[发明内容]
为了解决现有技术中的上述不足和缺陷,本发明提供一种用人工抗原提呈细胞制备治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞(CTL)及其制备方法。
为了实现上述目的,设计一种用于治疗肺癌的CD8毒性T淋巴细胞(CTL)的制备方法,其特征在于用人工抗原提呈细胞负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞,CD8T细胞经激活,分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的CD8毒性T淋巴细胞(CTL)。
通过果蝇细胞制备所述的人工抗原提呈细胞,通过在果蝇细胞表面共表达MHC I和T细胞共刺激分子,使果蝇细胞具有抗原递呈的功能。
所述的人工抗原提呈细胞是由编码HLA-A2和两个共刺激分子CD80和CD54的cDNA转染原始果蝇细胞株S2而得到的稳定表达HLA-A2、CD80和CD54分子的细胞株。
通过红细胞制备所述的人工抗原提呈细胞,将可溶性的MHC I类分子和微球蛋白包被在其表面,使其具有抗原递呈的功能。
所述的抗原肽是与MHC I类分子具有高亲和结合的多肽分子。
所述的抗原肽为MAGE-1、MAGE-3、NY-ESO-1、SSX-2、WT-1和hTERT。
上述CD8毒性T淋巴细胞(CTL)可用于制造肺癌治疗药物。
本发明同现有技术相比,用人工抗原提呈细胞(artificial antigen presenting cell,aAPC)668株负载抗原肽后在体外高效活化用磁珠法分选HLA-A2阳性肿瘤患者外周血而来的CD8T细胞,CD8T细胞经激活,分化成具为具有杀伤肿瘤细胞的CD8毒性细胞(CTL),诱导的CTL分泌IFN-γ,且体外对人肿瘤細胞株和体内对自体肿瘤细胞具有明显的杀伤作用,CTL回输给病人后可用来治愈肿瘤患者或延长患者的生命。
[具体实施方式]
为了使本发明更加清楚,结合附图和实施例对本发明做进一步说明,应当理解,本实施例并不用于限定本发明的保护范围。
1)多肽的制备和分析:运用生物信息学的方法,分析肺癌特异性抗原分子内的抗原肽片段,设计能与MHC I类分子结合的肽段,并在体外合成这些肽段,保证纯度在95%以上。研究肽段与MHC I类分子的结合稳定性。
2)人造抗原提呈细胞:
(1)昆虫细胞人造抗原递呈细胞(aAPC)的制备:构建表达各种相关蛋白的载体。以果蝇S2细胞为基础,共转染表达HLA-A2、β-微球蛋白、CD80、细胞间黏附分子-1(ICAM-1,CD54);流式细胞术(FACS)分析各种分子的表达情况,保证相关分子的表达在80%以上。
(2)红细胞人造抗原递呈细胞(aAPC)的制备:通过果蝇细胞表达可溶性HLA-A2分子和β2-微球蛋白,并包被于红细胞表面。通过流式细胞术分析,包被相关分子的红细胞占总数的80%以上。
3)分离CD8+T细胞及纯度分析:使用Ficoll或类似试剂进行分离PBMC,用磁珠法免疫纯化分离CD8+细胞。通过流式细胞术,分析CD8+T细胞的纯度。
4)CTL的产生:利用人工抗原递呈细胞和合成的抗原肽与CD8T细胞在体外共培养,在多肽存在的条件下用同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞(第一天已冻存)重覆刺激CD8细胞,细胞扩增后产生CD8T毒性T淋巴细胞(CTL)。
5)特异的CTL活性:通过51Cr释放试验,测定CTL对靶细胞的杀伤作用;
6)高质量CTL的确定:通过对CTL表型的追踪测定,可以确定高质量的CTL的表型分子表达水平。
7)CTL体内活性试验:使用肺癌小鼠模型分析检测CTL活性。
抗原肽的设计:根据文献报道的有关肺癌特异表达的抗原分子,计算机程序按照MHC I与多肽结合的立体结构预测与MHCI高亲和结合的多肽分子(SYFPEITHI epitope prediction)。表一所列出的7个多肽来自于7个肿瘤抗原上与MHC I亲和性最高的可能的抗原肽,这些肿瘤抗原分别是MAGE-1,MAGE-3,NY-ESO-1,SSX-2,WT-1和hTERT。在程序中输入抗原氨基酸顺序,计算机将显示出一系列亲和性不同的与MHC I结合的多肽。
MAGE=melanoma antigen gene
SSX=synovial sarcoma,X breakpoint2
WT=Wilm’s Tumor
NY-ESO=cancer-testis antigen
hTERT=human telomerase reverse transcriptase
抗原肽的稳定MHC I的确定:对于肽结合在主要组织相容性复合体(MHC/HLA-A2)分子的研究分析基于肽对果蝇人工抗原提呈细胞(aAPCs,668)上I类MHC的稳定能力。在96孔V型板上1:10稀释多肽,使最终肽浓度分别为200uM,20uM,2uM,200nM,20nM,2nM,每孔多肽溶液为100μl,同时设置无肽孔为阴性对照。将100μl的经1mM CuSO4诱导的果蝇668细胞(细胞浓度调至1×106个/ml)置于V底96孔板中,于26℃,5%CO2条件下培养,18h后移至37℃,5%CO2的细胞培养箱中继续培养2h。随后将细胞用FACS缓冲液(PBS,2.5%FCS,0.01%NaN3)洗涤一次,悬浮细胞在50μl的FACS缓冲液中,接着每孔加入1μl FITC标记的鼠抗人HLA-A2抗体(BD Pharmingen,Cat.No.551285)和1μl PI染色,4℃培养30min,染色后将洗涤后的细胞重新悬浮于200μl FACS缓冲液并将细胞转移至96个微型管中。样本用FACScan流式细胞仪测定,CellQuest软件分析,如图1、图2所示。
CD8T细胞增长曲线:从HLA-A2阳性捐献者中用血分仪得到的白细胞经Ficoll分离得到PBMC,经抗CD8抗体连接的磁珠进一步纯化出的CD8+T细胞,再和已负载多肽的果蝇APC668于37℃,5%CO2培养5天。在第五天加入人IL-2(20U/ml,R&D)和IL-7(30U/ml,R&D体),并于第7天和第15天,在多肽存在的条件下用同一个捐赠者的PBMC中的非CD8粘附细胞重复刺激CD8+T细胞两次,细胞浓度用细胞培养液调节至2×106/ml。在第7,10,12,14,17,20,22天用Typan Blue细胞计数而获得细胞增长曲线,如图3所示。
CTL活性测定:
释放51Cr方法:CTL(效应物)活性用标准的铬(
51Cr)释放试验来衡量,负载单一肽的T2细胞(靶目标)作为靶细胞(Brunner et al.,Immunology.1968February;14(2):181-96)。利用1:5的CTL(效应物)系列稀释倍数产生的剂量应答,得到最高效应物(E)和靶目标(T)比率为50:1。在试验之前,靶细胞(3×10
6cells/100μl T2细胞放置在含有4%FCS的1×PBS中)用100μl
51Cr(Perkin Elmer)标记并于37℃培养1h。结束后标记的靶细胞用含有2.5%马血清(Invitrogen)的1×Hank's平衡盐溶液(Invitrogen)洗4次,于4℃1200-1500rpm离心8min,重新悬浮在15ml新鲜MLR培养基(含10%FCS,1%谷氨酰胺,1%青霉素-链霉素,1%HEPES和1%MEM非必须氨基酸的RPMI-1640溶液)中。标记的T2细胞最终浓度定为0.2×10
6个/ml。试验前,标记的T2细胞用10uM单一肽于室温下负载30min;100μl CTL(初浓度为5×10
6个/ml)用MLR培养基在圆底96孔板中连读稀释1:5,每个效应细胞浓度设1个重复。在每个 孔中含有不同稀释倍数的CTL100μl,加入50μl K562细胞(4×10
6个/ml)(
Number:CCL-243
TM)和50μl负载肽的
51Cr标记的T2靶细胞(0.2×10
6个/ml),于37℃,5%CO培养4h,900rpm离心5min,每孔取100μl上清液至
51Cr计数管中计数(如图4、图5所示)。
IFN-γ的测定:在96孔板中,负载多肽的100μl靶细胞T2或肿瘤细胞(106cells/1000μl,多肽浓度:5μg/ml)与100μl效应细胞CTLs(106cells/1000μl)1:1在37℃,5%CO2培养8h,1200rpm离心5min,每孔取100μl上清液用于ELISA测定T细胞受抗原刺激产生并释放IFN-γ的量(IFN-γ测定试剂盒)。释放IFN-γ的量与T细胞的活性成正比,如图6所示。
细胞表型:细胞的表型反应了细胞的状态,与细胞的活性及在体内的存活有关。CD28,CD27,CD62L以及CCR7的表达常被用来推测CTL细胞形态和表型以及记忆状态。1×106的CTL用缓冲液(PBS/2%FCS/0.02%NaN3)洗涤,悬浮在100μl同一缓冲液中,加抗CD8-PerCP-Cy5-5抗体,并分别加入抗CD28-FITC,CD27-FITC,CD62L-FITC和CCR7-FITC抗体,4C,30min.,缓冲液洗涤后,悬浮细胞在0.5毫升的缓冲液中,用流式细胞仪分析CTL上CD28,CD27,CD62L和CCR7的表达,如图7所示。