CN116549620A - 一种基于癌细胞或肿瘤组织中一部分组分的癌症疫苗及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种基于癌细胞或肿瘤组织中一部分组分的癌症疫苗及制备方法。首先使用盐析法等先分离全细胞组分的中的水溶性蛋白质和非水溶性组分，然后将其负载于纳米粒子或微米粒子，用于预防或治疗癌症。本公开提供的疫苗系统包含纳米粒子和/或微米粒子、癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质以及癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分，能够高效的激活癌细胞特异性免疫反应，可用于癌症等疾病的预防和治疗。
Description
技术领域
本公开涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种基于癌细胞或肿瘤组织中一部分组分的癌症疫苗及制备方法。
背景技术
癌症疫苗是癌症免疫治疗的重要方法之一。癌症疫苗主要由抗原和佐剂组成，其中抗原是能够引发特异性免疫反应的主要成分，也是癌症疫苗中的最重要的组分。癌细胞或肿瘤组织含有全部的癌细胞特异性抗原和癌细胞相关抗原，是最好的癌症疫苗制备原料。癌细胞或肿瘤组织中含有多种多样的癌症抗原，其中最主要的抗原组分为蛋白质和多肽组分。再使用癌症疫苗，如癌症纳米疫苗或者微米疫苗，负载癌细胞全细胞组分时，由于癌细胞抗原的多种多样以及癌细胞全细胞组分中含有DNA、RNA、脂质和糖类等各种物质，降低了全细胞组分中蛋白质和多肽抗原的相对含量。在纳米疫苗或微米疫苗所负载的抗原含量较高时，有可能其所能激活的免疫反应会更强，因而适当富集和纯化抗原可能能够提高癌症纳米疫苗或者微米疫苗的功效。如何适度纯化和富集癌症疫苗就显得非常重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本公开提供了一种使用负载癌细胞和/或肿瘤组织中一部分组分的癌症纳米/微米疫苗及其制备方法。本公开将癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，和癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分或者非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分分别或同时负载于纳米粒子或微米粒子骨架的内部和/或表面，制备得到癌症纳米疫苗或微米疫苗。本公开中去除了癌细胞或肿瘤组织全细胞组分中的一部分成分，增加癌细胞或肿瘤组织中抗原组分的纯度，提高了癌症纳米疫苗或微米疫苗的功效。
本公开的第一个目的是提供一种癌症疫苗，其包括由粒子材料形成的骨架结构并负载有癌细胞和/或肿瘤组织的一部分组分，所述骨架结构的内部和/或表面负载有以下的其中一种或两种：(1)癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，和癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分或者非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，(2)直接获取的抗原组分。
进一步地，所述癌细胞或肿瘤组织中的一部分组分为癌细胞和/或肿瘤组织的裂解物中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，和癌细胞和/或肿瘤组织的裂解物中的非水溶性组分、或裂解物中的非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，或直接获取的抗原组分；
所述裂解物中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备方法包括：将所有水溶性组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后，沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液再溶解；
所述裂解物中的非水溶性组分制备方法包括：将非水溶性部分直接使用含有溶解剂的溶解液溶解；
所述裂解物中的非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备方法包括：将非水溶性部分使用含有溶解剂的溶解液溶解后经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解；
所述直接获取的抗原组分的制备方法包括：将癌细胞和/或肿瘤组织使用含有溶解剂的溶解液裂解后，使用含有溶解剂的溶解液溶解得到的裂解物组分，然后将所得溶解后裂解物组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解；
所述溶解剂独立地选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、氨基、羧基、取代或未取代胍基。
进一步地，在70-120℃下加热。
本公开所述的癌症疫苗，癌细胞为来自一个或者多个机体的癌细胞，或者来自于一种或者多种癌细胞系；肿瘤组织为来自一个或者多个机体的肿瘤组织；所述癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分/非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分中含有抗原组分。
分离提纯抗原组分前可以在癌细胞或肿瘤组织裂解物组分中加入蛋白酶抑制剂或者加入蛋白酶。
分离提纯水溶性组分中的抗原组分或者全细胞裂解物组分中的抗原组分的过程可以包括盐析。盐析所使用的试剂所含的阳离子包括但不限于Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Sn2+、Zn2 +、Ca2+、Li+、Na+、NH4 +、K+、Cu2+、Ag+、Ba2+等。盐析所使用的试剂所含的阴离子包括但不限于Cl-、SO4 2-、NO3 -、CO3 2-、SiO3 2-、S2O7 2-、B4O7 2-、PO4 3-、RCOO-、NO2 -、S2O8 2-、S2-、CrO4 2-、MnO4 -、P2O7 4-等。
盐析的过程可以使用分段盐析或者一次性盐析。
分离提纯水溶性组分中的抗原组分或者全细胞裂解物组分中的抗原组分的过程可以包括加热。
在一些实施方案中，所述癌症疫苗为纳米疫苗或者微米疫苗。癌症疫苗的粒径大小为纳米级或微米级，这样能保证癌症疫苗能被抗原提呈细胞高效吞噬。
进一步地，纳米疫苗的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，更优选地，粒径大小为50nm-600nm；更优选地，粒径大小为50-500nm；更优选地，粒径大小为100-400nm。示例性地，纳米疫苗的粒径为10nm、50nm、100nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、400nm、500nm等等。
进一步地，微米疫苗的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，更优选地，粒径大小为1μm-5μm，更优选为1-10μm；更优选为1-2μm。示例性地，微米疫苗的粒径为1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.5μm、3μm、5μm、10μm等等。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述癌症疫苗进一步负载至少一种如下所示的组分：
(iii)水溶性组分中的mRNA组分；
(iv)免疫佐剂；
(v)带正电荷的物质，其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物，和/或带正电荷的无机物；
优选地，所述免疫佐剂包括如下至少一种：模式识别受体类激动剂、卡介苗(BCG)、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、咪喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶QIO、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、细胞因子、mRNA、MF59、双链RNA、双链DNA、单链DNA、铝佐剂、锰佐剂、钙佐剂、STING激动剂、内毒素佐剂、脂质体佐剂、CAF01、人参有效成分、黄苠有效成分；
优选地，所述免疫佐剂包括Toll样受体3激动剂和Toll样受体9激动剂中的至少一种；进一步的，免疫增强佐剂包括(1)Poly(I:C)和/或Poly(ICLC)；(2)CpG-ODN；其中，CpG-ODN为A类CpG-ODN、B类CpG-ODN和C类CpG-ODN中的至少一种；优选为至少两种，且至少其中一种为B类CpG-ODN或C类CpG-ODN。
本公开的上下文中，“CpG”或“CpG-ODN”(CpG oligonucleotide,CpG寡脱氧核苷酸)，是合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡聚脱氧核苷酸(ODN)。不同类型的CpG-ODN的结构特征与免疫效应各有不同，一般分为A、B、C三类。
在一些实施方案中，CpG-ODN包括但不限于：CpG 1018(B类)、CpG 7909(B类)、CpG2006(B类)、CpG-BW006(B类)、CpG 2395(C类)、CpG SL01、CpG 1585(A类)、CpG 2216(A类)、CpG SL03、CpG 2395(C类)、CpG M362(C类)、CpG 2336(A类)。
在本公开中，所述带正电荷的物质包括但不限于如下至少一种：带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的高分子聚合物、带正电荷的无机物。示例性的，所述带正电荷的物质包括蜂毒肽、RALA多肽、KALA多肽、R8多肽、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸和NH4HCO3中的任意一种或任意组合。
示例性地，带正电荷的多肽包括但不限于含有精氨酸的多肽、含有组氨酸的多肽和/或组氨酸和/或赖氨酸的KALA多肽、RALA多肽、蜂毒肽等。
示例性地，带正电荷的氨基酸包括但不限于精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。
示例性地，带正电荷的高分子聚合物包括但不限于聚精氨酸、聚赖氨酸、聚组氨酸等。
示例性地，带正电荷的脂质包括但不限于DOTAP等。
示例性地，带正电荷的蛋白质包括但不限于鱼精蛋白、组蛋白等。
示例性地，带正电荷的无机物包括但不限于NH4HCO3、氢氧化铝等。
本公开中，癌症纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有靶向性分子。所述靶向性分子包括如下至少一种：甘露糖、甘露聚糖、CD19抗体、CD20抗体、BCMA抗体、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体等。
在本公开中，形成所述癌症疫苗的粒子材料由天然高分子材料和/或合成高分子材料形成。
在本公开中，形成所述抗原递送粒子由天然高分子材料和/或合成高分子材料形成。
示例性地，有机合成高分子材料包括但不限于PLGA、PLA、PEG-PLGA、PEG-PLA、PGA、PEG、PCL、Poloxamer、PVA、PVP、PEI、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽等。
示例性地，天然高分子材料包括但不限于卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分、淀粉、糖类、多肽等。
示例性地，无机材料包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸盐、磷酸盐等。
本公开所述的癌症纳米疫苗或微米疫苗的形状为常见的任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述疫苗中，所述粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.001-10；优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.01-2；最优选的，粒子制备骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比1：0.05-1。
本公开所述的癌症疫苗，所述癌症疫苗表面或者内部进一步含有至少一种如下所示的组分：
(a)来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞的癌细胞膜组分；
(b)来源于抗原提呈细胞的细胞膜组分；
(c)来源于细菌的膜组；
(d)来源与细胞外囊泡裂解物的细胞外囊泡膜组分，所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞或抗原提呈细胞分泌；
当膜组分位于纳米疫苗或微米疫苗表面时，将膜组分负载到纳米疫苗或微米疫苗表面的方法包括但不限于超声、共孵育、共挤出、超滤、离心、透析、化学键连接、搅拌、透析、均质化和匀浆中的一种或多种。
优选地，所述细菌包括如下至少一种：卡介苗、大肠杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
进一步地，所述癌细胞和/或肿瘤组织中的组分制备的纳米疫苗或微米疫苗选自如下的一种或两种：(1)水溶性组分中的蛋白质和多肽组分+非水溶性组分；(2)水溶性组分中的蛋白质和多肽组分+非水溶性组分中的蛋白质组分或多肽)。在一些优选的实施方案中，所述水溶性组分中的蛋白质和多肽与所述非水溶性组分/非水溶性组分中的蛋白质和多肽的质量比为(0.1-10)：(0.1-10)；优选为(0.5-2)：(0.5-2)。示例性地，水溶性组分中蛋白质和多肽组分与非水溶性组分/非水溶性组分中的蛋白质和多肽的质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施方案中，具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分和细胞外囊泡裂解物。进一步地，所述细胞外囊泡裂解物选自癌细胞的细胞外囊泡裂解物和/或细菌的细胞外囊泡裂解物。所述癌细胞和/或肿瘤组织中的一部分组分与所述细胞外囊泡裂解物组分的质量比为(0.1-10)：(0.1-10)；优选为(0.5-2)：(0.5-2)。示例性地，质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施方案中，具有免疫原性的蛋白和/或多肽来源于癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分和细菌裂解物。进一步地，所述癌细胞/肿瘤组织中的一部分组分与所述细菌裂解物的质量比为(0.1-10)：(0.1-10)；优选为(0.5-2)：(0.5-2)。示例性地，质量比为1:1、0.5:1、0.8:1、1:1.2、1:1.5、1:2、2:1、3:1、4:1、5:1、1:3、1:4、1:5等等。
在一些实施例中，在纳米疫苗或者微米疫苗的制备材料PLGA或者PLA等主要材料中加入适量PEG修饰的PLGA或者PLA，可以更好的达到长循环和被动靶向的效果；其中PEG修饰的PLGA或者PLA等与未修饰的PLGA或者PLA质量比为0.05％到20％，优选为0.1％到10％。
进一步地，所述粒子材料经过PEG修饰或未经PEG修饰，优选地，制备骨架结构时，未经PEG修饰的粒子材料与经过PEG修饰的粒子材料的质量比为25-200:1。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述癌细胞和/或肿瘤组织中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备步骤为：先裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物；然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分；然后将得到的裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀；然后将沉淀部分的蛋白质和多肽组分使用溶解剂溶解就得到了水溶性组分中的蛋白质和多肽组分。所述溶解剂选自含有结构式1结构的化合物(包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等)、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、氨基、羧基、取代或未取代胍基。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述癌细胞和/或肿瘤组织中的非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备步骤为：先裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物；然后使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分；然后将得到的裂解物中的非水溶性组分经过盐析和/或加热处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀；然后将沉淀部分的蛋白质和多肽组分使用溶解剂溶解就得到了非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分。所述溶解剂选自含有结构式1结构的化合物(包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等)、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述癌细胞和/或肿瘤组织中的的蛋白质和多肽组分制备步骤为：先裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物；然后使用溶解剂溶解所有裂解物组分；然后将溶解剂溶解后的裂解物组分经过盐析和/或加热处理后将其中的蛋白质和多肽组分沉淀；然后将沉淀部分的蛋白质和多肽组分使用溶解剂溶解就得到了所有裂解物中的蛋白质和多肽组分。所述溶解剂选自盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述细菌裂解物和/或细胞外囊泡裂解物是由细菌和/或细胞外囊泡经含有裂解剂的裂解液裂解得到；优选地，所述裂解剂选自盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述细菌裂解物和/或细胞外囊泡裂解物是由细菌和/或细胞外囊泡经含有裂解剂的裂解液裂解得到；优选地，所述裂解剂选自盐酸二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述非水溶性抗原、所述细菌裂解物或所述细胞外囊泡裂解物彼此独立地溶解于包含如下至少一种溶解剂的溶解液中：盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述粒子材料选自天然高分子材料、合成高分子材料和/或无机材料。
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述的核酸递送粒子和抗原递送粒子的形状为任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形、圆盘形、囊泡形等；
本公开所述的癌症疫苗，其中，所述癌症疫苗为纳米疫苗和/或微米疫苗；
所述纳米疫苗的粒径为1nm-1000nm；优选为50-500nm；更优选为100-400nm；
所述微米疫苗的粒径为1μm-1000μm；优选为1-10μm；更优选为1-5μm。
本公开的第三个目的在于提供了一种药物组合物，其包括本公开提供的癌症纳米疫苗和/或微米疫苗。
可选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学上可接受的载体。
本公开提供的药物组合物，可发挥显著的疾病预防或治疗效果。
本公开中的核酸递送粒子或核酸递送系统可以靶向抗原提呈细胞，有效激活机体的免疫应答反应，高效发挥核酸疫苗的预防或治疗效果。
本公开所述的癌症疫苗，或药物组合物在如下至少一项中的用途：
(1)预防或治疗疾病，或制备用于预防或治疗疾病的药物；
(2)在受试者中诱导免疫应答，或制备用于在受试者中诱导免疫应答的药物。
在一些实施方案中，所述疾病为癌症或肿瘤；
在一些实施方案中，所述癌症或肿瘤为实体肿瘤和血液瘤，所述实体肿瘤或血液瘤包括但不限于鳞状细胞癌、骨髓瘤、肺癌、胶质瘤、肝癌、淋巴瘤、急骨髓瘤、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝脏癌、白血病、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、肉瘤、细胞瘤、胰腺癌、宫颈癌、脑癌、膀胱癌、乳腺癌和头颈癌。
本公开中，疫苗负载的抗原组分来源于所述疾病相关的细胞或组织。进一步地，抗原组分来源于癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞组分中的一部分。
本公开所述一种预防或治疗疾病的方法，其中，所述方法包括向受试者施用预防或治疗有效量的癌症疫苗。
本公开的第四个目的在于提供上述癌症疫苗的制备方法。
其中，所述制备方法可以包括如下步骤：
S1.裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。可以使用超纯水、水溶液等裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。裂解方法为癌细胞或肿瘤组织常用的裂解方法，包括但不限于反复冻融、溶胀、超声处理、高压处理、均质化、挤出、匀浆、高速搅拌、化学物质处理、高剪切力处理、超滤处理、皱缩等处理方式中的一种或多种。
S2.使用超纯水或者水溶液裂解癌细胞或者肿瘤组织后，使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到水溶性组分和非水溶性组分。
S3.将裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解得到；裂解物中的非水溶性性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解后再经过盐析和/或加热处理后再使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者裂解物中的非水溶性组分不经处理直接使用含有溶解剂的溶解液溶解。每一步中的溶解剂都分别独自选择。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S4.将S3得到的水溶性组分中的蛋白质及多肽组分和/或非水溶性组分或其中的蛋白质剂多肽组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗。纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有膜组分。
本公开所述癌症疫苗的制备方法也可以包括如下步骤：
S1.裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。可以使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。
S2.细胞或组织裂解后直接使用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S3.将含有溶解剂的溶解液溶解的全细胞裂解物组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀，然后再将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解得到所需抗原组分。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S4.将S3得到抗原组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗。纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有膜组分。
其中，所述制备方法也可以包括如下步骤：
S1.裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。可以使用超纯水、水溶液等裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。裂解方法为癌细胞或肿瘤组织常用的裂解方法，包括但不限于反复冻融、溶胀、超声处理、高压处理、均质化、挤出、匀浆、高速搅拌、化学物质处理、高剪切力处理、超滤处理、皱缩等处理方式中的一种或多种。
S2.使用超纯水或者水溶液裂解癌细胞或者肿瘤组织后，使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到水溶性组分和非水溶性组分。
S3.将裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀和上清液两部分，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解，使用适当方法分离提取上清液中的mRNA组分，然后将上清液中的mRNA组分与含有溶解剂的溶解液溶解的沉淀部分混合后备用；裂解物中的非水溶性性组分使用溶解剂溶解后再经过盐析和/或加热处理后再使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者裂解物中的非水溶性组分不经处理直接使用含有溶解剂的溶解液溶解。每一步中的溶解剂都分别独自选择。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S4.将S3得到的水溶性组分中的所得组分和/或非水溶性组分或其中的蛋白质及多肽组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗。纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有膜组分。
本公开所述癌症疫苗的制备方法也可以包括如下步骤：
S1.裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。可以使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。
S2.细胞或组织裂解后直接使用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S3.将含有溶解剂的溶解液溶解的全细胞裂解物组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀和上清液两部分，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解；使用适当方法从上清液中分离得到mRNA组分，然后将mRNA组分与含有溶解剂的溶解液溶解的沉淀部分混合即所需抗原组分。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
S4.将S3得到抗原组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗。纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有膜组分。
本公开使用特定手段分离提纯了癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分中的抗原组分，能够富集蛋白质和多肽抗原组分，并规避了可能由糖类和DNA等物质引起的潜在毒副作用。
本公开部分实施例中使用了盐析、加热、酶解等方法纯化癌细胞/肿瘤组织裂解物中的抗原组分，也可以使用相分离、层析分离等其他可以去除裂解物中的DNA成分或者分离纯化出其中的蛋白质多肽和mRNA成分的方法。
上述说明仅是本公开技术方案的概述，为了能够更清楚了解本公开的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本公开的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本公开的内容更容易被清楚的理解，下面根据本公开的具体实施例并结合附图，对本公开作进一步详细的说明。
图1为结构式1的结构示意图。R1为C、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、氨基、羧基、取代或未取代胍基。
图2为本公开中核酸递送粒子的制备过程及应用示意图；其中，a为收集水溶性抗原组分中的部分组分和非水溶性的抗原组分/部分抗原组分以及制备纳米疫苗/微米疫苗的示意图；b为采用含有溶解剂的溶解解液直接裂解后溶解癌细胞全细胞抗原后分离纯化部分组分和制备纳米疫苗或者微米疫苗的过程示意图。
图3 -19分别为实施例1-17中使用纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗癌症时肿瘤生长速度和生存期实验结果；图3-19中，a为预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8)；b为预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；其中，a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析；***表示与PBS对照组相比p＜0.005，有显著性差异；**表示与PBS对照组相比p＜0.01，有显著性差异；###表示两组相比p＜0.005，有显著性差异；##代表两组相比p＜0.01，有显著性差异；#代表两组相比p＜0.05，有显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本公开作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本公开并能予以实施，但所举实施例不作为对本公开的限定。
除非有相反陈述，否则在本发明中所使用的术语具有下述含义。
在本发明的权利要求和/或说明书中，词语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
术语“治疗”是指：在罹患疾病之后，使受试者接触(例如给药)核酸递送粒子、核酸递送系统、核酸疫苗、负载核酸的药物、药物组合物，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指：身体出现了疾病症状。
术语“预防”是指：在罹患疾病之前，通过使受试者接触(例如给药)本公开的核酸递送粒子、核酸递送系统、核酸疫苗、负载核酸的药物、药物组合物，从而与不接触时相比减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。
术语“药学上可接受的辅料”或“药学上可接受的载体”是指在药物生产领域中广泛采用的辅助物料。使用辅料的主要目的在于提供一种使用安全、性质稳定和/或具有特定功能性的药物组合物，还在于提供一种方法，以便在为受试者施用药物之后，活性成分能够以所期望的速率溶出，或者促进活性成分在接受给药的受试者体内得到有效吸收。药学上可接受的辅料可以是具有惰性的填充剂，也可以是为药用组合物提供某种功能(例如稳定组合物的整体pH值或防止组合物中活性成分的降解)的功效成分。药学上可接受的辅料的非限制性实例包括但不限于粘合剂、助悬剂、乳化剂、稀释剂(或填充剂)、成粒剂、胶粘剂、崩解剂、润滑剂、抗粘着剂、助流剂、润湿剂、胶凝剂、吸收延迟剂、溶解抑制剂、增强剂、吸附剂、缓冲剂、螯合剂、防腐剂、着色剂、矫味剂、甜味剂等。
本公开中的药物组合物可以使用本领域技术人员已知的任何方法来制备。例如，常规混合、溶解、造粒、乳化、磨细、包封、包埋和/或冻干工艺。
在本公开中，施用途经能够以任何适用的方式进行变化或调整，以满足药物的性质、患者和医务人员的便利以及其它相关因素的需求。
本公开上下文中使用的术语“个体”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于，家养动物(例如，牛，羊，猫，狗和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，以及啮齿类动物(例如，小鼠和大鼠)。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“肿瘤”和“癌症”在本文中互换地使用，涵盖实体瘤和液体肿瘤。术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
本公开所述的疫苗系统，其内部负载癌细胞全细胞组分的一部分，其制备过程及应用领域如图1所示。
在制备纳米疫苗或微米疫苗时，可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性组分中的蛋白质和多肽和水不溶性组分/水溶性组分中的蛋白质和多肽，并分别制备纳米或微米疫苗；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织，并溶解癌细胞全细胞抗原，然后使用适当方法提取分离其中的蛋白质和多肽组分，将得到的该类组分再负载到纳米疫苗或微米疫苗。本公开所述癌细胞和/或肿瘤组织在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸分离提纯、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理等处理后再提取分离其中的蛋白质和多肽组分；也可以细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理直接提取分离其中的蛋白质和多肽组分。本公开部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理；本公开部分实施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、核酸分离提纯、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
尿素和盐酸胍等含有结构式1中的结构，发明人发现具有结构式1结构的物质可以作为溶解液中的溶解剂溶解细胞或者肿瘤组织中的非水溶性组分，因而除了尿素和盐酸胍、二甲双胍等常见的含有胍基结构的化合物外，其他含有改结构的化合物也具有作为溶解剂溶解非水溶性组分的能力。
在一些实施例中，在纳米疫苗或者微米疫苗的制备材料PLGA或者PLA等主要材料中加入适量PEG修饰的PLGA或者PLA，可以更好的达到长循环和被动靶向的效果；其中PEG修饰的PLGA或者PLA等与未修饰的PLGA或者PLA质量比为0.05％到20％，优选为0.1％到10％。
在部分实施例中使用了PEG修饰纳米疫苗或者微米疫苗表面，在实际应用中也可以使用双亲性分子、两性化电离物质等修饰纳米疫苗或者微米疫苗表面。
在部分实施例中，纳米疫苗或微米疫苗表面还可以负载有膜组分，膜组分可以来自于抗原提呈细胞、癌细胞、细菌或者细胞外囊泡中的一种或多种。
用于制备纳米疫苗或微米疫苗表面所负载的生物膜组分的抗原提呈细胞可以来源于自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是DC细胞、B细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物，也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。抗原提呈细胞可以经过负载抗原的纳米粒子或微米粒子激活。
癌症纳米疫苗或微米疫苗表面所负载的生物膜组分来源于细胞外囊泡时，可以是癌细胞的细胞外囊泡、细菌的细胞外囊泡或者抗原提呈细胞的细胞外囊泡中的一种或者多种。
任何本领域人员知晓的纳米粒子、微米粒子制备方法均可以用于制备本公开所述的纳米疫苗或微米疫苗，包括但不限于溶剂挥发法、透析法、微流控法、超滤法、均质乳化法、分散法、沉淀法等等。
在一些具体的实施方案中，本公开以溶剂挥发法为例，提供如下示例制备方法：
步骤1，裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。可以使用超纯水、水溶液等裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。裂解方法为癌细胞或肿瘤组织常用的裂解方法，包括但不限于反复冻融、溶胀、超声处理、高压处理、均质化、挤出、匀浆、高速搅拌、化学物质处理、高剪切力处理、超滤处理、皱缩等处理方式中的一种或多种。
或者可以使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞或肿瘤组织。癌细胞为一种或多种癌细胞或者癌细胞系；肿瘤组织为来源于一个机体或者多个机体的肿瘤组织。
步骤2，使用超纯水或者水溶液裂解癌细胞或者肿瘤组织后，使用离心、过滤、透析、超滤等方法中的一种或多种将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到水溶性组分和非水溶性组分。
或者使用含有溶解剂的溶解液裂解癌细胞或肿瘤组织后，直接使用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
步骤3，将裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解得到；裂解物中的非水溶性性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解后再经过盐析和/或加热处理后再使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者裂解物中的非水溶性组分不经处理直接使用含有溶解剂的溶解液溶解。每一步中的溶解剂都分别独自选择。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
或者将裂解物中的水溶性组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀和上清液两部分，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解，使用适当方法分离提取上清液中的mRNA组分，然后将上清液中的mRNA组分与含有溶解剂的溶解液溶解的沉淀部分混合后备用；裂解物中的非水溶性性组分使用溶解剂溶解后再经过盐析和/或加热处理后再使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者裂解物中的非水溶性组分不经处理直接使用含有溶解剂的溶解液溶解。每一步中的溶解剂都分别独自选择。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
或者将含有溶解剂的溶解液溶解的全细胞裂解物组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀，然后再将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解得到所需抗原组分。溶解剂包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
或者将含有溶解剂的溶解液溶解的全细胞裂解物组分经过盐析和/或加热处理后得到沉淀和上清液两部分，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解；使用适当方法从上清液中分离得到mRNA组分，然后将mRNA组分与含有溶解剂的溶解液溶解的沉淀部分混合即所需抗原组分。溶解剂包括但不限于包括但不限于盐酸二甲双胍、硫酸二甲双胍、磺酸二甲双胍、二甲双胍盐、二甲双胍、尿素、盐酸聚六亚甲基胍、硫酸胍基丁胺、盐酸甲基胍、盐酸四甲基胍、盐酸胍、硫酸胍、磺酸胍、胍盐、其他含有胍基或脲的化合物、碳酸胍、精氨酸、胍基乙酸、胍基磷酸、氨基磺酸胍、胍基琥珀酸、盐酸氨基脲、氨基甲酰脲、乙酰脲、磺酰脲类化合物(格列本脲、格列齐特、格列喹酮、格列美脲等)、硫脲类化合物(硫氧嘧啶类、咪唑类等)、亚硝基脲类等含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱等中的一种或多种。
本发明部分实施例中使用了盐析、加热等方法纯化癌细胞/肿瘤组织裂解物中的抗原组分，在实际应用中也可以使用酶解、相分离、层析分离等其他可以去除裂解物中的DNA成分或者分离纯化出其中的蛋白质多肽和mRNA成分的方法。
步骤4，将步骤3得到的水溶性组分中的蛋白质及多肽组分和/或非水溶性组分或其中的蛋白质剂多肽组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗；或者将步骤3得到抗原组分分别或同时负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面得到所述纳米疫苗或微米疫苗
制备时，混合初水相与有机相，具体为将第一预定体积的含有第一预定浓度的抗原组分的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度的制备粒子原材料的有机相中。
在一些实施例中，水相溶液可含有如下i)～iii)中的至少一种：i)癌细胞裂解物中各组分、ii)肿瘤组织裂解物中的各组分以及免疫增强佐剂。裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原中的蛋白质和多肽组分，或是溶于含有尿素或盐酸胍等溶解剂的溶解液中的原非水溶性抗原或其中的部分组分。第一预定浓度为水相溶液所含有的蛋白质和多肽的浓度，或者是水相溶液中所含有的水溶性抗原的浓度和/或原非水溶性抗原的浓度，第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/mL，以便能负载足够的抗原组分以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中，有机溶剂选用二氯甲烷。另外，在一些实施例中，制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL，选为100mg/mL。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本公开中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
在一些实施方案中，水相溶液为包含细胞和/或组织裂解物组分的溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL。在一些实施方案中，水相溶液为包含裂解物组分与免疫佐剂的溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL～20mg/mL。在一些实施方案中，有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
在一些实施方案中，水相溶液为包含裂解物组分的溶液时，其中蛋白质和多肽组分的的浓度大于0.01ng/mL，优选1μg/mL～1mg/mL。在一些实施方案中，水相溶液为包含蛋白质和多肽组分与免疫佐剂的溶液时，其中蛋白质和组分的浓度大于1ng/mL，优选1μg/mL～1mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL～20mg/mL。在一些实施方案中，有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
步骤5，将步骤1得到的混合液进行如下任一种处理：i)大于2秒的超声处理；ii)大于1分钟的搅拌；iii)均质处理；iv)微流控处理。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤6，将步骤5处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行如下任一种处理：i)大于2秒的超声处理；ii)大于1分钟的搅拌；iii)进行均质处理；iv)微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌或均质化或混合以进行纳米化或微米化。在本公开中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间等能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在一些实施例中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定体积为5mL，第三预定浓度为20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本公开中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1 -1:1000进行设定，优选地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间或均质化时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤7，将步骤6处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中，乳化剂水溶液为PVA溶液或其他溶液。
第四预定浓度为5mg/mL，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本公开中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000，优选地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本公开中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
步骤8，将步骤7处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)中；或者使用超滤离心或者使用能够去除特定分子量物质的透析法，去除游离的PVA等物质的同时将体系中的溶液更换为含有第五预定浓度的冻干保护剂的第五预定体积的水溶液或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)。
步骤9，将步骤8得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
步骤10，将第六预定体积的步骤9中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用；或者上述样品与第七预定体积的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原混合后使用。
在本公开中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1，优先体积比为1:100到100:1，最优体积比为1:30到30:1。
在一些实施方案中，所述纳米疫苗或微米疫苗中，每1mg粒子材料负载0.1-1000μg蛋白质或多肽组分。在一些实施方案中，或所述纳米疫苗或微米疫苗还负载免疫增强佐剂，其中，每1mg粒子材料负载1-400μg免疫增强佐剂。在一些实施方案中，所述纳米疫苗或微米疫苗还负载带正电性分子，其中，每1mg粒子材料负载1-800μg带正电性分子。
在部分实施例中，纳米疫苗或者微米疫苗的内部和/或表面还含有膜组分，纳米疫苗货微米疫苗内部和/或表面的膜组分为选自抗原提呈细胞的细胞膜、抗原提呈细胞的细胞外囊泡、癌细胞的细胞膜、癌细胞的细胞外囊泡、细菌的细胞膜和细菌的细胞外囊泡中的一种或者多种混合膜。
当膜组分位于纳米疫苗或微米疫苗表面时，将膜组分负载到纳米疫苗或微米疫苗表面的方法包括但不限于超声、共孵育、共挤出、超滤、离心、透析、化学键连接、搅拌、透析、均质化和匀浆中的一种或多种。
步骤11，将步骤10所制备的纳米疫苗或者微米疫苗用于预防或者治疗癌症等疾病。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1负载部分水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗用于治疗黑色素瘤
本实施例中，先使用超纯水裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性抗原，然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备纳米疫苗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于8M尿素水溶液备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于8M尿素水溶液；然后将使用8M尿素溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上8M尿素水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和8M尿素溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗1的抗原组分1。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和碳酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于8M尿素水溶液备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于8M尿素水溶液；然后将使用8M尿素溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上8M尿素水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和8M尿素溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗2的抗原组分2。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上8M尿素水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和水溶性组分即为制备癌症纳米疫苗3抗原组分3。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶后备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶；然后将使用5％PEG5000水溶液增溶的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上8M尿素水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和5％PEG5000水溶液溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗4的抗原组分4。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入5％PEG5000水溶液增溶沉淀部分即可得非水溶性组分在5％PEG5000水溶液中可溶的组分。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶后备用，将上清液在95℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶；然后将使用5％PEG5000水溶液增溶的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上5％PEG5000水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和5％PEG5000水溶液溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗5的抗原组分5。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过硫酸铵盐析纯化和加热分离纯化后使用8M尿素水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(硫酸铵盐析和加热分离纯化后使用8M尿素水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(8M尿素水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗1使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载15μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.2mg。
纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过碳酸铵盐析纯化和加热分离纯化后使用8M尿素水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(碳酸铵盐析和加热分离纯化后使用8M尿素水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(8M尿素水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗2使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载15μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.2mg。
纳米疫苗3(Nanovaccine 3)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。在制备时，肿瘤组织裂解物中所有水溶性组分不经过任何处理直接使用。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性组分的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(8M尿素水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗3使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子3平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载15μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.2mg。
纳米疫苗4(Nanovaccine 4)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过硫酸铵盐析纯化和加热分离纯化后使用5％PEG水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(硫酸铵盐析和加热分离纯化后使用5％PEG5000水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(8M尿素水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗4使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子4平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载15μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.2mg。
纳米疫苗5(Nanovaccine 5)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过硫酸铵盐析纯化和加热分离纯化后使用5％PEG水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(硫酸铵盐析和加热分离纯化后使用5％PEG5000水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(5％PEG5000水溶液水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗5使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为10KDa-20KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子5平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载15μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.2mg。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射2mg纳米疫苗1(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者2mg纳米疫苗2(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者2mg纳米疫苗3(1mg负载水溶性组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者2mg纳米疫苗4(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者2mg纳米疫苗5(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者100μL PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(4)实验结果
如图3所示，图3中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)、纳米疫苗2(Nanovaccine 2)、纳米疫苗3(Nanovaccine 3)、纳米疫苗4(Nanovaccine 4)和纳米疫苗5(Nanovaccine 5)的小鼠，其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其中一部分小鼠无瘤痊愈。其中，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2、纳米疫苗3、纳米疫苗4和纳米疫苗5，说明使用硫酸铵盐析分离纯化水溶性组分中蛋白质和多肽组分的效果好于使用碳酸铵，而且，分离纯化水溶性中组分中一部分组分后的效果，好于直接使用水溶性组分。而且，使用尿素溶解水溶性组分经过盐析和加热处理产生的沉淀好效果好于使用PEG。
实施例2微米疫苗用于黑色素瘤的治疗
本实施例中，先使用超纯水裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织中分离出来的癌细胞，将该部分分离得到的癌细胞培养后，制备肿瘤组织的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分以及溶解于6M盐酸胍的非水溶性抗原，然后将二者混合后，负载于微米疫苗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网制备得到单细胞悬液，然后将肿瘤组织中的癌细胞分离后在RPMI1640(含10％FBS)完全培养基中培养7天(37℃，5％CO2)。培养完成后，收集癌细胞并在400g离心5分钟去除培养基。将沉淀的癌细胞使用适量超纯水重悬后反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解癌细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6M盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在6M盐酸胍水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分中或者非水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸镁水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于6M盐酸胍水溶液后作为水溶性组分中的部分抗原组分使用；将所得样品与6M盐酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比1:1混合，得到的为制备微米疫苗1(Micronvaccine 1)的抗原组分1。
在裂解液中的水溶性组分中或者非水溶性组分中逐滴加入饱和硅酸钠水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于6M盐酸胍水溶液后作为水溶性组分中的部分抗原组分使用。将所得样品与6M盐酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比1:1混合，得到的为制备微米疫苗2(Micronvaccine 2)的抗原组分2。
或者将裂解液中的水溶性组分不做任何处理，与6M盐酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比1:1混合，得到的为制备微米疫苗3(Micronvaccine 3)的抗原组分3。
(2)微米疫苗的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，将抗原组分1负载于微米疫苗1。所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)和CpG ODN7909,且抗原组分和佐剂负载于微米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg微米粒子在8000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米疫苗1平均粒径为1.2μm左右，每1mg PLGA微米粒子约负载10μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒负载poly(I:C)和Cp GODN各0.01mg。
本实施例中微米疫苗2(Micronvaccine 2)制备方法和制备步骤同微米疫苗1。在制备时，将抗原组分2负载于微米疫苗2。所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)和CpG ODN7909,且抗原组分和佐剂负载于微米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg微米粒子在8000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米疫苗2平均粒径为1.2μm左右，每1mg PLGA微米粒子约负载10μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒负载poly(I:C)和Cp GODN各0.01mg。
本实施例中微米疫苗3(Micronvaccine 3)制备方法和制备步骤同微米疫苗1。在制备时，将抗原组分3负载于微米疫苗3。所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)和CpG ODN7909,且抗原组分和佐剂负载于微米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg微米粒子在8000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米疫苗3平均粒径为1.2μm左右，每1mg PLGA微米粒子约负载10μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒负载poly(I:C)和Cp GODN各0.01mg。
本实施例中微米疫苗4(Micronvaccine 4)制备方法和制备步骤同微米疫苗1。在制备时，同时负载等量的四种黑色素瘤多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM) ， B16-M24 (Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD) ， B16-M46 (Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)。所采用的微米粒子制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG ODN 7909,且多肽和佐剂同时负载于微米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米疫苗4平均粒径为1.2μm左右，每1mgPLGA微米粒子约负载10μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒负载poly(I:C)和Cp G ODN各0.01mg。
(8)微米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射4mg微米疫苗(微米疫苗1或者微米疫苗2或者微米疫苗3或者微米疫苗4)或者100μL PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
(9)实验结果
如图4所示，图中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用微米疫苗1(Micronvaccine 1)、微米疫苗2(Micronvaccine 2)、微米疫苗3(Micronvaccine 3)和微米疫苗4(Micronvaccine 4)的小鼠，其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其其中一部分小鼠痊愈。其中，微米疫苗1效果好于微米疫苗2、微米疫苗3和微米疫苗4，说明使用硫酸镁盐析分离纯化水溶性组分中蛋白质和多肽组分的效果好于使用硅酸钠，而且，分离纯化水溶性中组分中一部分组分后的效果，好于直接使用水溶性组分。而且，使用裂解物中水溶性组分中的一部分效果好于使用新抗原多肽。
实施例3纳米疫苗用于黑色素瘤的治疗
本实施例中，先使用超纯水裂解B16F10黑色素瘤癌细胞以制备癌细胞中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性组分，然后，以PLA和PEG修饰的PLA为纳米粒骨架材料制备纳米疫苗。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的B16F10细胞，弃去上清液后在癌细胞沉淀中加入适量超纯水重悬并反复冻融5次，并伴有超声以裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入10％脱氧胆酸钠水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在10％脱氧胆酸钠水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分在100℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于10％脱氧胆酸钠水溶液。将以上10％脱氧胆酸钠溶解的水溶性组分中加热后沉淀所得的组分和10％脱氧胆酸钠水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比10:1混合，即为制备纳米疫苗1的抗原组分1。
或者将裂解液中的水溶性组分不做任何处理，直接使用。将水溶性组分和10％脱氧胆酸钠水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比10:1混合，即为制备纳米疫苗2的抗原组分2。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料为PLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG5000-PLA(PLA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLA和PEG5000-PLA的质量比为200:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG SL01(B类)和CpG SL03(C类)且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为500nm左右，每1mg PLA纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG SL01(B类)和CpG SL03(C类)各0.2mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。所采用的纳米疫苗制备材料PLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG5000-PLA(PLA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLA和PEG5000-PLA的摩尔比为200:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG SL01(B类)和CpG SL03(C类)且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为500nm左右，每1mg PLA纳米粒子约负载50μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG SL01(B类)和CpG SL03(C类)各0.2mg。
(8)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射100μL的0.5mg纳米疫苗1(0.25mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+0.25mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者100μL的0.5mg纳米疫苗2(0.25mg负载水溶性组分的纳米粒子+0.25mg负载非水溶性组分的纳米粒子)或者100μL的PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
(9)实验结果
如图5所示，图5中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)和纳米疫苗2(Nanovaccine 2)的小鼠，其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其其中一部分小鼠无瘤痊愈。其中，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2，说明使用加热纯化水溶性组分中蛋白质和多肽组分能够提高疫苗效果，且分离纯化水溶性中组分中一部分组分后的效果，好于直接使用水溶性组分。
实施例4纳米疫苗用于肺癌的治疗
本实施例中，先使用超纯水裂解LLC小鼠肺癌癌细胞以制备癌细胞中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性组分，然后，以PLGA为纳米粒骨架材料制备纳米疫苗。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的癌细胞后，弃去上清液并在细胞沉淀中加入适量超纯水重悬细胞后反复冻融5次。尔后将裂解物以5000g的转速离心5分钟后，取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.1％辛基葡萄糖苷水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在0.1％辛基葡萄糖苷水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和氯化钠水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.1％辛基葡萄糖苷水溶液备用，将上清液在80℃加热30分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.1％辛基葡萄糖苷水溶液；然后将使用0.1％辛基葡萄糖苷水溶液溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。将以上0.1％辛基葡萄糖苷水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和0.1％辛基葡萄糖苷溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分按质量比10:1混合即为制备癌症纳米疫苗1的抗原组分1。
在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入逐滴加入饱和硅酸钠水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.1％辛基葡萄糖苷水溶液备用，将上清液在80加热30分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.1％辛基葡萄糖苷水溶液；然后将使用0.1％辛基葡萄糖苷水溶液溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。将以上0.1％辛基葡萄糖苷水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和0.1％辛基葡萄糖苷溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分按质量比10:1混合即为制备癌症纳米疫苗2的抗原组分。
(2)内部负载抗原组分和佐剂的纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，所采用的纳米疫苗制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)且佐剂和抗原组分共负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米疫苗1平均粒径为280nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质和多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg。
纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法和制备步骤同纳米疫苗1。在制备时，所采用的纳米疫苗制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG ODN1018(B类)和CpG ODN M362(C类)且佐剂和抗原组分共负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米疫苗2平均粒径为280nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg。
纳米疫苗3(Nanovaccine 3)制备材料和制备方法基本同纳米疫苗1，该纳米疫苗3平均粒径为280nm左右，1mg PLGA纳米粒子负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODNM362(C类)各0.02mg，区别是纳米疫苗3不负载任何抗原组分。
(3)抗原提呈细胞的制备和激活
采用骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和B细胞作为抗原提呈细胞。BMDC的制备同实施例1。B细胞提取流程如下：处死小鼠后摘取小鼠脾脏，然后制备小鼠脾细胞单细胞悬液，然后使用磁珠分选法从脾细胞单细胞悬液中分选出CD19+B细胞。将BMDC和B细胞按数量比1:1混合后作为混合抗原提呈细胞使用。
将纳米疫苗1(500μg)或纳米疫苗2(500μg)或纳米疫苗3(500μg)+游离裂解液与2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有细胞因子组合：IL-15(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-21(1000U/mL)。
或者将纳米疫苗1与2000万个BMDC在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有细胞因子组合：IL-15(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-21(1000U/mL)。
(4)内部负载抗原和佐剂同时表面负载抗原提呈细胞膜组分的纳米疫苗的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后与相对应的步骤(2)制备的纳米疫苗(50mg)共孵育10分钟，然后使用400nm的滤膜反复共挤出，将挤出液并在15000g离心60分钟，弃去上清后使用生理盐水重悬所得沉淀即为纳米粒子。其中，使用纳米疫苗1激活的混合抗原提呈细胞膜组分与纳米疫苗1共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗4(Nanovaccine 4)，粒径为300nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。使用纳米疫苗2激活的混合抗原提呈细胞膜组分与纳米疫苗2共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗5(Nanovaccine 5)，粒径为300nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。使用纳米疫苗3激活的混合抗原提呈细胞膜组分与纳米疫苗3共作用后所制得的纳米粒子为纳米疫苗6(Nanovaccine 6)，粒径为300nm,表面电位为-6mV；每1mgPLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpGODN M362(C类)各0.02mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。
或者通过在400g离心5分钟收集与纳米疫苗1共孵育后的2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后得抗原提呈细胞膜制备的纳米疫苗7(Nanovaccine 7)，粒径为200nm,表面电位为-4mV。
或者通过在400g离心5分钟收集与纳米疫苗1孵育后的2000万个BMDC，然后使用生理盐水洗涤BMDC两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后与步骤(2)制备的纳米疫苗1(50mg)共孵育10分钟，然后使用400nm的滤膜反复共挤出，将挤出液并在15000g离心60分钟，弃去上清后使用含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。即为纳米疫苗8(Nanovaccine 8)，粒径为300nm,表面电位为-6mV。每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质和多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。
通过在400g离心5分钟直接收集未经孵育和刺激的2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后与相对应的步骤(2)制备的纳米疫苗1(50mg)共孵育10分钟，然后使用400nm的滤膜反复共挤出，将挤出液并在15000g离心60分钟，弃去上清后使用生理盐水重悬所得沉淀即为纳米疫苗9。该纳米疫苗为纳米疫苗9(Nanovaccine 9)，粒径为300nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 1018(B类)和CpG ODN M362(C类)各0.02mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg细胞膜组分。
(7)纳米疫苗用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肺癌荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×106个LLC肺癌细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射100μL的0.2mg纳米疫苗(纳米疫苗1、或者纳米疫苗2、或者纳米疫苗3、或者纳米疫苗4、或者纳米疫苗5、或者纳米疫苗6、或者纳米疫苗7、或者纳米疫苗8、或者纳米疫苗9)或者100μL的PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
(8)实验结果
如图6所示，图6中结果显示，PBS对照组小鼠肿瘤生长速度都很快，小鼠生存期很短。与对照组相比，疫苗组小鼠的肿瘤生长速度都明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。其中，纳米疫苗4效果最好，纳米疫苗4明显好于其他纳米疫苗。而且，纳米疫苗4和纳米疫苗5的效果好于纳米疫苗9；而且，纳米疫苗1，纳米疫苗5和纳米疫苗8明显好于纳米疫苗3、纳米疫苗6和纳米疫苗7。这说明，纳米疫苗在表面负载抗原提呈细胞膜组分有利于提高内部负载部分癌细胞组分的纳米疫苗的效果；而且使用树突状细胞(DC)和B细胞的混合抗原提呈细胞的膜组分效果好于使用单一抗原提呈细胞DC的膜组分。而且，使用被负载癌细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分效果好于未被纳米粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分。
在本实施例中，使用了抗原提呈细胞的细胞膜组分，在实际应用中也可以使用抗原提呈细胞分泌的细胞外囊泡的膜组分；或者也可以同时再使用细菌或者癌细胞的细胞膜组分。
本实施例中，抗原提呈细胞的膜组分位于纳米疫苗或微米疫苗的表面，在实际应用中，抗原提呈细胞、细菌或癌细胞的膜组分也可以负载于纳米疫苗或微米疫苗内部。
实施例5疫苗用于结直肠癌的治疗
本实施例中，先使用超纯水裂解MC38小鼠肺结肠癌细胞以制备癌细胞中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性组分，然后制备纳米疫苗治疗结肠癌。本实施例中，细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡负载在纳米疫苗的表面，在实际应用时，根据需要细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡组分也可以负载于纳米疫苗内部；或者同时负载于纳米疫苗表面和纳米疫苗内部。本实施例中使用的细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡，在实际应用中也可以使用细菌的外膜组分或者癌细胞的膜组分；或者也可以使用被负载癌细胞抗原的抗原提呈细胞的膜组分(细胞膜或者细胞外囊泡膜)与来源于癌细胞的膜组分和/或来源于细菌的膜组分的任意混合膜组分。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的MC38小鼠结肠癌细胞后，弃去上清液并在细胞沉淀中加入适量超纯水重悬细胞后反复冻融5次。尔后将裂解物以5000g的转速离心5分钟后，取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入10％十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在10％SDS水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸钙水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于10％SDS水溶液备用，将上清液在100℃加热2分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于10％SDS水溶液；然后将使用10％SDS水溶液溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。
将以上10％SDS水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和10％SDS溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分按质量比1:1混合即为制备癌症纳米疫苗的抗原。
(2)内部负载抗原和佐剂的纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，癌细胞裂解液中非水溶性组分(10％SDS水溶液溶解)和癌细胞裂解物中水溶性组分中的部分组分(盐析纯化后使用10％SDS水溶液溶解的组分)按质量比1:1混合后作为抗原组分使用。所采用的纳米疫苗制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG ODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)，所采用的促进溶酶体逃逸的物质为蜂毒肽，且佐剂、蜂毒肽和抗原组分共负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米疫苗1平均粒径为380nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg癌细胞的蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)各0.05mg，负载蜂毒肽0.1mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法同纳米疫苗1。在制备时，癌细胞裂解液中非水溶性组分(10％SDS水溶液溶解)和癌细胞裂解物中水溶性组分中的部分组分(盐析纯化后使用10％SDS水溶液溶解的组分)按质量比1:1混合后作为抗原组分使用。所采用的纳米疫苗制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpGODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)且佐剂和抗原组分共负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米疫苗2平均粒径为380nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg癌细胞的蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)各0.05mg。
纳米疫苗3(Nanovaccine 3)制备材料和制备方法同纳米疫苗1，该纳米疫苗3平均粒径为380nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg蛋白质或多肽组分，不负载任何佐剂。
(3)细菌细胞外囊泡(OMV)和癌细胞外囊泡的制备
将长双歧杆菌在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，在4℃下使用20W超声处理5分钟，然后在16000g离心90分钟，将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分。
或者将癌细胞在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，在4℃下使用20W超声处理5分钟，然后在16000g离心90分钟，将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的癌细胞的外囊泡膜组分。
将细菌的外囊泡膜组分与癌细胞外囊泡膜组分按照质量比1:1混合后备用。
(4)内部负载抗原组分同时表面负载细菌和癌细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗的制备
将步骤(2)制备的30mg纳米疫苗(纳米疫苗1、或者纳米疫苗2、或者纳米疫苗3)与5mg步骤(3)制备的癌细胞和细菌外囊泡的混合膜组分混合后静置1分钟，然后在4℃下使用低功率7.5W超声1分钟后通过孔径为0.45μm滤膜反复共挤出，收集所得滤液后冷冻干燥即得纳米疫苗。其中，使用纳米疫苗1与癌细胞和细菌外囊泡的混合膜组分共作用后所制得的为纳米疫苗4(Nanovaccine 4)，粒径为400nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)各0.05mg，负载蜂毒肽0.1mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg膜组分。使用纳米疫苗2与癌细胞和细菌外囊泡的混合膜组分共作用后所制得的为纳米疫苗5(Nanovaccine 5)，粒径为400nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)、CpG ODN 7909(B类)和CpG ODN 2395(C类)各0.05mg；每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg膜组分。使用纳米疫苗3与癌细胞和细菌外囊泡的混合膜组分共作用后所制得的为纳米疫苗6(Nanovaccine 6)，粒径为400nm,表面电位为-6mV；每1mg PLGA纳米粒子约负载400μg蛋白质或多肽组分，不负载任何佐剂；每1mg PLGA纳米粒子约负载20μg膜组分。
(5)纳米疫苗用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠腋下皮下接种1.0×106个MC38结肠癌细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射100μL的0.3mg纳米疫苗(纳米疫苗1、或者纳米疫苗2、或者纳米疫苗3、或者纳米疫苗4、或者纳米疫苗5、或者纳米疫苗6)或者100μL的PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
(9)实验结果
结果显示，如图7中所示，PBS对照组小鼠的肿瘤生长速度很快，生存期很短。而几种纳米疫苗处理的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。而且，纳米疫苗4的效果优于纳米疫苗1；纳米疫苗5的效果优于纳米疫苗2；纳米疫苗6的效果优于纳米疫苗3；纳米疫苗4和纳米疫苗5的效果优于纳米疫苗6；纳米疫苗1和纳米疫苗2的效果优于纳米疫苗3；纳米疫苗4的效果优于纳米疫苗5；纳米疫苗1的效果优于纳米疫苗2。这说明使用细菌外囊泡组分和癌细胞外囊泡膜组分负载到纳米疫苗表面时可以提高负载癌细胞部分抗原的纳米疫苗的功效。
本实施例中，细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡负载在纳米疫苗的表面，在实际应用时，根据需要细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡组分也可以负载于纳米疫苗内部；或者同时负载于纳米疫苗表面和纳米疫苗内部。本实施例中使用的细菌的细胞外囊泡和癌细胞的细胞外囊泡，在实际应用中也可以使用细菌的外膜组分或者癌细胞的膜组分；或者也可以使用被负载癌细胞抗原的抗原提呈细胞的膜组分(细胞膜或者细胞外囊泡膜)与来源于癌细胞的膜组分和/或来源于细菌的膜组分的任意混合膜组分。
本实施例中，在将膜组分负载到纳米疫苗表面时，使用了超声、共孵育和共挤出的方法，在实际应用中，也可以使用任何通过共作用可以将膜组分负载到纳米疫苗或者微米疫苗表面的方法，包括但不限于超声、共孵育、共挤出、超滤、离心、透析、化学键连接、搅拌、透析、均质化和匀浆中的一种或多种。
本实施例中，细菌和癌细胞的膜组分位于纳米疫苗或微米疫苗的表面，在实际应用中，细菌或癌细胞的膜组分也可以负载于纳米疫苗或微米疫苗内部。
综上所述，本公开所述的疫苗对癌症具有优异的治疗效果。
实施例6微米疫苗用于治疗乳腺癌
本实施例中，首先使用6M盐酸胍裂解4T1乳腺癌癌细胞全细胞抗原，通过盐析和加热纯化抗原后，以CpG BW006(B类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC为免疫佐剂制备微米疫苗。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1乳腺癌癌细胞癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后加入含有0.1％蛋白酶抑制剂的超纯水重悬细胞后反复冻融5次裂解癌细胞，然后使用6M硫酸胍水溶液溶解裂解物组分。然后在上述样品中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，尔后将样品在10000g离心25分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于6M硫酸胍水溶液即为制备疫苗的抗原组分。
(2)微米疫苗的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用复乳法制备。所采用的微米疫苗1制备材料PLGA分子量为50KDa-75KDa，所采用的免疫佐剂为CpG ODN BW006、CpG ODN 2216和Poly ICLC。Poly ICLC是toll样受体3激动剂，而各类CpG是Toll样受体9激动剂，而Toll样受体3和Toll样受体9均位于细胞内的内吞体膜结构中。首先将抗原组分和免疫佐剂共负载于微米粒子内，然后在10000g离心15分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL抗原组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的微米疫苗1。该微米粒子平均粒径为2.50μm左右；每1mg PLGA微米粒子1约负载140μg蛋白质或多肽组分，负载的CpG BW006(B类)、CpG 2216(A类)和Poly ICLC各0.03mg。
微米疫苗2(Micronvaccine 2)制备材料和制备方法相同，负载的免疫佐剂为CpG2336(A类)、CpG 2216(A类)和Poly ICLC。微米疫苗2粒径为2.50μm左右，每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒所负载的CpG2336(A类)、CpG2216(A类)和Poly ICLC免疫佐剂各为0.03mg。
微米疫苗3(Micronvaccine 3)制备材料和制备方法相同，负载的免疫佐剂为CpGBW006(B类)和CpG 2216(A类)。微米疫苗3每1mgPLGA微米粒粒径为2.50μm左右，每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒所负载的CpG BW006(B类)和CpG 2216(A类)各0.045mg。
(7)纳米疫苗癌症的治疗
选取6-8周的雌性BALB/C为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个4T1细胞。在接种癌细胞后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射0.8mg的微米疫苗(微米疫苗1，或者微米疫苗2，或者微米疫苗3)或者皮下注射100μL PBS。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图8所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而纳米疫苗处理小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且，负载CpG佐剂和Poly ICLC混合佐剂的微米疫苗效果优于负载两种CpG混合佐剂的微米疫苗。而且，负载一种B类CpG、一种A类CpG和Poly ICLC混合佐剂的微米疫苗效果好于使用负载两种A类CpG和PolyICLC混合佐剂的微米疫苗。这说明负载两种不同toll样受体的混合佐剂的微米疫苗效果更好，而且，含有B类CpG的混合CpG与Toll样受体3激动剂作为混合佐剂的微米疫苗效果更好。
实施例7微米疫苗用于癌症的预防
(1)肿瘤组织的收集及裂解
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水，并反复冻融5次裂解肿瘤组织，尔后将裂解物以5000g的转速离心5分钟后，取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6M磺酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6M磺酸胍水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸镁水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，将沉淀溶解于6M磺酸胍水溶液备用，将上清液在100℃加热2分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于6M磺酸胍水溶液；然后将使用6M磺酸胍水溶液溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。在6M磺酸胍水溶液溶解的裂解液中的非水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸镁水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，然后将沉淀组分二次溶解于6M磺酸胍水溶液中。将以上6M磺酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分中的部分组分和6M磺酸胍溶解的水溶性组分中的部分组分按质量比1:2混合即为制备癌症微米疫苗的抗原组分1。
或者在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水，并反复冻融5次裂解肿瘤组织，尔后将裂解物以5000g的转速离心5分钟后，取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入5％PEG5000水溶液增溶沉淀部分即得到非水溶性组分溶解在5％PEG5000水溶液的组分。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸镁水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，将沉淀溶解于5％PEG5000水溶液备用，将上清液在100℃加热2分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶；然后将使用5％PEG5000水溶液溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。在5％PEG5000水溶液溶解的裂解液中的非水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸镁水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，然后将沉淀组分第二次使用5％PEG5000水溶液增溶。将以上5％PEG5000水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分中的部分组分和5％PEG5000水溶液溶解的水溶性组分中的部分组分按质量比1:2混合即为制备癌症微米疫苗的抗原组分2。
或者每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水，并反复冻融5次裂解肿瘤组织，尔后将裂解物以5000g的转速离心5分钟后，取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6M磺酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在6M磺酸胍水溶液中可溶。将所得肿瘤组织裂解物中的所有非水溶性组分和所有水溶性组分按质量比1:2混合，作为制备对照微米疫苗的抗原组分3。
(2)微米的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用溶剂挥发法制备。微米疫苗1所采用的制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)、CpG2006(B类)和CpGSL01(B类)，所负载的增加溶酶体逃逸的物质为RALA多肽(WEARLARALARALARHLARALARALRACEA)。抗原组分1、佐剂和RALA多肽共负载于微米粒子内部。制备方法如前所述，在微米粒子内部负载裂解物抗原组分和佐剂后，将100mg微米粒子在10000g离心15分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。该微米疫苗1平均粒径为5.0μm左右，微米粒子表面电位为-13mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载8μg肿瘤组织蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA微米粒负载Poly(I:C)、CpG2006、CpGSL01和RALA多肽各0.02mg。
微米疫苗2(Micronvaccine 2)制备方法同微米疫苗1。抗原组分2、佐剂和RALA多肽共负载于微米粒子内部。该微米疫苗2平均粒径为5.0μm左右，微米粒子表面电位为-13mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载8μg肿瘤组织蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA微米粒负载Poly(I:C)、CpG2006、CpGSL01和RALA多肽各0.02mg。
微米疫苗3(Micronvaccine 3)制备材料和制备方法同微米疫苗1，粒径为5.0μm左右，负载等量的抗原组分1，负载免疫佐剂为Poly(I:C)，每1mg PLGA负载Poly(I:C)0.06mg，负载RALA多肽0.02mg。
微米疫苗4(Micronvaccine 4)制备材料和制备方法同微米疫苗1，粒径为5.0μm左右，负载等量的抗原组分1，每1mg PLGA负载Poly(I:C)、CpG1585(A类)、CpG2216(A类)和RALA多肽各0.02mg。
微米疫苗5(Micronvaccine 5)制备方法同微米疫苗1。抗原组分3、佐剂和RALA多肽共负载于微米粒子内部。该微米疫苗5平均粒径为5.0μm左右，微米粒子表面电位为-13mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载8μg肿瘤组织蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA微米粒负载Poly(I:C)、CpG2006、CpGSL01和RALA多肽各0.02mg。
(3)微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠接种肿瘤前第-35天，第-28天，第-21天和第-14天分别在小鼠皮下注射3mg微米疫苗(微米疫苗1，或者微米疫苗2，或者微米疫苗3，或者微米疫苗4，或者微米疫苗5)、或者接种100μL PBS。第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。小鼠肿瘤生长速度和生存期监测方法同上。
(4)实验结果
结果显示，如图9所示，PBS对照组小鼠的肿瘤都很快长大，而微米疫苗处理组的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢，且大部分小鼠癌细胞接种后肿瘤消失。微米疫苗1效果好于微米疫苗2、微米疫苗3、微米疫苗4和微米疫苗5。这说明，使用分离纯化处理过裂解物的一部分蛋白质和多肽组分作为抗原组分制备的疫苗效果好于直接使用裂解物作为抗原组分制备的疫苗；而且，负载两种B类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的微米疫苗效果好于负载两种A类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的微米疫苗或者只负载Poly(I:C)作为佐剂的微米疫苗。而且，使用磺酸胍增溶裂解物中非水溶性组分以及水溶性组分经盐析等处理产生的沉淀所得到的抗原组分制备微米疫苗效果好于PEG5000。
实施例8纳米疫苗用于治疗T淋巴瘤
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
将培养的E.G7-OVA细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，加入胰蛋白酶(Trypsin，0.5mg/mL)和糜蛋白酶(Chymotrypsin，0.5mg/mL)共孵育30分钟，然后在95℃加热10分钟，尔后将裂解物以10000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.5M盐酸二甲双胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.5M盐酸二甲双胍水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.5M盐酸二甲双胍水溶液备用，将上清液在100℃加热2分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.5M盐酸二甲双胍水溶液；然后将使用0.5M盐酸二甲双胍溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。
将以上0.5M盐酸二甲双胍溶液溶解的裂解液中所有非水溶性组分和0.5M盐酸二甲双胍溶液溶解的水溶性组分中的部分组分按质量比5:1混合即为制备纳米疫苗的抗原组分。
(2)卡介苗(BCG)的裂解和溶解
收集BCG，使用0.5M盐酸二甲双胍水溶液裂解BCG后使用0.5M盐酸二甲双胍水溶液水溶液溶解BCG的裂解组分备用。
(3)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法制备。纳米疫苗1制备材料PLA分子量为20KDa，纳米粒子内部负载癌细胞裂解物、细菌裂解物以及免疫佐剂，表面负载癌细胞裂解物组分。所采用的免疫佐剂为CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和poly ICLC，且佐剂负载于纳米粒子内部，制备纳米粒子时使用的癌细胞裂解物抗原组分与细菌裂解物组分的质量比为1:1。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载癌细胞裂解物抗原、细菌裂解物组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mLPBS中，并于0.1mL含有癌细胞裂解物抗原组分(80mg/mL)的样品室温混合孵育5分钟后即可使用。纳米粒子1平均粒径为400nm左右，每1mg PLA纳米粒子1约负载400μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLA纳米粒负载CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和Poly ICLC免疫佐剂各0.005mg。
纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备材料和制备方法纳米粒子1，粒径为400nm左右，每1mg PLA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLA负载CpG1585(A类)、CpG2336(A类)和Poly ICLC各0.005mg。
(8)纳米疫苗用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞，在第5、第8天、第13天和第20天分别给小鼠注射100μLPBS或者0.1mg的纳米疫苗(纳米疫苗1，或者纳米疫苗2)。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(9)实验结果
如图10所示，PBS对照组的小鼠的肿瘤都生长很快小鼠生存期很短。与对照组相比，几种纳米疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且，纳米疫苗1效果更好。
实施例9疫苗用于黑色素瘤的治疗
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系和S91黑色素瘤癌细胞系两种黑色素瘤细胞系收集后按数量比1:1混合，然后在500g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并伴有超声以裂解细胞。待细胞裂解后，尔后将裂解物以10000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.3M硫酸二甲双胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.3M硫酸二甲双胍水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.3M硫酸二甲双胍水溶液备用，将上清液与DNA消化酶共作用5分钟后在100℃加热2分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.3M硫酸二甲双胍水溶液；然后将使用0.3M硫酸二甲双胍溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。
将以上0.3M硫酸二甲双胍溶液溶解的裂解液中所有非水溶性组分和0.3M硫酸二甲双胍溶液溶解的水溶性组分中的部分组分按质量比1:5混合即为制备纳米疫苗的抗原组分。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用复乳法制备。所采用的纳米疫苗1的制备材料为PLGA分子量为24KDa-38KDa。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2216，增加溶酶体免疫逃逸的物质为KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)，且佐剂、KALA多肽包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分、佐剂、KALA多肽，在内部负载上述组分后将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为250nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG1018和CpG2216各0.04mg,负载KALA多肽0.3mg。
纳米疫苗2(Nanovaccine 2)的制备材料和方法相同，其粒径为250nm左右，表面电位为-5mV左右，不负载KALA多肽，负载等量佐剂和细胞裂解抗原组分。
纳米疫苗3(Nanovaccine 3)的制备材料和制备方法相同，为250nm左右，表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)0.04mg,负载CpG1018为0.08mg,负载KALA多肽0.3mg。
(7)纳米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别皮下注射100μL PBS或者0.4mg相应的纳米疫苗。在实验中，小鼠肿瘤体积和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图11所示，结果显示，PBS对照组的肿瘤很快都长大。与对照组相比，纳米疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢生存期明显延长。而且，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2和纳米疫苗3，这说明，加入促进溶酶体逃逸物质的纳米疫苗效果更好；使用两种CpG和Poly(I:C)作为混合佐剂的纳米疫苗治疗效果好于只使用一种CpG和Poly(I:C)混合佐剂的纳米疫苗。综上所述，本公开所述的纳米疫苗对癌症具有良好的治疗效果。
实施例10微米疫苗用于癌症的预防
(1)癌细胞及细菌外囊泡组分的制备
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后使用6M盐酸胍水溶液裂解癌细胞后使用8M尿素水溶液溶解裂解物组分。
将嗜酸乳杆菌在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，然后在16000g离心90分钟，弃去上清液后所得沉淀即为细菌外囊泡组分，将沉淀使用8M尿素水溶液裂解后溶解细菌外囊泡组分。
将溶解于8M尿素溶液的癌细胞裂解液组分和溶解于8M尿素溶液的细菌外囊泡组分按照质量比8:1混合，然后在混合后的样品中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液进行盐析，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，弃去上清液后将盐析所得沉淀溶解于6M盐酸胍水溶液中，即得制备微米疫苗1的抗原组分1。
或者将溶解于8M尿素溶液的癌细胞裂解液组分和溶解于8M尿素溶液的细菌外囊泡组分按照质量比8:1混合，然后在混合后的样品中逐滴加入饱和硫酸铜水溶液进行盐析，待沉淀完全后将所得样品在12000g离心5分钟，弃去上清液后将盐析所得沉淀溶解于6M盐酸胍水溶液中，即得制备微米疫苗2的抗原组分2。
(2)微米疫苗的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用复乳法制备。微米疫苗1骨架材料为PLGA(分子量为20KDa-40KDa)和PEG2000-PLGA(PLGA部分分子量为20KDa-40KDa)；其中PLGA与PEG2000-PLGA质量比为9:1。所采用的免疫佐剂为CpG1018和Poly ICLC。制备时先采用复乳法制备内部负载抗原组分、和佐剂的微米粒子,尔后，将100mg微米粒子在8000g离心15分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后即得微米疫苗1，平均粒径为3.0μm左右，每1mg PLGA微米粒子1约负载100μg蛋白质或多肽组分(抗原组分1)，负载CpG 1018和Poly ICLC各0.15mg。
微米疫苗2(Micronvaccine 2)制备材料和制备方法同微米疫苗1，粒径为3.0μm左右，每1mg PLGA微米粒子1约负载100μg蛋白质或多肽组分(抗原组分2)，负载CpG1018和Poly ICLC各0.15mg。
微米疫苗3(Micronvaccine 3)制备材料和制备方法同微米疫苗1，粒径为3.0μm左右，负载等量抗原组分1，但是不负载CpG1018和Poly ICLC。
(3)微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在小鼠接种肿瘤前第-35、第-28天、第-21天、第-14天和第-7天分别给小鼠注射100μLPBS或者1.5mg的微米疫苗(微米疫苗1，或者微米疫苗2，或者微米疫苗3)，在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞，小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图12所示，与PBS对照组相比，微米疫苗处理的小鼠，其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，微米疫苗1明显好于微米疫苗2和微米疫苗3，说明使用特定盐析试剂效果更好，而且混合佐剂的加入有助于提高疫苗效果。由此可见，本公开所述的微米疫苗可被用于预防或者治疗癌症。
实施例11纳米疫苗用于结肠癌的治疗
(1)癌细胞裂解物组分及癌细胞外囊泡组分的制备
收集MC38癌细胞系及其培养基，然后在500g离心5分钟，收集细胞沉淀后将细胞沉淀使用6M盐酸胍水溶液裂解后完全溶解即为收集到的癌细胞裂解物组分；收集培养基上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，然后在160000g离心90分钟，弃去上清液后将沉淀使用6M盐酸胍水溶液裂解后完全溶解即为收集到的癌细胞细胞外囊泡裂解物组分。将上述二者合并，然后加入饱和硫酸镁水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀二次溶解于0.3M胍基琥珀酸钠和0.1M精氨酸水溶液，即得到制备纳米粒子1和纳米疫苗4的抗原组分1。
收集MC38癌细胞系及其培养基，然后在500g离心5分钟，收集细胞沉淀后将细胞沉淀使用6M盐酸胍水溶液裂解后完全溶解即为收集到的癌细胞裂解物组分；收集培养基上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，然后在160000g离心90分钟，弃去上清液后将沉淀使用6M盐酸胍水溶液裂解后完全溶解即为收集到的癌细胞细胞外囊泡裂解物组分。将上述二者合并，然后加入饱和硫酸镁水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀使用5％PEG5000水溶液增溶，即得到制备纳米粒子2和纳米疫苗5的抗原组分2。
收集MC38癌细胞系及其培养基，然后在500g离心5分钟，收集细胞沉淀后将细胞沉淀使用5％PEG5000水溶液裂解后使用5％PEG5000水溶液增溶后即为收集到的癌细胞裂解物组分；收集培养基上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，然后在160000g离心90分钟，弃去上清液后将沉淀使用6M盐酸胍水溶液裂解后完全溶解即为收集到的癌细胞细胞外囊泡裂解物组分。将上述二者合并，然后加入饱和硫酸镁水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀使用0.3M胍基琥珀酸钠和0.1M精氨酸水溶液溶解，即得到制备纳米粒子3和纳米疫苗6的抗原组分3。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1采用复乳法制备。纳米粒子1的制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，以Poly(I:C)、CpG2336和CpG2006为佐剂，抗原组分1和免疫佐剂均负载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备时首先在纳米粒子内部负载抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在15000g离心30分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用；该纳米粒子1平均粒径为110nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载2μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006各0.01mg。
纳米粒子2的制备材料和制备方法同纳米粒子1,但是内部负载的是抗原组分2和佐剂，粒径为110nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载2μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006各0.01mg。
纳米粒子3的制备材料和制备方法同纳米粒子1,但是内部负载的是抗原组分3和佐剂，粒径为110nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载2μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006各0.01mg。
(3)抗原提呈细胞的制备和激活
本实施例使用BMDC和B作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同上。B细胞来自小鼠外周血PBMC，使用磁珠分选得到。将BMDC与B细胞按照数量比1:1混合后即为混合抗原提呈细胞。将1mg的纳米粒子1或者纳米粒子2或者纳米粒子3与BMDC(1000万个)及B细胞(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有长春碱(10ng/mL)和Flt3L(100ng/mL)。
(4)负载抗原提呈细胞的膜组分以及癌细胞细胞外囊泡膜组分的纳米疫苗的制备
收集孵育后的混合抗原提呈细胞2000万个，在400g离心5分钟，弃去沉淀后收集上清液，将上清液在16000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡。
收集培养的MC38-OVA细胞2000万个，在400g离心5分钟，弃去沉淀后收集上清液，将上清液在15000g离心60分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得癌细胞的细胞外囊泡。
将收集的被激活的抗原提呈细胞的细胞外囊泡与癌细胞细胞外囊泡混合，然后在4℃低功率(20W)超声2分钟，然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出，将挤出液与步骤(2)制备的纳米粒子1或者纳米粒子2混合后使用高压均质机(10000bar)处理1分钟，然后使用0.22μm的滤膜反复共挤出，然后在15000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在4％的海藻糖水溶液中重悬后冷冻干燥48小时后即得纳米疫苗。其中，使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子1共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗4(Nanovaccine4)，粒径为120纳米，每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006免疫佐剂各10μg，每1mgPLGA约负载80μg膜组分。使用纳米粒子2激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子2共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗5(Nanovaccine 5)，粒径为120纳米，每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006免疫佐剂各10μg，每1mg PLGA约负载80μg膜组分。使用纳米粒子3激活的抗原提呈细胞外囊泡膜组分与纳米粒子3共作用所制备的纳米疫苗为纳米疫苗6(Nanovaccine 6)，粒径为120纳米，每1mgPLGA负载poly(I:C)、CpG2336和CpG2006免疫佐剂各10μg，每1mg PLGA约负载80μg膜组分。
(7)纳米疫苗用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38-OVA细胞。在接种结肠癌细胞后第6天、第9天、第12天、第15天、第20天和第25天分别皮下注射0.4mg纳米疫苗(纳米疫苗4、或者纳米疫苗5、或者纳米疫苗6)或者100μL的PBS。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图13所示，与PBS对照组相比，纳米疫苗处理小鼠后其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，纳米疫苗4的效果好于纳米疫苗5和纳米疫苗6。由此可见，说明经过盐析等方法处理的沉淀必须经过适当的溶解剂溶解或增溶后所制备的疫苗才能达到良好的疗效。本公开所述的纳米疫苗对癌症具有优异治疗效果。
实施例12纳米疫苗用于癌症的预防
(1)癌细胞相关组分的制备
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中，然后使用6M盐酸胍水溶液裂解癌细胞并溶解裂解物组分，然后加入饱和硫酸铵水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀再次溶解于6M盐酸胍水溶液，即得到溶解于6M盐酸胍水溶液中的癌细胞中的蛋白质和多肽组分，此为抗原组分1。
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中，然后使用3％吐温80水溶液裂解癌细胞并增溶裂解物组分，然后加入饱和硫酸铵水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀再次使用3％吐温80水溶液增溶，即得到溶解于3％吐温80水溶液中的癌细胞中的蛋白质和多肽组分，此为抗原组分2。
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中，然后使用6M盐酸胍水溶液裂解癌细胞并增溶裂解物组分，然后加入饱和硫酸铵水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀再次使用3％吐温80水溶液增溶，即得到溶解于3％吐温80水溶液中的癌细胞中的蛋白质和多肽组分，此为抗原组分3。
将培养的E.G7-OVA小鼠T淋巴瘤细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中，然后使用3％吐温80水溶液裂解癌细胞并增溶裂解物组分，然后加入饱和硫酸铵水溶液，直到沉淀完全后弃去上清液，将沉淀再次使用6M盐酸胍水溶液溶解，即得到溶解于6M盐酸胍水溶液中的癌细胞中的蛋白质和多肽组分，此为抗原组分4。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中制备纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用复乳法。纳米疫苗1骨架材料为PLA(分子量10-30KDa)和甘露糖-PEG2000-PLA(PLA分子量为10-30KDa),且PLGA(分子量10-30KDa)和甘露糖-PEG2000-PLGA(PLGA分子量为10-30KDa)质量比为9:1。所采用的免疫佐剂为CpG1018、CpG7909和Poly ICLC，所采用的带正电荷物质为R8多肽(RRRRRRRR)。制备时先采用复乳法制备内部负载抗原组分1、佐剂和R8多肽的微米粒子,尔后，将100mg纳米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后即得纳米疫苗1，平均粒径为200nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载5μg癌细胞的蛋白质和多肽组分，负载CpG1018、CpG7909和Poly ICLC各0.02mg，负载R8多肽0.05mg。
纳米疫苗2(Nanovaccine 2)制备方法同纳米疫苗1。但是内部负载的是抗原组分2、佐剂和R8多肽。纳米疫苗2平均粒径为200nm左右，每1mg PLGA纳米疫苗2约负载5μg癌细胞的蛋白质和多肽组分，负载CpG1018、CpG7909和Poly ICLC各0.02mg，负载R8多肽0.05mg。
纳米疫苗3(Nanovaccine 3)制备方法同纳米疫苗1。但是内部负载的是抗原组分3、佐剂和R8多肽。纳米疫苗3平均粒径为200nm左右，每1mg PLGA纳米疫苗3约负载5μg癌细胞的蛋白质和多肽组分，负载CpG1018、CpG7909和Poly ICLC各0.02mg，负载R8多肽0.05mg。
纳米疫苗4(Nanovaccine 1)制备方法同微米疫苗1。但是内部负载的是抗原组分4、佐剂和R8多肽。纳米疫苗4平均粒径为200nm左右，每1mg PLGA纳米疫苗4约负载5μg癌细胞的蛋白质和多肽组分，负载CpG1018、CpG7909和Poly ICLC各0.02mg，负载R8多肽0.05mg。
(3)纳米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备荷瘤小鼠。在小鼠接种肿瘤前第-35、第-28天、第-21天、第-14天和第-7天分别给小鼠注射100μLPBS或者1mg的纳米疫苗1或者1mg的纳米疫苗2或者1mg的纳米疫苗3或者1mg的纳米疫苗4，在第0天给每只小鼠皮下接种5×105个E.G7-OVA细胞。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(4)实验结果
如图14所示，与PBS对照组相比，微米疫苗处理的小鼠，其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2、纳米疫苗3和纳米疫苗4，说明适当的溶解剂是必须的。由此可见，本公开所述的微米疫苗可被用于预防或者治疗癌症。本实施例中使用了甘露糖作为主动靶向的靶头靶向树突状细胞，在实际应用中也可以使用其他具有靶向性的分子，包括但不限于甘露聚糖、CD11c、CD103、CD32、CD11b、CD19、CD38等。
实施例13负载部分水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗用于治疗黑色素瘤
本实施例中，先使用超纯水裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性抗原，然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备纳米疫苗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.2M盐酸氨基脲水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.2M盐酸氨基脲水溶液备用，将上清液在100℃加热5分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.2M盐酸氨基脲水溶液；然后将使用0.2M盐酸氨基脲溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和0.2M盐酸氨基脲溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗1的抗原组分1。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.2M盐酸氨基脲水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.2M盐酸氨基脲水溶液作为水溶性组分中的一部分组分使用。以上0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和0.2M盐酸氨基脲溶解的水溶性组分中盐析后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗2的抗原组分2。
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.2M盐酸氨基脲水溶液中可溶。将裂解液中的水溶性组分在100℃加热5分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.2M盐酸氨基脲水溶液，即为水溶性组分中的一部分组分。以上0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分和0.2M盐酸氨基脲溶解的水溶性组分中加热后沉淀所得的组分即为制备癌症纳米疫苗3的抗原组分3。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过硫酸铵盐析纯化和加热分离纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(硫酸铵盐析和加热分离纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗1使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将300mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为100nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载250μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.01mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过硫酸铵盐析纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(硫酸铵盐析分离纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗2使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为300nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载250μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.01mg。
本实施例中纳米疫苗3(Nanovaccine 3)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时，肿瘤组织裂解物中水溶性组分中的部分组分为经过加热分离纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分。在制备时，负载癌细胞裂解物中水溶性部分组分(加热分离纯化后使用0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解的组分)的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原(0.2M盐酸氨基脲水溶液溶解)的纳米粒子分别制备，然后使用时一起作为纳米疫苗3使用。所采用的抗原递送纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)且负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子3平均粒径为300nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载250μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒负载poly(I:C)0.01mg。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射2mg纳米疫苗1(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)，或者2mg纳米疫苗2(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)，或者2mg纳米疫苗3(1mg负载水溶性组分中的纯化组分的纳米粒子+1mg负载非水溶性组分的纳米粒子)，或者100μL PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(4)实验结果
如图15所示，图中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)、纳米疫苗2(Nanovaccine 2)和纳米疫苗3(Nanovaccine 3)的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其中一部分小鼠无瘤痊愈。其中，纳米疫苗3好于纳米疫苗2，说明使用加热进行分离纯化的效果好于使用特定试剂进行盐析进行分离纯化的效果；纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2和纳米疫苗3，说明同时使用盐析和加热进行分离纯化的效果明显好于只使用盐析进行分离纯化或者只使用加热进行分离纯化。
实施例14纳米疫苗用于黑色素瘤的治疗
本实施例中，先使用超纯水裂解B16F10黑色素瘤癌细胞以制备癌细胞中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和非水溶性组分，然后，以PLGA和PEG修饰的PLGA为纳米粒骨架材料制备纳米疫苗。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的B16F10细胞，弃去上清液后在癌细胞沉淀中加入适量超纯水重悬并反复冻融5次，并伴有超声以裂解细胞。裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入6M盐酸胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在6M盐酸胍水溶液中可溶。
在裂解液中的水溶性组分在100℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于6M盐酸胍水溶液。将以上6M盐酸胍溶解的水溶性组分中加热后沉淀所得的组分和6M盐酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比1:1混合，即为制备纳米疫苗1、2和3的抗原组分1。
或者将裂解液中的水溶性组分不做任何处理，直接使用。将水溶性组分和6M盐酸胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分按照质量比1:1混合，即为制备纳米疫苗4的抗原组分2。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料为PGLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG2000-PLGA(PLGA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLGA和PEG2000-PLGA的质量比为49:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG7909且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米疫苗1平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)和CpG7909各0.05mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料PGLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG2000-PLGA(PLGA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLGA和PEG2000-PLGA的质量比为500:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG7909且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米疫苗2平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)和CpG7909各0.05mg。
本实施例中纳米疫苗3(Nanovaccine 3)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料PGLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG2000-PLGA(PLGA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLGA和PEG2000-PLGA的质量比为4:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG7909且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米疫苗3平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)和CpG7909各0.05mg。
本实施例中纳米疫苗4(Nanovaccine 4)制备方法和材料同纳米疫苗1。所采用的纳米疫苗制备材料为PGLA(分子量为10KDa-20KDa)和PEG2000-PLGA(PLGA分子量为10KDa-20KDa)，而且使用的PLGA和PEG2000-PLGA的质量比为49:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG7909且佐剂负载于纳米疫苗内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞抗原组分2和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米疫苗4平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载500μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)和CpG7909各0.05mg。
(8)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射100μL的0.2mg纳米疫苗1，或者0.2mg纳米疫苗2，或者0.2mg纳米疫苗3，或者100μL的0.2mg纳米疫苗4，或者100μL的PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。
(9)实验结果
如图16所示，图16中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)、纳米疫苗2(Nanovaccine 2)、纳米疫苗3(Nanovaccine 3)和纳米疫苗4(Nanovaccine 4)的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长。其中，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗4，说明使用加热纯化水溶性组分中蛋白质和多肽组分能够提高疫苗效果，且分离纯化水溶性中组分中一部分组分后的效果，好于直接使用水溶性组分。其中，纳米疫苗1效果好于纳米疫苗2和纳米疫苗3，说明使用特定比例的PEG修饰粒子表面可以提高纳米疫苗或者微米疫苗的疗效。
实施例15纳米疫苗用于治疗黑色素瘤
本实施例中，先分离外周血中的循环肿瘤细胞，然后将外周血中的循环肿瘤细胞体外扩增培养后裂解，收集裂解得到的循环肿瘤细胞的全细胞抗原组分后，将其负载于纳米疫苗用于癌症的预防和治疗。
(1)抗原组分的收集
收集培养的B16F10细胞，然后给每只小鼠后背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，然后在接种癌细胞后15天处死小鼠收集外周血，分离外周血中的循环肿瘤细胞后，将其在体外培养扩增。收集扩增培养后的外周循环肿瘤细胞后，在其中加入适量超纯水并反复冻融5次以裂解循环肿瘤细胞。尔后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.2M盐酸甲基胍水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.2M盐酸甲基胍水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.2M盐酸甲基胍水溶液备用；将上清液在100℃加热5分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.2M盐酸甲基胍水溶液；然后将使用0.2M盐酸甲基胍溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。将以上0.2M盐酸甲基胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分与0.2M盐酸甲基胍溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分按质量比1:1混合,即为抗原组分1。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备,纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa，免疫佐剂为poly(I:C)。制备时先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原组分1和佐剂，然后将1000mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为300nm左右，每1mgPLGA纳米粒子约负载250μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)0.01mg。
本实施例中纳米疫苗2(Nanovaccine 2)采用溶剂挥发法中的复乳法制备,纳米粒子制备材料PLGA分子量为20KDa-40KDa，免疫佐剂为poly(I:C)。制备时先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原组分1和佐剂，然后将1000mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子2平均粒径为300nm左右，每1mgPLGA纳米粒子约负载0.025ng蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)0.01mg。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射0.5mg纳米疫苗(纳米疫苗1，或者纳米疫苗2)或者100μLPBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。小鼠肿瘤检测方法同上。
(4)实验结果
如图17所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其中一部分小鼠无瘤痊愈。这说明使用循环肿瘤细胞裂解物中的部分组分制备的癌症纳米疫苗可以有效治疗癌症。
实施例16纳米疫苗用于黑色素瘤的治疗
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的B16F10细胞，弃去上清液后将癌细胞使用0.2M盐酸聚六亚甲基胍和0.2M硫酸胍基丁胺裂解，然后使用0.2M盐酸聚六亚甲基胍和0.2M硫酸胍基丁胺水溶液溶解裂解物组分。将裂解物组分在100℃加热10分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.2M盐酸聚六亚甲基胍和0.2M硫酸胍基丁胺水溶液；在上述所得上清液中逐滴加入饱和氯化钠水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.2M盐酸聚六亚甲基胍和0.2M硫酸胍基丁胺水溶液水溶液备用；然后将使用溶解液溶解的加热后的沉淀和使用溶解液溶解液盐析后的沉淀合并，即为制备纳米疫苗1的抗原组分1。
(2)纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗1(Nanovaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备。所采用的纳米疫苗制备材料为PGLA(分子量为20KDa-40KDa)和PEG5000-PLGA(PLGA分子量为20KDa-40KDa)，而且使用的PLGA和PEG5000-PLGA的质量比为99:1；所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG7909。制备方法如前所述，先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原组分1和佐剂，然后将100mg纳米粒子在14000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。纳米疫苗1平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载200μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)和CpG7909各0.01mg。
(3)纳米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射100μL的0.1mg纳米疫苗1或者100μL的PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。小鼠肿瘤提交监测方法同上。
(4)实验结果
如图18所示，图18中PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用纳米疫苗1(Nanovaccine 1)的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长。
实施例17微米疫苗用于治疗黑色素瘤
(1)抗原组分的收集
收集培养的B16F10细胞，然后给每只小鼠后背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后加入适量超纯水并反复冻融5次以裂解循环肿瘤细胞。尔后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入0.1M盐酸四甲基胍的水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在0.1M盐酸四甲基胍水溶液中可溶。在裂解液中的水溶性组分中逐滴加入饱和硫酸铵水溶液，待沉淀完全后将所得样品在3000g离心5分钟，将沉淀溶解于0.1M盐酸四甲基胍水溶液备用，将上清液在100℃加热5分钟后将所得样品在3000g离心5分钟，弃去上清液后将沉淀溶解于0.1M盐酸四甲基胍水溶液；然后将使用0.1M盐酸四甲基胍溶解的盐析后的沉淀和加热后的沉淀合并后作为水溶性组分中的一部分组分使用。将以上0.1M盐酸四甲基胍水溶液溶解的裂解液中非水溶性组分与0.1M盐酸四甲基胍溶解的水溶性组分中盐析和加热后沉淀所得的组分按质量比1:1混合,即为微米疫苗1的抗原组分1。
(2)微米疫苗的制备
本实施例中微米疫苗1(Micronvaccine 1)采用溶剂挥发法中的复乳法制备,纳米粒子制备材料PLGA分子量为40KDa-60KDa，免疫佐剂为poly(I:C)。制备时先采用复乳法在微米粒子内部负载抗原组分1和佐剂，然后将200mg微米粒子在9000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该微米粒子1平均粒径为3.0μm左右，每1mgPLGA微米粒子约负载450μg蛋白质或多肽组分，负载poly(I:C)0.01mg。
(3)微米疫苗治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在小鼠接种肿瘤前第3天，第6天，第9天，第14天和第20天分别在小鼠皮下注射0.2mg微米疫苗1或者100μL PBS。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。小鼠肿瘤检测方法同上。
(4)实验结果
如图19所示，PBS组小鼠肿瘤体积快速长大小鼠很快死亡。使用微米疫苗1(Micronvaccine 1)的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，生存期明显延长，其中一部分小鼠无瘤痊愈。这说明使用循环肿瘤细胞裂解物中的部分组分制备的癌症微米疫苗可以有效治疗癌症。
本公开中涉及的氨基酸序列如下所示：
R8多肽，RRRRRRRR(SEQ ID NO:1)
B16-M20抗原多肽，FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM(SEQ ID NO:2)
B16-M24抗原多肽，TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD(SEQ ID NO:3)
B16-M46抗原多肽，NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ(SEQ ID NO:4)
TRP2:180-188抗原多肽，SVYDFFVWL(SEQ ID NO:5)
蜂毒肽，GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:6)
KALA多肽，WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA(SEQ ID NO:7)
RALA多肽，WEARLARALARALARHLARALARALRACEA(SEQ ID NO:8)
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本公开创造的保护范围之中。
Claims (12)
1.一种癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗包括：
(i)粒子材料形成的纳米粒子或微米粒子骨架结构，和负载于骨架结构上的(ii)癌细胞或肿瘤组织中的一部分组分，
所述癌细胞或肿瘤组织中的一部分组分为癌细胞和/或肿瘤组织的裂解物中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，和癌细胞和/或肿瘤组织的裂解物中的非水溶性组分、或裂解物中的非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分，或直接获取的抗原组分；
所述裂解物中的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备方法包括：将所有水溶性组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后，沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液再溶解；
所述裂解物中的非水溶性组分制备方法包括：将非水溶性部分直接使用含有溶解剂的溶解液溶解；
所述裂解物中的非水溶性组分中的蛋白质和多肽组分制备方法包括：将非水溶性部分使用含有溶解剂的溶解液溶解后经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解；
所述直接获取的抗原组分的制备方法包括：将癌细胞和/或肿瘤组织使用含有溶解剂的溶解液裂解后，使用含有溶解剂的溶解液溶解得到的裂解物组分，然后将所得溶解后裂解物组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后再将所得沉淀组分使用含有溶解剂的溶解液二次溶解；
所述溶解剂独立地选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、氨基、羧基、取代或未取代胍基。
2.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：癌细胞为来自一个或多个机体的癌细胞，或者来自于一种或多种癌细胞系；肿瘤组织为来自一个或多个机体的肿瘤组织。
3.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗还负载有至少一种如下所示的组分：
(iii)水溶性组分中的mRNA组分；
(iv)免疫佐剂；
(v)带正电荷的物质，其选自带正电荷的氨基酸、带正电荷的多肽、带正电荷的脂质、带正电荷的蛋白质、带正电荷的聚合物，和/或带正电荷的无机物。
4.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：骨架材料、蛋白质和多肽组分的质量比为1：0.001-10。
5.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于，所述癌症疫苗还负载有至少一种如下所示的组分：
(a)来源于肿瘤组织和/或肿瘤细胞的癌细胞膜组分；
(b)来源于细胞外囊泡裂解物的细胞外囊泡膜组分，所述细胞外囊泡由细菌或肿瘤细胞分泌；
(c)来源于细菌裂解物的细菌膜组分；
(d)来源于抗原提呈细胞的细胞膜组分。
6.根据权利要求5所述的癌症疫苗，其特征在于，所述细菌裂解物或细胞外囊泡裂解物由细菌或细胞外囊泡经含有裂解剂的裂解液裂解得到；
所述裂解剂选自含有结构式1结构的化合物、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、多肽、氨基酸、糖苷和胆碱中的一种或多种；其中，结构式1如下：
R1为C、N或O，R2～R5独立地选自氢、烷基、氨基、羧基、取代或未取代胍基。
7.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：盐析试剂所含的阳离子包括Al3+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、Sn2+、Zn2+、Ca2+、Li+、Na+、NH4 +、K+、Cu2+、Ag+、Ba2+中的一种或几种；盐析试剂所含的阴离子包括Cl-、SO4 2-、NO3 -、CO3 2-、SiO3 2-、S2O7 2-、B4O7 2-、PO4 3-、RCOO-、NO2 -、S2O8 2-、S2-、CrO4 2-、MnO4 -、P2O7 4-中的一种或几种。
8.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：所述粒子材料选自天然高分子材料、合成高分子材料和无机材料中的一种或几种。
9.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：所述癌症疫苗为纳米疫苗或微米疫苗；其中，
所述纳米疫苗的粒径为1nm-1000nm；
所述微米疫苗的粒径为1μm-1000μm。
10.根据权利要求1所述的癌症疫苗，其特征在于：所述粒子材料经聚乙二醇修饰。
11.权利要求1-10任一项所述的癌症疫苗在如下(1)-(2)至少一项中的应用：
(1)制备用于预防或治疗疾病的药物；
(2)制备用于诱导免疫应答的药物。
12.一种癌症疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)使用不含溶解剂的溶解液裂解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物，使用离心、过滤、透析、超滤中的一种或多种方法将裂解物中的水溶性组分和非水溶性组分分离，分别得到水溶性组分和非水溶性组分；或者直接使用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞和/或肿瘤组织得到其裂解物；
(2)将水溶性组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后得到沉淀，然后将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解，非水溶性组分使用含有溶解剂的溶解液溶解后再经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后再使用含有溶解剂的溶解液溶解，或者非水溶性组分不经处理直接使用含有溶解剂的溶解液溶解；或者将含有溶解剂的溶解液溶解的全细胞裂解物组分经过盐析、加热和酶解中至少一种手段处理后得到沉淀，然后再将沉淀部分使用含有溶解剂的溶解液溶解，得到直接获取的抗原组分；
(3)将得到的水溶性组分中的蛋白质和多肽组分和/或非水溶性组分或其中的蛋白质和多肽组分负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面，得到所述癌症疫苗；或将直接获取的抗原组分负载到纳米粒子或微米粒子的内部和/或表面，得到所述癌症疫苗。
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