CN116196404A - 基于激活的抗原提呈细胞的核酸递送粒子、核酸递送系统及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种基于激活的抗原提呈细胞膜组分的核酸递送粒子、核酸递送系统及其制备方法及应用,使用负载全细胞组分的纳米粒子或微米粒子激活抗原提呈细胞后将抗原提呈细胞的膜组分负载于已经内部负载mRNA的核酸递送前体粒子后,得到本公开中的核酸递送粒子。本公开提供的核酸递送粒子克服了mRNA递送过程中面临的无法在4摄氏度度或室温下长期储存、递送效率低等问题,能够高效的将mRNA递送到抗原提呈细胞并激活癌细胞特异性免疫反应,可用于癌症等疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本公开涉及免疫治疗领域,尤其涉及一种基于激活的抗原提呈细胞的核酸递送粒子、核酸递送系统及制备方法。
背景技术
信使RNA(Messenger RNA,mRNA)是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。理论上mRNA可以指导合成任意编码的蛋白质,因而具有广泛的应用潜力。目前对mRNA的研究主要集中在疫苗接种、蛋白质替代疗法和遗传疾病的治疗上。而且,mRNA疫苗目前已被应用于预防COVID-19。RNA生物学、化学、稳定性和递送系统的技术进步加速了mRNA疫苗的开发并且在动物模型中观察到有效、持久和安全的免疫反应。相比于传统疫苗,mRNA疫苗能够同时激活机体细胞免疫和体液免疫,产生较强的免疫反应。然而,mRNA的胞内递送较寡核苷酸困难,因为mRNA分子量较大且极其不稳定,容易被RNase降解,因此合适的递送载体就极为关键,其不仅能保护mRNA也有利于mRNA成功进入胞内发挥作用。目前研究用于递送mRNA的手段主要有RNA共聚物、修饰的RNA、病毒递送载体、聚合物递送载体、脂质递送载体等,其中发展最成熟的是脂质纳米颗粒(Lipidnanoparticle,LNP)。但是,LNP递送mRAN也存在一些问题,比如无法有效制备稳定的冻干制剂,因而只能在-70℃或者-20℃储存几个月时间,因而需要的运输和储存条件比较苛刻。而且,LNP表面带正电荷,注射进入人体后容易吸附蛋白质和细胞,因而具有一定的毒副作用,而且,PEG的使用使得其会在一定程度引起过敏反应。而且,LNP递送的mRNA体内的表达效率和疗效也有待进一步提升。因而,目前亟需开发新型递送技术以更好实现mRNA等核酸药物的递送。
发明内容
为解决上述技术问题,本公开提供了一种使用负载抗原组分的纳米粒子(NP)或微米粒子(MP)激活过的抗原提呈细胞制备的核酸递送粒子、包含核酸递送粒子的核酸递送系统及其制备方法。本公开将核酸负载于纳米粒子或微米粒子内部,然后使用来源于激活的抗原提呈细胞和/或其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分负载于纳米粒子或微米粒子表面,制备得到核酸递送粒子。本公开中核酸递送粒子的表面柔性有效提高,并解决了核酸递送时粒子归巢淋巴结、粒子靶向抗原提呈细胞以及粒子进入细胞后的溶酶体逃逸等问题,提高了递送系统递送核酸药物的效率,增加了核酸药物的功效。
本公开的第一个目的是提供一种核酸递送系统,其具有由粒子材料形成的骨架结构,所述骨架结构的内部负载有核酸,所述骨架结构的表面负载有生物膜组分;
其中,所述生物膜组分含有来源于激活的抗原提呈细胞和/或由所述激活的抗原提呈细胞分泌的细胞外囊泡;所述激活的抗原提呈细胞由抗原提呈细胞与抗原递送粒子共作用后得到,所述抗原递送粒子具有由粒子材料形成的骨架结构,以及负载于所述骨架结构的内部和/或表面负载有抗原组分。
在一些实施方案中,所述核酸递送粒子和所述抗原递送粒子彼此独立地选自纳米粒子或微米粒子。核酸递送粒子或抗原递送粒子的粒径大小为纳米级或微米级,这样能保证粒子被抗原提呈细胞吞噬。
进一步地,纳米粒子的粒径大小为1nm-1000nm,更优选地,粒径大小为30nm-1000nm,更优选地,粒径大小为50nm-600nm;更优选地,粒径大小为50-500nm;更优选地,粒径大小为100-400nm。示例性地,纳米粒子的粒径为10nm、50nm、100nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、400nm、500nm等等。
进一步地,微米粒子的粒径大小为1μm-1000μm,更优选地,粒径大小为1μm-100μm,更优选地,粒径大小为1μm-10μm,更优选地,粒径大小为1μm-5μm,更优选为1-10μm;更优选为1-2μm。示例性地,微米粒子的粒径为1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm、3μm、5μm、10μm等等。
在一些实施方案中,核酸递送粒子表面带有负电荷。
本公开所述核酸包括DNA和RNA。
本公开所述RNA包括但不限于mRNA、SiRNA、lcncRNA等。
核酸递送粒子的表面电位为-150mV到-1mv。更优选为-50mv到-1mv;更优选为-20mv到-1mv。
在一些实施方案中,本公开所述抗原组分包含如下的至少一种:
(i)具有免疫原性的蛋白和/或多肽;
(ii)编码抗原的核酸。
在一些实施方案中,所述具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于如下(1),和任选存在的(2)-(3)中的至少一种;
(2)全细胞裂解物;其中,所述全细胞裂解物组分来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞;
(2)细菌裂解物;
(3)细胞外囊泡裂解物;其中,所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌。
进一步地,所述全细胞裂解物包括如下的一种或两种:水溶性抗原的裂解物和非水溶性抗原的溶解物。在一些优选的实施方案中,所述全细胞裂解物中,所述非水溶性抗原的溶解物与所述水溶性抗原的裂解物混合的质量比为(0.1-10):(0.1-10);优选为(0.5-2):(0.5-2)。示例性地,非水溶性抗原的溶解物与所述水溶性抗原混合的质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施方案中,具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于全细胞裂解物和细胞外囊泡裂解物。进一步地,所述细胞外囊泡裂解物选自癌细胞的细胞外囊泡裂解物和/或细菌的细胞外囊泡裂解物。所述全细胞裂解物与所述细胞外囊泡裂解物的质量比为(0.1-10):(0.1-10);优选为(0.5-2):(0.5-2)。示例性地,所述全细胞裂解物与所述细胞外囊泡裂解物的质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施方案中,具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于全细胞裂解物和细菌裂解物。进一步地,所述全细胞裂解物与所述细菌裂解物的质量比为(0.1-10):(0.1-10);优选为(0.5-2):(0.5-2)。示例性地,所述全细胞裂解物与所述细菌裂解物的质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施方案中,本公开所述抗原递送粒子还负载如下至少一种:
(iii)免疫佐剂;
(iv)带正电荷的物质,其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物,和/或带正电荷的无机物。
进一步的,所述核酸递送粒子由核酸递送前体粒子与生物膜组分共作用得到;
进一步地,所述核酸递送前体粒子和/或所述核酸递送粒子还负载如下至少一种:
(iii)免疫佐剂;
(iv)带正电荷的物质,其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物,和/或带正电荷的无机物。
在一些实施方案中,所述核酸递送粒子中,所述粒子材料、核酸与生物膜组分的质量比(mg:μg:μg)为1:(1-100):(10-300)。
进一步地,所述核酸递送粒子进一步包括免疫佐剂和带电荷的物质,所述粒子材料、核酸、免疫佐剂、带正电荷的物质与所述生物膜组分的质量比(mg:μg:μg:μg:μg)为1:(1-100):(1-200):(10-500):(10-300)。
在一些实施方案中,核酸递送粒子负载的生物膜组分进一步含有至少一种如下所示的组分:
(a)来源于全细胞裂解物的癌细胞膜组分;其中,所述全细胞裂解物组分来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞;
(b)来源与细胞外囊泡裂解物的细胞外囊泡膜组分,所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌;
(c)来源于细菌裂解物的细菌膜组分。
在本公开中,细菌包括但不限于卡介苗、大肠杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。
在本公开中,免疫增强佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、锰佐剂、铝佐剂、钙佐剂、STING激动剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、植物油、内毒素佐剂、脂质体佐剂、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、CAF01、人参有效成分、黄芪有效成分等。
进一步地,免疫增强佐剂选自两种或两种以上Toll样受体激动剂。示例性地,免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种。
进一步的,免疫增强佐剂包括(1)Poly(I:C)和/或Poly(ICLC);(2)CpG-ODN;其中,CpG-ODN为A类CpG-ODN、B类CpG-ODN和C类CpG-ODN中的至少一种;优选为至少两种,且至少其中一种为B类CpG-ODN或C类CpG-ODN。
本公开的上下文中,“CpG”或“CpG-ODN”(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核苷酸),是合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡聚脱氧核苷酸(ODN)。不同类型的CpG-ODN的结构特征与免疫效应各有不同,一般分为A、B、C三类。
在一些实施方案中,CpG-ODN包括但不限于:CpG 1018(B类)、CpG 7909(B类)、CpG2006(B类)、CpG-BW006(B类)、CpG 2395(C类)、CpG SL01、CpG 1585(A类)、CpG 2216(A类)、CpG SL03、CpG 2395(C类)、CpG M362(C类)、CpG 2336(A类)。
在本公开中,所述带正电荷的物质包括但不限于如下至少一种:带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的高分子聚合物、带正电荷的无机物。示例性地,带正电荷的多肽包括但不限于含有精氨酸的多肽、含有组氨酸的多肽和/或组氨酸和/或赖氨酸的KALA多肽、RALA多肽、蜂毒肽等。
示例性地,带正电荷的氨基酸包括但不限于精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。
示例性地,带正电荷的高分子聚合物包括但不限于聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸等。
示例性地,带正电荷的脂质包括但不限于DOTAP等。
示例性地,带正电荷的蛋白质包括但不限于鱼精蛋白、组蛋白等。
示例性地,带正电荷的无机物包括但不限于NH4HCO3、氢氧化铝等。
在一些实施方案中,所述带正电荷的物质包括蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3中的任意一种或任意组合。
在一些实施方案中,抗原递送粒子和/或核酸递送粒子还负载有靶分子。所述靶分子包括如下至少一种:甘露糖、甘露聚糖、CD19抗体、CD20抗体、BCMA抗体、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体等。
在本公开中,所述非水溶性抗原、所述细菌裂解物或所述细胞外囊泡裂解物彼此独立地溶解于包含如下至少一种溶解剂的的溶解液中:尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、氨基酸、糖苷和胆碱;更优选地,所述溶质包括如下至少一种:尿素、脱氧胆酸钠、辛基葡萄糖苷和精氨酸。
在本公开中,所述细菌裂解物和/或细胞外囊泡裂解物经含有裂解剂的裂解液裂解细菌和/或细胞外囊泡得到;所述裂解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱的水溶液中的一种或多种。
在本公开中,所述抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞(DC)和巨噬细胞中的至少一种,优选为两种及以上,更优选为三种细胞的组合。
在本公开中,形成所述核酸递送粒子的粒子材料由天然高分子材料和/或合成高分子材料形成。
在本公开中,形成所述抗原递送粒子由天然高分子材料和/或合成高分子材料形成。
示例性地,有机合成高分子材料包括但不限于PLGA、PLA、PGA、PEG、PCL、Poloxamer、PVA、PVP、PEI、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽等。
示例性地,天然高分子材料包括但不限于卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分、淀粉、糖类、多肽等。
示例性地,无机材料包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸盐、磷酸盐等。
本公开所述的核酸递送粒子、核酸递送前体粒子和抗原递送粒子的形状为常见的任意形状,包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等。
在本公开中,所述激活的抗原提呈细胞由抗原提呈细胞与抗原递送粒子共孵育得到;其中,抗原递送粒子的表面和/或内部负载有抗原组分;其中,所述抗原递送粒子负载癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞抗原组分和/或核酸;其中,全细胞抗原组分包含水溶性抗原组分和非水溶性抗原组分。
在本公开,所述抗原提呈细胞与抗原递送粒子的共孵育体系中可以包含细胞因子和/或抗体。
示例性地,细胞因子包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素14(IL-14)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素17(IL-17)、IL-12、白介素12(IL-12)、白介素6(IL-6)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素33(IL-33)、γ干扰素(IFN-γ)、TNF-α。
示例性地,抗体包括但不限于CD80抗体、CD86抗体、αCD-3抗体、αCD-4抗体、αCD-8抗体、αCD-28抗体、αCD-40抗体、αOX-40抗体、αOX-40L抗体。
在本公开中,所述孵育体系中还包括如下至少一种:
(1)全细胞裂解物;其中,所述全细胞裂解物组分来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞;
(2)细菌裂解物;
(3)细胞外囊泡裂解物;其中,所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌。
本公开中,将核酸负载于纳米粒子或微米粒子中,同时使用负载抗原组分的抗原递送粒子先特异性激活抗原提呈细胞,再将来源于激活的抗原提呈细胞和/或由其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分负载于纳米粒子或微米粒子的表面,形成内部负载核酸、表面负载生物膜组分的核酸递送粒子。本公开提供的核酸递送例子可以有效归巢淋巴结,靶向抗原提呈细胞,能够提高核酸药物的递送效率及药物功效。核酸递送粒子在冷冻干燥后可在4℃下长期保存,不影响起药物功效。
本公开的第二个目的在于提供一种核酸递送系统,其包括本公开提供的核酸递送粒子。进一步地,核酸递送系统包含的核酸递送粒子可以相同或不同,能够实现对一种或多种核酸药物的体内递送,具有递送效率高、安全性高等优势,可发挥显著的药物预防或者治疗功效。
本公开的第三个目的在于提供了一种药物组合物,其包括本公开提供的核酸递送粒子或核酸递送系统。
在一些实施方案中,药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
本公开提供的药物组合物,可通过核酸递送粒子或核酸递送系统实现高效的核酸递送,发挥显著的疾病预防或治疗效果。
本公开的第四个目的在于提供一种核酸疫苗,其包括本公开提供的核酸递送粒子或核酸递送系统。
本公开中的核酸递送粒子或核酸递送系统可以靶向抗原提呈细胞,有效激活机体的免疫应答反应,高效发挥核酸疫苗的预防或治疗效果。
本公开的第五个目的在于提供上述核酸递送粒子、核酸递送系统或药物组合物在如下(1)-(3)至少一项中的用途:
(1)预防或治疗疾病,或制备用于预防或治疗疾病的药物;
(2)在受试者中诱导免疫应答,或制备用于在受试者中诱导免疫应答的药物;
(3)作为或用于制备核酸疫苗。
在一些实施方案中,所述疾病为癌症或肿瘤;
在一些实施方案中,所述癌症或肿瘤为实体肿瘤或者血液瘤,所述实体肿瘤或血液瘤包括但不限于鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌(HCC)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、急性髓性白血病(AML)、多种骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、淋巴母细胞白血病、淋巴细胞白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和头颈癌。
本公开中,用于形成生物膜组分的抗原提呈细胞,与抗原组分来源于受试者、细胞系或由干细胞转化形成。进一步地,抗原提呈细胞与抗原组分来源的受试者为同一个体或同种异体。
本公开中,抗原组分来源于所述疾病相关的细胞或组织。进一步地,抗原组分来源于癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞抗原组分。
本公开的第六个目的在于提供上述核酸递送粒子的制备方法,其包括如下步骤:
S1,将抗原提呈细胞与抗原递送粒子共孵育,得到激活的抗原提呈细胞;其中,抗原递送粒子的表面和/或内部负载有抗原组分;
S2,制备内部负载核酸的核酸递送前体粒子;
S3,将生物膜组分负载于所述核酸递送前体粒子的表面,得到核酸递送粒子;其中,所述生物膜组分来源于所述激活的抗原提呈细胞,或来源于由所述激活的抗原提呈细胞分泌的细胞外囊泡。
在一些实施方案中,所述将生物膜组分负载于所述核酸递送前体粒子的表面包括:
S31,将激活的抗原提呈细胞经过机械破坏,收集生物膜组分;
S32,将所述收集生物膜组分与核酸递送前体粒子共作用,得到核酸递送粒子。
进一步地,在步骤S31中,将激活的抗原提呈细胞经过机械破坏,经膜过滤或梯度离心,收集生物膜组分。
示例性地,所述机械破坏包括但不限于超声、均质化、挤出、匀浆、高速搅拌、高压破坏、高剪切力破坏、溶胀、化学物质、皱缩中的一种或多种。
示例性地,所述共作用包括但不限于共孵育、共挤出、超声、搅拌、透析、超滤、均质化和匀浆中的一种或多种。
在一些实施方案中,所述抗原递送粒子的制备步骤包括:
分别制备负载水溶性抗原的递送粒子,以及负载非水溶性抗原的溶解物的递送粒子,混合两种递送粒子,得到所述抗原递送粒子;或者,混合所述水溶性抗原和非水溶性抗原的溶解物,得到混合后的抗原组分;利用所述混合后的抗原组分,制备所述抗原递送粒子;或者,使用含有溶解剂的溶解液同时溶解水溶性抗原和非水溶性抗原,并利用所述混合抗原组分制备所述抗原递送粒子。
在一些实施方案中,所述抗原组分的制备步骤包括:
S11,在水或不含溶解剂的溶解液中裂解目标细胞和/或目标组织,离心;得到的上清液为水溶性抗原组分,沉淀为非水溶性抗原组分;
S12,将所述沉淀溶解于含有溶解剂的溶解液中,然后与水溶性抗原组分合并,得到来源于目标细胞和/或目标组织的抗原组分。
示例性地,目标细胞为癌细胞,目标组织为肿瘤组织,癌细胞为一种或一种以上,肿瘤组织为一种或者一种以上。
进一步地,所述在水或不含溶解剂的溶解液中裂解目标细胞和/或目标组织的步骤包括:将目前细胞和/或目标组织在-20℃~-273℃下冷冻,加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解。
在一些实施方案中,所述抗原组分的制备步骤包括:使用含有溶解剂的溶解液裂解并同时溶解目标细胞和/或目标组织织中的水溶性组分和非水溶性组分,得到抗原组分。
示例性地,目标细胞为癌细胞,目标组织为肿瘤组织,癌细胞为一种或一种以上,肿瘤组织为一种或者一种以上。
示例性地,溶解剂包括但不限于尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐(0.1-2000mg/mL)、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷、胆碱中的至少一种。
本公开突破现有核酸递送技术的限制,使粒子上负载核酸药物的同时负载有细胞全细胞抗原表位和/或核酸所表达的蛋白质或多肽的抗原表位,以及来源于激活的抗原提呈细胞的生物膜组分或其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分,能够更有效的发挥核酸药物的功能。
借由上述方案,本公开至少具有以下优点:
mRNA等核酸药物目前主要使用脂质纳米粒(LNP)技术递送,但是LNP为带正电荷的纳米粒子,极易吸附带负电的蛋白质或者细胞,因而细胞毒性较大。而且,PEG等物质的引入使得LNP易引起过敏反应。本公开提供了一种使用纳米级或微米级粒子递送核酸药物的技术,既能高效负载核酸药物,也能归巢淋巴结和靶向淋巴结内的抗原提呈细胞,从而在降低毒副作用的同时提高了核酸药物的疗效,本公开中的核酸递送粒子可以用于预防和治疗癌症等疾病的核酸药物的递送。而且,本公开所述核酸递送粒子表面带负电,所以降低了递送系统吸附带负电的蛋白质或多肽所引发的毒副作用。而且,本公开所述的核酸递送粒子可以冷冻干燥后长期储存备用,克服了LNP目前无法冷冻干燥以及长期储存的问题。
上述说明仅是本公开技术方案的概述,为了能够更清楚了解本公开的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本公开的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本公开的内容更容易被清楚的理解,下面根据本公开的具体实施例并结合附图,对本公开作进一步详细的说明。
图1为本公开中核酸递送粒子的制备过程及应用示意图;其中,a为收集水溶性抗原组分和非水溶性抗原组分与制备抗原递送粒子的过程示意图;b为采用含有溶解剂的溶解解液直接裂解后溶解癌细胞全细胞抗原和制备抗原递送粒子的过程示意图;c为使用a或b中制备的抗原递送粒子激活抗原提呈细胞,并将来源于激活的抗原提呈细胞生物膜组分或其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分与与负载核酸的核酸递送前体粒子共作用后制备得到纳米疫苗或微米疫苗用于预防或治疗癌症的示意图。
图2为实施例1中不同粒子递送体系递送核酸后所递送的核酸表达情况的分析的实验结果。
图3-14分别为实施例2-13中使用核酸疫苗(纳米疫苗或微米疫苗)预防或治疗癌症时小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果;图3-14中,a为预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8);b为预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8),每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM);图3c和d为使用流式细胞术分析共孵育后小鼠脾细胞中CD8+IFN-γ+T细胞占CD8+T细胞的比例以及CD4+IFN-γ+T细胞占CD4+T细胞的比例;其中
图3-12中,a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析,b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析;***表示与PBS空白对照组相比p<0.005,有显著性差异;**表示与PBS空白对照组相比p<0.01,有显著性差异;ΔΔΔ表示与负载核酸的LNP疫苗处理组相比p<0.005,有显著性差异;εε代表与使用特定细胞因子组分加入抗原递送粒子(纳米粒/微米粒)激活抗原提呈细胞共孵育体系,并将其生物膜组分与核酸递送前体粒子(纳米粒/微米粒)共作用后所制备的核酸递送粒子(纳米粒/微米粒)相比p<0.01,有显著性差异;ε表示与使用特定细胞因子组分加入抗原递送粒子(纳米粒/微米粒)激活抗原提呈细胞共孵育体系,并将其生物膜组分与核酸递送前体粒子(纳米粒/微米粒)共作用后所制备的核酸递送粒子(纳米粒/微米粒)相比p<0.05,有显著性差异;###表示单独孵育而无任何抗原递送粒子(纳米粒/微米粒)激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子(纳米粒/微米粒)共作用后所制备的核酸递送粒子(纳米粒/微米粒)相比p<0.005,有显著性差异;τ代表与抗原递送粒子(纳米粒/微米粒)激活的DC与核酸递送前体粒子(纳米粒/微米粒)共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;&&&表示只是内部负载核酸而表面不负载膜组分的纳米粒子和/或微米粒子对照组相比p<0.005,有显著性差异;&&表示与只是内部负载核酸而表面不负载膜组分的纳米粒子和/或微米粒子对照组相比p<0.01,有显著性差异;δδδ表示与空白对照纳米粒子/微米粒子+游离裂解液激活的抗原提呈细胞的生物膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.005,有显著性差异;δ表示与空白对照纳米粒子/微米粒子+游离裂解液激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;ωωω代表与多肽抗原递送粒子粒激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.005,有显著性差异;ωω代表与多肽抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.01,有显著性差异;ω代表与多肽抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;χ代表与负载癌细胞全细胞组分和吐温80裂解和溶解的细菌组分的抗原递送粒子的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的核酸疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;π代表与抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;ππ代表与抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.01,有显著性差异;θ代表与使用两种A类CpG和Poly ICLC/Poly(I:C)作为混合佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞与核酸递送前体粒子共作用所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.05,有显著性差异;γγγ代表与使用A类CpG和B类CpG作为混合佐剂的抗原粒子递送激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.005,有显著性差异;ΩΩ代表与只使用Poly(I:C)作为佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用所制备的纳米疫苗/微米疫苗组相比p<0.01,有显著性差异;Ο代表与使用两种A类CpG和Poly ICLC/Poly(I:C)作为混合佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞与核酸递送前体粒子共作用所制备的纳米疫苗/微米疫苗在室温储存12个月后相比p<0.05,有显著性差异;κ代表与抗原递送粒子激活的DC与核酸递送前体粒子共作用后所制备的纳米疫苗/微米疫苗在室温储存12个月后相比p<0.05,有显著性差异;β代表与不负载溶酶体逃逸物质的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后制备的纳米疫苗/微米疫苗相比p<0.05,有显著性差异;ξ代表与只负载一种CpG+Poly(I:C)混合佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后制备的核酸疫苗相比p<0.05,有显著性差异;μμμ代表与负载抗原不负载佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后制备的纳米疫苗/微米疫苗相比p<0.005,有显著性差异;ρ代表与负载癌细胞全细胞组分的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后制备的纳米疫苗/微米疫苗相比p<0.05,有显著性差异;λλ代表与只负载两类CpG作为佐剂的抗原递送粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体粒子共作用后制备的纳米疫苗/微米疫苗相比p<0.01,有显著性差异;ΔΔΔ代表与负载负载mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)疫苗相比p<0.005,有显著性差异;η代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与两种A类CpG和polyIC混合佐剂的疫苗相比p<0.05,有显著性差异;代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与一种B类CpG和polyIC混合佐剂的疫苗相比p<0.005,有显著性差异;∞代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与两种A类CpG、polyIC混合佐剂以及阳离子物质的疫苗相比p<0.05,有显著性差异;/>代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与polyIC和阳离子物质的疫苗相比p<0.05,有显著性差异;∝代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与两种B类CpG和阳离子物质的疫苗相比p<0.05,有显著性差异;/>代表与表面负载生物膜组分同时内部负载核酸与两种B类CpG和polyIC混合佐剂的疫苗相比p<0.05,有显著性差异;■代表与表面负载被抗原递送粒子激活的细胞的生物膜组分,同时内部只负载佐剂和多肽却不负载核酸组分(除佐剂外)的疫苗组相比p<0.05;■■代表与表面负载被抗原递送粒子激活的细胞的生物膜组分,同时内部只负载佐剂和多肽却不负载核酸组分(除佐剂外)的疫苗组相比p<0.01;■■■代表与表面负载被抗原递送粒子激活的细胞的生物膜组分,同时内部只负载佐剂和多肽却不负载核酸组分(除佐剂外)的疫苗组相比p<0.005。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本公开作进一步说明,以使本领域的技术人员可以更好地理解本公开并能予以实施,但所举实施例不作为对本公开的限定。
除非有相反陈述,否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
在本发明的权利要求和/或说明书中,词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”,但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的,词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的,并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
术语“治疗”是指:在罹患疾病之后,使受试者接触(例如给药)核酸递送粒子、核酸递送系统、核酸疫苗、负载核酸的药物、药物组合物,从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻,并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指:身体出现了疾病症状。
术语“预防”是指:在罹患疾病之前,通过使受试者接触(例如给药)本公开的核酸递送粒子、核酸递送系统、核酸疫苗、负载核酸的药物、药物组合物,从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状,并不意味着必需完全抑制患病。
术语“药学上可接受的辅料”或“药学上可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物,还在于提供一种方法,以便在为受试者施用药物之后,活性成分能够以所期望的速率溶出,或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂,也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
本公开中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如,常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
在本公开中,施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整,以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于,家养动物(例如,牛,羊,猫,狗和马),灵长类动物(例如,人和非人灵长类动物如猴),兔,以及啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)。
除非另外定义或由背景清楚指示,否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于,家养动物(例如,牛,羊,猫,狗和马),灵长类动物(例如,人和非人灵长类动物如猴),兔,以及啮齿类动物(例如,小鼠和大鼠)。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用,涵盖实体瘤和液体肿瘤。术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本公开所述的核酸递送系统(疫苗系统),其内部负载核酸,表面负载被粒子激活的抗原提呈细胞的细胞膜组分或细胞外囊泡膜组分。其中,用于制备纳米粒子或微米粒子的抗原提呈细胞先被负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞抗原和/或核酸或其混合物的纳米粒子和/或微米粒子(抗原递送粒子)激活;然后将被激活的抗原提呈细胞的膜组分负载于内部负载mRNA的粒子(核酸递送前体粒子)表面,制备预防或治疗癌症的粒子系统(核酸递送粒子),其制备过程及应用领域如图1所示。
在制备激活抗原提呈细胞的纳米粒子或微米粒子(抗原递送粒子)时,可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性抗原和水不溶性抗原并分别制备纳米或微米粒子系统(抗原递送粒子);或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织并溶解癌细胞全细胞抗原并制备纳米或微米粒子系统(抗原递送粒子)。本公开所述癌细胞和/或肿瘤组织全细胞抗原在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、蛋白质和/或多肽分离提纯、核酸分离提纯、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理等处理后再制备纳米粒子或微米粒子;也可细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理直接制备纳米粒子或微米粒子。本公开部分实施例中,肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理,在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理,或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理;本公开部分实施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热,在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、蛋白质和/或多肽分离提纯、核酸分离提纯、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解,在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
在将被激活的抗原提呈细胞制备成纳米粒子或微米粒子时,先对抗原提呈细胞进行机械破坏,然后使用离心和/或一定孔径的滤膜过滤,然后与负载全细胞组分和/或核酸的纳米粒子或微米粒子共作用。
被激活的抗原提呈细胞在经过机械破坏后含有一定的细胞膜结构。
激活的抗原提呈细胞在经过机械破坏后,与作为核酸递送前体粒子共作用后所形成核酸递送粒子。其中,来源于激活的抗原提呈细胞的生物膜组分位于核酸递送粒子的外层。
用于制备生物膜组分的抗原提呈细胞可以来源于自体或者同种异体,也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是DC细胞、B细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物,也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。
核酸递送粒子除了表面负载来源于激活的抗原提呈细胞的生物膜组分和/或其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分,还可以同时负载来源于癌细胞的生物膜组分,和/或来源于由癌细胞分泌的细胞外囊泡的生物膜组分,和/或细菌,和/或来源于细菌或其分泌的细胞外囊泡的生物膜组分。
以肿瘤组织,和/或癌细胞的全细胞组分作为抗原组分,在使用负载抗原组分的抗原递送粒子激活抗原提呈细胞时,体系中可含有细胞因子和/或抗体以提高激活效率。
在一些实施方案中,采用负载来源于癌细胞全细胞组分的抗原递送粒子先激活抗原提呈细胞,在将抗原提呈细胞的生物膜组分负载于纳米粒子或微米粒子表面,制备得到核酸递送粒子。
任何本领域人员知晓的纳米粒子、微米粒子制备方法均可以用于制备本公开所述的核酸递送粒子,包括但不限于溶剂挥发法、透析法、微流控法、均质乳化法、分散法、沉淀法等等。
在一些具体的实施方案中,本公开以溶剂挥发法为例,提供如下示例制备方法:
步骤1,混合初水相与有机相,具体为将第一预定体积的含有第一预定浓度的抗原组分的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度的制备粒子原材料的有机相中。
在一些实施例中,水相溶液可含有如下i)~iii)中的至少一种:i)癌细胞裂解物中各组分、ii)肿瘤组织裂解物中的各组分、iii)编码特定蛋白质或多肽的核酸,以及免疫增强佐剂。裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原,或是溶于含有尿素或盐酸胍等溶解剂的溶解液中的原非水溶性抗原。第一预定浓度为水相溶液所含有的核酸的浓度,或者是水相溶液中所含有的水溶性抗原的浓度和/或原非水溶性抗原的浓度,第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/mL,或编码特定蛋白质或多肽的核酸的浓度为大于0.01ng/mL核酸浓度大于0.01ng/mL,以便能负载足够的核酸或者癌细胞全细胞抗原以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中,有机溶剂选用二氯甲烷。另外,在一些实施例中,制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL,选为100mg/mL。
实际中,有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定,在本公开中,水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000,优选地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
在一些实施方案中,水相溶液为包含细胞和/或组织裂解物组分的溶液时,其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL,优选1mg/mL~100mg/mL。在一些实施方案中,水相溶液为包含裂解物组分与免疫佐剂的溶液时,其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL,优选1mg/mL~100mg/mL,免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL,优选0.01mg/mL~20mg/mL。在一些实施方案中,有机相溶液中,溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等,优选二氯甲烷;有机相的浓度为0.5mg/mL~5000mg/mL,优选为100mg/mL。
在一些实施方案中,水相溶液为包含核酸的溶液时,其中核酸的浓度大于0.01ng/mL,优选1μg/mL~1mg/mL。在一些实施方案中,水相溶液为包含核酸与免疫佐剂的溶液时,其中核酸的浓度大于1ng/mL,优选1μg/mL~1mg/mL,免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL,优选0.01mg/mL~20mg/mL。在一些实施方案中,有机相溶液中,溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等,优选二氯甲烷;有机相的浓度为0.5mg/mL~5000mg/mL,优选为100mg/mL。
步骤2,将步骤1得到的混合液进行如下任一种处理:i)大于2秒的超声处理;ii)大于1分钟的搅拌;iii)均质处理;iv)微流控处理。优选地,搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时,搅拌速度大于50rpm,搅拌时间大于1分钟,比如搅拌速度为50rpm~1500rpm,搅拌时间为0.1小时~24小时;超声处理时,超声功率大于5W,时间大于0.1秒,比如2~200秒;均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机,使用高压/超高压均质机时压力大于5psi,比如20psi~100psi,使用高剪切均质机时转速大于100rpm,比如1000rpm~5000rpm;使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化,超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小,过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤3,将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行如下任一种处理:i)大于2秒的超声处理;ii)大于1分钟的搅拌;iii)进行均质处理;iv)微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌或均质化或混合以进行纳米化或微米化。在本公开中,超声时间大于0.1秒,比如2~200秒,搅拌速度大于50rpm,比如50rpm~500rpm,搅拌时间大于1分钟,比如60~6000秒。优选地,搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时,搅拌速度大于50rpm,搅拌时间大于1分钟,比如搅拌速度为50rpm~1500rpm,搅拌时间为0.5小时~5小时;超声处理时,超声功率为50W~500W,时间大于0.1秒,比如2~200秒;均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机,使用高压/超高压均质机时压力大于20psi,比如20psi~100psi,使用高剪切均质机时转速大于1000rpm,比如1000rpm~5000rpm;使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化,超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小,过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在一些实施例中,乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液,第三预定体积为5mL,第三预定浓度为20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本公开中,第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1 -1:1000进行设定,优选地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸,可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地,本步骤的超声时间或搅拌时间或均质化时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据,均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤4,将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中,并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中,乳化剂水溶液为PVA溶液或其他溶液。
第四预定浓度为5mg/mL,第四预定浓度的选择,以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本公开中,第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000,优选地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本公开中,本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成,也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
步骤5,将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后,去除上清液,并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)中;或者使用超滤离心或者使用能够去除特定分子量物质的透析法,去除游离的PVA等物质的同时将体系中的溶液更换为含有第五预定浓度的冻干保护剂的第五预定体积的水溶液或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)。
步骤6,将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后,将冻干物质备用。
步骤7,将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用;或者上述样品与第七预定体积的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原混合后使用。
在本公开中,第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1,优先体积比为1:100到100:1,最优体积比为1:30到30:1。
在一些实施方案中,所述形成核酸递送粒子的核酸递送前体粒子中,每1mg粒子材料负载0.1-500μg核酸。在一些实施方案中,或所述核酸递送前体粒子还负载免疫增强佐剂,其中,每1mg粒子材料负载1-400μg免疫增强佐剂。在一些实施方案中,所述核酸递送前体粒子还负载带正电性分子,其中,每1mg粒子材料负载1-800μg带正电性分子。
步骤8,将抗原提呈细胞与上述制备的抗原递送粒子共孵育一定时间。制备抗原递送粒子的肿瘤组织和/或癌细胞与抗原提呈细胞可以来自于同一个体或者同种异体。
在一些实施方案中,每(50万-5000万)个所述抗原提呈细胞与(10μg-1500μg)的所述抗原递送粒子进行共孵育。
步骤9,收集共孵育后的抗原提呈细胞,进行超声、均质化、机械搅拌等机械破坏,然后将样品进行离心和/或使用一定孔径的滤膜过滤和/或共挤出等处理,得到被激活的抗原提呈细胞的生物膜组分和/或细胞外囊泡的生物膜组分。
步骤10,将mRNA或DNA等核酸采用步骤1-7的方法负载于纳米粒子或微米粒子中,制备核酸递送前体粒子。
步骤11,将步骤9得到的生物膜组分(含有被激活的抗原提呈细胞的生物膜组分,可同时含有癌细胞的生物膜组分和/或细菌的生物膜组分)与步骤10制备的负载核酸的核酸递送前体粒子共作用,制备得到内部负载核酸,表面负载被激活的抗原提呈细胞的膜组分和/或其分泌的细胞外囊泡的膜组分的纳米粒子或微米粒子。
在一些实施方案中,所述核酸递送递送粒子中,每1mg粒子材料负载0.1-500μg核酸。在一些实施方案中,所述核酸递送递送粒子还负载免疫增强佐剂,其中,每1mg粒子材料负载0.1-400μg免疫增强佐剂。在一些实施方案中,所述核酸递送递送粒子还负载带正电性分子,其中,每1mg粒子材料负载1-800μg带正电性分子。
步骤12,将步骤11所制备的粒子递送系统(疫苗系统)用于预防或者治疗癌症等疾病。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是,应当理解的是,详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出,因为在阅读该详细说明后,在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰,对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法,如无特殊说明均为常规技术方法,例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可通过正规商业渠道获得。
实施例1负载mRNA和抗原提呈细胞膜组分的纳米粒子被吞噬后体外表达效率
本实施例评价内部负载mRNA同时表面负载被激活的抗原提呈细胞的膜组分的核酸递送纳米粒子(也即,纳米疫苗)被细胞吞噬后所负载的核酸的表达效率。本实施例中,裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原,然后,以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料,以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的抗原递送纳米粒子,然后使用抗原递送纳米粒子激活抗原提呈细胞,并将抗原提呈细胞机械破坏后离心得到被激活的抗原提呈细胞的细胞膜组分。与此同时,将编码增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)的mRNA负载于核酸递送前体纳米粒子中。将前述被激活的抗原提呈细胞的膜组分与负载mRNA的核酸递送前体粒子共作用后,即得到内部负载核酸同时表面负载被激活的抗原提呈细胞的膜组分的核酸递送粒子,然后检测该核酸递送粒子系统被细胞吞噬后所负载的核酸表达高低。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次,并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后,将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原;在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备抗原递送纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)负载全细胞组分的抗原递送粒子(纳米粒子1)的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子1采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备,然后使用时一起使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa,所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在抗原递送纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂,然后将100mg抗原递送纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为240nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)免疫佐剂为0.02mg。
(3)负载EGFP-mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子2)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体纳米粒子2所负载的mRNA可以EGFP;核酸递送前体纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)和R8(RRRRRRRR)多肽。负载mRNA的核酸递送前体粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)和R8多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg。
(4)骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备BMDC。首先,取6-8周龄的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死,手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中,用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端,再用注射器抽取PBS溶液,针头分别从骨头两端插入骨髓腔,反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液,400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10% FBS)培养基终止裂解,400g离心3min,弃上清。将细胞放置在10mm培养皿中培养,使用RPMI 1640(10% FBS)完全培养基,同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL),在37℃,5% CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶,补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI 1640(10% FBS)培养基。第6天,对培养基进行半量换液处理。第7天,收集少量悬浮及半贴壁细胞,通过流式检测,当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20%之间,诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(5)抗原提呈细胞的激活
将负载来源于肿瘤组织的癌细胞全细胞组分的抗原递送纳米粒子1(250μg负载水溶性组分的纳米粒子+250μg负载非水溶性组分的纳米粒子)与BMDC(1000万个)在15mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有细胞因子组合1:IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)或者含有细胞因子组分2:IL-4(500U/mL)、IL-33(500U/mL)、IL10(500U/mL)。
(6)纳米疫苗的制备
收集步骤(4)制备的未经任何纳米粒子或微米粒子激活的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.40μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子3,也称为纳米疫苗3,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mgPLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。
或者通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分2的孵育后的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.40μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子4,也称为纳米疫苗4,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。
通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分1的孵育后的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.40μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子5,也称为纳米疫苗5,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。纳米疫苗5为制备好后立即测试或者在4℃储存18个月后测试。
(7)负载EGFP-mRNA的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)的制备
本实施例使用微流控法制备LNP。使用的脂质材料等的摩尔比如下:MC3:PEG2000:DSPC:胆固醇=50%:1.5%:10%:38.5%;所负载的mRNA同步骤(3)所负载的mRNA。先称取1mM各脂质成分即MC3(0.321mg)、PEG2000(0.037=mg)、DSPC(0.079mg)、Chol(0.148mg)一起混合后溶于0.586mL无水乙醇中。将0.107mg的EGFP mRNA溶于1mL pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液中。分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22μm滤膜过滤,然后将脂质-乙醇溶液吸入1mL注射器中,将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3mL注射器中(至少吸入1.5mL),并排出注射器中的空气,将注射器出口和样品导入管连接,并固定在微流控注射泵上。在微流控装置中设置好参数后点击运行(总流速2.4ml/min运行),观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200μL液体),用收集管收集流出的液体即为制备好的LNP。LNP粒径为95纳米,,表面电位为8mV,每1mg LNP负载mRNA为50μg。该LNP即为LNP疫苗,LNP疫苗现制现用。
(8)纳米疫苗递送核酸时的体外细胞表达效率
将抗原提呈细胞DC2.4细胞在RPMI完全培养基(含10%FBS)中以每孔10万个细胞密度接种于24孔板中,在37℃(5%CO2)培养过夜。在上述细胞中分别加入25ng游离EGFP-mRNA、或者0.5μg步骤(7)刚制备好的LNP疫苗、或者1.25μg步骤(6)制备的纳米疫苗(刚制备好的纳米疫苗3,刚制备好的纳米疫苗4,刚制备好的纳米疫苗5,或者已经长期储存的纳米疫苗5),尔后共孵育24h后。然后收集上述细胞并用流式细胞仪术分析含有EGFP荧光信号的细胞占所有细胞的比例以及EGFP阳性的细胞中的平均荧光信号强度(MFI)。
(9)实验结果
如图2所示,图2中Naked mRNA、LNP、Nanovaccine 3(Fresh)、Nanovaccine 4(Fresh)、Nanovaccine 5(Fresh)、Nanovaccine 5(Long term storage)依次对应裸mRNA、LNP疫苗、刚制备好的纳米疫苗3、刚制备好的纳米疫苗4、刚制备好的纳米疫苗5、已经长期储存的纳米疫苗5。结果显示,裸mRNA于细胞共孵育后细胞内的表达效率几乎为0。纳米疫苗5效果最好表达率最高,不管是冷冻干燥后短期储存的还是长期储存的纳米疫苗5,其效果均显著优于纳米疫苗3、纳米疫苗4和LNP疫苗;而且,纳米疫苗5制备好后长期储存不影响其功效。这说明:本公开所述纳米疫苗冷冻干燥后可以在4℃长期储存,不影响其功效;而且在激活抗原提呈细胞过程中加入细胞因子组合1效果优于细胞因子组分2;被负载癌细胞全细胞组分的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的核酸递送纳米粒子效果远好于未被激活的抗原提呈细胞制备的核酸递送纳米粒子。综上所述,本公开所述的核酸粒子递送系统可以非常高效的递送mRNA,而且粒子递送系统在冷冻干燥后可以在4℃长期储存。
实施例2负载mRNA和抗原提呈细胞膜组分的纳米粒子用于黑色素瘤的预防
本实施例以癌症模型来说明如何使用内部负载mRNA同时表面负载被激活的抗原提呈细胞的膜组分的核酸递送纳米粒子(纳米疫苗)预防疾病。本实施例中,裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原,然后,以PLGA为纳米粒骨架材料,以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的抗原递送纳米粒子系统,然后使用抗原递送纳米粒子激活抗原提呈细胞,并将抗原提呈细胞机械破坏后离心得到被激活的抗原提呈细胞的膜组分。与此同时,将编码四种黑色素瘤新抗原多肽的mRNA负载于纳米粒子中。将前述被激活的抗原提呈细胞的膜组分与负载mRNA的粒子共作用后,即得到内部负载核酸同时表面负载被激活的抗原提呈细胞的膜组分的核酸递送粒子,然后使用该纳米粒子预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次,并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后,将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原;在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)负载全细胞组分的抗原递送粒子(纳米粒子1)的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子1采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备,然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa,所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为240nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)免疫佐剂为0.02mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子2)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体纳米粒子2所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);核酸递送前体纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)和R8(RRRRRRRR)多肽。负载mRNA的核酸递送前体粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)和R8多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子2内部,然后将100mg PLGA纳米粒子2在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子2约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒2负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg。
(4)骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备BMDC。首先,取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死,手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中,用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端,再用注射器抽取PBS溶液,针头分别从骨头两端插入骨髓腔,反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液,400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10% FBS)培养基终止裂解,400g离心3min,弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养,使用RPMI 1640(10% FBS)完全培养基,同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL),在37℃和5% CO2中培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶,补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI 1640(10% FBS)培养基。第6天,对培养基进行半量换液处理。第7天,收集少量悬浮及半贴壁细胞,通过流式检测,当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20%之间,诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(5)抗原提呈细胞的激活
将负载来源于肿瘤组织的癌细胞全细胞组分的抗原递送纳米粒子1(250μg负载水溶性组分的纳米粒子+250μg负载非水溶性组分的纳米粒子)与BMDC(1000万个)在15mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有细胞因子组合1:IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)或者含有细胞因子组分2:IL-4(500U/mL)、IL-33(500U/mL)、IL10(500U/mL)。
(6)纳米疫苗的制备
收集步骤(4)制备的未经任何纳米粒子或微米粒子激活的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子3,也称为纳米疫苗3,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mgPLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。该纳米疫苗制备后直接使用。
或者通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分2的孵育后的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的的纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子4,也称为纳米疫苗4,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。该纳米疫苗制备后直接使用。
或者通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分1的孵育后的DC(1000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(3)制备的纳米粒子2共孵育10分钟,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用,即为核酸递送纳米粒子5,也称为纳米疫苗5,粒径为270nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载50μg细胞膜组分。该纳米疫苗制备后直接使用或者在4℃储存18个月后使用。
(7)负载mRNA的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)的制备
本实施例使用微流控法制备LNP。使用的脂质材料等的摩尔比如下:MC3:PEG2000:DSPC:胆固醇=50%:1.5%:10%:38.5%;所负载的mRNA同步骤(3)所负载的mRNA。先称取1mM各脂质成分即MC3(0.321mg)、PEG2000(0.037=mg)、DSPC(0.079mg)、Chol(0.148mg)一起混合后溶于0.586mL无水乙醇中。将mRNA溶于1mL pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液中。分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22μm滤膜过滤,然后将脂质-乙醇溶液吸入1mL注射器中,将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3mL注射器中(至少吸入1.5mL),并排出注射器中的空气,将注射器出口和样品导入管连接,并固定在微流控注射泵上。在微流控装置中设置好参数后点击运行,观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200μL液体),用收集管收集流出的液体即为制备好的LNP。LNP粒径为95纳米,表面电位为8mV,每1mg LNP负载mRNA为50μg。该LNP即为LNP疫苗,LNP疫苗现制现用。
(8)纳米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠,在小鼠接种肿瘤前第-35天,第-28天,第-21天,第-14天和第-7天分别在小鼠皮下接种1mg刚冷冻干燥后的纳米疫苗(纳米疫苗3,或者纳米疫苗4,或者纳米疫苗5)、或者接种1mg冷冻干燥后在4℃储存18个月的纳米疫苗5、或者接种0.5mg现制的LNP疫苗或者接种100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中,从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算,其中v为肿瘤体积,a为肿瘤长度,b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理,在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(9)纳米疫苗处理后小鼠体内癌细胞特异性T细胞含量的分析
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠,在小鼠接种肿瘤前第-35天,第-28天,第-21天,第-14天和第-7天分别在小鼠皮下接种1mg刚冷冻干燥后的纳米疫苗(纳米疫苗3,或者纳米疫苗4,或者纳米疫苗5)、或者接种1mg冷冻干燥后在4℃储存18个月的纳米疫苗3、或者接种0.5mg现制的LNP疫苗或者接种100μL PBS。在第0天处死小鼠,摘取小鼠脾细胞,制备小鼠脾细胞单细胞悬液,然后将200万个小鼠脾细胞与400μg抗原递送纳米粒子1(200μg负载水溶性的纳米粒子1+200μg负载非水溶性的纳米粒子1)+20μL步骤(1)制备的小鼠肿瘤组织裂解液(80mg/mL,其中水溶性组分和非水溶性组分等质量)的混合物在DMEM高糖完全培养基中在37℃(5%CO2)共孵育48小时。然后收集孵育后的细胞并用先使用带有荧光探针的抗小鼠CD3抗体、抗小鼠CD4抗体和抗小鼠CD8抗体标记小鼠细胞,然后使用2%多聚甲醛固定细胞后,使用破膜液对细胞破膜后使用带有荧光探针的IFN-γ抗体进行标记。尔后使用流式细胞术分析CD8+T细胞中CD8+IFN-γ+T细胞所占比例以及CD4+T细胞中CD4+IFN-γ+T细胞所占比例。抗原递送纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞膜表面,抗原提呈细胞制备的纳米粒子负载有上述降解提呈后的抗原表位,可以被癌细胞特异性T细胞识别并激活癌细胞特异性T细胞,被激活后分泌杀伤性细胞因子。IFN-γ是抗原特异性T细胞识别抗原后被激活所分泌的最主要的细胞因子。使用流式细胞术分析的CD8+IFN-γ+T细胞和CD4+IFN-γ+T细胞即为可以识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。
(10)实验结果
结果如图3所示,图3中PBS control、LNP vaccine、Nanovaccine 3(Fresh)、Nanovaccine4(Fresh)、Nanovaccine 5(Fresh)、Nanovaccine 5(Long term storage)依次为PBS对照组、LNP疫苗、刚制备好的纳米疫苗3、刚制备好的纳米疫苗4、刚制备好的纳米疫苗5、已经长期储存的纳米疫苗5。如图3a和b所示,PBS对照组的小鼠其肿瘤生长速度很快,生存期很短。接受几种疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢,小鼠生存期变长。其中,纳米疫苗5效果最好,不管是冷冻干燥后短期储存的还是长期储存的纳米疫苗5,其效果均显著优于纳米疫苗3、纳米疫苗4和LNP疫苗;而且,纳米疫苗5制备好后长期储存不影响其功效。这说明:本公开所述纳米疫苗冷冻干燥后可以在4℃长期储存,不影响其功效;而且在激活抗原提呈细胞过程中加入细胞因子组合1效果优于细胞因子组分2;被负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子效果远好于未被激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子。综上所述,本公开所述的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的预防效果。被负载癌细胞全细胞组分的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞会降解和提呈所吞噬纳米粒子负载的癌细胞全细胞组分中的全细胞抗原,被抗原提呈细胞提呈到细胞膜表面的癌细胞抗原表位已经与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合。将上述抗原提呈细胞经过机械破坏后,抗原提呈细胞的细胞膜组分中含有与MHC结合的抗原表位。通过离心和/或使用一定孔径的滤膜过滤后与纳米粒子或微米粒子共作用,上述抗原提呈细胞中的细胞膜组分会负载于纳米粒子或微米粒子表面,会形成新的纳米粒子或微米粒子,即为纳米疫苗或微米疫苗。上述方法制备的纳米疫苗或微米疫苗内部负载编码特定抗原的mRNA,同时表面负载了MHC分子和各类癌细胞抗原表位的复合物,因而其激活机体癌细胞特异性免疫反应的能力会更强也更广谱,因而预防或治疗癌症的效果也会更佳。
如图3c和d所示,与PBS对照组及LNP疫苗组相比,纳米疫苗可以激活更多的癌细胞特异性T细胞。纳米疫苗5效果激活的癌细胞特异性T细胞比例最高,不管是冷冻干燥后短期储存的还是长期储存的纳米疫苗5,其效果均显著优于纳米疫苗3、纳米疫苗4和LNP疫苗;而且,纳米疫苗5制备好后长期储存不影响其功效。该结果与疗效结果相一致,说明纳米疫苗通过激活更多的癌细胞特异性T细胞发挥作用。
实施例3纳米疫苗用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备成的负载mRNA的纳米粒子用于预防黑色素瘤。本实施例中,裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原,然后,以PLGA为纳米粒骨架材料,以poly(I:C)和CpG1018为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的抗原递送粒子系统,然后使用抗原递送粒子激活抗原提呈细胞,并将被激活的抗原提呈细胞的膜组分负载于核酸递送前体粒子表面,制备得到核酸递送粒子预防癌症。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次,并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后,将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原;在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:1混合后即为制备抗原递送纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)负载癌细胞全细胞组分的抗原递送粒子的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子及作为对照的空白纳米粒子和多肽纳米粒子采用溶剂挥发法制备。负载全细胞组分的抗原递送纳米粒子1制备材料PLGA分子量为7Da-17KDa,所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1018且佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为220nm左右;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分,每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG1018免疫佐剂各0.02mg。本实施例中,采用等质量负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)的多肽纳米粒子2作为对照纳米粒子使用,其制备材料和制备方法同纳米粒子1,对照纳米粒2的粒径为220nm左右,负载100μg多肽组分,负载等量佐剂。空白纳米粒3的制备材料和制备方法同纳米粒子1,粒径为220nm左右,只负载等量的免疫佐剂却不负载任何抗原组分。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子4)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体纳米粒子4所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)和带正电荷的蜂毒肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)。负载mRNA的粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)和蜂毒肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子4平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载10μgmRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为10μg,负载蜂毒肽20μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
采用骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和B细胞作为抗原提呈细胞。BMDC的制备同实施例1。B细胞提取流程如下:处死小鼠后摘取小鼠脾脏,然后制备小鼠脾细胞单细胞悬液,然后使用磁珠分选法从脾细胞单细胞悬液中分选出CD19+B细胞。将BMDC和B细胞按数量比1:1混合后作为混合抗原提呈细胞使用。
(5)抗原提呈细胞的激活
将抗原递送纳米粒子1(500μg)或多肽纳米粒子2(500μg)或空白纳米粒3(500μg)+游离裂解液与2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)在15mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有细胞因子组合:IL-15(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-21(1000U/mL)。
或者抗原递送纳米粒子1与2000万个BMDC在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有细胞因子组合:IL-15(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-21(1000U/mL)。
(6)基于抗原提呈细胞的纳米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤,收集所得滤液后与相对应的步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子4(50mg)共孵育10分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,将挤出液并在15000g离心60分钟,弃去上清后使用生理盐水重悬所得沉淀即为纳米粒子。其中,使用空白纳米粒子3激活的混合抗原提呈细胞膜组分与核酸递送前体纳米粒子4共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗7,粒径为220nm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为10μg,负载蜂毒肽20μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。使用多肽纳米粒子2激活的混合抗原提呈细胞膜组分与核酸递送前体纳米粒子4共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗6,粒径为220nm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为10μg,负载蜂毒肽20μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。使用纳米粒子1激活的混合抗原提呈细胞膜组分与核酸递送前体纳米粒子4共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗5,粒径为220nm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为10μg,负载蜂毒肽20μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。
或者通过在400g离心5分钟收集与抗原递送纳米粒子1孵育后的2000万个BMDC,然后使用生理盐水洗涤BMDC两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤,收集所得滤液后与步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子4(50mg)共孵育10分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,将挤出液并在15000g离心60分钟,弃去上清后使用含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。即为纳米疫苗8,粒径为220nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载10μgmRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)免疫佐剂为10μg,负载蜂毒肽20μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。
(7)纳米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠,在小鼠接种肿瘤前第-35天,第-28天,第-21天,第-14天和第-7天分别在小鼠皮下接种1mg纳米疫苗(纳米疫苗5,或者纳米疫苗6,或者纳米疫苗7,或者纳米疫苗8,或者纳米粒子4)或者100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中,从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算,其中v为肿瘤体积,a为肿瘤长度,b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理,在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(8)实验结果
如图4所示,图4中PBS control、Nanovaccine 4、Nanovaccine 5、Nanovaccine 6、Nanovaccine 7、Nanovaccine 8依次为PBS对照组、纳米疫苗4、纳米疫苗5、纳米疫苗6、纳米疫苗7、纳米疫苗8。结果显示,PBS对照组小鼠肿瘤生长速度都很快,小鼠生存期很短。与对照组相比,疫苗组小鼠的肿瘤生长速度都明显变慢,而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。其中,纳米疫苗5效果最好,纳米疫苗5明显好于纳米疫苗6、纳米疫苗7和纳米疫苗8;而且纳米疫苗5、纳米疫苗6和纳米疫苗8的效果都明显好于纳米粒子4。这说明,抗原提呈细胞膜组分的负载有利于提高纳米疫苗的效果;而且,使用负载癌细胞全细胞抗原的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体粒子共作用制备的纳米疫苗效果更佳;而且使用DC和B细胞的混合抗原提呈细胞效果好于使用单一抗原提呈细胞DC。
实施例4疫苗用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分负载于负载核酸的纳米粒子表面作为纳米疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中,首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以制备肿瘤组织和癌细胞的水溶性抗原混合物(质量比1:1)和非水溶性抗原混合物(质量比1:1),并将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。然后,以PLGA为纳米粒骨架材料,以Poly(I:C)、CpG7909和CpG2006为佐剂制备负载裂解物组分的抗原递送纳米粒子,然后将抗原递送纳米粒子与抗原提呈细胞共孵育一段时间后激活抗原提呈细胞,并将抗原提呈细胞的膜组分负载于已经内部负载核酸的核酸递送前体纳米粒子表面后制备成纳米疫苗,用于治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织,将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次,并可伴有超声以破坏裂解所得样品;收集培养的B16F10癌细胞系时,先离心去除培养基后使用PBS洗涤两次并离心收集癌细胞,将癌细胞在超纯水中重悬,反复冻融3次,并伴有超声破坏裂解癌细胞。待肿瘤组织或癌细胞裂解后,将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原;在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将肿瘤组织的水溶性抗原和癌细胞的水溶性抗原按质量比1:1混合;肿瘤组织的非水溶性抗原和癌细胞的非水溶性抗原按质量比1:1混合。将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合,即为制备纳米粒子的抗原组分。
(2)细菌细胞外囊泡(OMV)和癌细胞外囊泡的制备
将长双歧杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,在4℃下使用20W超声处理5分钟,然后在16000g离心90分钟,将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分,然后使用8M尿素水溶液裂解和溶解细菌外囊泡膜组分。
或者将长双歧杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,在4℃下使用20W超声处理5分钟,然后在16000g离心90分钟,将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分,然后使用吐温80水溶液裂解和溶解细菌膜组分。
(3)抗原递送粒子的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子1采用复乳法制备,制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa,所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG7909和CpG2006且负载于纳米粒子内。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子1平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子1约负载130μg蛋白质或多肽组分,每1mg PLGA纳米粒子1所负载的poly(I:C)、CpG7909和CpG2006免疫佐剂各0.005mg。
本实施例中抗原递送纳米粒子2制备材料和方法同纳米粒子1。纳米粒子2内部同时负载步骤(1)所制备的抗原组分和步骤(2)所制备的8M尿素溶解的细菌外囊泡膜组分,且二者质量比为1:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG7909和CpG2006且负载于纳米粒子内。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载肿瘤组织抗原组分、细菌外囊泡组分和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子2平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子2约负载130μg蛋白质或多肽组分,每1mg PLGA纳米粒2所负载的poly(I:C)、CpG7909和CpG2006免疫佐剂各0.005mg。
本实施例中纳米粒子3制备材料和制备方法同纳米粒1。纳米粒子3内部同时负载步骤(1)所制备的抗原组分和步骤(2)所制备的吐温80溶解的细菌外囊泡膜组分,且二者质量比为1:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG7909和CpG2006且负载于纳米粒子内。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负肿瘤组织载裂解液组分、细菌外囊泡组分和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子3平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子3约负载30μg蛋白质或多肽组分,每1mg PLGA纳米粒3所负载的poly(I:C)、CpG7909和CpG2006免疫佐剂各0.005mg。
空白纳米粒子4的制备材料和制备方法同纳米粒子1,但是空白纳米粒子4只负载等量的佐剂而不负载任何的肿瘤组织裂解物中的抗原组分。纳米粒子4的粒径为250nm左右。
(4)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子5)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体纳米粒子5所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、CpG7909、CpG1018和蜂毒肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)。负载mRNA的粒子的制备材料和制备方法同步骤(3),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG1018、CpG7909和蜂毒肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子5平均粒径为210nm左右,每1mgPLGA纳米粒子约负载2μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各5μg,负载蜂毒肽40μg。
(5)B细胞的分离
处死C57BL/6小鼠后摘取小鼠脾脏,制备小鼠脾细胞单细胞悬液,使用磁珠分选法分离脾细胞中的CD19+B细胞。
(6)抗原提呈细胞的激活
将500μg的抗原递送纳米粒子1,或者500μg的抗原递送纳米粒子2,或者500μg的抗原递送纳米粒子3,或者500μg的纳米粒子4+等量的癌细胞裂解物组分和尿素溶解的细菌组分分别与B细胞(1000万个)在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2),孵育体系中含IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(7)纳米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的B细胞(1000万个),然后使用PBS洗涤细胞三遍,将细胞重悬在PBS水中后在低功率(10W)超声15分钟。然后将样品在500g离心5分钟并收集上清液,将上清液依次过孔径为30um、10um、5um、0.45um、0.22um的膜过滤后,将所得滤液样品在18000g离心60分钟后弃去上清液并将沉淀使用PBS重悬后与核酸递送前体纳米粒子5共孵育2分钟后超声1分钟,然后使用0.22um的滤膜反复共挤出,然后将挤出液在13000g离心30分钟,并使用10mL含2%蔗糖和2%甘露醇的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。其中,使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子5共作用后制备的纳米粒子为纳米疫苗6,粒径为220纳米,表面电位为-10mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μgmRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各5μg,负载蜂毒肽40μg;每1mgPLGA纳米粒子约负载40μg细胞膜组分。使用纳米粒子2激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子5共作用后制备的纳米粒子为纳米疫苗7,粒径为220纳米,表面电位为-10mV;每1mgPLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各5μg,负载蜂毒肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载40μg细胞膜组分。使用纳米粒子3激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子5共作用后制备的纳米粒子为纳米疫苗8,粒径为220纳米,表面电位为-10mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各5μg,负载蜂毒肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载40μg细胞膜组分。使用纳米粒子4激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子5共作用后制备的纳米粒子为纳米疫苗9,粒径为220纳米,表面电位为-10mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各5μg,负载蜂毒肽40μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载40μg细胞膜组分。
(8)疫苗用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射1mg的纳米疫苗(疫苗6,或者疫苗7,或者疫苗8,或者疫苗9)或者皮下注射100μL PBS。在实验中,从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算,其中v为肿瘤体积,a为肿瘤长度,b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理,在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(9)实验结果
图5中PBS control、Nanovaccine 6、Nanovaccine 7、Nanovaccine 8、Nanovaccine 9依次为PBS对照组、纳米疫苗6、纳米疫苗7、纳米疫苗8、纳米疫苗9。结果显示,如图5中a和b所示,PBS对照组小鼠的肿瘤生长速度很快,生存期很短。而几种纳米疫苗处理的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢,而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。而且,纳米疫苗7的效果优于纳米疫苗6、纳米疫苗8和纳米疫苗9,这说明使用适当方法裂解和溶解的细菌外囊泡组分负载到纳米粒子后所激活的抗原提呈细胞的膜组分负载到本公开所述粒子疫苗表面后有利于提高疫苗效果。综上所述,本公开所述的疫苗对癌症具有优异的治疗效果。
实施例5疫苗用于治疗癌症
本实施例中,首先使用6M盐酸胍裂解B16F10黑色素瘤癌细胞全细胞抗原。然后,以PLGA为微米粒骨架材料,以CpG BW006(B类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的抗原递送微米粒子系统。使用抗原递送微米粒子激活抗原提呈细胞后,将抗原提呈细胞的膜组分负载于负载核酸的核酸递送前体纳米粒子表面制备得到纳米疫苗用于治疗癌症。
(1)癌细胞的裂解
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系收集后在350g离心5分钟,然后弃去上清并用PBS洗涤两遍,然后采用6M盐酸胍重悬和裂解癌细胞,癌细胞全细胞抗原裂解并溶于6M盐酸胍后即为制备抗原递送微米粒子系统的抗原原料来源。
(2)抗原递送粒子(微米粒子)的制备
本实施例中抗原递送微米粒子采用复乳法制备。所采用的微米粒子1制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa,所采用的免疫佐剂为CpG BW006、CpG 2216和Poly ICLC。PolyICLC是toll样受体3激动剂,而各类CpG是Toll样受体9激动剂,而Toll样受体3和Toll样受体9均位于细胞内的内吞体膜结构中。首先将裂解物组分和免疫佐剂共负载于微米粒子内,然后在10000g离心15分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h;在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL癌细胞裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min,得到内外都负载裂解物的微米粒子1。该微米粒子平均粒径为2.50μm左右,表面电位为-22mV左右;每1mg PLGA微米粒子1约负载140μg蛋白质或多肽组分,负载的CpG BW006(B类)、CpG 2216(A类)和Poly ICLC各0.02mg。
微米粒子2制备材料和制备方法相同,负载的免疫佐剂为CpG2336(A类)、CpG 2216(A类)和Poly ICLC。对照微米粒子2粒径为2.50μm左右,表面电位为-22mV左右,每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLGA微米粒所负载的CpG2336(A类)、CpG2216(A类)和Poly ICLC免疫佐剂各为0.02mg。
微米粒子3制备材料和制备方法相同,负载的免疫佐剂为CpG BW006(B类)和CpG2216(A类)。对照微米粒子3每1mgPLGA微米粒所使用的佐剂为0.02mg,粒径为2.50μm左右,表面电位为-22mV左右,每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLGA微米粒所负载的CpG BW006(B类)和CpG 2216(A类)各0.03mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子1)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体纳米粒子1所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);纳米粒子同时负载有免疫佐剂CpG2395、CpG1018、poly(I:C)和带正电荷的多肽蜂毒肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ)。负载mRNA的PLGA纳米粒子的制备材料和制备方法同实施例3,首先将mRNA、poly(I:C)、CpG2395、CpG1018和蜂毒肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载1μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各2μg,负载聚精氨酸10μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
处死小鼠后收集小鼠淋巴结和脾脏,将小鼠淋巴结或者脾脏切碎研磨分别通过细胞筛网过滤制备单细胞悬液,将淋巴结单细胞悬液和脾脏单细胞悬液混合后,使用流式细胞术从中分选出CD19+B细胞和CD11c+的DC,将B细胞和DC按数量比1:1混合后作为混合抗原提呈细胞使用。
(5)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的抗原递送微米粒子(100μg)与步骤(4)制备的混合抗原提呈细胞(2000万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2),孵育体系中含有GM-CSF(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-15(200U/mL)和CD86抗体(10ng/mL)。
(6)抗原提呈细胞来源的核酸递送纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(22.5W)超声1分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液,然后在16000g离心90分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子1混合后共孵育10分钟,然后使用0.22um的滤膜反复共挤出,然后将挤在在13000g离心30分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。使用微米粒子1激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子1共作用得到的纳米粒子为纳米疫苗2,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载1μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各2μg,负载聚精氨酸10μg;每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg细胞膜组分。使用微米粒子2激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子1共作用得到的纳米粒子为纳米疫苗3,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载1μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各2μg,负载聚精氨酸10μg,每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg细胞膜组分。使用微米粒子3激活的抗原提呈细胞的膜组分与纳米粒子1共作用得到的纳米粒子为纳米疫苗4,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA纳米粒子约负载1μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各2μg,负载聚精氨酸10μg,每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg细胞膜组分。
(7)纳米疫苗癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射0.8mg的纳米疫苗(纳米疫苗2,或者纳米疫苗3,或者纳米疫苗4)或者皮下注射100μL PBS。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
图6中PBS control、Nanovaccine 2、Nanovaccine 3、Nanovaccine 4依次为PBS对照组、纳米疫苗2、纳米疫苗3、纳米疫苗4。结果显示,如图6所示,对照组小鼠的肿瘤都长大,而纳米疫苗处理小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且,负载CpG佐剂和Poly ICLC混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的纳米疫苗效果优于负载两种CpG混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的疫苗。而且,负载一种B类CpG、一种A类CpG和Poly ICLC混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的纳米疫苗效果好于使用负载两种A类CpG和PolyICLC混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞和负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的纳米疫苗。这说明负载两种不同toll样受体的混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体粒子共作用制备的粒子疫苗效果更好,而且,含有B类CpG的混合CpG与Toll样受体3激动剂作为混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体粒子共作用制备的核酸递送粒子疫苗效果更好。
实施例6疫苗用于癌症的预防
本实施例中,首先使用8M尿素裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织,并溶解肿瘤组织裂解物组分。然后,以PLGA为微米粒骨架材料,以Poly(I:C)、CpG2006(B类)和CpGSL01(B类)为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的抗原递送微米粒子,使用抗原递送微米粒子激活抗原提呈细胞后将被激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体微米粒子共作用制备核酸递送微米疫苗用于预防癌症。
(1)肿瘤组织的收集及裂解
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入适量8M尿素裂解细胞,并溶解全细胞裂解物,使用蛋白质提取分离技术从全细胞裂解物中分离提取出总蛋白。分离提取得到的总蛋白即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)抗原递送粒子(微米粒子)的制备
本实施例中抗原递送微米粒子采用溶剂挥发法制备。微米粒子1所采用的制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa,所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)、CpG2006和CpGSL01,且裂解物抗原组分和佐剂负载于微米粒子内部。制备方法如前所述,在微米粒子内部负载裂解物抗原组分和佐剂后,将100mg微米粒子在12000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h,得冻干粉后备用。该微米粒子平均粒径为1.0μm左右,微米粒子表面电位为-13mV左右;每1mg PLGA微米粒子约负载80μg蛋白质或多肽组分,每1mg PLGA微米粒负载Poly(I:C)、CpG2006和CpGSL01各0.02mg。
抗原递送微米粒2子制备材料和制备方法同上,粒径为1.0μm左右,负载等量的裂解物抗原组分,负载免疫佐剂为Poly(I:C),每1mg PLGA负载Poly(I:C)0.06mg。
抗原递送微米粒子3粒径为1.0μm左右,负载等量的裂解物抗原组分,负载免疫佐剂为Poly(I:C)、CpG1585(A类)和CpG2216(A类),每1mg PLGA负载Poly(I:C)、CpG1585(A类)和CpG2216(A类)各0.02mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(微米粒子4)的制备
本实施例中负载mRNA的核酸递送前体微米粒子4所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);微米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、CpG(B类和C类混合CpG)和RALA多肽(WEARLARALARALARHLARALARALRACEA)。负载mRNA的微米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpGSL03(C类)、CpG1018(B类)和RALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLGA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米粒子4平均粒径为1.0μm左右,每1mg PLGA微米粒子约负载5μg mRNA组分,每1mgPLGA微米粒子负载poly(I:C)、CpG SL03和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载RALA多肽200μg。
(3)DC和B细胞的制备
处死C57BL/6后摘取小鼠淋巴结,制备小鼠淋巴结单细胞悬液,然后使用流式细胞术从淋巴结细胞单细胞悬液中分选出CD11c+DC和CD19+B细胞。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的抗原递送微米粒子1(800μg)、抗原递送微米粒子2(800μg)或抗原递送微米粒子3(800μg)与DC(500万个)和B细胞(500万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有GM-CSF(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的核酸递送微米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃使用匀浆机在2000rpm搅拌破坏处理25分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液,然后在15000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与步骤(3)制备的纳米粒子1混合后共孵育10分钟,然后使用2μm的滤膜反复共挤出,然后将挤在在13000g离心30分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。其中,由抗原递送微米粒子1激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体微米粒子4共作用后所制备的核酸递送微米粒子为微米疫苗5,粒径为1.1μm,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载5μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG SL03和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载RALA多肽200μg;每1mg PLGA约负载80μg细胞膜组分。由抗原递送微米粒子2激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体微米粒子4共作用后所制备的核酸递送微米粒子为微米疫苗6,粒径为1.1μm,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载5μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG SL03和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载RALA多肽200μg;每1mg PLGA约负载80μg细胞膜组分。由抗原递送微米粒子3激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体微米粒子4共作用后所制备的核酸递送微米粒子为微米疫苗7,粒径为1.1μm,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载5μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG SL03和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载RALA多肽200μg;每1mg PLGA约负载80μg细胞膜组分。
(7)微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠,在小鼠接种肿瘤前第-35天,第-28天,第-21天,第-14天和第-7天分别在小鼠皮下接种1mg刚冷冻干燥后的微米疫苗(微米疫苗5,或者微米疫苗6,或者微米疫苗7)、或者接种100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
图7中PBS control、Microvaccine 5、Microvaccine 6、Microvaccine 7依次为PBS对照组、微米疫苗5、微米疫苗6、微米疫苗7。结果显示,如图7所示,PBS对照组小鼠的肿瘤都很快长大,而微米疫苗处理组的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢,且大部分小鼠癌细胞接种后肿瘤消失。而且,负载两种B类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体微米粒子共作用后所制备的微米疫苗效果好于负载两种A类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的抗原递送微米粒子或者只负载Poly(I:C)作为佐剂的抗原递送微米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体微米粒子共作用后所制备的微米疫苗。
实施例7疫苗用于治疗T淋巴瘤
本实施例以E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的纳米粒子共作用后制备的纳米疫苗用于治疗T淋巴瘤。首先裂解E.G7-OVA细胞并使用蛋白酶在体外先降解裂解物为多肽。在实际应用中也可以使用其它酶或者其它方法先将全细胞组分中的蛋白质降解为多肽。然后再分别制备水溶性组分和非水溶性组分,并按质量比1:1混合。然后,以PLA为纳米粒骨架材料,以CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和Poly ICLC为免疫佐剂制备抗原递送纳米粒子,并用该抗原递送纳米粒子体外激活抗原提呈细胞,然后将激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备纳米疫苗。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
将培养的E.G7-OVA细胞系收集后在350g离心5分钟,然后弃去上清并用PBS洗涤两遍,然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次,并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后,加入胰蛋白酶(Trypsin,0.5mg/mL)和糜蛋白酶(Chymotrypsin,0.5mg/mL)共孵育30分钟,然后在95℃加热10分钟灭活蛋白酶备用。然后将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分;在所得沉淀部分中加入10%脱氧胆酸钠(含1M精氨酸)水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在10%脱氧胆酸钠(含1M精氨酸)水溶液中可溶。然后将水溶性抗原和非水溶性抗原按照质量比1:1混合,该混合物为制备纳米粒子的原料来源。
(2)卡介苗(BCG)的裂解和溶解
收集BCG,使用10%脱氧胆酸钠(含1M精氨酸)水溶液裂解BCG后使用10%脱氧胆酸钠(含1M精氨酸)水溶液溶解裂解组分备用。
(3)抗原递送粒子(纳米粒子)的制备
本实施例中纳米粒子1采用溶剂挥发法制备。抗原递送纳米粒子1制备材料PLA分子量为20KDa,纳米粒子内部负载癌细胞裂解物、细菌裂解物以及免疫佐剂,表面负载癌细胞裂解物组分。所采用的免疫佐剂为CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和poly ICLC,且佐剂负载于纳米粒子内部,制备纳米粒子时使用的癌细胞裂解物组分与细菌裂解物组分的质量比为1:1。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载癌细胞裂解物抗原、细菌裂解物组分和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mL PBS中,并于0.1mL含有癌细胞裂解物抗原组分(80mg/mL)的样品室温混合孵育5分钟后即可使用。纳米粒子1平均粒径为400nm左右,每1mg PLA纳米粒子1约负载400μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLA纳米粒负载CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和Poly ICLC免疫佐剂各0.005mg。
抗原递送纳米粒子2制备材料和制备方法纳米粒子1,粒径为400nm左右,每1mgPLA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分,每1mgPLA负载CpG1585(A类)、CpG2336(A类)和Poly ICLC各0.005mg。
(4)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子3)的制备
本实施例中负载mRNA的纳米粒子3所负载的mRNA可以编码OVA抗原;纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly ICLC、CpG、精氨酸和赖氨酸。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(3),首先将mRNA、poly ICLC、CpG2395(C类)、CpG7909(B类)、精氨酸和赖氨酸在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子3平均粒径为380nm左右,每1mg PLA纳米粒子约负载40μg mRNA组分,每1mgPLA纳米粒子负载poly ICLC、CpG2395和CpG7909免疫佐剂各5μg,负载精氨酸和赖氨酸各180μg。
(5)抗原提呈细胞的制备
处死C57BL/6后收集小鼠外周血,从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC),然后使用流式细胞术从PBMC中分选出CD19+B细胞。本实施例中同时使用BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例1。BMDM制备方法如下:将C57小鼠麻醉后脱臼处死,将小鼠使用75%乙醇的消毒,然后用剪刀在小鼠背部剪开一小口,用手直接撕开皮肤至小鼠小腿关节处,去除小鼠足关节以及皮肤。用剪刀沿着小鼠大腿根部大转子将后肢拆下来,去掉肌肉组织后放置在含有75%乙醇的培养皿内浸泡5min,更换新的75%乙醇的培养皿移入超净台中。将乙醇浸泡的腿骨移入冷的PBS浸泡,洗去胫骨、股骨表面的乙醇,此过程可重复3次。将清洗好的股骨、胫骨分开,并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断,使用1mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出,反复吹洗3次,直至腿骨内看不到明显的红色为止。用5mL移液枪将含有骨髓细胞的培养基反复吹打,使细胞团块分散,然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛,转移至15mL离心管内,1500rpm/min离心5min,弃上清,加入红细胞裂解液重悬静置5min后1500rpm/min离心5min,弃上清用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基(含有15%L929培养基的DMEM高糖培养基)重悬,铺板。将细胞培养过夜,以去除贴壁较快的其他杂细胞如纤维细胞等等。收集未贴壁细胞按实验设计安排种入皿或细胞培养板内。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)以40ng/mL浓度刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化。培养8天,光镜下观察巨噬细胞形态变化。8天后消化收集细胞,用抗小鼠F4/80抗体和抗小鼠CD11b抗体,4℃避光孵育30min后,使用流式细胞术鉴定所诱导成功的巨噬细胞的比例即可。
(6)抗原提呈细胞的激活
将抗原递送纳米粒子1(1000μg)与BMDC(3000万个)在RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
或者将抗原递送纳米粒子1(1000μg)与BMDC(1000万个)、BMDM(1000万个)、B细胞(1000万个)在20mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2),孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
或者将抗原递送纳米粒子2(1000μg)与BMDC(1000万个)、BMDM(1000万个)、B细胞(1000万个)在20mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2),孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(7)基于抗原提呈细胞的纳米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集与抗原递送纳米粒子1孵育后的BMDC(3000万个),然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在高压均质机中(5000bar)中处理5分钟。然后将样品在2000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液,将上清液与50mg步骤(4)所制备的核酸递送前体纳米粒子3在4℃共孵育1小时,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在13000g离心20分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在4%海藻糖水溶液中重悬冷冻干燥48小时后即得纳米疫苗4,粒径为400纳米,表面电位为-7mV,每1mg PLA约负载40μg mRNA组分,每1mgPLA负载Poly ICLC、CpG2395和CpG7909免疫佐剂各5μg,负载精氨酸和赖氨酸各180μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。在室温储存12个月后使用。
或者通过在400g离心5分钟收集与抗原递送纳米粒子孵育后BMDC(1000万个)、B细胞(1000万个)及BMDM(1000万个),然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在高压均质机中(5000bar)中处理5分钟。然后将样品在2000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液,将上清液与步骤(4)所制备的核酸递送前体纳米粒子3(50mg)在4℃共孵育1小时,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在13000g离心20分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在4%海藻糖水溶液中重悬冷冻干燥48小时后即得纳米疫苗。其中,使用抗原递送纳米粒子1激活的混合抗原提呈细胞与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗5,粒径为400纳米,表面电位为-7mV,每1mg PLA约负载40μg mRNA组分,每1mgPLGA负载Poly ICLC、CpG2395和CpG7909免疫佐剂各5μg,负载精氨酸和赖氨酸各180μg;每1mg PLA约负载280μg膜组分;制备好后立即使用或者在室温储存12个月后使用;使用抗原递送纳米粒子2激活的混合抗原提呈细胞与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗6,粒径为400纳米,表面电位为-7mV,每1mg PLGA约负载40μg mRNA组分,每1mgPLA负载Poly ICLC、CpG2395和CpG7909免疫佐剂各5μg,负载精氨酸和赖氨酸各180μg;每1mg PLA约负载280μg膜组分;在室温储存12个月后使用。
(8)纳米疫苗用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞,在第5、第8天、第13天和第20天分别给小鼠注射100μLPBS或者1mg的纳米疫苗(刚制备好的纳米疫苗5,或者储存12个月后的纳米疫苗4,或者储存12个月后的纳米疫苗5,或者储存12个月后的纳米疫苗6)。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(9)实验结果
图8中PBS control、Nanovaccine 4(Long term storage)、Nanovaccine 5(Longterm storage)、Nanovaccine 6(Long term storage)、Nanovaccine 5(Fresh)依次为PBS对照组、长期储存的纳米疫苗4、长期储存的纳米疫苗5、长期储存的纳米疫苗6、刚制备好的纳米疫苗5。结果显示,如图8所示,PBS对照组的小鼠的肿瘤都生长很快小鼠生存期很短。与对照组相比,几种纳米疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且,使用两种C类CpG与Poly ICLC作为混合佐剂的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的纳米疫苗5效果好于两种A类CpG与PolyICLC作为混合佐剂的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用制备的纳米疫苗6;而且,使用混合抗原提呈细胞的膜组分的纳米疫苗5效果好于使用单一抗原提呈细胞的膜组分的纳米疫苗4。而且,上述纳米疫苗在室温储存12个月后效果与刚制备好后相同,说明上述纳米疫苗稳定性良好。
实施例8疫苗用于黑色素瘤的治疗
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织,将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网后制备单细胞悬液,加入超纯水后反复冻融并伴有超声裂解上述细胞,然后加入核酸酶(0.5mg/mL)作用15分钟,再在95℃作用10分钟灭活核酸酶。尔后在8000g离心3分钟,上清液部分即为水溶性抗原;沉淀部分使用8M尿素(含200mM氯化钠)水溶液溶解非水溶性抗原。将水溶性抗原和8M尿素(含200mM氯化钠)溶解后的非水溶性抗原按质量比1:1混溶即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)抗原递送粒子(纳米粒子)的制备
本实施例中抗原递送纳米粒采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料为PLGA分子量为24KDa-38KDa。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2216,增加溶酶体免疫逃逸的物质为KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA),且佐剂、KALA多肽包载于纳米粒子内。制备方法如前所述,在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分、佐剂、KALA多肽,在内部负载上述组分后将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为250nm左右,表面电位为-5mV左右;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分,每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG1018和CpG2216免疫佐剂各0.04mg,负载KALA多肽0.3mg。
抗原递送纳米粒子2的制备材料和方法相同,其粒径为250nm左右,表面电位为-5mV左右,不负载KALA多肽,负载等量佐剂和细胞裂解抗原组分。
抗原递送纳米粒子3的制备材料和制备方法相同,为250nm左右,表面电位为-5mV左右;每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分,每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)0.04mg,负载CpG1018为0.08mg,负载KALA多肽0.3mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子4)的制备
本实施例中负载mRNA的纳米粒子4所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、CpG和促进溶酶体逃逸的物质KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG7909、CpGBW2006和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子4平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG7909、CpGBW2006免疫佐剂各1μg,负载KALA多肽400μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和BMDM作为混合抗原提呈细胞。BMDC和BMDM制备方法同上。
(5)抗原提呈细胞的激活
将1000μg抗原递送纳米粒子(纳米粒子1,或者纳米粒子2,或者纳米粒子3)与BMDC(1000万个)和BMDM(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有GM-CSF(200U/mL)、M-CSF(200U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(6)基于抗原提呈细胞的纳米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的BMDC和BMDM,然后使用含有0.0759M蔗糖和0.225M甘露醇的30mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液中1200rpm 3min离心清洗三次,然后在磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的存在下超声机械破坏抗原提呈细胞。经过离心后所获细胞膜用10mM pH 7.5的Tris-HCl和1mM EDTA的溶液清洗。然后将样品依次过孔径为30μm、10μm、5μm、2μm、0.45μm的膜过滤后,将滤液在12000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与核酸递送前体纳米粒子4在室温共孵育15分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心30分钟后弃去上清液,将沉淀在含有的4%甘露醇的生理盐水中重悬后冷冻干燥,即得核酸递送纳米疫苗。其中,使用抗原递送纳米粒子1激活的抗原提呈细胞与核酸递送前体纳米粒子4共作用所制备的核酸递送纳米粒子为纳米疫苗5,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909、CpGBW2006免疫佐剂各1μg,负载KALA多肽400μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。使用抗原递送纳米粒子2激活的抗原提呈细胞与核酸递送前体纳米粒子4共作用所制备的核酸递送纳米粒子为纳米疫苗6,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909、CpGBW2006免疫佐剂各1μg,负载KALA多肽400μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。使用抗原递送纳米粒子3激活的抗原提呈细胞与核酸递送前体纳米粒子4共作用所制备的核酸递送纳米粒子为纳米疫苗7,粒径为220纳米,表面电位为-7mV;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909、CpGBW2006免疫佐剂各1μg,负载KALA多肽400μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。
(7)纳米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射100μL PBS或者0.8mg相应的纳米疫苗。在实验中,小鼠肿瘤体积和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图9所示,图9中PBS control、Nanovaccine 5、Nanovaccine 6、Nanovaccine 7依次为PBS对照组、纳米疫苗5、纳米疫苗6、纳米疫苗7。结果显示,PBS对照组的肿瘤很快都长大。与对照组相比,纳米疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢生存期明显延长。而且,加入促进溶酶体逃逸物质的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备的纳米疫苗5效果好于未加入溶酶体逃逸的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备的纳米疫苗6;使用两种CpG和Poly(I:C)作为混合佐剂的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备的纳米疫苗5治疗效果好于只使用一种CpG和Poly(I:C)混合佐剂的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备的纳米疫苗7。这说明溶酶体逃逸物质的加入以及混合佐剂的使用都有利于提高纳米疫苗的疗效。综上所述,本公开所述的纳米疫苗对癌症具有良好的治疗效果。
实施例9微米疫苗用于癌症的预防
(1)癌细胞及细菌外囊泡组分的制备
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟,然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理,然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分,即为制备抗原递送微米粒子系统的抗原组分。
将嗜酸乳杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,然后在16000g离心90分钟,弃去上清液后所得沉淀即为细菌外囊泡组分,将沉淀使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解后溶解细菌外囊泡组分。
(2)抗原递送粒子(微米粒子)的制备
本实施例中制备抗原递送微米粒子采用复乳法。微米粒子1骨架材料为PLA,PLA分子量为40KDa。所采用的免疫佐剂为CpG2006(B类)、CpG2216(A类)和Poly ICLC,所采用的带正电荷物质为精氨酸和聚组氨酸。微米粒子制备时所使用的癌细胞裂解物组分和细菌外囊泡组分质量比为1:1。制备时先采用复乳法制备内部负载癌细胞裂解物抗原组分、细菌外囊泡组分、佐剂、精氨酸和聚组氨酸的抗原递送微米粒子,尔后,将100mg微米粒子在9000g离心20分钟,使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后即得抗原递送微米粒子1,平均粒径为4.98μm左右,每1mg PLGA微米粒子1约负载100μg蛋白质或多肽组分,负载CpG2006,CpG2216和Poly ICLC各0.07mg,负载精氨酸和聚组氨酸各0.05mg。
抗原递送微米粒子2制备材料和制备方法同微米粒子1,粒径为4.98μm左右,负载等量精氨酸、聚组氨酸和等量的癌细胞裂解物组分和细菌外囊泡组分,但是不负载任何佐剂。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(微米粒子3)的制备
本实施例中负载mRNA的微米粒子3所负载的mRNA可以编码OVA抗原;微米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种CpG(B类和C类)和聚组氨酸。负载mRNA的微米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG2395(C类)、CpG1018(B类)和聚组氨酸在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。微米粒子3平均粒径为4.95μm左右,每1mg PLA微米粒子约负载100μgmRNA组分,每1mgPLGA微米粒子负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各60μg,负载聚组氨酸250μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC、B细胞以及BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC及BMDM制备方法同上。B细胞来自小鼠外周血PBMC,制备方法同上。将BMDC、B细胞和BMDM按数量比2:1:1混和后即为混合抗原提呈细胞。
(5)抗原提呈细胞的激活
将1000μg的抗原递送微米粒子1或抗原递送微米粒子2分别与4000万个混合抗原提呈细胞(含2000万个BMDC,1000万个B细胞及1000万个BMDM)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)、和CD40抗体(20mg/mL)。
(6)抗原提呈细胞来源的核酸疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的4000万个混合抗原提呈细胞(微米粒子1或者微米粒子2激活),然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的微米粒子3共孵育10分钟后,使用5μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗。其中,使用微米粒子1激活的混合抗原提呈细胞与微米粒子3共作用制备的为微米疫苗4,粒径为5.00μm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载100μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各60μg,负载聚组氨酸250μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。使用微米粒子2激活的混合抗原提呈细胞与微米粒子3共作用制备的为微米疫苗5,粒径为5.00μm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载100μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各60μg,负载聚组氨酸250μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。
通过在400g离心5分钟收集微米粒子1激活的2000万个混合抗原提呈细胞,与2000万个E.G7-OVA癌细胞混合,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤混合细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的核酸递送前体微米粒子3共孵育10分钟后,使用5μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗6,微米疫苗6的粒径为5.00μm,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载100μgmRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各60μg,负载聚组氨酸250μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。
(7)微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在小鼠接种肿瘤前第-35、第-28天、第-21天、第-14天和第-7天分别给小鼠注射100μLPBS或者1mg的微米疫苗(微米疫苗4,或者微米疫苗5,或者微米疫苗6),在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞,。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图10所示,图10中PBS control、Microvaccine 4、Microvaccine 5、Microvaccine 6依次为PBS对照组、微米疫苗4、微米疫苗5、微米疫苗6。结果显示,与PBS对照组相比,微米疫苗处理的小鼠,其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且,微米疫苗4明显好于微米疫苗5;微米疫苗6好于微米疫苗4和微米疫苗5。这说明含有增加溶酶体逃逸功能的物质和混合佐剂的抗原递送微米粒子1激活的抗原提呈细胞的组分与核酸递送前体微米粒子3共作用制备的微米疫苗4效果好于只含有溶酶体逃逸功能的物质而不含有混合佐剂的抗原递送微米粒子2激活的抗原提呈细胞的膜组分与核酸递送前体微米粒子3共作用所制备的微米疫苗5。而且,微米疫苗6好于微米疫苗4,说明被激活的抗原提呈细胞的膜组分与癌细胞膜组分组成的混合膜组分效果更好。由此可见,本公开所述的微米疫苗可被用于预防或者治疗癌症。而且混合佐剂的使用以及癌细胞的膜组分负载于疫苗表面均有助于提高疫苗效果。
实施例10疫苗用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用负载结肠癌全细胞抗原的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后所制备的纳米疫苗用于治疗结肠癌。本实施例中,首先使用10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解结肠癌肿瘤组织并溶解裂解组分,然后,以PLGA为骨架材料,以Poly(I:C)、CpG2336和CpG2006为佐剂,以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质,制备抗原递送纳米粒子,使用该抗原递送纳米粒子激活抗原提呈细胞后将抗原提呈细胞后将来自抗原提呈细胞的细胞外囊泡与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备成纳米疫苗,并使用该纳米疫苗治疗癌症。
(1)肿瘤组织裂解物组分及细菌外囊泡组分的制备
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38-OVA结肠癌细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织,将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解肿瘤组织并溶解裂解后组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
将鼠李糖乳杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,在4℃下使用20W超声处理5分钟,然后在16000g离心90分钟,将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分,然后使用10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解和溶解细菌外囊泡膜组分。
(2)抗原递送粒子(纳米粒子)系统的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子采用复乳法制备。纳米粒子内部负载肿瘤组织裂解物组分、细菌细胞外囊泡组分、mRNA、免疫佐剂和增加溶酶体逃逸物质。纳米粒子的制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa,所使用的mRNA为编码OVA的mRNA,以Poly(I:C)和两种CpG为佐剂,以KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)为增加溶酶体逃逸物质,且佐剂和KALA多肽负载于纳米粒子内;制备时肿瘤组织裂解物组分:细菌外囊泡组分:mRNA的质量比为4:4:1。制备方法如前所述,在制备过程中首先在纳米粒子内部负载肿瘤组织裂解液组分、细菌细胞外囊泡裂解物组分、增加溶酶体逃逸物质和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用;该纳米粒子1平均粒径为110nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分,负载编码OVA的mRNA为10μg,每1mg PLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006各0.02mg,负载KALA多肽0.12mg。
抗原递送纳米粒子2的制备材料和制备方法同纳米粒子1,但是不负载poly(I:C),粒径为110nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分,负载编码OVA的mRNA为10μg,每1mg PLGA纳米粒负载KALA多肽0.12mg,负载CpG2336和CpG2006各0.03mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子3)的制备
本实施例中负载mRNA的纳米粒子3所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子3同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种B类CpG和聚赖氨酸。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG7909(B类)、CpG1018(B类)和聚赖氨酸在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子3平均粒径为110nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载聚赖氨酸40μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和B作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例1。B细胞来自小鼠外周血PBMC,制备方法同上。将BMDC与B细胞按照数量比1:1混合后即为混合抗原提呈细胞。
(5)抗原提呈细胞的激活
将1mg的抗原递送纳米粒子1或者抗原递送纳米粒子2与BMDC(1000万个)及B细胞(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(200U/mL)和GM-CSF(200U/mL)。
(6)负载抗原提呈细胞的膜组分以及癌细胞细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗的制备
收集孵育后的混合抗原提呈细胞2000万个,在400g离心5分钟,弃去沉淀后收集上清液,将上清液在15000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后即得被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡。
收集培养的MC38-OVA细胞2000万个,在400g离心5分钟,弃去沉淀后收集上清液,将上清液在15000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后即得癌细胞的细胞外囊泡。
将收集的被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡与癌细胞细胞外囊泡混合,然后在4℃低功率(20W)超声2分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,将挤出液与步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子(纳米粒子3)混合后使用高压均质机(10000bar)处理1分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,然后在15000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在4%的海藻糖水溶液中重悬后冷冻干燥48小时后即得纳米疫苗。其中,使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗4,粒径为120纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载聚赖氨酸40μg;每1mg PLGA约负载280μg膜组分。使用纳米粒子2激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗5,粒径为120纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载聚赖氨酸40μg;每1mgPLGA约负载280μg膜组分。
(7)纳米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38-OVA细胞。在接种结肠癌细胞后第6天、第9天、第12天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射0.4mg纳米疫苗(纳米疫苗4、或者纳米疫苗5)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图11所示,图11中PBS control、Nanovaccine 4、Nanovaccine 5依次为PBS对照组、纳米疫苗4、纳米疫苗5。结果显示,与PBS对照组相比,纳米疫苗处理小鼠后其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且,内部负载核酸表面同时负载被含有Poly(I:C)和CpG的粒子1激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡膜组分和癌细胞细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗4的效果好于内部负载核酸表面同时负载被只含有CpG的粒子2激活的抗原提呈细胞细胞外囊泡膜组分和癌细胞细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗5。由此可见,本公开所述的纳米疫苗对癌症具有优异治疗效果。
实施例11负载mRNA和抗原提呈细胞膜组分的纳米粒子用于黑色素瘤的预防
(1)负载mRNA的纳米粒子1的制备
本实施例中负载mRNA的纳米粒子1所负载的mRNA可以编码四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM),B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD),B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL);纳米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、CpGBW006、CpG2395和R8(RRRRRRRR)多肽。负载mRNA的粒子的制备材料和制备方法如前所述,首先将mRNA、poly(I:C)、CpGBW006、CpG2395和R8多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为250nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpGBW006和CpG2395各20μg,负载R8多肽40μg。
(2)BMDC和B细胞的制备
BMDC和B细胞的制备方法同上,将B细胞和BMDC按数量比1:1混合即为本实施例所使用的混合抗原提呈细胞。
(3)抗原提呈细胞的激活
将1mg纳米粒子1、2000万个混合抗原提呈细胞在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有细胞因子组合:IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)。
(4)纳米疫苗2的制备
通过在400g离心5分钟收集混合抗原提呈细胞(2000万个),然后使用生理盐水洗涤细胞两遍,将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液,将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液,将上清液与40mg步骤(1)制备的纳米粒子1共孵育10分钟,然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后即得纳米疫苗2,粒径为270nm;每1mg PLGA约负载10μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpGBW006和CpG2395各20μg,负载R8多肽40μg;每1mg PLGA约负载90μg膜组分。
(5)负载mRNA的脂质纳米粒(Lipid nanoparticles,LNP)的制备
本实施例使用微流控法制备LNP。使用的脂质材料等的摩尔比如下:MC3:PEG2000:DSPC:胆固醇=50%:1.5%:10%:38.5%;所负载的mRNA同步骤(1)所负载的mRNA。先称取1mM各脂质成分即MC3(0.321mg)、PEG2000(0.037=mg)、DSPC(0.079mg)、Chol(0.148mg)一起混合后溶于0.586mL无水乙醇中。将mRNA溶于1mL pH=4.0的柠檬酸缓冲溶液中。分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22μm滤膜过滤,然后将脂质-乙醇溶液吸入1mL注射器中,将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3mL注射器中(至少吸入1.5mL),并排出注射器中的空气,将注射器出口和样品导入管连接,并固定在微流控注射泵上。在微流控装置中设置好参数后点击运行,观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200μL液体),用收集管收集流出的液体即为制备好的LNP。LNP粒径为95纳米,每1mg LNP负载mRNA为50μg。该LNP即为LNP疫苗。
(6)纳米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠,在小鼠接种肿瘤前第-35天,第-28天,第-21天,第-14天和第-7天分别在小鼠皮下接种0.5mg纳米疫苗2、或者0.5mgLNP疫苗或者100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(7)实验结果
如图12所示,图12中PBS control、LNP vaccine、Nanovaccine 2依次为PBS对照组、LNP疫苗、纳米疫苗2。结果显示,PBS对照组的小鼠其肿瘤生长速度很快,生存期很短。接受疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢,小鼠生存期变长。其中,纳米疫苗2效果优于LNP疫苗。这说明本公开所述的纳米疫苗预防或者治疗癌症效果很好,且优于LNP疫苗。
实施例12微米疫苗用于癌症的预防
(1)癌细胞及细菌外囊泡组分的制备
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟,然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理,然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分,即为制备抗原递送微米粒子系统的抗原组分。
将嗜酸乳杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,然后在16000g离心90分钟,弃去上清液后所得沉淀即为细菌外囊泡组分,将沉淀使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解后溶解细菌外囊泡组分。
(2)抗原递送粒子(微米粒子1)的制备
本实施例中制备抗原递送微米粒子1采用复乳法。微米粒子1骨架材料为PLA,PLA分子量为40KDa。所采用的免疫佐剂为CpG2006(B类)、CpG2216(A类)和Poly ICLC,所采用的带正电荷物质为精氨酸和组氨酸。微米粒子制备时所使用的癌细胞裂解物组分和细菌外囊泡组分质量比为1:1。制备时先采用复乳法制备内部负载癌细胞裂解物抗原组分、细菌外囊泡组分、佐剂、精氨酸和组氨酸的抗原递送微米粒子,尔后,将100mg微米粒子在9000g离心20分钟,使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后即得抗原递送微米粒子1,平均粒径为2.45μm左右,每1mg PLGA微米粒子1约负载100μg蛋白质或多肽组分,负载CpG2006,CpG2216和Poly ICLC各0.02mg,负载精氨酸和组氨酸各0.05mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(微米粒子2、微米粒子3和微米粒子4及空白微米粒子5)的制备
本实施例中负载mRNA的微米粒子2所负载的mRNA可以编码OVA抗原;微米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种CpG(B类和C类)和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的微米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG2395(C类)、CpG1018(B类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。微米粒子2平均粒径为2.45μm左右,每1mg PLA微米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA微米粒子负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg。
本实施例中负载mRNA的微米粒子3所负载的mRNA可以编码OVA抗原;微米粒子3同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种A类CpG和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的微米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG1585(A类)、CpG2336(A类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。微米粒子3平均粒径为2.45μm左右,每1mg PLA微米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA微米粒子负载poly(I:C)、CpG1585、CpG2336免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg。
本实施例中负载mRNA的微米粒子4所负载的mRNA可以编码OVA抗原;微米粒子同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、一种CpG(B类)和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的微米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG1018(B类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。微米粒子4平均粒径为2.45μm左右,每1mgPLA微米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA微米粒子负载poly(I:C)20μg、负载CpG1018免疫佐剂40μg,负载KALA多肽150μg。
本实施例中不负载任何mRNA的对照空白微米粒子5同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种CpG(B类和C类)和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。微米粒子5的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将poly(I:C)、CpG2395(C类)、CpG1018(B类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于微米粒子内部,然后将100mg PLA微米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。微米粒子2平均粒径为2.45μm左右,每1mg PLA微米粒子负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg。
(4)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC、B细胞以及BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC及BMDM制备方法同上。B细胞来自小鼠外周血PBMC,制备方法同上。将BMDC、B细胞和BMDM按数量比2:1:1混和后即为混合抗原提呈细胞。
(5)抗原提呈细胞的激活
将1000μg的抗原递送微米粒子1分别与4000万个混合抗原提呈细胞(含2000万个BMDC,1000万个B细胞及1000万个BMDM)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)和CD40抗体(20mg/mL)。
(6)抗原提呈细胞来源的核酸疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集微米粒子1激活的2000万个混合抗原提呈细胞,与2000万个E.G7-OVA癌细胞混合,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤混合细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的核酸递送前体微米粒子2共孵育10分钟后,使用3μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗6,微米疫苗6的粒径为2.50μm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA约负载20μgmRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg;每1mg PLGA约负载190μg膜组分。
通过在400g离心5分钟收集微米粒子1激活的2000万个混合抗原提呈细胞,与2000万个E.G7-OVA癌细胞混合,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤混合细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的核酸递送前体微米粒子3共孵育10分钟后,使用3μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗7,微米疫苗7的粒径为2.50μm,表面电位为-10mV。每1mg PLGA约负载20μgmRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG1585、CpG2336免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg;每1mg PLGA约负载190μg膜组分。
通过在400g离心5分钟收集微米粒子1激活的2000万个混合抗原提呈细胞,与2000万个E.G7-OVA癌细胞混合,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤混合细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的核酸递送前体微米粒子4共孵育10分钟后,使用3μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗8,微米疫苗8的粒径为2.50μm,表面电位为-10mV。每1mg PLGA约负载20μgmRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)20μg、负载CpG1018免疫佐剂40μg,负载KALA多肽150μg;每1mg PLGA约负载190μg膜组分。
通过在400g离心5分钟收集微米粒子1激活的2000万个混合抗原提呈细胞,与2000万个E.G7-OVA癌细胞混合,然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤混合细胞两遍,将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液,将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液,将上清液通过0.22μm的膜反复挤出,将挤出液使用高压均质机(10000bar)处理3分钟,然后在16000g离心40分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后与30mg步骤(3)制备的对照空白微米粒子5共孵育10分钟后,使用3μm的滤膜反复共挤出,将挤出液在9000g离心25分钟后弃去上清液收集沉淀部分,将沉淀部分使用4%海藻糖重悬后冷冻干燥48小时后即得微米疫苗9,微米疫苗9的粒径为2.50μm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA负载poly(I:C)、CpG2395和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽150μg;每1mg PLGA约负载190μg膜组分。
(7)微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在小鼠接种肿瘤前第-35、第-28天、第-21天、第-14天和第-7天分别给小鼠注射100μLPBS或者1mg的微米疫苗(微米疫苗5,微米疫苗6,或者微米疫苗7),在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图13所示,图13中PBS control、Microvaccine 6、Microvaccine 7、Microvaccine 8、Microvaccine 9依次为PBS对照组、微米疫苗6、微米疫苗7、微米疫苗8和微米疫苗9。结果显示,与PBS对照组相比,微米疫苗处理的小鼠,其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。微米疫苗6、微米疫苗7和微米疫苗8的效果都好于微米疫苗9,说明疫苗内部负载核酸能显著提高疫苗的疗效。而且,微米疫苗6的效果好于微米疫苗7和微米疫苗8,说明核酸递送粒子(疫苗)中含有两种CpG(B类和C类)与poly(I:C)混合佐剂的效果好于核酸递送微米粒子(疫苗)中含有两种A类CpG与poly(I:C)混合佐剂的效果,也好于核酸递送微米粒子(疫苗)中含有一种B类CpG与poly(I:C)混合佐剂的效果;说明使用poly(I:C)+两种不同的CpG(含有至少一种B类CpG)能达到更佳的效果。由此可见,本公开所述的微米疫苗可被用于预防或者治疗癌症。而且混合佐剂的使用有助于提高疫苗效果。
实施例13疫苗用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用负载结肠癌全细胞抗原的抗原递送纳米粒子激活的抗原提呈细胞与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后所制备的纳米疫苗用于治疗结肠癌。本实施例中,首先使用10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解结肠癌肿瘤组织并溶解裂解组分,然后,以PLGA为骨架材料,以Poly(I:C)、CpG2336和CpG2006为佐剂,以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质,制备抗原递送纳米粒子,使用该抗原递送纳米粒子激活抗原提呈细胞后将抗原提呈细胞后将来自抗原提呈细胞的细胞外囊泡与负载核酸的核酸递送前体纳米粒子共作用后制备成纳米疫苗,并使用该纳米疫苗治疗癌症。
(1)肿瘤组织裂解物组分及细菌外囊泡组分的制备
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38-OVA结肠癌细胞,在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织,将肿瘤组织切块后研磨,通过细胞过滤网加入10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解肿瘤组织并溶解裂解后组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
将鼠李糖乳杆菌在5000g离心30分钟,然后弃去沉淀后收集上清液,将上清液使用1μm的滤膜过滤,在4℃下使用20W超声处理5分钟,然后在16000g离心90分钟,将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分,然后使用10%辛基葡萄糖苷水溶液裂解和溶解细菌外囊泡膜组分。
(2)抗原递送粒子(纳米粒子1)系统的制备
本实施例中抗原递送纳米粒子1采用复乳法制备。纳米粒子1内部负载肿瘤组织裂解物组分、细菌细胞外囊泡组分、mRNA、免疫佐剂和增加溶酶体逃逸物质。纳米粒子的制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa,所使用的mRNA为编码OVA的mRNA,以Poly(I:C)和两种CpG为佐剂,以KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)为增加溶酶体逃逸物质,且佐剂和KALA多肽负载于纳米粒子内;制备时肿瘤组织裂解物组分:细菌外囊泡组分:mRNA的质量比为4:4:1。制备方法如前所述,在制备过程中首先在纳米粒子内部负载肿瘤组织裂解液组分、细菌细胞外囊泡裂解物组分、增加溶酶体逃逸物质和佐剂,然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用;该纳米粒子平均粒径为260nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分,负载编码OVA的mRNA为10μg,每1mg PLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006各0.02mg,负载KALA多肽0.12mg。
(3)负载mRNA的核酸递送前体粒子(纳米粒子2,纳米粒子3,纳米粒子4和纳米粒子5)的制备
本实施例中负载mRNA的纳米粒子2所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子2同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种B类CpG和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG7909(B类)、CpG1018(B类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子2平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽140μg。
本实施例中负载mRNA的纳米粒子3所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子3同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种A类CpG和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG1585(A类)、CpG2336(A类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子3平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG1585和CpG2336免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽140μg。
本实施例中负载mRNA的纳米粒子4所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子4同时负载有免疫佐剂poly(I:C)和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子4平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)60μg,负载KALA多肽140μg。
本实施例中负载mRNA的纳米粒子5所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子5同时负载有免疫佐剂两种B类CpG和KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、CpG7909(B类)、CpG1018(B类)和KALA多肽在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mgPLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子5平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载CpG7909和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载KALA多肽140μg。
本实施例中负载mRNA的纳米粒子6所负载的mRNA可以编码OVA抗原。纳米粒子6同时负载有免疫佐剂poly(I:C)、两种B类CpG。负载mRNA的纳米粒子的制备材料和制备方法同步骤(2),首先将mRNA、poly(I:C)、CpG7909(B类)、CpG1018(B类)在水中混合,然后采用复乳法将上述混合物负载于纳米粒子内部,然后将100mg PLGA纳米粒子在9000g离心20分钟,并使用10mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米粒子6平均粒径为210nm左右,每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,不负载KALA多肽。
(4)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和B作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例1。B细胞来自小鼠外周血PBMC,制备方法同上。将BMDC与B细胞按照数量比1:1混合后即为混合抗原提呈细胞。
(5)抗原提呈细胞的激活
将1mg的抗原递送纳米粒子1与BMDC(1000万个)及B细胞(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5%CO2);孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(200U/mL)和GM-CSF(200U/mL)。
(6)负载抗原提呈细胞的膜组分以及癌细胞细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗的制备
收集与纳米粒1孵育后的混合抗原提呈细胞2000万个,在400g离心5分钟,弃去沉淀后收集上清液,将上清液在15000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后即得被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡。
收集培养的MC38-OVA细胞2000万个,在400g离心5分钟,弃去沉淀后收集上清液,将上清液在15000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在PBS中重悬后即得癌细胞的细胞外囊泡。
将收集的被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡与癌细胞细胞外囊泡混合,然后在4℃低功率(20W)超声2分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,将挤出液与步骤(3)制备的核酸递送前体纳米粒子(纳米粒子2、纳米粒子3、或者纳米粒子4、或者纳米粒子5、或者纳米粒子6)混合后使用高压均质机(10000bar)处理1分钟,然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出,然后在15000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀,将沉淀在4%的海藻糖水溶液中重悬后冷冻干燥48小时后即得纳米疫苗。其中,使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子2共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗7,粒径为220纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽140μg;每1mg PLGA约负载120μg膜组分。使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗8,粒径为220纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG1585和CpG2336免疫佐剂各20μg,负载KALA多肽140μg;每1mg PLGA约负载120μg膜组分。使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子4共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗9,粒径为220纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA负载ppoly(I:C)60μg,负载KALA多肽140μg;每1mg PLGA约负载120μg膜组分。使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子5共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗10,粒径为220纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA负载CpG7909和CpG1018免疫佐剂各30μg,负载KALA多肽140μg;每1mg PLGA约负载120μg膜组分。使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子6共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗11,粒径为220纳米,表面电位为-6mV;每1mg PLGA约负载20μg mRNA组分,每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG7909和CpG1018免疫佐剂各20μg,不负载KALA多肽;每1mgPLGA约负载120μg膜组分。
(7)纳米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38-OVA细胞。在接种结肠癌细胞后第6天、第9天、第12天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射0.4mg纳米疫苗(纳米疫苗7、或者纳米疫苗8、或者纳米疫苗9、或者纳米疫苗10、或者纳米疫苗11)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图14所示,图14中PBS control、Nanovaccine 7、Nanovaccine 8、Nanovaccine9、Nanovaccine 10、Nanovaccine 11依次为PBS对照组、纳米疫苗7、纳米疫苗8、纳米疫苗9、纳米疫苗10、纳米疫苗11。结果显示,与PBS对照组相比,纳米疫苗处理小鼠后其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且,纳米疫苗7治疗效果好于纳米疫苗8、纳米疫苗9、纳米疫苗10和纳米疫苗疫苗11。由此可见,本公开所述的纳米疫苗对癌症具有优异治疗效果。
本公开实施例中的纳米粒子、微米粒子、纳米疫苗或者微米疫苗中均未使用任何靶头,在实际应用中也可以根据需要添加甘露糖、CD32抗体、甘露聚糖、CD205抗体、CD19抗体等任何具有靶向靶细胞能力的靶头到纳米粒子、微米粒子、纳米疫苗或者微米疫苗表面。
本公开实施例中说明未使用钙化、硅化等技术处理纳米粒子或微米粒子,在实际可以使用钙化、硅化或其他生物矿化技术、交联、凝胶化等处理或修饰粒子。
本公开实施例中所递送的核酸为mRNA,在实际应用中也可以为DNA或者其他RNA。
本公开中涉及的氨基酸序列如下所示:
R8多肽,RRRRRRRR(SEQ ID NO:1)
B16-M20抗原多肽,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM(SEQ ID NO:2)
B16-M24抗原多肽,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD(SEQ ID NO:3)
B16-M46抗原多肽,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ(SEQ ID NO:4)
TRP2:180-188抗原多肽,SVYDFFVWL(SEQ ID NO:5)
蜂毒肽,GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:6)
KALA多肽,WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7)
RALA多肽,WEARLARALARALARHLARALARALRACEA(SEQ ID NO:8)
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本公开创造的保护范围之中。
Claims (23)
1.一种核酸递送粒子,其具有由粒子材料形成的骨架结构,所述骨架结构的内部负载有核酸,所述骨架结构的表面负载有生物膜组分;
其中,所述生物膜组分含有来源于激活的抗原提呈细胞的膜组分和/或由所述激活的抗原提呈细胞分泌的细胞外囊泡的膜组分;所述激活的抗原提呈细胞由抗原提呈细胞与抗原递送粒子共作用后获得,所述抗原递送粒子具有由粒子材料形成的骨架结构,以及负载于所述骨架结构的内部和/或表面负载有抗原组分。
2.根据权利要求1所述的核酸递送粒子,其中,所述核酸递送粒子进一步负载至少一种如下所示的组分:
(iii)免疫佐剂;
(iv)带正电荷的物质,其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物,和/或带正电荷的无机物;
优选地,所述免疫佐剂包括如下至少一种:模式识别受体类激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄苠有效成分;
优选地,所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种;更优选包括Poly(I:C)、Poly ICLC、A类CpG-OND、B类CpG-OND和C类CpG-OND中的至少一种;
优选地,所述带正电荷的物质包括蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3中的任意一种或任意组合。
3.根据权利要求1或2所述的核酸递送粒子,其中,所述核酸递送粒子中,所述粒子材料、核酸与生物膜组分的质量比(mg:μg:μg)为1:(1-100):(10-300);
优选地,所述核酸递送粒子进一步包括免疫佐剂和带电荷的物质,所述粒子材料、核酸、免疫佐剂、带正电荷的物质与所述生物膜组分的质量比(mg:μg:μg:μg:μg)为1:(1-100):(1-200):(10-500):(10-300)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸递送粒子,所述生物膜组分进一步含有至少一种如下所示的组分:
(a)来源于全细胞裂解物的癌细胞膜组分;其中,所述全细胞裂解物组分来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞;
(b)来源与细胞外囊泡裂解物的细胞外囊泡膜组分,所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌;
(c)来源于细菌裂解物的细菌膜组分;
优选地,所述全细胞裂解物包括如下的一种或两种:水溶性抗原的裂解物和非水溶性抗原的溶解物;
优选地,所述细菌包括如下至少一种:卡介苗、大肠杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
5.根据权利要求1-4任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述激活抗原提呈细胞的抗原递送粒子所负载的抗原组分包含如下的至少一种:
(i)具有免疫原性的蛋白和/或多肽;
(ii)编码抗原的核酸;
优选地,所述具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于如下(1),和任选存在的(2)-(3)中的至少一种;
(1)全细胞裂解物;其中,所述全细胞裂解物组分来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞;
(2)细菌裂解物;
(3)细胞外囊泡裂解物;其中,所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌;
优选地,所述全细胞裂解物包括如下的一种或两种:水溶性抗原的裂解物和非水溶性抗原的溶解物;
优选地,所述细菌包括如下至少一种:卡介苗、大肠杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
6.根据权利要求4或5所述的核酸递送粒子,其中,所述细菌裂解物和/或细胞外囊泡裂解物是由细菌和/或细胞外囊泡经含有裂解剂的裂解液裂解得到;
优选地,所述裂解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
7.根据权利要求4-6任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述非水溶性抗原、所述细菌裂解物或所述细胞外囊泡裂解物彼此独立地溶解于包含如下至少一种溶解剂的溶解液中:尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱。
8.根据权利要求5-7任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述抗原递送粒子进一步负载如下至少一种:
(iii)免疫佐剂;
(iv)带正电荷的物质,其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物,和/或带正电荷的无机物;
可选地,所述免疫佐剂包括如下至少一种:模式识别受体类激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄苠有效成分;
优选地,所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种;更优选包括Poly(I:C)、Poly ICLC、A类CpG-OND、B类CpG-OND和C类CpG-OND中的至少一种;
所述带正电荷的物质包括蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3中的任意一种或任意组合。
9.根据权利要求1-8任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述抗原提呈细胞选自树突状细胞、B细胞和巨噬细胞中的任意一种或两种以上的组合;
优选地,所述抗原提呈细胞选自树突状细胞、B细胞和巨噬细胞中的任意两种或三种。
10.根据权利要求1-9任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述抗原提呈细胞与所述抗原递送粒子的共作用体系中还包含细胞因子组分和/或抗体组分;优选地,所述细胞因子组分包括IL-2、IL-4、IL-7、IL10、IL-12、IL-15、IL-33、GM-CSF、M-CSF中的至少一种;所述抗体组分包括CD80抗体、CD86抗体中的至少一种;
可选地,所述孵育体系中还包括如下至少一种:
(1)全细胞裂解物;
(2)细菌裂解物;
(3)细胞外囊泡裂解物;其中,所述细胞外囊泡由细菌或癌细胞分泌。
11.根据权利要求1-10任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述核酸递送粒子由核酸递送前体粒子与生物膜组分共作用得到;
优选地,所述核酸递送前体粒子进一步负载如下至少一种:
(iii)免疫佐剂;
(iv)带正电荷的物质,其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物,和/或带正电荷的无机物。
12.根据权利要求1-11任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述粒子材料选自天然高分子材料、合成高分子材料和/或无机材料。
13.根据权利要求1-12任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述的核酸递送粒子和抗原递送粒子的形状为任意形状,包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等;
可选地,所述核酸递送粒子由核酸递送前体粒子与生物膜组分共作用得到,所述核酸递送前体粒子的形状为任意形状,包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等。
14.根据权利要求1-13任一项所述的核酸递送粒子,其中,所述核酸递送粒子和所述抗原递送粒子彼此独立地选自纳米粒子或微米粒子;
所述纳米粒子的粒径为1nm-1000nm;优选为50-500nm;更优选为100-400nm;
所述微米粒子的粒径为1μm-1000μm;优选为1-10μm;更优选为1-5μm。
15.根据权利要求1-14任一项述的核酸递送粒子,其中,所述核酸递送粒子和/或所述抗原递送粒子的表面带有负电荷。
16.一种核酸递送系统,其中,所述核酸递送系统包括如权利要求1-15任一项所述的核酸递送粒子。
17.一种药物组合物,其中,所述药物组合物包括如权利要求1-15任一项所述的核酸递送粒子,或如权利要求16所述的核酸递送系统;
可选地,所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
18.一种核酸疫苗,其中,所述核酸疫苗包括如权利要求1-15任一项所述的核酸递送粒子,或如权利要求16所述的核酸递送系统。
19.根据权利要求1-15任一项所述的核酸递送粒子,根据权利要求16所述的核酸递送系统,或根据权利要求17所述的药物组合物在如下(1)-(3)至少一项中的用途:
(1)预防或治疗疾病,或制备用于预防或治疗疾病的药物;
(2)在受试者中诱导免疫应答,或制备用于在受试者中诱导免疫应答的药物;
(3)作为或用于制备核酸疫苗;
可选地,所述疾病为癌症或肿瘤;
可选地,所述癌症或肿瘤为实体肿瘤或者血液瘤。
20.一种核酸递送粒子的制备方法,其中,所述制备方法包括如下步骤:
将抗原提呈细胞与抗原递送粒子共作用,得到激活的抗原提呈细胞;其中,抗原递送粒子的表面和/或内部负载有抗原组分;尔后制备含有来源于激活的抗原提呈细胞和/或其细胞外囊泡的生物膜组分;
制备内部负载核酸的核酸递送前体粒子;
将生物膜组分负载于所述核酸递送前体粒子的表面,得到核酸递送粒子。
21.根据权利要求20所述的制备方法,其中,所述抗原递送粒子的制备步骤包括:
分别制备负载水溶性抗原的递送粒子,以及负载非水溶性抗原的溶解物的递送粒子,混合两种递送粒子,得到所述抗原递送粒子;
或者,混合所述水溶性抗原和非水溶性抗原的溶解物,得到混合后的抗原组分;利用所述混合后的抗原组分,制备所述抗原递送粒子;
或者,使用含有溶解剂的溶解液同时溶解水溶性抗原和非水溶性抗原,并利用所述混合抗原组分制备所述抗原递送粒子。
22.根据权利要求20或21所述的制备方法,其中,所述将生物膜组分负载于所述核酸递送前体粒子的表面的步骤包括:
将所述激活的抗原呈递细胞和/或其细胞外囊泡机械破碎后,收集生物膜组分;
将所述生物膜组分与所述核酸递送前体粒子共作用,使所述将生物膜组分负载于所述核酸递送前体粒子的表面。
23.一种预防或治疗疾病的方法,其中,所述方法包括向受试者施用预防或治疗有效量的如权利要求1-15任一项所述的核酸递送粒子,如权利要求16所述的核酸递送系统,如权利要求17所述的药物组合物,或如权利要求18所述的核酸疫苗。
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PB01 | Publication | ||
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