CN114306244B - 一种微米级脂质复合物及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种微米级脂质复合物及其制备和应用。本发明微米级脂质复合物包括脂质载体、核酸和佐剂，所述核酸和佐剂均负载于脂质载体的内部及外部，粒径为0.8μm～500μm。本发明微米级脂质复合物在注射部位驻留时间更长，更容易被注射部位的抗原提呈细胞摄取从而引发机体免疫反应，在递送药物进入细胞时，能够同时递送引发免疫反应的核酸药物和佐剂并获得协同作用，相较于常用的纳米级脂质载体，能诱导产生强大的细胞免疫和体液免疫，并具有速释和缓释的效果；此外，荷负电的佐剂还能够中和核酸脂质复合物的表面电势，使其吸附更紧密，生物安全性更高，稳定性更强。

Description

一种微米级脂质复合物及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种微米级脂质复合物及其制备和应用。
背景技术
信使RNA(mRNA)疫苗高效能，生产效率高，低成本和注射安全性，有广泛的应用前景，其研发和临床应用也在快速推进。相比于其他核酸类疫苗，mRNA疫苗更高效、安全，但是其应用受到稳定性和递送效率低的限制。针对这一问题，现已开发出多种递送系统，其中最常用的是脂质载体。
经典的脂质载体配方组成为：可离子化脂质或阳离子脂质，中性磷脂，结构性脂质和聚乙二醇脂质。可离子化脂质或阳离子脂质用于吸附mRNA，中性磷脂和结构性脂质有助于稳定载体的脂质双分子层以提高mRNA的递送效率，聚乙二醇脂质通过减少等离子体蛋白的特异性吸附和在纳米粒子上形成水化层来提高胶体在生物环境中的稳定性。
常用于负载mRNA的脂质载体粒径约为100nm，脂质膜能够与细胞膜发生膜融合从而进入胞内，经内体逃逸释放出药物发挥作用。实际应用中，小粒径的脂质载体容易被快速清除，不能在注射部位长时间驻留被抗原提呈细胞获取，而且在机体各组织器官分布广泛，不能有效集中于目的组织器官。此外，核酸包封于脂质载体内部，能否发生内体逃逸及其释放效率严重影响免疫反应的激活。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种微米级脂质复合物及其制备和应用。所述微米级脂质复合物，包括脂质载体、核酸和佐剂，所述核酸和佐剂均负载于所述脂质载体的内部及外部，所述微米级脂质复合物的粒径为0.8μm～500μm。
优选地，所述微米级脂质复合物的粒径为0.85μm～100μm。
优选地，所述微米级脂质复合物的粒径为0.9μm～50μm。
优选地，所述微米级脂质复合物的粒径为0.95μm～10μm。
优选地，所述微米级脂质复合物的粒径为1.0μm～5.0μm。
优选地，所述微米级脂质复合物的粒径为1.1μm～3.0μm。
本发明大粒径的脂质复合物在注射部位驻留时间长，更容易被注射部位的抗原提呈细胞摄取从而引发机体免疫反应，并且微米级脂质复合物的内部和外部均负载有核酸和佐剂，能够同时达到速释和缓释的效果。
需要说明的是，所述佐剂对微米级脂质复合物的粒径几乎没有影响。
进一步地，所述核酸选自核糖核酸(RNA)、核酸适配体(Aptamer)和脱氧核糖核酸(DNA)中的一种或多种。
优选地，所述RNA选自mRNA、SiRNA和microRNA中的一种或多种。
进一步地，所述佐剂选自微生物来源的免疫增强剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、和中药有效成分中的一种或多种。
优选的，所述佐剂选自模式识别受体激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、免疫应答调节剂(Resiquimod)、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、聚肌胞苷酸(Poly(I:C))、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、羊毛脂、植物油、二价锰离子、锰胶体、卡介苗、槲皮素内毒素、脂质体佐剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、MF59佐剂、双链RNA、双链DNA、钙佐剂、铝佐剂、CAF01佐剂、人参和黄芪的有效成分中的至少一种。
进一步地，所述脂质载体包含可离子化脂质、中性脂质和胆固醇(cholesterol)。
优选地，所述可离子化脂质、中性脂质和胆固醇的摩尔比为2～5:2～5:2～5。
进一步地，所述脂质载体还包括聚乙二醇化磷脂(DMG-PEG2000)，以所述脂质载体的摩尔质量为基准，所述聚乙二醇化磷脂的摩尔百分比不超过10％，其中优选不超过5％。
优选地，所述可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂的摩尔比为20～50:20～50:20～50:0.1～10，优选35:16:46.5:2.5。
进一步地，所述可离子化脂质包括阳离子脂质和阴离子脂质。
优选地，所述阴离子脂质选自磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰甘油、DOPG和二豆蔻酰磷脂酰甘油中的一种或多种。
优选地，所述可离子化脂质为阳离子脂质，所述阳离子脂质选自(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基铵-氯盐(DOTAP)、双十八烷基溴化铵(DDAB)、1,2-双十八烯氧基-3-甲基铵丙烷(DOTMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂(DLin-DMA)、2，2_二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(N,N-二甲基氨基)丁酸(二亚油基)甲酯(DLin-MC3-DMA)和1,2-二油醇-3-二甲基氨基-丙烷(DODMA)中的一种或多种；
优选地，所述核酸与所述阳离子脂质的质量比为1:0.01～20000，优选1:10～20。
优选地，所述中性脂质选自(二油酰磷脂酰胆碱)DOPC、二棕榈酸磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰基卵磷脂(DLPC)和1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)中的一种或多种；
本发明的第二目的是提供一种所述微米级脂质复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂中得到有机相，核酸溶于缓冲盐溶液中作为水相，佐剂根据其极性溶于所述有机相或所述水相中；
(2)去除所述有机相中的有机溶剂，形成脂质膜；
(3)利用所述水相溶解所述脂质膜，得到所述微米级脂质复合物。
优选地，所述有机相与所述水相的体积比为1:0.2～50，优选1:0.5～10。
优选地，所述步骤(1)中，还可加入其他药物成分，根据其极性溶于所述有机相或所述水相中。
进一步地，所述微米级脂质复合物的电势为+10mV～+50mV。
具体的，所述微米级脂质复合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按配比分别称取可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂于烧杯中，加入有机溶剂，加热至磷脂的相变温度(52～57℃)溶解作为有机相，核酸溶于缓冲盐溶液中作为水相，佐剂或其他药物成分根据其极性溶于所述有机相或所述水相中；
(2)将所述有机相滴入圆底烧瓶，40～45℃蒸干，形成脂质膜；
(3)将所述水相滴入含有所述脂质膜的旋转蒸发仪圆底烧瓶中，加转子溶解所述脂质膜，形成所述微米级脂质复合物。
需要说明的是，本发明微米级脂质复合物含有内水相，荷负电的药物被稳定封装于内水相中或吸附于脂质膜表面，核酸及佐剂通过静电作用与阳离子脂质紧密吸附。
本发明的第三目的是提供一种药物递送系统，包括所述微米级脂质复合物。
进一步地，所述微米级脂质复合物与佐剂混匀孵育30～35min后使用。该步骤使得荷负电的佐剂吸附于脂质复合物外侧并中和表面正电荷，降低表面电荷，从而有效降低或避免细胞毒性，并且细胞直径小于20μm的细胞都可以很好地将其吞噬，优选细胞直径为7～20μm。
需要进一步说明的是，本发明内外负载核酸及佐剂的微米级脂质复合物可通过选用不同结构的脂质化合物作为脂质载体或对脂质载体进行结构修饰或其他方式使其富集于目的组织或细胞。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
本发明内外负载核酸及佐剂的微米级脂质复合物中，荷正电的脂质载体与荷负电的核酸及佐剂通过静电作用形成脂质复合物后，可以进一步吸附部分药物于复合物表面，降低表面电荷，在体内中性条件下，能够有效降低或避免细胞毒性，增加了药物负载量的同时还具有很高的包封率。此外，荷负电的佐剂能够中和核酸脂质复合物表面电势，使脂质复合物吸附更紧密，生物安全性更高，稳定性更强。
在递送药物进入细胞时，本发明微米级脂质复合物能够同时递送引发免疫反应的核酸和佐剂并获得协同作用，相较于常用的纳米级脂质载体，微米级脂质复合物能诱导产生强大的细胞免疫和体液免疫。一方面，将部分药物包封于脂质膜内部，减少了RNA酶降解，避免了其经内体逃逸释放出来，大粒径的脂质复合物在注射部位驻留时间长，更容易被注射部位的抗原提呈细胞摄取从而引发机体免疫反应；另一方面，利用静电吸附原理负载部分药物于脂质膜外，能够快速释放，从而引发机体免疫反应，达到速释和缓释效果。
本发明制备工艺简单，所需设备简单易得，容易操作。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明内外负载核酸及佐剂的微米级核酸脂质复合物的结构示意图。
图2是本发明实施例Small组、Medium组和Large组三种脂质复合物的粒径和电势表征图；图2a、图2b和图2c分别是三种脂质复合物的粒径图，粒径分别为98nm，328nm和1.2μm，图2d、图2e和图2f分别是三种脂质复合物的电势表征图，电势分别为+7.8mV，+7.5mV和+43.7mV。
图3是本发明实施例微米级核酸脂质复合物的体外摄取情况图。
图4是本发明实施例Small组、Medium组和Large组三种脂质复合物的体内摄取情况图；图4a和图4b分别是淋巴结中DC细胞和CD8a+的DC细胞对三种脂质复合物的摄取情况，图4c和图4d分别是淋巴结中的B细胞和巨噬细胞对三种组脂质复合物的摄取情况；
图5是本发明实施例Small组、Medium组和Large组三种脂质复合物的体外转染情况图；图5a和图5b分别是被转染细胞的百分比和细胞中GFP的荧光强度。
图6是本发明实施例Small nanoparticle(Poly(I:C))组、Medium nanoparticle(Poly(I:C))组和Large microparticle(Poly(I:C))组三种脂质复合物的体内预防实验结果图；图6a是小鼠预防和接种肿瘤的时间线，图6b是小鼠肿瘤的生长曲线图，图6c是小鼠生存期结果。
图7是本发明实施例Small nanoparticle(Poly(I:C))组、Medium nanoparticle(Poly(I:C))组和Large microparticle(Poly(I:C))组三种脂质复合物的抗原特异性T细胞检测实验结果图；图7a和图7b分别是OVA中的抗原多肽刺激小鼠脾脏细胞后被激活后，合成IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞的分析。
图8是本发明实施例Small nanoparticle(Poly(I:C))组、Medium nanoparticle(Poly(I:C))组和Large microparticle(Poly(I:C))组三种脂质复合物的免疫原性检测实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
内外负载核酸及佐剂的微米级脂质复合物的制备及表征
(1)按照摩尔比(35:16:46.5:2.5)分别称取DOTAP(3.6mg)，DOPE(1.8mg)，cholesterol(2.6mg)以及DMG-PEG2000(1.1mg)于烧杯中，加入0.6mL无水乙醇，加热至55℃溶解作为有机相，吸取浓度1mg/mL的mRNA 0.08mL，取Poly(I:C)0.56mL与RNA合并为水相；
(2)取0.14mL有机相滴入圆底烧瓶，45℃蒸干，形成脂质膜；
(3)水相滴入含有脂质膜的旋转蒸发仪圆底烧瓶中，加转子溶解脂质膜形成脂质复合物并收集；
(4)将所得复合物置于截留分子量1000的透析袋中，以1×PBS为透析介质，在4℃环境下透析，透析期间换3次透析液；
(5)透析后所得脂质复合物经超纯水稀释后，对粒径及电位进行表征(标记为Large组)。
本发明实施例制备的内外负载核酸及佐剂的微米级核酸脂质复合物的结构示意图如图1所示。
使用相同脂质材料利用水溶剂扩散法和微流控技术制备两种纳米级脂质复合物，分别标记为Small组和Medium组。
上述三组脂质复合物的粒径和电势表征结果如图2所示。
由图2a、图2b和图2c可知，Small组、Medium组和Large组脂质复合物的粒径分别为98nm，328nm和1.2μm，由图2d、图2e和图2f可知，上述脂质复合物的电势分别为+7.8mV，+7.5mV和+43.7mV。
使用前，取0.1mL Poly(I:C)与本发明微米级脂质复合物混匀孵育30min，使得Poly(I:C)吸附于脂质复合物外侧中和表面正电荷，降低表面电荷，从而有效降低或避免细胞毒性。
本实施例中的Poly(I:C)还可以替换为模式识别受体激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、免疫应答调节剂(Resiquimod)、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、聚肌胞苷酸(Poly(I:C))、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、羊毛脂、植物油、二价锰离子、锰胶体、卡介苗、槲皮素内毒素、脂质体佐剂、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、MF59佐剂、双链RNA、双链DNA、钙佐剂、铝佐剂、CAF01佐剂、人参或黄芪的有效成分。
实施例2微米级脂质复合物的包封率检测
(1)参照实施例1制备微米级脂质复合物，柠檬酸钠缓冲盐溶液等体积替换Poly(I:C)；
(2)参照Quanti-iT RiboGreen RNA reagent and Kit说明书检测复合物包封率；
(3)复合物样品用1×TE buffer稀释至5μg/mL；
(4)分别取50μL稀释后的样品加入96孔板的两孔中；
(5)向上述两孔中分别加入50μL 1×TE buffer或50μL 2％Triton-X100，空白孔中加入100μL 1×TE buffer；
(6)96孔板放入37℃培养箱中孵育15min；
(7)取10μL RiboGreen RNA reagent用1×TE buffer稀释100倍至1mL；
(8)分别向96孔板各孔中加入100μL稀释后的RiboGreen RNA reagent；
(9)设置酶标仪激发波长480nm，发射波长520nm读取各孔荧光值，包封率＝1－[(TE样品孔荧光值-空白孔荧光值)/(Triton-X100样品孔荧光值-空白孔荧光值)]×100％。
经计算，本发明实施例制备的微米级脂质复合物的包封率为83％～88％。
实施例3微米级脂质复合物的体外细胞摄取效果
(1)试剂和脂质储备液：按照摩尔比(35:16:46.5:2.5)分别称取DOTAP(3.6mg)，DOPE(1.8mg)，cholesterol(2.6mg)以及FITC-DSPE-PEG2000(1.1mg)于烧杯中，加入0.6mL无水乙醇，加热至55℃溶解为储备液；
(2)储备液放入圆底烧瓶中，在45℃水浴中旋转蒸发除去有机溶剂，形成脂质膜；
(3)取超纯水3mL于圆底烧瓶中，加转子溶解脂质膜形成脂质复合物并收集；
(4)将所得复合物置于截留分子量1000的透析袋中，以1×PBS为透析介质，在4℃环境下透析，透析期间换3次透析液；
(5)提前24h将DC2.4细胞以2.0×105/孔的密度铺于24孔板中，每孔加1mL含10％FBS的DMEM完全培养基置于37℃培养箱中培养；
(6)弃去培养基，PBS清洗3次，再加入1mL完全培养基；
(7)每孔加入33μL脂质复合物，加完全培养基至2mL，混匀(总脂质浓度约50μg/mL)；
(8)共孵育4h后，流式细胞仪检测摄取情况，结果如图3所示。
图3结果表明，本发明实施例制备的微米级脂质复合物几乎能够完全被DC2.4细胞摄取。
实施例4微米级脂质复合物的体内摄取评价
(1)按照实施例3制备微米级脂质复合物(标记为Large组)；
(2)使用相同脂质材料利用水溶剂扩散法和微流控技术制备两种纳米级脂质复合物(90～120nm和240～320nm)，分别标记为(Small组和Medium组)；
(3)小鼠皮下注射0.5mL脂质复合物(总脂质浓度约3mg/mL)，16h后处死；
(4)取小鼠腋下及腹股沟淋巴结，制备单细胞悬液；
(5)按照流式抗体厂家说明书使用抗体标记已经制成的淋巴结单细胞悬液(内含DC细胞、B细胞以及巨噬细胞)，按照说明书分别标记活死细胞染料、Fc-block膜抗体CD11c标记DC细胞，CD11c和CD8a标记DC细胞的cDC1s亚群，B220标记B细胞，F4/80标记巨噬细胞；
(6)流式细胞术检测分析三种抗原提呈细胞中异硫氰酸荧光素(FITC)的荧光强度；
(7)考察三种抗原提呈细胞对微米级和纳米级脂质复合物的摄取情况，结果如图4所示。
图4a和图4b分别为淋巴结中DC细胞和CD8a+的DC细胞对三种脂质复合物的摄取情况；图4c和图4d分别为淋巴结中B细胞和巨噬细胞对三种脂质复合物的摄取情况。
图4结果表明，B细胞倾向于摄取90～120nm和微米级的脂质复合物，巨噬细胞对三种粒径的脂质复合物摄取无明显差异，而相较于其他两种纳米级复合物，DC细胞摄取更多的微米级脂质复合物。
实施例5微米级脂质复合物的体外转染效果评价
(1)参照实施例1方法，使用EGFP-mRNA制备微米级脂质复合物，柠檬酸钠缓冲盐溶液等体积替换Poly(I:C)，标记为(Large组)；
(2)使用相同材料利用水溶剂扩散法和微流控技术制备两种纳米级mRNA-脂质复合物(90～120nm和240～320nm)，分别标记为(Small组和Medium组)；
(3)提前24h将DC2.4细胞以5×104/孔的密度铺于24孔板中，每孔加1.5mL含10％FBS的DMEM完全培养基置于37℃培养箱中培养；
(4)弃去培养基，PBS清洗3次，再加500μL DMEM培养基；
(5)每孔分别加入三种核酸脂质复合物(mRNA浓度约1.2μg/mL)，混匀后置于37℃培养箱中培养；
(6)转染24h后，PBS清洗3次，胰酶消化后，使用流式细胞仪中FITC荧光通道检测EGFP荧光。
本实施例体外转染实验结果如图5所示，图5a和图5b分别为被转染细胞的百分比和细胞中GFP的荧光强度。
图5中，被转染细胞的百分比和被转染细胞的荧光强度均表明，微米级核酸脂质复合物的转染性能与目前常用的90～120nm的脂质复合物无明显差异，且转染效率显著优于另外一组纳米级脂质复合物。
实施例6内外负载核酸及佐剂的微米级脂质复合物的体内预防实验
(1)参照实施例1，使用OVA-mRNA制备内外负载核酸及佐剂的微米级脂质复合物，标记为Large microparticle(Poly(I:C))组；
(2)使用相同材料利用水溶剂扩散法和微流控技术制备两种纳米级内外负载mRNA-佐剂的脂质复合物(90～120nm和240～320nm)，分别标记为(Small nanoparticle(Poly(I:C))组和Medium nanoparticle(Poly(I:C))组)；
(3)在6～8周龄的C57/BL6小鼠随机分为PBS组，Small nanoparticle(Poly(I:C))组，Medium nanoparticle(Poly(I:C))组和Large microparticle(Poly(I:C))组；
(4)在第0天和第7天于各组小鼠右后翼分别皮下注射0.5mL三种复合物(mRNA浓度为0.02mg/mL，Poly(I:C)浓度为0.16mg/mL)和PBS；
(5)第28天，在各组小鼠右后肢附近接种3.0×105E.G7-OVA细胞；
(6)8天左右肿瘤长至可测量大小，监测肿瘤体积和生存期；
(7)肿瘤体积按公式V＝0.52×长×宽2计算，超过2000cm3则停止测量。
本实施例小鼠预防和接种肿瘤的时间线图6a所示，图6b是小鼠肿瘤生长曲线图，图6c是小鼠生存期结果图。
图6结果表明，与PBS组相比，微米级与纳米级脂质复合物均能延缓小鼠肿瘤生长趋势，延长小鼠生存时间，效果显著了；从小鼠肿瘤体积生长曲线和生存期曲线看，微米级复合物与纳米级复合物对预防小鼠无明显差异。
实施例7抗原特异性T细胞检测实验
(1)当实施例6中小鼠肿瘤体积超过2000cm3即处死，取脾脏；
(2)脾脏置于70μm细胞筛网上研磨成单细胞，经红细胞裂解液裂解；
(3)细胞以2.0×105/孔接种于12孔板，加入2mL含10％FBS的DMEM完全培养基，放入细胞培养箱培养12h；
(4)每孔加入肽段OVA323-339，OVA257-264，OVA208-216和OVA27-35(各10μg/mL)孵育1h后，加入封闭剂Brefeldin A封闭11h；
(5)弃去培养基，PBS清洗5次，重悬于1mL PBS中；
(6)按照说明书分别标记活死细胞染料、Fc-block膜抗体CD3、CD4和CD8a；
(7)固定破膜后加入IFN-γ抗体孵育结束后，流式细胞仪检测。
检测结果如图7所示，图7a和图7b分别是OVA中的抗原多肽刺激小鼠脾脏细胞后被激活后，合成IFN-γ的CD4+T细胞和CD8+T细胞的结果图。
图7显示，与PBS组相比，Large microparticle(Poly(I:C))组多肽刺激脾脏后，可以产生IFN-γ的CD4+T细胞显著增加(P<0.05)，而另外两组则无明显变化；三组可以产生IFN-γ的CD8+T细胞均有显著增加，结果表明微米级脂质复合物能够有效激活抗原特异性免疫反应。
实施例8免疫原性检测实验
(1)当实施例6中小鼠肿瘤体积超过2000cm3即处死，取血约200μL收集于EP管中；
(2)37℃培养箱中静置2h后，在4℃，1200g条件下离心10min收集血清；
(3)使用商用小鼠卵清蛋白特异性IgG抗体试剂盒检测IgG含量；
(4)参照试剂盒说明书将标准品和20倍稀释的血清加入已包被抗原的96孔板中，37℃培养箱中孵育1h；
(5)加入wash buffer洗涤5次后，加入底物孵育15min；
(6)加入终止液终止反应，酶标仪设置吸收光450nm处读板，结果如图8所示。
图8显示，与PBS组相比，纳米级和微米级核酸脂质复合物均能使小鼠产生OVA蛋白特异性的IgG抗体，而三组之间无明显差异，结果表明微米级核酸脂质复合物能够有效激活机体免疫反应。
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (7)

1.一种微米级脂质复合物，其特征在于，包括脂质载体、核酸和佐剂，所述核酸和佐剂均负载于所述脂质载体的内部及外部，所述微米级脂质复合物的粒径为0.8 μm~500 μm；
所述微米级脂质复合物的制备方法包括以下步骤：
(1)将可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂中得到有机相，核酸溶于缓冲盐溶液中作为水相，佐剂根据其极性溶于所述有机相或所述水相中；其中，所述可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂的摩尔比为20~50:20~50:20~50:0.1~10，所述核酸与可离子化脂质的质量比为1:10~20；
(2)去除所述有机相中的有机溶剂，形成脂质膜；
(3)利用所述水相溶解所述脂质膜，得到所述微米级脂质复合物。
2.根据权利要求1所述的微米级脂质复合物，其特征在于，所述核酸选自RNA、Aptamer和DNA中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的微米级脂质复合物，其特征在于，所述可离子化脂质为阳离子脂质，所述阳离子脂质选自DOTAP、DDAB、DOTMA、DLin-DMA、DLin-K-DMA、DLin-MC3-DMA和DODMA中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的微米级脂质复合物，其特征在于，所述中性脂质选自DOPC、DPPC、DSPC、DOPE、DMPC、DLPC和POPC中的一种或多种。
5.一种权利要求1~4中任一项所述的微米级脂质复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将可离子化脂质、中性脂质、胆固醇和聚乙二醇化磷脂溶于有机溶剂中得到有机相，核酸溶于缓冲盐溶液中作为水相，佐剂根据其极性溶于所述有机相或所述水相中；
(2)去除所述有机相中的有机溶剂，形成脂质膜；
(3)利用所述水相溶解所述脂质膜，得到所述微米级脂质复合物。
6.一种药物递送产品，其特征在于，包括权利要求1~4中任一项所述的微米级脂质复合物。
7.根据权利要求6所述的药物递送产品，其特征在于，所述微米级脂质复合物与佐剂混匀孵育30~35 min后使用。
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