CN114984199A - 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用 - Google Patents

一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114984199A
CN114984199A CN202210411832.7A CN202210411832A CN114984199A CN 114984199 A CN114984199 A CN 114984199A CN 202210411832 A CN202210411832 A CN 202210411832A CN 114984199 A CN114984199 A CN 114984199A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cancer
cell
water
allogeneic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210411832.7A
Other languages
English (en)
Inventor
刘密
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Ersheng Biopharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Suzhou Ersheng Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Ersheng Biopharmaceutical Co Ltd filed Critical Suzhou Ersheng Biopharmaceutical Co Ltd
Priority to CN202210411832.7A priority Critical patent/CN114984199A/zh
Priority to PCT/CN2022/092331 priority patent/WO2023201787A1/zh
Publication of CN114984199A publication Critical patent/CN114984199A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明涉及一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用，细胞系统包括经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞，其中，癌症疫苗包括递送粒子及其负载的细胞组分，递送粒子为纳米粒子或微米粒子，细胞组分为来源于癌细胞和/或肿瘤组织分离得到的细胞中的水溶性组分和/或非水溶性组分。癌症特异性T细胞可以被癌症疫苗激活或使用癌症疫苗体外刺激DC细胞后将DC细胞注射进入体内激活。本发明通过同种异体激活免疫反应，并将先天免疫细胞和被激活的适应性免疫细胞同时移植到受体内，克服了临床上免疫能力较差的患者无法对疫苗产生有效免疫反应的难题。

Description

一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其 应用
技术领域
本发明涉及免疫治疗技术领域，尤其涉及一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用。
背景技术
免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和清除人体内的异常物质(如病毒、细菌等)，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。近些年来免疫技术发展很快，尤其是癌症的免疫治疗领域。随着对癌症认识的不断提高，人们发现人体的免疫系统和各类免疫细胞在抑制癌症发生、发展的过程中扮演着关键角色。通过调节机体免疫系统的平衡，我们有望影响和控制癌症的发生、发展和治疗。
机体通过各类免疫细胞识别和杀伤癌细胞。人体的免疫系统包含天然免疫系统和适应性免疫系统，天然免疫系统的细胞和适应性免疫系统的细胞相互配合，共同清除癌细胞。天然免疫系统中可以杀伤癌细胞的细胞包括NK 细胞等，而适应性免疫系统中可以杀伤癌细胞的免疫细胞主要是T细胞，尤其是癌症特异性的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞。天然免疫系统的免疫细胞的多少和功能强弱与癌症患者本身状态和机能有关，一般天然免疫系统的NK细胞和γδT细胞等含量高状态好的癌症患者预后较好。临床上很多年长的患者或者前期已经经历过放化疗的患者，其身体状态、生理机能和免疫功能很差，体内存在的先天免疫细胞较少或较弱，如果能补充一些同种异体年轻个体的先天免疫细胞，该部分患者的杀伤癌细胞的先天免疫系统能力会得到提升并进而更好的杀灭癌细胞。
适应性免疫系统的癌症特异性T细胞可以在肿瘤组织所释放的少量水溶性抗原刺激下产生一部分预存特异性免疫。但是，一种抗原表位只能激活一种特异性的T细胞。由于肿瘤组织部位抑制性的免疫微环境和癌细胞的高度异质性，预存的癌症特异性T细胞远远不够广谱和多样，因而识别和杀伤癌细胞效果有效。而癌症疫苗含有癌症特异性的抗原，可以刺激激活除机体预存特异性免疫以外的更广泛和多样的癌症特异性T细胞，因而癌症疫苗是治疗或预防癌症的方法之一。
癌症疫苗的作用基础是选择合适的癌症抗原来激活人体免疫系统对异常突变的癌细胞的识别，癌细胞和肿瘤组织异质性很高，突变很多，所以癌症细胞或者癌症肿瘤组织本身是最好的癌症抗原的来源。疫苗所含抗原种类越多，所能激活的癌症特异性T细胞种类越多，疫苗的疗效就会越好。但是，临床很多年长的患者或者前期已经经历过放化疗的患者，其身体状态、生理机能和免疫功能很差，因此，亟需寻找一种新的免疫治疗方案。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统，该细胞系统中的癌症特异性T细胞经癌症疫苗激活，能够更有效地激活癌症特异性免疫反应，并基于该细胞系统提供了一种同种异体淋巴细胞药物，由于癌症特异性T细胞激活时的效果与个体的免疫机能情况有关，因此本发明提出一种新的策略，即在免疫机能较好的同种异体上接种癌症疫苗或输入体外激活的树突状细胞(DC)细胞，然后分离提取被高效激活的癌症特异性免疫细胞和天然免疫细胞，再回输至免疫机能较差的同种异体上，解决上述年老的癌症患者或者前期经历过放疗或者化疗治疗的癌症患者中存在的免疫机能较差的问题。
本发明的第一个目的是提供一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统，该细胞系统包括经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞，其中，癌症疫苗包括递送粒子及其负载的细胞组分，所述递送粒子为纳米粒子或微米粒子，所述细胞组分为来源于癌细胞和/或肿瘤组织的水溶性组分和/或非水溶性组分；
细胞组分经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到；
裂解是将癌细胞或肿瘤组织加水或不含溶解剂的水溶液进行裂解，得到的上清液为水溶性组分，沉淀中经溶解剂溶解后转为可溶的部分为非水溶性组分；或，裂解是使用溶解剂裂解癌细胞或肿瘤组织，并溶解裂解后的组分，得到同时含有水溶性组分和非水溶性组分的混合物。
进一步地，将癌细胞或肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的水溶液后进行反复冻融裂解，直至细胞膜结构被破坏。
进一步地，所述癌症特异性T细胞包括CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
进一步地，所述细胞系统还包括天然免疫细胞，该天然免疫细胞无需经癌症疫苗激活，可为自体天然免疫细胞和/或异体天然免疫细胞。
将本发明的细胞系统制备成抗肿瘤制品时，该抗肿瘤制品包括以下任意一种：(1)含有经癌症疫苗激活后的癌症特异性T细胞的制剂；(2)含有经癌症疫苗激活后的癌症特异性T细胞的制剂，以及含有天然免疫细胞的制剂(其中，天然免疫细胞若多于一种，含有天然免疫细胞的制剂可为一种或多种，在给患者使用时可以分别注射或者混合后一起注射)；(3)含有经癌症疫苗激活后的癌症特异性T细胞和天然免疫细胞混合物的制剂。
进一步地，天然免疫细胞包括但不限于γδT细胞、自然杀伤细胞(NK 细胞)、中性粒细胞和自然杀伤T细胞(NKT细胞)等。
进一步地，所述的激活为将癌症疫苗注射至体内激活癌症特异性T细胞，或将树突状细胞(DC)在体外经癌症疫苗刺激后注射至体内激活癌症特异性T细胞。
进一步地，所述的刺激是将DC细胞与癌症疫苗共孵育一定时间，负载细胞组分的递送粒子被DC细胞吞噬后，可被DC细胞进行抗原提呈和激活，回输至体内后即可归巢淋巴结并利用DC细胞负载的抗原激活癌症特异性T 细胞。
进一步地，DC细胞与癌症疫苗共孵育至少4小时，优选为24-96小时。
进一步地，树突状细胞为自体树突状细胞、异体树突状细胞、细胞系或干细胞来源，DC细胞可来源于任何可以制备分离树突状细胞的细胞，包括但不限于来源于干细胞、细胞系、骨髓细胞、外周免疫细胞等。
进一步地，癌症疫苗中，将非水溶性组分负载于递送粒子时，将非水溶性组分采用适当的溶解方法使其由在纯水中不溶变为在含溶解剂的溶液中可溶。采用溶解剂溶解时，溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐(如脱氧胆酸钠)、十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠，SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、DMSO(二甲基亚砜)、乙腈、乙醇、甲醇、DMF(N,N-二甲基甲酰胺)、丙醇、异丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷和胆碱中的至少一种。
进一步地，癌症疫苗中，负载方式为水溶性组分和/或非水溶性组分被包载于递送粒子内部，和/或负载于递送粒子表面，包括但不限于水溶性组分同时负载于粒子中和负载于粒子表面，非水溶性组分同时负载于粒子中和负载于粒子表面，水溶性组分负载于粒子中而非水溶性组分负载于粒子表面，非水溶性组分负载于粒子中而水溶性组分负载于粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分负载于粒子中而只有非水溶性组分负载于粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分负载于粒子中而只有水溶性组分负载于粒子表面，水溶性组分负载于粒子中而水溶性组分和非水溶性组分同时负载于粒子表面，非水溶性组分负载于粒子中而水溶性组分和非水溶性组分同时负载于粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分同时负载于粒子中而且水溶性组分和非水溶性组分同时负载于粒子表面，水溶性组分和非水溶性组分同时负载于粒子内部，水溶性组分和非水溶性组分同时非水溶性组分同时负载于粒子表面。
进一步地，癌症疫苗中，水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子表面的方式包括吸附、共价连接、电荷相互作用、疏水相互作用、一步或多步的固化、矿化和包裹中的至少一种；水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子内部的方式为任何可以将其负载于递送粒子内部的方式，如包载于递送粒子内部、通过静电吸附作用负载于递送粒子内部、通过疏水相互作用负载于递送粒子内部。
进一步地，细胞组分负载于递送粒子后呈一层或多层结构，当递送粒子负载多层细胞组分时，层与层之间为修饰物。
进一步地，癌症疫苗中，递送粒子的表面连接有主动靶向树突状细胞的靶头。该靶头可为甘露糖、甘露聚糖、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体等靶头，带领癌症疫苗靶向输送进树突状细胞。
进一步地，癌症疫苗中，还包括免疫增强佐剂，其与细胞组分共同负载于递送粒子。免疫增强佐剂包括微生物来源的免疫增强剂、人或动物免疫系统的产物、固有免疫激动剂、适应性免疫激动剂、化学合成药物、真菌多糖类、中药及其他类中的至少一类；免疫增强佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗(BCG)、锰相关佐剂、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、 Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂polyICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、锰佐剂、铝佐剂、钙佐剂、各种细胞因子、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、细胞因子、植物油、内毒素、脂质体佐剂、MF59、双链 RNA、双链DNA、铝相关佐剂、CAF01、人参、黄芪的有效成分等。将免疫增强佐剂与细胞组分共同负载于递送粒子上时，癌症疫苗被DC细胞吞噬后可以更好地激活癌症特异性T细胞。
进一步地，递送粒子还可共负载协助粒子或抗原逃离溶酶体和提高激活效率的成分。协助和增加粒子或抗原溶酶体逃逸的物质包括但不限于细胞穿透肽、膜穿透肽、具有质子海绵效应的物质、具有膜融合效应的物质。
进一步地，癌症疫苗中，递送粒子表面可为电中性、带负电或者带正电。
进一步地，癌症疫苗中，递送粒子纳米级或微米级，这样能保证疫苗被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米粒子(NP)的粒径为1nm-1000nm，优选地，粒径为30nm-1000nm，最优选地，粒径为100nm-600nm；微米粒子(MP)的粒径为1μm-1000μm，优选地，粒径为1μm-100μm，更优选地，粒径为1μm-10μm，最优选地，粒径为1μm-5μm。
进一步地，癌症疫苗中，递送粒子由有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料制得。有机合成高分子材料为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、PLA(聚乳酸)、PGA (聚乙醇酸)、PEG(聚乙二醇)、PCL(聚己内酯)、Poloxamer(泊洛沙姆)、PVA(聚乙烯醇)、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、PEI(聚乙烯亚胺)、 PTMC(聚三亚甲基碳酸酯)、聚酸酐、PDON(聚对二氧六环酮)、PPDO (聚对二氧环己酮)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PLGA-PEG、PLA-PEG、 PGA-PEG、聚氨基酸、合成多肽、合成脂质等；天然高分子材料为为生物相容或可降解的高分子材料，包括但不限于卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜、淀粉、糖类、多肽等；无机材料为无明显生物毒性的材料，包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙、磷酸钙等。
进一步地，癌症疫苗在制备过程中可以不做修饰处理，也可以采用适当的修饰技术以提高纳米疫苗(Nanovaccine)或微米疫苗(Microvaccine)的抗原负载量和/或免疫原性进而提高树突状细胞疫苗的疗效。修饰技术包括但不限于化学修饰和物理修饰，如生物矿化(如硅化、钙化、镁化)、凝胶化、交联、添加带电物质等。
进一步地，癌症疫苗的形状为常见的任意形状，包括但不限于球形、椭球形、桶形、多角形、棒状、片状、线形、蠕虫形、方形、三角形、蝶形或圆盘形。
进一步地，癌症疫苗可以采用已有的制备方法制备，包括但不仅限于常见的溶剂挥发法、透析法、微流控法、挤出法、热熔法。在本发明的一些实施方案中，癌症疫苗采用溶剂挥发法中的复乳法制备得到，具体如下：
步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度的医用材料的有机相中。
其中，水相溶液含有细胞组分，可含有或不含有免疫增强佐剂；细胞组分为水溶性组分和/或溶于溶解剂的原非水溶性组分，或者水溶性组分和非水溶性组分同时溶于溶解剂中的混合物。第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL-100mg/mL，以确保能负载足够癌症抗原以激活相关免疫反应。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL-20mg/mL；
将医用高分子材料溶解于有机溶剂中，得到第二预定体积的含有第二预定浓度医用高分子材料的有机相。在一些实施例中，医用高分子材料为 PLGA或经修饰的PLGA或PLA，有机溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷。第二预定浓度为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100mg/mL。
在本发明实施例中，之所以选择PLGA或经修饰的PLGA或PLA，是由于该材料为生物可降解材料且已被FDA批准用作药物辅料。研究表明 PLGA或PLA都具有一定的免疫调节功能，因而适合作为纳米粒子或微米粒子制备时的辅料。在实际应用中可根据实际情况选择合适的材料。在本发明的实施例中，部分实施递送粒子共负载的组分中含有具有溶酶体逃逸能力的多肽，在实际应用中也可以加入任何其他可增加递送粒子或者抗原溶酶体逃逸的物质。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒子或微米粒子的尺寸大小。
步骤2，将步骤1得到的混合液进行超声处理、搅拌、均质处理或微流控处理。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～ 200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01 mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声、搅拌、均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短、搅拌速度、均质处理压力及时间能控制制备的微纳粒子大小。
步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行超声处理、搅拌、均质处理或微流控处理。
该步骤是为了继续纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度及时间能控制制备的纳米粒子或微米粒子大小，过长或过短都会带来粒径大小的变化，为此，需要选择合适的超声时间。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如 2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm，搅拌时间大于1 分钟，比如60～6000秒。优选的，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。
在本发明中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定浓度大于1mg/mL，优选1-100mg/mL，本发明的一些实施例中选择20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1-1:1000进行设定，优选为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中，乳化剂水溶液依然为PVA。
第四预定浓度大于0.01mg/mL，优选为0.01-100mg/mL，本发明的一些实施例中选择5mg/mL，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为 1:1.5-1:2000，优选为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本发明中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成。
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将沉淀重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的 PBS(或生理盐水)中。
其中，步骤5所得沉淀重新混悬于第六预定体积的PBS(或生理盐水) 中时不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验；或直接使用进行注射或者与细胞共孵育。
步骤5所得沉淀重新混悬于含有冻干保护剂的水溶液中时需进行冷冻干燥，再冷冻干燥以后再进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验。冻干保护剂选用海藻糖(Trehalose)；第五预定浓度为质量百分比1-15％，优选为4％，之所以如此设定，是为了在后续进行冷冻干燥中不影响冻干效果；或使用其他冻干保护剂进行冷冻干燥处理如蔗糖和甘露醇的混合溶液。
步骤6，将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
步骤7，将步骤5中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒或微米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用；或者上述样品与第七预定体积的水溶性组分和/或溶解的原非水溶性组分混合后使用，即表面负载细胞组分的癌症疫苗。
在本发明中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1，优选为1:100到100:1，最优体积比为1:30到30:1。
在一些实施例中，所述重悬的纳米粒子和/或微米粒子混悬液体积为9 mL时，水溶性组分和/或溶解的原非水溶性组分的体积为1mL。在实际使用时可将二者体积和比例根据需要进行调整。
进一步地，细胞系统用于治疗或预防癌症时：(1)将步骤5制备的纳米疫苗和/或微米疫苗注射给供体(如同种异体供体)；或者将步骤5制备的纳米疫苗和/或微米疫苗与树突状细胞混合孵育一定时间，然后将树突状细胞注射给供体；(2)从供体中收集步骤(1)激活的供体体内的癌症特异性T细胞；或者收集步骤(1)激活的供体体内的癌症特异性T细胞以及 NK细胞，NKT细胞以及γδT细胞。将收集的上述细胞回输到患者体内预防或治疗癌症。
上述方法中，若需在递送粒子表面负载多层细胞组分或对癌症疫苗进行修饰，可在上述步骤4之后进行以下操作：
S1，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将沉淀重新混悬于第八预定体积的第八预定浓度的含有水溶性组分和/或非水溶性组分的溶液中(该溶液中可含有或不含有佐剂)。
S2，将S1得到的混合液进行离心，去除上清液，并将沉淀重新混悬于第九预定体积的修饰处理试剂中(如固化处理试剂或矿化处理试剂),作用一定时间后离心洗涤，和/或将沉淀重悬于第十预定体积的含有带正电或者带负电的物质并作用一定时间。
本发明的S2中，沉淀重新混悬于第十预定体积的带电物质后可不进行冻干，对混合液进行离心，所得沉淀重悬于PBS(或生理盐水)中，直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面负载癌细胞/组织裂解物的相关实验或者直使用进行注射或者与细胞进行孵育。
或，将S2所得混合液进行离心，沉淀重新混悬于含有干燥保护剂的水溶液中后进行室温真空干燥或者冷冻真空干燥，在干燥以后再进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的相关实验。
S3，将S2中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒或微米粒的混悬液或者采用PBS(或生理盐水)重悬S2得到的干燥后的含有纳米粒或微米粒和干燥保护剂的干燥后物质直接使用；或者与第九预定体积的水溶性组分或者非水溶性组分混合后使用。
进一步地，S1-S3修饰和抗原负载步骤可重复多次以提高抗原的负载量。而且在添加带正电或带负电的物质时可以多次添加带同种电荷的或者也可以交替添加带不同电荷的物质。
本发明的癌症疫苗中，细胞组分来源于至少一种癌细胞和/或至少一种肿瘤组织中的细胞，且所述至少有一种癌细胞或肿瘤组织与预防或治疗的疾病相同。将非水溶性组分负载到递送粒子上，使该疫苗系统中含有更多的抗原，更优选地，将水溶性组分和非水溶性组分同时负载到递送粒子上，使递送粒子负载全部抗原，然后注射至供体体内以激活癌症特异性T细胞或在体外与DC细胞共孵育，再回输至供体体内以激活癌症特异性T细胞。
本发明要求保护上述基于癌症特异性T细胞的细胞系统在制备预防或治疗癌症产品中的应用。
进一步地，在癌症发生前、癌症发生后或手术切除肿瘤组织后多次给药，以激活机体免疫系统，从而延缓癌症的进展、治疗癌症或者预防癌症的复发、转移。
本发明的第二个目的是提供一种同种异体淋巴细胞药物，该同种异体淋巴细胞药物包括经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞，所述癌症特异性T 细胞来源于同种异体的个体，其中，癌症疫苗包括递送粒子及其负载的细胞组分，所述递送粒子为纳米粒子或微米粒子，所述细胞组分为来源于癌细胞和/或肿瘤组织的水溶性组分和/或非水溶性组分；
细胞组分经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到；
裂解是将癌细胞或肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解，上清液为水溶性组分，沉淀中经溶解剂溶解后转为可溶的部分为非水溶性组分；或裂解是使用溶解剂裂解癌细胞或肿瘤组织，并溶解裂解后的组分，得到同时含有水溶性组分和非水溶性组分的混合物。
进一步地，所述同种异体的个体可为一个或多个。
进一步地，所述癌症特异性T细胞包括CD4+ T细胞和/或CD8+ T细胞。
进一步地，所述同种异体淋巴细胞药物还包括来源于同种异体的天然免疫细胞，该天然免疫细胞无需经癌症疫苗激活，经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞从同种异体供体的体内分离后，与天然免疫细胞混合，即得所述同种异体淋巴细胞药物，将该药物注射入同种异体受体的体内用于相关疾病的治疗。
进一步地，天然免疫细胞包括但不限于γδT细胞、自然杀伤细胞(NK 细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)、中性粒细胞等。
进一步地，天然免疫细胞或经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞通过流式细胞术、磁珠分选等细胞分选技术从同种异体供体中分离得到。
进一步地，所述的激活为将癌症疫苗注射至同种异体供体的体内，激活癌症特异性T细胞，或将DC细胞在体外经癌症疫苗刺激后注射至同种异体供体的体内激活癌症特异性T细胞。
进一步地，DC细胞为自体DC细胞和/或同种异体DC细胞、细胞系或干细胞来源的DC细胞。
进一步地，所述的刺激是将DC细胞与癌症疫苗进行共孵育至少4小时，负载细胞组分的递送粒子被DC细胞吞噬后，可被DC细胞进行抗原提呈和激活，回输至体内后即可归巢淋巴结并利用DC细胞负载的抗原激活癌症特异性T细胞。
进一步地，溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙醇、异丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷和胆碱中的至少一种。除以上限定，其余对淋巴细胞药物中癌症疫苗的处理同上述细胞系统中的癌症疫苗。
本发明要求保护上述同种异体淋巴细胞药物在制备预防或治疗癌症产品中的应用。
进一步地，本发明所述的淋巴细胞药物输至同种异体体内使用时，将经过分选的细胞进行体外扩增。其中，经过分选的细胞指通过流式细胞术、磁珠分选等细胞分选技术从同种异体供体中分离得到的含有目标T细胞的混合物；体外扩增的方法包括但不限于与细胞因子和/或抗体共孵育。
进一步地，与淋巴细胞药物共孵育的细胞因子包括但不限于白介素2 (IL-2)、白介素2(IL-7)、白介素2(IL-15)、白介素2(IL-21)、白介素2(IL-17)、白介素2(IL-12)、白介素2(IL-6)、白介素2(IL-33)、γ干扰素(IFN-γ)、TNF-α。
进一步地，与淋巴细胞药物共孵育的抗体包括但不限于αCD-3抗体、αCD-4抗体、αCD-8抗体、αCD-28抗体、αCD-40抗体、αOX-40抗体、αOX-40L 抗体。
将本发明的同种异体淋巴细胞药物制备成抗肿瘤制品时，该抗肿瘤制品包括以下任意一种：(1)含有经癌症疫苗激活的来源于同种异体的癌症特异性T细胞的制剂；(2)含有经癌症疫苗激活的来源于同种异体的癌症特异性T细胞的制剂，以及含有来源于同种异体的天然免疫细胞的制剂(其中，天然免疫细胞若多于一种，含有天然免疫细胞的制剂可为一种或多种，在给患者使用时可以分别注射或者混合后一起注射)；(3)含有经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞和天然免疫细胞混合物的制剂，所述癌症特异性T 细胞和天然免疫细胞均来源于同种异体的个体。
进一步地，所述的应用为将同种异体供体体内分离得到的淋巴细胞药物回输至同种异体受体体内，回输方法包括但不限于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、腹腔注射、瘤内注射。
进一步地，在癌症发生前、癌症发生后或手术切除肿瘤组织后多次给药。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种基于癌症特异性T细胞的细胞药物，并将该细胞药物应用于同种异体癌症的预防和治疗，使用癌症疫苗激活免疫机能较好的同种异体的癌症特异性免疫细胞，然后分离提取被激活的癌症特异性免疫细胞和天然免疫细胞，应用于癌症的治疗或者预防。癌症疫苗在同种异体内激活的癌症特异性T细胞，在过继转移到患者体内后能特异性的识别和杀伤癌细胞；如果同时将同种异体体内分离的天然免疫系统的γδT细胞、NK细胞和NKT 细胞过继转移至患者体内，这些天然免疫细胞也可以通过各自的作用机制协同杀伤癌细胞。本发明提供的同种异体细胞药物，在应用于疾病的预防和治疗时，远远优于现有技术中直接分离得到或采用其他方式激活得到的同种异体T细胞或天然免疫细胞的效果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明疫苗系统的制备过程及细胞系统应用示意图；其中，a为水溶性组分和非水溶性组分分别收集和制备纳米粒子或微米粒子的示意图； b为采用含有溶解剂的溶液溶解全细胞组分和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；c为使用a或b中制备的上述粒子激活同种异体体内的癌症特异性T 细胞后分离提取含有癌症特异性T细胞的免疫细胞，并用该类细胞预防或治疗癌症的示意图；
图2分别为实施例1中用纳米粒激活癌症特异性T细胞结果以及使用同种异体免疫细胞预防黑色素瘤时小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；a, 流式细胞术分析注射纳米粒的小鼠脾细胞与抗原共孵育后可以被激活并分泌IFN-γ的CD8+ T细胞占脾细胞中CD8+ T细胞的比例；b,流式细胞术分析注射纳米粒的小鼠脾细胞与抗原共孵育后可以被激活并分泌IFN-γ的 CD4+ T细胞占脾细胞中CD4+ T细胞的比例；c,预防癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n＝8)；d,预防癌症时的小鼠生存期实验结果(n＝8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；a和b图中显著性差异分析采用t检验；c图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析；d 图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析；***表示与PBS空白对照组相比p＜0.005，有显著性差异；###标示与含免疫佐剂的空白纳米粒+游离裂解液激活的细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；&&&表示与PBS刺激的细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；
图3-22分别为实施例2-21中用本发明所述细胞系统预防或治疗癌症时小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；a,预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8)；b,预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和 log-rank test分析；***表示与PBS空白对照组相比p＜0.005，有显著性差异；**表示与PBS空白对照组相比p＜0.01，有显著性差异；###标示与含免疫佐剂的空白纳米粒+游离裂解液激活的细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；&&&表示与PBS刺激的细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；$代表与多肽纳米粒激活的细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；★代表与未修饰的的纳米粒或微米粒激活的细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；θ代表与无靶头有佐剂的纳米粒激活的细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；λ代表与只使用纳米粒激活的癌症特异性T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ηηη代表与不使用佐剂只使用增加溶酶体逃逸物质的纳米粒激活的癌症特异性T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；π代表与使用含有佐剂但是不含增加溶酶体逃逸物质的纳米粒激活的癌症特异性T细胞组相比p＜ 0.05，有显著性差异；
Figure BDA0003604319240000151
代表与使用纳米粒先激活DC,再注射DC到同种异体体内激活的癌症特异性T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；′Ω′Ω′Ω代表与只使用γδT细胞+NKT细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；
Figure BDA0003604319240000161
代表与使用扩增后的CD4+T细胞和CD8+T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明所述的用于预防或治疗癌症的细胞系统，其包含来自于同种异体的被纳米疫苗和/或微米疫苗激活的癌症特异性T细胞。纳米疫苗和/或微米疫苗负载全细胞组分或其混合物，可直接注射到同种异体体内激活癌症特异性T细胞或者用于体外激活树突状细胞后再注射到同种异体体内激活癌症特异性T细胞。然后分离提取同种异体体内被激活的含有癌症特异性T细胞的细胞系统，即可制备预防或治疗癌症的细胞系统，其制备过程及应用领域如图1所示。
在制备纳米疫苗或微米疫苗时，可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性组分和水不溶性组分并分别制备纳米或微米粒子系统；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶液直接裂解细胞或组织并溶解全细胞组分并制备纳米或微米粒子系统。本发明所述全细胞组分在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、交联化、核酸酶处理等处理后再制备纳米疫苗或微米疫苗；也可细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、交联化、核酸酶处理直接制备纳米疫苗或微米疫苗。本发明部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理；本发明部分实施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、交联化、核酸酶处理、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
在使用癌症疫苗体外激活DC然后再给同种异体注射被体外激活的DC 时，DC可以来源于自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。
同种异体体内的癌症特异性T细胞被激活后，可以从外周血提取含有被激活的癌症特异性T细胞的细胞系统，也可以从任何其他含有癌症特异性T 细胞的组织提取分离。分离提取含有被激活的癌症特异性T细胞的细胞系统时可以采用流式细胞术或者磁珠分选，或者其他任何可以提取分离该类细胞系统的方法。
实施例1纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后预防小鼠的黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分，然后，以有机高分子材料 PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子系统，然后将纳米粒子系统注射到同种异体体内，从同种异体体内分离提取含有癌症特异性T细胞的细胞后，将所提取的细胞注射到小鼠体内预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载水溶性组分的纳米疫苗和负载非水溶性组分的纳米粒子分别制备，应用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，在内部负载水溶性组分或非水溶性组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-9mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)免疫佐剂为0.02mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，表面电位为-8mV左右空白纳米粒制备时分别采用等量poly(I:C)的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)含有癌症特异性T细胞的细胞系统的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠。在第0天，第3天，第7天，第14 天，第21天，第28天和第35天分别给小鼠皮下注射100μL含水溶性组分的 1mgPLGA纳米粒子和100μL含溶解后的非水溶性组分的1mgPLGA纳米粒子。 PBS对照组和空白纳米粒+游离裂解液对照组在相应时间注射相同剂量作为对照。在第38天处死各组小鼠，分别收集各组小鼠的脾脏，制备小鼠脾脏细胞单细胞悬液，并进行红细胞裂解处理以去除单细胞悬液中的红细胞。然后采用磁珠分选法分选得到CD8+T细胞和CD4+T细胞。将所分离得到的上述细胞按下述方法过继移植给同种异体小鼠预防癌症。
使用之前，将小鼠脾细胞中的CD8+T细胞和CD4+T细胞与含有各类黑色素瘤抗原的肿瘤组织裂解液共孵育24小时，然后采用流式细胞术分析小鼠脾细胞中可以被裂解液中的抗原激活的CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的比例。所得结果即为脾细胞中被纳米疫苗激活的黑色素瘤特异性T细胞的比例。如图2a 和图2b所示，纳米疫苗可有效激活黑色素瘤特异性的CD8+ T细胞和CD4+ T 细胞。
(4)同种异体的癌症特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(3)制备得到的100万个CD4+ T细胞 (60万个)和CD8+ T细胞(40万个)静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过 2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图2c和2d所示，接受PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠T细胞的受体小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比，接收纳米粒免疫激活的T细胞的受体小鼠体内的肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明同种异体的癌症特异性T细胞对黑色素瘤具有良好的预防效果。
实施例2纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载有黑色素瘤癌细胞和肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，与天然免疫细胞一同回输给小鼠以治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以制备肿瘤组织和癌细胞的水溶性组分混合物(质量比1:1)和非水溶性组分混合物(质量比1:1)，然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子系统在同种异体体内激活癌症特异性T细胞，然后分离提取总T细胞、NKT细胞和NK细胞，将上述细胞注射给患癌小鼠治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10 细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解所得样品；收集培养的B16F10癌细胞系时，先离心去除培养基后使用PBS洗涤两次并离心收集癌细胞，将癌细胞在超纯水中重悬，反复冻融3次，并伴有超声破坏裂解癌细胞。待肿瘤组织或癌细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。将肿瘤组织的水溶性组分和癌细胞的水溶性组分按质量比1:1混合；肿瘤组织的非水溶性组分和癌细胞的非水溶性组分按质量比1:1混合。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用复乳法制备。在制备时负载水溶性组分混合物的纳米粒子和负载非水溶性组分混合物的纳米粒子分别制备，应用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为 7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG且佐剂只分布于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，在内部负载裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在使用前将其用9mL PBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80 mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为290nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG免疫佐剂各0.02mg。空白纳米粒粒径为270nm左右，表面电位为-6mV左右，空白纳米粒分别采用等量poly(I:C)和CpG的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)纳米粒子激活癌症特异性T细胞
本研究对照组分别是PBS组、空白纳米粒+游离裂解液对照组。选取6-8 周的雌性C57BL/6为模型小鼠。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天分别皮下注射100μL负载水溶性组分的1mg PLGA纳米粒和100μL 负载原非水溶性组分的1mg PLGA纳米粒。对照组在相应天数分别注射PBS 或者负载等量免疫佐剂的空白纳米粒+游离裂解物。第38天从小鼠中利用流式细胞术分离总T细胞、NK细胞和NKT细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体的细胞混合物给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射100μL含50万个T细胞、20万个NK细胞和20万个NKT细胞的同种异体的细胞混合物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式 v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图3所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比，纳米疫苗激活的来自同种异体的癌症特异性T细胞和天然免疫细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明的细胞系统对黑色素瘤具有良好的治疗效果。
实施例3来自同种异体的细胞系统用于黑色素瘤肺转移的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤肺模型来说明如何使用同种异体的细胞系统预防癌症转移。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分；然后，制备负载有肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分的纳米粒子系统。在本实施例中采用了硅化和添加带电物质的方法来增加抗原的负载量，且只进行了一轮矿化处理。本实施例中，使用纳米粒子先在体外激活树突状细胞，再注射树突状细胞激活癌症特异性 T细胞。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，加入胶原酶在RPMI 1640培养基中孵育30min,然后通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入％5的SDS水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在％5的SDS水溶液中可溶。以上即为制备粒子的抗原原料来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法中的复乳法制备，对复乳法进行了适当的修饰改进，在纳米粒子制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。在制备时负载水溶性组分的纳米粒子和负载非水溶性组分的纳米粒子分别制备，应用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)既分布于纳米粒子内部也负载于纳米粒子表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂，在内部负载抗原后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，然后使用7mL PBS重悬纳米粒子并与3mL含有细胞裂解物(60mg/mL)的 PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL硅酸盐溶液(含 150mM NaCl、80mM原硅酸四甲酯和1.0mM HCl，pH 3.0)重悬,并在室温固定10min，尔后在-80℃固定24h，使用超纯水离心洗涤后使用3mL含鱼精蛋白(5mg/mL)和聚赖氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心20min洗涤，采用10mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min,然后在10000g离心20分钟并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3 mL含佐剂的癌组织裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的经冷冻硅化和添加阳离子物质的修饰的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为350nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载300μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的纳米粒子制备方法步骤基本与修饰处理的纳米粒子的制备相同，只是未经过低温硅化和添加带电物质处理这些步骤。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载抗原(裂解组分) 后在10000g离心20分钟，然后使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入含佐剂的3mL癌组织裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子。该纳米粒子平均粒径为320nm左右，纳米粒子表面电位为-4mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载150μg蛋白质或多肽组分，每 1mgPLGA纳米粒内外所使用的poly(I:C)免疫佐剂共约为0.02mg且内外各半。
空白纳米粒粒径为300nm左右，表面电位为-5mV左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量poly(I:C)的纯水或5％的SDS代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)树突状细胞的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3 min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)， 37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF (20ng/mL)RPMI 1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)树突状细胞的激活
将小鼠BMDC铺到细胞培养板中，在每10万个BMDC细胞中加入5mL RPMI 1640(10％FBS)培养基，尔后加入30μg负载水溶性组分的PLGA纳米粒子和30μg负载非水溶性组分的PLGA纳米粒子与BMDC共孵育48h，尔后收集BMDC后在300g离心5分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后重悬于PBS中备用。对照组加入空白纳米粒+游离裂解液与BMDC细胞共孵育。
(5)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100万个BMDC细胞。各组注射的BMDC细胞分别被负载裂解液的纳米粒子或者空白纳米粒子+游离裂解液激活过。第32天从小鼠中利用流式细胞术从脾脏单细胞悬液中分离总T细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(6)同种异体细胞系统用于癌症转移的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL的50万个同种异体的 T细胞。同时在第1天给每只小鼠静脉注射接种0.5×105个B16F10细胞，第14 天处死小鼠，观察记录小鼠肺部黑色素瘤癌灶数量。
(7)实验结果
如图4所示，对照组小鼠的癌灶较多都长大，而经本发明所述细胞系统预处理的小鼠几乎没有癌灶。而且，采用硅化和添加带电物质修饰处理的纳米粒子激活的细胞系统对黑色素瘤肺转移的预防效果优于制备过程中未做修饰处理的纳米粒子激活的细胞系统。
实施例4微米粒子激活的同种异体细胞用于癌症的预防
本实施例中，首先使用6M盐酸胍裂解B16F10黑色素瘤癌细胞全细胞组分。然后，以有机高分子材料PLGA为微米粒骨架材料，以CpG为免疫佐剂制备负载有癌细胞的全细胞组分的微米粒子系统。在本实施例中采用了硅化、添加阳离子物质和阴离子物质的方法增加抗原的负载量，而且进行了两轮硅化处理。微米粒子激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，将包含上述细胞的细胞混合物注射给患癌小鼠预防癌症。
(1)癌细胞的裂解
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用6M盐酸胍重悬和裂解癌细胞，全细胞组分裂解并溶于6M盐酸胍后即为制备微米粒子系统的抗原原料来源。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中微米粒子及作为对照的空白微米粒采用复乳法制备，对复乳法进行了适当的修饰改进，在微米粒子制备过程中采用低温硅化技术和添加带电物质两种修饰方法提高抗原的负载量。所采用的微米粒子制备材料 PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG且CpG既分布于微米粒子内部也负载于微米粒子表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载全细胞组分，在内部负载裂解组分后，将100mg微米粒子在10000g离心15分钟，然后使用7mL PBS重悬微米粒子并与 3mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液混合，尔后在10000g离心20分钟，然后采用10mL硅酸盐溶液(含120mM NaCl、100mM原硅酸四甲酯和1.0 mM HCl，pH 3.0)重悬,并在室温固定12h，使用超纯水离心洗涤后使用3 mL含聚天冬氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心15 min洗涤，采用10mL含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用 10min,然后在10000g离心20分钟。然后采用10mL硅酸盐溶液(含150mM NaCl、80mM原硅酸四甲酯和1.0mMHCl，pH 3.0),并在室温固定12h，使用超纯水离心洗涤后使用3mL含组蛋白(5mg/mL)和聚精氨酸(10 mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心15min洗涤，采用10mL 含有细胞裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用10min,然后在10000g 离心15分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL含佐剂的癌细胞裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的经两轮冷冻硅化、添加阳离子物质和阴离子物质的修饰的微米粒子。该微米粒子平均粒径为2.50μm左右，微米粒子表面电位为-2mV左右；每1mg PLGA 微米粒子约负载340μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒使用CpG免疫佐剂共0.02mg且内外各半。
未经修饰处理的微米粒子制备方法步骤基本与修饰处理的微米粒子的制备相同，只是未经过硅化、添加阳离子物质和阴离子物质处理这些步骤。在制备过程中首先采用复乳法在微米粒子内部负载细胞组分，在内部负载细胞组分后在10000g离心15分钟，然后使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入含佐剂的3mL 癌组织裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的微米粒子。该微米粒子平均粒径为2.45μm左右，微米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载160μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒使用CpG免疫佐剂共0.02mg且内外各半。
空白微米粒粒径为2.43μm左右，表面电位为-3mV左右，空白微米粒制备时采用含有等量CpG的6M盐酸胍代替相对应的细胞组分。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含2mg PLGA的微米粒子。第32天从小鼠中利用流式细胞术分离总T细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含100万个T细胞的同种异体的细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式 v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图5所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而使用过继转移的T细胞组的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢。而且，采用硅化和添加带电物质修饰处理的微米粒子激活的细胞系统对黑色素瘤预防效果优于制备过程中未做修饰处理的微米粒子激活的细胞系统。
实施例5纳米粒子激活癌症特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例中，首先使用8M尿素水溶液((含500mM氯化钠))裂解B16F10 黑色素瘤肿瘤组织，并溶解肿瘤组织裂解物组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂制备负载有全细胞组分的纳米粒子系统。纳米粒子注射到小鼠体内激活癌症特异性T细胞后，分离提取T细胞和NK细胞，然后将T细胞和NK细胞给与同种异体的患癌小鼠用于预防癌症。
(1)肿瘤组织的收集及裂解
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解细胞，并溶解细胞裂解物。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG,且裂解物组分和佐剂负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂，在内部负载抗原裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右，纳米粒子表面电位为-8mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG免疫佐剂各为0.02mg。空白纳米粒粒径为250nm左右，表面电位为-9mV左右，空白纳米粒制备时采用含等量poly(I:C)和CpG的8M尿素(含500mM氯化钠)代替裂解物组分。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含2mg PLGA的纳米粒子。第32天从小鼠中利用流式细胞术分离总T细胞和NK细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含100万个T细胞和 50万个NK细胞的同种异体的细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种 1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过 2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图6所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而经负载抗原的纳米粒子激活过的免疫细胞进行移植的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢，且大部分小鼠癌细胞接种后肿瘤消失。
实施例6纳米粒子激活癌症特异性T细胞后用于治疗结肠癌
本实施例以MC38小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用同种异体的免疫细胞治疗结肠癌。首先裂解结肠癌肿瘤组织和肺癌癌细胞以制备水溶性组分混合物(质量比1:1)和非水溶性组分(质量比1:1)混合物，并将水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物按质量比1:1混合。然后，以有机高分子材料PLA为纳米粒骨架材料，以CpG和卡介苗(BCG)为免疫佐剂制备纳米粒子，并用该纳米粒子激活癌症特异性T细胞，然后分离提取含有癌症特异性T细胞的免疫细胞用于治疗同种异体的结肠癌。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38细胞在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将培养的LLC肺癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用 PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。
将来自结肠癌肿瘤组织的和肺癌癌细胞的的水溶性组分按质量比1:1混合；溶解于8M尿素中的非水溶性组分也按质量比1:1混合。然后将水溶性组分混合物和非水溶性组分混合物按照质量比1:1混合，该混合物为制备纳米粒子的原料来源。
(2)BCG的裂解和各组分的收集
BCG的裂解方法和各组分的收集方法同癌细胞的裂解方法和各组分的收集方法，水溶性组分和溶解的非水溶性组分按质量比1:1混合。
(3)纳米粒子的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLA分子量为40KDa，所采用的免疫佐剂为CpG和 BCG，且佐剂同时分布于纳米粒子内部和表面。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物混合物和佐剂，在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL 含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mL PBS中，并于0.1mL含有裂解物混合物(80mg/mL)和佐剂的样品室温混合孵育5分钟后即可使用。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载120μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒含有CpG和BCG免疫佐剂各0.02mg。空白纳米粒粒径为260nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量佐剂尿素溶液代替相对应裂解物组分。
(4)癌症特异性T细胞的激活
同实施例5。但是分离提取总T细胞、NK细胞和NKT细胞。
(5)同种异体细胞系统用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种2×106个MC38细胞，在第4、第7天、第10天、第15天和第 20天分别给小鼠注射100μL含60万个总T细胞、20万个NK细胞和20万个NKT 细胞的同种异体免疫细胞。从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过 2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(6)实验结果
如图7所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比纳米粒子激活的免疫细胞移植组小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明同种异体免疫细胞治疗方案对结肠癌具有良好的治疗效果。
实施例7被负载黑色素瘤肿瘤组织和肺癌肿瘤组织全细胞组分的纳米粒子激活的免疫细胞用于黑色素瘤的治疗
本实施例以黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载黑色素瘤和肺癌肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子激活癌症特异性T细胞，并用该细胞疫苗治疗同种异体小鼠的黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和LLC肺癌肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性组分混合物(质量比 3:1)和非水溶性组分混合物(3:1)。以PLGA为纳米粒骨架材料，以锰颗粒和CpG为免疫佐剂制备负载上述混合物的纳米粒子，然后采用该纳米粒子激活小鼠体内的癌症特异性T细胞，并分离提取免疫细胞治疗同种异体患癌小鼠的黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞或者2×106个 LLC肺癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。肿瘤的裂解和各组分收集方法同实施例1。将来自黑色素瘤肿瘤组织的和来自肺癌肿瘤组织的水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分分别按照3:1的比例混合即为制备纳米粒子的抗原来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子系统及作为对照的空白纳米粒采用复乳法制备。在制备时负载全细胞组分中水溶性组分的纳米粒子和负载全细胞组分中非水溶性组分的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为锰胶体颗粒和 CpG。先制备锰佐剂，然后将锰佐剂与全细胞组分中的水溶性组分或非水溶性组分混合后作为第一水相采用复乳法制备内部负载抗原和佐剂的纳米粒。在制备锰佐剂时，先将1mL 0.3M的Na3PO4溶液加入到9mL生理盐水中，后加入2mL 0.3M的MnCl2溶液，放置过夜后，即得到Mn2OHPO4胶体锰佐剂，锰佐剂粒径约为13nm。然后将锰佐剂与全细胞组分全细胞组分中的水溶性组分(60mg/mL)或非水溶性组分(60mg/mL)按1:3体积比混合后采用复乳法将抗原和锰佐剂负载到纳米粒内部。在内部负载抗原(裂解组分)和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为370nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载120μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒使用CpG佐剂为0.01mg。
空白纳米粒粒径为330nm左右，空白纳米粒制备时分别采用含有等量锰佐剂和CpG佐剂的纯水或8M尿素代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)树突状细胞的制备
同实施例3。
(4)树突状细胞的激活
同实施例3。
(5)癌症特异性T细胞的激活
同实施例3。
(6)同种异体细胞系统用于癌症的治疗
同实施例2。
(7)实验结果
如图8所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比纳米粒子激活的免疫细胞移植组小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明同种异体免疫细胞治疗方案对黑色素瘤具有治疗效果。
实施例8被微米粒子激活同种异体免疫细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用8M尿素溶解全细胞组分并制备负载有全细胞组分的微米粒子系统，并以该微米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先对乳腺癌细胞进行灭活和变性处理并以8M尿素裂解癌细胞后溶解全细胞组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG和Poly ICLC为免疫佐剂制备负载有全细胞组分的微米粒子系统。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后采用适量8M尿素裂解乳腺癌细胞并溶解裂解物即为制备粒子系统的原料来源。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统及作为对照的空白微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG 和Poly ICLC。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分和佐剂的微米粒子,在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.1μm左右，微米粒子系统表面电位为-5mV左右；每1mgPLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly ICLC各0.01mg。空白微米粒粒径为2.0μm左右，空白微米粒制备时采用含有等量CpG和Poly ICLC 佐剂的8M尿素代替相对应的细胞组分。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含2mg PLGA的微米粒子。第32天从小鼠中利用磁珠分选法分离总T细胞和NK细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含100万个T细胞和50 万个NK细胞的同种异体免疫细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3+天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过 2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图9所示，与对照组相比，被微米粒激活的免疫细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。由此可见，本发明所述的来自同种异体的激活免疫细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例9纳米粒子激活同种异体免疫细胞用于癌症转移的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤小鼠肺转移癌症模型来说明使用纳米粒子激活同种异体的免疫细胞后移植该类免疫细胞预防癌症转移。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。本实施例中，将小鼠黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以8M尿素裂解后溶解，然后肿瘤组织裂解组分和癌细胞裂解组分按质量比1:2负载于纳米粒子系统，并用该粒子系统激活同种异体小鼠体内的癌症特异性T细胞，预防移植小鼠体内的癌症转移。在本实施例中，采用负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1, TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4, NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL) 的纳米粒子作为对照纳米粒子使用，以分析负载全细胞抗原的纳米粒子和负载多种多肽新生抗原的纳米粒子激活的同种异体的免疫细胞预防癌症肺转移中的功效。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解
收集小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤组织和培养的癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解肿瘤组织和癌细胞全细胞组分，然后肿瘤组织组分和癌细胞组分按质量比1:2混溶。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子系统采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为CpG和Poly(I:C)。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂，在内部负载裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g 离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly(I:C)各0.02mg。负载多种抗原多肽的对照纳米粒子制备方法同上，对照纳米粒子粒径为260nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg抗原多肽和等量佐剂。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射200μL的2mg PLGA纳米粒子。第32天从小鼠中利用流式细胞术分离总T细胞、NK细胞和NKT细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症转移的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL含100万个T细胞、 20万个NK细胞和20万个NKT细胞的同种异体的细胞混合物。同时在第1天给每只小鼠静脉注射接种0.5×105个B16F10细胞，第14天处死小鼠，观察记录小鼠肺部黑色素瘤癌灶数量。
(5)实验结果
如图10所示，被纳米粒激活的免疫细胞可在同种异体中有效预防癌症转移。而且，与对照组相比，被负载裂解物和佐剂的纳米粒激活的免疫细胞在同种异体中预防癌症转移的效果更好。
实施例10纳米粒子激活同种异体中的癌症特异性T细胞用于胰腺癌的治疗
本实施例中，将小鼠Pan02胰腺癌肿瘤组织和MC38结肠癌肿瘤组织裂解组分按3:1的比例负载于纳米粒子，并使用该纳米粒子激活小鼠癌症特异性T 细胞，然后使用含有被激活细胞的免疫细胞治疗胰腺癌。实验中，先取得小鼠胰腺癌和结肠癌肿瘤组织并将其裂解以制备水溶性组分和溶于6M盐酸胍中的原非水溶性组分。在制备粒子时，水溶性组分为胰腺癌肿瘤组织水溶性组分和结肠癌肿瘤组织水溶性组分3:1的混合物；非水溶性组分为胰腺癌肿瘤组织非水溶性组分和结肠癌肿瘤组织非水溶性组分3:1的混合物。以PLGA 为纳米粒子骨架材料，以BCG为负载于纳米粒子的佐剂，注射纳米粒子时混合粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)作为佐剂。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠腋下皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞或接种 1×106个Pan02胰腺癌细胞，在各只小鼠所接种肿瘤长到体积分别为约1000 mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。裂解方法及各组分的收集方法同实施例1，只是使用6M盐酸胍而非8M尿素溶解非水溶性组分。BCG的裂解方法同肿瘤组织裂解方法。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为 BCG,且BCG负载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂，在内部负载抗原裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。在纳米粒子注射前将20mg纳米粒子溶于0.9mL PBS中，与0.1mL含裂解物(80mg/mL)和GM-CSF (50ng/mL)的样品混合并在室温作用10min后使用。该纳米粒子平均粒径为260nm左右，纳米粒子表面电位为-4mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载130μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒使用BCG免疫佐剂0.02mg。空白纳米粒粒径为230nm左右，空白纳米粒制备时采用含等量佐剂。
(3)癌症特异性T细胞的激活
同实施例6。
(4)疫苗用于癌症的治疗
同实施例6。
(5)实验结果
如图11所示，被纳米粒激活的免疫细胞可在同种异体中有效治疗胰腺癌。而且，与对照组相比，被负载裂解物和佐剂的纳米粒激活的免疫细胞在同种异体中治疗癌症转移的效果更好。
实施例11靶头修饰纳米粒激活同种异体免疫细胞用于癌症的预防
本实施例以甘露糖为主动靶向的靶头为例说明如何靶向纳米粒激活同种异体的癌症特异性T细胞并用于预防癌症。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。该纳米粒子系统可通过树突状细胞表面的甘露糖受体摄取进入树突状细胞，并进而激活癌针特异性T 细胞。
(1)癌细胞的裂解
收集培养的B16F10癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解癌细胞全细胞组分。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子系统使用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料为PLGA和甘露糖修饰的PLGA，制备带有靶头的纳米粒子时二者一起使用时质量比为4:1，分子量都为7KDa-17KDa。不带靶头的纳米粒只使用PLGA。所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)和CpG。制备方法如前所述，采用复乳法将裂解物组分和佐剂共负载于纳米粒子内部，然后将100mg纳米粒子在10000g 离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。带有靶头和不带靶头的纳米粒子的平均粒径均为270nm左右，每1mg PLGA 纳米粒子约负载80μg蛋白质或多肽组分，含Poly(I:C)和CpG各0.02mg。不负载佐剂的但带有甘露糖靶头的对照纳米粒粒径也为270nm左右，制备时采用等量细胞组分但是不含任何免疫佐剂，每1mgPLGA纳米粒子约负载80μg 蛋白质或多肽组分。
(3)癌症特异性T细胞的激活
同实施例1。
(4)疫苗用于癌症的预防
同实施例1。
(5)实验结果
如12图所示，与对照组相比，使用同种异体被激活免疫细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢。而且，纳米粒子只负载裂解物组分不负载佐剂时，纳米粒子激活的同种异体的癌症特异性T细胞也有预防癌症的效果。使用含有佐剂的纳米粒子激活的同种异体的癌症特异性T细胞效果好于不含佐剂的纳米粒子；使用含有靶头的纳米粒子所激活的免疫细胞好于不含靶头纳米粒子激活的免疫细胞。这说明本发明所述的来自同种异体的免疫细胞可以预防癌症，而且主动靶向靶头和佐剂的加入有助于纳米粒子激活同种异体的癌症特异性免疫细胞从而发挥作用。
实施例12纳米粒子激活同种异体的免疫细胞预防肝癌
本实施例中，首先裂解Hepa1-6肝癌细胞，以PLGA为纳米粒子骨架材料，以Poly(I:C)和BCG为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载肝癌细胞全细胞组分的纳米粒子系统，然后以该粒子系统激活同种异体的癌症特异性T细胞，分离提取同种异体的免疫细胞预防肝癌。
(1)癌细胞的裂解及各组分的收集
收集培养的Hepa 1-6肝癌细胞后使用PBS洗涤两遍，使用加热和紫外照射处理肝癌细胞，尔后采用8M尿素裂解和溶解癌细胞全细胞组分。BCG的裂解方法同上。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子系统采用溶剂挥发法中的复乳法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为BCG和 Poly(I:C)。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解组分和佐剂，在内部负载裂解组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥 48h后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含有BCG和Poly(I:C)各0.02mg。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射200μL的2mg PLGA纳米粒子。第32天从小鼠中利用流式细胞术分离CD4+T细胞、CD8+T细胞，γδT细胞和NK细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症转移的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肝癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠注射100μL含50万个CD8+T细胞+50万个 CD4+T细胞的同种异体的细胞混合物；或者第0天注射100μL含50万个CD8+T 细胞+50万个CD4+T细胞+50万个NK细胞+50万个γδT细胞的同种异体的细胞混合物。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.0×106个Hepa1-6肝癌细胞，肿瘤生长和小鼠生存期记录方式同实施例1。
(5)实验结果
如图13所示，与对照组相比，使用同种异体被激活免疫细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢。而且，使用含有NK细胞和NKT细胞等天然免疫细胞的效果好于不含天然免疫系统免疫细胞。这说明本发明所述的来自同种异体的免疫细胞可以预防癌症，而且天然免疫细胞的加入有助于增强纳米粒子体外激活癌症特异性免疫细胞发挥作用。
实施例13钙化的纳米粒子系统激活同种异体癌症特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例说明钙化的纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，在实际使用时也可以使用其他生物矿化技术、交联、凝胶化等修饰粒子。在实际应用时具体剂型，佐剂，给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。本实施例中，将小鼠黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以8M尿素裂解后溶解，然后肿瘤组织裂解组分和癌细胞裂解组分按质量比1:1负载于纳米粒子系统，并用该粒子系统激活同种异体的癌症特异性T细胞，并将同种异体的免疫细胞移植用于癌症的预防。在本实施例中，采用负载四种多肽新生抗原 B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24 (Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4, NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL) 的纳米粒子作为对照纳米粒子使用。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解
收集小鼠B16F10黑色素瘤肿瘤组织和培养的癌细胞后采用8M尿素裂解和溶解肿瘤组织和癌细胞全细胞组分，然后肿瘤组织组分和癌细胞组分按质量比1:1混溶。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例在纳米粒子内部和表面负载全细胞抗原后生物钙化纳米粒子。本实施例中纳米粒子系统及作为对照的空白纳米粒采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用免疫佐剂CpG 和Poly(I:C)负载于纳米粒子内部。制备方法如下所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，在内部负载裂解组分后，将100mg PLGA 纳米粒子在13000g离心20min后使用18mL PBS重悬，然后加入2mL溶解于8M尿素的肿瘤组织和癌细胞裂解液(60mg/mL)，在室温作用10分钟后在12000g离心20分钟后收集沉淀。然后将该100mg PLGA纳米粒子重悬于20 mL DMEM培养基中，然后加入200μL of CaCl2(1mM)并在37℃反应两小时。然后在10000g离心20分钟后收集沉淀，并采用超纯水重悬后离心洗涤两遍。该纳米粒子平均粒径为290nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，CpG和Poly(I:C)各0.02mg。负载多种抗原多肽的对照纳米粒子制备方法同上，对照纳米粒子粒径为290nm左右，每1mg PLGA 纳米粒子约负载130μg抗原多肽和等量佐剂。
(3)癌症特异性T细胞的激活
同实施例1。
(4)疫苗用于癌症的预防
同实施例1。
(5)实验结果
如图14所示，与对照组相比，钙化纳米粒激活的同种异体的免疫细胞可以延长小鼠生存期有效预防癌症。而且，负载全细胞组分纳米粒子激活的免疫细胞效果好于使用负载几种抗原多肽的纳米粒子。
实施例14纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，与天然免疫细胞一同回输给小鼠以治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织制备肿瘤组织的水溶性组分和非水溶性组分，然后以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂，以GALA (WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA)为促进溶酶体逃逸组分，采用溶剂挥发法制备共负载佐剂、溶酶体逃逸物质和水溶性组分混合物或非水溶性组分混合物的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子系统在同种异体体内激活癌症特异性T细胞，然后分离提取总T细胞、NKT细胞和NK细胞，将上述细胞注射给患癌小鼠治疗黑色素瘤。在纳米粒子递送载体中加入了可以促进溶酶体逃逸的物质，比如本实施例所加的细胞穿透肽，可以增加粒子或粒子负载的抗原溶酶体逃逸，进而增加抗原的交叉提呈和增加CD8+T细胞免疫反应的激活效能，更好的激活癌症特异性CD8+T细胞免疫反应。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10 细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解所得样品。待肿瘤组织或癌细胞裂解后，将裂解物以5000g 的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入2.0M的精氨酸氯化钠溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性组分转化为在水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用复乳法制备。在制备时负载水溶性组分混合物的纳米粒子和负载非水溶性组分混合物的纳米粒子分别制备，应用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为 7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG，溶酶体逃逸物质为 GALA多肽，且佐剂和多肽包裹于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，在内部负载裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在使用前将其用9mL PBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为290nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG免疫佐剂各0.02mg，负载GALA多肽0.05mg。空白纳米粒粒径为270nm左右，空白纳米粒分别采用等量佐剂和GALA多肽的纯水或2M精氨酸代替相对应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)纳米粒子激活癌症特异性T细胞
本研究对照组分别是PBS组、空白纳米粒+游离裂解液对照组。选取6-8 周的雌性C57BL/6为模型小鼠。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天分别皮下注射100μL负载水溶性组分的1mg PLGA纳米粒和100μL 负载原非水溶性组分的1mg PLGA纳米粒。对照组在相应天数分别注射PBS 或者负载等量免疫佐剂的空白纳米粒+游离裂解物。第38天从小鼠中利用流式细胞术分离总T细胞、NK细胞和NKT细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T细胞。
(4)同种异体的细胞混合物给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射100μL含80万个T细胞、10万个NK细胞和10万个NKT细胞的同种异体的细胞混合物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式 v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图15所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比，纳米疫苗激活的来自同种异体的癌症特异性T细胞和天然免疫细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明的细胞系统对黑色素瘤具有良好的治疗效果。
实施例15纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载有黑色素瘤肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，回输给小鼠以治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织，然后以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂，以聚赖氨酸为增加溶酶体逃逸组分制备纳米粒子系统，然后使用纳米粒子系统在同种异体体内激活癌症特异性T细胞，然后分离提取总CD4+T细胞和CD8+ T细胞，将上述细胞注射给患癌小鼠治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10 细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后制备单细胞悬液，然后使用5％脱氧胆酸钠水溶液裂解细胞并溶解裂解物组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米疫苗及作为对照的空白纳米粒采用复乳法制备，具有靶向树突状细胞的能力。所采用的纳米粒子制备材料为PLGA和甘露聚糖修饰的PLGA，二者分子量都为24KDa-38KDa，使用时未修饰PLGA和甘露聚糖修饰PLGA的质量比为4:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG，增加溶酶体免疫逃逸的物质为聚赖氨酸，且佐剂和聚赖氨酸包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂、聚赖氨酸，在内部负载上述组分后，将100mg纳米粒子在10000g 离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为-5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG免疫佐剂各0.02mg,聚赖氨酸0.05mg。对照纳米粒制备材料和方法同上，只是不负载聚赖氨酸，其粒径为280nm左右，负载等量佐剂和细胞裂解组分。
(3)纳米粒子激活癌症特异性T细胞
本研究对照组分别是PBS组、对照纳米粒子处理组。选取6-8周的雌性 C57BL/6为模型小鼠。在第0天、第7天、第14天、第21天、第28天和第35天分别皮下注射100μL的2mgPLGA纳米粒。第38天从小鼠中利用流式细胞术分离CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞。
(4)同种异体的细胞混合物给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射100μL含60万个CD8+T 细胞和40万个CD4+T细胞的细胞混合物。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图16所示，PBS对照组的肿瘤都长大。与对照组相比，纳米疫苗激活的来自同种异体的癌症特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且加入增加溶酶体逃逸物质的纳米粒子激活的T细胞好于未加入溶酶体逃逸的纳米粒子激活的T细胞。综上所述，本发明的细胞系统对黑色素瘤具有良好的治疗效果。
实施例16被微米粒子激活同种异体免疫细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载全细胞组分的微米粒子系统，并以该微米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先对乳腺癌细胞进行灭活和变性处理，尔后裂解细胞，并以辛基葡萄糖苷溶解裂解癌细胞中的非水溶性组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG和Poly ICLC为免疫佐剂，以KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有全细胞组分的微米粒子系统。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后加入超纯水并反复冻融5次辅以超声裂解癌细胞，将细胞裂解物在5000g离心10 分钟，上清液即为水溶性组分，将沉淀物使用10％辛基葡萄糖苷溶解后即为溶解后的原非水溶性组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统及作为对照微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为KALA多肽。制备时，负载水溶性组分的粒子和负载非水溶性组分的粒子分别制备，使用时一起使用。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂和KALA多肽的微米粒子,在内部负载裂解物和佐剂后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL 含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为 3.1μm左右，微米粒子系统表面电位为-7mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly ICLC各0.01mg，含KALA多肽 0.05mg。对照微米粒粒径为3.1μm左右，制备材料和制备方法与本实施例所述微米粒子相同，只是不负载KALA多肽，负载等量CpG和Poly ICLC佐剂细胞裂解物组分。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含水溶性组分的1mg PLGA的微米粒子和100μL含非水溶性组分的1mgPLGA的微米粒子。第32天从小鼠中利用磁珠分选法分离总T细胞。总T细胞中含有γδT细胞和被激活的癌症特异性T 细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含100万个T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3+天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图17所示，与对照组相比，被微米粒激活的免疫细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，含有增加溶酶体逃逸功能的物质的微米粒子所激活的T细胞效果好于不含有溶酶体逃逸功能的物质的微米粒子所激活的T细胞。由此可见，本发明所述的来自同种异体的激活免疫细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例17被微米粒子激活同种异体免疫细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载全细胞组分的微米粒子系统，并以该微米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先使用8M尿素溶液对乳腺癌细胞进行裂解并溶解裂解组分。然后，以PLA为微米粒子骨架材料，以CpG和Poly ICLC 为免疫佐剂，以精氨酸和组氨酸为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有全细胞组分的微米粒子系统。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分，即为制备微米粒子系统的抗原组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统及作为对照微米粒子采用复乳法，微米粒子骨架材料为未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA，分子量都为40KDa，未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA的比例为9:1。所采用的免疫佐剂为CpG和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为精氨酸和组氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂、精氨酸和组氨酸的微米粒子,尔后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.1μm左右，微米粒子系统表面电位为-7mV左右；每1mg PLA微米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly ICLC各0.01mg，含精氨酸和组氨酸各0.05mg。对照微米粒制备材料和制备方法与本实施例所述微米粒子相同，粒径为2.1μm左右，表面电位为-7mV左右，只负载精氨酸和组氨酸和等量的细胞裂解物组分，而不负载任何佐剂。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含2mg PLA的微米粒子。第32天处死小鼠后摘取小鼠脾脏，制备小鼠脾脏单细胞悬液，并从小鼠脾细胞中利用磁珠分选法分选得到CD8+T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL含100万个CD8+T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v 为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图18所示，与对照组相比，被微米粒激活的免疫细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，含有增加溶酶体逃逸功能的物质和免疫佐剂的微米粒子所激活的T细胞效果好于只含有溶酶体逃逸功能的物质而不含有佐剂的微米粒子所激活的T细胞。由此可见，本发明所述的来自同种异体的激活免疫细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例18纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用负载有黑色素瘤癌细胞和肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，回输给小鼠以治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10 黑色素瘤癌细胞以制备水溶性组分和非水溶性组分，然后，以PLGA为骨架材料，以Poly(I:C)和CpG为免疫佐剂，以R8(RRRRRRRR)多肽为溶解溶酶体逃逸能力的物质，制备负载水溶性组分或非水溶性组分的纳米粒子系统，然后将纳米粒子系统与树突状细胞体外共孵育后将树突状细胞回输同种异体体内激活癌症特异性T细胞，然后分离提取CD8+ T细胞用于癌症治疗。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10 细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解所得样品，加入核酸酶作用10分钟后在95℃加热5分钟灭活核酸酶；收集培养的B16F10癌细胞系时，先离心去除培养基后使用PBS 洗涤两次并离心收集癌细胞，将癌细胞在超纯水中重悬，反复冻融3次，并伴有超声破坏裂解癌细胞，尔后在样品中加入核酸酶作用10分钟后在95℃加热5分钟灭活核酸酶。待肿瘤组织或癌细胞酶作用处理后，将裂解物以 5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入50％甘油溶解沉淀部分转化为可溶。将肿瘤组织的水溶性组分和癌细胞的水溶性组分按质量比1:1混合；肿瘤组织的非水溶性组分和癌细胞的非水溶性组分按质量比1:1混合。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。在制备时负载水溶性组分混合物的纳米粒子和负载非水溶性组分混合物的纳米粒子分别制备，应用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG，R8多肽为增加溶酶体逃逸的物质，且佐剂和R8 多肽负载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分、佐剂和R8多肽，在内部负载裂解组分后，将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在使用前将其用9mL PBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的纳米粒子系统。该纳米粒子平均粒径为290nm左右，纳米粒子表面电位为 -5mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和CpG免疫佐剂各0.02mg，负载0.1mg R8多肽。空白纳米粒粒径为270nm左右，空白纳米粒分别负载等量佐剂和R8多肽的纯水或50％甘油代替相应的水溶性组分和非水溶性组分。
(3)树突状细胞的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备骨髓来源的树突状细胞(BMDC)。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3 min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)， 37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF (20ng/mL)RPMI 1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)树突状细胞的激活
将小鼠BMDC铺到细胞培养板中，在每10万个BMDC细胞中加入5mL RPMI 1640(10％FBS)培养基，尔后加入30μg负载水溶性组分的PLGA纳米粒子和30μg负载原非水溶性组分的PLGA纳米粒子与BMDC共孵育48h，尔后收集BMDC后在300g离心5分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后重悬于PBS中备用。对照组加入空白纳米粒+游离裂解液与BMDC细胞共孵育。
(5)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100万个BMDC细胞。各组注射的BMDC细胞分别被负载裂解液的纳米粒子或者空白纳米粒子+游离裂解液激活过。第32天从小鼠中利用流式细胞术从脾脏单细胞悬液中分离CD8+T细胞。
(6)同种异体的细胞混合物给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射100μL的80万个CD8+ T细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(7)实验结果
如图19所示，PBS对照组和空白纳米粒对照组小鼠的肿瘤都长大。与对照组相比，纳米疫苗激活的来自同种异体的癌症特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。综上所述，本发明的细胞系统对黑色素瘤具有良好的治疗效果。
实施例19同种异体的癌症特异性T细胞用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用负载有结肠癌肿瘤组织的全细胞组分的纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞后，回输给小鼠以治疗结肠癌。本实施例中，首先使用8M尿素水溶液裂解结肠癌肿瘤组织并溶解裂解组分，然后，以PLGA为骨架材料，以Poly(I:C)和CpG 为免疫佐剂，制备纳米粒子系统，然后使用纳米粒子系统激活同种异体体内的癌症特异性T细胞，然后分离提取CD8+ T细胞用于癌症治疗。本实施例中，激活癌症特异性T细胞使用两种不同的方法，一种为直接将纳米粒子注射进入人体激活，一种为先体外激活树突状细胞再注射进入体内激活癌症特异性 T细胞。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入8M尿素水溶液理解肿瘤组织并溶解裂解后组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料 PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG，且佐剂负载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为260nm左右，纳米粒子表面电位为-7mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)和 CpG免疫佐剂各0.02mg。
(3)树突状细胞的制备
同实施例18。
(4)树突状细胞的激活
将小鼠BMDC铺到细胞培养板中，在每10万个BMDC细胞中加入5mL RPMI 1640(10％FBS)培养基，尔后加入50μg负载裂解组分的PLGA纳米粒子与BMDC共孵育48h，尔后收集BMDC后在300g离心5分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次后重悬于PBS中备用。
(5)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100万个被预激活的BMDC细胞或者注射2mg的 PLGA纳米疫苗。注射的BMDC细胞被负载裂解组分和佐剂的纳米粒子预激活过。第32天从小鼠中利用流式细胞术从脾脏单细胞悬液中分离CD8+T细胞。
(6)同种异体的细胞给与患癌小鼠治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞。在接种结肠癌细胞后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别静脉注射100μL的80万个CD8+ T细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(7)实验结果
如图20所示，PBS对照组都很快长大。与对照组相比，纳米疫苗激活的来自同种异体的癌症特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢且生存期明显延长，而且被直接注射纳米疫苗激活的癌症特异性T细胞效果好于注射树突状细胞激活的癌症特异性T细胞。综上所述，本发明的细胞系统对癌症具有良好的治疗效果。
实施例20纳米粒子激活同种异体免疫细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载全细胞组分的纳米粒子系统，并以该纳米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先使用8M尿素溶液对乳腺癌肿瘤组织进行裂解并溶解裂解组分。然后，以CpG和Poly(I:C)为免疫佐剂，以精氨酸和 KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有全细胞组分的PLGA纳米粒子系统。
(1)肿瘤组织的裂解
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，背部皮下注射1×106个4T1乳腺癌细胞，待肿瘤体积长到1000mm3左右时，处死小鼠，摘取小鼠肿瘤组织，将肿瘤组织切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液，用PBS洗涤两遍后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解肿瘤组织单细胞悬液并溶解裂解物组分，即为制备纳米粒子系统的抗原组分。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中制备纳米粒子系统采用复乳法，纳米粒子骨架材料为未修饰的PLGA和甘露聚糖修饰的PLGA，分子量都为24-38KDa，未修饰的PLGA 和甘露聚糖修饰的PLGA的比例为4:1。所采用的免疫佐剂为CpG和Poly(I:C)，所采用的溶酶体逃逸增加物质为精氨酸和KALA多肽。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂、精氨酸和KALA多肽的纳米粒子，尔后，将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该纳米粒子系统平均粒径为250nm左右，纳米粒子系统表面电位为-8mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG和Poly(I:C)各0.02mg，含精氨酸和KALA各0.05mg。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性BALC/c小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第 21天和第28天分别皮下注射100μL含2mg PLGA的纳米粒子。第32天处死小鼠，收集小鼠外周血，并分离得到小鼠外周血单个核细胞(PBMC)，从PBMC 中利用流式细胞术分选CD3+CD8+T细胞和γδT细胞，将分选得到CD3+CD8+T 细胞和γδT细胞分别与IL-2(1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)和αCD3/αCD28 抗体(10ng/mL)共孵育14天以扩增CD8+T细胞和γδT细胞。对照组小鼠从 PBMC中分离γδT细胞和NKT细胞，并将上述两种细胞分别于IL-2 (1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)和αCD3/αCD28抗体(10ng/mL)共孵育14天以扩增分选得到γδT细胞和NKT细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在第0天给小鼠皮下注射100万个CD8+T细胞+50万个γδT细胞；或者注射75万个γδT细胞+75万个NKT细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式 v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图21所示，与对照组相比，免疫细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，含有CD8+T细胞+γδT细胞的混合免疫细胞效果好于γδT细胞+NKT细胞的混合免疫细胞。CD8+T细胞中含有适应性免疫的癌症特异性T细胞，γδT细胞和NKT细胞都属于天然免疫系统。这说明同时给予适应性免疫细胞和天然免疫细胞效果好于只给与天然免疫细胞。由此可见，本发明所述的来自同种异体的被粒子激活的免疫细胞对乳腺癌具有预防效果。
实施例21被微米粒子激活同种异体免疫细胞用于乳腺癌的治疗
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载全细胞组分的微米粒子系统，并以该微米粒子激活同种异体的癌症特异性T细胞，用于治疗乳腺癌。本实施例中，首先使用8M尿素溶液对乳腺癌细胞进行裂解并溶解裂解组分。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG和Poly ICLC 为免疫佐剂，以精氨酸和赖氨酸为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有全细胞组分的微米粒子系统。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分，即为制备微米粒子系统的抗原组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子系统采用复乳法，微米粒子骨架材料为未修饰的PLGA和甘露糖修饰的PLGA，分子量都为24-38KDa，未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLGA的比例为9:1。所采用的免疫佐剂为CpG和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为精氨酸和赖氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂、精氨酸和来氨酸的微米粒子,尔后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h 后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.1μm左右，微米粒子系统表面电位为 -7mV左右；每1mgPLGA微米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG 和Poly ICLC各0.01mg，含精氨酸和赖氨酸各0.05mg。
(3)癌症特异性T细胞的激活
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第4天、第7天、第14天、第21天和第28天分别后背皮下注射100μL含2mg PLGA的微米粒子。第32天处死小鼠，收集小鼠注射微米粒子附近的引流淋巴结，将引流淋巴结切碎后通过细胞筛网制备单细胞悬液。将2mL含有20万个淋巴结单细胞悬液的 RPMI1640完全培养基与步骤(2)所制备的PLGA微米粒子(30ug)共孵育 48小时，然后在400g离心5分钟收集孵育后的单细胞悬液。从孵育后的淋巴结细胞中利用流式细胞术分选CD3+CD8+CD69+ T细胞和CD3+CD4+CD69+ T 细胞，即为识别癌症特异性抗原表位后被癌症抗原表位激活的癌症特异性T 细胞，将分选得到的CD3+CD8+CD69+和CD3+CD4+CD69+癌症特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)共孵育10天以扩增分选得到癌细胞特异性CD8+T细胞和CD4+T细胞。对照组小鼠的淋巴结单细胞悬液不与微米粒子共孵育，而是直接从淋巴结单细胞悬液中利用流式细胞术分选得到CD3+CD8+T和CD3+CD4+ T细胞，并与IL-2(2000U/mL)、 IL-7(500U/mL)、IL-15(500U/mL)共孵育10天以扩增分选得到的CD8+T 细胞和CD4+T细胞。
(4)同种异体细胞系统用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。同时在第0 天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，第5天、第7天、第10天和第15 天、第20天分别给小鼠皮下注射100μL含200万个分选扩增后的T细胞(含140 万个CD8+T细胞和60万个CD4+T细胞)，或者皮下注射100μL含200万个癌症特异性T细胞(含140万个CD8+癌症特异性T细胞和60万个CD4+癌症特异性T 细胞)。从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小，肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(5)实验结果
如图22所示，与对照组相比，被微米粒激活的免疫细胞处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，分选得到的癌症特异性T细胞经扩增后使用好于直接分选的T细胞经扩增后使用。由此可见，本发明所述的来自同种异体的癌症特异性T细胞对乳腺癌具有良好的治疗效果。本发明在淋巴结单细胞悬液与粒子系统体外共孵育时，使用淋巴结中所含有的抗原提呈细胞(主要是DC细胞和B细胞)辅助粒子激活癌症特异性T细胞后分选被激活的癌症特异性T细胞，在实际使用时也可以使用任何其他来源的抗原提呈细胞辅助粒子系统激活癌症特异性T细胞，比如细胞系来源的抗原提呈细胞、干细胞来源的抗原提呈细胞、自体来源的抗原提呈细胞。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (37)

1.一种基于癌症特异性T细胞的细胞系统，其特征在于：所述细胞系统包括经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞，其中，癌症疫苗包括递送粒子及其负载的细胞组分，所述递送粒子为纳米粒子或微米粒子，所述细胞组分为来源于癌细胞和/或肿瘤组织的水溶性组分和/或非水溶性组分；
所述细胞组分经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到；
所述的裂解是将癌细胞或肿瘤组织加水或不含溶解剂的水溶液进行裂解，得到的上清液为所述水溶性组分，沉淀中经溶解剂溶解后转为可溶的部分为所述非水溶性组分；或所述的裂解是使用溶解剂裂解癌细胞或肿瘤组织，并溶解裂解后的组分，得到同时含有所述水溶性组分和非水溶性组分的混合物。
2.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述癌症特异性T细胞包括CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
3.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述细胞系统还包括天然免疫细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞系统，其特征在于：所述天然免疫细胞选自γδT细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和自然杀伤T细胞中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述的激活是将癌症疫苗注射至体内激活癌症特异性T细胞，或将树突状细胞经癌症疫苗刺激后注射至体内激活癌症特异性T细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞系统，其特征在于：所述的刺激是将树突状细胞与癌症疫苗在体外共孵育，直至癌症疫苗中负载的细胞组分被树突状细胞进行抗原提呈和激活。
7.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙醇、异丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷和胆碱中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子内部，和/或负载于递送粒子表面。
9.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子表面的方式为吸附、共价连接、电荷相互作用、疏水相互作用、一步或多步的固化、矿化和包裹中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述递送粒子的表面连接有主动靶向树突状细胞的靶头。
11.根据权利要求10所述的细胞系统，其特征在于：所述靶头选自甘露糖、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体和CD44抗体中的至少一种。
12.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述递送粒子上还负载免疫增强佐剂。
13.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述递送粒子上还负载有协助递送粒子或抗原逃离溶酶体的物质。
14.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述递送粒子由有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料制得；
所述有机合成高分子材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚己内酯、泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺、聚三亚甲基碳酸酯、聚酸酐、聚对二氧六环酮、聚对二氧环己酮、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA-PEG、PLA-PEG、PGA-PEG、聚氨基酸、合成多肽和合成脂质中的至少一种；所述天然高分子材料选自卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜、淀粉、糖类和多肽中的至少一种；所述无机材料选自三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙和磷酸钙中的至少一种。
15.根据权利要求1所述的细胞系统，其特征在于：所述癌症疫苗经过表面修饰，所述表面修饰的方式为化学修饰或物理修饰。
16.权利要求1-15任一项所述的基于癌症特异性T细胞的细胞系统在制备预防或治疗癌症产品中的应用。
17.一种同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述同种异体淋巴细胞药物包括经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞，所述癌症特异性T细胞来源于同种异体的个体，其中，癌症疫苗包括递送粒子及其负载的细胞组分，所述递送粒子为纳米粒子或微米粒子，所述细胞组分为来源于癌细胞和/或肿瘤组织的水溶性组分和/或非水溶性组分；
所述细胞组分经癌细胞和/或肿瘤组织裂解得到；
所述的裂解是将癌细胞或肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解，上清液为所述水溶性组分，沉淀中经溶解剂溶解后转为可溶的部分为所述非水溶性组分；或所述的裂解是使用溶解剂裂解癌细胞或肿瘤组织，并溶解裂解后的组分，得到同时含有所述水溶性组分和非水溶性组分的混合物。
18.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述同种异体的个体为一个或多个。
19.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述癌症特异性T细胞包括CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
20.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述同种异体淋巴细胞药物还包括来源于同种异体的天然免疫细胞。
21.根据权利要求20所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述天然免疫细胞选自γδT细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和自然杀伤T细胞中的至少一种。
22.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述的激活为将癌症疫苗注射至同种异体体内激活癌症特异性T细胞，或将树突状细胞经癌症疫苗刺激后注射至同种异体体内激活癌症特异性T细胞。
23.根据权利要求22所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述树突状细胞为自体树突状细胞、同种异体的树突状细胞、细胞系或干细胞来源。
24.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述的刺激是将树突状细胞与癌症疫苗在体外共孵育，直至癌症疫苗中负载的细胞组分被树突状细胞进行抗原提呈和激活。
25.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐、Triton、吐温、二甲基亚砜、乙腈、乙醇、甲醇、N,N-二甲基甲酰胺、丙醇、异丙醇、醋酸、胆固醇、氨基酸、糖苷和胆碱中的至少一种。
26.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述水溶性组分和/或非水溶性组分分别或同时负载于递送粒子内部，或分别或同时负载于递送粒子表面。
27.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述水溶性组分和/或非水溶性组分负载于递送粒子表面的方式为吸附、共价连接、电荷相互作用、疏水相互作用、一步或多步的固化、矿化和包裹中的至少一种。
28.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述递送粒子的表面连接有主动靶向树突状细胞的靶头。
29.根据权利要求28所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述靶头选自甘露糖、甘露聚糖、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体和CD44抗体中的至少一种。
30.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述递送粒子上还负载免疫增强佐剂。
31.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述递送粒子上还负载有协助递送粒子或抗原逃离溶酶体的物质。
32.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：制备所述递送粒子的材料为有机合成高分子材料、天然高分子材料或无机材料；
所述有机合成高分子材料选自聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇、聚己内酯、泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺、聚三亚甲基碳酸酯、聚酸酐、聚对二氧六环酮、聚对二氧环己酮、聚甲基丙烯酸甲酯、PLGA-PEG、PLA-PEG、PGA-PEG、聚氨基酸、合成多肽和合成脂质中的至少一种；所述天然高分子材料选自卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜、淀粉、糖类和多肽中的至少一种；所述无机材料选自三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸钙和磷酸钙中的至少一种。
33.根据权利要求17所述的同种异体淋巴细胞药物，其特征在于：所述癌症疫苗经过表面修饰，所述表面修饰的方式为化学修饰或物理修饰。
34.权利要求17-33任一项所述的同种异体淋巴细胞药物在制备预防或治疗癌症产品中的应用。
35.根据权利要求34所述的应用，其特征在于：所述的应用为将同种异体供体体内分离得到的淋巴细胞药物输至同种异体受体体内。
36.根据权利要求35所述的应用，其特征在于：将淋巴细胞药物输至同种异体受体体内前，还包括对所述淋巴细胞药物进行体外扩增的步骤。
37.一种抗肿瘤制品，其特征在于，所述抗肿瘤制品包括以下任意一种：(1)含有经癌症疫苗激活的来源于同种异体的癌症特异性T细胞的制剂；(2)含有经癌症疫苗激活的来源于同种异体的癌症特异性T细胞的制剂，以及含有来源于同种异体的天然免疫细胞的制剂；(3)含有经癌症疫苗激活的癌症特异性T细胞和天然免疫细胞混合物的制剂，所述癌症特异性T细胞和天然免疫细胞均来源于同种异体的个体。
CN202210411832.7A 2022-04-19 2022-04-19 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用 Pending CN114984199A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210411832.7A CN114984199A (zh) 2022-04-19 2022-04-19 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用
PCT/CN2022/092331 WO2023201787A1 (zh) 2022-04-19 2022-05-12 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210411832.7A CN114984199A (zh) 2022-04-19 2022-04-19 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114984199A true CN114984199A (zh) 2022-09-02

Family

ID=83023617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210411832.7A Pending CN114984199A (zh) 2022-04-19 2022-04-19 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114984199A (zh)
WO (1) WO2023201787A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118272306A (zh) * 2024-06-03 2024-07-02 吉林省藏舍生物科技有限公司 一种提高car-t细胞功能的组合物及其制备方法和应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207147B1 (en) * 1996-10-11 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using tumor cells combined with mixed lymphocytes
US20080166369A1 (en) * 2004-12-28 2008-07-10 Immuno Frontier, Inc. Cancer Vaccine Preparation
CN112114129A (zh) * 2020-09-25 2020-12-22 苏州大学 肿瘤特异性t细胞的检测方法
CN112245574A (zh) * 2020-10-23 2021-01-22 苏州大学 一种负载全细胞组分的靶向输送系统及其应用
CN114099655A (zh) * 2021-11-16 2022-03-01 苏州大学 一种预防或治疗癌症的疫苗系统及其应用
CN114225021A (zh) * 2022-01-28 2022-03-25 苏州尔生生物医药有限公司 基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统
CN114288398A (zh) * 2021-09-18 2022-04-08 苏州大学 基于全细胞组分的癌症疫苗系统在制备交叉预防或治疗异种癌症药物中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2301356A3 (en) * 2002-12-04 2012-05-30 Baylor Research Institute Rapid one-step method for generation of antigen loaded dendritic cell vaccine from precursors
AU2020203845C1 (en) * 2012-09-06 2022-08-11 Orbis Health Solutions, Llc Tumor lysate loaded particles
US20190343954A1 (en) * 2016-12-07 2019-11-14 Transtarget, Inc. Methods and compositions for vaccinating and boosting cancer patients
US11925693B2 (en) * 2017-07-27 2024-03-12 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Polymeric nanoparticles for enhanced cancer immunotherapy
CN114404580A (zh) * 2021-12-24 2022-04-29 苏州大学 一种树突状细胞癌症疫苗及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207147B1 (en) * 1996-10-11 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Cancer immunotherapy using tumor cells combined with mixed lymphocytes
US20080166369A1 (en) * 2004-12-28 2008-07-10 Immuno Frontier, Inc. Cancer Vaccine Preparation
CN112114129A (zh) * 2020-09-25 2020-12-22 苏州大学 肿瘤特异性t细胞的检测方法
CN112245574A (zh) * 2020-10-23 2021-01-22 苏州大学 一种负载全细胞组分的靶向输送系统及其应用
CN114288398A (zh) * 2021-09-18 2022-04-08 苏州大学 基于全细胞组分的癌症疫苗系统在制备交叉预防或治疗异种癌症药物中的应用
CN114099655A (zh) * 2021-11-16 2022-03-01 苏州大学 一种预防或治疗癌症的疫苗系统及其应用
CN114225021A (zh) * 2022-01-28 2022-03-25 苏州尔生生物医药有限公司 基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023201787A1 (zh) 2023-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2023115676A1 (zh) 一种树突状细胞癌症疫苗及其应用
WO2021189678A1 (zh) 一种全细胞组分的输送系统及其应用
WO2023087441A1 (zh) 一种预防或治疗癌症的疫苗系统及其应用
JP2023547789A (ja) 全細胞画分が担持された標的送達システム及びその使用
CN114288397B (zh) 基于多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分的预防或治疗癌症的疫苗系统及其制备与应用
CN114225021A (zh) 基于一种或多种癌细胞和/或肿瘤组织全细胞组分或其混合物的预防或治疗癌症的疫苗系统
EP1159967B1 (en) Tumor vaccines
WO2023227085A1 (zh) 用于预防或治疗癌症的特异性t细胞及其制备方法
CN114288398B (zh) 基于全细胞组分的癌症疫苗系统在制备交叉预防或治疗异种癌症药物中的应用
CN114984199A (zh) 一种基于癌症特异性t细胞的细胞系统、淋巴细胞药物及其应用
WO2023236330A1 (zh) 一种基于抗原提呈细胞膜组分的癌症疫苗及其制备方法和应用
WO2023236331A1 (zh) 一种来源于预激活抗原提呈细胞的自身免疫疾病疫苗的制备方法及其应用
WO2024000724A1 (zh) 负载癌细胞全细胞组分和混合膜组分的疫苗的制备方法及其应用
CN113925960B (zh) 一种预防或治疗i型糖尿病的疫苗系统及其制备方法
CN114887049A (zh) 一种免疫佐剂组合物和基于该组合物的癌症疫苗及其应用
WO2023206684A1 (zh) 一种细胞系统及其应用、以及激活广谱癌细胞特异性t细胞的方法
CN114028550A (zh) 一种基于一种或多种细菌全细胞组分的预防或治疗疾病的疫苗系统及其制备方法与应用
CN115554315A (zh) 一种癌细胞特异性t细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性t细胞的方法
WO2024016688A1 (zh) 基于激活的抗原提呈细胞的核酸递送粒子、核酸递送系统及制备方法
CN115561145A (zh) 一种癌细胞特异性t细胞的检测方法及试剂盒
WO2024212380A1 (zh) 一种基于癌细胞或肿瘤组织中一部分组分的癌症疫苗及制备方法
CN117653720A (zh) 一种抗原组分的提取方法及包含其的递送粒子和应用
CN117618602A (zh) 一种负载癌细胞裂解物组分的癌症粒子疫苗的终端灭菌方法及其应用
CN117122678A (zh) 一种制备抗原递送粒子的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination