, 2개의 서열이 최적으로 정열될 때 참조 서열 내에 해당 위치에서 동일한 명시된 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어서, 참조 서열에 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가진다. 폴리펩타이드에 대해, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개의 인접 아미노산, 및 가장 바람직하게는 전체-길이 아미노산 서열일 것이다. 핵산에 대해, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 5개의 인접 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 전체-길이 뉴클레오타이드 서열일 것이다. 서열 동일성은 디폴트 설정에 대한 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 미국 위스콘신주 53705 메디슨시 유니버시티 애버뉴 1710에 소재한, University of Wisconsin Biotechnology Center, Genetics Computer Group의 Sequence Analysis Software Package)를 사용하여 측정될 수 있다. 그런 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매칭할 수 있다.
"충분히 상보하는"은 표적 핵산으로서, 정확하게 상보하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 2개의 서열이 최적으로 배열될 때 표적 핵산 내의 해당 위치에서 정확히 상보하는 명시된 백분율 또는 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 표적 핵산 서열에 "실질적으로 상보하는" 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다. 10 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 RNAi 제제에 대해, 충분히 상보하는 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 비-상보하는 뉴클레오타이드를 갖는 것들을 포함한다. 실제로, 예를 들어, DsiRNA 제제를 포함하는 특정 구체예에서, 활성 이중-가닥 RNAi 제제는 표적 핵산에 충분히 상보하는 15 내지 19개만큼 적은 연속하는 뉴클레오타이드의 가이드 가닥을 가질 수 있는 한편, 가이드 가닥의 나머지에 대해서는 표적 핵산과의 어떠한 정도의 상보성을 가져야 한다는 요건은 없다(하지만 특정 구체예에서, 가이드 가닥의 나머지는 표적화된 핵산(예를 들어, mRNA)과 부분적으로 또는 전체적으로 상보적일 수 있다).
"표적 핵산"은 그것의 발현 또는 활성이 조절될 수 있는 어떤 핵산 서열을 의미한다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 핵산은 표적 mRNA이다.
"형질주입 지질"은 핵산, 예를 들어, 핵산 페이로드를 전달할 수 있는 어떤 지질 또는 지질들의 조합을 의미한다(임의로, 핵산 페이로드는 RNA 결합제, 예컨대 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질과 결합됨). 형질주입 지질은 본원에 기술된 어떤 지질(예를 들어, 본원에 또는 표 1에 기술된 것들과 같은, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들의 조합, 및 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들 및 어떤 다른 지질 또는 제제, 예컨대 중성 지질, 음이온성 지질, PEG-지질 포합체 또는 스테롤 유도체의 조합)을 포함한다. 형질주입 지질 또는 이러한 형질주입 지질을 포함하는 조합은 제형 내부에 어떤 유용한 구조, 예컨대 외부의 응집체 표면을 형성할 수 있다.
"약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능한 부형제로 제형되고, 포유동물에서 질환의 치료를 위한 치료 요법의 부분으로서 정부 관리 기관의 승인으로 제조되거나 또는 판매되는, 본원에 기술된 화합물을 함유하는 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은, 예를 들어서, 경구 투여를 위해 단위 투약량 형태(예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플렛(caplet), 젤캡(gelcap) 또는 시럽)로; 국소 투여를 위해(예를 들어, 크림, 겔, 로션 또는 연고로서); 정맥 내 투여를 위해(예를 들어, 미립자 색전이 없는 멸균 용액으로서 그리고 정맥 내 사용에 적합한 용매 시스템으로); 또는 본원에 기술된 어떤 다른 제형으로 제형될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 부형제"는 본원에 기술된 화합물 외에 어떤 성분(예를 들어서, 활성 화합물을 현탁하거나 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 의미하고 환자에게 비독성 및 비염증성인 성질을 가진다. 부형제는, 예를 들면 항점착제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색상), 유연제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 풍미제, 향, 활택제(흐름 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화용 물을 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 뷰틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘(이염기성), 스테아르산칼슘, 크로스카멜로스, 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 스테아르산마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전젤라틴화된 전분, 프로필 파라벤, 레틴일 팔미테이트, 쉘락, 이산화규소, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 시트르산나트륨, 전분 글리콜산나트륨, 소비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 슈크로스, 탈크, 이산화티탄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨을 포함하며, 이들로 제한되지 않는다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이득/위험 비와 적합한 그런 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염은 다음 문헌들: Berge et al., J. Pharm . Sci . 66(1):1, 1977에 그리고 Pharmaceutical Salts : Properties , Selection , and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008에 기술되어 있다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 분리 및 정제하는 동안 제자리에서 또는 별도로 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜테인프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 퓨마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 브롬화수소산염, 염산염, 요오드화수소산염, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메테인설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타트레이트, 싸이오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레르산 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 등, 및 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 등을 포함한다.
"대상"은 사람 또는 사람이 아닌 동물(예를 들어, 포유동물)을 의미한다.
본원에 사용되고, 본 분야에서도 이해되는 것과 같이, "치료"는 임상적인 결과와 같이 유익하거나 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근방법이다. 유익한 또는 원하는 결과는, 그것들에 한정되지는 않지만 하나 또는 그 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 호전; 질환, 장애 또는 상태의 정도의 감소; 질환, 장애 또는 상태의 상황의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질환, 장애 또는 상태의 확산의 방지; 질환, 장애 또는 상태의 진행의 지연 또는 둔화; 질환, 장애 또는 상태의 호전 또는 경감; 및 검출가능하든지 또는 검출불가능하든지 차도(부분이든지 또는 전체이든지)를 포함할 수 있다. 질환, 장애 또는 상태를 "경감시키는 것"은 치료의 부재하의 정도 또는 시간 과정과 비교해, 질환, 장애 또는 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적인 징후가 줄어들고 및/또는 진행의 시간 경과가 느려지거나 또는 길어지는 것을 의미한다. "암을 치료"하거나, "암을 예방"하거나, 또는 "암을 억제하는 것"은 종양의 크기 또는 암세포의 수의 감소를 야기하고, 종양의 크기의 증가 또는 암세포 증식을 늦추거나 또는 억제하며, 종양 또는 다른 암의 소멸과 그것의 재발 사이의 질환-없는 생존 시간을 증가시키고, 종양 또는 다른 암의 초기 또는 후속 발생의 가능성을 방지하거나 또는 감소시키며, 또는 종양 또는 다른 암과 관련된 부정적인 증상을 감소시키는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 치료에서 살아남는 종양 또는 암성 세포의 퍼센트는 어떤 표준 분석법을 사용하여 측정되는 것과 같이, 종양 또는 암성 세포의 초기 수보다 적어도 20, 40, 60, 80 또는 100% 낮다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물의 투여에 의해 유도된 종양 또는 암성 세포의 수의 감소는 비-종양 또는 비-암성 세포의 수의 감소보다 적어도 2, 5, 10, 20 또는 50배 높다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 표준 방법을 사용하여 측정되는 바와 같이, 종양의 크기 또는 암성 세포의 수에서 20, 40, 60, 80 또는 100%의 감소를 유발한다. 바람직하게는, 치료된 대상 중 적어도 20, 40, 60, 80, 90 또는 95%는 종양 또는 암의 모든 증거가 소멸되는 완전한 차도를 나타낸다. 바람직하게는, 종양 또는 암은 재발하지 않거나 또는 5, 10, 15 또는 20년 후에 재발한다. 대상에서 질환 또는 상태(예를 들어, 암)를 "예방학적으로 치료하는 것"은 질환 증상이 나타나기에 앞서 질환 또는 상태의 발달(즉, 발생률)의 위험을 감소시키거나 또는 심각성을 감소시키는 것을 의미한다. 예방 치료는 질환 또는 그것의 증상이 나타나는 것을 완전히 예방하거나 또는 감소시킬 수 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 예방 치료는 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환에 걸린 것으로 진단받지 않은 개인에게서 질환 또는 상태가 발생하는 것을 감소시키거나 또는 방지하는(예를 들어, 암을 방지하는) 것을 포함할 수 있다.
도 1은 아미노-아마이드("아마이드"로 표시됨) 및 아미노-아민("아민"으로 표시됨) 화합물의 예시적인 구체예를 도시한다. 이들 화합물에 대해, R1 및 R2는 본원에 기술된 어떤 테일기, 예컨대 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 알켄일, 알킨일, 헤테로알킬, 헤테로알켄일 또는 헤테로알킨일일 수 있다.
도 2a 내지 도 2b는 예시적인 화합물 L-1 내지 L-14를 도시한다.
도 3은 삼차 아민을 갖는 예시적인 화합물 L-15 내지 L-21을 도시한다.
도 4는 화합물 L-5, L-6, L-22, 및 L-23을 포함하는, L-2의 예시적인 유사체를 도시한다.
도 5는 화합물 L-24 내지 L-29를 포함하는, L-6의 예시적인 유사체를 도시한다.
도 6은 화합물 L-30 내지 L-36을 포함하는, L-9의 예시적인 아마이드 유사체를 도시한다.
도 7은 피페라지닐기를 갖는 화합물 L-37 내지 L-41을 나타내는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 본원에 기술된 어떤 테일기, 예컨대 임의로 치환된 C11 -24 알킬, 알켄일, 알킨일, 헤테로알킬, 헤테로알켄일 또는 헤테로알킨일이다.
도 8은 추가의 예시적인 아미노 아민 양이온성 지질 구조 L-42, L-43 및 L-44를 도시한다.
도 9는 본 발명의 예시적인 양이온성 지질 구조 L-6, L-45, L-46 및 L-47을 추가로 도시한다.
도 10은 미처리된 대조군과 비교하여, 화합물 L-1 또는 L-2를 함유하는 지질 입자의 시험관 내 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 11은 L-1, L-2, L-5, L-6, L-7, L-8, L-22 또는 L-30 및 5 mg/kg의 DsiRNA를 포함하는 지질 입자의 단일 용량을 사용하고, 이어서 48시간 후 조직을 수득한 마우스 간에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 12는 L-2, L-5, L-6, 또는 L-30 및 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 DsiRNA를 포함하는 지질 입자의 단일 용량을 사용하고, 이어서 48시간 후 조직을 수득한 마우스 간에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 13은 L-6 또는 L-30 및 5 mg/kg의 DsiRNA로 제형된 2가지 용량의 지질 입자를 사용하고, 이어서 48시간 후 조직을 수득한 마우스 간 및 동소이식 Hep3B 종양에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 14는 L-6 또는 L-30 및 5 mg/kg의 DsiRNA로 제형된 2가지 용량의 지질 입자를 사용하고, 이어서 48시간 후 조직을 수득한 마우스 간 및 동소이식 HepG2 종양에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다.
도 15는 생체 내 Hep3B 모델에서 혈청 α-태아단백질(AFP) 수준에 미치는 활성 DsiRNA("L-6 활성" 및 "L-30 활성")를 갖는 지질 입자 제형 L-6 및 L-30의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 DsiRNA 없는 제형("L-6 대조군" 및 "L-30 대조군") 및 완충액("PBS")에 대해 제공된다.
도 16은 생체 내 Hep3B 모델에서 종양 중량에 미치는 활성 DsiRNA("L-6 활성" 및 "L-30 활성")를 갖는 지질 입자 제형 L-6 및 L-30의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 DsiRNA 없는 제형("L-6 대조군" 및 "L-30 대조군") 및 완충액("PBS")에 대해 제공된다.
도 17은 다이올레일 테일기를 갖는 예시적인 화합물 L-48 및 L-49를 도시한다.
도 18은 L-30 및 1, 3 또는 10 mg/kg 중 하나의 DsiRNA를 포함하는 지질 입자의 단일 IV(정맥 내) 용량을 사용하고, 이어서 48시간 후 조직을 수득한 마우스 간 및 동소이식 Hep3B 종양(0.5g ± 0.1)에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. N= 7/그룹 간 및 종양(평균과 SEM). 2가지 제형: L-30[1] 및 L-30[2]이 본원에 기술된 바와 같이 시험되었다.
도 19는 L-30[1] 제형 및 DsiRNA를 갖는 지질 입자의 단일 용량을 사용하여 다중 동소이식 간암 모델에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. Hep3B 및 HepG2 모델이 세포 현탁액으로서 이식되었고; HuH1, HuH7, 및 MHCC97H가 트로카 단편으로서 이식되었다. N = 5-7/그룹, 5mg/kg에서 정맥 내로, Q2D×1. 모든 그룹에서 표적 녹다운은 PBS에 비교하여 유의미하였다(p<0.05).
도 20은 L-30[1] 제형 및 다양한 독립적인 DsiRNA를 갖는 지질 입자의 단일 용량을 사용하는 동소이식 Hep3B HCC 종양 모델에서 다양한 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. N = 6-7/그룹, 5mg/kg에서 정맥 내로, TIW×2; 모두 소라페닙과 함께 10 mg/kg, QD×14에서 경구 투여에 의해 제공되었다. ** = p<0.01, * = p<0.05.
도 21은 L-30의 7가지 상이한 제형([A] 내지 [G])중에 5mg/kg의 DsiRNA를 함유하는 지질 입자의 단일 용량을 사용하고, 이어서 72시간 후 조직을 수득한 Hep3B HCC 종양 조직에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. 오차를 포함한 막대의 값은 평균 + SEM(N = 7/그룹)을 나타낸다.
도 22는 제1일 및 제3일에 2가지 제형, L-6[2] 및 L-30[2]중에 10 mg/kg의 DsiRNA를 함유하는 지질 입자의 용량을 사용하고, 이어서 제5일에 조직을 수득한 H1975 NSCLC SC(피하) 이종이식 폐 종양 조직에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. 오차를 포함한 막대의 값은 평균 + SEM(N = 7/그룹)을 나타낸다.
도 23은 제1일 및 제3일에 2가지 제형, L-6[2] 및 L-30[2]중에 10 mg/kg의 DsiRNA를 함유하는 지질 입자의 용량을 사용하고, 이어서 제5일에 조직을 수득한 22Rv1 전립선암 SC(피하) 이종이식에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. 오차를 포함한 막대의 값은 평균 + SEM(N = 7/그룹)을 나타낸다.
도 24는 제1일 및 제3일에 3가지 제형, L-6[1], L-30[A], 및 L-30[E]중에 10 mg/kg의 DsiRNA를 함유하는 지질 입자의 용량을 사용하고, 이어서 제5일에 조직을 수득한 간에 이식된 22Rv1 전립선암에서 HPRT1 mRNA의 생체 내 녹다운을 나타내는 그래프이다. 오차를 포함한 막대의 값은 평균 + SEM(N = 7/그룹)을 나타낸다.
본 발명자들은 현재 지질 입자에 제형될 수 있는 아미노-아민 및 아미노-아마이드 양이온성 지질을 개발하였다. 본 발명의 제형은 다중음이온성 페이로드(예를 들어, 핵산 분자 또는 RNAi 제제)의 세포로의 전달을 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 대상의 시험관 내 또는 생체 내). 다중음이온성 페이로드의 전달은 세포에서 서열-특이적 유전자 침묵을 달성할 수 있다.
아미노-아민 및 아미노-아마이드 지질
본 발명의 화합물은 식 (I)의 어떤 화합물을 포함한다. 특정 구체예에서, 화합물은 표 1로부터 선택된다.
Figure 112014046675715-pct00013
Figure 112014046675715-pct00014
Figure 112014046675715-pct00015
Figure 112014046675715-pct00016
Figure 112014046675715-pct00017
Figure 112014046675715-pct00018
본 발명의 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 것과 같은)은 본 분야에 확립된 것들과 유사한 공정에 의해, 예를 들면 반응식 1-4에 나타낸 반응 순서에 의해 제조될 수 있다. 이들 반응 순서, 또는 이들의 변형에 의해 제조된 예시적인 지질은, 도 1 내지 도 9 및 도 17에 제공된다.
반응식 1
Figure 112014046675715-pct00019
식 C1의 이차 아민은 환원성 아민화 조건하에서 케톤 A1을 처리함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 R1 및 R2는 본원에 기술된 것과 같이, 일차 아민 B1을 포함하는 지질 테일기이고, R4는 본원에 기술된다. 환원성 아민화 조건은 적당한 용매에서, 케톤 A1 및 일차 아민 B1을 환원제, 예컨대 나트륨 사이아노보로하이드라이드 또는 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드와 조합하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, C1의 아미노-아민 지질은 더 산화되어 질소에 인접한 R3의 탄소 상에 옥소기를 갖는 해당 아미노-아마이드 지질을 형성한다. 다른 구체예에서, C1의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다. 이 반응식을 사용하여 제조될 수 있는 예시적인 화합물은 도 1에 제공된다.
반응식 2
Figure 112014046675715-pct00020
식 E2의 삼차 아민은 환원성 아민화 조건하에서 케톤 A2를 처리함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 각 R1 및 R2는 본원에 기술된 것과 같이 이차 아민 D2를 갖는, 본원에 기술된 지질 테일기이고, R3 및 R4는 본원에 기술된다. 환원성 아민화 조건은 적당한 용매에서, 케톤 A2 및 이차 아민 D2를 나트륨 사이아노보로하이드라이드 또는 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드와 같은 환원제와 조합하는 것을 포함한다. D2의 일부 구체예에서, R3 및 R4는 결합하여 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, 그 결과 생성된 삼차 아민 E2는 그런 R3 및 R4 기를 포함한다. 특정 구체예에서, E2의 아미노-아민 지질은 더 산화되어 질소에 인접한 R3 또는 R4의 탄소 상에서 옥소기를 갖는 해당 아미노-아마이드 지질이 형성된다. 다른 구체예에서, E2의 아미노-아민 지질은 R3 및/또는 R4의 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다.
반응식 3
Figure 112014046675715-pct00021
식 F3의 아민은 적당한 용매에서, 임의로, 고압하에서 케톤 A3, 암모니아, 2수소, 및 촉매를 조합함으로써 제조될 수 있다. 식 H3의 아미노-아마이드 지질은 적당한 용매에서 아민 F3를 활성화된 카복실산 G3와 조합함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 LG는 이탈기이고 R4는 본원에 기술된다. 예시적인 LG는 할로(예를 들어, 염소, 브로민, 또는 아이오딘), 토실레이트, 및 트라이플레이트를 포함한다. I3의 아미노-아민 지질은 아마이드 H3를 환원제(예를 들어, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 보레인-테트라하이드로퓨란 또는 보레인-다이메틸설파이드)와 조합함으로써 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, H3의 아미노-아마이드 지질은 R4'의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 될 수 있다. 다른 구체예에서, I3의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 될 수 있다.
반응식 4
Figure 112014046675715-pct00022
식 K4의 아미노-아마이드 지질은 적당한 용매에서 케톤 A4와 아민 J4를 조합함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 LG는 이탈기이고 R1, R2, 및 R4는 본원에 기술된다. 예시적인 LG는 할로(예를 들어, 염소, 브로민, 또는 아이오딘), 토실레이트, 및 트라이플레이트를 포함한다. L4의 아미노-아민 지질은 아마이드 K4를 환원제(예를 들어, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 보레인-테트라하이드로퓨란 또는 보레인-다이메틸설파이드)와 조합함으로써 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, K4의 아미노-아마이드 지질은 R4'의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다. 다른 구체예에서, L4의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다. 이 방법에 의해 제조된 예시적인 화합물은 도 7에 제공된다.
상기 반응식 중 어떤 것에서, R4는 본원에 기술된 것과 같이 임의로 치환된 헤테로사이클일, 임의로 치환된 -L1-NR5R6, 임의로 치환된 -C(O)-L1-NR5R6 또는 임의로 치환된 -L1-헤테로사이클일일 수 있다.
상기 반응식 중 어떤 것에서, 화합물은 추가로 알킬화되어 N 상에서 임의로 치환된 C1 -6 알킬이 도입되어(즉, R3는 임의로 치환된 C1 -6 알킬이다) 삼차 아민이 형성될 수 있다. 삼차 아민을 갖는 예시적인 화합물은 도 3에 제공된다.
본원에서 기술된, 예를 들어 도 1 내지 9 및 도 17에 도시된 것과 같은 지질 중 어떤 것이든지 상기 또는 실시예 1 내지 5에 제공된 합성 반응식을 적용하고, 필요에 따라 당업자에게 공지된 변형을 수행함으로써 제조될 수 있다.
지질 헤드기
본 발명의 화합물은 일반적으로 지질 헤드기, 헤드피스, 및 하나 또는 그 이상의 지질 테일기를 포함한다. 헤드피스, 예를 들어 >CH-는, 헤드기를 테일기(들)에 연결한다. 특정 구체예에서, 헤드기는 2가지 또는 그 이상의 질소 원자를 포함한다. 본원에서, 예를 들어 표 2 또는 3에 기술된 헤드기 중 어떤 것이든지 하나 또는 그 이상의 치환기(예를 들어, 알킬에 대해 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 치환기)로 임의로 치환될 수 있다.
아민기를 갖는 헤드기의 비-제한 목록을 표 2에 제공한다. 본원에 기술된 헤드기 중 어떤 것, 예를 들어 표 2의 헤드기 H-1 내지 H-39는 헤드피스 >CH-를 통해 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것과 조합되어 본 발명의 화합물이 형성될 수 있다.
Figure 112014046675715-pct00023
Figure 112014046675715-pct00024
Figure 112014046675715-pct00025
아마이드기를 갖는 헤드기의 비-제한 목록을 표 3에 제공한다. 본원에 기술된 헤드기 중 어떤 것, 예를 들어 표 3의 헤드기 H-40 내지 H-52는 헤드피스 >CH-를 통해 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것과 조합되어 본 발명의 화합물이 형성될 수 있다.
Figure 112014046675715-pct00026
지질 테일기
본원에 기술된 것과 같이, 본 발명의 화합물은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 하나 또는 그 이상의 테일기를 포함한다. 각 화합물에 대해, 테일기는 같거나 또는 상이할 수 있다. 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것이든지 하나 또는 그 이상의 치환기(예를 들어, 알킬에 대해 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 치환기)로 임의로 치환될 수 있다.
예시적인 테일기는 탄소 또는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자(예를 들어, O)를 갖는 포화된 및 불포화된 기, 예컨대 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2) 및 리놀레오일(C18:2); 및 메틸렌에 의해 헤드피스에 연결된 본원에 기술된 어떤 헤테로원자 테일기, 예를 들어 리놀레닐옥시메틸렌(C18:3), 리놀레노일메틸렌(C18:3), 및 리놀레일옥시메틸렌(C18:2), 또는 리놀레오일메틸렌(C18:2)의 군으로부터 선택된 테일기를 포함한다. 지질 테일기의 추가의 비-제한 목록을 표 4에 제공한다.
Figure 112014046675715-pct00027
Figure 112014046675715-pct00028
제형
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질)와 조합되어 제형이 제조될 수 있다. 제형은 또한 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체, PEG-지질 포합체, 폴리아마이드-지질 포합체, 강글리오사이드, 항산화제, 계면활성제, 양친매성 제제, 또는 염) 및/또는 하나 또는 그 이상의 다중음이온성 페이로드(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 RNAi 제제)를 포함할 수 있다. 핵산 페이로드를 통합하여 지질을 제형하는 방법은 예를 들어 참고문헌으로 본원에 포함된 다음 문헌들에 기술되어 있다: Judge et al., J. Clin . Invest . 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chem 다른. Pharmacol . 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol . Ther . 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res . 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control . Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol . Biol . 555:29, 2009 참조.
하나 이상의 지질 분자를 포함하는 제형
본 발명의 제형은 본원에 기술된 것과 같이, 지질 분자들 (예컨대 본 발명의 화합물, 양이온성 지질(임의로 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함하거나 및/또는 임의로 본 분야에 알려져 있는 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함한다), 중성 지질, 음이온성 지질, 및 PEG-지질 포합체를 포함한다)의 어떤 유용한 조합, 이를테면 폴리펩타이드-지질 포합체와 지질 벡터의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함하는 어떤 유용한 조합을 포함할 수 있다. 당업자라면 특정 제제의 캡슐화, 지질 제형의 안정성, 확대된 반응 조건, 또는 어떤 다른 적절한 인자에 유리한 조합을 최적화하는 방법을 알 것이다. 본 발명의 제형은 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함할 수 있다.
제형에서 각 성분의 백분율은 균형을 이루어서 RNAi 제제를 캡슐화하고 그 제제를 세포에 형질주입할 수 있는 지질 벡터가 제조될 수 있다. 예시적인 제형은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제형은 약 20 mol% 내지 약 25 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol% 또는 22 mol%)의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%(예를 들어, 약 25.1 mol%, 25.2 mol%, 25.3 mol%, 25.4 mol%, 25.5 mol%, 25.6 mol%, 25.7 mol%, 25.8 mol%, 25.9 mol%, 26.0 mol%, 26.2 mol%, 26.4 mol%, 26.6 mol%, 26.8 mol% 또는 27 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA), 약 10 mol% 내지 약 15 mol%(예를 들어, 약 13.0 mol%, 13.2 mol%, 13.4 mol%, 13.6 mol%, 13.8 mol%, 14 mol%, 14.1 mol%, 14.3 mol%, 14.5 mol%, 14.7 mol% 또는 14.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC), 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 2.5 mol%, 2.6 mol%, 2.7 mol%, 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3 mol%, 3.5 mol%, 4 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 5 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 6 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol%, 7 mol%, 7.5 mol%, 8 mol%, 8.5 mol% 또는 9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, 약 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3.0 mol%, 3.5 mol%, 3.7 mol%, 3.9 mol%, 4 mol%, 4.1 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 4.9 mol%, 5 mol%, 5.1 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 5.9 mol%, 6 mol%, 6.3 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol% 또는 7 mol%의 PEG2000-DSPE 및/또는 PEG2000-DMPE 및/또는 3 mol%, 3.5 mol%, 3.7 mol%, 3.9 mol%, 4 mol%, 4.1 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 4.9 mol%, 5 mol%, 5.1 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 5.9 mol%, 6 mol%, 6.3 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol% 또는 7 mol%의 PEG2000-DMG), 및 약 25 mol% 내지 약 35 mol%(예를 들어, 약 28.4 mol%, 28.6 mol%, 28.8 mol%, 29.0 mol%, 30 mol%, 31 mol%, 32 mol%, 33 mol%, 33.2 mol%, 33.4 mol%, 33.6 mol%, 33.8 mol%, 34 mol%, 34.4 mol%, 34.7 mol% 또는 34.9 mol%)의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)를 포함한다.
제형은 어떤 유용한 양의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제형 중의 양이온성 지질의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 10 mol% 내지 15 mol%, 약 15 mol% 내지 20 mol%, 약 20 mol% 내지 25 mol%, 약 25 mol% 내지 30 mol%, 약 30 mol% 내지 35 mol%, 및 약 35 mol% 내지 40 mol%)이다. 특정 구체예에서, 혼합된 양이온성 지질(예를 들어, 10.8 mol%의 L-1 및 10.8 mol%의 L-2)이 사용된다.
일부 구체예에서, 제형은 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 지질 입자를 포함하는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA) 및 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)를 포함하고; 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, 표 1의 L-6, -30, 또는 어떤 것), 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC), 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG-DMPE, 예컨대 PEG2000-DMPE), 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)를 포함한다.
지질 입자의 RNA-결합제(들)는 어떤 유용한 지질과 포합체의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 양이온성 지질(예를 들어, DODMA)의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 20 mol% 내지 40 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 15 mol% 내지 40 mol%, 15 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 25 mol%, 또는 15 mol% 내지 20 mol%)이다. 일부 구체예에서, PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)는 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.5 mol% 내지 1 mol%, 0.5 mol% 내지 5 mol%, 0.5 mol% 내지 10 mol%, 1 mol% 내지 5 mol%, 또는 1 mol% 내지 10 mol%)이다.
지질 입자의 형질주입 지질(들)은 어떤 유용한 지질과 포합체의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, 표 1의 L-6, -30, 또는 어떤 것)의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 10 mol% 내지 20 mol%, 10 mol% 내지 30 mol%, 10 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 20 mol%, 15 mol% 내지 25 mol%, 15 mol% 내지 30 mol%, 15 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 40 mol%, 20 mol% 내지 25 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 40 mol%, 25 mol% 내지 30 mol%, 25 mol% 내지 35 mol%, 또는 25 mol% 내지 40 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC)의 함량은 약 5 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 5 mol% 내지 10 mol%, 5 mol% 내지 15 mol%, 7 mol% 내지 10 mol%, 7 mol% 내지 15 mol%, 7 mol% 내지 20 mol%, 10 mol% 내지 15 mol%, 또는 10 mol% 내지 20 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)의 함량은 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.5 mol% 내지 1 mol%, 0.5 mol% 내지 5 mol%, 0.5 mol% 내지 10 mol%, 1 mol% 내지 5 mol%, 또는 1 mol% 내지 10 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)의 함량은 약 20 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 20 mol% 내지 25 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 40 mol%, 25 mol% 내지 30 mol%, 25 mol% 내지 35 mol%, 또는 25 mol% 내지 40 mol%)이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 화합물은 RNA-결합제(들)의 제형에 사용된다(예를 들어, 약 25.9 mol%의 L-6, L-30, L-48 또는 L-49). 특정 구체예에서, RNA-결합제(들)의 제형에 사용된 본 발명의 화합물은 형질주입 지질(들)의 제형에 사용된 본 발명의 화합물과 상이하다(예를 들어, RNA-결합제로서 25.9 mol%의 L-48, 및 형질주입 지질로서 21.6 mol%의 L-30). 제형의 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 내부 응집체를 형성하고, 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 외부, 응집체 표면을 형성한다. 특정 구체예에서, 외부 응집체 표면은 막, 지질 이중층, 및/또는 다중 라멜라(multilamellar)층이 아니다.
제형은 또한 어떤 유용한 양의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제형 중의 PEG-지질 포합체의 함량은 약 1 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 1 mol% 내지 약 2 mol%, 약 2 mol% 내지 약 4 mol%, 약 2 mol% 내지 약 7 mol%, 약 4 mol% 내지 약 8 mol%, 약 8 mol% 내지 약 12 mol%, 약 12 mol% 내지 약 16 mol%, 또는 약 16 mol% 내지 약 20 mol%)이다. 다른 구체예에서, PEG-지질 포합체의 함량은 약 7 mol%, 6 mol%, 3.0 mol%, 또는 2.5 mol%이다. 게다가, PEG-지질 함량은 DSPC 또는 콜레스테롤, 또는 둘 다의 함량의 적당한 조정에 의해, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%로 달라질 수 있다. PEG-지질은 C14:0(표 4에서와 같이, 예를 들면 PEG-DSPE 또는 PEG-DMPE 등), C16(PEG-DPPE, PEG-DPG 등), C18:0(PEG-DSPE, PEG-DSG 등), 또는 C18:1(PEG-DOPE, PEG-DOG, 등)을 사용함으로써 다양할 수 있다. 더욱이, 상이한 분자량 PEG 부분(PEG2000, PEG3400, PEG5000 등)이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 혼합된 PEG-포합체가 본원에 기술된 바와 같이 사용된다. 특정 구체예에서, PEG2000-DSPE가 사용된다. 특정 구체예에서, PEG2000-DMPE가 사용된다.
RNAi 제제를 포함하는 제형
본 발명의 제형은 본원에 기술된 방법 중 어떤 것에 의해 RNAi 제제를 포함하는 아미노-아민 양이온성 지질 및/또는 아미노-아마이드 지질을 사용하여 제형될 수 있다. 예를 들어 참고문헌으로 본원에 포함된 문헌들: Judge et al., J. Clin . Invest . 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chem 다른. Pharmacol . 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol . Ther . 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res . 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control . Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol . Biol . 555:29, 2009 참조.
제형은 RNAi 제제 및 지질 분자 및/또는 하나 또는 그 이상의 성분을 어떤 유용한 비로 포함할 수 있다. 예시적인 비는 약 1:10 내지 약 1:100(w/w)(예를 들어 약 1:10 내지 약 1:50, 예컨대 약 1:20)의 (w/w) 비의 RNAi 제제:전체 지질 비를 포함하는데, 여기서 전체 지질 비는 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질)와 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체, PEG-지질 포합체, 폴리아마이드-지질 포합체, 강글리오사이드, 항산화제, 계면활성제, 양친매성 제제 또는 염)의 조합의 중량이다.
제형은 RNAi 제제를, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위의 본원에 기술된 어떤 RNAi 제제의 용량으로 포함할 수 있다. 예시적인 용량은 제형 중의 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 및 10 mg/kg의 RNAi 제제를 포함한다.
제형을 제조하는 방법
본 발명의 제형은 어떤 유용한 공정으로 조제될 수 있다. 하나의 예시적인 과정에서, 제형의 성분(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제, 형질주입 지질, 또는 본원에 기술된 어떤 지질)은 용매(예를 들어, 수성 용매, 비-수성 용매, 또는 이것들의 용매 혼합물)에 용해된다. 그 결과 생성된 지질 현탁액은 임의로 여과되고, 혼합되며(예를 들어, 배취 혼합, 인-라인 혼합, 및/또는 와류), 증발되고(예를 들어, 질소 또는 아르곤 스트림을 사용하여), 재현탁되며(예를 들어, 수성 용매, 비-수성 용매, 또는 이것들의 용매 혼합물에), 동결-융해되고, 압출되며, 및/또는 초음파처리될 수 있다. 더욱이, 지질 현탁액은 임의로 어떤 원하는 성분(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 RNAi 제제, RNA-결합제, 형질주입 지질, 및/또는 본원에 기술된 어떤 지질)을 첨가함으로써 임의로 가공처리되어 최종 현탁액이 제조될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 원하는 성분이 현탁액으로서 동일한 또는 상이한 용매에 제공될 수 있다. 예를 들어서, 지질 현탁액은 제1 용매 또는 용매 시스템(예를 들어 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매(들), 예컨대 물, 물-HCl, 물-에탄올, 완충액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 평형 염 용액(HBSS), 둘베코 인산염-완충 식염수(DPBS), 얼스 평형 염 용액(EBSS), 탄산염, 락테이트, 아스코베이트, 및 시트레이트, 예컨대 5 mM, 10 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM 또는 150 mM), 생리학적 삼투질농도(osmolality) 용액(290 mOsm/kg, 예를 들어, 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스, 및 10% 슈크로스), 식염수, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, tert-뷰탄올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 클로로폼, 다이클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 아세톤, 에터, 다이에틸 에터, 다이옥산, 아이소프로필 에터, 테트라하이드로퓨란, 또는 이들의 조합)으로 제공될 수 있고, RNAi 제제는 제2 용매 또는 용매 시스템, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매(들), 예를 들어 물, 물-HCl, 물-에탄올, 완충액(예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 평형 염 용액(HBSS), 둘베코 인산염-완충 식염수(DPBS), 얼스 평형 염 용액(EBSS), 탄산염, 락테이트, 아스코베이트, 및 시트레이트, 예컨대 5 mM, 10 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM 또는 150 mM), 생리학적 삼투질농도 용액(290 mOsm/kg, 예를 들어, 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스, 및 10% 슈크로스), 식염수, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, tert-뷰탄올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 클로로폼, 다이클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 아세톤, 에터, 다이에틸 에터, 다이옥산, 아이소프로필 에터, 테트라하이드로퓨란, 또는 이들의 조합으로 제공될 수 있다. 수성 용매 및/또는 완충액의 예시적인 농도는 약 4% 내지 약 8%(예를 들어, 약 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7% 또는 7% 내지 8%)의 에탄올, 약 10 mM 내지 약 100 mM(예를 들어, 약 10 mM 내지 30 mM, 30 mM 내지 50 mM, 50 mM 내지 70 mM, 70 mM 내지 90 mM 또는 90 mM 내지 100 mM)의 시트레이트를 포함한다. 용매 또는 용매 시스템 중 어떤 것은 하나 또는 그 이상의 안정제, 예컨대 항산화제, 염(예를 들어, 염화 나트륨), 시트르산, 아스코브산, 글리신, 시스테인, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 만니톨, 락토스, 트레할로스, 말토스, 글리세롤, 및/또는 글루코스를 포함할 수 있다. 추가 예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 제1 용매 또는 용매 시스템을 사용하여 지질 현탁액에 도입된 다음 이어서 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 제2 용매 또는 용매 시스템에 첨가되는데, 여기서 제1 및 제2 용매 또는 용매 시스템은 같거나 또는 상이하다(예를 들어, 제1 용매 또는 용매 시스템은 본원에 기술된 어떤 것이고; 제2 용매 또는 용매 시스템은 본원에 기술된 어떤 것임). 특정 구체예에서, 제2 용매 또는 용매 시스템은 식염수, 완충액(예를 들어, 시트레이트 또는 PBS), 물, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매를 포함한다. 최종 현탁액은 임의로 분리되고(예를 들어, 초원심분리기에 의해), 혼합되며(예를 들어, 배취 혼합, 인-라인 혼합, 및/또는 와류), 재현탁되고(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 용매 또는 완충액 시스템으로), 조정되며, 초음파처리되고, 동결-융해되며, 압출되고, 및/또는 정제될 수 있다.
양이온성 지질
하나 또는 그 이상의 양이온성 지질이 제형에 포함될 수 있다. 본 발명의 화합물 외에 사용되는 다른 양이온성 지질은, 참고자료로 본원에 포함된 문헌: Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 107(5):1864-1869 (2010)에 기술된 바와 같이, 염화 N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄(DODAC), 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTMA), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄(DDAB), 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP, 키랄 형태 R-DOTAP 및 S-DOTAP를 포함한다), N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카복스아미도)에틸-N,N-다이메틸암모늄(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-(2,3-다이올레일옥시)프로필아민(DODMA), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸암모늄(DMRIE), 1,2-다이리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일카바모일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-O-에틸-3-포스포콜린(DPePC), 염화 다이스테아릴다이메틸암모늄(DSDMA), 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(12:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(16:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(18:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(18:1 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아미도스퍼민(DPPES), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아미도 L-리신(DPPEL), 염화 1-[2-(다이올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄(DOTIM), (1-메틸-4-(시스-9-다이올레일) 메틸-피리디늄-염화물)(SAINT), 및 C12-200을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
양이온성 지질은 상이한 키랄 형태(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질의 R 또는 S 형태) 또는 어떤 염 형태(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질의 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트 또는 메탄설포네이트 염)의 것들을 포함한다.
추가로, 양이온성 지질의 수많은 상용 제제가 제형에 포함될 수 있다. 이러한 상용 제제는 Invitrogen Corp.로 부터의 Lipofectamine™(DOSPA와 DOPE의 조합) 및 Lipofectin®(DOTMA와 DOPE의 조합); 및 Promega Corp.로부터의 Transfectam®(DOGS를 포함하는 조성물) 및 Transfast™을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
음이온성 지질
하나 또는 그 이상의 음이온성 지질이 제형에 포함될 수 있다. 그런 음이온성 지질은 포스파타이딜글리세롤(PGs), 카디올리핀(CLs), 다이아실포스파타이딜세린(PSs), 다이아실포스파타이트(PAs), 포스파타이딜이노시톨(PIs), N-아실포스파타이딜에탄올아민(NAPEs), N-석신일포스파타이딜에탄올아민, N-글루타릴포스파타이딜에탄올아민, 리실포스파타이딜글리세롤, 및 팔미토일올레오일포스파타이딜글리세롤(POPG), 및 상이한 키랄 형태(예를 들어, R 또는 S 형태), 염 형태(예를 들어, 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트 또는 메탄설포네이트 염), 및 이것들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
중성 지질
하나 또는 그 이상의 중성 지질이 제형에 포함될 수 있다. 이러한 중성 지질은 세라마이드, 스핑고미엘린(SM), 다이아실글리세롤(DAG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 키랄 형태 R-DSPC 및 S-DSPC를 포함한다), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이올레오일-글리세로-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE), 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(SOPE), 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 및 상이한 키랄 형태(예를 들어, R 또는 S 형태), 염 형태(예를 들어, 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트, 또는 메탄설포네이트 염), 및 이것들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 다이아실-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 다이아실-글리세로-sn-3-포스포에탄올아민 지질도 또한 본 발명의 지질 입자에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 제형에 존재하는 중성 지질 성분은 하나 또는 그 이상의 인지질을 포함한다. 추가의 구체예에서, 중성 지질 성분은 하나 또는 그 이상의 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 제형에 사용하기 위한 중성 지질의 선택은 약동학 및/또는 약력학 특성, 예를 들면 혈류 중의 지질 입자 크기 및 안정성을 고려하여 안내된다.
스테롤 유도체
하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체가 제형에 포함될 수 있다. 이론에 제한되길 원치 않지만, 스테롤 유도체는 제형을 안정화하고 및/또는 형질주입을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 스테롤 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올의 유도체(예를 들어, 콜레스탄올, 콜레스텐온 또는 코프로스탄올); 3β-[-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤, 예를 들어, 그것의 염산염); 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC); (2S,3S)-2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐아미노)에틸 2,3,4,4-테트라하이드록시부타노에이트(DPC-1); (2S,3S)-((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4,4-테트라하이드록시부타노에이트(DPC-2); 비스((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4-트라이하이드록시펜테인다이오에이트(DPC-3); 및 6-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)옥시도포스포릴옥시)-2,3,4,5-테트라하이드록시헥사노에이트(DPC-4)를 포함한다.
PEG -지질 포합체
하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체가 제형에 포함될 수 있다. 이론에 제한되길 원치 않지만, PEG-지질 포합체는 지질 벡터의 응집을 감소시킬 수 있었다. PEG-지질 포합체는 미국 특허 제5,885,613호 및 미국 가 특허출원 제2003/0077829호에 기술되고, 이들은 참고자료로 본원에 포함된다.
제형에 포함될 수 있는 PEG-지질 포합체는 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMPE)(예를 들어, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜-2000)(PEG-2000-DMPE)), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DSPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMG)(예를 들어, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-2000-DMG)), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DSG), 1,2-다이올레오일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOG), 3-N-[(ω-메톡시폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), R-3-[(ω-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일)]-1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-2000-C-DOMG) 및 PEG-세라마이드 포합체(예를 들어, 참고자료로 본원에 포함된 미국 특허 제5,820,873호에 기술된 PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가의 PEG-지질 포합체는 본원에 기술된 어떤 지질에 포합된 PEG, 예컨대 포스파타이딜에탄올아민 또는 세라마이드(참고자료로 본원에 포함된 미국 특허 제5,820,873호; 제5,534,499호; 및 제5,885,613호 참조), 및 본원에 기술된 어떤 PEG-지질 포합체의 염 형태(예를 들어, 나트륨, 암모늄 또는 트라이메틸암모늄 염)를 포함한다.
PEG-지질 포합체는 하나 또는 그 이상의 다양한 변형, 예컨대 본원에 기술된 어떤 지질 분자로 또는 상이한 분자량(예를 들어, 300 내지 5,000 달톤)의 PEG 부분으로의 치환을 포함할 수 있다. 예시적인 치환은 하나 또는 그 이상의 C14:0(표 4에서와 같이), C16(PEG-DPPE, PEG-DPG 등), C18:0(PEG-DSPE, PEG-DSG 등), 또는 C18:1(PEG-DOPE, PEG-DOG 등)을 폴리에틸렌글리콜 부분(예를 들어, PEG2000, PEG3400, PEG5000 등)과 조합하여 사용하여 PEG-지질 포합체(예를 들어, mPEG2000-DMG)를 형성하는 것을 포함한다. 다양한 분자량을 갖는 PEG 부분의 예는 PEG350, PEG550, PEG750, PEG1000, PEG2000, PEG3000, PEG3400, PEG4000 및 PEG5000을 포함한다.
다른 성분
제형은 지질 벡터를 안정화하고, 지질 벡터의 응집을 감소시키고, 및/또는 치료제(예를 들어, RNAi 제제)를 전달하는데 도움을 주는 어떤 다른 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 성분은 참고자료로 본원에 포함된, 미국 특허 제6,320,017호 및 제6,586,559호에 기술된 것들과 같은, ω-아미노 (올리고에틸렌글리콜) 알칸산 단량체에 기초한 폴리아마이드-지질 포합체(ATTA-지질); 강글리오사이드(예를 들어, 아시알로강글리오사이드 GM1 또는 GM2; 다이시알로강글리오사이드 GD1a, GD1a-NAcGal, GD1-b, GD2 또는 GD3; 글로보사이드, 모노시알로강글리오사이드 GM1, GM2 또는 GM3, 테트라시알로강글리오사이드 GQ1b, 및 트라이시알로강글리오사이드 GT1a 또는 GT1b); 항산화제(예를 들어, α-토코페롤 또는 β-하이드록시톨루이딘); 하나 또는 그 이상의 계면활성제(예를 들어, 소비탄 모노팔미테이트 또는 소비탄 모노팔미테이트, 유성 슈크로스 에스터, 폴리옥시에틸렌 소비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 소비톨 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 알킬 에터, 폴리옥시에틸렌 스테롤 에터, 폴리옥시에틸렌-폴리프로폭시 알킬 에터, 블록 중합체 및 세틸 에터, 및 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 또는 수소첨가된 피마자 오일 유도체 및 폴리글리세린 지방산 에스터, 예컨대 Pluronic®, Poloxamer®, Span®, Tween®, Polysorbate®, Tyloxapol®, Emulphor® 또는 Cremophor®(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스터를 포함하는 글리세롤-폴리에틸렌글리콜 리시놀리에이트의 주요 성분을 갖는 Cremophor® EL); 하나 또는 그 이상의 양친매성 제제(예를 들어, 식물성 오일, 예컨대 대두유, 홍화유, 올리브유, 참기름, 보라지유, 피마자유, 및 면실유; 미네랄 오일 및 수산 오일, 이러한 공급원으로부터 수소첨가된 및/또는 분별된 트라이글리세라이드; 중간 크기 사슬 트라이글리세라이드(MCT-오일, 예컨대 Miglyol®), 및 다양한 합성 또는 반합성 모노-, 다이- 또는 트라이글리세라이드, 예컨대 WO 92/05571에 개시된 규정된 비극성 지질, 및 아세틸화된 모노글리세라이드, 또는 지방산의 알킬 에스터, 예컨대 이소프로필 미리스트산, 에틸 올레산(EP 0 353 267 참조) 또는 지방산 알콜, 예컨대 올레일 알콜, 세틸 알콜); 및 본원에 기술된 어떤 염과 같은, 하나 또는 그 이상의 염을 포함한다. 전형적으로, 응집을 감소시키도록 선택된 지질 성분의 농도는 약 1 mol% 내지 15 mol%이다.
지질 벡터
본 발명의 제형은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, 식 (I)의 또는 표 1로부터 선택된 화합물) 및 치료제(예를 들어, RNAi 제제)를 수송할 수 있는 어떤 지질-기초 조성물을 포함할 수 있다. 예시적인 지질-기초 조성물은 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 본 발명의 화합물, 양이온성 지질, 음이온성 지질 또는 중성 지질) 및/또는 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체 및/또는 PEG-지질 포합체)을 포함한다.
지질 벡터는 어떤 생체적합성 지질 또는 지질 벡터(예를 들어, 리포솜, 리포플렉스 및 마이셀)를 형성할 수 있는 지질들의 조합을 사용하여 형성될 수 있다. 치료제의 지질 벡터 안으로의 캡슐화는 제제를 손상 또는 분해로부터 보호하거나 또는 제제의 세포 안으로의 유입을 용이하게 할 수 있다. 전하 상호작용의 결과로서의 지질 벡터(예를 들어, 양이온성 지질 벡터 및 음이온성 세포막)는 세포막과 상호작용 및 융합하고, 그로써 제제를 세포질로 방출시킨다. 리포솜은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 지질 분자, 및/또는 성분을 포함하는 이중 층의 소포이다. 지질 나노입자는 크기가 약 1 nm 내지 약 1,000 nm의 범위에 있는 리포솜이다. 리포플렉스는 전체적으로 포지티브 전하를 리포솜에 부여하기 위해 양이온성 지질 분자로 형성된 리포솜이다. 마이셀은 지질 분자의 단일 층을 갖는 소포이다.
리포솜
특정 구체예에서, 지질 벡터는 리포솜이다. 전형적으로, 사용된 지질은 이중층을 형성할 수 있고 양이온성이다. 적합한 지질 분자의 부류는 인지질(예를 들어, 포스포타이딜콜린), 지방산, 당지질, 세라마이드, 글리세라이드 및 콜레스테롤, 또는 이것들의 어떤 조합을 포함한다. 대안으로 또는 그 외에, 지질 벡터는 중성 지질(예를 들어, 다이올레오일포스파타이딜 에탄올아민(DOPE))을 포함할 수 있다. 지질 벡터를 형성할 수 있는 다른 지질이 본 분야에 알려져 있고 본원에 기술된다.
본원에 사용되는 것과 같은 "지질 분자"는 소수성 헤드 부분 및 친수성 테일 부분을 갖는 분자이고, 리포솜을 형성할 수 있으며, 본 발명의 화합물 또는 본원에 기술된 어떤 양이온성, 중성 또는 음이온성 지질을 포함한다. 지질 분자는 임의로 변형되어 친수성 중합체 기를 포함할 수 있다. 그러한 지질 분자의 예는 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2000-DSPE), 예를 들어, 그것의 암모늄 염 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2000-DSPE 카복시)을 포함한다.
지질 분자의 예는 천연 지질, 예컨대 카디올리핀(CL), 포스파티드산(PA), 포스파타이딜콜린(PC), 라이소포스파타이딜콜린(LPC), 포스파타이딜에탄올아민(PE), 포스파타이딜글리세롤(PG), 포스파타이딜이노시톨(PI) 및 포스파타이딜세린(PS); 지질 혼합물, 예컨대 레시틴; 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세레브로사이드, 설파타이드, 강글리오사이드 및 파이토스핑고신; 양이온성 지질, 예컨대 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DODAP), 브롬화 다이메틸다이옥타데실 암모늄(DDAB), 3-β-[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 브롬화 N-[1-(2,3,-다이테트라데실옥시)프로필]-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸암모늄(DMRIE), 브롬화 N-[1-(2,3,-다이올레일옥시)프로필]-N,N-다이메틸-N-하이드록시 에틸암모늄(DORIE) 및 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTMA); 포스파타이딜콜린, 예컨대 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린, 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(POPC); 포스포에탄올아민, 예컨대 2-다이뷰티릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE) 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(글루타릴); 포스파타이드산, 예컨대 다이세틸 포스페이트(DCP), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트; 포스파타이딜글리세롤, 예컨대 다이팔미토일 포스파타이딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일 포스파타이딜글리세롤(DOPG), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤); 포스파타이딜세린, 예컨대 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린, 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린; 카디올리핀, 예컨대 1',3'-비스[1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤; 및 PEG-지질 포합체, 예컨대 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-750], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000], 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]을 포함한다.
본 발명의 화합물은 상업적으로 구매가능한 지질 조성물을 포함하는, 어떤 유용한 지질 조성물과 조합될 수 있다. 그러한 조성물의 예는 Invitrogen Corp.로부터의 Lipofectamine™(DOSPA 및 DOPE의 조합) 및 Lipofectin®(DOTMA 및 DOPE의 조합); Promega Corp.로부터의 Transfectam®(DOGS를 포함하는 조성물) 및 Transfast™; Sigma-Aldrich Co.로부터의 NeuroPORTER™ 및 Escort™; Roche로부터의 FuGENE® 6; 및 Strategene으로부터의 LipoTAXI®를 포함한다. 공지된 지질 조성물은 문헌: Boado, Pharm . Res . 24:1772-1787 (2007)에 기술된 것과 같은, Trojan Horse Lipsome 기술을 포함한다.
리포솜은 또한 리포솜의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함할 수 있다. 그런 성분의 예는 콜레스테롤, 항산화제(예를 들어, α-토코페롤 또는 β-하이드록시톨루이딘), 계면활성제, 및 염을 포함한다.
리포솜은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물 및 리포솜의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 지질 성분을 포함하는, 지질 분자를 포함하는 어떤 유용한 조합일 수 있다. 당업자라면 특정 제제의 캡슐화, 리포솜의 안정성, 확대된 반응 조건, 또는 어떤 다른 적절한 인자에 유리한 조합을 최적화하는 방법을 알 것이다. 예시적인 조합은 문헌: Boado, Pharm . Res . 24:1772-1787 (2007)에 기술된다.
리포솜을 제조하는 것은 전형적으로 일반적인 2단계 공정을 통해 일어난다. 제1단계에서, 지질 및 지질 성분은 휘발성 유기 용매 또는 용매들의 혼합물에 혼합되어 균질한 지질의 혼합물이 보장된다. 용매의 예는 클로로폼, 메탄올, 사이클로헥산 및 t-뷰탄올을 포함한다. 그런 다음 용매는 제거되어 건조한 지질 혼합물이 필름, 분말 또는 펠릿으로 형성한다. 용매는 또한 어떤 공지된 분석 기술을 사용함으로써, 예컨대 질소, 회전 증발, 분무 건조, 동결건조 및 진공-건조를 사용함으로써, 어떤 공지된 분석 기술을 사용함으로써 제거될 수 있다.
제2단계에서, 건조한 지질 혼합물은 수성 용액으로 수화되어 리포솜이 형성된다. 제제가 수성 용액에 첨가될 수 있고, 그것은 캡슐화된 제제를 포함한 리포솜의 형성을 유발한다. 또는 달리, 리포솜이 수성 용액으로 먼저 형성된 다음 제제를 함유하는 다른 수성 용액에 노출된다. 제제의 캡슐화는 어떤 공지된 기술, 예컨대 반복적인 동결-해동 주기, 초음파처리 또는 혼합에 의해서 촉진될 수 있다. 이 접근방법의 추가의 예는 문헌: Boado, Pharm . Res . 24:1772-1787 (2007)에 기술된다. 또는 달리, 제제는 소수성 부분(예를 들어, 콜레스테롤)에 결합되어 친유성 유도체가 생성되고, 그 친유성 유도체는 다른 지질 분자와 함께 사용되어 리포솜이 형성된다.
제2단계 동안, 건조한 지질 혼합물은 폴리펩타이드-지질 포합체를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 공정은 다양한 추가 단계, 이를테면 지질 분자의 상전이 온도 이상으로 수성 용액을 가열한 후 그것을 건조한 지질 혼합물에 첨가하는 단계, 여기서 온도의 특정 범위는 약 40℃ 내지 약 70℃를 포함하고; 건조한 지질 혼합물과 수성 용액의 조합을 인큐베이션하는 단계, 여기서 특정 시간 범위는 약 30분 내지 약 2시간을 포함하고; 인큐베이션하는 동안 건조한 지질 혼합물과 수성 용액을 예컨대 와류 혼합, 진탕, 교반 또는 섞음에 의해 혼합하는 단계; 비전해질을 수성 용액에 첨가하여 생리학적 삼투질농도, 예컨대 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스 및 10% 슈크로스 용액을 보장하는 단계; 예컨대 압출 또는 초음파처리에 의해 큰 다중층 소포를 파괴하는 단계; 및 사전-형성된 리포솜을 폴리펩타이드-지질 포합체와 함께 추가 인큐베이션하는 단계, 여기서 건조한 지질 혼합물은 지질 분자를 함유하지 않는, 다양한 추가 단계를 임의로 포함할 수 있다. 당업자는 이 수화 단계 동안 특정 온도 및 인큐베이션 시간을 확인하여 유도체화된 지질 분자의 리포솜 안으로의 통합을 보장하거나 또는 안정한 리포솜을 얻을 수 있을 것이다.
본 발명의 화합물(들)은 리포솜을 형성하는 공정의 어떤 지점에서 첨가될 수 있다. 한 예에서, 화합물은 건조한 지질 혼합물이 형성되는 동안 지질 및 지질 성분에 첨가된다. 다른 예에서, 화합물은 지질 및 지질 성분을 함유하는 건조한 지질 혼합물로 사전-형성된 리포솜에 첨가된다. 또 다른 예에서, 마이셀은 화합물로 형성되고, 리포솜은 지질 및 지질 성분을 함유하는 건조한 지질 혼합물로 형성된 다음, 마이셀 및 리포솜이 함께 인큐베이션된다. 수성 용액은 제제 또는 리포솜을 안정화라기 위한 추가 성분, 예컨대 완충액, 염, 킬레이트화제, 식염수, 덱스트로스, 슈크로스, 등을 포함할 수 있다.
이 과정의 한 예에서, 지질 혼합물로 구성된 건조한 필름은 제제를 함유하는 수성 용액으로 수화된다. 이 혼합물은 먼저 50℃로 30분 동안 가열된 다음 실온으로 냉각된다. 그 다음, 혼합물은 폴리펩타이드-지질 포합체를 함유하는 건조한 필름상으로 이동된다. 혼합물은 그 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되어 폴리펩타이드-지질 포합체가 제제롤 함유하는 리포솜 안에 통합된다. 예를 들어, Zhang et al., J. Control . Release 112:229-239 (2006) 참조.
소포 구조를 갖는 지질 입자
특정 구체예에서, 지질 입자는 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 및/또는 아미노-아민 지질, 아미노-아마이드 지질, 또는 본 발명의 다른 지질) 및 RNAi 제제, 또한 중성 또는 양친매성 지질, PEG-지질 포합체, 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다.
하나 또는 그 이상의 RNA -결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 지질 입자
지질 입자는 또한 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제와 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 내부 응집체를 형성하고, 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 외부의 응집체 표면을 형성한다. 특정 구체예에서, 외부의 응집체 표면은 막, 지질 이중층 및/또는 다중 라멜라층이 아니다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)는 전체 지질의 약 10-90%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)은 전체 지질의 약 50%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)는 전체 지질의 약 30%를 나타낸다. 특정 구체예에서, 지질 입자의 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제를 갖는 핵산 페이로드의 복합체/응집체는 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 및/또는 본 발명의 아미노-아민 지질 또는 아미노-아마이드) 및 RNAi 제제를 포함하고, 지질 입자의 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 중성 또는 양친매성 지질, PEG-지질 포합체 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다. 다른 구체예에서, 입자의 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 아미노-아민 지질, 및/또는 아미노-아마이드 지질), 중성 지질, PEG-지질 포합체 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다.
RNAi 제제
RNA 간섭(RNAi)은 특정 RNA 분자의 분해를 유발하거나 또는 특정 유전자의 전사를 방해함으로써 유전자 발현을 억제하는 메커니즘이다. 본질적으로, RNAi 표적은 자주 바이러스 및 트랜스포존(고유한 면역 반응의 형태)으로부터의 RNA 분자이지만, 이것은 발생 및 게놈 보존을 조절하는데 또한 역할을 한다. RNAi의 메커니즘에 대한 단서는 작은 간섭 RNA 가닥(siRNA)인데, 이것은 표적화된 메신저 RNA(mRNA) 분자에 대해 충분히 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 가진다. siRNA는 RNAi 경로 내의 단백질을 표적화된 mRNA로 향하게 하고 그것들을 분해시키며, 그것들을 더 이상 단백질로 번역될 수 없는 더 작은 부분으로 파괴한다.
RNAi 경로는 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자를, 전형적으로 길이가 약 21 내지 약 23개의 뉴클레오타이드이고 약 19개의 염기쌍 듀플렉스를 함유하는 siRNA 분자로 절단하는 효소 다이서(Dicer)에 의해 개시된다. 가이드 가닥으로서 공지된, 각 단편의 2개의 가닥 중 하나가 다음 단계로 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)에 통합되고, 상보하는 서열과 쌍을 이룬다. RISC는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 서열을 갖는 단일-가닥 RNA의 절단을 중재한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 영역의 중간에서 일어난다. 이런 인식 사건의 결과는 전사-후 유전자 침묵이다. 이것은 가이드 가닥이 mRNA 분자와 특이적으로 쌍을 이룰 때 일어나고 RISC 복합체의 촉매 성분인 아고너트(Argonaute)에 의한 분해를 유도한다.
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 RNAi 제제를 세포에 시험관 내에서 또는 생체 내에서 (예를 들어, 대상의) 전달하기 위해 사용될 수 있다. RNAi 제제는 RNA:RNA 또는 RNA:DNA 가닥을 포함하는 상이한 타입의 이중-가닥 분자를 포함할 수 있다. 이들 제제는 듀플렉스(예를 들어, 3'-말단 상에 오버행(overhang)이 있거나 없는), 헤어핀 루프 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오타이드와 조합하여 형성할 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 발현 벡터를 포함하여, 다양한 구조로 세포에 도입될 수 있다. 예시적인 RNAi 제제는 본원에 기술된 siRNA, shRNA, DsiRNA 및 miRNA 제제를 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 길이가 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오타이드이고, 특정 RNAi 제제에 대한 바람직한 길이가 아래에서 기술된다.
RNAi 제제에 의한 기능적인 유전자 침묵은 표적화된 유전자 생성물의 완전한 억제를 반드시 포함하지는 않는다. 일부 경우에서, RNAi 제제에 의해 유발된 유전자 생성물 발현에서의 미미한 감소는 숙주 세포, 조직, 기관, 또는 동물에서 상당한 기능적인 또는 표현형 변화로 번역될 수 있다. 그러므로, 유전자 침묵은 기능적인 동등물인 것으로 이해되고, 침묵을 달성하기 위한 유전자 생성물 분해의 정도는 유전자 표적들 또는 숙주 세포 유형 사이에서 상이할 수 있다.
siRNA
작은 간섭 RNA(siRNA)는 일반적으로 3'-말단 상에서 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 가지거나 또는 어떤 오버행 없이 길이가 16 내지 30개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 21개의 뉴클레오타이드)의 이중-가닥 RNA 분자이다. 숙련된 의사는 이 서열 길이를 다양하게 할 수 있다(예를 들어, 유전자 침묵의 전체 수준을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해). 특정 구체예에서, 오버행은 3'-말단에서 UU 또는 dTdT이다. 일반적으로, siRNA 분자는 표적 DNA 분자의 한 가닥에 완전히 상보적인데, 왜냐하면 단일 염기쌍 미스매치조차도 침묵을 감소시키는 것으로 나타났기 때문이다. 다른 구체예에서, siRNA는 변형된 골격 조성물, 예컨대 2'-데옥시- 또는 2'-O-메틸 변형, 또는 본원에 기술된 어떤 변형을 가질 수 있다.
siRNA는 유전자 발현을 서열-특이적 방식으로 억제하거나 또는 하향-조절할 수 있는 핵산 분자를 말한다; 예를 들어서, Zamore et al., Cell 101:25 33 (2000); Bass, Nature 411:428-429 (2001); Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001); 및 PCT 공개 WO 00/44895호, WO 01/36646호, WO 99/32619호, WO 00/01846호, WO 01/29058호, WO 99/07409호 및 WO 00/44914호 참조. 유전자 침묵에 사용하기 위한 siRNA 분자의 제조 방법은 미국 특허 제7,078,196호에 기술되고, 이것은 참고자료로 본원에 포함된다.
shRNA
짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 헤어핀 루프 구조가 존재하는 단일-가닥 RNA 분자로, 같은 가닥 내에 상보하는 뉴클레오타이드를 허용하여 분자내 결합이 형성되게 한다. shRNA는 siRNA와 비교하여 뉴클레아제 분해에 대해 감소된 민감성을 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, shRNA는 길이가 19 내지 29개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 내지 21개의 뉴클레오타이드 또는 25 내지 29개의 뉴클레오타이드)의 줄기 길이를 가진다. 일부 구체예에서, 루프 크기는 길이가 4 내지 23개의 뉴클레오타이드이다. shRNA는 일반적으로 효능의 감소 없이, 하나 또는 그 이상의 미스매치, 예를 들어, shRNA 줄기의 2개의 가닥 사이의 G-U 미스매치를 함유할 수 있다.
DsiRNA
다이서-기질 RNA(DsiRNA)는 25 내지 35 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 제제이다. 이러한 길이의 제제는 RNA 간섭(RNAi) 경로의 다이서 효소에 의해 가공처리되는 것으로 여겨지는 반면, 25개의 뉴클레오타이드보다 짧은 제제는 일반적으로 다이서 생성물을 모방하고 다이서 가공처리를 모면한다. 일부 구체예에서, DsiRNA는 1 내지 4개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 1 또는 2개의 뉴클레오타이드)의 안티센스 또는 센스 가닥의 3'-말단에서 단일-가닥 뉴클레오타이드 오버행을 가진다.
DsiRNA 제제의 변형된 특정 구조는 참고자료로 본원에 포함된, 미국 특허 공개공보 제2007/0265220호에서와 같이, 문헌에 이미 기술되어 있다. 본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 추가의 DsiRNA 구조 및 특이한 조성물은 미국 특허 출원 제12/586,283호; 미국 특허 공개공보 제2005/0244858호, 제2005/0277610호, 제2007/0265220호, 제2011/0021604호, 제2010/0173974호, 제2010/0184841호, 제2010/0249214호, 제2010/0331389호, 제2011/0003881호, 제2011/0059187호, 제2011/0111056호; 및 PCT 공개공보 WO 2010/080129호, WO 2010/093788호, WO 2010/115202호, WO 2010/115206호, WO 2010/141718호, WO 2010/141724호, WO 2010/141933호, WO 2011/072292호, WO 2011/075188호에 기술되고, 이것들은 참고자료로 본원에 포함된다. 일반적으로, DsiRNA 구성물은 19 내지 23량체 siRNA에 대해 기술된 것과 같은 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 방법을 사용하여 합성된다(미국 특허 제5,804,683호; 제5,831,071호; 제5,998,203호; 제6,117,657호; 제6,353,098호; 제6,362,323호; 제6,437,117호; 제6,469,158호; 제6,111,086호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호 참조).
miRNA
마이크로RNA(miRNA)는 길이가 17 내지 25개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 내지 23개의 뉴클레오타이드)인 단일-가닥 RNA 분자이다. 숙련된 의사는 유전자 침묵의 전체 수준을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 이 서열 길이를 다양하게 할 수 있다. 이들 제제는 표적 메신저 RNA 상에서 상보하는 서열을 결합시킴으로써 표적 유전자를 침묵시킨다. 본원에 사용된 것과 같이 용어 "miRNA 전구체"는, 제한 없이, 일차 RNA 전사물, pri-miRNA 및 pre-miRNA를 포함하는 것으로 사용된다. 본 발명의 "miRNA 페이로드"는 pri-miRNA, pre-miRNA, 및/또는 miRNA(또는 성숙한 miRNA)를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 siRNA(예를 들어, DsiRNA)는 miRNA 서열을 통합하는 가이드 가닥을 제공할 수 있거나, 또는 miRNA 서열에 대해 충분히 상동성이어서 상기 miRNA로서 기능할 수 있다(이러한 siRNA "miRNA 모방체" 제공함).
안티센스 화합물
예시적인 안티센스 화합물은 연속하는 뉴클레오사이드 길이 범위를 포함하고, 여기서 범위의 상부 단부는 50개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 8개의 뉴클레오사이드이다. 특정 구체예에서, 범위의 상부 단부는 35개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 14개의 뉴클레오사이드이다. 추가의 구체예에서, 범위의 상부 단부는 24개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 17개의 뉴클레오사이드이다. 여전히 추가의 구체예에서, 안티센스 화합물은 20개의 연속하는 뉴클레오사이드이다. 당업자들은 본원에 개시된 바와 같이, 범위의 상부 단부가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연속하는 뉴클레오사이드를 포함하고 범위의 하부 단부가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속하는 뉴클레오사이드를 포함하는 것을 쉽게 인식할 것이다.
예시적인 안티센스 화합물은 표적 서열에 충분히 상보하는 적어도 8, 임의로 적어도 12, 임의로 적어도 15개의 연속하는 뉴클레오사이드의 신장부를 포함하여 전사, 번역을 간섭하고, 분해(임의로 뉴클레아제-중재된 분해)를 촉진하고 및/또는 달리 표적 서열의 기능을 파괴한다(예를 들어, 그렇지 않으면 기능적인 표적 서열의 기능, 예컨대 안티센스 화합물-중재된 메커니즘을 통해 프로모터, 인핸서 또는 다른 기능적인 핵산 표적 서열의 파괴를 간섭한다).
변형은 안티센스 화합물에 이루어질 수 있고 말단, 선택된 핵염기 위치, 당 위치 중 하나에 또는 뉴클레오사이드 내 연결 중 하나에 부착된 포합체기를 포함할 수 있다. 가능한 변형은, 2'-플루오린(2'-F), 2'-O메틸(2'-OMe), 2'-O-(2'-메톡시에틸)(2'-MOE) 고친화성 당 변형, 역 무염기 캡, 데옥시핵염기 및 바이사이클릭 핵염기 유사체, 예컨대 닫힌 핵산(LNA) 및 에틸렌-가교된 핵산(ENA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
RNAi 제제의 제조 방법
RNAi 제제는 표적 핵산(예를 들어, 표적 유전자)에 대해 지시된 적어도 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 선택된 표적 서열에 상보하는 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA의 경우에, 그것들은 그것에 결합함으로써 상보하는 RNA 가닥의 번역을 방지한다. 안티센스 DNA는 특이한 상보하는 (코딩 또는 비-코딩) RNA를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 원하는 표적 유전자에 80%, 85%, 90%, 95%, 99%까지 또는 심지어 100% 상보할 수 있다.
안티센스 및 센스 뉴클레오타이드, 및 해당 듀플렉스 또는 헤어핀 루프를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있고, 어떤 표적 핵산 서열을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 쉽게 적용될 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 예컨대 표적 서열을 분석하고 이차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대적인 안정성을 측정함으로써, 표적 특이성을 최적화 하기 위해; 및/또는 이차 구조, 예컨대 이량체, 헤어핀 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특잉한 결합을 감소시키거나 또는 금지시키는 다른 이차 구조의 형성을 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에서 또는 가까이에 있는 그런 영역들 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보하는 그런 서열들을 포함한다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은, 예를 들어서, v.4의 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어(Molecular Biology Insights) 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어(Altschul et al., Nucleic Acids Res . 25(17):3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. RNAi 제제를 제조하기 위한 비-제한 방법은 미국 특허 제5,804,683호; 제5,831,071호; 제5,998,203호; 제6,117,657호; 제6,353,098호; 제6,362,323호; 제6,437,117호; 제6,469,158호; 제6,111,086호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호에 기술되고, 이것들은 참고자료로 본원에 포함된다.
RNAi 제제는 예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 선형, 원형(예를 들어, 플라스미드), 구멍 뚫린 (nicked) 원형, 코일형, 슈퍼코일형, 연쇄체화된, 또는 하전된 것과 같이, 어떤 유용한 형태를 가질 수 있다. 추가로, 뉴클레오타이드는 5' 및 3' 센스 및 안티센스 가닥 말단 변형을 함유할 수 있고 블런트 또는 오버행 말단 뉴클레오타이드(예를 들어, 3'-말단에서의 UU 또는 TT), 또는 이것들의 조합을 가질 수 있다.
변형된 핵산, 이를테면 변형된 DNA 또는 RNA 분자는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNAi 제제)에서 자연 발생 핵산 대신 사용될 수 있다. 변형된 핵산은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 반감기, 안정성, 특이성, 전달, 용해도 및 뉴클레아제 내성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어서, siRNA 제제는 상기 기술된 유익한 특성을 부여하는 뉴클레오타이드 유사체로 부분적으로 또는 전체적으로 구성될 수 있다. 문헌: Elmn et al.(Nucleic Acids Res. 33:439-447 (2005))에 기술된 바와 같이, 합성된 RNA-유사 뉴클레오타이드 유사체(예를 들어, 닫힌 핵산(LNA))는 표적 유전자 생성물에 대해 침묵 활성을 나타내는 siRNA 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있다.
포스포다이에스터 결합의 비-가교 산소가 황에 의해 교체된, 포스포로싸이오에이트(PS) 골격 변형은, 뉴클레아제 분해에 대해 핵산 약물을 안정화시키기 위해 배치된 가장 최근의, 그리고 가장 통상적인 수단 중 하나이다. 일반적으로, PS 변형은 활성에 대해 큰 영향을 미치지 않으면서 두 개의 siRNA 가닥 모두에 대해 광범위하게 이루어질 수 있는 것으로 나타난다(Kurreck, Eur. J. Biochem . 270:1628-44 (2003)). 특정 구체예에서, PS 변형은 보통 3' 및 5' 단부에서 1개 또는 2개의 염기로 제한된다. 보라노포스페이트 링커는 낮은 독성을 가지면서 siRNA 활성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다(Hall et al., Nucleic Acid Res . 32:5991-6000 (2004)). 올리고뉴클레오타이드 골격에 대한 다른 예시적인 변형은 메틸포스포네이트, 포스포로다이싸이오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 알킬 포스포네이트(예를 들어, 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트(예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트), 아미노알킬포스포라미데이트, 싸이오노포스포라미데이트, 싸이오노알킬포스포네이트, 싸이오노알킬포스포트라이에스터, 및 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 갖는 단백질 뉴클레오타이드(PNA) 골격을 포함하고, 여기서 대표적인 PNA 화합물은 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호, 및 제5,719,262호, 및 Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)에 개시된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
골격에 대한 다른 변형은 인 원자를 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 내 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 내 연결, 또는 하나 또는 그 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 내 연결(예를 들어, 모폴리노 연결; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들)로 교체하는 것들을 포함한다.
특정 변형된 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일우라실, 5-프로핀일사이토신, 및 5-메틸사이토신)은 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 예시적인 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신 (5-me-C 또는 m5c); 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 및 하이포크산틴; 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체; 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체; 2-싸이오유라실; 2-싸이오싸이민; 2-싸이오시토신; 5-할로우라실 및 사이토신; 5-프로핀일 우라실 및 사이토신; 6-아조 우라실, 사이토신, 및 싸이민; 5-우라실(슈도우라실); 4-싸이오우라실; 8-할로, 8-아미노, 8-싸이올, 8-싸이오알킬, 8-하이드록시, 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌; 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신; 7-메틸구아닌; 7-메틸아데닌; 8-아자구아닌; 8- 아자아데닌; 7-데아자구아닌; 7-데아자아데닌; 3-데아자구아닌; 및 3- 데아자아데닌을 포함한다. 이들 변형된 핵염기는, 특정 구체예에서 다른 변형, 예컨대 본원에 기술된 어떤 당 변형과 조합될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 또는 그 이상의 치환된 당 부분을 함유할 수 있는데, 여기서 변형은 리보스 고리의 어떤 반응성 부위(예를 들어, 리보스 고리의 2'-OH), 또는 하나 또는 그 이상의 보편적 염기에서 이루어질 수 있다. 예시적인 변형은 F, Br 또는 Cl과 같은 2'-할로; 2'-O-알킬, 2'- S-알킬, 또는 2'-N-알킬, 예컨대 2'-OMe; 2'-O-(알킬-O)n-알킬, 예컨대 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O[(CH2)nO]mCH3, 2'-O(CH2)nOCH3, 2'-O(CH2)2ON(CH3)2O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, 2'-O(CH2)nONH2 및 2'-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이고; 2'-O-알켄일, 2'-S-알켄일, 또는 2'-N-알켄일; 2'-O-알킨일, 2'-S-알킨일, 또는 2'-N-알킨일을 포함하며, 여기서 알킬, 알켄일 및 알킨일은 치환된 또는 비치환된 C1-10 알킬 또는 C2 -10 알켄일 및 알킨일, 그뿐만 아니라 리보스의 2'와 4' 위치 사이의 가교 변형으로 닫힌 핵산(LNA)이 형성될 수 있다. 예시적인 보편적 염기는 1-β-D-리보퓨라노실-5-나이트로인돌 및 1-β-D-리보퓨라노실-3-나이트로피롤과 같이, 변형된 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 당 부분의 1' 위치에, 또는 뉴클레오타이드 당 부분 치환에서 동등한 위치에 위치된 헤테로사이클릭 부분을 포함한다.
특정 구체예에서, 변형의 기술된 형태 및/또는 변형 패턴을 포함하는 핵산이 사용될 수 있다. 핵산의 예시적인 변형 및 변형 패턴에 관련된 추가의 상세한 내용은, 예를 들어 적어도 하기 참고문헌에서 찾아볼 수 있다: US 2010/0240734; WO 2010/080129; WO 2010/033225; US 2011/0021604; WO 2011/075188; WO2011/072292; WO 2010/141724; WO 2010/141726; WO 2010/141933; WO 2010/115202;WO 2008/136902; WO/2011/109294; WO/2011/075188; PCT/US11/42810; PCT/US11/42820; 미국 출원 제61/435,304호; 미국 출원 제61/478,093호; 미국 출원 제61/497,387호; 미국 출원 제61/529,422호; 미국 특허 제7,893,245호; WO 2007/051303; 및 US 2010/0184209. 각 선행 문헌은 그것의 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
RNAi 유전자 표적
본 발명은 RNAi 제제와 조합되어, 화합물 또는 제형을 사용한 치료에 의해 질환에 걸린 조직 또는 기관에서 표적 유전자의 침묵을 특징으로 한다. 본 발명의 치료 능력은 질환 상태(예를 들어, 암)의 확립 또는 보존에 포함되는 것으로 공지되었거나 또는 여겨지는 특이하고 표적화된 유전자의 mRNA 분자가 RNAi 제제에 의해 분해될 때 실현된다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 RNAi 표적의 예는 발달상의 단백질, 예컨대 부착 분자, 사이클린 키나제 억제제, Wnt 계열 구성원, Pax 계열 구성원, Winged 나선 계열 구성원, Hox 계열 구성원, 사이토카인/림포카인 및 그것의 수용체, 성장/분화 인자 및 그것의 수용체, 신경전달물질 및 그것의 수용체; 발암유전자-코드화된 단백질(예를 들어, ABL1(UniProt Entry No. P00519, NCBI Gene ID: 25), AR(UniProt Entry No. P10275, NCBI Gene ID: 3647), β-카테닌(CTNNB1, UniProt Entry No. P35222, NCBI Gene ID: 1499), BCL1(UniProt Entry No. P24385, NCBI Gene ID: 595), BCL2(UniProt Entry No. P10415, NCBI Gene ID: 596), BCL6(UniProt Entry No. P41182), CBFA2(UniProt Entry No. Q01196, NCBI Gene ID: 861), CBL(UniProt Entry No. P22681, NCBI Gene ID: 687), CSF1R(UniProt Entry No. P07333, NCBI Gene ID: 1436), ERBA1(UniProt Entry No. P10827, NCBI Gene ID: 7067), ERBA2(UniProt Entry No. P10828, NCBI Gene ID: 7068), ERBB(UniProt Entry No. P00533, NCBI Gene ID: 1956), ERBB2(UniProt Entry No. P04626, NCBI Gene ID: 2064), ERBB3(UniProt Entry No. P21860, NCBI Gene ID: 190151), ERBB4(UniProt Entry No. Q15303, NCBI Gene ID: 600543), ETS1(UniProt Entry No. P14921, NCBI Gene ID: 2113), ETS2(UniProt Entry No. P15036, NCBI Gene ID: 2114), ETV6(UniProt Entry No. 41212, NCBI Gene ID: 2120), FGR(UniProt Entry No. P09769, NCBI Gene ID: 2268), FOS(UniProt Entry No. P0110, NCBI Gene ID: 2353), FYN(UniProt Entry No. P06241, NCBI Gene ID: 2534), HCR(UniProt Entry No. Q8TD31, NCBI Gene ID: 54535), HRAS(UniProt Entry No. P01112, NCBI Gene ID: 3265), JUN(UniProt Entry No. P05412, NCBI Gene ID: 3725), KRAS(UniProt Entry No. P01116, NCBI Gene ID: 3845), LCK(UniProt Entry No. P06239 NCBI Gene ID: 3932), LYN(UniProt Entry No. P07948, NCBI Gene ID: 4067), MDM2(UniProt Entry No. Q00987, NCBI Gene ID: 4193), MLL1(UniProt Entry No. Q03164, NCBI Gene ID: 4297), MLL2(UniProt Entry No. O14686, NCBI Gene ID: 8085), MLL3(UniProt Entry No. Q8NEZ4, NCBI Gene ID: 58508), MYB(UniProt Entry No. P10242, NCBI Gene ID: 4602), MYC(UniProt Entry No. P01106, NCBI Gene ID: 4609), MYCL1(UniProt Entry No. P12524, NCBI Gene ID: 4610), MYCN(UniProt Entry No. P04198, NCBI Gene ID: 4613), NRAS(UniProt Entry No. P01111, NCBI Gene ID: 4893), PIM1(UniProt Entry No. P11309, NCBI Gene ID: 5292), PML(UniProt Entry No. P29890, NCBI Gene ID: 5371), RET(UniProt Entry No. P07949, NCBI Gene ID: 5979), SRC(UniProt Entry No. P12931, NCBI Gene ID: 6714), TAL1(UniProt Entry No. P17542, NCBI Gene ID: 6886), TAL2(UniProt Entry No. Q16559, NCBI Gene ID: 6887), TCL3(UniProt Entry No. P31314, NCBI Gene ID: 3195), TCL5(UniProt Entry No. P17542, NCBI Gene ID: 6886), 및 YES(UniProt Entry No. P07947, NCBI Gene ID: 7525)); 종양 억제제 단백질(예를 들어, BRCA1(UniProt Entry No. P38398, NCBI Gene ID: 672), BRCA2(UniProt Entry No. P51587, NCBI Gene ID: 675), MADH4(UniProt Entry No. Q13485, NCBI Gene ID: 4089), MCC(UniProt Entry No. P23508, NCBI Gene ID: 4163), NF1(UniProt Entry No. P21359, NCBI Gene ID: 4763), NF2(UniProt Entry No. P35240, NCBI Gene ID: 4771), RB1(UniProt Entry No. P06400, NCBI Gene ID: 5925), TP53(UniProt Entry No. P04637, NCBI Gene ID: 7157), PLK1(UniProt Entry No. P53350, NCBI Gene ID: 9606), KIF1-결합 단백질(UniProt Entry No. Q96EK5, NCBI Gene ID: 9606) 및 WT1(UniProt Entry No. P19544, NCBI Gene ID: 4790)); 리포단백질(예를 들어, 아포리포단백질 B(ApoB100, UniProt Entry No. P04114, NCBI Gene ID: 338)); 효소(예를 들어, ACC 합성효소 및 산화효소, ACP 불포화효소 및 수산화효소, ADP-글루코스 파이로포릴라제, ATPase, 알콜 탈수소효소, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 셀룰라제, 칼콘 합성효소, 키티나제, 사이클로옥시게나제, 탈카복실화효소, 덱스트리나제, DNA 및 RNA 중합효소, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 산화효소, 과립-결합된 전분 합성효소, GTPase, 헬리카제, 허니셀룰라제, 인티그라제, 이눌리나제, 전환효소, 아이소머라제, 키나제(예를 들어, PLK1(UniProt Entry No. P53350, NCBI Gene ID: 9606)), 락타제, 라이가제(예를 들어, COP1로서도 알려져 있는 고리핑거- 및 WD 반복-함유 단백질 2(RFWD2)), 리파제, 리폭시게나제, 라이소자임, 노팔린 합성효소, 옥토핀 합성효소, 펙틴에스터제, 과산화효소, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 파이타제, 식물 성장 조절제 합성효소, 폴리갈락투로나제, 단백질분해효소 및 펩티다제, 풀라나제, 재조합효소, 역전사효소, 리뷸로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제(RuBisCos), 토포아이소머라제, 전달 효소, 예컨대 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실전달효소 1(HPRT1) 및 자일라나제)를 포함한다.
간은 대사(예를 들어, 다양한 과콜레스테롤혈증의 리포단백질 대사) 및 순환 단백질(예를 들어, 혈우병의 응고 인자)의 분비에서 그것의 중심 역할을 부여한 핵산 치료를 위한 가장 중요한 표적 조직 중 하나이다. 또한, 만성 간염 및 간경변과 같은 후천적 장애는 통상적이고 폴리뉴클레오타이드-기초 간 치료에 의해 또한 잠재적으로 치료된다. 간에 의해 영향을 주거나 받는 수많은 질환 또는 상태는 간에서 유전자 발현의 녹다운(억제)을 통해 잠재적으로 치료된다. 예시적인 간 질환 및 상태는 다음을 포함한 목록으로부터 선택될 수 있다: 간암(간세포암종, HCC 포함), 바이러스 감염(간염 포함), 대사 장애(고지혈증 및 당뇨병 포함), 섬유증, 및 급성 간손상. 간 치료(예를 들어, 특히 HCC에 표적화된 치료 포함)를 위한 -및 임의로 다른 암을 포함하는 다른 표적, 질환 및/또는 장애를 해결하는 치료를 위한- 예시적인 분자 표적은, 다른 것들 중에서도 CSN5(UniProt Entry No. Q92905, NCBI Gene ID: 10987), CDK6(UniProt Entry No. Q00534, NCBI Gene ID: 1021), ITGB1(UniProt Entry No. P05556, NCBI Gene ID: 3688), MYC(UniProt Entry No. P01106, NCBI Gene ID: 4609), TGFβ1(UniProt Entry No. P01137, NCBI Gene ID: 7040), 사이클린 D1(UniProt Entry No. Q9H014, NCBI Gene ID: 595), 헵사이딘(UniProt Entry No. P81172, NCBI Gene ID: 57817), PCSK9(UniProt Entry No. Q8NBP7, NCBI Gene ID: 255738) 및 트랜스싸이레틴(TTR, UniProt Entry No. P02766, NCBI Gene ID: 7276)을 포함한다.
본 발명의 제형은 임의로 정상적인 조직(예를 들어, 정상적인 간 조직)에, 및 다양한 모델(예를 들어, 동소이식 간 모델, 피하 간 모델 등)에 대해 표적화될 수 있다.
본 발명의 제형에 대한 한 가지 예시적인 표적은 아포리포단백질 B(ApoB)이고, 이것은 다양한 부류의 리포단백질: 카일로미크론, 초저밀도 리포단백질(VLDL), 중간 밀도 리포단백질(IDL), 및 저밀도 리포단백질(LDL)에서 발견된다. ApoB는 ApoB/E 수용체에 의한 LDL 입자의 세포 결합 및 내재화를 위한 인식 신호로서 기능한다. 아포리포단백질 B-함유 리포단백질의 축적 또는 과잉은 죽상동맥경화증과 같은 지질-관련 장애를 가져올 수 있다. ApoB를 감소시키는 제형된 치료는 지질-관련 장애를 치료하기에 유용할 수 있다. 한 가지 핵산 기초 치료는 안티센스 치료의 형태로 마우스에서 생체 내 ApoB 수준을 감소시키고, 치료는 계속해서 혈청 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드 수준(미국 공개공보 제2003/0215943호)을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 ApoB의 적당한 하향조절 및 지질-관련 장애를 치료하는 데 있어 표적으로서의 그것의 용도를 증명하였다.
본 발명의 제형에 대한 다른 예시적인 표적은 단백질 C이고, 이것은, 예를 들어, 혈우병의 치료에 대해 표적화될 수 있다.
치료제의 전달
본 발명의 제형은 치료제(예를 들어, 다중음이온성 제제, 핵산 또는 RNAi 제제)를 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 제형에 의해 전달된 제제는 유전자-침묵을 위해 (예를 들어, 대상에서 시험관 내 또는 생체 내에서) 또는 대상에서 질환(예를 들어, 암)를 치료하거나 또한 예방학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다.
치료제의 전달은 어떤 유용한 방법을 사용함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 화합물을 함유하는 제형을 사용하는 전달은 동등한 용량의 대조군과 비교하여, 1) 표적 유전자의 녹다운 또는 2) 독성 또는 내성에 의해 평가될 수 있다. 이들 평가는 본 발명의 화합물(예를 들어, 식 (I) 또는 표 1의 어떤 화합물)과 조합하는 제형 중의 지질들, 예컨대 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질(예를 들어, DOTAP, DODMA, DLinDMA, 및/또는 DLin-KC2-DMA)과의 어떤 유용한 조합으로 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제의 전달의 개선은 본 발명의 화합물을 사용할 때 관찰되고, 여기서 개선은 대조군과 비교하여, 25% 이상(예를 들어, 전달에서 2배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 이상의 개선)이다.
RNAi 제제의 전달
RNAi 침묵은 광범위한 세포에서 사용될 수 있는데, 여기서 HeLa S3, COS7, 293, NIH/3T3, A549, HT-29, CHO-KI 및 MCF-7 셀라인은 어떤 수준의 siRNA 침묵에 민감하다. 더욱이, 포유동물 세포에서의 억제는 표적화된 유전자에 대해 특이성을 갖는 RNA 수준에서 일어날 수 있고, 여기서 RNA와 단백질 억제 사이의 강력한 상관관계가 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 화합물, 및 이것의 제형은, 사용되어 RNAi 제제를 하나 또는 그 이상의 세포(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내의)에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 RNAi 제제는 본원에 기술된 것과 같은 siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, 및 DsiRNA 제제를 포함한다.
시험관 내 표적 녹다운
RNAi 제제의 전달은 어떤 유용한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어서, 치료제를 포함하는 제형은 세포 배양 모델(예를 들어, HeLa 세포)에 시험관 내에서 형질주입될 수 있고, 여기서 종결 지점 측정은: (i) qPCR을 사용하는 mRNA 정량; (ii) 웨스턴 블롯을 사용하는 단백질 정량; (iii) 본 발명의 제제 및/또는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질의 표지된 세포 내재화 중 하나 또는 그 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 흡수 또는 전달은 상기 언급된 종결 지점의 정도 및 기간 둘 다에 대해 평가될 수 있다. 전달에 앞서, 제형은 실온에서 약 30분 동안 세포 배양 배지로 희석될 수 있고, 최종 농도는 용량-반응 실험에서 치료제 또는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질의 0 내지 50 nM로 다양할 수 있다. 시간-경과 실험에 대해, 용량-실험으로부터의 최적 농도는 다양한 인큐베이션 시간, 예를 들어, 30분 내지 7일 동안 연구될 수 있다.
다중음이온성 페이로드 및 지질 제형의 기능성은 또한 지질 화합물 및 치료제를 형광 태그로 구별하여 표지하고 형광 공유 국소화(colocalization) 연구를 수행함으로써 시험될 수 있다. 본 발명의 화합물의 다중음이온성 페이로드 및/또는 부착된 형광 표지를 전달하는 능력은 세포 내부의 전체 형광을 측정하고, 엔도솜 또는 리소좀 구획과 안정하게 결합되지 않은 형광을 측정하는 것 두 가지에 의해 평가될 수 있다(RNAi를 촉발하는 치료제는 기능하기 위해서 세포 내부에 도달할 뿐만 아니라, 세포의 세포질에도 도달하는 것이 필요하다). 형광 국소화의 성능 및 세포 추적 연구가 본 분야에 기술되어 있다(Lu, et al., Mol . Pharm . 6(3):763, 2009; McNaughton et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A. 106(15):6111, 2009).
특정 표적 세포 유형 및 표적 조직으로의 전달
본 발명의 화합물은 치료제를 다양한 기관 및 조직에 전달하여 다양한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 표적화된 조직 또는 기관은 간, 췌장, 폐, 전립선, 콩팥, 골수, 비장, 흉선, 림프절, 뇌, 척수, 심장, 골격근, 피부, 구강 점막, 식도, 위, 회장, 소장, 결장, 방광, 자궁경부, 난소, 고환, 유선, 부신, 지방조직(백색 및/또는 갈색), 혈액(예를 들어, 조혈세포, 예컨대 사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, CD4+ 세포와 같은, 조혈세포), 림프구 및 다른 혈액 계통 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암 치료
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 치료제(예를 들어, RNAi 제제)를 암에 걸렸거나 또는 암이 발생할 위험(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 증가된 위험)이 있는 대상에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 암은 간암(예를 들어, 간세포암종, 간모세포종, 담관암종, 혈액육종 또는 혈액내피종) 또는 신경모세포종을 포함한다. 예시적인 종양 질환 및 관련 합병증은 암종(예를 들어, 폐, 유방, 췌장, 결장, 간세포, 신장, 여성생식기, 편평세포, 제자리 암종), 림프종(예를 들어, 조직구 림프종, 비-호지킨 림프종), MEN2 증후군, 신경섬유종증(시반세포 종양 포함), 골수이형성증후군, 백혈병, 종양맥관형성, 갑상선, 간, 뼈, 피부, 뇌, 중추신경계, 췌장, 폐(예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암(NSCLC)), 유방, 결장, 방광, 전립선, 위장관, 자궁내막, 나팔관, 고환 및 난소의 암, 위장관기질종양(GIST), 전립선종, 비만세포종( 개 비만세포종 포함), 급성 골수성 골수섬유증, 백혈병, 급성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 만성 림프성백혈병, 다발성 골수종, 악성 흑색종, 비만세포증, 신경교종, 악성 뇌교종, 성상세포종, 신경모세포종, 육종(예를 들어, 신경외배엽 기원 또는 평활근육종의 육종), 종양의 다른 조직으로의 전이 및 화학요법-유발된 저산소증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
투여 및 투약량
본 발명은 치료제(예를 들어, RNAi 제제)를 포함하는 제형과 같은 화합물을 함유하는 약학적 조성물, 또는 치료적으로 유효한 양의 조성물에 관련된다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기 위해 제형될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 또한 적당한 제형을 위한 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제형은 미국 펜실베니아주, 필라델피아시에 소재한 Mack Publishing Company에서 발행한 Remingtons Pharmaceutical Sciences , 17th ed., 1985에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달 방법의 간단한 리뷰에 대해서는, 예를 들어 Langer, Science 249:1527-1533, 1990 참조.
약학적 조성물은 예방 및/또는 치료 처치를 위해 비경구, 비강 내, 국소, 경구, 또는 국소 투여, 예컨대 경피 수단에 의한 국소 투여를 위해 의도된다. 약학적 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥 내, 근육 내 또는 피하 주사에 의해), 또는 경구 섭취에 의해, 또는 혈관 또는 암 상태에 의해 영향을 받은 영역에서 국소 적용 또는 관절 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여의 추가 경로는 혈관 내, 동맥 내, 종양 내, 복강 내, 뇌실 또는 심실 내(intraventricular), 경막 내, 및 비강, 눈에, 공막 내, 안와, 직장, 국소, 또는 에어로졸 흡입 투여를 포함한다. 지속성 방출 투여는 또한 데포 주사 또는 분해성 이식물 또는 성분과 같은 수단에 의해 본 발명에 특별하게 포함된다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 또는 현탁되어 있는 상기 언급된 제제를 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하게 위해 필요한 약학적으로 허용가능한 보조물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 긴장 조정제, 습윤제, 계면활성제 등을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 경구 전달을 위한 조성물을 제공하는데, 이것은 정제, 캡슐 등의 제형에 대해 결합제 또는 충전제와 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 국소 투여를 위한 조성물을 제공하는데, 이것은 크림, 연고 등의 제형을 위한 용매 또는 유화제와 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다.
이들 조성물은 종래의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 그 결과 생성되는 수성 용액은 있는 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 또는 동결건조되고, 동결건조된 제제는 투여에 앞서 멸균 수성 담체와 조합될 수 있다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 그 결과의 고체 형태의 조성물은 다중 단일 용량 단위로 포장될 수 있고, 각각은 고정된 양의 상기 언급된 제제 또는 제제들을, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장으로와 같이 함유할 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 신축가능한 양이 담길 수 있는 용기에, 예컨대 국소로 적용가능한 크림 또는 연고를 위해 고안된, 짤 수 있는 튜브에 포장될 수 있다.
유효한 양을 함유하는 조성물은 예방 또는 치료 처치를 위해 투여될 수 있다. 예방 적용에서, 조성물은 종양 또는 암의 발생에 대해 임상적으로 측정된 소인을 나타내거나 또는 민감성이 증가되어 있는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자(예를 들어, 사람)에게 임상적인 질환 또는 종양형성의 개시를 지연시키거나, 감소시키거나, 또는 바람직하게는 방지하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료 적용에서, 조성물은 이미 암에 걸려 있는 환자(예를 들어, 사람)에게 상태의 증상 및 그것의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이 목적을 달성하기에 충분한 양은 "치료적으로 유효한 용량", 즉 질환 또는 의학적 상태와 관련된 일부 증상을 실질적으로 개선하기에 충분한 화합물의 양으로서 정의된다. 예를 들어서, 암의 치료에서, 질환 또는 상태의 어떤 증상을 감소시키거나, 방지하거나, 지연시키거나, 억압하거나, 또는 저지하는 제제 또는 화합물이 치료적으로 유효할 것이다. 치료적으로 유효한 양의 제제 또는 화합물은 질환 또는 상태를 치료하기 위해 필요할 뿐만 아니라 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공하게 되어 질환 또는 상태의 발병이 지연되거나, 방해되거나, 또는 방지되고, 또는 질환 또는 상태의 증상이 호전되거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 용어가 변화되거나 또는, 예를 들어 덜 심각하거나 또는 개인의 회복이 가속화된다.
이런 용도에 유효한 양은 질환 또는 상태의 심각성 및 환자의 체중 및 일반적인 상태에 좌우될 수 있지만, 일반적으로 환자당 용량당 약 0.5 mg 내지 약 3000 mg의 제제 또는 제제들의 범위일 수 있다. 초기 투여 및 추가 투여에 적합한 체계는 초기 투여에 이어서 반복된 용량을 하나 또는 그 이상의 시간, 일, 주 또는 달 간격으로 계속해서 투여하는 것이 전형적이다. 본 발명의 조성물에 존재하는 제제의 유효한 총량은 포유동물에게 단일 용량으로서, 볼루스(bolus)로서 또는 비교적 짧은 기간의 시간에 걸친 주입에 의해 투여될 수 있거나, 또는 분별된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있고, 여기서 다중 용량은 더 연장된 기간의 시간에 걸쳐 (예를 들어 매 4-6, 8-12, 14-16 또는 18-24시간, 또는 매 2-4일, 1-2주, 1달 1회의 용량) 투여된다. 또는 달리, 혈액 중에 치료적으로 유효한 농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥 내 주입이 고려된다.
본 발명의 조성물 내에 존재하고 포유동물(예를 들어 사람)에 적용되는 본 발명의 방법에 사용된 하나 또는 그 이상의 제제의 치료적으로 유효한 양은 통상적으로-숙련된 당업자에 의해 포유동물의 연령, 체중, 및 상태의 개별적인 차이를 고려함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 제제는 대상(예를 들어 사람과 같은 포유동물)에게 유효한 양으로 투여되는데, 이것은 치료된 대상에서 바람직한 결과(예를 들어, 암 또는 신경퇴행성 장애의 둔화 또는 차도)를 생성하는 양이다. 이러한 치료적으로 유효한 양은 당업자들에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
환자는 또한 제제를 1주 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회 또는 그 이상) 용량당 약 0.1 내지 3,000 mg, 1주에 용량당 0.1 내지 2,500(예를 들어, 2,000, 1,500, 1,000, 500, 100, 10, 1, 0.5 또는 0.1) mg의 범위로 받을 수 있다. 환자는 또한 조성물의 제제를 2 또는 3주당 1회 용량당 0.1 내지 3,000 mg의 범위로 받을 수 있다.
투여될 제형 및 페이로드(예를 들어, DsiRNA)의 양(용량)은 경험적으로 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 발현의 유효한 녹다운은 0.0001 내지 10 mg/kg 동물 체중의 핵산 페이로드 및 0.001-200 mg/kg 동물 체중의 전달 제형을 사용하여 관찰된다. 마우스에서 예시적인 양은 0.1-5 mg/kg의 핵산 페이로드 및 0.7-100 mg/kg의 전달 제형이다. 임의로, 약 1-50 mg/kg의 전달 제형이 투여된다. 페이로드(예를 들어, DsiRNA)의 양은 그것이 전형적으로 더 큰 용량에서는 독성이 아니기 때문에 쉽게 증가된다.
특정 구체예에서, 용량은 일, 주, 또는 더 긴 기간(예를 들어, 1 내지 28일 또는 그 이상)에 걸쳐 매일, 또는 단지 1회, 또는, 예를 들어, 급성 대 만성 징후 등에 따라, 다른 간격으로, 투여될 수 있다.
유효한 양을 포함하는 본 발명의 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 용량 및 투여 스케줄은 환자의 질환 또는 상태의 심각성에 기초하여 결정되고 조정될 수 있는데, 이것은 임상의 또는 당업자에 의해 흔히 실시된 방법에 따른 치료의 전 과정 동안 모니터링될 수 있다.
본 발명의 화합물 및 제형은 종래의 처치 또는 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있거나 또는 종래의 처치 또는 치료 방법과 별도로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 제형이 다른 제제와의 조합 치료로 투여될 때, 그것들은 개체에 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또는 달리, 본 발명에 따르는 약학적 조성물은 본원에 기술된 것과 같이, 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 본 분야에 공지된 또 다른 치료 또는 예방 제제와 결합된 본 발명의 화합물 또는 제형의 조합을 포함한다.
제형된 제제들은 키트로서 함께 포장될 수 있다. 그것의 비-제한적인 예는, 예를 들어 2가지 알약, 알약 및 분말, 좌약 및 바이알 중의 액체, 2가지 국소 크림 등을 함유하는 키트를 포함한다. 키트는 분말 형태를 복원하기 위한 바이알, 주사용 주사기, 맞춤용 정맥 내 전달 시스템, 흡입기 등과 같이 환자에게 단위 용량의 투여에 도움을 주는 선택적인 구성요소를 포함할 수 있다. 추가로, 단위 용량 키트는 조성물의 제형 및 투여를 위한 설명서를 함유할 수 있다. 키트는 한 명의 환자를 위한 단일 용도로, 특정 환자를 위한 다중 용도로(일정한 용량으로 또는 개별적인 화합물은 치료가 진행되면서 효능이 다양할 수 있는 경우) 제조될 수 있거나; 또는 키트는 다수의 환자에게 투여하기에 적합한 다중 용량을 함유할 수 있다("벌크 포장"). 키트 구성요소는 상자, 블리스터 팩, 병, 튜브 등으로 조립될 수 있다.
조립된 나노입자에서 지질의 pKa 값의 측정
지질의 상이한 물리화학적 성질은 상이한 환경에 존재할 때 지질의 행동방식에 크게 영향을 미친다. 한 가지 이러한 중요한 특성은 지질의 이온화 상수(Ka)이다. 지질의 고유한 pKa는 어셈블링된 나노입자에 존재할 때 그것의 행동방식에 대한 정확하고 올바른 설명이 아닐 수 있다. 지질은 수성 환경에 존재할 때 높은 유전상수를 갖게 되는 환경을 경험하는 반면, 어셈블링된 나노입자/소포에서 그것은 낮은 유전상수를 제공하는 지질에 의해 둘러싸인다. 또한, 둘러싸는 지질, 콜레스테롤, 및 페길화된 지질은 모두 제형의 외관상 pKa에게 영향을 준다. 양이온성 지질과 핵산 사이의 상호작용의 성질은 정전기이고, 제형의 외관상 pKa는 나노입자에서 핵산의 캡슐화 및 또한 그것의 후속적인 세포 내 방출을 결정한다.
TNS 형광 방법이 사용되어 제형의 지질의 외관상 pKa를 결정할 수 있다. TNS(2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산)은 네거티브로 하전된 형광 염료인데, 이것의 형광은 물의 존재하에서 퀀칭된다. TNS는 포지티브로 하전된 막으로 분배하고 이것은 물의 제거로 인하여 형광의 증가를 유발한다. 따라서 형광의 증가는 상이한 pH 환경에 존재할 때 양이온성 지질의 이온화를 추정하기 위해 사용될 수 있다. TNS를 사용하여 pKa를 측정하는 방법은, 예를 들어, 실시예에 기술된 바와 같이 본 분야에 알려져 있다.
실시예
실시예 1: 케톤 및 일차 아민으로부터 아미노-아민 지질 L-1의 합성
Figure 112014046675715-pct00029
케톤 a(1 당량) 및 아민 b(1.1 당량)를 모두 N2 분위기하에서 건조한 플라스크에서 다이클로로에탄에 녹이고 실온(RT)에서 30분 동안 교반하였다. 트라이아세톡시보로수화물(1.5 당량)을 첨가하고, 그 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응을 1 N NaOH로 퀀칭하였다. 퀀칭된 반응을 DCM으로 희석하고, 물로 1회 추출한 후, 식염수로 1회 추출하여, 생성된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 건조된 용액을 여과하고 회전증발기 상에서 농축시켰다. 그 잔류물을 실리카 칼럼(1% MeOH/DCM으로 출발하여 5% MeOH/DCM까지의 단계 구배, 수율은 60% 내지 90%로 다양함)에 의해 정제하여 화합물 L-1을 제조하였다. H1 NMR (CDCl3): δ 5.41 - 5.30 (m, 8H), 3.12 (t, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.77 (t, 6H), 2.48 (bs, 6H), 2.20 (m, 2H), 2.05 (q, 8H), 1.80-1.69 (m, 4H), 1.38-1.25 (m, 40H), 0.89 (t, 3H); MS: 전기분무: [M+1] 이론: 613, 실측치: 613.
이 실시예의 합성 단계를 변형함으로써, 도 2A, 2B, 및 3에 제공된 것들과 같은 추가의 아미노-아민 지질을 제조하였다.
실시예 2: 케톤 및 이차 아민으로부터 아미노-아민 지질 L-2의 합성
Figure 112014046675715-pct00030
케톤 a(1 당량)를 N2 분위기하에서 건조한 플라스크에서 건조한 MeOH에 녹였다. 거기에 아민 b(1.1 당량)을 첨가하고, 이어서 트라이아세톡시보로수화물(1.5 당량) 및 AcOH(1 당량)를 첨가한 후, 반응을 실온에서 밤새도록 교반하였다. 반응을 DCM으로 희석하고, 물로 1회 추출한 후, 식염수로 1회 추출하여, 생성된 유기상을 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 건조된 용액을 여과하고 회전증발기 상에서 농축시켰다. 그 잔류물을 실리카 칼럼(1% MeOH/DCM으로 출발하여 5% MeOH/DCM까지의 단계 구배, 수율은 60% 내지 90%로 다양함)으로 정제하여 화합물 L-2를 제조하였다. H1 NMR: (CD3OD) δ 5.39-5.30 (m, 8H), 2.78 (t, 4H), 2.59-2.52 (m, 10H), 2.33 (bs, 8H), 2.07 (q, 8H), 1.25 (m, 2H), 1.40-1.26 (m, 40H), 0.914 (t, 6H); MS: 전기분무 pos. [M+1] 이론 668, 실측치 668.
이 실시예의 합성 단계를 변형함으로써, 도 4 및 5에 제공된 L-2 및 L-6 유사체와 같은 추가의 아미노-아민 지질을 제조하였다.
실시예 3: 케톤 및 모폴린으로부터 지질 L-46의 합성
Figure 112014046675715-pct00031
DCE(12 ml)중의 케톤 a(2.66 g; 5.05 mmol), 모폴린 b(1.34 ml; 15 mmol) 및 AcOH(1.77 ml; 30 mmol)의 혼합물에 NaBH(AcO)3(1.6 g; 7.5 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 72시간 동안 교반하였다. TLC 시험(실리카겔; 헥산:EtAc-Et3N 95:5로 용출)은 대략 45%가 전환된 것을 나타냈다. 반응 혼합물을 5% 수성 K2CO3로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 용매를 K2CO3 상에서 건조하고 회전증발기 상에서 증발시켰다. 그 잔류물을 실리카겔 상의 LC(헥산:EtAc 90:10으로 용출)에 의해 분리하였다. 원하는 생성물 L-46을 39% 수율(1.18 g)로 얻었고, 그것은 NMR에 의해 순수한 것으로 나타났다.
실시예 4: 케톤 및 피페리딘으로부터 지질 L-47의 합성
Figure 112014046675715-pct00032
DCE(24 ml)중의 다이리놀레일 케톤 a(3.99 g; 7.58 mmol), 피페리딘 b(2.25 ml; 22 mmol) 및 AcOH(1.33 ml; 23 mmol)의 혼합물에 NaBH(AcO)3(2.4 g; 11.3 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 96시간 동안 교반하였다. TLC 시험(실리카겔; 헥산:EtAc-Et3N 95:5 용출)은 대략 35%가 전환된 것을 나타냈다. 반응 혼합물을 5% 수성 K2CO3로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 용매를 K2CO3 상에서 건조시키고 회전증발기 상에서 증발시켰다. 그 잔류물을 실리카겔 상의 LC(헥산:EtAc 90:10으로 용출)에 의해 분리하였다. 원하는 생성물 L-47을 29% 수율(1.30 g)로 얻었고, 그것은 NMR에 의해 순수한 것으로 나타났다.
이 실시예뿐만 아니라 실시예 3에 제공된 방법을 사용함으로써, 도 9에 제공된 것들과 같은, 다양한 헤드기를 갖는 양이온성 지질을 제조할 수 있다.
실시예 5: 일차 아민 및 카복실산으로부터 아마이드 양이온성 지질의 합성
하기 다이리놀레일 아마이드 유도체를 아래의 일반적인 과정을 사용하여 제조하였다. DCM(15 g/mL)중의 다이리놀레일 아민(338 mg; 0.64 mmol), HOBt(65 mg; 0.5 mmol), 아미노산(1 mmol), 및 DIPEA(1 당량)의 용액에 EDC(1.2 mmol)를 첨가하여 조합하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. TLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 물 중의 0.5% K2CO3로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 회전증발기 상에서 농축한 후, 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피(헥산:Et3N 95:5 내지 헥산:CHCl3:Et3N 46:44:5의 구배)에 의해 정제하였다. 얻어진 수율은 80-85%였다.
다이올레일 유도체를 또한 아래 제공된 반응식을 기초로 제조하였다:
일차 아민 및 카복실산으로부터 지질 L-30의 합성
Figure 112014046675715-pct00033
일차 아민 및 카복실산으로부터 지질 L-31의 합성
Figure 112014046675715-pct00034
일차 아민 및 카복실산으로부터 지질 L-32의 합성
Figure 112014046675715-pct00035
일차 아민 및 카복실산으로부터 지질 L-42의 합성
Figure 112014046675715-pct00036
이 실시예의 합성 단계를 변형함으로써, 도 6 내지 8에 제공된 것들과 같은 추가의 아마이드-아민 지질을 제조하였다.
실시예 6: 아민 지질 제형 의 제조
지질 L-1 및 L-2의 효능을 시험하기 위해, 제형은 양이온성 지질(DODMA), 중성 지질(DSPC), PEG-지질 포합체(PEG-DMPE 및 PEG-DMG), 및 하기 구조를 가지는, RNAi 제제(HPRT1을 위한 DsiRNA)에 대해 콜레스테롤 제형을 제조하였다:
5'-GCCAGACUUUGUUGGAUUUGAAAtt (서열번호 1)
3'-UUCGGUCUGAAACAACCUAAACUUUAA (서열번호 2),
여기서 대문자 글자는 RNA 뉴클레오타이드를 나타내고, 밑줄친 대문자 글자는 2'-O-메틸-RNA 뉴클레오타이드를 나타내며, 그리고 소문자 글자는 DNA 뉴클레오타이드를 나타낸다.
DsiRNA 가닥의 제조: 올리고뉴클레오타이드 합성 및 정제
표준 방법(미국 아이오와주의 코랄빌시에 소재한, Integrated DNA Technologies)에 따라 개별 RNA 가닥을 합성하고 HPLC 정제하였다. 예를 들어서, RNA 올리고뉴클레오타이드를 고체상 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성하고, 탈보호한 후, 표준 기술을 사용하여 NAP-5 칼럼(미국 뉴저지주의 피스타카웨이시에 소재한, Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 탈염하였다(Damha and Olgivie, Methods Mol . Biol . 20:81, 1993; Wincott et al., Nucleic Acid Res . 23: 2677, 1995). 올리고머를 15분 단계-선형 구배를 사용하여 Amersham Source 15Q 칼럼(1.0 cm × 25 cm; 미국 뉴저지주의 피스타카웨이시에 소재한, Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(IE-HPLC)를 사용하여 정제하였다. 구배는 90:10 완충액 A:B 내지 52:48 완충액 A:B였고, 여기서 완충액 A는 100 mM Tris pH 8.5이고 완충액 B는 100 mM Tris pH 8.5, 1M NaCl이다. 샘플을 260 nm에서 모니터링하고, 전체-길이 올리고뉴클레오타이드 종에 대해 해당하는 피크들을 수집하고, 모아서 NAP-5 칼럼 상에서 탈염하고, 동결건조하였다.
각 올리고머의 순도를 Beckman PACE 5000(미국 캘리포니아주 풀러톤시에 소재한, Beckman Coulter, Inc.) 상에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 측정하였다. CE 모세관은 내부 직경이 100 ㎛이고 ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)을 함유하였다. 전형적으로, 약 0.6 nmole의 올리고뉴클레오타이드를 모세관에 주입하고, 444 V/cm의 전기장에서 작동시키고, 260 nm에서의 UV 흡광도에 의해 검출하였다. 변성 Tris-보레이트-7 M-유레아 작동 완충액을 Beckman-Coulter로부터 구매하였다. 하기 기술된 실험에 사용하기 위해 CE에 의해 평가되는 바 적어도 90% 순수한 올리고리보뉴클레오타이드를 얻었다. 화합물 동일성을 제조사의 권고된 프로토콜을 따라 Voyager DETM Biospectometry Workstation(미국 캘리포니아주 포스터시에 소재한, Applied Biosystems) 상에서 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행시간(MALDI-TOF) 질량분석법에 의해 확인하였다. 모든 올리고머의 상대 분자 질량을 얻었고, 그것은 자주 예상된 분자 질량의 0.2% 내에 있었다.
DsiRNA 듀플렉스의 제조
단일-가닥 RNA(ssRNA) 올리고머를 100 mM 칼륨 아세테이트, 30 mM HEPES, pH 7.5로 구성된 듀플렉스 완충액 중에, 예를 들어 100 μM 농도로 재현탁하였다. 상보하는 센스 및 안티센스 가닥을 동등한 몰량으로 혼합하여, 예를 들어, 50 μM 듀플렉스의 최종 용액을 수득하였다. 샘플을 100℃로 5분 동안 RNA 완충액(IDT)에서 가열하고 실온으로 냉각되도록 놓아둔 후 사용하였다. 이중-가닥 RNA(dsRNA) 올리고머를 -20℃에서 보관하였다. 단일-가닥 RNA 올리고머를 동결건조된 상태로 또는 -80℃에서 뉴클레아제가 없는 물에 보관하였다.
소포-기초 지질 제형 의 제조
지질 입자를 표 5에 제공된 mol%로 제조하였다. 전체 지질 대 DsiRNA 비는 약 1:7이었다.
제형 조성물
L-1v L-1 (57.2%) PEG-DMPE (3%) DSPC (7.1%) 콜레스테롤 (32.7%)
L-2v L-2 (57.2%) PEG-DMPE (3%) DSPC (7.1%) 콜레스테롤 (32.7%)
L-5v L-5 (57.2%) PEG-DMPE (3%) DSPC (7.1%) 콜레스테롤 (32.7%)
L-6v L-6 (57.2%) PEG-DMPE (3%) DSPC (7.1%) 콜레스테롤 (32.7%)
L-30v L-30 (57.2%) PEG-DMPE (3%) DSPC (7.1%) 콜레스테롤 (32.7%)
RNA -결합제 및 형질주입 지질 제형 의 제조
지질 입자를 표 6에 제공된 mol%로 제조하였다. 전체 지질 대 DsiRNA 비는 약 1:20이었다.
제형 RNA-결합제 형질주입 지질
L-1 DODMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) L-1 (21.6%) PEG-DMG (2.8%) DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
L-2 DODMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) L-2 (21.6%) PEG-DMG (2.8%) DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
DLinDMA DODMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) DLinDMA (21.6%) PEG-DMG (2.8%) DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
DLin-KC2-DMA DLinDMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) DLin-KC2-DMA (21.6%) PEG-DMG (2.8%) DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
표 5 및 표 6에서, PEG-DMPE는 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]이고 PEG-DMG는 (R)-3-[(ω-메톡시-PEG2000-카바모일)]-1,2-다이-O-테트라데실-sn-글리세라이드이다.
실시예 7: 아민 지질 제형의 시험관 내 성능
다양한 지질 제형의 효능을 평가하기 위해, 시험관 내 분석법을 HPRT1을 표적으로 하는 DsiRNA 분자로 수행하였다. 지질 제형은 상기 실시예 6에 기술된 바와 같이, HPRT1에 대한 DsiRNA로 제조하였다.
세포 배양 및 RNA 형질주입
HeLa 세포를 ATCC로부터 얻고, 10% 소태아혈청(HyClone)이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(HyClone)에 37℃에서 5% CO2하에서 유지하였다. 본 발명의 dsRNA-양이온성 지질 제형을 1 nM, 5 nM 또는 25 nM의 최종 농도에서 본 발명의 제형과 함께 인큐베이션을 통해 HeLa 세포에 형질주입하였다. 0.1 nM 또는 1 nM의 Lipofectamine™ RNAiMAX(Invitrogen) dsRNA를 양성 대조군으로서 사용하였다. 간단하게 설명하면, 각 dsRNA의 0.2 μM 또는 0.02 μM 스톡 용액 2.5 μL를 47.5 μL의 Opti-MEM I(Invitrogen)과 혼합하였다. Lipofectamine™ 대조군에 대해, 각 dsRNA의 0.2 μM 또는 0.02 μM 스톡 용액 2.5 μL를 46.5 μL의 Opti-MEM I(Invitrogen) 및 1 μL의 Lipofectamine™ RNAiMAX와 혼합하였다. 그 결과의 50 μL 혼합물을 12-웰 플레이트의 개별 웰에 첨가하고 실온에서 20분 동안 인큐베이션하여 dsRNA:Lipofectamine™ RNAiMAX 복합체가 형성되도록 허용하였다.
그 동안, HeLa 세포를 트립신처리하고 배지에 약 367 세포s/μL의 최종 농도로 재현탁하였다. 마지막으로, 450 μL의 세포 현탁액을 각 웰에 첨가하고(최종 부피 500 μL) 플레이트를 인큐베이터에 24시간 동안 넣어두었다. 용량 반응 연구를 위해, dsRNA의 농도를 초기에 10 pM로부터 100 nM로 다양하게 하였다. 시간 경과 연구를 위해, 약 4시간 내지 약 72시간의 인큐베이션 시간을 연구하였다.
억제의 평가
표적 유전자 녹다운을 qRT-PCR에 의해 측정하였고, 산출되는 값을 단독(비히클 대조군) 또는 미처리된 Lipofectamine™ RNAiMAX를 포함하여 HPRT 발현 대조 처리에 대해 정규화하였다.
RNA 분리 및 분석
세포를 2 mL의 PBS로 1회 세척하고, 전체 RNA를 RNeasy Mini KitTM(Qiagen)를 사용하여 추출한 후 30 μL의 최종 부피로 용출하였다. 1 μg의 전체 RNA를 제조사의 설명서에 따라 Transcriptor 1st Strand cDNAKitTM(Roche) 및 무작위 헥사머를 사용하여 역전사시켰다. 그 결과 생성되는 cDNA의 1/30(0.66μL)를, 5 μL의 IQ Multiplex Powermix(Bio-Rad)와 3.33 μL의 H2O 및 사람 유전자 HPRT-1(승인 번호 NM_000194) 표적 서열에 특이적인 프라이머와 프로브를 함유하는 3μM의 믹스 1μL과 함께 혼합하였다.
정량적 RT - PCR
C1000 열 싸이클러가 포함된 CFX96 실시간 시스템(Bio-Rad)을 증폭 반응을 위해 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 3분 동안; 그런 다음 95℃에서 10초; 그리고 55℃에서 1분의 싸이클을 40회 반복함. 각 샘플을 3회 시험하였다. 상대적인 HPRT mRNA 수준을 표적 mRNA 수준에 대해 정규화하고, 형질주입 시약으로 단독 처리된 또는 미처리된 대조 샘플에서 얻어진 mRNA 수준과 비교하였다. 데이터를 Bio-Rad CFX Manager 버전 1.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 발현 데이터는 dsRNA의 아미노-아민 양이온성 지질 제형의 처리하에서의 발현 대 아미노-아민 양이온성 지질이 없는 dsRNA 제형의 처리하에서의 발현의 비교로서 제공된다.
결과
도 10은 아미노-아민 지질 L-1 또는 L-2를 함유하는 지질 입자를 사용하여 시험관 내 녹다운시킨 결과를 제공한다. 전체적으로, L-1 및 L-2는 둘 다 HeLa 세포에 투여될 때 표적 mRNA 수준을 효과적으로 억제하였다. 특히, L-1은 1 nM의 가장 낮은 농도에서 약 70%의 잔류하는 mRNA 수준을 제공하였다. 따라서, 아미노-아민 지질은 형질주입을 통해 HeLa 세포에 투여될 때 RNAi 제제의 유효한 전달을 제공하였다. 따라서, 본 발명의 화합물 중 어떤 것, 예를 들어, 어떤 지질 또는 그것의 제형은, 다중음이온성 페이로드, 예를 들어, RNAi 제제 또는 안티센스 페이로드의 전달에 유용할 것이다.
실시예 8: 아민 지질 제형 의 생체 내 성능
지질의 성능을 추가로 평가하기 위해, 생체 내 실험을 HPRT1에 대해 DsiRNA를 갖는 제형으로 수행하였다.
제형을 다음의 대략적인 백분율: 20 mol%의 L-1, L-2, L-5, L-6, L-7, L-8, L-22 또는 L-30 중 하나; 26 mol%의 DODMA; 3 mol%의 PEG2000-DMPE; 3 mol%의 PEG2000-DMG; 13 mol%의 DSPC; 및 33 mol%의 콜레스테롤로 제조하였다. 제형은 약 1:20(w/w) 비율의 DsiRNA:전체 지질을 더 포함하였다.
약 4주령의 CD1 암컷 마우스에 꼬리 정맥을 통한 정맥 내 투여에 의해 단일 용량(1 mg/kg 또는 5 mg/kg중 하나)의 지질 입자 제형을 10 μL/g 체중의 투약 부피로 투여하였다. (투약-후) 48시간 후에, 조직을 RNALater(Qiagen)에 수집하였다. 종점 분석에서, 전체 RNA를 RT-qPCR을 위해 마우스 간으로부터 분리하였다. RNA 샘플을 RT 전에 올리고d(T) 프라이머와 함께 70℃에서 5분 동안 가열하였다. PCR 반응에서, mHPRT 발현을 RPL23(본원에 대조군으로서 사용된 항존 유전자)로 정규화하였다. 도 11 및 도 12는 n = 5마리 동물/그룹에 대한 오차 막대와 평균 ± SD를 포함한 데이터를 나타낸다.
실험의 첫 번째 설정에서, 지질 제형의 투약량은 단일 용량으로 5 mg/kg이었다(도 11). 이 투약량에서, 화합물 L-1 및 L-7은 약 80% 내지 약 90%의 잔류하는 mRNA 수준을 제공하였다. 예컨대 L-30에서와 같이 헤드기에 옥소기가 첨가되는 것은 약 15%의 잔류하는 mRNA 수준에 의해 입증된 바와 같이, 유전자 침묵의 급격한 증가를 유발하였다. 또한, 헤드기에 헤테로사이클일을 가지는 화합물(예를 들어, L-2, L-5, L-6, L-8, 및 L-22)은 약 15% 내지 약 45%의 잔류하는 mRNA 수준을 가지는 화합물을 제공하였다. 다양한 제형에 대한 %mRNA 녹다운을 표 7에 나타낸다. 표 7은 TNS 형광 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 각 지질에 대한 pKa 값을 추가로 나타낸다.
본 발명의 양이온성 지질의 pKa 값을 측정하기 위해, 제형(1 mM의 농도)을 상이한 pH 값의 인산염 완충액에서 인큐베이션하고, 여기에 DMSO에 용해된 TNS를 첨가하였다(그 결과 최종 농도는 6 μM TNS이다). 그 결과의 용액의 형광을 SpectraMax® M3 형광 플레이트 리더 상에서 325 nm의 여기 파장 및 435 nm의 방출 파장을 사용하여 측정하였다. TNS의 측정된 형광을 다음 식 1에 나타낸 3개-변수 시그모이드 함수로 맞추었다.
Figure 112014046675715-pct00037
(식 1)
최대 형광의 절반이 도달된 때의 pH를 제형의 외관상 pKa로서 기록하였고, 여기서 a 및 b는, 각각 시그모이드 함수의 최대 관찰된 형광 및 기울기를 반영하는 무한한 변수이다.
지질 제형 TNS pKa 값 % mRNA 녹다운
L-1 7.6 18.7
L-2 6.7 75.6
L-5 6.4 88.5
L-6 5.6 88.2
L-7 7.1 8.9
L-8 6.7 54.6
L-22 7.0 66.3
L-24 5.7 74.1
L-25 6.5 76.8
L-26 7.1 63.6
L-30 5.8 86.4
L-31 6.9 83.6
L-32 7.0 41.0
L-35 6.5 26.1
L-42 6.7 66.6
실험의 두 번째 설정에서, 화합물 L-2, L-5, L-6, 및 L-30을 단일 용량으로 1 mg/kg 또는 5 mg/kg의 투약량에서 평가하였다(도 12). 특히, L-5, L-6, 및 L-30은 1 mg/kg의 더 낮은 용량에서 효과적인 유전자 침묵을를 제공하였다. 전체적으로, 이들 데이터는 생체 내 모델에서의 표적 RNA 수준의 유효한 억제제인 다양한 지질 화합물 및 투약량을 제공한다.
본 발명 및 dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질을 함유하는 지질 제형의 내성을 평가하기 위하여, 암컷 CD-1 마우스에 L-6 및 L-30 제형을 주입하고[10 mg/kg DsiRNA 용량을 2개 용량(qod)으로 투여함, 각각 약 200 mg/kg 총 지질 용량], 혈청 샘플을 두 번째 용량 후 48시간에 수집하였다. 혈청 샘플을 효소 알라닌 아미노기 전이효소(ALT) 및 아스파테이트 아미노기 전이효소(AST)의 특정을 통한 간 기능 시험(LFT)을 포함하여, 임상적인 화학 평가의 패널에 대해 시험하였다. 인산염 완충 식염수(PBS)를 비히클 대조군으로서 사용하였다. ALT 및 AST 상승은 제형 L-6 및 L-30에 대해 PBS 그룹의 3×보다 작았다. 또한 L-6 및 L-30 제형에 대해 관찰된 체중 또는 간의 변화는 없었다. 따라서, L-6 및 L-30 제형은 내성이 좋았다. 그러므로, 본원에 기술된 지질 중 어떤 것, 및 그것의 제형은 하나 또는 그 이상의 제제, 예를 들어 다중음이온성 또는 안티센스 페이로드의 전달에 유용하다.
실시예 9: 피하 동물 종양 모델에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 dsRNA를 포함하는 지질 제형의 사용
아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질 및 dsRNA를 함유하는 지질 제형의 전달 효율 및 후속 기능을 평가하기 위하여, 특정하게 변형된 피하(s.c.) 종양 모델(Judge et al., J. Clin . Invest . 119:661, 2009)을 사용한다. Hep3B 종양을 수컷 nu/nu 마우스에서 왼쪽-뒤 옆구리에 50 μL PBS중의 3 × 106개 세포를 피하 주사함으로써 수립하였다. 종양이 촉진가능하게 됨에 따라 씨딩 10 내지 17일 후에 마우스를 처리 그룹으로 무작위 분류한다. dsRNA 또는 비히클 대조군의 지질 제형을 개별적인 동물 체중에 따라 mg dsRNA/kg 체중을 기초로 계산하여, 측면 꼬리 정맥을 통해 표준 정맥 내(i.v.) 주사에 의해 투여한다. 종양은 2차원(너비 × 길이)으로 측정하여 디지털캘리퍼스를 사용하여 종양 성장을 평가한다. 종양 부피를 식 x * y * y/2를 사용하여 계산하고, 여기서 x = 가장 큰 직경이며, y = 가장 작은 직경이고, 그룹 평균 ± SD로서 표시한다. 종양 조직을 또한 상이한 처리그룹의 동물로부터 제거하고 유전자 녹다운을 확인한다. 종양 부피, 생존 및 RNA 발현 데이터는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질 없이 dsRNA의 지질 제형으로의 처리 대 dsRNA 제형의 처리들 사이의 비교로서 나타낸다.
실시예 10: Hep3B 동소이식 간 종양 모델에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 dsRNA 를 갖는 지질 제형의 사용
dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질 제형의 표적화 효율 및 후속 기능을 평가하기 위하여, 특정 변형이 이루어진 간내 종양 모델(Judge et al., J. Clin . Invest . 119:661, 2009)을 이용한다. 간 종양을 마우스에서 Hep3B 종양 세포의 직접적인 간내 주사에 의해 수립하였다. 수컷 nu/nu 마우스를 Hep3B 종양에 대한 숙주로서 사용하였다. 2,2,2-트라이브로모에탄올(Sigma)을 사용한 마취 하에 마우스를 유지하면서, 정중선을 가로지르는 단일 1-cm 절개를 흉골 아래에 만들고, 왼쪽 측면 간엽을 적출하였다. 40μL의 50% PBS/50% MatrigelTM (BD)에 현탁되어 있는 대략 2×106 Hep3B 세포를 간엽에 완만한 각도로 Hamilton 주사기와 30-게이지 바늘을 사용하여 서서히 주사하였다. 그런 다음 구멍난 상처에 탈지면을 붙여 어떠한 출혈도 중지시킨 후 봉합하였다. 마우스를 멸균 우리에서 마취로부터 회복시키고, 2 내지 4시간 동안 근접 모니터링한 후 원래의 마우스 우리에 돌려보냈다. 종양을 이식하고 약 3주 후에 마우스를 무작위로 처리 그룹으로 분류하였다. 마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통한 표준 정맥내(i.v.) 주사에 의해 다음을 투여하였다(n=7마리/그룹): (1) dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 지질 제형; (2) 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질이 없는 dsRNA 제형; 또는 (3) 비히클 대조군. 용량은 개별적인 동물 체중에 따라 체중 kg당 dsRNA의 mg을 토대로 계산하였다.
도 13에 도시된 결과를 생성한 실험에 대해, 동물에게 L-6 또는 L-30-제형된 지질 입자와 함께 5mg/kg의 DsiRNA를 투약하였다. 아래의 표 8은 즉석 연구에 사용된 L-6 및 L-30 지질을 포함하는 지질 제형의 특수한 조성물을 나타낸다.
제형 RNA-결합제 형질주입 지질
L-6 DODMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) L-6 (21.6%) PEG-DSPE (2.8%) DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
L-30 DODMA (25.9%) PEG-DMPE (2.9%) L-30 (21.6%) PEG-DSPE
(2.8%)		 DSPC (13.8%) 콜레스테롤 (33.0%)
체중을 전체 연구 기간을 통해 종양 덩어리의 발달 및 처리 내성의 지표로서 모니터링하였다. 효능 연구를 위해 규정된 인도적인 종점을 생존에 대한 대리물로서 측정하였다. 평가는 임상 신호, 체중 손실, 및 복부 팽창의 조합을 토대로 행하여 종양 덩어리로 인한 안락사 날을 결정하였다. 종양 조직을 상이한 처리 그룹의 동물로부터 제거하고 유전자 녹다운을 확인하였다.
도 13에서 알 수 있는 것과 같이, 시험된 L-6 및 L-30 제형은 둘 다 제형된 항-HPRT1 DsiRNA 페이로드를 간 및 동소이식 Hep3B 종양 조직 두 곳에 모두 현저하게 효과적으로 전달하였다. 구체적으로, PBS 대조군과 비교하여, HPRT1표적 mRNA의 50%보다 큰 녹다운(및 어떤 경우에는 60 내지 80% 녹다운)을 간과 동소이식 Hep3B 종양 조직 둘 다에서 관찰하였다. 따라서 어떤 지질, 또는 그것의 제형은 표적 유전자(예컨대 암과 관련된 표적 유전자)의 발현을 감소시키는 데 유용하다.
실시예 11: HepG2 동소이식 간 종양 모델에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 dsRNA 를 포함하는 지질 제형의 사용
dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질 제형의 표적화 효율 및 후속적인 기능을 평가하기 위하여, 두 번째 간내 종양 모델을 활용하였다. 간 종양을 마우스에서 HepG2 종양 세포의 직접적인 간내 주사에 의해 수립하였다. 암컷 nu/nu 마우스를 HepG2 종양에 대한 숙주로서 사용하였다. Avertin(Sigma)을 사용한 마취 하에 마우스를 유지하면서, 정중선을 가로지르는 단일 1-cm 절개를 흉골 아래에 만들고, 왼쪽 측면 간엽을 적출하였다. 60μL의 50% PBS/50% MatrigelTM (BD)에 현탁되어 있는 대략 3×106 HepG2 세포를 간엽에 완만한 각도로 Hamilton 주사기와 30-게이지 바늘을 사용하여 서서히 주사하였다. 그런 다음 구멍난 상처에 탈지면을 붙여 어떠한 출혈도 중지시킨 후 봉합하였다. 마우스를 멸균 우리에서 마취로부터 회복시키고, 2 내지 4시간 동안 근접 모니터링한 후 원래의 마우스 우리에 돌려보냈다. 종양을 이식하고 약 3주 후에 마우스를 무작위로 처리 그룹으로 분류하였다. 마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통한 표준 정맥내(i.v.) 주사에 의해 다음을 투여하였다(n=6 내지 7마리/그룹): (1) dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 지질 제형; (2) 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질이 없는 dsRNA 제형; 또는 (3) 비히클 대조군. 용량은 개별적인 동물 체중에 따라 체중 kg당 dsRNA의 mg을 토대로 계산하였다. 도 14에 도시된 결과를 생성한 실험의 용량은 L-6 또는 L-30-제형된 지질 입자 중의 5mg/kg DsiRNA이었다. 표 8은 즉석 연구에 사용된 L-6 및 L-30 지질을 포함하는 지질 제형의 특수한 조성물을 나타낸다. 체중을 전체 연구 기간을 통해 종양 덩어리의 발달 및 처리 내성의 지표로서 모니터링하였다. 효능 연구를 위해 규정된 인도적인 종점을 생존에 대한 대리물로서 측정하였다. 평가는 임상 신호, 체중 손실, 및 복부 팽창의 조합을 토대로 행하여 종양 덩어리로 인한 안락사 날을 결정하였다. 종양 조직을 상이한 처리 그룹의 동물로부터 제거하고 유전자 녹다운을 확인하였다.
도 14에서 알 수 있는 것과 같이, 시험된 L-6 및 L-30 제형은 둘 다 제형된 항-HPRT1 DsiRNA 페이로드를 간 조직에 매우 효과적으로 전달하였다. 한편 동소이식 HepG2 종양 조직에서는 두 가지 제형에 대해 20 내지 50% 수준의 HPRT1 표적 mRNA 녹다운을 관찰하였다. 상기 결과는 본원에서 조사한 L-6 및 L-30 제형이 정상적인 간 및 적어도 특정 종양 조직(예컨대 동소이식 Hep3B 종양 및, 그것보다는 적은 정도로 동소이식 HepG2 종양)으로의 전달에 대해 dsRNA 전달 비히클만큼 효과적인 것을 확인해 주었다. 따라서 어떤 지질, 또는 그것의 제형은 표적 유전자(예컨대 암과 관련된 표적 유전자)의 발현을 감소시키는 데 유용하다.
또한 지질 및/또는 deRNA를 형광 태그로 표지화하고 살아있는 동물 영상화 시스템(Xenogen 또는 Biolab)(Eguchi et al., Nat . Biotechnol . 27:567, 2009)을 사용하여 형광 생체 내 분포 연구를 수행함으로써 종양 세포 흡수에 대한 dsRNA의 지질 제형의 기능을 시험하였다. 이 방법을 사용하여, 그리고 dsRNA 제형 단독과 비교함으로써, dsRNA에 대한 종양 세포 내재화를 촉진하는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질의 능력을 확인한다. 대조적으로, 이 연구에서 대조군으로서 사용된 dsRNA 제형은 단독으로는 흡수되어 동일한 정도로 종양 표면에 전달될 수 없다. 효능 종점, RNA 발현, 및 생체내 분포 데이터는 dsRNA의 지질 제형의 처리 대 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질이 없는 dsRNA 제형의 처리 사이의 비교로서 제공한다.
실시예 12: 지질 제형으로의 간세포암종 항 -종양 효능
간 종양을 실시예 10에서 설명한 것과 같이 Hep3B 종양 세포의 직접적인 간내 주사에 의해 마우스에서 수립하였다. 종양을 이식하고 2주 후에 마우스를 무작위로 처리 그룹으로 분류하였다. 마우스에게 측면 꼬리 정맥을 통한 표준 정맥내(i.v.) 주사에 의해 다음 중 하나를 투여하였다(n=6마리/그룹): (1) 대조 dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 지질 제형; (2) 활성 dsRNA의 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질 제형; 또는 (3) 비히클 대조군. 용량은 개별적인 동물 체중에 따라 체중 kg당 dsRNA의 mg을 토대로 계산하였다. 도 15 및 16에 도시된 결과를 생성한 실험의 용량은 L-6- 또는 L-30-제형된 지질 입자 중의 5mg/kg DsiRNA이었다. 상기 표 8은 즉석 연구에 사용된 L-6 및 L-30 지질을 포함하는 지질 제형의 특수한 조성물을 나타낸다.
체중을 전체 연구 기간을 통해 종양 덩어리의 발달 및 처리 내성의 지표로서 모니터링하였다. 효능 연구를 위해 규정된 인도적인 종점을 생존에 대한 대리물로서 측정하였다. 평가는 임상 신호, 체중 손실, 및 복부 팽창의 조합을 토대로 행하여 종양 덩어리로 인한 안락사 날을 결정하였다. 종양 조직을 상이한 처리 그룹의 동물로부터 제거하고 종양 중량을 측정하여 상이한 처리 그룹의 효능을 측정하였다. 혈청 α-태아단백질(AFP) 수준을 또한 종양 덩어리의 생체마커로서 측정하였다.
활성 페이로드를 포함한 L-6 및 L-30 제형은 둘 다 대조 페이로드를 포함한 L-6 및 L-30 제형 및 PBS 대조군에 비교하여 혈청 AFP(도 15) 및 종양 중량(도 16)을 감소시키는 데 매우 효과적이었다.
실시예 13: 다중 동소이식 간암 모델에서 다양한 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 dsRNA 를 갖는 상이한 L-30 지질 제형의 사용
종양에서 HPRT1의 간에 대한 녹다운이 L-30의 상이한 제형으로 조정될 수 있는 지를 평가하기 위하여, PEG-지질 함량을 조정하였다. 하기의 표 9는 즉석 연구에 사용된 L-30 지질을 포함하는 지질 제형의 특수한 조성물을 나타낸다. 도 18에 도시된 결과를 생성하는 실험의 용량은 L-30[1] 제형된 지질 입자에서는 1, 3 및 10mg/kg이었고, L-30[2] 제형된 지질 입자에서는 10mg/kg이었다. 어떤 유용한 용매 또는 용매 시스템이든지 RNA-결합제 및 DsiRNA를 제형 안으로 도입하기 위하여 사용될 수 있는데, 이를테면 형질주입 지질에 대한 것과 동일하거나 상이한 용매 및 용매 시스템(예컨대 수성 및/또는 비-수성 용매(들))이 사용될 수 있다.
도 18에서 알 수 있는 것과 같이, L-30[1]과 L-30[2] 제형은 둘 다 간 조직 및 동소이식 Hep3B 종양 조직으로 제형된 항-HPRT1 DsiRNA 페이로드를 매우 효과적으로 전달하였다. 한편, 간 녹다운은 10mg/kg의 DsiRNA를 포함한 L-30[1] 제형에 비교하여 L-30[2] 제형에서 종양 녹다운에 유해한 작용을 미치지 않으면서 상당히 감소한다. 이들 결과는 지질 제형의 PEG-지질 함량을 증가시키는 것이 지질 입자의 전달과, 계속해서 특정 조직에 대한 표적 유전자의 녹다운에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다.
dsRNA 전달 비히클로서의 L-30[1] 제형의 유효성을 다양한 동소이식 간암 모델에서 상이한 dsRNA을 사용하여 시험하였다. 도 19는 상이한 간암 모델을 사용한 실험으로부터의 결과를 나타내는데, L-30[1]이 대조군에 비교하여 모든 시험된 암모델에 대해 제형된 항-PTR1 DsiRNA 페이로드를 전달하는 데 있어 효과적인 것을 나타냈다. 도 20은 다수의 독립적인 DsiRNA를 포함하는 L-30[1] 제형으로부터 생성된 결과 및 동소이식 Hep3B HCC 종양 모델에서 해당하는 유전자의 녹다운을 보여준다. 따라서, 본원에 기술된 어떤 지질이든지 아래의 표 9의 지질 제형의 특정 조성물에서 L-30을 대체하기 위하여 사용될 수 있고, 어떤 dsRNA든지 표적 유전자(예컨대 본원에서 기술된 암 또는 질환과 관련된 표적 유전자)의 발현을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다.
지질 L-30 [1]2 L-30 [2]2
RNA-결합제 DODMA 25.9 25.9
PEG2000-DMPE 2.9 2.9
형질주입 지질 L-30 21.6 21.6
DSPC 13.8 13.8
콜레스테롤 33.0 28.8
PEG2000-DSPE 2.8 7.0
혼합 배취식 배취식
에탄올 %1 4% 4%
LNP 완충액 식염수 식염수
1 정제 전; 2 지질 몰 백분율
실시예 14: Hep3B HCC 종양 조직에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한dsRNA를 포함하는 상이한 L-30 지질 제형의 사용
dsRNA의 L-30 제형의 표적화 효율 및 후속적인 기능을 평가하기 위하여, 지질 몰 백분율이 상이한 L-30제형들을 시험하였다. 아래의 표 10은 형질주입 지질로서 L-30을 포함하는 지질 제형의 특정 조성물을 나타낸다. 특히 L-30[E] 및 L-30[G] 제형은 DODMA 대신 RNA-결합제로서 L-48을 함유한다. L-48은 H-5 헤드기와 다이올레일 테일기를 함유한다(도 17). RNA-결합제 및 DsiRNA를 제형에 도입하기 위하여 어떤 유용한 용매 또는 용매 시스템이든지, 이를테면 형질주입 지질에 대한 것과 동일하거나 상이한 용매 및 용매 시스템(예컨대 수성 및/또는 비-수성 용매(들))이 사용될 수 있다.
Hep3B HCC 조직에서 hHPRT1 녹다운의 결과가 도 21에 도시된다. 모든 L-30 제형들(즉 [A]에서 [G])은 PBS 대조군에 비교하여 hHPRT1 발현의 감소를 유발하였다. 특히, L-30[A]가 hHPRT1 발현에서 가장 큰 감소를 나타냈고, 그 뒤를 L-30[D], L-30[G], 및 L-30[E]가 따랐다.
Figure 112014046675715-pct00038
실시예 15: 폐 및 전립선 종양 조직에서 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위한 dsRNA 를 포함하는 상이한 L-6 및 L-30 지질 제형의 사용
상이한 L-6 및 L-30 제형의 표적화 효율 및 후속적인 기능을 평가하기 위하여, 다양한 종양 조직에서 HPRT1 mRNA 녹다운을 시험하였다. 표 9, 표 10 및 표 11은 즉석 연구에 사용된 L-6 및 L-30 지질을 포함하는 지질 제형의 특정 조성물을 나타낸다. RNA-결합제 및 핵산 페이로드(예컨대 DsiRNA)를 제형에 도입하기 위하여 어떤 유용한 용매 또는 용매 시스템, 이를테면 형질주입 지질에 대한 것과 동일하거나 상이한 용매 및 용매 시스템(예컨대 수성 및/또는 비-수성 용매(들))이 사용될 수 있다.
도 22의 결과를 생성한 실험의 용량은 L-6[2] 및 L-30[2] 제형된 지질 입자에서 10mg/kg DsiRNA 이었고, 실험의 제1일과 3일에 투여하였다. 종양을 제5일에 수득하였다. hHPRT1 mRNA의 녹다운을 H1975 NSCLC 폐종양 조직에서 측정하였다. L-6[2] 제형과 비교하여 L-30[2] 제형에 대해 더 큰 수준의 HPRT1 표적 mRNA 녹다운을 관찰하였다.
도 23의 결과를 생성한 실험은 L-6[2] 및 L-30[2] 제형된 지질 입자에서 10mg/kg DsiRNA이었고, 실험의 제1일과 3일에 투여하였다. 종양을 제5일에 수득하였다. hHPRT1 mRNA의 녹다운을 22Rv1 전립선암 SC 이종이식 종양 조직에서 측정하였다. L-6[2] 제형과 비교하여 L-30[3] 제형에 대해 더 큰 수준의 HPRT1 표적 mRNA 녹다운을 관찰하였다. 간에 이식된 22RvQ 전립선암에서의 hHPRT1 녹다운의 결과는 도 24에 도시한다. 실험을 도 23에서 수행한 실험에 유사하게 설정하였다. 도 24의 특별한 실험에서, L-30[A] 및 L-30[E] 제형 둘 다에 비교하여 더 큰 수준의 HPRT1 표적 mRNA 녹다운이 L-6[1] 제형에 대해 관찰되었다. 따라서 본원에 기술된 어떤 지질이든지 표 9P 나타낸 지질 제형의 특정 조성물에서 L-6 또는 L-30을 대체하기 위해 사용될 수 있고, dsRNA는 암(예컨대 본원에 기술된 어떤 암)과 관련된 표적 유전자의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
Figure 112014046675715-pct00039
실시예 16: dsRNA 를 포함하는 L-30을 함유하는 지질 제형
아래의 표 12는 형질주입 지질로서 L-30을 포함하는 지질 제형의 특정 조성물을 제공한다. RNA-결합제 및 DsiRNA를 제형 안에 도입하기 위하여 어떤 유용한 용매 또는 용매 시스템, 이를테면 형질주입 지질에 대한 것과 동일하거나 상이한 용매 및 용매 시스템(예컨대 수성 및/또는 비-수성 용매(들))이 사용될 수 있다. 게다가, 본원에 기술된 어떤 지질이든지 표 12의 형질주입 지질(예컨대 본원, 예를 들면 표 1에서 기술된 어떤 것)로서 L-30을 대체하기 위해 사용될 수 있고, 어떤 dsRNA든지 표적 유전자(예컨대 본원에 기술된 암 또는 질환과 관련된 표적 유전자)의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
Figure 112014046675715-pct00040
다른 구체예
본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되었지만, 추가로 변형될 수 있고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따라 본 발명의 어떤 변동, 용도, 또는 적용을 포함하도록 의도되며, 본 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지된 또는 관용적인 실시범주 내에서 본 개시내용으로부터 벗어난 그런 이탈 내용을 포함하는 것으로 의도되고, 지금까지 설명된 본질적인 특징에 적용될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
모든 공개공보, 특허 및 특허 출원은 그것들의 전체 내용이 각각의 개별적인 공개공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로써 포함되는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다.
<110> DICERNA PHARMACEUTICALS, INC. Bob Dale Brown Sujit Kumar Basu David A. Schwartz Allister Fraser <120> AMINE CATIONIC LIPIDS AND USES THEREOF <130> 3904/1120WO <150> PCT/US2012/060875 <151> 2012-10-18 <150> US 61/548,598 <151> 2011-10-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 1 gccagacuuu guuggauuug aaatt 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> n is 2'-O-methyl-C <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> n is 2'-O-methyl-A <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n is 2'-O-methyl-C <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> n is 2'-O-methyl-A <220> <221> misc_feature <222> (19) <223> n is 2'-O-methyl-G <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n is 2'-O-methyl-C <220> <221> misc_feature <222> (23) <223> n is 2'-O-methyl-G <220> <221> misc_feature <222> (25) <223> n is 2'-O-methyl-C <220> <221> misc_feature <222> (26)..(27) <223> n is 2'-O-methyl-U <400> 2 aauuucaaau ncnanananu nungnnn 27

Claims (100)

  1. 하기 식을 가지는 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염:
    Figure 112019067868043-pct00119

    상기 식에서,
    각각의 R1 및 R2는 독립적으로 C11-24 알킬, C11-24 알켄일, C11-24 알킨일, C11-24 헤테로알킬, C11-24 헤테로알켄일 또는 C11-24 헤테로알킨일이고;
    L1은 C1 알킬렌이며;
    R3는 H이고;
    각각의 R5 및 R6는 C1-6 알킬이다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 다음과 같은 화학식을 갖는 것인 화합물:
    Figure 112019067868043-pct00120
    .
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 다음과 같은 화학식을 갖는 것인 화합물:
    Figure 112019067868043-pct00121
    .
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 제형.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제형은 상기 화합물 중 2가지 또는 그 이상을 포함하는 것인 제형.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제형은 10 중량% 내지 80 중량%의 상기 화합물을 포함하는 것인 제형.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제형은 20 mol% 내지 25 mol%의 상기 화합물을 포함하는 것인 제형.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제형은 22 mol%의 상기 화합물을 포함하는 것인 제형.
  9. 제4항에 있어서, 상기 제형은 양이온성 지질, 중성 지질 및 스테롤 유도체를 더 포함하는 것인 제형.
  10. 제9항에 있어서, PEG-지질 포합체를 더 포함하는 것인 제형.
  11. 제4항에 있어서, 상기 제형은 10 mol% 내지 40 mol%의 L-30, 10 mol% 내지 40 mol%의 L-49, 10 mol% 내지 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 1 mol% 내지 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 5 mol% 내지 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 20 mol% 내지 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함하는 것인 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제형은 20 mol% 내지 25 mol%의 의 L-30, 20 mol% 내지 25 mol%의 의 L-49, 20 mol% 내지 30 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 2 mol% 내지 8 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 10 mol% 내지 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 25 mol% 내지 35 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함하는 것인 제형.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제형은 22 mol%의 L-30, 22 mol%의 L-49, 26 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 5 mol% 내지 9 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 14 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 29 mol% 내지 33 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함하는 것인 제형.
  14. 제11항에 있어서, 상기 제형은 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제, 또는 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 지질 입자를 포함하는 것인 제형.
  15. 제14항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 10 mol% 내지 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 또는 L-30 또는 L-49 중 하나 또는 그 이상의 화합물, 및 0.5 mol% 내지 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질을 포함하며;
    상기 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 10 mol% 내지 40 mol%의 L-30 또는 L-49 중 하나 또는 그 이상의 화합물, 5 mol% 내지 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 0.5 mol% 내지 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 및 20 mol% 내지 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함하는 것인 제형.
  16. 제9항에 있어서, 상기 양이온성 지질은
    N,N-다이메틸-(2,3-다이올레일옥시)프로필아민(DODMA),
    1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTMA),
    1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-O-에틸-3-포스포콜린(DPePC),
    1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP) 및
    1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP)으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 상기 중성 지질은, 존재하는 경우,
    1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC),
    1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC),
    1,2-다이올레오일-글리세로-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및
    스핑고미엘린(SM)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  17. 제16항에 있어서, 상기 양이온성 지질은 DODMA이고, 상기 중성 지질은 DSPC인 것인 제형.
  18. 제10항에 있어서, 상기 PEG-지질 포합체는
    1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMG),
    1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMPE),
    1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DSPE),
    1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPPE),
    1,2-다이팔미토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPG),
    1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOPE) 및
    1,2-다이올레오일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOG)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  19. 제18항에 있어서, 상기 PEG-지질 포합체는 PEG-DMPE 또는 PEG-DSPE인 것인 제형.
  20. 제9항에 있어서, 상기 스테롤 유도체는 콜레스테롤; 콜레스타논; 콜레스테논; 코프로스타놀;
    3β-[-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤);
    비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC);
    (2S,3S)-2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐아미노)에틸 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-1);
    (2S,3S)-((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-2);
    비스((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4-트라이하이드록시펜테인다이오에이트(DPC-3); 및
    6-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)옥시도포스포릴옥시)-2,3,4,5-테트라하이드록시헥사노에이트(DPC-4)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  21. 제20항에 있어서, 상기 스테롤 유도체는 콜레스테롤인 것인 제형.
  22. 제4항에 있어서, 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드를 더 포함하는 것인 제형.
  23. 제22항에 있어서, 상기 다중음이온성 페이로드는 RNAi 제제인 것인 제형.
  24. 제23항에 있어서, 상기 RNAi 제제는, 이중-가닥 RNA(dsRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 전사 후 유전자 침묵화 RNA(ptgs)RNA 및 다이서-기질 RNA(DsiRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제형.
  25. 제23항에 있어서, 상기 RNAi 제제는 10 내지 40개 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것인 제형.
  26. 제25항에 있어서, 상기 RNAi 제제는 25 내지 35개 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것인 제형.
  27. 제26항에 있어서, 상기 RNAi 제제는 DsiRNA인 것인 제형.
  28. 제25항에 있어서, 상기 RNAi 제제는 16 내지 30개 뉴클레오타이드 또는 19 내지 29개 뉴클레오타이드의 길이를 가지는 것인 제형.
  29. 제22항에 있어서, 상기 제형은 상기 제형 중에 1:10(w/w) 내지 1:100(w/w)의 비로 존재하는 상기 다중음이온성 페이로드 대 전체 지질을 포함하는 것인 제형.
  30. 제4항에 있어서, 상기 제형은 리포솜, 리포플렉스 또는 마이셀을 포함하는 것인 제형.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제형은 상기 리포솜을 포함하고, 상기 리포솜은 지질 나노입자인 것인 제형.
  32. 제22항의 제형; 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  33. 암의 치료에 사용하기 위한 제32항의 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 암은 간세포암종, 폐암, 전립선암 및 신경모세포종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 상기 치료는 대상에서 표적 핵산의 발현을 감소시키는 것을 포함하는 것인 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 표적 핵산은 ABL1, AR, β-카테닌, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA1, ERBA2, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MET, MDM2, MLL1, MLL2, MLL3, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TAL2, TCL3, TCL5, YES, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53, WT1, ApoB100, CSN5, CDK6, ITGB1, TGFβ1, 사이클린 D1, PLK1 및 KIF1-결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 암의 치료에 사용하기 위한 조성물.
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