BRPI0808084A2 - Método para ativação de células t auxiliadoras e composição para uso no método. - Google Patents
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Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T AUXILIADORAS E COMPOSIÇÃO PARA USO NO MÉTODO".
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a um método para a ativação de
células T auxiliadoras, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, e ativando deste modo a célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem competência para qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 e uma mo10 lécula HLA-DPB1*0501 e uma composição para a mesma, uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora e similares.
Antecedentes
O gene WT1 (gene 1 do tumor de Wilms) foi identificado como 15 um gene responsável pelo tumor de Wilms, o qual é um câncer renal em crianças (Documentos Não-Patente 1 e 2). WT1 é um fator de transcrição com uma estrutura de dedo de zinco. No início, o gene WT1 foi considerado como sendo um gene supressor de tumor. Entretanto, estudos subsequentes (Documentos Não-Patente 3, 4, 5 e 6) mostraram que o gene WT1 antes 20 funciona como um oncogene nos tumores hematopoiéticos e cânceres sólidos.
Foi demonstrado que um linfócito T peptídeo WT1-específico (CTL) pode ser induzido pela estimulação in vitro de uma célula mononuclear do sangue periférico com um peptídeo WT1, e tal célula danifica uma cé25 lula cancerígena, tal como uma célula de tumor hematopoiético e uma célula de câncer sólido a qual expressa endogenamente WT1. O CTL reconhece o peptídeo WT1 como a forma do complexo na qual o peptídeo WT1 se liga a uma molécula de MHC de classe I. Consequentemente, tal peptídeo WT1 é diferente dependendo dos subtipos do MHC de classe I (Documento Patente 30 1, Documento Não-Patente 7 e Documentos Patente 2, 3 e 4).
A existência de uma célula T auxiliadora específica para um antíqeno de câncer é importante para induzir um CTL efetivamente (Documento Não-Patente 8). A célula T auxiliadora é induzida e ativada pelo reconhecimento de um complexo de uma molécula MHC de classe Il e um peptídeo de antígeno em uma célula apresentadora de antígeno. A célula T auxiliadora ativada produz uma citoquina tal como IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 ou interferon para auxiliar no crescimento, diferenciação ou maturação de uma célula B. A célula T auxiliadora ativada também tem a função de facilitar o crescimento, diferenciação ou maturação de outros subgrupos de células T (por exemplo, células Tc e TD). Deste modo, a célula T auxiliadora ativada tem a função de ativar um sistema imune pela facilitação do crescimento ou ativação de uma célula B ou célula T. Consequentemente, a intensificação de uma função de uma célula T auxiliadora por um peptídeo antígeno de ligação à MHC de classe Il (um peptídeo auxiliador) em uma imunoterapia cancerígena para aumentar o efeito de uma vacina cancerígena é considerada como sendo útil (Documento Não-Patente 9). Somente um peptídeo se ligando a uma molécuia HLA-DRB 1*0401 (Documento Não-Patente 10), um peptídeo se ligando a uma molécula HLA-DRB1*0405 e um peptídeo se ligando a uma molécula HLA-DRB1*1502 (Documento Patente 5) foram constatados como um peptídeo auxiliador de WT1 até a presente data. Consequentemente existe uma necessidade por encontrar peptídeos, cada um se ligando a uma molécula HLA-DRB1 *1501, HLA-DPB1 *0901 ou HLA-DPB1 *0501.
Além disso, foi demonstrado que dentre os peptídeos auxiliadores, existe um peptídeo auxiliador promíscuo o qual pode se ligar a várias moléculas MHC de classe Il e induzir as células T auxiliadoras (Documentos Não-Patente 11 e 12). Entretanto, foi constatado ser difícil identificar um pep25 tídeo auxiliador promíscuo o qual se ligue a três ou mais tipos de moléculas MHC de classe Il e que exerça um efeito adequado.
Documento Patente 1: WO 2003/106682 Documento Patente 2: WO 2005/095598 Documento Patente 3: WO 2007/097358 Documento Patente 4: Pedido de Patente Internacional No.
PCT/JP2007/074146
Documento Patente 5: WO 2005/045027 Documento Não-Patente 1: Daniel A. Haber et al., Cell. 29 de junho de 1990; 61(7):1257-69.
Documento Não-Patente 2: Call KM et al., Cell. 9 de fevereiro de 1990; 60(3):509-20.
Documento Não-Patente 3: Menke AL et al., Int Rev Cytol. 1998;
181:151-212. Revisão.
Documento Não-Patente 4: Yamagami T et al., Blood. 1o de abril de 1996; 87(7):2878-84.
Documento Não-Patente 5: Inoue K et al., Blood. 15 de abril de 1998; 91(8):2969-76.
Documento Não-Patente 6: Tsuboi A et al., Leuk Res. Maio de 1999; 23(5):499-505.
Documento Não-Patente 7: Oka Y et al., Immunogenetics. Fevereiro de 2000; 51(2):99-107.
Documento Não-Patente 8: Gao FG et al., Cancer Res. 15 de
novembro de 2002; 62(22):6438-41.
Documento Não-Patente 9: Zeng G, J lmmunother. Maio de 2001; 24(3): 195-204.
Documento Não-Patente 10: Knights AJ et al., Cancer Immunol lmmunother. Julho de 2002; 51(5):271-81.
Documento Não-Patente 11: Sotiriadou R et al., BrJ Cancer. 16 de novembro de 2001; 85(10): 1527-34.
Documento Não-Patente 12:Hural JA et al., J Immunol. 1o de julho de 2002; 169(1):557-65.
Descrição da Invenção
Problemas a serem Solucionados pela Invenção
Os problemas a serem resolvidos pela presente invenção são para fornecer um método para a ativação de uma célula T auxiliadora com um peptídeo WT1 o qual tenha a capacidade de se ligar a uma molécula 30 HLA-DRB1*1501, a uma molécula HLA-DPB1*0901 ou a uma molécula HLADPB1*0501 e uma composição para a mesma, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora e similares.
Formas de Resolver os Problemas
Como resultado de estudos intensivos em vista da situação conforme descrito acima, o presente inventor verificou que dentre os peptídeos 5 WT1 os quais se ligam a uma molécula HLA-DRB1*0405 e a uma molécula HLA-DRB1*1502, um peptídeo WT1 com uma seqüência de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His também se liga a uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 e uma molécula HLA-DPB1*0501. Deste modo, a presente invenção foi com
pletada.
A presente invenção fornece:
(1) Um método para a ativação de uma célula T auxiliadora, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, e ativando consequentemente a célula T auxiliadora, em que o
peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901 e molécula HLADPB1*0501;
(2) o método, de acordo com (1), em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a pelo menos duas dentre uma molécula HLA
DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901 e molécula HLA-DPB 1*0501;
(3) o método, de acordo com (1) ou (2), em que o peptídeo WT1 ainda tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*0405 e/ou a uma molécula HLA-DRB1*1502;
(4) o método, de acordo com qualquer um dentre (1) a (3), em
que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA
DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901, molécula HLA-DPB1*0501, molécula HLA-DRB 1*0405 e molécula HLA-DRB1*1502;
(5) o método, de acordo com qualquer um dentre (1) a (4), em que o peptídeo WT1 é um peptídeo compreendendo uma seqüência de ami
noácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID No: 2);
(6) o método, de acordo com qualquer um dentre (1) a (5), em que a adição do peptídeo WT1 à célula apresentadora de antígenos é praticada pela adição do peptídeo WT1, a adição de um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou a adição de uma célula incluindo o vetor de expressão;
(7) uma composição para ativação de uma célula T auxiliadora
pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre a molécula HLA-DRB1*1501, a molécula HLA-DPB 1*0901 e a molécula HLA-DPB1*0501;
(8) um método para o tratamento ou prevenção de um câncer
em um indivíduo, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e a ativação de uma célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre a molécula HLA-DRB1*1501, a moiécula HLA-DPB1*0901 e a molécula HLA
DPB1*0501;
(9) uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a
qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLADPB1*0901 e uma molécula HLA-DPB 1*0501;
(10) um anticorpo se ligando especificamente a um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 e
uma molécula HLA-DPB1 *0501;
(11) um método para a determinação da presença ou quantidade de um peptídeo WT1 em qualquer um dentre um indivíduo HLA-DRB1*1501- positivo, HLA-DPB1*0901- positivo e HLA-DPB1 *0501-positivo, compreendendo:
(a) a reação de um anticorpo anti-WT1 com uma amostra do in
divíduo; e
(b) a determinação da presença ou quantidade do anticorpo antiWT1 se ligando especificamente ao peptídeo WT1 contido na amostra;
(12) um método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e deste modo ativando uma célula T auxiliadora, e a adminis
tração da célula T auxiliadora ativada a um indivíduo, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 ou uma molécula HLA-DPB1*0501;
(13) uma composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo uma célula T auxiliadora ativada com
um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma de uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLADPB1*0901 e uma molécula HLA-DPB1*0501;
(14) um método para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1-específica em qualquer um dentre um indi
víduo HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA-DPB 1*0901- positivo e HLADPB1 *0501 -positivo, compreendendo:
(a) a reação de um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 ou uma molécula HLA-DPB1*0501 com uma amostra de um indivíduo; e
(b) a determinação da presença ou quantidade de uma célula T
auxiliadora reconhecendo o complexo contido na amostra; e
(15) um método para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1-específica em um indivíduo HLADRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1*0901- positivo, HLA-DPB1*0501- positivo,
HLA-DRB1*0405- positivo ou HLA-DRB1*1502- positivo, compreendendo:
(a) a estimulação de uma célula mononuclear de sangue periférico, um linfócito invasivo, célula tumoral, célula em fluido ascítico, célula no fluido pleural, célula no fluido cerebrospinal, célula da medula óssea ou célula do nódulo linfático com um peptídeo WT1; e
(b) a determinação da produção de uma citoquina ou da reação
da célula T auxiliadora,
em que a presença ou um aumento na quantidade da produção da citoquina ou a reação da célula T auxiliadora indica a presença ou quantidade da célula T auxiliadora WT1 específica.
Efeitos da Invenção
A presente invenção fornece um método para a ativação de uma célula T auxiliadora com um peptídeo WT1 o qual se liga a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901, molécula HLA-DPB1*0501, molécula HLA-DRB 1*0405 e molécula HLA-DRB1*1502 e uma composição para a mesma, assim como uma composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora, e similar. Consequentemente, é possível ativar in vivo e in vitro uma célula T auxiliadora no indivíduo com qualquer uma dentre as moléculas MHC de classe II, tratar e prevenir um câncer e similares. Devido ao fato de cerca de 90% dos japoneses serem cobertos pelos cinco tipos de subclasses de MHC classe II, as células T auxiliadoras podem ser ativadas para tratar e/ou prevenir câncer em uma ampla variedade de indivíduos.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 é um gráfico o qual representa a quantidade de IFN-γ produzido pela célula TA28.1. Na figura, um eixo longitudinal representa a concentração de IFN-γ (pg/mL). Os gráficos correspondem ao "caso de culti20 vo de células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLADRB1 *1501-positivo na ausência do peptídeo WT1", "o caso de cultivar células TA28.1 na presença do peptídeo WT1 (preto)", "o caso de cultivar células mononucleares de sangue periférico de um indivíduo HLA-DRB1*1501- negativo na ausência do peptídeo WT1", "o caso de cultivar células mononu25 cleares de sangue periférico de um indivíduo HLA-DRB1 *1501-negativo na presença do peptídeo WT1" iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 2 é um gráfico o qual representa as quantidades de IFNy, IL-4 e IL-10 produzidas pela célula TA28.1 Na figura, um eixo longitudinal representa a concentração (pg/mL). Os gráficos correspondem aos valores de IFN-γ, IL-4 e IL-10 iniciando da esquerda.
A figura 3 é um gráfico o qual representa as quantidades de IFNy, IL-4 e IL-10 produzidas pela célula E15.2. Na figura, um eixo longitudinal representa a concentração (pg/mL). Os gráficos correspondem aos valores de IFN-γ, IL-4 e IL-10 iniciando da esquerda.
A figura 4 representa as produções de IFN-γ e de IL-17 pelas células mononucleares HLA-DPB1 *0501/*0501-positivas. Na figura, um eixo 5 horizontal representa IFN-γ, e um eixo longitudinal representa IL-17. Afigura 4a representa as células sem serem estimuladas com o peptídeo WT1, e a figura 4b representa as células estimuladas com o peptídeo WT1.
A figura 5 é um gráfico o qual representa o crescimento das células TA28.1. Na figura, um eixo longitudinal representa cpm (x 104). Os grá10 ficos correspondem ao "caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico sem pulsar com um peptídeo WT1", "o caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 (preto)", "o caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas 15 com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-MHC classe I", "o caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo antiHLA-DR (sombreado)", "o caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na 20 presença de um anticorpo anti-HLA-DQ", "o caso de cocultivo das células TA28.1 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DP", iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 6 é um gráfico o qual representa o crescimento das cé25 lulas E15.2. Na figura, um eixo longitudinal representa cpm (x 104). Os gráficos correspondem ao "caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLA-DPB1 *0901-positivo sem pulsar com um peptídeo WT1", "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLA30 DPB1 *0901-positivo pulsadas com um peptídeo WT1 (preto)", "os casos de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLA-DPB1 *0901-positivo pulsadas com um peptídeo WT1", "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLA-DPB1 *0901-negativo pulsadas com um peptídeo WT1", iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 7 é um gráfico o qual representa o crescimento das cé5 lulas E15.2. Na figura, um eixo longitudinal representa cpm. Os gráficos correspondem ao "caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico sem pulsar com um peptídeo WT1", "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 (preto)", "o caso de cocultivo das células 10 E15.2 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-MHC classe I", "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DR", "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do san15 gue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DQ" e "o caso de cocultivo das células E15.2 com células mononucleares do sangue periférico pulsadas com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DP (sombreado)" iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 8 é um gráfico o qual representa o crescimento de célu
las mononucleares HLA-DPB1 *0501/*0501-positivas. Na figura, um eixo longitudinal representa cpm. Os gráficos correspondem ao "caso sem estímulo com um peptídeo WT1" e "o caso com estímulo com um peptídeo WT1" iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 9 representa que o crescimento de células mononuclea
res DPB1 *0501/*0501-positivas é suprimido por anticorpos anti-HLA-DP. Na figura, um eixo longitudinal representa cpm. Os gráficos correspondem ao "caso sem estímulo com um peptídeo WT1", "o caso sem estímulo com um peptídeo de controle de HIV", "o caso com estímulo com um peptídeo WT1", 30 "o caso com estímulo com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DR", "o caso com estímulo com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DQ" e "o caso com estímulo com um peptídeo WT1 na presença de um anticorpo anti-HLA-DR", iniciando da esquerda, respectivamente.
A figura 10 é um gráfico o qual representa o crescimento da célula E15.2 nos casos de uso de várias concentrações de um peptídeo WT1.
5 Na figura, um eixo longitudinal representa cpm (x 104), e um eixo horizontal representa a concentração do peptídeo WT1.
Melhor Modo de Executar a Invenção
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a ativação de uma célula T auxiliadora, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e deste modo ativando a célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma da molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLADPB1*0901 e molécula HLA-DPB1*0501. Na presente invenção, o peptídeo WT1 se refere a um peptídeo consistindo em uma parte da seqüência de aminoácidos da proteína humana WT1 mostrada na SEQ ID NO: 1, um peptídeo o qual tem uma substituição, modificação ou eliminação de um a vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos, e tem uma capacidade de se ligar a qualquer uma dentre a molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLADPB1*0901 e molécula HLA-DPB1*0501, ou um peptídeo no qual várias substâncias, tal como um aminoácido, um peptídeo ou um análogo seu podem ser ligados no N-terminal ou no C-terminal do peptídeo. A substância pode ser processada, por exemplo, por uma enzima em um corpo vivo ou através de um processo tal como processamento intracelular, e finalmente o peptídeo WT1 se torna a forma a qual pode se ligar a qualquer uma das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. A substância pode ser uma substância que modula a solubilidade do peptídeo WT1 da presente invenção, ou aumenta a sua estabilidade (resistência à protease, etc). Alternativamente, ela pode ser uma substância que distribui o peptídeo WT1 da presente invenção especificamente, por exemplo, a um dado tecido ou órgão, ou aumenta a eficiência da captação por uma célula apresentadora de antígenos ou similar. Alternativamente, ela pode ser um peptídeo WT1 o qual é restrito ao mesmo tipo de uma molécula MHC classe I que aquela de um indivíduo do qual uma célula apresentadora de antígeno é derivada.
O peptídeo WT1 da presente invenção tem uma capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. Deste modo o peptídeo WT1 pode ser um peptídeo o qual 5 tenha a capacidade de se ligar a pelo menos duas das moléculas HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501, ou um peptídeo que tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501 e/ou HLADPB1*0901 e/ou HLA-DPB1*0501, e uma molécula MHC classe Il diferente das moléculas, por exemplo, um peptídeo o qual tenha a capacidade de se 10 ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DRB1*0405 e/ou molécula HLA-DRB1*1502, um peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DPB 1*0901, molécula HLA-DRB 1*0405 e/ou molécula HLA-DRB1*1502, ou um peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901, molécula HLA15 DPB1*0501, molécula HLA-DRB1*0405 e/ou molécula HLA-DRB1*1502. Devido ao fato de um peptídeo WT1 com uma seqüência de aminoácidos Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID No: 2) ter a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula H LA-DPB 1*0901, molécula HLA-DPB 1*0501, molécula HLA20 DRB1*0405 e molécula HLA-DRB1*1502, o peptídeo WT1 com tal seqüência de aminoácidos é preferível. Em geral, um peptídeo de ligação ao MHC classe Il consiste em 10 a 25 aminoácidos. Consequentemente, o peptídeo WT1 preferivelmente tem uma seqüência de aminoácidos consistindo em 10 a 25 aminoácidos.
O peptídeo WT1 da presente invenção pode ser sintetizado por
métodos geralmente usados na técnica ou suas modificações. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Peptide Synthesis, lnterscience, Nova Iorque, 1966; The Proteins, Volume 2, Academic Press Inc., Nova Iorque, 1976; Peptide-Gosei, Maruzen Co., Ltd., 1975; Peptide-Gosei No Kiso To Jikken, 30 Maruzen Co., Ltd., 1985; e Iyakuhin No Kaihatsu (Zoku), Vol. 14, PeptideGosei, Hirokawa - Book store, 1991.
O peptídeo WT1 da presente invenção também pode ser preparado usado técnicas de engenharia genética baseando-se na informação a cerca da seqüência de nucleotídeos que codifica o peptídeo WT1. Tais técnicas de engenharia genética são bem-conhecidas por uma pessoa versada na técnica.
5 A célula apresentadora de antígenos se refere a uma célula tal
como uma célula dendrítica a qual pode apresentar o peptídeo WT1 juntamente com uma molécula de MHC de classe Il a uma célula T auxiliadora ou similar. Deste modo, um indivíduo do qual a célula apresentadora de antígeno é derivada deve ter a mesma subclasse do MHC classe Il (por exemplo, 10 HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901, HLA-DPB1*0501, HLA-DRB1*0405 ou HLA-DRB1*1502) daquela a qual o peptídeo WT1 adicionado se liga.
Em geral, uma célula T auxiliadora é ativada pelo reconhecimento de um peptídeo de antígeno através de uma molécula MHC classe Il na superfície de uma célula apresentadora de antígeno pelo complexo TCR15 CD3 na superfície da célula T, e a estimulação de uma integrina na superfície da célula T por um Iigante de integrina na superfície da célula apresentadora de antígeno. Na presente invenção, a ativação da célula T auxiliadora engloba não somente a ativação da célula T auxiliadora, mas também a indução e crescimento da célula T auxiliadora. Conforme descrito acima, a 20 célula T auxiliadora ativada tem a função de ativar um sistema imune pelo aumento da indução, crescimento ou ativação de uma célula B ou de uma célula T. Deste modo, o método para a ativação de uma célula T auxiliadora da presente invenção pode ser usado como uma terapia adjuvante no tratamento de câncer ou similar. Alternativamente, a célula T auxiliadora ativada 25 in vivo usando o método da presente invenção pode ser usada para tratar ou prevenir um câncer ou similar, ou pode ser usada como uma terapia adjuvante na mesma. A ativação da célula T auxiliadora pode ser determinada pela medição da quantidade da produção ou secreção de uma citoquina, tal como um interferon e uma interleucina, e similares.
A adição do peptídeo WT1 à célula apresentadora de antígeno
pode ser praticada diretamente pela adição do peptídeo WT1, ou indiretamente pela adição de um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou a adição de uma célula compreendendo o vetor de expressão. O vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1, e a célula compreendendo o vetor de expressão pode ser produzida pelo método bem-conhecido pela pessoa 5 versada na técnica.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição para ativar uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das 10 moléculas HLA-DRB1 *1501, HLA-DPB1 *0901 e HLA-DPB1 *0501. Quando a composição da presente invenção é administrada a um indivíduo HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1 *0501-positivo, o sistema imune no indivíduo é ativado pela ativação da célula T auxiliadora no indivíduo. O gene WT1 é expresso em altos níveis em vários cânceres e tumores incluin15 do tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno, e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de célula germinativa, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical ou câncer de ovário. Conse20 quentemente, a composição da presente invenção pode ser usada como uma terapia adjuvante no tratamento ou prevenção de um câncer. Alternativamente, a célula T auxiliadora ativada usando a composição da presente invenção pode ser usada, por exemplo, como adjuvante no tratamento de câncer.
Conforme descrito acima, o peptídeo WT1 da presente invenção
pode ser um peptídeo o qual tem a capacidade de se ligar a pelo menos duas das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB 1*0501, ou um peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLADRB1*1501 e/ou HLA-DPB1*0901 e/ou HLA-DPB1*0501, e uma molécula 30 MHC classe Il diferente delas. Deste modo, desde que a célula apresentadora de antígeno seja derivada de um indivíduo positivo para uma subclasse MHC classe Il para a qual o peptídeo WT1 da presente invenção pode se ligar, o efeito da ativação da célula T auxiliadora da composição da presente invenção pode ser originado.
A composição da presente invenção pode compreender, além do peptídeo WT1, por exemplo, um veículo, um excipiente, um aditivo ou simi5 lar. Devido ao fato do peptídeo WT1 compreendido na composição da presente invenção ativar o peptídeo auxiliador especificamente para o peptídeo WT1, a composição pode compreender um peptídeo WT1 restrito de MHC classe I, ou ele pode ser usado com o peptídeo.
O método de uso da composição da presente invenção pode ser apropriadamente selecionado dependendo das condições, tal como a ativação desejada da célula T auxiliadora, o estado da célula apresentadora de antígeno. Exemplos de tais métodos incluem, porém não estão limitados, à administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intravenosa, administração nasal e administração oral, e a adição a um meio de cultura da célula apresentadora de antígeno. A quantidade do peptídeo WT1 compreendida na composição da presente invenção, assim como a forma, a quantidade de vezes de uso e o tipo da composição da presente invenção podem ser apropriadamente selecionados dependendo das condições tais como da ativação desejada da célula T auxiliadora, o estado da célula apresentadora de antígeno.
Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma composição para ativar uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 25 ou uma célula compreendendo o vetor de expressão, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre as moléculas HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. O vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 e a célula compreendendo o vetor de expressão são descritos acima.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um
vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um peptídeo WT1, ou uma célula compreendendo o vetor de expressão para a produção da composição.
Em um aspecto asdicional, a presente invenção se refere a um kit para ativar uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo o peptídeo WT1, em 5 que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. Preferivelmente, o kit é usado no método para a ativação de uma célula T auxiliadora. O kit da presente invenção pode compreender, além do peptídeo WT1, por exemplo, uma forma de obter uma célula apresentadora de antígeno, uma 10 forma de determinar a atividade da célula T auxiliadora ou similar. Em geral, um manual de instruções é anexado ao kit. Pelo uso do kit da presente invenção, as células T auxiliadoras podem ser eficientemente induzidas.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para ativar uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célu15 Ia apresentadora de antígeno, compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando um peptídeo WT1, ou uma célula compreendendo o vetor de expressão, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLA-DRB1*1501, HLADPB1*0901 e HLA-DPB 1*0501.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método
para o tratamento ou prevenção de um câncer em um indivíduo, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e deste modo ativando uma célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLA25 DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. O método da presente invenção é um método no qual o sistema imune no indivíduo é ativado pela ativação de uma célula T auxiliadora, e um câncer no indivíduo é tratado ou prevenido. A adição do peptídeo WT1 à célula apresentadora de antígeno pode ser praticada diretamente pela adição do peptídeo WT1, ou indireta30 mente pela adição de um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou a adição de uma célula compreendendo o vetor de expressão. Conforme descrito acima, a célula T auxiliadora reconhece o complexo de qualquer uma das moléculas de MHC classe II, particularmente uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1* e o peptídeo WT1. Consequentemente, o indivíduo é um que tem uma molécula MHC 5 classe Il à qual o peptídeo WT1 se liga, por exemplo, a um indivíduo HLADRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLA-DPB1 *0501-positivo. Conforme descrito acima, o peptídeo WT1 da presente invenção pode ser um peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a pelo menos duas das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501, ou um
peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLADRB1*1501 e/ou HLA-DPB1*0901 e/ou HLA-DPB 1*0501, e uma molécula MHC classe Il diferente delas. Deste modo, em tal caso, é possível tratar ou prevenir um câncer em um indivíduo positivo para uma subclasse de MHC classe Il à qual o peptídeo WT1 da presente invenção pode se ligar. O cân15 cer a ser tratado ou prevenido pode qualquer um, e exemplos seus incluem tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndrome mielodisplásica, mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de célula germinativa, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, cân20 cer de próstata, câncer uterino, câncer cervical ou câncer de ovário. Além disso, o método da presente invenção pode ser usado com um método para o tratamento ou prevenção de um câncer com um peptídeo WT1 restrito de molécula MHC classe I ou uma composição farmacêutica para o mesmo.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma compo25 sição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer em um indivíduo pela ativação de uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre uma molécula DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. 30 O gene WT1 é expresso em altos níveis em vários cânceres e tumores, incluindo tumores hematopoiéticos tais como leucemia, síndrome mielodisplásica , mieloma múltiplo ou Iinfoma maligno e cânceres sólidos tais como câncer gástrico, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de célula germinativa, câncer hepático, câncer de pele, câncer de bexiga, câncer de próstata, câncer uterino, câncer cervical ou câncer de ovário. Consequentemente, a composição farmacêutica da presente invenção pode 5 ser usada para o tratamento ou prevenção de câncer.
Conforme descrito acima, o peptídeo WT1 da presente invenção pode ser um peptídeo o qual tenha a capacidade de se ligar a pelo menos duas das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501, ou um peptídeo que tenha a capacidade de se ligar a uma molécula HLA10 DRB1*1501 e/ou HLA-DPB1*0901 e/ou HLA-DPB1*0501, e uma molécula MHC classe Il diferente delas. Deste modo, contanto que a célula apresentadora de antígeno seja derivada de um indivíduo positivo para uma subclasse de MHC classe Il ao qual o peptídeo WT1 da presente invenção pode se ligar, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada 15 para tratar ou prevenir câncer.
Quando a composição farmacêutica da presente invenção é administrada, por exemplo, a um indivíduo HLA-DRB 1*1501-positivo, HLADPB1 *0901-positivo ou HLA-DPB1 *0501-positivo, o sistema imune em um indivíduo pode ser ativado pela ativação da célula T auxiliadora pelo peptí20 deo WT1 compreendido na composição farmacêutica, tratando ou prevenindo deste modo um câncer. Deste modo, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser usada juntamente com o método para o tratamento ou prevenção de um câncer ou a composição farmacêutica para o mesmo.
A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender, além do peptídeo WT1 como ingrediente ativo, por exemplo, um veículo, um excipiente ou similar. O peptídeo WT1 compreendido na composição farmacêutica da presente invenção se liga a uma molécula MHC classe
Il na superfície da célula apresentadora de antígeno e ativa uma célula T auxiliadora. Consequentemente, a composição farmacêutica da presente invenção pode ainda compreender um ativador, fator de crescimento, indutor ou similar da célula T auxiliadora, ou pode compreender um peptídeo WT1 restrito por MHC classe I. O método para administrar a composição farmacêutica da presente invenção pode ser apropriadamente selecionado dependendo das condições, tais como do tipo de doença, da condição do indivíduo ou sítioalvo. Exemplos de tais métodos incluem, porém não estão limitados, à admi5 nistração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intravenosa, administração nasal e administração oral. A quantidade do peptídeo compreendido na composição farmacêutica da presente invenção, assim como a forma de dosagem, a quantidade de vezes de administração e o tipo de composição farmacêutica da presente invenção 10 pode ser apropriadamente selecionados dependendo das condições tais como do tipo de doença, a condição do indivíduo ou o sítio-alvo. A dose individual do peptídeo é geralmente de 0,0001 mg a 1000 mg, preferivelmente de 0,001 mg a 1000 mg.
Em aspecto adicional, a presente invenção se refere a uma 15 composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer em um indivíduo pela ativação da célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno compreendendo um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1, ou uma célula compreendendo o vetor de expressão, em que o peptí20 deo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501.
Em aspecto adicional, a presente invenção se refere ao uso de um peptídeo WT1, um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou uma célula compreendendo o vetor de expressão para a produção da composição farmacêutica.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um anticorpo se ligando especificamente a um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. O anticorpo da presente 30 invenção pode ser preparado através de um método conhecido pela pessoa versada na técnica. O anticorpo da presente invenção pode ser usado para o diagnóstico de vários cânceres, seus prognósticos ou similares. Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a determinação da presença ou quantidade de um peptídeo WT1 em um indivíduo HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLADPB1 *0501-positivo, compreendendo:
(a) a reação de um anticorpo anti-WT1 com uma amostra do in
divíduo; e
(b) a determinação da presença ou quantidade do anticorpo antiWT1 se ligando especificamente ao peptídeo WT1 contido na amostra. Por exemplo, é possível diagnosticar um câncer, seu prognóstico ou similar pela incubação do anticorpo anti-WT1 com uma amostra de um indivíduo HLADRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLA-DPB1 *0501-positivo, ou a administração do anticorpo anti-WT1 a um indivíduo HLA-DRB1*1501- positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLA-DPB1 *0501-positivo, e a determinação, por exemplo, da posição, sítio ou quantidade sua. O anticorpo antiWT1 da presente invenção se refere a um anticorpo o qual pode reconhecer especificamente o peptídeo WT1 da presente invenção. O anticorpo WT1 pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo policlonal. O anticorpo anti-WT1 pode ser marcado. Um marcador conhecido tal como um marcador fluorescente ou um marcador radioativo pode ser usado como um marcador. Ao marcá-lo, a presença ou quantidade do peptídeo WT1 pode ser determinada prontamente e rapidamente.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um kit para a determinação da presença ou quantidade de um peptídeo WT1 compreendendo o anticorpo anti-WT1 como um componente essencial.
Além disso, na determinação da presença ou quantidade do
peptídeo WT1, quando o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*0405 e/ou HLA-DRB1*1502, é possível determinar a presença ou quantidade do peptídeo WT1 em um indivíduo com tal subclasse de MHC classe II.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a uma compo
sição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de câncer, compreendendo uma célula T auxiliadora ativada com um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501. O câncer é tratado ou evitado pela indução, crescimento ou ativação de uma célula B ou célula T pela célula T auxiliadora ativada. Deste modo, a composição farmacêutica 5 da presente invenção nesse aspecto pode ser usada juntamente com outro método para o tratamento ou prevenção de um câncer ou composição farmacêutica para o mesmo. A ativação da célula T auxiliadora com o peptídeo WT1 engloba não somente a ativação direta com o peptídeo WT1, mas também a ativação indireta com um vetor de expressão compreendendo um po10 linucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou uma célula compreendendo o vetor de expressão.
A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender, além da célula T auxiliadora ativada como ingrediente ativo, por exemplo, um veículo, um excipiente ou similar. O método de administração da composição farmacêutica da presente invenção pode ser apropriadamente selecionado dependendo das condições tais como o tipo de doença, a condição do indivíduo ou o sítio-alvo. Exemplos de tais métodos incluem, porém não estão limitados, à administração intradérmica, administração subcutânea, administração intramuscular, administração intravenosa, administração nasal e administração oral. A quantidade de célula T auxiliadora compreendida na composição farmacêutica da presente invenção, assim como a forma de dosagem, a quantidade de vezes de administração e o tipo de composição farmacêutica da presente invenção podem ser apropriadamente selecionados dependendo de uma condição, tal como do tipo de doença, da condição do indivíduo ou do sítio-alvo.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e deste modo ativando uma célula T auxiliadora, e administrando a célula T auxiliadora 30 ativada a um indivíduo, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLADPB1*0501. Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere ao uso de um peptídeo de WT1 para a produção da composição farmacêutica compreendendo uma célula T auxiliadora ativada.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método 5 para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1 específica em qualquer indivíduo HLA-DRB 1*1501-positivo, HLADPB1 *0901-positivo e HLA-DPB1*0501-positivo, compreendendo:
(a) a reação de um complexo de um peptídeo WT1 e de uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501 com uma
amostra do indivíduo; e
(b) determinando a presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora reconhecendo o complexo contido na amostra. A amostra do indivíduo pode ser qualquer uma, contanto que exista a possibilidade de conter um linfócito. Exemplos das amostras incluem fluidos corporais tais como
sangue ou Iinfa e um tecido. O complexo de um peptídeo WT1 e de uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501 pode ser preparado, por exemplo, como um tetrâmero ou pentâmero usando um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como o método de biotina-estreptavidina. A presença ou quantidade da célula T auxiliadora reco20 nhecendo tal complexo pode ser medida por um método conhecido por uma pessoa versada na técnica. Nesse aspecto da presente invenção, o complexo pode ser marcado. Um marcador conhecido, tal como um marcador fluorescente ou um marcador radioativo pode ser usado como tal. Ao marcá-lo, a presença ou quantidade da célula T auxiliadora pode ser rapidamente ou 25 prontamente determinada. O método da presente invenção nesse aspecto pode ser usado para diagnosticar um câncer, seu prognóstico ou similar.
Deste modo, a presente invenção também fornece uma composição para a determinação da presença ou quantidade da célula T auxiliadora em qualquer um dos indivíduos HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA30 DPB1 *0901-positivo e HLA-DPB1 *0501-positivo, compreendendo um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-DRB1*1501, HLADPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501. Além disso, a presente invenção fornece um kit para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora em um indivíduo HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLADPB1 *0501-positivo, compreendendo um complexo de um peptídeo WT1 e 5 uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501.
Além disso, na determinação da presença ou quantidade da célula T auxiliadora, quando o peptídeo WT1 tem competência para uma molécula HLA-DRB1*0405 e/ou HLA-DRB1*1502 na determinação da presença ou quantidade da célula T auxiliadora, é possível determinar a presença ou 10 quantidade da célula T auxiliadora em um indivíduo, com tal subclasse de MHC classe II. Em tal caso, um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula MHC classe Il à qual o peptídeo WT1 se liga é usada.
Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a um método para a obtenção de uma célula T auxiliadora usando um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501, compreendendo:
(a) a reação de uma amostra com o complexo; e
(b) a obtenção de uma célula T reconhecendo o complexo contido na amostra. O complexo é descrito acima. A amostra pode ser qualquer
uma, contanto que exista a possibilidade de conter um linfócito. Exemplos das amostras incluem uma amostra de um indivíduo, tal como sangue, e uma cultura celular. A célula T auxiliadora reconhecendo o complexo pode ser obtida usando um método conhecido por uma pessoa versada na técnica, tal como FACS ou MACS. A presente invenção permite cultivar a célula T 25 auxiliadora obtida e usá-la para o tratamento ou prevenção de vários cânceres.
Deste modo, a presente invenção também se refere a uma célula T auxiliadora a qual é obtenível por um método para obter uma célula T auxiliadora usando um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLA-DPB1*0501.
Além disso, a presente invenção se refere a um kit para obter uma célula T auxiliadora, compreendendo um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 ou HLADPB1*0501.
Além disso, ao obter a célula T auxiliadora, quando o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*0405 e/ou 5 HLA-DRB1*1502, é possível obter uma célula T auxiliadora reconhecendo um complexo de tal subclasse de MHC classe Il e um peptídeo WT1. Em tal caso, o complexo do peptídeo WT1 e uma molécula MHC classe Il ao qual ele se liga é usado.
Em outro aspecto, a presente invenção se refere a um método para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1 específica em um indivíduo HLA-DRB1 *1501-positivo, HLADPB1 *0901-positivo, HLA-DPB1 *0501-positivo, HLA-DRB1*0405-positivo ou HLA-DRB1 *1502-positivo, compreendendo:
(a) estimular uma célula mononuclear de sangue periférico, Iinfócito invasivo, célula tumoral, célula em fluido ascítico, célula em fluido pleu
ral, célula no fluido cerebrospinal, célula da medula óssea ou célula do nóduIo linfático com um peptídeo WT1; e
(b) determinar a produção de uma citoquina ou a reação da célula T auxiliadora,
em que a presença ou um aumento na quantidade da produção
da citoquina ou a reação da célula T auxiliadora indica a presença ou quantidade da célula T auxiliadora WT1-específica. As células, tais como as células mononucleares de sangue periférico, linfócito invasivo, célula tumoral, célula em fluido ascítico, célula em fluido pleural, célula no fluido cerebrospi25 nal, célula da medula óssea e célula do nódulo linfático usadas no método da presente invenção podem ser derivadas de um indivíduo saudável ou um paciente com câncer. Pelo uso das células de um indivíduo saudável, é possível determinar se o indivíduo está sofrendo de câncer ou não, se o indivíduo é predisposto a isso ou não, ou similares. Pelo uso das células de um 30 paciente com câncer, é possível prever se a imunoterapia com WT1 tem efeito no paciente com câncer ou não ou similar. O estímulo das células com o peptídeo WT1 pode ser praticado in vitro ou in vivo. Devido à facilidade, o estímulo in vitro é preferível. A presença da produção da citoquina ou a reação da célula T auxiliadora, ou a quantidade da produção da citoquina ou a reação da célula T auxiliadora pode ser determinada por um método conhecido.
Os exemplos a seguir ilustram a presente invenção de modo
mais detalhado, porém não são para serem construídos para limitar o seu escopo.
Exemplos
1. Preparação de célula apresentadora de antígeno
Células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) foram
separadas do sangue periférico que havia sido coletado de um doador saudável (HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo ou HLADPB1 *0501-positivo). As PBMCs foram semeadas em uma placa plástica com 6 poços na densidade de 1 x 107 células/poço em soro AB a 1% (Nabi, 15 Miami, FL), meio X-VIVO 15 (Cambrex), e cultivadas por 2 horas. Depois do cultivo, as células da suspensão foram removidas, e as células aderentes remanescentes foram cultivadas em IL-4 1000 UI/mL (PeproTech), GM-CSF 1000 UI/mL (PeproTech),soro AB a 1% e meio X-VIVO 15. No dia 2 e no dia
4, o meio foi alterado, e IL-4 e GM-CSF foram adicionados. No dia 6, TNF-a 100 UI/mL foi adicionado às células apresentadoras de antígeno maduras.
2. Indução de célula T CD4 positiva específica para peptídeo WT1.
As células T CD4 positivas foram separadas do sangue derivado do mesmo doador usando RosetteSep para a separação de células T CD4 positivas (StemCeII). As células T CD4 positivas (3 x 106 células) foram adi25 cionadas a cada poço de uma placa de 24 poços. Elas foram estimuladas com células apresentadoras de antígeno autólogas (3 x 105 células) que haviam sido pulsadas com 20 μg/mL de peptídeo WT1 (SEQ ID NO: 2), e irradiadas com 25 Gy de radiação. No dia seguinte, depois do estímulo, IL-2 UI/mL foi adicionada. Da mesma forma, as células T CD4 positivas foram 30 estimuladas usando as células apresentadoras de antígeno pulsadas com peptídeo WT1 20 μg/mL semana sim, semana não. Além disso, o meio foi alterado para o meio contendo IL-2 dia sim dia não depois do segundo estímulo. As células T CD4 positivas induzidas por três vezes de estímulo no total (células T HLA-DRB1*1501 e HLA-DPB1*0901 positivas foram definidas como célula TA28.1 e E15.2, respectivamente) foram usadas para os experimentos abaixo.
5 3. Medição de IFN-γ
As células TA28.1 e as células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo a partir do qual as células TA28.1 foram derivadas foram cultivadas na presença de 20 μg/mL do peptídeo WT1 por 24 horas. Depois do cultivo, a quantidade de IFN-γ no sobrenadante foi quantificada 10 usando o kit ELISA. Como controle, uma célula mononuclear do sangue periférico de um indivíduo HLA-DRB1 *1501-negativo foi usada. Os resultados estão mostrados na figura 1. Foi confirmado que a célula TA28.1 reconhece o peptídeo WT1 especificamente para uma molécula HLA-DRB1*1501 para aumentar a quantidade produzida de IFN-γ (isto é, ativação).
Além disso, foi confirmado que a célula TA28.1 e a célula E15.2
não produzem IL-4 e IL-10 usando o kit ELISA. Os resultado estão mostrados nas figuras 2 e 3. Foi confirmado que a célula TA28.1 e E15.2 são as células Th1.
Células mononucleares HLA-DPB1 *0501/ 0501-positivas foram usadas para efetuar os seguintes experimentos. As células foram suspensas em X-VIVO (soro AB a 1%), e 20 μg/mL de peptídeo WT1, 10 μg/mL de Brefeldin A e 0,5 μg/mL de CD28/49d foram adicionados. Elas foram incubadas a 37 0C com CO2 a 5% por 4 horas. Como controle, uma célula incubada sem a adição de um peptídeo WT1 foi usada. Depois de lavar com tampão, um anticorpo anti-CD3-perCP e um anticorpo anti-CD4-APC foram adicionados, e eles foram incubados a 4 0C por 30 minutos. Depois de lavar com tampão, as células foram fixadas e permeabilizadas usando BD Cytofix/Cytoperm (4 0C, 20 minutos). Depois de lavar com BD perm/tampão de lavagem, anti-INF-y-FITC (BD, clone: B27) e anti-IL-17-ΡΕ (eBioscience, clone: eBio64DEC17) foram adicionados, e eles foram incubados a 4 0C por minutos. Depois de lavar com tampão, as células foram analisadas com FACSAria. Os resultados estão mostrados na figura 4. Foi confirmado que células mononucleares HLA-DPB1 *0501-positivas crescem e produzem IFNYe IL-17.
4. Ensaio de Crescimento
Ensaio de crescimento foi efetuado pelo método de incorporação de [3H]-timidina. As células TA28.1 (3 X 104 células) e células mononucleares do sangue periférico (HLA-DRB1 *1501-positivo; 1 x 105 células) que foram pulsadas com os peptídeos WT1 e irradiadas foram cocultivadas em uma placa de 96 poços. Depois do cocultivo por 80 horas, 37 KBq/poço de [3H]-timidina (Amersham Biosciences) foi adicionada. Elas foram incubadas por mais 16 horas, e medidas usando o contador de β-cintilação. As medições foram representadas como contagem/minuto (cpm). Como controle, uma célula mononuclear de sangue periférico pulsando com um peptídeo foi usada. Além disso, para confirmar que o sinal de ativação é específico para uma molécula HLA-DRB1*1501, o anticorpo anti-MHC classe I, anticorpo anti-HLA-DR, anticorpo anti-HLA-DQ e anticorpo anti-HLA-DP foram usados. Os resultados estão mostrados na figura 5. Foi confirmado que as células TA28.1 foram ativadas por um sinal pelo peptídeo WT1 e HLA-DRB1*1501, e cresceram. Foi ainda confirmado que o crescimento foi específico para HLA-DRB1*1501, uma vez que ele foi suprimido pelo anticorpo anti-HLA-DR. Da mesma forma, as células E15.2 foram usadas para efetuar o
ensaio de crescimento. Como controle adicional, as células mononucleares do sangue periférico de um indivíduo HLA-DPB1 *0901-negativo foram usadas. Os resultados estão mostrados nas figuras 6 e 7. Foi confirmado que as células E15.2 foram ativadas por um sinal pelo peptídeo WT1 e HLA25 DPB1*0901 e cresceram. Foi ainda confirmado que o crescimento é específico para HLA-DPB1*0901, uma vez que ele é suprimido pelo anticorpo antiHLA-DP.
Além disso, células mononucleares HLA-DPB1 *0501/0501- positivas foram usadas para efetuar o crescimento de ensaio. Como controle, uma célula mononuclear do sangue periférico de um indivíduo HLADPB1 *0501 -negativo também foi usada. Os resultados estão mostrados nas figuras 8 e 9. Foi confirmado que células mononucleares HLADPB 1*0501/*0501-positivas foram ativadas por um sinal pelo peptídeo WT1 e HLA-DPB1*0501, e cresceram. Foi ainda confirmado que o crescimento é específico para HLA-DPB 1*0501, uma vez que ele é suprimido pelo anticorpo anti-HLA-DP.
5 Além disso, o ensaio de crescimento das células E15.2 foi efetu
ado com várias concentrações do peptídeo WT1. A concentração do peptídeo WT1 usado foi de 0,08, 0,4, 2, 10, 50, 100 ou 150 μο/ιτιί. Os resultados estão mostrados na figura 10. Foi confirmado que peptídeos WT1 fazem as células E15.2 crescer de modo dependente da concentração.
Aplicabilidade Industrial
A presente invenção fornece um método para a ativação de uma célula T auxiliadora com um peptídeo WT1, o qual tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901 ou molécula HLA-DPB1*0501 e uma composição para o mesmo, assim como uma 15 composição farmacêutica para o tratamento e/ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora e similar. Consequentemente, a presente invenção pode ser usada nos campos da medicina e similares, por exemplo, nos campos do desenvolvimento e preparação de uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamento de vários tumores hema20 topoiéticos e cânceres sólidos que expressam o gene WT1 em altas concentrações.
Claims (15)
1. Método para a ativação de uma célula T auxiliadora, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, e ativando consequentemente a célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma das moléculas HLADRB1*1501, HLA-DPB1*0901 e HLA-DPB1*0501.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a pelo menos duas das moléculas HLADRB1 *1501, HLA-DPB1 *0901 e HLA-DPB1*0501.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o peptídeo WT1 ainda tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLADRB1*0405 e/ou a uma molécula HLA-DRB1*1502.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901, molécula HLA-DPB1*0501, molécula HLA-DRB1*0405 e molécula HLA-DRB1*1502.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o peptídeo WT1 é um peptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID No: 2).
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a adição do peptídeo WT1 à célula apresentadora de antígenos é praticada pela adição do peptídeo WT1, a adição de um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo codificando o peptídeo WT1 ou a adição de uma célula incluindo o vetor de expressão.
7. Composição para ativação de uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre a molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLADPB1 *0901 e molécula HLA-DPB1 *0501.
8. Método para o tratamento ou prevenção de um câncer em um indivíduo, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígenos, e consequentemente a ativação de uma célula T auxiliadora, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre a molécula HLA-DRB1*1501, molécula HLA-DPB1*0901 e a molécula HLA-DPB1*0501.
9. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer pela ativação de uma célula T auxiliadora pela adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, compreendendo o peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB 1*0901 e uma molécula HLA-DPB1 *0501.
10. Anticorpo se ligando especificamente a um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma dentre uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 e uma molécula HLA-DPB1*0501.
11. Método para a determinação da presença ou quantidade de um peptídeo WT1 em qualquer um dentre um indivíduo HLA-DRB1*1501- positivo, HLA-DPB1*0901- positivo e HLA-DPB1 *0501-positivo, compreendendo: (a) a reação de um anticorpo anti-WT 1 com uma amostra do indivíduo; e (b) a determinação da presença ou quantidade do anticorpo antiWT1 se ligando especificamente ao peptídeo WT1 contido na amostra.
12. Método para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo a adição de um peptídeo WT1 a uma célula apresentadora de antígeno, e deste modo ativando uma célula T auxiliadora, e a administração da célula T auxiliadora ativada a um indivíduo, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 ou uma molécula HLA-DPB1*0501.
13. Composição farmacêutica para o tratamento ou prevenção de um câncer, compreendendo uma célula T auxiliadora ativada com um peptídeo WT1, em que o peptídeo WT1 tem a capacidade de se ligar a qualquer uma de uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLADPB1*0901 e uma molécula HLA-DPB1*0501.
14. Método para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1 -específica em qualquer um dentre um indivíduo HLA-DRB1 *1501-positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo e HLA-DPB1*0501- positivo, compreendendo: (a) a reação de um complexo de um peptídeo WT1 e uma molécula HLA-DRB1*1501, uma molécula HLA-DPB1*0901 ou uma molécula HLA-DPB1*0501 com uma amostra do indivíduo; e (b) a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora reconhecendo o complexo contido na amostra.
15. Método para a determinação da presença ou quantidade de uma célula T auxiliadora WT1-específica em um indivíduo HLA-DRB1*1501- positivo, HLA-DPB1 *0901-positivo, HLA-DPB1 *0501-positivo, HLADRB1*0405-positivo ou HLA-DRB1*1502- positivo, compreendendo: (a) a estimulação de uma célula mononuclear de sangue periférico, um linfócito invasivo, célula tumoral, célula em fluido ascítico, célula no fluido pleural, célula no fluido cerebrospinal, célula da medula óssea ou célula do nódulo linfático com um peptídeo WT1; e (b) a determinação da produção de uma citoquina ou da reação da célula T auxiliadora, em que a presença ou um aumento na quantidade da produção da citoquina ou a reação da célula T auxiliadora indica a presença ou quantidade da célula T auxiliadora WT1 específica.
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