CN108607094A - 由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的t细胞疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的t细胞疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了由基因工程化的人造抗原提呈细胞aAPC的分泌小体囊泡，exosome所构建的T细胞疫苗的制备及应用。本发明通过转染两种真核表达质粒载体pcDNAHLA‑A2、pcDNACD80和感染两种重组腺病毒载体AdVGag、AdV41BBL，构造了一种基因工程化的K562A2/Gag/CD80/41BBLaAPC。然后通过差速超高速离心法从K562A2/Gag/CD80/41BBL培养上清液中纯化exosomes，并进行电子显微镜和免疫印迹分析。这些exosomes通过孵育和Con‑A刺激的HLA‑A2转基因小鼠的非特异性T细胞共孵育而构建了具有HLA‑A2限制性的和Gag特异性的Gag‑Texo疫苗。本发明用无限来源的不断生长的人工抗原提呈细胞aAPCK562A2/Gag/CD80/41BBL囊泡替换有限来源的DC囊泡用于制备HIV‑1Gag特异性T细胞疫苗。这种新颖的使用基因工程化抗原提呈细胞的囊泡制备T细胞疫苗的方法将对HIV‑1患者临床治疗性疫苗的研制具有重要的影响。

Description

由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细 胞疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法及应用。
背景技术
人类免疫缺陷病毒-I型(HIV-I)感染病人的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，是一种迅速扩大的全球大流行性疾病。有效的抗病毒疗法(HAART)能成功抑制病毒的复制，显著改善病人的预后[1]。然而，它不能恢复抗HIV-1免疫反应。在炎症慢性期的药物治疗并不能逆转由病毒引起的CD4+T细胞和CD8+效应T细胞的衰退，从而导致HIV-1病毒的潜伏[2]。因此，迫切发展在药物间断治疗过程中提高对病毒控制的新治疗策略具有现实意义，从而使病人可避免对药物的长期使用，进而减少其毒性和治疗成本。
树突状细胞(DC)是体内最有效的抗原提呈细胞(APC)。他们已被用作疫苗在动物模型[3]和艾滋病患者临床试验[4,5]中刺激HIV特异性CTL反应。在这些试验中发现，安全状况良好，仅有轻微的局部副作用。然而，可能是由于缺陷的免疫系统如CD4+T细胞的帮助不足，由DC疫苗引起的HIV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的反应通常仅能低效率控制艾滋病患者的进展，因而需要探索一种更有效的HIV特异性治疗性细胞疫苗。
我们以前通过Con-A刺激的非特异性T细胞摄取重组Gag表达腺病毒(AdVGag)感染的DC(DCGag)所释放的分泌小体(囊泡)EXOGag，开发了HIV-1 Gag蛋白特异性树突状细胞(DC)分泌小体亦称囊泡(exosomes；EXO)靶向的T细胞(Gag-Texo)疫苗，并表明Gag-Texo相较DC疫苗能够不依赖宿主CD4+T细胞的帮助而刺激CTL反应并能逆转CD4+25+FoxP3+调节性T细胞的免疫抑制，从而能更有效的刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和治疗性免疫反应[6]。为了提高其免疫原性，我们进一步构造了4-1BBL表达的Gag-Texo疫苗，并证明了它具更有效的诱导HLA-A2转基因小鼠的CTL反应和治疗性抗肿瘤免疫[7]。我们最近的研究表明，Gag-Texo疫苗能通过CD40L-mTORC1途径抵抗慢性炎症介导的T细胞无能和逆转CTL耗竭[8]，提示我们的Gag-Texo新疫苗可能成为治疗性HIV-1疫苗。然而，获得大量自体树突状细胞的技术难点显著限制了DCs或DC释放的囊泡在临床免疫治疗中的应用[9,10]。当然亦将限制DC释放的囊泡所构造的囊泡靶向的T细胞疫苗在临床免疫治疗的应用。
作为一种替代策略，以人肿瘤细胞为基础的人工抗原提呈细胞(aAPC)系统目前已经发展并且广泛用于作扩增用于免疫治疗的肿瘤特异性CTLs，其中缺乏内源性表达HLA-A、B和DR分子的人红白血病K562细胞株是最常用的aAPC[11]。因其CD54和LFA-3的表达有助于形成一个有效的免疫突触促进T细胞活化[11,12]，而其缺乏内源性表达HLA-A，B和DR分子从而限制其同种异体T细胞刺激所引起的副作用。K562细胞经由基因工程化表达HLA-A、肿瘤抗原、其他免疫分子等已经发展为一种用于扩增用于临床免疫治疗的抗原非特异性或特异性T细胞的人工APC[13,14]。
发明内容
为了解决上述存在的问题，
本发明的第一个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗。
本发明的第二个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法
本发明的第三个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗在制备抗慢性病毒性炎症、抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。
本发明的第四个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体及其制备方法。
本发明的第五个目的在于提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及其制备方法。
本发明的技术方案如下：
由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体亦称囊泡(exosome；EXO)所构建的T细胞疫苗，包含治疗有效量的由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及药用载体；
所述由基因工程化的一种特殊的人造抗原提呈细胞通过载体将基因转染到K562细胞而达到基因工程的转化，所述载体可以包括真核质粒载体和/或病毒载体；
所述分泌小体由所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌；
所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞。
所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞，其有如下步骤制备而成：通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL。
根据本发明所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，所述K562细胞也可经由lentiviral载体将多个转基因转染从而形成K562A2/Gag/CD80/41BBL，由K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO制备的EXO靶向T细胞疫苗可用于治疗HIV-1病人；
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有肿瘤抗原在内的多个转基因转染。从而形成基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗肿瘤的病人；
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有不同类别的组织相容抗原复合体在内的多个转基因转染，从而形成工程基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗相应的HLA-A1+，或HLA-A2+，或HLA-A3+的病人。
本发明还提供一种上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体。
本发明还提供一种上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体及其制备方法，通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL，由APCK562A2/Gag/CD80/41BBL分泌的小体。
本发明还提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞；所述分泌小体由上述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌。
本发明还提供一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞的制备方法。
本发明还提供一种所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；
(2)将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染K562细胞后，并用腺病毒载体AdVGag和AdV41BBL再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL；
(3)通过构建的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL所释放的分泌小体(EXOs)与Con-A刺激的HLA-A2转基因小鼠的非特异性的CD8+T细胞共孵育从而构建了HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗。
本发明还提供一种所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，所述pcDNANeo/CD80和pcDNAHygro/HLA-A2的构建编码HLA-A2α链和CD80 DNA片段分别插入CMV启动子驱动的pcDNAHygro、pcDNANeo真核表达质粒载体。
本发明还提供一种所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，所述腺病毒载体为HIV-1 Gag表达的AdVGag、41BBL表达的AdV41BBL；Gag和41BBL cDNA片段分别插入pShuttle载体。然后将载体转染到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183Ecoli细菌进行同源性的DNA重组从而形成重组腺病毒质粒载体。然后将Gag和41BBL表达的腺病毒质粒载体再转染293细胞从而生成Gag和41BBL表达的腺病毒AdVGag和AdV41BBL。
本发明还提供一种所述基因工程化的人造抗原提呈细胞的制备方法，包括如下步骤：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染K562细胞后，再用腺病毒载体感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL。
所述基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)ConA激活的非特异的CD8+T细胞的制备：在含有IL-2和ConA的RPMI1640培养基中培养脾脏细胞，分离得到ConA激活的CD8+T细胞，
(2)囊泡的制备：将基因工程化的人造提呈细胞K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞在无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到囊泡沉淀物，
(3)ConA激活的CD8+T细胞对所述囊泡的摄取：在含有IL-2的AIM-V培养基中，将步骤(1)所得的CD8+T细胞与步骤(2)所得的囊泡共培养，以利于囊泡被T细胞所摄取，从而得到所述囊泡的ConA激活的CD8+T细胞疫苗。
本发明还提供一种所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗或所制备的T细胞疫苗在制备抗慢性病毒性炎症、抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。
本发明中，我们提出了构造HIV-1 Gag特异性人工APC释放的囊泡靶向的T细胞疫苗，并在HLA-A2转基因小鼠中评估其Gag特异性的免疫反应。我们通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2。我们将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染K562细胞后，并用以前构建的腺病毒载体(HIV-1Gag表达的AdVGag、41BBL表达的AdV41BBL)再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL。为检测其免疫原性，我们用K562A2/Gag/CD80/41BBL人工APC免疫HLA-A2转基因小鼠。通过流式细胞仪检测发现该疫苗能诱导HLA-A2转基因小鼠CTL反应，并引起对HLA-A2/Gag表达的BL6-10A2/Gag肿瘤免疫保护反应。我们进一步通过构建的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL所释放的EXOs与Con-A刺激的HLA-A2转基因小鼠的非特异性的CD8+T细胞共孵育从而构建了HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗。我们结果表明Gag-Texo疫苗在HLA-A2转基因小鼠中能够诱导CTL反应和对BL6-10A2/Gag肿瘤的抗肿瘤免疫反应。
本发明公开的由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备及应用。人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢性感染导致每年数百万的人死亡。我们以前开发了一种新型的HIV-1 Gag蛋白特异性树突状细胞(DC)所释放的分泌小体(囊泡)(EXO)靶向的T细胞(Gag-Texo)疫苗，并表明Gag-Texo较DC疫苗能够刺激更有效的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应[6]。然而，要获得大量自体DC成为技术难点，从而限制了DC释放的囊泡在临床免疫治疗中的应用。作为一种替代策略，一种缺乏内源性表达HLA-A、B和DR分子的人红白血病K562细胞株通过基因工程化表达HLA-A2和其他免疫分子，已被用作一种人工抗原提呈细胞(aAPC)进行体外扩增用于临床免疫治疗的肿瘤特异性CTLs。在这项研究中，我们通过转染两种真核表达质粒载体pcDNAHLA-A2、pcDNACD80和感染两种重组腺病毒载体AdVGag、AdV41BBL，构造了一种基因工程化的K562A2/Gag/CD80/41BBL aAPC。为评估其表型，我们进行了流式细胞仪、免疫印迹分析。我们证明K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞表达转基因HLA-A2、Gag、CD80、41BBL分子。然后通过差速超高速离心法从K562A2/Gag/CD80/41BBL培养上清液中纯化囊泡EXOs，并进行电子显微镜和免疫印迹分析。我们的数据表明，EXOs具有50-100纳米直径的“飞碟”或圆形状，并包含EXO相关标志物CD9和LAMP-1。这些EXOs通过孵育和Con-A刺激的HLA-A2转基因小鼠的非特异性T细胞共孵育而构建了具有HLA-A2限制性的和Gag特异性的Gag-Texo疫苗。为评价疫苗的免疫原性，HLA-A2转基因小鼠被接种Gag-Texo。我们的结果证明，Gag-Texo疫苗在HLA-A2转基因小鼠中能够诱导CTL反应和对表达HLA-A2/Gag的BL6-10A2/Gag肿瘤具有免疫保护反应。综上所述，本研究证明用无限来源的不断生长的人工抗原提呈细胞(aAPC)K562A2/Gag/CD80/41BBL囊泡替换有限来源的DC囊泡用于制备HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗。这种新颖的使用基因工程化抗原提呈细胞的囊泡制备T细胞疫苗的方法将对HIV-1患者临床治疗性疫苗的研制具有重要的影响。
发明详述
本发明显示了活化的非特异性T细胞能获取从基因工程化人工抗原提呈细胞所衍生的囊泡，特别是这些细胞能从囊泡获取抗原特异性的组织相容复合体和共同刺激分子。本发明显示了这些从囊泡获取的分子是具有功能性的。这样囊泡靶向的非特异性T细胞就能直接地刺激抗原特异性的免疫反应。
本发明显示了基因工程化人工抗原提呈细胞来源于缺乏内源性表达HLA-A、B和DR组织相容符合体的K562细胞。K562细胞先由两个真核表达质粒载体pcDNAHygro/HLA-A2和
pcDNANeo/CD80转染。然后再由两个腺病毒载体AdVGag和AdV41BBL转染，形成表达转基因HLA-A2、CD80、Gag和41BBL的基因工程化抗原提呈细胞K562A2/Gag/CD80/41BBL。
K562细胞也可经由lentiviral载体将多个转基因转染从而形成K562A2/Gag/CD80/41BBL。由K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO制备的EXO靶向T细胞疫苗可用于治疗HIV-1病人。
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有肿瘤抗原(CEA,CA125)在内的多个转基因转染。从而形成基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗肿瘤的病人。
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有不同类别的组织相容抗原复合体(比如HLA-A1，HLA-A2，HLA-A3等)在内的多个转基因转染，从而形成工程基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗相应的HLA-A1+，或HLA-A2+，或HLA-A3+的病人。
本发明也相应的提供了一种制备囊泡靶向的T细胞的方法。其中包括将工程化的人工抗原提呈细胞所衍生的囊泡和活化的非特异性T细胞在一定的条件下接触，以利于囊泡被非特异性T细胞所获取。
活化的非特异性的T细胞包括活化的非特异性的CD8+或CD4+T细胞或其他免疫细胞。
活化的非特异性的T细胞不但可用于摄取抗原特异性的囊泡,还可进一步基因工程化表达其他免疫分子以增加疫苗的免疫反应。
术语“囊泡”是指直径50-90nm的细胞膜囊泡。在本发明中，囊泡是指来源于基因工程化的人工抗原提呈细胞。这类囊泡具有抗原递呈能力和粘附分子，共同刺激分子。这些包括有抗原特异性的组织相容性复合体，CD80和41BBL等。
术语“肿瘤细胞来源的囊泡”是指制备及纯化由肿瘤细胞衍生的囊泡。工程化抗原提呈细胞的培养液通过离心去除细胞和细胞碎片，然后再离心获得囊泡。
术语“囊泡靶向的T细胞”是指获取囊泡的T细胞。它们能直接从囊泡获取组织相容性复合体和共同刺激分子，从而能刺激免疫反应。
术语“在一定条件下以利于T细胞获取囊泡”是指工程化的抗原提呈细胞衍生的囊泡和T细胞接触一边T细胞获取囊泡，同时抗原递呈的功能和共同刺激分子也从囊泡被转移到T细胞。具体来讲，T细胞(1×106)和囊泡(5-10ug)在含有IL-2的培养液，37摄氏度下培养4小时。期间每20-30分钟将细胞摇匀一次。应当指出，许多因素包括温度、细胞浓度、囊泡浓度、培养液的成分等均能影响T细胞对囊泡的最佳获取。
术语“增强免疫反应”是指增强在一个动物体内的免疫反应，具体的来说就是细胞毒性的T淋巴细胞的反应。这种免疫反应通常可用免疫检测方法来测试。比如说可用体内和体外CD8+T细胞增殖试验方法来检测。再举例来说可用体内和体外CD8+T细胞毒性试验方法来检测。
具体来说，囊泡导向的树状细胞和T细胞可被单独用来增强机体免疫系统进而治疗或预防一种疾病特别是细胞毒性T淋巴细胞反应。这些EXO靶向T细胞疫苗也可和其他免疫治疗方法进行联合治疗。
术语“治疗有效量”是指有效的剂量和打到所期望治疗结果所需要的治疗时间。本发明所述的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL和T细胞的有效剂量可能随如下一些因素而改变。其中包括疾病的临床期，年龄，性别，动物的重量。剂量也可随最佳治疗的反应而调整。举例来说，可将一个剂量分开在同一天里使用，剂量也可根据治疗情况进行适当调整。
为了更适合体内的使用，本发明所述的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL和T细胞还可与其他药物成分组成复合剂。
本发明的有益效果是：使用非特异性T细胞通过获取抗原特异性EXO制备抗原特异性T细胞疫苗克服了当前运用T细胞为基础的免疫治疗的第一个瓶颈，即大量制备抗原特异性T细胞的困难。而运用基因工程化抗原提成细胞释放的EXO去代替有常规触突细胞的EXO所构造的EXO靶向T细胞疫苗又克服了第二瓶颈，即大量制备抗原特异性EXO的困难。从而使这种新颖的T细胞疫苗服务于临床成为可能。比如使用Gag表达的EXO制备的T细胞疫苗可用于HIV-1病人，而使用HLA-A1表达的EXO制备的T细胞疫苗可用于HLA-A1+病人的治疗,而使用HLA-A1/Gag表达的EXO制备的T细胞疫苗可用于HLA-A1+HIVA-1病人的治疗。
附图说明
图1.Gag特异性人工APC细胞的表型分析。
(A)表达载体pcDNANeo-CD80和pcDNAHygro-HLA-A2构建示意图。
(B)K562来源的基因工程化的人工APC(实线)和K562细胞(虚线)用抗原特异性抗体染色，并流式细胞仪检测分析转基因CD80、HLA-A2和41BBL的表达。K562来源的人工APC用对照同型匹配的不相关抗体(灰色阴影)染色，然后用流式细胞仪分析。
(C)K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞裂解物免疫印迹分析Gag的表达。两次实验的一次代表性实验结果显示。
图2.K562A2/Gag/CD80/41BBL疫苗刺激Gag特异性抗肿瘤免疫反应。
(A)转基因HLA-A2小鼠静脉注射K562A2/Gag/CD80/41BBL或与对照组的K562A2/CD80/41BBL(K562A2)疫苗细胞。免疫6天后，用流式细胞仪检测免疫小鼠的尾静脉血液样本。每组值代表活化的CD44+CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的百分比。括号中的值表示标准差。*P<0.05与对照组的比较。
(B)在另一组实验中，小鼠免疫6天后，静脉注射B6-10A2/Gag细胞。3周后处死小鼠。收集肺标本并计数黑色肿瘤转移性结节。*P<0.05与对照组比较。
(C)肺组织的H/E染色。放大倍率，100倍。两次实验的一次代表性实验结果显示。
图3.K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的囊泡靶向的T细胞为基础的疫苗Gag-Texo刺激Gag特异性抗肿瘤免疫反应。
(A)K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的囊泡EXO生成及分析流程图。
(B)EXO电镜分析图。
(C)免疫印迹分析EXO标记物CD9、LAMP-1。
(D)Gag-Texo制备和刺激HLA-A2转基因小鼠的抗肿瘤免疫流程图。
(E)Gag-Texo或对照组的无EXO摄取的ConA-T细胞静脉注射,免疫HLA-A2转基因小鼠。小鼠免疫6天后，用流式细胞仪检测免疫小鼠的尾静脉血液样本。每组值代表活化的CD44+CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的百分比。
(F)在另一组实验中，小鼠免疫6天后，静脉注射B6-10A2/Gag细胞，然后肿瘤挑战3周后处死。收集肺标本并计数黑色肿瘤转移性结节。*P<0.05与对照组比较。
(G)肺组织的H/E染色。放大倍率，100倍。两次实验的一次代表性实验结果显示。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合附图和实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
材料与方法
试剂、细胞系和动物
FITC标记的抗CD8、CD80、HLA-A2和41BBL抗体；PE标记的抗CD44，兔抗CD9和兔抗LAMP-1抗体从BD Bioscience(Missisauga,ON,Canada)购买；兔抗HIV-1 Gag p24抗体从Thermo Scientific购买(Burlington,ON,Canada)；重组HIV-1 Gag、41BBL表达腺病毒AdVGag、AdV41BBL由我们实验室以前制备[7]；缺乏内源性表达HLA-A、B和DR分子的人红白血病K562细胞株[11,15]从ATCC(ATCC,Rockville,MD)购买；Gag/HLA-A2表达的BL6-10A2/Gag肿瘤细胞由我们实验室以前构建[6]；转基因(Tg)HLA-A2小鼠从Jackson实验室(Bar,Harbor,MA)购买。
一、一种工程化人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL的制备及其免疫原性的研究
K562细胞不表达human leukocyte antigen(HLA)-A、B和DR分子和共刺激41BBL分子，很弱表达共刺激分子CD80分子[12]。然而这些分子是T细胞活化的关键的APC分子[7]。
用RNA试剂盒从CD中抽提总RNA，利用RT-PCR法从DC细胞的cDNA文库中用PFU酶克隆一段1000bp的鼠CD80分子开放可译框架的cDNA片段。PCR的上下游引物分别为：上游引物：5，ctcca ttggc tctag attcc-3，；下游引物：5，cctca tgagc cacat aatac-3，。克隆的CD80 cDNA片段连接到pCR2.1载体上，形成pCR2.1/CD80，cDNA片段用双脱氧核苷酸法测序后将CD80基因酶切后(HindⅢ/Xbal)克隆到pcDNA3.1Neo质粒上(Invitrogen Inc)，形成表达载体pcDNANeo-CD80。HLA-A2α链cDNA片段从M13-HLA-A2质粒中将HLA-A2基因酶切(Sal Ⅰ/HindⅢ)后克隆到pcDNA3.1Hygro质粒上(Invitrogen Inc)，形成表达载体pcDNAHygro-HLA-A2。编码HLA-A2α链和CD80DNA片段分别插入CMV启动子驱动的pcDNAHygro、pcDNANeo真核表达质粒载体。K562通过脂质体lipofectamine2000(Invitrogen Inc)依次转染pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLAA2后分别在含G418(5mg/ml)和潮霉素(5mg/ml)的培养基中筛选。所选择的肿瘤细胞K562A2/CD80维持在含G418(0.5mg/ml)和潮霉素(0.5mg/ml)的培养基中培养。
用RNA试剂盒从CD中抽提总RNA，利用RT-PCR法从DC细胞的cDNA文库中用PFU酶克隆一段～1100bp的鼠41BBL分子开放可译框架的cDNA片段。PCR的上下游引物分别为：上游引物：5，atgga ccagc acaca cttga-3，；下游引物：5，tcatt cccat gggtt gtcgg-3，。克隆的41BBL cDNA片段连接到pCR2.1载体上，形成pCR2.1/41BBL，cDNA片段用双脱氧核苷酸法测序后将41BBL基因酶切后(KpnⅠ/HindⅢ)克隆到pShuttle载体(Strategene Inc)。然后将载体转染到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183Ecoli细菌进行同源性的DNA重组从而形成重组腺病毒质粒载体。Gag cDNA片段从含有Gag片段的p89.6质粒(NIH,AIDS ResearchReference Reagent Program,Bethesda,MD,USA)中，用酶切(SalⅠ/HindⅢ)后，将Gag片段(Sal Ⅰ/HindⅢ)插入pShuttle载体。然后将载体转染到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183Ecoli细菌进行同源性的DNA重组从而形成重组腺病毒质粒载体。然后将Gag和41BBL表达的腺病毒质粒载体由PacⅠ酶切线性化后再通过脂质体lipofectamine2000(Invitrogen Inc)依次再转染293细胞从而生成Gag和41BBL表达的腺病毒AdVGag和AdV41BBL。腺病毒AdVGag和AdV41BBL分别从感染的293细胞经过裂解后，通过cesium chlorideutracentrifugation高速离心获得提纯并保存在-80℃。
K562A2/CD80转基因肿瘤细胞进一步分别在multiplicities of infection(MOI)200的情况下，即在200plague fecming unif(PFU)AdV/细胞的比例下感染AdVGag和AdV41BBL形成基因工程化的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL。
Western blot分析
细胞裂解物(10μg/泳道)行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并随后转移至硝酸纤维素膜(Millipore,Bedford,MA)。膜与奥德赛封闭液封闭(Li-CORBioscience,Lincoln,NE)后，分别与兔抗Gag抗体孵育，然后再用抗兔IRDyeR800CW二抗孵育，最后按照制造商的指示使用奥德赛扫描仪进行扫描。
流式细胞仪分析
为评估转基因表达，K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞先用抗CD80、HLA-A2和41BBL抗体染色，然后再用流式细胞仪分析。
为评估K562A2/Gag/CD80/41BBL刺激的CTL免疫反应，K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞免疫的HLA-A2转基因小鼠,在免疫6天后收集外周血，按以前我们所描述的方法[7]，经FITC标记的抗CD8抗体和PE标记的抗CD44抗体染色，然后用流式细胞仪检测和分析CTL反应。
动物实验
在动物实验中，我们使用转基因HLA-A2小鼠。为检测K562A2/Gag/CD80/41BBLGag特异性的抗肿瘤免疫反应，分别用10,000rad所照射的K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞(2×106细胞/小鼠)和不表达Gag的对照K562A2/CD80/41BBL细胞(2×106细胞/小鼠)由尾静脉注射到HLA-A2转基因小鼠体内(n＝4)[7]。免疫6天后，取鼠尾静脉血，然后如上所述用流式细胞仪分析CTL反应。
1.人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL的获得及其表型
为构建一种Gag特异性的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL，K562细胞先被转染HLA-A2α链和CD80表达载体pcDNAHLA-A2和pcDNACD80(图1A)，然后再用重组腺病毒载体AdVGag和AdV41BBL去感染K562细胞。为评估感染后的K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞中转基因编码分子的表达，我们采用流式细胞仪、免疫印迹分析。我们使用抗HLA-A2、CD80、41BBL及Gag抗体染色证明了K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞表达所有转基因编码分子，包括细胞表面HLA-A2，CD80和41BBL分子(图1B)以及细胞内Gag分子(图1C)
2.评估K562A2/Gag/CD80/41BBL介导的CTL和抗肿瘤免疫反应
为评估潜在的免疫原性，我们用人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL(2×106细胞/小鼠)尾静脉免疫HLA-A2转基因小鼠。免疫6天后，采集鼠尾静脉血用F5TC-CD8和PE-CD44，我们用流式细胞仪测量了外周血CD8+CD44+T细胞反应[15]。在K562A2/Gag/CD80/41BBL免疫的小鼠外周血中表现出占总的CD8+T细胞44％的CD8+CD44+T细胞，而没有Gag表达的K562A2/CD80/41BBL免疫的小鼠外周血中只占26％CD8+CD44+T细胞(图2A)。结果提示，K562A2/Gag/CD80/41BBL能够刺激HLA-A2转基因小鼠体内的CD8+T细胞的免疫反应。
在另一组动物实验中，为检测K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞所引起的Gag特异性的抗肿瘤免疫反应。被K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞所免疫的小鼠在免疫6天后，将HLA-A2/Gag表达的BL6-10A2/Gag肿瘤细胞由尾静脉注射(0.5×106/小鼠)[7]。肿瘤细胞注射后3周处死小鼠，并以一种对实验组别盲视的方式计数肺转移瘤的克隆数。新鲜分离的肺组织出现转移表现为离散的黑色素性病灶，很容易和正常肺组织区别，并通过组织学检查证实。太多计数的转移灶被分配一个任意值>100[7]
我们的结果表明，Gag表达的K562A2/Gag/CD80/41BBL免疫能够保护所有的小鼠(4/4)免于BL6-10A2/Gag肿瘤肺转移、生长，而不表达Gag的K562A2细胞免疫没有任何保护作用(图2B)。BL6-10A2/Gag的肺转移、生长进一步通过组织病理学分析得到证实(图2C)。这样我们的数据进一步表明，K562A2/Gag/CD80/41BBL刺激的CTL反应是Gag特异性，能够引起对Gag表达的BL6-10A2/Gag肿瘤的抗肿瘤免疫反应。这与以往的报道，MHC-Ig人工APC在小鼠体内能有效扩增过继性肿瘤特异性CD8+T细胞[17]和K562细胞疫苗能增强CAR-T的抗肿瘤效应[18]相一致。
二、囊泡制备及分析
为了避免常规培养细胞所使用的牛血清(Fetal calf seum)中所含有的非特异性囊泡，人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL生长在包含有G418(0.5mg/ml)和潮霉素(0.5mg/ml)的无血清AIM-V培养液(Invitrogenl,Calsbad,USA)中。为提纯细胞培养液中的囊泡，细胞过夜生长的培养液分别进行三级离心；(1)1200×g离心20分钟以去除细胞；(2)10000×g离心30分钟以去除细胞碎片；(3)100000×g离心1小时以沉淀囊泡。所得囊泡沉淀用PBS缓冲液洗涤2遍后再用100000×g离心1小时后回收。回收所得囊泡用Bradford axlxlag来定量[6]；
人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的囊泡(EXOs)通过差速超高速离心法从其培养上清液中纯化，并且命名为EXOGag。
电镜分析
囊泡用4％多聚甲醛固定后，加在碳包被的福尔瓦网格。囊泡样品加载的网格与饱和水铀染色，然后行JEOL 1200EX电子显微镜(60kV)观察。
Western blot分析
囊泡(10μg/泳道)行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，并随后转移至硝酸纤维素膜(Millipore,Bedford,MA)。膜与奥德赛封闭液封闭(Li-CORBioscience,Lincoln,NE)后，分别与抗CD9、抗LAMP-1抗体孵育，然后再用抗兔IRDyeR800CW二抗孵育，最后按照制造商的指示使用奥德赛扫描仪进行扫描。
囊泡的分析
我们通过差速离心法从K562A2/Gag/CD80/41BBL培养上清液中纯化K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的EXOs(EXOGag)(图3A)。我们通过电镜分析，发现这些纯化的EXO具有典型的胞外体的直径为50-100nm的“飞碟”或圆形状(图3B)[19]。为了进一步对EXOGag表型分析，我们进行免疫印迹分析。我们在我们制备的EXOGag样本中检测到EXO标记物CD9和LAMP-1(图3C)[19]，确认它们是EXOs。
三、Gag-Texo的制备及免疫原性的分析
HLA-A2转基因小鼠的脾细胞在含IL-2(20U/ml)和Con-A(1μg/ml)的培养基中培养3天。Con-A活化的非特异性CD4+T(Con A-T)用抗小鼠CD4磁珠(DYNAL Inc.,Lake Success,NY)正性选择纯化。Gag-Texo疫苗的制备正如我们以前所描述的通过CD4+Con A-T细胞与EXOGag共孵育[16]。具体来说，Con-A活化的非特异性CD4+T细胞(1×106)在含有5-10ugEXOGag的0.5-1.0ml培养液中，37摄氏度下培养4小时，期间每20-30分钟将细胞摇匀一次，4小时后，将细胞离心而成Gag-Texo细胞(图3D)。
动物实验
在动物实验中，我们使用转基因HLA-A2小鼠。为检测K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO靶向T细胞疫苗Gag-Texo所引起的Gag特异性的CTL反应和保护性抗肿瘤免疫反应，Gag-Texo(2×106细胞/鼠)和对照非特异性的ConA-T细胞(2×106细胞/鼠)由由尾静脉注射到HLA-A2鼠体内[7]。免疫小鼠在6天后，HLA-A2/Gag表达的小鼠B16黑色素BL6-10A2/Gag肿瘤细胞由尾静脉注射(0.5×106/小鼠)[7]。肿瘤细胞注射后3周处死小鼠，并以一种对实验组别盲视的方式计数肺转移瘤的克隆数。新鲜分离的肺组织出现转移表现为离散的黑色素性病灶，很容易和正常肺组织区别，并通过组织学检查证实。太多计数的转移灶被分配一个任意值>100[7]。
统计分析
统计分析采用Prism软件(GraphPad Software,San Diago,CA)，用Mann-WhitneyU检验进行比较动物实验的不同组别间的差异和采用Student t检验进行比较流式细胞仪分析的不同组别间的差异[7]。p<0.05的值被认为有统计学意义。
1.评估K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的EXO靶向的T细胞疫苗Gag-Texo介导的CTL和抗肿瘤免疫反应
为评估其潜在的免疫原性，我们用类似的方法即用Gag-Texo去免疫HLA-A2转基因小鼠，然后检测小鼠体内的Gag-Texo疫苗刺激的CTL反应和抗肿瘤免疫反应。我们发现，Gag-Texo免疫的小鼠外周血中CD8+CD44+CTLs占总CD8+T细胞达35％，而对照Con A-T免疫的小鼠外周血中只占24％CD8+CD44+CTLs(图3E)。并且揭示Gag-Texo而不是Con A-T疫苗能保护所有的小鼠(4/4)免于Gag表达的BL6-10A2/Gag肿瘤肺转移、生长(图3F)。在Con A-T免疫的小鼠中，BL6-10A2/Gag的肺转移、生长进一步通过组织病理学分析得到证实(图3G)。综上所述，我们的结果提示，我们新型的Gag特异性的人工APC释放的EXOGag靶向的T细胞疫苗Gag-Texo能够在HLA-A2转基因小鼠中刺激Gag特异性CTL反应及其介导的抗肿瘤免疫反应。
讨论
将体外扩大T细胞用于临床免疫治疗的人工APC系统包括以细胞或以磁珠为基础的APC。以细胞为基础的APC一般是用人肿瘤细胞如用基因重组表达HLA-A2、肿瘤抗原和其他重要免疫分子的K562细胞[20]，而基于磁珠的APC是包被有抗原肽/MHC重要免疫分子和抗体的聚苯乙烯或聚乙交酯(PLGA)磁珠[21,22]。虽然以磁珠为基础的人工APC很容易制备，并能良好控制信号传递和有效扩增T细胞[23]，但这种方法仍然存在一些缺点。例如，T细胞和磁珠的相互作用和表面结合的抗体提供的信号不完全等同于T细胞和自然APC之间发生的作用，进而很难控制所扩增T细胞的质量[24]。相反，以细胞为基础的APC如K562在扩增T细胞方面具有所需的抗原特异性、并能提供现成的用于临床的免疫制剂等引人注目的优势。APC、细胞因子和其他药理性调节物的选择及其对T细胞扩增的评估，可潜在给予或保留某种执行程序使T细胞输入体内后能以所想要的方式在体内长期存活、行使功能和迁移[20]。
K562细胞最近被应用于扩增肿瘤特异性T细胞的免疫治疗。例如，K562细胞被转导的HLA-A0201与其他重要的免疫分子如CD54、CD58、CD80、CD83[12]；CD80、CD83、Mart[25]，进而能有效地在体外扩增而成为临床肿瘤免疫治疗的CTLs。由于K562细胞缺乏HLA-DM的表达[26]，该细胞重组表达HLA-DM、CD64、CD80、CD83也被应用于抗原特异性CD4+T细胞的扩增[26]。除了扩增T细胞外，K562细胞也被用于扩增自然杀伤(NK)细胞以治疗骨髓瘤患者[27]。
Exosomes(EXOs)是细胞内涵体的囊泡内吞体与细胞膜融合，然后通过胞吐作用分泌到细胞外的小囊泡(分泌小体或称囊泡)[28]。免疫细胞如DC分泌的EXOs可用作调节免疫应答的疫苗[19,28,29]。然而，产生足够数量的自体树突状细胞进而制备树突状细胞来源EXOs仍旧是DC为基础的产物广泛应用的瓶颈[9,10]。在这项研究中，我们首次通过基因重组工程构建了一种表达人HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80和41BBL的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL和一种人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL释放的EXOs靶向T细胞为基础的新型HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗。据我们所知，这是世界上首次报告使用人工APC释放的EXOs替换常规DC释放的EXOs用于疫苗研制，特别是用于构建人工APC EXO靶向的T细胞疫苗。为评估其Gag特异性免疫原性，我们用Gag-Texo疫苗免疫HLA-A2转基因小鼠，并分析CTL免疫反应及其介导的抗肿瘤免疫。我们发现，我们新型的HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗Gag-Tex能够诱导CTL反应和对BL6-10A2/Gag肿瘤的抗肿瘤免疫。这些结果和我们以前使用DC释放的EXO靶向的T细胞疫苗Gag-Texo在小鼠中所得的结果相同[6，8]。这说明用不停生长的人工APC囊泡替换DC囊泡用于制备囊泡靶向的T细胞疫苗是可行的。根据我们近来的发现，我们的Gag特异性DC释放的EXO靶向的小鼠T细胞疫苗Gag-Texo在动物慢性感染模型中能够直接逆转CTL耗竭[8]。下一步我们将会研究通过表达人HLA-A2、HIV-1 Gag、CD80、41BBL的人工APC来源的EXO制备人Gag-Texo疫苗并研究该疫苗是否能活化HLA-A2+HIV-1患者外周血中Gag特异性的CTLs，恢复其增殖，逆转CTL耗竭。综上所述，本研究证明以不停生长的人工APC来源的囊泡替换DC的囊泡用于制备HIV-1 Gag特异性T细胞疫苗是可行的，解决了再临床上难以获得大量人体自身树突细胞囊泡的瓶颈，并且将对HIV-1患者临床治疗新疫苗的研制具有重要的影响。
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Claims (10)

1.由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：包含由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞及药用载体；
所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞通过载体将基因转染到K562细胞而达到基因工程的转化，所述载体可以包括真核质粒载体和/或病毒载体；
所述分泌小体由所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌；
所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞，由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞。
2.根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：其由如下步骤制备而成：通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染一种特殊的缺乏内源性表达HLA-A,B和DR分子的K562细胞后，并用腺病毒载体再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL。
3.根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗，其特征在于：所述K562细胞也可经由lentiviral载体将多个转基因转染从而形成K562A2/Gag/CD80/41BBL，由K562A2/Gag/CD80/41BBLEXO制备的EXO靶向T细胞疫苗可用于治疗HIV-1病人；
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有肿瘤抗原在内的多个转基因转染。从而形成基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗肿瘤的病人；
K562细胞也可经由腺病毒或lentiviral载体将包含有不同类别的组织相容抗原复合体在内的多个转基因转染，从而形成工程基因工程化抗原提呈细胞释放的EXO构造的EXO靶向T细胞疫苗，可用于治疗相应的HLA-A1+，或HLA-A2+，或HLA-A3+的病人。
4.一种权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体。
5.一种由基因工程化的人造抗原提呈细胞所分泌的分泌小体所构建的T细胞，其特征在于：由T细胞摄取分泌小体而形成的具有免疫刺激作用的细胞；所述分泌小体由权利要求1或2所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞分泌。
6.一种根据权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)通过重组技术首先构建了两个真核表达质粒载体：表达CD80分子的pcDNANeo/CD80和表达HLA-A2分子的pcDNAHygro/HLA-A2；
(2)将pcDNANeo/CD80、pcDNAHygro/HLA-A2转染K562细胞后，并用腺病毒载体AdVGag和AdV41BBL再感染K562细胞，形成一种表达HLA-A2、HIV-1Gag、CD80和41BBL的人工APCK562A2/Gag/CD80/41BBL；
(3)通过构建的人工APC K562A2/Gag/CD80/41BBL所释放的分泌小体与Con-A刺激的HLA-A2转基因小鼠的非特异性的T细胞共孵育从而构建了HIV-1Gag特异性T细胞疫苗。
7.根据权利要求6所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述pcDNANeo/CD80和pcDNAHygro/HLA-A2的构建编码HLA-A2α链和CD80DNA片段分别插入CMV启动子驱动的pcDNAHygro、pcDNANeo真核表达质粒载体。
8.根据权利要求6所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述腺病毒载体为HIV-1Gag表达的AdVGag、41BBL表达的AdV41BBL；Gag和41BBL cDNA片段分别插入pShuttle载体。然后将载体转染到含有pAdEasy-1骨架载体的BJ5183Ecoli细菌进行同源性的DNA重组从而形成重组腺病毒质粒载体。然后将Gag和41BBL表达的腺病毒质粒载体再转染293细胞从而生成Gag和41BBL表达的腺病毒AdVGag和AdV41BBL。
9.根据权利要求1所述基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)ConA激活的非特异的CD8+T细胞的制备：在含有IL-2和ConA的RPMI1640培养基中培养脾脏细胞，分离得到ConA激活的CD8+T细胞，
(2)分泌小体的制备：将基因工程化的人造提呈细胞K562A2/Gag/CD80/41BBL细胞在无血清AIM-V培养基中培养，离心所得上清液，得到分泌小体沉淀物，
(3)ConA激活的CD8+T细胞对所述分泌小体的摄取：在含有IL-2的AIM-V培养基中，将步骤(1)所得的CD8+T细胞与步骤(2)所得的分泌小体共培养，以利于分泌小体被T细胞所摄取，从而得到所述分泌小体的ConA激活的CD8+T细胞疫苗。
10.一种权利要求1所述由基因工程化的人造抗原提呈细胞的分泌小体所构建的T细胞疫苗或权利要求6所制备的T细胞疫苗在制备抗慢性病毒性炎症、抗肿瘤、抑制自身免疫疾病和/或抑制排异反应的药物上的应用。
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