CN115784920B

CN115784920B - 一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用

Info

Publication number: CN115784920B
Application number: CN202310086372.XA
Authority: CN
Inventors: 章雪晴; 滕以龙; 陈起静
Original assignee: Rongcan Biomedical Technology Shanghai Co ltd
Current assignee: Rongcan Biomedical Technology Shanghai Co ltd
Priority date: 2023-02-09
Filing date: 2023-02-09
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2043-02-09
Also published as: CN115784920A

Abstract

本发明公开了一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用，属于生物医药领域，可电离脂质化合物为如下结构的化合物：

，其中，各基团的定义如说明书中所述。由本发明的化合物制备得到的脂质纳米载体，在生理环境下（pH=7.4）具有较好的细胞相容性，且在细胞的内涵体酸性环境中具有较佳的内涵体逃逸能力，在提高转染效果上具有意想不到的进步，具有优秀的安全性和转染效果，适合生物医药产业化。

Description

一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用。

背景技术

基因治疗（gene therapy）是通过将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷、异常基因引起的疾病，达到治疗目的的一种治疗方法。核酸疫苗 (nucleic acid vaccine),也称基因疫苗 (geneticvaccine)，是指将含编码免疫原蛋白或多肽的核酸序列（如DNA、mRNA等）导入宿主体内，通过宿主细胞表达免疫原蛋白或多肽，诱导宿主细胞产生对该免疫原的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。其中，确保外源基因的顺利导入是基因治疗过程和基因疫苗免疫极为重要的一环。在众多基因导入的方法中，开发合适的脂质纳米粒（即LNP，Lipid Nanoparticle）包裹核酸，使其靶向至目标细胞，并将特定基因的核酸递送至细胞内的方法逐渐为科学家所使用。

核酸药物与普通化学药物的一个明显区别是核酸带有数量庞大的磷酸根，因而呈负电，且分子量大。为了使其能够被LNP更好地包裹，人们开发了可电离脂质等多种脂质化合物。

“可电离脂质化合物”指在酸性pH值下带正电荷，在生理pH值下呈中性的脂质分子。可电离脂质的理化性质及浓度等参数影响LNP在不同pH条件下的表面电荷。这种电荷状态可以影响其在血液中的免疫识别、血液清除和组织分布，以及其在细胞内的内涵体逃逸的能力，对于核酸的细胞内递送是至关重要的。

“脂质纳米粒（LNP）”是指使用可电离脂质化合物等将需要递送的核酸等药物封装或缔合后形成的纳米结构，具有双层或多层膜结构。纳米粒中分布有可电离脂质化合物、其它脂质辅料及包裹在纳米粒中的核酸。LNP和其组合物可以用于各种目的，包括在体外和体内将封装的或缔合的(例如，复合的)诸如核酸等治疗剂递送至细胞，从而诱导目标蛋白质的表达或者抑制靶基因的表达。

LNP的开发克服了核酸类药物在临床应用中面临的诸多难题，比如：第一，核酸分子易被生物体内或自然界中存在的核酸酶降解；第二，核酸分子进入细胞、与目标细胞器相互作用、调节目标基因表达或目标蛋白表达的能力有限；第三，胞内递送效率低（如无法从内涵体逃逸）。

当LNP通过不同给药途径进入生物体的体液后，LNP在可电离脂质化合物的影响下具有pH敏感性。体液的pH为7.4，此时LNP最好趋向电中性，需要在生物系统中的稳定性最好，避免免疫清除；待携载核酸（如mRNA）的LNP通过胞吞进入细胞后，其陷入酸性囊泡（内涵体），内涵体内的酸性介质使得pH环境变为酸性，pH值约为5.5，LNP的核心组分可电离脂质化合物在酸性环境下质子化，破坏内涵体膜，从而使mRNA逃逸出内涵体。市场需要开发一种在中性环境中安全稳定，在酸性环境（pH=3-5.5）中则适当促进破膜作用，具有较佳核酸内涵体逃逸能力的用于制备LNP的可电离脂质化合物，本发明解决这样的问题。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种转染效率高的可电离脂质化合物及其应用，通过本发明的全新结构的可电离脂质化合物制备得到的mRNA-LNP（包载mRNA的脂质纳米粒）的核酸内涵体逃逸能力好、转染效率高、稳定性高。

为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：

一种转染效率高的可电离脂质化合物，其特征在于，所述的化合物为如下结构：

式I，

其中，n1和n2各自独立地为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；

G₁、G₂各自独立的为C₁-C₁₀亚烷基；

R₁、R₂、R₃、R₄各自独立地为C₁-C₂₀烷烃基、C₂-C₂₀烯烃基或H；且当R₁或R₂中任一为H时，另一个为C₂-C₂₀烯烃基；当R₃或R₄中任一为H时，另一个为C₂-C₂₀烯烃基；

G₃为C₁-C₁₀亚烷基，或为，其中a和b各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9，且a+b为2-10的整数。

本发明的可电离脂质化合物以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-（C=O）O-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团。这样的结构在中性环境中稳定，在酸性环境中能够促进核酸的内涵体逃逸；只要是基于这样结构做的改进均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物，作为一种优选实施例，所述的化合物具有选自下组的结构：

、、、、、、、、、、、、、、、；

优选为：

、、、、、。

在一种优选的实施方式中，所述的化合物具有选自下组的结构：

、、、。

在另一种优选的实施方式中，所述的化合物具有选自下组的结构：

、。

本发明的实施方式包括但并不限于上述实施方式，例如在某些实施例中，式I中，或各自独立地为选自下组的结构：、、、、、、、、中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，只要是采用以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-（C=O）O-或-O（C=O）-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。

在另一种实施例中，式I中，或各自独立地为选自下组的结构：、、、、中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，双键的位置和数量也不受限制，只要是采用以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-（C=O）O-或-O（C=O）-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。

在另一种实施例中，式I中，或各自独立地为选自下组的结构：：、、、中的任意一个；需要说明的是疏水基团的结构不受限制，烷烃基上取代基的数量和位置也不受限制，只要是采用以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-（C=O）O-或-O（C=O）-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团的化合物均在本发明的保护范围内。

本发明还提供了一种前述的转染效率高的可电离脂质化合物、或其立体异构体、其互变异构体或其在药学上可接受的盐的应用，其应用于制备包含可电离脂质化合物、其立体异构体、其互变异构体或其在药学上可接受的盐的组合物。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，所述的组合物包括：载体、所载的药物试剂、药物辅助剂，或其组合。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，载体包括：一种或多种可电离脂质化合物、助脂质、结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物中的一种或几种的组合；需要说明的是：载体组合物的组分不受限制，可以是现有已知的物质组成的组合物也可以是未知的物质组成的组合物，只要是采用了本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，作为一种实施例，可电离脂质化合物与助脂质的摩尔比为0.5:1-15:1。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，作为一种实施例，可电离脂质化合物与结构脂质的摩尔比为0.5:1-5:1。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，作为一种实施例，可电离脂质化合物与聚合物缀合脂质的摩尔比为10：1-250：1。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，作为一种实施例，可电离脂质化合物与两亲性嵌段共聚物的摩尔比为1：1-200：1。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，作为一种实施例，载体为脂质纳米粒，脂质纳米粒的平均尺寸为30-200nm，脂质纳米粒的多分散指数≤0.3。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，所载的药物试剂包括：核酸分子、小分子化合物、多肽、蛋白质，或其组合；所载的药物试剂的选择和组合配方不受限制，只要是采用了本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。

前述的一种转染效率高的可电离脂质化合物的应用，药物辅助剂包括：稀释剂、稳定剂、防腐剂或冻干保护剂中的一种或多种；药物辅助剂的选择和组合配方不受限制，只要是采用了本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，且均受本发明的启示。

本发明的有益之处在于：

本发明的可电离脂质化合物以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-O（C=O）-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团，这样的结构在中性环境中对细胞膜的破坏作用低，显示出更好的安全性，同时在进入细胞后，在内涵体酸性环境中破坏内涵体膜的作用较高，相比市场已在使用的LNP（辉瑞样品）内涵体逃逸能力更强、逃逸的速率更快，从而产生更好的转染效率，从转染LuciferasemRNA后的荧光结果看具有显著的差异。

本发明结构的可电离脂质转染效率高，安全性好，生物相容性高，合成步骤简单，适合生物医药产业化。

附图说明

图1是本发明实验二中化合物H1-H16和h1-1、h1-2、h2-1、h2-2组成LNP转染Luciferase mRNA后的荧光示意图；

图2是本发明内涵体逃逸能力实验中样品在中性pH环境中的实验结果示意图；

图3是本发明内涵体逃逸能力实验中样品在酸性pH环境中的实验结果示意图；

图4是本发明内涵体逃逸速率实验中样品在酸性pH环境中的实验结果示意图；

图5是本发明采用样品H-3的化合物制备得到脂质纳米粒的电镜图；

图6是本发明可电离脂质化合物制备得到的LNP和市场上的LNP的免疫效果对比实验结果示意图。

术语、英文缩写解释说明：

核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称，是由多个核苷酸单体组成的生物大分子；核酸由核苷酸组成，核苷酸单体由五碳糖、磷酸基、含氮碱基、或任何修饰基团组成。如果五碳糖是核糖，则形成的聚合物是RNA；如果五碳糖是脱氧核糖，则形成的聚合物是DNA。

核酸分子包括单链DNA、双链DNA、短异构体、mRNA、tRNA、rRNA、长链非编码RNA（lncRNA）、微小非编码RNA（miRNA和siRNA）、端粒酶RNA(Telomerase RNA Component）、小分子RNA （snRNA和scRNA）、环状RNA（circRNA）、合成miRNA（miRNA mimics 、miRNA agomir、miRNA antagomir）、反义DNA、反义RNA、核酶(ribozyme)、不对称干扰RNA(aiRNA)、Dicer-substrate RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)、gRNA、sgRNA、crRNA或tracrRNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、吗啉反义寡核苷酸、吗啉代寡核苷酸或生物定制寡核苷酸等。这里的举例也并非穷举，只要是由核苷酸单体聚合成的都可以应用于本发明。

药物可用的盐是指酸加成盐或碱加成盐。

其中酸加成盐的酸包括但不限于：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、酸式磷酸盐、乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸，柠檬酸、环酰胺酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙磺酸、甲酸、富马酸、半乳糖酸、龙胆酸、葡庚酸、葡糖酸、葡聚糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5二甲酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、棕榈酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、季铵酸以及十一碳烯酸。

其中碱加成盐举例包括但不限于：钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐，锌盐、铜盐、锰盐、以及铝盐；有机碱包括但不限于氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、脱醇、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、肼苯胺、胆碱、甜菜碱、苯那敏(benethamine)、苄星青霉素(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、以及聚胺树脂；优选地，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。

助脂质包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂（SM）、甾醇及其衍生物、神经酰胺、带电脂质中的一种或几种的组合；磷脂酰胆碱作为一种优选包括：DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC；磷脂酰乙醇胺作为一种优选为DOPE；甾醇作为一种优选为胆固醇；可电离脂质化合物是指：脂质化合物具有这样的特性，在生理pH值下呈中性；其在酸性pH值下进行质子化，从而带正电荷，有助于将核酸包封到LNP中。细胞摄取后，LNP在酸性内涵体中质子化，进行内涵体破膜、内体逃逸一系列胞内递送行为，从而释放所携载的核酸或药物进入细胞质内。

带电脂质是指一类脂质化合物以带正电荷或带负电荷的形式存在；其所带电荷不依赖于生理学范围内的pH，例如pH= 3～9，不受pH的影响。带电脂质可以是合成的或天然来源的。带电脂质的实例包括但不限于DOTAP、DOTMA、18PA。

mRNA，信使RNA，中文译名：信使核糖核酸，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。mRNA可以是单顺反子mRNA也可以是多顺反子mRNA。mRNA也可以包含一种或多种功能性核苷酸类似物，功能性核苷酸类似物举例包括：假尿嘧啶核苷、1-甲基-假尿嘧啶核苷或5-甲基胞嘧啶等。这里的举例也并非穷举，任何修饰的mRNA或其衍生物都可以应用于本发明。

小分子化合物可以是用于治疗或预防的试剂中的有效成分，例如：抗肿瘤药、抗感染药、局部麻醉药、抗抑郁药、抗惊厥药、抗生素/抗菌剂、抗真菌药、抗寄生虫药、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递质拮抗剂、抗青光眼剂、麻醉剂、或成像剂等，这里并非穷举。

多肽是α－氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物，是蛋白质水解的中间产物。

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质；蛋白质可以是干扰素、蛋白质激素、细胞因子、趋化因子或者酶类等。

稀释剂是本领域技术人员可知的任意可以药用的水溶性辅料，包括：氨基酸、单糖、二糖、三糖、四糖、五糖、其它寡聚糖、甘露醇、右旋糖苷、氯化钠、山梨醇、聚乙二醇、磷酸盐，或其衍生物等。

稳定剂可以是本领域技术人员可知的任意可以药用的辅料：吐温-80、十二烷基硫酸钠、油酸钠、甘露醇、甘露糖或海藻酸钠等。

防腐剂可以是本领域技术人员可知的任意可以药用的防腐剂，比如：硫柳汞等。

冻干保护剂可以是领域技术人员可知的任意可以药用的冻干保护剂，比如：葡萄糖、甘露醇、蔗糖、乳糖，海藻糖，麦芽糖等。

DSPC：英文名称：Distearoyl Phosphatidylcholine，1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine ；中文名称：二硬脂酰基卵磷脂，CAS号: 816-94-4。

DPPC：中文名称：二棕榈酸磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-DIPALMITOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOCHOLINE，CAS号: 63-89-8。

DMPC：中文名称：二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；英文名称：1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号: 18194-24-6。

DOPC：中文名称：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:4235-95-4。

POPC：中文名称：2-油酰-1-棕榈锡甘油-3-磷酸胆碱；英文名称：2-Oleoyl-1-palmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，CAS号:26853-31-6。

DOPE：中文名称：1,2-二油酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺；英文名称：1,2-DIOLEOYL-SN-GLYCERO-3-PHOSPHOETHANOLAMINE，CAS号：4004-05-1。

DOTAP：中文名称：(1,2-二油氧基丙基)三甲基氯化铵；英文名称：1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (chloride salt)，CAS号：132172-61-3；化学结构式如下所示：

。

DOTMA：中文名称：N,N,N-三甲基-2,3-双(十八碳-9-烯-1-基氧基)丙-1-铵氯化物，CAS号: 1325214-86-5，化学结构式如下所示：

。

18PA：CAS号：108392-02-5，化学结构式如下所示：

。

SM：中文名称：鞘磷脂（SM）；英文名称：sphingomyelin。

PEG：中文名称：聚乙二醇；英文名称：Polyethylene glycol。

两亲性嵌段共聚物指：PEG与下列一种或多种聚合物组分的嵌段共聚物，聚合物组分包括：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚原酸酯、聚酸酐、聚（β-氨基酯）（PBAE）中的一种或多种。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。

通过以下实施例1的制备方法制备可电离脂质化合物。

实施例1：

化合物a的合成：将6-溴己酸（10.00g，51.27mmol），二环己基碳二亚胺（DCC，12.69g，61.52mmol），4-二甲氨基吡啶（1.25g，10.25mmol）溶于200mL二氯甲烷中（DCM），加入2-己基癸醇（12.43g，51.27mmol），室温搅拌反应12 h。TLC监测反应完全后，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂。加入300mL乙酸乙酯，等体积饱和碳酸氢钠溶液洗2次，等体积饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸钠干燥30min，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂，柱分离纯化（硅胶柱，洗脱液为PE：EA=100：1（体积比）），得19.78g无色液体，收率92%。

化合物b的合成：将化合物a（10.00g，23.84mmol），2-(2-氨乙氧基)乙醇（5.01g，47.68mmol），N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，3.70g，28.61mmol）溶于100mL乙醇（EtOH）中，60℃加热搅拌反应12 h。TLC监测反应完全后，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂。加入200mL乙酸乙酯，等体积饱和氯化钠溶液洗3次，无水硫酸钠干燥30min，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂，柱分离纯化（硅胶柱，洗脱液为DCM：MeOH=20：1（体积比）），得7.51g浅黄色油状液体，收率71%。

化合物c的合成：将6-溴正己醇（10g，55.23mmol），4-二甲氨基吡啶（6.75g，55.23mmol）溶于200mL二氯甲烷中（DCM），氮气保护，冰浴搅拌10min后，分批加入对硝基氯甲酸苯酯（13.36g，66.27mmol），逐渐恢复至室温，室温搅拌3 h后，冰浴条件下加入2-己基癸醇（14.73g，60.75mmol），室温搅拌反应12 h。TLC监测反应完全后，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂。加入400mL乙酸乙酯，等体积饱和碳酸氢钠溶液洗2次，等体积饱和氯化钠溶液洗1次，无水硫酸钠干燥30min，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂，柱分离纯化（硅胶柱，洗脱液为PE：EA=100：1（体积比）），得20.01g无色液体，收率82%。

化合物H-1的合成：将化合物b（2.04g，4.59mmol），化合物c（2g，4.59mmol），N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，0.71g，5.51mmol）溶于50mL乙醇（EtOH）中，60℃加热搅拌反应12 h。TLC监测反应完全后，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂。加入200mL乙酸乙酯，等体积饱和氯化钠溶液洗3次，无水硫酸钠干燥30min，使用旋转蒸发仪减压蒸馏除去溶剂，柱分离纯化（硅胶柱，洗脱液为DCM：MeOH=50：1（体积比）），得3.01g淡黄色液体，收率82%。¹H NMR (400MHz, Chloroform-d) δ 4.43 (s, 1H), 4.09 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 4.00 (d, J = 5.9Hz, 2H), 3.94 (d, J = 5.8 Hz, 2H), 3.70 – 3.63(m, 2H), 3.64 – 3.55 (m, 4H),2.63 (s, 2H), 2.47 (s, 4H), 2.28 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.70 – 1.18(m, 64H),0.86 (t, J = 6.5 Hz, 12H). MS m/z (ESI)：812.8[M+H]⁺。

采用实施例1的方法，同样也可以制备得到化合物H-2~H-16，对比样品h1-2、对比样品h2-1、对比样品h2-2，在此不再一一赘述。

H-2~H-16的氢谱数据如下所示：

作为一种应用，以上化合物可以用于制备医药用途的组合物，组合物包括：载体，所载的药物试剂，药物辅助剂；

载体包括：一种或多种可电离脂质化合物，助脂质，结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物。

作为一种实施例，载体为脂质纳米粒（LNP），LNP的平均尺寸为30-200nm，纳米粒制剂的多分散指数≤0.3。需要说明的是：一种或多种可电离脂质化合物制备成的任何纳米粒都在本专利范围内，均受本发明的启示；比如：除了LNP还可能是一种或多种可电离脂质化合物与高分子形成的杂化纳米粒，比如：PLGA-PEG，PLA-PEG，PCL、PBAE（Poly β-aminoacid）等这里不再穷举。

助脂质包括：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂（SM）、甾醇及其衍生物、神经酰胺、带电脂质中的一种或几种的组合；磷脂酰胆碱作为一种优选包括：DSPC，DPPC，DMPC，DOPC，POPC；磷脂酰乙醇胺作为一种优选为DOPE；甾醇作为一种优选为胆固醇；带电脂质作为一种实施例为DOTAP、DOTMA、18PA；这里并非穷举，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物的组合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。这里并非穷举，助脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

结构脂质包括：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、番茄碱、熊果酸、α-生育酚或皮质类固醇中的一种或几种。这里并非穷举，结构脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

聚合物缀合脂质为聚乙二醇化脂质；作为一种实施例，聚乙二醇化脂质包括：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油或PEG修饰的二烷基甘油中的一种或多种。这里并非穷举，聚合物缀合脂质的选择不受限制，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

作为一种实施例，两亲性嵌段共聚物可以包括：聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）、聚原酸酯、聚酸酐、聚（β-氨基酯）（PBAE）或聚乙二醇(PEG)修饰的两亲性嵌段共聚物中的一个或多个的组合。需要说明的是：这里的举例并非穷举只要是对本发明结构可电离脂质的应用都在本发明的保护范围之内。

所载的药物试剂包括：核酸分子，小分子化合物，多肽或蛋白质中的一种或多种。这里并非穷举，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物，无论选用何种药物试剂均可以应用于本发明，均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

药物辅助剂包括：稀释剂，稳定剂，防腐剂或冻干保护剂中的一种或多种。这里并非穷举，只要是采用本发明结构的可电离脂质化合物，无论选用何种药物辅助剂复配，均在本发明的保护范围内，均受本发明启示。

实验一：

制备mRNA-LNP（包载mRNA的）用于以下实验，制备方法为：

步骤一：将表1中H-1~H-16和对比样品h1-2，h2-1，h2-2对应的阳离子化合物，DOPE（艾维拓（上海）医药科技有限公司），胆固醇（艾维拓（上海）医药科技有限公司），以及PEG-脂质以设计的处方配比（Lipid/DOPE/Cholesterol/lipid-PEG为35/25/38.5/1.5（摩尔比））溶于乙醇中，配制成脂质乙醇溶液（Lipid 的浓度20mg/mL）。将表1中市售对比样品h1-1对应的阳离子化合物（辉瑞疫苗BNT162b2）通过其最优配比（Lipid/DSPC/Cholesterol/lipid-PEG为46.3/9.4/42.7/1.6（摩尔比））溶于乙醇，制得的脂质乙醇溶液（Lipid的浓度20mg/mL）。

步骤二：按照可电离脂质化合物与mRNA质量比为10:1到30:1准备mRNA，使用柠檬酸盐或醋酸钠缓冲液（pH=3或5）将mRNA稀释至0.2mg/mL。

步骤三，将步骤一得到的脂质乙醇溶液与mRNA溶液以体积比为1:5到1:1的比例充分混匀。所获纳米粒通过超滤和透析的手段纯化，过滤除菌后，使用Malvern ZetasizerNano ZS表征mRNA-LNP的粒径（Size）约和PDI，再使用Ribogreen RNA定量测定试剂盒（Thermo Fisher）测定mRNA的包封率，mRNA-LNP的粒径、PDI和包封率如表1所示。

表1

实验二：转染效率实验：

雄性ICR小鼠（6-8 week，上海杰思捷实验动物有限公司）饲养在 22 ± 2 ˚C以及相对湿度为45–75%的实验条件下，光照/黑暗周期为12 h。使用编码荧光素酶的 mRNA（Luciferase mRNA）作为报道基因。荧光素酶催化荧光素产生生物荧光，通过检测单位时间内生物荧光强度，反映LNP的转染效率。以荧光素酶 mRNA（购自ApexBio Technology）为例，准备实验一获得的mRNA-LNP样品H-1~H-16，市售对比样品h1-1，对比样品h1-2，h2-1，h2-2；将以上样品分别以150μg/kg mRNA的剂量，通过肌肉注射给药，每组样品2只小鼠，两条腿。取特定的时间点，于小鼠腹腔注射荧光素（20μg/mL），5分钟后，将小鼠置于小动物活体成像仪测定荧光强度，最后的结果以平均荧光强度表示，小鼠腹腔注射给药后荧光强度实验结果如图1和表2所示；

表2

结果分析：

h1-1是市售对比样品（辉瑞BNT162b2）。本发明的含有H-1~H-16的LNP样品与h1-1的实验结果对比可知：本发明结构的可电离脂质化合物制备得到的LNP样品的转染效率显著高于市售对比样品的转染效率，具有显著的进步；

由H-1和h1-1、h1-2对比、H2和h2-2的实验结果对比可知：碳酸酯键和-（C=O）O-同时存在的脂质化合物制备得到的LNP样品的转染效率要显著高于只有酯键或只有碳酸酯键存在的化合物制备得到的LNP样品的转染效率；具有意想不到的技术效果；

由图1的荧光强度结合表2可以直观的看出：本发明结构特征的化合物制备所得的LNP与对比化合物制备所得LNP相比，具有显著增高的荧光强度，荧光强度基本增高了3倍以上，其中，H-3，H-10，H-11，H-13，H-15，H-16的荧光强度明显更优，其中H-3为最优，荧光强度增强了15倍以上。

实验三：内涵体逃逸能力实验

mRNA逃逸的实现，主要是因为 pH 敏感性脂质体在胞内酸性环境（pH=3-5.5）中破坏内涵体膜而实现的。以下实验模拟了LNP在中性pH环境下与细胞膜的相互作用；以及胞内内涵体的酸性pH环境中，LNP和内涵体膜的相互作用；从而验证可电离脂质化合物制备得到的LNP的安全性和内涵体逃逸能力。

实验过程如下：四周龄雌性ICR小鼠，体重15~20g，饲养于温度22±2˚C，相对湿度45-75%的实验环境中，光照/黑暗周期为12h。小鼠购入后先于动物房内适应一周后方可进行正式的动物试验。取小鼠全血后，将小鼠血液于离心机中10000g离心5min，分离出小鼠红细胞后，使用PBS（pH =7.4）冲洗五次。然后，将分离后的红细胞分别悬浮于pH为 7.4和pH5.5的PBS溶液中，并加入96孔板中。然后加入浓度梯度的实验一中制备的LNP，样品H-1，对比样品h1-1，对比样品h1-2。37℃条件下孵育1小时，取孔板中的样品于离心机中10000g离心5min，取含血红蛋白的上清液。使用多功能微孔板检测仪检测每孔于540 nm处的吸光度（检测过程中孔板中不能出现气泡），将未经LNP处理的细胞作为阴性对照组。

实验结果如图2、3所示。

结果分析：由图2可知：本发明结构特征的可电离脂质化合物制备得到的LNP在中性pH环境中红细胞溶解率很低，说明在中性环境中对细胞膜的破坏作用很低，显示出安全性。相比之下，对比样品（辉瑞样品和不符合本发明结构特征的化合物制备出的样品）在高浓度（0.12-0.24mM）时，破坏细胞膜的效果严重，说明在高浓度时具有潜在的细胞毒性。由图3可知：本发明结构特征的可电离脂质化合物制备得到的LNP在酸性pH环境中红细胞溶解率显著高于对比样品，说明本发明结构特征的可电离脂质能够在进入细胞后，在内涵体内破坏内涵体膜的作用较强，显示出比对比样品更强的内涵体逃逸作用，由此产生更高的转染效率。

实验四：内涵体逃逸速率实验

使用实验三中分离的红细胞分别悬浮于pH为5.5的PBS溶液中，并加入96孔板中。然后加入固定浓度的实验二中制备的LNP，样品H-1，市售对比样品h1-1（辉瑞），对比样品h1-2。37℃条件分别下孵育10min，20min，40min，60min和80min，取孔板中的样品于离心机中10000g离心5min，取含血红蛋白的上清液。使用多功能微孔板检测仪检测每孔于540 nm处的吸光度（检测过程中孔板中不能出现气泡），将未经LNP处理的细胞作为阴性对照组。

实验结果如图4所示。

结果分析：由图4可知：本发明结构特征的可电离脂质化合物制备得到的LNP在40min之前，红细胞溶解率随着时间的增加显著增加，在40min后开始维持稳定；对比样品（辉瑞样品和不符合本发明结构特征的化合物）制备得到的LNP在60min之前，红细胞溶解率随着时间的增加显著增加，在60min后开始维持稳定；由此可知本发明的可电离脂质制备得到的LNP在酸性条件下破坏内涵体膜的速度更快，从而内涵体逃逸的速率更快，使得更多具有生物活性的mRNA到达细胞质，从而翻译出更多的目标蛋白，转染效率更好。

实验五：脂质纳米粒结构形貌表征实验

透射电镜样品的制备及表征（以样品H-1为例）。在铜网上滴上10μ制备好的样品15L，放置10 min后吸干样品并晾干。醋酸双氧铀染色5 min，滤纸吸干染液后干燥过夜，利用透射电子显微镜（TEM）观察其形貌。

如图5所示，本发明的脂质纳米粒（LNP）都能形成稳定的纳米结构，尺寸分布较窄，尺寸随不同的LNP的结构有所变化，在30-150nm范围内。

实验六：生物相容性实验

使用CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒测定细胞活力。将处于指数增长期的Hep3B细胞（100 μL，细胞密度为2×10⁴个/ml）悬浮液加入96孔板中，于细胞培养箱中孵育24 h，然后从每个孔中除去细胞培养液，并添加100μL含mRNA 20μg/mL的LNP的新制细胞培养液，和细胞共孵育4 h。随后，除去细胞上清液，加入新鲜细胞培养液，继续孵育20 h。然后，除去上清液，加入含CCK-8工作溶液（10 μL/mL）的新鲜的细胞培养液100 μL，孵育2 h，空白孔的设置：加含CCK-8工作溶液的细胞培养液。使用多功能微孔板检测仪检测每孔于450 nm处的吸光度（检测过程中孔板中不能出现气泡），将未经LNP处理的细胞作为对照组，将其细胞活力设为100%。

细胞活力 (%) = [A1-A0]/[A2-A0]× 100；

A1为加药组吸光度，A0为空白组吸光度，A2为对照组吸光度。实验结果如表3所示。

实验结果表明在限定的LNP浓度内，大多数细胞活力大于95%，未见明显细胞毒性。

实验七：脂质纳米粒低温保存稳定性实验

以样品H-3为例，将按照配方制作的脂质纳米粒（LNP）置于4^oC条件下低温保存，取不同时间点（0天、6天、10天、15天、30天、45天），使用Malvern Zetasizer Nano ZS表征mRNA-LNP（包载mRNA的脂质纳米粒）的粒径（Size）约和PDI，mRNA的包封率均使用RibogreenRNA定量测定试剂盒（Thermo Fisher）测定。测定结果见表4所示。

由表4可知：本发明的脂质分子形成的LNP可在低温储存90天粒径和包封率仍然稳定，方便产品的运输和保存，适合工业生产。

实验八：免疫效果动物试验

材料准备：六周龄雌性Balb/c小鼠，体重15~20g，30只，饲养于温度22±2˚C，相对湿度45-75%的实验环境中，光照/黑暗周期为12h。小鼠购入后先于动物房内适应一周后方可进行正式的动物试验。将30只小鼠随机分成5组，第一组后腿肌肉注射等体积PBS（阴性对照组），第二组后腿肌肉注射市售对比样品h1-1（阳性对照组1）、10 µg的mRNA、PBS的混合物，第三组为后腿肌肉注射对比样品h1-2（阳性对照组2）、10 µg的mRNA、PBS的混合物，第四组后腿肌肉注射样品H-3（试验组1）、10 µg的mRNA、PBS的混合物，第五组后腿肌肉注射样品H-11（试验组2）、10 µg的mRNA、PBS的混合物；以上mRNA为基于自主设计的模板通过体外转录合成的可表达Spike全长的mRNA。

实验过程为：在第0和14天，按照以上五个分组将包载mRNA的LNP混合物肌肉注射到Balb/c小鼠体内。在第13和21天进行眼部取血，将血样放在37˚C孵育1小时后，3500rpm离心15分钟，取上清进行分析。通过自制ELISA试剂盒检测一免和二免小鼠血清对Delta变异株S1蛋白特异性抗体滴度。

检测一免和二免小鼠血清对Delta变异株S1蛋白特异性抗体滴度的具体操作过程如下：将Spike S1重组蛋白加入96孔板，每孔加0.25μg，4℃ 放置过夜。第二天，弃去孔内液体，使用5% BSA的PBST溶液（200ul）在37℃条件下封闭1h。之后弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。将小鼠血清用PBS稀释（稀释比列为1：20000），或者标准品用PBS稀释为一系列浓度（母液为1ug/ul，对半稀释，共14个标曲）。将稀释后的样品和标准品100µL加入空中，37℃，孵育2h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍，每遍3min，甩板晾干。加入Goat anti-mouse IgG HRP（PBS 1:5000稀释），每孔100ul，37℃，1h。弃去孔内液体，用PBST洗涤液200ul洗涤3遍,每遍3min，甩板晾干。将TMB底物A液和B液等比例混合，每孔100 µL，置37℃避光放置数分钟（3-5mins）。在650nm测吸光度，最高吸光度值在1.5附近时，即可加100ul终止液。加入终止液后15min内检测450nm处的吸光度值。根据标准曲线公式计算各组IgG含量。

实验结果如图6所示，结果显示：阳性对照组1、2和试验组1、试验组2四组mRNA均可产生针对S1蛋白特异性抗体，试验组1和试验组2的抗体滴度显著高于阳性对照组1、2，试验组1和试验组2可高效递送mRNA进入细胞，表达抗原，进而激起体内免疫反应，产生相应抗体，发挥保护功能。

综上所述，本发明的新可电离脂质化合物结构具有突出性的实质性特点，且以上实验证明本发明的可电离脂质化合物以N原子为可电离中心，以亲水基团为头部，两个疏水基团为尾部，在两个疏水尾部上分别一边引入-O（C=O）-，一边引入碳酸酯键作为可降解功能团，这样的结构使得LNP在胞内酸性的内涵体环境中能够促进内涵体逃逸；且相比市场已在使用的LNP（辉瑞样品）内涵体逃逸的速率更快，从而使得核酸纳米药物的转染效率更好；由荧光结果可知：本发明结构特征的化合物制备所得LNP与对比化合物制备所得LNP相比，具有显著增高的荧光强度，荧光强度增高了至少3倍以上，以上所述特征在提高转染效果上具有协同作用，具有意想不到的技术效果，具有非显而易见性，具有创造性。

这里需要说明的是：本发明可电离脂质化合物是一种药物原料、药物产品，不涉及任何疾病的治疗方法或诊断方法，属于可以授予专利权利的范围。本发明的应用范围不受限制，可以应用于疫苗领域，也可以应用在蛋白替代疗法，基因编辑，细胞治疗等领域，且这里的举例不是穷举，只要是采用本发明结构特征的可电离脂质化合物均在本发明的保护范围内。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种可电离脂质化合物，其特征在于，所述的化合物具有选自下组的结构：

。

2.根据权利要求1所述的可电离脂质化合物，其特征在于，所述的化合物选自下组：

。

3.根据权利要求1所述的可电离脂质化合物，其特征在于，所述的化合物具有选自下组的结构：

。

4.根据权利要求1所述的可电离脂质化合物，其特征在于，所述的化合物具有选自下组的结构：

。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的可电离脂质化合物、或其在药学上可接受的盐的应用，其特征在于，应用于制备包含可电离脂质化合物或其在药学上可接受的盐的组合物。

6.根据权利要求5所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述组合物包括：载体、所载的药物试剂、药物辅助剂，或其组合。

7.根据权利要求6所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述载体包括：一种或多种可电离脂质化合物、助脂质、结构脂质、聚合物缀合脂质或两亲性嵌段共聚物，或其组合。

8.根据权利要求7所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述可电离脂质化合物与助脂质的摩尔比为0.5:1-15:1。

9.根据权利要求7所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述可电离脂质化合物与结构脂质的摩尔比为0.5:1-5:1。

10.根据权利要求7所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述可电离脂质化合物与聚合物缀合脂质的摩尔比为10:1-250:1。

11.根据权利要求7所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述可电离脂质化合物与两亲性嵌段共聚物的摩尔比为1:1-200:1。

12.根据权利要求6所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述载体为脂质纳米粒，所述脂质纳米粒的平均尺寸为30-200nm，所述脂质纳米粒的多分散指数≤0.3。

13.根据权利要求6所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述所载的药物试剂包括：核酸分子、小分子化合物、多肽、蛋白质，或其组合。

14.根据权利要求6所述的可电离脂质化合物的应用，其特征在于，所述药物辅助剂包括：稀释剂、稳定剂、防腐剂、冻干保护剂，或其组合。