CN114306279A - 基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统及其制备方法和应用。本发明提供的脂质纳米颗粒由包括科罗索酸或其类似物和脂质材料制备而成，科罗索酸类似物包括熊果酸和齐墩果酸，脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性磷脂、PEG化磷脂以及含有或不含胆固醇组成，科罗索酸或其类似物与脂质体材料的摩尔比为1：9～1：1。与现有技术相比，本发明提供的基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒具有更强的细胞穿膜和组织渗透能力，本脂质纳米颗粒用于核酸分子的递送载体，包载至少一种核酸药物后，可被细胞高效摄取，并通过内体逃逸能力，达到显著提高核酸类药物的预防和治疗效果。

Description

基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于生物医药和纳米医学技术领域，尤其是涉及一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统及其制备方法和应用。

背景技术

核酸药物主要指具有遗传特性和药理活性的含核苷酸或脱氧核苷酸的化合物，主要包括小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、信使RNA(Messenger RNA,mRNA、质粒DNA等。RNA是存在于生物细胞、部分病毒和类病毒中的遗传信息。siRNA是人工合成的双链RNA，是RNA诱导沉默复合物的主要成员，激发与之互补的目标信使RNA的沉默，阻断mRNA的翻译和蛋白表达。mRNA是基因和蛋白质之间的一种瞬时中间体，其由DNA的一条链转录而来，是蛋白质生物合成的直接模板。质粒DNA是一种小型环状共价闭合的双链DNA分子，在质粒中插入目标DNA片段，并将其递送进细胞，可实现目标DNA在细胞质表达或入核与细胞基因组整合。核酸药物由于具有高度靶向特异性，在预防和治疗感染性疾病、癌症和遗传性疾病等领域发挥重要的作用。特别是，自20世纪80年代末以来，随着mRNA体外转录(IVT)技术的成熟和各类降低mRNA体内免疫原性、提高mRNA稳定性等相关研究的发展，mRNA成为了一种潜在的新型药物，其在病毒疫苗、蛋白质替代疗法、细胞重编程、基因组编辑等领域均显示出独特优势。

然而，核酸这类大分子存在稳定性差(易被酸、碱和酶降解)，体内半衰期短，很难穿过细胞膜以及胞内不稳定等问题。必须采取措施，首先将足够多的核酸递送到特定靶细胞或组织并避免被核酸酶降解，其次须保证核酸药物能被细胞内吞，入胞后通过有效的内体逃逸，以促进核酸药物释放到胞内。目前，核酸药物的靶向递送和内体逃逸是其所面临的两大挑战。对于前者而言，需要将核酸完整地、特异性地递送到合适的细胞内，以达到最高的治疗效果和最小的不良反应。例如，对于基因组编辑，需要将mRNA尽可能多地递送到需要编辑的细胞亚群，而避免对其他细胞产生不需要的编辑。而对于内体逃逸，由于被目标细胞摄取后，递送系统会首先存在于细胞的内体中并随后被降解或排出细胞外，因此要使核酸突破内体结构、成功释放到细胞质中成为了决定核酸能否在细胞中被成功表达的关键因素。

脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)是近年来研究较多、较成熟的一种核酸药物载体。一般来说，LNP是由中性脂质、一种阳离子脂质/可离子化脂质、胆固醇和一种PEG化脂质制备而成的具有纳米尺度的、有电子致密核心的球状或多面体颗粒，由于阳离子脂质和/或可离子化脂质的存在，LNP可以通过正负电荷的相互吸附将带负电的核酸包载在颗粒的核心部位。而中性脂质和胆固醇则起到维持和稳定LNP结构的作用。PEG化脂质定位于LNP的最外层，起到提高LNP稳定性、控制LNP粒径等作用。另外，阳离子脂质/可离子化脂质可在细胞内体中通过和带负电的内体膜相互作用，促进药物的内体逃逸。胆固醇和部分中性脂质也与LNP的内体逃逸能力相关。LNP纳米级的尺度可配合不同给药方式(例如皮下注射、肌内注射、静脉注射等)实现体内靶向递送。相对于其它递送载体，LNP具有生物相容性高、包封效果和体内外表达效果好，以及生产工艺成熟等优点。尽管如此，现有技术的LNP载体仍存在靶向效率和胞内递送效率低的问题。

发明内容

基于现有技术中脂质纳米颗粒载体所存在的靶向效率和胞内递送效率低的问题，本发明提供一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统及其制备方法和应用。

本发明提供的基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统能够实现核酸分子的有效包载，并同时提高核酸药物的靶组织蓄积、胞内递送效率和转染效率。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，为由科罗索酸或其类似物和脂质材料制备而成的脂质纳米颗粒，科罗索酸或其类似物与脂质体材料的摩尔比为1：9～1：1。所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒可作为核酸药物的递送载体，用于递送核酸药物。

在本发明的一个实施方式中，所述科罗索酸的类似物为熊果酸或齐墩果酸。

在本发明的一个实施方式中，所述科罗索酸或其类似物(如熊果酸和齐墩果酸)中，优选科罗索酸。

在本发明的一个实施方式中，所述脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质组成，所述可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(0.1～10)，优选为50：10：0.1～5。

所述可电离的阳离子脂质选自1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(DOTMA)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、双甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、N,N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(BHEM-Chol)、乙基磷脂酰胆碱(ePC)、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、(2S)-2,5-二(3-氨基丙基氨基)-N-[2-(双十八烷基氨基)乙酰基]戊酰胺(DOGS)、N1-(2-{(1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰胺基}乙基)-3,4-二(油酰氧基)-苯甲酰胺(MVL5)、N4-胆固醇-精胺(GL67)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、9-(4-(二甲氨基)丁酰氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、8-[(2-羟乙基)(8-壬氧基-8-氧代辛基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(Lipid5)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(SM-102)、[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、1,1'-[(2-{4-[2-({2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基}(2-羟基十二烷基)氨基)乙基]哌嗪-1-基}乙基)氮杂二烷基]双(十二烷-2-醇)(C12-200)、四(8-甲基壬基)3,3',3”,3”'-{[(甲基氮杂二烷基)双(丙烷-3,1二基)]双(氮杂三基)}四丙酸酯(306Oi10)、3,6-双{4-[双(2-羟基十二烷基)氨基]丁基}哌嗪-2,5-二酮(cKK-E12)、3,6-双(4-{双[(9Z,12Z)-2-羟基十八碳-9,12-二烯-1-基]氨基}丁基)哌嗪-2,5-二酮(OF-02)、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)(OF-C4-Deg-Lin)、N1,N3,N5-三[3-(双十二烷基氨基)丙基]苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)、9,9',9”,9”',9””,9””'-{[(苯并-1,3,5-三酰胺基)三(丙烷-3,1-二基)]三氮杂三基}六壬酸六(辛烷-3-基)酯(FTT5)中的一种或多种，优选4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(SM-102)或[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)中的一种或几种；

所述中性脂质选自DOPE、DOPC、DOPS和DMPC中的一种或多种，优选为DSPC和/或DOPE；

所述PEG化脂质选自1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DSG-PEG2000)或n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG2000)中的一种或几种，优选为DMG-PEG2000和/或ALC-0159。

在本发明的一个实施方式中，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒中，可电离的阳离子脂质、中性脂质、科罗索酸或其类似物、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(10～70)：(0.1～10)，优选为50：10：35～49.9：0.1～5。此种情况为脂质纳米颗粒中不含有胆固醇的情况。

在本发明的一个实施方式中，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒中，所述脂质材料中还可以包括胆固醇，此时所述脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇、PEG化脂质组成，此时，可电离的阳离子脂质、中性脂质、科罗索酸或其类似物、胆固醇、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(10～70)：(0～60)：(0.1～10)，优选为50：10：35～49.9：0～20：0.1～5。

即，本发明基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒可以不含或含有部分胆固醇。

本发明还提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒的用途，所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒在制备药物递送载体中的应用。本发明中所述药物递送载体优选为核酸药物递送载体，但不限于核酸药物递送载体。

本发明还提供一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统，包括基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，以及包载的核酸药物，所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒和核酸药物的氮/磷比为1：10～10：1，优选3：1～6：1。基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统简写为NC/xLNP，其中，NC代表核酸药物，x代表CA(科罗索酸，Corosolic Acid)、UA(熊果酸，Ursolic Acid)或OA(齐墩果酸，Oleanoic Acid)，LNP为脂质纳米颗粒。

本发明基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统为核-壳结构，由中性脂质、PEG化脂质、部分可电离的阳离子脂质和部分科罗索酸或其类似物形成外部的壳，

在壳的内部，所述核酸药物外侧被部分可电离的阳离子脂质及部分科罗索酸或其类似物所包裹，形成核，

在壳的内部，还存在部分游离的可电离的阳离子脂质及科罗索酸或其类似物。核-壳结构可以将NC保护在结构核心中，如图1所示的mRNA/xLNP。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸药物包括RNA药物、DNA药物、质粒中的任意一种，优选RNA药物，进一步优选siRNA和mRNA。

在本发明的一个实施方式中，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的平均粒径为50～150nm，优选为80～100nm。

本发明还提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的制备方法，选择以下方法中的任意一种或两种：

(1)快速混合法：将脂质材料、科罗索酸或其类似物溶于乙醇中，得到的乙醇溶液与溶有核酸药物的水性溶液快速混合，即得NC/xLNP悬液，用适当水性介质稀释NC/xLNP悬液，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(2)微流控合成法：使用微流控设备和配套芯片，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料与科罗索酸或其类似物的乙醇溶液以适宜参数和程序混合，收集得到的NC/xLNP溶液，用适当水性介质稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(3)T型接头合成法：使用T型接头，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料和科罗索酸或其类似物的乙醇溶液以适宜参数混合，形成NC/xLNP，用适当水性介质将NC/xLNP稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(4)冷冻干燥法：采用快速混合法、微流控合成法、T型接头合成法等常规LNP制备方法制得NC/xLNP后，配合蔗糖、海藻糖等适当的冻干保护剂，经冷冻干燥，制成NC/xLNP冻干粉末；临用前用适当水性无菌介质重悬脂质纳米颗粒冻干粉末，得粒径均匀的NC/xLNP悬液，NC/xLNP悬液中含有基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统。

在本发明的一个实施方式中，所述水性介质可选择纯水、磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、硫酸铵溶液、生理盐水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液等中的一种或几种。

基于本发明的方法，制备NC/xLNP的平均粒径为50～150nm，优选为80～100nm。

本发明还提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的用途，所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统在制备预防或治疗感染性疾病、癌症、糖尿病等疾病的药物中的应用。

本发明提供的基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒包载核酸药物的制备方法，能够方便制备，并同时实现稳定核酸的目的。

科罗索酸(Corosolic Acid，CA)，即2α-羟基熊果酸，是存在于大叶紫薇、枇杷、金莲花等植物中的五环三萜类化合物。现有技术研究发现，CA具有降血糖、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗心血管疾病等作用。

熊果酸(Ursolic Acid，UA)，即3-β-羟基-熊果-12-烯-28-羧酸，是主要从杜鹃花科常绿蔓生灌木熊果中提取的一种五环三萜类化合物，据报道具有镇静、抗炎、抗菌、降血糖、抗氧化等作用。

齐墩果酸(Oleanoic Acid，OA)，是主要从木犀科植物齐墩果、龙胆科植物獐牙菜属的青叶胆全草或女贞子的果实中分离提取的一种五环三萜类化合物，据报道具有护肝、降血糖、降血脂、镇静、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤等作用。

本申请研究发现了科罗索酸及其结构类似物(主要包括熊果酸和齐墩果酸)不同于已知功能的新的功能。本申请发现科罗索酸及其结构类似物(主要包括熊果酸和齐墩果酸)能起到稳定LNP结构的作用，通过完全或部分取代常规LNP中的胆固醇，均可制得稳定的脂质纳米颗粒xLNP，即CALNP、UALNP或OALNP，并且成功实现了核酸药物的包载。

与现有技术相比，本发明提供的基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统具有显著优势，具体表现在：

(1)基于科罗索酸或其类似物的xLNP载体系统具有独特的肿瘤靶向、细胞穿膜和组织渗透功能，作为核酸药物递送的载体，可显著提高核酸分子的靶组织分布和靶细胞的胞内递送效率，借助同样具有的内体逃逸能力，进而使得NC具有更高的转染效率；

(2)基于科罗索酸或其类似物的NC/xLNP系统，可同时发挥核酸转染和科罗索酸或其类似物的药理作用，从而实现对部分疾病的协同治疗作用。

本发明方法制备基于科罗索酸或其类似物脂质纳米颗粒包载的NC/xLNP，另外采用相同方法制备现有技术公开的含胆固醇的NC/LNP，体外包封率测定和稳定性实验结果表明，NC/xLNP和NC/LNP的粒径和包封率无显著区别，且均能在血清中保持稳定。体外细胞实验结果表明，mRNA/CALNP进入靶细胞的效力和转染效率显著高于mRNA/LNP，蛋白表达水平显著更高。

本发明所述基于科罗索酸或其类似物的NC/xLNP系统，制备简单，设备要求低，工艺可靠，具有高效、稳定的核酸药物胞内递送效率，并显著提高核酸药物的预防和治疗效果。

因此，本发明可以克服现有技术的不足，可以以更小的剂量进行给药，并且达到更高的蛋白表达水平，不仅可减少较高剂量给药造成的不良反应，也可减小患者的经济负担，预示xLNP作为核酸药物的新型递送载体，在感染性疾病、癌症、糖尿病等重大疾病防治领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为装载mRNA的mRNA/xLNP结构示意图。

图2为mRNA/xLNP和mRNA/LNP的粒径与mRNA包封率。

图3为mRNA/xLNP、mRNA/LNP的血清稳定性考察，72小时内，mRNA/xLNP、mRNA/LNP在血清中的粒径无明显变化，表明其血清稳定性良好。

图4为mRNA、mRNA/CALNP与mRNA/LNP的细胞转染水平，分别考察MCF-7和SK-OV-2细胞转染，表明，mRNA/CALNP对两种细胞的转染水平最高。

具体实施方式

本发明提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，为由科罗索酸或其类似物和脂质材料制备而成的脂质纳米颗粒，科罗索酸或其类似物与脂质体材料的摩尔比为1：9～1：1。所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒可作为核酸药物的递送载体，用于递送核酸药物。

所述科罗索酸的类似物为熊果酸或齐墩果酸。

所述脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质组成，所述可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(0.1～10)，优选为50：10：0.1～5。

所述可电离的阳离子脂质选自1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)(DOTMA)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)、双甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-二甲基三氟乙酸铵(DOSPA)、N,N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵(BHEM-Chol)、乙基磷脂酰胆碱(ePC)、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、(2S)-2,5-二(3-氨基丙基氨基)-N-[2-(双十八烷基氨基)乙酰基]戊酰胺(DOGS)、N1-(2-{(1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰胺基}乙基)-3,4-二(油酰氧基)-苯甲酰胺(MVL5)、N4-胆固醇-精胺(GL67)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、9-(4-(二甲氨基)丁酰氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、8-[(2-羟乙基)(8-壬氧基-8-氧代辛基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(Lipid5)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(SM-102)、[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、1,1'-[(2-{4-[2-({2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基}(2-羟基十二烷基)氨基)乙基]哌嗪-1-基}乙基)氮杂二烷基]双(十二烷-2-醇)(C12-200)、四(8-甲基壬基)3,3',3”,3”'-{[(甲基氮杂二烷基)双(丙烷-3,1二基)]双(氮杂三基)}四丙酸酯(306Oi10)、3,6-双{4-[双(2-羟基十二烷基)氨基]丁基}哌嗪-2,5-二酮(cKK-E12)、3,6-双(4-{双[(9Z,12Z)-2-羟基十八碳-9,12-二烯-1-基]氨基}丁基)哌嗪-2,5-二酮(OF-02)、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)(OF-C4-Deg-Lin)、N1,N3,N5-三[3-(双十二烷基氨基)丙基]苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)、9,9',9”,9”',9””,9””'-{[(苯并-1,3,5-三酰胺基)三(丙烷-3,1-二基)]三氮杂三基}六壬酸六(辛烷-3-基)酯(FTT5)中的一种或多种，优选4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯(SM-102)或[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)中的一种或几种；

所述中性脂质选自DOPE、DOPC、DOPS和DMPC中的一种或多种，优选为DSPC和/或DOPE；

所述PEG化脂质选自1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DSG-PEG2000)或n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺钠盐(DSPE-mPEG2000)中的一种或几种，优选为DMG-PEG2000和/或ALC-0159。

在本发明的一个实施方式中，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒中，所述脂质材料中还可以包括胆固醇，此时所述脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性脂质、胆固醇、PEG化脂质组成，此时，可电离的阳离子脂质、中性脂质、科罗索酸或其类似物、胆固醇、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(10～70)：(0～60)：(0.1～10)，优选为50：10：35～49.9：0～20：0.1～5。即，本发明基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒可以不含或含有部分胆固醇。

本发明还提供一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统，包括基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，以及包载的核酸药物，所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒和核酸药物的氮/磷比为1：10～10：1，优选3：1～6：1。基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统简写为NC/xLNP，其中，NC代表核酸药物，x代表CA(科罗索酸，CorosolicAcid)、UA(熊果酸，UrsolicAcid)或OA(齐墩果酸，OleanoicAcid)，LNP为脂质纳米颗粒。

本发明基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统为核-壳结构，由中性脂质、PEG化脂质、部分可电离的阳离子脂质和部分科罗索酸或其类似物形成外部的壳，在壳的内部，所述核酸药物外侧被部分可电离的阳离子脂质及部分科罗索酸或其类似物所包裹，形成核，在壳的内部，还存在部分游离的可电离的阳离子脂质及科罗索酸或其类似物。

在本发明的一个实施方式中，所述核酸药物包括RNA药物、DNA药物、质粒中的任意一种，优选RNA药物，进一步优选siRNA和mRNA。

在本发明的一个实施方式中，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的平均粒径为50～150nm，优选为80～100nm。

本发明还提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的制备方法，选择以下方法中的任意一种或两种：

(1)快速混合法：将脂质材料、科罗索酸或其类似物溶于乙醇中，得到的乙醇溶液与溶有核酸药物的水性溶液快速混合，即得NC/xLNP悬液，用适当水性介质稀释NC/xLNP悬液，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(2)微流控合成法：使用微流控设备和配套芯片，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料与科罗索酸或其类似物的乙醇溶液以适宜参数和程序混合，收集得到的NC/xLNP溶液，用适当水性介质稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(3)T型接头合成法：使用T型接头，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料和科罗索酸或其类似物的乙醇溶液以适宜参数混合，形成NC/xLNP，用适当水性介质将NC/xLNP稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析、超滤等手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(4)冷冻干燥法：采用快速混合法、微流控合成法、T型接头合成法等常规LNP制备方法制得NC/xLNP后，配合蔗糖、海藻糖等适当的冻干保护剂，经冷冻干燥，制成NC/xLNP冻干粉末；临用前用适当水性无菌介质重悬脂质纳米颗粒冻干粉末，得粒径均匀的NC/xLNP悬液，NC/xLNP悬液中含有基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统。

在本发明的一个实施方式中，所述水性介质可选择纯水、磷酸盐缓冲液、枸橼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、硫酸铵溶液、生理盐水、葡萄糖溶液或蔗糖溶液等中的一种或几种。

本发明还提供基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统在制备预防或治疗感染性疾病、癌症、糖尿病等疾病的药物中的应用。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

微流控合成法制备mRNA/CALNP和mRNA/LNP

以无水乙醇为溶剂，取适量DLin-MC3-DMA、CA或胆固醇、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	DLin-MC3-DMA	CA或胆固醇	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	177	100	21	43	659

得1mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取160μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积3mL，置冰上备用。

采用NanoAssemblr微流控合成仪器和其配套微流控芯片制备LNP，分别在左侧和右侧注射器中加入mRNA水溶液与载体材料乙醇溶液。总液体流速设置为9mL/min，左右侧流速比为3:1，初始丢弃体积为0.1mL，结束丢弃体积为0.05mL。收集制得的mRNA/CALNP，用柠檬酸缓冲液稀释至乙醇比例不超过0.5％，并超滤使mRNA/CALNP达到适当的浓度。

参考图2，制得的mRNA/CALNP平均粒径约100nm，包封率为96％。

实施例2

微流控合成法制备mRNA/UALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量SM-102、UA、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	SM-102	UA	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	195	100	21	43	640

得1mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取160μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积3mL，置冰上备用。

mRNA/UALNP的制备与纯化同实施例1。参考图2，制得的mRNA/UALNP粒径与包封率同实施例1。

实施例3

微流控合成法制备mRNA/OALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量ALC-0315、OA、ALC-0159和DOPE分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	ALC-0315	OA	ALC-0159	DOPE	无水乙醇
						体积/μL	211	100	20	41	628

得1mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取160μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积3mL，置冰上备用。

mRNA/OALNP的制备与纯化同实施例1。参考图2，制得的mRNA/OALNP粒径与包封率同实施例1。

实施例4

微流控合成法制备mRNA/UALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量DLin-MC3-DMA、UA、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	DLin-MC3-DMA	UA	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	177	97	21	43	663

得1mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取160μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积3mL，置冰上备用。

mRNA/UALNP的制备与纯化同实施例1。参考图2，制得的mRNA/UALNP平均粒径约104nm，包封率为62.7％。

实施例5

微流控合成法制备mRNA/OALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量DLin-MC3-DMA、OA、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	DLin-MC3-DMA	OA	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	177	97	21	43	663

得1mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取160μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积3mL，置冰上备用。

mRNA/OALNP的制备与纯化同实施例1。制得的mRNA/OALNP平均粒径约104nm，包封率为55％。

实施例6

T型接头合成法制备siRNA/CALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量DLin-MC3-DMA、CA、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	DLin-MC3-DMA	CA	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	708	400	84	172	2636

得4mL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取640μg的siRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积12mL，置冰上备用。

使用自搭建T型接头混合仪器，总液体流速设置为40mL/min，siRNA水溶液与载体材料乙醇溶液的流速比为3:1，初始丢弃体积为1.52mL，结束丢弃体积为0.513mL。收集制得的siRNA/CALNP，用柠檬酸缓冲液稀释至乙醇比例不超过0.5％，使用切向流过滤仪器除去乙醇和缓冲盐，并使siRNA/CALNP达到适当的浓度。制得的siRNA/CALNP粒径与包封率同实施例1。

实施例7

快速混合法制备mRNA/CALNP

以无水乙醇为溶剂，取适量DLin-MC3-DMA、CA、DMG-PEG2000和DSPC分别准确配置浓度为10mg/mL母液，置于37℃水浴锅中充分溶解。按下表所示体积混合上述母液和无水乙醇，配置载体材料的乙醇溶液:

组分	DLin-MC3-DMA	CA	DMG-PEG2000	DSPC	无水乙醇
						体积/μL	8.9	5	1	2.2	33

得50μL载体材料混合乙醇溶液，置于37℃水浴锅中保温备用。

取8μg的fLucmRNA，用pH＝6.0的柠檬酸缓冲液稀释至总体积150μL，置冰上备用。

用移液枪吸取全部载体材料混合液，将其与mRNA水溶液快速混合均匀。用柠檬酸缓冲液稀释至乙醇比例不超过0.5％，使用切向流过滤仪器除去乙醇和缓冲盐，并使mRNA/CALNP达到适当的浓度。制得的mRNA/CALNP粒径与包封率同实施例1。

实施例8

冻干法制备mRNA/CALNP

按实施例1方法使用微流控设备制备mRNA/CALNP，并在含甘氨酸的5％海藻糖水溶液中对mRNA/CALNP进行透析。通过超滤将mRNA/CALNP调整到适宜浓度后，置于-80℃冰箱冷冻10小时，冷冻干燥机干燥48小时，得到白色mRNA/CALNP粉末。将mRNA/CALNP粉末用生理盐水重悬后，得到mRNA/CALNP悬液。制得的mRNA/CALNP粒径与包封率同实施例1。

实施例9

粒径与包封率考察

制备得到mRNA/xLNP悬液后，在MalvernZetasizerNano上使用DLS测量纳米颗粒的流体动力学尺寸。通过使用RediPlate^TM96RiboGreen^TMRNAQuantitationKit测定mRNA包封率。方法如下：将mRNA/CALNP的浓度调整到2～4ng/μL，并以1:1的体积比分别与TE缓冲液(测量未包封mRNA浓度)和含有2％TritonX-100的TE缓冲液(测量总mRNA浓度)混合，得到待测mRNA样品。按说明书将180μLTE缓冲液加入预制96孔板，并分别将20μL的待测mRNA样品加入不同测量孔，等待10分钟后，使用TecanInfiniteM200Pro多功能酶标仪测量荧光信号。包封率的计算公式为

实施例10

血清稳定性考察

取mRNA/LNP、mRNA/CALNP、mRNA/UALNP与mRNA/OALNP，置于含10％胎牛血清与10％青霉素-链霉素的PBS溶液中(pH＝7.4)，37℃恒温震荡孵育。于固定时间点测量粒径，考察其血清稳定性。结果如附图3所示，96小时内，mRNA/LNP、mRNA/CALNP、mRNA/UALNP与mRNA/OALNP在血清中的粒径均无明显变化，表明其血清稳定性良好。

实施例11

体外转染效率考察

取处于对数生长期的MCF-7与SK-OV-3细胞，以10000个/孔接种于白色不透明96孔板，待细胞生长至约80％汇合度时，分别用mRNA、mRNA/LNP和mRNA/CALNP以每孔50ngmRNA的剂量进行转染。孵育24小时后，除去培养基，用PBS清洗两次后，使用ONE-Glo^TM+ToxAssay测量细胞活力和荧光素酶表达水平。转染效率被表示为荧光强度与细胞活力的比值，并以mRNA/LNP组作为对照计算相对转染效率，结果如图4所示，图4表明，mRNA/CALNP对两种细胞的转染水平最高。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，其特征在于，为由科罗索酸或其类似物和脂质材料制备而成的脂质纳米颗粒，所述科罗索酸的类似物为熊果酸或齐墩果酸，科罗索酸或其类似物与脂质体材料的摩尔比为1：9～1：1。

2.根据权利要求1所述的一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述脂质材料由可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质组成，所述可电离的阳离子脂质、中性脂质、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(0.1～10)，优选为50：10：0.1～5。

3.根据权利要求2所述的一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，其特征在于，所述可电离的阳离子脂质选自1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(氯盐)、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、双甲基双十八烷基溴化铵、N-[1-(2,3-二油酰基)丙基]-N-(精氨酸基酰胺)乙基-N,N-二甲基三氟乙酸铵、N,N-二羟乙基-N-甲基-N-2-(胆固醇氧羰基氨基)乙基溴化铵、乙基磷脂酰胆碱、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]胆固醇、(2S)-2,5-二(3-氨基丙基氨基)-N-[2-(双十八烷基氨基)乙酰基]戊酰胺、N1-(2-{(1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基]丁基甲酰胺基}乙基)-3,4-二(油酰氧基)-苯甲酰胺、N4-胆固醇-精胺、2,2-二亚油基-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、9-(4-(二甲氨基)丁酰氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯、8-[(2-羟乙基)(8-壬氧基-8-氧代辛基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯、[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)、1,1'-[(2-{4-[2-({2-[双(2-羟基十二烷基)氨基]乙基}(2-羟基十二烷基)氨基)乙基]哌嗪-1-基}乙基)氮杂二烷基]双(十二烷-2-醇)、四(8-甲基壬基)3,3',3”,3”'-{[(甲基氮杂二烷基)双(丙烷-3,1二基)]双(氮杂三基)}四丙酸酯、3,6-双{4-[双(2-羟基十二烷基)氨基]丁基}哌嗪-2,5-二酮、3,6-双(4-{双[(9Z,12Z)-2-羟基十八碳-9,12-二烯-1-基]氨基}丁基)哌嗪-2,5-二酮、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(乙烷-2,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)、{[(3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基)]双(氮杂三基)}四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9'Z,9”Z,9”'Z,12Z,12'Z,12”Z,12”'Z)-四(十八-9,12-二烯酸酯)、N1,N3,N5-三[3-(双十二烷基氨基)丙基]苯-1,3,5-三甲酰胺(TT3)、9,9',9”,9”',9””,9””'-{[(苯并-1,3,5-三酰胺基)三(丙烷-3,1-二基)]三氮杂三基}六壬酸六(辛烷-3-基)酯(FTT5)中的一种或多种，优选4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯、8-[(2-羟乙基)(6-氧代-6-癸氧基己基)氨基]辛酸(十七烷-9-基)酯或[(4-羟基丁基)氮杂二基]双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)中的一种或几种；

所述中性脂质选自DOPE、DOPC、DOPS和DMPC中的一种或多种，优选为DSPC和/或DOPE；

所述PEG化脂质选自1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000、2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺、1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DSG-PEG2000)或n-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺钠盐中的一种或几种，优选为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000和/或2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N二十四烷基乙酰胺。

4.根据权利要求2所述的一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，其特征在于，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒中，所述脂质材料中还允许包括胆固醇，可电离的阳离子脂质、中性脂质、科罗索酸或其类似物、胆固醇、PEG化脂质的摩尔比为(10～70)：(2～30)：(10～70)：(0～60)：(0.1～10)，优选为50：10：35～49.9：0～20：0.1～5；

当胆固醇摩尔量为0表示所述脂质材料中不包括胆固醇，当胆固醇摩尔量不为0表示所述脂质材料中包括胆固醇。

5.权利要求1-4中任一项所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒在制备药物递送载体中的应用。

6.一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统，其特征在于，包括如权利要求2-4中任一项所述的基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒，以及包载的核酸药物，所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒和核酸药物的氮/磷比为1：10～10：1，优选3：1～6：1。

7.根据权利要求6所述的一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统，其特征在于，所述核酸药物包括RNA药物、DNA药物、质粒中的任意一种，优选RNA药物，进一步优选siRNA和mRNA。

8.根据权利要求6所述的一种基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统，其特征在于，基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的平均粒径为50～150nm，优选为80～100nm。

9.一种如权利要求6所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统的制备方法，其特征在于，选择以下方法中的任意一种或两种：

(1)快速混合法：将脂质材料、科罗索酸或其类似物溶于乙醇中，得到的乙醇溶液与溶有核酸药物的水性溶液快速混合，即得NC/xLNP悬液，用水性介质稀释NC/xLNP悬液，并通过切向流过滤、透析或超滤手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(2)微流控合成法：使用微流控设备和配套芯片，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料与科罗索酸或其类似物的乙醇溶液混合，收集得到的NC/xLNP溶液，用水性介质稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析或超滤手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(3)T型接头合成法：使用T型接头，将核酸药物水性溶液与溶有脂质材料和科罗索酸或其类似物的乙醇溶液混合，形成NC/xLNP，用水性介质将NC/xLNP稀释，使乙醇浓度小于0.5％，并通过切向流过滤、透析或超滤手段对NC/xLNP进行纯化和浓缩，得到基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统；

(4)冷冻干燥法：采用快速混合法、微流控合成法、T型接头合成法等常规LNP制备方法制得NC/xLNP后，配合冻干保护剂，经冷冻干燥，制成NC/xLNP冻干粉末；临用前用水性无菌介质重悬脂质纳米颗粒冻干粉末，得粒径均匀的NC/xLNP悬液，NC/xLNP悬液中含有基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统。

10.一种如权利要求6所述基于科罗索酸或其类似物的脂质纳米颗粒系统在制备预防或治疗感染性疾病、癌症、糖尿病等疾病的药物中的应用。

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