CN115554315A - 一种癌细胞特异性t细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性t细胞的方法 - Google Patents

一种癌细胞特异性t细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性t细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种癌细胞特异性T细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性T细胞的方法，将外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞与被激活的抗原提呈细胞制备的粒子共孵育以激活癌细胞特异性T细胞。本发明克服了临床上目前无法有效筛选肿瘤浸润淋巴细胞中广谱和多克隆的癌细胞特异性T细胞的难题，能够从外周血、外周免疫器官或者肿瘤浸润淋巴细胞中分离广谱的具有特异性肿瘤杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞，且具有易分离获取和特异性高的特点，可用于癌症的预防和治疗。

Description

一种癌细胞特异性T细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性T细胞 的方法
技术领域
本发明涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种癌细胞特异性T细胞疫苗、以及激活癌细胞特异性T细胞的方法。
背景技术
T细胞尤其是癌细胞特异性T细胞发挥着抗癌主力军的作用。T细胞是机体特异性识别和杀灭癌细胞的主要细胞，每一种癌细胞特异性T细胞的克隆可以特异性识别一种抗原表位。癌症患者体内尤其是经过免疫治疗或者放疗的患者体内都含有一定数量的癌细胞特异性T细胞。但肿瘤患者体内癌细胞特异性T细胞普遍数量不足，因此限制了癌细胞特异性T细胞杀伤癌细胞的能力，如果能够将体内的癌细胞特异性T细胞分离出来之后扩增重新回输给患者，那么就能调控免疫微环境，较好的控制癌症进展。
但是，如何从上百万种甚至上千万种不同克隆的T细胞中分选出广谱的癌细胞特异性T细胞中的具有癌细胞识别和杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞就显得非常关键。目前没有特别高效的手段从众多T细胞中较全面的分离出该部分具有特异性肿瘤杀伤功能的效应性癌细胞特异性T细胞，因此提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种使用被负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(NP)或微米粒子(MP)激活过的抗原提呈细胞制备的纳米粒子和/或微米粒子辅助分离和扩增杀伤性(效应性)癌细胞特异性T细胞(Teff)的方法，该方法使用被激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子或微米粒子先激活广谱多克隆的癌细胞特异性T细胞，然后将利用被激活的杀伤性癌细胞特异性T细胞(Teff)特异性表达的标志物分离提取上述癌细胞特异性T细胞，回输给患者预防或者治疗癌症，有效地解决了如何从外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞中特异性分离提取具有识别和杀伤癌细胞能力的广谱和多克隆的癌细胞特异性T细胞的问题。而且，由于辅助分离和扩增癌细胞特异性T细胞的纳米粒子或微米粒子负载抗原提呈细胞膜组分，所以在使用本发明所述纳米粒子或微米粒子与T细胞共孵育时体系中可以没有抗原提呈细胞的辅助。
本发明的第一个目的是提供一种由粒子激活的抗原提呈细胞制备的癌症T细胞疫苗的制备方法，包括以下步骤：
S1、将抗原提呈细胞与第一粒子共孵育，得到激活后的抗原提呈细胞；其中，第一粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S2、将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分制备成纳米囊泡；或将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分与第二粒子共作用，使细胞膜组分负载于第二粒子上，得到负载细胞膜组分的粒子；其中，第二粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S3、将S2的纳米囊泡和/或负载细胞膜组分的粒子与含有T细胞的免疫细胞共孵育，将其中可以识别癌细胞抗原的癌细胞特异性T细胞激活，再使用特定手段分选出该部分被激活的癌细胞特异性T细胞，即可得到癌症T细胞疫苗。
进一步地，在步骤S3中，分选出被激活的癌细胞特异性T细胞之后，还包括对癌细胞特异性T细胞进行扩增的步骤。
进一步地，上述分选为利用被癌细胞全细胞组分激活的癌细胞特异性T细胞的特异性表面标志物进行筛选。特异性表面标志物包括但不限于CD69、PD-1、TIM-3、LAG-3、CD25、OX40(CD134)、TCF-1、CD137、CD44、CD39、CD103、CD56、CD279、CD278、CD244、CD27、CD154、CD28等。利用表面标志物分离癌细胞特异性T细胞的技术包括但不限于流式细胞术和磁珠分选法。
进一步地，含有T细胞的免疫细胞可来源于外周血、外周免疫器官或肿瘤浸润淋巴细胞。当其与S2的产物共孵育之前，可对以上免疫细胞进行分选，分选出其中的T细胞，具体地，使用流式细胞术或者磁珠分选法从外周血、外周免疫组织、肿瘤浸润淋巴细胞中分选CD3+的细胞、分选出CD45+CD3+的细胞、分选出CD3+CD8+的细胞、分选出CD45+CD3+CD8+的细胞、分选出CD3+CD4+的细胞或分选出CD45+CD3+CD4+的细胞。
进一步地，上述扩增为体外扩增，即将癌细胞特异性T细胞与细胞因子和/或抗体进行共孵育。
进一步地，步骤S1的抗原提呈细胞与第一粒子的共孵育体系中、步骤S3的纳米囊泡和负载细胞膜组分的粒子与免疫细胞共孵育体系中，均可含有细胞因子和/或抗体。
优选地，孵育体系中含有IL-2和IL-7。
进一步地，细胞因子包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素7(IL-7)、白介素14(IL-14)、白介素4(IL-4)、白介素15(IL-15)、白介素21(IL-21)、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素17(IL-17)、IL-12、白介素12(IL-12)、白介素6(IL-6)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素33(IL-33)、γ干扰素(IFN-γ)、TNF-α。
进一步地，抗体包括但不限于αCD-3抗体、αCD-4抗体、αCD-8抗体、αCD-28抗体、αCD-40抗体、αOX-40抗体、αOX-40L抗体。
进一步地，在步骤S3中，共孵育体系中还可含有未经激活的抗原提呈细胞。
进一步地，在上述制备方法中，第一粒子或第二粒子上还可负载细菌裂解组分和/或细菌外囊泡裂解组分，该抗细菌裂解组分和/或细菌外囊泡裂解组分经含有裂解剂的裂解液裂解细菌或细菌外囊泡得到，裂解剂为尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、氨基酸、糖苷、胆碱等的水溶液，细菌包括但不限于卡介苗、大肠杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、乳双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、格式乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等。
进一步地，第一粒子或第二粒子上还负载有免疫增强佐剂，免疫增强佐剂包括但不限于模式识别受体激动剂、卡介苗、卡介苗细胞壁骨架、卡介苗甲醇提取残余物、卡介苗胞壁酰二肽、草分枝杆菌、多抗甲素、矿物油、病毒样颗粒、免疫增强的再造流感病毒小体、霍乱肠毒素、皂苷及其衍生物、Resiquimod、胸腺素、新生牛肝活性肽、米喹莫特、多糖、姜黄素、免疫佐剂CpG、免疫佐剂poly(I:C)、免疫佐剂poly ICLC、短小棒状杆菌苗、溶血性链球菌制剂、辅酶Q10、左旋咪唑、聚胞苷酸、锰佐剂、铝佐剂、钙佐剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、聚肌苷酸、聚腺苷酸、明矾、磷酸铝、羊毛脂、角鲨烯、植物油、内毒素、脂质体佐剂、MF59、双链RNA、双链DNA、CAF01、人参、黄芪的有效成分等。
优选地，免疫增强佐剂两种或两种以上Toll样受体激动剂，如包括(1)Poly(I:C)或Poly(ICLC)；(2)CpG-ODN，其中，CpG-ODN为A类CpG-ODN、B类CpG-ODN和C类CpG-ODN中的至少两种，且至少其中一种为B类CpG-ODN或C类CpG-ODN。其中，A类CpG-ODN选自CpG-ODN2216、CpG-ODN 1585或CpG-ODN 2336，B类CpG-ODN选自CpG-ODN 1018、CpG-ODN 2006、CpG-ODN 1826、CpG-ODN 1668、CpG-ODN 2007、CpG-ODN BW006或CpG-ODN SL01，C类CpG-ODN选自CpG-ODN 2395、CpG-ODN SL03或CpG-ODN M362。
进一步地，第一粒子或第二粒子上还负载有带正电荷的多肽(如KALA多肽、RALA多肽、蜂毒肽等)、精氨酸、聚精氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、组氨酸、聚组氨酸、NH4HCO3、鱼精蛋白或组蛋白等。
进一步地，第一粒子或第二粒子上还负载有主动靶向抗原提呈细胞的靶头，靶头可为甘露糖、甘露聚糖、CD19抗体、CD20抗体、BCMA抗体、CD32抗体、CD11c抗体、CD103抗体、CD44抗体等。
进一步地，第一粒子或第二粒子可由以下材料制备得到：有机合成高分子材料包括但不限于PLGA、PLA、PGA、PEG、PCL、Poloxamer、PVA、PVP、PEI、PTMC、聚酸酐、PDON、PPDO、PMMA、聚氨基酸、合成多肽等；天然高分子材料包括但不限于卵磷脂、胆固醇、海藻酸盐、白蛋白、胶原蛋白、明胶、细胞膜成分、淀粉、糖类、多肽等；无机材料包括但不限于三氧化二铁、四氧化三铁、碳酸盐、磷酸盐等。
进一步地，第一粒子或第二粒子的粒径大小为纳米级或微米级，这样能保证粒子被抗原提呈细胞吞噬，而为了提高吞噬效率，粒径大小要在适宜的范围内。纳米粒子的粒径大小为1nm-1000nm，更优选地，粒径大小为30nm-1000nm，最优选地，粒径大小为50nm-600nm；微米粒子的粒径大小为1μm-1000μm，更优选地，粒径大小为1μm-100μm，更优选地，粒径大小为1μm-10μm，最优选地，粒径大小为1μm-5μm。
进一步地，在步骤S2中，将被激活的抗原提呈细胞经过机械破坏、膜过滤或梯度离心制备得到纳米囊泡，或将被激活的抗原提呈细胞经过机械破坏、膜过滤或梯度离心，将产物与第二粒子共作用，得到包裹细胞膜组分的粒子。
进一步地，机械破坏方式选自超声、均质化、匀浆、高速搅拌、高压破坏、高剪切力破坏、溶胀、化学物质、皱缩中的一种或多种。共作用方式选自共孵育、共挤出、超声、搅拌、透析、超滤、均质化和匀浆中的一种或多种，与纳米粒子或微米粒子共作用后抗原提呈细胞组分覆盖于原有纳米粒子或微米粒子表层形成新的纳米粒子或微米粒子。
进一步地，肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分由以下步骤制备得到：将癌细胞和/或肿瘤组织在-20℃～-273℃下冷冻，加水或不含溶解剂的溶液后进行反复冻融裂解，得到的上清液为水溶性组分，沉淀中经含有溶解剂的溶液溶解后转为可溶的部分为非水溶性组分，水溶性组分和非水溶性组分合并后得到肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；或将癌细胞和/或肿瘤组织经含有溶解剂的溶解液裂解并溶解后得到可溶组分，该可溶组分为肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分。溶解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐(如SDS)、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、无机盐(0.1-2000mg/mL)、Triton、吐温、氨基酸、糖苷、胆碱中的至少一种。
进一步地，抗原提呈细胞包括B细胞、树突状细胞(DC)和巨噬细胞中的至少一种，优选为两种及以上，更优选为三种细胞的组合。
进一步地，得到的癌细胞特异性T细胞包括CD4+T细胞和/或CD8+T细胞，优选为同时包括CD4+T细胞和CD8+T细胞。
本发明中，使用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子先特异性激活抗原提呈细胞，在将抗原提呈细胞制备成纳米粒子或微米粒子，所制备成的纳米粒子或微米粒子就负载癌细胞全细胞抗原表位，然后使用由抗原提呈细胞制备而成的纳米粒子或微米粒子激活外周血、外周免疫组织或者肿瘤浸润淋巴细胞中预存的已在淋巴结中被激活过的癌细胞特异性T细胞，再利用被激活的癌细胞特异性T细胞分泌特定细胞因子或者高表达某些表面分子的特性，利用流式细胞术等手段分离得到癌细胞特异性T细胞，经体外扩增后回输给患者使用，能够分离和扩增到最多样和广谱的具有识别和杀伤癌细胞功能的癌细胞特异性T细胞。
本发明的第二个目的是提供上述癌症T细胞疫苗在制备治疗或预防癌症的药物中的应用。
进一步地，外周血、外周免疫组织或肿瘤浸润淋巴细胞中的T细胞来源于自体或同种异体。
进一步地，抗原提呈细胞可以与癌细胞特异性T细胞来源于同体、同种异体，细胞系或由干细胞转化而来。
进一步地，第一粒子或第二粒子中，用于制备抗原的癌细胞或肿瘤组织中至少有一种与上述药物治疗的目标疾病类型相同。本发明制备的疫苗具有特异性。
本发明的第三个目的是提供一种体外激活癌细胞特异性T细胞的方法，该方法包括以下步骤：
S1、将抗原提呈细胞与第一粒子共孵育，得到激活后的抗原提呈细胞；其中，第一粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S2、将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分制备成纳米囊泡；或将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分与第二粒子共作用，使细胞膜组分负载于第二粒子上，得到负载细胞膜组分的粒子；其中，第二粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S3、将S2的纳米囊泡和/或负载细胞膜组分的粒子与含有T细胞的细胞共孵育，其中的可以识别癌细胞抗原的癌细胞特异性T细胞被激活，使用特定方法分选出被激活的癌细胞特异性T细胞后经体外扩增即得。
本发明突破现有激活方式的限制，使粒子上负载全部抗原和经激活的抗原提呈细胞细胞膜，能够辅助分离更广谱和多样的癌细胞特异性T细胞，且高度特异，在免疫治疗中效果更佳，从而为细胞治疗提供更有力的备选药物。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种使用纳米级或微米级粒子递送系统体外辅助激活后分离免疫细胞中癌细胞特异性T细胞的技术，所分离得到的癌细胞特异性T细胞广谱而且高度特异，包含所有克隆的可以特异性识别和杀伤癌细胞效应性(杀伤性)癌细胞特异性T细胞(Teff)，将癌细胞特异性T细胞扩增后，所得细胞可以用于预防和治疗癌症。并在此基础上对抗原提呈细胞激活过程、与T细胞孵育过程、第一粒子和第二粒子负载物质进行优化，得到一种治疗和预防效果极佳的癌症疫苗。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为本发明细胞系统的制备过程及应用示意图；其中，a为水溶性抗原和非水溶性抗原分别收集和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；b为采用含有溶解剂的溶解液溶解癌细胞全细胞抗原和制备纳米粒子或微米粒子的示意图；c为使用a或b中制备的纳米粒子和/或微米粒子激活抗原提呈细胞，并将被激活的抗原提呈细胞制备的粒子激活癌细胞特异性T细胞后，利用T细胞被激活后的特征分离提取癌细胞特异性T细胞，尔后扩增该类T细胞，并用该类细胞预防或治疗癌症的示意图；
图2-14分别为实施例1-13中用分离扩增的癌细胞特异性T细胞预防或治疗癌症时小鼠肿瘤生长速度和生存期实验结果；图2-14中，a为预防或治疗癌症时的肿瘤生长速度实验结果(n≥8)；b为预防或治疗癌症时的小鼠生存期实验结果(n≥8)，每个数据点为平均值±标准误差(mean±SEM)；图3、4和13中，c和d为使用流式细胞术分析被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞占相应T细胞比例的结果；a图中肿瘤生长抑制实验的显著性差异采用ANOVA法分析，b图中显著性差异采用Kaplan-Meier和log-rank test分析；***表示与PBS空白对照组相比p＜0.005，有显著性差异；**表示与PBS空白对照组相比p＜0.01，有显著性差异；*表示与PBS空白对照组相比p＜0.05，有显著性差异；εε代表与使用特定细胞因子组分加入纳米粒/微米粒激活抗原提呈细胞共孵育体系，所制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的癌细胞特异性T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；###表示单独孵育而无任何纳米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；
Figure BDA0003731405250000061
表示与纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的空心纳米粒子(内部不负载癌细胞全细胞组分)辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；&&&表示与空白纳米粒/微米粒+游离裂解液激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子和/或微米粒子辅助分离的T细胞对照组相比p＜0.005，有显著性差异；δδδ代表与多肽纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；ω代表与纳米粒/微米粒激活的DC细胞或者B细胞制备的纳米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；χ代表与负载癌细胞全细胞组分和吐温80裂解和溶解的细菌组分的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；θ代表与使用两种A类CpG和Poly ICLC/Poly(I:C)作为混合佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ττ代表与使用A类CpG和B类CpG作为混合佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；μμ代表与只使用Poly(I:C)作为佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；ΟΟΟ代表与使用内部负载癌细胞全细胞组分但是表面不负载任何抗原提呈细胞膜组分的纳米粒/微米粒激活的辅助分离的T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；φ代表与纳米粒/微米粒激活的DC制备的纳米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；
Figure BDA0003731405250000062
代表与负载抗原不负载佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；
Figure BDA0003731405250000063
代表与负载抗原不负载佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；Δ代表将负载癌细胞全细胞组分的纳米粒/微米粒、DC细胞及T细胞共孵育后辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ρ代表纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离T细胞时不加入细胞因子的组相比p＜0.05，有显著性差异；η代表纳米粒/微米粒激活抗原提呈细胞时不加入细胞因子所制备的基于抗原提呈细胞的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；β代表与不负载溶酶体逃逸物质的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；ξ代表与只负载一种CpG+Poly(I:C)混合佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异；υυυ代表与表面负载膜细胞组分但是内部不负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子或微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.005，有显著性差异；ΣΣ代表与内部不负载佐剂但负载癌细胞全细胞组分，表面负载使用不负载佐剂的纳米粒子激活的抗原提呈细胞的膜组分的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；λλ代表与只负载两类CpG作为佐剂的纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的T细胞组相比p＜0.01，有显著性差异；π代表与只使用被纳米粒/微米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子/微米粒子辅助分离的癌细胞特异性CD8+T细胞组相比p＜0.05，有显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明所述的用于预防或治疗癌症的T细胞系统，其包含来自于外周血、外周免疫组织或者肿瘤浸润淋巴细胞中的经过特异性分离和扩增的癌细胞特异性T细胞，该类癌细胞特异性T细胞在分离时先被激活过的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子和/或微米粒子激活，然后利用被激活后高表达的特异性分子被分离。分离后扩增的癌细胞特异性T细胞可以来自同种同体或者同种异体。其中，用于制备纳米粒子或微米粒子的抗原提呈细胞先被负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞抗原或其混合物的纳米粒子和/或微米粒子激活。制备预防或治疗癌症的T细胞系统，其制备过程及应用领域如图1所示。
在制备激活抗原提呈细胞的纳米粒子或微米粒子时，可裂解细胞或组织后先分别收集水溶性抗原和水不溶性抗原并分别制备纳米或微米粒子系统；或者也可以直接采用含有溶解剂的溶解液直接裂解细胞或组织并溶解癌细胞全细胞抗原并制备纳米或微米粒子系统。本发明所述癌细胞全细胞抗原在裂解前或(和)裂解后既可经过包括但不限于灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理等处理后再制备纳米粒子或微米粒子；也可细胞裂解前或(和)裂解后不经过任何灭活或(和)变性、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、蛋白酶内切或降解、核酸酶处理直接制备纳米粒子或微米粒子。本发明部分实施例中，肿瘤组织细胞在裂解前经过了灭活或(和)变性处理，在实际使用过程中也可以在细胞裂解后做灭活或(和)变性处理，或者也可以细胞裂解前和裂解后均做灭活或(和)变性处理；本发明部分实施例中细胞裂解前或(和)裂解后的灭活或(和)变性处理方法为紫外照射和高温加热，在实际使用过程中也可以采用包括但不限于放射线辐照、高压、固化、生物矿化、离子化、化学修饰、核酸酶处理、蛋白酶内切或降解、胶原酶处理、冷冻干燥等处理方法。本领域技术人员可以理解，在实际应用过程中技术人员可根据具体情况进行适当调整。
在将被激活的抗原提呈细胞制备成纳米粒子或微米粒子时，先对抗原提呈细胞进行机械破坏，然后使用离心和/或一定孔径的滤膜过滤，可选地，与纳米粒子或微米粒子共同作用。
被激活的抗原提呈细胞在经过机械破坏后含有一定的细胞膜结构。
被激活的抗原提呈细胞在经过机械破坏后，与纳米粒子或微米粒子共作用后所形成的新的纳米粒子或微米粒子中抗原提呈细胞的组分位于粒子外层。
在使用抗原提呈细胞制备的纳米粒子和/或微米粒子体外激活癌细胞特异性T细胞时，体系中也可以同时加入抗原提呈细胞的辅助。制备成纳米粒子或微米粒子的抗原提呈细胞以及用来加入与T细胞共孵育的抗原提呈细胞可以来源于自体或者同种异体，也可以来自于细胞系或者干细胞。抗原提呈细胞可以是DC细胞、B细胞、巨噬细胞或者上述三者的任意混合物，也可以是其他具有抗原提呈功能的细胞。
在使用负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分激活抗原提呈细胞时，体系中可含有细胞因子和/或抗体以提高激活效率。
在使用被激活的抗原提呈细胞制备成的纳米粒子和/或微米粒子激活癌细胞特异性T细胞时，体系中可含有细胞因子和/或抗体以提高激活效率。
在一些实施方案中，采用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子先激活抗原提呈细胞，再将抗原提呈细胞制备成纳米粒子或微米粒子，使用抗原提呈细胞制备的纳米粒子或微米粒子辅助分离扩增来自外周血、外周免疫组织或肿瘤浸润淋巴细胞的癌细胞特异性T细胞的具体制备方法如下：
步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含有第二预定浓度制备粒子原材料的有机相中。
在一些实施例中，水相溶液可含有癌细胞/肿瘤组织裂解物中的各组分以及免疫增强佐剂；裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原或是溶于含有尿素或盐酸胍等溶解剂的溶解液中的原非水溶性抗原。水相溶液所含有的水溶性抗原的浓度或原非水溶性抗原的浓度，也即第一预定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/mL，能负载足够癌细胞全细胞抗原以激活相关细胞。免疫增强佐剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng/mL。
在一些实施例中，有机溶剂选用二氯甲烷。另外，在一些实施例中，制备粒子原材料的第二预定浓度的范围为0.5mg/mL-5000mg/mL，优选为100mg/mL。
实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预定体积的比例进行设定，在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1-1:5000，优选地为1:10。在具体实施过程中可根据需要对第一预定体积、第二预定体积和第一预定体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或微米粒的尺寸大小。
优选地，水相溶液为裂解物组分溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL；水相溶液为裂解物组分/免疫佐剂溶液时，其中蛋白质和多肽的浓度大于1ng/mL，优选1mg/mL～100mg/mL，免疫佐剂的浓度大于0.01ng/mL，优选0.01mg/mL～20mg/mL。有机相溶液中，溶剂为DMSO、乙腈、乙醇、氯仿、甲醇、DMF、异丙醇、二氯甲烷、丙醇、乙酸乙酯等，优选二氯甲烷；有机相的浓度为0.5mg/mL～5000mg/mL，优选为100mg/mL。
步骤2，将步骤1得到的混合液进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或均质处理或微流控处理。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.1小时～24小时；超声处理时，超声功率大于5W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于5psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的微纳粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
步骤3，将步骤2处理后得到的混合物加入第三预定体积的含有第三预定浓度乳化剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处理。该步骤将步骤2得到的混合物加入到乳化剂水溶液中继续超声或搅拌纳米化或微米化。在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm～500rpm，搅拌时间大于1分钟，比如60～6000秒。优选地，搅拌为机械搅拌或者磁力搅拌时，搅拌速度大于50rpm，搅拌时间大于1分钟，比如搅拌速度为50rpm～1500rpm，搅拌时间为0.5小时～5小时；超声处理时，超声功率为50W～500W，时间大于0.1秒，比如2～200秒；均质处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min-100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的纳米或微米粒子大小，过大或过小都会带来粒径大小的变化。
在一些实施例中，乳化剂水溶液为聚乙烯醇(PVA)水溶液，第三预定体积为5mL，第三预定浓度为20mg/mL。第三预定体积根据其与第二预定体积的比例进行调整。在本发明中，第二预定体积与第三预定体积之的范围为1:1.1-1:1000进行设定，优选地可以为2:5。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸，可以对第二预定体积和第三预定体积之比进行调整。同样地，本步骤的超声时间或搅拌时间、乳化剂水溶液的体积以及浓度的取值根据，均为了得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒。
步骤4，将步骤3处理后得到的液体加入第四预定体积的第四预定浓度的乳化剂水溶液中，并进行搅拌直至满足预定搅拌条件。
本步骤中，乳化剂水溶液为PVA溶液或其他溶液。
第四预定浓度为5mg/mL，第四预定浓度的选择，以得到尺寸大小合适的纳米粒或微米粒为依据。第四预定体积的选择依据第三预定体积与第四预定体积之比决定。在本发明中，第三预定体积与第三预定体积之比为范围为1:1.5-1:2000，优选地为1:10。在具体实施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比进行调整。
在本发明中，本步骤的预定搅拌条件为直至有机溶剂挥发完成，也即步骤1中的二氯甲烷挥发完成。
步骤5，将步骤4处理满足预定搅拌条件的混合液在以大于100RPM的转速进行大于1分钟的离心后，去除上清液，并将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有冻干保护剂的水溶液中或者第六预定体积的PBS(或生理盐水)中。
步骤6，将步骤5得到的含有冻干保护剂的混悬液进行冷冻干燥处理后，将冻干物质备用。
步骤7，将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有纳米粒或微米粒和冻干保护剂的冻干物质直接使用；或者上述样品与第七预定体积的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原混合后使用。
在本发明中，第六预定体积与第七预定体积的体积比为1:10000到10000:1，优先体积比为1:100到100:1，最优体积比为1:30到30:1。
步骤8，将抗原提呈细胞与上述制备的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一定时间。制备纳米粒子和/微米粒子的肿瘤组织和/或癌细胞与抗原提呈细胞可以来自于自体或者同种异体。
步骤9，收集共孵育后的细胞，进行超声、均质化、机械搅拌等机械破坏。
步骤10，将超声完的样品进行离心和/或使用一定孔径的滤膜过滤和/或与负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子和/或微米粒子共同作用，制备得到基于抗原提呈细胞的纳米粒子或微米粒子。
步骤11，取得外周血、外周免疫组织或者肿瘤组织，收集上述组织中T细胞或含有T细胞的免疫细胞。以上外周血、外周免疫组织或者肿瘤组织可以来自于自体或者同种异体。
步骤12，将步骤10制备的纳米和/或微米粒子与步骤11得到的含有T细胞的免疫细胞混合后共孵育一定时间。
步骤13，采用流式细胞术、磁珠分选法等分离被抗原激活的T细胞。
步骤14，将分离得到的被癌细胞全细胞抗原激活的T细胞进行体外扩增。
步骤15，将扩增后的癌细胞特异性T细胞，回输到患者体内预防或治疗癌症。
实施例1癌细胞特异性T细胞分离扩增后用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后用于预防黑色素瘤。本实施例中，裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原，然后，以有机高分子材料PLGA为纳米粒骨架材料，以Polyinosinic-polycytidylic acid(poly(I:C))为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子激活抗原提呈细胞，并将抗原提呈细胞机械破坏后离心制备纳米粒子，使用该纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，并经扩增后注射到体内预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量超纯水并反复冻融5次，并伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)负载全细胞组分的纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1采用溶剂挥发法中的复乳法制备。在制备时负载癌细胞全细胞抗原中水溶性抗原的纳米粒子和负载癌细胞全细胞抗原中非水溶性抗原的纳米粒子分别制备，然后使用时一起使用。所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为24KDa-38KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)且poly(I:C)只分布于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载细胞组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为280nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)免疫佐剂为0.02mg。
(3)骨髓来源的树突状细胞(BMDC)的制备
本实施例以从小鼠骨髓细胞制备树突状细胞为例来说明如何制备BMDC。首先，取1只6-8周龄C57小鼠颈椎脱臼处死，手术取出后腿的胫骨和股骨放入PBS中，用剪刀和镊子将骨周围的肌肉组织剔除干净。用剪刀剪去骨头两端，再用注射器抽取PBS溶液，针头分别从骨头两端插入骨髓腔，反复冲洗骨髓到培养皿中。收集骨髓溶液，400g离心3min后加入1mL红细胞裂解液裂红。加入3mL RPMI 1640(10％FBS)培养基终止裂解，400g离心3min，弃上清。将细胞放置10mm培养皿中培养，使用RPMI 1640(10％FBS)培养基，同时加入重组小鼠GM-CSF(20ng/mL)，37度，5％CO2培养7天。第3天轻轻摇晃培养瓶，补充同样体积含有GM-CSF(20ng/mL)RPMI 1640(10％FBS)培养基。第6天，对培养基进行半量换液处理。第7天，收集少量悬浮及半贴壁细胞，通过流式检测，当CD86+CD80+细胞在CD11c+细胞中的比例为15-20％之间，诱导培养的BMDC即可被用来做下一步实验。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载来源于肿瘤组织的癌细胞全细胞组分的纳米粒子(250μg负载水溶性组分的纳米粒子+250μg负载非水溶性组分的纳米粒子)与BMDC(1000万个)在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有细胞因子组合1：粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(500U/mL)或者含有细胞因子组分2：GM-CSF(500U/mL)、IL-4(500U/mL)、肿瘤坏死因子α(TNF-α，500U/mL)、IL10(500U/mL)。
(5)DC来源的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分1的孵育后的DC(1000万个)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液，将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液，然后在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子2，纳米粒子2粒径为120纳米。
或者收集步骤(3)制备的未经任何纳米粒子或微米粒子激活的DC(1000万个)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液，将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液，将上清液与40mg步骤(2)制备的负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子1(负载水溶性组分的纳米粒子20mg+负载非水溶性组分的纳米粒子20mg)共孵育10分钟，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子3，粒径为300nm。
或者通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分2的孵育后的DC(1000万个)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液，将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液，将上清液与40mg步骤(2)制备的负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子1(负载水溶性组分的纳米粒子20mg+负载非水溶性组分的纳米粒子20mg)共孵育10分钟，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子。其中，使用纳米粒子1与膜组分共孵育得到的为纳米粒子4，粒径为300nm。
或者通过在400g离心5分钟收集添加细胞因子组分1的孵育后的DC(1000万个)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在在4℃和7.5W下超声20分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品在2000g离心20分钟并收集上清液，将上清液在7000g离心20分钟后收集上清液，将上清液与40mg步骤(2)制备的负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子1(负载水溶性组分的纳米粒子20mg+负载非水溶性组分的纳米粒子20mg)共孵育10分钟，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液在15000g离心120分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子5，粒径为300nm。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种0.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织和脾细胞。将小鼠肿瘤组织切成小块后使用胶原酶消化15分钟，然后通过细胞筛网制备单细胞悬液，离心并用PBS洗涤后使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。将纳米粒子2(100μg)或者纳米粒子3(100μg)或者纳米粒子4(100μg)或者纳米粒子5(100μg)与来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(50万个)在3mL RPMI 1649完全培养基中共孵育96小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术分选孵育后的细胞中的CD3+CD8+CD69+T细胞，即为癌细胞特异性CD8+T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、IL-7(2000U/mL)、IL-12(200U/mL)、IL-15(200U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)共孵育10天(每两天换液一次)以扩增分选得到癌细胞特异性T细胞，即为T细胞疫苗。其中，由纳米粒子2辅助分选和扩增得到的癌细胞特异性T细胞疫苗为T细胞疫苗1；由纳米粒子3辅助分选和扩增得到的癌细胞特异性T细胞疫苗为T细胞疫苗2；由纳米粒子4辅助分选和扩增得到的癌细胞特异性T细胞疫苗为T细胞疫苗3；由纳米粒子5辅助分选和扩增得到的癌细胞特异性T细胞疫苗为T细胞疫苗4。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(6)制备得到的400万个癌细胞特异性T细胞(T细胞疫苗1，或者T细胞疫苗2，或者T细胞疫苗3，或者T细胞疫苗4)或者100μL PBS静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(8)实验结果
如图2所示，PBS对照组的小鼠其肿瘤生长速度很快，生存期很短。接受几种T细胞疫苗处理的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢，小鼠生存期变长。其中，T细胞疫苗4效果最好，T细胞疫苗4的效果优于T细胞疫苗1、T细胞疫苗2和T细胞疫苗3。这说明：在激活抗原提呈细胞过程中加入细胞因子组合1效果优于细胞因子组分2；辅助分离T细胞的纳米粒子表面负载抗原提呈细胞膜组分，内部为负载细胞组分的实心纳米粒子效果优于只是表面负载膜组分的纳米囊泡结构；被负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子效果远好于未被激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子。综上所述，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对黑色素瘤具有良好的预防效果。被负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞会降解和提呈所吞噬纳米粒子负载的癌细胞全细胞组分中的全细胞抗原，被抗原提呈细胞提呈到细胞膜表面的癌细胞抗原表位已经与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合。将上述抗原提呈细胞经过机械破坏后，抗原提呈细胞的细胞膜组分中含有与MHC结合的抗原表位。通过离心和/或使用一定孔径的滤膜过滤和/或与纳米粒子或微米粒子共作用，上述抗原提呈细胞中的细胞膜组分会形成纳米粒子或微米粒子，并负载了MHC分子和被降解提呈的癌细胞抗原表位，因而可以不经过抗原提呈细胞的辅助而直接激活癌细胞特异性T细胞。
实施例2癌细胞特异性T细胞分离扩增后用于黑色素瘤的预防
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备纳米粒子辅助分离扩增癌细胞特异性T细胞后用于预防黑色素瘤。本实施例中，裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织以制备肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原，然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以poly(I:C)和CpG1018为免疫佐剂采用溶剂挥发法制备负载有肿瘤组织的水溶性抗原和非水溶性抗原的纳米粒子系统，然后使用纳米粒子激活抗原提呈细胞，并将被激活的抗原提呈细胞制备成纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，并经扩增后注射到体内预防黑色素瘤。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:1混合后即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子及作为对照的空白纳米粒子和多肽纳米粒子采用溶剂挥发法制备。负载全细胞组分的纳米粒子1制备材料PLGA分子量为7Da-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG1018且佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子平均粒径为280nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所使用的poly(I:C)和CpG1018免疫佐剂各0.02mg。本实施例中，采用等质量负载四种多肽新生抗原B16-M20(Tubb3,FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM)，B16-M24(Dag1,TAVITPPTTTTKKARVSTPKPATPSTD)，B16-M46(Actn4,NHSGLVTFQAFIDVMSRETTDTDTADQ)和TRP2:180-188(SVYDFFVWL)的多肽纳米粒子2作为对照纳米粒子使用，其制备材料和制备方法同纳米粒子1，对照纳米粒2的粒径为280nm左右，负载100μg多肽组分，负载等量佐剂。空白纳米粒3的制备材料和制备方法同纳米粒子1，粒径为280nm左右，只负载等量的免疫佐剂却不负载任何抗原组分。
(3)抗原提呈细胞的制备
采用骨髓来源的树突状细胞(BMDC)和B细胞作为抗原提呈细胞。BMDC的制备同实施例1。B细胞提取流程如下：处死小鼠后摘取小鼠脾脏，然后制备小鼠脾细胞单细胞悬液，然后使用磁珠分选法从脾细胞单细胞悬液中分选出CD19+B细胞。将BMDC和B细胞按数量比1:1混合后作为混合抗原提呈细胞使用。
(4)抗原提呈细胞的激活
将纳米粒子1(500μg)或多肽纳米粒子2(500μg)或空白纳米粒3(500μg)+游离裂解液与2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有细胞因子组合：IL-15(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(1000U/mL)。
或者纳米粒子1与2000万个BMDC在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有细胞因子组合：IL-15(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(1000U/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的2000万个混合抗原提呈细胞(1000万个BMDC+1000万个B细胞)，然后使用生理盐水洗涤细胞两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后与相对应的步骤(2)制备的负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子1(50mg)或者多肽纳米粒子2(50mg)或者空白纳米粒子3(50mg)共孵育10分钟，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液并在15000g离心60分钟，弃去上清后使用生理盐水重悬所得沉淀即为纳米粒子。其中，使用空白纳米粒子3激活的混合抗原提呈细胞膜组分与空白纳米粒子3共作用后所制得的纳米粒子为纳米粒子4，粒径为300nm；使用多肽纳米粒子2激活的混合抗原提呈细胞膜组分与多肽纳米粒子2共作用后所制得的纳米粒子为纳米粒子5，粒径为300nm；使用纳米粒子1激活的混合抗原提呈细胞膜组分与纳米粒子1共作用后所制得的纳米粒子为纳米粒子6，粒径为300nm。
或者通过在400g离心5分钟收集与纳米粒子1孵育后的2000万个BMDC，然后使用生理盐水洗涤BMDC两遍，将细胞重悬在生理盐水中后在4℃下使用低功率7.5W超声10分钟以破坏细胞并制备含有细胞膜组分的样品。然后将样品一次通过滤膜孔径为50μm、10μm、5μm、1μm、0.45μm、0.22μm的滤膜过滤，收集所得滤液后与步骤(2)制备的纳米粒子1(50mg)共孵育10分钟，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液并在15000g离心60分钟，弃去上清后使用生理盐水重悬所得沉淀即为纳米粒子7，粒径为300nm。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种5×105个B16F10细胞，在第7天，第14天，第21天和第28天分别给小鼠皮下注射100μL负载癌细胞全细胞组分的1mgPLGA纳米粒子。在第32天处死小鼠，收集小鼠的脾脏和肿瘤组织。将小鼠肿瘤组织切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液，离心并用PBS洗涤后使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分离活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。与此同时，将小鼠脾脏通过细胞筛网和裂解红细胞后制备脾细胞单细胞悬液，使用流式细胞术从脾细胞单细胞悬液中分选活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD19+B细胞。将步骤(5)制备的基于抗原提呈细胞的100μg纳米粒子(纳米粒子4，或者纳米粒子5，或者纳米粒子6，或者纳米粒子7)与B细胞(500万个)和来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(40万个)在5mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD134+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞；其中使用纳米粒子4辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；其中使用纳米粒子5辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；其中使用纳米粒子6辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3；其中使用纳米粒子7辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗4。或者将步骤(5)制备的基于抗原提呈细胞的100μg纳米粒子6与来自肿瘤浸润淋巴细胞的T细胞(40万个)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD134+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞，为T细胞疫苗5。
与此同时，分别使用抗小鼠CD3抗体、抗小鼠CD4抗体、抗小鼠CD8抗体和抗小鼠CD134抗体标记孵育后的T细胞，然后使用流式细胞术分析不同纳米粒子与T细胞和抗原提呈细胞共孵育后CD8+T细胞亚型和CD4+T细胞亚型中CD134+的T细胞所占的比例。纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别癌细胞全细胞抗原的特异性T细胞即可以识别癌细胞全细胞抗原表位后被激活并表达特异性表面标志物，通过流式细胞术分析高表达特异性表面标志物的T细胞的比例，即可以知道被激活和可以分选出来的可以识别和具有杀伤效能的癌细胞特异性T细胞的数量。
将上述分选得到的T细胞疫苗分别与IL-2(2000U/mL)和αCD-3抗体(20ng/mL)共孵育14天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤(6)制备得到的100万个癌细胞特异性T细胞疫苗(T细胞疫苗1，或者T细胞疫苗2，或者T细胞疫苗3，或者T细胞疫苗4，或者T细胞疫苗5)或者100μL PBS静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(8)实验结果
如图3所示，PBS对照组和T细胞疫苗1组小鼠肿瘤生长速度都很快，小鼠生存期很短。与上述两组对照组相比，其他T细胞疫苗组小鼠的肿瘤生长速度都明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。T细胞疫苗3和T细胞疫苗5效果最好，T细胞疫苗3和T细胞疫苗5都明显好于T细胞疫苗2和T细胞疫苗4；而且T细胞疫苗3和T细胞疫苗5效果相当。这说明，使用负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子有利于分离得到更好的癌细胞特异性T细胞；而且DC和B细胞的混合抗原提呈细胞效果好于单一DC。T细胞疫苗5优于T细胞疫苗4说明本发明所述的辅助分离广谱癌细胞特异性T细胞的方法可以不依赖于抗原提呈细胞。而且，在辅助分离得到癌细胞特异性T细胞的过程中，不需要添加抗原提呈细胞即可得到与添加抗原提呈细胞辅助分离癌细胞特异性T细胞一样的效果，这也是本发明所述的由被激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子或微米粒子辅助分选和扩增癌细胞特异性T细胞的一个优势。
负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞对癌症的预防效果优于负载四种抗原多肽的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞。这说明负载四种新生抗原多肽纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子辅助分离的癌细胞特异性T细胞种类有限，因而扩增后的T细胞系统所含有的T细胞克隆数很少，所能识别和杀灭的癌细胞也就较少。而负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子能辅助分离更广谱的癌细胞特异性T细胞，因而扩增后所能得到的T细胞克隆数也就更广谱，所能识别和杀灭的癌细胞也就越多，治疗或预防癌症的效果也越好。
如图3中c和d所示为5个T细胞疫苗体外激活癌细胞特异性T细胞的情况，负载全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子所能激活的CD8+CD134+T细胞和CD4+CD134+T细胞占CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例明显高于对照组。由此可见，本发明所述的负载全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子可以更好的辅助分离具有识别癌细胞和杀伤癌细胞能力的癌细胞特异性T细胞。
实施例3分选扩增的癌细胞特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
本实施例以小鼠黑色素瘤为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增小鼠外周免疫细胞中的癌细胞特异性T细胞后用于治疗黑色素瘤。本实施例中，首先裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织和癌细胞以制备肿瘤组织和癌细胞的水溶性抗原混合物(质量比1:1)和非水溶性抗原混合物(质量比1:1)，并将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)和CpG2006为佐剂制备负载裂解物组分的纳米粒子，然后将纳米粒子与抗原提呈细胞共孵育一段时间后激活抗原提呈细胞，并将抗原提呈细胞制备成纳米粒子辅助分离激活癌细胞特异性T细胞，并扩增后用于治疗黑色素瘤。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解所得样品；收集培养的B16F10癌细胞系时，先离心去除培养基后使用PBS洗涤两次并离心收集癌细胞，将癌细胞在超纯水中重悬，反复冻融3次，并伴有超声破坏裂解癌细胞。待肿瘤组织或癌细胞裂解后，将裂解物以5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。将肿瘤组织的水溶性抗原和癌细胞的水溶性抗原按质量比1:1混合；肿瘤组织的非水溶性抗原和癌细胞的非水溶性抗原按质量比1:1混合。将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合，即为制备纳米粒子的抗原原料来源。
(2)细菌细胞外囊泡(OMV)和癌细胞外囊泡的制备
将长双歧杆菌在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，在4℃下使用20W超声处理5分钟，然后在16000g离心90分钟，将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分，然后使用8M尿素水溶液裂解和溶解细菌外囊泡膜组分。
或者将长双歧杆菌在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，在4℃下使用20W超声处理5分钟，然后在16000g离心90分钟，将沉淀在PBS中重悬后即为收集到的细菌外囊泡膜组分，然后使用吐温80水溶液裂解和溶解细菌膜组分。
(3)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1采用复乳法制备，制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG2006且佐剂包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子1平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载130μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒子1所负载的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各0.02mg。
本实施例中纳米粒子2制备材料和制备方法同纳米粒子1。纳米粒子2内部同时负载步骤(1)所制备的抗原组分和步骤(2)所制备的8M尿素溶解的细菌外囊泡膜组分，且二者质量比为1:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG2006且佐剂包载于纳米粒子内。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负肿瘤组织载裂解液组分、细菌外囊泡组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子2平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子2约负载130μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒2所负载的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各0.02mg。
本实施例中纳米粒子3制备材料和制备方法同纳米粒1。纳米粒子3内部同时负载步骤(1)所制备的抗原组分和步骤(2)所制备的吐温80溶解的细菌外囊泡膜组分，且二者质量比为1:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)和CpG2006且佐剂包载于纳米粒子内。在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负肿瘤组织载裂解液组分、细菌外囊泡组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h备用。纳米粒子3平均粒径为250nm左右，每1mg PLGA纳米粒子3约负载130μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒3所负载的poly(I:C)和CpG2006免疫佐剂各0.02mg。
空白纳米粒子4的制备材料和制备方法同纳米粒子1，但是空白纳米粒子4只负载等量的佐剂而不负载任何的肿瘤组织裂解物组分。纳米粒子4的粒径为250nm左右。
(4)B细胞的分离
处死C57BL/6小鼠后摘取小鼠脾脏，制备小鼠脾细胞单细胞悬液，使用磁珠分选法分离脾细胞中的CD19+B细胞。
(5)抗原提呈细胞的激活
将500μg的纳米粒子1，或者500μg的纳米粒子2，或者500μg的纳米粒子3，或者500μg的纳米粒子4分别与B细胞(1000万个)在15mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含GM-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、白蛋白(50ng/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(6)抗原提呈细胞来源的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的B细胞，然后使用PBS洗涤细胞三遍，将细胞重悬在PBS水中后在低功率(10W)超声15分钟。然后将样品在500g离心5分钟并收集上清液，将上清液依次过孔径为30um、10um、5um、0.45um、0.22um的膜过滤后，将所得滤液样品在18000g离心60分钟后弃去上清液并将沉淀使用PBS重悬后即得纳米粒子。其中，使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子5，粒径为110纳米；使用纳米粒子2激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子6，粒径为110纳米；使用纳米粒子3激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子7，粒径为110纳米；使用纳米粒子4激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子8，粒径为110纳米。
(7)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种5×105个B16F10细胞，在第10天，第17天和第24天分别给小鼠皮下注射0.5mg步骤(3)制备的PLGA纳米粒子1。第31天处死小鼠，摘取小鼠脾脏并制备小鼠脾脏单细胞悬液，使用磁珠分选法分选脾脏细胞中活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD45+CD3+T细胞。将分离得到的T细胞(400万个)与步骤(6)制备的100μg的纳米粒子(纳米粒子5，或者纳米粒子6，或者纳米粒子7，或者纳米粒子8)在40mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD134+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原特异性激活的癌细胞特异性T细胞。其中，使用纳米粒子5辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；使用纳米粒子6辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；使用纳米粒子7辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3；使用纳米粒子8辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗4。
与此同时，在流式细胞术分选T细胞的同时分析脾脏T细胞与不同的纳米粒子在DMEM高糖完全培养基中共孵育48小时后T细胞中CD3+CD134+T细胞的比例。
与此同时，将未经纳米粒子辅助分选的脾细胞中的T细胞与步骤(6)制备的不同纳米粒子在DMEM高糖完全培养基中共孵育48小时，然后收集孵育后的细胞并用带有荧光探针的IFN-γ抗体标记孵育后的T细胞，尔后使用流式细胞术分析T细胞中IFN-γ+T细胞所占比例。纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞膜表面，抗原提呈细胞制备的纳米粒子负载有上述降解提呈后的抗原表位，可以被癌细胞特异性T细胞识别并激活癌细胞特异性T细胞，被激活后分泌杀伤性细胞因子。IFN-γ是抗原特异性T细胞识别抗原后被激活所分泌的最主要的细胞因子。使用流式细胞术分析的CD3+IFN-γ+T细胞即为可以识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。
将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗分别与IL-2(2000U/mL)和IL-7(2000U/mL)在DMEM高糖完全培养基中共孵育7天(37℃，5％CO2，每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗。
(8)癌细胞特异性T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天、第20天和第25天分别静脉注射200万个癌细胞特异性T细胞疫苗(T细胞疫苗1，或者T细胞疫苗2，或者T细胞疫苗3，或者T细胞疫苗4)或者100μL PBS。在实验中，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(9)实验结果
如图4中a和b所示，PBS对照组和空白纳米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞疫苗4对照组小鼠的肿瘤生长速度很快，生存期很短。而T细胞疫苗1、T细胞疫苗2和T细胞疫苗3处理的小鼠其肿瘤生长速度明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。而且，T细胞疫苗2的效果优于T细胞疫苗1和T细胞疫苗3，这说明使用适当方法裂解和溶解的细菌外囊泡组分负载到纳米粒子后所激活的抗原提呈细胞有利于辅助分离癌细胞特异性T细胞。综上所述，本发明所述的细胞系统对癌症具有优异的治疗效果。
如图4中c和d所示为T细胞疫苗体外激活癌细胞特异性T细胞的情况，使用不同粒子辅助分选时所能激活的癌细胞特异性T细胞的比例高低与a和b图中的疗效相关。而且，使用CD134作为激活的表面标志物分选得到的被激活的癌细胞特异性T细胞比例与遇到癌细胞抗原后可以释放杀伤性细胞因子IFN-γ的T细胞的比例相一致，这说明，使用CD134作为激活的表面标志物分选得到的T细胞就是可以特异性识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。由此可见，本发明所述的分离方法可以有效的分选肿瘤组织中具有识别癌细胞和杀伤癌细胞能力的癌细胞特异性T细胞。
实施例4纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞用于预防癌症
本实施例中，首先使用6M盐酸胍裂解B16F10黑色素瘤癌细胞全细胞抗原。然后，以PLGA为微米粒骨架材料，以CpG BW006(B类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的微米粒子系统。使用微米粒子激活抗原提呈细胞后，将抗原提呈细胞制备成纳米粒子辅助分离癌细胞特异性T细胞，并扩增后用于预防癌症。
(1)癌细胞的裂解
将培养的B16F10黑色素瘤癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用6M盐酸胍重悬和裂解癌细胞，癌细胞全细胞抗原裂解并溶于6M盐酸胍后即为制备微米粒子系统的抗原原料来源。
(2)微米粒子的制备
本实施例中微米粒子采用复乳法制备。所采用的微米粒子1制备材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG BW006、CPG2216和Poly ICLC。Poly ICLC是toll样受体3激动剂，而各类CpG是Toll样受体9激动剂，而Toll样受体3和Toll样受体9均位于细胞内的内吞体膜结构中。首先将裂解物组分和免疫佐剂共负载于微米粒子内，然后在10000g离心15分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h；在粒子使用前将其用7mL PBS重悬然后加入3mL癌细胞裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载裂解物的微米粒子1。该微米粒子平均粒径为2.50μm左右，表面电位为-2mV左右；每1mg PLGA微米粒子1约负载140μg蛋白质或多肽组分，负载的CpG BW006(B类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC各0.02mg。
对照微米粒子2制备材料和制备方法相同，负载的免疫佐剂为CpG2336(A类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC。对照微米粒子2粒径为2.50μm左右，表面电位为-2mV左右，每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒所负载的CpG2336(A类)、CPG2216(A类)和Poly ICLC免疫佐剂各为0.02mg。
对照微米粒子3制备材料和制备方法相同，负载的免疫佐剂为CpG BW006(B类)和CPG2216(A类)。对照微米粒子3每1mgPLGA微米粒所使用的佐剂为0.02mg，粒径为2.50μm左右，表面电位为-2mV左右，每1mg PLGA微米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米粒所负载的CpG BW006(B类)和CPG2216(A类)各0.03mg。
(3)抗原提呈细胞的制备
处死小鼠后收集小鼠淋巴结和脾脏，将小鼠淋巴结或者脾脏切碎研磨分别通过细胞筛网过滤制备单细胞悬液，将淋巴结单细胞悬液和脾脏单细胞悬液混合后，使用流式细胞术从中分选出CD19+B细胞和CD11c+的DC。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的微米粒子(500μg)与制备的DC(1000万个)和B细胞(1000万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含有粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)和CD86抗体(10ng/mL)。
(5)抗原提呈细胞来源的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(22.5W)超声1分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液，然后在16000g离心90分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子，纳米粒子粒径为110纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在第10天，第15天，第20天使用射线照射肿瘤部位对小鼠进行射线照射治疗。在第25天处死小鼠，收集各组小鼠的肿瘤组织，将小鼠肿瘤组织切成小块后过细胞筛网，制备单细胞悬液，然后使用磁珠分选法分选肿瘤组织单细胞悬液中的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。将分选所得T细胞(500万个)、步骤(5)所制备的纳米粒子(100μg)在2mLRPMI1640完全培养基中共孵育24小时(37℃,5％CO2)，尔后采用磁珠分选法分选T细胞中的CD69+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、αCD-3抗体(20ng/mL)及αCD-28抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育7天(两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(7)癌细胞特异性T细胞扩增后用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠静脉注射100μL含300万个癌细胞特异性T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(8)实验结果
如图5所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而使用癌细胞特异性T细胞处理小鼠肿瘤生长速度都明显变慢且生存期明显延长。而且，负载CpG佐剂和Poly ICLC混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞对黑色素瘤的预防效果优于负载两种CpG混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞。而且，负载一种B类CpG、一种A类CpG和Poly ICLC混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子效果好于使用负载两种A类CpG和PolyICLC混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子。这说明负载两种不同toll样受体的混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞能制备的纳米粒子效果更好，而且，含有B类CpG与Toll样受体3激动剂作为混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子效果更好。
实施例5癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例中，首先使用8M尿素裂解B16F10黑色素瘤肿瘤组织，并溶解肿瘤组织裂解物组分。然后，以PLGA为纳米粒骨架材料，以Poly(I:C)、CpG2006(B类)和CpGSL01(B类)为免疫佐剂制备负载有癌细胞全细胞抗原的纳米粒子，使用纳米粒子激活抗原提呈细胞后制备纳米粒子，然后辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞后，将上述细胞扩增后用于预防癌症。
(1)肿瘤组织的收集及裂解
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量8M尿素裂解细胞，并溶解细胞裂解物。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子采用溶剂挥发法制备。纳米粒子1所采用制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)、CpG2006和CpGSL01，且裂解物组分和佐剂包载于纳米粒子内部。制备方法如前所述，在纳米粒子内部负载裂解物组分和佐剂后，将100mg纳米粒子在12000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，得冻干粉后备用。该纳米粒子平均粒径为270nm左右，纳米粒子表面电位为-3mV左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载80μg蛋白质或多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所使用的Poly(I:C)、CpG2006和CpGSL01各为0.02mg。
对照纳米粒2制备材料和制备方法同上，粒径为270nm左右，负载等量的裂解物组分，负载免疫佐剂为Poly(I:C)，每1mg PLGA负载Poly(I:C)0.06mg。
对照纳米粒子3粒径为270nm左右，负载等量的裂解物组分，负载免疫佐剂为Poly(I:C)、CpG1585(A类)和CpG2216(A类)，每1mg PLGA负载Poly(I:C)、CpG1585(A类)和CpG2216(A类)各0.02mg。
(3)DC和B细胞的制备
处死C57BL/6后摘取小鼠淋巴结，制备小鼠淋巴结单细胞悬液，然后使用流式细胞术从淋巴结细胞单细胞悬液中分选出CD11c+DC和CD19+B细胞。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子1(500μg)、纳米粒子2(500μg)或纳米粒子3(500μg)与DC(500万个)和B细胞(500万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)和CD86抗体(10ng/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃使用匀浆机在2000rpm搅拌破坏处理25分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液，然后在15000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米例子，纳米粒子粒径为150纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天，在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在第8天，第10天，第12天，第14天，第16天，第18天，第20天分别给小鼠皮下注射100μL的αPD-1抗体(10mg/kg)。在第24天处死小鼠，分别收集各组小鼠的肿瘤组织，制备肿瘤组织单细胞悬液，然后使用磁珠分选法分选得到肿瘤组织单细胞悬液中的活细胞中(使用活死细胞染料标记死细胞以去除死细胞)的CD3+T细胞。然后，将分选得到的T细胞(50万个)与来源于同种异体的B细胞(250万个)、步骤(5)制备的纳米粒子(100μg)在10mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD8+CD69+T细胞和CD3+CD4+CD69+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(2000U/mL)、αCD-3抗体(20ng/mL)以及αCD-28抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育11天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在小鼠癌细胞特异性T细胞移植前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL的80万个扩增得到的癌细胞特异性CD8+T细胞和20万个扩增得到的癌细胞特异性CD4+T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1.5×105个B16F10细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。肿瘤体积采用公式v＝0.52×a×b2计算，其中v为肿瘤体积，a为肿瘤长度，b为肿瘤宽度。出于动物实验伦理，在小鼠生存期试验中当小鼠肿瘤体积超过2000mm3即视为小鼠死亡并将小鼠安乐死。
(8)实验结果
如图6所示，对照组小鼠的肿瘤都长大，而经负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞进行移植的小鼠肿瘤生长速度都明显变慢，且大部分小鼠癌细胞接种后肿瘤消失。而且，负载两种B类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞效果好于负载两种A类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的纳米粒子或者只负载Poly(I:C)作为佐剂的纳米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的纳米粒子辅助分离扩增的T细胞。
实施例6癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌
本实施例以MC38小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离广谱的癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌。首先裂解结肠癌肿瘤组织和肺癌癌细胞以制备水溶性抗原，并将抗原使用蛋白酶在体外先降解为多肽。在实际应用中也可以使用其它酶或者其它方法先将全细胞组分中的蛋白质降解为多肽。然后再制备水溶性抗原混合物(质量比1:1)和非水溶性抗原(质量比1:1)混合物，并将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按质量比1:1混合。然后，以PLA为纳米粒骨架材料，以CpGM362、CPG1018和和Poly ICLC为免疫佐剂制备纳米粒子，并用该纳米粒子体外激活癌细胞特异性T细胞，然后分离提取扩增癌细胞特异性T细胞用于治疗结肠癌。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38细胞在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织。将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入适量纯水并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以大于5000g的转速离心5分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。在水溶性抗原(80mg/mL)中加入胰蛋白酶(Trypsin，0.5mg/mL)和糜蛋白酶(Chymotrypsin，0.5mg/mL)共孵育1小时，然后在95℃加热10分钟灭活蛋白酶备用。
将培养的LLC肺癌细胞系收集后在350g离心5分钟，然后弃去上清并用PBS洗涤两遍，然后采用超纯水重悬细胞并反复冻融5次，并可伴有超声以破坏裂解细胞。待细胞裂解后，将裂解物以3000g的转速离心6分钟并取上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入8M尿素溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在8M尿素水溶液中可溶。在水溶性抗原(80mg/mL)中加入胰蛋白酶(Trypsin，0.5mg/mL)和糜蛋白酶(Chymotrypsin，0.5mg/mL)共孵育1小时，然后在95℃加热10分钟灭活蛋白酶备用。
将来自结肠癌肿瘤组织的和肺癌癌细胞的水溶性抗原按质量比1:1混合；溶解于8M尿素中的非水溶性抗原也按质量比1:1混合。然后将水溶性抗原混合物和非水溶性抗原混合物按照质量比1:1混合，该混合物为制备纳米粒子的原料来源。
(2)卡介苗(BCG)的裂解和溶解
收集BCG，使用8M尿素水溶液裂解BCG后溶解裂解组分备用。
(3)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子1采用溶剂挥发法制备。纳米粒子1制备材料PLA分子量为20KDa，纳米粒子内部负载肿瘤组织和癌细胞裂解物、细菌裂解物以及免疫佐剂，表面负载肿瘤组织和癌细胞裂解物组分。所采用的免疫佐剂为CpGM362、CPG1018和poly ICLC，且佐剂负载于纳米粒子内部，制备纳米粒子时使用的肿瘤组织和癌细胞裂解物与细菌裂解物的质量比为1:1。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载裂解物混合物、细菌裂解物组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mL PBS中，并于0.1mL含有等量癌细胞和肿瘤组织裂解物混合物和细菌裂解物组分(80mg/mL)的样品室温混合孵育5分钟后即可使用。纳米粒子1平均粒径为290nm左右，每1mg PLGA纳米粒子1约负载140μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒含有CpGM362、CPG1018和Poly ICLC免疫佐剂各0.04mg。
(4)抗原提呈细胞的制备
处死C57BL/6后收集小鼠外周血，从外周血中分离外周血单核细胞(PBMC)，然后使用流式细胞术从PBMC中分选出CD11c+DC和CD19+B细胞。本实施例中同时使用BMDC和BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例2。BMDM制备方法如下：将C57小鼠麻醉后脱臼处死，将小鼠使用75％乙醇的消毒，然后用剪刀在小鼠背部剪开一小口，用手直接撕开皮肤至小鼠小腿关节处，去除小鼠足关节以及皮肤。用剪刀沿着小鼠大腿根部大转子将后肢拆下来，去掉肌肉组织后放置在含有75％乙醇的培养皿内浸泡5min，更换新的75％乙醇的培养皿移入超净台中。将乙醇浸泡的腿骨移入冷的PBS浸泡，洗去胫骨、股骨表面的乙醇，此过程可重复3次。将清洗好的股骨、胫骨分开，并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断，使用1mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹洗3次，直至腿骨内看不到明显的红色为止。用5mL移液枪将含有骨髓细胞的培养基反复吹打，使细胞团块分散，然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛，转移至15mL离心管内，1500rpm/min离心5min，弃上清，加入红细胞裂解液重悬静置5min后1500rpm/min离心5min，弃上清用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基(含有15％L929培养基的DMEM高糖培养基)重悬，铺板。将细胞培养过夜，以去除贴壁较快的其他杂细胞如纤维细胞等等。收集未贴壁细胞按实验设计安排种入皿或细胞培养板内。巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)以40ng/mL浓度刺激使骨髓细胞向单核巨噬细胞分化。培养8天，光镜下观察巨噬细胞形态变化。8天后消化收集细胞，用抗小鼠F4/80抗体和抗小鼠CD11b抗体，4℃避光孵育30min后，使用流式细胞术鉴定所诱导成功的巨噬细胞的比例即可。
(5)抗原提呈细胞的激活
将纳米粒子1(1000μg)与外周血来源的DC(2000万个)、BMDC(2000万个)在RPMI1640完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
或者将纳米粒子1(1000μg)与外周血来源的DC(1000万个)、BMDC(1000万个)、BMDM(1000万个)、B细胞(1000万个)在20mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含有GM-CSF(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)、IL-12(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(6)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的外周血来源的DC(2000万个)和BMDC(2000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在高压均质机中(5000bar)中处理5分钟。然后将样品在2000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液，将上清液与步骤(3)所制备的纳米粒子1在4℃共孵育16小时，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液在13000g离心20分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子2，粒径为310纳米。
或者通过在400g离心5分钟收集孵育后的外周血来源的DC(1000万个)、BMDC(1000万个)、B细胞(1000万个)及BMDM(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在高压均质机中(5000bar)中处理5分钟。然后将样品在2000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液，将上清液与步骤(3)所制备的纳米粒子1(50mg)在4℃共孵育16小时，然后使用0.45μm的滤膜反复共挤出，将挤出液在13000g离心20分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子3，粒径为310纳米。
(7)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个MC38细胞，在第10天，第15天和第21天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子1。在第24天处死小鼠，收集小鼠的引流淋巴结和脾脏，制备引流淋巴结和脾细胞的单细胞悬液并使用磁珠法从中分选出T细胞。将所得T细胞(400万个)、200μg的纳米粒子(纳米粒子1，或者纳米粒子2，或者纳米粒子3)、IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)及IL-15(5000U/mL)在5mLDMEM完全培养基中共孵育96小时，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+CD8+CD69+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞与IL-2(1000U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)和αCD-3抗体(10ng/mL)在DMEM完全培养基中共孵育8天(每两天换液一次)以扩增分选得到的癌细胞特异性CD8+T细胞。其中，使用纳米粒子1辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；使用纳米粒子2辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；使用纳米粒子3辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3。
(8)癌细胞特异性CD8+T细胞用于癌症的治疗
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠皮下接种2×106个MC38细胞，在第4、第7天、第10天、第15天和第20天分别给小鼠注射100μL含200万个癌细胞特异性CD8+T细胞。小鼠肿瘤体积及生存期监测方法同上。
(9)实验结果
如图7所示，PBS对照组和T细胞疫苗1组的小鼠的肿瘤都生长很快小鼠生存期很短。与上述两组相比，T细胞疫苗2和T细胞疫苗3处理的小鼠其肿瘤生长速度都明显变慢，而且部分小鼠肿瘤消失痊愈。而且，T细胞疫苗3效果好于T细胞疫苗2。这说明粒子表面负载被激活的抗原提呈细胞膜组分以及使用混合抗原提呈细胞膜组分均可以提高纳米粒子或微米粒子辅助分离和扩增癌细胞特异性T细胞的效果。综上所述，本发明所述T细胞疫苗对结肠癌具有良好的治疗效果。
实施例7癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子激活抗原提呈细胞后制备成微米粒子辅助分离来自外周血癌细胞特异性T细胞并用于预防乳腺癌。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中，然后反复冻融5遍并伴有超声以裂解癌细胞。在所裂解系细胞中加入1mg/mL的核酸酶降解裂解物中的核酸，然后在95℃加热10分钟灭活核酸酶，然后在5000g离心5分钟收集上清液即为水溶性抗原组分，沉淀使用10％脱氧胆酸钠(含10M精氨酸)溶解即为非水溶性抗原组分，将水溶性抗原组分与非水溶性抗原组分按质量比3：1混合即为制备粒子系统的原料来源。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子采用复乳法。微米粒子1骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG2395(C类)、CpGM362(C类)和Poly(I:C)。制备时采用复乳法制备内部负载裂解物组分和佐剂的微米粒子,然后将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子系统平均粒径为2.5μm左右，表面电位为-6mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，负载CpG2395、CpGM362和Poly(I:C)各0.02mg。对照微米粒子2制备材料和制备方法同上，粒径为2.5μm左右，表面电位为-6mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA负载CpG1585(A类)、CpG2336(A类)和Poly(I:C)各0.02mg。
(3)B细胞的制备
使用来自外周脾细胞中的B细胞。处死小鼠后摘取脾脏，然后制备小鼠脾细胞单细胞悬液，使用磁珠分选法分选单细胞悬液中的CD19+B细胞。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞抗原组分的微米粒子(800μg)与步骤(3)制备的B细胞(1000万个)在15mL 高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含有GM-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)和CD86抗体(10ng/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的微米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的B细胞(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声1分钟后使用匀浆机在1000rpm处理3分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清液，将上清液与步骤(2)所制备的微米粒子(60mg)以及DSPE-PEG-甘露糖(1mg)在100W超声处理2分钟，然后在8000g离心20分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得微米粒子，粒径为2.6μm。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
第0天每只BALB/c小鼠背部皮下接种1×106个4T1细胞，在第10天，第17天和第24天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA微米粒子。在第30天处死小鼠，收集小鼠的外周血，从外周血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，然后使用流式细胞术从PBMC中分离CD3+T细胞。将T细胞(100万个)、DC2.4(200万个)以及微米粒子(50μg)在2mL DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术从中分选出CD3+CD69+T细胞，即为被癌细胞全细胞抗原激活的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的癌细胞特异性T细胞分别与IL-2(4000U/mL)、IL-7(2000U/mL)和αCD-3抗体(20ng/mL)在DMEM完全培养基中共孵育12天(每两天换液一次)扩增分选得到的癌细胞特异性T细胞。
(4)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL的150万个扩增的癌细胞特异性T细胞。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，从第3天开始每3天记录一次小鼠肿瘤体积的大小。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(5)实验结果
如图8所示，与对照组相比，微米粒子激活的抗原提呈细胞所制备的微米粒子辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢且生存期明显延长。而且，使用两种C类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的微米粒子效果好于两种A类CpG与Poly(I:C)作为混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的微米粒子。本实施例微米疫苗中使用甘露糖作为主动靶向的靶头，在实际应用中也可以使用CD32抗体、甘露聚糖、CD205抗体、CD19抗体等任何具有靶向靶细胞能力的靶头。
实施例8癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
本实施例以甘露糖为靶头说明如何使用主动靶向纳米粒激活抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离癌细胞特异性T细胞并用于预防癌症。在实际应用时具体剂型、佐剂、给药时间、给药次数、给药方案可根据情况调整。主动靶向纳米粒子可通过树突状细胞表面的甘露糖受体摄取进入树突状细胞。
(1)癌细胞的裂解
收集培养的Pan02胰腺癌癌细胞后采用10％辛基葡萄糖苷裂解癌细胞和溶解来源于癌细胞的癌细胞全细胞抗原。
(2)纳米粒子的制备
本实施例中纳米粒子系统使用复乳法制备。纳米粒子制备材料为PLGA和甘露糖修饰的PLGA，二者分子量都为7KDa-17KDa。制备带有靶头的纳米粒子时二者一起使用时质量比为4:1。所采用的免疫佐剂为Poly(I:C)和CpG SL03。制备方法如前所述，采用复乳法将裂解物组分和佐剂共负载于纳米粒子内部，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用。带有靶头的纳米粒子1的平均粒径均为270nm左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载80μg蛋白质和多肽组分，含Poly(I:C)和CpGSL03各0.04mg。不负载佐剂但带有甘露糖靶头的纳米粒子2粒径也为270nm左右，制备时采用等量细胞裂解组分但是不含任何免疫佐剂，每1mg PLGA纳米粒子约负载80μg蛋白质和多肽组分。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC和BMDM制备方法同上。
(4)抗原提呈细胞的激活
将纳米粒子1(1000μg)或者纳米粒子2(1000μg)分别与BMDC(1000万个)、BMDM(1000万个)及IL-7(500U/mL)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)。或者将BMDC(1000万个)、BMDM(1000万个)及IL-7(500U/mL)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)。上述两种孵育系统中都含有IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(5)抗原提呈细胞来源的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和巨噬细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(10W)超声20分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液依次过孔径为30μm、10μm、5μm、2μm、1μm、0.45μm、0.22μm的膜过滤后，收集滤液，然后将滤液在18000g离心50分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在4％海藻糖水溶液中重悬，尔后冷冻干燥48小时后即得纳米粒子。其中，使用未被纳米粒子激活的混合抗原提呈细胞制备的为纳米粒子3，粒径为110纳米；使用纳米粒子2激活的混合抗原提呈细胞制备的为纳米粒子4，粒径为110纳米；使用纳米粒子1激活的混合抗原提呈细胞制备的为纳米粒子5，粒径为110纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1×106个Pan02胰腺癌细胞，第10天，第15天、第20天和第27天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子。第24天处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织和淋巴结。将小鼠肿瘤组织和淋巴结分别制备成单细胞悬液。然后从肿瘤组织单细胞悬液中和淋巴结单细胞悬液中分别使用流式细胞术分离CD45+CD3+T细胞，将来自肿瘤组织的和淋巴结的T细胞混合。然后将T细胞(500万个)与100μg纳米粒子(纳米粒子1，或者纳米粒子3，或者纳米粒子4，或者纳米粒子5)在DMEM高糖培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含有IL-2(500U/mL)、IL-7(500U/mL)和IFN-γ(500U/mL)。然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分选出CD3+CD69+T细胞，即为癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的T细胞与IL-2(2000U/mL)、IL-7(2000U/mL)、IL-15(1000U/mL)和αCD-3抗体(50ng/mL)在DMEM高糖培养基中共孵育12天(每两天换液一次)扩增所得癌细胞特异性T细胞。其中，使用纳米粒子1辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；使用纳米粒子3辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；使用纳米粒子4辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3；使用纳米粒子5辅助分选和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗4。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备胰腺癌荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤500万个癌细胞特异性T细胞(T细胞疫苗1，或者T细胞疫苗2，或者T细胞疫苗3，或者T细胞疫苗4)或100μL PBS静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1×106个Pan02胰腺癌细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图9所示，PBS组、T细胞疫苗1及T细胞疫苗2处理组小鼠肿瘤生长很快，小鼠很快死亡。与上述几组相比，T细胞疫苗3和T细胞疫苗4处理的小鼠其肿瘤生长速度明显变慢。而且，T细胞疫苗4效果好于T细胞疫苗3。综上所述，不管是否被带有佐剂的纳米粒子激活的抗原提呈细胞，其所制备的纳米粒子都可以有效辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，但是带有佐剂的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子效果更佳。这说明本发明所述的癌细胞特异性T细胞可以有效预防癌症。
实施例9纳米粒子辅助分离癌细胞特异性T细胞用于预防肺癌
本实施例说明钙化的纳米粒子辅助分离肿瘤浸润淋巴细胞中的癌细胞特异性T细胞，在实际使用时也可以使用其他生物矿化技术、交联、凝胶化等修饰粒子。本实施例中，将小鼠肺癌肿瘤组织以8M尿素(含200mM氯化钠)裂解后溶解并负载于纳米粒子系统，使用该粒子激活抗原提呈细胞后，将抗原提呈细胞制备成纳米粒子，辅助分离肿瘤组织浸润淋巴细胞和外周血中的癌细胞特异性T细胞并扩增后用于肺癌的预防。
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解
在6-8周的雌性C57BL/6小鼠后背接种1×106个LLC小鼠肺癌细胞，待肿瘤体积长到1000mm3时处死小鼠摘取小鼠肿瘤组织，将肿瘤组织切块研磨后通过细胞筛网过滤制备成单细胞悬液，使用紫外照射5分钟后在80℃高温加热10分钟，然后采用8M尿素(含200mM氯化钠)裂解和溶解肿瘤组织单细胞悬液，即得癌细胞全细胞抗原。
(2)纳米粒子的制备
本实施例在纳米粒子内部和表面负载癌细胞全细胞抗原后生物钙化纳米粒子。本实施例中纳米粒子采用溶剂挥发法制备，所采用的纳米粒子制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，所采用免疫佐剂CpG2006和Poly(I:C)负载于纳米粒子内部。制备方法如下所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子内部负载抗原，然后将100mg PLGA纳米粒子在13000g离心20min后使用18mL PBS重悬，然后加入2mL溶解于8M尿素的肿瘤组织和癌细胞裂解液(60mg/mL)，在室温作用10分钟后在12000g离心20分钟后收集沉淀。然后将该100mgPLGA纳米粒子重悬于20mL DMEM培养基中，然后加入200μL of CaCl2(1mM)并在37℃反应两小时。然后在10000g离心20分钟后收集沉淀，并采用超纯水重悬后离心洗涤两遍。该纳米粒子平均粒径为290nm左右；每1mg PLGA纳米粒子约负载140μg蛋白质或多肽组分，CpG2006和Poly(I:C)各0.03mg。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和B作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例1。B细胞来自小鼠外周血PBMC，制备方法同上。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子(1000μg)与BMDC(500万个)及B细胞(500万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)和CD40抗体(20mg/mL)或者作为对照在孵育体系中不含有任何细胞因子和抗体。
(5)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液，将上清液通过0.45μm的膜过滤后使用超滤膜(截留分子量50KDa)超滤离心过滤和浓缩，将过滤和浓缩后的样品与步骤(2)制备的纳米粒子混合后使用高压均质机(10000bar)处理3分钟，然后在13000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子，粒径为300纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的分离和扩增
在第0天给每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1×106个LLC肺癌细胞，第10天，第15天、第20天和第27天分别给小鼠皮下注射100μL的1mg PLGA纳米粒子。第24天处死小鼠并摘取小鼠肿瘤组织和收集小鼠外周血。将小鼠肿瘤组织制备成单细胞悬液并从肿瘤组织单细胞悬液中使用流式细胞术分离CD45+CD3+T细胞；从外周血中分离PBMC，并使用流式细胞术从PBMC中分离CD45+CD3+T细胞；将来自肿瘤组织和外周血的T细胞混合。然后将T细胞(500万个)与抗原提呈细胞制备的纳米粒子(100μg)在DMEM高糖培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，在孵育过程中系统中含有IL-2(500U/mL)和IL-7(500U/mL)；或者T细胞(500万个)与抗原提呈细胞制备的纳米粒子(100μg)在DMEM高糖培养基中共孵育72小时(37℃，5％CO2)，且孵育体系中不含任何细胞因子或抗体。然后采用流式细胞术从孵育后细胞中分选出CD3+CD69+T细胞，即为癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的T细胞与IL-2(2000U/mL)、IL-7(2000U/mL)、IL-15(1000U/mL)和αCD-3抗体(50ng/mL)在DMEM高糖培养基中共孵育12天(每两天换液一次)扩增T细胞。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备肺癌荷瘤小鼠，在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。然后，将步骤500万个癌细胞特异性T细胞静脉注射给受体小鼠。隔天，给每只受体小鼠背部右下方皮下接种1×106个LLC肺癌细胞。监测小鼠肿瘤生长速度和小鼠生存期。肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图10所示，与对照组相比，钙化纳米粒激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞可以延长小鼠生存期有效预防癌症。而且，负载癌细胞全细胞抗原纳米粒子激活抗原提呈细胞时体系中含有细胞因子和/或抗体优于体系中不含细胞因子和/或抗体的；而且，抗原提呈细胞制备的纳米粒子与T细胞共孵育时体系中含有细胞因子和/或抗体的优于体系中不含有细胞因子和/或抗体的。
实施例10癌细胞特异性T细胞后用于黑色素瘤的治疗
(1)肿瘤组织和癌细胞的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种1.5×105个B16F10细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网后制备单细胞悬液，加入超纯水后反复冻融并伴有超声裂解上述细胞，然后加入核酸酶(0.5mg/mL)、胰蛋白酶(Trypsin，0.5mg/mL)和糜蛋白酶(Chymotrypsin，0.5mg/mL)作用15分钟，再在95℃作用10分钟灭活核酸酶。尔后在8000g离心3分钟，上清液部分即为水溶性抗原；沉淀部分使用10％脱氧胆酸钠水溶液溶解非水溶性抗原。将水溶性抗原和脱氧胆酸钠溶解后的非水溶性抗原按质量比1:1混溶即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒采用复乳法制备，具有靶向树突状细胞的能力。所采用的纳米粒子1制备材料为PLGA和甘露聚糖修饰的PLGA，二者分子量都为24KDa-38KDa，使用时未修饰PLGA和甘露聚糖修饰PLGA的质量比为9:1。所采用的免疫佐剂为poly(I:C)、CpG1018和CpG2216，增加溶酶体免疫逃逸的物质为KALA多肽(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)，且佐剂、KALA多肽包载于纳米粒子内。制备方法如前所述，在制备过程中首先采用复乳法在纳米粒子1内部负载裂解液组分、佐剂、KALA多肽，然后将100mg纳米粒子在12000g离心25分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。该纳米粒子1平均粒径为250nm左右，表面电位为-5mV左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG1018和CpG2216免疫佐剂各0.02mg,负载KALA多肽0.05mg。纳米粒子2的制备材料和方法与纳米粒子1相同，其粒径为250nm左右，表面电位为-5mV左右，纳米粒子2不负载KALA多肽，但是负载等量佐剂和细胞裂解组分。纳米粒子3的制备材料和制备方法与纳米粒子1相同，为250nm左右，表面电位为-5mV左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载100μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)0.02mg,负载CpG1018为0.04mg,负载KALA多肽0.05mg。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和BMDM作为混合抗原提呈细胞。BMDC和BMDM制备方法同上。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子(1000μg)与BMDC(1000万个)和BMDM(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(2000U/mL)、M-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、,IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的BMDC和BMDM，然后使用含有0.0759M蔗糖和0.225M甘露醇的30mM pH 7.0Tris-HCl缓冲液中1200rpm 3min离心清洗三次，然后在磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的存在下超声3分钟(25W)机械破坏抗原提呈细胞。经过离心后所获细胞膜用10mM pH 7.5的Tris-HCl和1mM EDTA的溶液清洗。然后将样品依次过孔径为30μm、10μm、5μm、2μm、0.45μm的膜过滤后，将滤液在12000g离心45分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在含有的4％甘露醇的生理盐水中重悬后冷冻干燥，即得纳米粒子。其中使用纳米粒子1激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子4，粒径为260纳米；使用纳米粒子2激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子5，粒径为260纳米；使用纳米粒子3激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子为纳米粒子6，粒径为260纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天分别给小鼠皮下注射0.5mg的PLGA纳米粒子(负载裂解物组分、Poly(I:C)和两种CpG佐剂及KALA多肽)。在第32天处死小鼠,收集小鼠的外周血和淋巴结。使用梯度离心法分离小鼠外周血中的PBMC，将淋巴结切成小块后研磨通过细胞筛网制备单细胞悬液，尔后把PBMC和淋巴结细胞单细胞悬液混合。然后使用磁珠分选法分选出CD45+CD3+的T细胞。将分选得到的CD3+T细胞(500万个)和40μg纳米粒子(纳米粒子4、或者纳米粒子5、或者纳米粒子6)以及IL-7(10ng/mL)在2mL RPMI1640完全培养基中共孵育96小时。然后采用流式细胞术分选孵育后的T细胞中的CD3+OX40+T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD3+OX40+T细胞与IL-2(1000U/mL)、IL-15(1000U/mL)、IL-21(1000U/mL)以及αCD-3抗体(20ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。其中，由纳米粒子4辅助分选扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；由纳米粒子5辅助分选扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；由纳米粒子6辅助分选扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3。
(7)扩增后的癌细胞特异性T细胞用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备黑色素瘤荷瘤小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种1.5×105个B16F10细胞。在接种黑色素瘤后第4天、第7天、第10天、第15天和第20天分别静脉注射150万个扩增后的癌细胞特异性T细胞。在实验中，小鼠肿瘤体积和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图11所示，PBS对照组的肿瘤很快都长大。与对照组相比，被负载全细胞组分的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增的癌细胞特异性T细胞处理的小鼠肿瘤生长速度明显变慢生存期明显延长。而且，加入增加溶酶体逃逸物质的纳米粒子1激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子4辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞疫苗1好于未加入溶酶体逃逸的纳米粒子2激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子5辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞疫苗2；使用两种CpG和Poly(I:C)作为混合佐剂的纳米粒子1激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子4辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞疫苗1的治疗效果好于只使用一种CpG和Poly(I:C)混合佐剂的纳米粒子3激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子6辅助分选扩增的T细胞疫苗3。综上所述，本发明所述的T细胞对癌症具有良好的治疗效果。
实施例11癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
本实施例以4T1小鼠三阴性乳腺癌为癌症模型来说明如何采用负载癌细胞全细胞抗原的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞，用于预防乳腺癌。本实施例中，首先对乳腺癌细胞进行灭活和变性处理，尔后裂解细胞，并以辛基葡萄糖苷溶解裂解癌细胞中的非水溶性抗原。然后，以PLGA为微米粒子骨架材料，以CpG2007、CpG1018、和Poly ICLC为免疫佐剂，以聚精氨酸和聚赖氨酸为增强溶酶体逃逸的物质，制备负载有癌细胞全细胞抗原的微米粒子，并使用该粒子激活抗原提呈细胞后制备纳米粒子，使用纳米粒子辅助分离和扩增癌细胞特异性T细胞并用于癌症预防。
(1)癌细胞的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和60℃高温加热进行灭活和变性处理5分钟，然后加入超纯水并反复冻融5次辅以超声裂解癌细胞，将细胞裂解物在5000g离心10分钟，上清液即为水溶性抗原，将沉淀物使用10％辛基葡萄糖苷溶解后即为溶解后的原非水溶性抗原，将水溶性抗原和非水溶性抗原按质量比2:1混合，即为制备微米粒子所需的裂解物组分。
(2)微米粒子系统的制备
本实施例中制备微米粒子采用复乳法，微米粒子1骨架材料PLGA分子量为38KDa-54KDa，所采用的免疫佐剂为CpG2007、CpG1018和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为聚精氨酸和聚赖氨酸。制备时先采用复乳法制备内部负载裂解物组分、佐剂和KALA多肽的微米粒子,然后将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后备用。该微米粒子1平均粒径为1.5μm左右，微米粒子系统表面电位为-7mV左右；每1mg PLGA微米粒子约负载110μg蛋白质或多肽组分，含CpG2007、CpG1018和Poly ICLC各0.01mg，含聚精氨酸和聚赖氨酸各0.02mg。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和小鼠脾细胞来源的B细胞作为抗原提呈细胞。BMDC及B细胞制备方法同上。将BMDC和B细胞按数量比1:1混合后即为混合抗原提呈细胞。
(4)混合抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的微米粒子(1000μg)与2000万个混合抗原提呈细胞(含BMDC1000万个+DC2.4细胞1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(500U/mL)、M-CSF(500U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)。
(5)抗原提呈细胞来源的微米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的混合抗原提呈细胞2000万个，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液，将上清液通过0.45μm的膜过滤后使用超滤膜(截留分子量50KDa)超滤离心过滤和浓缩，将过滤和浓缩后的样品与40mg步骤(2)制备的纳米粒子共孵育10分钟后使用2μm的滤膜反复挤出，然后将挤出液在10000g离心20分钟后收集弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得微米粒子2，粒径为1.6μm。
(6)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天小鼠后背皮下接种2×106个4T1乳腺癌细胞；在第7天、第14天、第21天和第28天分别皮下注射0.3mg PLGA 的微米粒子(负载裂解物组分、佐剂及增加溶酶体逃逸的物质)。在第32天处死小鼠,收集小鼠肿瘤组织，将肿瘤组织切成小块后通过细胞筛网制备单细胞悬液。使用流式细胞术从肿瘤组织单细胞悬液中分选CD3+的肿瘤浸润T细胞。将分选得到的CD3+T细胞(100万个)、100μg微米粒子2以及IL-7(500U/mL)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；或者将分选得到的CD3+T细胞(100万个)、100μg微米粒子2在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；或者将分选得到的CD3+T细胞(100万个)、100万个步骤(3)制备的BMDC、100μg微米粒子1以及IL-7(500U/mL)在5mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)。然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+T细胞中的CD8+CD69+T细胞以及CD4+CD69+T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+T细胞或者CD4+CD69+T细胞分别与IL-2(1000U/mL)、IL-6(1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)以及αCD28抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天以扩增癌细胞特异性T细胞。其中，使用CD3+T细胞、微米粒子2及IL-7共孵育分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；使用CD3+T细胞及微米粒子2共孵育分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；使用CD3+T细胞、DC、微米粒子1以及IL-7共孵育分选得到的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天,给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射100μL T细胞疫苗(内含100万个扩增得到的CD8+T细胞以及20万个扩增得到的CD4+)或者100μL PBS。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图12所示，与PBS对照组相比，微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的微米粒子辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗处理组肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，在抗原提呈细胞制备成的纳米粒子与含有T细胞的免疫细胞共孵育过程中加入IL-7辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗1效果好于共孵育过程中不加IL-7辅助分选得到的癌细胞特异性T细胞疫苗2。而且，T细胞疫苗1的效果好于T细胞疫苗3。这说明在共孵育中加入细胞因子IL-7有利于辅助分离癌细胞特异性T细胞，而且，被激活的混合抗原提呈细胞制备成的微米粒子在无抗原提呈细胞的情况下辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞效果好于使用负载全细胞组分的纳米粒子与DC+T细胞共孵育分选得到的癌细胞特异性T细胞。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞疫苗对乳腺癌具有预防效果。
实施例12癌细胞特异性T细胞用于乳腺癌的预防
(1)癌细胞及细菌外囊泡的裂解
将培养的4T1细胞在400g离心5分钟，然后用PBS洗涤两遍后重悬于超纯水中。所得癌细胞分别采用紫外线和高温加热进行灭活和变性处理，然后使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解癌细胞并溶解裂解物组分，即为制备微米粒子系统的抗原组分。
将长嗜酸乳杆菌在5000g离心30分钟，然后弃去沉淀后收集上清液，将上清液使用1μm的滤膜过滤，然后在16000g离心90分钟，将沉淀使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)裂解和溶解细菌外囊泡组分。
(2)微米粒子的制备
本实施例中制备微米粒子采用复乳法。微米粒子1骨架材料为未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA，分子量都为40KDa，未修饰的PLA和甘露糖修饰的PLA的比例为4:1。所采用的免疫佐剂为CpG2006、CpG2216和Poly ICLC，所采用的溶酶体逃逸增加物质为精氨酸和组氨酸。微米粒子制备时所使用的癌细胞裂解物组分和细菌外囊泡组分质量比为1:1。制备时先采用复乳法制备内部负载癌细胞裂解物组分、细菌外囊泡组分、佐剂、精氨酸和组氨酸的微米粒子,尔后，将100mg微米粒子在9000g离心20分钟，使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后干燥48h后即得微米粒子1，平均粒径为1.5μm左右，每1mg PLGA微米粒子1约负载100μg蛋白质或多肽组分，含CpG2006，CpG2216和Poly ICLC各0.02mg，含精氨酸和组氨酸各0.05mg。对照微米粒子2制备材料和制备方法同微米粒子1，粒径为1.5μm左右，负载等量精氨酸、组氨酸和等量的癌细胞裂解物组分和细菌外囊泡组分，但是不负载任何佐剂。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC、B细胞以及BMDM作为抗原提呈细胞。BMDC及BMDM制备制备方法同上。B细胞来自小鼠外周血PBMC，制备方法同上。将BMDC、B细胞和BMDM按数量比2:1:1混和后即为混合抗原提呈细胞。
(4)抗原提呈细胞的激活
将1000μg的微米粒子1或微米粒子2分别与4000万个混合抗原提呈细胞(含2000万个BMDC，1000万个B细胞及1000万个BMDM)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)和CD40抗体(20mg/mL)。
(5)抗原提呈细胞来源的粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的4000万个混合抗原提呈细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液，将上清液通过0.45μm的膜过滤后使用超滤膜(截留分子量50KDa)超滤离心过滤和浓缩，将过滤和浓缩后的样品使用高压均质机(10000bar)处理3分钟，然后在13000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子。其中，使用微米粒子1激活的混合抗原提呈细胞制备的为纳米粒子1，粒径为250纳米；使用微米粒子2激活的混合抗原提呈细胞制备的为纳米粒子2，粒径为250纳米。
通过在400g离心5分钟收集与微米粒子1或者微米粒子2孵育后的4000万个混合抗原提呈细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液，将上清液通过0.45μm的膜过滤后使用超滤膜(截留分子量50KDa)超滤离心过滤和浓缩，将过滤和浓缩后的样品使用高压均质机(10000bar)处理3分钟，然后与60mg相对应的步骤(2)制备的微米粒子1或微米粒子2共作用10分钟后使用2μm滤膜反复共挤出，然后将挤出液在10000g离心20分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得微米粒子。其中，使用微米粒子1激活的混合抗原提呈细胞膜组分与微米粒子1共作用制备的为微米粒子3，粒径为1.6μm；使用微米粒子2激活的混合抗原提呈细胞膜组分与微米粒子2共作用制备的为微米粒子4，粒径为1.6μm。
(6)癌细胞特异性T细胞的制备及分析
选取6-8周的雌性BALB/c小鼠，在第0天、第7天、第14天、第21天和第28天分别皮下注射100μL含0.2mg步骤(2)制备的PLGA的微米粒子1。在第32天处死小鼠,收集外周血和脾脏，然后制备PBMC和脾细胞单细胞悬液并将二者混合，然后使用磁珠分选法从中分选出CD3+T细胞。然后使用纳米粒子1、或者纳米粒子2、或者微米粒子3或者微米粒子4分别辅助分选和扩增癌细胞特异性T细胞。将分选得到的CD3+T细胞(200万个)、纳米粒子或微米粒子(100μg)、DC2.4细胞(100万个)在10mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，孵育体系中含有IL-2(200U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-15(200U/mL)以及CD80抗体(10ng/mL)。然后采用流式细胞术分选孵育后的CD3+T细胞中的CD3+CD8+CD69+T细胞以及CD4+T细胞中CD4+CD69+T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+T细胞或者CD4+CD69+T细胞按照数量比2:1混合后分别与IL-2(1000U/mL)、IL-7(1000U/mL)以及αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天以扩增癌细胞特异性T细胞，期间每两天换液一次。其中使用纳米粒子1辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗1；纳米粒子2辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗2；微米粒子3辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗3；微米粒子4辅助分离和扩增的癌细胞特异性T细胞为T细胞疫苗4。
与此同时，分别使用抗小鼠CD3抗体、抗小鼠CD3抗体和抗小鼠CD69抗体标记孵育后的T细胞，然后使用流式细胞术分析不同纳米粒子与T细胞和抗原提呈细胞共孵育后T细胞中CD69+的T细胞所占的比例。
与此同时，将未经纳米粒子辅助分选的脾细胞中的T细胞与步骤(6)制备的不同纳米粒子在DMEM高糖完全培养基中共孵育48小时，然后收集孵育后的细胞并用带有荧光探针的IFN-γ抗体标记孵育后的T细胞，尔后使用流式细胞术分析T细胞中IFN-γ+T细胞所占比例。纳米粒子所负载的癌细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞膜表面，抗原提呈细胞制备的纳米粒子负载有上述降解提呈后的抗原表位，可以被癌细胞特异性T细胞识别并激活癌细胞特异性T细胞，被激活后分泌杀伤性细胞因子。IFN-γ是抗原特异性T细胞识别抗原后被激活所分泌的最主要的细胞因子。使用流式细胞术分析的CD3+IFN-γ+T细胞即为可以识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。
(7)癌细胞特异性T细胞用于癌症的预防
选取6-8周的雌性BALB/c为模型小鼠制备乳腺癌荷瘤小鼠。在小鼠过继转移细胞前1天，给受体小鼠腹腔注射100mg/kg剂量的环磷酰胺以清除受体小鼠体内的免疫细胞。在第0天给小鼠皮下注射T细胞疫苗(内含60万个扩增后的CD8+T细胞和30万个扩增后的CD4+T细胞)或者100μL PBS。同时在第0天给每只小鼠皮下注射接种1×106个4T1细胞，小鼠肿瘤体积以及生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图13中a和b所示，与对照组相比，使用T细胞疫苗处理的小鼠，其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，T细胞疫苗1好于T细胞疫苗2；T细胞疫苗3好于T细胞疫苗4。这说明含有增加溶酶体逃逸功能的物质和混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的粒子所辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞效果好于只含有溶酶体逃逸功能的物质而不含有混合佐剂的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的粒子所辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞。而且，T细胞疫苗3好于T细胞疫苗1，T细胞疫苗4好于T细胞疫苗2，这说明内部负载癌细胞裂解组分而表面负载被激活的抗原提呈细胞组分的实心粒子所辅助分离得到的癌细胞特异性T细胞好于只是负载被激活的抗原提呈细胞组分的囊泡粒子所辅助分离的癌细胞特异性T细胞。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对乳腺癌具有杀伤能力，可以用于预防或者治疗癌症。而且混合佐剂的使用以及内部负载癌细胞全细胞组分均有助于辅助分离癌细胞特异性T细胞。
如图13中c和d所示,使用不同粒子辅助分选时所能激活的癌细胞特异性T细胞的比例高低与a和b图中的疗效相关，这说明使用本发明所述粒子辅助分选得到的T细胞就是可以特异性识别和杀伤癌细胞的癌细胞特异性T细胞。
实施例13癌细胞特异性T细胞用于结肠癌的治疗
本实施例以小鼠结肠癌为癌症模型来说明如何使用负载结肠癌全细胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞并用于治疗结肠癌。本实施例中，首先使用8M尿素水溶液裂解结肠癌肿瘤组织并溶解裂解组分，然后，以PLGA为骨架材料，以Poly(I:C)、CpG2336和CpG2006为佐剂，以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质，制备纳米粒子，使用该纳米粒子激活抗原提呈细胞后将抗原提呈细胞制备成纳米粒子，然后使用纳米粒子辅助分选癌细胞特异性T细胞，经过两步分选得到的癌细胞特异性T细胞经过扩增后用于癌症治疗。
(1)肿瘤组织的裂解及各组分的收集
收集肿瘤组织时先在每只C57BL/6小鼠背部皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞，在肿瘤长到体积分别为约1000mm3时处死小鼠并摘取肿瘤组织，将肿瘤组织切块后研磨，通过细胞过滤网加入8M尿素水溶液理解肿瘤组织并溶解裂解后组分。以上即为制备纳米粒子系统的抗原原料来源。
(2)纳米粒子系统的制备
本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。纳米粒子的制备材料PLGA分子量为7KDa-17KDa，以Poly(I:C)和CpG为佐剂，以NH4HCO3为增加溶酶体逃逸物质，且佐剂和NH4HCO3负载于纳米粒子内；制备方法如前所述，在制备过程中首先在纳米粒子内部负载裂解液组分和佐剂，然后将100mg纳米粒子在10000g离心20分钟，并使用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h后备用；该纳米粒子平均粒径为260nm左右，表面电位为-7mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒所负载的poly(I:C)、CpG2336和CpG2006免疫佐剂各0.02mg，负载NH4HCO3 0.01mg。纳米粒子2的制备材料和制备方法同纳米粒子1,粒径为260nm左右，表面电位为-7mV左右，每1mg PLGA纳米粒子约负载90μg蛋白质和多肽组分，每1mg PLGA纳米粒负载NH4HCO3 0.01mg,负载CpG2336和CpG2006各0.03mg。
(3)抗原提呈细胞的制备
本实施例使用BMDC和B作为抗原提呈细胞。BMDC制备方法同实施例1。B细胞来自小鼠外周血PBMC，制备方法同上。
(4)抗原提呈细胞的激活
将负载癌细胞全细胞组分的纳米粒子(1000μg)与BMDC(500万个)及B细胞(500万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)；孵育体系中含有GM-CSF(2000U/mL)、IL-2(500U/mL)、IL-7(200U/mL)、IL-12(200U/mL)、IFN-γ(500U/mL)和CD80抗体(10ng/mL)和CD40抗体(20mg/mL)。
(5)基于抗原提呈细胞的纳米粒子的制备
通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和B细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超声2分钟。然后将样品在3000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在5000g离心10分钟后收集上清液，将上清液通过0.45μm的膜过滤后使用超滤膜(截留分子量50KDa)超滤离心过滤和浓缩，将过滤和浓缩后的样品与步骤(2)制备的纳米粒子混合后使用高压均质机(10000bar)处理3分钟，然后在13000g离心30分钟后弃去上清液收集沉淀，将沉淀在PBS中重悬后即得纳米粒子，纳米粒子粒径为300纳米。
(6)癌细胞特异性T细胞的制备
选取6-8周的雌性C57BL/6小鼠，第0天在后背部皮下接种2×106个MC38结肠癌细胞，在第14天和第28天分别皮下注射100μL含0.4mg PLGA的纳米粒子(负载裂解物组分、混合佐剂及增加溶酶体逃逸的物质)。在第32天处死小鼠,摘取小鼠肿瘤组织和收集小鼠外周血。将小鼠肿瘤组织制备成肿瘤组织单细胞悬液；从小鼠外周血中分离PBMC，然后将肿瘤组织单细胞悬液和PBMC混合，然后使用流式细胞术从上述混合细胞中分选出CD3+CD8+T细胞和分选出CD3+CD4+T细胞。将分选得到的CD8+T细胞(20万个)、CD4+T细胞(10万个)、抗原提呈细胞制备的纳米粒子(50μg)、B细胞(100万个)以及IL-7(10ng/mL)在2mL RPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃，5％CO2)，然后采用流式细胞术分选孵育后的CD8+T细胞中的CD8+CD69+T细胞以及CD4+T细胞中CD4+CD69+T细胞，即为可识别癌细胞全细胞抗原的癌细胞特异性T细胞。将上述分选得到的CD8+CD69+T细胞或者CD4+CD69+T细胞分别与IL-2(1000U/mL)、IL-12(1000U/mL)、IL-15(1000U/mL)以及αCD-3抗体(10ng/mL)在RPMI1640完全培养基中共孵育14天(每两天换液一次)以扩增癌细胞特异性T细胞。
(7)癌细胞特异性T细胞用于治疗癌症
选取6-8周的雌性C57BL/6为模型小鼠制备结肠癌小鼠。在第0天给每只小鼠背部右下方皮下接种2×106个MC38细胞。在接种结肠癌细胞后第6天、第9天、第12天、第15天、第20天和第25天分别静脉注射80万个CD8+癌细胞特异性T细胞和40万个CD4+癌细胞特异性T细胞；或者在上述天数注射120万个CD8+癌细胞特异性T细胞。小鼠肿瘤生长和生存期监测方法同上。
(8)实验结果
如图14所示，与对照组相比，纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米粒子辅助分离扩增得到的癌细胞特异性T细胞处理小鼠后其肿瘤生长速度明显变慢且小鼠生存期明显延长。而且，同时使用抗原提呈细胞制备成的纳米粒子辅助分离和扩增得到的CD8+T细胞和CD4+T细胞好于只使用纳米粒子辅助分离和扩增得到的CD8+T细胞。而且，负载混合佐剂、裂解物组分和溶酶体逃逸物质的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备成的纳米粒子辅助分离的癌细胞特异性T细胞效果好于负载裂解物组分、两种CpG佐剂和溶酶体逃逸物质的纳米粒子。由此可见，本发明所述的癌细胞特异性T细胞对癌症具有优异治疗效果。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种由粒子激活的抗原提呈细胞制备的癌症T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将抗原提呈细胞与第一粒子共孵育，得到激活后的抗原提呈细胞；其中，第一粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S2、将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分制备成纳米囊泡；或将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分与第二粒子共作用，使所述细胞膜组分负载于第二粒子上，得到负载细胞膜组分的粒子；其中，第二粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S3、将S2所述的纳米囊泡和/或负载细胞膜组分的粒子与含有T细胞的免疫细胞共孵育，将其中可以识别癌细胞抗原的癌细胞特异性T细胞激活，再分选出该部分被激活的癌细胞特异性T细胞，得到所述癌症T细胞疫苗。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，共孵育体系中含有抗原提呈细胞、细胞因子和抗体中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，分选出被激活的癌细胞特异性T细胞之后，还包括对所述癌细胞特异性T细胞进行体外扩增的步骤；所述的分选为利用T细胞被激活后细胞表面高表达的标志物对所述癌细胞特异性T细胞进行筛选，所述的体外扩增为将所述癌细胞特异性T细胞与细胞因子和/或抗体共孵育。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，共孵育体系中含有细胞因子和/或抗体。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述抗原提呈细胞选自树突状细胞、B细胞和巨噬细胞中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一粒子或第二粒子还负载有细菌裂解组分和/或细菌外囊泡裂解组分，所述细菌裂解组分和/或细菌外囊泡裂解组分经含有裂解剂的裂解液裂解细菌和/或细菌外囊泡得到；所述裂解剂选自尿素、盐酸胍、脱氧胆酸盐、十二烷基硫酸盐、甘油、蛋白质降解酶、白蛋白、卵磷脂、Triton、吐温、氨基酸、糖苷和胆碱的水溶液中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述第一粒子或第二粒子还负载有免疫增强佐剂。
8.权利要求1-7任一项所述的制备方法制备得到的癌症T细胞疫苗。
9.权利要求8所述的癌症T细胞疫苗在制备用于治疗或预防癌症药物中的应用。
10.一种体外激活癌细胞特异性T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将抗原提呈细胞与第一粒子共孵育，得到激活后的抗原提呈细胞；其中，第一粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S2、将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分制备成纳米囊泡；或将激活后的抗原提呈细胞的细胞膜组分与第二粒子共作用，使所述细胞膜组分负载于第二粒子上，得到负载细胞膜组分的粒子；其中，第二粒子负载肿瘤组织和/或癌细胞全细胞组分；
S3、将S2所述的纳米囊泡和/或负载细胞膜组分的粒子与含有T细胞的细胞共孵育，分选出被激活的癌细胞特异性T细胞。
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