CN113185421B - 脂质化合物及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种脂质化合物及其组合物，包含其的脂质纳米颗粒，及其制备方法和在药物递送中的用途。

Description

脂质化合物及其组合物
技术领域
本发明属于生物医药和生物技术领域，涉及一类脂质化合物的治疗药物递送系统。
背景技术
外源生物分子和一些药物分子很难穿透细胞膜到达细胞质达到治疗效果。mRNA是一类高负电荷的生物分子，必须克服细胞膜的屏障，才能翻译成蛋白发挥生物功能，因此，这类生物分子的治疗应用在体内高效递送是一重要挑战。
脂质纳米颗粒(LNP)是一新型的核酸生物分子递送技术，LNP通常由四种成分组成：(1)可离子化脂质，可与mRNA自组装成病毒大小的颗粒，并可将mRNA从内涵体释放到细胞质；(2)聚乙二醇化脂质，可提高LNP在血液中半衰期；(3)胆固醇，可增加纳米颗粒稳定性；(4)天然的磷脂，有助于脂质双层结构的形成。LNP既可以保护mRNA不被RNA酶分解，又可保护mRNA分子不被TLRs识别，避免先天免疫系统的过度激活的作用；而可离子化脂质既起到促进细胞摄取，也可帮助药物分子从内涵体逃逸，到达治疗效果。
首个MC3阳离子化脂质的LNP包封的siRNA药物已获批上市，证明LNP在体内可有效递送核酸药物，并且具有一定安全性。近几年研究发现LNP在mRNA药物与疫苗领域也展现出巨大的应用潜力。LNP递送系统的发展方向主要集中在可离子化脂质和配方上，以及如何克服一些脂质制剂的毒性等。
PCT/US2016/052352公开了用于细胞内递送治疗剂的化合物和组合物，包括多个新颖的脂质结构，能将mRNA分子递送至靶细胞。PCT/US2010/038224公开了MC3的化学结构，该化合物能较高效率包封siRNA药物分子，在递送过程中免受降解和清除。目前，LNP递送系统仍被视为推动核酸药物分子进入治疗应用的关键技术之一。
发明内容
基于此，有必要针对现有的技术问题，发现新颖离子化的脂质化合物，提高递送效率和降低毒性。本发明提供一类结构新颖的可离子化脂质化合物，这类可离子化脂质结构通过丙三醇的酯基和醚键组成脂肪链，其递送效果好于脂肪链结构的可离子化脂质。当与其它脂质成分形成脂质纳米颗粒后，能够有效地递送mRNA或药物分子到细胞内发挥生物功能，例如递送siRNA到体内细胞发挥基因沉默治疗作用，递送mRNA到体内细胞可以高效翻译成蛋白或抗原作为疫苗或药物治疗，递送抗体到体内发挥治疗作用以及递送Cas 9 mRNA到体内发挥基因编辑功能。
本发明提供一类新颖的可离子化脂质，其合成方法，以及其与聚乙二醇化脂质化合物、结构性脂质胆固醇和天然磷脂等混合包封药物分子，形成纳米粒递送系统，可以用于体外细胞递送和体内器官靶向细胞递送，具体如下：
在一个实施方案中，本发明公开了下式(I)的化合物：
Figure BDA0003096168540000021
其中R1选自R1’-X；
R1’为-(CH2)0-6-，X为氨基、羟基、乙炔基、氰基、-C(O)(CH2)1-3NRaRb、-C(O)O(CH2)1- 3NRaRb、-OC(O)(CH2)1-3NRaRb、-C(O)NH(CH2)1-3NRaRb、-NHC(O)(CH2)1-3NRaRb、- NHC(O)CH(NRaRb)(CH2)1-3NRaRb、C3-7环烷基、4-7元杂环基、C6-10芳基或5-10元杂芳基，上述环烷基、杂环基、芳基或杂芳基基团任选被选自下列的基团所取代；-(CH2)1-3OH、 -(CH2)1-3NRaRb、-(CH2)1-3C(O)NRaRb；或者X还可以为：
Figure BDA0003096168540000022
Ra、Rb各自独立地选自H、C1-3烷基、-(CH2)1-3NH2、-(CH2)1-3NH(CH2)1-3NH2；或者 Ra和Rb与其所连接的氮原子一起形成包含1-3个选自N、O或S的杂原子的5-10元杂环，该杂环任选被选自下列的基团所取代；C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷基氨基；
R2、R3独立地选自H、C2-18烷基、C4-18烯基或
Figure BDA0003096168540000023
每个M各自独立地选自-CH2-、-CH＝CH-、-NH-、-C(O)-、-O-、-C(O)O-、-OC(O)-、 -C(O)NH-、-NHC(O)-；
每个R各自独立地选自H、R’、-OR*或-R’OR*；
每个R’各自选自C1-10烷基或C3-12烯基；
每个R*各自选自C1-10烷基或C3-12烯基；
n、m各自独立地选自1-9的整数；
或其盐或其异构体。
可选的，该式(I)的化合物中：
R1’为-(CH2)2-3-，X为羟基、-C(O)(CH2)2-3NRaRb、-C(O)O(CH2)2-3NRaRb、- C(O)NH(CH2)2-3NRaRb，或5-10元杂芳基，上述杂芳基任选被选自下列的基团所取代； -(CH2)2-3OH、-(CH2)2-3NRaRb、-(CH2)2-3C(O)NRaRb；或者X还可以为：
Figure BDA0003096168540000031
Ra、Rb各自独立地选自H、C1-3烷基、-(CH2)2-3NH2、-(CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2；或者 Ra和Rb与其所连接的氮原子一起形成包含1-3个选自N或O的杂原子的5-10元杂环，该杂环任选被选自下列的基团所取代；C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷基羟基、C1-6烷基氨基。
可选的，该式(I)的化合物中：
每个M各自独立地选自-CH2-、-CH＝CH-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)NH-、-NHC(O)-。
可选的，该式(I)的化合物为式(II)化合物：
Figure BDA0003096168540000032
其中，每个R*独立地选自C2-10烷基，优选C6-10烷基，优选C6烷基。
可选的，该式(II)化合物中，每个M独立地选自-C(O)O-或-OC(O)-，优选- C(O)O-。
可选的，该式(II)化合物中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为羟基。
可选的，该式(II)化合物中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为-C(O)(CH2)2- 3NRaRb、 -C(O)O(CH2)2-3NRaRb、-C(O)NH(CH2)2-3NRaRb，
Ra、Rb各自独立地选自H、C1-3烷基、-(CH2)2-3NH2；或者Ra和Rb与其所连接的氮原子一起形成包含1-3个选自N或O的杂原子的5-10元杂环，优选为吗啉基或哌啶基，该杂环任选被选自下列的基团所取代；C1-6烷基羟基。
可选的，该式(II)化合物中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为5-6元杂芳基，优选为三唑基，上述杂芳基任选被选自下列的基团所取代；-(CH2)2-3OH、-(CH2)2-3NRaRb、 -(CH2)2-3C(O)NRaRb，
Ra、Rb各自独立地选自H、C1-3烷基、-(CH2)2-3NH2、-(CH2)2-3NH(CH2)2-3NH2；或者 Ra和Rb与其所连接的氮原子一起形成包含1-3个选自N或O的杂原子的5-10元杂环，优选为吗啉基、哌嗪基或哌啶基，该杂环任选被选自下列的基团所取代；C1-6烷基羟基。
可选的，该式(II)化合物中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为
Figure BDA0003096168540000041
可选的，该式(II)化合物中，每个n为7，m为7。
可选的，该式(I)化合物为式(III)化合物：
Figure BDA0003096168540000042
可选的，该式(III)化合物中，每个R’各自选自独立地选自C1-10烷基，优选C2-8烷基。
可选的，该式(III)化合物中，每个M各自独立地-C(O)O-或-OC(O)-，优选-C(O)O-。
可选的，该式(I)化合物为式(IV)化合物：
Figure BDA0003096168540000043
可选的，该式(IV)化合物中，每个R*各自独立地选自C2-10烷基，优选C6-10烷基，优选C6烷基。
可选的，该式(IV)化合物中，每个M各自独立地-C(O)O-或-OC(O)-，优选-C(O)O-。
可选的，该式(I)化合物为式(V)化合物：
Figure BDA0003096168540000044
可选的，该式式(V)化合物中，每个R*各自独立地选自C2-10烷基，优选C6-10烷基，优选C6烷基。
可选的，该式式(V)化合物中，每个M各自独立地-CH＝CH-、-C(O)O-或-OC(O)-，优选-CH＝CH-或-C(O)O-。
可选的，该式式(V)化合物中，每个R’各自选自C1-10烷基或C3-12烯基，优选C10烷基或C8烯基。
在一个实施方案中，该化合物选自如下化合物、其盐或其异构体中的任意至少一种： A1、A5-A7、A9-A13、A15-A32和A34-A48。
在一个实施方案中，本发明还公开一种组合物，包括有如权利要求1所述可离子化脂质化合物、聚乙二醇化脂质化合物、结构性脂质和磷脂。
可选的，所述磷脂选自1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1，2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1，2- 二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18：0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1，2- 二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 1，2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1，2- 二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)中的任意至少一种。
可选的，所述聚乙二醇化(PEGylation)脂质化合物包括有PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油、以及细胞靶向配体修饰的以上PEG改性脂质中的任意至少一种。
可选的，所述结构性脂质包括有胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。
可选的，该组合物中，可离子化脂质化合物为20％-80％、聚乙二醇化脂质化合物为 1％-10％、结构性脂质为10％-50％和磷脂为5％-30％，按摩尔计。可选的，可离子化脂质化合物的含量为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、 75％、80％，按摩尔计。可选的，聚乙二醇化脂质化合物的含量为1％、1.5％、2％、2.5％、 3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、 10％，按摩尔计。可选的，结构性脂质的含量为10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％，按摩尔计。可选的，磷脂的含量为5％、10％、15％、20％、25％、30％，按摩尔计。
可选的，该组合物为脂质纳米颗粒。
可选的，该脂质纳米颗粒还包括有效成分，所述有效成分选自DNA、RNA、蛋白质、药物活性分子中的任意至少一种。
可选的，所述RNA选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA、反义核苷酸(ASO)或寡核苷酸(oligonucleotide)中的任意至少一种。
可选的，所述蛋白质选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
在一个实施方案中，本发明还公开一种脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤(1)将所述可离子化脂质化合物、聚乙二醇脂质化合物、结构性脂质和磷脂混合溶解在乙醇溶液中。
可选的，该方法还包括步骤(2)通过混合器与有效成分混合形成脂质纳米颗粒。
可选的，将所述可离子化脂质化合物、聚乙二醇或修饰聚乙二醇脂质化合物、结构性脂质和磷脂溶解混合在乙醇中，通过混合器与有效成分混合形成脂质纳米颗粒。
在一个实施方案中，本发明还公开本发明的化合物在制备脂质纳米颗粒中的用途。
可选的，所述脂质纳米颗粒中性介质中呈中性不带电荷，在酸性介质中质子化后呈带正电荷。
可选的，所述脂质纳米颗粒如本发明说明书所定义。
在一个实施方案中，本发明还公开一种药物组合物，其包括本发明所述的脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明还公开了所述的脂质纳米颗粒或的药物组合物在制备药物中的用途。
可选的，该药物还包括有效成分，所述有效成分选自DNA、RNA、蛋白质、药物活性分子中的任意至少一种。
可选的，所述RNA选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA 中的任意至少一种。
在一个实施方案中，本发明还公开一种脂质纳米颗粒在制备药物中的用途，将药物有效成分封装在所述脂质纳米颗粒内。
在一个实施方案中，本发明还公开一种药物的使用方法，将所述药物通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、微针贴片、口服、口鼻腔喷雾、涂抹的方式对人或动物使用。
可选的，本发明的可离子化脂质化合物的化学式如下所示：
Figure BDA0003096168540000071
Figure BDA0003096168540000081
Figure BDA0003096168540000091
Figure BDA0003096168540000101
Figure BDA0003096168540000111
Figure BDA0003096168540000121
与现有技术如PCT/US2016/052352、PCT/US2010/038224相比较，本申请的可离子化脂质区别在于：
1、化学结构不同：连接叔胺氮原子(N)的其中2条或1条含酯基的脂肪链分别通过丙三醇结构与含饱和脂肪链或不饱和的脂肪链形成新颖的含醚键的脂肪链，结果显示比脂肪链的可离子化脂质转染效率更好；
2、代谢产物不同：本发明的可离子化脂质的脂肪链通过酯基与丙三醇及较短的脂肪链构成，代谢产物为较短小的脂肪酸、脂肪醇或醚等小分子化合物，在体内更易被代谢排泄，不易在体内积累，毒性更低。
3、新型的含炔中间体结构：由丙炔胺与溴代脂肪链形成的含炔中间产物，可以与很多带有叠氮基化合物进行Click反应，生成一系列的新型可离子化脂质化合物。
4、合成简单和原料易得：起始原料为丙三醇、短小的脂肪醇和脂肪酸，原料便宜易得，合成简单。
附图说明
图1：LNP安全性评价中的雄性大鼠体重变化
图2：LNP安全性评价中的雌性大鼠体重变化
图3：LNP安全性评价中的雄性大鼠摄食量变化
图4：LNP安全性评价中的雌性大鼠摄食量变化
图5：LNP包封mRNA的免疫原性研究IgG抗体滴度
定义
当列出数值范围时，既定包括每个值和在所述范围内的子范围。例如“C1-6烷基”包括C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、 C3-5、C3-4、C4-6、C4-5和C5-6烷基。
术语“烷基”是指包括一个或多个碳原子(例如、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个碳原子)的直链或支链饱和烃基。具体地，“C1-10烷基”是指包括1-10个碳原子的直链或支链饱和烃基。“C2-18烷基”是指包括 2-18个碳原子的任选取代的直链或支链饱和烃基。除非另有说明，本文所述的烷基是指未取代和取代的烷基。
术语“烯基”或“链烯基”是指包含两个或更多个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20或更多个碳原子)。烯基可以包括一个、两个、三个、四个或更多个碳-碳双键。具体地，“C3-12烯基”是指包括3-12个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基。“C4-18烯基”是指包括4-18个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基。除非另有说明，本文所述的烯基是指未取代和取代的烯基。
术语“卤代”或“卤素”是指氟(F)、氯(Cl)、溴(Br)和碘(I)。
术语“C1-6卤代烷基”是指上述“C1-6烷基”被一个或多个卤素基团取代。示例性的所述卤代烷基包括但不限于：-CF3、-CH2F、-CHF2、-CHFCH2F、-CH2CHF2、-CF2CF3、-CCl3、 -CH2Cl、-CHCl2、2，2，2-三氟-1，1-二甲基-乙基，等等。
术语“C3-7环烷基”是指具有3至7个环碳原子和零个杂原子的非芳香环烃基团。示例性的所述环烷基包括但不限于：环丙基(C3)、环丙烯基(C3)、环丁基(C4)、环丁烯基(C4)、环戊基(C5)、环戊烯基(C5)、环己基(C6)、环己烯基(C6)、环已二烯基(C6)、环庚基(C7)、环庚烯基(C7)、环庚二烯基(C7)、环庚三烯基(C7)，等等。环烷基基团可以被一或多个取代基任选取代，例如，被1至5个取代基、1至3个取代基或1个取代基取代。
术语“4-10元杂环基”是指具有环碳原子和1至3个环杂原子的4至10元非芳香环系的基团，其中，每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅。同样，术语“4-7元杂环基”和“5-10元杂环基”也具有同样的定义。在包含一个或多个氮原子的杂环基中，只要化合价允许，连接点可为碳或氮原子。示例性的包含一个杂原子的3元杂环基包括但不限于：氮杂环丙烷基、氧杂环丙烷基、硫杂环丙烷基(thiorenyl)。示例性的含有一个杂原子的4元杂环基包括但不限于：氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和硫杂环丁烷基。示例性的含有一个杂原子的5元杂环基包括但不限于：四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢噻吩基、吡咯烷基、二氢吡咯基和吡咯基-2，5-二酮。示例性的包含两个杂原子的5元杂环基包括但不限于：二氧杂环戊烷基、氧硫杂环戊烷基(oxasulfuranyl)、二硫杂环戊烷基(disulfuranyl)和噁唑烷-2-酮。示例性的包含三个杂原子的5元杂环基包括但不限于：三唑啉基、噁二唑啉基和噻二唑啉基。示例性的包含一个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌啶基、四氢吡喃基、二氢吡啶基和硫杂环己烷基(thianyl)。示例性的包含两个杂原子的6元杂环基包括但不限于：哌嗪基、吗啉基、二硫杂环己烷基、二噁烷基。示例性的包含三个杂原子的6元杂环基包括但不限于：六氢三嗪基(triazinanyl)。示例性的含有一个杂原子的7元杂环基包括但不限于：氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基和硫杂环庚烷基。
术语“C6-10芳基”是指具有6-10个环碳原子和零个杂原子的单环或多环的(例如，双环)4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6或10个π电子)的基团。在一些实施方案中，芳基具有六个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有十个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，例如，1-萘基和2-萘基)。
术语“5-10元杂芳基”是指具有环碳原子和1-4个环杂原子的5-10元单环或双环的4n+2芳族环体系(例如，具有以环状排列共享的6或10个π电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，只要化合价允许，连接点可以是碳或氮原子。杂芳基双环系统在一个或两个环中可以包括一个或多个杂原子。杂芳基还包括其中上述杂芳基环与一个或多个环烷基或杂环基稠合的环系统，而且连接点在所述杂芳基环上，在这种情况下，碳原子的数目继续表示所述杂芳基环系统中的碳原子数目。示例性的含有一个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：吡咯基、呋喃基和噻吩基。示例性的含有两个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：咪唑基、吡唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基和异噻唑基。示例性的含有三个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：三唑基、噁二唑基(例如，1，2，4-噁二唑基)和噻二唑基。示例性的含有四个杂原子的5元杂芳基包括但不限于：四唑基。示例性的含有一个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：吡啶基。示例性的含有两个杂原子的6元杂芳基包括但不限于：哒嗪基、嘧啶基和吡嗪基。示例性的含有三个或四个杂原子的6元杂芳基分别包括但不限于：三嗪基和四嗪基。示例性的含有一个杂原子的7元杂芳基包括但不限于：氮杂环庚三烯基、氧杂环庚三烯基和硫杂环庚三烯基。示例性的5，6-双环杂芳基包括但不限于：吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、异苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噻二唑基、茚嗪基和嘌呤基。示例性的6，6-双环杂芳基包括但不限于：萘啶基、喋啶基、喹啉基、异喹啉基、噌琳基、喹喔啉基、酞嗪基和喹唑啉基。
术语“异构体”为具有同样分子式的不同化合物。本发明尤其优选立体异构体，术语“立体异构体”为只是原子空间排列不同的异构体。
在一些情况下，本发明的化合物可以形成盐，这些盐也在本发明的范围内术语“盐(一种或多种)”指与无机和/或有机酸和碱形成的酸性盐和/或碱性盐。本发明尤其优选药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的盐”表示本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐，它们在可靠的医学判断范围内适用于与患者组织接触，不会产生不恰当的毒性、刺激作用、变态反应等，与合理的益处/风险比相称，就它们的预期应用而言是有效的，包括(可能的话)本发明化合物的两性离子形式。
药学上可接受的碱加成盐是与金属或胺生成的，例如碱金属与碱土金属氢氧化物或有机胺。用作阳离子的金属的实例有钠、钾、镁、钙等。适合的胺的实例有N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。
酸性化合物的碱加成盐可以这样制备，按照常规方式使游离酸形式与足量所需的碱接触，生成盐。按照常规方式使盐形式与酸接触，再分离游离酸，可以使游离酸再生。游离酸形式在某些物理性质上多少不同于它们各自的盐形式，例如在极性溶剂中的溶解度，但是出于本发明的目的，盐还是等价于它们各自的游离酸。
盐可以是从无机酸制备的硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物，酸例如盐酸、硝酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等。代表性盐包括：氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、月桂基磺酸盐和羟乙磺酸盐等。盐也可以是从有机酸制备的，例如脂肪族一元与二元羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、烷二酸、芳香族酸、脂肪族与芳香族磺酸等。代表性盐包括乙酸盐、丙酸盐、辛酸盐、异丁酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、富马酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盆、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、萘甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。药学上可接受的盐可以包括基于碱金属与碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。还涵盖氨基酸的盐，例如精氨酸盐、葡糖酸盐、半乳糖醛酸盐等(例如参见Berge S.M.et al.，〞PharmaceuticalSalts，”J.Pharm.Sci.，1977；66：1-19，引入此作为参考)。
本发明化合物的药学上可接受的无毒酰胺的实例包括从C1-C6烷基酯，其中烷基是直链或支链的。可接受的酯还包括C5-C7环烷基酯以及芳基烷基酯，例如但不限于苄基酯。C1-C4烷基酯是优选的。本发明化合物的酯可以按照常规方法制备，例如：March′s AdvancedOrganic Chemistry，5Edition”M.B.Smith&J.March，John Wiley&Sons，2001。
本发明化合物的药学上可接受的无毒性酰胺的实例包括从氨、伯C1-C6烷基胺和仲C1-C6二烷基胺衍生的酰胺，其中烷基是直链或支链的。在仲胺的情况下，胺也可以是含有一个氮原子的5或6元杂环的形式。从氨、C1-C3烷基伯胺和C1-C2二烷基仲胺衍生的酰胺是优选的。本发明化合物的酰胺可以按照常规方法制备，例如：March′s Advanced OrganicChemistry，5Edition”，M.B.Smith&J.March，John Wiley&Sons，2001。
术语“可接受的载体”是指可用来将现有的物质用于本发明目的的合适的载体，而没有过度的毒性、刺激、过敏反应等，相当于具有合理的得益/风险比。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，通过以下实施例，并结合附图，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1——A1的合成
Figure BDA0003096168540000171
溴代十六烷(2.22g、7.28mmol)溶于50ml无水乙醇中，加入DIEA(1.17g、9.10mmol)、和胺醇化合物(2g、6.07mmol)，80℃下反应18h，反应完全后，浓缩除去溶剂，加EA 200ml稀释，水200ml洗一次，萃取分液，干燥有机相，浓缩至干，过硅胶柱分离纯化(DCM：MeOH＝3％--5％)，得到油状产品1.2g。MS(ES)：m/z(M+H)+553.54。1HNMR (CDCl3)δ：ppm：4.06(t，2H)，3.57(t，2H)，2.62(bs，2H)，2.50(br，4H)，2.29(m，2H)，1.68- 1.25(m，52H)，0.88(m，6H)。
后续的A5-A7、A9-A13、A15-A32的合成思路均可参考本实施例的进行设计，基本如下：通过溴代化合物或者酮烯化合物和伯/仲胺化合物(如醇胺类化合物)发生取代反应。
实施例2——A5的合成
Figure BDA0003096168540000172
参考实施例1的方法，制备A5，得到油状产品0.75g。MS(ES)：m/z(M+H)+835.80。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：4.87(m，2H)，3.79(t，2H)，2.67(br，2H)，2.45(br，4H)，2.27(t，4H)，1.70- 1.25(m，78H)，0.90(m，12H)。
实施例3——A6的合成
Figure BDA0003096168540000173
参考实施例1的方法，制备A6，得到油状产品0.51g。MS(ES)：m/z(M+H)+611.55。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：4.05(t，4H)，3.78(m，2H)，2.65(t，2H)，2.43(br，4H)，2.29(m，4H)，1.69- 1.31(m，50H)，0.90(m，6H)。
实施例4——A7的合成
Figure BDA0003096168540000181
参考实施例1的方法，制备A7，得到油状产品2.45g。MS(ES)：m/z(M+H)+703.68。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.38-5.31(m，4H)，4.86(m，1H)，3.79(t，2H)，2.77(m，2H)，2.67(br，2H)， 2.45(br，4H)，2.27(m，2H)，2.04(m，4H)，1.70-1.25(m，58H)，0.90(m，9H)。
实施例5——A9的合成
Figure BDA0003096168540000182
参考实施例1的方法，制备A9，得到油状产品1.6g。MS(ES)：m/z(M+H)+577.54。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.38-5.33(m，4H)，4.06(t，2H)，3.60(t，2H)，2.77(t，2H)，2.66(m，2H)，2.54(bs，4H)，2.30(m，2H)，2.05(m，4H)，1.68-1.25(m，42H)，0.88(m，6H)。
实施例6——A10的合成
Figure BDA0003096168540000183
参考实施例1的方法，制备A10，得到油状产品0.4g。MS(ES)：m/z(M+H)+693.63。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.36(m，4H)，5.10(m，1H)，3.56(t，4H)，3.46-3.40(br，4H)，2.76(t，2H)，2.64(br，4H)，2.51(bs，4H)，2.32(m，2H)，2.05(m，6H)，1.67-1.25(m，44H)，0.88(m，9H)。
实施例7——A11的合成
Figure BDA0003096168540000191
参考实施例1的方法，制备A11，得到油状产品0.5g。MS(ES)：m/z(M+H)+713.62。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.10(m，1H)，4.05(d，4H)，4.03(t，4H)，3.54(m，2H)，3.43(s，2H)， 3.16(t，2H)，3.10(br，4H)，2.32(t，4H)，1.66-1.27(m，50H)，0.88(m，9H)。
实施例8——A12的合成
Figure BDA0003096168540000192
参考实施例1的方法，制备A12，得到油状产品2.68g。MS(ES)：m/z(M+H)+591.56，1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.37-5.35(m，4H)，4.05(t，2H)，3.78(t，2H)，2.77(t，2H)，2.64(m，2H)，2.41(bs，4H)，2.31(m，2H)，2.03(m，4H)，1.68-1.25(m，44H)，0.88(m，6H)。
实施例9——A13的合成
Figure BDA0003096168540000193
参考实施例1的方法，制备A13，得到油状产品1.2g。MS(ES)：m/z(M+H)+825.74；1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.12(m，1H)，4.86(m，1H)，3.65-3.40(m，10H)，2.72(br，2H)，2.60(br，4H)， 2.34-2.26(m，4H)，1.62-1.25(m，64H)，0.88(m，12H)。
实施例10——A15的合成
Figure BDA0003096168540000201
参考实施例1的方法，制备A15，得到油状产品0.4g。MS(ES)：m/z(M+H)+707.64。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.34(m，4H)，5.10(m，1H)，3.79(t，2H)，3.56-3.41(m，8H)，2.80(t，2H)，2.77(t，2H)，2.46(br，4H)，2.32(m，2H)，2.05(m，4H)，1.67-1.25(m，46H)，0.88(m，9H)。
实施例11——A16的合成
Figure BDA0003096168540000202
参考实施例1的方法，制备A16，得到油状产品0.59g。MS(ES)：m/z(M+H)+727.63。1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.10(m，1H)，4.05(dd，2H)，3.77(t，2H)，3.54(dd，4H)，3.46-3.38(m，4H)， 3.19(t，2H)，3.01(br，4H)，2.32(t，4H)，1.66-1.27(m，52H)，0.88(m，9H)。
实施例12——A17的合成
Figure BDA0003096168540000211
参考实施例1的方法，制备A17，得到油状产品1.1g。MS(ES)：m/z(M+H)+839.76；1HNMR(CDCl3)δ：ppm：5.12(m，1H)，4.86(m，1H)，3.79(t，2H)，3.55(t，4H)，3.41(m，4H)， 2.67(br，2H)，2.44(br，4H)，2.32-2.26(t，4H)，1.62-1.25(m，66H)，0.88(m，12H)。
实施例13——A18的合成
Figure BDA0003096168540000212
参考实施例1的方法，制备A18，得到油状产品1.44g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.5.11(t，2H)，3.57-3.37(m，18H)，2.57(t，2H)，2.44(t，4H)，2.32(m，4H)，1.62-1.27(m，52H)， 0.88(m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+829.70。
实施例14-A19的合成
Figure BDA0003096168540000213
参考实施例1的方法，制备A19，得到油状产品2.3g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.5.06(t，2H)，3.72(t，2H)，3.50-3.33(m，16H)，2.27(t，2H)，2.25-2.24(m，8H)，1.56-1.19(m， 52H)，0.88(m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+843.72。
实施例15——A20的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000221
参考实施例1的方法，制备A20，得到油状产品0.95g。MS(ES)：m/z(MH+)821.75；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：ppm 5.29(m，4H)，4.03(s，2H)，3.51(t，2H)，3.30- 3.27(m，12H)，2.70(m，2H)，2.57(t，2H)，2.46(br，4H)，2.21(m，2H)，1.30-1.19(br. m，52H)，0.89(m，12H)。
实施例16——A21的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000222
参考实施例1的方法，制备A21，得到油状产品0.68g。MS(ES)：m/z(MH+)835.76；1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：ppm5.35(m，4H)，4.10(s，2H)，3.79(t，2H)，3.30(m， 12H)，2.76(br，m，4H)，2.50(br，4H)，2.28(m，2H)，2.05(m，4H)，1.61(br，4H)， 1.57(m，4H)，1.54-1.24(br.m，54H)，0.88(m，12H)。
实施例17——A22的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000231
参考实施例1的方法，制备A22，得到油状产品0.43g。1HNMR(400MHz，CDCl3)δ：ppm.4.03(s，2H)，3.98(t，2H)，3.72(t，2H)，3.28(m，12H)，2.65(t，2H)，2.45(t，4H)， 2.25-2.20(m，4H)，1.66-1.19(m，60H)，0.83(m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+855.75。
实施例18——A23的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000232
参考实施例1的方法，制备A23，得到油状产品1.8g。1HNMR(400MHz，CDCl3) δ：ppm.4.10(s，2H)，4.06(t，2H)，3.56(t，2H)，3.36-3.34(m，12H)，2.61(t，2H)，2.49(t， 4H)，2.30(m，4H)，1.67-1.26(m，58H)，0.88(m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+841.74。
实施例19——A24的合成
Figure BDA0003096168540000233
参考实施例1的方法，制备A24，得到油状产品0.72g。1HNMR(400MHz，CDCl3) δ：ppm.4.10(s，4H)，3.67(br，2H)，3.35(m，24H)，2.80-2.50(br，6H)，2.28(m，4H)， 1.67-1.23(m，68H)，0.89(m，18H)，MS(ES)：m/z(M+H)+1085.94。
实施例20——A25的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000241
参考实施例1的方法，制备A25，得到油状产品0.3g。1HNMR(400MHz，CDCl3) δ：ppm.5.23(m，1H)，5.05(t，1H)，4.11(br，4H)，3.78(t，2H)，3.49-3.34(br，m，16H)， 3.15(t，2H)，3.01(t，4H)，2.26(m，2H)，2.10(m，2H)，2.01(m，2H)，1.79-1.18(br，m， 52H)，0.83(br，m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+842.73。
实施例21——A26的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000242
参考实施例1的方法，制备A26，得到油状产品0.46g。1HNMR(400MHz，CDCl3) δ：ppm.5.03(m，2H)，3.75(t，2H)，3.48-3.34(br，m，16H)，2.91(br，2H)，2.72(br，4H)， 2.27(t，4H)，1.85(m，2H)，1.58-1.10(br，m，48H)，0.81(br，m，6H)，MS(ES)：m/z(M+H)+ 787.65。
实施例22——A27的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000251
参考实施例1的方法，制备Cbz-1，3-丙二胺辛酸酯。Cbz-1，3-丙二胺辛酸酯(3.5g，5.9mmol)，无水碳酸钠(0.94g，8.8mmol)，KI(0.19g，1.18mmol)。)溶解在30mL的无水乙醇和30mL的无水乙腈中，然后加入溴化物，在75℃下反应24小时。反应完成后，通过浓缩除去溶剂，往反应混合物加入200mL二氯甲烷以稀释，用200mL水洗涤，萃取，将有机层干燥，浓缩，并通过硅胶柱进行纯化(DCM：MeOH＝3％-10％)，得到油状Cbz-胺产物。将Cbz-胺(2.1g，2.43mmol)溶解在20mL的无水甲醇和20mL乙酸乙酯中，然后添加钯(0.35g，10％)，将氢置换3次后，在室温下氢化20H。反应完成后，过滤除去钯，浓缩并除去溶剂，萃取，得到胺产物。将得到的胺产物(1.1g， 1.51mmol)溶解在20mL无水乙醇，加入酮-甲胺(0.22g，1.51mmol)，将溶液搅拌并在室温下反应 20小时。反应完成后，浓缩并除去溶剂，将滤液干燥，浓缩并通过硅胶柱进行纯化(DCM：MeOH ＝3％-10％)，得到A270.6g。1HNMR(d-DMSO)δ：ppm.4.99(p，1H)，3.98(t，2H)，3.50- 3.31(m，8H)，3.10(d，3H)，2.49(dt，8H)，2.26(m，4H)，1.52(dd，6H)，1.43(m，6H)， 1.26(m，40H)，0.84(m，9H)，MS(ES)：m/z(M+H)+835.66。
实施例23——A28的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000261
参考实施例22的方法，制备A28，得到产品1.3g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.5.04(t， 2H)，3.61(t，2H)，3.50-3.31(m，16H)，3.21(s，3H)，2.71(t，2H)，2.55(t，4H)，2.28-2.24(m，4H)，1.86-1.19(m，54H)，0.82(m，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+951.75。
实施例24——A29的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000262
参考实施例22的方法，制备A29，得到产品0.11g。1HNMR(d-DMSO)δ：ppm. 5.00(m，2H)，3.60-3.30(m，16H)，3.11(s，3H)，2.63-2.49(m，10H)，2.36(m，2H)，2.26(m，4H)，1.80(m，2H)，1.46-1.26(m，54H)，0.85(t，12H)，MS(ES)：m/z(M+H)+1103.81。
实施例25——A30的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000271
参考实施例22的方法，制备A30，得到产品0.34g。1HNMR(d-DMSO)δ：ppm. 4.99(m，4H)，3.60-3.30(m，32H)，2.63-2.40(m，20H)，2.25(m，8H)，1.80-1.20(m，110H)， 0.81(m，24H)，MS(ES)：m/z(M+H)+1915.5。
实施例26——A31的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000281
参考实施例22的方法，制备A31，得到产品0.7g。1HNMR(d-DMSO)δ：ppm.5.05(m，2H)，3.60-3.30(m，20H)，2.63-2.40(m，12H)，2.2(m，6H)，1.80-1.20(m，64H)，0.85(m，12H)。MS(ES)：m/z(M+H)+1134.95。
实施例27——A32的合成
Figure BDA0003096168540000282
参考实施例22的方法，制备A32，得到产品1.5g。1HNMR(d-DMSO)δ：ppm.5.1(m，2H)，3.60-3.30(m，24H)，2.5(m，4H)，2.4(m，4H)，2.3(m，4H)，2.2(m，6H)，1.95(m， 2H)，1.8(m，2H)，1.5-1.6(m，8H)，1.2-1.4(m，48H)，0.9(m，8H)，MS(ES)：m/z(M+H)+ 1174.88。
实施例28——A34的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000291
参考实施例1的方法，合成炔基脂质化合物中间产品。溴代氧醚酯(11g)、碳酸钠(2.5g)、KI(0.4g)，溶于50ml的乙腈中，加入炔胺(0.65g)，反应完全后，浓缩除去乙腈，通过乙酸乙酯和水150ml搅拌萃取后，对有机相干燥浓缩，过柱分离纯化 (PE∶EA＝10∶1-5∶1)，得到炔基脂质化合物中间产品。
制备A34步骤：3-叠氮丙醇-1化合物(0.5g)、无水硫酸铜(0.15g)、抗坏血酸钠(0.24g)和炔基化合物(0.08g)，溶解在10ml的THF和10ml的水中，室温反应后，浓缩除去THF，加二氯甲烷100ml稀释，过滤，除去不溶物，滤液加水搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化(DCM：MeOH＝1％-2％)，得到A34产品0.39g。1HNMR (CDCl3)δ：ppm.7.56(s，1H)，5.12(p，2H)，4.50(m，2H)，3.77(s，2H)，3.62-3.43(m， 18H)，2.44(s，4H)，2.32(t，4H)，2.13(tt，2H)，1.70-1.50(m，16H)，1.26(m，36H)， 0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+925.37。
实施例29——A35的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000292
参考实施例28的方法，制备A35，得到产品2.2g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.7.50(d，1H)，5.11(p，2H)，4.45(t，2H)，3.77(s，2H)，3.68-3.43(m，20H)，2.82(t，2H)，2.49(m， 4H)，2.41(s，4H)，2.32(t，4H)，1.70-1.50(m，20H)，1.26(m，32H)，0.88(m，12H)；MS(ES)： m/z(M+H)+980.45。
实施例30——A36的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000301
参考实施例28的方法，制备A36，得到产品2.4g。1H NMR(500MHz，DMSO)δ 7.86(s，1H)，5.00(p，J＝5.2Hz，2H)，4.41(t，J＝6.3Hz，2H)，3.62(s，2H)，3.55-3.41(m， 10H)，3.42-3.35(m，8H)，2.68(d，J＝5.9Hz，4H)，2.36(s，4H)，2.32-2.27(m，4H)，2.25(t， J＝7.3Hz，4H)，1.55-1.48(m，4H)，1.46-1.43(m，6H)，1.41-1.36(m，4H)，1.25(dd，J＝ 16.2，4.5Hz，38H)，1.10(s，1H)，0.84(t，J＝6.9Hz，12H)。MS(ES)：m/z(M+H)+979.47。
实施例31——A37的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000302
参考实施例28的方法，制备A37，得到产品1.7g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.7.59(d， 1H)，5.10(p，2H)，4.46(t，2H)，3.75(s，2H)，3.75-3.43(m，20H)，2.94-2.87(t，4H)，2.69- 2.43(m，4H)，2.41(s，4H)，2.33(t，4H)，1.70-1.50(m，22H)，1.26(m，32H)，0.88(m， 12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+1037.54。
实施例32——A38的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000311
参考实施例28的方法，制备A38，得到产品2.5g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.7.53(d， 1H)，5.11(p，2H)，4.42(t，2H)，3.76(s，2H)，3.68-3.41(m，20H)，2.83(t，2H)，2.49(s， 6H)，2.32(t，4H)，1.70-1.50(m，20H)，1.26(m，32H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z (M+H)+953.45。
实施例33——A39的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000312
参考实施例28的方法，制备A39，得到产品1.7g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.7.59(d， 1H)，5.11(p，2H)，4.47(t，2H)，3.73(s，2H)，3.70-3.41(m，24H)，2.78(t，2H)，2.51(4， 4H)，2.42(m，2H)，2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，59H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+ 1036.56。
实施例34——A40的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000321
参考实施例28的方法，制备A40，得到产品1.4g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm.7.53(d，1H)，5.11(p，2H)，4.47(t，2H)，3.72(s，2H)，3.70-3.40(m，22H)，2.66(t，2H)，2.65- 2.55(m，6H)，2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，44H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+1052.54。
实施例35——A42的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000322
参考实施例1的方法，合成炔基脂质化合物中间产品。溴代氧醚酯(10.6g)、碳酸钠(2.42g)、KI(0.4g)，溶50ml的乙腈中，加入苄基-丙胺酸(2.04g)，回流反应完全后，浓缩除去乙腈，加乙酸乙酯、水搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化 (DCM：MeOH＝2％-3％)，得到A42-I产品7.5g。
A42-I中间体(2g)、钯碳(0.5g)，溶50ml的甲醇中，氢化室温反应完全后，过滤除去钯碳，滤液浓缩至干得到A42-II产品1.7g。
制备A42步骤：A42-II中间体(1.5g)、DCC(0.54g)、DMAP(0.21g)，溶50ml 的二氯甲烷中，加入吗啉乙醇(0.23g)，室温反应完全后处理，加二氯甲烷、水搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化(DCM：MeOH＝1％-3％)，得到A42产品1.1g。1HNMR (CDCl3)δ：ppm.5.12(p，2H)，4.41(t，2H)，3.76(t，2H)，3.55-3.40(m，20H)，3.01-2.76(m，10H)，2.49(t，6H)，2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，52H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+ 971.44。
实施例36——A43的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000331
参考实施例35的方法，制备A43，得到A43产品0.5g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm. 5.12(p，2H)，4.41(t，2H)，3.76(t，2H)，3.55-3.40(m，20H)，3.01-2.76(m，10H)，2.49(t， 2H)，2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，54H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+942.44。
实施例37——A44的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000332
参考实施例35的方法，得到Boc保护的哌嗪乙醇酯中间体。
制备A44步骤：Boc保护的哌嗪乙醇酯中间体(1.1g)溶于20ml的2mol/L的盐酸乙醇中，室温反应完全后，浓缩至干，得到A44产品0.8g。1HNMR(CDCl3)δ：ppm. 5.10(p，2H)，4.35(t，2H)，3.60-3.40(m，18H)，3.01-2.85(m，6H)，2.65-2.50(t，10H)， 2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，52H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+970.45。
实施例38——A45的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000341
参考实施例37的方法，制得A44。
制备A45步骤：A44(1.6g)、碳酸钠(0.17g)、KI(0.054g)，溶50ml的乙腈中，加入溴乙醇(0.2g)，回流反完全后，浓缩除去乙腈，加乙酸乙酯、水搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化(DCM：MeOH＝3％-5％)，得到产品A45约1.1g。1HNMR(CDCl3) δ：ppm.5.10(p，2H)，4.35(t，2H)，3.60-3.40(m，18H)，3.32(t，2H)，3.01-2.90(m，6H)， 2.53(t，2H)，2.49-2.35(t，10H)，2.32(t，4H)，1.59-1.25(m，52H)，0.87(m，12H)；MS(ES)： m/z(M+H)+1014.50。
实施例39——A46的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000342
参考实施例35的方法，制得A42-II。
制备A46-I步骤：A42-II(1.5g)、DCC(0.39g)、PFP-OH(0.35g)，溶50ml的二氯甲烷中，室温反应完全后，浓缩除去DCM，加乙酸乙酯稀释，过滤除去白色不溶物，加入10％的碳酸钠溶液搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化(DCM：MeOH＝1％-3％)，得到产品A46-I约1.2g。
制备A46-II步骤：单Boc-二氨基二丙基胺(0.23g)、DIEA(0.19g)、A46-I(1g)，溶20ml的二氯甲烷中，室温反应完全后，加二氯甲烷、碳酸钠溶液搅拌萃取，有机相干燥浓缩，过柱分离纯化(DCM：MeOH＝1％-3％)，得到产品约A46-II约0.8g。
制备A46步骤：参考实施例37制备A44的方法，制得A46。1HNMR(CDCl3)δ： ppm.5.10(p，2H)，3.60-3.40(m，18H)，3.37(t，2H)，2.70-2.55(m，10H)，.2.50(t，2H)，2.32(t，4H)，1.72(m，4H)，1.59-1.25(m，52H)，0.87(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+971.48。
实施例40——A47的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000351
制备A47-I步骤：参考实施例35制备A42-I的方法，制得A47-I。
制备A47-II步骤：参考实施例35制备A42-II的方法，制得A47-II。
制备A47-III步骤：参考实施例39制备A46-I的方法，制得A47-III。
制备A47-IV步骤：参考实施例39制备A46-II的方法，制得A47-IV。
制备A47步骤：参考实施例37制备A44的方法，制得A47约1.1g。1HNMR(400 MHz，CD3OD)δ：ppm.5.10(m，2H)，3.53(m，8H)，3.44(m，9H)，3.20-3.0(m，16H)， 2.34(t，4H)，2.09(m，4H)，1.98(dt，4H)，1.84(dd，4H)，1.71(s，4H)，1.63(dd，4H)，1.53(m， 8H)，1.40-1.20(m，40H)，0.88(m，12H)；MS(ES)：m/z(M+H)+1071.65。
实施例41——A48的合成
合成路线：
Figure BDA0003096168540000361
制备A48-I步骤：参考实施例35制备A42-I的方法，制得A48-I。
制备A48-II步骤：参考实施例35制备A42-II的方法，制得A48-II。
制备A48-III步骤：参考实施例39制备A46-II的方法，制得A48-III。
制备A48步骤：参考实施例37制备A44的方法，制得A48约0.5g。1HNMR(400 MHz，CD3OD)δ：ppm.7.78(m，7H)，5.08(m，8H)，3.87(m，1H)，3.0-2.91(m，2H)， 2.71(m，4H)，2.50(m，12H)，1.84(dd，4H)，1.71(m，4H)，1.63-1.53(m，12H)，1.40-1.20(m， 36H)，0.88(m，6H)；MS(ES)：m/z(M+H)+799.35。
对比例——MC3、A2、A3、A4、A8和A33
将MC3、A2、A3、A4、A8和A33作为对比例，因MC3、A2、A3、A4、A8和A33 为已知的阳离子脂质体，具体合成方法不再赘述，MC3、A2、A3、A4、A8和A33如下：
Figure BDA0003096168540000362
Figure BDA0003096168540000371
实施例42——脂质纳米颗粒的制备
脂质纳米颗粒包括有(1)可离子化脂质化合物，可离子化脂质化合物可商购亦可自制得到，例如MC3(购自Avanti)，A1-A33为自制；(2)磷脂(如DOPE或者DSPC，购自Avanti)；(3)聚乙二醇化脂质化合物(如PEG-DMG，购自Avanti或自制)；(4) 结构性脂质(如胆固醇，购自Sigma-Aldrich)；(5)有效成分(如Luciferase mRNA，siRNA， SARS-CoV-2S蛋白mRNA，Cas 9 mRNA等)。
制备封装方法：(1)将可离子化的脂质、磷脂、聚乙二醇化脂质和结构性脂质一般分别按(摩尔计)50％，10％，1.5％和38.5％依次溶解混合于乙醇中；(2)使用微流控芯片或T-型混合器将脂质混合物与有效成分(mRNA)按1∶3的比例均匀混合得到脂质纳米颗粒。
包封率反映了被包封物质的包裹程度。包封率越高，说明被包封的物质在体内递送过程中越不容易被分解。
表1：可离子化脂质及其脂质纳米颗粒的性能
Figure BDA0003096168540000372
Figure BDA0003096168540000381
实施例43——证明转染效率的实验
按实施例42方法包封各种阳离子脂质化合物与荧光素酶mRNA纳米颗粒，测试不同LNP包封的荧光素酶mRNA的荧光强度或总光子数。
试验动物：SPF级BALB/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：SXCK(京)2016-0006。所有动物试验前适应性饲养7天以上，试验期间自由进食饮水，光照12/12h明暗交替，室内温度20～26℃，湿度40～70％。
试验方法：雌性BALB/c小鼠，使用皮下注射(腋下)、尾静脉注射、腹腔注射、肌肉注射(小鼠后腿胫前肌)四种不同给药方式给予不同LNP包封的荧光素酶mRNA；于给药后3、6、24、48h应用小动物活体成像系统(品牌：Bruker，型号：XTREME) 进行生物发光检测，具体操作步骤如下：底物配制：取适量底物Luciferin(品牌：Promega) 加入生理盐水配制成10mg/ml的溶液，避光备用，每只小鼠腹腔注射100μl。小鼠给予底物后自由活动5-10min，随后将小鼠放入麻醉箱使用浓度为2.5％异氟烷进行麻醉。将麻醉好的小鼠放入机器中，设置生物发光参数并拍照，采集图像后根据不同组别的荧光强度调整图片上限和下限的数值，并对荧光集中分布的部位进行数据采集(如：荧光强度、平均光子数和总光子数)及数据处理。统计学分析：活体成像结果以同一受试物组内不同动物荧光强度或总光子数的均值表示，以此判定不同LNP包封的荧光素酶 mRNA的荧光强度或总光子数高低。
荧光强度和总光子数反映了LNP的转染效率，数值越高，说明LNP将被包封的物质递送至细胞内的效率越高。
表2：可离子化脂质纳米颗粒制剂的诱导荧光素酶表达
Figure BDA0003096168540000391
注：给药途径：(1)肌肉注射；(2)尾静脉注射；剂量：10μg；检测时间：给药后3，6和24h
表3：可离子化脂质纳米颗粒制剂的诱导荧光素酶表达
Figure BDA0003096168540000392
Figure BDA0003096168540000401
注：NA：未记录相关数据；给药途径：肌肉注射；剂量：1μg/只；检测时间：给药后3，6和24h
表4：可离子化脂质纳米颗粒制剂的诱导荧光素酶表达
Figure BDA0003096168540000402
注：给药途径：肌肉注射；剂量：5μg/只；检测时间：给药后3，6和24h
实施例44——评价LNP安全性
取8只Wistar大鼠，雌雄各半，体重相差不超过10％，随机分为2组，即溶剂对照组、受试物组，应用A18进行脂质体纳米粒包装，LNP制剂包封条件和粒径分布见表5，测定浓度为2mg/mL。每只动物单日给药3次，每次注射250μl，给药时间间隔4h，左右腿交替给药。总给药量每只1.50mg，相当于人最大单位体重剂量的1200倍(假设人最大给药剂量是0.25mg)。临床观察：给药后24h内，每小时观察1次，给药后24-72h，每6小时观察1次，给药后4-14天，每天观察1次，详细记录毒性反应症状，症状出现和消失的时间，死亡时间(如有发生)。给药后每天记录1次体重，给药后每2天记录1次摄食量。于给药后第14 天将剩余全部动物称量体重后安乐死并剖检取主要脏器：心、肝、脾、肺、肾、胸腺、淋巴结称重，计算脏器系数。解剖后取心、肝、脾、肺、肾、肠道、胸腺、淋巴结、注射部位肌肉组织及其他观察到有病理学改变的器官保存于固定液中，通过H&E染色考查各组织器官的病理学变化，病变程度评分参照表7。
表5：大鼠的注射情况
可离子化脂质 粒径(纳米) 粒径分布(PDI)
溶剂对照组 - - -
受试物组(LNP空载体对照) A18 147 0.088
体重变化结果如图1-2所示，溶剂对照组雄性大鼠体重持续增长，受试物组大鼠体重初期开始下降至Day4-Day6恢复至给药前水平，后续持续增长。摄食量变化结果如图 3-4所示，溶剂对照组单只大鼠24h内摄食量稳定在18-35g之间，受试物组大鼠初期摄食量略微减少，至Day4-Day7恢复至正常水平。脏器系数结果如表6所示，与溶剂对照组比较，受试物组无明显差异。组织的病理学变化结果如表8所示，与溶剂对照组大鼠 (雌雄各一只)比较，受试物组大鼠的心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、淋巴结无病理改变。其中受试物组：除肺部部分间质细胞增生以及肌肉组织中有少量炎性细胞浸润外无其他异常病理改变。综合上述结果，在1200倍大剂量注射脂质纳米颗粒后大鼠仅在肺部和腿部有轻微的病理改变。
表6：大鼠急性毒性试验脏器系数结果
Figure BDA0003096168540000411
Total：雄性、雌性大鼠的脏器系数的平均值。
表7：病变严重程度评分标准
Figure BDA0003096168540000412
表8：大鼠急性毒性试验组织病理学结果
Figure BDA0003096168540000421
“-”表示无异常
实施例45——LNP包封mRNA的免疫原性研究
经由T7体外转录方法制备SARS-CoV-2的S蛋白mRNA，按照实施例42制备方法，用可离子化脂质A7、A18和A33，分别进行纳米颗粒包封，包装条件、LNP制剂包封率和粒径分布见表9。
表9：包封结果
可离子化脂质 包封率(％) 粒径(纳米) 粒径分布(PI)
A33 95 76 0.104
A7 97 79 0.060
A18 94 86 0.075
免疫方案：
Figure BDA0003096168540000422
将所得3种LNP制剂用于BALB/c小鼠免疫试验，具体操作：6-8周龄BALB/c小鼠，雌性，每组9只小鼠，通过肌肉注射分别于Day0和Day14接种两次LNP制剂，注射体积50μL。分别于免疫7天后，取小鼠脾脏分离脾脏淋巴细胞，通过ELISPOT法检测小鼠体内分泌γ干扰素的T淋巴细胞，结果如表10所示，mRNA在BALB/c小鼠体内可诱导更强的细胞免疫。于第二次免疫14天后，通过间接ELISA法检测S蛋白特异性IgG抗体，通过拟合量效曲线，计算IgG抗体EC50滴度见图5，结果表明A7、A18和A33在BALB/c小鼠体内均可诱导产生高水平的IgG抗体。
ELISPOT试验具体操作按照达优Mouse IFN-γprecoated ELISPOT kit说明书进行。
表10：Elispot计数免疫不同mRNA序列疫苗后分泌INFγ的T淋巴细胞
Figure BDA0003096168540000431
间接ELISA法检测S蛋白特异性IgG抗体滴度具体操作：
1.包被抗原：S蛋白用包被缓冲液稀释至2ng/uL，100uL/孔，4℃包被过夜。
2. 1XPBST洗板3次，每次5min。
3.用1％BSA封闭液进行封闭，200uL/孔，37℃静置1h。
4. 1XPBST洗板3次，每次5min。
5.待检血清用稀释缓冲液倍比稀释，100ul/孔加入，37℃孵育1h，同时设置阴性血清对照及不加血清的空白对照孔。
6. 1XPBST洗板3次，每次5min。
7.抗IgG二抗1∶000稀释，100ul/孔加入，37℃孵育1h。
8. 1XPBST洗板3次，每次5min。
9.加入新鲜配置的TMB底物显色液，100ul/孔，37℃孵育适当时间。
10.加入终止液2mol/L硫酸，50ul/孔。
11.酶标仪测定OD450nm吸光值。
ELISA检测抗体
一免14天抗体检测
1.样本：免疫组，溶剂对照组一免14天小鼠血清，每组6只小鼠血清混合
2.抗原蛋白：SARS-CoV-2(COVID-19)S protein(R683A，R685A)，His Tag(SPN-C52H4)
3.抗原蛋白包被：2ng/μL，100uL/孔
4.二抗：Goat anti-mouse IgG(H+L)，HRP conjugate1∶1000稀释
二免14天抗体检测
1.样本：免疫组，溶剂对照组二免14天小鼠血清，每组6只小鼠血清混合
2.抗原蛋白：SARS-CoV-2(COVID-19)S protein(R683A，R685A)，His Tag(SPN-C52H4)
3.抗原蛋白包被：2ng/μL，100uL/孔
4.二抗：Goat anti-mouse IgG(H+L)，HRP conjugate1∶1000稀释
5.结果见图5
请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献，已发布的专利，已公开的专利申请和同时待审的专利申请)的内容在此明确地全文引入作为参考。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均与本领域普通技术人员通常已知的含义一致。
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由具有相同，等同或相似目的的替代特征代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等同或相似特征的示例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施例也在所附权利要求的范围内。

Claims (47)

1.下式(II)的化合物：
Figure FDA0003395899650000011
其中R1选自R1’-X；
R1’为-(CH2)0-6-，X为羟基；或者X还可以为：
Figure FDA0003395899650000012
每个R*独立地选自C2-10烷基；
每个M各自独立地选自-C(O)O-或-C(O)NH-；
n、m各自独立地选自1-9的整数；
或其盐或其立体异构体。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中：
R1’为-(CH2)2-3-，X为羟基；或者X还可以为：
Figure FDA0003395899650000013
3.根据权利要求1所述的化合物，其中：
每个M各自独立地为-C(O)O-。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个R*独立地选自C6-10烷基。
5.根据权利要求4所述的化合物，其中，每个R*为C6烷基。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为羟基。
7.根据权利要求1所述的化合物，其中，R1选自R1’-X，R1’为-(CH2)1-6-，X为
Figure FDA0003395899650000021
8.根据权利要求1所述的化合物，其中，每个n为7，m为7。
9.下式(III)的化合物：
Figure FDA0003395899650000022
其中R1选自R1’-X；
R1’为-(CH2)0-6-，X为羟基；
每个M各自独立地为-C(O)O-；
每个R’各自选自C1-10烷基；
每个R*各自选自C1-10烷基；
n、m各自独立地选自1-9的整数；
或其盐或其立体异构体。
10.根据权利要求9所述的化合物，其中：
R1’为-(CH2)2-3-，X为羟基。
11.根据权利要求9所述的化合物，其中：每个R’各自选自独立地选自C2-8烷基。
12.下式(IV)的化合物：
Figure FDA0003395899650000023
其中R1选自R1’-X；
R1’为-(CH2)0-6-，X为羟基；
每个M各自独立地为-C(O)O-；
每个R*各自选自C1-10烷基；
n、m各自独立地选自1-9的整数；
或其盐或其立体异构体。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中：
R1’为-(CH2)2-3-，X为羟基。
14.根据权利要求12所述的化合物，其中：每个R*各自独立地选自C2-10烷基。
15.根据权利要求14所述的化合物，其中：每个R*各自独立地选自C6-10烷基。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中：每个R*为C6烷基。
17.下式(V)的化合物：
Figure FDA0003395899650000031
其中R1选自R1’-X；
R1’为-(CH2)0-6-，X为羟基；
每个M各自独立地选自-CH＝CH-或-C(O)O-；
每个R’各自选自C1-10烷基或C3-12烯基；
每个R*各自选自C1-10烷基；
n、m各自独立地选自1-9的整数；
或其盐或其立体异构体。
18.根据权利要求17所述的化合物，其中：
R1’为-(CH2)2-3-，X为羟基。
19.根据权利要求17所述的化合物，其中：每个R*各自独立地选自C2-10烷基。
20.根据权利要求19所述的化合物，其中：每个R*各自独立地选自C6-10烷基。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中：每个R*为C6烷基。
22.根据权利要求17所述的化合物，其中：每个R’各自选自C10烷基或C8烯基。
23.化合物或其盐或其立体异构体，该化合物选自：A13、A17-A26、A28-A32，
Figure FDA0003395899650000032
Figure FDA0003395899650000041
Figure FDA0003395899650000051
24.一种组合物，其特征在于，其包括前述权利要求1-23中任一项所述的化合物。
25.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，其还包括磷脂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其特征在于，所述磷脂选自1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)中的任意至少一种。
27.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，其还包括聚乙醇化脂质化合物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其特征在于，所述聚乙醇化脂质化合物选自PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油中的任意至少一种。
29.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，其还包括结构性脂质。
30.根据权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述结构性脂质选自胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中的任意至少一种。
31.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，还包括有效成分，所述有效成分选自DNA、RNA、蛋白质、药物活性分子中的任意至少一种。
32.根据权利要求24所述的组合物，其特征在于，其包括可离子化脂质化合物、聚乙二醇化脂质化合物、结构性脂质和磷脂，并且其中所述可离子化脂质化合物为20％-80％、聚乙二醇化脂质化合物为1％-10％、结构性脂质为10％-50％和磷脂为5-30％，按摩尔计。
33.根据权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述RNA选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA中的任意至少一种。
34.根据权利要求31所述的组合物，所述蛋白质选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
35.根据权利要求24-34中任一项所述的组合物，其为脂质纳米颗粒。
36.一种制备权利要求35所述的组合物的方法，其特征在于，包括步骤(1)：将所述的化合物任选地与聚乙醇化脂质化合物、结构性脂质和磷脂溶解混合。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，还包括步骤(2)：通过混合器与有效成分混合形成脂质纳米颗粒。
38.权利要求1-23中任一项的化合物在制备脂质纳米颗粒中的用途。
39.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，所述脂质纳米颗粒中性介质中呈中性不带电荷，在酸性介质中质子化后呈带正电荷。
40.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，所述脂质纳米颗粒如权利要求35所定义。
41.根据权利要求38所述的用途，其特征在于，将所述的化合物、聚乙二醇化脂质化合物、结构性脂质和磷脂溶解混合，通过混合器与有效成分混合形成脂质纳米颗粒。
42.药物组合物，其包括权利要求35所述的组合物和药学上可接受的载体。
43.权利要求35所述的组合物或权利要求42的药物组合物在制备药物中的用途。
44.根据权利要求43所述的用途，其特征在于，还包括有效成分，所述有效成分选自DNA、RNA、蛋白质、药物活性分子中的任意至少一种。
45.根据权利要求44所述的用途，其特征在于，所述RNA选自mRNA、siRNA、aiRNA、miRNA、dsRNA、aRNA、lncRNA中的任意至少一种。
46.根据权利要求44所述的用途，其特征在于，所述蛋白质选自抗体、酶、重组蛋白、多肽和短肽中的任意至少一种。
47.根据权利要求43-46中任一项的用途，其特征在于，所述药物通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射、微针贴片、口服、口鼻腔喷雾、涂抹的方式对人使用。
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