CN114225021A - 基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统 - Google Patents
基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统 Download PDFInfo
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Abstract
本申请属于免疫治疗领域，公开了一种基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统及其制备方法与应用，利用修饰的纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子递送一种或多种癌细胞和/或组织的全细胞组分的水溶性成分和/或非水溶性成分，用于制备预防、治疗癌症的疫苗。水溶性部分和/或非水溶性部分都被负载于纳米粒子或微米粒子中，即变异蛋白质或多肽就都被负载于纳米疫苗或微米疫苗中。利用全细胞组分或其混合物中这些具有免疫原性的物质即可用于癌症的预防和治疗。在疫苗制备过程加入化学修饰和添加带电物质等方法的修饰处理，增加抗原量，可使疫苗的效果更好。因此本发明所述疫苗系统可以预防和/或治疗癌症。
Description
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，具体涉及一种基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的纳米或微米的癌症疫苗及其修饰处理制备技术，尤其是涉及一种基于一种或一种以上癌症的癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞组分的癌症疫苗及其在预防和治疗癌症中的应用。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，近些年来免疫技术发展很快，尤其是癌症的免疫治疗领域，发现人体的免疫系统和各类免疫细胞在抑制癌症发生、发展的过程中扮演着关键角色，通过调节机体免疫系统的平衡，有望影响和控制癌症的发生、发展和治疗。癌症疫苗在癌症免疫治疗和预防的重要方法之一。开发癌症疫苗的基础是选择合适的癌症抗原来激活人体免疫系统对异常突变的癌细胞的识别，而癌症细胞或者癌症肿瘤组织本身是最好的癌症抗原的来源。科学家曾采用新技术从癌症病人的肿瘤细胞分析鉴别癌症特异性的或癌症相关的抗原多肽，但是该类方法费时费力，花费巨大。而且所采用的方法都是只从癌细胞水溶性组分中提取分析癌细胞与正常细胞的差异进而寻找有差异的多肽，因而该类方法和技术只能找到有限的几种水溶性好的抗原多肽，从而极大的限制了该类方法的应用。发明人之前公开了将癌细胞或癌症组织的全细胞组分作为疫苗用于预防和治疗癌症的疫苗的来源，是很有前景的方法，但是其应用效果还需改善。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种修饰处理方法以提高基于一种负载一种或多种癌症细胞和/或肿瘤组织的全细胞组分或其混合物的微米或纳米疫苗在预防或治疗癌症中的疗效。本发明在纳米疫苗或微米疫苗制备过程中采用固化处理和加入带正电的物质等修饰方法处理可以提高疫苗的抗原负载量，并进而提高疫苗的预防和治疗的疗效。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，包括纳米和/或微米粒子、全细胞组分或其混合物、提高抗原负载量或免疫原性的修饰物；所述全细胞组分或其混合物为一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物；所述纳米疫苗和/或微米疫苗在制备过程中使用适当的修饰技术以提高疫苗的抗原负载量和/或免疫原性并进而提高疫苗的疗效。
本发明基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统为纳米或微米的疫苗系统，称为纳米疫苗或微米疫苗，可以预防或治疗癌症，由纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子和所述粒子负载的全细胞组分或其混合物、修饰物组成，或者由纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子和所述粒子负载的全细胞组分或其混合物、免疫佐剂、修饰物组成；所述全细胞组分为癌细胞和/或肿瘤组织中全细胞的水溶性成分混合物和/或非水溶性成分或者其混合物。混合物可为但不限于水溶性成分互相混合，或者非水溶性成分互相混合，或者全部和/或部分水溶性组分与全部和/或部分水溶性组分互相混合。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统，所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解后加工得到，或者所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞加工后裂解得到。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统的制备方法为，在修饰物存在下，将一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统；或者在修饰物存在下，将一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物、免疫佐剂负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统。在纳米和/或微米疫苗的制备过程中，可以分一次或多次对纳米粒子内部和/或表面进行修饰处理，以提高疫苗负载的抗原量和/或抗原的免疫原性并进而提高疫苗的效果。具体的，本发明所述基于一种多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统可以按照纳米尺寸粒子和微米尺寸粒子已有的制备方法制备得到，包括但不仅限于常见的溶剂挥发法、透析法、挤出法、热熔法，在制备过程中利用修饰物处理以提高抗原负载量。在一些实施方案中，所述的疫苗系统采用溶剂挥发法中的复乳法制备得到。在纳米疫苗或微米疫苗制备过程中，可以进行一步或多步的固化、加入带正电的物质等处理，以提高抗原的负载量或提高抗原的免疫原性并进而提高疫苗的疗效。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统的活性成分全细胞组分或其混合物为全细胞的水溶性成分混合物和/或非水溶性成分或其混合物，由一种或多种的癌细胞和/或肿瘤组织制备，可以为一种或一种以上的癌细胞制备，也可以由一种或一种以上的肿瘤组织制备，亦可以由一种以上的癌细胞和肿瘤组织混合制备。在制备过程中，采用固化和/或加入带正电物质等修饰技术提高纳米疫苗或微米疫苗抗原的负载量，可以提高疫苗的疗效，此为本发明的创造性所在。制备过程中所使用到的提高抗原负载量或免疫原性的修饰技术，即对纳米粒子内部和/或表面进行修饰处理包括但不限于一步或多步的固化、生物矿化、共价修饰、添加带正电的物质、添加带负电的物质；上述提高抗原负载量或免疫原性的修饰物来自于此，本发明通过固化、生物矿化、共价修饰、添加带正电的物质、添加带负电的物质中的一种或几种方法在疫苗系统上体现提高抗原负载量或免疫原性的修饰物；优选的，修饰为硅化处理、钙化处理、添加带正电的物质、添加带负电的物质中的一种或几种。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统用于预防或治疗癌症及其复发。本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，癌细胞或肿瘤组织中有一种与用于预防或治疗的癌症类型相同。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，所述负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子的内部，和/或分别或同时负载于粒子的表面。全细胞组分或其混合物被负载于纳米和/或微米粒子表面的方式包括但不限于吸附、共价连接、电荷相互作用、疏水相互作用、固化、包裹等。具体的，所述负载方式为全细胞的水溶性成分和非水溶性成分分别或同时被包载于粒子内部，和/或分别或同时负载于粒子表面，包括但不仅限于水溶性成分同时装载于粒子中和负载于粒子表面，非水溶性成分同时装载于粒子中和负载于粒子表面，水溶性成分装载于粒子中而非水溶性成分负载于粒子表面，非水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分装载于粒子中而只有非水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分装载于粒子中而只有水溶性成分负载于粒子表面，水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面，非水溶性成分装载于粒子中而水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面，水溶性成分和非水溶性成分同时装载于粒子中而且水溶性成分和非水溶性成分同时负载于粒子表面。所述负载于纳米粒子和/或微米粒子表面的全细胞组分中的水溶性组分和/或非水溶性组分负载后为一层或多层，优选的，为多层时，层与层之间为修饰物，来自上述修饰技术。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，所述纳米和/或微米粒子内部和/或表面还包括免疫佐剂，其添加方式包括装载于纳米粒子或微米粒子内，或者负载于纳米粒子或微米粒子表面，或者同时装载于纳米粒子或微米粒子内及负载于纳米粒子或微米粒子表面。所述免疫佐剂包括但不限于微生物来源的免疫佐剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、中药及其他类中的至少一类；所述免疫佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗（BCG）、锰相关佐剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、植物油、内毒素、脂质体佐剂、GM-CSF、MF59、双链RNA、双链DNA、铝相关佐剂、CAF01、人参、黄芪的有效成分中的至少一种。本领域技术人员可以理解，所述免疫佐剂也可采用其他可使免疫反应增强的物质。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统表面可以不连接具有主动靶向功能的靶头或者连接有主动靶向功能的靶头；所述靶头可带领输送系统靶向到特定细胞；所述特定细胞或组织为树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴结、胸腺、脾脏、骨髓中的一种或两种以上。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，所述全细胞组分按照在纯水或不含增溶剂的水溶液中的溶解性可分为两部分：水溶性成分和非水溶性成分。所述水溶性成分为可溶于纯水或不含增溶剂的水溶液的原水溶性部分，所述非水溶性成分为在纯水中不溶的原非水溶性部分，采用增溶方法由在纯水或不含增溶剂的水溶液中不溶变为在含增溶剂的水溶液中或有机溶剂中可溶的部分。所述全细胞组分中的水溶性部分和非水溶性部分都可以被含增溶剂的增溶水溶液或有机溶剂溶解。所述增溶剂为可以增加蛋白质或多肽在水溶液中溶解性的增溶剂中的至少一种；所述有机溶剂为可以溶解蛋白质或多肽的有机溶剂。所述增溶剂包括但不限于尿素、盐酸胍、脱氧胆酸钠、SDS、甘油、pH大于7的碱性溶液、pH小于7的酸性溶液、各类蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、高浓度无机盐、Triton、吐温、DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、丙醇、异丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱、Brij™-35、Octaethylene glycolmonododecyl ether、CHAPS、Digitonin、lauryldimethylamine oxide、IGEPAL® CA-630。本领域技术人员可以理解，所述非水溶性成分也可采用其他可使蛋白质和多肽片段增溶的方法由在纯水中不溶变为可溶。所述有机溶剂包括但不限于DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、丙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯。本领域技术人员可以理解，所述有机溶剂也可采用其他可使蛋白质和多肽片段增溶的含有机溶剂的方法。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，纳米和/或微米粒子为纳米级尺寸的粒子和/或微米级尺寸的粒子。所述纳米疫苗和纳米级尺寸的粒子的粒径为1nm-1000nm，优选为50nm-800nm，进一步优选为100nm-600nm；所述微米疫苗和微米级尺寸的粒子的粒径为1μm-1000μm，优选为1μm-100μm，进一步优选为1μm-10μm，更优选为为1μm-5μm；纳米和/或微米粒子的形状为常见的任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形；所述纳米和/或微米疫苗系统表面可为电中性，带负电或者带正电。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统中，纳米和/或微米粒子的制备材料为有机合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料。其中所述有机合成高分子材料为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于PLGA、PLA、PGA、Poloxamer、PEG、PCL、PEI、PVA、PVP、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽、合成脂质。所述的天然高分子材料为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于卵磷脂、胆固醇、淀粉、脂类、糖类、多肽、海藻酸钠、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分。所述的无机材料为无明显生物毒性的材料，包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙、磷酸钙。
本发明所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统可将装载的全细胞组分递送给相关免疫细胞，通过所装载成分的免疫原性而激活和增强自身免疫系统对癌细胞的杀伤作用。因此本发明还提供了所述基于多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统在制备预防和/或治疗癌症的疫苗中的应用。
本发明所述全细胞组分或其混合物的癌症疫苗系统在预防或治疗疾病时可以同时使用只负载水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子和只负载非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子、使用只负载非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子或者使用同时负载水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子和/或微米粒子。
由上述技术方案可知本发明提供了一种利用纳米级尺寸或微米级尺寸的粒子递送细胞水溶性成分和/或非水溶性成分的输送系统，以及用于制备预防和治疗癌症的疫苗中的应用。因为相关细胞或组织的全细胞组分按照在纯水中的溶解性被分为两部分，可溶于纯水的水溶性部分和在纯水中不溶的非水溶性部分，并且水溶性部分和非水溶性部分都被负载于纳米粒子或微米粒子中，所以细胞组分中因为癌症所产生的变异蛋白质或多肽就大部分都被负载于纳米粒子或微米粒子中。细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分囊括了整个细胞的成分；细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分也可以同时被含有增溶剂的水溶液溶解。其中与正常细胞成分相同未突变的蛋白质、多肽和基因因为自身免疫系统发育过程中所产生的免疫耐受不会引起免疫反应；而因为癌症等产生的基因、蛋白质和多肽的突变因为没有自身免疫系统发育过程中所产生的免疫耐受因而具有免疫原性且可激活免疫反应。利用全细胞组分中这些因为疾病突变而产生的具有免疫原性的物质即可用于癌症的治疗。纳米疫苗或者微米疫苗中负载的抗原含量越高，疫苗在使用时所需的量就越少，同等剂量下的疗效也就会越好，为此，本发明提出可通过固化、生物矿化、加入带正电物质、加入带负电物质、共价修饰等方法增加疫苗对于抗原的负载量或免疫原性，进而增强疫苗的疗效。
本发明所述癌症疫苗系统可以制备预防和/或治疗癌症的疫苗。在用作癌症疫苗以预防和治疗癌症时，本发明所述的疫苗可以在癌症发生前或癌症发生后或手术切除肿瘤组织后多次给药以激活机体免疫系统，从而延缓癌症的进展、治疗癌症或者预防癌症的复发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 为本发明所述疫苗的制备过程及应用领域示意图；a:水溶性组分和非水溶性组分分别收集和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图；b:采用含有增溶剂的增溶液溶解全细胞组分和制备纳米疫苗或微米疫苗的示意图；在包载、负载组分时，利用修饰技术提高装载量。
图2为载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子的结构示意图。
图3为载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子的结构示意图。
图4为主动靶向靶头修饰的载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图。
图5为主动靶向靶头修饰的载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图。
图6为主动靶向靶头修饰的载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图。
图7为实施例1小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图8为实施例2小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图9为实施例3小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图10为实施例4小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图11为实施例5小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图12为实施例6小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图13为实施例7小鼠肿瘤实验结果；
图14为实施例8小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图15为实施例9小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图16为实施例10小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图17为实施例11小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；
图7至图17中，a, 纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果 （n≥8）； b, 纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗其他癌症时的小鼠生存期实验结果（n≥8），每个数据点为平均值±标准误差（mean±SEM）；a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test 分析；**表示疫苗组与PBS空白对照组相比p＜0.005，有显著性差异；##代表疫苗组与空白纳米粒+细胞裂解物对照组相比p＜0.005，有显著性差异； ***表示疫苗组与PBS空白对照组相比p＜0.0005，有显著性差异；###代表疫苗组与空白纳米粒+细胞裂解物对照组相比p＜0.0005，有显著性差异。$代表疫苗组与未修饰疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；$$代表疫苗组与未修饰疫苗组相比p＜0.005，有显著性差异；
代表冷冻硅化处理疫苗组与常温硅化处理疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；&代表同时经过低温硅化和添加带电物质两种修饰方式的疫苗组与只经过低温硅化修饰的疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；δ代表同时经过低温硅化和添加带电物质两种处理方式的疫苗组与只经过添加带电物质处理的疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异；θ代表与钙化处理疫苗组相比p＜0.05，有显著性差异。
具体实施方式
本发明公开了一种纳米级或微米级的负载一种或一种以上癌症细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的广谱癌症疫苗系统及其应用预防或治疗癌症。在疫苗制备过程中，本发明通过生物矿化和添加阳离子物质等方法增加了抗原的负载量并进而提高了疫苗的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明在将癌细胞和/或组织裂解后首先获取在纯水或不含增溶剂的水溶液中可溶的水溶性组分，尔后采用含有增溶剂的增溶水溶液将水不溶性的组分溶解于增溶液中，这样就可将所有的细胞组分都转变为可在水溶液中溶解的组分并进而将其负载于纳米粒子或微米粒子内外以制备纳米疫苗或微米疫苗用于癌症的预防和治疗。在实际应用中也可将细胞或组织裂解后直接采用含有增溶剂的增溶水溶液溶解全细胞组分而不分别收集水溶性组分和非水溶性组分，并采用增溶水溶液溶解后的全细胞组分制备纳米疫苗或微米疫苗。
本发明通过采用含有增溶剂的水溶液将细胞中不溶于纯水或不含增溶剂水溶液的组分转化为在特定增溶溶液中可溶并可被用于制备纳米粒子和微米粒子，从而提高了纳米粒子或微米粒子所负载的抗原物质或成分的全面性和免疫原性。将癌细胞和/或肿瘤组织中全细胞组分分为可在纯水或不含增溶剂水溶液中溶解的水溶性部分和可用一定增溶剂溶解于水溶液中的非水溶性部分，并将水溶性部分和非水溶性部分包载于纳米粒子或微米粒子中和负载于其表面，从而保证了绝大部分抗原物质被负载于所制备的疫苗中。细胞组分中水溶性部分和非水溶性部分囊括了整个细胞的成分和组分。其中与正常细胞成分相同未突变的蛋白质、多肽和基因因为自身免疫系统发育过程中所产生的免疫耐受不会引起免疫反应；而因为癌症产生的基因、蛋白质和多肽的突变因为没有自身免疫系统发育过程中所产生的免疫耐受因而具有免疫原性且可激活机体针对癌细胞的免疫反应。利用全细胞组分中这些因为疾病突变而产生的具有癌细胞特异性免疫原性的物质即可用于癌症的预防和治疗。
本发明所述全细胞组分或其混合物的输送系统可用于制备预防和/或治疗癌症的疫苗，其制备过程及应用领域如图1所示。在制备时可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性组分和水不溶性组分并分别制备纳米疫苗或微米疫苗；或者也可以直接采用含有增溶剂的增溶液直接裂解细胞或组织并溶解全细胞组分并制备纳米疫苗或微米疫苗，在其制备过程中，可在疫苗内部或表面进行生物矿化和添加阳离子物质等方法以增加同等条件下的抗原负载量并进而提高疫苗的疗效。
本发明全细胞组分或其混合物由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞裂解后加工得到，或者所述全细胞组分由一种或多种细菌的全细胞加工后裂解得到。全细胞组分在裂解前或（和）裂解后既可经过包括但不限于灭活或（和）变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理等处理后再制备纳米疫苗或微米疫苗；也可细胞裂解前或（和）裂解后不经过任何灭活或（和）变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理直接制备纳米疫苗或微米疫苗。本发明部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或（和）变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或（和）变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或（和）变性处理；本发明部分实施例中细胞裂解前或（和）裂解后的灭活或（和）变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。得到的广谱癌症疫苗系统，表面可以不连接具有主动靶向功能的靶头或者连接有主动靶向功能的靶头。
本发明所述基于多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统的结构示意图如图2-图6所示，为了表示简洁，没有示出修饰物质，不影响本领域技术人员的理解。在实际使用过程中可以为只使用其中的某一种特定结构的纳米粒子和/或微米粒子，或者是同时使用两种或两种以上的不同结构的纳米粒子和/或微米粒子。图2-图3为载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子的结构示意图，其中1：细胞或组织组分中的水溶性成分；2，细胞或组织组分中的非水溶性成分；3，免疫佐剂；4，纳米粒子或微米粒子；5：纳米粒子中的内核部分；2.a-5.i中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；6.a-9.i中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；10.a-13.i中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；14.a-17.i纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；2.a-i，6.a-i，10.a-i和14.a-i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；3.a-i，7.a-i，11.a-i和15.a-i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了一个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；4.a-i，8.a-i，12.a-i和16.a-i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时形成了多个内核部分，内核可为制备过程中生成或通过使用聚合物或无机盐等方式形成；5.a-i，9.a-i，13.a-i和17.a-i中纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时位于所形成内核的外层；a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分而表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分而表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分；f: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的水溶性成分；g: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的非水溶性成分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分；i: 纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分。图4-图6所示为主动靶向靶头修饰的载有水溶性和非水溶性细胞组分的纳米粒子或微米粒子的结构示意图，其中1：细胞或组织组分中的水溶性成分；2：细胞或组织组分中的非水溶性成分；3：免疫佐剂；4：纳米粒子或微米粒子；5：纳米粒子中的内核部分；6：可以靶向特定细胞或者组织的靶头。2.a-5.i中纳米粒子或微米粒子表面和内部均含有免疫佐剂；6.a-9.i中免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子的内部；10.a-13.i中纳米粒子或微米粒子只在外表面含有免疫佐剂；14.a-17.i纳米粒子或微米粒子内部和外表面均无免疫佐剂；18.a-19i细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子内部；20.a-i、23.a-i细胞组分和/或免疫佐剂只分布于纳米粒子或微米粒子外部；21.a-22.i细胞组分和免疫佐剂分别分布于纳米粒子或微米粒子内部或外部。在图4-5中，2.a-2.i，6.a-6.i，10.a-10.i和14.a-14.i纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；3.a-3.i，7.a-7.i，11.a-11.i和15.a-15.i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；4.a-4.i，8.a-8.i，12.a-12.i和16.a-16.i纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分；5.a-5.i，9.a-9.i，13.a-13.i和17.a-17.i纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层；a：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分；b：纳米粒子或微米粒子内部包载和表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分；c：纳米粒子或微米粒子内部包载的为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分而表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分；d：纳米粒子或微米粒子内部包载的为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分而表面负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分；e：纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面也同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分；f: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的水溶性成分；g: 纳米粒子或微米粒子内部同时包载的细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面只负载细胞或组织组分中的非水溶性成分；h：纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的非水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分；i: 纳米粒子或微米粒子内部只包载的细胞或组织组分中的水溶性成分，而纳米粒子或微米粒子表面同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分。在图6中，a, b和c中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部时未形成明显的内核；d, e和f中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的一个内核部分；g，h和i中纳米粒子或微米粒子所负载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部的多个内核部分；j，k和l中纳米粒子或微米粒子所包载的细胞或组织组分中的水溶性成分或非水溶性成分分布于纳米粒子或微米粒子内部所形成内核的外层；a, d,g 和j中纳米粒子或微米粒子负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的水溶性成分；b，e，h和k中纳米粒子或微米粒子负载的均为癌细胞或肿瘤组织组分中的非水溶性成分；c，f，i和l中纳米粒子或微米粒子同时负载细胞或组织组分中的水溶性成分和非水溶性成分。
在实施例中，免疫佐剂包载于纳米粒子或微米粒子内并同时负载于纳米粒子或微米粒子表面，在实际使用过程中免疫佐剂也可只包载于纳米粒子或微米粒子内，或者只负载于纳米粒子或微米粒子表面，或者不加入免疫佐剂。在一些实施例中，本发明先将细胞组分中的可溶于纯水的水溶性部分或（和）非水溶性部分经增溶剂进行增溶后包载于纳米粒子或微米粒子内，同时负载免疫佐剂；然后，将细胞组分中的水溶性部分或（和）非水溶性部分负载于纳米粒子表面，同时负载有免疫佐剂。这样就使得纳米粒子或微米粒子中细胞的水溶性组分或非水溶性组分的负载能力可以达到最大。在实际应用中，也可以直接采用含有增溶剂的增溶液（如8M尿素水溶液或6M盐酸胍水溶液）直接裂解细胞或组织并直接溶解全细胞组分，尔后以此制备纳米疫苗或微米疫苗。
在本发明所述制备纳米疫苗及微米疫苗的方法为常用制备方法。在一些实施方案中，制备纳米疫苗采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的纳米粒子制备材料为有机高分子聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）分子量为24KDa-38KDa, 38KDa-54KDa或者7-17KDa, 所采用的免疫佐剂为 poly(I:C)、卡介苗（BCG）cGAS-STING 激动剂或CpG。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况对制备方法、制备过程、所采用的纳米粒子制备材料、免疫佐剂的种类和浓度等进行适当调整。
在纳米粒制备过程中的修饰中，生物矿化的方法本发明使用了硅化和钙化的方法，在实际应用中还可以使用镁化等其他可以增加抗原负载量的方法。
在一些实施方案中，本发明所采用的复乳法的具体制备方法如下：
步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度医用高分子材料的有机相中。
在一些实施例中，水相溶液可含有癌细胞裂解物中的各组分以及免疫佐剂poly(I:C)、锰佐剂、BCG或CpG；癌细胞裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性组分或者是溶于8M尿素中的原非水溶性组分。水相溶液所含有来自癌细胞的水溶性组分的浓度或者是来自癌细胞的溶于8M尿素中的原非水溶性组分的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1 ng/mL，能负载足够癌症抗原以激活相关免疫反应。免疫佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01 ng/mL。
在一些实施例中，水相溶液含有肿瘤组织裂解物中的各组分以及免疫佐剂poly(I:C)，锰佐剂、BCG或CpG；肿瘤组织裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性组分或者是溶于8M尿素中的原非水溶性组分。水相溶液所含有得来自肿瘤组织的水溶性组分的浓度或者是来自肿瘤组织的溶于8M尿素中的原非水溶性组分的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1 ng/mL，能负载足够癌症抗原以激活相关免疫反应。免疫佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01 ng/mL。
在本发明中，将医用高分子材料溶解于有机溶剂中，得到第二预定体积的含有第二预定浓度医用高分子材料的有机相。在一些实施例中，医用高分子材料为PLGA，有机溶剂选用二氯甲烷。另外，在一些实施例中，医用高分子材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL ，优选为100 mg/mL。
在本发明中，之所以选择PLGA或修饰的额PLGA，是由于该材料为生物可降解材料且已被FDA批准用作药物敷料。研究表明PLGA具有一定的免疫调节功能，因而适合作为疫苗制备时的辅料。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优先地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
优选的，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1 ng/mL，优选1 mg/mL～100 mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1 ng/mL，优选1 mg/mL～100 mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01 ng/mL，优选0.01mg/mL～20 mg/mL。高分子材料有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；高分子材料的浓度为0.5 mg/mL～5000mg/mL，优选为100 mg/mL。第一乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为10 mg/mL～50mg/mL，优选20 mg/mL。第二乳化剂溶液优选为聚乙烯醇水溶液，浓度为1 mg/mL～20 mg/mL，优选5 mg/mL。分散液为PBS缓冲液或生理盐水或纯水。
步骤2，将步骤1得到的混合液进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或均质处理或微流控处理。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50 rpm～1500 rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5 psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100 rpm，比如1000 rpm～5000 rpm；使用微流控处理流速大于0.01 mL/min, 比如0.1 mL/min-100 mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米和/或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌纳米化或微米化。该步骤是为了进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度及时间能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过长或过短都会带来粒径大小的变化，为此，需要选择合适的超声时间。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50 rpm～500 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50 rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50 rpm～1500 rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000 rpm，比如1000 rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01 mL/min, 比如0.1 mL/min-100 mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在本发明中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇（PVA）水溶液，第三预定体积为5 mL，第三预定浓度为20 mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1 -1:1000进行设定，优先地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件或者也可不进行搅拌直接进行后续处理。
本步骤中，乳化剂水溶液依然为PVA。
第四预定浓度为5 mg/mL，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000，优先地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本发明中，本步骤的预定搅拌条件为有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。也不不经搅拌进行后续试验。
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100 RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有全细胞组分中水溶性和/或非水溶性组分的溶液中，或者将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有全细胞组分中水溶性和/或非水溶性组分与佐剂混合的溶液中。
步骤6，将步骤5处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100 RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第六预定体积的固化处理试剂或生物矿化处理试剂,作用一定时间后离心洗涤，然后加入第七预定提交的含有带正电或者带负电的物质并作用一定时间。
在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于第七预定体积的带电物质后可不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面负载癌细胞/组织裂解物的相关实验。
在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于含有干燥保护剂的水溶液中后进行室温真空干燥或者冷冻真空干燥，在干燥以后再进行纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物。
在本发明中，所述冻干保护剂选用海藻糖（Trehalose），或者甘露醇与蔗糖的混合溶液。在本发明中，该步骤的干燥保护剂的浓度为质量百分比为2～6%，比如3～5%，最优为4%，之所以如此设定，是为了在后续进行干燥中不影响干燥效果。
步骤7，将步骤6得到的含有干燥保护剂的混悬液进行干燥处理后，将干燥后的物质备用。
步骤8，将第八预定体积的步骤6中得到的重悬于PBS（或生理盐水）中的含纳米粒的混悬液或者采用第八预定体积的PBS（或生理盐水）重悬步骤7得到的干燥后的含有纳米粒或微米粒和干燥保护剂的干燥后物质，与第九预定体积的水溶性组分或者非水溶性组分混合后即得纳米疫苗或微米疫苗。
在本发明中，步骤5-步骤8的修饰和抗原负载步骤可重复多次以提高抗原的负载量。而且在添加带正电或带负电的物质时可以多次添加带同种电荷的或者也可以交替添加带不同电荷的物质。
在一些实施例中，所述重悬的纳米粒子混悬液体积为10 mL时，含有癌细胞裂解物或含有肿瘤组织裂解物中的水溶性组分或者原非水溶性组分的体积与为0.1 -100 mL。在实际使用时可将二者体积和比例根据需要进行调整。
在本发明中，所采用的含有癌细胞裂解物或含有肿瘤组织裂解物中水溶性组分或者原非水溶性组分中含有poly(I:C)、锰佐剂、卡介苗（BCG）或CpG，且poly(I:C)、锰佐剂、BCG或CpG的浓度为大于1 ng/mL。
纳米疫苗或微米疫苗的粒径大小为纳米级或微米级，这样能保证疫苗被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米疫苗的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，最优选地，粒径大小为100nm-600nm；微米疫苗的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。本实施例中，纳米粒疫苗粒径大小为100nm-600nm，微米疫苗粒径大小为1μm-5μm。
另外，在本发明中，采用尿素和盐酸胍来增溶癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中的原非水溶性组分，在实际使用中亦可使用任何其他可使癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中的原非水溶性组分溶解于水溶液的增溶物质，如脱氧胆酸钠，SDS，pH大于7的碱性溶液，pH小于7的酸性溶液，白蛋白，卵磷脂、高浓度无机盐、Triton、吐温、DMSO、乙腈、乙醇、甲醇、DMF、异丙醇、丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷、胆碱、Brij™-35、Octaethylene glycolmonododecyl ether、CHAPS、Digitonin、lauryldimethylamine oxide、IGEPAL® CA-630；或者也可以使用上述增溶液同时溶解水溶性组分和非水溶性组分。
另外，在本发明中，采用8M的尿素和6M的盐酸胍水溶液来增溶癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中的原非水溶性组分，在实际使用中亦可使用任何其他可使癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中的原非水溶性组分溶解于水溶液的尿素浓度或盐酸胍浓度；或者使用含增溶剂的溶液同时溶解癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞组分中的水溶性组分和非水溶性组分。
另外，在本发明中，纳米疫苗和微米疫苗的制备采用复乳法并辅以适当的修饰处理，在实际中也可采用任何其他的纳米粒子或微米粒子制备方法；纳米疫苗和微米疫苗的制备材料为PLGA，在实际中亦可采用任何其他可以制备纳米粒子或微米粒子的材料。
另外，在本发明中，癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中水溶性组分或者溶于增溶剂中的原非水溶性组分分别包载在纳米粒子内部和负载在纳米粒子表面，在实际使用时，癌细胞裂解物或肿瘤组织裂解物中水溶性组分和溶于非水溶性组分亦可混合后再包载到纳米粒子内部或负载到纳米粒子表面；或者也可以采用含增溶剂的溶液同时溶解水溶性组分和非水溶性组分然后包载于纳米粒子或微米粒子内部和/或负载于纳米粒子或微米粒子表面。
另外，在本发明中，采用poly(I:C)、锰佐剂、卡介苗（BCG）和CpG为免疫佐剂，在实际中亦可不加入免疫佐剂或者加入任何其他具有免疫增强功能的免疫佐剂，如模式识别受体激动剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、植物油、内毒素、脂质体佐剂、GM-CSF、MF59、双链RNA、双链DNA、氢氧化铝、CAF01、人参、黄芪等中药有效成分。
另外，在本发明中，部分实施例中采用的疫苗为纳米疫苗，部分实施例采用的是微米疫苗。本领域技术人员在实际中可以根据实际情况选择采用纳米疫苗和/或微米疫苗。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所使用的方法均为常规方法；所使用的材料、试剂等均可从商业途径得到。本发明实施例中所涉及到的纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子结构、制备方法、疾病治疗时的使用策略等仅为代表性方法，其他纳米尺寸粒子或微米尺寸粒子结构、制备方法、疾病预防或治疗时的使用策略、与其他药物的联用策略亦可采用本发明所述的方法。实施例中仅列出了本发明在部分癌症中的应用，但是本发明亦可用在其他类型的任何癌症。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。在实际应用时具体给药时间、给药次数、给药方案、与其他药物联用情况可根据情况调整。
实施例1 黑色素瘤肿瘤组织全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗预防黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid (poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。在本实施例中采用了硅化和添加阳离子物质的方法来增加抗原的负载量，而且只进行了一轮低温硅化处理。
（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16-F10 细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备疫苗的抗原原料来源。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备时负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C) 且poly(I:C)既分布于纳米粒子内部也负载于纳米粒子表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mLPBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mMHCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚赖氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟后去除上清液并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬沉淀后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL含免疫佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为270nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载280μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的纳米疫苗制备方法步骤基本与修饰处理的纳米疫苗的制备相同，只是未经过低温硅化和添加带电物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后在10000g离心20分钟，然后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h，在疫苗使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入含佐剂的3 mL癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为230nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
空白纳米粒粒径为230nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
（3）纳米疫苗用于癌症的预防
本研究对照组分别是PBS组、空白纳米粒+细胞裂解物组和未修饰制备的纳米疫苗组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。
纳米疫苗组给药方案如下：在接种黑色素瘤之前第42天、第35天、第28天、第21天和第14天分别皮下注射200μL内部和表面都负载裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。
PBS对照组方案如下：在接种黑色素瘤之前第42天、第35天、第28天、第21天和第14天分别皮下注射400μL PBS。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。空白纳米粒+游离裂解物对照组：在接种黑色素瘤之前第42天、35天、28天、21天和第14天分别皮下注射400μL 空白纳米粒和与疫苗负载的等量的游离裂解物。空白纳米粒和游离裂解物注射在不同部位。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。
在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图7所示，纳米疫苗制备过程中经过修饰处理的负载B16F10肿瘤组织全细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤在接种后全部消失；而未经过修饰处理的负载B16F10肿瘤组织全细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤在接种后70%消失；而PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。综上所述，本发明采用硅化和添加阳离子物质修饰处理的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的预防效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其预防效果优于制备过程中未做修饰处理的纳米疫苗组。
实施例2 黑色素瘤癌细胞全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤癌细胞的全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗预防黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤癌细胞以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以CpG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有癌细胞的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。在本实施例中采用了硅化、添加阳离子物质和阴离子物质的方法来增加抗原的负载量，而且进行了两轮硅化处理。
（1）癌细胞的裂解及各组分的收集
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备疫苗的抗原原料来源。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备时负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为CPG且CpG既分布于纳米粒子内部也负载于纳米粒子表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含120mM NaCl、100 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定30 min，尔后在-80℃固定48 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含聚天冬氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后12000g离心18min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟。然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0),并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚赖氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟，并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h； 在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL含佐剂的癌细胞裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为350nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载350μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的CpG免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的纳米疫苗制备方法步骤基本与修饰处理的纳米疫苗的制备相同，只是未经过硅化、添加阳离子物质和阴离子物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后在10000g离心20分钟，然后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h，在疫苗使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入含佐剂的3 mL癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为320nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的CpG免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
空白纳米粒粒径为300nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量CpG的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
（3）纳米疫苗用于癌症的预防
本研究对照组分别是PBS组、空白纳米粒+细胞裂解物组和未修饰制备的纳米疫苗组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。
纳米疫苗组给药方案如下：在接种黑色素瘤之前第42天、第35天、第28天、第21天和第14天分别皮下注射200μL内部和表面都负载癌细胞裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。
PBS对照组方案如下：在接种黑色素瘤之前第42天、第35天、第28天、第21天和第14天分别皮下注射400μL PBS。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。空白纳米粒+细胞裂解物对照组：在接种黑色素瘤之前第42天、35天、28天、21天和第14天分别皮下注射400μL 空白纳米粒和与疫苗负载的等量的游离细胞裂解物。空白纳米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。
在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图8所示，纳米疫苗制备过程中经过修饰处理的负载B16F10肿瘤组织全细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤在接种后全部消失；而未经过修饰处理的负载B16F10肿瘤组织全细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤在接种后70%消失；而PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。综上所述，本发明采用硅化和添加带电物质修饰处理的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的预防效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其预防效果优于制备过程中未做修饰处理的纳米疫苗组。
实施例3 结肠癌肿瘤组织和结肠癌全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何制备负载有结肠癌肿瘤组织和结肠癌癌细胞全细胞组分混合物的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗结肠癌。
本实施例中，以MC38小鼠结肠癌为癌症模型。首先裂解结肠癌肿瘤组织和结肠癌细胞以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以卡介苗（BCG）为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备纳米疫苗并采用该纳米疫苗来治疗结肠癌。
（1）肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38细胞在肿瘤长到体积分别为约1000 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将培养的MC38癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将来自MC38肿瘤组织的和来MC38癌细胞的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分分别按照1:1的质量比例混合即为制备疫苗的原料来源。
（2）BCG的裂解和各组分的收集
BCG的裂解方法和各组分的收集方法同癌细胞的裂解方法和各组分的收集方法，将MC38癌细胞系替换为卡介苗。
（3）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，制备方法同实施例1，只是将实施例1中的水溶性组分或非水溶性组分换成了本实施例中相应的混合物；将poly(I:C)免疫佐剂更换为本实施例的BCG裂解物。该纳米疫苗平均粒径为280nm左右，纳米疫苗表面电位为-4.5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载290μg蛋白质或多肽组分，每1 mg PLGA纳米粒内外所使用的免疫佐剂共约为0.04 mg且内外各半。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
（4）采用纳米疫苗治疗小鼠结肠癌
本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠。
纳米疫苗组给药方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射200μL负载水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。PBS对照组方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射400μL PBS。空白纳米粒+细胞裂解物对照组：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射400μL 空白纳米粒和与疫苗负载的等量的游离细胞裂解物。空白纳米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图9所示，纳米疫苗制备过程中经过修饰处理的负载结肠癌肿瘤组织结肠癌细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤治疗后部分痊愈消失；而PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。综上所述，本发明采用硅化和添加阳离子物质修饰处理的纳米疫苗对结肠癌具有良好的治疗效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其治疗效果优于制备过程中未做修饰处理的纳米疫苗组。
实施例4 黑色素瘤肿瘤组织和肺癌肿瘤组织全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗
本实施例以黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织和肺癌肿瘤组织的全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和LLC肺癌肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以锰颗粒和CpG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织组分的纳米疫苗。然后采用该纳米疫苗治疗黑色素瘤。
（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10 细胞或者2×106个LLC肺癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。肿瘤的裂解和各组分收集方法同实施例1。将来自B16-F10肿瘤组织的和来自LLC肺癌肿瘤组织的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分分别按照1:1的质量比例混合即为制备疫苗的原料来源。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备时负载全细胞组分中水溶性组分的纳米疫苗和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米疫苗分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为锰胶体颗粒和CpG且锰颗粒分布于纳米粒子内部而CpG分布于纳米疫苗表面。将锰佐剂与全细胞组分中的水溶性组分或非水溶性组分混合后作为第一水相采用复乳法制备内部负载抗原和佐剂的纳米粒。在制备锰佐剂时，先将1 mL 0.3M的Na3PO4溶液加入到9 mL生理盐水中，后加入2 mL 0.3 M的MnCl2溶液，放置过夜后，即得到Mn2OHPO4胶体锰佐剂，锰佐剂粒径约为13nm。然后将锰佐剂与全细胞组分中的水溶性组分（60mg/mL）或非水溶性组分（60mg/mL）按1:3体积比混合后采用复乳法将抗原和锰佐剂负载到纳米粒内部。在内部负载抗原（裂解组分）和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含组蛋白（5 mg/mL）和聚精氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL含CpG佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为360nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载300μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的CpG佐剂为0.01mg，粒子内部所负载锰含量为0.005mg。
未经修饰处理的纳米疫苗制备方法步骤基本与修饰处理的纳米疫苗的制备相同，只是未经过低温硅化和添加阳离子物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）和锰佐剂后在10000g离心20分钟，然后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h，在疫苗使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入含CpG佐剂的3 mL癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为330nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒CpG佐剂为0.01mg，粒子内部所负载锰含量为0.005mg。
空白纳米粒粒径为300nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量锰佐剂和CpG佐剂的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
（3）纳米疫苗用于癌症的治疗
本研究对照组分别是PBS组和空白纳米粒+细胞裂解物组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。纳米疫苗组给药方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射200μL负载水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200μL负载原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。PBS对照组方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射400μL PBS。空白纳米粒+细胞裂解物对照组：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射400μL 空白纳米粒和与疫苗负载的等量的游离细胞裂解物。空白纳米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图10所示，负载B16F10和LLC混合肿瘤组织全细胞组分的疫苗处理组小鼠的肿瘤在接种后部分消失；而PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。综上所述，本发明所述的负载多种肿瘤组织全细胞组分的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的治疗效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其治疗效果优于制备过程中未做修饰处理的纳米疫苗组。
实施例5 结肠癌和肺癌细胞水溶性组分负载于微米粒子内部和表面用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何制备只负载有结肠癌和肺癌细胞组分中水溶性部分的微米疫苗，并应用该疫苗预防结肠癌。
本实施例中，首先裂解MC38结肠癌肿瘤组织和LLC肺癌细胞以制备水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为微米粒子骨架材料，以锰颗粒和poly(I:C)为免疫佐剂制备负载有全细胞的水溶性组分的微米疫苗。
（1）MC38结肠癌肿瘤组织和LLC肺癌细胞的裂解及各组分的收集
肿瘤组织和癌细胞的收集、裂解方法以及水溶性组分和非水溶性组分的收集方法同上。上述所得来源于结肠癌肿瘤组织和肺癌细胞的两种裂解物的水溶性组分按3:1质量混合即为制备微米疫苗的抗原来源。
（2）微米疫苗的制备
本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料为有机高分子材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为锰颗粒和poly(I:C) 且锰颗粒分布于疫苗内而poly(I:C)分布于疫苗表面。在微米疫苗复乳法制备过程中采用低温硅化技术和添加带正电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备过程中，先制备锰佐剂，然后将锰佐剂与全细胞组分中的水溶性组分混合后作为第一水相采用复乳法制备内部负载抗原和佐剂的纳米粒。在制备锰佐剂时，先将1 mL0.3 M的Na3PO4溶液加入到9 mL生理盐水中，后加入2 mL 0.3 M的MnCl2溶液，放置过夜后，即得到Mn2OHPO4胶体锰佐剂，锰佐剂粒径约为13nm。然后将锰佐剂与全细胞组分全细胞组分中的水溶性组分（60mg/mL）按1:4体积比混合后采用复乳法将抗原和锰佐剂负载到微米粒内部。在内部负载抗原（裂解组分）和佐剂后，将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬微米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80mM原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10min，尔后在-80℃固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含组蛋白（5 mg/mL）和聚精氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL含poly(I:C)佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的微米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为1.5μm左右，纳米疫苗表面电位为-4mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载320μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)佐剂为0.01mg，粒子内部所负载锰含量为0.005mg。
未经修饰处理的微米疫苗制备方法步骤基本与修饰处理的微米疫苗的制备相同，只是未经过低温硅化和添加阳离子物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）和锰佐剂后在10000g离心20分钟，然后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h，在疫苗使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入含poly(I:C)佐剂的3 mL癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10min，得到内外都负载裂解物的微米疫苗。该微米疫苗平均粒径为1.4 μm左右，微米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载190μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒poly(I:C)佐剂为0.01mg，粒子内部所负载锰含量为0.005mg。
空白微米粒粒径为300nm左右，空白微米粒制备时分别采用含有等量锰佐剂和poly(I:C)佐剂的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分。
（3）微米疫苗用于癌症的治疗
本研究对照组分别是PBS组和空白微米粒+游离裂解物组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠。微米疫苗组给药方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射200μL内部和表面都负载癌细胞裂解物中水溶性成分的4mg PLGA微米疫苗。PBS对照组方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射200μL PBS。空白微米粒+细胞裂解物对照组：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞，尔后在第3天、第6天、第9天、第12天，第15天和第18天分别皮下注射200μL 空白微米粒和与疫苗负载的等量的游离细胞裂解物，空白微米粒和游离细胞裂解物注射在不同部位。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图11所示，与PBS空白对照组相比，空白微米粒+游离裂解物对照组和相比，微米疫苗给药组中小鼠肿瘤体积生长速度均明显变慢且小鼠生存期均明显延长。而且，微米疫苗给药组中小鼠有部分小鼠肿瘤接种后部分消失痊愈。由此可见，本发明所述的负载结肠癌肿瘤组织和肺癌细胞水溶性组分的微米疫苗对结肠癌具有良好的治疗效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其治疗效果优于制备过程中未做修饰处理的微米疫苗组。
实施例6 8M尿素溶解乳腺癌癌细胞并负载于微米粒子内部和表面用于乳腺癌的预防
本实施例以小鼠乳腺癌为癌症模型来说明如何采用8M尿素溶解全细胞组分并制备负载有全细胞组分的微米疫苗以预防乳腺癌。本实施例中，以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型。首先对乳腺癌细胞进行灭活和变性处理并以8M尿素裂解癌细胞后溶解全细胞组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG和Poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有全细胞组分的微米疫苗。
（1）癌细胞的裂解及各组分的收集
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后采用8M尿素水溶液裂解乳腺癌细胞并溶解裂解物即为制备疫苗的原料来源。
（2）微米疫苗的制备
本实施例中制备微米疫苗及作为对照的空白微米粒采用溶剂挥发法中的复乳法，所采用的微米粒子制备材料为有机高分子材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG和Poly(I:C)。在微米疫苗复乳法制备过程中采用低温硅化技术、添加带正电物质和添加带负电物质三种修饰方法提高抗原的负载量。在制备过程中，先采用复乳法制备内部负载抗原和佐剂的纳米粒, 在内部负载抗原和佐剂后，将100mg微米粒子在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mMHCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含组蛋白（5 mg/mL）和鱼精蛋白（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬微米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合并作用10min，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含聚天冬氨酸（5 mg/mL）、poly(I:C)（3 mg/mL）和CpG (1 mg/mL)的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL癌细胞裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化、添加阳离子物质和添加阴离子物质的修饰的微米疫苗。该微米疫苗平均粒径为2.5μm左右，微米疫苗表面电位为-4mV左右；每1mgPLGA微米粒子约负载340μg蛋白质或多肽组分, 负载poly（I:C）0.01mg，CpG为0.001mg。
空白微米粒粒径为2.4μm左右，空白微米粒制备时分别采用含有等量Poly(I:C)和CpG佐剂的8M尿素代替相对应的组分。
（3）微米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c制备4T1荷瘤小鼠。微米疫苗预防组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天皮下注射200μL负载肿瘤组织全细胞组分的2 mg PLGA微米疫苗；在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种4×105个4T1细胞。PBS空白对照组在在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天皮下注射200μL PBS；在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种4×105个4T1细胞。空白微米粒+细胞裂解物对照组在在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天皮下注射等量肿瘤组织裂解物，以及2mg PLGA空白微米粒; 在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种4×105个4T1细胞。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。生存期实验中小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图12所示，与对照组相比，微米疫苗预防组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。由此可见，本发明所述的负载癌细胞全细胞组分的微米疫苗对乳腺癌具有预防效果。
实施例 7 肿瘤组织和癌细胞全细胞组分负载于甘露糖靶向修饰的纳米疫苗用于癌症转移的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤小鼠肺转移癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞组分的纳米疫苗，并用该疫苗预防癌症转移。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。
本实施例中，将小鼠黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞分别以6M盐酸胍水溶液裂解后溶解，然后肿瘤组织裂解组分和癌细胞裂解组分按质量比1:4负载于纳米疫苗。
（1）肿瘤组织和癌细胞的裂解
收集小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤组织和培养的癌细胞后采用6M盐酸胍裂解和溶解肿瘤组织和癌细胞全细胞组分，然后肿瘤组织组分和癌细胞组分按质量比1:4混溶。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用常温或者低温硅化技术和添加带正电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为CpG且CpG负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和CpG，在内部负载抗原（裂解组分）后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3mL含有细胞裂解物(50mg/mL)和CpG(1mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mMNaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定24 h或者在室温固定10min后在-80℃固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含聚天冬氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后12000g离心18min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟。然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0), 并在室温固定24h或者在室温固定10min后在-80°C固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚乙烯亚胺（PEI，10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯修饰的甘露糖(1mg/mL)的PBS溶液重悬并在4℃作用2h后10000g离心20min洗涤，然后加入10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min，然后在10000g离心20分钟，并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米疫苗平均粒径为320nm左右，纳米疫苗表面电位为2mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载330μg蛋白质或多肽组分。
空白纳米粒粒径为300nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量CpG的6M盐酸胍代替相对应的细胞组分。
（3）靶向树突状细胞的纳米疫苗用于癌症的转移
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肺癌荷瘤小鼠。疫苗组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射200μL负载裂解物的4mg PLGA纳米粒子。PBS空白对照组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射400μL PBS。空白纳米粒+裂解物对照组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射400μL 空白纳米粒和与疫苗所负载的等量的游离裂解物。在第0天给每只小鼠尾静脉注射3×105个B16F10黑色素瘤细胞，在第15天处死小鼠取出肺部后观察小鼠肺部黑色素瘤转移形成的癌块的数量。
（4）实验结果
如图13所示，与PBS对照组和空白纳米粒+裂解物对照组相比，纳米疫苗组小鼠癌症转移灶数量都显著减少。而且，经过低温硅化和添加阳离子物质处理的纳米疫苗组好于经过常温硅化和添加阳离子物质处理的纳米疫苗组。这说明本发明所述的负载肿瘤组织和癌细胞混合组分的主动靶向纳米疫苗可以预防癌症转移。
实施例8 胰腺癌肿瘤组织和结肠癌肿瘤组织裂解组分负载于纳米粒子内部和表面用于胰腺癌的治疗
本实施例以小鼠胰腺癌为癌症模型来说明如何制备负载有胰腺癌肿瘤组织和结肠癌肿瘤组织裂解物组分的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗胰腺癌。
本实施例中，将小鼠Pan02胰腺癌肿瘤组织和MC38结肠癌肿瘤组织裂解组分按5:1的质量比例负载于纳米疫苗。首先取得小鼠胰腺癌和结肠癌肿瘤组织并将其裂解以制备水溶性组分和溶于8M尿素中的原非水溶性组分。在制备疫苗时，水溶性组分为胰腺癌肿瘤组织水溶性组分和结肠癌肿瘤组织水溶性组分按5:1质量比的混合物；非水溶性组分为胰腺癌肿瘤组织非水溶性组分和结肠癌肿瘤组织非水溶性组分5:1质量比的混合物；然后将水溶性组分和非水溶性组分混合物按质量比1:1混合，得到全细胞组分混合物。以PLGA为纳米粒子骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂制备纳米疫苗并用该纳米疫苗治疗Pan02胰腺癌荷瘤小鼠体内的肿瘤。
（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠腋下皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞或接种1×106个Pan02胰腺癌细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积分别为约1000 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。癌细胞的裂解方法及各组分的收集方法同实施例1。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中制备纳米疫苗制备方法同实施例1。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载280μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。空白纳米粒粒径为230nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的8M尿素代替相应的细胞组分。
（3）纳米疫苗用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6制备胰腺癌瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1×106个Pan02细胞。疫苗组在第3天、第6天、第6天、第12天、第15天、第18天和第21天分别皮下注射200μL负载裂解物成分的4mg PLGA纳米粒子。PBS空白对照组在第3天、第6天、第6天、第12天、第15天、第18天和第21天分别皮下注射400μL PBS。空白纳米粒+裂解物对照组在第3天、第6天、第6天、第12天、第15天、第18天和第21天分别皮下注射200μL的4mgPLGA空白纳米粒和游离裂解物。在实验中，从第3天起每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图14所示，与对照组相比，纳米疫苗组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，有部分小鼠肿瘤消失。由此可见，本发明所述的负载胰腺癌和结肠癌肿瘤组织全细胞组分的纳米疫苗对胰腺癌具有治疗效果。
实施例9 肝癌癌细胞全细胞组分负载于以卡介苗（BCG）为佐剂的纳米疫苗用于肝癌的预防
本实施例以BCG为免疫佐剂来说明如何制备负载有肝癌癌细胞全细胞组分的纳米疫苗并应用该疫苗预防肝癌。本实施例中，首先裂解肝癌细胞后分别收集水溶性组分和非水溶性组分。然后，以PLGA为纳米粒子骨架材料，以BCG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备纳米疫苗。
（1）癌细胞的裂解及各组分的收集
该实施例中癌细胞裂解及裂解物收集同上。
（2）BCG的裂解及各组分的收集
该实施例中BCG的裂解及裂解物收集和增溶方法同实施例1中的裂解方法，只是将肿瘤组织换成BCG。
（3）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗的制备方法、所使用的材料等均与实施例1相同。但是在该实施例中，纳米疫苗负载的免疫佐剂由poly(I:C)换成了BCG。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载280μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的BCG免疫佐剂共约为0.03mg且内外各半。空白纳米粒粒径为230nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量BCG的水或者8M尿素代替相应的细胞组分。
（4）纳米疫苗用于肝癌的预防
选取雌性C57BL/6为模型小鼠制备肝癌荷瘤小鼠。疫苗组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射200μL内部和表面都负载癌细胞裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米粒子和200μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米粒子。PBS空白对照组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射400μL PBS。空白纳米粒+裂解物对照组在肿瘤接种前第35天、第28天、第21天、第14天和第7天分别皮下注射400μL空白纳米粒和游离裂解物。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1×106个Hepa1-6肝癌细胞。在实验中，从第3天起每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v=0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图15所示，与对照组相比，以纳米疫苗给药组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。由此可见，本发明所述的纳米疫苗可以预防肝癌。
实施例10 黑色素瘤肿瘤组织全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。在本实施例中采用了硅化和添加阳离子物质的方法来增加抗原的负载量，而且只进行了一轮低温硅化处理。
（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
方法同实施例1。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量，制备过程同实施例1。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载280μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
仅进行低温硅化处理的纳米疫苗制备方法步骤基本与两种修饰处理的纳米疫苗的制备基本相同，只是低温硅化后未添加带电物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL 硅酸盐水溶液 (含150mM NaCl、80 mM 原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬, 并在室温固定10 min，尔后在-80℃固定24 h，使用超纯水离心洗涤后使用PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3mL含免疫佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化修饰的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载210μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
仅进行添加阳离子处理的纳米疫苗制备方法步骤基本与两种修饰处理的纳米疫苗的制备基本相同，只是没有低温硅化仅有添加带电物质处理步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚赖氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min， 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min, 然后在10000g离心20分钟并使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mL PBS 重悬然后加入3 mL含免疫佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的经添加阳离子修饰的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为240nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载220μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的纳米疫苗制备方法同实施例1。该纳米疫苗平均粒径为230nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
（3）纳米疫苗用于癌症的预防
本研究对照组分别是PBS组、只冷冻硅化修饰疫苗组和只添加阳离子修饰疫苗组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。
纳米疫苗组给药方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第13天，第16天，第19天，第24天和第29天分别皮下注射200 μL内部和表面都负载裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200 μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。
PBS对照组方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第13天，第16天，第19天，第24天和第29天分别皮下注射400μL PBS。
在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v =0.52×a×b 2 计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000 mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图16所示，而PBS对照组小鼠的肿瘤很快都长大且27天内都死亡，各个疫苗处理组小鼠的肿瘤生长速度都明显变慢，纳米疫苗制备过程中未经过任何修饰处理的疫苗组小鼠治疗后约20%小鼠痊愈；而经过硅化修饰或添加阳离子修饰处理的的疫苗处理组小鼠约30%的小鼠痊愈；而同时经过硅化修饰和添加阳离子修饰处理的疫苗处理组小鼠约50%的小鼠痊愈。综上所述，本发明采用硅化和添加阳离子物质修饰处理的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的治疗效果，且由于修饰后可负载更多的抗原其治疗效果更佳。
实施例11 黑色素瘤肿瘤组织全细胞组分负载于纳米粒子内部和表面用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何制备负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米疫苗，并应用该疫苗治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分。然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米疫苗。在本实施例中采用了硅化或者钙化的方法来增加抗原的负载量。
（1）肿瘤组织的裂解及各组分的收集
方法同实施例1。
（2）纳米疫苗的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，在纳米疫苗制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量，制备过程同实施例1。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载280μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
进行钙化处理的纳米疫苗制备方法步骤如下：在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原（裂解组分）后在10000g离心20分钟，然后使用7mLPBS重悬纳米粒子并与3 mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后使用 10 mL DMEM培养基重悬并在4°C作用16小时， 然后加入100μL CaCl2 (1mmol) 并在37°C作用2h。然后在10000g离心20min，使用超纯水离心洗涤后使用 3 mL含鱼精蛋白（5 mg/mL）和聚赖氨酸（10 mg/mL）的PBS重悬并作用10 min, 然后10000g离心20min洗涤，采用10 mL含有细胞裂解物 (50mg/mL) 的PBS溶液重悬并作用10min, 弃去上清后使用10 mL含4%海藻糖的超纯水重悬沉淀后冷冻干燥48 h；在疫苗注射使用前将其用7 mLPBS 重悬然后加入3 mL含免疫佐剂的癌组织裂解液组分（蛋白质浓度50 mg/mL）并室温作用 10 min，得到内外都负载裂解物的纳米疫苗。该纳米疫苗平均粒径为250nm左右，纳米疫苗表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载230μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的纳米疫苗制备方法同实施例1。该纳米疫苗平均粒径为230nm左右，纳米疫苗表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载180μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
（3）纳米疫苗用于癌症的预防
本研究对照组分别是PBS组、只冷冻硅化修饰疫苗组和只添加阳离子修饰疫苗组。选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。
纳米疫苗组给药方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第13天，第16天，第19天，第24天和第29天分别皮下注射200 μL内部和表面都负载裂解物中水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗和200 μL内部和表面都负载溶于8M尿素中原非水溶性成分的2mg PLGA纳米疫苗。
PBS对照组方案如下：在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在接种黑色素瘤之后第4天、第7天、第10天、第13天，第16天，第19天，第24天和第29天分别皮下注射400μL PBS。
在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v =0.52×a×b 2 计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000 mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
（4）实验结果
如图17所示，而PBS对照组小鼠的肿瘤很快都长大且27天内都死亡，各个疫苗处理组小鼠的肿瘤生长速度都明显变慢，纳米疫苗制备过程中未经过任何修饰处理的疫苗组小鼠治疗后约20%小鼠痊愈；而经过钙化处理和添加阳离子修饰处理的疫苗处理组小鼠约30%的小鼠痊愈；而同时经过硅化修饰和添加阳离子修饰处理的疫苗处理组小鼠约50%的小鼠痊愈。综上所述，本发明采用钙化或硅化处理的纳米疫苗对黑色素瘤具有良好的治疗效果，且低温硅化和添加阳离子处理可负载更多的抗原其治疗效果更佳。
Claims (10)
1.一种基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，包括纳米和/或微米粒子、全细胞组分或其混合物、提高抗原负载量或免疫原性的修饰物。
2.根据权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，所述全细胞组分为一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织中全细胞的水溶性成分和/或非水溶性成分；所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解得到，或者所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞裂解后加工得到，或者所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织的全细胞加工后裂解得到；在纳米和/或微米疫苗的制备过程中，一次或多次对纳米粒子内部和/或表面进行修饰处理。
3.根据权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，所述全细胞组分由一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织制备；所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统的表面不连接具有主动靶向功能的靶头或者连接有主动靶向功能的靶头。
4.根据权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，所述全细胞组分或其混合物被包载于纳米和/或微米粒子的内部和/或负载于纳米和/或微米粒子的表面；所述纳米和/或微米粒子的内部和/或表面还包括免疫佐剂；所述负载于纳米和/或微米粒子表面的全细胞组分或其混合物为一层或多层；所述负载于纳米和/或微米粒子表面的全细胞组分或其混合物为多层时，层与层之间为修饰物。
5.根据权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，纳米粒子为纳米级尺寸的粒子，微米粒子为微米级尺寸的粒子；所述纳米和/或微米粒子的制备材料为有机合成高分子材料、天然高分子材料或者无机材料；所述纳米和/或微米粒子的形状为球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。
6.根据权利要求5所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，所述纳米疫苗和纳米粒子的粒径独立地选自1nm～1000nm；所述微米疫苗和微米粒子的粒径独立地选自1μm～1000μm；所述纳米和/或微米疫苗系统的表面为电中性，带负电或者带正电。
7.根据权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统，其特征在于，癌细胞或肿瘤组织中有一种与用于预防或治疗的癌症类型相同。
8.权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统的制备方法，其特征在于，在修饰物存在下，将一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统；或者在修饰物存在下，将一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物、免疫佐剂负载于纳米和/或微米粒子内部和/或表面，得到所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统。
9.权利要求1所述基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的纳米和/或微米疫苗系统在制备预防和/或治疗癌症的疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，癌细胞和/或肿瘤组织中有一种与用于预防或治疗的癌症类型相同。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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