JP2003524021A - 悪性中皮腫の診断および治療のための組成物および方法 - Google Patents

悪性中皮腫の診断および治療のための組成物および方法

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マーティン エイ． チーバー，
アレクサンダー ゲイジャー，
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ウィルムス腫瘍抗原に関連する癌（詳細には、中皮腫）の診断および治療のための、組成物および方法を開示する。本発明の特定の実施形態では、本発明は、ウィルムス腫瘍抗原ポリペプチド由来抗原性フラグメントに対する免疫応答およびＴ細胞応答を惹起するための、新規の、有効な、方法、組成物、およびキットを提供する。本発明はまた、ヒト悪性胸膜中皮腫の診断、検出、処置、モニタリング、および／または予防のためのこのような組成物の使用のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （１．発明の背景） 本出願は、２０００年２月２２日に出願された米国仮特許出願番号６０／１８
４（０７０）を優先権を主張する；これらの全明細書、請求項および図のいずれ
もが断り書きなしで本願明細書に引用される。この研究の部分は、補助金番号Ｓ
ＢＩＲ Ｒ４３ ＣＡ８１７５２の下で、米国保健社会福祉省から資金提供によ
る一部において、実施された。
【０００２】 （１．１ 技術分野） 本発明は、一般にガン診断および療法の分野に関する。より詳しくは、それは
組成物および中皮腫の発見および免疫治療のための方法の驚くべき開示手続に関
係する。そして、特に、悪性の肋膜の中皮腫。本発明は、ウィルムス腫抗原ポリ
ペプチド由来抗原性フラグメントへの免疫性のおよびＴ細胞反応を誘発するため
の、新規な、効果的方法、組成物、およびキット、ならびにヒト悪性の肋膜の中
皮腫の、診断、発見、処理、モニタリングおよび／または防止のためのこの種の
組成物の使用のための方法を提供する。
【０００３】 （１．２ 関連技術の説明） （１．２．１．ウィルムス腫抗原） ウィルムス腫遺伝子がコード化する核の表されたポリペプチドは、ＷＴ１と称
した、あるコピー要因を結合しているＤＮＡの構造上の特徴を所有する。ＷＴ１
は、４つの隣接する亜鉛指領域から成る４２９−アミノ酸ポリペプチドを含む代
わりに継がれた変化を有するそのカルボキシ終点、そして、一時的なトランスフ
ェクション分析評価の転写抑制または起動を調停するそのアミンの終点でグルタ
ミン／プロリンの豊富な領域。
【０００４】 ＷＴ１ペプチドの探知のための様々な診断上の試薬が存在する。そして、具体
的には、野生のタイプＷＴ１ポリペプチドの大きい内部アミノ酸断片を認識する
ウサギ多クローン性血清を含む。
【０００５】 市販のＷＴ１多クローン性抗体が存在する、しかし、多クローン性血清として
のそれらの性質を原因として生じるので、それらは密接に関連したタンパク質を
有する交差反応性および抗原特性および結合する類似性研究の矛盾している結果
を含む特定の不利な点を有する。この種の血清は、したがって、特に診断上の使
用にとって望ましくなくて、ＷＴ１ポリペプチドの活発な抑制において、治療的
な試薬を開発することに役立たない。
【０００６】 市販のマウス・モノクロナール抗体はまた、報告された、しかし、ほとんどは
大部分の治療的で診断上のアプリケーションに不適当である。−その理由は、次
のことにある。それらも、（ａ）は特定のユニークな組み継ぎ異なる配列（それ
は、代わりに継がれたＷＴ１ ｍＲＮＡの部分母集団だけにおいて、表される）
だけを認識する；または、相応するが、機能的に無関係なペプチド（ポリペプチ
ド）によって、交差反応して広く（ｂ）またはタンパク質。
【０００７】 （１． ２．２ 悪性中皮腫におけるＷＴ１ポリペプチドの検出） 悪性肋膜の中皮腫はますます普通のガンである。そして、主にアスベストへの
露出によって、生じる。アスベスト規則および改良された制御計測の実行の前に
、アスベスト塵にさらされた労働者の大衆は、病気のために危険にさらされてい
る。加えて、労働者はアスベストの重大な量にさらされ続ける。そのとき、アス
ベスト材料は革新、修復または破壊の間、乱される。材料をアスベスト含有する
ことは米国中で産業で、商用で住居の設定において、分かり続ける。そして、悪
性の中皮腫のために危険にさらされたままであるかなり大きい人口に結果として
なる。
【０００８】 悪性の中皮腫のための予想は、病気の段階までに影響される。手術、助手免疫
学の処理と同じ（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン）、初期診
断のまれに見るイベントだけにおいて、以外、効果的処理にあることができる。
【０００９】 （１．３ 従来技術の不足） 現代のガン治療に対する主な障害は、選択性の課題である；すなわち、通常の
細胞の機能を影響を受けないままにすると共に、ガンの細胞の増殖を禁止する能
力。
【００１０】 残念なことに、大部分の中皮腫患者は全然高度なステージだけにおいて、診断
される放射も、また、化学療法も、そして、多様式処理はかなり貧しい予想を変
えることができる。さらに、これらの患者のための標準の効果的療法の欠如は、
ありそうもない長期のサバイバルをする（Ｂｕｌｔｚｉｎｇｓｌｏｗｅｎ（１９
９９）の；Ｇｅｌｉｎａｒｏ ｅｔ ａＬ、２０００）。
【００１１】 しかし、より正確で以前の発見（選択的に過剰増殖している中皮腫細胞を禁ず
る改良された療法と同様に）を提供する診断上の方法によって、悪性の中皮腫で
苦しめられる患者のための低い生存率は、非常に改善されてもよい。必要も、中
皮腫のための効果的処理摂生のために、そして、既存の療法の有毒な副作用を迂
回して、直接治療的な構造物のガンの細胞のより特定の遺伝子現れを提供する特
定の、人間の悪性の肋膜の中皮腫において、存在する。人間の悪性の肋膜の中皮
腫のための適切な処理摂生の開発は、ｏｎｃｏｌｏｇｉｃな技術の技術のそれら
のための重大な前進を表して、この積極的なガンのための改良された診断上で治
療的な様相を容易にする。
【００１２】 （２． 発明の要旨） 本発明は、診断、発見、予防、療法およびＷＴ１提携のガンの、そして、特定
の、悪性の肋膜の中皮腫のｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎのための新規で効
果的戦略を識別することによって、従来技術において、前述の長いフェルト必要
および他の不足のアドレス指定を行う。
【００１３】 一つには、本発明は非常に免疫性の驚くべきで予想外の開示手続およびウィル
ムス腫（ＷＴ）遺伝子製品の特定の抗原性のペプチド断片へのＴ細胞反応に基づ
く（例えば、（ＷＴ１）特に有利な組成物および診断、予防および／または動物
のための療法のための方法を提供できる有して、疑う、あるいは、増加するＷＴ
１遺伝子発現によって、特徴づけられる一つ以上の悪性の病気になるための危険
でそして、特に、人間の悪性の肋膜の中皮腫を有することの。ＷＴ１遺伝子は、
元々識別されて、染色体１で細胞遺伝学な削除を基礎としてウィルムス腫（米国
特許番号５、３５０、８４０）をもつ患者のｌｐｌ３を分離した。遺伝子は、１
０人の近衛伍長から成って、マウスおよび人間のＷＴ１ポリペプチドのコピー要
因および配列が図１において、提供される亜鉛指をコード化する（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３１９およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３２０、それぞれ）。
【００１４】 第１実施例の、本発明が方法を提供することの生成する免疫性の、または、動
物の、そして、特に人間のような哺乳類のＴ細胞反応。少なくとも第１の単離さ
れたペプチドから成る動物に、一般の方法懸念は、長さの約６０のアミノ酸に対
する９または少なくともペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従う
第１の隣接するアミノ酸配列から成るこの種のペプチドをコード化する第１の核
酸部分から少なくとも第１の組成物の管理を検出する：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０ ３２６に対する３２１およびよりＳＥＱ ＩＤ Ｎ０のいかなる一つに
も従う特に隣接するアミノ酸配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０による２８：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯにおいて、開示される主要なアミノ酸配列のうちの１つ以上から成るペ
プチドについては、３１８：２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３４、ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０３５、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：４９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：８８（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０）：１４４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
：１８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９９（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２５５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：２８２（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０）：２８３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：特に好まれている２９３。
【００１５】 本発明は、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２
０または約１５のアミノ酸についてさえの好適な範囲（例えば約５５のそれらの
ペプチド）のまたはそのように長さのいかなる中間長さの中でもあることができ
るペプチドを含む、これらの範囲の中で全ての整数を含んでいる中間長さを有す
るそれらのペプチドと同じ（例えば、ペプチドは、約５４、約５３、約５２、約
５１、約４９、約４８、約４７、約４６、約４４、約４３、約４２、約４１、２
７または長さの約３６ほどのアミノ酸さえ、その他についての３８について、約
３９であってもよい。）。特定の実施態様において、より小さいペプチドが好ま
れるときに、ペプチドの長さは９または約１０であってもよい、または、約１１
または、あるいは、１３または約１４についてまたは長さのペプチドくらい長く
１５ほどのアミノ酸にさえついて、約１２は少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯのい
かなる一つにも従う第１の隣接するアミノ酸配列から成る：１（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：１３（ＳＥＱ ＩＤ）：１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１５（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：１７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ
）：１８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯのいかなる一つと同じくも、２０：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：
３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１３、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０３１４、ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０
）：３２１（ＳＥＱ ＩＤ）：３２２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２３（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：３２４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３２５およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３２６． 同様に、僅かにより長いペプチドが好まれるときに、ペプチドの長さが１６ま
たは約１７についてまたは１８または約１９についてあってもよい、または、約
２０または、あるいは、２２または約２３についてまたは長さのペプチドくらい
長く２４または約２５ほどのアミノ酸にさえついて、約２１は少なくともＳＥＱ
ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従う第１の隣接するアミノ酸配列から成る：Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０
に対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８
：３１１（ＳＥＱ ＩＤ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１４（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６．中間の長さ抗原性のペプ
チドまたは抗原結合断片が要求されるときに、ペプチドは約２６または約２７の
または２８または約２９についての命令にあることができる、または、約３０ま
たは、あるいは、３２または約３３についてまたは長さの各々それらくらい長く
３４または約３５ほどのアミノ酸にさえついて、約３１は少なくともＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯのいかなる一つにも従う第１の隣接するアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３
１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６。
【００１６】 これらのペプチドは、少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従う
第１の隣接するアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６、しかし、また任意に、少なくとも
１秒、少なくとも第３または少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも
従う第４であるかより大きい隣接するアミノ酸配列さえ成る：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１３：
２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３１１（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６．単一のペプチドは本願明細書にお
いて、開示される隣接するアミノ酸配列のうちの１つだけを含むことができる、
または、あるいは、単一のペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従
う複数の隣接するアミノ酸配列から成ることができる：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯに対する３２１：３２６．実際、ペプチドは複数の同じ隣接するアミノ酸
配列から成ることができる、または、それらはＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて、開
示される一つ以上の異なる隣接するアミノ酸配列から成ることができる：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対するＩ：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤに対する２８：３１１（
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ：Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６．例えば、単一のペプチドの、ｅｐｉ
ｔｏｐｉｃなペプチドが本願明細書において、開示するかまたは成ってもよいシ
ングルは、９から長さの約５０のアミノ酸まで成り立ってもよい２、３、４また
はＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいずれにでもて開示したように、５はっきりしたｅｐｉ
ｔｏｐｉｃな配列さえ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：
３１８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３２１：３２６
．あるいは単一のペプチドの、２、３、４またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる
一つにもて開示したように、５つの同一のｅｐｉｔｏｐｉｃな配列さえ、９から
長さの約５０のアミノ酸まで成り立ってもよい：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１
：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１３：２０（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：
３１３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０
に対する３２１：３２６。
【００１７】 １つの典型的な実施態様、組成物が９から長さの約４０のアミノ酸まで少なく
とも第１の単離されたペプチドから成るペプチドまたは少なくとも第１の核酸部
分において、それは、この種のペプチドをコード化する；そこにおいて、ペプチ
ドは少なくともＳＥＱ ＩＤ Ｎ０からなる群から選択される第１の隣接するア
ミノ酸配列から成る：３４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０
）：４９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：８８（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：１４４（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎ０）：１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１８５（ＳＥＱ ＩＤ）：
１９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２。
【００１８】 １４から長さの約６０のアミノ酸に対する１５からの長さおよびそれらの約６
０のアミノ酸へのそれらと同じく、本発明の好適なペプチドは、長さの６０のア
ミノ酸について１３から同様に１０から長さの約６０のアミノ酸へのそれら、１
１から長さの約６０のアミノ酸へのそれら、１２から長さの約６０のアミノ酸へ
のそれら、それらを含む。同様に、本発明の好適なペプチドは本当に１６から長
さおよびいずれでもの約６０のアミノ酸まで、それらを含む。そして、オーバー
オールの範囲内の長さの長さおよび副範囲は９から約６０のアミノ酸までペプチ
ドの範囲を好んだほど長さの。類似した傾向の、本発明も長さを有するそれらの
ペプチドを含むことの長さを有する長さおよびそれらの約５５か６０のアミノ酸
に対する１０または１１から１２または１３から長さの約４５か５０のアミノ酸
までの長さを有するそれらのペプチドと同じ１４または１５から長さの約３５か
４０のアミノ酸までの長さを有するそれらのペプチドの長さを有する長さおよび
それらのペプチドの約２５か３０のアミノ酸に対する１６または１７からの長さ
および、オーバーオールの範囲内の副範囲が９から長さの約６０のアミノ酸まで
変動する全てを含むために、その他の約２０ほどのアミノ酸に対する１８または
１９から。
【００１９】 この開示（この種がＳＥＱ ＩＤにて開示したように、配列するフレーズ）の
全体にわたって：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４」は、特に、そして、これ
らの配列識別子のいずれにでもよって開示されるいずれでもおよび全ての隣接す
るアミノ酸配列を含むことを目的とすると、ペプチド・配列が本願明細書の表４
９による表２において、明らかにした。それは言うことになっている。「ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯのいずれにでもて開示したように、配列：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０によ
る１：４」は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて、開示される配列を意味する：１（
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３またはＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：４。
【００２０】 同様に、ＳＥＱはの身元を確認する：いずれでもおよびそのような人々がＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯにて開示したように、配列する３７に対する２５：２５（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０）：２６（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：２７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：
２８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２９（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３０（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎ０）：３１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３２（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３３
（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３５（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：３６およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：３７、その他。事実、本発明はそれら
をコード化しているペプチドおよびポリヌクレオチドを含む。そして、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯと確認される配列のいかなる一つにもて開示したように、少なくとも
第１の隣接するアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１：４（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３
１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に
対する３２１：３２６． 本発明も、少なくとも本願明細書において、開示されるように、ペプチドまた
はペプチド変化のうちの１つ以上をコード化する第１の配列領域から成るポリヌ
クレオチドを含む。この種のポリヌクレオチドは、長さの約５０００のヌクレオ
チドまたは長さの約２０００のヌクレオチドまたは長さの約１０００のヌクレオ
チドまたは約９００または約８００に対するまたは７００または約６００につい
ての２７の配列領域に対するまたは５００または約４００についての２７の配列
領域に対するまたは３００または約２００についての２７の配列領域にまたは長
さの１００ほどのヌクレオチドにさえついて２７の配列領域から成ることができ
る。
【００２１】 それが少なくとも第１の配列領域から成ってそれらのポリヌクレオチドのよう
な、ペプチドの場合ペプチドをコード化する配列領域の長さがこれらの範囲のい
かなる中間長さの中でもあることができるように、約３０から長さの約７５０の
ヌクレオチドまでの少なくとも第１の配列領域から成るものの少なくとも第１の
配列領域から成る長さおよびものの約６５０のヌクレオチドに対する約３５から
の約５５０、約４５０、約３５０、約２５０、約１５０または長さの約５０ほど
のヌクレオチドにさえ対する約４０から。この種の配列領域は約２７または約２
８の命令にあることができる、または、２９または、あるいは、３１または約３
２についてまたは３３または約３４について、約３０についてまたは長さの３５
ほどのヌクレオチドにさえついて、配列領域が少なくとも第１のペプチドをコー
ド化する限り、それは少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従う第
１の隣接するアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１
３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
０に対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３
２１：３２６．中間の長さ抗原性のペプチドまたは抗原結合断片が要求されると
きに、それらをコード化する核酸は、４５または約５０についてまたは５５また
は約６０について、約４０のまたは６５または約７０についての命令にあること
ができる、または、７５または約８０についてまたは長さの８５か９０のほどヌ
クレオチドにさえついて、それらが少なくとも各々第１のペプチドをコード化す
る限り、それは少なくともＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにも従う第１の隣
接するアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３
２１：３２６．より大きい抗原性のペプチドをコード化しているかまたは断片を
抗原結合している配列領域から成るポリヌクレオチドが熟慮されるときに、それ
らをコード化している核酸配列領域は長さにおいて、必然的により長い。たとえ
ば、ペプチドをコード化している核酸配列領域または長さの５０のアミノ酸に約
４０の命令上の断片を結合している抗原が少なくとも約１２０から長さの約１５
０ほどのヌクレオチドまで、必然的にある。そして、三つ子コドンが単一のアミ
ノ酸をコード化することを必要とするという事実を与えられる。
【００２２】 同様に、特に配列領域が使用可能な状態で一つ以上のプロモータにまたは一つ
以上の信号の配列および／またはペプチド融合製品をコード化する一つ以上の配
列領域に結ばれるときに、この種の配列領域から成るポリヌクレオチドは符号化
領域より実質的に大きくありえる。それらの実施態様の、６００、約７００、約
８００、約９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４
００についてまたは１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または
上でさえ長さの２０００ほどのヌクレオチドにさえさえついて、ポリヌクレオチ
ドが約５００の命令にあることができることために、そして、約１０、０００ま
たはそのように長さのヌクレオチドの命令にあるそれらの配列を含むこと。この
種のポリヌクレオチドは、特に発現ベクトル、交付ビヒクル、ウィルスのベクト
ルの準備に役立って、ポリヌクレオチドおよび／または遺伝子の構造物または発
現要素の範囲内で成られる配列領域によって、コード化される特定のコード化さ
れたペプチドおよび／または抗原−結合断片を表す宿主細胞を変えた。
【００２３】 典型的な他の実施態様において、第一がペプチドを長さの約１１のアミノ酸に
対する９または少なくともペプチドをコード化する第１の核酸部分から分離した
最少で、ペプチドは成り立つ；そこにおいて、ペプチドは本質的にＳＥＱ ＩＤ
ＮＯのいかなる一つものアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０１：ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎ０ ４：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０ １３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ２０：
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０ ２８：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０ ３１１：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０
３１３：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ３１４：ＳＥＱ ＩＤ ３１６：およびＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０ ３１８：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０ ３２１：３２６。
【００２４】 同様に、関連した他の実施態様において、第一がペプチドを長さの約１０か１
１のほどアミノ酸に対する９または少なくともペプチドをコード化する第１の核
酸部分から分離した最少で、ペプチドは成り立つ；そこにおいて、ペプチドはＳ
ＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つものアミノ酸配列から成る：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２
８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１４お
よびＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３１６：３１８、そして
、特にそこにおいて、ペプチドＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つものアミノ酸
配列の成る：３４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：４９
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：８８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１４４（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０）：１４７（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１８５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１
９８（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１９９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８２。
【００２５】 単一のペプチド種から成るペプチドおよび組成物に加えて、本発明も２、３、
４またはより多くのペプチド種から成る組成物に関することおよび／またはこの
種のペプチドをコード化するポリヌクレオチド。ペプチドおよび／またはポリヌ
クレオチド種のこの種の多数は、特にＳＥＱ ＩＤ ＮＯのアミノ酸配列にて開
示したように、２つ以上の異なる隣接するアミノ酸配列を有するペプチドの多数
から成る治療的なエージェントの処方物において、望ましい：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：
２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３２１：この種のペプチドをコード化する３２６お
よび／または複数のポリヌクレオチド。特定の抗原性のＷＴ１から派生したペプ
チドおよびポリヌクレオチド合成物の産地にかかわりなく、本発明が特に１つか
、２つか、３つか４つのはっきりした上でペプチド（ポリヌクレオチドまたはそ
れの派生物）の使用を熟慮することために、そして、複数のこの種の合成物を含
むこと。これは、全アプリケーションの全体にわたって単数用語の使用を例証す
る。そこにおいて、用語ａａｎｄ「感覚において、使用するａｎａｒｅそのそれ
ら最も少なく一つのｍｅａｎａｔ」（少なくとも第一）」、１またはｍｏｒｅｏ
ｒａ ｐｌｕｒａｌｉｔｙｏｆ参照された構成要素または、上限がその後で、具
体的には、述べられるかまたは従来技術において、当業者によって、よく理解さ
れている例において、以外、ステップ。いかなる一人の代理人もの量と同様に、
組合せの操作可能な限度およびパラメータは、現在の開示を考慮して技術の通常
の技術のそれらにとって公知である。
【００２６】 この種の組成物の追加のペプチドはほぼ同じサイズおよび／またはほぼ同じ主
要なアミノ酸配列の中で全くあることができる、または、あるいは、ペプチドは
かなり長さおよび／または主要なアミノ酸配列において、異なることができる。
この種の組成物は、一つ以上の追加の構成要素（例えば薬学的に受け入れられる
賦形剤、バッファまたは詳細にて説明したように、以下に試薬）から更に成るこ
とができる。
【００２７】 本願明細書において、記載されているように、この種の組成物はまた、少なく
とも任意に第１の免疫刺激物または少なくとも第１の助手から更に成ることがで
きる。この種の免疫刺激物および助手は、優先して人間のＴ細胞反応を強化して
、好ましくはＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０、Ｓｅｐｐｉｃ Ｍｏｎｔａｎｉ
ｄｅ ＩＳＡ７２０、サイトカイン、ミクロスフェア、ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｄｉ
ｏｃｔａｄｅｃｙｌアンモニウム臭化物助手、ＡＳ−１、ＡＳ−２、Ｒｉｂｉ
Ａｄｊｕｖａｎｔ、ＱＳ２１、サポニン、ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｄされた
シンテックス助手、ＭＶ、ｄｄＭＶ、免疫性の刺激的な複合体および機能させな
くされた毒素からなる群から選択されることができる。以下により多くの詳細に
て説明したように、そして、特に第４節において、組成物は診断上であるか治療
的な使用のために処方物されることができる。そして、特に好まれている非経口
で、静脈で、腹膜内で、皮下で、鼻腔内で、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌで口のルー
トをもつ哺乳類（例えば人間）の管理に適しているそれらの処方物については、
臨床包装および／または商用の再販のための一つ以上の診断上であるか治療的な
キットに、それらの編入を含む。
【００２８】 組成物は、更に任意に一つ以上の発見試薬、一つ以上の追加の診断上の試薬、
一つ以上の制御試薬および／または一つ以上の治療的な試薬から成ることができ
る。診断上の試薬の場合、組成物は更に任意にｖｉｔｒｏのおよび／または活発
な診断上で治療的な方法論の両方ともにおいて、使うことができる一つ以上の検
出可能なラベルから成ることができる。治療的な組成物および処方物の場合、本
発明の組成物がまた、更に任意に一つ以上の追加の制癌性であるか、反対の中皮
腫か一方治療として有益な構成要素から成ることができること特定の状況、その
他において、必要でありえるように、ような。
【００２９】 別の態様においては、本発明も忍耐強い、人間の患者に貢献することから成る
人間の悪性の中皮腫の発達を禁止する方法に成り立っている製薬組成物を提供す
る：（ａ） 自国のＷＴ１またはそれの変化の免疫原性部分から成るＷＴ１ペプ
チド、一つ以上の置換、削除、加算および／または挿入において、異なる抗原に
特有の抗体および／またはＴ細胞系とともに化学反応する変化またはクローンの
能力が実質的に減らされない；そして、（ｂ）生理的に受け入れられるキャリア
または賦形剤。特定の実施態様の範囲内で、患者は悪性の中皮腫に悩む。他の実
施態様において、組成物は予防して悪性の中皮腫の発達のために危険にさらされ
たとみなされる患者に与えられる。ＷＴ１ペプチドはワクチンの範囲内であって
もよいが、あってはならない。そして、それは免疫刺激物（例えば助手）から更
に成る。
【００３０】 更なる態様の範囲内で、方法が忍耐強い、人間の患者に貢献することから成る
人間の悪性の中皮腫の発達を禁止して提供されること、成り立って、製薬の組成
物：（ａ） ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチド。そこにおい
て、ペプチドは自国のＷＴ１またはそれの変化の免疫原性部分から成る。そして
、一つ以上の置換、削除、加算および／または挿入において、異なる抗原に特有
の抗体および／またはＴ細胞系とともに化学反応する変化またはクローンの能力
が実質的に減らされない；そして、（ｂ）薬学的に受け入れられるキャリアまた
は賦形剤。
【００３１】 特定の実施態様の範囲内で、患者は悪性の中皮腫に悩む。他の実施態様におい
て、組成物は予防して悪性の中皮腫の発達のために危険にさらされたとみなされ
る患者に与えられる。ＷＴ１ポリヌクレオチドはワクチンの範囲内であってもよ
いが、あってはならない。そして、それは免疫刺激物（例えば助手）から更に成
る。
【００３２】 方法は、更に、人間の患者に製薬組成物を与えることから成る、人間の患者の
悪性の中皮腫の発達を禁止することを提供される：抗体またはそれの抗原−結合
断片が非常に特にＷＴ１に結合する（ａ）；そして、（ｂ）薬学的に受け入れら
れるキャリアまたは賦形剤。特定の実施態様の範囲内で、患者は悪性の中皮腫に
悩む。他の実施態様において、組成物は予防して悪性の中皮腫の発達のために危
険にさらされたとみなされる患者に与えられる。
【００３３】 更なる態様の範囲内で、方法が忍耐強い、人間の患者に貢献することから成る
人間の悪性の中皮腫の発達を禁止して提供されること、成り立って、製薬の組成
物：Ｔ細胞が非常に特にＷＴ１と作用する（ａ）；そして、（ｂ）薬学的に受け
入れられるキャリアまたは賦形剤。特定の実施態様の範囲内で、患者は悪性の中
皮腫に悩む。他の実施態様において、組成物は予防して悪性の中皮腫の発達のた
めに危険にさらされたとみなされる患者に与えられる。
【００３４】 人間の患者の悪性の中皮腫の発達を禁止する更なる方法は人間の患者に製薬組
成物を与えることを含む。そして、成り立つ：（ａ）自国のＷＴ１またはそれの
変化の免疫原性部分から成るＷＴ１ペプチドを表す（ｉ）抗原−示している細胞
、一つ以上の置換、削除、加算および／または挿入において、異なる抗原に特有
の抗体および／またはＴ細胞系とともに化学反応する変化またはクローンの能力
が実質的に減らされない；そして、（ｂ）薬学的に受け入れられるキャリアまた
は賦形剤。特定の実施態様の範囲内で、患者は悪性の中皮腫に悩む。他の実施態
様において、組成物は予防して悪性の中皮腫の発達のために危険にさらされたと
みなされる患者に与えられる。細胞を示している抗原はワクチンの範囲内であっ
てもよいが、あってはならない。そして、それは免疫刺激物（例えば助手）から
更に成る。
【００３５】 他の態様の範囲内で、本発明は忍耐強い、人間の患者に貢献することから成る
人間の悪性の中皮腫の発達を禁止する方法に刺激されるおよび／または発泡させ
たＴ細胞の準備を提供する。そこにおいて、Ｔ細胞は刺激されておよび／または
ＷＴ１ペプチドとの接触、ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチド
および／またはＷＴ１ペプチドを表す抗原−示している細胞によって、広がった
。たとえば、Ｔ細胞は骨髄、周辺の血液または骨髄または周辺の血液の一部分の
範囲内であってもよい（例えば、（悪性の中皮腫で苦しめられる患者から得られ
る）。Ｔ細胞は、展開の前にクローンをつくられることが可能であるが、クロー
ンをつくられてはならない。
【００３６】 方法は、患者（ステップを含むこと）の悪性の中皮腫の発達を禁止して、更に
提供される：以下の通りの一つ以上をもつ患者から分離されるＣＤ４＋および／
またはＣＤ８’Ｔ細胞を培養している（ａ）（ｉ） ＷＴ１ペプチド；（ｉｉ）
ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ） Ｗ
Ｔ１ペプチドを表す抗原−示している細胞；Ｔ細胞が増殖するように；そして、
患者に実働兵員を与えることは、増殖されたＴ細胞の中で達する。（ｂ）患者（
ステップを含むこと）の悪性の中皮腫の発達を禁止する更なる方法：以下の通り
の一つ以上をもつ患者から分離されるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞
を培養している（ａ）（ｉ） ＷＴ１ペプチド；（ｉｉ） ＷＴ１ペプチドをコ
ード化しているポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ） ＷＴ１ペプチドを表す抗
原−示している細胞；Ｔ細胞が増殖するように；ＷＴ１ペプチドがある場合には
、増殖した（ｂ）クローニング一つ以上細胞；そして、患者にクローンをつくら
れたＴ細胞の効果的量を与えている（ｃ）。
【００３７】 他の態様の範囲内で、本発明は方法を患者（ステップを含むこと）の悪性の中
皮腫の有無を決定するために提供する：以下の通りの一つ以上をもつ患者から分
離されるＣＤ４’ａｎｄ／ｏｒ ＣＤ８’Ｔ細胞を培養している（ａ）（ｉ）
ＷＴ１ペプチド；（ｉｉ） ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチ
ド；または（ｉｉｉ） ＷＴ１ペプチドを表す抗原−示している細胞；そして、
（ｂ）検出Ｔ細胞の特定の起動の有無。たとえば、検出するステップは成り立つ
ことができる。そして、Ｔ細胞の増殖または細胞融解活動の生成の有無を検出す
る。
【００３８】 本発明は、更に方法を患者（ステップを含むこと）の悪性の中皮腫の有無を決
定するために提供する：以下の通りの一つ以上をもつ患者から得られる生物学的
サンプルを培養している（ａ）（ｉ） ＷＴ１ペプチド；（ｉｉ） ＷＴ１ペプ
チドをコード化しているポリヌクレオチド；または（ｉｉｉ） ＷＴ１ペプチド
を表す抗原−示している細胞；そこにおいて、インキュベーションは状況の下で
実行されて、しばらく、形成する免疫複合体を許すのに十分である；そして、Ｗ
Ｔ１ペプチドの間で形成される検出（ｂ）免疫複合体および生物学的サンプルの
抗体は、ＷＴ１ペプチドに非常に特に縛る。たとえば、検出するステップは免疫
複合体に縛ることができる発見試薬を有する免疫複合体を培養している（ａ）を
含むことができる。そこにおいて、発見試薬はリポータ・グループ、移動してい
る解放された（ｂ）発見試薬およびリポータ・グループの有無を検出している（
ｃ）から成る。
【００３９】 免疫の効果または患者（ステップを含むこと）の悪性の中皮腫の治療をモニタ
するために、他の態様の範囲内で、方法は更に提供される：以下の通りの一つ以
上を有する第１の生物学的サンプルを培養している（ａ）（ｉ） ＷＴ１ペプチ
ド；（ｉｉ） ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチド；またはＷ
Ｔ１ペプチドを表す、第１の生物学的サンプルがある抗原−示している細胞が療
法または免疫の前に患者から得た、そして、インキュベーションが状況の下で実
行されて、しばらく、形成する免疫複合体を許すのに十分である（ｉｉｉ）；Ｗ
Ｔ１ペプチドの間で形成される検出（ｂ）免疫複合体および生物学的サンプルの
抗体は、ＷＴ１ペプチドに非常に特に縛る；ステップ（ａ）を繰り返していて、
忍耐強い以下の療法または免疫から得られる第２の生物学的サンプルを使用して
いる（ｂ）（ｃ）；そして、免疫複合体の数を比較することは、第１および第２
の生物学的サンプルにおいて、検出した。（ｄ）たとえば、検出するステップは
免疫複合体に縛ることができる発見試薬を有する免疫複合体を培養している（ａ
）を含むことができる。そこにおいて、発見試薬はリポータ・グループ、移動し
ている解放された（ｂ）発見試薬およびリポータ・グループの有無を検出してい
る（ｃ）から成る。
【００４０】 更なる態様の範囲内で、方法は免疫の効果または患者（ステップを含むこと）
の悪性の中皮腫の治療をモニタして提供される：以下の通りの一つ以上を有する
第１の生物学的サンプルを培養している（ａ）（ｉ） ＷＴ１ペプチド；（ｉｉ
） ＷＴ１ペプチドをコード化しているＷＴ１ポリヌクレオチド；または（ｉｉ
ｉ） ＷＴ１ペプチドを表す抗原−示している細胞；そこにおいて、生物学的サ
ンプルはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞から成って、療法または免疫
の前に患者から得られる。そして、インキュベーションは状況の下で実行されて
、しばらく、特定の起動、増殖および／または生物学的サンプルのＴ細胞の渙散
を許すのに十分である；（ｂ）検出起動、増殖および／またはＴ細胞の渙散の量
；ステップ（ａ）を繰り返していて、第２の生物学的サンプルが同じ忍耐強い以
下の療法または免疫から得られるＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞から
成っている第２の生物学的サンプルを使用している（ｂ）（ｃ）；そして、（ｄ
）比較起動、増殖および／または第１および第２の生物学的サンプルのＴ細胞の
渙散の量。
【００４１】 本発明の方法の全体にわたってａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ抑制するａｍｏｕｎｔ
ｉｓ効果的な第１のＷＴ１合成物の少なくとも量禁止して、そして、好ましくは
かなり禁止する、この種の不調で苦しめられる動物の中皮腫。効果的抑制する量
は、このようにまた、禁じて、好ましくはかなり禁ずる量実兵力である、天然の
ＷＴ１ポリペプチドの生物学的活動。好ましくは、効果的抑制する量は、効果的
なＷＴ１合成物の量である禁止して、そして、好ましくはかなり禁止する、人間
の天然のＷＴ１ポリペプチドの生物学的な活動有してまたは疑う悪性の肋膜の中
皮腫を有することの。抑制のいかなる程度も本発明を満たすのに十分である。但
し、通常の技術のそれらは従来技術において、指示するのに十分であるレベルが
ｖｉｔｒｏにおいて、そして、活発な抑制において、好んだ抑制を理解する。
【００４２】 「ａｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ（すなわち）が絶えず観察したＩｎｈｉｂｉｔ
ｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｓ、前述のパラメータのうちの１つ以上の抑制。少なくと
も５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％または制御と比
較して約８５％についての前述のパラメータ（例えば約５０％の再生可能な抑制
）の一つ以上の再生可能であるか絶えず観察された重大な抑制が平らにするＡｓ
ｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｉｓ（すなわち）ＷＴ１治療的な
組成物の非存在下で。
【００４３】 本発明を実践することを必要としないにもかかわらず、約９６％、９４％につ
いてのまたは９８％またはそれ以上についてさえの約９２％、約９０％の抑制レ
ベルは少なくとも決して除外されない。
【００４４】 本願明細書において、開示される治療的な方法のうちの１つ以上の遂行は、悪
性の中皮腫を防ぐかまたは治療するための効果的療法を引き起こす。これらの方
法、概して動物または患者に与えることから成る、あるいは、危険にさらされて
、悪性の中皮腫になるために少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、細胞を示
している抗原、Ｔ細胞、断片を結合している抗原または動物または患者の細胞の
範囲内で、悪性の中皮腫を禁ずるのに効果的なポリヌクレオチドの量を有する疑
いがあって、有するこのことにより防止であるか扱っている悪性の中皮腫。
【００４５】 用語生物学的効果的量および有効に抑制する量のＷＴ１ペプチド、抗体、細胞
を示している抗原、Ｔ細胞、断片を結合している抗原またはポリヌクレオチド組
成物の範囲内でこのように含まれる先の予防的および治療として効果的量。いく
つかを生産するのに効果的な開示されたＷＴ１合成物および好ましくはいくつか
の全てのこうのゆな有効量量重大な、動物または患者の管理への利点。利点は、
伝送および他の獣医で臨床利点のチャンスを少なくすることと、同様に徴候（厳
しさおよび／または持続）を減らすことを含む。Ｉ、第１のＷＴ１ペプチド、抗
体、細胞を示している抗原、Ｔ細胞、断片を結合している抗原またはポリヌクレ
オチド組成物の効果的量がこのことにより少なくとも提供されることができるく
らい、長く、本発明において、使うことができる管理のルートは、実質的に無制
限である。ｅを含む開示された組成物の治療的な配送のための典型的な手段。摂
取、吸入、ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ、非経口の管理、鼻腔内の管理、皮下の注入
、静脈注射、連続する注入、などは、以下に更に詳細に議論される。
【００４６】 全てのこの種の組成物および本発明の方法は、一つ以上の他の抗癌剤（例えば
少なくとも１秒、第３、第４または第５）の用途に、結合されることができるａ
ｎｔｉ中皮腫エージェントまたは少なくとも第１であるか、第２であるか、第３
であるか第４の制癌性の治療的なエージェント。治療的なエージェントが動物ま
たは患者に与えられることが可能であるはっきりした制癌性であるか反中皮腫の
、そして、組合せの毒性を制限している服用を含む複数。
【００４７】 本発明は、このように他の療法との相乗効果的な組合せおよび／またはおそら
く服用−制限する毒性および／または抵抗による周知のエージェント（以前に生
体内に最大限の効果を達成することに失敗した特にそれらの方法およびエージェ
ント）を形成するために用いることがありえる。
【００４８】 この種の組合せ療法で少なくとも、第１のＷＴ１ペプチド、抗体、細胞を示し
ている抗原、Ｔ細胞、断片を結合している抗原または、そして、第２の反中皮腫
または制癌性の治療的なエージェントが単一の製薬処方物または２つのはっきり
した製薬処方物から例えば実質的に同時に動物または患者に施されることができ
る最少で、ポリヌクレオチド。あるいは少なくとも、第１のＷＴ１ペプチド、抗
体、細胞を示している抗原、Ｔ細胞、断片を結合している抗原または、そして、
第２の反中皮腫または制癌性の治療的なエージェントが交互の日に例えば順番に
動物または患者に施されることができる最少で、ポリヌクレオチド。
【００４９】 更なる実施態様において、本発明は治療的なキットの範囲を提供する。キット
が少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、細胞を示している抗原、Ｔ細胞、断
片を結合している抗原またはポリヌクレオチド組成物の治療として効果的量を含
むことを確信している。そして、動物または主題に組成物を与えるための指示、
または、中皮腫になるための、そして、特定の、悪性の肋膜の中皮腫の危険にさ
らされた。この種のキットは、ＷＴ１ポリペプチドまたは抗体を検出する少なく
とも一つの診断上のエージェントまたは中皮腫細胞を検出する少なくとも一つの
診断上のエージェントの効果的量と組み合わせられることが可能である；または
、少なくとも一つの他の制癌性であるか、反対の中皮腫か反対のＷＴｌポリペプ
チド治療的なエージェントの治療として効果的量を有する。
【００５０】 本願明細書において、開示される組成物の特定の他の治療的なキットおよび使
用は少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、細胞を示している抗原、Ｔ細胞、
断片を結合している抗原またはポリヌクレオチドの効果的量から成ることができ
る。そして、検出する少なくとも一つの診断上のエージェントの効果的量は中皮
腫細胞を検出する；または少なくとも１、２、３、４またはいかなる数の他の制
癌性であるか、反対の中皮腫か反対のＷＴ１ポリペプチド治療的なエージェント
の効果的量。指示は、また、これらのキットと組み合わせられることが可能であ
る。薬を製作し使用することに対するもののような、他の生物学的エージェント
または構成要素は含まれることができる。
【００５１】 典型的な診断上のエージェントは、少なくとも第１のＷＴ１−符号化核酸を検
出する分子の生物学的エージェントを含む；少なくとも、第１のＷＴ１ペプチド
またはポリペプチド（少なくとも少なくとも第１のＷＴ１タンパク質を検出する
第１の抗体またはペプチド）；そして、少なくとも、第１のＷＴ１タンパク質ま
たは少なくともＷＴ１タンパク質またはペプチドに縛る第１の抗体を検出するペ
プチド。追加の治療的なエージェントの範囲は、公知である現在の開示を考慮し
た本願明細書において、記載されているそれらにより例証されるように技術の通
常の技術のそれら。
【００５２】 この種のキットで、診断上のエージェントは、好ましくはキットのはっきりし
たコンテナ内に配置される。結合された治療的なエージェントは、しかし「カク
テル混合物において、ＷＴ１組成物と同じ組成物のキット（すなわち）の単一の
コンテナの範囲内で結合されることができる。はっきりしたコンテナにおいて、
それらはＷＴ１合成物から別に代わりに維持されることができる。
【００５３】 いかなる薬学的に受け入れられる形式にもおいて、本発明はこのように少なく
とも１秒の反ＷＴ１、ａｎｔｉ中皮腫または制癌性の治療的なエージェントの治
療として効果的量と協力して、ＷＴ１合成物の治療として効果的量から成る組合
せ治療学を提供する。また、薬剤の製造またはいかなる薬学的に受け入れられる
形式にもおいて少なくとも第１のＷＴ１組成物の治療として効果的量から成る医
薬のカクテルに用いられる組成物は、提供される。
【００５４】 さらに、本発明は薬剤の製造に用いられる組成物または、いかなる薬学的に受
け入れられる形式も、第１のＷＴＩ組成物および複数のはっきりした反対のＷＴ
ｌか、反対の中皮腫か制癌性の治療的なエージェントにおいて、成り立つ医薬の
カクテルを提供する。 ＷＴ１合成物が治療的な方法の１つの構成要素である結合された使用および薬剤
は、また、本発明の範囲内で含まれる。
【００５５】 これらの、そしてまた他の、本発明の態様は以下の詳細なる説明を参照するこ
とで、明らかになって、図面を取り付けた。あたかも各々が個々に取り入れられ
るかのように、本願明細書において、開示される全ての参照はそれらの全部にお
いて、本願明細書に引用したものとする。
【００５６】 本発明は、参照番号の類のいずれが要素のように同一化するか、添付の図面と
ともにとられる以下の説明を参照することで、そして、中でよく理解されていて
もよい。
【００５７】 （４． 本願明細書において記載されている本発明をより充分に理解するために、以下
の種々の例示的実施形態の記載が示される。
【００５８】 本発明は、一般に組成物およびＷＴＩ提携の病気（例えば悪性の中皮腫）の免
疫治療および診断のための方法を目的とする。
【００５９】 ＷＴ１に対する特定のＷＴ１発現および免疫反応の（例えば、（患者血清のＷ
Ｔ１特定の抗体の存在）、患者を悪性の中皮腫および他のＷＴ１関連する悪性で
識別する目印として使用できる（白血病に例えば（例えば、鋭いｍｙｅｌｏｉｄ
白血病（ＡＭＬ）、常習的なｍｙｅｌｏｉｄ白血病（ＣＭＬ）、鋭いｌｙｍｐｈ
ｏｃｙｔｉｃな白血病（ＡＬＬ）、そして、幼年期ＡＬＬ）（脊髄形成異常な症
候群）ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅな症候群、前立腺ガン、肺ガン、
乳ガン、甲状腺のガン、胃腸内のガン、腎臓ガン、肝臓ガン、卵巣のガン、睾丸
のガン、そして、黒色腫）。この種の診断上の方法（ｅ。高いスループット分析
評価フォーマットにおいて、ｇ．）ガンの早い診断のための使用されることがで
きて、そして、健康な個人のスクリーニングを許可できる誰有してまたは有する
かもしれないアスベストにさらす。この種の悪性に悩むとわかられる患者は、ベ
ースのワクチンまたはＴ−細胞治療的な方法が本願明細書において、提供したＷ
Ｔ１−から利益を得ることができる。
【００６０】 本願明細書において、一般に記載されている組成物は、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ
１ポリヌクレオチド、抗原−示している細胞から成る（ＡＰＣ ；例えば、樹状
突起の細胞）、ＷＴ１ペプチド、具体的には、ポリペプチドをＷＴ１に結合する
抗体のようなエージェントおよびＷＴ１ｄｅｒｉｖｅｄペプチドを表す；および
／または免疫性のシステム細胞（例えば、（Ｔ細胞）ＷＴ１．のための具体的で
ある本発明のＷＴ１ペプチドは、それについて少なくとも一般に一部のウィルム
ス腫遺伝子製品（ＷＴｌ）または変化から成る。主題発明の核酸配列は一般にＤ
ＮＡ（ＰＮＡ）から成る、または、全てをコード化するＲＮＡ配列またはこの種
のペプチドまたはそれの部分はこの種の配列に相補的である。抗体は、タンパク
質または抗原−結合がそれについて分解する、一部のＷＴ１ペプチドに縛ること
ができる一般に免疫性のシステムである。この種の組成物の範囲内で使用される
ことができるＴ細胞は一般に細胞である（例えば、（ＣＤ４’ａｎｄ／ｏｒ Ｃ
Ｄ８）』）、ＷＴ１ペプチドに特有である。本願明細書において、よりはるかに
記載されている特定の方法は、本願明細書において、提供されるように、少なく
とも第１のＷＴ１ペプチドまたはポリペプチドを表す一つ以上の抗原−示してい
る細胞を使用する。
【００６１】 （４．１ ＷＴ１ペプチド） 本発明のコンテキストの範囲内で、典型的な好適なＷＴ１から派生した抗原性の
ペプチドがそれらのペプチドを含むことの少なくとも第１のエピトープ、抗原性
の断片、サイトを結合している抗体またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯからなる群から選
択される免疫原性配列から成る長さの約１００のアミノ酸に対する９から：ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に
対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：
３１１（ＳＥＱ ＩＤ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３１６：３１８およびＳＥＱＩＤ Ｎ
Ｏ：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する３２１：３２６。
【００６２】 それが少なくとも第１の免疫原性部分から成る、または、天然のＷＴ１ポリペ
プチドまたは変化の中でそれについて、縛ることは据え付ける。そして、特にそ
れらのペプチド・配列がＳＥＱのいかなる一つにもおいて開示したエピトープま
たは抗体がＮＯの身元を確認すると仮定するならば、ＷＴＩから派生したペプチ
ドはいかなる中間長さの中でもあることができる：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する
１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥ
Ｑ ＩＤ Ｎ０）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ
Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ Ｎ０に対する３２１：３２６．換言すれば、ＷＴ１ペプチドは、ｏｌｉｇｏ
ペプチド（すなわち、アミノ酸残留物（例えば約１２か１３のほどアミノ酸残留
物に対する９）の比較的少ない数からなるそれら）、より大きいｏｌｉｇｏペプ
チドｓ（すなわち（アミノ酸残留物の例えば、約２０ほどのアミノ酸残留物に対
する１４について、比較的より大きい数からなるそれら）、さらにより大きいペ
プチドであってもよい（すなわち、例えば、約４０ほどのアミノ酸残留物に対す
る２１についてのアミノ酸残留物の比較的より大きい数からなるそれら）前へ、
したがって最高、そして、中間サイズの全てのペプチドと同様にアミノ酸残留物
（例えば約９０か１００のほどアミノ酸残留物に対する約５）のかなりより大き
い数から成るそれらのペプチドを含むこと。
【００６３】 特定の実施態様の範囲内で、天然のＷＴ１ペプチドの少数の連続的アミノ酸残
留物を含むＷＴＩペプチドの使用は、好まれる。Ｔ細胞反応の生成が要求される
特定の使用のために、この種のペプチドは、好まれる。たとえば、この種のＷＴ
１ペプチドは、好ましくは天然のＷＴ１ポリペプチドの少なくとも９または少な
くとも約１０か、１１か、１２か、１３か、１４か１５の以上連続的アミノ酸残
留物を含む。
【００６４】 非アメリックなペプチド（９−マーまたは天然のＷＴ１ポリペプチドの少なく
とも９つの連続的アミノ酸残留物から成るそれら）は、特に本願明細書において
、開示される方法に役立つために熟慮される。ペプチドおよびこの種の配列がそ
うすることができるいかなるＷＴ１の範囲内でも、自国のプロテインＡおよび／
または異種な配列に由来する追加の配列は、あってもよい（必要以外の）更なる
免疫原性であるか抗原性の特性を所有する。ペプチド本願明細書において、提供
する他のペプチドまたは非ペプチド合成物を有する、更に関連させることができ
る（共有結合または非共有結合）。免疫学的部分、本願明細書において、使用す
る、認識される（すなわち（具体的には、束縛される）一部のペプチドは、Ｂ−
細胞および／またはＴ−細胞表層の抗原受容器によって、ある。好適な免疫原性
部分がＭＨＣクラスに縛ることを確信しているＩまたはクラスＩＩ分子。ここで
使用しているように、免疫原性部分は、前記ｔｏｂｉｎｄ ｔｏａｎ ＭＨＣク
ラスであるＩまたはクラスＩＩ分子この種の結合が公知技術のいかなる分析評価
も使用して検出可能な。たとえば、Ｉが１１５１の編入を促進する能力をモニタ
して、間接的に評価されることができるＭＨＣクラスに縛るペプチドの能力は、
ＭＨＣクラスＩ／ｐ２ｍ／ペプチドヘテロトリマーな複合体、パーカーほか、１
９９４に、２−ミクログロブリン（ｐ２ｍ）にラベルをつけた。あるいは、従来
技術において、周知である機能のペプチド競争分析評価を、使用できる。特定の
免疫原性部分は、一つ以上の表２−１４の範囲内で詳述される配列のうちの１つ
以上を有する。
【００６５】 本発明の典型的な免疫原性ペプチドは表４９による表２において、例示される
実施例において、開示されるそれらを含むが、これに限定されるものではない、
そして、特に、少なくともＳＥＱのいかなる一つにもおいて定義した第１のアミ
ノ酸配列から成るペプチドはＮＯの身元を確認する：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対す
る１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６。
【００６６】 図示するＷＴ１から派生したペプチド組成物は、少なくともＳＥＱ ＩＤから
なる群から選択される第１のアミノ酸配列から成るものを含むが、これに限定さ
れるものではない：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）： ＳＥＱ ＩＤに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：３１４およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する
３１６：以下のいかなる一つにもて開示したように、３１８および特にこの種の
配列：ＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧ（人間のＷＴ１残留物６−２２；Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬＥ（
人間のおよびマウスＷＴ１残留物１１７−１３９；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２およ
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、それぞれ）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷ
ＴＥ（人間のＷＴ１残留物２４４−２６２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、ＧＡＴ
ＬＫＧＶＡＡ（人間のＷＴ１残留物２４４−２５２；ＳＥＱ ＩＤ：８８）、Ｃ
ＭＴＷＮＱＭＮＬ（人間のおよびマウスＷＴ１残留物２３５−２４３；ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：４９およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８、それぞれ）、ＳＣＬＥＳ
ＱＰＴＩ（マウスＷＴ１残留物１３６−１４４；ＳＥＱ ＩＤ：２９６）、ＳＣ
ＬＥＳＱＰＡＩ（人間のＷＴ１残留物１３６−１４４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
９８），ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（人間のおよびマウスＷＴ１残留物２２５−２３３
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４、それぞれ）
；ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（マウスＷＴ１残留物１０−１８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
２５５） ；またはＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（人間のおよびマウスＷＴ１残留物１２
６−１３４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９３、
それぞれ）。
【００６７】 更なる免疫原性断片およびペプチドは本願明細書において、提供される。そし
て、他は周知の技術、ポール、１９９３を使用して、一般に識別されることがで
きる。たとえば、免疫原性ペプチドを識別することの代表的な技術、エピトープ
およびモティーフを結合している抗体は抗原に特有の抗血清および／またはＴｃ
ｅｌｌ線とともに化学反応する能力またはクローンのためのペプチドをふるいに
かけることを含む。天然のＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分は、実質的に全長
ＷＴ１の反応性未満でないレベルで、この種の抗血清および／またはＴ細胞とと
もに化学反応する部分である（ｅ。ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性分析
評価において、ｇ．）。換言すれば、それが同様であるレベルで、免疫原性部分
は、この種の分析評価の範囲内で反応できる以上、全身のポリペプチドの反応性
に。この種のスクリーンは、方法を従来技術において、通常の技術、ハーローお
よびＬａｎｅ、１９８８のそれらにとって周知に扱って、一般に実行されること
ができる。
【００６８】 あるいは、免疫原性部分（例えばＴｓｉｔｅｓプログラム）が、コンピュータ
分析を使用して識別されてあってもよい（Ｒｏｔｈｂａｒｄおよびテイラー（１
９８８）；Ｄｅａｖｉｎその他、１９９６）、それはＴｈ反応を誘発するために
可能性を有するペプチド・モティーフを捜す。ネズミに縛ることに適当なモティ
ーフおよびＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣがＢＩＭＡＳ、パーカーほか、１９９４
に識別されることができる人間のクラスおよび予言分析を結合している他のＨＬ
Ａペプチドを有するＣＴＬペプチド。免疫性を確かめるために、ペプチドはトラ
ンスジェニックのマウス・モデルおよび／または試験管内の刺激が樹状突起の細
胞、線維芽細胞または周辺の血球を使用して分析するＨＬＡ Ａ２を使用して試
験されることができる。
【００６９】 上記したように、本願明細書において、開示されるように、本発明のペプチド
はアミノ酸配列の一つ以上の変化から成ることができる。本願明細書において、
使われるように、ペプチドｖａｒｉａｎｔがペプチドの免疫性が実質的に保持さ
れるように、一つ以上の置換の特定の主要なアミノ酸配列、削除、加算および／
または挿入と異なるペプチドであって（すなわち、抗原に特有の抗血清および／
またはＴ−細胞系とともに化学反応する変化の能力またはクローン実質的に天然
のペプチドと関連して減らす）。換言すれば、抗原に特有の抗血清および／また
はＴ細胞線またはクローンとともに化学反応する変化の能力を、強化できるかま
たは、変化が引き出されたペプチドと関連して、不変である。
【００７０】 好ましくは、異なるペプチドの生物学的活動は、１％以上減らされなくて、変
更されていないペプチドの生物学的活動と関連して、２％以上好ましくはまだ減
らされない。好ましくは、異なるペプチドの生物学的活動は、３％以上減らされ
なくて、変更されていないペプチドの生物学的活動と関連して、４％以上、５％
、６％、７％、８％または９％より好ましくは、まだ減らされない。より好まし
くは、まだ、異なるペプチドの生物学的活動は、１０％以上減らされなくて、ｃ
ｏｒｒｅｓｅｐｏｎｄｉｎｇしている変更されていないペプチドの生物学的活動
と関連して、１１％以上、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、
１８％、１９％または２０％より好ましくは、まだ減らされない。
【００７１】 ％配列異体同形に基礎をおいて、本発明で異なるペプチドがＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏのいかなる一つにもおいてｄｉｓｌｏｓｅｄされるアミノ酸配列の最少の一つ
で、９から長さの約１００のアミノ酸まである。そして、少なくとも少なくとも
７５％同一である第１の配列領域から成るそれらのペプチドを含むのを好んだ：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２
８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（
ＳＥＱ ＩＤ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：少なくとも少なくとも８０％ア
ミノ酸配列のうちの少なくとも１つと同一である第１の配列領域から成る３２６
および好ましくは、ものは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにもおいてｄｉ
ｓｌｏｓｅｄした：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ
）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１
８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６． 好ましくは％配列異体同形に基づいて、本発明の好適なペプチド変化は、少な
くとも少なくとも８５％ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにもおいてｄｉｓ
ｌｏｓｅｄされるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つと同一である第１の配列
領域から成るそれらのペプチドである：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３
１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に
対する３２１：少なくとも少なくとも９０％アミノ酸配列のうちの少なくとも１
つと同一である第１の配列領域から成る３２６およびより好ましくは、ものは、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つにもおいてｄｉｓｌｏｓｅｄした：ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０に対す
る１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する２８：３１
１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６．本発明の特に好適なペプ
チド変化は、少なくとも少なくとも９１％である第１の配列領域、９２％、９３
％、９４％または９５％から成るそれらのペプチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯの
いかなる一つにもおいてｄｉｓｌｏｓｅｄされるアミノ酸配列のうちの少なくと
も１つまで同一の：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯに対する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６
：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：少な
くとも９８％、９７％、少なくとも９６％である第１の配列領域から成るそれら
のペプチドについては、３２６または９９％ＳＥＱ ＩＤ ＮＯのいかなる一つ
にもおいてｄｉｓｌｏｓｅｄされるアミノ酸配列のうちの少なくとも１つまで同
一の：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する１：４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯに対する１３：２０（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対
する２８：３１１（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３
１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およ
びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３２１：３２６． この種のペプチド変化は、概してｎｎｆ ｎｆ ｔｈｆ ｎｆｎｔｉｒｔｆ
ＩＤを修正しているｎｒｆｎａｒｆｄ ｂｖであってもよい：３１１（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ）：３１３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３１４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）
：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯに対する３１６：３１８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯに対する３２１：一つ以上の保守的なアミノ酸置換による３２６
。
【００７２】 本発明のコンテキストの範囲内で、それがそれであるとわかった保守的である
か中立の置換の比較的小さい番号（例えば、１または２）、ペプチドの生物学的
活動を実質的に変えずに、本願明細書において、開示されるｎｏｎａｍｅｒｉｃ
なペプチド・エピトープの配列の範囲内でなされることができる。場合によって
は、特定のペプチドの一つ以上のアミノ酸の置換は、事実修正されたペプチドか
ら成る組成物またはペプチドをコード化するポリヌクレオチドを備えていた動物
の免疫性であるかＴ−細胞反応を誘発するために強化するかまたは一方ペプチド
の能力を向上させるのに役立つことができる。適切な置換は以下に記載されてい
るように、コンピュータプログラムを使用することによって、一般に識別される
ことができる。そして、本願明細書において、記載されているように、この種の
置換の効果は抗血清および／またはＴ細胞を有する修正されたペプチドの反応性
に基づくと確認されることができる。
【００７３】 したがって、特定の好適な実施例の範囲内で、開示された診断上で治療的な方
法に用いられるＷＴ１ペプチドは一つ以上のアミノ酸残留物が一つ以上の置き換
えアミノ酸により置換される主要なアミノ酸配列から成ることができる。そうす
ると、抗原に特有の抗血清および／またはＴｃｅｌｌ線とともに化学反応する修
正されたペプチドまたはクローンの能力はかなり変更されていないペプチドのた
めのそれ未満でない。典型的な、この種の置換は、ペプチド上のサイトを結合し
ている一つ以上のＭＨＣの範囲内で、好ましくは位置できる。
【００７４】 上記の通りに、好適なペプチド変化は、一つ以上の保守的な置換を含むもので
ある。アミノ酸がある保存的置換１は類似した特性を有する他のアミノ酸と交代
した。そうすると、ペプチド化学の当業者は第２の構造および水治療法性質を実
質的に不変のペプチドに求める。アミノ酸置換は、極性、負担、可溶性、疎水性
、親水性および／または残留物の両親媒性の性質の類似を基礎として、一般にな
されることができる。たとえば、否定的に充電されるアミノ酸は、アスパラギン
酸およびグルタミン酸を含む；明らかに充電されるアミノ酸は、リジンおよびア
ルギニンを含む；そして、類似した親水性値を有する充電してない極地の頭グル
ープを有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリンを含む；グリシ
ンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；そして、セリン、トレオニ
ン、フェニルアラニンおよびチロシン。保守的な変化を表すアミノ酸置換の実施
例は、以下から成る：一つ以上のＡｌａの（１）置き換え、Ｇｌｙに、プロＧｌ
ｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒ；同じグループからの一つ以
上の残留物を有する残留物；一つ以上のＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒまたは同じグル
ープからの一つ以上の残留物を有するＴｈｒ残留物の（２）置き換え；一つ以上
のＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａまたは同じグループからの一つ以上
の残留物を有するＰｈｅ残留物の（３）置き換え；一つ以上のＬｙｓの（４）置
き換え、Ａｒｇまたは同じグループからの一つ以上の残留物を有する神の残留物
；そして、一つ以上のＰｈｅの（５）置き換え、Ｔｙｒ、Ｔｒｐまたは同じグル
ープからの一つ以上の残留物を有する神の残留物。
【００７５】 変化はそうすることができるまた、または代わりに、たとえば、グループ（２
）からのアミノ酸残留物を有するグループ（１）からのアミノ酸残留物、グルー
プ（３）、グループ（４）またはグループ（５）のうちの１つを置換することに
よって、ｎｏｎｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅな変化を含む。たとえば、変化はまた
、削除または免疫性、第２の構造およびペプチドの水治療法性質に対する最小の
影響を有するアミノ酸の追加により修正されることができる（または代わりに）
。
【００７６】 （４．２ 生物学的機能の均等物） 変更態様および変化は、ポリヌクレオチドの構造および本発明のペプチドにお
いて、なされることができるか、まだ望ましい特徴を有するペプチドをコード化
する機能の分子を得ることができるかまたはまだ望ましい発現特性および／また
は特性を有する遺伝子の構造物を得ることができる。しばしば一つ以上の変化を
特定のポリヌクレオチド・配列にもたらすことは、望ましいように、変化を従来
技術において、技術のそれらにとって公知のポリヌクレオチドまたはペプチド・
配列にもたらすさまざまな手段は選択された細胞または動物の種に導入されるこ
とができる異種な配列の準備のために使用されることができる。特定の状況にお
いて、結果として生じるコード化されたペプチド・配列はこの変化によって、変
えられる、または、他の場合には、ペプチドの配列はポリヌクレオチドをコード
化する際の一つ以上の変化によって、不変である。他の状況において、一つ以上
の変化は、活動を変えるポリヌクレオチド構造物または発現要素の特性のプロモ
ータおよび／またはエンハンサ領域に導入されて、このように要素の制御の下に
使用可能な状態で配置される異種な治療的な核酸部分の現れを変える。
【００７７】 均等物をつくるために発現構造物によって、コード化される異種なペプチドの
一つ以上のアミノ酸配列を変えることは、望ましいか平らな、表１により改良さ
れた、第二世代の分子（変化がＤＮＡ配列をコード化するコドンの一つ以上を変
えて成し遂げられることが可能であるアミノ酸）。
【００７８】 たとえば、特定のアミノ酸は、構造（例えば抗体の抗原−結合領域または基板
分子上の結合するサイト）を有する双方向結合する容量のかなりのロスのないタ
ンパク質構造の他のアミノ酸と置換されることができる。それが双方向容量およ
びそのタンパク質の生物学的機能の活動を定義するタンパク質の性質であるので
、特定のアミノ酸配列置換がタンパク質配列において、なされることができて、
そして、コース（その下にあるＤＮＡ符号化配列）の、そして、それにもかかわ
らず、特性の類のタンパク質を得る。 さまざまな変化が開示された組成物のペプチド・配列またはそれらの生物学的有
用性または活動のかなりのロスのない前記ペプチドをコード化する対応するＤＮ
Ａ配列において、なされることができることは、このように発明者により熟慮さ
れる。
【００７９】
【表１】 この種の変化をする際に、アミノ酸の水治療法インデックスを、考慮できる。
インタラクティブな生物学的機能をタンパク質に授ける際の水治療法アミノ酸イ
ンデックスの重要性は、従来技術において、一般に理解される（胃およびＤｏｏ
ｌｉｔｔｌｅ（１９８２）は、ここにて結合する）。アミノ酸の相対的な水治療
法特徴が結果として生じるタンパク質の第２の構造に貢献することを認められる
。そして、それは順番に他の分子（たとえば酵素、基板、受容器、ＤＮＡ、抗体
、抗原、など）を有するタンパク質の相互作用を定義する。各々のアミノ酸はそ
れらの疎水性および負担特徴、胃およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２を基礎と
して、水治療法インデックスを割り当てられた、これらはそうである：イソロイ
シン（＋４．５） ；バリン（＋４．２） ；ロイシン（＋３．８） ；フェニ
ルアラニン（＋２．８） ；ｃｙｓｔｅｉｎｅ／ｃｙｓｔｉｎｅ（＋２．５）
； メチオニン（＋１．９） ；アラニン（＋１．８） ；グリシン（−０．４）
；ｔｌｉｒｅｏｎｉｎｅ（−０．７） ；セリン（−０．８） ；トリプトファ
ン（−０．９） ；チロシン（−１．３） ；プロリン（−１．６） ；ヒスチ
ジン（−３．２） ；グルタミン酸塩（−３．５） ；グルタミン（−３．５）
；アスパラギン酸塩（−３．５） ；アスパラギン（−３．５） ；リジン（
−３．９） ；そして、アルギニン（−４．５）。
【００８０】 特定のアミノ酸が類似した水治療法インデックスまたはスコアを有する他のア
ミノ酸および類似した生物学的活動を有するタンパク質の静かな結果により置換
されることができることは、公知技術であるすなわち、静寂は、生物学的機能的
に等価タンパク質を得る。この種の変化をする際の、水治療法インデックスが２
の範囲内であるアミノ酸の置換が好まれること、１の範囲内であるものは、特に
好まれる。そして、０の範囲内のそれら。５は、特に好まれさえする。同類アミ
ノ酸の置換が親水性を基礎として効果的になされることができることは、また、
従来技術において、理解される。米国特許４、５５４、１０１（本願明細書に引
用したものとする）は、その隣接したアミノ酸の親水性で定めるように、タンパ
ク質の最も大きいローカル平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関すると
述べる。
【００８１】 米国特許４、５５４、１０１において、詳述されるように、以下の親水性値は
アミノ酸残留物に割り当てられた：アルギニン（＋３．０） ；リジン（＋３．
０） ；アスパラギン酸塩（＋３．０ １） ；グルタミン酸塩（＋３．０ １
） ；セリン（＋０．３） ；アスパラギン（＋０．２） ；グルタミン（＋０
．２） ；グリシン（０）；トレオニン（−０．４） ；プロリン（−０．５
１） ；アラニン（−０．５） ；ヒスチジン（−０．５） ；システイン（−
１．０） ；メチオニン（−１．３） ；バリン（−１．５） ；ロイシン（−
１．８） ；イソロイシン（−１．８） ；チロシン（−２．３） ；フェニル
アラニン（−２．５） ；トリプトファン（−３．４）。
【００８２】 アミノ酸が交代されることができると理解するもう、類似した親水性値および
静寂を有することは、得る生物学上、そして、事項（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａ
ｌｌｙな等価タンパク質）において、等価な。この種の変化の、親水性値が２の
範囲内であるアミノ酸の置換が好まれること、１の範囲内であるものは、特に好
まれる。そして、０の範囲内のそれら。５は、特に好まれさえする。
【００８３】 その概略について述べましたように、上記の、アミンの酸性の置換は、一般に
したがって、アミノ酸サイドチェーン置換分（たとえばそれらの疎水性、親水性
、負担、サイズ、など）の相対的な類似に基づく。
【００８４】 前述の特徴のいくつかを考慮に入れる典型的な置換は従来技術において、技術
のそれらにとって周知である。そして、含む：アルギニンおよびリジン；グルタ
ミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよび
アスパラギン；そして、バリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００８５】 本発明のペプチドおよびペプチド変化はペプチドのＮ−ターミナル端で、信号
の（またはリーダー）配列に活用されることができる。そして、それはｃｏ−ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙにまたはｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ
ｌｙにペプチドの転送を導く。ペプチドは、そうすることができるまた、または
代わりに、統合、浄化またはペプチドの識別の容易さのための一つ以上のリンカ
ー・配列に活用させる（例えば、（ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）、または、強力なサポー
トにペプチドの中で縛ることを強化すること。たとえば、ペプチドは免疫グロブ
リンＦｃ領域に活用されることができる。
【００８６】 本発明のペプチドおよびペプチド変化を、分離できるか、例えば、天然のＷＴ
１ペプチドから主要なアミノ酸配列の全部または一部を分離することによる自国
のソースから浄化するかまたは代わりに様々な周知のペプチド統合技術のいずれ
でも使用して、全体的にあるいは部分的に化学的に総合されることができる。た
とえば、約１００未満のアミノ酸、好ましくは約９０か８０の未満アミノ酸およ
び、約６０または、３０または約２０のアミノ酸についての４０について、約５
０未満より、好ましくは、約７０未満を有するペプチドは市販の固いフェーズ技
術（例えばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固体のフェーズ統合方法）のいずれでも使用し
て合成されることができる。ここで、アミノ酸は順番に発達するアミノ酸チェー
ン、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３に加えられる。ペプチドのオートメーショ
ン化した統合のための設備は、供給元、例えばＡｐｐｌｉｅｄされたＢｉｏＳｙ
ｓｔｅｍｓ社、フォスター市、ＣＡから市販されていて、製造業者の指示により
作動されることができる。
【００８７】 ペプチドおよびペプチド変化本願明細書において、記載するまた、再結合物Ｗ
Ｔ１ペプチドから直ちに準備されることができてまたはこの種のペプチドをコー
ド化するポリヌクレオチド・配列の翻訳により準備されることができる。一般に
、従来技術において、通常の技術のそれらにとって公知の様々な発現ベクトルの
いずれでも、明確な再結合物ペプチドに使用されることができる。
【００８８】 発現は、変わったいかなる適当な宿主細胞にもおいて成し遂げられることが可
能であるかまたはペプチドをコード化する核酸分子を含んでいる発現ベクトルに
よって、トランスフェクションすることができる。適切な宿主細胞は、原核生物
、イーストおよびより高い真核生物細胞を含む。
【００８９】 好ましくは、使用される宿主細胞は、大腸菌、イーストまたは哺乳類の細胞系
（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ）である。
【００９０】 一般、ペプチドおよびポリヌクレオチドの本願明細書において、記載する分離
する。「ｉｓｏｌａｔｅｄペプチドまたはポリヌクレオチドは、その本来の環境
から除去されるものである。
【００９１】 たとえば、それがいくつかまたは自然のシステムの共存している材料の全てか
ら切り離される場合、自然に起こっているペプチドまたはポリペプチドは分離さ
れる。好ましくは、純粋なこの種のペプチドは、８０％または８５％について少
なくともある、好ましくは少なくとも約９０％より多くのまたは９５％純粋な、
そして、好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％について最
も多くの純粋な。ポリヌクレオチドは、たとえば、自然の環境の一部でないベク
トルに、それがクローンをつくられる場合、分離されると考えられる。
【００９２】 更なる態様の範囲内で、本発明はＷＴ１ペプチドの擬似を提供する。
【００９３】 この種のｍｉｍｅｔｉｅｓは、一つ以上のアミノ酸擬似（すなわち、１または
ＷＴ１タンパク質の範囲内のより多くのアミノ酸は、模倣のアミノ酸と取り替え
られることが可能である）に連結されるアミノ酸から成ることができるかまたは
完全にｎｏｎペプチド ｍｉｍｅｔｉｅｓであってもよい。 模倣のアミノ酸は、能力を実質的に減らすことのないＷＴ１ペプチドの範囲内の
アミノ酸が抗原ｓｐｅｃｉｆｉｃな抗血清および／またはＴ細胞線またはクロー
ンとともに化学反応することを、置換できるように、ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ａｌｌｙにアミノ酸と同様である合成物である。模倣のｎｏｎペプチドはアミノ
酸を含まない、そして、ＷＴ１ペプチドと同様である全体的な形態を有する合成
物である能力の模倣の、ＷＴ １−特定の抗血清および／またはＴ細胞線または
クローンとともに化学反応することはＷＴ１ペプチドの能力と関連して、実質的
に減らされない。この種のｍｉｍｅｔｉｅｓは標準の技術に基づいて設計される
ことができる（例えば、核磁気共鳴、そして、計算の技術）、ペプチド・配列の
３つの次元の構造を評価する。ＷＴ１ペプチドのサイドチェーン機能性のうちの
１つ以上が必ずしも同じサイズまたは体積を有するというわけではなくて、類似
した生物学的反応を起こす類似した化学のおよび／または物理的な特性を有する
というわけではないグループと取り替えられる所で、擬似を、設計できる。本願
明細書において、記載されている実施態様の範囲内で、擬似がＷＴ１ペプチドと
置換されることができると理解されなければならない。
【００９４】 他の例示の実施例の範囲内で、ポリペプチドがそれが多数のポリペプチドから
成るポリペプチドが本願明細書において、記載した、または、本願明細書におい
て、記載されているように、少なくとも一つのポリペプチドから成る融合であっ
てもよいこと、そして、無関係な配列（例えば周知の腫瘍タンパク質）。
【００９５】 融合パートナーは、たとえば、Ｔヘルパーにエピトープ（免疫学の融合パート
ナー）（好ましくは、人間により認識されるＴヘルパー・エピトープ）を提供す
るのを助けることができるかまたは天然の再結合物タンパク質より高い産出で、
タンパク質（発現エンハンサ）を表すのを助けることができる。特定の好適な融
合パートナーは、両方の免疫学の発現強化している融合パートナーである。他の
融合パートナーはポリペプチドの可溶性を増やすために選ばれることができる、
または、目標とされるポリペプチドを可能にすることは細胞内コンパートメント
を要求した。
【００９６】 なお更なる融合パートナーは類似性タグを含む。そして、それはポリペプチド
の浄化を容易にする。
【００９７】 融合ポリペプチドは標準の技術を使用して、一般に準備されることができる。
そして、化学活用を含む。好ましくは、融合ポリペプチドは再結合物ポリペプチ
ドとして表される。そして、発現システムにおいて、非溶解されたポリペプチド
と関連して、増加するレベルの製造を許す。簡潔に、ポリペプチド構成要素をコ
ード化しているＤＮＡ配列は、別に集められることができて、適切な発現ベクト
ルに結さつされることができる。
【００９８】 第２のポリペプチド構成要素をコード化しているＤＮＡ配列の配列で読出フレ
ームが同調しているために５’−端に対するペプチド・リンカーの有無にかかわ
らず、１つのポリペプチド構成要素をコード化しているＤＮＡ配列の３’−端は
、結さつされる。両方の構成要素ポリペプチドの生物学的活動を保持する単一の
融合ポリペプチドに、これは翻訳を許可する。
【００９９】 ペプチド・リンカー・配列は、各々のポリペプチドがその第２で第三の構造に
折り重なることを確実にするのに十分な距離によって、第１および第２のポリペ
プチド構成要素を切り離すために使用されることができる。この種のペプチド・
リンカー・配列は、公知技術の標準の技術を使用している融合ポリペプチドに組
み込まれる。適切なペプチド・リンカー・配列は、以下の要因に基づいて選ばれ
ることができる：曲げやすいものを採用するそれらの能力は、形態を延長した；
（１）それがそうしてもよい第２の構造を採用することがそれらのできないこと
は、第１および第２のポリペプチド上の機能のエピトープと相互に作用する（２
）；そして、（３）ポリペプチド汎関数エピトープとともに化学反応するかもし
れない疎水性であるか充電される残留物の欠如。 リンカー・配列がＧｌｙに含む好適なペプチド、ＡｓｎおよびＳｅｒ残留物。
【０１００】 他の近い中立のアミノ酸、例えばＴｈｒおよびＡｌａが、また、リンカー・配
列において、使うことができる。有効にリンカーとして使用されることができる
アミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａほか（１９８５）において、開示されるそれら
を含む；マーフィーほか１９８６；米国特許番号４、９３５、２３３および米国
特許番号４、７５１、１８０。リンカー・配列が、１から約１０、約２０、約３
０、約４０までまたは長さの５０ほどのアミノ酸について一般にあってもよい。
第１および第２のポリペプチドが機能の領域を切り離して、ｓｔｅｒｉｃな干渉
を防ぐために用いることがありえる本質的でないＮ−ターミナル・アミノ酸領域
を有するときに、リンカー・配列は必要でない。
【０１０１】 結さつされたＤＮＡ配列は、使用可能な状態で適切な転写であるかｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎａｌな規定する要素に連結される。ＤＮＡの発現に対して責任があ
る規定する要素は、５’ｔｏだけ位置する第１のポリペプチドをコード化してい
るＤＮＡ配列。同様に、翻訳およびコピー終了信号があることを終えることを必
要とする中止コドンは、３’ｔｏに第２のポリペプチドをコード化しているＤＮ
Ａ配列を贈るだけである。
【０１０２】 無関係な免疫原性タンパク質（例えばリコール反応を誘発できる免疫原性タン
パク質）と共に、本願明細書において、記載されているように、融合ポリペプチ
ドはポリペプチドから成ることができる。この種のタンパク質の実施例は、破傷
風、結核および肝炎タンパク質（実施例、Ｓｔｏｕｔｅその他のために、１９９
７を見る）を含む。
【０１０３】 １つの好適な実施例において、免疫学の融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｓｐ．（例えばＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ結核−引き出されたＲ
ａｌ２断片）に由来する。Ｒａｌ２組成物、そして、発現を強化する際のそれら
の使用および／または異種なポリヌクレオチド／ポリペプチド・配列の免疫性の
ための方法米国特許出願６０／１５８、５８５、いずれが完全に本願明細書に引
用したものとするか、開示の記載されている。簡潔に、Ｒａｌ２はＭｙｃｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ結核ＭＴＢ３２Ａ核酸の結果であるポリヌクレオチド領域に関連
する。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．結核の有毒でａｖｉｒｕｌｅｎｔな緊張の遺伝子に
よって、コード化される３２ｋＤａ分子量のセリン・プロテアーゼである。ＭＴ
Ｂ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されていた（実施例、
米国特許出願６０／１５８、５８５のために見る；そして、各々本願明細書に引
用したものとするＳｋｅｉｋｙほか（１９９９）。高さでのＭＴＢ３２Ａ符号化
配列急行のＣ−ターミナル断片は、浄化方法の全体にわたって平らにして、可溶
なポリペプチドを残る。さらに、Ｒａｌ２はそれが溶かされる異種な免疫原性ポ
リペプチドの免疫性を強化できる。１つの好適なＲａｌ２融合ポリペプチドは、
ＭＴＢ３２Ａのうちの３２３までアミノ酸残留物１９２に対応する１４ｋＤａ
Ｃ−ターミナル断片から成る。他の好適なＲａｌ２ポリヌクレオチドは、少なく
とも一般に２００のヌクレオチドについて最少の、最少の約１００のヌクレオチ
ドで少なくとも、約６０のヌクレオチドでのまたは一部のＲａｌ２ポリペプチド
をコード化する最少の約３００のヌクレオチドでの約１５の連続的ヌクレオチド
（少なくとも約３０のヌクレオチド）から成る。
【０１０４】 Ｒａｌ２ポリヌクレオチドは、自国の配列、すなわち、Ｒａｌ２ポリペプチド
またはそれの部分をコード化する内部から発生する配列から成ることができるか
またはこの種の配列の変化から成ることができる。天然のＲａｌ２ポリペプチド
から成る融合ポリペプチドと関連して、コード化された融合ポリペプチドの生物
学的活動が実質的に減らされないように、Ｒａｌ２ポリヌクレオチド変化は一つ
以上の置換、加算、削除および／または挿入を含むことができる。変化は、少な
くとも好ましくは約７０％の識別、好ましくは、少なくとも約８０％の識別およ
び最も好ましくは少なくとも約９０％の識別を天然のＲａｌ２ポリペプチドまた
はそれの部分をコード化するポリヌクレオチド・配列に示す。
【０１０５】 他の好適な実施例の範囲内で、免疫学の融合パートナーがプロテインＤに由来
することグラム−否定のバクテリアＨａｅｔｎｏｐｈｉｌｕｓインフルエンザＢ
の表面だけのタンパク質（国際的である特許出願Ｐｕｂｌ．数ＷＯ ９１／１８
９２６）。
【０１０６】 好ましくは、派生的なプロテインＤはほぼタンパク質の第１の第３から成る（
例えば、（第１のＮ−ターミナル１００−１１０のアミノ酸）、そして、派生的
なプロテインＤはｌｉｐｉｄａｔｅｄされることができる。特定の好適な実施例
の範囲内で、融合パートナーがＮ−終点に含まれるＬｉｐｏプロテインＤの最初
の１０９の残留物は、ポリペプチドに追加の外生のＴ細胞エピトープを供給して
、大腸菌（このように、発現エンハンサとして機能して）において、発現を増や
すために水平になる。脂質尾部は、抗原−提示細胞にすることで抗原の最適の提
出を確実にする。他の融合パートナーは、ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅウイルス、ＮＳ
１、ｈｅｍａｇｌｕｔｉｎｉｎから、ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌなタンパク質
を含む。一般的に、Ｎ−ターミナル８１のアミノ酸が使われる。但し、Ｔ−ヘル
パー・エピトープを含む異なる断片が使うことができる。
【０１０７】 もう一つの実施例では、免疫学の融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタ
ンパク質またはそれの（好ましくはＣ−ターミナル部分）部分である。ＬＹＴＡ
はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｒｒｚｏｎｉａｅに由来する。そして
、それはアミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によって、コード化されて）とし
て公知のＮ−アセチル−Ｌアラニン・アミダーゼを合成する。ＬＹＴＡは、具体
的には、ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎバックボーンの特定の結合の等級を下げる
自己分解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ−ターミナル領域は、コリンにまた
は若干のコリン・アナログ（例えばＤＥＡＥ）に類似性の原因となる。この特性
は、融合タンパク質の発現に役立つプラスミドを表している大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡ
の開発のために開発された。アミンの終点でＣ ＬＹＴＡ断片を含んでいる複合
型タンパク質の浄化は、記載されていた。好適な実施例の範囲内で、ＬＹＴＡの
繰り返し部分は、融合ポリペプチドに組み込まれることができる。繰り返し部は
、残留物１７８から始まっているＣ−ターミナル領域で見つけられる。特に好適
な繰り返し部は、残留物１８８−３０５を取り入れる。
【０１０８】 それでも、他の例示の実施例はそれらをコード化している融合ポリペプチドお
よびポリヌクレオチドを含む。そこにおいて、融合パートナーは、米国特許番号
５、６３３、２３４にて説明したように、ポリペプチドをｅｎｄｏｓｏｍａｌな
／ｌｙｓｏｓｏｍａｌなコンパートメントにあてることができる目標としている
信号から成る。この信号を目標とすると共に溶かされるときに、本発明の免疫原
性ポリペプチドはより能率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して、ポリペプチド
に固有なＣＤ４＋ Ｔ細胞の活発な刺激において、強化して、それによって、備
える。
【０１０９】 （４．３ ポリヌクレオチド組成物） それが本願明細書において、記載されて、ＷＴ１ペプチドをコード化する、ま
たは、この種のポリヌクレオチドに相補的であるいかなるポリヌクレオチドも、
本発明に取り囲まれているＷＴ１ポリヌクレオチドである。この種のポリヌクレ
オチドは、シングルの要素をもってもよい（符号化であるかアンチセンスの）か
二倍の要素をもってもよくて、ＤＮＡ（ゲノムであるか、ｃＤＮＡであるか合成
の）またはＲＮＡ分子であってもよい。配列が、追加の符号化または非符号化は
本発明およびポリヌクレオチドのポリヌクレオチドの範囲内である、しかし、他
の分子および／または支持資料にリンクされる。
【０１１０】 本願明細書において、記載されているように、ＷＴ１ポリヌクレオチドは天然
のＷＴ１タンパク質をコード化することができるかまたはＷＴ１の変化をコード
化することができる。天然のＷＴ１タンパク質と関連して、コード化されたペプ
チドの免疫性が減らされないように、ポリヌクレオチド変化は一つ以上の置換、
加算、削除および／または挿入を含むことができる。本願明細書において、記載
されているように、コード化されたペプチドの免疫性に対する効果は一般に査定
されることができる。好適なペプチド変化は、好ましくは、約１５％だけで、約
２０％だけで、そして、より好ましくは、まだ対応する自国の変更されていない
ＷＴ１配列と関連するアミノ酸位置の約１０％だけまたは５％の以下だけでアミ
ノ酸置換、削除、挿入および／または加算を含む。
【０１１１】 同様に、この種のペプチド変化をコード化しているポリヌクレオチドは、好ま
しくは、約１５％だけで、約２０％だけで、そして、より好ましくは、まだ自国
の変更されていないＷＴ１ペプチド・配列をコード化する対応するポリヌクレオ
チド・配列と関連するヌクレオチド位置の約１０％だけまたは５％の以下だけで
好ましくはヌクレオチド置換、削除、挿入および／または加算を含まなければな
らない。もちろん、ポリヌクレオチド変化が実質的に相応してもよいことを確信
しているために、または、実質的に同一の変更されていないペプチドをコード化
しているヌクレオチド配列の対応する領域に。この種のポリヌクレオチド変化は
、ＷＴ１ペプチド（または相補的な配列）をコード化している自然に起こってい
るＤＮＡ配列に雑種を産むことができるの下で適度に厳しい、非常に、非常に非
常に厳しい状況にとって、厳しい。
【０１１２】 適切な適度に厳しい状況は、約５Ｘ ＳＳＣ（０）を含んでいるソリューショ
ンでプレウォッシュすることを含む。５％の特別割引販売（１）。０ｍＭのＥＤ
ＴＡ（ｐＨ ８。０） ；一晩ＳＳＣの約５０のＣから５Ｘの約６０のＣへの温
度で雑種を産むこと；２Ｘ、０の各々を有する２０分の間の６５Ｃまで、約６０
で二度を洗うことによって、あとに続いた。５Ｘおよび０。０を含んでいる２Ｘ
ＳＳＣ。１％ＳＤＳ）。適切な非常に厳しい状況は、約５Ｘ ＳＳＣ（０）を
含んでいるソリューションでプレウォッシュすることを含む。５％ ＳＤＳ（１）。０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ ８。０） ；一晩ＳＳＣの約６０のＣ
から５Ｘの約７０のＣへの温度で雑種を産むこと；２Ｘ、０の各々を有する２０
分の間の７０Ｃまで、約６５で二度を洗うことによって、あとに続いた。５Ｘお
よび０。０を含んでいる２Ｘ ＳＳＣ。１％の特別割引販売）。たとえば、非常
に非常に厳しい交雑状況の代表例は、約５Ｘ ＳＳＣ（０）を含んでいるソリュ
ーションでプレウォッシュすることを含むことができる。５％の特別割引販売（
１）。０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ ８。０）；一晩ＳＳＣの約７０のＣから５Ｘの
約７５のＣへの温度で雑種を産むこと；２Ｘ、０の各々を有する２０分の間の約
７５Ｃまで、約７０Ｃで二度を洗うことによって、あとに続いた。５Ｘおよび０
。０を含んでいる２Ｘ ＳＳＣ。１％の特別割引販売）。
【０１１３】 この種の雑種を産んでいるＤＮＡ配列は、また、本発明の範囲内である。
【０１１４】 それは、そこの遺伝暗号の変質の結果として、ＷＴ１ペプチドをコード化する
多くのヌクレオチド配列である技術の通常の技術のそれらによって、認められる
。これらのポリヌクレオチドは、いかなる天然の遺伝子ものヌクレオチド配列に
、最小の異体同形を運ぶ。
【０１１５】 それでもなお、コドン使用の違いのために変化するポリヌクレオチドは、具体
的には、本発明により熟慮される。
【０１１６】 一旦ＷＴ１の免疫原性部分が識別されると、上記の通りに、ＷＴ１ポリヌクレ
オチドは様々な技術のいずれでも使用して準備されることができる。 たとえば、ＷＴ１ポリヌクレオチドは、ＷＴ１を表す細胞から準備されるｃＤＮ
Ａから拡大されることができる。この種のポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）を経て拡大されることができる。この方法のために、配列に特
有の下塗りは、免疫原性部分の配列に基づいて設計されることができるか、購入
されることができるかまたは総合される。
【０１１７】 例えば、人間のＷＴ１遺伝子のＰＣＲ拡大のための適切な下塗りは、以下から
成る：第１のステップ−Ｐ１１８：１４３４−１４１４ ：５’−ＧＡＧＡＧＴ
ＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、そして
、Ｐ１３５：５’−ＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣ−３』（ＳＥＱ
ＩＤ Ｎ０：６）；第２のステップＰ１３６：５’−ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧ
ＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧＧ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）およびＰ
１３７：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡＡＣＧＧＴＣＣＣＣＧＡ−３』（
ＳＥＱ ＩＤ Ｎ０：８）。マウスＷＴ１遺伝子のＰＣＲＴＭ拡大のための下塗
りは、以下から成る：第１のステップ−Ｐ１３８：５’−ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣ
ＡＣＣＴＣＡＴＧ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）およびＰ１３９：５’−Ｇ
ＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）（第
２のステップ−Ｐ１４０）：５’−ＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡ
ＣＧＴＧＣＧＧ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）およびＰ１４１：５’−Ｇ
ＧＧＧＴＡＣＣＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴ−３』（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２）。
【０１１８】 拡大された部分はそれから全身の遺伝子を人間のゲノムＤＮＡライブラリから
または適切なｃＤＮＡライブラリから分離するために用いてもよい。そして、周
知の技術を使用する。
【０１１９】 あるいは、全身の遺伝子は、多数のＰＣＲＴＭ断片から造られることが可能で
ある。ＷＴ１ポリヌクレオチドは、また、オリゴヌクレオチド構成要素を総合し
て、一緒に構成要素を結さつすることによって、完全なポリヌクレオチドを生成
する準備ができていることができる。
【０１２０】 ＷＴ１ポリヌクレオチドは、また、化学の統合を含む公知技術のいかなる方法
にもよって合成されることができる（例えば、（強力なフェーズｐｈｏｓｐｈｏ
ｒａｍｉｄｉｔｅ化学の統合）。
【０１２１】 ポリヌクレオチド・配列の変更態様は、また、標準の突然変異生成技術、例え
ばオリゴヌクレオチドに誘導された特定地域向けの突然変異生成、Ａｄｅｌｍａ
ｎほか、１９８３を使用して導かれることができる。あるいは、分子がｖｉｔｒ
ｏにおいて、またはＷＴ１ペプチドをコード化しているＤＮＡ配列の活発なコピ
ーにおいて、発生できるＲＮＡは、ＤＮＡが適切なＲＮＡポリメラーゼ・プロモ
ータ（例えばＴ７またはＳＰ６）を有するベクトルに組み込まれると定めた。
【０１２２】 特定の部分は、本願明細書において、記載されているように、コード化された
ペプチドを準備するために用いてもよい。加えて、または代わりに、コード化さ
れたペプチドが生体内に発生するように、部分は患者に与えられることが可能で
ある（例えば、ＷＴ１ペプチドをコード化しているｃＤＮＡ構造物を有する樹状
突起の細胞のような抗原−示している細胞をトランスフェクションさせて、患者
にトランスフェクションする細胞を与えることによって）。
【０１２３】 ＷＴ１ペプチドをコード化するポリヌクレオチドがｖｉｔｒｏにペプチドの製
造のために一般に使うことができる、または、生体内の。符号化配列、すなわち
、アンチセンスのポリヌクレオチドに相補的であるＷＴ１ポリヌクレオチドがま
た、調査として使うことができる、または、ＷＴ１発現を禁止する。アンチセン
スのＲＮＡに写されることができるｃＤＮＡ構造物はまた、アンチセンスのＲＮ
Ａの製造を容易にするために組織の細胞に導入されることができる。
【０１２４】 いかなるポリヌクレオチドも、生体内に安定性を増やすために更に修正される
ことができる。
【０１２５】 変更態様が配列の側面に位置することの追加を含むが、これに限定されるもの
ではないことをあり得る５』および／または３−端；バックボーンのホスホジエ
ステラーゼ結合よりむしろｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅな２’−ｏ−メチ
ルの使用；および／またはアセチル・メチル、アデニンのｔｈｉｏ−ａｎｄ他の
修正された形、シチジン、グアニン、チミンおよびウリジンと同様にｎｏｎｔｒ
ａｄｉｔｉｏｎａｌなベース（例えばイノシン、ｑｕｅｏｓｉｎｅおよびｗｙｂ
ｕｔｏｓｉｎｅ）の包含。
【０１２６】 ヌクレオチド配列本願明細書において、記載する確立した組み換えＤＮＡ技術
を使用している様々な他のヌクレオチド配列に接続できる。
【０１２７】 たとえば、ポリヌクレオチドは様々なクローニング・ベクトルのいずれにでも
クローンをつくられることが可能である。そして、プラスミド、ｐｈａｇｅｍｉ
ｄｓ、ラムダ・バクテリオファージ派生物およびｃｏｓｍｉｄｓを含む。特定の
関心のベクトルは、発現ベクトル、複写ベクトル、調査生成ベクトルおよび配列
することベクトルを含む。一般に、ベクトルは少なくとも一つの有機体、近くの
制限エンドヌクレアーゼ・サイトおよび一つ以上の選択可能な目印の複写汎関数
の起源を含む。他の要素は、所望の使用に依存して、従来技術において、通常の
技術のそれらにとって明らかである。
【０１２８】 特定の実施態様の範囲内で、ポリヌクレオチドは哺乳類および発現の細胞への
エントリをその中で許可するために処方物されることができる。下記のように、
この種の処方物は、特に治療的な目的に役立つ。通常の技術のそれらは目標細胞
のポリヌクレオチドの発現を達成する多くの方法があると従来技術において、認
める。そして、いかなる適切な方法も使用されることができる。たとえば、ポリ
ヌクレオチドは例えばウィルスのベクトルに組み込まれることができるが、制限
されることができないために（アデノウイルス）アデノ関連するウイルス、レト
ロウイルスまたは牛痘またはその他ポックスウイルス（例えば、（鳥ポックスウ
イルス）。ＤＮＡをこの種のベクトルに組み込むことの技術は、従来技術におい
て、通常の技術のそれらにとって周知である。ベクトルを具体的な目標とするた
めに、特定の目標細胞上の受容器のためのリガンドをコード化する遺伝子のよう
な、レトロウイルスのベクトルは、加えて、移すことができるかまたは選択可能
な目印（識別の援助または変換された細胞の選択に）および／または目標として
いる半分のための遺伝子を取り入れることができる。目標とするまた、抗体を使
用して達成できる従来技術において、通常の技術のそれらにとって公知の方法。
たとえば、この種のベクトルの中のｃＤＮＡ構造物が、腫瘍または白血病−成長
抑制を示すために腫瘍保護および採用する免疫治療実験を実行するために用いて
もよいＷＴ１陽腫瘍モデルまたはこの種の細胞の渙散を決めるために、人間であ
るか動物の細胞系をトランスフェクションさせるために使うことができる。
【０１２９】 ポリヌクレオチドのための他の治療的な処方物は、コロイド分散システム（例
えば高分子複合体、ナノカプセルｓ、ミクロスフェア、ビーズ）を含んで、ｏｉ
ｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒエマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含
むシステムをｌｉｐｉｄｂａｓｅｄした。ｖｉｔｒｏの交付ビヒクルとしての、
そして、中で使用の好適なコロイド・システムは、活発にリポソーム、すなわち
、人工膜小嚢である。準備、そして、この種のシステムの用途公知技術である。
【０１３０】 （４．４ 特定の実施態様の核酸交付およびＤＮＡトランスフェクションの方
） それは熟慮された非常に一つであるかより多くのＲＮＡまたはＤＮＡであるお
よび／または、本願明細書において、開示される置換されたポリヌクレオチド組
成物は適当な宿主細胞をトランスフェクションさせるために用いる。ＲＮＡおよ
びＤＮＡのはじめにおよび適切な宿主細胞にそれらから成っているベクトルのた
めの技術は、従来技術において、技術のそれらにとって周知である。特に、この
種のポリヌクレオチドは遺伝的に一つ以上の宿主細胞を変えるために用いてもよ
い。そのとき、一つ以上の活性ペプチド、合成物またはワクチンの治療的な管理
は重要な一つ以上の治療的な合成物をコード化する一つ以上のポリヌクレオチド
構造物の現れで成し遂げられる。
【０１３１】 ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを適切な目標細胞にもたらすた
めの様々な手段は、従来技術において、技術のそれらにとって公知である。たと
えば、ポリヌクレオチドがセルへの配達のために熟慮されるときに、洗練された
哺乳類の細胞への発現構造物の転送のための非ウィルスのいくつかの方法は彼の
使用のための熟練職人が利用できる。 たとえば、これらはリン酸カルシウム沈殿を含む（グレアムおよびバンＤｅｒ
Ｅｂ（１９７３）；チェンおよび岡山（１９８７）；Ｒｉｐｐｅその他、１９９
０）；ＤＥＡＥ−デキストラン沈殿、Ｇｏｐａｌ、１９８５；ｅｌｅｃｔｒｏｐ
ｏｒａｔｉｏｎ（ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ（１９８２）；フロムほか（１
９８５）；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａほか（１９８６）；陶芸家ｅｔａｌ．（１９８４
）；鈴木ほか（１９９８）；Ｖａｎｂｅｖｅｒその他、１９９８）、直接の顕微
鏡下注射（Ｃａｐｅｃｃｈｉ（１９８０）；ハーランド、そして、Ｗｅｉｎｔｒ
ａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ−ロードしたリポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳ
ｅｎｅ（１９８２）；Ｆｒａｌｅｙほか（１９７９）；タカクラ、１９９８）、
そして、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、Ｆｅｃ
ｈｈｅｉｍｅｒほか、１９８７、高い速度ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓを
使用している遺伝子爆撃（ヤンほか（１９９０）；クラインその他、１９９２）
、そして、受容器により媒介されるトランスフェクション（Ｃｕｒｉｅｌほか（
１９９１）；ワグナーｅｔａｌ．（１９９２）；呉語および呉語（１９８７）；
呉語、そして、呉語、１９８８）。これらの技術は、活発であるか前の活発な使
用において、うまく適応されることができる。
【０１３２】 バクテリアの細胞、イースト細胞または開示された発現ベクトルの一つ以上に
よって、変わる動物性細胞は、重要な本発明の態様を表す。この種の変わる宿主
細胞は、構造物が本願明細書において、開示したさまざまなＤＮＡ遺伝子の発現
ために、しばしば望ましい。
【０１３３】 若干の本発明の態様において、しばしば本願明細書において、開示される遺伝
子部分の現れを調整するか、管理するかまたは一方制御することは、望ましい。
この種の方法は、分子の遺伝子の技術の技術のそれらに対するルーチンである。
概して増加する、または、特定の遺伝子の過剰発現は、所望の、さまざまな操作
である特定の変わる宿主細胞のメッセンジャＲＮＡの安定性を強化する配列を使
用することによって、と同様に、特に活性プロモータを使用することによって、
メッセンジャＲＮＡの、そして、事項（本願明細書において、開示されるそれら
のような組織に特有のプロモータ）の発現を強化するための使用できる。
【０１３４】 概して、開始およびｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌな終了領域は中止コドン（タ
ーミネータ領域）を含む、そして、任意に、ポリアデニル化信号。コピーの方向
に、すなわち符号化または感覚配列の５’ｔｏ ３’ｄｉｒｅｃｔｉｏｎの、構
造物がいずれでもおよびプロモータである場合転写規定する領域を含むこと規定
する領域がいずれの５’ｏｒ ３’ｏｆでもあってもよい所で、プロモータ、ｒ
ｉｂｏｓｏｍａｌな結合するサイト、開始コドン、開始コドンを有するフェーズ
の開いた読出フレームを有する構造遺伝子、中止コドン、いずれでもおよびター
ミネータ領域である場合ポリアデニル化信号配列。倍の岸としてのこの配列が微
生物または真核生物ホストの変換のためのそれ自体によって、使うことができる
が、目印を含んでいるＤＮＡ配列によって、通常含まれる。ここで、第２のＤＮ
Ａ配列はホストにＤＮＡのはじめにの間、発現構造物に結ばれることができる。
【０１３５】 機能の複写システムがない所で、７０について約１００ほどのｂｐに対する８
０または約９０について、そして、通常、構造物がまた、少なくとも好ましくは
約３０または約４０のまたは５０のｂａｓｅｐａｉｒｓ（ｂｐ）またはそのよう
に、好ましくは少なくとも約６０についての配列を含んで、ホストの配列によっ
て、相応する配列の約１０００ほどのｂｐに約５００以上。
【０１３６】 このような方法で、合法の組換えの蓋然性は強化される。その結果、遺伝子は
ホストに組み込まれて、ホストによって、安定して維持される。望ましく、発現
構造物の規定する領域は、競争的効果を提供している遺伝子と同様に相補を提供
している選択された治療的な遺伝子への近い近接（更に、使用可能な状態で、同
じ系統を配置されて）において、ある。したがって、治療的な遺伝子が消失する
。その結果、結果として生じる有機体はまた、競争的効果を提供している遺伝子
を失いそうである。その結果、それは完全な構造物を保持している遺伝子を有す
る環境に参加することができない。
【０１３７】 開始領域の規定する制御中であるために、選択された治療的な遺伝子は、転写
で翻訳開始領域および転写で翻訳終了領域の間で導かれることができる。この構
造物はプラスミド（それは少なくとも一つの複写システムを含む）に含まれるこ
とができるが、１以上を含むことができる。ここで、１つの複写システムはプラ
スミドの開発の間、クローニングのために使用される。そして、第２の複写シス
テムは、このケース（哺乳類の宿主細胞）において、最後のホストにおいて、機
能するために必要である。加えて、一つ以上の目印はあってもよい。そして、そ
れは以前に記載されていた。統合が要求される所で、プラスミドは望ましくホス
ト・ゲノムによって、相応する配列を含む。
【０１３８】 本願明細書において、開示されるように、遺伝子または他の核酸部分は公知技
術である様々な技術を使用している宿主細胞に嵌入されることができる。細胞に
核の部分を届ける５つの一般的な方法は、記載されていた：化学の（１つの）方
法、グレアムおよびＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３；物理的な（２つの）方法（例
えば顕微鏡下注射、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８０、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉ
ｏｎ）（米国特許５、４７２、８６９；ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ（１９８
２）；フロムその他、１９８５）（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ爆撃（特に
本願明細書に引用したものとする米国特許５、８７４（２６５）完全に）遺伝子
銃」、ヤンほか、１９９０；ウィルスの（３つの）ベクトル、Ｅｇｌｉｔｉｓお
よびアンダーソン、１９８８；受容器により媒介される（４つの）メカニズム（
Ｃｕｒｉｅｌほか（１９９１）； ワグナーその他、１９９２）；そして、（５）は変換をｂａｃｔｅｒｉａｌ−ｍ
ｅｄｉａｔｅｄした。
【０１３９】 （４． ５ ＷＴ１に特有の抗体、そして、それの抗原−結合断片） 本発明は更に抗体およびそれの抗原−結合断片に提供する、具体的には、縛るた
めに（または、ｉｍｍｕｎｏｓｐｅｃｉｆｉｃにある）少なくとも、第１のペプ
チドまたは異なるペプチド本願明細書において、開示する。ここで使用している
ように、抗体または抗原−結合断片は、前記ｔｏｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂ
ｉｎｄｔｏであるペプチドそれがペプチドと検出可能な同一水準（ＥＬＩＳＡの
範囲内で、たとえば）で反応して、類似した状況の下でｄｅｔｅｃｔａｂｌｙに
無関係なペプチドまたはタンパク質とともに化学反応しない。ここで使用してい
るように、ａｃｏｍｐｌｅｘｉｓが生じたように、２間のｎｏｎｃｏｖａｌｅｎ
ｔな関連に対する結合ｒｅｆｅｒｓは分子を分離する。たとえば、縛る能力は、
複合体の形成のための結合する定数を決定することにより評価されることができ
る。
【０１４０】 複合体の濃度が構成要素集中の製品によって、分けられるときに、結合する定
数は得られた値である。本発明のコンテキストにおいて、一般に、２つの合成物
は、複合の形成のための結合する定数が約１０３のＬ／モル上回る前記ｔｏｂｉ
ｎｄｗｈｅｎである。結合する定数は、おそらく公知技術の方法を使用すること
を決定した。
【０１４１】 上記の必要条件を満たすいかなる代理人も、結合する代理人であってもよい。
例示の実施例において、結合するエージェントは、抗体またはそれの抗原−結合
断片である。この種の抗体は、従来技術において、通常の技術、ハーローおよび
Ｌａｎｅ、１９８８のそれらにとって公知の様々な技術のいずれにでもよって準
備されることができる。一般に、抗体が細胞培養技術によって、生じることがで
きる。そして、あるいは、再結合物抗体の製造を考慮に入れるために、適切なバ
クテリアであるか哺乳類の細胞ホストへの抗体遺伝子のトランスフェクションを
経て、本願明細書において、記載されているように、モノクロナール抗体の生成
を含む。１つの技術で、ペプチドから成る免疫原がまず最初に多種多様な哺乳類
のいずれにでも注射されること（例えば、マウス、ネズミ、ウサギ、羊またはヤ
ギ）。このステップで、本発明のペプチドは、変更態様のない免疫原として役立
つことができる。
【０１４２】 あるいは、ペプチドがキャリア・タンパク質（例えばウシ血清アルブミンまた
は鍵穴カサガイ・ヘモシアニン）に結ばれる場合、特に比較的短いペプチドのた
めに、優れた免疫反応は引き出されることができる。好ましくは一つ以上のブー
スタ免疫を取り入れている予め定められた予定によれば、免疫原は動物のホスト
に注射される。そして、動物は周期的に血を取られる。たとえば、ペプチドに固
有な多クローン性抗体は、それから適切な強力なサポートに連結するペプチドを
使用している類似性クロマトグラフィによって、この種の抗血清から精製される
ことができる。
【０１４３】 たとえば、重要な抗原性のペプチドに固有なモノクロナール抗体を、準備でき
る。そして、それに対してケーラーおよびミルシテイン（１９７６）および改良
の技術を使用する。
【０１４４】 簡潔に、これらの方法は、所望の特性、すなわち、重要なペプチドを有する反
応性を有する抗体を生産できる不滅の細胞系の準備を含む。たとえば、この種の
細胞系は、上記の通りに免疫にされる動物から得られる脾臓細胞から作り出され
ることができる。たとえば、脾臓細胞は、それから骨髄腫細胞融合パートナー（
免疫にされた動物と同系である好ましくは１）を有する融合によって、不滅にさ
れる。様々な融合技術を、使用できる。たとえば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は
、２、３分の間の非イオン洗剤と組み合わせられることができて、それから、骨
髄腫細胞以外でない、複合型細胞の成長を支える選択的な媒体上の低い密度でメ
ッキをされることができる。好適な選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）選択を使用する。充分な時間（通常２週に対する約１）
以後、ハイブリッドのコロニーは、観察される。一つのコロニーは選ばれる。そ
して、それらの培養上澄みはペプチドに対して活動を結合するために試験した。
高い反応性および特性を有するハイブリドーマは、好まれる。
【０１４５】 モノクロナール抗体は、発展しているハイブリドーマ植民地の上澄みから分離
されることができる。加えて、さまざまな技術は、マウスのような産出（例えば
ハイブリドーマ細胞系の適切な脊椎動物ホストの腹膜の空洞への注入）を強化す
るために使用されることができる。
【０１４６】 モノクロナール抗体は、それから腹水流体または血液から収穫されることがで
きる。汚濁物は、従来の技術（例えばクロマトグラフィ、ゲル濾過、沈殿および
抽出）によって、抗体から除去されることができる。たとえば、本発明のペプチ
ドが、類似性クロマトグラフィ・ステップの浄化プロセスで使うことができる。
【０１４７】 特定の実施態様の範囲内で、抗体の抗原−結合断片の使用は、好まれることが
できる。この種の断片はＦａｂ断片を含む。そして、それは標準の技術を使用し
て準備されることができる。簡潔に、免疫グロブリンはプロテインＡビーズ・コ
ラム、ハーローおよびＬａｎｅ、１９８８上の類似性クロマトグラフィによるウ
サギ血清から浄化されることができて、ＦａｂおよびＦｃ断片を生むためにパパ
インにより消化されることができる。ＦａｂおよびＦｃ断片は、プロテインＡビ
ーズ・コラム上の類似性クロマトグラフィによって、切り離されることができる
。
【０１４８】 モノクロナール抗体およびそれの断片は、一つ以上の治療的なエージェントに
連結できる。適切なエージェントは、この事については放射性のトレーサおよび
ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃなエージェントを含む。そして、たとえば、
それが試験管内の自己の骨髄を一掃するために使うことができる）。代表的な治
療的なエージェントは放射性核種を含む。そして、分化は誘導して、薬を混ぜる
（毒素）、そして、それの派生物。好適な放射性核種は、９０Ｙ、１２３Ｉ、１
２５Ｉ、３ｉＩ、３６Ｒｅ、８８Ｒｅ、２ｌｌＡｔおよび２ｔ２Ｂｉを含む。好
適な薬は、メトトレキサートおよびピリミジンおよびプリン・アナログを含む。
好適な分化は、誘導するホルボール・エステルおよび酪酸を含む。好適な毒素は
、リシン、アブリン、ｄｉｐｔｈｅｒｉａ毒素、コレラ毒素、ｇｅｌｏｎｉｎ、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素およびアメリカヤマゴボ
ウ抗ウイルス物質タンパク質を含む。診断上のために、放射性のエージェントの
継手は、転移の追跡を容易にするかまたはＷＴ１−肯定腫瘍の場所を決定するた
めに用いてもよい。
【０１４９】 治療的なエージェントを、連結できる（例えば、（共有結合して結合される）
適切なモノクロナール抗体直接間接的に（ｅ。リンカー・グループを経て、ｇ．
）。各々がその他とともに化学反応できる置換分を所有するときに、代理人およ
び抗体間の直接の反応は可能である。たとえば、１上のｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｉ
ｃなグループ（例えばアミンのメルカプト基グループ）は、カルボニルを含むグ
ループ（例えば無水物または酸性ハロゲン化物）とともに化学反応することでま
たは良い去っているグループを含んでいるアルキル基によって、能力があっても
よい（例えば、（ハロゲン化物）もう一方上の。
【０１５０】 あるいは、リンカー・グループを経た治療的なエージェントおよび抗体を連結
することは、望ましくてもよい。リンカー・グループは、能力を結合することに
対する干渉を避けるために代理人から抗体を遠くに隔てるために間隔保持装置と
して機能できる。リンカー・グループは、また、代理人または抗体上の置換分の
化学反応性を増やすのに役立つことができて、このようにカップリング効率を増
やすことができる。化学反応性の増加はまた、代理人の利用またはエージェント
上の官能基を容易にすることができる。そして、それは一方可能でない。
【０１５１】 それは、当業者に明らかである様々なそのｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌなｐｏｌ
ｙｆｕｎｃ−ｔｉｏｎａｌな試薬、両方のｈｏｍｏ−ａｎｄヘテロ汎関数（ピア
スＣｈｅｍｉｃａｌのカタログに記載されているそれらのような社（Ｒｏｃｋｆ
ｏｒｄ）ＩＬ）、リンカー・グループとして使用できる。継手は、たとえば、ア
ミンのグループ、カルボキシル基およびメルカプト基グループによって、影響を
受けることができるかまたは炭水化物残留物を酸化した。この種の方法論を記載
している多数の参照が、ある。ｅに、ｇ．、米国特許番号４、６７１、９５８。
【０１５２】 本発明のｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓの抗体部分から自由なときに、治
療的なエージェントがより有力な所で、細胞に内面化の間、またはにｃｌｅａｖ
ａｂｌｅであるリンカー・グループを使用することは、望ましくてもよい。多く
の異なるｃｌｅａｖａｂｌｅなリンカー・グループは、記載されていた。血清補
足−調停された加水分解（米国特許番号４、６７１、９５８）および酸性の触媒
作用を及ぼされた加水分解（米国特許番号４、５６９、７８９）によるｄｅｒｉ
ｖａｔｉｚｅｄされたアミノ酸サイドチェーン（米国特許番号４、６３８、０４
５）の加水分解によって、ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ結合（米国特許番号４、６２
５、０１４）の照射によって、これらのリンカー・グループからの代理人の細胞
内釈放のためのメカニズムは、二硫化物結合（米国特許番号４、４８９、７１０
）の減少によって、裂け目を含む。
【０１５３】 複数のエージェントを抗体に連結することは、望ましくてもよい。実施例にお
いて、代理人の多数の分子は、１つの抗体分子に連結する。もう一つの実施例で
は、複数種類のエージェントは、１つの抗体に連結できる。特定の実施態様に関
係なく、複数のエージェントを有するｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓは、様
々な方法で準備されることができる。たとえば、複数のエージェントは直接抗体
分子に連結できる、または、多数のサイトを付着のために用意するリンカーが使
うことができる。あるいは、キャリアが使うことができる。キャリアは、共有結
合結合を含む様々な方法ものエージェントを運ぶことができる直接、または、リ
ンカー・グループを経た。適切なキャリアは、タンパク質（例えばアルブミン（
米国特許番号４、５０７、２３４）、ペプチドおよび多糖類（例えばａｍｉｎｏ
ｄｅｘｔｒａｎ（米国特許番号４、６９９、７８４、を含む。キャリアは、また
、ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔな結合によって、または、小嚢（米国特許番号４、４
２９、００８および米国特許番号４、８７３（０８８）のような、リポソームの
範囲内のカプセル化によって、代理人を運ぶことができる。放射性核種エージェ
ントに固有なキャリアは、ｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄされた小さい分子
およびキレート化している合成物を含む。たとえば、米国特許番号４、７３５、
７９２は、代表的なｒａｄｉｏｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄされた小さい分子および
それらの統合を開示する。放射性核種キレートは、金属または金属酸化物（放射
性核種）を結合するための提供者原子として、窒素および硫黄原子を含んでいる
それらを含む合成物をキレート化することから形成されることができる。たとえ
ば、米国特許番号４、６７３、５６２は、代表的なキレート化している合成物お
よびそれらの統合を開示する。
【０１５４】 抗体およびｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓのための管理の様々なルートが
、使うことができる。概して、管理は静脈であるか、筋内であるか、皮下である
か流行っているｒｅｓｅｃｔｅｄされた腫瘍の台。ａｎｔｉｂｏｄｙ／ｉｍｍｕ
ｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅの正確な服用が使用する抗体、腫瘍上の抗原密度および
抗体のクリアランスの率によって、変化することは、明白である。
【０１５５】 また、ＷＴ１の免疫原性部分を模倣する反ｉｄｉｏｔｙｐｉｃな抗体は、本願
明細書において、提供される。この種の抗体は抗体に対して上がることができる
、または、それの抗原−結合断片は非常に具体的には、ｗｅｌｌｋｎｏｗｎ技術
を用いてＷＴ１の免疫原性部分に縛る。
【０１５６】 ＷＴ１の免疫原性部分を模倣する反ｉｄｉｏｔｙｐｉｃな抗体は、抗体または
それの抗原−結合断片に縛る、本願明細書において、記載されているように、具
体的には、ＷＴ１の免疫原性部分に縛るそれらの抗体である。
【０１５７】 最初のＷＴ１の出所にかかわりなく、ペプチドに特有の抗体、完全な抗体、抗
体ｍｕｌｔｉマーまたは抗体の様々な機能の、抗原−結合領域のいかなる一つも
、本発明において、使うことができる。典型的な機能の領域は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ
、Ｆａｂを含む』、ＷＴ１ペプチド−特定の抗体のＦａｂてＦ ２つの（ａｂ』
）断片。この種の構造物を準備することの技術は、従来技術において、それらに
とって周知で、本願明細書において、更に例証される。
【０１５８】 抗体構造物の選択は、さまざまな要因により影響されることができる。たとえ
ば、長くなる半減期は、腎臓（免疫グロブリンのＦｃ部分の特性）の範囲内で、
完全な抗体の作動中のｒｅａｄｓｏｒｐｔｉｏｎから生じることがありえる。Ｉ
ｇＧベースの抗体は、したがって、それらのＦａｂ’ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ
より遅い血液クリアランスを呈すると思われる。しかし、Ｆａｂ』断片−ベース
の組成物は、一般に能力を通しているより良い組織を呈する。
【０１５９】 抗体断片は、非特異性のチオール・プロテアーゼ（パパイン）によって、全部
の免疫グロブリンのタンパク質分解によって、得られることが可能である。パパ
イン消化は、２つの同一の抗原−結合断片（ｔｅｒｍｅｄＦａｂ断片）に単一の
抗原−結合サイトおよびｒｅｓｉｄｕａｌＦｃ断片を有する各々を与える。」Ｐ
ａｐａｉｎが、システイン、２−メルカプトエタノールまたはｄｉｔｈｉｏｔｈ
ｒｅｉｔｏｌ．を有する活発なサイトのメルカプト基グループを減らすことによ
って、最初に活性化されなければならない株酵素の重金属は、最大の酵素活動を
確実にするためにＥＤＴＡ（２ｍＭ）を有するキレート化により除去されなけれ
ばならない。酵素および基板は、一緒に通常１の比率に加えられる：重量による
１００。インキュベーションの後、反応はｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅをもつま
たは単に透析によるチオール・グループの取り消せないアルキル化によって、止
められることが可能である。消化の完全性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、モニタ
されなければならない、そして、さまざまな分数はプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒ
ｏｓｅまたはイオン交換クロマトグラフィによって、分かれた。
【０１６０】 準備のための通常の手順（ａｂ％はウサギのＩｇＧから分解する。そして、人
間の起源は酵素ペプシンによる限られたタンパク質分解である。状況（ｐＨ ４
での酢酸塩バッファの１００ｘ抗体過剰ｗｔ．／ｗｔ．）。３７Ｃ、５は抗体が
インター重いチェーン二硫化物結合のＣ−ターミナル側で裂かれることを示唆す
る。マウスＩｇＧの消化の率はサブクラスによって、変化できる。そして、若干
の『消化不良であるか完全に等級を下げられたＩｇＧのない活発なＦ ２つの（
ａｂ』）断片の高い産出を得ることはむずかしくてもよい。特に、ＩｇＧ２ｂは
完全な低下に非常に影響されやすい。他のサブクラスは異なるインキュベーショ
ン状況が最適の結果をもたらすことを必要とする。そして、その全ては従来技術
において、周知である。
【０１６１】 完全な抗体のペプシン処理は、２つの抗原結合しているサイトを有して、抗原
をクロスリンクすることがさらにできる２つの１Ｆ（ａｂ』）断片を生む。ペプ
シンによるネズミＩｇＧの消化は、透析を０に含んでいる状況を必要とする。１
Ｍの酢酸塩バッファ（ｐＨ ４）。１％のｗｔ．／ｗｔ．ペプシンを有する４時
間のための５およびそれからインキュベーション；ＩｇＧ、そして、ＩｇＧ２ａ
消化最初に、０に対して透析される場合、改善されてある。１Ｍのギ酸塩バッフ
ァ（ｐＨ ２）。１６時間のための４Ｃで、８は酢酸塩バッファによって、あと
に続いた。ＩｇＧ２ｂは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌなＶ ８のインキュベ
ーションを有するより一貫した結果に０のプロテアーゼ（３％のｗｔ．／ｗｔ．
）を与える。１Ｍのリン酸ナトリウム・バッファ（ｐＨ ７）。３７のＣ．での
４つの時間間、８Ｆａｂ断片も、軽鎖の安定した領域および重いチェーンの第１
の安定した領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’ｆｒａｇｍｅｎｔｓは、抗体ヒンジ
領域から一つ以上のシステインを含んでいる重いチェーンＣＨ１領域のカルボキ
シル終点で、２、３の残留物の追加によって、Ｆａｂ断片と異なる。２つの抗体
が分解するＦ（ａｂ』）が、それら間のヒンジ・シスチンを有するＦａｂ’ｆｒ
ａｇｍｅｎｔｓの一組として、元々生じた。抗体断片の他の化学の継手は、また
、公知である。
【０１６２】 抗体に関して本願明細書において、使われるように、ｔｅｒｍｖａｒｉａｂｌ
ｅは可変の領域の特定の部分が広く抗体の中の配列において、異なって、その特
定の抗原に対する各々の特定の抗体の結合および特性において、使われることを
意味する。しかし、可変性は抗体の可変の領域の全体にわたって均一に計量分配
されない。それは、３つの部分ｔｅｒｍｅｄｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ領域（
軽鎖および重いチェーン変数領域の両方とも）に集中する。
【０１６３】 可変の領域のより非常に節約された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼
ばれている。自国の重くて軽いチェーンの可変の領域は、各々４つのＦＲｓ（Ｆ
Ｒ１、ＦＲ２、ＦＲ３および、それぞれ、ＦＲ４）から成る主に採用する（３−
シート構成は、３つの超可変領域（形式はそれの中で一部を接続して、場合によ
っては形成することを環状にする）によって、接続した（３−シート構造。
【０１６４】 各々のチェーンの超可変領域は、ＦＲｓによる近い近接において、一緒に保た
れて、他のチェーンからの超可変領域については、抗体、特に本願明細書に引用
したものとするＫａｂａｔほか、１９９１の抗原−結合サイトの形成に貢献する
。安定した領域は、直接抗体を抗原に結合することに関係していなくて、さまざ
まな効果器機能（例えば抗体依存な細胞毒性の抗体の参加）を呈する。
【０１６５】 本願明細書において、使われるように、ｔｅｒｍｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ
領域は抗原−結合の原因となる抗体のアミノ酸残留物に関連する。超可変領域は
、ｒｅｇｉｏｎｏｒＣＤＲを決定しているａｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙか
らアミノ酸残留物から成る」（ｉ． ｅ。残留物２４−３４（Ｌ １）、５０−
５６（Ｌ２）、そして、軽鎖変数領域および３１−３５（ＨＩ）（ａｈｙｐｅｒ
ｖａｒｉａｂｌｅからの可変の領域、特に本願明細書に引用したものとするＫａ
ｂａｔほか、１９９１および／またはそれらの残留物が環状にする重いチェーン
の５０−５６、Ｈ２）および９５−１０２、Ｈ３の８９−９７（Ｌ３）」（すな
わち、残留物２６−３２（ＬＩ）、５０−５２（Ｌ２）および軽鎖変数領域およ
び２６−３２（ＨＩ）（重いチェーン変数領域の５３−５５、Ｈ２）および９６
−１０１、Ｈ３の９１−９６（Ｌ３）。「本願明細書において、定義されるよう
に、フレームワークＦ残基は超可変領域残留物以外のそれらの可変の領域残留物
である。
【０１６６】 Ｆｖフラグメントは、完全な抗原認識および結合するサイトを含む最小限の抗
体断片である。この領域は、１つの重いチェーンの二量体およびきつい、反対の
共有結合関連の１つの軽鎖変数領域から成る。各々の可変の領域の３つの超可変
領域がｔｈｅＶＨ−ＶＬ二量体の表層上の抗原−結合サイトを定義するために相
互に作用することは、この構成において、ある。集合的に、６つの超可変領域は
、抗体に抗原−結合特性を授ける。しかし、単一の可変の領域（または抗原に固
有な３つの超可変領域だけから成るＦｖの半分）にさえ、全ての結合するサイト
より低い類似性で認識して、抗原を結合する能力がある。
【０１６７】 「シングルのチェーンＦｖｏｒｓＦｖａｎｔｉｂｏｄｙ断片は抗体のＶＨおよ
びＶＬ領域から成る。そこにおいて、これらの領域は単一のポリペプチド・チェ
ーンに存在する。通常、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨ間のポリペプチド・リンカー
およびｓＦｖに縛っている抗原のための所望の構造を形成するのを可能にするＶ
Ｌ領域から更に成る。
【０１６８】 「小さい抗体が２つの抗原−結合サイトによって、分解する、分解するＤｉａ
ｂｏｄｉｅｓａｒｅは、同じポリペプチド・チェーン（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖変数
領域（ＶＬ）に接続している重いチェーン変数領域（ＶＨ）から成る。同じチェ
ーン上の２つの領域の間で対になるのを許すにはあまりに短いリンカーを使用す
ることによって、領域は他のチェーンの相補的な領域を有する一組に移動されて
、２つの抗原−結合サイトをつくる。Ｄｉａｂｏｄｉｅｓは、欧州特許出願番号
ＥＰ ４０４に記載されている０９７、そして、国際。特許出願公開番号ＷＯ
９３／１１。１６１は、各々具体的には、ここにて結合した。線形の抗体」、そ
れはｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃでありえるか単一特異的なでありえる以下から成る、
Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａＬ（１９９５）にて説明したように、具体的には、領域
を結合している一対の抗原を形成する一対の縦に並んだＦｄ部分（ＶＨ−ＣＨｌ
−ＶＨ ＣＨ１）は、ここにて取り入れた。
【０１６９】 他の種類の変化は、それらが発生する親抗体と関連する改良された生物学的特
性を有する抗体である。この種の変化または第二世代の合成物は、親抗体の一つ
以上の置換された超可変領域残留物を含んでいる概して代用の変化である：この
種の代用の変化を生成するための近くの道は、バクテリオファージ・ディスプレ
イを使用している類似性成熟である。
【０１７０】 バクテリオファージを使用することは表示する、超可変いくつかの領域が据え
付ける類似性成熟の（例えば、（７つのサイトに対する６）各々のサイトで全て
の可能なアミンの置換を生成するために変化させる。このように発生する抗体変
化は、各々の分子の範囲内で包装されるＭ １３の遺伝子ＩＩＩ製品に、融合と
して糸状のバクテリオファージ分子から一価のやり方で表示される。ｐｈａｇｅ
−ｄｉｓｐｌａｙｅｄされた変化は、それからそれらの生物学的活動のために隠
される（例えば、類似性を結合して、本願明細書において、）開示する。
【０１７１】 変更態様の候補超可変領域場所を識別するために、アラニン−スキャン突然変
異生成は、かなり縛っている抗原に貢献すると確認される超可変領域残留物に実
行されることができる。
【０１７２】 代わりにまたは加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造は、詳細に描写されて、
抗体および目標間の接触位置を識別するために分析される。この種の接触残留物
および隣接した残留物は、置換の候補である。一旦この種の変化が発生すると、
変化のパネルはスクリーニングを受ける。そして、一つ以上の関連した分析評価
の異なるか優れていさえする特性以外のアナログを有する抗体は更なる開発のた
めに選ばれる。
【０１７３】 組織浸透に対する付き添いの利益については、抗体の断片を結合しているＦａ
ｂ’または抗原を使用する際に、１はその半減期を増やすために断片を修正する
ことから追加の効果を引き出すことができる。不活性キャリアに対する抗体分子
、更には活用の操作または変更態様のような、様々な技術を、使用できる。配達
するために、目標に対する代理人がＦａｂ’ａｎｄ他の断片が組織を通すように
選ばれるというにおいて、慎重に接近されなければならないよりはむしろ、半減
期を増やす唯一のためのいかなる活用も。それでもなお、非タンパク性の重合体
（この種のＰＥＧなど）に対する活用は、熟慮される。
【０１７４】 活用以外の変更態様は、したがって、それがより安定していなっておよび／ま
たはボディの異化の率を減らすために抗体断片の構造を修正することに基づく。
この種の変更態様のための１台のメカニズムは、Ｌ−アミノ酸の代わりのＤ−ア
ミノ酸の使用である。通常の技術のそれらは、この種の変更態様のはじめにがそ
れがまだ所望の生物学的特性を保持することを確実にするために結果として生じ
る分子の厳密なテストが続くことを必要とすると従来技術において、理解する。
更なる安定させている変更態様は両方ともかＮ−ターミナルかＣ−ターミナルに
半分を安定させることの追加の使用を含む。そして、それは一般に生物学的分子
の半減期を長くするために用いる。実施例だけとして、１はａｃｙｌａｔｉｏｎ
またはアミノ化によって、終点を修正することを望むことができる。
【０１７５】 本発明用としての適度な活用−タイプ変更態様は、抗体断片にエピトープを結
合しているサルベージ受容器を取り入れることを含む。これを達成することの技
術は抗体断片の適当な領域の変化を含む、または、抗体に取り付けられるペプチ
ド・タグとして、エピトープを取り入れることは分解する。国際である特許 出願Ｐｕｂｌ．数ＷＯ ９６／３２４７８は、具体的には、この種の技術を更
に例証するためのために本願明細書に引用したものとする。
【０１７６】 サルベージ受容器結合エピトープは、概して抗体断片に対する相似性の姿勢へ
動かされるＦｃ領域の１、２の小枝からの３つ以上のアミノ酸の領域である。受
容器−結合エピトープが中で開示したサルベージ国際。特許出願Ｐｕｂｌ．数Ｗ
Ｏ ９８／４５３３１は、本発明の用途に、本願明細書に引用したものとする。
【０１７７】 （４．６ ＷＴ１ペプチドに特異的なＴ細胞組成物） 免疫治療組成物は、ＷＴ１特異的なＴ細胞を含むか、またはこれから成る。こ
の種の細胞は、一般に用意された試験管内であるか前の活発な、使用している標
準の手順であってもよい。たとえば、Ｔ細胞はあってもよいの範囲内で（または
、分離する）骨髄、周辺の血液またはＮｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ
社から入手可能な市販の細胞分離システム（例えばＩｓｏｌｅｚシステム）を用
いて哺乳類（例えば患者）の骨髄または周辺の血液の一部分（アーヴィン（ＣＡ
）；また、米国特許番号５、２４０、８５６を参照のこと；米国特許番号５、２
１５、９２６；国際特許出願公報番号ＷＯ ８９／０６２８０；国際特許出願公
報番号ＷＯ ９１／１６１１６、そして、国際特許出願公報番号ＷＯ ９２／０
７２４３）。あるいは、Ｔ細胞は関連したか無関係な人間、人間外の哺乳類、細
胞系または培養に由来できる。
【０１７８】 Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオ
チドおよび／またはＷＴ１ペプチドを表す抗原−示している細胞、ＡＰＣにより
刺激されることができる。この種の刺激は、状況の下で実行されて、しばらく、
ＷＴ１ペプチドに特有であるＴ細胞の生成を許可するのに十分である。好ましく
は、ＷＴ１ペプチドまたはポリヌクレオチドは、交付ビヒクル（例えば抗原ｓｐ
ｅｃｉｆｉｃなＴ細胞の生成を容易にするミクロスフェア）の範囲内である。簡
潔にＴ細胞、ルーチン技術（例えばＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅｔによって、
）によって、患者または関連したか無関係な提供者から分離されることができる
周辺の血液リンパ球の密度勾配遠心分離）、ＷＴ１ペプチドを有する抱く。たと
えば、Ｔ細胞はＷＴ１ペプチドを有する３７のＣで２−９つの日（概して４日）
の間のインビトロにおいて、培養されることができる（例えば、（２５のｐｇ／
ｍｌに対する５）またはＷＴ１ペプチドの比較できる量を総合している細胞。制
御として役立つためにＷＴ１ペプチドがない場合、Ｔ細胞サンプルの別々の約数
を培養することは、望ましくてもよい。
【０１７９】 Ｔ細胞は、Ｔ細胞がＷＴ１ペプチドでおおわれている目標細胞を殺す場合、Ｗ
Ｔ１ペプチドに特有であるために考慮されるかまたはこの種のペプチドをコード
化している遺伝子を表している。Ｔ細胞特性は、様々な標準の技術のいずれでも
使用して評価されることができる。たとえば、クロミウム・リリース分析評価ま
たは増殖分析評価の範囲内で、渙散および／または、否定の制御と比較して、増
殖の２倍以上の増加の刺激インデックスは、Ｔ細胞特性を示す。たとえば、この
種の分析評価は、チェンその他（１９９４）にて説明したように、実行されるこ
とができる。
【０１８０】 あるいは、Ｔ細胞の増殖の探知は、様々な周知の技術によって、完成していて
もよい。Ｔ細胞増殖がＤＮＡ合成の増加する率を測定することにより検出される
ことができて、たとえば（ｅ。ｔｒｉｔｉａｔｅｄされたチミジンを有するＴ細
胞の培養をｐｕｌｓｅ−ｌａｂｅｌｉｎｇして、ＤＮＡに組み込まれるｔｒｉｔ
ｉａｔｅｄされたチミジンの量を計ることによって、ｇ．）。Ｔ細胞増殖を検出
する方法が測ることを含むその他は、インターロイキン２（ＩＬ−２）製造、Ｃ
ａ２＋流量または染料理解が増加する３−（４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａ
ｚｏｌ−２−イル）−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ． あるいは、リンフォカイン（例えばインターフェロン−γ）の統合は測られるこ
とが可能である、または、ＷＴ１ペプチドに応答できるＴ細胞の相対的な数は量
を定められることが可能である。３−７つの日の間のＷＴ１ペプチド、２００の
ｎｇ／ｍｌ−１００のＪ． ｇ／ｍｌ、好ましくは１００のｎｇ／ｍｌ−２５の
ｐｇ／ｍｌとの接触は、２−３のためのＴ細胞および／または上記の通りの接触
の増殖の少なくとも１つの二倍の増加に結果としてならなければならない時間ど
の１つの２−折り目がサイトカイン・リリースのレベルが増加するか、標準のサ
イトカイン分析評価を使用して測られて、Ｔ細胞の起動の結果としてならなけれ
ばならない（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−ｙ）Ｔ細胞起動、Ｃｏｌｉｇａｎほ
か、１９９８を表す。ＷＴ１特定のＴ細胞は、標準の技術を使用して拡張される
ことができる。好適な実施例の範囲内で、Ｔ細胞は患者または関連したか無関係
な提供者に由来して、忍耐強い以下の刺激および展開に与えられる。
【０１８１】 ＷＴ１ペプチド、ポリヌクレオチドまたはＷＴｌ−表しているＡＰＣに応答し
て活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であってもよい。Ｃ
Ｄ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の特定の起動は、様々な方法に認められることが
可能である。特定のＴ細胞起動を検出する方法は、Ｔ細胞の増殖を検出すること
を含む、サイトカインの製造（例えば、（リンフォカイン）、または、細胞融解
活動、すなわち、ＷＴ１に固有な細胞障害性Ｔ細胞の生成の世代。
【０１８２】 ＣＤ４＋ Ｔ細胞のために、特定のＴ細胞起動を検出する好適な方法は、Ｔ細
胞の増殖の探知である。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のために、特定のＴ細胞起動を検出す
る好適な方法は、細胞融解活動の生成の探知である。
【０１８３】 治療的な目的のために、ＷＴ１ペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応
答して増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞は、試験管内の数において、拡
張されることができるかまたは生体内である。
【０１８４】 インビトロのこの種のＴ細胞の増殖は、様々な方法で完成していてもよい。例
えば、Ｔ細胞があることがありえる−、Ｔ細胞発育因子（例えばＷＴ１ペプチド
を合成するインターロイキン２および／または刺激器細胞）の追加の有無にかか
わらず、ＷＴ１ペプチドにさらす。ＣＤ８＋ Ｔ細胞反応を起こす所で、刺激器
細胞の追加は好まれる。Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチドを有する断続的な再刺激に応
答して特性の保持を有する大きい数ｉＭ ｖｉｔｒｏに育てられることが可能で
ある。簡潔に、第一のための試験管内の刺激（ＩＶＳ）が大きくリンパ球の中で
計算すること（例えば、４つを超えるｘ１０）人間の血清を含んでいるメディア
を有するフラスコの配置できる。ＷＴ１ペプチド（例えば、（１０のｐｇ／ｍｌ
でのペプチド）破傷風毒素を有する直接加えることができる（例えば、５つのｐ
ｇ／ｍｌ）。フラスコは、それから培養されることができる（例えば、（７つの
日の間の３７のＣ）。第２のＩＶＳのために、Ｔ細胞はそれから収穫されて、２
−３つのｘ １０を有する新しいフラスコに置かれる』光に包まれた周辺の血液
単核細胞。ＷＴ１ペプチド（例えば、１０、ｕｇ／ｍｌ）直接加える。
【０１８５】 フラスコは、７日の間の３７Ｃで培養される。第２のＩＶＳの後の日２および
日４に関して、インターロイキン２（ＩＬ−２）の２−５台の装置は、加えられ
ることが可能である。第３のＩＶＳのために、Ｔ細胞はウェルに置かれることが
できて、変わるＢ細胞がペプチドでおおった個人の自身のＥＢＶにより刺激され
ることができる。ＩＬ−２は、各サイクルの日２および４に加えられることが可
能である。細胞が特定の細胞障害性Ｔ細胞であることを示すとすぐに、それらは
日２、４および６上のより高いＩＬ−２（２０台の装置）を有する１０日の刺激
サイクルを使用して拡張されることができる。
【０１８６】 あるいは、ＷＴ１ペプチドがある場合には、増殖する一つ以上のＴ細胞は、ク
ローニングによって、総計で拡張されることができる。クローニング細胞のため
の方法は、公知技術で、希薄を制限することを含む。応答者Ｔ細胞は、ｒｏｓｅ
ｔｔｉｎｇしている密度勾配遠心分離および羊赤血球による感度を高められた患
者の周辺の血液から浄化されることができて、照射を受けた自己の注入物細胞が
ある場合には、名目上の抗原によって、刺激となることによって、培養において
、決められることが可能である。ＣＤ４＋ Ｔ細胞系を生成するために、ＷＴ１
ペプチドが抗原性の刺激および自家組織の周辺の血液リンパ球（ＰＢＬ）として
使われる、または、Ｅｐｓｔｅｉｎバー・ウイルスへの感染によって、不滅にさ
れるｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ細胞系（ＬＣＬ）が細胞を抗原ｐｒｅｓｅｎ
ｔｉｎｇするとして使われる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞系を生成するために、ＷＴ１ペ
プチドを生産する発現ベクトルによって、トランスフェクションする自己の抗原
−示している細胞が、刺激器細胞として使うことができる。確立したＴ細胞系は
、焼き付けによる抗原刺激が０の周波数でＴ細胞を刺激したことになっているク
ローンをつくられた２−４つの日であってもよい。１つのｘ １０６を有する９
６−かなり平坦な底プレートのウェルにつき５つの細胞は、ＰＢＬまたはＬＣＬ
細胞および再結合物インターロイキン２（ｒＩＬ２）（５０のＵ／ｍｌ）を照ら
した。
【０１８７】 確立したｃｌｏｎａｌな成長をもつウェルズはほぼ最初の焼き付けの後の２−
３週に識別されることができて、自己の抗原−示している細胞がある場合には、
適当な抗原によって、再刺激した。そして、抗原刺激に続いているｒＩＬ２ ２
−３つの（１０のＵ／ｍｌ）日の低い量の追加によって、続いて、拡張された。
Ｔ細胞クローンは、抗原およびほぼ毎ｒＩＬ２を有する周期的な再刺激によって
、２４ｗｅｌｌプレートにおいて、維持されることができる。２週。
【０１８８】 チャンその他によって、実施例（１９９６）のために、記載されているように
、クローンをつくられるおよび／または発泡させた細胞は患者へ管理されること
ができる。
【０１８９】 特定の実施態様の範囲内で、異系なＴ細胞は、生体内に満たされることができ
、すなわち、ＷＴｌに感度を高められるておよび／または試験管内である。この
種の雷管取付けは、ＷＴ１ペプチドを有する接触Ｔ細胞、この種のペプチドをコ
ード化しているポリヌクレオチドまたは状況の下でこの種のペプチドを生産して
いる細胞によって、成し遂げられることができて、しばらく、Ｔ細胞の雷管取付
けを許可するのに十分である。一般に、Ｔ細胞は、たとえば、ＷＴ１ペプチドと
の接触がＴ細胞の増殖および／または起動に結果としてなる場合、満たされると
考えられる。そして、本願明細書において、記載されているのと、同程度標準の
増殖、クロミウム・リリースおよび／またはサイトカイン・リリース分析評価に
よって、測られる。増殖または渙散の２倍以上の増加およびサイトカインのレベ
ルの３倍以上の増加の刺激インデックスは、否定の制御と比較してＴ細胞特性を
示す。
【０１９０】 たとえば、ｖｉｔｒｏにおいて、満たされる細胞は、骨髄移植の範囲内でまた
は提供者リンパ球注入として使用されることができる。
【０１９１】 ＷＴ１に固有なＴ細胞は、ＷＴ１タンパク質を表す細胞を殺すことができる。
ＷＴ１のためのチェーンが量的に、そして、質的に手段として使われるＴ細胞受
容器（ＴＣＲ）をコード化している遺伝子のはじめには、白血病に耐えているＷ
Ｔ１およびガン細胞への反応を改善する。ＷＴ１肯定細胞に反応できるＴ細胞の
数を増やすワクチンは、細胞を運んでいるＷＴ１を目標とする１つの方法である
。ＷＴ１に固有なＴ細胞を有するＴ細胞療法は、他の方法である。
【０１９２】 代替方式は、Ｔ細胞へのＷＴ１またはｌｙｔｉｃな可能性を有する他の細胞に
固有なＴＣＲチェーンを導くことである。適切な実施態様において、ＴＣＲアル
ファおよびベータ・チェーンがＷＴ１特定のＴ細胞系から外へクローンをつくら
れて、採用するＴ細胞療法（例えばＷ０９６／３０５１６に記載されている）の
ために使われる。そして、ここにて取り入れられる。
【０１９３】 （４．７ 薬学的組成物およびワクチン処方物） 特定の局面では、ペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および／またはＴ細胞の
範囲内の７つの製薬組成物およびワクチンの処方物は、製薬組成物または免疫原
性組成物、すなわち、ワクチンに組み込まれることができる。あるいは、製薬組
成物は、抗原−示している細胞から成ることができる（例えば、（樹状突起の細
胞）、抗原提示細胞がＷＴ１ペプチドを表すように、ＷＴ１ポリヌクレオチドに
よって、トランスフェクションする。医薬組成物は、一つ以上のこの種の合成物
または細胞から成る。そして、生理的に受け入れられるキャリアまたは賦形剤。
【０１９４】 ワクチンは、一つ以上のこの種の合成物または細胞を含むことができる。そし
て、免疫刺激物（例えば助手またはリポソーム（合成物がいずれであるか、統合
された）。免疫刺激物は、外生の抗原に強化するかまたは免疫反応（細胞媒介の
ａｎｔｉｂｏｄｙａｎｄ／ｏｒ）を強化するいかなる物質でもあってもよい。免
疫刺激物の実施例は、助手を含む、生物分解可能なミクロスフェア（例えば、（
ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃなｇａｌａｃｔｉｄｅ）、そして、リポソーム（合成物が
いずれであるか、統合された）（米国特許番号４、２３５、８７７）。 たとえば、ワクチンの準備は、一般にパウエルおよびニューマン（１９９５）に
記載されている。本発明の範囲内の製薬組成物およびワクチンはまた、他の合成
物を含むことができる。そして、それは生物学上活発でもよいか不活発でもよい
。たとえば、他の腫瘍抗原の一つ以上の免疫原性部分は、あってもよい融合ペプ
チドにまたは、組成物またはワクチンの範囲内で、別々の合成物として取り入れ
る。
【０１９５】 特定の実施態様の範囲内で、製薬組成物およびワクチンは、患者のＷＴ１ペプ
チドに固有なＴ細胞反応（例えば人間）を誘発するように設計されている。一般
に、Ｔ細胞反応は、比較的短いペプチドの使用で支持されることができる（ｅ。
天然のＷＴ１ペプチド、好ましくは４−１６の連続的残留物、好ましくは、８−
１６の連続的残留物およびなお多く好ましくは８１０の連続的残留物の２３未満
の連続的アミノ酸残留物から成る、ｇ．）。代わりにまたは加えて、ワクチンは
優先してＴ細胞反応を強化する免疫刺激物を含むことができる。換言すれば、比
例して抗体反応が強化される量より大きい量によって、免疫刺激物はＷＴ１ペプ
チドへのＴ細胞反応のレベルを強化できる。
【０１９６】 たとえば、標準と比較して油が助手（例えばアフリカ金融共同体）の基礎を形
成するときに、優先してＴ細胞反応を強化する免疫刺激物はＷＴ１−否定の制御
細胞系と比較して、少なくとも２倍少なくとも２倍、少なくとも１０％によるｌ
ｙｔｉｃな反応および／またはＴ細胞起動によって、増殖的なＴ細胞反応を強化
できる、その一方で、ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙに抗体反応を強化しない。 ＷＴ１ペプチドへのＴ細胞または抗体反応が強化される量は、公知技術のいかな
る代表的な技術（例えば本願明細書において、提供される技術）も使用して、一
般に決定されることができる。
【０１９７】 製薬組成物またはワクチンは上記の通りにペプチドのうちの１つ以上をコード
化しているＤＮＡを含むことができる。そうすると、ペプチドは原位置に発生す
る。上記したように、ＤＮＡは従来技術において、通常の技術のそれらにとって
公知の様々な交付システムのいずれの範囲内ででもあってもよい。そして、核酸
発現システム、バクテリアでウィルスの発現システムおよび哺乳類の発現システ
ムを含む。多数の遺伝子交付技術は、公知技術である（ロラン、１９９８および
その中の引例）。適切な核酸発現システムは、必要なＤＮＡ（患者（例えば適切
なプロモータおよび終わっている信号）の発現のためのｃＤＮＡまたはＲＮＡ配
列）を含む。バクテリアの交付システムは、その細胞表層上のペプチドの免疫原
性部分を表すかまたはこの種のエピトープを分泌するバクテリア（例えばＢａｃ
ｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｒｉｎ）の管理を含む。好適な実施例
の、ＤＮＡがウィルスの発現システムを使用して導かれることができること（例
えば、牛痘またはその他はウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスを梅
毒に感染させる）、使用を含むことができるの非病原性の（不完全な）、複写有
能なウイルス（漁師−ホックほか（１９８９）；フレクスナーほか（１９８９）
；フレクスナーほか（１９９０）；米国特許番号４、６０３、１１２、米国特許
番号４、７６９、３３０、米国特許番号５、０１７、４８７；国際である特許出
願Ｐｕｂｌ．数ＷＯ ８９／０１９７３；米国特許番号４、７７７、１２７；グ
レートブリテン特許番号ＧＢ ２、２００、６５１；ヨーロッパの特許番号ＥＰ
０、３４５、２４２；国際特許出願公開ＷＯ ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎ
ｅｒ（１９８８）；ローゼンフェルドほか（１９９１）；Ｋｏｌｌｓほか（１９
９４）；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒほか（１９９３）；１９９３ａ、グスマンほか
；そして、グスマンその他、１９９３）。ＤＮＡをこの種の発現システムに組み
込むことの技術は、従来技術において、通常の技術のそれらにとって周知である
。ＤＮＡは、そうすることができるまた、たとえば、Ｕｌｍｅｒその他（１９９
３）に記載されていて、コーエン（１９９３）によって、チェックされるように
ｂｅｎａｋｅｄ。裸のＤＮＡの理解は生物分解可能なビーズの上へＤＮＡをおお
うことによって、増加できる。そして、それは細胞に能率的に輸送される。ワク
チンがポリヌクレオチドおよびペプチド構成要素を含むことができることは、明
らかである。この種のワクチンは、強化された免疫反応を提供できる。
【０１９８】 上記したように、製薬組成物またはワクチンは、ＷＴ１ペプチドを表す抗原提
示細胞を含むことができる。治療的な目的のために、本願明細書において、記載
されているように、抗原−示している細胞は好ましくは自己の樹状突起の細胞で
ある。この種の細胞は、準備されることができて、標準の技術を使用することを
トランスフェクションさせた（リーヴズほか（１９９６）；ほか（１９９８）を
Ｔｕｔｉｎｇすること；そして、Ｎａｉｒその他、１９９８）。本願明細書にお
いて、記載されているように、抗原−示している細胞の表面上のＷＴ１ペプチド
の発現は、クロミウム・リリース分析評価と同様に試験管内の刺激および標準の
増殖によって、確かめられることが可能である。
【０１９９】 ワクチンがポリヌクレオチドの薬学的に受け入れられる塩および本願明細書に
おいて、提供されるペプチドを含むことができることは、現在の教示の利点を従
来技術において、有している通常の技術のそれらにとって明らかである。この種
の塩は、有機主成分を含む薬学的に受け入れられる非中毒性の主成分から準備さ
れることができる（例えば、第一の塩、第２で第三のアミン、そして、基本的な
アミノ酸）、そして、無機主成分（例えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、
アンモニウム、カルシウム、そして、マグネシウム塩）。適当な様に、動物また
は人間に与えられるときに、それがそうしない分子の実在および組成物に対する
句薬理学的に受容可能または薬学的に受容可能は逆であるか、アレルギであるか
他の重大な困った反応を起こす。本願明細書において、薬学的に受け入れられ扱
うキャリアいずれ、そして、全ての溶媒（分散メディア）コーティング、抗菌性
で抗真菌性のエージェント、等張の吸収遅延エージェントなど。製薬活性物質の
ためのこの種のメディアおよび代理人の利用は、公知技術である。 従前通りのいずれまででもメディアまたはエージェントが活性成分と非互換であ
るのを除いて、治療的な組成物のその使用は熟慮される。
【０２００】 人間の管理のために、準備はＢｉｏｌｏｇｉｃｓ標準の食品医薬品局局によっ
て、必要に応じて不毛、発熱性および一般的な安全および純度標準を満たさなけ
ればならない。補助活性成分は、また、ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｔｏに組
成物でありえる。
【０２０１】 従来技術において、通常の技術のそれらにとって公知のいかなる適切なキャリ
アも本発明の製薬組成物において、使用されることができると共に、キャリアの
タイプは管理のモードに従い異なる。本発明の組成物は、実施例（局所の、口頭
の、鼻の、静脈の、頭蓋内、腹膜内の）のために、管理のいかなる適切な方法の
ためにも処方物されることができる皮下であるか筋内の管理。非経口の管理（例
えば皮下の注入）のために、キャリアは好ましくは水、塩水湖、アルコール、脂
肪、ワックスまたはバッファから成る。口頭の管理のために、上記のキャリアま
たは固体キャリア（例えばマンニトール、ラクトース、澱粉、マグネシウム・ス
テアリン酸塩、ナトリウム・サッカリン、滑石、セルロース、ブドウ糖、サッカ
ロースおよび炭酸マグネシウム）のいずれでも、使用されることができる。生物
分解可能なミクロスフェア（例えば、（ｐｏｌｙｌａｃｔａｔｅなｐｏｌｙｇｌ
ｙｃｏｌａｔｅ）また、本発明の製薬組成物のためのキャリアとして使用できる
。たとえば、適切な生物分解可能なミクロスフェアは、米国Ｐａｔｅｎｔ数字４
、８９７、２６８において、開示される；５， ０７５， １０９ ；５， ９
２８， ６４７ ；５， ８１１， １２８ ；５， ８２０， ８８３ ；５
， ８５３， ７６３ ；５、８１４、３４４および５、９４２、２５２。特定
の局所のアプリケーションのために、クリームまたは、周知の構成要素を使用し
て、ローションとしての処方物は、好まれる。
【０２０２】 この種の組成物は、また、バッファから成ることができる（例えば、中立の緩
衝された塩水湖またはリン酸塩が、塩水湖を緩衝した）、炭水化物（例えば、ブ
ドウ糖、マンノース、サッカロースまたはデキストラン）（マンニトール）タン
パク質、ペプチドまたはアミノ酸（例えばグリシン、酸化防止剤、静菌剤、ＥＤ
ＴＡまたはグルタチオンのようなキレート試薬、助手）（例えば、（水酸化アル
ミニウム）（処方物が等張になる溶質）低張性または弱く受取人、停止している
エージェント、厚くなっているエージェントおよび／または防腐剤の血液を有す
る高緊張の。あるいは、本発明の組成物を、処方物できるｌｙｏｐｈｉｌｉｚａ
ｔｅなまたは処方物する一つ以上のリポソーム、ミクロスフェア、ｎａｎｏｐａ
ｒｔｉｃｌｅｓまたは周知の技術を使用しているｍｉｃｒｏｎｉｚｅｄされた交
付システムを有する。
【０２０３】 様々な免疫刺激物（例えば助手）のいずれでも、本発明のワクチンの組成物の
準備において、使用されることができる。大部分の助手は抗原を速い異化（例え
ば水酸化アルミニウムまたは鉱油）から保護するように設計されている物質を含
む、そして、免疫反応、例えば脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ百日咳またはＭｖ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ結核の刺激器はタンパク質を誘導した。たとえば、適切
な助手は、ミョウバンに基づく助手として市販である（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏ
ｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ、リン酸アルミニウム、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、
水酸化アルミニウム）；油は、助手（フロイントのＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄ
ｊｕｖａｎｔおよびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ、デトロイト、ＭＩ）、Ｓｐｅｃｏｌ、ＲＩＢＩ、Ｔｉｔｅ
ｒＭａｘ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０またはＳｅｐｐｉｃなＭＯＮＴＡＮ
ＩＤＥ ＩＳＡ ７２０）の基礎を形成した；非イオン物質は、共重合体に基づ
く助手を抑止する、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌａｔ３−リ
ガンド）；メルクＡｄｊｕｖａｎｔ ６５（メルク、そして、株式会社（Ｒａｈ
ｗａｙ）ＮＪ）；ＡＳ−２（スミスクライン・ビーチャム、フィラデルフィア、
ＰＡ）；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化されたチロシンの不溶性の懸
濁；アシル化された糖；ｃａｔｉｏｎｉｃａｌｌｙであるか陰イオンでｄｅｒｉ
ｖａｔｉｚｅｄされた多糖類；ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅｓ；生物分解可
能なミクロスフェア；ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質ＡおよびＱｕｉｌ Ａ
． Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、例えばＧＭ−ＣＳＦまたはインターロイキン２（−７
）、ｏｒ１２がまた、助手として使うことができる。
【０２０４】 ヘモシアニンおよびｈｅｍｏｅｒｙｔｈｒｉｎｓが、また、本発明で使うこと
ができる。鍵穴カサガイ（ＫＬＨ）からのヘモシアニンの使用は特に好まれる。
但し、他の軟体動物および節足動物ヘモシアニンおよびｈｅｍｏｅｒｙｔｈｒｉ
ｎｓを、使用できる。さまざまな多糖類助手が、また、使うことができる。キチ
ン質およびキトサンのような、多糖類のポリアミン種類は特に好まれる。そして
、ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄされたキチン質を含む。
【０２０５】 更なる好適なグループの助手は、ｍｕｒａｍｙｌジペプチド、ＭＤＰ、Ｎ−ａ
ｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏグルタミングループ
のバクテリアのｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎｓである。ｍｕｒａｍｙｌジペプチ
ド（例えばアミンの酸性の派生的なｔｈｒｅｏｎｙｌ−ＭＤＰおよび脂肪質の酸
性の派生的なＭＴＰＰＥ）の派生物は、また、熟慮される。
【０２０６】 米国特許番号４、９５０、６４５は、ホスファチジル基コリンおよびホスファ
チジル基グリセロールから形成される人工リポソームために、提案されるｍｕｒ
ａｍｙｌジペプチドの脂肪親和性二糖類−ｔｒｉペプチド派生物を記載する。そ
れは、人間の単球を活性化して、腫瘍細胞を破壊することに効果的であると言わ
れているが、一般に高い服用において、非中毒性である。米国の合成物 特許番号４、９５０（６４５）、そして、国際。特許出願Ｐｕｂｌ．数ＷＯ
９１／１６３４７は、また、特定の本発明の態様を達成するために、提案される
。 ジミコール酸なトレハロースの有無にかかわらず、ＢＣＧおよびＢＣＧ−細胞壁
骨組み（ＣＷＳ）がまた、本発明の助手として使うことができる。ジミコール酸
なトレハロース自体が、使うことができる。
【０２０７】 アヅマほか（１９８８）は、ジミコール酸な管理がマウスのインフルエンザ・
ウイルス伝染病に対する増大された抵抗と相関することをそのトレハロースに明
らかにする。
【０２０８】 ジミコール酸なトレハロースは、米国特許番号４、５７９、９４５にて説明し
たように、準備されることができる。
【０２０９】 両親媒性の界面活性剤。例えば、（ＱＳ２１（ケンブリッジＢｉｏｔｅｃｈ）
のようなサポニンおよび派生物）本発明の免疫原用としての形式、それでも、他
のグループの好適な助手。非イオン物質は、共重合体界面活性剤を抑止する（Ｒ
ａｂｉｎｏｖｉｃｈほか（１９９４）；ハンターその他、１９９１）また、使用
できる。オリゴヌクレオチド山本ｅｔａｌ．により記載されているように、役立
つ他のグループの助手は、いる（１９８８）。Ｑｕｉｌ Ａおよびｌｅｎｔｉｎ
ｅｎは、また、好適な助手である。
【０２１０】 スーパー抗原は、また、本発明の助手としての用途のために熟慮される。
【０２１１】 「抗原処理、ムーニーｅｔ． ａｌ．、１９９４のために必要な条件のないペ
プチド抗原より大きいＴリンパ球の割合を刺激するスーパー抗原ａｒｅ一般にバ
クテリアの製品。スーパー抗原は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｘｏタン
パク質を含む、例えば、（Ｓ．アウレウスおよびＳ． ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
からのｙおよび８つのエンテロトキシン）、そして、（ｙおよび５つの大腸菌外
毒素）。
【０２１２】 記載されている、Ｒｏｔｔ ｅｔ． ａｌ．、１９９２Ｅ（ＳＥＥ）によるエ
ンテロトキシンについては、一般のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキ
シンは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌなエンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）および
ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌなエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）として公知であ
る。連鎖球菌ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｂ（ＳＥＢ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅ
ｒｆｉｉ１ｓｇｅｎｓエンテロトキシン、Ｂｏｗｎｅｓｓ ｅｔ． ａｌ．、１
９９２、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓから細胞質の膜提携のタンパク質（ＣＡＰ）（
サトウｅｔ．ａｌ．、１９９４）、そして、Ｓ．アウレウス、シュワッブｅｔ．
ａｌ．、１９９３からの有毒なショック症候群ｔｏｘｉｎ−１（ＴＳＳＴ−１
）更なる役立つスーパー抗原．ある １つのグループの特に本発明ために、好まれる助手は、ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ
された内毒素（例えば米国特許番号の精練したｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒
素）である。
【０２１３】 ４， ８６６， ０３４．これらの精練したｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒
素は、哺乳類の助手反応を起こすことに効果的である。
【０２１４】 ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒素は、他の助手と組み合わせられることが可
能である。
【０２１５】 米国特許番号４、４３５、３８６にて説明したように、ジミコール酸なトレハ
ロースを有するｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒素の組合せは、熟慮される。ジ
ミコール酸なトレハロースおよびｅｎｄｏｔｏｘｉｃな糖脂質を有するｄｅｔｏ
ｘｉｆｉｅｄされた内毒素の組合せ、米国Ｐａｔｅｎｔ数字４、４３６、７２７
、４、４３６、７２８および４にて説明したように、細胞壁骨組み（ＣＷＳ）ま
たはＣＷＳを有するｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒素の組合せおよびトレハロ
ースが５０５、９００をジミコール酸されているように、また、熟慮する（米国
特許番号４、５０５、８９９）。ちょうどＣＷＳの組合せおよびジミコール酸な
トレハロースは、ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄされた内毒素なしでまた、米国特許番号
４、５２０、０１９にて説明したように、役立つために想像される。
【０２１６】 ＭＰＬは、本願明細書において、使用のための現在一つの好適なｉｍｍｕｎｏ
ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇしているエージェントである。ＭＰＬの使用に関係す
る参照は、Ｔｏｍａｉその他（１９８７）を含む、チェンその他（１９９１）、
そして、Ｇａｒｇおよび各々加齢マウスの反応のＭＰＬの特定の役割に関係する
Ｓｕｂｂａｒａｏ（１９９２）；リポ多糖類およびＭＰＬにＤ−ガラクトサミン
・ロードしたマウスおよびその強化された感度に関係するエリオットほか（１９
９１）；バクテリアの伝染病に関するほか（１９８６）を追う；そして、Ｔｏｘ
ｏｐｌａｓｎＺａ ｇｏｎｄｉｉ．にＭＰＬの効果およびマウスの抵抗上の内毒
素を記載するＭａｓｉｈｉほか（１９８８）フィッツジェラルド（１９９１）も
、ＭＰＬの使用について上で報告した−梅毒ワクチンのｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ
ｔｙを管理する。そして、ウサギのチャレンジ伝染病からの重大な保護を授ける
こと。
【０２１７】 このように、ＭＰＬは、上記のモデル・システムに示すように、使用にとって
安全なことは公知である。
【０２１８】 第−Ｉ臨床試験は、また、ＭＰＬが使用、Ｖｏｓｉｋａほか、１９８４にとっ
て安全であることを示した。実に、１００ｌｌｇ／ｍ２は、外来患者基礎、Ｖｏ
ｓｉｋａほか、１９８４にさえ関して、人間の使用にとって安全なことは公知で
ある。
【０２１９】 ＭＰＬは、一般に多クローン性Ｂ細胞起動、ベーカーほか、１９９４を誘導し
て、たとえば、ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙな未熟なマウス、ベーカーほか
、１９８８の多くのシステムの抗体製造を増やすことを示した；加齢マウス、Ｔ
ｏｍａｉおよびジョンソン、１９８９の；そして、裸のおよびＸｉｄマウスの（
マドンナおよびＶｏｇｅｌ（１９８６）；マイヤーズその他、１９９５）。抗体
製造は、赤血球、Ｈｒａｂａほか、１９９３に対して示された；依存しているＴ
細胞および独立抗原；Ｐｎｕ−免疫性のワクチン、ＧａｒｇおよびＳｕｂｂａｒ
ａｏ、１９９２；単離された腫瘍提携の抗原（米国特許４、８７７、６１１）；
同系な腫瘍細胞に対して（リヴィングストンほか（１９８５）； １９９４ａ、Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈなほか；ｂ）；そして、腫瘍提携のガン
グリオシドに対して（１９９４ａ、Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈなほか；ｂ）。
【０２２０】 接頭母音ＩｇＭであるＭＰＬの役立つ他の属性は、ある。ベーカーその他（１
９８８ａ）によって、誰が若いマウスの抗体反応を増加するためにＭＰＬの能力
を解説するかについて示されるように反応。これは、本発明の特定の実施態様に
用いられる助手の特に役立つ特徴である。マイヤーズほか（１９９５）は、長所
Ｔ細胞−独立抗体製造によって、ＩｇＭ抗体を誘導するために最近ＭＰＬの能力
について報告した。
【０２２１】 ほか（１９９５）が研究するマイヤーズにおいて、ＭＰＬはハプテン（ＴＮＰ
）に活用した。ＭＰＬは、他のハプテン（例えばペプチド）のためのキャリアと
しての用途に推薦された。
【０２２２】 ＭＰＬも、マクロファージ、Ｖｅｒｍａほか、１９９２を活性化して、入れる
。Ｔｏｍａｉおよびジョンソン（１９８９）は、ＭＰＬ−刺激されたＴ細胞がマ
クロファージによって、ＩＬ−１つの分泌を強化することを示した。
【０２２３】 ＭＰＬは、また、過酸化物製造、リゾチーム活動、食菌作用およびネズミ腹膜
のマクロファージ、チェンほか、１９９１のカンディダの殺害を活性化すること
は公知である。
【０２２４】 Ｔ細胞上のＭＰＬの効果は、ＭＰＬ、ベネットほか、１９８８によって、ＢＣ
Ｇ−満たされたマウスの血清における細胞障害性要因（例えばＴＮＦ）の内部か
ら発生する製造を含む。Ｋｏｖａｃｈ ｅｔａｌな（１９９０）およびエリオッ
トｅｔａｌ．（１９９１）も、ＭＰＬがＴＮＦ活動を誘導することを示す。ＭＰ
Ｌは、ＮＫ細胞によって、ＩＦＮ−ｙの発表を誘導するためにＴＮＦ−ａにより
行うことは公知である。ＭＰＬに応答するＴ細胞によるＩＦＮ−ｙ製造は、また
、Ｔｏｍａｉおよびジョンソン（１９８９）によって、文書化された、そして、
Ｏｄｅａｎその他（１９９０）。
【０２２５】 ＭＰＬは、また、有力なＴ細胞助手であることは公知である。たとえば、ＭＰ
Ｌは黒色腫−抗原特定のＣＴＬｓ（ミッチェルほか、１９８８、１９９３）の増
殖を刺激する。更に、ベーカーその他（１９８８ｂ）は、非毒性ＭＰＬが抑制Ｔ
細胞活動を機能させないことを示した。
【０２２６】 自然に、生理的環境において、Ｔ抑制遺伝子細胞の不活化は、動物のための実
感されるように増加する利点を考慮に入れるによって。ｅに、ｇ．、増加する抗
体製造。ジョンソンおよびＴｏｍａｉ（１９８８）は、ＭＰＬの助手動作の考え
られる細胞で分子の仲裁者について報告した。
【０２２７】 ＭＰＬは、また、小板の集合を誘発して、セロトニン分泌、Ｇｒａｂａｒｅｋ
ほか、１９９０の誘導の前に、小板タンパク質を燐酸化することは公知である。
この研究は、ＭＰＬがプロテインキナーゼＣ起動および信号形質導入に関係して
いることを示す。
【０２２８】 構造およびＭＰＬの機能が含む多くの物品懸念。これらは、Ｓａｌｍｏｎｅｌ
ｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ５９５リポ多糖類から得られるＭＰＬ相同物の
構造上の特徴描写を記載するジョンソンほか（１９９０）を含む。 ジョンソンの仕事その他 Ｇｒａｂａｒｅｋその他（１９９０）と同じように、商用の種にさえおいて、
ＭＰＬの脂肪質の酸性の半分がそうすることができるショーは、変化する。（１
９９０）薄い層クロマトグラフィによって、ＭＰＬを８分数に分ける際に、ジョ
ンソンｅｔ ａＬ（１９９０）は、査定された使用している人間の小板反応とし
て、３が特に活発であるとわかった。さまざまなＭＰＬ種の化学の構成要素は、
ジョンソンその他（１９９０）によって、特徴づけられた。
【０２２９】 もっと先のベーカーほか（１９９２）は、脂質Ａおよびそのアナログの能力に
抑制Ｔ細胞活動の現れを廃止するように影響を与える構造上の特徴を分析した。
それらは、２から、主に３つの位置で残留物を除去することによって、脂肪質の
アシル内容を減少させることと同様に１（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質Ａ
（ＭＰＬ）をつくって、すなわち）への脂質Ａのリン酸基の数を減少させること
は毒性の進歩的な減少に結果としてなると報告した；しかし、これらの構造上の
変更態様は、Ｔｓ機能、ベーカーほか、１９９２の現れを廃止するその能力に影
響しなかった。ＭＰＬのこれらのタイプは、本発明ために、理想的である。
【０２３０】 ベーカーその他（１９９２）また、Ｂ細胞の多クローン性起動を誘導しない５
から４（脂質Ａ先駆者ＩＶＡまたはＩａ）への内容がＴｓ機能に影響する能力を
除去した脂肪質のアシルを減らすことをその示した。 これらの研究は、Ｔｓ機能の現れを廃止することが可能であるために、脂質Ａは
グルコサミン二糖類でなければならないことを示す；いずれの１つか２つのリン
酸基も有することができる；そして、少なくとも５つの脂肪質のアシル基を有し
なければならない。また、ｎｏｎｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｅｄされた脂肪質の酸（
ａｃｙｌｏｘｙａｃｙｌグループ（３’ｐｏｓｉｔｉｏｎ対２』）の場所と同様
に）のチェーン長は、重要な役割、ベーカーほか、１９９２を演ずることができ
る。
【０２３１】 活動、ベーカーその他（１９９４）が見つけた抑制Ｔ細胞（Ｔｓ）の現れを廃
止するためにチェーン長との関係および脂質Ａの能力上の脂肪質のアシル基の位
置を調べる際に、Ｃ１４に対するＣｌ２のその脂肪質のアシル・チェーン長は、
生物活性のために最適に見えた。したがって、それらの使用がさらに可能である
にもかかわらず、比較的短いチェーン長（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇ
ｉｎｏｓａおよびＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍからのＣ
１２に対するＣＩＯ）または主に長いチェーン長、Ｃ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅ
ｒ幽門からの８の脂肪質のアシル基を有する脂質Ａ準備は本発明ために、より好
適でない。
【０２３２】 ベーカーほか（１９９４）も、バクテリアの若干のリポ多糖類の脂質Ａ最も近
い内核領域オリゴ糖類がＴｓ活動の現れを増やすことを示した；主に無関係な微
生物の抗原への通常の抗体反応のコースの間、発生するＣＤ８＋ Ｔｓの人口を
大きくするかまたは広がるためにバクテリアのグラム−否定の中の構造で、比較
的節約されるこの種のオリゴ糖類の容量に対する料金。観察される加算免疫抑制
の現れのために必要な最小の構造は、いずれが取付けられた２つのｐｙｒｏｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅグループ、ベーカーほか、１９９４
であるかについて、１つの２−ｋｅｔｏ−３−ｄｅｏｘｙｏｃｔｏｎａｔｅな残
留物、２つのブドウ糖残留物および３つのヘプトース残留物を含んでいるｈｅｘ
ａｓａｃｃｈａｒｉｄｅであると報告された。この情報は、本発明ために、利用
しているか設計していさえする更なる助手において、考慮されることができる。
【０２３３】 仕事、Ｔａｎａｍｏｔｏその他の一般に関連した線の（ｉ ９９４ａ；ｂ；１
９９５）アセチル化またはｓｕｃｃｉｎｙｌａｔｉｏｎ．の後の化学的に総合さ
れたＬｉｐｉｄ Ａ先駆者のｅｎｄｏｔｏｘｉｃな活動の分離記載されているこ
のように、この種のａｓａｃｅｔｙｌ ４０６ａｎｄｓｕｃｃｉｎｙｌ ５１６
を合成させた」（１９９４ａ、Ｔａｎａｍｏｔｏほか；ｂ；１９９５）また、本
発明ために、熟慮する。
【０２３４】 合成ＭＰＬｓは、特に好適なグループの抗原を形成する。たとえば、Ｂｒａｄ
ｅその他（１９９３）は、反Ｌｉｐｉｄ Ａ ＭＡｂｓに縛る脂質Ａのｂｉｓｐ
ｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄされたグルコサミン二糖類バックボーンを含んで、
ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅな人造物を記載した。これは、特定の本発明の態
様に用いられる１人の候補である。
【０２３５】 米国特許番号４、９８７、２３７に記載されているＭＰＬ派生物は、特に本発
明ために、熟慮される。米国特許番号４、９８７、２３７は、エステル・グルー
プによるｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質Ａ核の主要な水酸基に取り付けられ
るサイドチェーン上の一つ以上の自由なグループ（例えばアミン）を含むＭＰＬ
派生物を記載する。
【０２３６】 派生物は、さまざまな生物学上活性材料に継手のための便利な方法に結合エー
ジェントによる脂質Ａを提供する。脂質Ａの免疫刺激物な特性は、維持される。
米国特許番号４、９８７、２３７に従う全てのＭＰＬ派生物は、本発明のＭＰＬ
助手−統合された細胞ために、想像される。
【０２３７】 さまざまな助手（人間において、共通して使わないものさえ）は動物において
、まだ使用されることができる。ここで、たとえば、１は抗体を上げるかまたは
その後活性化されたＴ細胞を得るのを望む。毒性または助手か細胞から生じるこ
とができる他の副作用例えば、非照射を受けた腫瘍細胞を使用して起こることが
できるように、この種の状況において、無関係である。
【０２３８】 本願明細書において、提供されるワクチンの範囲内で、助手組成物は、好まし
くはＴｈｌタイプの中で主に免疫反応を誘発するように設計されている。Ｔｈｌ
−タイプ・サイトカインの高いレベル（例えば、ＩＦＮ−ｙ、ＴＮＦａ、ＩＬ−
２、そして、ＩＬ−１２）管理された抗原に細胞媒介の免疫反応の誘導を支持す
ることを傾向がある。対照的に、高さはＴｈ２−タイプ・サイトカインの中で水
平になる（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、そして、ＩＬ−１０）体液
の免疫反応の誘導を支持することを傾向がある。
【０２３９】 本願明細書において、提供されるように、ワクチンのアプリケーションに従っ
て、患者はＴｈｌ−およびＴｈ２−タイプ反応を含む免疫反応を支持する。 好適な実施例（。そこにおいて、反応は主にＴｈｌ−タイプである）の範囲内で
、Ｔｈｌ−タイプ・サイトカインのレベルは、Ｔｈ２−タイプ・サイトカインの
レベルより大きい範囲まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準の
分析評価を使用して、直ちに査定されることができる。ｅは、サイトカインの一
系統の再考のために見える。ｇ．、Ｍｏｓｍａｎｎ、そして、Ｃｏｆｆｍａｎ（
１９８９）。
【０２４０】 たとえば、主にＴｈｌ−タイプ反応を誘発するのに用いられる好適な助手は、
アルミニウム塩とｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質Ａ、好ましくは３ｄｅ Ｏ
−アシル化されたｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質Ａ、３Ｄ−ＭＰＬの組合せ
を含む。ＭＰＬ助手は、Ｃｏｒｉｘａ社から入手可能である（シアトル（ＷＡ）
； ｅを示す。ｇ．、米国Ｐａｔｅｎｔ数字４、４３６、７２７；４， ８７７，
６１１ ；４、８６６、０３４、そして、４、９１２（０９４）、それぞれは具
体的には、完全に本願明細書に引用したものとする）。ＣｐＧを含有するオリゴ
ヌクレオチド（。そこにおいて、ＣｐＧジヌクレオチドは、ｕｎｍｅｔｈｙｌａ
ｔｅｄされる）も、誘導する主に、Ｔｈｌ反応。この種のオリゴヌクレオチドは
、周知で、たとえば、中で記載されている国際。特許出願Ｐｕｂｌ．第ＷＯ ９
６／０２５５５、そして、国際。特許出願Ｐｕｂｌ． 第ＷＯ ９９／３３４８８。たとえば、Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ
ＤＮＡ配列は、また、サトウその他（１９９６）により記載されている。好適
な他の助手はサポニン（好ましくはＱＳ２１（アクィラＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ社、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）である。そして、それが他の
助手と協力してか単独で使うことができる。強化されたシステムがｍｏｎｏｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｙｌ脂質Ａおよび派生的なサポニンの組合せ、例えばＱＳ２１の組
合せおよび３Ｄ ＭＰＬを含んで、たとえば（ｅを示す。ｇ．、国際。特許出願
Ｐｕｂｌ．第ＷＯ ９４／００１５３）、または、ＱＳ２１がコレステロールに
よって、いやされるよりｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃでない組成物（ｅを示す。ｇ．
、国際。特許出願Ｐｕｂｌ．。
【０２４１】 ＷＯ ９６／３３７３９）。他の好適な処方物は、ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒエ
マルジョンおよびトコフェロールから成る。ＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコ
フェロールをｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒエマルジョンに関係させている特に有力
な助手処方物は、また、記載されていた（例えば、国際特許出願公報ＷＯ ９５
／１７２１０）。
【０２４２】 他の好適な助手は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（Ｓｅｐｐｉｃな）
、ＳＡＦ（ケイロン）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（ケイロン）、助
手のＳＢＡＳ連続を含む（例えば、スミスクライン・ビーチャム、Ｒｉｘｅｎｓ
ａｒｔ、ベルギーから入手可能な（ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４）、Ｄｅｔ
ｏｘ、Ｃｏｒｉｘａ社ＲＣ５２９（Ｃｏｒｉｘａ社）およびａｍｉｎｏａｌｋｙ
ｌ ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ ４−リン酸塩（ＡＧＰ）。
【０２４３】 本願明細書において、提供されるいかなるワクチンも、一つ以上の抗原の組合
せ、一つ以上の免疫刺激物または助手て一つ以上適切なキャリア（賦形剤）に結
果としてなる周知の方法を使用して調合されることができるかまたは薬学的に受
け入れられるバッファ。本願明細書において、記載されている組成物は、支えら
れたリリース処方物（すなわち、カプセルのような処方物、スポンジまたは複以
下の管理の遅い発表を遂行するゲル［たとえば、多糖類から成って］）の一部と
して管理されることができる。この種の処方物は、周知の技術、峡谷ほか、１９
９６を使用して、一般に準備されることができて、たとえば、口であるか、直腸
であるか皮下の移植によって、または所望の目標サイトでの移植によって、管理
者の仕事を行った。持続性処方物はペプチドを含むことができる。そして、ポリ
ヌクレオチドまたは抗体がキャリア・マトリックスで分散しておよび／または率
−制御膜によって、囲まれる貯蔵器の範囲内で含まれる。
【０２４４】 この種の処方物の範囲内の使用のためのキャリアは、好ましくは生物学的適合
性で、また、生物分解可能でもよい；好ましくは、処方物は能動部分リリースの
比較的安定したレベルを提供する。この種のキャリアは、ｐｏｌｙａｃｒｙｌａ
ｔｅ、ラテックス、澱粉、セルロースおよびデキストランと同様にボリエステル
繊維（ラクチド−共同ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）のｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓを
含む。他の遅延リリース・キャリアは、ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏ
ｖｅｃｔｏｒｓを含む。そして、それは非流動親水性核から成る（例えば、クロ
スにリンクされた多糖類またはオリゴ糖類）、そして、任意に、外部は両親媒性
の合成物から成る階層化しているリン脂質に例えば（米国特許番号５、１５１、
２５４；国際特許出願公報ＷＯ ９４／２００７８；国際特許出願公報ＷＯ／９
４／２３７０１；そして、国際。特許出願公報第ＷＯ ９６／０６６３８）。支
えられたリリース処方物の範囲内で含まれる活性合成物の量は、移植（率および
リリースの期待される継続および扱われるかまたは防がれる状態の性質）のサイ
トに依存する。
【０２４５】 様々な交付ビヒクルのいずれでも、腫瘍細胞を目標とする抗原に特有の免疫反
応の製造を容易にするために製薬組成物およびワクチンの範囲内で使用されるこ
とができる。交付ビヒクルは、抗原−示している細胞（ＡＰＣ）（例えば樹状突
起の細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球および効果的なＡＰＣであるために設
計されることができる他の細胞）を含む。この種の細胞はが、起動および／また
はＴ細胞反応のメンテナンスを改善して、本質的に抗腫瘍の効果を有しておよび
／またはｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙにレシーバ、すなわち、マッチされた
ＨＬＡ ｈａｐｌｏｔｙｐｅと互換性を持つために、抗原を示すことの能力を増
加するために、遺伝子が組み替えられている。ＡＰＣは、一般に様々な生物学的
流体および、腫瘍およびｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌな組織を含んで、器官のいずれ
からでも分離されることができて、自己であるか、異系であるか、同系であるか
ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃな細胞であってもよい。
【０２４６】 本発明の特定の好適な実施例は、細胞を抗原−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇするとし
て樹状突起の細胞またはそれの原種を使用する。樹状突起の細胞は、非常に有力
なＡＰＣ、ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８であって、
予防であるか治療的な抗腫瘍の免疫、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎおよびレビー、１９９
９を誘発するための生理的助手として効果的なことを示した。一般に、樹状突起
の細胞は、素朴なＴ細胞反応を活性化するためにそれらの典型的形（原位置に、
ｖｉｔｒｏにおいて、見える著しい細胞質の方法（樹枝状結晶）については、星
形の）、巻き取るそれらの能力、方法および高効率およびそれらの能力を有する
現在の抗原を主成分として識別されることができる。生体内に樹状突起の細胞に
共通に分からない明確な特定の細胞−表層受容器またはリガンドに樹状突起の細
胞は、もちろん、設計されることができる、または、前の活発な、そして、この
種の修正された樹状突起の細胞は本発明により熟慮される。樹状突起の細胞に代
わるものとして、分泌された小嚢抗原−ロードした樹状突起の細胞（ｅｘｏｓｏ
ｍｅｓと呼ばれて）が、ワクチン、Ｚｉｔｖｏｇｅｌほか、１９９８の範囲内で
使うことができる。
【０２４７】 樹状突起の細胞および原種は、周辺の血液、骨髄、腫瘍−浸透している細胞、
周辺腫瘍状石灰化組織−浸透している細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血また
は他のいかなる適切な組織からも得られることが可能であるかまたは流動的であ
る。たとえば、樹状突起の細胞を、差別化できる前の活発なサイトカイン（例え
ばＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／または周辺の血液から収穫され
る単球の培養に対するＴＮＦａ）の組合せを加えることによって。あるいは、陽
細胞が周辺の血液、臍帯血または骨髄から収穫したＣＤ３４は、ＧＭ−ＣＳＦ、
ＩＬ−３、ＴＮＦａ、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／ま
たは分化、成熟および樹状突起の細胞の増殖を誘発する他の合成物の培養媒体組
合せを増すことによって、樹状突起の細胞に差別化されることができる。
【０２４８】 樹状突起の細胞は便利に分類された未成熟細胞および成熟細胞である。そして
、それによって、単純な方法が２つのかなり特徴づけられた発現型を区別できる
。しかし、この命名法は、分化の全ての可能な中間舞台を除外するために解釈さ
れてはならない。未熟な樹状突起の細胞は抗原理解および処理の高い能力を有す
るＡＰＣとして描写される。そして、それはＦｃｙ受容器およびマンノース受容
器の高い現れと相関する。成熟した発現型は、これらの目印、しかし、クラスの
ようなＴ細胞起動に対して責任がある細胞表層分子の高い発現の下部の現れによ
って、概して特徴づけられるＩ、そして、クラスＩＩ ＭＨＣ、粘着力分子（例
えば、ＣＤ５４、そして、ＣＤ１１）、そして、ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ分
子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、そして、４−１ＢＢ）。
【０２４９】 ＡＰＣはＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチドによって、一般
にトランスフェクションすることができる。そうすると、ペプチドまたは免疫原
性部分はそれについて細胞表層に表される。
【０２５０】 この種のトランスフェクションは起こることができる前の活発な、そして、本
願明細書において、記載されているように、この種のトランスフェクションする
細胞から成る組成物またはワクチンがそれから治療的な目的のために使うことが
できる。あるいは、樹状突起であるか他の抗原−示している細胞を目標とする遺
伝子交付ビヒクルは患者に与えられることが可能である。そして、生体内に起こ
るトランスフェクションに結果としてなる。中で記載されているそれらが、樹状
突起の細胞の活発で前の活発なトランスフェクションにおいて、たとえば、従来
技術において、公知のいかなる方法も使用することを実行されて、一般にあって
もよいＭａｈｖｉその他（１９９７）により記載されている国際特許出願公報Ｗ
Ｏ ９７／２４４４７または遺伝子銃方法。樹状突起の細胞の抗原積載は、ＷＴ
１ペプチドを有する樹状突起の細胞または原種細胞を培養することによって、成
し遂げられることが可能であるＤＮＡ（裸の、または、プラスミド・ベクトルの
範囲内で）またはＲＮＡ；または、抗原−表している再結合物バクテリアまたは
ウイルスを有する（例えば、牛痘、ｆｏｗｌｐｏｘ、アデノウイルスまたはｌｅ
ｎｔｉｖｉｒｕｓベクトル）。載せる前に、Ｔ細胞援助を提供する免疫学のパー
トナーにペプチドが共有結合して活用されることができること（例えば、（キャ
リア分子）。あるいは、それとは別にあるいは、ペプチドがある場合には、樹状
突起の細胞は、非活用された免疫学のパートナーと律動的に送られることが可能
である。
【０２５１】 結合された治療学はまた、熟慮される。そして、下にある製薬組成物の同じタ
イプは一つで結合された薬剤のために使用されることができる。
【０２５２】 ワクチンおよび製薬組成物は、装置−服用か複数の服用コンテナ（例えば密封
されたアンプルまたは小びん）において、示されることができる。この種のコン
テナは、使用まで処方物の不毛を保存するために好ましくは密封して封止される
。一般に、処方物はサスペンション、溶液または油性であるか水のビヒクルのエ
マルジョンとして格納されることができる。あるいは、ワクチンであるか製薬組
成物は、使用の前に直ちに不毛な流動運送業者に加算だけを要求している冷凍乾
燥させた状態に格納されることができる。
【０２５３】 （４．８ 悪性疾患の治療のための方法） 本発明の更なる態様、組成物および本願明細書において、記載されているワク
チンの悪性の病気の療法のための８つの方法は、悪性の病気の発達を禁止するた
めに用いてもよい（例えば、進歩的であるか転移の病気または最小の残された病
気のような小さい腫瘍重荷によって、特徴づけられる病気）。一般に、この種の
方法は、ＷＴ１発現と関連する病気を防ぐか、遅延させるかまたは治療するため
に用いてもよい。換言すれば、本願明細書において、提供される治療的な方法は
、既存のＷＴ１提携の病気を治療するために用いてもよいかまたは病気から自由
である、または、ＷＴ１発現とまだ関連しない病気に悩む患者のこの種の病気の
開始を防ぐかまたは遅延させるために用いてもよい。
【０２５４】 ここで使用しているように、ＷＴ１発現を有する病気は、細胞を病気にかから
せた（例えば、（腫瘍細胞）いくつかで病気のコースの間の時間が同じ組織の通
常の細胞より高いＷＴ１ペプチドの検出可能なレベルを生成すること。悪性の病
気を有するＷＴ１発現連合は、ＷＴ１が腫瘍に存在することを必要としない。た
とえば、ＷＴ１の過剰発現は腫瘍の開始と関係していることができる、しかし、
タンパク質発現はその後消失できる。あるいは、増加するＷＴ１発現によって、
特徴づけられる病気に、ＷＴ１発現の増加によって、特徴づけられない悪性の病
気は、最近の時間に、進行できる。したがって、いかなる悪意を抱く人も、病気
にかかった細胞が前はいずれを表したかについて、病気にかからせる現在明白な
、または、その後ＷＴ１の増加するレベルを表す思われるＷＴ１発現を有するｂ
ｅａｓｓｏｃｉａｔｅｄに考慮する。特定の実施態様の範囲内で、本願明細書に
おいて、提供される療法が危険を苦しめられるかまたは考慮される患者に与えら
れること、悪性の中皮腫。
【０２５５】 免疫治療は様々な技術のいずれでも使用して実行されることができる。そこに
おいて、本願明細書において、提供される合成物または細胞は患者からＷＴ１−
表している細胞を除去するように機能する。
【０２５６】 この種の除去は、ＷＴ１のための忍耐強い特性またはＷＴ１を表している細胞
の免疫反応を強化するかまたは誘発することの結果として、起こることができる
。 あるいは、ＷＴｌ−表している細胞を、除去できる前の活発な（ｅ。自己の骨髄
、周辺の血液または骨髄または周辺の血液の断片の処理によって、ｇ．）。骨髄
または周辺の血液の分数は、従来技術において、いかなる標準の技術も使用して
得られることが可能である。
【０２５７】 この種の方法の範囲内で、製薬組成物およびワクチンは、患者に与えられるこ
とが可能である。ここで使用しているように、いかなる温血の動物（好ましくは
人間）にも対するａｐａｔｉｅｎｔｒｅｆｅｒｓ。患者は、悪性の病気に悩むこ
とができるかまたは悩むことができない。したがって、上記の製薬組成物および
ワクチンは、病気（予防して、すなわち）の開始を防ぐかまたは病気で苦しめら
れる患者を扱うために用いてもよい（ｅ。既存の病気の進行および／または転移
を防ぐかまたは遅延させるために、ｇ．）。病気で苦しめられる患者は、最小の
残された病気にかかっていることができる（例えば、（手術放射線療法および／
または化学療法の後、腫瘍重荷の減少に続いている完全であるか部分的な鎮静ま
たはガン患者の白血病患者の低い腫瘍重荷）。この種の患者は、後戻り（すなわ
ちは、防ぐかまたは後戻りを遅延させるかまたは後戻りの厳しさを減少させる）
を禁止するために免疫にされることができる。
【０２５８】 特定の好適な実施例の範囲内で、患者は悪性の中皮腫に悩む。他のＷＴ１提携
の状況は、白血病を含む（例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、すべてのものまたは幼年期
ＡＬＬ）脊髄形成異常な症候群（ＭＤＳ）、そして、ガン（例えば、（胃腸内の
）肺、甲状腺の胸ガンまたは黒色腫）ガンまたは白血病がＷＴ１肯定（すなわち
は、ｄｅｔｅｃｔａｂｌｙに反対のＷＴＩ抗体（本願明細書において、記載され
ているように、そのことは本願明細書において、備えるかまたはＲＴ−ＰＣＲＴ
Ｍによって、検出可能なレベルでＷＴ１ ｍＲＮＡを表す）とともに化学反応す
る）（ＷＴｌ−表している細胞に向けられるａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ病と同様に）
である所で。
【０２５９】 サトウその他（２０００）にて説明したように、ＷＴ１過剰発現と関連する他
の病気は、腎臓ガン（例えば腎臓の細胞癌またはＷｉｌｍｓ腫瘍）を含む、そし
て、キャンベルその他（１９９８）；そして、Ａｍｉｎその他にて説明したよう
に、中皮腫（１９９５）。ハラダほか（１９９９）は、ＷＴ１遺伝子発現を人間
の睾丸の性細胞腫瘍に記載する。Ｎｏｎｏｍｕｒａその他Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ（
１９９９）は、睾丸のガンに特有の遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を使用してい
る睾丸のガンの分子の上演を記載する。清水ほか（２０００）は、上皮卵巣の腫
瘍のウィルムス腫遺伝子（ＷＴ１）の免疫組織化学の探知を記載する。
【０２６０】 ＷＴ１過剰発現は、また、Ｂａｒｏｕｄ、その他によって、癒着性な小さい丸
い細胞腫瘍（２０００）に記載されていた。神経膠芽腫および他のガンのＷＴ１
過剰発現はＭｅｎｓｓｅｎその他により記載されていた。そして、肺ガン、腸ガ
ンおよび神経膠芽腫細胞系の発現が最近匹敵したウィルムス腫遺伝子（ＷＴ１）
は腫瘍標本を分離した（２０００）。バーキットリンパ腫およびｎａｓｏｐｈａ
ｒｙｎｇｅａｌなガン、Ｓｐｉｎｓａｎｔｉほか、２０００（通常で悪性の人間
のＢリンパ球によるウィルムス腫遺伝子発現）のような、過剰発現がＥＢＶを含
むことをＷＴ１に明らかにしている他の病気は病気と関連した。」、パンその他
（２０００）は、白血病または脊髄形成異常な症候群をもつ患者からの周辺の血
液ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ細胞の試験管内のＩＬ−１２の処理を記載して、細胞
毒性およびＷＴ１遺伝子発現の減少の増加を報告した。Ｐａｔｍａｓｉｒｉｗａ
ｔその他（１９９９）は、脊髄形成異常な症候群および急性の白血病のＷＴ１お
よびＧＡＴＡ１発現を報告した。タマキその他（１９９９）は、Ｗｉｌｍｓ腫瘍
遺伝子ＷＴ１が脊髄形成異常な症候群の病気進行の診断のための良い目印である
と報告した。Ｏｊｉその他において、堅実な腫瘍のＷｉｌｍｓ腫瘍遺伝子ＷＴ１
および腫瘍細胞成長とのその関係の現れは、胃ガン、腸ガン、肺ガン、乳ガン細
胞系、性細胞腫瘍細胞系、卵巣のガン、子宮ガン、甲状腺のガン細胞系、ｈｅｐ
ａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ癌に関して議論された。（１９９９）。
【０２６１】 本願明細書において、提供される組成物が、従来の治療的な摂生（例えば手術
、照射、化学療法および／または骨髄移植（自家組織であるか、同系であるか、
異系であるか無関係な）と協力して、か単独で使うことができる。更に詳細に下
で議論されるように、本願明細書において、提供されて、エージェントおよびＴ
細胞を結合することは自己の幹細胞を一掃するために使用されることができる。
たとえば、清まっているそのようなものは、血液またはそれの構成要素の骨髄移
植または輸血の前に有益でもよい。結合するエージェント、Ｔ細胞、抗原−示し
ている細胞（ＡＰＣ）および本願明細書において、提供される組成物が、更にｖ
ｉｔｒｏの自家組織であるか、異系であるか、同系であるか無関係なＷＴ１−特
定の（または雷管取付け）Ｔ細胞を拡張して、刺激するために使われることがで
きておよび／または生体内である。たとえば、この種のＷＴ１に特有のＴ細胞が
、提供者リンパ球注入の範囲内で使うことができる。
【０２６２】 管理（投薬と同様に）のルートおよび周波数は、個人から個人まで変化して、
標準の技術を使用して、直ちに確立されることができる。一般に、製薬組成物お
よびワクチンは注入により投与されることができる（ｅ。筋内であるか、静脈で
あるか皮下のｇ（ｔａｎｅｏｕｓなｉｎｔｒａｃｕ）、鼻腔内に（ｅ。呼吸によ
って、ｇ．）、または、口で。若干の腫瘍において、製薬組成物またはワクチン
は、局所的に投与されることができる（ｒｅｃｔｏｃｏｌｏｓｃｏｐｙ、胃鏡検
査、ｖｉｄｅｏｅｎｄｏｓｃｏｐｙ、血管造影法または他の方法によって、たと
えば、公知技術の）。
【０２６３】 好ましくは、１および１０との間に服用は、５２週期間にわたって管理される
ことができる。好ましくは、１ヵ月の間隔で、６つの服用は管理される。そして
、ブースタ予防接種は周期的にその後で、与えられることが可能である。交互の
プロトコルは、個々の患者に適当でもよい。適切な服用は、上記の通りに管理さ
れるときに、少なくとも基礎の、すなわち、処理されていないレベルより上の１
０−５０％である抗腫瘍の免疫反応を進めることができる合成物の量である。こ
の種の反応は、患者の抗腫瘍の抗体を測ることによって、またはｖｉｔｒｏの患
者の腫瘍細胞を殺すことができる細胞融解効果器細胞のワクチンの依存している
生成によって、モニタされることができる。この種のワクチンは、また、改良さ
れた臨床結果に至る免疫反応が生じることができなければならない（例えば、よ
り頻繁な完全であるか部分的な鎮静またはより長い病気のないおよび／または全
体的な生存）非予防注射をされた患者と比較した予防注射をされた患者の。一般
に一つ以上のペプチドから成る製薬組成物およびワクチンのために、服用に存在
する各々のペプチドの量は、約１００ｌｌｇから５ｍｇまで変動する。適切な服
用サイズは、患者の大きさによって、変化するが、約０から概して変動する。約
５ｍＬに対する１ｍＬ。
【０２６４】 一般に、適当な投薬および処理摂生は、治療的なおよび／または予防の利点を
提供するのに十分な量の活性合成物を提供する。
【０２６５】 この種の反応は、改良された臨床結果を確立することによって、モニタされる
ことができる（例えば、より頻繁な完全であるか部分的な鎮静またはより長い病
気のないおよび／または全体的な生存）非扱われた患者と比較した扱われた患者
の。一般にＷＴ１に免疫反応より先に存在することの増加は、利用された臨床結
果と相関する。この種の免疫反応は標準の増殖、細胞毒性またはサイトカイン分
析評価を使用して、一般に評価されることができる。そして、それは処理の前後
で患者から得られるサンプルを使用して実行されることができる。
【０２６６】 更なる態様の範囲内で、ＷＴ１発現と関連する悪性の病気の発達を禁止する方
法は、上記の通りに、ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１−表しているＡＰＣに応答し
て活性化された自家組織のＴ細胞の管理を含む。
【０２６７】 この種のＴ細胞は、ＣＤ４’および／またはＣＤ８であってもよい』、そして
、上記の通りに増殖できる。Ｔ細胞は、悪性の病気の発達を禁止するのに効果的
な量の個人に与えられることが可能である。一般的に、約１は、細胞／Ｍ’ａｒ
ｅが静脈内に、内腔に管理した１つのｘ １０Ｔにまたは切除された腫瘍の台に
おいて、１０９に×印を付ける。細胞の数および管理の周波数が患者の反応次第
であることは、当業者に明らかである。
【０２６８】 特定の実施態様の範囲内で、Ｔ細胞は自家組織の骨髄移植の前に刺激されるこ
とができる。この種の刺激は、活発にまたは試験管内で場所を取り入れることが
できる。試験管内の刺激、骨髄および／または周辺機器のために患者から得られ
る血液（または骨髄または周辺の血液の一部分）は、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペ
プチドをコード化しているポリヌクレオチドおよび／または状況の下でＷＴ１ペ
プチドを表すＡＰＣにより連絡されることができて、しばらく、上記の通りにＴ
細胞の刺激を許可するのに十分である。骨髄、周辺の血液幹細胞および／または
ＷＴ１に特有のＴ細胞は、それから標準の技術を使用している患者に与えられる
ことが可能である。
【０２６９】 関連した実施態様の範囲内で、関連したか無関係な提供者のＴ細胞は、同系で
あるか異系な（関するか無関係な）骨髄移植の前に刺激されることができる。
【０２７０】 この種の刺激は、活発にまたは試験管内で場所を取り入れることができる。試
験管内の刺激のために、骨髄および／または関連したか無関係な提供者から得ら
れた周辺の血液（または骨髄または周辺の血液の一部分）は、ＷＴ１ペプチド、
ＷＴ１ポリヌクレオチドおよび／または状況の下でＷＴ１ペプチドを表すＡＰＣ
により連絡されることができて、しばらく、上記の通りにＴ細胞の刺激を許可す
るのに十分である。骨髄、周辺の血液幹細胞および／またはＷＴ１に特有のＴ細
胞は、それから標準の技術を使用している患者に与えられることが可能である。
【０２７１】 他の実施態様の範囲内でＷＴ１に特有のＴ細胞本願明細書において、記載する
自己の骨髄、周辺の血液または骨髄または周辺の血液の一部分からＷＴ１を表し
ている細胞を除去するために用いあることができる（例えば、患者の管理より前
のＣＤ３４＋豊かにされた周辺の血液、ＰＢ）。この種の方法は、状況の下でこ
の種のＴ細胞を有する骨髄またはＰＢに連絡することにより実行されることがで
きて、しばらく、骨髄または周辺の血液のｍｙｅｌｏｉｄまたはリンパ管細胞の
総数の中で、１０％未満、好ましくは５％未満および好ましくは、１％未満まで
ＷＴ１−表している細胞の減少を許可するのに十分である。この種の細胞が除去
された範囲は、標準の方法（例えば質的で量的ＰＣＲＴＭ分析、形態学、免疫組
織化学およびＦＡＣＳ分析）によって、直ちに決定されることができる。骨髄ま
たはＰＢ（またはそれの一部分）は、それから標準の技術を使用している患者に
与えられることが可能である。
【０２７２】 （４．９ ＷＴ１−特異的疾患の診断法および予後） 本発明が更にＷＴ１発現と関連する悪性の病気を検出するための、そして、免
疫の効果またはこの種の病気の治療をモニタするための方法に提供する。ＷＴ１
タンパク質に固有な免疫反応が悪性の中皮腫を含むこの種の病気で苦しめられる
患者に認められることが可能である本発明の範囲内で、この種の方法は開示手続
に基づく、そして、この種の免疫反応を強化するその方法は防止的であるか治療
的な利点を提供できる。本願明細書において、提供される診断上の方法は、これ
らの病気の早期発見を提供することができて、危険にさらされたとみなされる患
者の高いスループット・スクリーニングを許可できる。たとえば、この種の患者
はアスベスト露出の中で疑われる個人を含む。そして、それは悪性の中皮腫の発
達のために危険にさらされていてもよい。
【０２７３】 ＷＴ１発現と関連する悪性の病気の有無を決定するために、患者はＷＴ１に固
有なＴ細胞のレベルを見つけるため検査されることができる。特定の方法の範囲
内で、患者から分離されるＣＤ４’ａｎｄ／ｏｒ ＣＤ８’Ｔ細胞から成る生物
学的サンプルはＷＴ１ペプチド（ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレ
オチドおよび／またはＷＴ１ペプチドを表すＡＰＣ）により培養される。そして
、本願明細書において、記載されているように、Ｔ細胞の特定の起動の有無は検
出される。適切な生物学的サンプルは、単離されたＴ細胞を含むが、これに限定
されるものではない。たとえば、Ｔ細胞はルーチン技術（例えば周辺の血液リン
パ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって、）によって、
患者から分離されることができる。
【０２７４】 Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチドを有する３７のＣで２−９つの日（概して４日）の
間のｖｉｔｒｏにおいて、培養されることができる（例えば、（５−２５のｌｌ
ｇ／ｍｌ）。制御として役立つためにＷＴ１ペプチドがない場合、Ｔ細胞サンプ
ルの他の約数を培養することは、望ましくてもよい。ＣＤ４＋ Ｔ細胞のために
、起動はＴ細胞の増殖を評価することによって、好ましくは検出される。ＣＤ８
＋ Ｔ細胞のために、起動は細胞融解活動を評価することによって、好ましくは
検出される。少なくとも２倍より大きい増殖および／または１レベルの少なくと
も２０％、病気のない患者の大きい細胞融解活動のレベルは、ＷＴ１発現と関連
する悪性の病気の存在を示す。
【０２７５】 更なる相互関係は作られることが可能である。そして、方法を、増殖および／
または細胞融解活動のレベルおよび療法への予測された反応との間に、公知技術
に扱う。事項（より高い抗体を表示する患者）において、増殖的なおよび／また
は溶解な反応は、療法へのより大きい反応を示すと思われることができる。
【０２７６】 他の方法の範囲内で、患者から得られる生物学的サンプルは、ＷＴ１に固有な
抗体のレベルを見つけるため検査される。生物学的サンプルは、ＷＴ１ペプチド
、ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチドおよび／または状況の下
でＷＴ１ペプチドを表すＡＰＣにより培養されて、しばらく、形成する免疫複合
体を許すのに十分である。ＷＴ１ペプチドの間で形成される免疫複合体および具
体的には、ＷＴｌペプチドに縛る生物学的サンプルの抗体は、それから検出され
る。この種の方法の範囲内の使用のための生物学的サンプルは、抗体を含むと思
われる患者から得られるいかなるサンプルでもあってもよい。
【０２７７】 適切な生物学的サンプルは、血液、血清、腹水、骨髄、肋膜の流出および脳脊
髄液を含む。
【０２７８】 生物学的サンプルは、条件の反応混合のＷＴ１ペプチドにより培養されて、し
ばらく、ペプチド間の形式およびＷＴ１に固有な抗体に免疫複合体を許可するの
に十分である。たとえば、生物学的サンプルおよびＷＴ１ペプチドは、２４−４
８の時間の間の４Ｃで培養されることができる。
【０２７９】 インキュベーションに続いて、反応混合は、免疫複合体の存在用に試験される
。ＷＴ１ペプチドの間で形成される免疫複合体の発見および生物学的サンプルに
存在する抗体は、様々な周知の技術（例えば標識免疫検定法、ＲＩＡ）および酵
素連結された免疫吸着剤分析評価、ＥＬＩＳＡによって、完成していてもよい。
適切な分析評価は、公知技術で、十二分に科学的で特許文学、ハーローおよびＬ
ａｎｅ、１９８８に記載されている。使うことができる分析評価は、二重のモノ
クロナール抗体サンドイッチ免疫測定技術（米国特許番号４、３７６、１１０）
を含むが、これに限定されるものではない；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ｐｏｌｙｃ
ｌｏｎａｌな抗体サンドイッチ分析評価、広いほか、１９７０；「西のｂｌｏｔ
ｍｅｔｈｏｄ（米国特許番号４、４５２、９０１）；ラベルをつけられたリガン
ド、茶色のほか、１９８０の免疫沈降；酵素にリンクされた免疫吸着剤分析評価
、レインズおよびロス、１９８２；蛍光色素、ブルックスほか、１９８０の使用
を含むｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌな技術；そして、活動、ボーエン
−法王ほか、１９８４の中立化。他の免疫測定は、米国Ｐａｔｅｎｔ数字３、８
１７、８２７に記載されているそれらを含むが、これに限定されるものではない
；３， ８５０， ７５２ ；３， ９０１， ６５４ ；３， ９３５， ０
７４ ；３， ９８４， ５３３ ；３， ９９６，３４５ ；４， ０３４，
０７４ ；そして、４、０９８、８７６。
【０２８０】 発見目的のための、ペプチドがそうすることができるＷＴ１もラベルをつけら
れるかまたはラベルのない。
【０２８１】 ラベルのないＷＴ１ペプチドが、接着分析評価において、または免疫複合体に
縛るラベルをつけられた発見試薬と協力して使うことができる（例えば、（抗免
疫グロブリン）タンパク質Ｇ、プロテインＡまたはレクチン、そして、第２の抗
体または抗原−結合それの、具体的には、ＷＴ１ペプチドに縛る抗体に縛ること
ができる断片）。ＷＴ１ペプチドがラベルをつけられる場合、リポータ・グルー
プは公知技術のいかなる適切なリポータ・グループでもあってもよい。そして、
放射性同位元素、蛍光性のグループ、発光のグループ、酵素、ビオチンおよび染
料分子を含む。
【０２８２】 特定の分析評価の範囲内で、ラベルのないＷＴ１ペプチドは、強力なサポート
に固定される。固体の支持体は、ペプチドが取り付けられることが可能である技
術の通常の技術のそれらにとって公知のいかなる材料でもあってもよい。たとえ
ば、固体の支持体は、よくマイクロータイタープレートまたはニトロセルロース
の試験または他の適切な膜であってもよい。あるいは、サポートはビーズまたは
ディスク（例えばガラス、ファイバーグラス、ラテックスまたはプラスチック材
料（例えばポリスチレンまたはｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）であって
もよい。支持体は、また、磁気分子または、たとえば、米国特許番号５、３５９
、６８１において、開示されるそれらのような、ファイバー・オプティックスの
センサであってもよい。ペプチドは従来技術において、技術のそれらにとって公
知の様々な技術を使用している強力なサポートに固定されることができる。そし
て、それは十二分に特許および科学的な文学に記載されている。本発明、両方の
ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔな関連に対するｔｅｒｍｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
ｒｅｆｅｒｓ、例えば吸着および共有結合付着のコンテキストの（抗原間の直接
の結合であってもよい、そして。汎関数が、サポートに集まるかまたはクロス連
結しているエージェントを経由してリンクであってもよい）。
【０２８３】 マイクロータイタープレートのまたは膜に対するウェルに対する吸着による固
定することは、好まれる。そのような場合、吸着は、時間の適切な量の強力なサ
ポートについては、適切なバッファにおいて、ＷＴ１ペプチドに連絡することに
より達成されることができる。接触時間は、温度によって、変化するが、概して
約１時間および約１日の間にある。一般に約１０の水差しに、そして、好ましく
は約１つのｕに対する１００ｎｇについて約１０ｎｇから変動しているペプチド
の量を有するプラスチックマイクロータイタープレート（例えばポリスチレンま
たはｐｏｌｙｖｉｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）の源に連絡する。ｇは、ペプチドの
適切な量を固定するのに十分である。
【０２８４】 固定することに続いて、サポート上の残留するタンパク質結合サイトは、概し
て抑止される。技術（例えばウシ血清アルブミン、Ｔｗｅｅｎ ２０ＴＭ（シグ
マＣｈｅｍｉｃａｌ社、セントルイス、ＭＯ）の通常の技術のそれらにとって公
知のいかなる適切なブロッキング・エージェントも通常のヤギ血清（ＮＧＳ）を
熱不活化した、または、ＢＬＯＴＴＯ（また、防腐剤、塩および消泡剤を含む脂
肪を含まない粉ミルクの溶液を緩衝した）が使うことができる。サポートは、そ
れから特定の抗体を含むことで疑われる生物学的サンプルにより培養される。
【０２８５】 きちんとしたサンプルを、適用できる、または、よりしばしば、抗体間の平衡
で達成されるそれの約９５％である結合を成し遂げるのが薄められることが可能
である通常少ない量を含む緩衝された溶液の（０．１％−５．０重量部）タンパ
ク質（例えばＢＳＡ、ＮＧＳまたはＢＬＯＴＴＯ．）の一般に、適当な接触時間
、すなわち、インキュベーション時間は、具体的には、この種の抗体を含んでい
るサンプルの範囲内で、ＷＴ１を結合する抗体の存在を検出するのに十分である
期間である。好ましくは、接触時間は、１レベルの少なくとも縛られて解放され
ることが、で十分ある。通常の技術のそれらは、平衡を成し遂げるのに必要な時
間が期間にわたって起こる結合のレベルを分析することによって、直ちに決定さ
れることができると従来技術において、認識する。室温で、約３０分のインキュ
ベーション時間は、一般に充分である。
【０２８６】 解放されたサンプルは、それから適当なバッファ（例えば０を含んでいるＰＢ
Ｓ）を有する強力なサポートを洗うことにより除去されることができる。１％の
Ｔｗｅｅｎ ２０。免疫複合体に縛る。そして、リポータ・グループから成る発
見試薬は、それから加えられることが可能である。発見試薬は、縛られた抗体を
検出するのに十分な時間の量のためのｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｌｅｘにより培養さ
れる。時間の適当な量は、期間にわたって起こる結合のレベルを分析することに
よって、一般に決定されることができる。解放された発見試薬はそれから除去さ
れる。そして、縛られた発見試薬はリポータ・グループを使用して検出される。
リポータ・グループを検出するために使用される方法は、リポータ・グループの
性質に依存する。放射性のグループのために、計数している火花またはａｕｔｏ
ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃな方法は、一般に適当である。分光器の方法は、染料
、発光のグループおよび蛍光性のグループを検出するために用いてもよい。ビオ
チンはアビディンを使用して検出されることができる。そして、異なるリポータ
・グループ（共通に放射性であるか蛍光性のグループまたは酵素）に連結する。
酵素リポータ・グループ（例えば、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ、ベータ
−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、そして、ブドウ糖オキシダーゼ
）基板（一般に特定の期間の間の）（反応製品の分光器であるか他の分析が続く
）の追加によって、一般に検出できる。使用される特定の方法に関係なく、１レ
ベルの背景（すなわち、レベルが病気のない個人から得られる生物学的サンプル
のために、観察した）が悪性の病気の存在を示すより、少なくとも２倍大きい縛
られた発見試薬は、ＷＴ１発現と関連した。
【０２８７】 一般に、免疫または療法の効果をモニタする方法は、監視変化を抗体のレベル
または患者のＷＴ１に固有なＴ細胞に関係させる。抗体レベルがモニタされる方
法は、ステップを含むことができる：第１の生物学的サンプル（インキュベーシ
ョンが状況の下で実行されて、しばらく、形成する免疫複合体を許すのに十分で
あるＷＴ１ペプチドについては、療法または免疫の前に患者から得られる）を培
養している（ａ）；ＷＴ１ペプチドの間で形成される検出（ｂ）免疫複合体およ
び生物学的サンプルの抗体は、ＷＴ１ペプチドに非常に特に縛る；ステップ（ａ
）を繰り返していて、忍耐強い以下の療法または免疫からとられる第２の生物学
的サンプルを使用している（ｂ）（ｃ）；そして、免疫複合体の数を比較するこ
とは、第１および第２の生物学的サンプルにおいて、検出した。（ｄ）あるいは
、ＷＴ１ペプチドをコード化しているポリヌクレオチドまたはＷＴ１ペプチドを
表しているＡＰＣは、ＷＴ１ペプチドの代わりに使用されることができる。 この種の方法の範囲内で、ポリヌクレオチドによって、コード化されるかまたは
生物学的サンプルのＡＰＣおよび抗体により表されるＷＴ１ペプチド間の免疫複
合体は、検出される。
【０２８８】 Ｔ細胞起動および／またはＷＴ１特定の先駆者の数がモニタされる方法は、ス
テップを含むことができる：ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋細胞から成る第１
の生物学的サンプルを培養している（ａ）（ｅ。ｇ、骨髄、周辺の血液またはそ
れの一部分、療法または免疫の前に患者から得られて）、ＷＴ１ペプチドについ
ては、そこにおいて、インキュベーションは状況の下で実行されて、しばらく、
特定の起動、増殖および／またはＴ細胞の渙散を許すのに十分である；（ｂ）検
出起動、増殖および／またはＴ細胞の渙散の量；ステップ（ａ）を繰り返してい
て、生物学的な第二を使用している（ｂ）（ｃ）は、ＣＤ４’ａｎｄ／ｏｒ Ｃ
Ｄ８’Ｔ細胞から成るサンプルをとる。そして、療法に従っている同じ患者また
は免疫からする；そして、（ｄ）比較起動、増殖および／または第１および第２
の生物学的サンプルのＴ細胞の渙散の量。あるいは、ＷＴ１ペプチドをコード化
しているポリヌクレオチドまたはＷＴ１ペプチドを表しているＡＰＣは、ＷＴ１
ペプチドの代わりに使用されることができる。
【０２８９】 この種の方法の範囲内の使用のための生物学的サンプルは、抗体、ＣＤ４＋
Ｔ細胞および／またはＣＤ８ Ｔ細胞を含むと思われる患者から得られるいかな
るサンプルでもあってもよい。 適切な生物学的サンプルは、血液、血清、腹水、骨髄、肋膜の流出および脳脊髄
液を含む。第１の生物学的サンプルは、療法の開始または療法または予防接種制
度による免疫または一部方法の前に得られることが可能である。以下の追加の療
法または免疫以外の、第２の生物学的サンプルは、一度に類似した方法で得られ
なければならない。生物学的サンプルが完成で得られることが可能である第二ま
たは終わった一部方法（療法または免疫）は、少なくとも、一部の療法または免
疫が第１および第２の生物学的サンプルの隔離の間で起こると定めた。
【０２９０】 両方のサンプルのためのインキュベーションおよび発見ステップは、上記の通
りに一般に実行されることができる。第１のサンプルと関連する第２のサンプル
のｉｍｍｕ ｍｏｃｏｍｐｌｅｘｅｓの数の統計学的に重大な増加は、成功した
療法または免疫を反映する。
【０２９１】 （４．１０薬学的処方物および組成物の投与） １つの特定の実施態様（細胞または動物の管理の薬学的に受け入れられる解答
において、本願明細書において、開示されるポリヌクレオチド組成物のうちの１
つ以上の本発明懸念処方物）のまたは制癌性の療法の一つ以上の他の様相と協力
した処方物。
【０２９２】 それは、また、理解される、必要に応じて、核酸部分、ＲＮＡまたはＤＮＡ組
成物が、本願明細書において、ｅとしてよく（例えば）他のエージェントと協力
して管理されることができることを明らかにした。ｇ．、タンパク質またはペプ
チド、または、さまざまな薬学的に作動中のエージェント。組成物が本願明細書
において、開示される遺伝子の発現構造物のうちの少なくとも１つから成る限り
、また、含まれることができる他の構成要素、追加のエージェントによって、目
標細胞との接触に重大な副作用が生じない既知の事実またはホスト組織に対する
制限が実質的にない。
【０２９３】 ＲＮＡ−またはＤＮＡ−誘導された組成物は、このように特定の例において、
必要に応じてさまざまな他のエージェントとともに届けられることが可能である
。本願明細書において、記載されているように、この種のＲＮＡまたはＤＮＡ組
成物は宿主細胞または他の生物学的ソースから精製されることができるかまたは
代わりに化学的に合成されることができる。同様に、この種の組成物は、置換さ
れるかｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄされたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物から成ることが
できる。この種の組成物は、一つ以上の治療的な遺伝子構造物（一人の）を含む
ことができるかまたは一つ以上と協力してペプチドか核酸置換分として働く派生
物および／または他の制癌性の治療学を修正した。
【０２９４】 薬学的に受け入れられる賦形剤の処方およびキャリア溶液は、従来技術におい
て、技術のそれらに周知である。そして、そのことは本願明細書において、ｅを
含む様々な処理摂生に記載されている特定の組成物を使用するための適切な一回
分を盛っているおよび処理摂生の開発である。ｇ．（口頭試問）静脈の、鼻腔内
の、経皮な、ｉｎｔｒａｐｒｏｓｔａｔｉｃな、ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌなお
よび／または筋内の管理、そして、処方物。
【０２９５】 （４．１０．１ 注射可能送達） 例えば、本願明細書において、開示される製薬組成物は、米国特許５、５４３
、１５８、米国特許５、６４１、５１５および米国特許５、３９９、３６３（各
々特に本願明細書に引用したものとする完全に）にて説明したように、静脈内に
、筋肉内に、にまたは腹膜内にさえ非経口的に管理されることができる。 フリーベースまたは薬理学的に受け入れられる塩としての活性合成物の溶液は、
界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース）を最適に混ぜ合わせられる
水において、準備されることができる。分散は、また、それについてグリセロー
ル、液体ポリエチレングリコールおよび混合において、そして、油において、準
備されることができる。倉庫および使用の通常の状態の下で、これらの準備は、
微生物の成長を防ぐために防腐剤を含む。
【０２９６】 注射可能な使用に適している製薬形式は、不毛な水溶液または分散を含む、そ
して、不毛な注射可能な溶液または分散（特に本願明細書に引用したものとする
米国特許５、４６６（４６８）完全に）の即座の準備のための不毛な粉。全ての
ケースにおいて、書式は不毛でなければならなくて、簡単なｓｙｒｉｎｇａｂｉ
ｌｉｔｙが存在するというほどに対する体液でなければならない。それは、製造
および倉庫の条件の下で安定していなければならなくて、微生物（例えばバクテ
リアおよび真菌）の動作を汚染することに対して保存されなければならない。
【０２９７】 キャリアは、たとえば、水、エタノール、多価アルコールを含んでいる溶媒ま
たは分散媒体でありえる（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、そし
て、液体のポリエチレングリコール、など）（それの適切な混合）および／また
は植物油。たとえば、適当な流動性は、分散の場合必須の分子サイズのメンテナ
ンスによるコーティング（例えばレシチン）の使用によって、そして、界面活性
剤の使用により維持されることができる。微生物の動作の防止は、さまざまな抗
菌性のａｄ抗真菌薬エージェント（たとえばパラベン、クロロブタノール、フェ
ノール、ソルビン酸、チメロサール、など）によって、もたらされることができ
る。多くの場合、等張のエージェント（たとえば糖または塩化ナトリウム）を含
むことが、好ましい。注射可能な組成物の長くなる吸収は、吸収（たとえばモノ
ステアレート、アルミニウムおよびゼラチン）を遅延させているエージェントの
組成物の使用によって、もたらされることができる。
【０２９８】 水溶液の非経口の管理のために、たとえば、溶液は必要に応じて最適に緩衝さ
れなければならない、そして、流動希釈剤によって、最初に塩水湖またはブドウ
糖が十分によって、等張になった。これらの特定の水溶液は、特に静脈で、筋内
で、皮下で腹膜内の管理に適している。この点について、使用されることができ
る不毛な水のメディアは、現在の開示を考慮して技術の技術のそれらにとって公
知である。たとえば、１つの投薬は、１ｍｌの等張のＮａＣＩ解答に溶かされる
ことができるか、１０００ｍｌの皮下注射療法流体に加えられることが可能であ
るか注入（実施例、フーバー、１９７５のために見える）の提案されたサイトで
吹き込まれることができる。投薬における若干の変化は、処理されている主題の
状態に従い、必然的に起こる。管理に対して責任がある人は、いずれにしても、
個々の主題のための適切な服用を決定する。
【０２９９】 さらに、人間の管理のために、準備はＢｉｏｌｏｇｉｃｓ標準のＦＤＡによっ
て、必要に応じて不毛、発熱性および一般的な安全および純度標準を満たさなけ
ればならない。
【０３００】 不毛な注射可能な溶液は遺伝子治療構造物を、必要に応じて、上で列挙される
他の成分のいくつかを有する適当な溶媒の必須の量に取り入れることにより準備
されることができる。そして、フィルターを通した殺菌が続く。通常、分散はそ
れらからさまざまな殺菌された活性成分を基本的分散媒体を含む不毛なビヒクル
および必須の他の成分に組み込むことにより準備される。列挙する。不毛な注射
可能な溶液の準備のための不毛な粉の場合、準備の好適な方法は、それの以前に
不毛な濾過された溶液から、活性成分さらにいかなる追加の所望の成分もの粉を
生む技術をｖａｃｕｕｍ−ｄｒｙｉｎｇしていて、凍結乾燥にしている。
【０３０１】 本願明細書において、開示される組成物は、中立であるか塩気がある形式にお
いて、処方物されることができる。
【０３０２】 薬学的に受け入れられる塩は、加算が加塩する。そして、酢に、蓚酸に、酒石
酸に、ｍａｎｄｅｌｉｃな様に、たとえば、塩化水素であるかリン酸またはこの
種の有機酸のような無機酸が形成されている酸を含む、そして、ような。自由な
カルボキシル基が形成される塩は、また、有機質の無機主成分（例えばナトリウ
ム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ）、その他）
に由来できるイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン
などとしてベース。処方物に、治療として効果的であるように、溶液は投薬処方
物によって、そして、この種の量において、互換性を持つ方法で管理される。 処方物は、様々な投薬形式（例えば注射可能な溶液、薬リリース・カプセルなど
）において、容易に管理される。
【０３０３】 ここで使用しているように、任意の、キャリア、そして、全ての溶媒（分散メ
ディア）ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌性で抗真菌性のエージェント、
等張の吸収遅延エージェント、バッファ、キャリア溶液、サスペンション、コロ
イド、など。製薬活性物質のためのこの種のメディアおよび代理人の利用は、公
知技術である。従前通りのいずれまででもメディアまたはエージェントが活性成
分と非互換であるのを除いて、治療的な組成物のその使用は熟慮される。 補助活性成分は、また、組成物に組み込まれることができる。 （４．１０．２ 鼻腔内送達） 鼻の溶液またはスプレー（開示されたペプチドおよびポリヌクレオチドのより
多くのうちの１つを有する中皮腫の治療のためのエアゾールまたは吸入器さえ）
を使用できる。鼻の溶液は、通常低下またはスプレーの鼻の通路の管理のために
設計される水溶液である。それらが多くの点で鼻の分泌と同様であるために、鼻
の溶液は準備される。その結果、通常のまつげの動作は維持される。このように
、水の鼻の溶液は、通常等張で、ｐＨを維持するために僅かに緩衝されるの約５
から。約６に対する５。５．必要な場合、眼の準備および適当な薬において、使
用するそれらと同様の加算（抗菌性防腐剤）において、スタビライザは処方物に
含まれることができる。さまざまな商用の鼻の準備は、公知である。
【０３０４】 吸入および吸入器は、患者の呼吸の木に、薬または合成物を届けるために設計
される製薬準備である。蒸気または霧は、管理されて、しばしば気管支で鼻の混
雑の徴候から救われることを与えるために、影響を受ける領域に着く。
【０３０５】 しかし、このルートは、また、体循環にエージェントを分配するために使用さ
れることができる。
【０３０６】 吸入は、鼻であるか口の呼吸のルートにより管理されることができる。霧が細
気管支に着くために、液滴が大きさにおいて、十分に素晴らしくて均一な場合、
吸入溶液の管理は効果的なだけである。
【０３０７】 製品（また、吸入として公知で、時々吸入と呼ばれている）の他のグループは
、溶液または液化されたガス推進体の薬の中止を保つ速達郵便システム（例えば
製薬エアゾール）の使用によって、呼吸の通路に運び込まれる細かく粉にされる
か流動薬から成る。適切な弁および口のアダプタでリリースされる、メーターで
測る吸入のする患者の呼吸の地域に推進する。
【０３０８】 分子サイズは、この種の準備の管理において、重要である。肺の空洞への浸透
のための最適の分子サイズが約０の命令の中であると報告された。約７つのｊｊ
． ｍに対する５。素晴らしい霧が、有利であるとみなされて、加圧されたエア
ゾールおよびそれゆえに、それらの使用によって、中で生じる。
【０３０９】 （４． １０．３ リポソーム、ナノカプセル、およびミクロ粒子媒介送達） 特定の実施態様では、適切な宿主細胞への本発明のポリヌクレオチド組成物の
はじめにのために、発明者はリポソーム、ナノカプセル、およびミクロ粒子媒介
送達、ミクロスフェア、脂質分子、小嚢、などの使用を熟慮する。特に、本発明
のポリヌクレオチド組成物は、交付のためにも処方物されることができる脂質分
子、リポソーム、小嚢、ナノスフェアまたはナノ粒子のカプセル化する等。
【０３１０】 この種の処方物は、本願明細書において、開示される核酸の薬学的に受け入れ
られる処方物のはじめにのために好まれることができる。形成、そして、リポソ
ームの用途技術の従来技術において、それらに一般に公知である（実施例、Ｃｏ
ｕｖｒｅｕｒその他のために見る、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ（１９８８）；
Ｌａｓｉｃ（１９９８）；それは、細胞内バクテリアの伝染病および病気の目標
とされた抗生治療のリポソームおよびナノカプセルｓの使用を記載する）。最近
、リポソームは改良された血清安定性および循環半減期により開発された（Ｇａ
ｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８８）；アレンおよび
Ｃｈｏｕｎ（１９８７）；特に本願明細書に引用したものとする完全に米国特許
５、７４１（５１６）。リポソームおよび潜在的な薬キャリアとしての準備のよ
うなリポソームの更なる、さまざまな方法は、チェックされた（タカクラ（１９
９８）；Ｃｈａｎｄｒａｎほか（１９９７）；Ｍａｒｇａｌｉｔ（１９９５）；
米国特許５、５６７、４３４；米国特許５、５５２、１５７；米国特許５、５６
５、２１３；米国特許５、７３８、８６８、そして、各々特に本願明細書に引用
したものとする完全に米国特許５、７９５（５８７）。
【０３１１】 １２セルＴ細胞サスペンションを含んでいる他の手順、主要な肝細胞培養およ
びＰＣによって、トランスフェクションに通常抵抗する多くの細胞タイプによっ
て、リポソームがうまく使われた（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎほか（１９９０）；マラ
ーその他、１９９０）。加えて、リポソームはウィルスのベースの交付システム
を代表するＤＮＡ長さ制約から自由である。
【０３１２】 リポソームが、遺伝子を導くために効果的に使われた薬（ヒースおよびマーテ
ィン（１９８６）；ヒースほか（１９８６）；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓほか（１
９８９）；Ｆｒｅｓｔａ、そして、Ｐｕｇｌｉｓｉ、１９９６）、ｒａｄｉｏｔ
ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃなエージェント、Ｐｉｋｕｌほか、１９８７酵素（１９９
０ａ、イマイズミほか；イマイズミその他、１９９０ｂ）、ウイルス、フォーラ
およびボルチモア、１９８４様々な洗練された細胞系および動物へのコピー要因
およびａｌｌｏｓｔｅｒｉｃな効果器、ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ
、１９７９。加えて、リポソームにより媒介される薬交付の効果を調べている成
功した臨床いくつかの痕跡は、完了された（１９８５ａ、ロペス−Ｂｅｒｅｓｔ
ｅｉｎほか；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ（１９８８）；Ｓｃｕｌｉｅｒその他、１
９８８）。さらに、いくつかの研究は、リポソームの使用が体系の交付、モリお
よびＦｕｋａｔｓｕ、１９９２の後、ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ反応、毒性または生
殖腺の局地化にかかわらないことを示唆する。
【０３１３】 リポソームは、水の媒体で分散して、自発的にｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ同
心の二分子層小嚢を形成するリン脂質から形成される（また、ｍｕｌｔｉｌａｍ
ｅｌｌａｒ小嚢（ＭＬＶｓ）と呼ばれる。ＭＬＶｓに通常、２５ナノメートルか
ら午前４時まで直径を有する。ＭＬＶｓの超音波処理は５００のＡに２００の範
囲の直径を有する小さいｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ小嚢（ＳＵＶ）の形成に結果と
してなる。そして、核の水溶液を含む。
【０３１４】 リポソームは、細胞膜に似ていて、ペプチド組成物のためのキャリアとして本
発明との関係ために、熟慮される。両方のｗａｔｅｒ−ａｎｄ脂質−可溶な物質
が入り込まれることができるように、それらは広く適切である。ｉ． ｅに、水
のスペースの、そして、それぞれ、二分子層の範囲内で。薬−関係リポソームが
ｌｉｐｏｓｏｍａｌな処方物を選択的に修正することによって、活発な代理人の
特定地域向けの出産のために使用されさえすることができることはあり得る。
【０３１５】 Ｃｏｕｖｒｅｕｒその他の教示に加えて（１９７７；１９８８）、情報がｌｉ
ｐｏｓｏｍａｌな処方物を生成して利用できる以下。水に対する脂質のモル比率
に従い、ウェーハにおいて、分散するときに、リン脂質はリポソーム以外の様々
な構造を形成できる。低い比率で、リポソームは好適な構造である。リポソーム
の物理的な特徴は、ｐＨ、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。リ
ポソームはイオンで極地の物質に低い透過性を示すことができる、しかし、高架
鉄道で、温度は著しくそれらの透過性を変えるフェーズ移行を経る。フェーズ移
行は、密接に包まれた、命じられた構造（ゲル状態として公知の）から、変化を
含むゆるく包んで、より少ない−構造（流体状態として公知の）を命じる。これ
は、特性フェーズ−転移温度で起こって、イオン、糖および薬に透過性の増加に
結果としてなる。
【０３１６】 あるいは、本発明は本発明のポリヌクレオチド組成物の薬学的に受け入れられ
るナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルｓは、一般に安定して再生可能
な方法の合成物に入り込むことができる（ヘンリー−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄ ｅ
ｔａｌ．（１９８７）；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−ゲレロほか（１９９８）；ダグラ
スその他、１９８７）。細胞内重合体のオーバーローディングのために副作用を
避けるためにこの種のｕｌｔｒａｆｉｎｅ分子（約０の大きさを設定した。１ｊ
ｕｍ）重合体を生体内に等級を下げられることが可能に扱って設計しなければな
らない。これらの必要条件を満たす生物分解可能なｐｏｌｙａｌｋｙｌ−シアノ
アクリレートｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓは、本発明およびこの種の分子ために
、熟慮される容易になされる、記載する（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ ｅｔａｌ．（１９
８０）；１９８８ ；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎほか（１９９８）；Ｚａｍｂａｕｘ
ほか１９９８；ピント−Ａｌｐｈａｎｄｒｙほか、１９９５、そして、特に本願
明細書に引用したものとする完全に米国特許５、１４５（６８４）。事項、いず
れのｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓも使用している目標セルへのポリヌクレオチド
・ポリヌクレオチド配達の方法またはｎａｎｏｓｐｈｅｒｅｓの（シュワッブほ
か（１９９４）；Ｔｒｕｏｎｇ−Ｌｅその他、１９９８）また、特に動物に対す
る。そして、人間特に対する管理のための開示された組成物を処方物することに
役立つために熟慮する。
【０３１７】 （４．１１ 治療剤およびキット） 本発明も、ＷＴ１に特有の抗体のうちの１つ以上または一つ以上の薬学的に受
け入れられる賦形剤、キャリア、希釈剤、助手および／または投与のための他の
部品で処方物される断片またはＷＴ１から派生したペプチドまたはペプチド変化
を結合している抗原にそれの必要の動物を提供する。開示されたエピトープ、抗
体て抗原結合する断片、断片−符号化ポリヌクレオチドまたは追加の抗癌剤を結
合している抗体または抗原、ポリヌクレオチド、ペプチド、抗原または治療的な
その他が混合する添加物の本願明細書において、開示される特定の組成物および
処方物の処方物において、そして、特に影響を受けた哺乳類の管理のための抗癌
剤または抗中皮腫療法の準備において、使用されることができる。
【０３１８】 このように、本願明細書において、開示される製薬組成物の管理のための好適
な動物は、哺乳類および特に人間を含む。
【０３１９】 ペット、家畜または商業上関連した動物の種と共通に考えられる他のいかなる
哺乳類の種と同じくも、他の好適な動物は、霊長類、羊、ヤギ、ウシ、ウマ、ブ
タ、オオカミ、犬およびネコを含む。組成物および処方物は、部分的にまたはか
なり精製されたポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体か抗原結合する断片
組成物（一人の）を含むことができる、または、一つ以上の追加の活性成分、抗
癌剤、ワクチン、助手または自然の再結合物ソースから得られることが可能であ
る、または、自然に獲得できてもよい他の治療学と協力して、または、どちらか
、化学的に合成してまたはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙｐｒｏｄｕｃｅｄされた
一つ以上のこの種の追加の活性成分をコード化する一つ以上の核酸部分を表して
いる再結合物宿主細胞、キャリア、助手、共同因子または他の治療的な合成物か
らのｖｉｚｒｏ。
【０３２０】 （４．１２ 診断試薬およびキット） 本発明は、更に様々な診断ために、一つ以上のこの種の試薬から成ることはた
とえば含有を示す診断上の試薬およびキットを提供する、ＥＬＩＳＡおよびサン
ドウィッチ−タイプ免疫測定のような免疫測定。この種のキットは、それについ
て少なくとも好ましくは第１のペプチドまたは本発明、それの機能の断片または
カクテルの第１の抗体か抗原結合する断片を含むことができる。そして、信号生
成のための手段。キットが使われるときに、キットの構成要素は予め強力なサポ
ートに付属でもよいかまたは強力なサポートの表層に適用されることができる。
信号発生手段は、予め本発明の抗体と関連させるようになることができるかまた
は一つ以上の構成要素との組合せを必要とすることができる。ｅに、ｇ．（バッ
ファ）ａｎｔｉｂｏｄｙｅｎｚｙｍｅ同根語、酵素基板、使用の前に、等。 キットは、また、追加の試薬を含むことができる。ｅに、非特異性の結合を固体
のフェーズ表層、洗っている試薬、酵素基板に下げるための試薬を抑止して、ｇ
．など。固体のフェーズ表層が、マイクロータイタープレート、ミクロスフェア
またはタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを固定することに適している他
の材料の形であってもよい。好ましくは、ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔで
あるかｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃな製品の形成またはｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃ
ｅｎｔであるかｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃな基板の減少に触媒作用を及ぼす酵素は
、信号発生手段の構成要素である。この種の酵素は、公知技術である。
【０３２１】 この種のキットは、発見、モニタリングおよび過剰発現によって、特徴づけら
れる状況またはＷＴ１の不適当な現れの診断法に役立つかまたはペプチドおよび
／またはポリペプチドをＷＴ１−由来した。抗体、ペプチド、断片を結合してい
る抗原、ハイブリドーマ、ベクトル、ワクチン、ポリヌクレオチドまたは本願明
細書において、開示される細胞組成物のうちの少なくとも１つから成る本発明の
治療的で診断上のキットは、また、準備されることができる。そして、診断上の
試薬または治療的なエージェントとして組成物を使用するための指示。診断上の
および／または治療的な組成物のどの一つ以上が配置されることができて、好ま
しくは最適に等分されることができるか、この種のキットに用いられるコンテナ
は、概して少なくとも一つの小びん、試験管、フラスコ、ビン、注射器または他
の適切なコンテナから成ることができる。第２の治療的なエージェントがまた、
提供される所で、キットはまた、この第２の診断上のおよび／または治療的な組
成物が配置されることができる第２のはっきりしたコンテナを含むことができる
。あるいは、複数の合成物は、単一の製薬組成物において、準備されることがで
きて、単一のコンテナ手段（例えば小びん、フラスコ、注射器、ビンまたは他の
適切な一つのコンテナ）に詰められることが可能である。本発明のキットはまた
、概して、例えば、商用の販売のための近い制限の小びんを含むための手段を含
む例えば、注入またはブロー成形のプラスチックのコンテナ、所望の小びんはい
ずれに保持される。識別用放射性同位元素、ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ、ｆｌｕｏ
ｒｉｇｅｎｉｃまたは検出可能なラベルまたは検出手段の他のタイプがキットの
範囲内で含まれる所で、ラベルをつけている代理人は診断上であるか治療的な組
成物と同じコンテナのどちらでも提供されることができるかまたは代わりにこの
第２の組成物が配置されることができて、最適に等分されることができる第２の
はっきりしたコンテナ手段に置かれることができる。 あるいは、発見試薬およびラベルは単一のコンテナ手段で準備されることができ
る。そして、ほとんどの場合、キットはまた、概して商用の販売および／または
便利な包装および交付のための近い制限の小びんを含むための手段を含む。
【０３２２】 （４． １３ 典型的な定義） 本発明によれば、核酸配列はＤＮＡを含むが、これに限定されるものではない（
含む、そして、ゲノムであるかｅｘｔｒａｇｅｎｏｍｉｃなＤＮＡに制限する）
（遺伝子）、ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むがこれに限らず
）、ヌクレオシドおよび適切な核酸部分も自国のソース（化学的に総合される）
から得たペプチド核酸（ＰＮＡｓ）は人を修正するかまたは全体的にあるいは部
分的に一方備えた。
【０３２３】 一方定義されない限り、本願明細書において、用いられる全ての専門的で科学
的な語は共通に本発明が帰属する技術の当業者によって、理解するのと、同じ意
味を有する。いかなる方法もおよび類似したか本願明細書において、記載されて
いるそれらに等しい組成物が本発明の実行またはテストにおいて、使うことがで
きるにもかかわらず、好適な方法および組成物は本願明細書において、記載され
ている。本発明のために、次の用語は、下で定義される： Ａ，ａｎ：長年の特許法的慣習に従って、語「ａ」および「ａｎ」は、本明細
書中（特許請求の範囲を含む）で用いられる場合、「１つ以上を示す」。
【０３２４】 ペプチドを合成する構造遺伝子またはポリペプチド）によって、経られる翻訳
の組合せ。
【０３２５】 プロモータ：項は、一般にコピーを管理する核酸配列の領域または領域を記載
したものである。
【０３２６】 規定する要素：項は、一般にコピーを管理する核酸配列の領域または領域を記
載したものである。
【０３２７】 構造遺伝子：コード化されたペプチドまたはポリペプチドを生産するために表
される遺伝子または配列領域。
【０３２８】 変換：外生のポリヌクレオチド・配列を導く方法（例えば、ベクトル、組み換
えＤＮＡまたはＲＮＡ分子）その外生の核酸部分が少なくとも第１の染色体に組
み込まれるかまたは変わる宿主細胞の範囲内で自主的な複写ができる宿主細胞ま
たは原形質体に。トランスフェクション、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎおよ
び裸の核酸理解は、全く使用する技術の実施例が一つ以上のポリヌクレオチドを
有する宿主細胞を変えると述べる。
【０３２９】 変わる細胞：核酸補足がその細胞に一つ以上の外生のポリヌクレオチドのはじ
めによって、変えられた宿主細胞。
【０３３０】 トランスジェニックの細胞：いかなる細胞も、由来するかまたは変わる細胞か
ら再生するかまたはトランスジェニックの細胞からまたは変わるこの種の宿主細
胞のいかなる生成もの後継者または子から生じた。
【０３３１】 トランスジェニックの動物：動物または後継者、または、それのいかなる世代
もの子、動物のＤＮＡが元々土地の人、野生のタイプ、同じ種のｎｏｎｔｒａｎ
ｓｇｅｎｉｃな動物に存在しない導かれた外生の核酸分子を含む変わる動物性細
胞に由来する。時々用語ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌａｎｄｔｒａｎｓ
ｆｏｒｍｅｄ ａｎｉｍａｌｈａｖｅ動物（いずれが一つ以上の外生の核酸部分
を含むために修正されたか、遺伝子の内容）を定義する同義の条件として、従来
技術において、使用する。
【０３３２】 ベクトル：核酸分子（概してＤＮＡ（宿主細胞の複写でおよび／または他の核
酸部分が取付けられた部分の複写をもたらすためにそのようにいずれとして有効
に連結されることができるか能力がある）から成る）。プラスミド、ｃｏｓｍｉ
ｄまたはウイルスは、典型的なベクトルである。
【０３３３】 用語実質的にが、一致する」実質的に相応する，」、本願明細書において、用
いられるまたは実質的に同一は核酸またはアミノ酸配列の特徴を示す。そこにお
いて、選択された核酸またはアミノ酸配列は選択された参照核酸またはアミノ酸
配列と比べて、少なくとも約７０または約７５パーセントの配列識別を有する。
より一般的に、そして、好ましくは、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９
２、９３、９４または９５パーセントの配列識別についての最少で、選択された
配列および参照配列は少なくとも約７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２
、８３、８４または８５パーセントの配列識別さえ有する。
【０３３４】 好ましくは、まだ、少なくともより選択された配列間の識別およびそれがあっ
た参照配列が比較した９６、９７、９８または９９パーセントの配列について大
きい非常に相応する配列は、しばしば分担する。 配列識別のパーセンテージは、比較される配列の全ての長さ以上算出されること
ができるかまたは合計選ばれた参照配列の約２５パーセントほど未満になる小さ
い削除または加算を除外することにより算出されることができる。参照配列は、
より大きい配列（例えば遺伝子または側面を接している配列の部分または染色体
の反復的な部分）のサブセットであってもよい。しかし、２つ以上のポリヌクレ
オチド・配列の配列異体同形の場合、参照配列は、１８−２５のヌクレオチド（
より概して少なくとも３５のヌクレオチドに対する約２６）について、そして、
より概して少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ほどの
ヌクレオチドにさえさえついて少なくとも概して成り立つ。望ましく、どの非常
に相応する断片が要求される、２つの配列間のパーセント識別の範囲は少なくと
も８０％について、そして、好ましくは、好ましくは８５％についての最少で、
直ちに、従来技術において、技術のそれらに周知の配列比較アルゴリズムの一つ
以上により決定されるように、約９０％であるか９５％であるかより高いｅに例
えば。ｇ．、Ｐｅａｒｓｏｎおよびリップマン（１９８８）により記載されてい
るＦＡＳＴＡプログラム分析。
【０３３５】 本願明細書において、用いられる用語天然に存在するオブジェクトに適用する
目的が性質において、見つかるという事実に関連する。たとえば、性質のソース
から分離されることができる。そして、研究所の人の手によって、故意に修正さ
れなかった有機体（ウイルスを含むこと）に存在するポリペプチドまたはポリヌ
クレオチド・配列は、自然に起こる。ここで使用しているように、古典的な遺伝
学によると選択的に飼育されることができた齧歯動物の研究所緊張は、自然に起
こっている動物と考えられる。
【０３３６】 ここで使用しているように、異種は予め定められた参照された遺伝子に関して
配列を定義した。たとえば、構造遺伝子配列に関して、異種なプロモータは、参
照された構造遺伝子に隣接して自然に起こらない、しかし、研究所操作により配
置されるプロモータとして定義される。同様に、異種な遺伝子または核酸部分は
、参照されたプロモータおよび／またはエンハンサ要素に隣接して、自然に起こ
らない遺伝子または部分として定義される。
【０３３７】 「一つ以上の他の核酸配列と協力してか単独でコピーを活性化するポリヌクレ
オチド・配列に対する転写規定する要素を言う。転写規定する要素は、たとえば
、一つ以上のプロモータ、一つ以上の反応要素、一つ以上の否定の規定する要素
および／または一つ以上のエンハンサを含むことができる。
【０３３８】 ここで使用しているように、転写部位は、ポリヌクレオチド・配列に結合して
いる認識部位および転写要因または一つ以上のコピー要因の配列に特有の相互作
用の場所であると確認される配列・モティーフを因数に分解する。そして、しば
しば直接のタンパク質−ＤＮＡ結束という形をとる。一般的に、サイトを結合し
ているコピー要因は、ｆｏｏｔｐｒｉｎｔｉｎｇしているＤＮＡ、ゲル可動性シ
フト分析評価、などにより識別されることができておよび／または周知の共通配
列モティーフを基礎としてまたは従来技術において、技術のそれらにとって公知
の他の方法により予測されることができる。
【０３３９】 ここで使用しているように、２つ以上のポリヌクレオチドの結合または機能の
関係の２つ以上の核酸配列に対するｔｅｒｍｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄｒ
ｅｆｅｒｓ。それが機能の関係に配置される核酸ｉｓｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎ
ｋｅｄｗｈｅｎ他の核酸配列。たとえば、それが符号化配列のコピーに影響を及
ぼす場合、プロモータまたはエンハンサは使用可能な状態で符号化配列に連結さ
れる。連結されているＤＮＡ配列が概して隣接して、必要な場合、２つのタンパ
ク質符号化領域を接合するために、隣接して、読む際に進行する使用可能な状態
で連結された手段。数キロベースによるプロモータおよびｉｎｔｒｏｎｉｃな配
列が可変の長さの中であることができて分離されるときに、エンハンサが一般に
機能した時から、しかし、若干のポリヌクレオチド要素は、使用可能な状態で連
結されることができる隣接する。
【０３４０】 「転写ユニットは、そして、構造遺伝子配列および少なくとも第１の末梢部の
規定する要素の効果的なコピーおよび翻訳のために必要であるいかなる追加のシ
ス・配列と同様にもプロモータおよび／またはエンハンサ要素の制御の下に、使
用可能な状態で配置される構造遺伝子配列の適当な組織に特有で発達上のコピー
のために必要でありえるように効果的な転写のために必要な一つ以上の他のシス
代理の核酸配列に、使用可能な状態で任意に少なくとも少なくとも第１のシス代
理のプロモータ・配列に、使用可能な状態で連結される第１の構造遺伝子から成
るポリヌクレオチド・配列とつながった（例えば、ポリアデニル化サイト、ｍＲ
ＮＡ配列を制御している安定性、その他）。
【０３４１】 （５． 実施例） 以下の実施例は、本発明の好適な実施例を示すために含まれる。しかし、技術の
それらは、従来技術において、現在の開示を考慮して、開示される特定の実施態
様において、多くの変化がなされることができると認めなければならなくて、ま
だ行われていなければならないような、または、添付の請求の範囲に記載されて
いる本発明の精神と範囲から逸脱することなく、類似した結果。
【０３４２】 （５．１ 実施例１−悪性の中皮腫患者のＷＴ１特定の抗体の検出） この実施例は、悪性の中皮腫のための目印としてＷＴ１の使用を例示する。
【０３４３】 （５．１．１．１ 組換えタンパク質の精製） タンパク質発現について、人間のＷＴ１全長（アミノ酸１−４４９）を表して
いるｃＤＮＡ構造物、Ｎ−終点（アミノ酸１−２４９）およびＣ−終点（アミノ
酸２６７４４９）領域は、修正されたｐＥＴ２８ベクトルにサブクローン化され
た。結果として生じるベクトルに５’Ｈｉｓタグがあった。そして、符号化領域
（３’ヒスチジンタグが続く）がトロンビンおよびＥＫサイトによって、続いた
チオレドキシン（Ｔｒｘ）が続いた。ＴＲＸ−ＷＴ１ プロテインのための発現
構造物を含んでいる再結合物ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ、ラ・ホーヤ、ＣＡ）、ＴＲＸを有するＷＴ１の先端を切った種類の融合タン
パク質は、一晩発達して、イソプロピル−により誘導された（３−Ｄ−チオガラ
クトシダーゼ（ＩＰＴＧ）。全てのタンパク質は、同様にふるまって、本質的に
同じプロトコルに従って精製された。細胞は、収穫されて、１０ｍＭのＴｒｉｓ
ｐＨ＝８のインキュベーションによって、溶解した。３７のＣでの完全なプロ
テアーゼ抑制剤タブレット（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒマンハイムＢｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ、インディアナポリス、ＩＮ）を有する０は、超音波処理の繰り返され
たラウンドあとに続いた。得られた封入体は、１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ＝８に
よって、二回洗われた。０／０．５％のＣＨＡＰＳ、そして、ｐＨ＝８．で１０
ｍＭのＴｒｉｓを含んでいる８Ｍの尿素の可溶性にする０（バッファＡ）。タン
パク質は、それからニッケル・ニトリロ三酢酸樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社、バレンシ
ア、ＣＡ）の上の金属キレート類似性クロマトグラフィにより精製された。タン
パク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された、そして、重要なタンパク質を含ん
でいる分数はプールされて、過剰な１０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ＝８に対して、一
晩透析した。０． 透析は、８Ｍの尿素に持ってこられて、バッファＡ． タンパク質において、
釣り合わせられる陰イオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）が１Ｍ ０から勾配を有する
バッファＡにおいて、抽出されたＳｏｕｒｃｅ Ｑに積まれたＮａＣｌ．重要な
タンパク質を含んでいる分数はプールされた。そして、過剰な１０ｍＭのＴｒｉ
ｓ ｐＨ＝８に対して、一晩透析された。更なる使用のための０および格納され
たａｔ８０ Ｃ。ＷＴ１ペプチドのアイデンティティは、Ｎ−ターミナル配列す
ることによって、確かめられた。
【０３４４】 （５．１．１．２抗体反応） ＷＴ１ポリペプチドへの２つの抗体反応は縦に再結合物および切り詰めたＷＴ
１タンパク質を使用している西洋のしみ分析により決定された、そして、ＷＴ１
ポリペプチドはＷＴ Ｎ１８０（サンタクルーズＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社
、サンタクルーズ、ＣＡ）を示した。主要な抗体、非免疫にされたのと同様に免
疫にされたＢ６マウスからの血清または人間のＡＭＬ患者が、使われた１：Ｔｒ
ｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄされた塩水湖／１％のＢＳＡおよび０を有する５００の
希薄。１％のＮＰ−４０ＴＭ。多角形のａｎｔｉｍｏｕｓｅまたは抗人のセイヨ
ウワサビｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄされた第２の抗体（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、
ＮＪ）が、使われた１：１０、０００希薄。しみは、それからそれらがＨｙｐｅ
ｒｆｉｌｍ−ＥＣＬＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にさらされたｃｈｅｍｉｌｕｍｉ
ｎｅｓｃｅｎｔな反応、ＥＣＬＴ＾４ Ｒｅａｇｅｎｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍを使
用することにより開発された。フィルムは、現像されて、調べられた。全ての制
御しみは、商業上用意されたＷＴ１−特定の抗体、ＷＴ Ｃ−１９およびＷＴ
１８０（サンタクルーズＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用することにより開
発されて、ＴＲＸ−ＷＴ１融合タンパク質の期待される寸法で、各々強いバンド
を示した（全身の（ほぼ８５ｋＤａ）ＴＲＸ−ＷＴ１；ＴＲＸ−ＷＴ１ Ｎ−終
点（ほぼ６０ｋＤａ）；ＴＲＸ ＷＴ１ Ｃ−終点（ほぼ５０ｋＤａ）。
【０３４５】 （５．１．１．３ ＷＴ１ ＥＬＩＳＡ） ９６−ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）は、各々のＷＴ１タンパク質の
５０のｕｌ／ｗｅｌｌでおおわれていた。ＷＴ１タンパク質は、ＥＬＩＳＡコー
ティング・バッファの５ｎｇ／ｌｌに薄められた（１ＭのＮａ２ＨＣＯ３（ｐＨ
９）。６）．プレートは、４つのＣでの夜または３７のＣでの４時間以上培養
されて、それから二度をＰＢＳ／０で洗った。１％のＴｗｅｅｎ．プレートは、
２００ｕｌ／ウェルＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにより抑止された（通常の
１０％のヤギ血清／ＰＢＳ／０。１％のＴｗｅｅｎ）、培養された室温で、そし
て、それから洗われた２時間の二度。
【０３４６】 第１のステップ抗体として５０ｕ。いずれの忍耐強いサンプルも、明確な制御
またはＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにおいて、薄められる否定の制御サンプ
ルのｌは、加えられた。明確な制御は、ＷＴＣ１９およびＷＴ１８０抗体（サン
タクルーズ）を含んだ。否定の制御は、健康なボランティアから血清を含んだ。
【０３４７】 試験サンプルは、悪性の中皮腫患者に由来する血清を含んだ。 プレートは、室温で、４つのＣまたは４時間で一晩培養されて、それからプレー
ト洗濯機を使用している４つの時間を洗った。第２のステップ抗体、反ウサギＨ
ＲＰ（１：５０００）（明確な制御のための）または抗人のＨＲＰに（１：８０
００）、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒにおいて、薄められる１００ｐｌ／ウ
ェルでのＡｂは、加えられた。プレートは、室温で、２時間およびそれから洗わ
れた６つの時間の間培養された。
【０３４８】 結果は図２において、示される。そして、それは中皮腫患者のＷＴ１に特有の
抗体の探知を示す。最初の２本の柱は、明確な制御（ＷＴＣ １９およびＷＴ１
８０）を示す。第３のコラム（Ｄ４４を示した）は、通常の制御血清のための結
果を示す。残留するコラムは、悪性の中皮腫をもつ患者から得られる血清サンプ
ルのための結果を示す。血清サンプルはＳ３３７を示した、そして、Ｓ３３９は
通常の制御の中間がサンプルをとる二度より大きくて、このように悪性の中皮腫
のためにポジティブであるとみなされた値を有した。
【０３４９】 （５．２ 実施例２−ＷＴ１を発現する細胞系によって、免疫にされるマウス
のＷＴ１に対する抗体の誘導） この実施例は、生体内にＷＴ１特定の抗体反応を誘発するためにＷＴ１を表して
いる細胞の使用を例示する。
【０３５０】 白血病をもつ患者のＷＴ１に対する現存する抗体の探知は、ＷＴ１に免疫を誘
発することはＷＴ１タンパク質に免疫にするのが可能なことを強く意味した。Ｗ
Ｔ１に対する免疫が予防接種によって、発生できるかどうか検査するために、マ
ウスはＴＲＡＭＰ−Ｃ（Ｂ６起源のＷＴ１陽腫瘍細胞系）を注射された。簡潔に
、雄Ｂ６マウスは、皮下に５つの×１０６のＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞で免疫にされて
、３週間隔の５つのｘ １０６のセルを有する二度を押し上げた。３週最終的な
免疫の後、血清は得られた、そして、脾臓の単細胞中止は２５を有するＲＰＭＩ
１６４０の媒体（ＧＩＢＣＯ）で準備された。Ｍ（３−２−メルカプトエタノ
ール、ｍｌにつきペニシリンの２００台の装置、１０ｍＭのＬ−グルタミンおよ
び胎児のウシ１０％の血清。
【０３５１】 ＴＲＡＭＰ−Ｃに免疫に続いて、免疫にされた動物のＷＴ１特定の抗体反応は
、検出可能であった。西洋のしみは、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＷＴ１陽腫瘍細胞系）に
よって、免疫にされるＢ６マウスのＷＴ１−ｓｐｅｃｉｆ１ｃ抗体反応の探知を
例示して実行された。レーン１、３および５は分子量目印を含んだ、そして、レ
ーン２、４および６はＷＴ１に特有の明確な制御（Ｎ１８０、サンタクルーズＢ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ほぼ５２ｋＤａで西洋のしみに移って、ＷＴ１タン
パク質のＮ−ターミナル領域の１８０のアミノ酸にわたっているポリペプチド）
を含んだ。使用する主要な抗体は、レーン２のＷＴ１８０、レーン４の非免疫に
されたＢ６マウスの血清およびレーン６の免疫にされたＢ６マウスの血清であっ
た。これらの結果は、ＷＴ１ポリペプチドに対する免疫がＷＴ１ポリペプチドに
免疫反応を引き出すことを証明した。
【０３５２】 （５．３ 実施例３−ＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスのＴＨお
よび抗体反応の誘導） この実施例は、ＷＴ１に固有な免疫反応を引き出すためにＷＴ１ペプチドを有
する免疫の能力を例示する。
【０３５３】 Ａｂを引き出すことに適しているペプチドおよび増殖的なＴ細胞反応は、Ｔｓ
ｉｔｅｓプログラムによれば識別された（Ｒｏｔｈｂａｒｄおよびテイラー（１
９８８）；Ｄｅａｖｉｎその他、１９９６）、それはＴｈ反応を誘発するために
可能性を有するペプチド・モティーフを捜す。表２に示されるペプチドは、合成
されて、配列された。
【０３５４】
【表２】 免疫、ペプチドは集められた続く： グループＡ：ｐ６−２２人の人間：１０．ｐ１１７−１３９人の１ｍｌの（１０
のｐ１ ＝ １００ｕｇ）人間／マウスの９ｍｇ：７．１ｍｌの６ｍｇ（１４
１００ｕ ｐ１ ＝。ｇ）ｐ２４４−２６２人間：４．ｌｍｌ（２２のｕｌ ＝
１００）ｇ）グループＢの６ｍｇ：ｐ２８７−３０１人の人間／マウス：７．
１ｍｌの２ｍｇ（１４ １００ｕ Ｉｌｌ ＝。ｇ）マウスｐ２９９−３１３：
６．ｐ４２１−４３５人の１ｍｌの（１５のＩｌｌ ＝ １００のＡｇ）人間／
マウスの６ｍｇ：３．中で３ｍｇＩｍｌ（＝ １００ ３０ａｌ ｕ。ｇ）Ｃｏ
ｎｔｒｏｌ：＋（ＦＢＬペプチド１００ｕｇ）ＣＦＡ／ＩＦＡ Ｃｏｎｔｒｏｌ
：＋（ＣＤ４５ペプチド１００ａｇ）ＣＦＡ／ＩＦＡグループＡは、あるペプチ
ドを含まれるＷＴ１（エクソン１）およびグループＢのアミンの終点部分の範囲
内で、あるペプチドを含んだカルボキシ他のＤＮＡ−結合タンパク質に、配列異
体同形を有する４つの亜鉛指領域を含む終点。グループＢの範囲内で、ｐ２８７
−３０１およびｐ２９９−３１３はエクソン７（亜鉛指１）に由来した、そして
、ｐ４２１−４３５はエクソン１０（亜鉛指ＩＶ）に由来した。
【０３５５】 Ｂ６マウスは、一群のＷＴ１ペプチドによって、または制御ペプチドによって
、免疫にされた。ペプチドは注入のためのｌｍｌ不毛な水に溶かされた、そして
、Ｂ６マウスは３週の時間間隔での免疫にされた３つの時間であった。使用する
助手はアフリカ金融共同体／ＩＦＡ（ＧＭ−ＣＳＦ）であった、そして、１およ
び２および増殖的なＴ細胞反応が標準のチミジン編入分析評価を使用して評価さ
れた実施例において、ＷＴ１に固有な抗体の存在がそれから決定されたＭｏｎｔ
ｉｎｉｄｅ．はどの細胞が抗原がある場合には、培養されるかについて記述した
、そして、増殖は測定統合された放射能、チェンほか、１９９４により評価され
た。特に、リンパ球は４つの×１０５の照射を受けた同系な（３０００ラド）脾
臓細胞および指定されたペプチドを有するウェルにつき、２つのｘ １０５の細
胞で９６−ウェルプレートで培養された。
【０３５６】 グループＡに指定されるペプチドのグループをもつマウスの免疫は、ＷＴ１へ
の抗体反応を誘発した。代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウス
のＷＴ１−ｓｐｅｃｉＥ１ｃ抗体の探知を例示した代表的な西洋のしみは、実行
された。ＷＴ１特定の明確な制御（Ｎ１８０、サンタクルーズＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、５２ｋＤａで西洋のしみに移って、ＷＴ１タンパク質のＮ−ターミ
ナル領域の１８０のアミノ酸にわたっているポリペプチド）を示しているレーン
２、４および６については、レーン１、３および５は分子量目印を含んだ。
【０３５７】 使用する主要な抗体は、レーン２のＷＴ１８０、レーン４の非免疫にされたＢ
６マウスの血清およびレーン６の免疫にされたＢ６マウスの血清であった。抗体
は、なかった。Ｖａｃｃｉｎｅ Ｂ． Ｐ１１７−１３９の誘発された増殖的な
Ｔ細胞反応（図３Ａ、図３Ｂおよび図３Ｃ）を有する免疫から、ヘルパーＴ細胞
反応の不足と整合しているＶａｃｃｉｎｅ Ｂに検出以下の免疫。刺激インデッ
クス（ＳＩ）は、８および７２の間を変化した。他のペプチド（Ｐ６−２２およ
びＰ２９９−３１３）も、増殖的なＴ細胞反応を誘発することを示した。
【０３５８】 Ｐ６−２２を有する免疫は、２の刺激インデックス（ＳＩ）に結果としてなっ
た。Ｐ２９９−３１３を有する３および免疫は、３のＳＩに結果としてなった。
３．細胞が周知の抗原（例えばＣＤ４５およびＦＢＬ）によって、刺激した、そ
して、異系なＴ細胞が線をひく、ＤｅＢｒｕｉｊｎほか、１９９１Ｔと同じく、
明確な制御は、ＣｏｎＡ刺激されたＴ細胞を含んだ。
【０３５９】 図４Ａおよび図４Ｂは、ワクチンのＡ（図４Ａ）およびワクチンのＢ（図４Ｂ
）の範囲内で各々の３つのペプチドのために観察される増殖的な反応を示す。 ワクチンのＡは、３および８の間を（大きさ線）変化している刺激インデックス
（ＳＩ）については、ペプチドｐ６−２２およびｐ１１７−１３９を免疫にする
ことへの増殖的なＴ細胞反応を誘発した。ｐ２４４−２６２への増殖的な反応は
、検出されなかった（図４Ａ）。
【０３６０】 中で次に、ｖｉｔｒｏ刺激は、ｐ６−２２およびｐｌ １７−１３９だけを使
用している一つのペプチド刺激として、実行された。ｐｌ １７−１３９を有す
るＶａｃｃｉｎｅ Ａ特定のＴ細胞系の刺激は、ｐ６−２２（図５Ａ）への反応
なしで、ｐｌ １７−１３９に増殖に結果としてなった。線に由来するクローン
は、ｐｌ １７−１３９（図５Ｂ）に特有であった。対照的に、ｐ６−２２を有
するＶａｃｃｉｎｅ Ａ特定のＴ細胞系の刺激は、ｐｌｌ７−１３９（図５Ｃ）
への反応なしで、ｐ６−２２に増殖に結果としてなった。線に由来するクローン
は、ｐ６−２２（図５Ｄ）に特有だった。
【０３６１】 これらの結果は、ＷＴ１ペプチドを有する予防接種がＷＴ１ポリペプチドへの
抗体反応およびペプチドを免疫にすることへの増殖的なＴ細胞反応を誘発できる
ことを証明した。
【０３６２】 （５．４ 実施例４−ＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスのＣＴＬ
反応の誘導） この実施例は、ＣＴＬ免疫を誘発するためにＷＴ１ペプチドの能力を例示する
。 クラスに縛ることに適当なモティーフを有するＮｏｎａｍｅｒｉｃなペプチド（
９−マー）Ｉ、ＭＨＣは、予言分析、パーカーその他、１９９４を結合している
ＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチドを含んで、様々な解析法を使用して識別された。こ
の種の分析の範囲内で識別されるペプチドは、表３−表４５に示される。各々の
これらのテーブルにおいて、スコアは示されるＭＨＣ分子にペプチドの理論上の
結合する類似性（分離のハーフタイム）を反映する。
【０３６３】 ペプチドは、ＴＳＩＴＥＳプログラムを使用することを識別した（Ｒｏｔｈｂ
ａｒｄおよびテイラー（１９８８）；Ｄｅａｖｉｎその他、１９９６）、それは
引き出すＴｈ反応がよりはるかに表４６に示す効果があるペプチド・モティーフ
を捜す。
【０３６４】
【表３】
【０３６５】
【表４】
【０３６６】
【表５】
【０３６７】
【表６】
【０３６８】
【表７】
【０３６９】
【表８】
【０３７０】
【表９】
【０３７１】
【表１０】
【０３７２】
【表１１】
【０３７３】
【表１２】
【０３７４】
【表１３】
【０３７５】
【表１４】
【０３７６】
【表１５】
【０３７７】
【表１６】
【０３７８】
【表１７】
【０３７９】
【表１８】
【０３８０】
【表１９】
【０３８１】
【表２０】
【０３８２】
【表２１】
【０３８３】
【表２２】
【０３８４】
【表２３】
【０３８５】
【表２４】
【０３８６】
【表２５】
【０３８７】
【表２６】
【０３８８】
【表２７】
【０３８９】
【表２８】
【０３９０】
【表２９】
【０３９１】
【表３０】
【０３９２】
【表３１】
【０３９３】
【表３２】
【０３９４】
【表３３】
【０３９５】
【表３４】
【０３９６】
【表３５】
【０３９７】
【表３６】
【０３９８】
【表３７】
【０３９９】
【表３８】
【０４００】
【表３９】
【０４０１】
【表４０】
【０４０２】
【表４１】
【０４０３】
【表４２】
【０４０４】
【表４３】
【０４０５】
【表４４】
【０４０６】
【表４５】
【０４０７】
【表４６】 特定のＣＴＬペプチド（表４７に示す）がさらなる研究のために選ばれた。表
４７の各々のペプチドのために、予言分析を結合しているＢＩＭＡＳ ＨＬＡペ
プチドを使用して得られたスコアは、提供される。
【０４０８】
【表４７】 Ｃ５７Ｂ１／６つのネズミＭＨＣに縛っているペプチドは、白血病細胞系を使
用して確かめられたＲＭＡ−Ｓ、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎほか、１９９０。手短に言
えば、ＲＭＡ−Ｓ細胞は、１％のＦＣＳで補充される完全な媒体の２６Ｃで、７
つの時間間培養された。細胞が２４−ウェルプレートの中で、各々よく加えられ
て、培養した合計１０６ ＲＭＡ−Ｓも一人の、または、２６のＣでの１６時間
のための指定されたペプチド（２５のｌｌｇ／ｍｌ）を有する。そして、完全な
媒体の３７のＣでの３時間追加の。細胞は、それから３回洗われて、フルオレセ
イン・イソチオシアン酸塩−活用された反Ｄｂまたは反Ｋｂ抗体（ＰｈａｒＭｉ
ｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）で染色された。ラベルをつけられた細胞は、二
回洗われて、再懸濁されて、１％のパラホルムアルデヒドをもつＰＢＳの５００
のｐ１に取り付けられて、流れｃｙｔｏｍｅｔｅｒのｆｌｕｏｒｅｓ ｃｅｎｃ
ｅ強度のために分析された（Ｂｅｃｔｏｎ−ディキンソンＦＡＣＳＣａｌｉｂｕ
ｒ（Ｄ）。Ｄｂの増加またはＲＭＡ−Ｓ細胞の表面上のＫｂ分子のパーセンテー
ジは、単独で媒体で培養される細胞のそれと比較して、ペプチドにより培養され
る細胞の増加する中間の蛍光性の強度で測定された。
【０４０９】 マウスは、ネズミ・クラスに縛ることができるペプチドによって、免疫にされ
たＭＨＣ Ｉ免疫に続いて、脾臓細胞は、ｖｉｔｒｏにおいて、刺激されて、Ｗ
Ｔ１ペプチドにより培養される目標を溶解させる能力を見つけるため検査された
。ＣＴＬは、標準のクロミウム・リリース分析評価、チェンほか、１９９４によ
り評価された。１０６の目標細胞は、１５０を有する３７のＣで培養された｝１
Ｃｉの、特定のペプチドの有無において、９０分間ナトリウム５’Ｃｒ。細胞は
、３回洗われて、胎児のウシ５％の血清を有するＲＰＭＩの中に再懸濁された。
分析評価のための、１０４の５’Ｃｒ−ラベルをつけられた目標細胞が２００の
ｕの最終的な体積の効果器細胞の異なる濃度により培養されたこと。Ｕ−底を付
けられた９６−ウェルプレートのｌ。上澄みは３７Ｃで４−７つの時間以後除去
された、そして、パーセンテージ特定の渙散は式により決定された： ％具体的な渙散＝ １００ ｘ（実験的なリリース−自然発生的なリリース）／
（最大のリリース−自然発生的なリリース）。
【０４１０】 結果（表４８において、示される）は、若干のＷＴ１ペプチドがクラスに縛る
ことができることを示すＩＭＨＣ ＣＴＬ．を生成することにとって重要である
分子さらに、ペプチドのいくつかは、決定された使用しているクロミウム・リリ
ースとしての特定のＣＴＬ（図６Ａおよび図６Ｂ）が分析するペプチドを引き出
すことが可能であった。ＣＴＬペプチドｐｌＯ−１８人の人間、ｐｌ３６−１４
４人の人間、ｐｌ３６−１４４匹のマウスおよびｐ２３５−２４３に免疫に続い
て、ペプチド特定のＣＴＬ線は発生した、そして、クローンは決められた。これ
らの結果は、ペプチド特定のＣＴＬがＷＴ１を表している悪性の細胞を殺すこと
ができることを示す。
【０４１１】
【表４８】 （５．５ 実施例５−マウスにおけるＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発するためのＷ
Ｔ１ペプチドの使用） この実施例は、ＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺すことができるＣＴＬ免疫を誘発する
ために代表的なＷＴ１ペプチドの能力を例示する。
【０４１２】 Ｐ１１７−１３９、縛ることに適当なモティーフを有するペプチド、クラス、
予言を結合しているペプチドが分析するＴＳＩＴＥＳおよびＢＩＭＡＳ ＨＬＡ
を使用して、ＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣは上記の通りに識別された。マウスは
、実施例３にて説明したように、免疫にされた。免疫に続いて、脾臓細胞は、ｖ
ｉｔｒｏにおいて、刺激されて、ＷＴ１ペプチド（ＷＴ１正や負腫瘍細胞と同様
に）により培養される目標を溶解させる能力を見つけるため検査された。ＣＴＬ
は、標準のクロミウム・リリース分析評価により評価された。結果（図７Ａ、図
７Ｂ、図７Ｃおよび図７Ｄにおいて、示される）はＰＩ １７がＷＴ１陽腫瘍細
胞を殺すことができるＷＴ１特定のＣＴＬを引き出すことができることを示すの
に、ＷＴ１否定の細胞の殺害は観察されなかった。これらの結果はペプチド特定
のＣＴＬが事実ＷＴ１を表している悪性の細胞を殺すことを証明する。そして、
そのワクチンおよびＴ細胞療法はＷＴ１を表す悪性に対して効果的である。
【０４１３】 類似した免疫は、ペプチドｐｌ３６−１４４を結合している９ｍｅｒ ｃｌａ
ｓｓ−Ｉ ＭＨＣ、ｐ２２５−２３３、２３ｍｅｒペプチドと同じｐ２３５−２
４３、ｐｌ １７−１３９を使用して実行された。免疫に続いて、脾臓細胞は、
各々の４つのペプチドを有するｖｉｔｒｏにおいて、刺激されて、ＷＴ１ペプチ
ドにより培養される目標を溶解させる能力を見つけるため検査された。ＣＴＬは
、π３６−１４４、ｐ２３５−２４３および、ｐ２２５−２３３以外のために以
外、ｐ１１７−１３９のための生成された特性であった。ｐ２３５−２４３およ
びπ１７−１３９のためのＣＴＬデータはペプチドｐ１３６−１４４のための図
８Ａて図８Ｂ． データにおいて、示される。そして、ｐ２２５−２３３は表さ
れない。
【０４１４】 ＣＴＬ渙散は、目標ＷＴ１ペプチドがｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙに処理されて
、腫瘍細胞クラスに関連して示されると迫るＩＭＨＣ分子。上記のＷＴ１ペプチ
ド特定のＣＴＬは、否定の腫瘍細胞系対ＷＴ１肯定を溶解させる能力を見つける
ため検査された。
【０４１５】 ｐ２３５−２４３の溶解する目標に固有なＣＴＬは、ｐ２３５−２４３のペプ
チドによって、卵を抱くが、ＷＴ１タンパク質（図８Ａ）を表した細胞系を溶解
させることに失敗した。著しい対照によって、ｐｕ １７−１３９の溶解する目
標に固有なＣＴＬは、π１７−１３の９つのペプチドによって、卵を抱いて、更
にＷＴ１（図８Ｂ）を表している悪性の細胞を溶解させた。否定の制御として、
ｐ１１７−１３９に固有なＣＴＬは、ＷＴ１否定のＥＬ−４（また、本願明細書
において、Ｅ１０と称されて）を溶解させなかった。
【０４１６】 ＷＴ１特定の渙散の特性は、冷たい目標抑制（図９Ａおよび図９Ｂ）によって
、確かめられた。効果器細胞は、さまざまな効果器のためにメッキをされた： ９６−ウェルＵ−の目標比率は、プレートに底を付ける。１０−折り目は、５’
Ｃｒのない示されたペプチド−ｃｏａｔｅｄされた目標の中で、ラベルをつける
ことを休職させる（熱い目標と比較して）加えた。最後に、ウェルにつき１０４
５’Ｃｒのラベルが付いた目標細胞は加えられた、そして、プレートは４時間の
ための３７Ｃで卵が孵化された。ウェルにつき総体積は、１７−１３９の特定の
ＣＴＬが、無関係なペプチド（図９Ａ）により培養されるＥＬ−４以外について
は以外、関連したペプチドｐｌｌ７−１３９により培養されるＥＬ４によって、
３６％まで５８％遮断されたｐ１によるＴＲＡＭＰ−Ｃの２００ｆｆｉ Ｌｙｓ
ｉｓであった。同様に、ＢＬＫ−ＳＶ４０の渙散は、関連したペプチドｐｌｌ７
−１３９（図９Ｂ）により培養されるＥＬ−４によって、１８％から０％まで遮
断された。結果は、特定のＣＴＬが具体的には、認識によって、悪性の細胞を殺
すＷＴ１ペプチドがＷＴ１を処理したことを確認する。
【０４１７】 推定のＣＴＬモティーフを有するいくつかの部分は、ｐｌｌ７−１３９の範囲
内で含まれる。 ＣＴＬエピトープの正確な配列を決定するために、π１７−１３９の範囲内の全
ての潜在的な９ｍｅｒペプチドは、合成された（表４９）。これらのペプチド（
ｐｌ２６−１３４およびｐ１３０−１３８）のうちの２つは、Ｈ−２つのクラス
に縛ることを示したＩ分子（表４９）。ｐｌｕ７−１３９（図１０Ａ）の範囲内
の他の９ｍｅｒペプチド以外でない、ｐｌｌ７−１３９の溶解する目標を有する
免疫によって、発生するＣＴＬは、ｐｌ２６−１３４およびｐ１３０−１３８に
よって、卵を抱いた。
【０４１８】 ｐｌ １７−１３９本の特定のＣＴＬ線は、いずれのｐｌ２６−１３４もまた
はｐ１３０−１３８によって、再刺激された。
【０４１９】 再刺激にｐｌ２６−１３４またはｐ１３０−１３８を付け加えて、両方のＴ細
胞系はペプチド特定の渙散を示した、しかし、ｐｌ３０−１３８の特定のＣＴＬ
だけはＷＴ１陽腫瘍細胞系（図１ ＯＢおよび図１ ＯＣ）の渙散を示した。こ
のように、ｐａｌ３０−１３８は自然に被処理エピトープであるように見える。
【０４２０】
【表４９】 この実施例は、細胞および細胞系にＷＴ１特定のｍＲＮＡを認めるためにＲＴ
−ＰＣＲＴＭの使用を例示する。
【０４２１】 ＷＴ１特定のｍＲＮＡの存在のためのＲＴ−ＰＣＲにより分析されるまで、Ｍ
ｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ細胞は密度勾配遠心分離により分離されて、直ちに凍って
、ａｔ−８０ Ｃを格納した。Ｆｒａｉｚｅｒその他（１９９５）により記載さ
れているように、ＲＴ−ＰＣＲは一般に実行された。全体のＲＮＡは、標準の手
順に従う１０’細胞から抽出された。ＲＮＡペレットが、ジエチルプロピルカル
ボネート２５Ｌの水の中に再懸濁されて、逆のコピーのために直接使われた。亜
鉛−指領域（１０に対するエクソン７）は、３３０ｂｐマウスｃＤＮＡとして、
ＰＣＲにより拡大された。
【０４２２】 拡大は、１の間のｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒまたは必要なときにＰＣＲＴＭの
２連続したラウンドにおいて、実行された。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌ
ｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｅｒｋｉｎエルマー鯨座、ノーウォーク、ＣＴ）（２）。５
ｍＭのＭｇＣｌ２、そして、５０のｕの総反応体積の各々の下塗りの２０ ｐｍ
ｏｌ。ｌが、使われた。ＰＣＲＴＭ製品の２０ｐＬ約数は、エチジウム臭化物で
染色される２％のアガロース・ゲルに電気泳動にかけられた。ゲルは、ポラロイ
ド・フィルム（ポラロイド６６７、ポラロイド社、ハートフォードシア、イング
ランド）によって、写真を撮られた。クロス汚染に対する予防措置は、クウォッ
クおよびヒグチ（１９８９）の推薦に従ってとられた。否定の制御は、各々の実
験のｃＤＮＡの代わりに水を有するｃＤＮＡ−ａｎｄ ＰＣＲＴＭ−試薬混合を
含んだ。うその否定を避けるために、完全なＲＮＡおよび適切なｃＤＮＡ世代の
存在は、Ｐ−アクチン下塗りを使用している制御ＰＣＲＴＭによって、各々のサ
ンプルのために評価された。
【０４２３】 これらの下塗りで詳細に述べなかったサンプルは、分析から締め出された。
【０４２４】 マウス細胞系のＷＴ１の拡大のための下塗りは、以下の通りであったＰ１１５
：１４５８−１４７８ ：５’−ＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡＴＡ
−３』（前の下塗り；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）そして、Ｐ １１６：１７６
７１７８７ ：５’−ＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＧＧＡＣＣＡＡＴ−３』（下
塗りを逆転させる；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（イノウエほか（１９９６）；
Ｆｒａｉｚｅｒ ｅｔ ａＬ、１９９５）。
【０４２５】 制御反応において、使用されるベータＡｃｔｉｎ下塗りは、以下の通りであっ
た５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３』（下塗りを検出する
；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３） ；そして、５’−ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡ
ＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣ−３（アンチセンスの下塗り；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
４）人間のＷＴ１を拡大するのに用いられる下塗りは、以下から成る：ＰＩ １
７：９５４−９７４ ：５’−ＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡ−
３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）；そして、Ｐ１１８：１４３４−１４１４
：５’−ＧＡＧＡＧＴＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴ−３』（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：５）。入れ子にされたＲＴ−ＰＣＲのために、下塗りがあってもよい：
ＰＩ １９：１０２３−１０４３ ：５’−ＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧ
ＡＴＧＣＡ−３』（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）；そして、Ｐ１２０：１３４５
−１３６５ ：５’−ＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴ−３（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２７）。 表５０は、マウス腫瘍細胞系のＷＴ１ ＰＣＲＴＭ分析の結果を示す。表の範囲
内で５が第１のステップＲＴ−ＰＣＲＴＭの強いＷＴ１ ＰＣＲＴＭ拡大製品が
第１のステップＷＴ１ ＲＴ−ＰＣＲによって、検出可能であるＷＴ１拡大製品
がＷＴ１ ＲＴ−ＰＣＲＴＭの第２のステップだけで、検出可能である製品を示
す（＋）ことを示す（＋＋）ことを示す（＋＋＋）こと、そして、（−）、否定
のＷＴ１ ＰＣＲＴＭは、示す。
【０４２６】
【表５０】 （５．７ 実施例７−マウスにおけるＷＴ１免疫化の全身性の組織学的評価お
よび毒物学的効果の評価） この目的があるマウスのＷＴ１免疫の毒物的な効果は免疫性を分析する。そし
て、倍数のＷＴ１タンパク質免疫の潜在的な体系のｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇ
ｉｃａｌで毒物的な効果はマウスの滴定の一回分を盛る。
【０４２７】 ＷＴ１タンパク質をもつマウスの免疫のための実験的な計画は、表５１におい
て、概説される。
【０４２８】
【表５１】 雌のＣ５７／Ｂ６マウスの多数の服用滴定研究（２５ｐｇ（ｌＯＯＯｕ． ｇ
ＷＴ１タンパク質にｌＯＯｐｇな）から変動している服用）の２人のＲａｌ２
−ＷＴｌ ＋ ＭＰＬ−ＳＥ（助手としてＭＰＬ−ＳＥを使用しているＷＴ１タ
ンパク質に対する３ｘ １０００のｉｇ ４つのＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）は、
強いＷＴ１に特有の抗体反応（図１９）および細胞Ｔ細胞反応（図２０）を引き
出した。
【０４２９】 ＷＴ１タンパク質を有する免疫の体系のｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ
であるか毒物的な効果は、観察されなかった。毒性の組織学の証拠は、以下の組
織に示さなかった：副腎、脳、盲腸、コロン、十二指腸、目、大腿骨および髄は
、膀胱、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉頭、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、食
道、卵巣、すい臓、副甲状腺、唾液の腺、胸骨および髄（脾臓）をすりむく胃、
胸腺、気管、甲状腺、膀胱および子宮。
【０４３０】 特別な強調は、潜在的な血液生成毒性の評価の上に置かれた。胸骨および大腿
骨髄の骨髄／赤血球比率は、通常であった。全ての評価可能な血球は計数する。
そして、血液化学（ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリ
ン）は通常の範囲の中であった。
【０４３１】 ＷＴ１に対するその現存する免疫が白血病をもつ一部の患者に存在する。そし
て、ＷＴ１タンパク質に対するその予防接種が通常の組織に毒性のないマウスの
ＷＴＩに特有のＡｂおよび細胞Ｔ細胞反応を誘発できると仮定すると、これらの
実験は腫瘍／白血病ワクチンとしてＷＴ１を確認する。
【０４３２】 （５．８ 実施例８−全遺伝子のインビトロプライミングによるヒトＷＴ１特
異的Ｔ細胞応答の誘導） この実施例は、ＷＴ１特定のＴ細胞反応が通常の個人の血液から発生できるこ
とを証明する。
【０４３３】 樹状突起の細胞（ＤＣ）は、人間の１０％の血清、５０のｎｇ／ｍｌのＧＭＣ
ＳＦおよび３０のｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を含んでいるＲＰＭＩ媒体の４−１０の
日の間の成長によって、通常の提供者のＰＢＭＣに由来する単球培養と差別化さ
れた。あとに続くことは、培養する、ＤＣは１Ｍ．、１６時間、牛痘ウイルスを
ＷＴ１−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇしている再結合物に感染したＯ． Ｉ． ５のま
たはＭ． Ｏ．でアデノウイルスをＷＴｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇしている再結
合物を有する３つの日のためのＩ． １０の。Ｖａｃｃｉｎａウイルスは、Ｕ．
Ｖ．照射によって、機能させなくされた。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は磁気ビーズを使
用している明確な選択により分離された、そして、雷管取付け培養は９６−ウェ
ルプレートにおいて、始められた。培養は、自己の樹状突起の細胞を使用してい
る再刺激された７−１０の日ごとであったアデノ、または、ＷＴ１．を表すため
に感染する牛痘３−６つの刺激サイクルに続いて、樹状突起の細胞または線維芽
細胞をａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ−ＷＴｌ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇすると共に刺激さ
れるときに、ＣＤ８＋線は識別された非常に特に生成されたｉｎｔｅｒｆｅｒｏ
ｎｇａｍｍａでありえた。これらの線のＷＴ１に特有の活動は、維持された以下
の追加の刺激サイクルでありえた。これらの線は、具体的には、誓約書を出すた
めに示されたアデノ、または、自己の樹状突起の細胞を感染する牛痘ＷＴ１アデ
ノ、または、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析評価による牛痘ＥＧＦＰ−感染する自己の樹状
突起の細胞。
【０４３４】 （５．９ 実施例９−−注入のためのＲＡ１２−ＷＴ１の処方：凍結乾燥産物
を安定化するために賦形剤の使用） この実施例は、凍結乾燥されたＲａｌ２−ＷＴ１の完全な可溶化を許す処方物
を記載する。
【０４３５】 以下の処方物は、再結合物タンパク質Ｒａｌ２−ＷＴｌがそっけなさにｌｙｏ
ｐｈｙｌｉｚｅｄされた後に水の媒体に分解されるのを許した： 再結合物Ｒａｌ２−ＷＴｌ集中：０．５−１．０のｍｇ／ｍｌ；バッファ：１０
−２０のｍＭ Ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ（ｐＨ １０）。０ ；１．０−５．
０ｍＭのＣｙｓｔｅｉｎｅ；０．０５ ％ Ｔｗｅｅｎ−８０（Ｐｏｌｙｓｏｒ
ｂａｔｅ−８０）；糖：１０％ １０％のＴｒｅｈａｌｏｓｅ（Ｔ５２５１、Ｓ
ｉｇｍａ、ＭＯ）Ｍａｌｔｏｓｅ １０％（Ｍ９１７１、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）１
０％のＳｕｃｒｏｓｅ（Ｓ７９０３、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）Ｆｒｕｃｔｏｓｅ（Ｆ
２５４３、Ｓｉｇｍａ、ＭＯ）１０％のＧｌｕｃｏｓｅ（Ｇ７５２８、Ｓｉｇｍ
ａ、ＭＯ）。
【０４３６】 糖賦形剤を有する凍結乾燥されたタンパク質が、糖賦形剤なしでよりかなり溶
解するとわかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥように染色されるＣｏｏｍａｓｓｉｅによ
る分析は、溶かされた材料の残留する固体のサインを示さなかった。
【０４３７】 （５．１０ 実施例１０−血液学的な悪性を有する患者におけるＷＴ１に対す
る免疫応答の同定） この実施例は、血液学的な悪性をもつ患者の現存する免疫反応の識別を例示す
る。
【０４３８】 ＷＴ１より先に存在することの存在を評価するために、患者、急性の骨髄性白
血病（ＡＭＬ）をもつ患者の血清、急性のｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃな白血病（Ａ
ＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および厳しい無形成性貧血の特定の抗体反
応は、西洋のしみ分析を使用して分析された。世羅は、ＷＴｌを人間の白血病の
細胞系Ｋ５６２（アメリカのＴｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から免疫沈降させる能力を見つけるため検査された
。各々のケースにおいて、免疫沈降はゲル電気泳動によって、切り離されて、膜
へ移されて、反ＷＴ−１つの抗体ＷＴ１８０（サンタクルーズＢｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ社、サンタクルーズ、ＣＡ）によって、徹底調査された。この西洋の
しみ分析は、血液学的な悪性をもつ患者の潜在的なＷＴ１特定の抗体を識別した
。忍耐強い血清を使用して発生する免疫沈降の５２ｋＤａタンパク質は、ＷＴｌ
特定の抗体により認識された。５２ｋＤａタンパク質は、明確な制御と同じサイ
ズで移った。
【０４３９】 追加の研究は、ＡＭＬをもつ患者および全身で切り詰めたＷＴ１タンパク質に
対する抗体の存在のためのＣＭＬの血清を分析した。ＣＤＮＡ構造物が人間のＷ
Ｔｌ／ｆｕｌｌ−長（ａａ １−４４９）を表して、（ＷＴｌ／Ｃ−終点）領域
がサブクローン化されたＮ−終点（ａａ １−２４９）（ＷＴｌ／Ｎ−終点）お
よびＣｔｅｒｍｉｎｕｉｓ（ａａ ２６７−４４９）は、ｐＥＴ２８ベクトルを
修正した。ＷＴｌ／ｆｕｌｌ−長てＷＴｌ／Ｎ−終点タンパク質は、Ｒａｌ２融
合タンパク質として表された。Ｒａｌ２は分泌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ結核タンパク質のＣ−ターミナル断片である。そして、ＭＴＢ３２Ｂとして示
される。（Ｓｋｅｉｋｙほか、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．、６７：３９９８，
１９９９）．Ｒａｌ２−ＷＴｌ／ｆｕｌｌ−長さ融合領域は、ヒスチジン−タ
グ修正されたｐＥＴ２８のヒスチジン−ｔａｇが一定方向に向けるクローンをつ
くられた３’ｔｏであった。チオレドキシン（ＴＲＸ）によって、従われる５’
ヒスチジン−タグを有する修正されたｐＥＴ２８ベクトルに、ＷＴｌ／Ｎ−終点
領域はサブクローン化された−、ＷＴｌ／Ｎ−終点融合領域は３’−ヒスチジン
−タグによって、あとに続いた。ＷＴｌ／Ｃ−終点符号化領域は５’ａｎｄ ３
’ヒスチジン−タグだけを含んでいる融合パートナーのない修正されたｐＥＴ２
８ベクトルにサブクローン化された。そして、トロンビンおよびＥＫサイトが続
いた。
【０４４０】 ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ラ・ホーヤ、ＣＡ）は
、３つのＷＴ１発現構造物によって、変わって、一晩育てられて、イソプロピル
−−Ｄ チオガラクトシダーゼ（ＩＰＴＧ）により誘導された。ＷＴ１タンパク
質は、次のように精製された：細胞は、収穫されて、ｌＯｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
８）のインキュベーションによって、溶解した。
【０４４１】 完全なプロテアーゼ抑制剤タブレットを有する０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ マンハイムＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナポリス、ＩＮ）３７分にＣ
が超音波処理の繰り返されたラウンドあとに続いたこと。封入体は、１０ｍＭの
Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８）によって、二回洗われた。０．タンパク質は、それからＳ
ｏｕｒｃｅ Ｑ陰イオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）上のクロマトグラフィが続くニッ
ケル−ニトリロ三酢酸樹脂（ＱＩＡＧＥＮ社、バレンシア、ＣＡ）の上の金属キ
レート類似性クロマトグラフィにより精製された。ＷＴ１タンパク質のアイデン
ティティは、Ｎ−ターミナル配列することによって、確かめられた。
【０４４２】 デノボＡＭＬまたはＣＭＬをもつ成人の患者からの世羅は、ＷＴ１特定のＡｂ
の存在のために研究された。再結合物タンパク質は、ＴＣ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ
プレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、デンマーク）に吸着された。プレート
は、ＰＢＳ／０によって、洗われた。５％のＴｗｅｅｎ−２０、そして、１％の
ＢＳＡ／ＰＢＳ／０により抑止される。１％のＴｗｅｅｎ−２０。洗った後に、
血清希薄は加えられた、そして、４つのＣ． Ｐｌａｔｅｓでの培養された前夜
は洗われた、そして、Ｄｏｎｋｅｙ抗人のＩｇＧ−ＨＲＰ第２の抗体は加えられ
（ジャクソン−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、西グローヴ、ＰＡ）て、室温で、２つの
時間間卵が孵化された。プレートは、洗われて、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
基板溶液、ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびペリーＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＭＡ
によって、卵が孵化されて、１つのＮ Ｈ２ＳＯ４によって、静まって、直ちに
読んだ（サイト・フルーア２３５０；ミリポア、ベッドフォード、ＭＡ）。
【０４４３】 血清学的な調査のために、人間の血清は、１から連続的希薄の範囲以上のＥＬ
ＩＳＡにより試験された：１に対する５０：２０， ０００．陽反応は、ＯＤ値
として定義された１：５００は、３つの、ＷＴ １／ｆｕｌｌ−長、ＷＴｌＣ−
終点標準偏差によって、通常の提供者（ｎ＝９６）から、血清の平均のＯＤ値を
上回った血清を薄めた。ＷＴｌ／Ｎ−終点プロテインＡに対する通常の提供者の
より高い背景のために、ＷＴｌ／Ｎ−終点に対する陽反応は、１のＯＤ値として
定義された：５００は、４つの標準偏差によって、通常の提供者から血清の平均
のＯＤ値を上回った血清を薄めた。忍耐強いＡｂ反応をＷＴ１にあてたことを確
かめて、Ｒａｌ２またはＴＲＸ融合に、タンパク質または可能な大腸菌汚濁物タ
ンパク質の中で分かれないために、制御はＲａｌ２を含んだ、そして、ＴＲＸ
プロテイン単独は類似した方法で浄化した。Ｒａｌ２および／またはＴＲＸタン
パク質に対して、反応性を示したサンプルは、分析から締め出された。
【０４４４】 ＷＴ１に免疫の存在のために評価するために、全身の再結合物に対するＡｂお
よび通常の個人の血清および白血病をもつ患者の切り詰めたＷＴ１タンパク質は
、決定された。抗体反応性は、ＷＴ１／ｆｕｌｌ−長タンパク質（ＷＴｌ／Ｎ−
終点プロテインＡｎｄ ＷＴｌ／Ｃ−終点タンパク質）に、ＥＬＩＳＡ反応性に
より分析された。
【０４４５】 ９６人の通常の提供者のうちの２人だけは、ＷＴｌ／ｆｕｌｌ−長タンパク質
によって、反動的な血清抗体を有した。それらの個人のうちの１人は、ＷＴｌ／
Ｎ−終点に対するプロテインＡｎｄ １がＷＴｌ／Ｃ−終点タンパク質に対する
抗体を有する効果があった。対照的に、ＡＭＬをもつ６３人の患者（２５％）の
うちの１６人は、ＷＴｌ／ｆｕｌｌ−長タンパク質によって、反動的な血清抗体
を有した。著しい対照によって、６３人の患者（３％）のうちの２人だけは、Ｗ
Ｔｌ／Ｃ−終点タンパク質に反応性を有した。ＣＭＬをもつ８１人の患者（１９
％）のうちの１５人は、ＷＴｌ／ｆｕｌｌ−長によって、反動的な血清８１人の
患者（１５％）のプロテインＡｎｄ １２がＷＴｌ／Ｎ−終点によって、反動的
な血清抗体を有する効果があった。８１人の患者（３％）のうちの３人だけは、
ＷＴｌ／Ｃ−終点タンパク質に反応性を有した。
【０４４６】 これらのデータは、ＷＴ１へのＡｂ反応がＡＭＬおよびＣＭＬをもつ一部の患
者において、検出可能なことを証明した。白血病患者の抗体のより大きい発生率
は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫がＷＴ１を表すかまたは若干の時間に表した
悪性を運んでいる患者の結果として、起こったという強い証拠を提供する。特定
の理論に限られていずに、ＷＴ１への観察された抗体反応がきっと彼ら自身の白
血病細胞上のＷＴ１に免疫性になっている患者から生じて、ＷＴ１がａｓｅｌｆ
’タンパク質であることにもかかわらず免疫原性でありえる直接証拠を提供する
と考えられる。
【０４４７】 ＷＴ１に対する抗体の存在は、並列のヘルパーＴ細胞反応がまた、同じ患者に
存在することを強く意味する。ＷＴ１は、内部タンパク質である。このように、
ＣＴＬ反応は、白血病療法に関して最も効果的であるものおよび免疫の最も有毒
な腕でありそうである。このように、これらのデータは、ＷＴ１に向けられる治
療的なワクチンがＷＴ１に免疫反応を引き出すことが可能であるという証拠を提
供する。
【０４４８】 患者の小さいサブグループだけがＣ終点への弱い抗体反応を示すと共に、検出
される大多数の抗体はＮ終点の中でエピトープによって、反動的であった。これ
は動物のモデルの観察と整合している。ここで、Ｎ−終点に由来するペプチドを
有する免疫は抗体、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬ反応を誘発したのに、Ｃ−終点
から試験されるペプチドのどれも抗体またはＴ細胞反応、Ｇａｉｇｅｒほか、２
０００を誘発しなかった。
【０４４９】 （６． 参考文献） 以下の参考文献は、これらの参考文献が、本明細書中に示される参考文献のセ
ットを補完する例示的な手順または他の説明を提供する範囲まで、本明細書中で
参考として特に援用される。
【０４５０】
【表５２】 組成物の全ておよび開示されて、本願明細書において、請求される方法は、作
られることができて、現在の開示を考慮して過度の実験なしで実行されることが
できる。組成物および本発明の方法が好適な実施例に関して記載されると共に、
バリエーションが組成物に適用されることができることは従来技術において、技
術のそれらにとって明らかで、方法、そして、工程のまたは概念（本発明の精神
と範囲）から逸脱することなく、本願明細書において、記載されている方法のス
テップの配列の。より具体的には、同じであるか類似した結果が成し遂げられる
と共に、化学的に、そして、生理的に関する特定のエージェントが本願明細書に
おいて、記載されているエージェントと置換されることができることは、明らか
である。類似したそのような人々は代理をする。そして、当業者にとって明らか
な変更態様は趣旨の範囲内であるために添付の請求項に記載の本発明の範囲およ
び概念とみなされる。したがって、特許権を得ようとする独占権は、添付の特許
請求の範囲にて説明したようである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マウス（ＭＯ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０）および人間の（ＨＵ
）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１９）ＷＴ１ペプチド・配列の比較を表す。
【図２】 図２は、悪性の中皮腫患者にＷＴ１−特定の抗体を認めるためにＥＬＩＳＡ分
析評価の結果を示している棒グラフを表す。示されるように、ＷＴ１８０および
ＷＴＣ１９は明確な制御を表す。Ｄ４４は通常の制御血清を表す、そして、残留
するサンプルは悪性の中皮腫で苦しめられる人間の患者から得られる血清サンプ
ルであった。
【図３Ａ】 図３Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスの増殖的な
Ｔ細胞反応の刺激を例示しているグラフを表す。チミジン編入分析評価は示され
るように、１Ｔの細胞系および２台の異なるクローンを使用して実行された、そ
して、結果はｃｐｍとして表された。Ｘ軸に示される制御は、抗原（Ａｇでない
）でないおよびＢ６／ｍｅｄｉａであった；使用する抗原は、ｐ６−２２人の人
間（ｐｌ）、ｐｌｌ７−１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２人の人間（ｐ３
）であった。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスの増殖的な
Ｔ細胞反応の刺激を例示しているグラフを表す。チミジン編入分析評価は示され
るように、１Ｔの細胞系および２台の異なるクローンを使用して実行された、そ
して、結果はｃｐｍとして表された。Ｘ軸に示される制御は、抗原（Ａｇでない
）でないおよびＢ６／ｍｅｄｉａであった；使用する抗原は、ｐ６−２２人の人
間（ｐｌ）、ｐｌｌ７−１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２人の人間（ｐ３
）であった。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスの増殖的な
Ｔ細胞反応の刺激を例示しているグラフを表す。チミジン編入分析評価は示され
るように、１Ｔの細胞系および２台の異なるクローンを使用して実行された、そ
して、結果はｃｐｍとして表された。Ｘ軸に示される制御は、抗原（Ａｇでない
）でないおよびＢ６／ｍｅｄｉａであった；使用する抗原は、ｐ６−２２人の人
間（ｐｌ）、ｐｌｌ７−１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２人の人間（ｐ３
）であった。
【図４Ａ】 図４Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスの増殖的な
Ｔ細胞反応の刺激を例示している棒グラフを示す。第３の免疫、Ｖａｃｃｉｎｅ
Ａを接種されたマウスの脾臓細胞またはＶａｃｃｉｎｅ Ｂが一人の（媒体）
媒体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）、Ｂ６脾臓
細胞がペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ １１７−１３９（ｐ １１７）、ｐ２
４４−２６２（ｐ２４４）によって、パルスして、３週、（ワクチンのＡ；図４
Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ
４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンのＢ；図４Ｂ）、そして、細胞が２５の
Ｊ．ゲルでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって、律動的に送
って、チミジン編入によって、増殖のための９６時間分析された（３Ｈ）脾臓。
棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原のないＢ６脾
臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算出される。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドによって、免疫にされるマウスの増殖的な
Ｔ細胞反応の刺激を例示している棒グラフを示す。第３の免疫、Ｖａｃｃｉｎｅ
Ａを接種されたマウスの脾臓細胞またはＶａｃｃｉｎｅ Ｂが一人の（媒体）
媒体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）、Ｂ６脾臓
細胞がペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ １１７−１３９（ｐ １１７）、ｐ２
４４−２６２（ｐ２４４）によって、パルスして、３週、（ワクチンのＡ；図４
Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ２９９）、ｐ
４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンのＢ；図４Ｂ）、そして、細胞が２５の
Ｊ．ゲルでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって、律動的に送
って、チミジン編入によって、増殖のための９６時間分析された（３Ｈ）脾臓。
棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原のないＢ６脾
臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算出される。
【図５Ａ】 図５Ａは、増殖的なＴ−細胞系の生成およびｐｌ １７−１３９およびｐ６−
２２に固有なクローンを例示している棒グラフである。活発な免疫法であとに続
いて、最初の３つの試験管内の刺激（ＩＶＳ）は、それぞれ、Ｖａｃｃｉｎｅ
ＡまたはＢの全ての３つのペプチドを使用して、実行された。次のＩＶＳは、２
つの関連したペプチドπ１７−１３９およびｐ６−２２だけを使用している一つ
のペプチド刺激として、実行された。示されるように、クローンはｐ６−２２お
よびｐｌｉ７−１３９の特定のＴ細胞系に由来した。Ｔ細胞は一人の（媒体）媒
体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）。そして、Ｂ
６脾臓細胞はペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）また
は２５のｓｓｇｌｍｌでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって
、パルスして、チミジン編入によって、増殖のための９６時間の後、分析された
（３Ｈ）。棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原の
ないＢ６脾臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算
出される。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、増殖的なＴ−細胞系の生成およびｐｌ １７−１３９およびｐ６−
２２に固有なクローンを例示している棒グラフである。活発な免疫法であとに続
いて、最初の３つの試験管内の刺激（ＩＶＳ）は、それぞれ、Ｖａｃｃｉｎｅ
ＡまたはＢの全ての３つのペプチドを使用して、実行された。次のＩＶＳは、２
つの関連したペプチドπ１７−１３９およびｐ６−２２だけを使用している一つ
のペプチド刺激として、実行された。示されるように、クローンはｐ６−２２お
よびｐｌｉ７−１３９の特定のＴ細胞系に由来した。Ｔ細胞は一人の（媒体）媒
体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）。そして、Ｂ
６脾臓細胞はペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）また
は２５のｓｓｇｌｍｌでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって
、パルスして、チミジン編入によって、増殖のための９６時間の後、分析された
（３Ｈ）。棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原の
ないＢ６脾臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算
出される。
【図５Ｃ】 図５Ｃは、増殖的なＴ−細胞系の生成およびｐｌ １７−１３９およびｐ６−
２２に固有なクローンを例示している棒グラフである。活発な免疫法であとに続
いて、最初の３つの試験管内の刺激（ＩＶＳ）は、それぞれ、Ｖａｃｃｉｎｅ
ＡまたはＢの全ての３つのペプチドを使用して、実行された。次のＩＶＳは、２
つの関連したペプチドπ１７−１３９およびｐ６−２２だけを使用している一つ
のペプチド刺激として、実行された。示されるように、クローンはｐ６−２２お
よびｐｌｉ７−１３９の特定のＴ細胞系に由来した。Ｔ細胞は一人の（媒体）媒
体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）。そして、Ｂ
６脾臓細胞はペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）また
は２５のｓｓｇｌｍｌでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって
、パルスして、チミジン編入によって、増殖のための９６時間の後、分析された
（３Ｈ）。棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原の
ないＢ６脾臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算
出される。
【図５Ｄ】 図５Ｄは、増殖的なＴ−細胞系の生成およびｐｌ １７−１３９およびｐ６−
２２に固有なクローンを例示している棒グラフである。活発な免疫法であとに続
いて、最初の３つの試験管内の刺激（ＩＶＳ）は、それぞれ、Ｖａｃｃｉｎｅ
ＡまたはＢの全ての３つのペプチドを使用して、実行された。次のＩＶＳは、２
つの関連したペプチドπ１７−１３９およびｐ６−２２だけを使用している一つ
のペプチド刺激として、実行された。示されるように、クローンはｐ６−２２お
よびｐｌｉ７−１３９の特定のＴ細胞系に由来した。Ｔ細胞は一人の（媒体）媒
体または脾臓細胞で培養されて、中間である（Ｂ６／抗原でない）。そして、Ｂ
６脾臓細胞はペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）また
は２５のｓｓｇｌｍｌでの無関係な制御ペプチド（無関係なペプチド）によって
、パルスして、チミジン編入によって、増殖のための９６時間の後、分析された
（３Ｈ）。棒は刺激インデックス（ＳＩ）を表す。そして、それは制御（抗原の
ないＢ６脾臓細胞）の中間によって、分けられる実験的なウェルの中間として算
出される。
【図６Ａ】 図６Ａは、マウスのペプチドに特有のＣＴＬがＷＴ１ペプチドによって、免疫
にしたＷＴ１の引き出すことを例示しているグラフである。図６Ａが、異系な細
胞系による目標細胞および図６Ｂの渙散を例示するは、ペプチドおおわれている
細胞系の渙散である。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリ
ース分析評価によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を
目標とする。結果は、提供されたリンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）（Ｅ
１０ ＋ ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）と同様に）である。Ｅ１０細
胞は、また、本願明細書において、ＥＬ−４細胞と称される。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、マウスのペプチドに特有のＣＴＬがＷＴ１ペプチドによって、免疫
にしたＷＴ１の引き出すことを例示しているグラフである。図６Ａが、異系な細
胞系による目標細胞および図６Ｂの渙散を例示するは、ペプチドおおわれている
細胞系の渙散である。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリ
ース分析評価によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を
目標とする。結果は、提供されたリンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡおよびＥ１０）（Ｅ
１０ ＋ ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）と同様に）である。Ｅ１０細
胞は、また、本願明細書において、ＥＬ−４細胞と称される。
【図７Ａ】 図７ＡはＷＴ１特定のＣＴＬ（それはＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺すが、ＷＴ１否
定の細胞系を殺さない）の引き出すことを例示しているグラフである。そして、
ＷＴ１ペプチドＰ１１７をもつＢ６マウスの予防接種に続く。図７Ａは、非免疫
にされたＢ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺さないことをである。図
７Ｂは、異系な細胞系による目標細胞の渙散である。２つの異なる研究のＷＴ１
否定の細胞系と比較すると、図７Ｃおよび図７ＤはＷＴ１陽腫瘍細胞系の渙散を
示す。加えて、図７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドｃｏａｔｅｄされた細胞系（否
定の細胞系Ｅ１０が関連したＷＴ１ペプチドＰｕ１７でおおったＷＴ１）の渙散
を示す。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリース分析評価
によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を目標とする。
結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、変わる
線維芽細胞細胞系（ＢＬＫ−ＳＶ４０）（Ｅ１０＋ｐｌ １７と同様に）のため
に提供される。
【図７Ｂ】 図７ＢはＷＴ１特定のＣＴＬ（それはＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺すが、ＷＴ１否
定の細胞系を殺さない）の引き出すことを例示しているグラフである。そして、
ＷＴ１ペプチドＰ１１７をもつＢ６マウスの予防接種に続く。図７Ａは、非免疫
にされたＢ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺さないことをである。図
７Ｂは、異系な細胞系による目標細胞の渙散である。２つの異なる研究のＷＴ１
否定の細胞系と比較すると、図７Ｃおよび図７ＤはＷＴ１陽腫瘍細胞系の渙散を
示す。加えて、図７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドｃｏａｔｅｄされた細胞系（否
定の細胞系Ｅ１０が関連したＷＴ１ペプチドＰｕ１７でおおったＷＴ１）の渙散
を示す。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリース分析評価
によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を目標とする。
結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、変わる
線維芽細胞細胞系（ＢＬＫ−ＳＶ４０）（Ｅ１０＋ｐｌ １７と同様に）のため
に提供される。
【図７Ｃ】 図７ＣはＷＴ１特定のＣＴＬ（それはＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺すが、ＷＴ１否
定の細胞系を殺さない）の引き出すことを例示しているグラフである。そして、
ＷＴ１ペプチドＰ１１７をもつＢ６マウスの予防接種に続く。図７Ａは、非免疫
にされたＢ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺さないことをである。図
７Ｂは、異系な細胞系による目標細胞の渙散である。２つの異なる研究のＷＴ１
否定の細胞系と比較すると、図７Ｃおよび図７ＤはＷＴ１陽腫瘍細胞系の渙散を
示す。加えて、図７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドｃｏａｔｅｄされた細胞系（否
定の細胞系Ｅ１０が関連したＷＴ１ペプチドＰｕ１７でおおったＷＴ１）の渙散
を示す。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリース分析評価
によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を目標とする。
結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、変わる
線維芽細胞細胞系（ＢＬＫ−ＳＶ４０）（Ｅ１０＋ｐｌ １７と同様に）のため
に提供される。
【図７Ｄ】 図７ＤはＷＴ１特定のＣＴＬ（それはＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺すが、ＷＴ１否
定の細胞系を殺さない）の引き出すことを例示しているグラフである。そして、
ＷＴ１ペプチドＰ１１７をもつＢ６マウスの予防接種に続く。図７Ａは、非免疫
にされたＢ６マウスのＴ細胞がＷＴ１陽腫瘍細胞系を殺さないことをである。図
７Ｂは、異系な細胞系による目標細胞の渙散である。２つの異なる研究のＷＴ１
否定の細胞系と比較すると、図７Ｃおよび図７ＤはＷＴ１陽腫瘍細胞系の渙散を
示す。加えて、図７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドｃｏａｔｅｄされた細胞系（否
定の細胞系Ｅ１０が関連したＷＴ１ペプチドＰｕ１７でおおったＷＴ１）の渙散
を示す。各々のケースにおいて、％渙散（標準のクロミウム・リリース分析評価
によって、定まる）は、３人の指された実行者で示される：比率を目標とする。
結果は、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺ガン細胞（ＴＲＡＭＰ−Ｃ）、変わる
線維芽細胞細胞系（ＢＬＫ−ＳＶ４０）（Ｅ１０＋ｐｌ １７と同様に）のため
に提供される。
【図８Ａ】 図８Ａは、ＷＴ１陽腫瘍細胞を溶解させるために代表的なペプチドＰＩ １７
−１３９の特定のＣＴＬの能力を例示している棒グラフである。第３の免疫、ペ
プチドｐ２３５−２４３を接種されたマウスの脾臓細胞またはπ１７−１３ ９
の数週間後に３は、関連したペプチドを有するｖｉｔｒｏにおいて、刺激されて
、ＷＴ１正や負腫瘍細胞と同様にＷＴ１ペプチドにより培養される目標を溶解さ
せる能力を見つけるため検査された。棒は、クロミウム・リリースの特定の渙散
が分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにおいて、実行したことを表す：
２５のＴ比率：１．図８Ａは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定の
ＷＴ１に対するｐ２３５−２４３の特定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。Ｅ
Ｌ−４は、関連した（再刺激のためにと同様に免疫のために使われる）ペプチド
ｐ２３５−２４３（ＥＬ−４＋ｐ２３５）によって、パルスした；ＥＬ−４は、
無関係なペプチドｐｌｌ７−１３９（ＥＬ−４＋ｐｌｌ７）、ｐｌ２６−１３４
（ＥＬ−４＋ｐｌ２６）またはｐｌ３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐｌ３０）によっ
て、パルスした示されるように、ＷＴ１陽腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＢＬＫ−
ＳＶ４０、ポジティブなＷＴ１およびＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ポジテ
ィブなＷＴ１を、そして。図８Ｂは、ＥＬ−４に対してｐ１１７−１３９の特定
のＴ細胞系の細胞障害性活動を示す；ＥＬ−４は関連したペプチドＰＩ １７−
１３ ９（ＥＬ−４＋ｐｌｌ７）によって、パルスした、そして、ＥＬ−４は無
関係なペプチドｐｌ２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐｌ２３）またはｐｌ２８−１３
６（ＥＬ−４＋ｐｌ２８）によって、パルスした；ＢＬＫ−ＳＶ４０およびＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ示されるように。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、ＷＴ１陽腫瘍細胞を溶解させるために代表的なペプチドＰＩ １７
−１３９の特定のＣＴＬの能力を例示している棒グラフである。第３の免疫、ペ
プチドｐ２３５−２４３を接種されたマウスの脾臓細胞またはπ１７−１３ ９
の数週間後に３は、関連したペプチドを有するｖｉｔｒｏにおいて、刺激されて
、ＷＴ１正や負腫瘍細胞と同様にＷＴ１ペプチドにより培養される目標を溶解さ
せる能力を見つけるため検査された。棒は、クロミウム・リリースの特定の渙散
が分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにおいて、実行したことを表す：
２５のＴ比率：１．図８Ａは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定の
ＷＴ１に対するｐ２３５−２４３の特定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。Ｅ
Ｌ−４は、関連した（再刺激のためにと同様に免疫のために使われる）ペプチド
ｐ２３５−２４３（ＥＬ−４＋ｐ２３５）によって、パルスした；ＥＬ−４は、
無関係なペプチドｐｌｌ７−１３９（ＥＬ−４＋ｐｌｌ７）、ｐｌ２６−１３４
（ＥＬ−４＋ｐｌ２６）またはｐｌ３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐｌ３０）によっ
て、パルスした示されるように、ＷＴ１陽腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＢＬＫ−
ＳＶ４０、ポジティブなＷＴ１およびＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ポジテ
ィブなＷＴ１を、そして。図８Ｂは、ＥＬ−４に対してｐ１１７−１３９の特定
のＴ細胞系の細胞障害性活動を示す；ＥＬ−４は関連したペプチドＰＩ １７−
１３ ９（ＥＬ−４＋ｐｌｌ７）によって、パルスした、そして、ＥＬ−４は無
関係なペプチドｐｌ２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐｌ２３）またはｐｌ２８−１３
６（ＥＬ−４＋ｐｌ２８）によって、パルスした；ＢＬＫ−ＳＶ４０およびＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ示されるように。
【図９Ａ】 図９Ａは、示しとして冷たい目標抑制によって、ＷＴ１陽腫瘍細胞の渙散の特
性を例示している棒グラフである。棒は、クロミウム・リリースの特定の渙散が
分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにおいて、実行したことを表す：２
５のＴ比率：１。図９Ａは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定のＷ
Ｔ１に対するｐｌ １７−１３９の特定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。Ｗ
Ｔ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ポジティブなＷＴ１
；ｐ１１７−１３９の（ＴＲＡＭＰ−Ｃ １７の冷えた＋ｐｌ目標）ｗｉｔｈｏ
ｕｔＣｒラベルをつけているおよびＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞が５’Ｃｒのない無関係
なペプチドによって、律動的に送られるＥＬ−４によって、ラベルをつける（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ ＋無関係な冷えた目標）ことを培養した関連したペプチドによっ
て、ＥＬ−４細胞の１０倍の過剰（熱い目標と比較して）により培養されるＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ細胞はパルスした。そして、そのことは指示した。図９Ｂは、ＷＴ１
否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定のＷＴ１に対するｐｌｉ７−１３９の特
定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。ＷＴ１陽腫瘍細胞系ＢＬＫ−ＳＶ４０、
ＢＬＫ−ＳＶ４０、ポジティブなＷＴ１；ＢＬＫ−ＳＶ４０細胞は関連した冷え
た目標（ＢＬＫ−ＳＶ４０ ＋ ｐｌｌ７冷えた目標）によって、卵が孵化され
た、そして、ＢＬＫ−ＳＶ４０細胞は無関係な冷えた目標（ＢＬＫ−ＳＶ４０
＋無関係な冷えた目標）によって、卵が孵化された。そして、そのことは指示し
た。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、示しとして冷たい目標抑制によって、ＷＴ１陽腫瘍細胞の渙散の特
性を例示している棒グラフである。棒は、クロミウム・リリースの特定の渙散が
分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにおいて、実行したことを表す：２
５のＴ比率：１。図９Ａは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定のＷ
Ｔ１に対するｐｌ １７−１３９の特定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。Ｗ
Ｔ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ポジティブなＷＴ１
；ｐ１１７−１３９の（ＴＲＡＭＰ−Ｃ １７の冷えた＋ｐｌ目標）ｗｉｔｈｏ
ｕｔＣｒラベルをつけているおよびＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞が５’Ｃｒのない無関係
なペプチドによって、律動的に送られるＥＬ−４によって、ラベルをつける（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ ＋無関係な冷えた目標）ことを培養した関連したペプチドによっ
て、ＥＬ−４細胞の１０倍の過剰（熱い目標と比較して）により培養されるＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ細胞はパルスした。そして、そのことは指示した。図９Ｂは、ＷＴ１
否定の細胞系ＥＬ−４、ＥＬ−４、否定のＷＴ１に対するｐｌｉ７−１３９の特
定のＴ細胞系の細胞障害性活動である。ＷＴ１陽腫瘍細胞系ＢＬＫ−ＳＶ４０、
ＢＬＫ−ＳＶ４０、ポジティブなＷＴ１；ＢＬＫ−ＳＶ４０細胞は関連した冷え
た目標（ＢＬＫ−ＳＶ４０ ＋ ｐｌｌ７冷えた目標）によって、卵が孵化され
た、そして、ＢＬＫ−ＳＶ４０細胞は無関係な冷えた目標（ＢＬＫ−ＳＶ４０
＋無関係な冷えた目標）によって、卵が孵化された。そして、そのことは指示し
た。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、π１７−１３９の範囲内でｎｏｎａペプチド ＣＴＬエピトープ
の評価を表す棒グラフである。特定のＣＴＬが線をひくｐｌ １７−１３９の腫
瘍は、適切なＨ−２ｂクラスを含んでいるかまたは欠いているａａ１１７−１３
９の範囲内で、ペプチドに対して試験されたＩモティーフを結合して、そして、
ｐｌ２６−１３４またはｐ１３０−１３８を有する再刺激を続く。棒は、クロミ
ウム・リリースの特定の渙散が分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにお
いて、実行したことを表す：２５のＴ比率：１．図１０Ａは、ｐｌ １７−１３
９の特定のＴ細胞が、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４（ＥＬ−４、否定のＷＴ１）
に対して、線をひく、そして、ＥＬ−４細胞が、ペプチドｐ１１７−１３９（Ｅ
Ｌ−４つの＋ ｐ １１７）、ｐ １１９−１２７（ＥＬ−４つの＋ ｐｌｌ９
）、ｐｌ２０−１２８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１２０）、ｐｌ２３−１３１（ＥＬ
−４つの＋ ｐｌ２３）、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２６）、ｐ
ｌ２８−１３６（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２８）およびｐｌ３０−１３８（ＥＬ−
４つの＋ ｐｌ３０）によって、律動的に送ったの細胞障害性活動である。図１
０Ｂは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、π１７−１３９（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ
ｌ７）によって、律動的に送られるＥＬ−４細胞、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４
つの＋ ｐｌ２６）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ−Ｃに対するｐ
ｌ２６−１３４を有する再刺激の後のＣＴＬ線の細胞障害性活動である。そして
、ＥＬ−４細胞は、ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４つの＋π１７）、ｐ１３０−１
３８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１３０）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ
−Ｃによって、パルスした。と、図１０ＣがＥＬ−４に対してｐｌ３０−１３８
を有する再刺激の後、ＣＴＬ線の細胞障害性活動に明らかにする。
【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、π１７−１３９の範囲内でｎｏｎａペプチド ＣＴＬエピトープ
の評価を表す棒グラフである。特定のＣＴＬが線をひくｐｌ １７−１３９の腫
瘍は、適切なＨ−２ｂクラスを含んでいるかまたは欠いているａａ１１７−１３
９の範囲内で、ペプチドに対して試験されたＩモティーフを結合して、そして、
ｐｌ２６−１３４またはｐ１３０−１３８を有する再刺激を続く。棒は、クロミ
ウム・リリースの特定の渙散が分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにお
いて、実行したことを表す：２５のＴ比率：１．図１０Ａは、ｐｌ １７−１３
９の特定のＴ細胞が、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４（ＥＬ−４、否定のＷＴ１）
に対して、線をひく、そして、ＥＬ−４細胞が、ペプチドｐ１１７−１３９（Ｅ
Ｌ−４つの＋ ｐ １１７）、ｐ １１９−１２７（ＥＬ−４つの＋ ｐｌｌ９
）、ｐｌ２０−１２８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１２０）、ｐｌ２３−１３１（ＥＬ
−４つの＋ ｐｌ２３）、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２６）、ｐ
ｌ２８−１３６（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２８）およびｐｌ３０−１３８（ＥＬ−
４つの＋ ｐｌ３０）によって、律動的に送ったの細胞障害性活動である。図１
０Ｂは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、π１７−１３９（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ
ｌ７）によって、律動的に送られるＥＬ−４細胞、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４
つの＋ ｐｌ２６）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ−Ｃに対するｐ
ｌ２６−１３４を有する再刺激の後のＣＴＬ線の細胞障害性活動である。そして
、ＥＬ−４細胞は、ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４つの＋π１７）、ｐ１３０−１
３８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１３０）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ
−Ｃによって、パルスした。と、図１０ＣがＥＬ−４に対してｐｌ３０−１３８
を有する再刺激の後、ＣＴＬ線の細胞障害性活動に明らかにする。
【図１０Ｃ】 図１０Ｃは、π１７−１３９の範囲内でｎｏｎａペプチド ＣＴＬエピトープ
の評価を表す棒グラフである。特定のＣＴＬが線をひくｐｌ １７−１３９の腫
瘍は、適切なＨ−２ｂクラスを含んでいるかまたは欠いているａａ１１７−１３
９の範囲内で、ペプチドに対して試験されたＩモティーフを結合して、そして、
ｐｌ２６−１３４またはｐ１３０−１３８を有する再刺激を続く。棒は、クロミ
ウム・リリースの特定の渙散が分析する卑しい％がＥを有する三つ組の一つにお
いて、実行したことを表す：２５のＴ比率：１．図１０Ａは、ｐｌ １７−１３
９の特定のＴ細胞が、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４（ＥＬ−４、否定のＷＴ１）
に対して、線をひく、そして、ＥＬ−４細胞が、ペプチドｐ１１７−１３９（Ｅ
Ｌ−４つの＋ ｐ １１７）、ｐ １１９−１２７（ＥＬ−４つの＋ ｐｌｌ９
）、ｐｌ２０−１２８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１２０）、ｐｌ２３−１３１（ＥＬ
−４つの＋ ｐｌ２３）、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２６）、ｐ
ｌ２８−１３６（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ２８）およびｐｌ３０−１３８（ＥＬ−
４つの＋ ｐｌ３０）によって、律動的に送ったの細胞障害性活動である。図１
０Ｂは、ＷＴ１否定の細胞系ＥＬ−４、π１７−１３９（ＥＬ−４つの＋ ｐｌ
ｌ７）によって、律動的に送られるＥＬ−４細胞、ｐｌ２６−１３４（ＥＬ−４
つの＋ ｐｌ２６）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ−Ｃに対するｐ
ｌ２６−１３４を有する再刺激の後のＣＴＬ線の細胞障害性活動である。そして
、ＥＬ−４細胞は、ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４つの＋π１７）、ｐ１３０−１
３８（ＥＬ−４つの＋ ｐ１３０）およびＷＴ１プラスの腫瘍細胞系ＴＲＡＭＰ
−Ｃによって、パルスした。と、図１０ＣがＥＬ−４に対してｐｌ３０−１３８
を有する再刺激の後、ＣＴＬ線の細胞障害性活動に明らかにする。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月９日（２００２．９．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 （１．発明の背景） 本出願は、２０００年２月２２日に出願した、米国仮特許出願第６０／１８４
，０７０号に対する優先権を主張する；この仮特許出願の、明細書の全体、特許
請求の範囲、および図面は、棄権することなく本明細書中で参考として援用され
る。本研究の一部を、米国保健社会福祉省からの基金（助成金番号ＳＢＩＲ Ｒ
４３ ＣＡ８１７５２）を一部介して行った。
【０００２】 （１．１ 発明の分野） 本発明は、一般的に、癌の診断および治療の分野に関する。より詳細には、本
発明は、中皮腫（特に、悪性の胸膜中皮腫）の検出および免疫治療のための組成
物および方法の驚くべき発見に関する。本発明は、ウィルムス腫瘍抗原ポリペプ
チド由来抗原性フラグメントに対する免疫応答およびＴ細胞応答を惹起する新規
の有効な方法、組成物、およびキット、ならびにヒト悪性胸膜中皮腫の診断、検
出、処置、モニタリング、および／または予防のためのこのような組成物の使用
のための方法を提供する。
【０００３】 （１．２ 関連技術の記載） （１．２．１ ウィルムス腫瘍抗原） ウィルムス腫瘍遺伝子は、核発現ポリペプチド（ＷＴ１と命名した）をコード
する。ＷＴ１は、ＤＮＡ結合転写因子の構造特性を有する。ＷＴ１は、選択的ス
プライシング改変体を有する。この改変体は、そのカルボキシ末端に、４つの連
続するジンクフィンガードメインを含む４２９アミノ酸ポリペプチド、およびそ
のアミノ末端にグルタミン／プロリンリッチ領域（これは、一過性トランスフェ
クションアッセイにおける転写抑制または活性化を媒介する）を含む。
【０００４】 ＷＴ１ペプチドの検出のための種々の診断試薬が存在する。これらの試薬とし
ては、ウサギポリクローナル血清（これは、野生型ＷＴ１ポリペプチドの大きな
内部アミノ酸フラグメントを特異的に認識する）を含む。市販のＷＴ１ポリクロ
ーナル抗体が存在するが、これらは、ポリクローナル血清としてのこれらの性質
に起因して、近縁のタンパク質との交叉反応を伴う特有の不利益、ならびに抗原
特異性研究および結合親和性研究における矛盾した結果を有する。従って、この
ような血清は、診断用途に特に望ましくなく、そしてＷＴ１ポリペプチドのイン
ビボ阻害のための治療薬の開発のために有用ではない。
【０００５】 市販のマウスモノクローナル抗体もまた報告されているが、これらの殆どは、
治療適用および診断適用に適切ではない。なぜならば、これらは、（ａ）特定の
固有のスプライシング改変体配列（これらは、選択的スプライシングＷＴ１ ｍ
ＲＮＡの亜集団のみで発現される）のみを認識するか；または（ｂ）相同である
が機能的に関連しないペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質と、広範に交
叉反応するかのいずれかを行うからである。
【０００６】 （１．２．２ 悪性中皮腫におけるＷＴ１ポリペプチドの検出） 悪性の胸膜中皮腫は、アスベストへの曝露により主に引き起こされる、増加し
ている一般的な癌である。アスベスト規制および改善した制御手段の実行の前に
、アスベスト塵に曝露された無数の労働者は、この疾患の危険性がある。さらに
、アスベスト材料が、修復、修理、または取り壊しの間に撹乱される場合、労働
者は、有意な量のアスベストに曝露され続ける。アスベスト含有材料は、米国中
の工業環境、商業環境、および住宅環境において見出され続けており、このこと
は、結果として、悪性の中皮腫の危険性が存在する相当数の集団を生じる。
【０００７】 悪性の中皮腫の予後は、疾患の段階に影響される。手術およびアジュバントの
免疫学的処置（例えば、インターフェロンまたはインターロイキン）は、有効な
処置であり得るが、初期の段階の診断の稀な事象においてのみ有効である。
【０００８】 （１．３ 先行技術の欠陥） 最新の癌治療に対する主な障害は、選択性（すなわち、正常細胞の機能に影響
せずに、癌細胞の増殖を阻害する能力）の問題である。残念なことに、殆どの中
皮腫患者は、進行した段階（この段階では、放射線も、化学療法も、多様式の処
置も、悪い予後を有意に変化させない）でのみ診断される。さらに、これらの患
者に対する標準となる有効な治療の欠如は、長期の生存の見込みをなくさせる（
Ｖｏｎ Ｂｕｌｔｚｉｎｇｓｌｏｗｅｎ，１９９９；Ｇｅｎｎａｒｏら、２００
０）。
【０００９】 しかし、悪性中皮腫に冒された患者についての悪い生存率は、より正確かつよ
り早い検出、ならびに過剰増殖する中皮腫細胞を選択的に阻害する改善された治
療を提供する診断方法により、大きく改善され得る。この必要性はまた、中皮腫
（詳細には、ヒト悪性胸膜中皮腫）の有効な処置レジメンに存在する。これは、
既存の治療の毒性の副作用を回避し、そして癌細胞における治療構築物のより特
異的な遺伝子発現を直接的に提供する。ヒト悪性胸膜中皮腫のための適切な処置
レジメンの開発は、腫瘍学の分野の当業者に有意な前進を提示し、そしてこの攻
撃的な癌についての改善された診断および治療様式を容易にする。
【００１０】 （２．発明の要旨） 本発明は、当該分野における、上記の長年にわたる切実な必要性および他の欠
陥を、ＷＴ１関連癌（詳細には、胸膜中皮腫）の診断、検出、予防、治療、およ
び免疫調節のための、新規かつ有効なストラテジーを確認することにより、取り
組む。本発明は、部分的に、驚くべきかつ予想外の発見に基づく。この発見は、
ウィルムス腫瘍（ＷＴ）遺伝子産物（例えば、ＷＴ１）の特定の抗原性ペプチド
フラグメントに対する免疫応答およびＴ細胞応答は、増加したＷＴ１遺伝子発現
により特徴付けられる１つ以上の悪性疾患（詳細には、ヒトの悪性胸膜中皮腫）
を有するか、この疾患を有する疑いがあるか、またはこの疾患を発症する危険性
のある動物に対する診断、予防、および／または治療のための有利な組成物およ
び方法を、特に提供し得る。ＷＴ１遺伝子は、当初は、ウィルムス腫瘍を有する
患者の染色体１１ｐ１３での細胞遺伝学的欠損の基準に基づいて、同定および単
離された（米国特許第５，３５０，８４０号）。この遺伝子は、１０のエキソン
からなり、そしてジンクフィンガー転写因子をコードする。マウスおよびヒトの
ＷＴ１ポリペプチドの配列（それぞれ、配列番号３１９および配列番号３２０）
を図１に提供する。
【００１１】 第１の実施形態では、本発明は、動物（詳細には、ヒトのような哺乳動物）に
おける免疫応答またはＴ細胞応答を生じる方法を提供する。この方法は、一般的
な意味では、動物に対する少なくとも第１の組成物（これは、少なくとも第１の
、９〜約６０アミノ酸長の単離されたペプチドを含む）、または少なくとも第１
の核酸セグメント（これはこのようなペプチドをコードする）の投与に関する。
ここで、このペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２
０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番
号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか
１つに従う、第１の連続するアミノ酸配列、ならびに、より詳細には、配列番号
２、配列番号３４、配列番号３５、配列番号４９、配列番号８８、配列番号１４
４、配列番号１４７、配列番号１８５、配列番号１９８、配列番号１９９、配列
番号２５５、配列番号２８２、配列番号２８３、および配列番号２９３（これら
は特に好ましい）に開示される１つ以上の一次アミノ酸配列を含むペプチドを有
する、配列番号２８〜配列番号３１８のいずれか１つに従う、連続するアミノ酸
配列を含む。
【００１２】 本発明は、例えば、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２
５、約２０、または、さらに、約１５程度のアミノ酸の長さのペプチド、ならび
にこれらの範囲内の全ての整数を含む中間の長さを有するペプチド（例えば、こ
れらのペプチドは、約５４、約５３、約５２、約５１、約５０、約４９、約４８
、約４７、約４６、約４４、約４３、約４２、約４１、約３９、約３８、約２７
、または、さらに、約３６程度のアミノ酸の長さなどであり得る）のような、好
ましい範囲の任意の中間の長さであるペプチドを含む。特定の実施形態では、よ
り小さなペプチドが好ましい場合、このペプチドの長さは、このペプチドが、配
列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号１３、配列番号１４
、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、
および配列番号２０のいずれか１つ、ならびに配列番号２８〜配列番号３１１、
配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、配列番号
３２１、配列番号３２２、配列番号３２３、配列番号３２４、配列番号３２５、
および配列番号３２６のいずれか１つに従う、少なくとも１つの第１の連続する
アミノ酸配列を含む限り、９、または約１０、または約１１、または約１２、ま
たは約１３、または約１４、または、さらに、約１５程度のアミノ酸の長さであ
り得る。同様に、わずかにより長いペプチドが好ましい場合、このペプチドの長
さは、このペプチドが、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０
、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号
３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１
つに従う、少なくとも第１の連続するアミノ酸配列を含む限り、約１６、または
約１７、または約１８、または約１９、または約２０、または約２１、または約
２２、または約２３、または約２４、または、さらに、約２５程度のアミノ酸の
長さであり得る。中間の長さの抗原性ペプチド、または抗原結合フラグメントが
望ましい場合、このペプチドは、これらの各々が、配列番号１〜配列番号４、配
列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、
配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配
列番号３２６のいずれか１つに従う、少なくとも第１の連続するアミノ酸配列を
含む限り、長さが、約２６、または約２７、または約２８、または約２９、また
は約３０、または約３１、または約３２、または約３３、または約３４、または
、さらに、約３５程度のアミノ酸の長さのオーダーであり得る。
【００１３】 これらのペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０
、配列番号２８〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のい
ずれか１つに従う、少なくとも１つの連続するアミノ酸配列を含むが、これらは
また、必要に応じて、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、
配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３
１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つ
に従う、少なくとも第２、少なくとも第３、または、さらに、少なくとも第４以
上の連続するアミノ酸配列を含み得る。単一のペプチドは、本明細書中に開示さ
れる連続するアミノ酸配列の１つのみを含み得るか、あるいは、単一のペプチド
は、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配
列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３
１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれかに従う複数の連続する
アミノ酸配列を含み得る。実際、このペプチドは、複数の同一の連続するアミノ
酸配列を含み得るか、またはこれらは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３
〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３
１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２
６に開示される１つ以上の異なる連続するアミノ酸配列を含み得る。例えば、９
〜約５０のアミノ酸の長さの単一のペプチドは、本明細書中に開示される単一の
エピトープのペプチドを含み得るか、または配列番号１〜配列番号４、配列番号
１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番
号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号
３２６のいずれかに開示されるような、２、３、４、または、さらに、５の別の
エピトープ配列を含み得る。あるいは、９〜約５０のアミノ酸の長さの単一のペ
プチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２
８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列
番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれかに開示されるよ
うな、２、３、４、または、さらに、５の同一のエピトープ配列を含み得る。
【００１４】 １つの例示的実施形態では、このペプチド組成物は、約９〜４０のアミノ酸の
長さの、少なくとも第１の単離されたペプチド、またはこのようなペプチドをコ
ードする少なくとも第１の核酸セグメントを含み；ここで、このペプチドは、配
列番号３４、配列番号３５、配列番号４９、配列番号８８、配列番号１４４、配
列番号１４７、配列番号１８５、配列番号１９８、配列番号１９９、および配列
番号２８２からなる群より選択される、少なくとも第１の連続するアミノ酸配列
を含む。
【００１５】 本発明の好ましいペプチドは、同様に、１０〜約６０のアミノ酸の長さのペプ
チド、１１〜約６０のアミノ酸の長さのペプチド、１２〜約６０のアミノ酸の長
さのペプチド、１３〜約６０のアミノ酸の長さのペプチド、および１４〜６０の
アミノ酸の長さのペプチド、および１５〜約６０のアミノ酸の長さのペプチドを
含む。同様に、本発明の好ましいペプチドは、１６〜約６０のアミノ酸の長さ、
ならびに全ての長さ、ならびに９〜約６０程度のアミノ酸の長さのペプチドの全
ての好ましい範囲内の部分的な範囲の長さのペプチドを含む。類似の様式では、
本発明はまた、９〜約６０のアミノ酸の長さの全ての範囲内の全ての部分的範囲
を含むために、１０もしくは１１〜約５５もしくは６０のアミノ酸の長さの長さ
を有するペプチド、１２もしくは１３〜約４５もしくは５０のアミノ酸の長さの
長さを有するペプチド、１４もしくは１５〜約３５もしくは４０のアミノ酸の長
さの長さを有するペプチド、１６もしくは１７〜約２５もしくは３０のアミノ酸
の長さの長さを有するペプチド、および１８もしくは１９〜約２０程度のアミノ
酸の長さの長さを有するペプチドなどを含む。
【００１６】 この開示を通じて、「配列番号１〜配列番号４に開示されるような配列」のよ
うな句は、これらの配列の識別名（特に、本明細書中の表２〜表４９に開示され
るペプチド配列）のいずれかにより開示される、連続するアミノ酸配列の総てを
含むことを意図する。すなわち、「配列番号１〜配列番号４のいずれかに開示さ
れるような配列」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号
４に開示される配列を意味する。同様に、「配列番号２５〜３７」とは、配列番
号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号
３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３
５、配列番号３６、および配列番号３７などに開示されるような配列番号の総て
を意味する。実際、本発明は、ペプチドおよびこれらのペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを含む。これらのペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番
号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列
番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番
号３２６として同定される配列のいずれか１つに開示されるような、少なくとも
第１の連続するアミノ酸配列を含む。
【００１７】 本発明はまた、本明細書中に開示されるようなペプチドまたはペプチド改変体
の１つ以上をコードする、少なくとも１つの第１の配列領域を含むポリヌクレオ
チドを含む。このようなポリヌクレオチドは、２７〜約５０００のヌクレオチド
の長さの配列領域、または２７〜約２０００のヌクレオチドの長さの配列領域、
２７〜約１０００のヌクレオチドの長さの配列領域、２７〜約９００の配列領域
、または約８００、または約７００、または約６００、または約５００、または
約４００、または約３００、または約２００、または、さらに、約１００程度の
ヌクレオチドの長さの配列領域を含み得る。
【００１８】 これらのペプチドの場合、これらのペプチドをコードする配列領域の長さは、
約３０〜約７５０のヌクレオチドの長さの、少なくとも第１の配列領域を含むポ
リヌクレオチド、約３５〜約６５０のヌクレオチドの長さの、少なくとも第１の
配列領域を含むポリヌクレオチド、および約４０〜約５５０、約４５０、約３５
０、約２５０、約１５０、または、さらに、約５０程度のヌクレオチドの長さの
、少なくとも第１の配列領域を含むポリヌクレオチドのような、これらの範囲の
任意の中間の長さであり得る。このような配列領域は、これらの配列領域が、配
列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号
３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、
および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに従う、少なくとも第１
の連続するアミノ酸配列を含む、少なくとも第１のペプチドをコードする限り、
約２７、または約２８、または約２９、または約３０、または約３１、または約
３２、または約３３、または約３４、または、さらに、約３５程度のヌクレオチ
ドの長さのオーダーであり得る。中間の長さの抗原性ペプチドまたは抗原結合フ
ラグメントが、所望される場合、これらをコードする核酸は、これらが、各々、
配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番
号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８
、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに従う、少なくとも第
１の連続するアミノ酸配列を含む少なくとも第１のペプチドをコードする限り、
約４０、約４５、または約５０、または約５５、または約６０、または約６５、
または約７０、または約７５、または約８０、または約８５、または約９０程度
のヌクレオチドの長さのオーダーであり得る。ポリヌクレオチドが、より大きな
抗原性ペプチドまたは抗原結合フラグメントをコードする配列領域を含むことを
意図される場合、これらをコードする核酸配列領域は、必然的に、長さがより長
い。例えば、約４０〜５０のアミノ酸の長さのオーダーのペプチドまたは抗原結
合フラグメントをコードする核酸配列領域は、３つのコドンが１つのアミノ酸を
コードするために必要とされるという事実から、必然的に、少なくとも約１２０
〜約１５０程度のヌクレオチドの長さである。
【００１９】 同様に、このような配列領域を含むポリヌクレオチドは、特に、この配列領域
が１つ以上のプロモーターか、または１つ以上のシグナル配列および／またはペ
プチド融合産物をコードする１つ以上の配列領域に作動可能に連結される場合、
それ自体のコード領域よりも実質的により大きくてもよい。これらの実施形態で
は、これらのポリヌクレオチドは、約１０，０００程度のヌクレオチドの長さの
オーダーである配列を含むまで、約５００、約６００、約７００、約８００、約
９００、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、また
は、さらに、約１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または、
さらに、２０００程度のヌクレオチドの長さのオーダーであり得る。このような
ポリヌクレオチドは、発現ベクター、送達ビヒクル、ウイルスベクター、ならび
にこれらのポリヌクレオチドおよび／または遺伝子構築物または発現要素内に含
まれる配列領域によりコードされる、特定のコードされたペプチドおよび／また
は抗原結合フラグメントを発現する、形質転換した宿主細胞の調製において特に
有用である。
【００２０】 別の例示的実施形態では、このペプチドは、９〜約１１のアミノ酸の長さの少
なくとも第１の単離されたペプチド、またはこれらのペプチドをコードする少な
くとも第１の核酸セグメントを含み；ここで、このペプチドは、配列番号１〜配
列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列
番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番
号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つのアミノ酸配列から本質的になる。
【００２１】 同様に、別の関連した実施形態では、このペプチドは、９〜約１０もしくは１
１程度のアミノ酸の長さの、少なくとも第１の単離されたペプチド、またはこれ
らのペプチドをコードする少なくとも第１の核酸セグメントを含み；ここで、こ
のペプチドは、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、
配列番号３１３、配列番号３１４、および配列番号３１６〜配列番号３１８のい
ずれか１つのアミノ酸配列からなり、そして、特に、このペプチドは、配列番号
３４、配列番号３５、配列番号４９、配列番号８８、配列番号１４４、配列番号
１４７、配列番号１８５、配列番号１９８、配列番号１９９、および配列番号２
８２のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【００２２】 単一のペプチド種を含むペプチドおよび組成物に加えて、本発明はまた、２、
３、４以上のペプチド種および／またはこのようなペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む組成物に関する。このような複数のペプチド種および／または
ポリヌクレオチド種は、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０
、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号
３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のアミノ酸配
列に開示される、２つ以上の異なる連続するアミノ酸配列を有する複数のペプチ
ド、および／またはこのようなペプチドをコードする複数のポリヌクレオチドを
含む治療剤の処方に特に望ましい。特定の抗原性ＷＴ１由来ペプチドおよびポリ
ヌクレオチド化合物の供給源に関係なく、本発明は、複数のこのような化合物を
含むまで、１つ、２つ、３つ、または４つの別個のペプチド、ポリヌクレオチド
、またはこれらの誘導体の使用を特に意図する。これは、適用全体を通じて単数
の用語の使用を例示し、ここで、用語「ａ」および「ａｎ」は、これらが、上限
が、その後に具体的に述べられるか、または当業者により理解されるという例を
除いて、「少なくとも１つ」、「少なくとも第１の」、「１つ以上」、または「
複数」の参照される成分または工程を意味するという意味で用いられる。組み合
わせの実施可能な制限およびパラメーターは、任意の単一の薬剤の量と同様に、
本発明の開示の範囲内で当業者に公知である。
【００２３】 このような組成物中のさらなるペプチドは、およそ同じサイズ、および／また
はおよそ同じ一次アミノ酸配列のペプチドの全てであり得るか、またはこのペプ
チドは、長さおよび／または一次アミノ酸配列においてかなり異なり得る。この
ような組成物は、１つ以上のさらなる成分（例えば、本明細書中の以下に詳細に
記載される、薬学的に受容可能な賦形剤、緩衝液、試薬）をさらに含み得る。こ
のような組成物はまた、本明細書中に記載されるような、少なくとも第１の免疫
賦活剤、または少なくとも第１のアジュバントを、必要に応じて、さらに含む。
このような免疫賦活剤およびアジュバントは、好ましくは、ヒトにおけるＴ細胞
応答を増大し、そして好ましくは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０、Ｓｅｐｐ
ｉｃ Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０、サイトカイン、ミクロスフィア、ジ
メチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドアジュバント、ＡＳ−１、ＡＳ−
２、Ｒｉｂｉアジュバント、ＱＳ２１、サポニン、ミクロ流体化Ｓｙｎｔｅｘア
ジュバント、ＭＶ、ｄｄＭＶ、免疫刺激複合体、および不活化毒素からなる群よ
り選択され得る。本明細書中の以下、詳細には、第４節でより詳細に記載される
ように、組成物は、哺乳動物（例えば、ヒト）への非経口経路、静脈内経路、腹
腔内経路、皮下経路、経鼻経路、経皮経路、および経口経路（これらが特に好ま
しい）による投与に適切なこれらの処方物を用いる、診断用途または治療用途（
臨床用のパッケージングおよび／または商業的再販（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｒ
ｅｓａｌｅ）のための、１つ以上の診断キットまたは治療キットへのこれらの組
成物の組み込みを含む）のために処方され得る。
【００２４】 組成物は、さらに、必要に応じて、１つ以上の検出試薬、１つ以上のさらなる
診断試薬、１つ以上の制御試薬、および／または１つ以上の治療試薬を含み得る
。診断試薬の場合、これらの組成物は、さらに、必要に応じて、インビトロおよ
び／またはインビボでの診断法および治療法の両方に用いられ得る、１つ以上の
検出可能な標識を含み得る。治療用組成物および処方物の場合、本発明の組成物
はまた、特定の状況などで必要とされ得る場合、さらに、必要に応じて、１つ以
上のさらなる、抗癌成分、抗中皮腫成分、または他の治療的に有益な成分を含み
得る。
【００２５】 別の局面では、本発明はまた、ヒト患者における悪性の中皮腫の発症を阻害す
るための方法を提供する。この方法は、以下をを含む薬学的組成物をヒト患者に
投与する工程を包含する：（ａ）ネイティブのＷＴ１、または抗原特異的抗体お
よび／またはＴ細胞株またはクローンと反応するための改変体の能力が、実質的
に低下しないような、１つ以上の、置換、欠失、付加、および／または挿入の点
で異なるこれらの改変体の、免疫原性部分を含むＷＴ１ペプチド；ならびに（ｂ
）生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。特定の実施形態では、患者は、
悪性の中皮腫に罹患している。他の実施形態では、この組成物は、悪性の中皮腫
の発症の危険性があると考えられる患者に対して、予防的に投与される。ＷＴ１
ペプチドは、必要ではないが、ワクチン（これは、アジュバントのような免疫賦
活剤をさらに含む）内に存在し得る。
【００２６】 さらなる局面では、ヒト患者における悪性の中皮腫の発症を阻害するための方
法が、提供される。この方法は、以下を含む薬学的組成物をヒト患者に投与する
工程を包含する：（ａ）ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、ここで
、このペプチドは、ネイティブのＷＴ１、または抗原特異的抗体および／または
Ｔ細胞株またはクローンと反応するための改変体の能力が、実質的に低下しない
ような、１つ以上の、置換、欠失、付加、および／または挿入の点で異なるこれ
らの改変体の、免疫原性部分を含む；ならびに（ｂ）薬学的に受容可能なキャリ
アまたは賦形剤。特定の実施形態では、患者は、悪性の中皮腫に罹患している。
他の実施形態では、この組成物は、悪性の中皮腫の発症の危険性があると考えら
れる患者に対して、予防的に投与される。ＷＴ１ポリヌクレオチドは、必要では
ないが、ワクチン（これは、アジュバントのような免疫賦活剤をさらに含む）内
に存在し得る。
【００２７】 ヒト患者における悪性の中皮腫の発症を阻害するための方法が提供される。こ
の方法は、以下を含む薬学的組成物をヒト患者に投与する工程を包含する：（ａ
）ＷＴ１に特異的に結合する、抗体または抗体の抗原結合フラグメント；および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。特定の実施形態では、患者は
、悪性の中皮腫に罹患している。他の実施形態では、この組成物は、悪性の中皮
腫の発症の危険性があると考えられる患者に対して、予防的に投与される。
【００２８】 さらなる局面において、ヒト患者における悪性中皮腫の発症を阻害するための
方法を提供し、この方法は、以下を含む薬学的組成物をヒト患者に投与する工程
を包含する：（ａ）ＷＴ１と特異的に反応するＴ細胞；および（ｂ）薬学的に受
容可能なキャリアまたは賦形剤。特定の実施形態において、この患者は、悪性中
皮腫に罹患している。他の実施形態において、この組成物は、中皮腫の発症の危
険性があるとみなされた患者に対して予防的に投与される。
【００２９】 ヒト患者における悪性中皮腫の発症を阻害するためのさらなる方法は、以下を
含む薬学的組成物をヒト患者に投与する工程を包含する：（ａ）抗原提示細胞で
あって、該細胞が、（ｉ）ネイティブＷＴ１またはその改変体の免疫学的部分を
含むＷＴ１ペプチドを発現し、この改変体は、１以上の置換、欠失、付加および
／または挿入において異なり、その結果、この改変体が抗原特異的抗体および／
またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が、実質的に減少されていない
、抗原提示細胞；および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。特定
の実施形態において、この患者は、悪性中皮腫に罹患している。他の実施形態に
おいて、この組成物は、中皮腫の発症の危険性があるとみなされた患者に対して
予防的に投与される。抗原提示細胞は、必要ではないが、ワクチン中に存在し得
、ワクチンは、免疫賦活剤（例えば、アジュバント）をさらに含む。
【００３０】 他の局面において、本発明は、ヒト患者における悪性中皮腫の発症を阻害する
ための方法を提供し、この方法は、刺激および／または拡大されたＴ細胞の調製
物をヒト患者に投与する工程を包含し、ここで、このＴ細胞は、ＷＴ１ペプチド
、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはＷＴ１ペプチド
を発現する抗原提示細胞との接触によって、刺激および／または拡大される。Ｔ
細胞は、例えば、骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分（例えば、中皮
腫に罹患している患者から得られた）中に存在し得る。Ｔ細胞は、必要ではない
が、拡大前にクローン化され得る。
【００３１】 患者における悪性中皮腫の発症を阻害するための方法をさらに提供し、この方
法は、以下の工程（ａ）患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細
胞を、（ｉ）ＷＴ１ペプチド、（ｉｉ）ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレ
オチドまたは（ｉｉｉ）ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１以上
と共にインキュベートする工程であって、その結果、これらのＴ細胞が増殖する
、工程；および（ｂ）この患者にこの増殖されたＴ細胞の有効量を投与する工程
、を包含する。
【００３２】 患者における悪性中皮腫の発症を阻害するためのさらなる方法は、以下の工程
（ａ）患者から単離したＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、（ｉ）ＷＴ
１ペプチド、（ｉｉ）ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（ｉ
ｉｉ）ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１以上と共にインキュベ
ートする工程であって、その結果、これらのＴ細胞が増殖する、工程；（ｂ）Ｗ
Ｔ１ペプチドの存在下で増殖された１以上の細胞をクローン化する工程；および
（ｃ）この患者にこのクローン化したＴ細胞の有効量を投与する工程、を包含す
る。
【００３３】 他の局面において、本発明は、患者における悪性中皮腫の存在または非存在を
決定するための方法を提供し、この方法は、以下の工程（ａ）患者から単離した
ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、（ｉ）ＷＴ１ペプチド、（ｉｉ）Ｗ
Ｔ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）ＷＴ１ペプチドを
発現する抗原提示細胞のうちの１以上と共にインキュベートする工程；および（
ｂ）これらのＴ細胞の特異的な活性化の存在または非存在を検出する工程、を包
含する。この検出工程は、例えば、Ｔ細胞の増殖の存在または非存在あるいは細
胞溶解活性の発生を検出する工程を包含し得る。
【００３４】 本発明はさらに、患者における悪性中皮腫の存在または非存在を決定するため
の方法を提供し、この方法は、以下の工程（ａ）患者から得た生物学的サンプル
を、（ｉ）ＷＴ１ペプチド、（ｉｉ）ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオ
チドまたは（ｉｉｉ）ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞のうちの１以上と
共にインキュベートする工程であって、このインキュベーションは、免疫複合体
が形成するのを可能にするに十分な条件および時間で行う、工程；および（ｂ）
このＷＴ１ペプチドと、このＷＴ１ペプチドに特異的に結合するこの生物学的サ
ンプル中の抗体との間で形成された、免疫複合体を検出する工程、を包含する。
この検出工程は、例えば、（ａ）この免疫複合体を、この免疫複合体に結合し得
る検出試薬と共にインキュベートする工程であって、この検出試薬は、レポータ
ー基を含む、工程、（ｂ）結合していない検出試薬を除去する工程、および（ｃ
）このレポーター基の存在または非存在を検出する工程を包含し得る。
【００３５】 他の局面において、患者における悪性中皮腫の免疫または治療の効果をモニタ
ーするための方法をさらに提供し、この方法は、以下の工程（ａ）第１の生物学
的サンプルを、（ｉ）ＷＴ１ペプチド、（ｉｉ）ＷＴ１ペプチドをコードするポ
リヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞のうち
の１以上と共にインキュベートする工程であって、この第１の生物学的サンプル
は、治療前または免疫前の患者から得られ、そして、このインキュベーションは
、免疫複合体が形成するのを可能にするに十分な条件および時間で行う、工程；
（ｂ）このＷＴ１ペプチドと、このＷＴ１ペプチドに特異的に結合するこの生物
学的サンプル中の抗体との間で形成された、免疫複合体を検出する工程；（ｃ）
第２の生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程であ
って、この第２の生物学的サンプルは、治療後または免疫後のこの患者から得ら
れる、工程；および（ｄ）この第１および第２の生物学的サンプル中で検出され
た免疫複合体の数を比較する工程、を包含する。この検出工程は、例えば、（ａ
）この免疫複合体を、この免疫複合体に結合し得る検出試薬と共にインキュベー
トする工程であって、この検出試薬は、レポーター基を含む、工程、（ｂ）結合
していない検出試薬を除去する工程、および（ｃ）このレポーター基の存在また
は非存在を検出する工程を包含し得る。
【００３６】 さらなる局面において、患者における悪性中皮腫の免疫または治療の効果をモ
ニターするための方法をさらに提供し、この方法は、以下の工程（ａ）第１の生
物学的サンプルを、（ｉ）ＷＴ１ペプチド、（ｉｉ）ＷＴ１ペプチドをコードす
るポリヌクレオチドまたは（ｉｉｉ）ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞の
うちの１以上と共にインキュベートする工程であって、この生物学的サンプルは
、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、かつ治療前または免疫前の患
者から得られ、そして、このインキュベーションは、この生物学的サンプル中の
Ｔ細胞の特異的な活性化、増殖および／または溶解を可能にするに十分な条件お
よび時間で行う、工程；（ｂ）このＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の
量を検出する工程；（ｃ）第２の生物学的サンプルを使用して工程（ａ）および
（ｂ）を繰り返す工程であって、この第２の生物学的サンプルは、ＣＤ４＋およ
び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、かつこの第２の生物学的サンプルは、治療後
または免疫後のこの患者から得られる、工程；ならびに（ｄ）この第１および第
２の生物学的サンプル中のＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を比較
する工程、を包含する。
【００３７】 本発明の方法を通して、「有効阻害量」は、中皮腫に罹患している動物におい
てこのような障害を阻害、そして好ましくは、有意に阻害するのに有効な少なく
とも第１のＷＴ１化合物の量である。従って、有効阻害量はまた、ネイティブＷ
Ｔ１ポリペプチドの生物学的活性を阻害、そして好ましくは、有意に阻害するの
に有効な量である。より好ましくは、有効阻害量は、悪性胸膜中皮腫を有するか
または有することが疑われるヒトにおける、ネイティブＷＴ１ポリペプチドの生
物学的活性を阻害、そして好ましくは、有意に阻害するのに有効なＷＴ１化合物
の量である。任意の程度の阻害が、本発明を満足するに十分であるが、当業者は
、好ましいインビトロおよびインビボ阻害を示すに十分な阻害レベルを理解する
。
【００３８】 「阻害」は、前述のパラメーターの１以上における、「再現性のある」（すな
わち、一貫して観察される）阻害を必要とする。「有意な阻害」は、前述のパラ
メーターの１以上における、再現性のある、すなわち、一貫して観察される有意
な阻害（例えば、コントロールレベル（すなわち、ＷＴ１治療組成物の非存在下
での）と比較した、少なくとも約５０％、５５％、約６０％、約６５％、約７０
％、約７５％、約８０％または約８５％の再現性のある阻害）である。本発明の
実施に必要ではないが、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、
またはさらには約９８％以上の阻害レベルは、決して除外されない。
【００３９】 本明細書中に開示される治療方法の１以上の実施は、悪性中皮腫の予防または
処置のために有効な治療を生じる。これらの方法は、代表的に、悪性中皮腫を有
するか、有することが疑われるかまたは発症する危険性がある動物または患者に
、その動物または患者の細胞内の悪性中皮腫を阻害するのに有効な量の、少なく
とも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、抗原提示細胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメン
トまたはポリヌクレオチドを提供する工程を包含し、それによって、悪性中皮腫
を予防または処置する。
【００４０】 従って、前述の「予防的および治療的有効量」は、ＷＴ１ペプチド、抗体、抗
原提示細胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメントまたはポリヌクレオチド組成物の用
語「生物学的に有効な量」および「有効阻害量」に包含される。全てのこのよう
な「有効量」は、動物または患者への投与に際して、いくらか、そして好ましく
は、いくらか有意な利益を提供するのに効果的な、開示されたＷＴ１化合物の量
である。これらの利益としては、症状、重篤度および／または持続期間の減少、
ならびに転移の可能性の減少、ならびに他の獣医学的および臨床的利益が挙げら
れる。
【００４１】 本発明に使用され得る投与経路は、少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、
抗原提示細胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメントまたはポリヌクレオチド組成物の
有効量が、それによって提供される限り、実質的に限定されない。開示された組
成物の治療的送達のための例示的手段（例えば、摂取、吸入、経皮投与、非経口
投与、鼻内投与、皮下注射、静脈内注射、連続注入などを含む）を、本明細書以
下により詳細に議論する。
【００４２】 本発明の全てのこのような組成物および方法は、１以上の他の抗癌剤（例えば
、少なくとも第２、第３、第４または第５の抗中皮腫剤、あるいは少なくとも第
１、第２、第３、第４または第５の抗癌治療剤）と共に使用するために合わせら
れ得る。複数の別々の抗癌または抗中皮腫治療剤が、その組み合わせの毒性が制
限される用量以下で、動物または患者に投与され得る。従って、本発明は、他の
治療剤および／または公知の薬剤、特に、以前は、用量を制限する毒性および／
または抵抗性におそらく起因して、インビボでの最大効果を達成できなかった方
法および薬剤との相乗的な組み合わせを形成するために使用され得る。
【００４３】 このような組み合わせ治療において、この少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、
抗体、抗原提示細胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメントまたはポリヌクレオチド、
および少なくとも第２の抗中皮腫または抗癌治療剤は、例えば、単一の薬学的処
方物または別の２つの薬学的処方物から、実質的に同時に動物または患者に投与
され得る。あるいは、この少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、抗原提示細
胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメントまたはポリヌクレオチド、および少なくとも
第２の抗中皮腫または抗癌治療剤は、連続的（例えば、隔日で）に動物または患
者に投与され得る。
【００４４】 さらなる実施形態において、本発明は、ある範囲の治療用キットを提供する。
特定のキットは、治療有効量の少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、抗原提
示細胞、Ｔ細胞、抗原結合フラグメントまたはポリヌクレオチド組成物、および
中皮腫（特に、悪性胸膜中皮腫）を有するかまたは発症する危険性がある動物ま
たは被験体へその組成物を投与するための指示書を備える。このようなキットは
、ＷＴ１ポリペプチドまたは抗体を検出する少なくとも１つの診断剤または中皮
腫細胞を検出するための少なくとも１つの診断剤の有効量；あるいは少なくとも
１つの他の抗癌治療剤、抗中皮腫治療剤または抗ＷＴ１ポリペプチド治療剤の治
療有効量と組み合わせられ得る。
【００４５】 本明細書中に開示されるこれらの組成物の特定の他の治療用キットおよび用途
は、少なくとも第１のＷＴ１ペプチド、抗体、抗原提示細胞、Ｔ細胞、抗原結合
フラグメントまたはポリヌクレオチドの有効量、および中皮腫細胞を検出するた
めの少なくとも１つの診断剤の有効量；あるいは少なくとも１つ、２つ、３つ、
４つまたは任意の数の他の抗癌治療剤、抗中皮腫治療剤または抗ＷＴ１ポリペプ
チド治療剤の有効量を含み得る。指示書もまた、これらのキットに組み合わせら
れ得る。他の生物学的薬剤または成分（例えば、薬物を作製および使用するため
の生物学的薬剤または成分）が、含まれ得る。
【００４６】 例示的な診断剤としては、少なくとも第１のＷＴ１コード核酸を検出する分子
生物学的薬剤；少なくとも第１のＷＴ１ペプチドまたはポリペプチド、少なくと
も第１のＷＴ１タンパク質またはポリペプチドを検出する少なくとも第１の抗体
；およびＷＴ１タンパク質またはペプチドに結合する少なくとも第１の抗体を検
出する少なくとも第１のＷＴ１タンパク質またはポリペプチドが挙げられる。さ
らなる治療剤の範囲は、本明細書中に記載されるそれらによって例示されるよう
に、本開示から当業者に理解される。
【００４７】 このようなキットにおいて、診断剤は、好ましくは、そのキットの別の容器に
含まれる。しかし、この組み合わせの治療剤は、そのキットの単一の容器内で、
すなわち、ＷＴ１組成物と同じ組成物（例えば、「カクテル」または混合物）中
に合わせられ得る。あるいは、これらは、別の容器中に、ＷＴ１化合物と別々に
維持され得る。
【００４８】 従って、本発明は、組み合わせ治療剤を提供し、これは、任意の薬学的に受容
可能な形態で、治療有効量の少なくとも第２の抗ＷＴ１治療剤、抗中皮腫治療剤
または抗癌治療剤と組み合わせた治療有効量のＷＴ１化合物を含む。医薬または
医薬カクテルの製造における使用のための組成物もまた提供し、これは、任意の
薬学的に受容可能な形態で、治療有効量の少なくとも第１のＷＴ１化合物を含む
。さらに、本発明は、医薬または医薬カクテルの製造における使用のための組成
物を提供し、これは、任意の薬学的に受容可能な形態で、第１のＷＴ１化合物お
よび複数の別の抗ＷＴ１治療剤、抗中皮腫治療剤または抗癌治療剤を含む。ＷＴ
１化合物が治療アプローチの１つの成分である組み合わせの使用および医薬もま
た、本発明に包含される。
【００４９】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照
して明らかになる。本明細書中に開示される全ての参考文献は、各々が個々に援
用されるように、それらの全体が参考として本明細書によって援用される。
【００５０】 （４．例示的な実施形態の説明） 本明細書中に記載の発明がより十分に理解され得るために、以下の種々の例示
的な実施形態の説明を示す。
【００５１】 本発明は、一般に、ＷＴ１関連疾患（例えば、悪性中皮腫）の免疫療法および
診断のための組成物および方法に関する。特に、ＷＴ１発現およびＷＴ１に対す
る免疫応答（例えば、患者血清中のＷＴ１特異的抗体の存在）が、悪性中皮腫お
よび他のＷＴ１関連悪性疾患（例えば、白血病（例えば、急性骨髄性白血病（Ａ
ＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および小
児期ＡＬＬ）、脊髄形成異常症候群、骨髄増殖性症候群、前立腺癌、肺癌、乳癌
、甲状腺癌、胃腸癌、腎臓癌、肝臓癌、卵巣癌、精巣癌および黒色腫）を有する
患者を同定するためのマーカーとして使用され得る。このような診断方法（例え
ば、高スループットアッセイ形式における）は、癌の早期の診断に使用され得、
そしてアスベストに曝されたかまたは曝されたかもしれない健常な個体のクリー
ニングを可能にし得る。このような悪性疾患に罹患していると見出された患者は
、本明細書中に提供される、ＷＴ１ベースのワクチンまたはＴ細胞治療方法から
利益を受け得る。
【００５２】 本明細書中に記載の組成物は、一般に、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ポリヌクレオ
チド、ＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ；例えば、樹状細胞）、
ＷＴ１ポリペプチドおよびＷＴ１由来のペプチドに特異的に結合する抗体のよう
な薬剤；および／またはＷＴ１に特異的な免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）を含む
。本発明のＷＴ１ペプチドは、一般に、ウィルムス腫瘍遺伝子産物（ＷＴ１）ま
たはその改変体の少なくとも一部を含む。本発明の核酸配列は、一般に、このよ
うなペプチドの全てまたは一部をコードするＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡ配列、
あるいはこのような配列に相補的であるＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡ配列を含む
。抗体は、一般に、ＷＴ１ペプチドの一部に結合し得る、免疫系のタンパク質ま
たはその抗原結合フラグメントである。このような組成物において使用され得る
Ｔ細胞は、一般に、ＷＴ１ペプチドに特異的な細胞（例えば、ＣＤ４＋および／
またはＣＤ８＋）である。本明細書中に記載の特定の方法はさらに、本明細書中
に提供される少なくとも第１のＷＴ１ペプチドまたはポリペプチドを発現する１
以上の抗原提示細胞を使用する。
【００５３】 （４．１ ＷＴ１ペプチド） 本発明の状況下で、例示的な好ましいＷＴ１由来の抗原性ペプチドとしては、
少なくとも第１のエピトープ、抗原性フラグメント、抗体結合部位、または以下
からなる群より選択される免疫原性配列を含む、９〜約１００アミノ酸長のそれ
らのペプチドを含む：配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、
配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３
１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６。
【００５４】 ＷＴ由来ペプチドは、そのペプチドが、ネイティブなＷＴ１ポリペプチドまた
はその改変体の少なくとも第１の免疫原性部分もしくはエピトープ、または抗体
結合部位を含むという条件下で、任意の中間の長さのペプチドであり得、そして
特に、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜
配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号
３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示されたそ
れらのペプチド配列であり得る。換言すると、ＷＴ１ペプチドは、オリゴペプチ
ド（すなわち、９個〜約１２個または１３個程度のアミノ酸残基のように、比較
的少数のアミノ酸残基からなるペプチド）であり得るか、より長いオリゴペプチ
ド（すなわち、例えば、約１４個〜約２０個程度のアミノ酸残基のように、比較
的多数のアミノ酸残基からなるペプチド）であり得るか、さらに長いペプチド（
すなわち、例えば、約２１個〜約４０個程度のアミノ酸残基のように、比較的多
数のアミノ酸残基からなるペプチド）などから、例えば、約５個〜約９０個また
は１００個程度のアミノ酸残基のように、かなり多数のアミノ酸残基からなるペ
プチドまで（かなり多数のアミノ酸残基からなるペプチド、を含む）であり得、
ならびに中間のサイズのすべてのペプチドであり得る。
【００５５】 特定の実施形態では、ネイティブなＷＴ１ペプチドの少数連続したアミノ酸残
基を含むＷＴ１ペプチドの使用が好ましい。このようなペプチドは、Ｔ細胞応答
の生成が所望される特定の用途のために好ましい。例えば、このようなＷＴ１ペ
プチドは、好ましくは、ネイティブなＷＴ１ポリペプチドの少なくとも９個、ま
たは少なくとも約１０個、１１個、１２個、１３個、１４個または１５個以上連
続したアミノ酸残基を含む。九量体ペプチド（９マー、またはネイティブなＷＴ
１ポリペプチドの少なくとも９個連続したアミノ酸残基を含むペプチド）が、本
明細書中に開示された方法において有用であることが特に意図される。ネイティ
ブなプロテインＡおよび／または異種配列に由来するさらなる配列が、任意のＷ
Ｔ１ペプチドにおいて存在し得、そしてこのような配列は、（必要ではないが）
さらなる免疫原性特性または抗原性特性を有し得る。本明細書中に提供されたペ
プチドはさらに、他のペプチドまたは非ペプチド化合物と（共有結合的または非
共有結合的に）結合され得る。
【００５６】 「免疫原性部分」は、本明細書中で使用される場合、Ｂ細胞表面抗原レセプタ
ーおよび／またはＴ細胞表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特
異的に結合される）、ペプチドの部分である。特定の好ましい免疫原性部分は、
ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。本明細書中で使用
される場合、免疫原性部分は、このような結合が当該分野で公知の任意のアッセ
イを使用して検出可能である場合に、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩ
Ｉ分子「に結合する」といわれる。例えば、ペプチドがＭＨＣクラスＩに結合す
る能力は、ＭＨＣクラスＩ／β２ｍ／ペプチドヘテロ三量体の複合体中への１２ ５ Ｉ標識化β２−ミクログロブリン（β２ｍ）の取り込みを促進する能力をモニ
タリングすることによって、間接的に評価され得る（Ｐａｒｋｅｒら、１９９４
）。あるいは、当該分野において公知である機能的ペプチドの競合アッセイを使
用し得る。特定の免疫原性部分は、表２〜１４のうちの１つ以上において列挙さ
れた配列の１つ以上を有する。
【００５７】 本発明の例示的な免疫原性ペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：表２〜表４９において例示されている実施例に開示されたペプチ
ド、そして特に、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列
番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６
〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに規
定されるような、少なくとも第１のアミノ酸配列を含むペプチド。
【００５８】 例示的なＷＴ１由来ペプチド組成物としては、以下が挙げられるが、これらに
限定されない：配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番
号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、および配列番号３
１６〜配列番号３１８からなる群より選択される、少なくとも第１のアミノ酸配
列を含むペプチド組成物、そして特に、以下のいずれか１つに開示されるような
配列を含むペプチド組成物：ＲＤＬＮＡＬＬＰＡＶＰＳＬＧＧＧＧ（ヒトＷＴ１
残基６〜２２；配列番号１）、ＰＳＱＡＳＳＧＱＡＲＭＦＰＮＡＰＹＬＰＳＣＬ
Ｅ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基１１７〜１３９；それぞれ、配列番号２およ
び配列番号３）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡＧＳＳＳＳＶＫＷＴＥ（ヒトＷＴ１残基２
４４〜２６２；配列番号４）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（ヒトＷＴ１残基２４４〜２
５２；配列番号８８）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２
３５〜２４３；それぞれ、配列番号４９および配列番号２５８）、ＳＣＬＥＳＱ
ＰＴＩ（マウスＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号２９６）、ＳＣＬＥＳＱＰ
ＡＩ（ヒトＷＴ１残基１３６〜１４４；配列番号１９８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ
（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基２２５〜２３３；それぞれ、配列番号１４７お
よび配列番号２８４）；ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（マウスＷＴ１残基１０〜１８；配
列番号２５５）；またはＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（ヒトおよびマウスのＷＴ１残基１
２６〜１３４；それぞれ、配列番号１８５および配列番号２９３）。
【００５９】 さらなる免疫原性フラグメントおよびペプチドが本明細書中において提供され
、そして他は一般的に、周知技術を使用して同定され得る（Ｐａｕｌ、１９９３
）。免疫原性ペプチド、エピトープ、および抗体結合モチーフを同定するための
代表的な技術としては、例えば、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株もし
くはクローンと反応する能力についてペプチドをスクリーニングすることが挙げ
られる。ネイティブなＷＴ１ポリペプチドの免疫原性部分は、全長ＷＴ１の反応
性に対して実質的に勝るとも劣らないレベルで、このような抗血清および／また
はＴ細胞と反応する部分である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応
性アッセイにおいて）。換言すると、免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応
性と類似のレベルまたは全長ポリペプチドの反応性よりも高いレベルで、このよ
うなアッセイにおいて反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当
業者に周知の方法を使用して、実施され得る（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１
９８８）。
【００６０】 あるいは、免疫原性部分は、Ｔｈ応答を誘発する能力を有するペプチドモチー
フについて検索する、Ｔｓｉｔｅｓプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙ
ｌｏｒ，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら，１９９６）のようなコンピューター分析を
使用して、同定され得る。マウスおよびヒトのクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨ
Ｃに対して結合するために適切なモチーフを有するＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡ
Ｓ（Ｐａｒｋｅｒら，１９９４）および他のＨＬＡペプチド結合予測分析に従っ
て同定され得る。免疫原性を確認するために、ＨＬＡ Ａ２トランスジェニック
マウスモデル、および／または、樹状細胞、線維芽細胞もしくは末梢血細胞を用
いるインビトロでの刺激アッセイを用いてペプチドを試験し得る。
【００６１】 上述のように、本発明のペプチドは、本明細書中に開示されたようなアミノ酸
配列の１つ以上の改変体を含み得る。ペプチド「改変体」は、本明細書中で使用
される場合、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において、特定の
一次アミノ酸配列とは異なり、その結果、そのペプチドの免疫原性は実質的に保
持される（すなわち、その改変体が、抗原特異的抗血清および／またはＴ細胞株
もしくはクローンと反応する能力は、ネイティブなペプチドと比較して、実質的
に減少されない）ペプチドである。換言すると、改変体が、抗原特異的抗血清お
よび／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力は、その改変体が由来し
たペプチドと比較して、増強され得るかまたは不変であり得る。
【００６２】 好ましくは、ペプチド改変体の生物学的活性は、改変されていないペプチドの
生物学的活性と比較して、１％より大きく減少することはなく、そして好ましく
はなお、２％より大きく減少することはない。より好ましくは、ペプチド改変体
の生物学的活性は、改変されていないペプチドの生物学的活性と比較して、３％
より大きく減少することはなく、そしてより好ましくはなお、４％、５％、６％
、７％、８％、または９％より大きく減少することはない。より好ましくはなお
、ペプチド改変体の生物学的活性は、対応する改変されていないペプチドの生物
学的活性と比較して、１０％より大きく減少することはなく、そしてより好まし
くはなお、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％
、１９％、または２０％より大きく減少することはない。
【００６３】 ％配列相同性に基づいて、本発明の好ましいペプチド改変体としては、９個〜
約１００個のアミノ酸の長さのペプチド、ならびに配列番号１〜配列番号４、配
列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、
配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配
列番号３２６のいずれか１つに開示されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ
に対して、少なくとも７５％同一である少なくとも第１の配列領域を含むペプチ
ド、そしてより好ましくは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号
２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列
番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれ
か１つに開示されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つに対して、少なくとも
８０％同一である少なくとも第１の配列領域を含むペプチドが挙げられる。より
好ましくは、％配列相同性に基づいて、本発明の好ましいペプチド改変体は、配
列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号
３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、
および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示されたアミノ酸配
列のうちの少なくとも１つに対して、少なくとも８５％同一である少なくとも第
１の配列領域を含むペプチドであり、そしてより好ましくは、配列番号１〜配列
番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番
号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号
３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示されたアミノ酸配列のうちの少な
くとも１つに対して、少なくとも９０％同一である少なくとも第１の配列領域を
含むペプチドである。本発明の特に好ましいペプチド改変体は、配列番号１〜配
列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列
番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番
号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示されたアミノ酸配列のうちの少
なくとも１つに対して、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、または９
５％同一である少なくとも第１の配列領域を含むペプチドと共に、配列番号１〜
配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配
列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列
番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示されたアミノ酸配列のうちの
少なくとも１つに対して、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％同
一である少なくとも第１の配列領域を含むペプチドである。
【００６４】 このようなペプチド改変体は代表的には、本明細書中に開示されるペプチドの
１つを改変することによって、および詳細には、以下のいずれか１つに開示され
る１つ以上の９量体ペプチドエピトープの１次アミノ酸配列を改変することによ
って、調製され得る：配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、
配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３
１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６。これらの生物
学的機能の等価なペプチドは、１つ以上の保存的アミノ酸置換によって、配列番
号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１
１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、およ
び配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つに開示される本来のペプチド
配列と異なる１次アミノ酸配列を含み得る。
【００６５】 本発明の状況下では、比較的少数の保存的置換または中性置換（例えば、１個
または２個）が、このペプチドの生物学的活性を実質的に改変することなく、本
明細書中に開示された九量体のペプチドエピトープの配列においてなされ得るこ
とが見出された。いくつかの場合では、特定のペプチドにおける１つ以上のアミ
ノ酸の置換は、実際に、その改変されたペプチドもしくはそのペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む組成物を提供された動物において、そのペプチドが
免疫応答またはＴ細胞応答を誘発する能力を増強するのに役立ち得るか、さもな
くば改善するのに役立ち得る。適切な置換は、一般的に、本明細書中の以下にお
いて記載されるようなコンピュータープログラムを使用することによって同定さ
れ得、そしてそのような置換の効果は、本明細書中に記載されるように、改変さ
れたペプチドと、抗血清および／またはＴ細胞との反応性に基づいて確認され得
る。従って、特定の好ましい実施形態では、開示された診断方法および治療方法
において使用するためのＷＴ１ペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基が１つ以上
の置換アミノ酸によって置換され、その結果、その改変されたペプチドが抗原特
異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力が、改変さ
れていないペプチドの能力に対して有意に勝るとも劣らない、一次アミノ酸配列
を含み得る。例示的なこのような置換は、好ましくは、ペプチドにおける１以上
のＭＨＣ結合部位内に位置付けられ得る。
【００６６】 上記のように、好ましいペプチド改変体は、１つ以上の保存的置換を含む改変
体である。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸に
ついて置換され、その結果、ペプチド化学の分野における当業者が、そのペプチ
ドの二次構造およびヒドロパシー性質が実質的に不変であることを予測する置換
である。アミノ酸置換は、一般的に、残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水
性および／または両親媒性の性質における類似性に基づいてなされ得る。例えば
、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げら
れ；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニンが挙げられ；そし
て、類似の親水性値を有する非荷電極性頭基を有するアミノ酸としては、ロイシ
ン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよ
びグルタミン；ならびに、セリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシ
ンが挙げられる。保存的変化を表すアミノ酸置換の例としては、以下が挙げられ
る：（１）１つ以上のＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓ
ｎ、Ｓｅｒ、またはＴｈｒ残基を、同一群に由来する１つ以上の残基で置換する
こと；（２）１つ以上のＣｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、またはＴｈｒ残基を、同一群
に由来する１つ以上の残基で置換すること；（３）１つ以上のＶａｌ、Ｉｌｅ、
Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＰｈｅ残基を、同一群に由来する１つ以上の残
基で置換すること；（４）１つ以上のＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓ残基を、同
一群に由来する１つ以上の残基で置換すること；および（５）１つ以上のＰｈｅ
、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、またはＨｉｓ残基を、同一群に由来する１つ以上の残基で置
換すること。
【００６７】 改変体はまた（または、あるいは）、例えば（１）群由来のアミノ酸残基の１
つを、（２）群、（３）群、（４）群、または（５）群由来のアミノ酸残基で置
換することによる非保存的変化を含み得る。改変体はまた（または、あるいは）
、例えば、ペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー性質に対して最小
限の影響を有する、アミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。
【００６８】 （４．２ 生物学的機能等価物） 改変および変更が、本発明のポリヌクレオチドおよびペプチドの構造において
なされ得、なお所望の特徴を有するペプチドをコードする機能的分子を獲得し得
るか、またはなお所望の発現特異性および／または特性を有する遺伝子構築物を
獲得し得る。特定のポリヌクレオチド配列中に１以上の変異を導入することがし
ばしば所望されるので、当業者に公知のポリヌクレオチド配列またはペプチド配
列中に変異を導入する種々の手段が、選択された細胞または動物種に導入され得
る異種配列の調製のために使用され得る。特定の状況下では、結果として生じる
コードペプチド配列は、この変異によって改変されるか、または他の場合では、
このペプチド配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１つ以上の変異によ
って不変である。他の状況下では、１つ以上の変化を、ポリヌクレオチド構築物
のプロモーターおよび／またはエンハンサー領域内に導入して、その発現エレメ
ントの活性または特異性を改変し、それによって、そのエレメントの制御下に作
動可能に位置付けられた治療的異種核酸セグメントの発現を改変する。
【００６９】 等価物を作製するため、またはさらに、改善された第二世代分子を作製するた
めに、発現構築物によってコードされる１つ以上の異種ペプチドのアミノ酸配列
を改変することが所望される場合、アミノ酸変化は、表１に従って、コードして
いるＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変化させることによって達成され得る。
【００７０】 例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合部位または基質分子の結
合部位のような構造と相互作用する結合能力を、検知され得るほどには損失させ
ることなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸について置換され得る。タンパク
質の生物学的機能活性を規定するのは、タンパク質の相互作用の能力および性質
であるので、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列（そして当然のことな
がら、その基になるＤＮＡコード配列）においてなされ得、それにもかかわらず
、同様の特性を有するタンパク質を獲得し得る。従って、種々の変化が、その生
物学的な有用性も活性も検知され得るほどに損失させることなく、開示された組
成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応のＤＮＡ配列において
なされ得ることが本発明者らにより意図される。
【００７１】
【表１】 このような変化を作製する際、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミ
ノ酸指数の重要性が、一般的に当該分野において理解されている（Ｋｙｔｅおよ
びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２（本明細書中で参考として援用される））。ア
ミノ酸の相対的なヒドロパシー特徴が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、
これが次いで、このタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、
ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定するということが認められている
。各アミノ酸には、その疎水性および荷電性の特徴に基づいて、ヒドロパシー指
数が割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。こ
れらは、以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；
ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン
（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−
０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−
０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．
２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（
−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニ
ン（−４．５）。
【００７２】 特定のアミノ酸が、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ
酸によって置換され得、そしてなお、類似の活性を有するタンパク質を生じ得る
（すなわち、生物学的機能の等価なタンパク質をなお獲得し得る）ということが
当該分野において公知である。このような変化を作製する際、ヒドロパシー指数
が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸の置換
が特に好ましく、そして±０．５以内のアミノ酸の置換が、さらにより特に好ま
しい。類似のアミノ酸の置換が、親水性に基づいて効率的に作製され得ることも
また、当該分野において理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（本
明細書中で参考として援用される）は、隣接アミノ酸の親水性によって支配され
るような、タンパク質の最高局所平均親水性（ｇｒｅａｔｅｓｔ ｌｏｃａｌ
ａｖｅｒａｇｅ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）が、タンパク質の生物学的特
性と相関することを記載する。
【００７３】 米国特許第４，５５４，１０１号において詳述されたように、以下の親水性値
が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋
３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；
セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グ
リシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン
（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン
（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−
１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトフ
ァン（−３．４）。アミノ酸が、類似の親水性値を有する別のアミノ酸について
置換され得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質、そして特に、免疫学的
に等価なタンパク質を獲得し得ることが理解される。このような変化において、
親水性値が、±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ
酸の置換が特に好ましく、そして±０．５以内のアミノ酸の置換が、さらにより
特に好ましい。
【００７４】 従って、上記に概説したように、アミノ酸置換は一般的に、アミノ酸側鎖の置
換基の相対的類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズなど）に基づ
く。いくつかの前述の特徴を考慮に入れた例示的な置換が、当業者に周知であり
、そしてこれには、以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸
およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギ
ン；ならびに、バリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【００７５】 本発明のペプチドおよびペプチド改変体は、そのペプチドのＮ末端において、
シグナル（または、リーダー）配列（これは、翻訳と同時または翻訳後に、ペプ
チドの移行を指示する）に対して結合体化され得る。ペプチドはまた（または、
あるいは）、ペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）の合成、精製もしくは同定を容
易にするためか、または固体支持体へのペプチドの結合を増強するために、１つ
以上のリンカー配列に結合体化され得る。例えば、ペプチドは、免疫グロブリン
Ｆｃ領域に結合体化され得る。
【００７６】 本発明のペプチドおよびペプチド改変体は、ネイティブな供給源から単離およ
び精製され得る（例えば、ネイティブなＷＴ１ペプチドから一次アミノ酸配列の
すべてまたは一部を単離することによってなど）か、あるいは、種々の任意の周
知であるペプチド合成技術を使用して、全体または一部を化学的に合成され得る
。例えば、約１００未満のアミノ酸、好ましくは、約９０もしくは８０未満のア
ミノ酸、そしてより好ましくは、約７０未満、約６０未満、または約５０未満、
約４０未満、約３０未満、もしくは約２０未満のアミノ酸を有するペプチドが、
任意の市販されている固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（こ
こでは、伸長するアミノ酸鎖に対して連続的にアミノ酸が付加される（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ、１９６３）））を使用して、合成され得る。自動化されたペプチ
ド合成のための装置が、Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆ
ｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のような供給業者から市販されており、そして製
造業者の指示書に従って操作され得る。
【００７７】 本明細書中に記載されるペプチドおよびペプチド改変体はまた、組換えＷＴ１
ペプチドから容易に調製され得るか、またはこのようなペプチドをコードするポ
リヌクレオチド配列の翻訳によって調製され得る。一般的に、当業者に公知であ
る種々の任意の発現ベクターが使用されて、組換えペプチドを発現し得る。発現
は、このペプチドをコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換またはト
ランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿
主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞および高等真核生物細胞が挙げられる
。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞株、酵母細胞株、また
は哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。
【００７８】 一般的に、本明細書中に記載されたペプチドおよびポリヌクレオチドは、単離
される。「単離された」ペプチドまたはポリヌクレオチドとは、その本来の環境
から取り出されたペプチドまたはポリヌクレオチドである。例えば、天然に存在
するペプチドまたはポリヌクレオチドは、それらが、その天然の系において共存
するいくらかの物質またはすべての物質から分離されている場合に、単離されて
いる。好ましくは、このようなペプチドは、少なくとも約８０％または８５％純
粋、より好ましくは、少なくとも約９０％または９５％純粋、そして最も好まし
くは、少なくとも約９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である。ポリヌ
クレオチドは、例えば、それらが、その天然の環境の一部ではないベクター中に
クローン化されている場合に、単離されているとみなされる。
【００７９】 さらなる局面では、本発明は、ＷＴ１ペプチドの模倣物を提供する。このよう
な模倣物は、１つ以上のアミノ酸模倣物に連結されたアミノ酸を含み得る（すな
わち、ＷＴ１タンパク質の１つ以上のアミノ酸が、アミノ酸模倣物によって置換
され得る）か、または全体的に非ペプチド性の模倣物であり得る。アミノ酸模倣
物は、立体配置的にアミノ酸に類似し、その結果、抗原特異的抗血清および／ま
たはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力を実質的に減少させることなく、
ＷＴ１ペプチドのアミノ酸について置換され得る、化合物である。非ペプチド性
の模倣物は、アミノ酸を含まず、かつＷＴ１ペプチドに類似した全体的な立体配
置を有し、その結果、ＷＴ１特異的抗血清および／またはＴ細胞株もしくはクロ
ーンと反応する模倣物の能力が、ＷＴ１ペプチドの能力と比較して実質的に減少
されない、化合物である。このような模倣物は、ペプチド配列の三次元構造を評
価する標準的な技術（例えば、核磁気共鳴およびコンピューター技術）に基づい
て、設計され得る。模倣物は、ＷＴ１ペプチドの側鎖の１つ以上の官能基が、必
ずしも同一のサイズまたは体積を有する必要はないが類似の化学的特性および／
または物理的特性（これらが、類似の生物学的応答を生じる）を有する基によっ
て置換されるように、設計され得る。本明細書中に記載の実施形態では、模倣物
が、ＷＴ１ペプチドについて置換され得ることが理解されるべきである。
【００８０】 他の例示的な実施形態では、ペプチドは、本明細書中に記載のような複数のポ
リペプチドを含む融合ポリペプチドであり得るか、または本明細書中に記載の少
なくとも１つのポリペプチドと、公知の腫瘍タンパク質のような無関連の配列と
を含む融合ポリペプチドであり得る。融合パートナーは、例えば、Ｔヘルパーエ
ピトープ（好ましくは、ヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープ）を提供
するのを補助し得る（免疫学的融合パートナー）か、またはそのネイティブな組
換えタンパク質よりも高収量でタンパク質を発現させるのを補助し得る（発現エ
ンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよ
び発現エンハンサーの両方である融合パートナーである。他の融合パートナーは
、ポリペプチドの可溶性を増加させるように選択され得るか、またはポリペプチ
ドが所望の細胞内区画に標的化されるのを可能にするように選択され得る。なお
さらなる融合パートナーとしては、ポリペプチドの精製を容易にする、アフィニ
ティータグが挙げられる。
【００８１】 融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（例えば、化学的結合）を使用し
て調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポ
リペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの
産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配
列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つの
ポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用
いてかまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’
末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される
。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポ
リペプチドへの翻訳を可能にする。
【００８２】 ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと
折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第１および第２のポリペプチド成
分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野
で周知の標準的な技術を用いて融合ポリペプチド中に組み込まれる。適切なペプ
チドリンカー配列は、以下の要因に基づいて選択され得る：（１）可撓性の伸長
したコンフォメーションを採る能力；（２）第１および第２のポリペプチド上の
機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと；およ
び（３）そのポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性残基または
荷電した残基が無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓ
ｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのようなほぼ中性の他のア
ミノ酸もまた、このリンカー配列において用いられ得る。リンカーとして有用に
用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、１９８５；Ｍｕｒｐｈ
ｙら、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１
，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。このリンカー配列は、一般
的に１アミノ酸から約１０アミノ酸、約２０アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０
アミノ酸、または約５０アミノ酸程度の長さであり得る。その第１および第２の
ポリペプチドが、機能的ドメインを分離するためおよび立体障害を防ぐために用
いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は必要とされ
ない。
【００８３】 その連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレ
メントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第１の
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳終
結シグナルおよび転写終結シグナルを終了するために必要とされる停止コドンは
、第２のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【００８４】 この融合ポリペプチドは、本明細書中に記載されるポリペプチドを、関係のな
い免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免
疫原性タンパク質）とともに含み得る。このようなタンパク質の例としては、破
傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、
Ｓｔｏｕｔｅら、１９９７を参照のこと）。
【００８５】 １つの好ましい実施形態において、その免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．に由来する（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメント）。Ｒａ１２組成物と
、異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増
強する際にそれらを使用するための方法とが、米国特許出願６０／１５８，５８
５号に記載され、その開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
簡潔にいうと、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏ
ｓｉｓ ＭＴＢ３２Ａ核酸の部分配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴ
Ｂ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性株および無毒性株中の遺伝子
によりコードされる、３２ｋＤａ分子量のセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３
２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、記載されている（例えば、米国
特許出願６０／１５８，５８５号；およびＳｋｅｉｋｙら、１９９９を参照のこ
と。これら各々が、本明細書中で参考として援用される）。このＭＴＢ３２Ａコ
ード配列のＣ末端フラグメントは、高レベルで発現し、そして精製プロセス全体
を通して可溶性ポリペプチドのままである。さらに、Ｒａ１２は、それが融合さ
れる異種面疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１
２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する
１４ｋＤａのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチ
ドは、一般に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする、少なくとも約１５個
連続するヌクレオチドか、少なくとも約３０ヌクレオチドか、少なくとも約６０
ヌクレオチドか、少なくとも約１００ヌクレオチドか、少なくとも約２００ヌク
レオチドか、または少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌク
レオチドは、ネイティブ配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部
をコードする内因性配列）を含み得るか、またはそのような配列の改変体を含み
得る。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブＲａ１２ポリペプチドを
含む融合ポリペプチドと比較して、コードされる融合ポリペプチドの生物学的活
性が実質的に減少されないように、１つ以上の置換、付加、欠失および／または
挿入を含み得る。改変体は、好ましくは、ネイティブＲａ１２ポリペプチドまた
はその一部をコードするポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも約７０％同
一性を示し、より好ましくは少なくとも約８０％同一性を示し、そして最も好ま
しくは少なくとも約９０％同一性を示す。
【００８６】 他の好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｂの表面タンパク質であるプロ
テインＤに由来する（国際特許出願公開番号ＷＯ ９１／１８９２６）。好まし
くは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質の最初のほぼ１／３（例えば、最
初のＮ末端の１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、
脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リ
ポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基が、Ｎ末端上に含まれて、さ
らなる外因性Ｔ細胞エピトープを伴うポリペプチドを提供し、そしてＥ．ｃｏｌ
ｉにおける発現レベルを増加する（そのようにして発現エンハンサーとして機能
する）。この脂質テールは、抗原提示細胞に対する抗原の最適提示を確実にする
。他の融合パートナーとしては、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク
質（ＮＳ１（赤血球凝集素））が挙げられる。代表的には、Ｎ末端の８１アミノ
酸が使用されるが、Ｔヘルパーエピトープを含む種々のフラグメントが使用され
得る。
【００８７】 別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタ
ンパク質またはその一部（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダ
ーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる）として公知のＮ−アセチル
−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成する、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕ
ｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を
特異的に分解する、自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは
、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性を担
う。この特性は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ Ｃ−ＬＹ
ＴＡ発現プラスミドの開発のために開発された。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラ
グメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている。好ましい実
施形態において、ＬＹＴＡの反復部分が、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。
反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反
復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【００８８】 なお別の例示的実施形態は、融合ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌ
クレオチドを包含し、ここでその融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２
３４号に記載されるような、エンドソーム／リソソーム区間へとポリペプチドを
指向し得る、標的化シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標
的化シグナルと融合された場合、ＭＨＣクラスＩＩ分子とより効率的に結合し、
それにより、そのポリペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞の増強されたインビボ
刺激を提供する。
【００８９】 （４．３ ポリヌクレオチド組成物） 本明細書中に記載されるＷＴ１ペプチドをコードする任意のポリヌクレオチド
、またはそのようなポリヌクレオチドと相補的な任意のポリヌクレオチドが、本
発明に含まれるＷＴ１ポリヌクレオチドである。そのようなポリヌクレオチドは
、一本鎖（コード一本鎖またはアンチセンス一本鎖）であってもまたは二本鎖で
あってもよく、そしてＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）分
子であってもまたはＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コ
ード配列が、本発明のポリヌクレオチド中に存在し得るが、その必要はなく、そ
して、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持体物質に結合され得る
が、その必要はない。ＷＴ１ポリヌクレオチドは、ネイティブＷＴ１タンパク質
をコードし得るか、または本明細書中に記載されるＷＴ１の改変体をコードし得
る。ポリヌクレオチド改変体は、ネイティブＷＴ１タンパク質と比較して、コー
ドされるペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失
および／または挿入を含み得る。コードされるペプチドの免疫原性に対する効果
は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。好ましいペプチド改
変体は、対応するネイティブの非改変型ＷＴ１配列と比較して、そのアミノ酸位
置の約２０％以下、より好ましくは約１５％以下、そしてなおより好ましくは約
１０％以下または５％以下に、アミノ酸の置換、欠失、挿入および／または付加
を含む。
【００９０】 同様に、このようなペプチド改変体をコードするポリヌクレオチドは、好まし
くは、ネイティブの非改変型ＷＴ１ペプチド配列をコードする対応するポリヌク
レオチド配列と比較して、そのヌクレオチド位置の約２０％以下、より好ましく
は約１５％以下、そしてなおより好ましくは約１０％以下または５％以下に、ヌ
クレオチドの置換、欠失、挿入および／または付加を含むべきである。当然、特
定のポリヌクレオチド改変体は、非改変体ペプチドをコードするヌクレオチド配
列の対応する領域と、実質的に相同または実質的に同一であり得る。そのような
ポリヌクレオチド改変体は、中程度にストリンジェントな条件か、高度にストリ
ンジェントな条件か、または非常に高度にストリンジェントな条件下で、ＷＴ１
ペプチドをコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補配列）にハイブリ
ダイズし得る。
【００９１】 適切な中程度にストリンジェントな条件は、以下を含む：ほぼ５×ＳＳＣ、０
．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む溶液中での予備洗
浄；約５０℃〜約６０℃の温度で５×ＳＳＣ中での一晩のハイブリダイゼーショ
ン；続いて０．１％ＳＤＳを含む、２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×
ＳＳＣのそれぞれを用いる、約６０〜６５℃で２０分間の２回の洗浄。適切な高
度にストリンジェントな条件は、以下を含む：ほぼ５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤ
Ｓ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含む溶液中での予備洗浄；約６０℃
〜約７０℃の温度で５×ＳＳＣ中での一晩のハイブリダイゼーション；続いて０
．１％ＳＤＳを含む、２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣのそれ
ぞれを用いる、約６５〜７０℃で２０分間の２回の洗浄。非常に高度にストリン
ジェントなハイブリダイゼーション条件の代表的例は、例えば、以下を含み得る
：ほぼ５×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を
含む溶液中での予備洗浄；約７０℃〜約７５℃の温度で５×ＳＳＣ中での一晩の
ハイブリダイゼーション；続いて０．１％ＳＤＳを含む、２×ＳＳＣ、０．５×
ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いる、約７０℃〜７５℃で２０分間
の２回の洗浄。このようなハイブリダイズするＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲
内にある。
【００９２】 遺伝子コードの縮重の結果として、ＷＴ１ペプチドをコードする多くのヌクレ
オチド配列が存在することが、当業者によって理解される。これらのポリヌクレ
オチドのいくつかは、どのネイティブ遺伝子のヌクレオチド配列に対しても最小
の相同性を有する。それでもなお、コドン使用法における差異により変化するポ
リヌクレオチドは、本発明により特に意図される。
【００９３】 上記のように、一旦ＷＴ１の免疫原性部分が同定されると、ＷＴ１ポリヌクレ
オチドは、種々の技術のいずれかを使用して調製され得る。例えば、ＷＴ１ポリ
ヌクレオチドは、ＷＴ１を発現する細胞から調製されたｃＤＮＡから増幅され得
る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）を介
して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、その免
疫原性部分の配列に基づいて設計され得、そして購入または合成され得る。
【００９４】 例えば、ヒトＷＴ１遺伝子のＰＣＲＴＭ増幅に適切なプライマーとしては、以
下が挙げられる：第１工程−Ｐ１１８：１４３４〜１４１４：５’−ＧＡＧＡＧ
ＴＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号５）およびＰ１３５：５
’−ＣＴＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＡＡＴＧＧＧＣ−３’（配列番号６）；第２工
程−Ｐ１３６：５’−ＧＡＧＣＡＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＧＡＣＧＴＧＣＧＧ
Ｇ−３’（配列番号７）およびＰ１３７：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＡＣＴＧＡ
ＡＣＧＧＴＣＣＣＣＧＡ−３’（配列番号８）。マウスＷＴ１遺伝子のＰＣＲＴ Ｍ 増幅に適切なプライマーとしては、以下が挙げられる：第１工程−Ｐ１３８：
５’−ＴＣＣＧＡＧＣＣＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号９）およびＰ１
３９：５’−ＧＣＣＴＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＧ−３’（配列番号１０）、
第２工程−Ｐ１４０：５’−ＧＡＧＣＡＴＧＣＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＧＡＣＧＴ
ＧＣＧＧ−３’（配列番号１１）およびＰ１４１：５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣ
ＡＡＡＧＣＧＣＣＡＣＧＴＧＧＡＧＴＴＴ−３’（配列番号１２）。
【００９５】 その後、増幅された部分は、周知技術を使用して、ヒトゲノムＤＮＡライブラ
リーまたは適切なｃＤＮＡライブラリーから全長遺伝子を単離するために使用さ
れ得る。あるいは、全長遺伝子は、複数のＰＣＲＴＭフラグメントから構築され
得る。ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチド成分を合成すること
、そして完全ポリヌクレオチドを生成するように成分をともに連結することによ
っても、調製され得る。
【００９６】 ＷＴ１ポリヌクレオチドはまた、当該分野で公知の任意の方法（化学合成（例
えば、固相ホスホロアミダイト化学合成）を含む）によって、合成され得る。ポ
リヌクレオチド配列における改変はまた、標準的な変異誘発技術（例えば、オリ
ゴヌクレオチド指向性部位特異的変異誘発（Ａｄｅｌｍａｎら、１９８３）を使
用して導入され得る。あるいは、ＲＮＡ分子が、ＷＴ１ペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列のインビトロまたはインビボでの転写によって生成され得るが、但し、
そのＤＮＡは、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳ
Ｐ６）とともに、ベクターに組み込まれる。特定の部分を使用して、本明細書中
に記載されるように、コードされたペプチドを調製し得る。さらに、またはある
いは、部分を、（例えば、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を、ＷＴ１ペプチ
ドをコードするｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトし、そしてトランスフェクト
された細胞を患者に投与することによって）コードされたポリペプチドがインビ
ボで生成されるように、患者に投与し得る。
【００９７】 ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一般に、インビトロまたは
インビボで、そのペプチドの生成のために使用され得る。コード配列と相補的な
ＷＴ１ポリヌクレオチド（すなわち、アンチセンスポリヌクレオチド）はまた、
プローブとしてかまたはＷＴ１発現を阻害するために、使用され得る。アンチセ
ンスＲＮＡへと転写され得るｃＤＮＡ構築物もまた、アンチセンスＲＮＡの生成
を容易にするように、組織の細胞中に導入され得る。
【００９８】 任意のポリヌクレオチドをさらに改変して、インビボでの安定性を増加し得る
。可能な改変としては、５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；
骨格中のホスホジエステラーゼ結合に代わる、ホスホロチオエート結合または２
’Ｏ−メチル結合の使用；ならびに／または、非伝統的塩基（例えば、イノシン
、キューオシンおよびワイブトシン、ならびにアセチル形態、メチル形態、チオ
形態、および他の改変形態の、アデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウ
リジン）の含有が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】 本明細書中に記載されるヌクレオチド配列は、確立された組換えＤＮＡ技術を
使用して、種々の他のヌクレオチド配列に結合され得る。例えば、ポリヌクレオ
チドは、種々のクローニングベクター（プラスミド、ファージミド、λファージ
誘導体およびコスミドを含む）のいずれかにクローニングされ得る。特に興味深
いベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよ
び配列決定ベクターが挙げられる。一般的に、ベクターは、少なくとも１つの生
物において機能的な複製起点、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位および１以上
の選択可能なマーカーを含む。他のエレメントは、所望される用途に依存し、そ
して当業者に明らかである。
【０１００】 特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の細胞内への侵入、
およびその細胞内での発現を可能にするように処方され得る。このような処方物
は、以下に記載のような、治療目的に特に有用である。標的細胞におけるポリヌ
クレオチドの発現を達成するための多くの方法が存在し、そして任意の適切な方
法が使用され得ることを、当業者は認識する。例えば、ポリヌクレオチドは、ウ
イルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイル
ス、またはワクシニアウイルスあるいは他のポックスウイルス（例えば、トリポ
ックスウイルス）が挙げられるが、限定されない）に組み込まれ得る。ＤＮＡを
このようなベクターに組み込むための技術は、当業者に周知である。レトロウイ
ルスベクターは、さらに、選択マーカーの遺伝子（形質導入された細胞の同定ま
たは選択を補助するため）および／または標的部分の遺伝子（例えば、特定の標
的細胞上のレセプターについてのリガンドをコードする遺伝子）を、移入するか
または組み込んで、そのベクターを標的特異的にし得る。標的化はまた、当業者
に公知の方法によって、抗体を使用して達成され得る。このようなベクター中の
ｃＤＮＡ構築物は、例えば、ＷＴ１陽性腫瘍モデルを確立することにおける使用
のためにヒト細胞株または動物細胞株をトランスフェクトするために使用され得
、このＷＴ１陽性腫瘍モデルは、腫瘍増殖阻害または白血病増殖阻害またはその
ような細胞の溶解を示すための腫瘍保護実験および養子免疫実験を実施するため
に使用され得る。
【０１０１】 ポリヌクレオチドについての他の治療処方物としては、コロイド分散系（例え
ば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズおよび脂質ベース系
（水中油滴型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む））
が挙げられる。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとしての使用のため
に好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。このよ
うな系の調製および使用は、当該分野で周知である。
【０１０２】 （４．４ 核酸送達およびＤＮＡトランスフェクションの方法） 特定の実施形態において、本明細書中に開示される１つ以上のＲＮＡもしくは
ＤＮＡおよび／または置換ポリヌクレオチド組成物が、適切な宿主細胞をトラン
スフェクトするために使用されることが、意図される。ＲＮＡおよびＤＮＡなら
びにそれらを含むベクターを適切な宿主細胞中に導入するための技術は、当業者
に周知である。特に、１つ以上の活性ペプチド、化合物またはワクチンの治療投
与が、１つ以上の目的の治療化合物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド構
築物の発現を介して達成される場合、そのようなポリヌクレオチドは、１つ以上
の細胞を遺伝的に形質転換するために使用され得る。
【０１０３】 適切な標的細胞中にポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを導入する
ための種々の手段は、当業者に公知である。例えば、ポリヌクレオチドが細胞へ
の送達について意図される場合、培養された哺乳動物細胞中に発現構築物を移入
するためのいくつかの非ウイルス性方法が、当業者にとってその使用のために利
用可能である。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：リン酸カルシウム
沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯ
ｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストラン
沈殿（Ｇｏｂａｌ、１９８５）；エレクトロポレーション（ＷｏｎｇおよびＮｅ
ｕｍａｎｎ、１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９
８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４；Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８；Ｖａｎｂｅｖｅ
ｒら、１９９８）；直接のマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９
８０；ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡをロード
したリポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、
１９７９；Ｔａｋａｋｕｒａ、１９９８）ならびにリポフェクタミン−ＤＮＡ複
合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微粒子銃を
使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｋｌｅｉｎら、１９
９２）、ならびにレセプター媒介性トランスフェクション（Ｃｕｒｉｅｌら、１
９９１；Ｗａｇｎｅｒ、１９９２；ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ
、１９８８）。これらの技術のうちのいくつかは、インビボまたはエキソビボで
の使用に首尾良く適合され得る。
【０１０４】 開示される発現ベクターのうちの１つ以上で形質転換された細菌細胞、酵母細
胞、または動物細胞は、本発明の重要な局面を示す。このような形質転換宿主細
胞は、しばしば、本明細書中に開示される種々のＤＮＡ遺伝子構築物の発現にお
ける使用に望ましい。本発明のいくつかの局面において、本明細書中に開示され
る遺伝子セグメントの発現を、調整、調節、または制御することが、しばしば望
ましい。そのような方法は、分子遺伝学の分野の当業者にとって慣用的である。
代表的には、特定の遺伝子の発現の増加または過剰発現が望まれる場合、種々の
操作が、特に活性プロモーター（特に、本明細書中に開示されるもののような、
組織特異的プロモーター）を使用することによって、そして特定の形質転換宿主
細胞におけるメッセンジャーＲＮＡの安定性を増加する配列を使用することによ
って、メッセンジャーＲＮＡの発現を増強するために、使用され得る。
【０１０５】 代表的には、開始および翻訳終結領域は、終止コドン、ターミネーター領域、
そして必要に応じて、ポリアデニル化シグナルを含む。転写の方向（すなわち、
コード配列もしくはセンス配列の５’から３’への方向）で、その構築物は、転
写調節領域（もしあれば）、およびプロモーター（調節領域はそのプロモーター
の５’側または３’側のいずれかであり得る）、リボソーム結合部位、開始コド
ン、その開始コドンと相があったオープンリーディングフレームを有する構造遺
伝子、終止コドン、ポリアデニル化シグナル配列（もしあれば）、およびターミ
ネーター領域を含む。この配列は、二本鎖として、微生物宿主または真核生物宿
主の形質転換のために単独で使用され得るが、通常は、マーカーを含むＤＮＡ配
列とともに含まれ、その第２のＤＮＡ配列は、その宿主中へのそのＤＮＡの導入
の間に発現構築物に結合され得る。
【０１０６】 機能的複製系が存在しない場合、その構築物はまた、好ましくは、その宿主に
中の配列と少なくとも約３０塩基対（ｂｐ）、または少なくとも約４０塩基対ま
たは少なくとも約５０塩基対程度相同な配列の配列を含み、好ましくは少なくと
も約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、または約９０ｂｐ〜約１００ｂｐ程度
相同な配列の配列を含み、そして通常は約５００ｂｐ〜約１０００ｂｐ以下相同
な配列の配列を含む。この様式で、正当な組換えの確立が増大し、その結果、そ
の遺伝子は、その宿主中に組込まれ、そしてその宿主によって安定に維持される
。望ましいことには、その発現構築物の調節領域は、相補性を提供する選択した
治療遺伝子および競合的利点を提供する遺伝子に近接（しそしてまたこれらの遺
伝子に対して作動可能に位置）する。従って、その治療遺伝子が失われる事象に
おいて、生じた生物は、その競合利点を提供する遺伝子も失う可能性があり、そ
の結果、その生物は、インタクトな構築物を保持する遺伝子と、その環境におい
て競合できない。
【０１０７】 その選択した治療遺伝子は、転写開始領域および翻訳開始領域と転写終結領域
および翻訳終結領域との間に、その開始領域の調節制御下にあるように、導入さ
れ得る。この構築物は、プラスミドに含まれ得、このプラスミドは、少なくとも
１つの複製系を含むが、１つより多くを含み得、１つの複製系がそのプラスミド
の開発の間のクローニングに使用される場合、その第２の複製系が、最終宿主細
胞（この場合は、哺乳動物宿主細胞）において機能するために必要である。さら
に、以前に記載された１つ以上のマーカーが、存在し得る。組み込みが望まれる
場合、そのプラスミドは、望ましくは、その宿主ゲノムと相同な配列を含む。
【０１０８】 本明細書中に開示される遺伝子または他の核酸セグメントは、当該分野で周知
の種々の技術を使用して宿主細胞に挿入され得る。細胞中に核酸セグメントを送
達するための以下の５つの一般的方法が、記載されている：（１）化学的方法（
ＧｒａｈａｍおよびＶａｎＤｅｒＥｂ、１９７３）；（２）物理学的方法（例え
ば、マイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ、１９８０）、エレクトロポ
レーション（米国特許第５，４７２，８６９号；ＷｏｎｇおよびＮｅｕｍａｎｎ
、１９８２；Ｆｒｏｍｍら、１９８５）、微粒子銃（本明細書中にその全体が参
考として特に援用される米国特許第５，８７４，２６５号）、「遺伝子銃」（Ｙ
ａｎｇら、１９９０））；（３）ウイルスベクター（ＥｇｌｉｔｉｓおよびＡｎ
ｄｅｒｓｏｎ、１９８８）；（４）レセプター媒介機構（Ｃｕｒｉｅｌら、１９
９１；Ｗａｇｎｅｒら、１９９２）；および（５）細菌媒介形質転換。
【０１０９】 （４．５ ＷＴ１特異的抗体およびその抗原結合フラグメント） 本発明は、さらに、本明細書中に開示される少なくとも第１のペプチドまたは
ペプチド改変体に特異的に結合する（かまたは免疫特異的である）抗体およびそ
の抗原結合フラグメントを提供する。本明細書において用いられる場合、抗体ま
たは抗原結合フラグメントは、ペプチドと検出可能なレベルで反応し（例えば、
ＥＬＩＳＡにおいて）、そして同様の条件下で無関係のペプチドもしくはタンパ
ク質とは検出可能には反応しない場合、そのペプチドに「特異的に結合する」と
いわれる。本明細書において用いられる場合、「結合」は、「複合体」が形成さ
れるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、
その複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。その
結合定数は、その複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般
に、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中
で２つの化合物は「結合する」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法
を用いて決定され得る。
【０１１０】 上記の要件を満たす任意の薬剤が、結合剤であり得る。例示的実施形態におい
て、結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。そのような抗体は
、当業者に公知の種々の技術（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）のいず
れかによって調製され得る。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細
胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか
、または適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランス
フェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、そのペプチドを
含む免疫原は、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツ
ジ、またはヤギ）のいずれかにまず注射される。この段階で、本発明のペプチド
は、改変なしの免疫原として作用し得る。あるいは、特に、比較的短いペプチド
について、そのペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンま
たはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合している場合、優れた免疫応答
が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブ
ースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてその動物は、
定期的に採血される。次いで、そのペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、
例えば、適切な固体支持体に結合しているそのペプチドを用いるアフィニティー
クロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０１１１】 目的の抗原性ペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅ
ｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）の技術およびその改良法を用いて、調製
され得る。手短に言えば、これらの方法は、所望する特異性（すなわち、目的の
ポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を含む
。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾
臓細胞から調製され得る。次いで、この脾臓細胞は、例えば、（好ましくは、免
疫化された動物と同質遺伝子的である）ミエローマ細胞融合パートナーとの融合
によって不死化され得る。種々の融合技術が利用され得る。例えば、脾臓細胞お
よびミエローマ細胞は、数分間、非イオン性の界面活性剤と組み合わされ得、次
にハイブリット細胞の増殖を支持するがミエローマ細胞の増殖を支持しない選択
培地上に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技法は、ＨＡＴ（ヒポキサン
チン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いる。十分な時間（通常約１〜２週
間）の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そ
してこれらの培養上清がペプチドに対する結合活性について試験される。高い反
応性および特異性を有するハイブリドーマが、好ましい。
【０１１２】 モノクローナル抗体は、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され
得る。さらに、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔内へのハイブリド
ーマ細胞株の注射のような種々の技法が、収量の増加のために利用され得る。次
いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から収集され得る。夾雑物は、ク
ロマトグラフィー、ゲルろ過、沈降、および抽出のような従来の技法によってこ
の抗体から除去され得る。本発明のペプチドは、例えば、アフィニティクロマト
グラフィー工程における精製プロセスにおいて用いられ得る。
【０１１３】 特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用は好ましくあり
得る。このようなフラグメントは、Ｆａｂフラグメントを含み、これは、標準的
な技術を用いて調製され得る。要するに、免疫グロブリンは、プロテインＡビー
ズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによってウサギ血清から精製さ
れ得（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８）、そしてパパインによって消化
されてＦａｂおよびＦｃフラグメントを生成し得る。Ｆａｂフラグメントおよび
Ｆｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラムでのアフィニティークロマトグ
ラフィーによって、分離され得る。
【０１１４】 モノクローナル抗体およびそのフラグメントは、１つ以上の治療剤に結合され
得る。この点において、適切な物質としては、放射性トレーサー、および化学療
法剤（これは、例えば、インビトロにおいて自系の骨髄をパージするために用い
られ得る）が挙げられる。代表的な治療剤としては、放射性核種、分化誘導物質
、薬物、毒素、およびそれらの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種として
、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａ
ｔ、および２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物として、メトトレキセート、
ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化
誘導物質として、フォルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素
として、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏ
ｎｉｎ）、シュードモナス外毒素、赤痢菌毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウ
ィルス性タンパク質が挙げられる。診断目的では、放射性因子の結合が、転移の
追跡を容易にするために、またはＷＴ１陽性腫瘍の位置を確認するために用いら
れ得る。
【０１１５】 治療薬は、適切なモノクローナル抗体と、直接的にかまたは（例えば、リンカ
ー基を介して）間接的にかのいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。各
々が、他と反応し得る置換基を有する場合、薬剤と抗体との間の直接的な反応が
可能である。例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基のような求核基は、無水
物または酸ハロゲン化物のようなカルボニル含有基と、あるいは他方では良好な
脱離基（例えば、ハロゲン化物）を有するアルキル基と反応し得る。
【０１１６】 あるいは、リンカー基を介して治療薬と抗体と結合することが望ましいであろ
う。リンカー基は、結合能力の妨害を避けるために、薬剤から抗体を離すスペー
サーのように機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学
反応性を増大するために供し得、従って結合効率を増大する。化学反応性の増大
はまた、（そうでなければ不可能である）薬剤または薬剤上の官能基の使用を容
易にし得る。
【０１１７】 ホモ官能性およびヘテロ官能性の両方の種々の二官能性試薬または多官能性試
薬（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ
Ｌのカタログに記載されているもの）が、リンカー基として利用され得ることが
当業者に明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、
スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を通じてなされ得る。このよ
うな方法論（米国特許第４，６７１，９５８号）を記載する多数の参考文献が存
在する。
【０１１８】 本発明の免疫複合体の抗体部分がないときに治療薬がより効き目のある場合は
、細胞中への内在化の間か、あるいは内在化の際に切断され得るリンカー基を用
いることが望ましいだろう。多数の異なる切断可能なリンカー基が、記載されて
いる。これらリンカー基からの薬剤の細胞内放出に関するメカニズムとして、ジ
スルフィド結合の還元（米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射
（米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解
（米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体を媒介した加水分解（米国特許
第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（米国特許第４，５６９，７
８９号）による切断が挙げられる。
【０１１９】 抗体に対する１つ以上の薬剤の結合が所望され得る。１つの実施形態において
、薬剤の複数の分子が、１つの抗体分子に対して結合される。別の実施形態にお
いて、１つ以上のタイプの薬剤が、１つの抗体分子に対して結合され得る。特定
の実施形態に関係なく、１つより多くの薬剤を有する免疫複合体が、多様な方法
で調製され得る。例えば、１つより多くの薬剤が、抗体分子に直接的に結合され
得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが用いられ得る。あ
るいは、キャリアが用いられ得る。キャリアは、直接的にかまたはリンカー基を
介してかのいずれかでの共有結合を含む、多様な方法でこの薬剤を保持し得る。
適切なキャリアとして、アルブミンようなタンパク質（米国特許第４，５０７，
２３４号）、アミノデキストランのようなペプチドおよびポリサッカライド（米
国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、非共有結合に
よるか、またはカプセル化（例えば、リポソーム小胞中（米国特許第４，４２９
，００８号および米国特許第４，８７３，０８８号））により薬剤を運び得る。
放射性核種薬剤に特異的なキャリアとして、放射ハロゲン化（ｒａｄｉｏｈａｌ
ｏｇｅｎａｔｅｄ）低分子およびキレート化合物が挙げられる。例えば、米国特
許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射ハロゲン化低分子およびそれらの合
成を開示する。放射性核種キレートは、金属放射性核種、または金属酸化物放射
性核種を結合するための供与体原子として、窒素原子および硫黄原子を含むよう
なキレート化合物から形成され得る。例えば、米国特許第４，６７３，５６２号
は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０１２０】 この抗体および免疫複合体に関して種々の投与経路が用いられ得る。代表的に
は、投与は、静脈内、筋肉内、皮下、または切除した腫瘍の床（ｂｅｄ）内であ
る。抗体／免疫複合体の正確な用量は、用いる抗体、腫瘍に対する抗原密度、お
よび抗体のクリアランス速度に依存して変化することが明らかである。
【０１２１】 本明細書において、またＷＴ１の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗
体が提供される。このような抗体は、周知の技術を用いて、ＷＴ１の免疫原性部
分に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合フラグメントに対して惹起され
得る。ＷＴ１の免疫原性部分を模倣する抗イディオタイプ抗体は、本明細書に記
載のように、ＷＴ１の免疫原性部分に特異的に結合する、抗体、またはその抗原
結合フラグメントに結合する抗体である。
【０１２２】 元々のＷＴ１ペプチド特異的抗体の供給源にかかわりなく、インタクトな抗体
、抗体マルチマー、またはこの抗体の種々の抗原結合領域のいずれか１つが、本
発明において用いられ得る。代表的な機能的領域としては、ＷＴ１ペプチド特異
的抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント
が挙げられる。このような構築物を調製するための技術は、当業者に周知であり
、そして本明細書においてさらに例示されている。
【０１２３】 抗体構築物の選択は、種々の因子によって影響され得る。例えば、長い半減期
は、免疫グロブリンのＦｃ部分の特徴である、腎臓内のインタクトな抗体の能動
的再吸収によって生じ得る。従って、ＩｇＧベースの抗体は、Ｆａｂ’対応物よ
りも遅い血中クリアランスを示すことが予期される。しかし、Ｆａｂ’フラグメ
ントベースの組成物は、一般に、より良好な組織浸潤能力を示す。
【０１２４】 抗体フラグメントは、非特異的なプロテアーゼであるパパインによる免疫グロ
ブリン全体のタンパク質分解によって得られ得る。パパイン消化は、「Ｆａｂフ
ラグメント」と呼ばれる２つの同一な抗原結合フラグメント（そのそれぞれは、
単一の抗原結合部位を有する）および残りの「Ｆｃフラグメント」を生成する。
【０１２５】 パパインは、システイン、２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトー
ルで、活性部位のスルフヒドリル基を還元することによってまず活性化されるべ
きである。貯蔵酵素中の重金属は、最大の酵素活性を確実にするために、ＥＤＴ
Ａ（２ｍＭ）でのキレート化によって取り除かれるべきである。酵素および基質
は、通常、１：１００の重量比で一緒に混合される。インキュベーション後、反
応は、ヨードアセトアミドでのチオール基の不可逆的なアルキル化によってか、
または単に透析によって停止され得る。消化の完全性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
ってモニターされ、そして種々の画分は、プロテインＡセファロースまたはイオ
ン交換クロマトグラフィーによって分離されるべきである。
【０１２６】 ウサギまたはヒト起源のＩｇＧ由来のＦ（ａｂ’）２フラグメントの調製のた
めの通常の手順は、酵素であるペプシンによる限定タンパク質分解（ｌｉｍｉｔ
ｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ）である。この条件は、酢酸緩衝液、ｐＨ４．５
、３７℃で１００×抗体過剰（ｗｔ／ｗｔ）であり、このことは、抗体が内部重
鎖ジスルフィド結合のＣ末端側で切断されることを示唆する。マウスＩｇＧの消
化の速度は、サブクラスで変化し得、そしてある程度の未消化のＩｇＧも完全に
分解されたＩｇＧもなしに、高い収率の活性なＦ（ａｂ’）２フラグメントを得
ることは困難かもしれない。詳細には、ＩｇＧ２ｂは、完全な分解に非常に感受
性である。他のサブクラスは、至適の結果を生成するために異なるインキュベー
ション条件を必要とするが、その全てが当該分野で公知である。
【０１２７】 インタクトな抗体のペプシン処理は、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する
。このフラグメントは、２つの抗原結合部位を有し、そして依然として抗原と架
橋し得る。ペプシンでのラットＩｇＧの消化は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．
５）中での透析、次いで１％（ｗｔ／ｗｔ）ペプシンとの４時間のインキュベー
ションを含む条件を必要とする；ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ消化は、最初に、０
．１Ｍギ酸緩衝液（ｐＨ２．８）で４℃１６時間、続いて酢酸緩衝液に対して透
析した場合に、改善される。ＩｇＧ２ｂでは、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ
Ｖ８プロテアーゼ（３％ｗｔ／ｗｔ）を含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ７．８）３７℃４時間でのインキュベーションによって、より堅実な結
果が得られる。
【０１２８】 Ｆａｂフラグメントはまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメ
イン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体のヒンジ領域由来の１つ
以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端の２〜３の残
基の付加によってＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメ
ントは、元々、Ｆａｂ’フラグメントの対（その間にヒンジシステインを有する
）として産生された。抗体フラグメントの他の化学結合もまた公知である。
【０１２９】 用語「可変性（ｖａｒｉａｂｌｅ）」とは、本明細書において抗体に関して用
いる場合、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列が非常に異なっていること
を意味し、そしてその特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性にお
いて用いられる。しかし、この可変性は、抗体の可変ドメインにわたって均等に
は分布していない。これは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方にある、「超
可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」と名づけられた３つ
の部分に集中している。
【０１３０】 可変性ドメインの、さらに高度に保存された部分は、フレームワーク領域（Ｆ
Ｒ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、４つのＦ
Ｒ（それぞれ、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）を含み、これは３つの超
可変領域に接続されたβシート構成（ループ接続を形成する）にかなり適合して
おり、そしてある場合には、βシート構造の一部を形成する。
【０１３１】 各鎖における超可変領域は、ＦＲに近接して一緒に保持され、そして他の鎖由
来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら
、１９９１、参考として本明細書に詳細に援用される）。定常ドメインは、抗原
に対する抗体の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗
体依存性細胞毒性における抗体の関与）を示す。
【０１３２】 用語、「超可変領域」とは、本明細書において用いる場合、抗原結合を担う抗
体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」
由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２４〜３４（Ｌ
１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイ
ンにおける３１〜３５（Ｈ１）、５０〜５６（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３
）（Ｋａｂａｔら、１９９１、参考として本明細書に詳細に引用されている））
、および／または「超可変ループ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ド
メインにおける残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６
（Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインにおける２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５
（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３））を含む。「フレームワーク」すなわち「
ＦＲ」残基は、本明細書において規定された超可変領域残基以外の可変ドメイン
残基である。
【０１３３】 「Ｆｖ」フラグメントは、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体フ
ラグメントである。この領域は、１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの
、緊密な共有結合による、二量体（ダイマー）からなる。この構成においては、
各可変ドメインの３つの超可変領域が、相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表
面上の抗原結合部位を規定する。まとめると、６つの超可変領域が抗体に対して
抗原結合特異性を付与する。しかし、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的
な３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分）でさえ、抗原を認識してかつこれ
に結合する能力を有する（ただし、結合部位全体よりも低い親和性である）。
【０１３４】 「単鎖Ｆｖ」すなわち「ｓＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨおよびＶＬ ドメインを含む。ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する
。一般に、Ｆｖポリペプチドは、さらに、抗原結合のために、ｓＦｖに所望の構
造を形成させることができるＶＨドメインとＶＬドメインとの間のポリペプチド
リンカーを、含む。
【０１３５】 「二価抗体（ダイボディ）（ｄｉａｂｏｄｙ）」とは、２つの抗原結合部位を
有する小さい抗体フラグメントである。このフラグメントは、同じポリペプチド
鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメ
イン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の上の２つのドメインの間の対合を可能にするには
短すぎるリンカーを用いることにより、このドメインは、別の鎖の相補性ドメイ
ンと対合するように強制され、そして２つの抗原結合部位を作成する。二価抗体
は、欧州特許出願番号ＥＰ４０４，０９７および国際特許出願公開番号ＷＯ９３
／１１１６１（各々は本明細書において参考として詳細に援用されている）に記
載されている。二価特異的または単特異的であり得る「リンカー抗体」は、Ｚａ
ｐａｔａら（１９９５）（本明細書において参考として詳細に援用されている）
に記載のように、１対の抗原結合領域を形成する並列の１対のＦｄセグメント（
ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む。
【０１３６】 他の型の改変体は、その改変体が生成された親の抗体に対して改善された生物
学的特性を有する抗体である。このような改変体または第２世代化合物は、代表
的には、親の抗体の１つ以上の置換された可変領域残基を含む置換改変体である
。このような置換改変体を生成する都合のよい方法は、ファージディスプレイを
用いるアフィニティー（親和性）成熟である。
【０１３７】 ファージディスプレイを用いるアフィニティー成熟（親和性成熟）では、いく
つかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）が、変異されて、各部位において
、全ての可能性のあるアミノ置換を生成する。このように生成された抗体改変体
は、糸状ファージ粒子から、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ
産物に対する融合物として、一価の様式で提示される。ファージディスプレイ（
提示）された改変体は、次に、本明細書に開示されるように、その改変体の生物
学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための
候補の超可変領域部位を同定するため、抗原結合に有意に寄与することが同定さ
れている超可変領域残基において、アラニンスキャンニング変異誘発を実施し得
る。
【０１３８】 あるいは、またはさらに、抗原抗体複合体の結晶構造を描写し、分析して抗体
と標的との間の接触点を同定し得る。このような接触残基および隣接残基は、置
換の候補である。一旦このような改変体が生成されれば、改変体のパネルは、ス
クリーニングに供され、そして類似であるが、１つ以上の関連のアッセイにおい
て異なるかまたはなお優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択さ
れる。
【０１３９】 抗体のＦａｂ’または抗原結合フラグメント（組織浸透に付随する利点を有す
る）を使用するにおいて、このフラグメントを改変することから、その半減期を
延長するというさらなる利点を誘導し得る。種々の技術（例えば、抗体分子自体
の操作または改変）、およびまたは不活性キャリアに対する結合体化が使用され
得る。標的に対して薬剤を送達するのではなく、半減期を延長するためだけの任
意の結合体化は、組織に浸透するために、Ｆａｂ’および他のフラグメントが選
択されるという点で、注意深くアプローチされるべきである。それにもかかわら
ず、非タンパク質ポリマー（ＰＥＧなど）に対する結合体化が意図される。
【０１４０】 従って、結合体化以外の改変は、抗体フラグメントをさらに安定にするか、お
よび／または身体中の異化作用の速度を低下するように、抗体フラグメントの構
造を改変することに基づく。このような改変のための１つの機構は、Ｌ−アミノ
酸の代わりのＤ−アミノ酸の使用である。当業者は、このような改変の導入には
、その後に、得られた分子の厳密な試験を行って、所望の生物学的特性がなお保
持されていることを確認することが必要であることを理解する。さらなる安定化
のための改変は、生物学的分子の半減期を延長するために一般に用いられる、Ｎ
末端もしくはＣ末端のいずれか、またはその両方に対する安定化部分の付加の使
用を含む。例示のみの目的であるが、アシル化またはアミノ化による末端の改変
を所望し得る。
【０１４１】 本発明での使用のための中度の結合体化改変は、抗体フラグメントに対するサ
ルベージレセプター結合エピトープの組み込みを含む。これを達成するための技
術としては、抗体フラグメントの適切な領域の変異、または抗体フラグメントに
結合されたペプチドタグとしてのエピトープの組み込みが挙げられる。国際特許
出願公開番号ＷＯ９６／３２４７８は、このような技術をさらに例示する目的で
参考として本明細書に詳細に援用されている。サルベージレセプター結合エピト
ープは、代表的に、抗体フラグメント上の類似の位置に移されている、Ｆｃドメ
インの１または２のループ由来の３以上のアミノ酸の領域である。国際特許出願
公開番号ＷＯ９８／４５３３１に開示のサルベージレセプター結合エピトープは
、本発明での使用のための参考として本明細書に援用されている。
【０１４２】 （４．６ ＷＴ１ペプチドに特異的なＴ細胞組成） 免疫療法組成物は、同様に、または代替的に、ＷＴ１に特異的なＴ細胞を含み
得る。このような細胞は、一般的に、標準的技術を用いてインビトロまたはイン
ビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、Ｎ
ｅｘｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なＩｓｏｌｅｘ ＴＭ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；また、米国特許第５，２４０，８５６
号；米国特許第５，２１５，９２６号；国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０６２
８０；国際特許出願公開番号ＷＯ９１／１６１１６および国際特許出願公開番号
ＷＯ９２／０７２４３を参照のこと））を用いて、骨髄、末梢血または哺乳動物
（例えば、患者）の骨髄もしくは末梢血の画分内に（またはそれらから単離され
て）存在し得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または非関連のヒト、非ヒト哺乳動
物の細胞株または培養物から得られ得る。
【０１４３】 Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、
および／またはＷＴ１ペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）で刺激され得
る。このような刺激は、ＷＴ１ペプチドに特異的なＴ細胞の生成を可能にするの
に十分な条件および時間で実施される。好ましくは、ＷＴ１ペプチドまたはポリ
ヌクレオチドは、抗原特異的Ｔ細胞の生成を容易にする、送達ビヒクル（例えば
マイクロスフェア）内に存在する。要するに、慣用的な技術（例えば、末梢血リ
ンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）密度勾配遠心分離）によっ
て、患者からまたは関連もしくは非関連ドナーから単離され得るＴ細胞が、ＷＴ
１ペプチドとインキュベートされる。例えば、Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチド（例え
ば、５〜２５μｇ／ｍｌ）と、またはかなりの量のＷＴ１ペプチドを合成する細
胞とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）インビトロでインキュベ
ートされ得る。コントロールとして用いるために、ＷＴ１ペプチドの非存在下で
、Ｔ細胞サンプルの別のアリコートをインキュベートすることが所望され得る。
【０１４４】 Ｔ細胞がＷＴ１ペプチドでコートされた標的細胞、またはこのようなペプチド
をコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合、このＴ細胞はＷＴ１ペ
プチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、任意の種々の標準的技術
を用いて評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおい
て、陰性コントロールと比べた場合、溶解および／または増殖における、２倍よ
り大きな刺激係数は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃ
ｈｅｎら（１９９４）に記載のように実施され得る。あるいは、Ｔ細胞増殖の検
出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ
合成の増大した速度を測定することによって（例えば、トリチウム化チミジンを
用いるＴ細胞のパルス表示培養およびＤＮＡに取り込まれるトリチウムチミジン
の量を測定することによって）検出され得る。Ｔ細胞増殖を検出するための他の
方法としては、インターロイキン−２（ＩＬ−２）生成、Ｃａ２＋流、または色
素取り込み（例えば、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５
−ジフェニル−テトラゾリウム）の増大を測定する工程が挙げられる。あるいは
、リンホカイン（例えば、インターフェロンγ）の合成が測定され得るか、また
はＷＴ１ペプチドに反応し得るＴ細胞の相対数が定量され得る。３〜７日間のＷ
Ｔ１ペプチドとの接触（２００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０
０ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）は、Ｔ細胞の増殖における少なくとも２倍の増
大を生じるはずであり、そして／または２〜３時間の上記のような接触では、Ｔ
細胞の活性化を生じるはずである（標準的サイトカインアッセイ（ここで、サイ
トカイン放出（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）のレベルにおける２倍の増大
は、Ｔ細胞活性化の指標である）を用いて測定した場合）（Ｃｏｌｉｇａｎら、
１９９８）。ＷＴ１特異的Ｔ細胞は、標準的技術を用いて増殖され得る。好まし
い実施形態において、Ｔ細胞は患者から、または関連もしくは非関連のドナーか
ら誘導され、そして刺激および増殖後に患者に投与される。
【０１４５】 ＷＴ１ペプチド、ポリヌクレオチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活性化
されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。ＣＤ４＋または
ＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化は、種々の方法で検出され得る。特異的Ｔ細胞活
性化を検出するための方法は、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えば、リンホカ
イン）の生成、または細胞溶解性活性の生成（すなわち、ＷＴ１に特異的な細胞
傷害性Ｔ細胞の生成）を検出する工程を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、特異的
Ｔ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。Ｃ
Ｄ８＋Ｔ細胞について、特定のＴ細胞活性化を検出するための好ましい方法は、
細胞溶解性活性の生成の検出である。
【０１４６】 治療目的のために、ＷＴ１ペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答し
て増殖するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいず
れかで数が増加され得る。インビトロにおけるこのようなＴ細胞の増殖は、種々
の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インター
ロイキン２）および／またはＷＴ１ペプチドを合成する刺激細胞の追加ありでま
たはなしで、ＷＴ１ペプチドに再曝露され得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する
刺激細胞の追加が好ましい。Ｔ細胞は、ＷＴ１ペプチドでの間欠的再刺激に応答
して、特異性を保持しながらインビトロで多数に増殖され得る。要するに、初回
のインビトロ刺激（ＩＶＳ）のために、多数のリンパ球（例えば、４×１０７よ
り多数）が、ヒト血清を含有する培地を含むフラスコに入れられ得る。ＷＴ１ペ
プチド（例えば、１０μｇ／ｍｌのペプチド）は、破傷風毒素（例えば、５μｇ
／ｍｌ）と一緒に直接添加され得る。次いでこのフラスコは、インキュベートさ
れ得る（例えば、７日間で３７℃）。第二回目のＩＶＳでは、次にＴ細胞が回収
され、そして２〜３×１０７個の照射末梢血単核球とともに新しいフラスコに入
れられる。ＷＴ１ペプチド（例えば、１０μｇ／ｍｌ）を直接添加する。このフ
ラスコを３７℃で７日間インキュベートする。第二回目のＩＶＳ後、２日目およ
び４日目に、２〜５単位のインターロイキン２（ＩＬ−２）を添加し得る。３回
目のＩＶＳでは、Ｔ細胞がウェルに入れられ、そしてペプチドでコートされた、
個体の自己のＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を用いて刺激され得る。ＩＬ−２は、各サイ
クルの２日目および４日目に添加され得る。細胞が細胞傷害性Ｔ細胞に特異的で
あることが示されればすぐに、それらの細胞を２日目、４日目および６日目に、
さらに高いＩＬ−２（２０単位）を用いる１０日間刺激サイクルを用いて増殖し
得る。
【０１４７】 あるいは、ＷＴ１ペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニ
ングによって、数を増加され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該
分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。応答Ｔ細胞
は、感作された患者の抹消血液からの密度勾配遠心分離、およびヒツジ赤血球の
ロゼット形成によって精製され得、そして照射された自己由来フィラー細胞の存
在下で正常な抗原で刺激することによって、培養中に樹立され得る。ＣＤ４＋Ｔ
細胞株を生じさせるために、ＷＴ１ペプチドが、抗原性刺激として使用され、そ
してエプスタイン−バーウイルスでの感染によって不死化した自己由来の末梢血
液リンパ球（ＰＢＬ）またはリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）が、抗原提示細胞とし
て使用される。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を生じさせるために、ＷＴ１ペプチドを産生す
る発現ベクターでトランスフェクトされた自己由来の抗原提示細胞が、刺激細胞
として使用され得る。樹立されたＴ細胞株は、刺激されたＴ細胞を９６ウェル平
底プレート中１ウェルあたり０．５細胞の頻度で、１×１０６の照射したＰＢＬ
細胞またはＬＣＬ細胞および組換えインターロイキン−２（ｒＩＬ２）（５０Ｕ
／ｍｌ）とともにプレートすることによる抗原刺激の後２〜４日間クローニング
され得る。樹立したクローン増殖を有するウェルは、最初のプレーティング後約
２〜３週間後に同定され得、そして自己由来の抗原提示細胞の存在下で適切な抗
原で再刺激され得、引き続いて、抗原提示の２〜３日後に、低用量のｒＩＬ２（
１０Ｕ／ｍｌ）の添加によって増殖され得る。Ｔ細胞クローンは、抗原およびｒ
ＩＬ２での約２週間ごとの周期的な再刺激によって、２４ウェルプレート内に維
持され得る。クローニングおよび／または増殖された細胞は、例えば、Ｃｈａｎ
ｇら、（１９９６）に記載のように、患者に投与し戻され得る。
【０１４８】 特定の実施形態において、同種異型のＴ細胞が、インビボおよび／またはイン
ビトロでプライムされ得る（すなわち、ＷＴ１に対して感作され得る）。このよ
うなプライミングは、Ｔ細胞を、ＷＴ１ペプチド、このようなペプチドをコード
するポリヌクレオチド、またはこのようなペプチドを産生する細胞と、Ｔ細胞の
プライミングを可能にするに十分な条件下で、そしてそのような時間にわたって
接触させることによって、達成され得る。一般に、Ｔ細胞は、例えば、ＷＴ１ペ
プチドと接触される場合にプライムされて、本明細書中に記載されるような標準
的な増殖アッセイ、クロム放出アッセイおよび／またはサイトカイン放出アッセ
イによって測定されるように、Ｔ細胞の増殖および／または活性化を生じると考
えられる。ネガティブコントロールと比較した、増殖または溶解における２倍よ
り大きな増加、およびサイトカインのレベルの３倍より大きな増加の、刺激係数
は、Ｔ細胞の特異性を示す。インビトロでプライムされた細胞は、例えば、骨髄
移植において、またはドナーのリンパ球注入物として、使用され得る。
【０１４９】 ＷＴ１に対して特異的なＴ細胞は、ＷＴ１タンパク質を発現する細胞を殺傷し
得る。Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）鎖をコードする遺伝子のＷＴ１への導入が、
ＷＴ１保有白血病および癌細胞に対する応答を定量的および定性的に改善させる
ための手段として、使用される。ＷＴ１陽性細胞と反応し得るＴ細胞の数を増加
させるためのワクチンは、ＷＴ１保有細胞を標的化する１つの方法である。ＷＴ
１に対して特異的なＴ細胞を用いるＴ細胞治療は、別の方法である。代替の方法
は、ＷＴ１に対して特異的なＴＣＲ鎖をＴ細胞または細胞溶解減少の可能性のあ
る他の細胞に導入することである。適切な実施形態において、ＴＣＲα鎖および
β鎖が、ＷＴ１特異的Ｔ細胞株からクローニングされ、そして例えば、ＷＯ９６
／３０５１６（本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、養子
Ｔ細胞治療のために使用される。
【０１５０】 （４．７ 薬学的組成物およびワクチン処方物） 特定の局面では、ペプチド、ポリヌクレオチド、抗体および／またはＴ細胞を
、薬学的組成物または免疫原性組成物（すなわち、ワクチン）中に組み込み得る
。あるいは、薬学的組成物は、抗原提示細胞がＷＴ１ペプチドを発現するように
、ＷＴ１ポリヌクレオチドでトランスフェクトされた抗原提示細胞（例えば、樹
状細胞）を含み得る。薬学的組成物は、１つ以上のこのような化合物または細胞
および生理的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。ワクチンは、１つ以上
のこのような化合物または細胞および免疫刺激薬（例えば、アジュバントまたは
リポソーム（この中に、化合物が取り込まれる））を含み得る。免疫刺激薬は、
外因性の抗原に対する免疫応答（抗体および／または細胞により媒介される）を
増強または強化する任意の物質であり得る。免疫刺激薬の例としては、アジュバ
ント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（ｐｏｌｙｌａｃ
ｔｉｃ ｇａｌａｃｔｉｄｅ）およびリポソーム（この中に、化合物が取り込ま
れる）（米国特許第４，２３５，８７７号）が挙げられる。ワクチン調製物は、
一般的に、例えば、ＰｏｗｅｌｌおよびＮｅｗｍａｎ（１９９５）に記載される
。本発明の範囲内にある薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性ま
たは不活性であり得る他の化合物を含み得る。例えば、他の腫瘍抗原の１つ以上
の免疫原性部分は、組成物またはワクチンにおいて、融合ペプチドに組み込まれ
てかまたは別個の化合物としてのいずれかで存在し得る。
【０１５１】 特定の実施形態において、薬学的組成物およびワクチンは、患者（例えば、ヒ
ト）においてＷＴ１ペプチドに対して特異的なＴ細胞応答を惹起するように、設
計される。一般に、Ｔ細胞応答は、比較的短いポリペプチド（例えば、ネイティ
ブＷＴ１ペプチドの２３未満の連続したアミノ酸残基、好ましくは、４〜１６の
連続した残基、より好ましくは、８〜１６の連続した残基、そしてなおより好ま
しくは、８〜１０の連続した残基を含む）の使用によって、支持され得る。代替
的に、またはさらに、ワクチンは、Ｔ細胞応答を優先的に増強する免疫刺激剤を
含み得る。換言すれば、この免疫刺激剤は、ＷＴ１ペプチドに対するＴ細胞応答
のレベルを、抗体応答が増強される量より比例的に大きな量だけ、増強し得る。
例えば、標準的な油に基づくアジュバント（例えば、ＣＦＡ）と比較する場合に
、Ｔ細胞応答を優先的に増強する免疫刺激剤は、ＷＴ１ネガティブコントロール
細胞株と比較して、増殖性Ｔ細胞応答を少なくとも２倍、溶解応答を少なくとも
１０％、そして／またはＴ細胞活性化を少なくとも２倍増強し得るが、抗体応答
を検出可能には増強しない。ＷＴ１ペプチドに対するＴ細胞応答または抗体応答
が増強される量は、一般に、当該分野において公知の任意の代表的な技術（本明
細書中に教示されるような）を使用して、決定され得る。
【０１５２】 薬学的組成物またはワクチンは、上記のような１つ以上のペプチドをコードす
るＤＮＡを含み得、その結果、このペプチドはインサイチュで生成される。上記
のように、ＤＮＡは、当業者に公知の種々の任意の送達系（核酸発現系、細菌性
発現系、およびウイルス性発現系、ならびに哺乳動物発現系を含む）において存
在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野において周知である（Ｒｏｌｌａｎ
ｄ，１９９８、およびそこに引用される参考文献によって記載される技術）。適
切な核酸発現系は、患者における発現のために必要なＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列
、またはＲＮＡ配列を含む（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）
。細菌性送達系は、細胞表面上でペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはこ
のようなエピトープを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔ
ｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含む。好ましい実施形態では、ウイルス性発現
系（例えば、ワクシニアもしくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、また
はアデノウイルス）を使用してＤＮＡを導入し得る。このウイルス発現系は、非
病原性（欠損性）で複製能力のあるウイルスの使用を含み得る（Ｆｉｓｈｅｒ−
Ｈｏｃｈら、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、１９
９０；米国特許第４，６０３，１１２号、米国特許第４，７６９，３３０号、米
国特許第５，０１７，４８７号；国際特許出願公開番号ＷＯ８９／０１９７３；
米国特許第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；欧州特許
第０，３４５，２４２号；国際特許出願公開番号ＷＯ９１／０２８０５；Ｂｅｒ
ｋｎｅｒ、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、１９９
４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、１９９３ａ；およ
びＧｕｚｍａｎら、１９９３）。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、
当業者に周知である。ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら（１９９３）におい
て記載され、そしてＣｏｈｅｎ（１９９３）によって概説されるように、「裸」
であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的
に輸送される）上にＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。ワク
チンがポリヌクレオチドとペプチド成分との両方を含み得ることが、明らかであ
る。このようなワクチンは、増強された免疫応答を提供し得る。
【０１５３】 上記のように、薬学的組成物またはワクチンは、ＷＴ１ペプチドを発現する抗
原提示細胞を含み得る。本明細書中に記載されるように、治療の目的で、抗原提
示細胞は、好ましくは、自己由来の樹状細胞である。このような細胞は、標準的
な技術（Ｒｅｅｖｅｓら、１９９６；Ｔｕｔｉｎｇら、１９９８；およびＮａｉ
ｒら、１９９８）を使用して、調製およびトランスフェクトされ得る。抗原提示
細胞の表面でのＷＴ１ペプチドの発現は、本明細書中に記載されるように、イン
ビトロ刺激アッセイおよび標準的な増殖アッセイ、ならびにクロム放出アッセイ
によって、確認され得る。
【０１５４】 本教示を利用して、ワクチンは、本明細書中に提供されるポリヌクレオチドお
よびペプチドの薬学的に受容可能な塩を含有し得ることが、当業者に明らかであ
る。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一
級、二級、および三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例
えば、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグ
ネシウムの塩）を含む）から調製され得る。句「薬学的にかまたは薬理学的に受
容可能な」とは、動物またはヒトに適切に投与される場合に、有害反応、アレル
ギー性反応、または他の有意な都合の悪い反応を生じない、分子の実体または組
成物をいう。本明細書中において使用される場合に、「薬学的に受容可能なキャ
リア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗
真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。このような媒体および薬剤の、薬
学的な活性物質のための使用は、当該分野において周知である。任意の従来の媒
体または薬剤が活性成分と非適合性である場合において、治療組成物におけるそ
の使用が考慮されることが予測される。ヒトへの投与に関して、調製物は、生物
製剤の標準の、食品医薬品局によって要求されるような、滅菌、発熱性、ならび
に一般的な安全性および純度の標準を満たすべきである。補充的な活性成分もま
た、この組成物に組み込まれ得る。
【０１５５】 当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用
され得るが、キャリアの型は、投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物
は、任意の適切な投与の様式（例えば、局所的投与、経口投与、経鼻投与、静脈
内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋内投与を含む）について
処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）については、キャリアは、好ま
しくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝液を含む。経口
投与については、任意の上記のキャリアまたは固体キャリア（例えば、マンニト
ール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリ
ン、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウム）
を使用し得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリラクテートポリグリコレ
ート）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適
切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同
第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８
号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，
３４４号、および同第５，９４２，２５２号に開示される。特定の局所用途につ
いては、周知の成分を使用する、クリームまたはローションのような処方物が好
ましい。
【０１５６】 このような組成物はまた、以下を含み得る：緩衝液（例えば、中性の緩衝化生
理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マ
ンノース、スクロース、またはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ペ
プチド、またはアミノ酸（例えば、グリシン）、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤
（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アジュバント（例えば、水酸化アル
ミニウム）、処方物をレシピエントの血液と等張性にか、低張性にか、もしくは
わずかに高張性にする溶質、懸濁剤、増粘剤および／または保存剤。あるいは、
本発明の組成物は、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｅ）として処方され得
るか、または周知技術を使用して、１つ以上のリポソーム、ミクロスフェア、ナ
ノ粒子、もしくは微小化送達系を用いて、処方され得る。
【０１５７】 任意の種々の免疫刺激剤（例えば、アジュバント）が、本発明のワクチン組成
物の調製において使用され得る。大半のアジュバントは、迅速な異化作用から抗
原を保護するために設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）
、および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ ｐｅｒ
ｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由
来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、ミョウバンに基づく
アジュバント（例えば、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ、リン酸
アルミニウム、Ａｌｇａｍｍｕｌｉｎ、水酸化アルミニウム）；油に基づくアジ
ュバント（フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｓｐｅｃｏｌ，ＲＩＢ
Ｉ，ＴｉｔｅｒＭａｘ，Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０またはＳｅｐｐｉｃ
ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ ＩＳＡ ７２０）；非イオン性ブロックコポリマーに基づ
くアジュバント、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦまたはＦｌａｔ３−リガ
ンド）；Ｍｅｒｃｋ Ａｄｊｕｖａｎｔ ６５（Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ
Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；カルシウム、鉄または亜
鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン性またはアニ
オン性に誘導体化された多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；
モノホスホリル脂質ＡおよびＱｕｉｌ Ａのように市販されている。ＧＭ−ＣＳ
Ｆまたはインターロイキン−２、インターロイキン−７、もしくはインターロイ
キン−１２のようなサイトカインもまた、アジュバントとして使用され得る。
【０１５８】 ヘモシアニンおよびヘモエリトリンもまた、本発明において使用され得る。キ
ーホールリンペット由来のヘモシアニン（ＫＬＨ）の使用が特に好ましいが、他
の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリトリンが、使用され得
る。種々の多糖類アジュバントもまた、使用され得る。多糖類のポリアミン改変
体（例えば、脱アセチルキチンを含むキチンおよびキトサン）が特に好ましい。
【０１５９】 アジュバントのさらに好ましい群は、細菌ペプチドグリカンのムラミルジペプ
チド（ＭＤＰ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン）の
群である。ムラミルジペプチドの誘導体（例えば、アミノ酸誘導体であるスレオ
ニル−ＭＤＰ、および脂肪酸誘導体であるＭＴＰＰＥ）もまた、考慮される。
【０１６０】 米国特許第４，９５０，６４５号は、ムラミルジペプチドの親油性ジサッカリ
ド−トリペプチド誘導体を記載し、これは、ホスファチジルコリンおよびホスフ
ァチジルグリセロールから形成された人工リポソームにおいて使用することが提
唱される。これは、ヒト単球を活性化する際および腫瘍細胞を破壊する際に有効
であるが、一般的な高用量において非毒性であるといえる。米国特許第４，９５
０，６４５号および国際特許出願番号ＷＯ９１／１６３４７の化合物もまた、本
発明の特定の局面を達成する際に使用されることが、提唱される。
【０１６１】 ＢＣＧおよびＢＣＧの細胞壁骨格（ＣＷＳ）もまた、トレハロースジミコレー
トありまたはなしで、本発明においてアジュバントとして使用され得る。トレハ
ロースジミコレートは、それ自体で使用され得る。Ａｚｕｍａら（１９９８）は
、トレハロースジミコレートの投与が、マウスにおいて、インフルエンザウイル
ス感染に対する増大された耐性と相関することを示す。トレハロースジミコレー
トは、米国特許第４，５７９，９４５号に記載されるように、調製され得る。
【０１６２】 両親媒性の薬剤および表面活性薬剤（例えば、サポニンおよび誘導体（例えば
、ＱＳ２１）（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ））は、本発明の免疫原と
ともに使用するための好ましいアジュバントのなお別の群を形成する。非イオン
性ブロックコポリマー界面活性剤（Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈら、１９９４；Ｈｕｎ
ｔｅｒら、１９９１）もまた、使用され得る。Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８８）
によって記載されるように、オリゴヌクレオチドは、アジュバントの別の有用な
群である。Ｑｕｉｌ Ａおよびレンチネン（ｌｅｎｔｉｎｅｎ）もまた、好まし
いアジュバントである。
【０１６３】 スーパー抗原もまた、本発明においてアジュバントとしての使用について考慮
される。「スーパー抗原」とは、一般に、抗原プロセシングに対する要求なしに
、ペプチド抗原より大きなＴリンパ球の集団を刺激する、細菌産物である（Ｍｏ
ｏｎｅｙら、１９９４）。スーパー抗原としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ表面タンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ由来のα、β、γおよびδエンテロトキシン、ならびにα、β、γおよびδ
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞体外毒素）が挙げられる。
【０１６４】 通常のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓエンテロトキシンは、ブドウ球菌エンテ
ロトキシンＡ（ＳＥＡ）およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）として
公知であり、Ｅ（ＳＥＥ）までのエンテロトキシンが、記載されている（Ｒｏｔ
ｔら、１９９２）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｂ（ＳＥ
Ｂ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓエンテロトキシン（Ｂ
ｏｗｎｅｓｓら、１９９２）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来の細胞質膜関連タンパ
ク質（ＣＡＰ）（Ｓａｔｏら、１９９４）およびＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のトキシ
ックショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）（Ｓｃｈｗａｂら、１９９３）が
、さらに有用なスーパー抗原である。
【０１６５】 本発明において使用するために特に適したアジュバントの１つの群は、米国特
許第４，８６６，０３４号の精製された無毒化内毒素のような、無毒化内毒素で
ある。これらの精製された無毒化内毒素は、哺乳動物におけるアジュバント応答
を生じる際に効果的である。
【０１６６】 無毒化内毒素は、他のアジュバントと組み合わせられ得る。無毒化内毒素とト
レハロースジミコレートとの組み合わせが、米国特許第４，４３５，３８６号に
記載されるように、考慮される。無毒化内毒素とトレハロースジミコレートおよ
び内毒素の糖脂質との組み合わせ（米国特許第４，５０５，８９９号）もまた、
米国特許第４，４３６，７２７号、同第４，４３６，７２８号、および同第４，
５０５，９００号に記載されるように、無毒化内毒素と細胞壁骨格（ＣＷＳ）ま
たはＣＷＳおよびトレハロースジミコレートとの組み合わせと同様に、考慮され
る。無毒化内毒素を含まない、ＣＷＳとトレハロースジミコレートのみの組み合
わせもまた、米国特許第４，５２０，０１９号に記載されるように、有用である
と予測される。
【０１６７】 ＭＰＬは、本明細書中における使用のための、現在好ましい１つの免疫増強剤
である。ＭＰＬの使用を考慮する参考文献としては、以下が挙げられる：Ｔｏｍ
ａｉら（１９８７）、Ｃｈｅｎら（１９９１）ならびにＧａｒｇおよびＳｕｂｂ
ａｒａｏ（１９９２）（これらは各々、加齢マウスの反応におけるＭＰＬの特定
の役割を考慮する）；Ｅｌｌｉｏｔｔら（１９９１）（これは、Ｄ−ガラクトサ
ミドを負荷したマウスならびにリポ多糖類およびＭＰＬに対するその増強された
感受性を考慮する）；Ｃｈａｓｅら（１９８６）（これは、細菌感染に関する）
；ならびにＭａｓｉｈｉら（１９８８）（これは、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏ
ｎｄｉｉに対するマウスの耐性に対する、ＭＰＬおよび内毒素の効果を記載する
）。Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ（１９９１）もまた、梅毒ワクチンの免疫原性をアッ
プレギュレートするため、およびウサギにおけるチャレンジ感染に対する有意な
保護を与えるための、ＭＰＬの使用に関して報告した。
【０１６８】 従って、ＭＰＬは、上記モデル系において示されるように、使用のために安全
であることが公知である。第Ｉ相臨床試験もまた、ＭＰＬが使用のために安全で
あることを示した（Ｖｏｓｉｋａら、１９８４）。実際に、１００μｇ／ｍ２が
、外来患者に基づいてさえも、ヒトへの使用のために安全であることが公知であ
る（Ｖｏｓｉｋａら、１９８４）。
【０１６９】 ＭＰＬは、一般に、ポリクローナルＢ細胞の活性化を誘導し（Ｂａｋｅｒら、
１９９４）、そして多くの系（例えば、免疫学的に未熟なマウス（Ｂａｋｅｒら
、１９８８）；加齢マウス（ＴｏｍａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９８９）；な
らびにヌードマウスおよびＸｉｄマウス（ＭａｄｏｎｎａおよびＶｏｇｅｌ、１
９８６；Ｍｙｅｒｓら、１９９５）において、抗体産生を増大させることが示さ
れた。抗体産生は、赤血球（Ｈｒａｂａら、１９９３）；Ｔ細胞依存性抗原およ
びＴ細胞非依存性抗原；Ｐｎｕ−免疫ワクチン（ＧａｒｇおよびＳｕｂｂａｒａ
ｏ、１９９２）；単離された腫瘍関連抗原（米国特許第４，８７７，６１１号）
；同系の腫瘍細胞（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎら、１９８５；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａ
ｔｈら、１９９４ａ；ｂ）；ならびに腫瘍関連ガングリオシド（Ｒａｖｉｎｄｒ
ａｎａｔｈら、１９９４ａ；ｂ）に対して、示された。
【０１７０】 ＭＰＬの別の有用な寄与は、Ｂａｋｅｒら（１９８８ａ）（これは、ＭＰＬが
若年マウスにおいて抗体応答を増加させる能力を記載する）によって示されたよ
うに、これがＩｇＭ応答を増加させることである。このことは、本発明の特定の
実施形態において使用するためのアジュバントの、特に有用な特徴である。Ｍｙ
ｅｒｓら（１９９５）は、最近、ウイルスのＴ細胞非依存性抗体産生によって、
ＭＰＬがＩｇＭ抗体を誘導する能力に関して報告した。
【０１７１】 Ｍｙｅｒｓら（１９９５）の研究において、ＭＰＬは、ハプテンであるＴＮＰ
と結合体化された。ＭＰＬは、他のハプテン（例えば、ペプチド）のためのキャ
リアとしての使用について提唱された。
【０１７２】 ＭＰＬはまた、マクロファージを活性化および漸増させる（Ｖｅｒｍａら、１
９９２）。ＴｏｍａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８９）は、ＭＰＬによって刺
激されたＴ細胞が、マクロファージによるＩＬ−１分泌を増強することを示した
。ＭＰＬはまた、スーパーオキシド生成、リゾチーム活性、食菌作用、およびカ
ンジダ属の殺傷を、マウス腹膜マクロファージにおいて活性化することが公知で
ある（Ｃｈｅｎら、１９９１）。
【０１７３】 Ｔ細胞に対するＭＰＬの効果は、ＭＰＬによる細胞傷害性因子（例えば、ＴＮ
Ｆ）の内因性産生をＢＣＧでプライムされたマウスの血清において、誘導する（
Ｂｅｎｎｅｔｔら、１９８８）。Ｋｏｖａｃｈら（１９９０）およびＥｌｌｉｏ
ｔら（１９９１）もまた、ＭＰＬがＴＮＦ活性を誘導することを示す。ＭＰＬは
、ＴＮＦ−αとともに作用して、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの放出を誘導するこ
とが公知である。Ｔ細胞によるＭＰＬに応答したＩＦＮ−γ産生もまた、Ｔｏｍ
ａｉおよびＪｏｈｎｓｏｎ（１９８９）、ならびにＯｄｅａｎら（１９９０）に
よって記載された。
【０１７４】 ＭＰＬはまた、強力なＴ細胞アジュバントであることが公知である。例えば、
ＭＰＬは、黒色腫抗原特異的ＣＴＬの増殖を刺激する（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、１
９８８、１９９３）。さらに、Ｂａｋｅｒら（１９８８ｂ）は、非毒性ＭＰＬが
、サプレッサＴ細胞活性を不活化することを示した。当然、生理学的環境におい
ては、Ｔサプレッサ細胞の不活化は、例えば、増大した抗体産生によって実現さ
れるように、動物に対する利点を増加させ得る。ＪｏｈｎｓｏｎおよびＴｏｍａ
ｉ（１９８８）は、ＭＰＬのアジュバント作用の可能な細胞媒介物および分子媒
介物に関して、報告した。
【０１７５】 ＭＰＬはまた、血小板の凝集を誘導すること、およびセロトニン分泌の誘導の
前に血小板タンパク質をリン酸化することが、公知である（Ｇｒａｂａｒｅｋら
、１９９０）。この研究は、ＭＰＬが、プロテインキナーゼＣの活性化およびシ
グナル伝達に関与することを示す。
【０１７６】 ＭＰＬの構造および機能を考慮する多くの文献が挙げられる。これらとしては
、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）が挙げられ、これは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ
ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒｅ５９５リポ多糖類から得られたＭＰＬホモログの構造
的特徴づけを記載する。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）の研究は、Ｇｒａｂａｒ
ｅｋら（１９９０）と共通して、ＭＰＬの脂肪酸部分が、市販の種においてさえ
も変化し得ることを示す。薄層クロマトグラフィーによってＭＰＬを８つの画分
に分離する際に、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）は、ヒト血小板応答を使用して
評価した場合に、３つが特に活性であることを見出した。種々のＭＰＬ種の化学
的組成が、Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９０）によって特徴付けられた。
【０１７７】 Ｂａｋｅｒら（１９９２）はさらに、脂質Ａおよびそのアナログがサプレッサ
Ｔ細胞活性の発現を廃止する能力に影響を与える構造的特徴を分析した。この著
者らは、脂質Ａにおけるリン酸基の数が２から１に減少したこと（すなわち、モ
ノホスホリル脂質Ａ、すなわちＭＰＬを生成すること）、ならびに主として３位
において残基を除去することによって、脂肪アシル含有量が低下して、その結果
、毒性が次第に減少すること；しかし、これらの構造的改変は、Ｔｓの機能の発
現を廃止する能力には影響を与えなかったことを報告した（Ｂａｋｅｒら、１９
９２）。これらの型のＭＰＬは、本発明における使用のために理想的である。
【０１７８】 Ｂａｋｅｒら（１９９２）はまた、脂肪アシル含有量を５から４に低下させる
と（脂質Ａの前駆体ＩＶＡまたはＩａ）、Ｔｓの機能に影響を与える能力を排除
したが、Ｂ細胞のポリクローナル活性を誘導しなかったことを示した。これらの
研究は、Ｔｓの機能の発現を廃止し得るためには、脂質Ａがグルコサミンジサッ
カリドでなければならないこと；１つまたは２つのいずれかのリン酸基を有し得
ること；および少なくとも５つの脂肪アシル基を有さなければならないことを示
す。また、ヒドロキシル化されていない脂肪酸の鎖長、およびアシルオキシアシ
ル基の位置（２’位対３’位）が、重要な役割を果たし得る（Ｂａｋｅｒら、１
９９２）。
【０１７９】 脂質ＡがサプレッサＴ細胞（Ｔｓ）の活性の発現を廃止する能力に対する、鎖
長と脂肪アシル基の位置との間の関係を試験する際に、Ｂａｋｅｒら（１９９４
）は、Ｃ１２〜Ｃ１４の脂肪アシル鎖の長さが、生物活性のために最適であるよ
うであることを見出した。従って、これらの使用は依然として可能であるが、比
較的短い鎖長（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＣｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ由来のＣ１０〜Ｃ１２）、または
優勢に長い鎖長（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来のＣ１８）の脂
肪アシル基を有する脂質Ａ調製物は、本発明における使用のためにさほど好まし
くない。
【０１８０】 Ｂａｋｅｒら（１９９４）はまた、いくつかの細菌リポ多糖類の脂質Ａの近位
内側コア領域オリゴサッカリドが、Ｔｓ活性の発現を増加させることを示した；
これは主として、グラム陰性細菌の間で比較的構造が保存されているようなオリ
ゴサッカリドが、関連しない微生物抗原に対する正常な抗体応答の経過中にＣＤ
８＋Ｔｓの集団が生じる際に、拡大または拡張する能力に起因する。観察された
さらなる免疫抑制の発現のために必要とされる最低限の構造は、１つの２−ケト
−３−デオキシオクトン酸（ｄｅｏｘｙｏｃｔｏｎａｔｅ）残基、２つのグルコ
ース残基、および３つのヘプトース残基（これらに、２つのピロホスホリルエタ
ノールアミン基が結合している）を含む六糖類であることが報告された（Ｂａｋ
ｅｒら、１９９４）。この情報は、本発明において使用するためのさらなるアジ
ュバントを利用する際、または設計する際にさえ、考慮され得る。
【０１８１】 研究の一般的に関連するラインにおいて、Ｔａｎａｍｏｔｏら（１９９４ａ；
ｂ；１９９５）は、アセチル化またはスクシニル化の後の化学的に合成された脂
質Ａ前駆体における、内毒素活性の解離を記載した。従って、「アセチル４０６
」および「スクシニル５１６」（Ｔａｎａｍｏｔｏら、１９９４ａ；ｂ；１９９
５）のような化合物もまた、本発明における使用のために考慮される。
【０１８２】 合成ＭＰＬは、抗原の特に好ましい群を形成する。例えば、Ｂｒａｄｅら（１
９９３）は、抗脂質Ａ ＭＡｂに結合する、脂質Ａのビスホスホリル化グルコサ
ミンジサッカリド骨格を含む人工糖結合体を記載した。これは、本発明の特定の
局面において使用するための１つの候補である。
【０１８３】 米国特許第４，９８７，２３７号に記載されるＭＰＬ誘導体は、本発明におい
て使用するために特に考慮される。米国特許第４，９８７，２３７号は、１つ以
上の遊離基（例えば、アミン）を、エステル基を介してモノホスホリル脂質Ａ核
の一級ヒドロキシル基に結合した側鎖上に含む、ＭＰＬ誘導体を記載する。これ
らの誘導体は、脂質Ａをカップリング剤を介して種々の生物学的に活性な物質に
結合するための、好都合な方法を提供する。脂質Ａの免疫刺激剤特性は、維持さ
れる。米国特許第４，９８７，２３７号による全てのＭＰＬ誘導体は、本発明の
ＭＰＬアジュバントに取り込まれた細胞において使用するために、考慮される。
【０１８４】 ヒトにおいては通常使用されないものでさえも、例えば、抗体を惹起すること
、または活性化したＴ細胞を引き続いて得ることが望ましい場合には、種々のア
ジュバントが、動物において依然として使用され得る。アジュバントまたは細胞
のいずれかから生じ得る、毒性または他の有害な影響（例えば、照射されていな
い腫瘍細胞を使用して生じ得るような）は、このような状況においては関連しな
い。
【０１８５】 本明細書中において提供されるワクチンにおいて、アジュバント組成物は、好
ましくは、Ｔｈ１型に優勢な免疫応答を誘導するよう設計される。高レベルのＴ
ｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１
２）は、投与された抗原に対して、細胞により媒介される免疫応答の誘導を支持
する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−
４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持す
る傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用に続いて、患者は
、Ｔｈ１型およびＴｈ２型の応答を誘導する免疫応答を支持する。応答が優勢的
にＴｈ１型である、好ましい実施形態においては、Ｔｈ１型サイトカインのレベ
ルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより大きな程度まで増加する。これらのサ
イトカインのレベルは、標準的なアッセイを使用して、容易に評価され得る。サ
イトカインのファミリーの総説については、例えば、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏ
ｆｆｍａｎ（１９８９）を参照のこと。
【０１８６】 Ｔｈ１型優勢の応答を誘発する使用のための好ましいアジュバンドは、例えば
、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル
リピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬアジ
ュバンドは、Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；
米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６
，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと（これらの各々は、本
明細書においてその全体が参考として具体的に援用されている））から入手可能
である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチ
ル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌ
クレオチドは周知であり、そして例えば国際特許出願ＷＯ９６／０２５５５およ
び国際特許出願ＷＯ９９／３３４８８に記載される。免役刺激ＤＮＡ配列はまた
、例えば、Ｓａｔｏら（１９９６）に記載されている。別の好ましいアジュバン
ドは、サポニン、好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅ
ｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）であり、これは単独
でか、または他のアジュバンドと組み合わせて使用され得る。例えば、増強され
た系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、Ｑ
Ｓ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ（例えば、国際特許出願ＷＯ９４／００１
５３を参照のこと））、またはＱ２１がコレステロールで抑制（ｑｕｅｎｃｈ）
される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物（例えば、
国際特許出願ＷＯ９６／３３７３９を参照のこと）を含む。他の好ましい処方物
は、水中油乳濁液およびトコフェロールを含む。水中油乳濁液中にＱＳ２１、３
Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバンド処方物がまた記
載されている（国際特許出願ＷＯ９５／１７２１０を参照のこと）。
【０１８７】 他の好ましいアジュバンドとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０（
Ｓｅｐｐｉｃ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５
９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバンド（例えば、ＳＢＡ−２も
しくはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｒｉｘｅｎｓａ
ｒｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能））、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）お
よびアミノアルキルグルコサミド４−ホスフェート（ＡＧＰ）が挙げられる。
【０１８８】 本明細書中で提供されるいずれのワクチンも、１以上の抗原、１以上の免役刺
激剤またはアジュバンド、および１以上の適切なキャリア、賦形剤、または薬学
的に受容可能な緩衝剤の組み合わせから得られる周知の方法を使用して調製され
得る。本明細書において記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後
、化合物の緩徐な放出をもたらすカプセル、スポンジ、またはゲル（例えば、多
糖類から構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような
処方物は一般に、周知の技術（Ｃｏｏｍｂｅｓら、１９９６）を用いて調製され
得、そして例えば、口腔移植、直腸移植または皮下移植によってか、あるいは所
望の標的部位への移植によって投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリ
ックスに分散され、そして／または速度制御膜に囲まれた貯蔵所内に含まれる、
ペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を含み得る。
【０１８９】 このような処方物内での使用のためのキャリアは、好ましくは、生体適合性で
あり、そしてまた生分解性でもあり得；好ましくは、この処方物は比較的一定レ
ベルの活性成分の放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチ
ド−ｃｏ−グリコリド）、およびポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セ
ルロースおよびデキストランの微粒子が挙げられる。他の徐放キャリアとしては
、超分子バイオベクター（ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、このバイオベクタ
ーとしては、非液体親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたは架橋オリゴ
サッカリド）および、必要に応じて、両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含
む外部層を含む（米国特許第５，１５１，２５４号；国際特許出願ＷＯ９４／２
００７８；国際特許出願ＷＯ９４／２３７０１；および国際特許出願ＷＯ９６／
０６６３８）。徐放性処方物内に含まれる活性化合物の量は、移植の部位、放出
の速度および予期される期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に
依存する。
【０１９０】 任意の種々の送達ビヒクルが、薬学的組成物およびワクチン内で使用され、腫
瘍細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の生成を容易にし得る。送達ビヒクルと
しては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞
、単球、および効率的なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられ
る。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活
性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するよう
に、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハ
プロタイプ）であるように遺伝学的に改変され得るが、改変される必要はない。
ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織
を含む）のいずれかから単離され得、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞
、または異種細胞であり得る。
【０１９１】 本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはそ
の前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（Ｂａｎｃｈｅ
ｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、１９９８）、そして予防的または治療的な抗
腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバンドとして有効であることが示さ
れている（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、１９９９）。一般に、樹状細胞
は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは顕著な細胞
質突起（樹状突起）が目に見える）、高い効率で抗原を取り込み、処理し、そし
て提示するそれらの能力、およびナイーブＴ細胞応答を活性化するそれらの能力
に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹
状細胞上に通常は見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現
するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。
樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原をロードした樹状細胞（エキソソーム（ｅ
ｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら
、１９９８）。
【０１９２】 樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤
細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の適切な任意の組織もしくは流
体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に
、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイト
カインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化し得る。あるいは
、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧ
Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガン
ドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組
み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化し得る。
【０１９３】 樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、この
ことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える
。しかしこの命名は、分化のあらゆる可能な中間段階を排除するように解釈され
るべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよび処理の高い能力を有
するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプター、およびマンノ
ースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、これらのマ
ーカーのより低い発現だが、クラスＩ ＭＨＣおよびクラスＩＩ ＭＨＣ、接着
分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに副刺激性分子（例えば、ＣＤ
４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因であ
る細胞表面分子の高度な発現によって特徴付けられる。
【０１９４】 ＡＰＣは、一般に、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドを用いてト
ランスフェクトされ得、その結果、そのペプチドまたはその免疫原性部分が細胞
表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、
次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、
本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹
状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与
され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボ
およびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、国際特許出願ＷＯ９７
／２７４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら（１９９７）によって記
載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一
般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を
、ペプチド、ＤＮＡ（裸のＤＮＡもしくはプラスミドベクター中のＤＮＡ）また
はＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、ワクシニア
ウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）と
インキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、そのペプ
チドは、Ｔ細胞補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に
共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にかまたはポリペプチドの存在
下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０１９５】 併用治療もまた考慮され、そして同一の型の基本的な薬学的組成物は、単一の
医薬および併用医薬の両方のために使用され得る。ワクチンおよび薬学的組成物
は、単一用量の容器または複数用量の容器（例えば、密閉されたアンプルまたは
バイアル）中に存在し得る。このような容器は、好ましくは、密閉されており、
使用までの処方物の無菌性を維持する。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは
水性ビヒクル中で、懸濁液、溶液または乳濁液として保存され得る。あるいは、
ワクチンまたは薬学的組成物は、使用の直前に無菌液キャリアの添加のみを必要
とする凍結乾燥状態で保存され得る。
【０１９６】 （４．８ 悪性疾患の治療のための方法） 本発明のさらなる局面において、悪性疾患（例えば、進行性の疾患もしくは転
位性の疾患、または最小の残留疾患のような小さな腫瘍負荷によって特徴付けら
れる疾患）の成長を阻害するために本明細書中に記載される組成物およびワクチ
ンを使用し得る。一般にこのような方法は、ＷＴ１発現に関連する疾患を予防、
遅延または処置するために使用され得る。言い換えれば、本明細書で提供される
治療方法は、存在するＷＴ１関連疾患を処置するために使用され得るか、または
疾患を有さないか、もしくはＷＴ１発現に関連しない疾患に苦しんでいる患者に
おいて、このような疾患の発症を予防または遅延させるために使用され得る。
【０１９７】 本明細書中で使用される場合、疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）が、この疾患の
過程の間のある時に、同一組織の正常細胞よりも検出可能に高いレベルのＷＴ１
ペプチドを産生する場合に、この疾患は、「ＷＴ１発現に関連」している。悪性
疾患とＷＴ１発現の関連は、ＷＴ１が腫瘍上に存在することを必要としない。例
えば、ＷＴ１の過剰発現は、腫瘍の開始と関連し得るが、そのタンパク質の発現
は、その後に失われ得る。あるいは、ＷＴ１発現の増加によって特徴付けられな
い悪性疾患は、増加したＷＴ１発現によって特徴付けられる疾患へと、後で進行
し得る。従って、疾患細胞が、増加したレベルのＷＴ１を、以前に発現したか、
現在発現しているか、または後で発現すると予測される、任意の悪性疾患が、「
ＷＴ１発現に関連」していると考えられる。特定の実施形態内で、本明細書中で
提供される治療は、悪性中皮腫を患った患者、または悪性中皮腫の危険があると
考えられる患者に施される。
【０１９８】 免役治療が、任意の種々の治療を使用して実施され得、この治療において、本
明細書中で提供される化合物または細胞が、患者からＷＴ１発現細胞を除去する
ように機能する。このような除去は、ＷＴ１に特異的な患者またはＷＴを発現す
る細胞における、免役応答の増強または誘導の結果として生じ得る。あるいは、
ＷＴ１発現細胞は、エキソビボで（例えば、自己の骨髄、末梢血、または骨髄も
しくは末梢血の画分の処置によって）除去され得る。骨髄または末梢血の画分は
、当該分野で任意の標準的な技術を使用して得られ得る。
【０１９９】 このような方法において、薬学的組成物およびワクチンを、患者に投与し得る
。本明細書中で使用される場合、「患者」とは、任意の温血動物（好ましくは、
ヒト）をいう。患者は、悪性疾患に罹患していても、していなくてもよい。従っ
て、上記の薬学的組成物およびワクチンは、疾患の発症を予防するために（すな
わち、予防的に）かまたは疾患に罹患している患者を処置するために（すなわち
、既存の疾患の進行および／または転移を予防または遅延するために）使用され
得る。疾患に罹患している患者は、最小の残留疾患（例えば、完全なまたは部分
的な寛解期にある白血病患者あるいは外科的放射線療法および／または化学療法
後の腫瘍負荷の減少後の癌患者における、低い腫瘍負荷）を有し得る。このよう
な患者を、再発を阻止する（すなわち、再発を予防または遅延するか、あるいは
再発の重篤度を減少する）ために免疫し得る。特定の好ましい実施形態において
、患者は、悪性中皮腫に罹患している。他のＷＴ１関連状態としては、白血病（
例えば、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬまたは小児期ＡＬＬ）、脊髄形成異常症候群（
ＭＤＳ）および癌（例えば、胃腸癌、肺癌、甲状腺癌または乳癌、あるいは黒色
腫）（この癌または白血病は、ＷＴ１陽性（すなわち、本明細書中に提供される
ような抗ＷＴ１抗体と検出可能に反応するか、または本明細書中に記載のような
ＲＴ−ＰＣＲＴＭによって検出可能なレベルでＷＴ１ ｍＲＮＡを発現する）で
ある）、ならびにＷＴ１発現細胞に対する自己免疫疾患が挙げられる。
【０２００】 ＷＴ１過剰発現に関連する他の疾患としては、腎臓癌（例えば、腎細胞癌また
はウィルムス腫瘍）（Ｓａｔｏｈら（２０００）およびＣｍｐｂｅｌｌら（１９
９８）に記載のような）；ならびに中皮腫（Ａｍｉｎら（１９９５）に記載のよ
うな）が挙げられる。Ｈａｒａｄａら（１９９９）は、ヒト精巣生殖細胞腫瘍に
おけるＷＴ１遺伝子発現を記載する。Ｎｏｎｏｍｕｒａら、Ｈｉｎｙｏｋｉｋａ
（１９９９）は、精巣癌特異的遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応を使用する、精巣
癌の分子病期分類を記載する。Ｓｈｉｍｉｚｕら（２０００）は、上皮卵巣腫瘍
におけるウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）の免疫組織化学的検出を記載する。
【０２０１】 ＷＴ１過剰発現はまた、Ｂａｒｎｏｕｄら（２０００）によって、線維形成性
小円形細胞腫瘍（ｄｅｓｍｐｌａｓｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｒｏｕｎｄ ｃｅｌｌ
ｔｕｍｏｒ）においても記載されている。神経膠芽細胞腫および他の癌におけ
るＷＴ１過剰発現は、Ｍｅｎｓｓｅｎら（２０００）、「Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍ
ｏｒ ｇｅｎｅ（ＷＴ１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅ
ｒ，ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ
ｌｉｎｅｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ｆｒｅｓｈｌｙ ｉｓｏｌａｔｅｄ
ｔｕｍｏｒ ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」に記載されている。ＷＴ１過剰発現を示す他
の疾患としては、ＥＢＶ関連疾患（例えば、バーキットリンパ腫および鼻咽頭癌
（Ｓｐｉｎｓａｎｔｉら、２０００、「Ｗｉｌｍｓ’ ｔｕｍｏｒ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｈ
ｕｍａｎ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」）が挙げられる。
【０２０２】 Ｐａｎら（２０００）は、白血病または脊髄形成異常症候群を有する患者由来
の末梢血単核細胞のインビトロＩＬ−１２処理を記載し、そして細胞傷害性の増
加およびＷＴ１遺伝子発現における減少を報告した。Ｐａｔｍａｓｉｒｉｗａｔ
ら（１９９９）は、脊髄形成異常症候群および急性白血病におけるＷＴ１および
ＧＡＴＡ１の発現を報告した。Ｔａｍａｋｉら（１９９９）は、ウィルムス腫瘍
遺伝子ＷＴ１が、脊髄形成異常症候群の疾患進行の診断についての良好なマーカ
ーであることを報告した。Ｏｊｉら（１９９９）において、固形腫瘍におけるウ
ィルムス腫瘍遺伝子ＷＴ１の発現、および腫瘍細胞増殖におけるその関与が、胃
癌、結腸癌、肺癌、乳癌細胞株、生殖細胞腫瘍細胞株、卵巣癌、子宮癌、甲状腺
癌細胞株、肝細胞癌と関連して議論されている。
【０２０３】 本明細書中に提供される組成物は、単独でかまたは従来の治療レジメン（例え
ば、手術、照射、化学療法および／または骨髄移植（自己、同系、同種異型また
は無関連））と組み合わせて使用され得る。以下に詳細に議論するように、本明
細書中に提供されるような結合因子およびＴ細胞は、自己幹細胞のパージング（
ｐｕｒｇｉｎｇ）に使用され得る。このようなパージングは、例えば、骨髄移植
あるいは血液またはその成分の輸血の前に有利であり得る。本明細書中で提供さ
れる結合因子、Ｔ細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および組成物はさらに、自己、
同種異型、同系または無関連のＷＴ１特異的Ｔ細胞をインビトロおよび／または
インビボで拡大および刺激（またはプライミング）するために使用され得る。こ
のようなＷＴ１特異的Ｔ細胞は、例えば、ドナーリンパ球注入液において使用さ
れ得る。
【０２０４】 投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個体間で変化し、そして標準的な
技術を使用して容易に確立され得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、
注射（例えば、皮内、筋内、静脈内または皮下）によってか、鼻内（例えば、吸
入によって）または経口的に投与され得る。いくつかの腫瘍において、薬学的組
成物またはワクチンは、局所的（例えば、直腸結腸鏡検査法、胃鏡検査法、ビデ
オ内視鏡検査法、血管造影法または当該分野で公知の他の方法によって）投与さ
れ得る。好ましくは、１〜１０用量が、５２週の期間にわたって投与され得る。
好ましくは、６用量が、１ヶ月間隔で投与され、そしてその後、ブースターワク
チン接種が、定期的に与えられ得る。交互のプロトコルが、個々の患者に適切で
あり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合に、基礎（すなわち、未
処置）レベルを少なくとも１０〜５０％超える抗腫瘍免疫応答を促進し得る、化
合物の量である。このような応答は、患者における抗腫瘍抗体を測定することに
よってか、またはインビトロで患者の腫瘍細胞を殺し得る細胞溶解性エフェクタ
ーのワクチン依存性の生成によって、モニターされ得る。このようなワクチンは
また、ワクチン接種していない患者と比較した場合に、ワクチン接種した患者に
おいて改善された臨床結果（例えば、より頻繁な完全な寛解または部分的な寛解
、またはより長期の無疾患生存および／または全体的な生存）を導く免疫応答を
生じ得る。一般に、１以上のペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについ
て、１用量中に存在する各ペプチドの量は、約１００μｇ〜５ｍｇの範囲にある
。適切な用量サイズは、患者のサイズに伴って変化するが、代表的には、０．１
ｍＬ〜５ｍＬの範囲にある。
【０２０５】 一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的利点および／または予防
的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処
置していない患者と比較した場合に、処置した患者にいて改善された臨床結果（
例えば、より頻繁な完全な寛解または部分的な寛解、またはより長期の無疾患生
存および／または全体的な生存）を確立することによってモニターされ得る。Ｗ
Ｔ１に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に改善された臨床結果と相
関する。このような免疫応答は、一般に、標準的な増殖アッセイ、細胞傷害性ア
ッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これらは、処置の前
後に患者から得られたサンプルを使用して行われ得る。
【０２０６】 さらなる局面において、ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の発症を阻害するため
の方法は、上記のような、ＷＴ１ペプチドまたはＷＴ１発現ＡＰＣに応答して活
性化された自己Ｔ細胞の投与を包含する。このようなＴ細胞は、ＣＤ４＋および
／またはＣＤ８＋であり得、そして上記のように増殖され得る。Ｔ細胞は、悪性
疾患の発症を阻害するのに有効な量で個体に投与され得る。代表的には、約１×
１０９〜１×１０１１Ｔ細胞／Ｍ２で、静脈内にか、腔内にか、または切除した
腫瘍床中に投与される。細胞数および投与の頻度は、患者の応答に依存すること
が、当業者に明らかである。
【０２０７】 特定の実施形態において、Ｔ細胞は、自己骨髄移植の前に刺激され得る。この
ような刺激は、インビボまたはインビトロで生じ得る。インビトロ刺激について
、患者から得た骨髄および／または末梢血（あるいは骨髄または末梢血の画分）
を、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／ま
たはＷＴ１ペプチドを発現するＡＰＣと、上記のようなＴ細胞の刺激を可能にす
るのに十分な条件および時間で接触させ得る。次いで、骨髄、末梢血幹細胞およ
び／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞を、標準的な技術を使用して患者に投与し得る。
【０２０８】 関連する実施形態において、関連するドナーかまたは関連しないドナーのＴ細
胞が、同系または同種異系の（関連するかまたは関連しない）骨髄の移植前に刺
激され得る。このような刺激は、インビボまたはインビトロで行われ得る。イン
ビトロでの刺激のために、関連するドナーかまたは関連しないドナーから得られ
た骨髄および／または末梢血（または骨髄もしくは末梢血の画分）が、上記のよ
うなＴ細胞の刺激を許容するのに十分な条件下および時間で、ＷＴ１ペプチド、
ＷＴ１ポリヌクレオチドおよび／またはＷＴ１ペプチドを発現するＡＰＣと接触
され得る。骨髄、末梢血幹細胞および／またはＷＴ１特異的Ｔ細胞は、次いで、
標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０２０９】 他の実施形態において、本明細書において記載されるＷＴ１特異的Ｔ細胞は、
ＷＴ１を発現する細胞を、自己骨髄、末梢血、または骨髄もしくは末梢血の画分
（例えば、患者に投与する前のＣＤ３４＋富化末梢血（ＰＢ））から除去するた
めに使用され得る。このような方法は、骨髄またはＰＢをこのようなＴ細胞と、
ＷＴ１発現細胞を、骨髄もしくは末梢血中の骨髄細胞もしくはリンパ細胞の全数
の１０％未満、好ましくは、５％未満、そしてより好ましくは、１％未満に減少
させることを可能にするに十分な条件下でまたはそのような時間接触させること
によって行われ得る。このような細胞が除去された程度は、標準的な方法（例え
ば、定性的および定量的なＰＣＲＴＭ分析、形態学、免疫組織化学、およびＦＡ
ＣＳ分析）によって容易に決定され得る。骨髄またはＰＢ（またはその画分）は
、次いで、標準的な技術を使用して患者に投与され得る。
【０２１０】 （４．９ ＷＴ１特異的疾患についての診断および予後の方法） 本発明は、さらに、ＷＴ１発現に関連する悪性疾患を検出するための方法、お
よびこのような疾患のための免疫または治療の有効性をモニターするための方法
を提供する。このような方法法は、本発明の範囲内における、ＷＴ１タンパク質
に特異的な免疫反応が、このような疾患（悪性中皮腫を含む）に罹っている患者
において検出され得るという発見、およびこのような免疫応答を増強する方法が
、予防的または治療的な利益を提供し得るという発見に基づいている。本明細書
において提供される診断方法は、これらの疾患の早期検出を提供し得、そして危
険な状態にあると考えられる患者のハイスループットスクリーニングを可能にし
得る。このような患者には、例えば、アスベストに曝されたと疑われる個体（悪
性中皮腫の発症の危険性があり得る個体）が含まれる。
【０２１１】 ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在または非存在を決定するために、患者は
、ＷＴ１に特異的なＴ細胞のレベルについて試験され得る。特定の方法において
、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する
生物学的サンプルが、ＷＴ１ペプチド、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレ
オチドおよび／またはＷＴ１ペプチドを発現するＡＰＣとともにインキュベート
され、そしてそのＴ細胞の特異的活性化が存在するかしないかが、本明細書に記
載されるように検出される。適切な生物学的サンプルには、単離されたＴ細胞が
含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的な技術（例えば
、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって）
によって患者から単離され得る。Ｔ細胞は、インビトロで、２〜９日間（代表的
には、４日間）、３７℃で、ＷＴ１ペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）と
ともにインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの更なるアリコートを、コント
ロールとして役立つようにＷＴ１ペプチドの非存在下で、インキュベートするこ
とが望ましくあり得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞については、活性化は、好ましくは、Ｔ
細胞の増殖を評価することによって検出され得る。ＣＤ８＋細胞については、活
性化は、好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出され得る。疾患
のない患者において観察されるよりも、少なくとも２倍大きい増殖のレベルおよ
び／または少なくとも２０％大きい細胞溶解活性のレベルは、ＷＴ１発現に関連
する悪性疾患の存在を示す。さらなる関連付けが、当該分野で周知の方法を使用
して、増殖および／または細胞溶解活性のレベルと治療に対する予想される応答
のレベルの間でなされ得る。特に、より高い抗体、増殖、および／または溶解応
答を示す患者は、治療に対してより高い応答を示すことが予想され得る。
【０２１２】 他の方法では、患者から得られた生物学的サンプルが、ＷＴ１に対して特異的
な抗体のレベルについて試験される。その生物学的サンプルは、ＷＴ１ペプチド
、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＷＴ１ペプチ
ドを発現するＡＰＣとともに、免疫複合体が形成されるのに十分な条件下でかつ
そのような時間インキュベートされる。次いで、ＷＴ１ペプチドとＷＴ１ペプチ
ドに特異的に結合する生物学的サンプル中の抗体との間で形成された免疫複合体
が検出される。このような方法で使用するための生物学的サンプルは、抗体を含
有すると予想される患者から得られる任意のサンプルであり得る。適切な生物学
的サンプルには、血液、血清、腹水、骨髄、胸水、および脳脊髄液が含まれる。
【０２１３】 その生物学的サンプルは、ＷＴ１ペプチドとともに反応混合物中で、そのペプ
チドとＷＴ１に特異的な抗体との間で免疫複合体が形成される条件下でかつその
ような時間インキュベートされる。例えば、生物学的サンプルおよびＷＴ１ペプ
チドは、４℃で、２４〜４８時間インキュベートされ得る。
【０２１４】 インキュベート後、その反応混合物は、免疫複合体の存在について試験される
。ＷＴ１ペプチドと生物学的サンプル中に存在する抗体との間に形成される免疫
複合体の検出は、種々の公知の技術（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）
および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって達成され得る。適切
なアッセイは、当該分野で周知であり、そして科学的文献および特許文献（Ｈａ
ｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８）に豊富に記載されている。使用され得るア
ッセイには、二重モノクローナル抗体サンドイッチイムノアッセイ技術（米国特
許第４，３７６，１１０号）；モノクローナル抗体−ポリクローナル抗体サンド
イッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、１９７０）；「ウエスタンブロット」法（米国特
許第４，４５２，９０１号）；標識化リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎら、１９
８０）；酵素結合免疫吸着アッセイ（ＲａｉｎｓおよびＲｏｓｓ、１９８２）；
免疫細胞化学技術（蛍光色素の使用を含む）（Ｂｒｏｏｋｓら、１９８０）；お
よび活性の中和（Ｂｒｏｗｅｎ−Ｐｏｐｅら、１９８４）が含まれるが、これら
に限定されない。他のイムノアッセイには、米国特許第３，８１７，８２７号；
同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号；同第３，９３５，０７
４号；同第３，９８４，５３３号；同第３，９９６，３４５号；同第４，０３４
，０７４号；および同第４，０９８，８７６号に記載されるものが含まれるが、
これらに限定されない。
【０２１５】 検出目的のために、ＷＴ１ペプチドは、標識されるかまたは非標識であるかの
いずれかであり得る。非標識ＷＴ１ペプチドは、凝集反応アッセイにおいてかま
たは免疫複合体に結合する標識検出試薬（例えば、抗イムノグロブリン、プロテ
インＧ、プロテインＡ、またはレクチン、および二次抗体、またはＷＴ１ペプチ
ドに特異的に結合し得る抗体に結合し得るその抗原結合フラグメント）と組み合
わせて使用され得る。ＷＴ１ペプチドが標識される場合、そのレポーター基は、
当該分野で公知の任意の適切なレポーター基（放射性同位体、蛍光色素基、発光
基、酵素、ビオチン、および色素粒子を含む）であり得る。
【０２１６】 特定のアッセイにおいて、標識していないＷＴ１ペプチドは、固体支持体に固
定される。この固体支持体は、ペプチドが結合し得る、当業者に公知の任意の材
料であり得る。例えば、この固体支持体は、マイクロタイタープレートの試験ウ
ェルまたはニトロセルロース、あるいは他の適切な膜であり得る。あるいは、こ
の支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラ
テックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビ
ニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（
例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に開示のような）であり得る。このペ
プチドは、当業者に公知の様々な技術を使用して、固体支持体に固定され得、こ
れらの技術は特許および科学文献に十分に記載される。本発明の状況において、
用語「固定」とは、非共有結合（例えば、吸着）および共有結合（これは、抗原
と支持体上の官能基との間の直接結合であり得るか、または架橋剤による結合で
あり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェルまたは膜への吸着
による固定が好ましい。このような場合において、吸着は、ＷＴ１ペプチドを、
適切な緩衝液中で適切な時間、固体支持体と接触させることによって達成され得
る。この接触時間は温度と共に変化するが、代表的には、約１時間と約１日との
間である。一般的に、プラスチックマイクロタイタープレートのウェル（例えば
、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）と、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、好ましく
は約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量のペプチドとの接触は、適切な量のペプチ
ドを固定するのに十分である。
【０２１７】 固定の後、この支持体上の残りのタンパク質結合部位は、代表的には、ブロッ
クされる。当業者に公知の任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミ
ン、ＴｗｅｅｎＴＭ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、熱不活性化正常ヤギ血清（ＮＧＳ）、またはＢＬＯＴＴＯ
（脱脂粉乳の緩衝溶液、これはまた保存剤、塩、および消泡剤を含む））を、使
用し得る。次いで、この支持体を、特定の抗体を含む疑いのある生物学的サンプ
ルと共にインキュベートする。このサンプルは、ニートに適用され得、すなわち
、より頻繁には、このサンプルは、通常、少量（０．１重量％〜５．０重量％）
のタンパク質を含む緩衝溶液（例えば、ＢＳＡ、ＮＧＳまたはＢＬＯＴＴＯ）中
で希釈され得る。一般的に、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時
間）は、このような抗体を含むサンプル中のＷＴ１に特異的に結合する抗体の存
在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合抗体と
未結合抗体との間の平衡状態時に達成される結合レベルの少なくとも約９５％で
ある結合レベルを達成するのに十分である。当業者は、平衡状態を達成するのに
必要な時間は、ある時間に生じる結合のレベルをアッセイすることによって、容
易に決定され得ることを理解する。室温において、約３０分のインキュベーショ
ン時間は、一般に十分である。
【０２１８】 次いで、この固体支持体を適切な緩衝液（例えば、０．１％ ＴｗｅｅｎＴＭ ２０を含むＰＢＳ）で洗浄することによって、未結合のサンプルを除去し得る。
次いで、免疫複合体に結合し、かつレポーター基を含む検出試薬を添加し得る。
この検出試薬を、結合抗体を検出するのに十分な時間、この免疫複合体と共にイ
ンキュベートする。適切な時間は、一般に、ある時間に生じる結合のレベルをア
ッセイすることによって決定し得る。次いで、未結合の検出試薬を除去し、そし
て結合した検出試薬を、レポーター基を使用して検出する。このレポーター基を
検出するために用いられる方法は、このレポーター基の特徴に依存する。放射性
基について、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が、一般
に、適切である。分光学的方法を使用して、色素、発光性基および蛍光性基を検
出し得る。ビオチンは、異なるレポーター基（一般的に、放射性基または蛍光性
基、あるいは酵素）に結合したアビジンを使用して検出され得る。酵素レポータ
ー基（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
アルカリホスファターゼおよびグルコースオキシダーゼ）を、一般に、基質を添
加し（一般的に、特定の時間）、続いてこの反応生成物の分光学的分析または他
の分析を行うことによって検出し得る。用いられる特定の方法に関わらず、バッ
クグラウンド（すなわち、疾患を有さない個体から得られる生物学的サンプルに
ついて観察されるレベル）より少なくとも２倍大きい結合検出試薬のレベルは、
ＷＴ１発現に関連する悪性疾患の存在を示す。
【０２１９】 一般に、免疫または治療の有効性をモニタリングするための方法は、患者にお
けるＷＴ１に特異的な抗体またはＴ細胞のレベルの変化をモニタリングする工程
を包含する。抗体のレベルをモニタリングする方法は、以下の工程を包含し得る
：（ａ）治療前または免疫前の患者から得られる第１の生物学的サンプルを、Ｗ
Ｔ１ペプチドと共にインキュベートする工程であって、ここで、このインキュベ
ーションは、免疫複合体が形成し得るのに十分な条件下、これに十分な時間、行
われる、工程；（ｂ）このＷＴ１ペプチドと、この生物学的サンプル中の、ＷＴ
１ペプチドに特異的に結合する抗体との間で形成された免疫複合体を検出する工
程；（ｃ）治療後または免疫後の患者から採取した第２の生物学的サンプルを用
いて、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）第１の生物学的
サンプルおよび第２の生物学的サンプルで検出された免疫複合体の数を比較する
工程。あるいは、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはＷＴ１
ペプチドを発現するＡＰＣを、ＷＴ１ペプチドの代わりに使用し得る。このよう
な方法において、このポリヌクレオチドによりコードされるＴＷ１ペプチドまた
はＡＰＣによって発現されるＷＴ１ペプチドと、生物学的サンプル中の抗体との
間の免疫複合体が、検出される。
【０２２０】 Ｔ細胞活性化および／またはＷＴ１特異的前駆体の数をモニタリングする方法
は、以下の工程を包含し得る：（ａ）治療前または免疫前の患者から得た、ＣＤ
４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞（例えば、骨髄、末梢血またはそれらの画
分）を含む第１の生物学的サンプルを、ＷＴ１ペプチドと共にインキュベートす
る工程であって、ここでこのインキュベーションは、Ｔ細胞の特異的な活性化、
増殖および／または溶解が起こるのに十分な条件下で、これに十分な時間、行わ
れる、工程；（ｂ）このＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を検出す
る工程；（ｃ）治療後または免疫後の同じ患者から採取した、ＣＤ４＋細胞およ
び／またはＣＤ８＋細胞を含む第２の生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）
および（ｂ）を繰り返す工程；ならびに（ｄ）第１の生物学的サンプルおよび第
２の生物学サンプルにおけるＴ細胞の活性化、増殖および／または溶解の量を比
較する工程。あるいは、ＷＴ１ペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
ＷＴ１ペプチドを発現するＡＰＣを、ＷＴ１ペプチドの代わりに使用し得る。
【０２２１】 このような方法で使用するための生物学的サンプルは、抗体、ＣＤ４＋Ｔ細胞
および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を含むことが予想される患者から得られる任意の
サンプルであり得る。適切な生物学的サンプルとしては、血液、血清、腹水、骨
髄、胸水および脳脊髄液が挙げられる。第１の生物学的サンプルは、治療または
免疫の開始前、あるいは治療またはワクチンレジメンの間に得られ得る。第２の
生物学的サンプルは、さらなる治療または免疫後の時点である以外は、類似の様
式で得られるべきである。この第２の生物学的サンプルは、治療または免疫の完
了時、またはその間に得られ得るが、ただし、治療または免疫の少なくとも一部
は、第１の生物学的サンプルの単離と第２の生物学的サンプルの単離との間に行
われる。
【０２２２】 両方のサンプルのインキュベーション工程および検出工程は、一般に、上記の
ように行われ得る。第１のサンプルと比較した第２のサンプル中の免疫複合体の
数の統計学的に有意な増加は、首尾良い治療または免疫を示す。
【０２２３】 （４．１０ 薬学的組成物および処方物の投与） 特定の実施形態において、本発明は、単独でかまたは１つ以上の他の抗癌治療
の様式と組み合わせてのいずれかで、細胞または動物に投与するための薬学的に
受容可能な溶液の形態の、本明細書中で開示される１つ以上のポリヌクレオチド
組成物の処方に関する。
【０２２４】 所望の場合、本明細書中で開示される核酸セグメント、ＲＮＡまたはＤＮＡ組
成物は、同様に、他の薬剤（例えば、タンパク質もしくはペプチド、または様々
な薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得ることもまた理解される。こ
の組成物が、少なくとも１つの本明細書中で開示される遺伝子発現構築物を含む
限り、さらなる薬剤が標的細胞または宿主組織と接触する際に、有意な悪影響を
引き起こさない場合には、さらに含まれ得る他の成分に対する制限は実質的にな
い。従って、ＲＮＡまたはＤＮＡ由来の組成物は、特定の場合に必要に応じて、
様々な他の薬剤と共に送達され得る。このようなＲＮＡまたはＤＮＡ組成物は、
宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に
記載されるようにして化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置
換または誘導体化されたＲＮＡまたはＤＮＡ組成物を含み得る。このような組成
物は、１つ以上の治療遺伝子構築物を、単独でかまたは１つ以上の改変ペプチド
または核酸の置換基誘導体および／または他の抗癌治療剤と組み合わせてのいず
れかで含み得る。
【０２２５】 様々な処置レジメン（例えば、経口、静脈内、鼻腔内、経皮、前立腺内、腫瘍
内、および／または筋肉内の投与および処方を含む）において、本明細書中で記
載される特定の組成物を使用するために適切な投薬レジメンおよび処置レジメン
の開発と同様に、薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方物は、当
業者に周知である。
【０２２６】 （４．１０．１ 注射可能な送達） 例えば、本明細書中に開示される薬学的組成物は、米国特許第５，５４３，１
５８号、米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３
号（これらの各々は詳細に、それらの全体において本明細書中で参考として援用
される）に記載されるように、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、またはさ
らに腹腔内投与され得る。遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩のような活性
化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切
に混合された水中で調製され得る。分散剤もまた、グリセロール、液体ポリエチ
レングリコールおよびそれらの混合物中、あるいは油中で調製され得る。貯蔵お
よび使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止する保存剤
を含む。
【０２２７】 注射用用途に適切な薬学的形態としては、滅菌水溶液または分散液、ならびに
滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる（米国特
許第５，４６６，４６８号、これはその全体が本明細書中で参考として詳細に援
用される）。全ての場合において、この形態は、滅菌状態でなければならず、か
つ容易に注射することが可能な状態で存在する程度まで流動性でなければならな
い。これは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、かつ細菌および
真菌の様な微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアは、
例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリ
コールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、およ
び／または植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、
例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合には
、必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る
。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、ク
ロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって達成さ
れ得る。多くの場合、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが
好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノ
ステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の組成物の使用によって達成され得
る。
【０２２８】 例えば、水溶液の非経口投与について、この溶液は、必要な場合、適切に緩衝
化されるべきであり、そして液体希釈剤は、初めに、十分な生理食塩水またはグ
ルコースで等張性にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋肉内投与
、皮下投与および腹腔内投与に特に適切である。これに関連して、用いられ得る
滅菌水性媒体は、本開示に照らして、当業者に公知である。例えば、ある投薬量
は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入
液に添加されるか、または注入の計画された部位に注射される（例えば、Ｈｏｏ
ｖｅｒ、１９７５を参照のこと）。処置されている被験体の状態に依存して、あ
る程度の投薬の変化が必然的に生じる。投与に責任を負う人は、いずれにしても
、個々の被験体に適切な容量を決定する。さらに、ヒトの投与について、調製物
は、無菌性、発熱性および一般の安全性、ならびに食品医薬品庁の生物製剤基準
により必要とされるような純度基準を満たさなければならない。
【０２２９】 滅菌注射可能溶液は、必要な量の遺伝子治療構築物を、いくつかの上記の他の
成分と共に適切な溶媒に組込み、続いて、必要に応じて滅菌濾過することによっ
て調製され得る。一般的に、分散液は、様々な滅菌活性成分を、基本の分散媒体
および上記の必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製さ
れる。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は
、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術は、活性成分＋予め滅
菌濾過したそれらの溶液由来の任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０２３０】 本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬
学的に受容可能な塩としては、酸付加塩が挙げられ、そしてこれは、無機酸（例
えば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マ
ンデル酸など）と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機
塩基（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸
化鉄（ＩＩ））、および有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルア
ミン、ヒスチジン、プロカインなど）から誘導され得る。処方の際、溶液は、こ
の投薬処方物に適合した様式で、かつ治療的に有効な量で投与される。この処方
物は、様々な投薬形態（例えば、注射可能溶液、薬物放出カプセルなど）で容易
に投与される。
【０２３１】 本明細書中で使用する場合、「キャリア」は、任意のおよび全ての溶媒、分散
媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および
吸収遅延剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的に活
性な物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。
任意の従来の媒体または薬剤が活性成分と不適合性である場合を除いて、治療組
成物におけるその使用は意図される。補助的に活性な成分もまた、この組成物に
組み込まれ得る。
【０２３２】 （４．１０．２ 鼻腔内送達） １つ以上の開示されるペプチドおよびポリペプチドを用いて中皮腫を処置する
ために、鼻腔溶液またはスプレー、エアロゾル、あるいは吸入剤を使用し得る。
鼻腔溶液は、通常、ドロップまたはスプレーで鼻孔に投与するために設計された
水溶液である。鼻腔溶液は、それらが多くの点において、鼻腔分泌に類似してお
り、その結果、正常な線毛作用が維持されるように調製され得る。従って、水性
鼻腔溶液は、通常、等張性であり、そして約５．５〜約６．５のｐＨを維持する
ようわずかに緩衝化される。さらに、眼用調製物において使用される抗菌保存剤
と類似の抗菌保存剤および適切な薬物安定剤が、必要に応じて、この処方物に含
有され得る。様々な市販の鼻腔調製物が公知である。
【０２３３】 吸入薬および吸入剤は、薬物または化合物を患者の気道に送達するために設計
された薬学的調製物である。蒸気またはミストが投与され、そして罹患領域に到
達し、しばしば気管支および鼻腔のうっ血の症状からの解放を与える。しかし、
この経路はまた、薬剤を体循環に送達するために用いられ得る。吸入薬は、鼻呼
吸経路または口呼吸経路によって投与され得る。吸入溶液の投与は、液滴が、こ
のミストが気管支に到達するのに十分に微細であり、そしてサイズが均一である
場合にのみ、有効である。
【０２３４】 吸入薬としてもまた公知であり、時折、吸入剤（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）
と呼ばれる製品の別の群は、特定の送達システム（例えば、薬学的エアロゾル）
によって気道に送達され、そして液化ガス噴霧剤中の薬物の溶液または懸濁液を
保持する、微粉化薬物または液体薬物からなる。適切な弁および経口アダプタを
介して放出される場合、計量した用量の吸入薬は、患者の気道に推進される。
【０２３５】 粒子サイズは、このタイプの調製物の投与において重要である。肺腔内への浸
透に最適な粒子サイズは、約０．５〜約７μｍのオーダーであることが報告され
ている。微細なミストは、加圧エアロゾル、故に熟慮した有利なそれらの使用に
よって、生成され得る。
【０２３６】 （４．１０．３ リポソーム媒介送達、ナノカプセル媒介送達および微粒子媒
介送達） 特定の実施形態において、本発明者らは、本発明のポリヌクレオチド組成物を
適切な宿主細胞に導入するために、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロ
スフェア、脂質粒子、ビヒクルなどの使用を意図する。特に、本発明のポリヌク
レオチド組成物は、脂質粒子、リポソーム、ビヒクル、ナノスフェアまたはナノ
粒子などのいずれかにカプセル化されて、送達のために処方され得る。
【０２３７】 このような処方物は、本明細書中で開示される核酸の薬学的に受容可能な処方
物の導入のために好ましくあり得る。リポロームの形成および使用は、一般に、
当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕ
ｒ，１９８８；Ｌａｓｉｃ，１９９８（これは細胞内細菌感染および疾患の標的
抗生物質治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）を参照
のこと）。最近、改良された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが
開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、１９８８
；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ、１９８７；米国特許第５，７４１，５１６号（
これらは本明細書中で参考としてその全体が詳細に援用される））。さらに、お
よび強力な薬物キャリアとしてのリポソームリポソーム様調製物の様々な方法が
再検討されている（Ｔａｋａｋｕｒａ、１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら、１９９
７；Ｍａｒｇａｌｉｔ、１９９５；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許
第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７
３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、本明
細書中で参考としてその全体が詳細に援用される））。
【０２３８】 リポソームは、他の手順（Ｔ細胞懸濁、一次肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞
を含む）によるトランスフェクションに対して通常は抵抗性である多数の細胞型
と共に首尾良く使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅ
ｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的な
ＤＮＡ長制限を含まない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａ
ｒｔｉｎ、１９８６；Ｈｅａｔｈら、１９８６；Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１
９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ、１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉ
ｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕ
ｍｉら、１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１
９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（Ｎｉｃｏｌａｕおよび
Ｇｅｒｓｏｎｄｅ、１９７９）を、様々な培養細胞株および動物に効率的に導入
するために使用される。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を試験するい
くつかの首尾良い臨床試験が完了した（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、１
９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ、１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）
。さらに、いくつかの研究は、リポソームの使用は、自己免疫応答、毒性または
全身送達後の生殖腺局在に関連しないことを示唆する（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａ
ｔｓｕ、１９９２）。
【０２３９】 リポソームは、水性媒体に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心状
二層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも称される）を自発的に形成する。ＭＬＶは、
一般に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理により、２００
〜５００Åの範囲の直径を有し、コア中に水溶液を含む小さな単層小胞（ＳＵＶ
）が形成する。
【０２４０】 リポソームは、細胞膜に対して類似点を有し、そしてペプチド組成物のための
キャリアとして本発明と共に使用することが意図される。これらは、水溶性物質
および脂溶性物質の両方が捕捉され得る（すなわち、それぞれ、水性空間中およ
び二層自体の中）ため、広範に適切である。リポソーム処方物を選択的に改変す
ることによって、薬物保有リポソームを活性薬剤の部位特異的送達のためにさら
に用いることが可能である。
【０２４１】 Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報は、
リポソーム処方物を作製する際に使用され得る。リン脂質は、水に分散された場
合、脂質対水のモル比に依存して、リポソーム以外の様々な構造を形成し得る。
小さい比において、このリポソームは好ましい構造である。リポソームの物理特
性は、ｐＨ、イオン強度および二価の陽イオンの存在に依存する。リポソームは
、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示し得るが、高温において
、それらの透過性を著しく変える相転移を受ける。この相転移は、密に充填した
規則的な構造（ゲル状態として公知）からゆるく充填したそれほど規則的ではな
い構造（液体状態として公知）への変化を含む。これは、特有の相転移温度で生
じ、そしてイオン、糖および薬剤に対する透過性の増加をもたらす。
【０２４２】 あるいは、本発明は、本発明のポリオヌクレオチド組成物の薬学的に受容可能
なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは、一般に、安定な再現性のあ
る様式で、化合物を捕捉し得る（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８
７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら、
１９８７）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このよ
うな超微細粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマー
を使用して設計されなければならない。これらの要件を満たす生分解性ポリアル
キル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用を企図され、そして
このような粒子は、記載されるように、容易に作製され得る（Ｃｏｕｖｒｅｕｒ
ら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘ
ら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第
５，１４５，６８４号（これらは本明細書中でその全体が参考として詳細に援用
される））。特に、ナノ粒子またはナノスフェアのいずれかを使用して標的細胞
にポリヌクレオチドを送達する方法（Ｓｃｈｗａｂら、１９９４；Ｔｒｕｏｎｇ
−Ｌｅら、１９９８）はまた、動物、特にヒトに投与するための開示される組成
物を処方する際に、有用であることが特に意図される。
【０２４３】 （４．１１ 治療剤およびキット） 本発明はまた、１つ以上のＷＴ１特異的抗体もしくは抗原結合フラグメント、
またはこれを必要とする動物に投与するために、１つ以上の薬学的に受容可能な
賦形剤、キャリア、希釈剤、アジュバントおよび／もしくは他の成分と共に処方
されたＷＴ１由来ペプチドもしくはペプチド改変体を提供する。開示されるエピ
トープ、抗体および抗原結合フラグメントに加えて、抗体もしくは抗原結合フラ
グメントコードポリヌクレオチド、またはさらなる抗癌剤、ポリヌクレオチド、
ペプチド、抗原、あるいは他の治療化合物は、本明細書中で開示される特定の組
成物および処方物の処方において、特に、罹患した哺乳動物に投与するための抗
癌剤または抗中皮腫治療剤の調製において、用いられ得る。
【０２４４】 このように、本明細書中で開示される薬学的組成物の投与のために好ましい動
物としては、哺乳動物、特に、ヒトが挙げられる。他の好ましい動物としては、
霊長類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、オオカミ、イヌおよびネコ、ならび
に一般にペットと考えられる他の哺乳動物種、家畜、または商業的に関係した動
物種が挙げられる。この組成物および処方物は、部分的または有意に精製された
ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体または抗原結合フラグメント組成
物を、単独でかまたは１つ以上のさらなる活性成分、抗癌剤、ワクチン、アジュ
バントまたは他の治療剤（これは、天然の供給源または組換え供給源から得られ
得るか、または天然で得られ得るかまたは化学的に合成されるか、あるいは１つ
以上のこのようなさらなる活性成分、キャリア、アジュバント、補因子、または
他の治療化合物をコードする１つ以上の核酸セグメントを発現する組換え宿主細
胞からインビトロで産生され得る）と組み合わせてのいずれかで含み得る。
【０２４５】 （４．１２ 診断試薬およびキット） 本発明は、診断試薬、ならびに例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ
および「サンドイッチ」型イムノアッセイ）を含む様々な診断アッセイにおいて
使用するための、１つ以上このような試薬を含むキットをさらに提供する。この
ようなキットは、好ましくは、本発明の少なくとも１つの第１のペプチド、また
は第１の抗体もしくは抗原結合フラグメント、それらの機能的フラグメント、ま
たはそれらのカクテル、ならびにシグナル生成のための手段を含む。このキット
の成分は、固体支持体に予め結合され得るか、またはキットが使用される場合に
、固体支持体の表面に適用され得る。シグナル生成手段は、本発明の抗体と予め
結合され得るか、または１つ以上の成分（例えば、緩衝液、抗体−酵素結合体、
酵素基質など）と使用前に組み合わせることを必要とし得る。キットはまた、さ
らなる試薬（例えば、固相表面に対する非特異的結合を減少するためのブロッキ
ング剤、洗浄剤、酵素基質など）を含み得る。固相表面は、マイクロタイタープ
レート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチドを
固定するために適切な他の材料の形態であり得る。好ましくは、化学発光性生成
物もしくは色素生産性生成物の形成、または化学発光性物質もしくは色素生産性
物質の還元を触媒する酵素は、シグナル生成手段の成分である。このような酵素
は、当該分野で周知である。
【０２４６】 このようなキットは、ＷＴ１、またはＷＴ１−由来ペプチドおよび／またはポ
リペプチドの過剰発現またたは不適切な発現によって特徴付けられる状態の検出
、モニタリング、および診断において有用である。
【０２４７】 本発明の治療的および診断的キットもまた、調製され得、このキットは、本明
細書中に開示される抗体、ペプチド、抗原結合フラグメント、ハイブリドーマ、
ベクター、ワクチン、ポリヌクレオチド、または細胞組成物のうちの少なくとも
１つ、ならびに診断試薬または治療剤としてその組成物を使用するための説明書
を備える。このようなキットにおける使用のための容器は、代表的に、少なくと
も１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の適切な容器
を含み得、この中に、１以上の診断および／または治療組成物が、配置され得、
そして好ましくは適切に分配され得る。第二の治療剤がまた提供される場合、こ
のキットはまた、第二の別個の容器を含み得、この中に、この第二の診断／およ
び／または治療組成物が配置され得る。あるいは、複数の化合物が、単一の薬学
的組成物に調製され得、そし単一の容器手段（例えば、バイアル、フラスコ、シ
リンジ、ボトル、または他の適切な単一容器）に充填され得る。本発明のキット
はまた、代表的に、市販のために、バイアルを密接にきっちり収容するための手
段（射出成形またはブロー成形されたプラスティック容器（この中に、所望のバ
イアルが保持される））を含み得る。放射標識、発色性、蛍光性（ｆｌｕｏｒｉ
ｇｅｎｉｃ）、または他の型の検出可能な標識または検出手段が、このキットに
含まれる場合、この標識剤は、診断また治療組成物自体と同じ容器において提供
され得るか、またはあるいはこの第二の組成物が配置され得、そして適切に分配
され得る第二の別個の容器手段に配置され得るかのいずれかである。あるいは、
検出試薬および標識は、単一の容器手段に調製され得、そしてほとんどの場合に
おいて、このキットはまた、典型的に、市販および／または好都合な包装ならび
に送達のために、バイアルを密接にきっちり収容するための手段を含み得る。
【０２４８】 （４．１３ 例示的な定義） 本発明に従って、核酸配列は、ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡまたはゲノム外ＤＮＡを
含むがこれらに限定されない）、遺伝子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＲＮＡ（ｒ
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｔＲＮＡを含むがこれらに限定されない）、ヌクレオ
シド、および適切な核酸セグメント（ネイティブな供給源から得られるか、化学
的に合成されるか、改変されるか、またはそうでなければ人の手によって全体的
にまたは部分的に調製されたかのいずれかである）を含むがこれらに限定されな
い。
【０２４９】 他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的用語および科学
的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する
。本明細書中に記載される方法および組成物のと類似するかまたは等価な任意の
方法および組成物が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好まし
い方法および組成物が、本明細書中に記載される。本発明の目的のために、以下
の用語が、下に定義される： Ａ、ａｎ：長年の特許法の習慣に従って、語「ａ」および「ａｎ」は、本明細
書（特許請求の範囲を含む）中で使用される場合、「１またはそれ以上」を表す
。
【０２５０】 発現：コードされるペプチドまたはポリペプチドを合成するための、ポリヌク
レオチド（例えば、構造遺伝子）が受ける細胞内プロセス（転写および翻訳を含
む）の組合せ。
【０２５１】 プロモーター：転写を調節する核酸配列の領域を一般的に記述するために使用
される用語。
【０２５２】 調節エレメント：転写を調節する核酸配列の領域を一般的に記述するために使
用される用語。
【０２５３】 構造遺伝子：発現されて、コードされるペプチドまたはポリペプチドを生成す
る遺伝子または配列領域。
【０２５４】 形質転換：外来性ポリヌクレオチド配列（例えば、ベクター、組換えＤＮＡま
たはＲＮＡ分子）の宿主細胞またはプロトプラストへの導入のプロセス。ここで
、外来性核酸セグメントは、少なくとも第一の染色体に組込まれるか、または形
質転換された宿主細胞内で自立複製し得る。トランスフェクション、エレクトロ
ポレーション、および裸の核酸の取り込みは、全て、１つ以上のポリヌクレオチ
ドで宿主細胞を形質転換するために使用される技術の例を表す。
【０２５５】 形質転換された細胞：その核酸相補体が１つ以上の外来性ポリヌクレオチドの
その細胞への導入によって変更されている、宿主細胞。
【０２５６】 トランスジェニック細胞：形質転換された細胞から誘導されたかまたは生成さ
れた、あるいはトランスジェニック細胞から誘導された、あるいはこのような形
質転換された宿主細胞の任意の世代の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）または子孫（ｏｆ
ｆｓｐｒｉｎｇ）由来の、任意の細胞。
【０２５７】 トランスジェニック動物：形質転換された動物細胞由来の動物あるいはその任
意の世代の子孫または子孫。ここで、動物のＤＮＡは、導入された外来性核酸分
子（同じ種のネイティブの野生型非トランスジェニック動物には元々存在しない
）を含む。用語「トランスジェニック動物」および「形質転換された動物」は、
しばしば、動物を規定するための同義語として当該分野で使用され、この遺伝子
的内容は、１つ以上の外来性核酸セグメントを含むように改変されている。
【０２５８】 ベクター：代表的にＤＮＡから構成され、宿主細胞において複製し得、そして
／またはその結合された別の核酸セグメントが作動可能に連結され、セグメント
の複製をもたらし得る、核酸分子。プラスミド、コスミド、またはウイルスが、
例示的なベクターである。
【０２５９】 用語「実質的に対応する」、「実質的に相同性の」、または「実質的に同一性
」とは、本明細書中で使用される場合、核酸またはアミノ酸配列の特徴を表し、
ここで、選択された核酸またはアミノ酸配列は、選択された参照核酸またはアミ
ノ酸配列と比較して、少なくとも約７０％または約７５％の配列同一性を有する
。より代表的に、選択された配列および参照配列は、少なくとも、約７６、７７
、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５％の配列同一性を有
し、より好ましくは、少なくとも約８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２
、９３、９４、または９５％の配列同一性を有する。より好ましくは、なお、高
度に相同性の配列は、しばしば、選択された配列とそれが比較される参照配列と
の間で、少なくとも約９６、９７、９８、または９９％より大きな配列同一性を
共有する。配列同一性の割合は、比較される配列の全長にわたって計算され得る
か、または合計が選択された参照配列の約２５％未満である小さい欠失または付
加を排除することによって計算され得る。この参照配列は、より大きな配列（例
えば、遺伝子または隣接配列の一部分、または染色体の繰返し部分）のサブセッ
トであり得る。しかし、２つ以上のポリヌクレオチド配列の配列相同性の場合に
おいて、参照配列は、代表的に、少なくとも約１８〜２５ヌクレオチド、より代
表的に、少なくとも約２６〜３５ヌクレオチド、およびなおより代表的に、少な
くとも約４０、５０、６０、７０、８０、９０、またはなお１００以上のヌクレ
オチドを含む。望ましくは、高度に相同性のフラグメントが所望される場合、２
つの配列の間の％同一性の程度は、当業者に周知である配列比較アルゴリズム（
例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）に記載されるＦＡＳＴ
Ａプログラム分析）の１つ以上によって容易に決定されるように、少なくとも約
８０％、好ましくは少なくとも約８５％、およびより好ましくは約９０％または
９５％より大きい。
【０２６０】 用語「天然に存在する」とは、対象に適用されるように本明細書中で使用され
る場合、対象が、天然に見出され得るという事実をいう。例えば、天然の供給源
から単離され得る生物（ウイルスを含む）に存在し、そして研究室において、人
の手によって意図的に改変されていない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド
配列は、天然に存在する。本明細書中で使用される場合、古典的な遺伝学に従っ
て、選択的に交配されたげっ歯類の研究室株は、天然に存在する動物であると考
えられる。
【０２６１】 本明細書中で使用される場合、「異種」は、所定の参照された遺伝子配列に関
連して定義される。例えば、構造遺伝子配列に関して、異種プロモーターは、そ
の参照された構造遺伝子に隣接して天然には存在しないが、研究室での操作によ
って配置されるプロモーターとして定義される。同様に、異種遺伝子または核酸
セグメントは、参照プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに隣接
する天然には存在しない遺伝子またはセグメントとして定義される。
【０２６２】 「転写調節エレメント」は、それのみで、または１つ以上の他の核酸と組合せ
て、転写を活性化するポリヌクレオチド配列をいう。転写調節エレメントは、例
えば、１つ以上のプロモーター、１つ以上の応答エレメント、１つ以上のネガテ
ィブ調節エレメント、および／または１つ以上のエンハンサーを含み得る。
【０２６３】 本明細書中で使用される場合、「転写因子認識部位」および「転写因子結合部
位」は、１つ以上の転写因子の配列特異的相互作用（しばしば、直接的なタンパ
ク質−ＤＮＡ結合の形態をとる）のための部位であると同定されるポリヌクレオ
チド配列または配列モチーフをいう。代表的に、転写因子結合部位は、ＤＮＡフ
ットプリンティング、ゲル移動度シフトアッセイなどによって同定され得、そし
て／または既知のコンセンサス配列モチーフを基にしてか、または当業者に公知
の他の方法によって予測され得る。
【０２６４】 本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される」は、機能的関係
にある、２つ以上のポリヌクレオチドあるいは２つ以上の核酸の連結をいう。核
酸は、それが別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に、「作動可能に連
結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の
転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結される。作動可能に連結
されるとは、連結されるＤＮＡ配列が、代表的に、連続的であり、そして２つの
タンパク質コード領域を結合する必要性がある場合には、連続的でありかつイン
フレームである。しかし、エンハンサーは、プロモーターから数キロベース離れ
る場合に一般的に機能し、そしてイントロン配列は、種々の長さが可能であるの
で、いくつかのポリヌクレオチドエレメントは、作動可能に連結され得るが、連
続的はない。
【０２６５】 「転写単位」は、少なくとも第一のシス作用性プロモーター配列に作動可能に
連結され、そして構造遺伝子配列の効率的な転写のために必要な１つ以上の別の
ｃｉｓ作用性核酸配列、およびプロモーターおよび／またはエンハンサーエレメ
ントの制御下に作動可能に配置された構造遺伝子配列の適切な組織特異的および
発生的転写のために必要とされる少なくとも第一の遠位の調節エレメント、なら
びに効率的な転写および翻訳のために必要とされる任意のさらなるシス配列（例
えば、ポリアデニル化部位、ｍＲＮＡ安定性制御配列など）に必要に応じて連結
された、少なくとも第一の構造遺伝子を含むポリヌクレオチド配列をいう。
【０２６６】 （５ 実施例） 以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証するように含まれる。しか
し、当業者は、本発明の開示を考慮して、多くの変化が開示される特定の実施形
態においてなされ得、そして添付の特許請求の範囲に記載される本発明の精神お
よび範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果が得られ得ることを、理
解する。
【０２６７】 （５．１ 実施例１−悪性中皮腫患者におけるＷＴ１特異的抗体の検出） この実施例は、悪性中皮腫に対するマーカーとしてのＷＴ１の使用を例示する
。
【０２６８】 （５．１．１ 材料および方法） （５．１．１．１ 組換えタンパク質精製） タンパク質発現について、ヒトＷＴ１全長（アミノ酸１〜４４９）、Ｎ末端領
域（アミノ酸１〜２４９）およびＣ末端領域（アミノ酸２６７〜４４９）を表す
ｃＤＮＡ構築物を、改変ｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。得られた
ベクターは、５’Ｈｉｓタグ、続いて、チオレドキシン（Ｔｒｘ）コード領域、
続いて、３’ヒスチジンタグ、続いて、トロンビンおよびＥＫ部位を有した。Ｔ
ＲＸ−ＷＴ１タンパク質およびＴＲＸを有するＷＴ１の短縮型形態の融合タンパ
ク質についての発現構築物を含む組換えＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ（
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を一晩増殖させ、そしてイソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。全てのタンパク
質は、同様に挙動し、そして本質的に同じプロトコルに従って、精製した。細胞
を回収し、そして３７℃で、完全なプロテアーゼインヒビター錠剤（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐ
ｏｌｉｓ，ＩＮ）を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８）中でのインキュベーシ
ョンによって溶解し、続いて、超音波処理のラウンドを繰り返した。得られた封
入体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８）／０．５％ ＣＨＡＰＳで２回洗浄し
、そして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８）を含む８Ｍ尿素中（緩衝液Ａ）で可
溶化した。次いで、タンパク質を、金属キレートアフィニティクロマトグラフィ
ー（ニッケルニトリロ三酢酸樹脂（（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉ
ａ，ＣＡ）上での）によって精製した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分析し、そして目的のタンパク質を含む画分をプールし、そして過剰の１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８）に対して一晩透析した。透析物を、８Ｍ尿素にし、そ
してＳｏｕｒｃｅ ＱＴＭアニオン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）（緩衝液Ａで平衡化
した）にロードした。タンパク質を、０〜１Ｍ ＮａＣｌの勾配を用いて、緩衝
液Ａで溶出した。目的のタンパク質を含む画分をプールし、過剰の１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ（ｐＨ＝８）に対して一晩透析し、そしてさらなる使用のために、−８０
℃で保存した。ＷＴ１ペプチドの同一性を、Ｎ末端配列決定によって確認した。
【０２６９】 （５．１．１．２ 抗体応答） ＷＴ１ポリペプチドに対する抗体応答を、組換え全長および短縮型のＷＴ１タ
ンパク質の両方とＷＴ Ｎ１８０と称されるＷＴ１ポリペプチド（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃ
Ａ）とを使用する、ウエスタンブロット分析によって決定した。一次抗体として
、免疫化および非免疫化Ｂ６マウスまたはヒトＡＭＬ患者由来の血清を、Ｔｒｉ
ｓ緩衝化生理食塩水／１％ ＢＳＡおよび０．１％ ＮＰ−４０ＴＭを用いて、
１：５００に希釈して使用した。多角形抗マウスまたは抗ヒト−西洋ワサビぺル
オキシダーゼ−結合体化第二抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を、１：１０，０００の希釈度で
使用した。次いで、ブロットを、化学発光反応（ＥＣＬＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ，
Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して発色させ、その後、それらを、Ｈｙｐｅｒｆｉｌ
ｍ−ＥＣＬＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に露光した。このフィルムを、現像そして
試験した。全てのコントロールブロットを、市販の調製されたＷＴ１特異的抗体
、ＷＴ Ｃ−１９およびＷＴ １８０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）を使用して発色させ、そして各々は、ＴＲＸ−ＷＴ１融合タンパ
ク質（ＴＲＸ−ＷＴ１全長（約８５ｋＤａ）；ＴＲＸ−ＷＴ１ Ｎ末端（約６０
ｋＤａ）；ＴＲＸ−ＷＴ１ Ｃ末端（約５０ｋＤａ））の予期されるサイズに、
強いバンドを示した。
【０２７０】 （５．１．１．３ ＷＴ１ ＥＬＩＳＡ） ９６−ウェルＥＬＩＳＡ プレート（Ｎｕｎｃ）を、各々５０μｌ／ウェルの
ＷＴ１タンパク質でコーティングした。ＷＴ１タンパク質を、ＥＬＩＳＡコーテ
ィング緩衝液（１Ｍ Ｎａ２ＨＣＯ３，ｐＨ ９．６）中で５ｎｇ／μｌに希釈
した。プレートを、４℃で一晩、または３７℃で４時間インキュベートし、次い
でＰＢＳ／０．１％ ＴｗｅｅｎＴＭで２回洗浄した。プレートを、２００μｌ
／ウェルのブロック緩衝液（１０％正常ヤギ血清／ＰＢＳ／０．１％ Ｔｗｅｅ
ｎＴＭ）でブロックし、室温で２時間インキュベートし、次いで２回洗浄した。
第一工程の抗体として、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ中で希釈した５０μｌ
の患者サンプル、ポジティブコントロールまたはネガティブコントロールを、添
加した。ポジティブコントロールは、ＷＴＣ１９抗体およびＷＴ１８０抗体（Ｓ
ａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を含んだ。ネガティブコントロールは、健康なボランティ
アからの血清を含んだ。試験サンプルは、悪性中皮腫患者由来の血清を含んだ。
プレートを、４℃で一晩または室温で４時間インキュベートし、そしてプレート
ウォッシャーを使用して、４回洗浄した。第二工程の抗体として、ブロック緩衝
液で１００μｌ／ウェルに希釈した抗ウサギＨＲＰ（１：５０００）（ポジティ
ブコントロールについて）または抗ヒトＨＲＰ（１：８０００）Ａｂを、添加し
た。プレートを、室温で２時間インキュベートし、次いで６回洗浄した。
【０２７１】 これらの結果を、図２に示し、これは、悪性中皮腫患者におけるＷＴ１特異的
抗体の検出を示す。最初の２つの列は、ポジティブコントロール（ＷＴＣ１９お
よびＷＴ１８０）を示す。第３の列（Ｄ４４と表記される）は、正常なコントロ
ール血清についての結果を示す。残りの列は、悪性中皮腫を患う患者から得られ
た血清サンプルについての結果を示す。Ｓ３３７およびＳ３３９と表記される血
清サンプルは、正常なコントロールサンプルの平均の２倍より大きい値を有し、
従って、悪性中皮腫についてポジティブであると考えられる。
【０２７２】 （５．２ 実施例２−ＷＴ１を発現する細胞株を用いて免疫したマウスにおけ
るＷＴ１に対する抗体の誘導） この実施例は、インビボでのＷＴ１特異的抗体応答を誘導するための、ＷＴ１
を発現する細胞の使用を例証する。
【０２７３】 白血病を患う患者におけるＷＴ１に対する既存の抗体の検出は、ＷＴ１タンパ
ク質に対して免疫してＷＴ１に対する免疫を惹起することが可能であることを、
強く意味する。ＷＴ１に対する免疫が、ワクチン接種によって生じ得るか否かを
試験するために、マウスにＴＲＡＭＰ−Ｃ（Ｂ６起源のＷＴ１ポジティブ腫瘍細
胞株）を注射した。簡単には、雄性Ｂ６マウスを、５×１０６ ＴＲＡＭＰ−Ｃ
細胞によって皮下的に免疫し、そして３週間の間隔で５×１０６の細胞で２回ブ
ーストされた。最終免疫の３週間後、血清を得、そして脾臓の単一の細胞の懸濁
液を、２５μＭ β−２−メルカプトエタノール、２００ユニット／ｍｌのペニ
シリン、１０ｍＭのＬ−グルタミン、および１０％のウシ胎児血清を有するＲＰ
ＭＩ １６４０培地（ＧＩＢＣＯ）中で調製した。
【０２７４】 ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する免疫後、その免疫した動物におけるＷＴ１特異的抗体
応答が、検出可能であった。ウエスタンブロットを実施し、ＴＲＡＭＰ−Ｃ（Ｗ
Ｔ１ポジティブ腫瘍細胞株）で免疫したＢ６マウスにおけるＷＴ１特異的抗体応
答の検出を示した。レーン１、３および５は、分子量マーカーを含み、そしてレ
ーン２、４および６は、ＷＴ１特異的コントロール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＷＴ１タンパク質のＮ末端領域の１８０
個のアミノ酸にわたるポリペプチド、約５２ｋＤａでウエスタンブロットを移動
する）を含んだ。使用した一次抗体は、レーン２においてＷＴ１８０、レーン４
において非免疫Ｂ６マウスの血清、およびレーン６において免疫Ｂ６マウスの血
清であった。これらの結果は、ＷＴ１ポリペプチドに対する免疫が、ＷＴ１ポリ
ペプチドに対する免疫応答を惹起することを示した。
【０２７５】 （５．３ 実施例３−ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＴＨ応答およ
び抗体応答の誘導） この実施例は、ＷＴ１に特異的な免疫応答を惹起する、ＷＴ１ペプチドでの免
疫の能力を示す。
【０２７６】 Ａｂおよび増殖性Ｔ細胞応答を誘発するに適切なペプチドを、Ｔｓｉｔｅｓプ
ログラム（これは、Ｔｈ応答を惹起する能力を有するペプチドモチーフを検索す
る）に従って同定した（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌｏｒ，１９８８；Ｄｅ
ａｖｉｎら，１９９６）。表２に示されるペプチドを、合成し、そして配列決定
した。
【０２７７】
【表２】 免疫化について、ペプチドを以下のように分類した： 群Ａ：ｐ６−２２ヒト：１ｍｌ中に１０．９ｍｇ（１０μ１＝１００μｇ） ｐ１１７−１３９ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．６ｍｇ（１４μ１＝１００μ
ｇ） ｐ２４４−２６２ヒト：１ｍｌ中に４．６ｍｇ（２２μｌ＝１００μｇ） 群Ｂ：ｐ２８７−３０１ヒト／マウス：１ｍｌ中に７．２ｍｇ（１４μｌ＝１０
０μｇ） マウスｐ２９９−３１３：１ｍｌ中に６．６ｍｇ（１５μｌ＝１００μｇ） ｐ４２１−４３５ヒト／マウス：１ｍｌ中に３．３ｍｇ（３０μｌ＝１００μ
ｇ） コントロール：（ＦＢＬペプチド １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ コントロール：（ＣＤ４５ペプチド １００μｇ）＋ＣＦＡ／ＩＦＡ 群Ａは、ＷＴ１のアミノ末端部分（エキソン１）内に存在するペプチドを含み
、そして群Ｂは、カルボキシ末端内に存在するペプチドを含み、このカルボキシ
末端は、他のＤＮＡ結合タンパク質に対する配列相同性を有する４つのジンクフ
ィンガー領域を含む。群Ｂにおいて、ｐ２８７−３０１およびｐ２９９−３１３
を、エキソン７、ジンクフィンガー１から誘導し、そしてｐ４２１−４３５を、
エキソン１０、ジンクフィンガーＩＶから誘導した。
【０２７８】 Ｂ６マウスを、ＷＴ１ペプチドの群またはコントロールペプチドを用いて免疫
した。ペプチドを、注射用の１ｍｌの滅菌水に溶解し、そして、Ｂ６マウスを、
３週間の時間間隔で３回免疫した。使用したアジュバントは、ＣＦＡ／ＩＦＡ、
ＧＭ−ＣＳＦ、およびモンチナイド（Ｍｏｎｔｉｎｉｄｅ）であった。次いで、
ＷＴ１に特異的な抗体の存在を、実施例１および２に記載されるように決定し、
そして増殖性Ｔ細胞応答を、標準的なチミジン取り込みアッセイ（ここでは、細
胞を、抗原の存在下で培養し、そして増殖を、取り込まれた放射活性を測定する
ことによって評価した（Ｃｈｅｎら，１９９４））を使用して評価した。詳細に
は、リンパ球を、９６ウェルプレートにおいて、４×１０５の照射（３０００ｒ
ａｄ）された同系脾細胞および表記されたペプチドとともに、ウェルあたり２×
１０５の細胞で培養した。
【０２７９】 群Ａと表記されるペプチドの群でのマウスの免疫は、ＷＴ１に対する抗体応答
を惹起した。代表的なウエスタンブロットを実施し、これは、代表的なＷＴ１ペ
プチドで免疫したマウスにおけるＷＴ−特異的抗体の検出を示す。レーン１、３
および５は、分子量マーカーを含み、レーン２、４および６は、ＷＴ１特異的ポ
ジティブコントール（Ｎ１８０、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ、ＷＴ１タンパク質のＮ末端の１８０個のアミノ酸にわたるポリペプチド
、約５２ｋＤａでウエスタンブロットを移動する）を示す。使用した一次抗体は
、レーン２においてＷＴ１８０、レーン４において非免疫Ｂ６マウスの血清、お
よびレーン６において免疫Ｂ６マウスの血清であった。ワクチンＢに対する免疫
後では、抗体は検出されず、このことは、ワクチンＢでの免疫からのヘルパーＴ
細胞応答の欠損と一致する。Ｐ１１７−１３９は、増殖性Ｔ細胞応答を惹起した
（図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃ）。この刺激指数（ＳＩ）は、８と７２との間
で変化した。他のペプチド（ｐ６−２２およびＰ２９９−３１３）もまた、増殖
性Ｔ細胞応答を惹起することが示された。Ｐ６−２２での免疫は、２．３の刺激
指数（ＳＩ）を生じ、そしてＰ２９９−３１３での免疫は、３．３のＳＩを生じ
た。ポジティブコントロールは、ＣｏｎＡ刺激Ｔ細胞、ならびに既知の抗原（例
えば、ＣＤ４５およびＦＢＬ）で刺激したＴ細胞、および同種異系Ｔ細胞株（Ｄ
ｅＢｒｕｉｊｎら，１９９１）を含んだ。
【０２８０】 図４Ａおよび図４Ｂは、ワクチンＡ（図４Ａ）およびワクチンＢ（図４Ｂ）内
の３つのペプチドの各々について観察された増殖性応答を示す。ワクチンＡは、
免疫化ペプチドｐ６−２２およびｐ１１７−１３９に対する増殖性Ｔ細胞応答を
惹起した（刺激指数（ＳＩ）は、３と８との間で変化する（大部分の株））のｐ
２４４−２６２に対する増殖性応答は、検出されなかった（図４Ａ）。
【０２８１】 引き続くインビトロ刺激を、ｐ６−２２およびｐ１７７−１３９のみを使用す
る単一ペプチド刺激として実施した。ワクチンＡ特異的Ｔ細胞株のｐ１１７−１
３９での刺激は、ｐ１１７−１３９に対する増殖を示したが、ｐ６−２２に対す
る応答は生じなかった（図５Ａ）。この株から誘導されたクローンは、ｐ１１７
−１３９に特異的であった（図５Ｂ）。対照的に、ワクチンＡ特異的Ｔ細胞株の
ｐ６−２２での刺激は、ｐ６−２２に対する増殖を生じたが、ｐ１１７−１３９
に対する応答は生じなかった（図５Ｃ）。この株から誘導されたクローンは、ｐ
６−２２に対して特異的であった（図５Ｄ）。これらの結果は、ＷＴ１ペプチド
でのワクチン接種が、ＷＴ１ポリペプチドに対する抗体応答、およびこの免疫化
ペプチドに対する増殖性Ｔ細胞応答を惹起し得ることを示した。
【０２８２】 （５．４ 実施例４−ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＣＴＬ応答の
誘導） この実施例は、ＣＴＬ免疫を惹起する、ＷＴ１ポリペプチドの能力を示す。
【０２８３】 クラスＩ ＭＨＣへの結合に適切なモチーフを有する９量体ペプチド（９マー
）を、種々の分析方法（ＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測アッセイ（Ｐａｒ
ｋｅｒら、１９９４）を含む）を使用して、同定した。このような分析で同定さ
れたペプチドを、表３〜表４５に示す。これらの表の各々において、スコアは、
その示されたＭＨＣ分子に対するペプチドの理論的な結合親和性（解離の半分の
時間）を反映する。ＴＳＩＴＥＳプログラム（ＲｏｔｈｂａｒｄおよびＴａｙｌ
ｏｒ，１９８８；Ｄｅａｖｉｎら，１９９６）（これは、Ｔｈ応答を惹起する能
力を有するペプチドモチーフを検索する）を使用して同定されたペプチドが、表
４６にさらに示される。
【０２８４】
【表３】
【０２８５】
【表４】
【０２８６】
【表５】
【０２８７】
【表６】
【０２８８】
【表７】
【０２８９】
【表８】
【０２９０】
【表９】
【０２９１】
【表１０】
【０２９２】
【表１１】
【０２９３】
【表１２】
【０２９４】
【表１３】
【０２９５】
【表１４】
【０２９６】
【表１５】
【０２９７】
【表１６】
【０２９８】
【表１７】
【０２９９】
【表１８】
【０３００】
【表１９】
【０３０１】
【表２０】
【０３０２】
【表２１】
【０３０３】
【表２２】
【０３０４】
【表２３】
【０３０５】
【表２４】
【０３０６】
【表２５】
【０３０７】
【表２６】
【０３０８】
【表２７】
【０３０９】
【表２８】
【０３１０】
【表２９】
【０３１１】
【表３０】
【０３１２】
【表３１】
【０３１３】
【表３２】
【０３１４】
【表３３】
【０３１５】
【表３４】
【０３１６】
【表３５】
【０３１７】
【表３６】
【０３１８】
【表３７】
【０３１９】
【表３８】
【０３２０】
【表３９】
【０３２１】
【表４０】
【０３２２】
【表４１】
【０３２３】
【表４２】
【０３２４】
【表４３】
【０３２５】
【表４４】
【０３２６】
【表４５】
【０３２７】
【表４６】 特定のＣＴＬペプチド（表４７に示す）を、さらなる研究のために選択した。
表４７の各ペプチドに関して、ＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチド結合予測分析を用い
て得たスコアを提供する。
【０３２８】
【表４７】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスＭＨＣに結合するペプチドを、白血病細胞株ＲＭＡ−Ｓ
（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、１９９０）を使用して確認した。手短に言うと、ＲＭ
Ａ−Ｓ細胞を１％ＦＣＳを補充した完全培地中で、２６℃で７時間培養した。総
量１０６個のＲＭＡ−Ｓ細胞を２４ウェルプレートの各ウェルに添加し、２６℃
で１６時間、単独でかまたは指定されたペプチド（２５μｇ／ｍｌ）と共にのい
ずれかでインキュベートし、そして、完全培地中で、さらに３７℃でさらに３時
間インキュベートした。次いで、細胞を３回洗浄し、そして、フルオレセインイ
ソチオシアネート結合体化抗Ｄｂまたは抗Ｋｂ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓ
ａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。標識した細胞を２回洗浄し、再懸濁し、
そして、１％パラホルムアルデヒドを用いて５００μｌのＰＢＳ中で固定し、そ
してフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａ
ｌｉｂｕｒ（登録商標））中で蛍光強度について分析した。ＲＭＡ−Ｓ細胞の表
面上のＤｂまたはＫｂ分子の増加の割合を、培地単独中でインキュベートした細
胞の平均蛍光強度と比較した、ペプチドと共にインキュベートした細胞の平均蛍
光強度の増加によって測定した。
【０３２９】 マウスを、マウスクラスＩ ＭＨＣに結合し得るペプチドを用いて免疫した。
免疫後、脾臓細胞をインビトロで刺激して、ＷＴ１ペプチドと共にインキュベー
トした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴＬを、標準クロム放出アッセ
イ（Ｃｈｅｎら、１９９４）を用いて評価した。１０６個の標的細胞を、特定の
ペプチドの存在下または非存在下で、９０分間、１５０μＣｉの５１Ｃｒナトリ
ウムと共に３７℃でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、５％胎児ウシ血清
を含むＲＰＭＩ中で再懸濁した。アッセイについて、１０４個の５１Ｃｒ標識し
た標的細胞をＵ底の９６ウェルプレート中で、２００μｌの最終容量の、異なる
濃度のエフェクター細胞とインキュベートした。上清を３７℃で４〜７時間後に
除去し、そして特異的な溶解の割合を、以下の式によって決定した： 特異的な溶解％＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大の放出−自発
的放出） 表４８に示されるように、結果は、いくつかのＷＴ１ペプチドが、クラスＩ
ＭＨＣ分子に結合し得、これが、ＣＴＬを生成するために必須であることを示す
。さらに、ペプチドのいくつかは、クロム放出アッセイを使用して決定されるよ
うに、ペプチド特異的ＣＴＬ（図６Ａおよび図６Ｂ）を誘発し得る。ＣＴＬペプ
チドｐ１０−１８ヒト、ｐ１３６−１４４ヒト、ｐ１３６−１４４マウスおよび
ｐ２３５−２４２に対する免疫の後、ペプチド特異的ＣＴＬ株を産生し、そして
、クローンを樹立した。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬは、ＷＴ１を発
現する悪性細胞を殺し得ることを示す。
【０３３０】
【表４８】 （５．５ 実施例５−マウスにおけるＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発するＷＴ１ペ
プチドの使用） この実施例は、ＷＴ１ポジティブ腫瘍細胞株を殺し得るＣＴＬ免疫を誘発する
代表的なＷＴ１ペプチドの能力を示す。
【０３３１】 Ｐ１１７−１３９（クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣに対する結合に適切な
モチーフを有するペプチド）を、ＴＳＩＴＥＳおよびＢＩＭＡＳ ＨＬＡペプチ
ド結合予測分析を使用して、上記のように同定した。マウスを、実施例３におい
て記載されるように、免疫した。免疫後、脾臓細胞をインビトロで刺激し、そし
て、ＷＴ１ペプチドならびにＷＴ１ポジティブ腫瘍細胞およびＷＴ１ネガティブ
腫瘍細胞と共にインキュベートした標的を溶解する能力について試験した。ＣＴ
Ｌを、標準的なクロム放出アッセイを用いて、評価した。結果（図７Ａ、図７Ｂ
、図７Ｃ、および図７Ｄに示される）は、Ｐ１１７が、ＷＴ１ポジティブ腫瘍細
胞を殺し得るＷＴ１特異的ＣＴＬを誘発し得るが、ＷＴ１ネガティブ細胞の死滅
は観察されなかったことを示す。これらの結果は、ペプチド特異的ＣＴＬが、実
際に、ＷＴ１を発現する悪性細胞を殺し、そして、ワクチンおよびＴ細胞治療が
、ＷＴ１を発現する悪性度に対して、効果的であることを実証する。
【０３３２】 同様の免疫を、９マーのクラスＩ ＭＨＣ結合ペプチドであるｐ１３６−１４
４、ｐ２２５−２３３、ｐ２３５−２４３ならびに２３マーのペプチドであるｐ
１１７−１３９を使用して行った。免疫化後、脾臓細胞を、４つのペプチドの各
々を用いてインビトロで刺激し、そして、ＷＴ１ペプチドと共にインキュベート
した標的を溶解するための能力について試験した。ｐ２２５−２３３ではなく、
ｐ１３６−１４４、ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９に特異的なＣＴＬ
が生じた。ｐ２３５−２４３およびｐ１１７−１３９についてのＣＴＬデータを
、図８Ａおよび図８Ｂにおいて示す。ペプチドｐ１３６−１４４およびｐ２２５
−２３３についてのデータは、示されていない。
【０３３３】 ＣＴＬ溶解は、標的ＷＴ１ペプチドが、内因的にプロセシングされ、そして、
腫瘍細胞クラスＩ ＭＣＨ分子に関して提示されることを要求する。上記のＷＴ
１ペプチド特異的ＣＴＬを、ネガティブな腫瘍細胞株に対するＷＴ１ポジティブ
を溶解するための能力について試験した。ｐ２３５−２４３について特異的なＣ
ＴＬは、ｐ２３５−２４３ポリペプチドと共にインキュベートした標的を溶解し
たが、ＷＴ１タンパク質を発現する細胞株を溶解できなかった（図８Ａ）。顕著
に対照的に、ｐ１１７−１３９について特異的なＣＴＬは、ｐ１１７−１３９ペ
プチドと共にインキュベートされた標的を溶解し、そしてまた、ＷＴ１を発現す
る悪性細胞を溶解した（図８Ｂ）。ネガティブコントロールとして、ｐ１１７−
１３９について特異的なＣＴＬは、ＷＴ１ネガティブＥＬ−４（本明細書中で、
Ｅ１０ともいわれる）を溶解しなかった。
【０３３４】 ＷＴ１特異的溶解の特異性を、非放射性の標的阻害によって確かめた（図９Ａ
および図９Ｂ）。エフェクター細胞を、９６ウェルＵ底プレート中で、種々のエ
フェクター：標的の比率でプレートした。（放射能性の標的と比較して）１０倍
過剰の示されたペプチドコーティング標的（５１Ｃｒ標識を含まない）を添加し
た。最後に、１ウェル当り１０４個の５１Ｃｒ標識細胞を添加し、プレートを３
７℃で４時間インキュベートした。１ウェル当りの総容量は、２００μｌであっ
た。
【０３３５】 ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬによるＴＲＡＭＰ−Ｃの溶解は、関連ペプチド
ｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、５８％から３６
％ブロックされたが、無関係のペプチドと共にインキュベートしたＥＬ−４では
、ブロックされなかった（図９Ａ）。同様に、ＢＬＫ−ＳＶ４０の溶解は、関連
したペプチドｐ１１７−１３９と共にインキュベートしたＥＬ−４によって、１
８％から０％ブロックされた（図９Ｂ）。結果は、ＷＴ１ペプチド特異的ＣＴＬ
が、プロセシングされたＷＴ１の認識によって、悪性細胞を特異的に殺すことを
確証する。
【０３３６】 推定ＣＴＬモチーフを有するいくつかのセグメントは、ｐ１１７−１３９内に
含まれる。ＣＴＬエピトープの正確な配列を決定するために、ｐ１１７−１３９
内の全ての潜在的な９マーのペプチドを合成した（表４９）。これらのペプチド
の２つ（ｐ１２６−１３４およびｐ１３０−１３８）は、Ｈ−２ｂクラスＩ分子
に結合することが示された（表４９）。ｐ１１７−１３９を用いる免疫によって
生じたＣＴＬは、ｐ１１７−１３９内の他の９マーペプチドではなく、ｐ１２６
−１３４およびｐ１３０−１３８と共にインキュベートした標的を溶解した（図
１０Ａ）。
【０３３７】 ｐ１１７−１３９特異的ＣＴＬ株を、ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３
８のいずれかを用いて、再刺激した。ｐ１２６−１３４またはｐ１３０−１３８
を用いる再刺激の後、両方のＴ細胞株が、ペプチド特異的溶解を実証したが、ｐ
１３０−１３８特異的ＣＴＬのみが、ＷＴ１ポジティブ腫瘍細胞株の溶解を示し
た（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。従って、ｐ１３０−１３８は、天然でプロセス
されたエピトープであるようである。
【０３３８】
【表４９】 （５．６ 実施例６−マウス腫瘍細胞株におけるＷＴ１特異的ｍＲＮＡの同定
） この実施例は、細胞および細胞株におけるＷＴ１特異的ｍＲＮＡを検出するた
めに、ＲＴ−ＰＣＲＴＭの使用を例示する。
【０３３９】 単核細胞を、密度勾配遠心分離によって単離し、そして、すぐに凍結し、ＷＴ
１特異的ｍＲＮＡの存在についてＲＴ−ＰＣＲＴＭによって分析するまで、−８
０℃で保存した。ＲＴ−ＰＣＲＴＭを、一般に、Ｆｒａｉｚｅｒら（１９９５）
によって記載されるように行なった。総ＲＮＡを、標準的な手順に従って、１０ ７ 個の細胞から抽出した。ＲＮＡペレットを、２５μＬのジエチルピロカルボネ
ート処理水に再懸濁し、そして、逆転写に直接使用した。ジンクフィンガー領域
（エキソン７−１０）を３３０ｂｐのマウスｃＤＮＡとして、ＰＣＲＴＭによっ
て増幅した。増幅を、サーモサイクラー中で、１回または、必要な場合、２回の
連続した回のＰＣＲＴＭの間行なった。５０μｌの総反応容量中で、Ａｍｐｌｉ
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒ
ｗａｌｋ，ＣＴ）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２０ｐｍｏｌの各プライマー
を使用した。ＰＣＲＴＭ産物の２０μＬのアリコートを、臭化エチジウムで染色
した２％アガロースゲル上で電気泳動した。このゲルを、Ｐｏｌａｒｏｉｄフィ
ルム（Ｐｏｌａｒｏｉｄ ６６７、Ｐｏｌａｒｏｉｄ Ｌｔｄ．，Ｈｅｒｔｆｏ
ｒｄｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて写真撮影した。相互汚染に対する予
防策は、ＫｗｏｋおよびＨｉｇｕｃｈｉ（１９８９）の推奨にしたがって行なっ
た。ネガティブコントロールは、ｃＤＮＡ試薬およびＰＣＲＴＭ試薬が、各実験
において、ｃＤＮＡの代わりに水と混合することを含んだ。偽のネガティブを避
けるために、インタクトなＲＮＡの存在および適切なｃＤＮＡ生成を、β−アク
チンプライマーを使用するコントロールＰＣＲＴＭによって、各サンプルについ
て評価した。これらのプライマーを用いて増加しなかったサンプルは、分析から
除外した。
【０３４０】 マウス細胞株におけるＷＴ１の増幅のためのプライマーは、以下であった：Ｐ
１１５：１４５８−１４７８：５’−ＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＧＡＧＡ
ＴＡ−３’（正方向プライマー；配列番号２１）；およびＰ１１６：１７６７−
１７８７：５’−ＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＧＣＧＧＡＣＣＡＡＴ−３’（逆方向
プライマー；配列番号２２）（Ｉｎｏｕｅら、１９９６；Ｆｒａｉｚｅｒら、１
９９５）。
【０３４１】 コントロール反応において使用されるβアクチンプライマーは、以下であった
：５’−ＧＴＧＧＧＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＡ−３’（センスプライマー
；配列番号２３）；および５’−ＧＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ
ＴＴＣ−３’（アンチセンスプライマー；配列番号２４）。
【０３４２】 ヒトＷＴ１を増幅する際の使用のためのプライマーは、以下を含む：Ｐ１１７
：９５４−９７４：５’−ＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＡ−３’
（配列番号２５）；およびＰ１１８：１４３４−１４１４：５’−ＧＡＧＡＧＴ
ＣＡＧＡＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴ−３’（配列番号５）。ネストＲＴ−ＰＣＴ ＴＭ については、プライマーは、以下のようであり得る：Ｐ１１９：１０２３−
１０４３：５’−ＧＣＴＧＴＣＣＣＡＣＴＴＡＣＡＧＡＴＧＣＡ−３’（配列番
号２６）；およびＰ１２０：１３４５−１３６５：５’−ＴＣＡＡＡＧＣＧＣＣ
ＡＧＣＴＧＧＡＧＴＴＴ−３’（配列番号２７）。
【０３４３】 表５０は、マウス腫瘍細胞株のＷＴ１ ＰＣＲＴＭ分析の結果を示す。表５中
で、（＋＋＋）は、第１工程のＲＴ−ＰＣＲＴＭにおける強力なＷＴ１ ＰＣＲ ＴＭ 増幅産物を示し、（＋＋）は、第１工程のＷＴ１ ＲＴ−ＰＣＲＴＭによっ
て検出可能であるＷＴ１増幅産物を示し、（＋）は、第２工程のＷＴ１ ＲＴ−
ＰＣＲＴＭにおいてのみ検出可能である産物を示し、そして（−）は、ＷＴ１
ＰＣＲＴＭネガティブを示す。
【０３４４】
【表５０】 （５．７ 実施例７−マウスにおけるＷＴ１免疫の全身性の組織病理学的影響
および全身性の毒物学的影響の評価） この実施例の目的は、マウスにおける複数回用量の力価測定（ｔｉｔｒａｔｉ
ｏｎ）における、ＷＴ１タンパク質免疫の免疫原性ならびに潜在的な全身性の組
織病理学的影響および全身性の毒素学的影響を分析することである。
【０３４５】 ＷＴ１タンパク質を用いてマウスを免疫するための実験設計を表５１に概略す
る。
【０３４６】
【表５１】 雌性Ｃ５７／Ｂ６マウスにおける複数回用量の力価測定研究（用量は、ＷＴ１
タンパク質の２５μｇ、１００μｇ〜１０００μｇまでの範囲にわたる）におけ
る、ＭＰＬ−ＳＥをアジュバントとして使用するＷＴ１タンパク質に対するワク
チン接種は、強力なＷＴ１−特異的抗体反応（図１９）および細胞性Ｔ細胞応答
（図２０）を誘発した。
【０３４７】 ＷＴ１タンパク質を用いる免疫性の全身性の組織病理学的影響または全身性の
毒素学的影響は、観察されなかった。毒性についての組織学的証拠は、以下の組
織において見られなかった：副腎腺、脳、盲腸、結腸、十二指腸、眼、大腿およ
び骨髄、胆嚢、心臓、回腸、空腸、腎臓、喉、涙腺、肝臓、肺、リンパ節、筋肉
、食道、卵巣、膵臓、上皮小体、唾液腺、胸骨および骨髄、脾臓、胃、胸腺、気
管、甲状腺、膀胱および子宮。
【０３４８】 潜在的な造血毒性の評価が、特に注目された。胸骨髄および大腿骨髄における
骨髄球／赤血球の比率は、正常であった。全ての評価可能な血球計数および血液
化学（ＢＵＮ、クレアチニン、ビリルビン、アルブミン、グロブリン）は、正常
な範囲内であった。
【０３４９】 ＷＴ１に対する既存の免疫が、白血病を有する何匹かの患者において存在し、
そして、ＷＴ１タンパク質に対するワクチン接種が、正常な組織に対する毒性な
しにマウスにおける、ＷＴ１特異的Ａｂ応答および細胞性Ｔ細胞応答を誘発し得
る場合、これらの実験は、ＷＴ１を腫瘍／白血病ワクチンであると確認する。
【０３５０】 （５．８ 実施例８−全遺伝子インビトロプライミングによるヒトＷＴ１特異
的Ｔ細胞応答の誘発） この実施例は、ＷＴ１特異的Ｔ細胞応答が、正常な個体の血液から生じ得るこ
とを実証する。
【０３５１】 樹状細胞（ＤＣ）を、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦおよび３
０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４を含むＲＰＭＩ培地で、４〜１０日間、増殖によって、
正常なドナーのＰＢＭＣ由来の単球培養物から分化させた。培養後、ＤＣを、５
のＭ．Ｏ．Ｉ．で、組換えＷＴ１発現ワクシニアウイルスを用いて１６時間、ま
たは、１０のＭ．Ｏ．Ｉで、組換えＷＴ１発現アデノウイルスを用いて３日間感
染させた。ワクシニアウイルスをＵ．Ｖ．照射によって不活化した。ＣＤ８＋Ｔ
細胞を磁気ビーズを使用して、ポジティブ選択によって単離し、そして、培地の
プライミングを、９６ウェルプレート中で開始させた。培養液を、ＷＴ１を発現
するようにアデノまたはワクシニア感染させた自己樹状細胞を使用して、７〜１
０日毎で再刺激した。３〜６回の刺激周期の後、ＣＤ８＋株が、自己ＷＴ１発現
樹状細胞または繊維芽細胞を用いて刺激した場合、インターフェロンγを特異的
に産生したことを確認し得る。これらの株のＷＴ１比活性は、さらなる刺激周期
の後、維持し得る。これらの株は、アデノまたはワクシニアＷＴ１感染させた自
己樹状細胞を特異的に認識するが、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによってアデノまた
はワクシニアＥＧＦＰ感染自己樹状細胞は認識しないことが実証された。
【０３５２】 （５．９ 実施例９−注射のためのＲＡ１２−ＷＴ１の処方：凍結乾燥された
産物を安定化するための賦形剤の使用） この実施例は、凍結乾燥されたＲａ１２−ＷＴ１の完全な可溶化を可能にする
処方物を記載する。
【０３５３】 以下の処方物は、乾燥まで凍結乾燥された後、組換えタンパク質Ｒａ１２−Ｗ
Ｔ１が、水性培地に溶解されるのを可能にする： 組換えＲａ１２−ＷＴ１濃度：０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌ；緩衝液：１０−２
０ｍＭ エタノールアミン、ｐＨ１０．０；１．０〜５．０ｍＭ システイン；
０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−８０（ポリソルベート−８０）；糖：１０％ トレハ
ロース（Ｔ５２５１、Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ マルトース（Ｍ９１７１，Ｓ
ｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ スクロース（Ｓ７９０３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％
フルクトース（Ｆ２５４３，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）１０％ グルコース（Ｇ７５２
８，Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）。
【０３５４】 糖賦形剤を有する凍結乾燥されたタンパク質は、糖賦形剤を有さないタンパク
質よりも、有意により多く溶解することを見出した。クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる分析は、溶解された物質における残りの固体の形跡がないことを示し
た。
【０３５５】 （５．１０ 実施例１０−血液学的悪性度を有する患者におけるＷＴ１に対す
る免疫応答の同定） この実施例は、血液学的悪性度を有する患者における存在する免疫応答の同定
を示す。
【０３５６】 患者において前から存在するＷＴ１特異的抗体反応の存在を評価するために、
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血
病（ＣＭＬ）および重篤な再生不良性貧血を有する患者の血清を、ウエスタンブ
ロット分析を使用して分析した。血清を、ヒト白血病細胞株Ｋ５６２（Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａ
ｓ，ＶＡ）からＷＴ１を免疫沈降する能力について試験した。各々の場合におい
て、免疫沈降物を、ゲル電気泳動によって分離し、膜に転写し、そして、抗ＷＴ
−１抗体ＷＴ１８０（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉ
ｎｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて調査した。このウエスタンブロ
ット分析は、血液学的悪性度を有する患者において、潜在的なＷＴ１特異的抗体
を同定した。患者血清を用いて産生された免疫沈降物中の５２ｋＤａタンパク質
を、ＷＴ１特異的抗体によって認識した。５２ｋＤａタンパク質は、ポジティブ
コントロールと同じ大きさに移動した。
【０３５７】 さらなる研究は、全長および短縮型ＷＴ１タンパク質に対する抗体の存在につ
いて、ＡＭＬおよびＣＭＬを有する患者の血清を分析した。ヒトＷＴ１／全長（
ａａ１−４４９）、Ｎ末端（ａａ１−２４９）（ＷＴ１／Ｎ末端）およびＣ末端
（ａａ２６７−４４９）（ＷＴ１／Ｃ末端）領域を示すｃＤＮＡ構築物を、改変
されたｐＥＴ２８ベクター中にサブクローニングした。ＷＴ１／全長およびＷＴ
１／Ｎ末端タンパク質をＲａｌ２融合タンパク質として発現させた。Ｒａ１２は
、ＭＴＢ３２Ｂとして示される、分泌されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕ
ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓタンパク質のＣ末端フラグメントである（Ｓｋｅｉｌｙら
、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．，６７：３９９８，１９９９）。Ｒａ１２−ＷＴ
１／全長融合領域を、ヒスチジンタグ改変ｐＥＴ２８ベクター中のヒスチジンタ
グの３’側にクローニングした。ＷＴ１／Ｎ末端領域を、５’ヒスチジンタグ、
次いで、チオレドキシン（ＴＲＸ）ＷＴ１／Ｎ末端融合領域、次いで、３’ヒス
チジンタグを有する改変されたｐＥＴ２８ベクターにサブクローニングした。Ｗ
Ｔ１／Ｃ末端コード領域を、５’および３’ヒスチジンタグ、次いで、トロンビ
ンおよびＥＫ部位のみを含む融合パートナーを有さない、改変したｐＥＴ２８ベ
クターにサブクローニングした。
【０３５８】 ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌ
ｌａ，ＣＡ）を、３つのＷＴ１発現構築物を用いて形質転換し、一晩増殖し、そ
して、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導した
。ＷＴ１タンパク質を以下のように精製した：細胞を収穫し、３７℃で、コンプ
リートプロテアーゼインヒビタータブレット（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａ
ｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔｓ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を
含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０中でのインキュベーションによって溶解し
、その後、複数回の超音波処理を行なった。封入体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐ
Ｈ８．０を用いて、２回洗浄した。次いで、タンパク質を、ニッケル−ニトリロ
三酢酸樹脂（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）の金属キレー
ト親和性クロマトグラフィーによって精製し、次いで、Ｓｏｕｒｃｅ Ｑアニオ
ン交換樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｓ
ａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）のクロマトグラフィーを行なった。ＷＴ１タンパク質の
同定を、Ｎ末端配列決定によって確かめた。
【０３５９】 新規のＡＭＬまたはＣＭＬを有する成人患者由来の血清を、ＷＴ１特異的Ａｂ
の存在について研究した。組換えタンパク質を、ＴＣマイクロウェルプレート（
Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に吸着させた。プレートをＰＢ
Ｓ／０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そして、１％ ＢＳＡ／ＰＢＳ／０
．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０でブロックした。洗浄後、血清希釈液を添加し、そし
て、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、そして、ロバ抗ヒトＩ
ｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ−Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｗｅｓｔ Ｇ
ｒｏｖｅ，ＰＡ）を添加し、そして、室温で２時間インキュベートした。プレー
トを洗浄し、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ａｎｄ
Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＭＡ）と共にインキュベートし、１
Ｎ Ｈ２ＳＯ４でクエンチし、そして、直ぐに読み取った（Ｃｙｔｏ−Ｆｌｕｏ
ｒ ２３５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。
【０３６０】 血清学的調査について、ヒト血清を、１：５０〜１：２０，０００の連続希釈
の範囲にわたって、ＥＬＩＳＡによって試験した。ポジティブ反応を、３つの（
ＷＴ１／全長、ＷＴ１Ｃ末端）標準偏差によって、正常なドナー（ｎ＝９６）由
来の血清の平均ＯＤ値を超える１：５００希釈した血清のＯＤ値として定義した
。ＷＴ１／Ｎ末端に対する正常ドナーにおけるより高いバックグラウンドに起因
して、ＷＴ１／Ｎ末端に対するプロテインＡポジティブ反応を、４つの標準偏差
による正常なドナー由来の血清の平均ＯＤ値を超えた１：５００希釈の血清のＯ
Ｄ値として定義した。患者のＡｂ反応が、タンパク質のＲａ１２またはＴＲＸ融
合部分または可能なＥ．ｃｏｌｉ混入タンパク質に対してではなく、ＷＴ１に対
して指向されたことを検証するために、コントロールは、同様の様式で精製され
たＲａ１２タンパク質単独およびＲＴＸタンパク質単独を含んだ。Ｒａ１２およ
び／またはＴＲＸタンパク質に対して反応性を示したサンプルは、分析から除外
された。
【０３６１】 ＷＴ１に対する免疫の存在を評価するために、正常な個体および白血病を有す
る患者の血清中の組換え全長ＷＴ１タンパク質および短縮型ＷＴ１タンパク質に
対するＡｂを決定した。抗体反応性を、ＷＴ１／全長タンパク質、ＷＴ１／Ｎ末
端タンパク質およびＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対するＥＬＩＳＡ反応性によっ
て分析した。
【０３６２】 ９６人の正常なドナーのうちたった２人が、ＷＴ１／全長タンパク質と反応性
である血清抗体を有した。これらの個体のうちの１人は、ＷＴ１／Ｎ末端タンパ
ク質に対する抗体を有し、そして、１人がＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する抗
体を有した。対照的に、ＡＭＬを有する６３人の患者のうち１６人（２５％）が
、ＷＴ１／全長タンパク質と反応性である血清抗体を有した。顕著に対照的には
、６３人の患者のうちたった２人（３％）が、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対す
る反応性を有した。ＣＭＬを有する８１人の患者のうち１５人（１９％）が、Ｗ
Ｔ１／全長タンパク質と反応性である血清抗体を有し、そして８１人の患者のう
ち１２人（１５％）が、ＷＴ１／Ｎ末端と反応性である血清抗体を有した。８１
人の患者のうちたった３人（３％）が、ＷＴ１／Ｃ末端タンパク質に対する反応
性を有した。
【０３６３】 これらのデータは、ＷＴ１に対するＡｂ応答が、ＡＭＬおよびＣＭＬを有する
何人かの患者において検出可能であることを実証した。白血病患者における抗体
のより大きい発生率は、ＷＴ１タンパク質に対する免疫が、患者が、ＷＴ１を発
現するか、ＷＴ１をある時点で発現したという悪性度を保有する結果として生じ
るという強力な証拠を提供する。特定の理論に制限されることなく、ＷＴ１に対
する観察された抗体反応は、おそらく、自身の白血病細胞上のＷＴ１に対する免
疫を生じる患者から最も生じ、そして、ＷＴ１は、「自己」タンパク質であるに
も関わらず、免疫原性であり得るという直接的な証拠を提供する。
【０３６４】 ＷＴ１に対する抗体の存在は、同時のヘルパーＴ細胞応答がまた、同一の患者
に存在することを強力に意味する。ＷＴ１は、内部タンパク質である。従って、
ＣＴＬ反応は、白血病治療の点で、最も効果的であり、そして、最も毒性の強い
免疫の武器であるようである。従って、これらのデータは、ＷＴ１に対する治療
ワクチンが、ＷＴ１に対する免疫反応を誘発し得る証拠を提供する。
【０３６５】 検出された抗体の大多数は、Ｎ末端内のエピトープと反応性であるが、患者の
ごく少数のサブグループのみが、Ｃ末端に対する弱い抗体反応を示した。これは
、動物モデルにおける観察と一貫しており、ここで、Ｎ末端に由来するペプチド
を用いる免疫は、抗体、ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬ反応を誘発し、ここで、Ｃ
末端由来の試験されたペプチドのいずれも、抗体またはＴ細胞反応を誘発しなか
った（Ｇａｉｇｅｒら、２０００）。
【０３６６】 （６．参考文献） 以下の参考文献を、本明細書中に示される例示的な詳細または他の詳細に対し
て補足的な例示的な詳細または他の詳細をそれらが提供する程度まで、参考とし
て本明細書中に特に援用する。
【０３６７】
【表５２】 本明細書中に開示されそして特許請求される全ての組成物および方法は、本開
示を考慮して過度の実験なく作製および実行され得る。本発明の組成物および方
法は好ましい実施形態に関して記載されるが、本発明の概念、精神、および範囲
から逸脱することなく本明細書中に記載される組成物、方法ならびにこの方法の
工程およびこの方法の工程の連続に変化が適用され得ることは、当業者に明らか
である。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の因子が、
同じかまたは類似の結果を達成しながら本明細書中に記載される因子と置換され
得ることは、明らかである。当業者に明らかなこのような類似の置換および改変
の全ては、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神、範囲
および概念の範囲内であると考えられる。従って、特許されることを要求する排
他的な権利は、上記の特許請求の範囲に記載されるような権利である。
【０３６８】 本発明は、添付の図面と共に以下の説明を参照して理解され得る。ここで、同
様の参照数字は、同様のエレメントを示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、マウス（ＭＯ）ＷＴ１ペプチド配列（配列番号３２０）およびヒト（
ＨＵ）ＷＴ１ペプチド配列（配列番号３１９）の比較を表す。
【図２】 図２は、悪性中皮腫患者におけるＷＴ１特異的抗体を検出するためのＥＬＩＳ
Ａアッセイの結果を表すヒストグラムを示す。示されるように、ＷＴ１８０およ
びＷＴＣ１９は、ポジティブコントロールを表す。Ｄ４４は、正常なコントロー
ル血清を表し、残りのサンプルは、悪性中皮腫に罹患しているヒト患者から得た
血清サンプルであった。
【図３Ａ】 図３Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおける増殖性のＴ細胞
応答の刺激を説明するグラフを示す。チミジン取り込みアッセイを、示されるよ
うに、１つのＴ細胞株および２つの異なるクローンを使用して行い、そして結果
をｃｐｍで表した。Ｘ軸に示されるコントロールは、抗原を含まない（Ａｇなし
）、Ｂ６／培地であり；使用した抗原は、ｐ６−２２ヒト（ｐｌ）、ｐｌｌ７−
１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２ヒト（ｐ３）であった。
【図３Ｂ】 図３Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおける増殖性のＴ細胞
応答の刺激を説明するグラフを示す。チミジン取り込みアッセイを、示されるよ
うに、１つのＴ細胞株および２つの異なるクローンを使用して行い、そして結果
をｃｐｍで表した。Ｘ軸に示されるコントロールは、抗原を含まない（Ａｇなし
）、Ｂ６／培地であり；使用した抗原は、ｐ６−２２ヒト（ｐｌ）、ｐｌｌ７−
１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２ヒト（ｐ３）であった。
【図３Ｃ】 図３Ｃは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおける増殖性のＴ細胞
応答の刺激を説明するグラフを示す。チミジン取り込みアッセイを、示されるよ
うに、１つのＴ細胞株および２つの異なるクローンを使用して行い、そして結果
をｃｐｍで表した。Ｘ軸に示されるコントロールは、抗原を含まない（Ａｇなし
）、Ｂ６／培地であり；使用した抗原は、ｐ６−２２ヒト（ｐｌ）、ｐｌｌ７−
１３９（ｐ２）またはｐ２４４−２６２ヒト（ｐ３）であった。
【図４Ａ】 図４Ａは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおける増殖性のＴ細胞
応答の刺激を説明するヒストグラムを示す。３回目の免疫の３週間後、ワクチン
ＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ（培地）または脾
臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（
ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワク
チンＡ；図４Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ
２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図４Ｂ）でパルスした
Ｂ６脾臓細胞ならびに無関連のコントロールペプチドでパルスした脾臓細胞（無
関連ペプチド）と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（ＳＩ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図４Ｂ】 図４Ｂは、代表的なＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおける増殖性のＴ細胞
応答の刺激を説明するヒストグラムを示す。３回目の免疫の３週間後、ワクチン
ＡまたはワクチンＢを接種したマウスの脾臓細胞を、培地のみ（培地）または脾
臓細胞および培地（Ｂ６／抗原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（
ｐ６）、ｐ１１７−１３９（ｐ１１７）、ｐ２４４−２６２（ｐ２４４）（ワク
チンＡ；図４Ａ）またはｐ２８７−３０１（ｐ２８７）、ｐ２９９−３１３（ｐ
２９９）、ｐ４２１−４３５（ｐ４２１）（ワクチンＢ；図４Ｂ）でパルスした
Ｂ６脾臓細胞ならびに無関連のコントロールペプチドでパルスした脾臓細胞（無
関連ペプチド）と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（ＳＩ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図５Ａ】 図５Ａは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性のＴ細胞株お
よびクローンの生成を示すヒストグラムである。インビボ免疫後、最初の３回の
インビトロ刺激（ＩＶＳ）を、それぞれ、ワクチンＡまたはＢの全３つのペプチ
ドを使用して行った。引き続くＩＶＳを、２つの関連ペプチドｐ１１７−１３９
およびｐ６−２２のみを使用する、単一ペプチド刺激として行った。示されるよ
うに、クローンを、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方か
ら誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗
原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（
ｐ１１７）または無関連のコントロールペプチド（無関連ペプチド）でパルスし
たＢ６脾臓細胞と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（ＳＩ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図５Ｂ】 図５Ｂは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性のＴ細胞株お
よびクローンの生成を示すヒストグラムである。インビボ免疫後、最初の３回の
インビトロ刺激（ＩＶＳ）を、それぞれ、ワクチンＡまたはＢの全３つのペプチ
ドを使用して行った。引き続くＩＶＳを、２つの関連ペプチドｐ１１７−１３９
およびｐ６−２２のみを使用する、単一ペプチド刺激として行った。示されるよ
うに、クローンを、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方か
ら誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗
原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（
ｐ１１７）または無関連のコントロールペプチド（無関連ペプチド）でパルスし
たＢ６脾臓細胞と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（ＳＩ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図５Ｃ】 図５Ｃは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性のＴ細胞株お
よびクローンの生成を示すヒストグラムである。インビボ免疫後、最初の３回の
インビトロ刺激（ＩＶＳ）を、それぞれ、ワクチンＡまたはＢの全３つのペプチ
ドを使用して行った。引き続くＩＶＳを、２つの関連ペプチドｐ１１７−１３９
およびｐ６−２２のみを使用する、単一ペプチド刺激として行った。示されるよ
うに、クローンを、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方か
ら誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗
原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（
ｐ１１７）または無関連のコントロールペプチド（無関連ペプチド）でパルスし
たＢ６脾臓細胞と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（ＳＩ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図５Ｄ】 図５Ｄは、ｐ１１７−１３９およびｐ６−２２に特異的な増殖性のＴ細胞株お
よびクローンの生成を示すヒストグラムである。インビボ免疫後、最初の３回の
インビトロ刺激（ＩＶＳ）を、それぞれ、ワクチンＡまたはＢの全３つのペプチ
ドを使用して行った。引き続くＩＶＳを、２つの関連ペプチドｐ１１７−１３９
およびｐ６−２２のみを使用する、単一ペプチド刺激として行った。示されるよ
うに、クローンを、ｐ６−２２およびｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の両方か
ら誘導した。Ｔ細胞を、培地のみ（培地）または脾臓細胞および培地（Ｂ６／抗
原なし）、２５μｇ／ｍｌのペプチドｐ６−２２（ｐ６）、ｐ１１７−１３９（
ｐ１１７）または無関連のコントロールペプチド（無関連ペプチド）でパルスし
たＢ６脾臓細胞と共に培養し、９６時間後、（３Ｈ）チミジンの取り込みによっ
て増殖についてアッセイした。バーは、刺激指数（Ｓｉ）を表し、これは、実験
ウェルの平均をコントロール（抗原なしのＢ６脾臓細胞）の平均で除算して計算
する。
【図６Ａ】 図６Ａは、ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的Ｃ
ＴＬの誘発を示すグラフである。図６Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶
解を示し、そして図６Ｂは、ペプチドコートした細胞株の溶解を示す。各場合に
おいて、溶解％（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つ
の示されたエフェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡお
よびＥ１０）およびＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について提
供する。Ｅ１０細胞はまた、ＥＬ−４細胞として本明細書中で称される。
【図６Ｂ】 図６Ｂは、ＷＴ１ペプチドで免疫したマウスにおけるＷＴ１ペプチド特異的Ｃ
ＴＬの誘発を示すグラフである。図６Ａは、同種異系細胞株による標的細胞の溶
解を示し、そして図６Ｂは、ペプチドコートした細胞株の溶解を示す。各場合に
おいて、溶解％（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つ
の示されたエフェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（ＬＳＴＲＡお
よびＥ１０）およびＥ１０＋ｐ２３５−２４３（Ｅ１０＋Ｐ２３５）について提
供する。Ｅ１０細胞はまた、ＥＬ−４細胞として本明細書中で称される。
【図７Ａ】 図７Ａは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後の、ＷＴ
１陽性腫瘍細胞株を殺すがＷＴ１陰性細胞株を殺さない、ＷＴ１特異的ＣＴＬの
誘発を例示するグラフである。図７Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞が、ＷＴ１
陽性腫瘍細胞株を殺さないことを示す。図７Ｂは、同種異系細胞株による標的細
胞の溶解を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、２つの異なる研究においてＷＴ１陰性
細胞株と比較した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図
７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドコートした細胞株（関連ＷＴ１ペプチドｐ１１７
をコートしたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各場合において、溶解％
（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つの示されたエフ
ェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換した線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１
０＋ｐ１１７について提供する。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後の、ＷＴ
１陽性腫瘍細胞株を殺すがＷＴ１陰性細胞株を殺さない、ＷＴ１特異的ＣＴＬの
誘発を例示するグラフである。図７Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞が、ＷＴ１
陽性腫瘍細胞株を殺さないことを示す。図７Ｂは、同種異系細胞株による標的細
胞の溶解を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、２つの異なる研究においてＷＴ１陰性
細胞株と比較した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図
７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドコートした細胞株（関連ＷＴ１ペプチドｐ１１７
をコートしたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各場合において、溶解％
（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つの示されたエフ
ェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換した線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１
０＋ｐ１１７について提供する。
【図７Ｃ】 図７Ｃは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後の、ＷＴ
１陽性腫瘍細胞株を殺すがＷＴ１陰性細胞株を殺さない、ＷＴ１特異的ＣＴＬの
誘発を例示するグラフである。図７Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞が、ＷＴ１
陽性腫瘍細胞株を殺さないことを示す。図７Ｂは、同種異系細胞株による標的細
胞の溶解を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、２つの異なる研究においてＷＴ１陰性
細胞株と比較した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図
７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドコートした細胞株（関連ＷＴ１ペプチドｐ１１７
をコートしたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各場合において、溶解％
（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つの示されたエフ
ェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換した線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１
０＋ｐ１１７について提供する。
【図７Ｄ】 図７Ｄは、ＷＴ１ペプチドＰ１１７でのＢ６マウスのワクチン接種後の、ＷＴ
１陽性腫瘍細胞株を殺すがＷＴ１陰性細胞株を殺さない、ＷＴ１特異的ＣＴＬの
誘発を例示するグラフである。図７Ａは、非免疫Ｂ６マウスのＴ細胞が、ＷＴ１
陽性腫瘍細胞株を殺さないことを示す。図７Ｂは、同種異系細胞株による標的細
胞の溶解を示す。図７Ｃおよび図７Ｄは、２つの異なる研究においてＷＴ１陰性
細胞株と比較した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞株の溶解を実証する。さらに、図
７Ｃおよび図７Ｄは、ペプチドコートした細胞株（関連ＷＴ１ペプチドｐ１１７
をコートしたＷＴ１陰性細胞株Ｅ１０）の溶解を示す。各場合において、溶解％
（標準的なクロム放出アッセイによって測定した場合）を、３つの示されたエフ
ェクター：標的比で示す。結果を、リンパ腫細胞（Ｅ１０）、前立腺癌細胞（Ｔ
ＲＡＭＰ−Ｃ）、形質転換した線維芽細胞株（ＢＬＫ−ＳＶ４０）、およびＥ１
０＋ｐ１１７について提供する。
【図８Ａ】 図８Ａは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬが、ＷＴ１陽性腫
瘍細胞を溶解する能力を示す、ヒストグラムである。３回の免疫後３週間で、ペ
プチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を
、関連ペプチドでインビトロ刺激し、そして、ＷＴ１ペプチドと共にインキュベ
ートした標的ならびにＷＴ１陽性および陰性腫瘍細胞を溶解する能力について試
験した。バーは、２５：１のＥ：Ｔ比で３連にて行ったクロム放出アッセイにお
ける、平均特異的溶解％を表す。図８Ａは、示されるような、ＷＴ１陰性細胞株
ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；関連（免疫および再刺激に使用した）ペプ
チドｐ２３５−２４３でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ２３５）；無関連ペ
プチドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４
＋ｐ１２６）またはｐ１３０−１３８（Ｅｌ−４＋ｐ１３０）でパルスしたＥＬ
−４、およびＷＴ１陽性腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１
陽性）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）に対する、ｐ２３
５−２４３特異的Ｔ細胞株の細胞傷害活性を示す。図８Ｂは、示されるような、
ＥＬ−４；関連ペプチドＰ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４（Ｅｌ−４＋ｐ
１１７）および無関連ペプチドｐ１２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐ１２３）または
ｐ１２８−１３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）でパルスしたＥＬ−４；ＢＬＫ−ＳＶ
４０およびＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷
害活性を示す。
【図８Ｂ】 図８Ｂは、代表的なペプチドＰ１１７−１３９特異的ＣＴＬが、ＷＴ１陽性腫
瘍細胞を溶解する能力を示す、ヒストグラムである。３回の免疫後３週間で、ペ
プチドｐ２３５−２４３またはｐ１１７−１３９を接種したマウスの脾臓細胞を
、関連ペプチドでインビトロ刺激し、そして、ＷＴ１ペプチドと共にインキュベ
ートした標的ならびにＷＴ１陽性および陰性腫瘍細胞を溶解する能力について試
験した。バーは、２５：１のＥ：Ｔ比で３連にて行ったクロム放出アッセイにお
ける、平均特異的溶解％を表す。図８Ａは、示されるような、ＷＴ１陰性細胞株
ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；関連（免疫および再刺激に使用した）ペプ
チドｐ２３５−２４３でパルスしたＥＬ−４（ＥＬ−４＋ｐ２３５）；無関連ペ
プチドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４
＋ｐ１２６）またはｐ１３０−１３８（Ｅｌ−４＋ｐ１３０）でパルスしたＥＬ
−４、およびＷＴ１陽性腫瘍細胞ＢＬＫ−ＳＶ４０（ＢＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１
陽性）およびＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）に対する、ｐ２３
５−２４３特異的Ｔ細胞株の細胞傷害活性を示す。図８Ｂは、示されるような、
ＥＬ−４；関連ペプチドＰ１１７−１３９でパルスしたＥＬ−４（Ｅｌ−４＋ｐ
１１７）および無関連ペプチドｐ１２３−１３１（ＥＬ−４＋ｐ１２３）または
ｐ１２８−１３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）でパルスしたＥＬ−４；ＢＬＫ−ＳＶ
４０およびＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷
害活性を示す。
【図９Ａ】 図９Ａは、コールド標的阻害によって実証した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の
溶解の特異性を示すヒストグラムである。バーは、２５：１のＥ：Ｔ比で３連に
て行ったクロム放出アッセイにおける、平均特異的溶解％を表す。図９Ａは、示
されるような、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽
性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）；５１Ｃｒ標識し
ていない関連ペプチドｐ１１７−１３９でパルスした１０倍過剰（ホット標的と
比較して）のＥＬ−４細胞と共にインキュベートしたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ＋ｐ１１７コールド標識）、および５１Ｃｒ標識していない無関連ペ
プチドでパルスしたＥＬ−４細胞と共にインキュベートしたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞
（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋無関連コールド標識）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ
細胞株の細胞傷害活性を示す。図９Ｂは、示されるような、ＷＴ１陰性細胞株Ｅ
Ｌ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＢＬＫ−ＳＶ４０（Ｂ
ＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）；関連コールド標識と共にインキュベートしたＢ
ＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋ｐ１１７コールド標識）、および無関
連コールド標識と共にインキュベートしたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ
４０＋無関連コールド標識）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞
傷害活性を示す。
【図９Ｂ】 図９Ｂは、コールド標的阻害によって実証した場合の、ＷＴ１陽性腫瘍細胞の
溶解の特異性を示すヒストグラムである。バーは、２５：１のＥ：Ｔ比で３連に
て行ったクロム放出アッセイにおける、平均特異的溶解％を表す。図９Ａは、示
されるような、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽
性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃ（ＴＲＡＭＰ−Ｃ、ＷＴ１陽性）；５１Ｃｒ標識し
ていない関連ペプチドｐ１１７−１３９でパルスした１０倍過剰（ホット標的と
比較して）のＥＬ−４細胞と共にインキュベートしたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞（ＴＲ
ＡＭＰ−Ｃ＋ｐ１１７コールド標識）、および５１Ｃｒ標識していない無関連ペ
プチドでパルスしたＥＬ−４細胞と共にインキュベートしたＴＲＡＭＰ−Ｃ細胞
（ＴＲＡＭＰ−Ｃ＋無関連コールド標識）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ
細胞株の細胞傷害活性を示す。図９Ｂは、示されるような、ＷＴ１陰性細胞株Ｅ
Ｌ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）；ＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＢＬＫ−ＳＶ４０（Ｂ
ＬＫ−ＳＶ４０、ＷＴ１陽性）；関連コールド標識と共にインキュベートしたＢ
ＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ４０＋ｐ１１７コールド標識）、および無関
連コールド標識と共にインキュベートしたＢＬＫ−ＳＶ４０細胞（ＢＬＫ−ＳＶ
４０＋無関連コールド標識）に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞
傷害活性を示す。
【図１０Ａ】 図１０Ａは、ｐ１１７−１３９中のノナペプチドＣＴＬエピトープの評価を示
すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株（およびｐ１２６
−１３４またはｐ１３０−１３８での再刺激後のｐ１１７−１３９腫瘍特異的Ｃ
ＴＬ株）を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは含まないアミ
ノ酸１１７−１３９中のペプチドに対して試験した。バーは、２５：１のＥ：Ｔ
比で３連にて行ったクロム放出アッセイにおける、平均特異的溶解％を表す。図
１０Ａは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）、ならびにペプ
チドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１１９−１２７（ＥＬ−４＋
ｐ１１９）、ｐ１２０−１２８（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ｐ１２３−１３１（Ｅ
Ｌ−４＋ｐ１２３）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ｐ１２８−１
３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）で
パルスしたＥＬ−４細胞に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害
活性を示す。図１０Ｂは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９（ＥＬ
−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）でパルスしたＥＬ
−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１２６−
１３４での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示し、図１０Ｃは、ＥＬ−４、
ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１
３０）でパルスしたＥＬ−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−
Ｃに対する、ｐ１３０−１３８での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示す。
【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、ｐ１１７−１３９中のノナペプチドＣＴＬエピトープの評価を示
すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株（およびｐ１２６
−１３４またはｐ１３０−１３８での再刺激後のｐ１１７−１３９腫瘍特異的Ｃ
ＴＬ株）を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは含まないアミ
ノ酸１１７−１３９中のペプチドに対して試験した。バーは、２５：１のＥ：Ｔ
比で３連にて行ったクロム放出アッセイにおける、平均特異的溶解％を表す。図
１０Ａは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）、ならびにペプ
チドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１１９−１２７（ＥＬ−４＋
ｐ１１９）、ｐ１２０−１２８（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ｐ１２３−１３１（Ｅ
Ｌ−４＋ｐ１２３）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ｐ１２８−１
３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）で
パルスしたＥＬ−４細胞に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害
活性を示す。図１０Ｂは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９（ＥＬ
−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）でパルスしたＥＬ
−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１２６−
１３４での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示し、図１０Ｃは、ＥＬ−４、
ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１
３０）でパルスしたＥＬ−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−
Ｃに対する、ｐ１３０−１３８での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示す。
【図１０Ｃ】 図１０Ｃは、ｐ１１７−１３９中のノナペプチドＣＴＬエピトープの評価を示
すヒストグラムである。ｐ１１７−１３９腫瘍特異的ＣＴＬ株（およびｐ１２６
−１３４またはｐ１３０−１３８での再刺激後のｐ１１７−１３９腫瘍特異的Ｃ
ＴＬ株）を、適切なＨ−２ｂクラスＩ結合モチーフを含むかまたは含まないアミ
ノ酸１１７−１３９中のペプチドに対して試験した。バーは、２５：１のＥ：Ｔ
比で３連にて行ったクロム放出アッセイにおける、平均特異的溶解％を表す。図
１０Ａは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４（ＥＬ−４、ＷＴ１陰性）、ならびにペプ
チドｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１１９−１２７（ＥＬ−４＋
ｐ１１９）、ｐ１２０−１２８（ＥＬ−４＋ｐ１２０）、ｐ１２３−１３１（Ｅ
Ｌ−４＋ｐ１２３）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）、ｐ１２８−１
３６（ＥＬ−４＋ｐ１２８）およびｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１３０）で
パルスしたＥＬ−４細胞に対する、ｐ１１７−１３９特異的Ｔ細胞株の細胞傷害
活性を示す。図１０Ｂは、ＷＴ１陰性細胞株ＥＬ−４、ｐ１１７−１３９（ＥＬ
−４＋ｐ１１７）、ｐ１２６−１３４（ＥＬ−４＋ｐ１２６）でパルスしたＥＬ
−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−Ｃに対する、ｐ１２６−
１３４での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示し、図１０Ｃは、ＥＬ−４、
ｐ１１７−１３９（ＥＬ−４＋ｐ１１７）、ｐ１３０−１３８（ＥＬ−４＋ｐ１
３０）でパルスしたＥＬ−４細胞、ならびにＷＴ１陽性腫瘍細胞株ＴＲＡＭＰ−
Ｃに対する、ｐ１３０−１３８での再刺激後のＣＴＬ株の細胞傷害活性を示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ｂ】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５Ｄ】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９Ｂ】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年９月２６日（２００２．９．２６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｃ０７Ｋ 14/82 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 CA04 DA02 EA04 GA11 4C084 AA02 AA03 AA13 AA19 BA17 BA18 BA19 BA20 MA02 NA14 ZA891 ZB092 ZB261 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 MA02 NA14 ZB26 4H045 AA11 AA30 BA10 CA40 CA41 DA86 EA28 EA51 FA74

Claims (40)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 中皮腫を処置または予防するための医薬の製造における、９
    〜約４０アミノ酸長の少なくとも第一の単離されたペプチド、または該ペプチド
    をコードする少なくとも第一の核酸セグメントを含む組成物の使用であって、こ
    こで、該ペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番号２０、
    配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配列番号３
    １６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいずれか１つ
    に記載の第一の連続するアミノ酸配列を含む、使用。
  2. 【請求項２】 前記組成物が、９〜約３５アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１に記載の使用。
  3. 【請求項３】 前記組成物が、９〜約３０アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１または２に記載の使用。
  4. 【請求項４】 前記組成物が、９〜約２５アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用。
  5. 【請求項５】 前記組成物が、９〜約２０アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
  6. 【請求項６】 前記組成物が、９〜約１５アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
  7. 【請求項７】 前記組成物が、９〜約１３アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
  8. 【請求項８】 前記組成物が、９〜約１１アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用。
  9. 【請求項９】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第一の単
    離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメ
    ントを含み、該ペプチドは、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列
    番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４および配列番号３１６〜配列番号
    ３１８のいずれか１つに記載の第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１〜
    ８のいずれか１項に記載の使用。
  10. 【請求項１０】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第一の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントを含み、該ペプチドは、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３
    、配列番号３１４および配列番号３１６〜配列番号３１８のいずれか１つに記載
    の第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使
    用。
  11. 【請求項１１】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第一の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントを含み、該ペプチドは、ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３４）、ＡＬＬＰ
    ＡＶＳＳＬ（配列番号３５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９）、ＧＡＴＬ
    ＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４７）、ＲＭＦ
    ＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号１９８）およ
    びＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９）からなる群より選択される少なくとも
    第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使
    用。
  12. 【請求項１２】 前記組成物が、９〜約１１アミノ酸長の少なくとも第一の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントを含み、該ペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜配列番
    号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４、配
    列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６のいず
    れか１つのアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜１１のいずれか１項に記
    載の使用。
  13. 【請求項１３】 前記組成物が、９〜約１１アミノ酸長の少なくとも第一の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントを含み、該ペプチドは、配列番号１３〜配列番号２０、配列番号２８〜配
    列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４および配列番号３１６〜配列番
    号３１８のいずれか１つのアミノ酸配列から実質的になる、請求項１〜１２のい
    ずれか１項に記載の使用。
  14. 【請求項１４】 前記組成物が、９〜約１１アミノ酸長の少なくとも第一の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントを含み、該ペプチドは、アミノ酸配列ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３４
    ）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９
    ）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４
    ７）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号
    １９８）またはＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９）から実質的になる、請求
    項１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
  15. 【請求項１５】 前記組成物が、配列番号１〜配列番号４、配列番号１３〜
    配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１
    ４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号３２６
    のいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる少なくとも第一の単離されたペプ
    チド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメントを含む、
    請求項１〜１４に記載の使用。
  16. 【請求項１６】 前記組成物が、配列番号２８〜配列番号３１１のいずれか
    １つに記載のアミノ酸配列からなる少なくとも第一の単離されたペプチド、また
    は該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜
    １５に記載の使用。
  17. 【請求項１７】 前記組成物が、アミノ酸配列ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番
    号３４）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番
    号４９）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番
    号１４７）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配
    列番号１９８）またはＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９）からなる少なくと
    も第一の単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の
    核酸セグメントを含む、請求項１〜１６に記載の使用。
  18. 【請求項１８】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第二の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第二のペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号
    １３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番
    号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８、および配列番号３２１〜配列番号
    ３２６のいずれか１つに記載の少なくとも第一の連続するアミノ酸配列を含む、
    請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
  19. 【請求項１９】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第二の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第二のペプチドは、配列番号１３〜配列番号２０、配列
    番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番号３１４および配列番号３
    １６〜配列番号３１８のいずれか１つに記載の少なくとも第一の連続するアミノ
    酸配列を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用。
  20. 【請求項２０】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第二の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第二のペプチドは、ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３４
    ）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９
    ）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４
    ７）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号
    １９８）およびＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９）からなる群より選択され
    る少なくとも第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１〜１９のいずれか１
    項に記載の使用。
  21. 【請求項２１】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第三の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第三のペプチドは、配列番号１〜配列番号４、配列番号
    １３〜配列番号２０、配列番号２８〜配列番号３１１、配列番号３１３、配列番
    号３１４、配列番号３１６〜配列番号３１８および配列番号３２１〜配列番号３
    ２６のいずれか１つに記載の少なくとも第一の連続するアミノ酸配列を含む、請
    求項１８〜２０のいずれか１項に記載の使用。
  22. 【請求項２２】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第三の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第三のペプチドは、配列番号２８〜配列番号３１１のい
    ずれか１つに記載の少なくとも第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１８
    〜２１のいずれか１項に記載の使用。
  23. 【請求項２３】 前記組成物が、９〜約４０アミノ酸長の少なくとも第三の
    単離されたペプチド、または該ペプチドをコードする少なくとも第一の核酸セグ
    メントをさらに含み、該第三のペプチドは、ＡＬＬＰＡＶＰＳＬ（配列番号３４
    ）、ＡＬＬＰＡＶＳＳＬ（配列番号３５）、ＣＭＴＷＮＱＭＮＬ（配列番号４９
    ）、ＧＡＴＬＫＧＶＡＡ（配列番号８８）、ＮＬＹＱＭＴＳＱＬ（配列番号１４
    ７）、ＲＭＦＰＮＡＰＹＬ（配列番号１８５）、ＳＣＬＥＳＱＰＡＩ（配列番号
    １９８）およびＳＣＬＥＳＱＰＴＩ（配列番号１９９）からなる群より選択され
    る少なくとも第一の連続するアミノ酸配列を含む、請求項１８〜２２のいずれか
    １項に記載の使用。
  24. 【請求項２４】 前記組成物が、２７〜約５０００ヌクレオチド長の少なく
    とも第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用
    。
  25. 【請求項２５】 前記組成物が、２７〜約３０００ヌクレオチド長の少なく
    とも第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用
    。
  26. 【請求項２６】 前記組成物が、２７〜約１０００ヌクレオチド長の少なく
    とも第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用
    。
  27. 【請求項２７】 前記組成物が、２７〜約５００ヌクレオチド長の少なくと
    も第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用。
  28. 【請求項２８】 前記組成物が、少なくとも第一の異種のプロモーターの制
    御下で作動可能に位置づけられた少なくとも第一の核酸セグメントを含む、請求
    項１〜２７のいずれか１項に記載の使用。
  29. 【請求項２９】 前記組成物が、ベクター内に含まれる少なくとも第一の核
    酸セグメントを含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の使用。
  30. 【請求項３０】 前記組成物が、プラスミドまたはウイルスベクター内に含
    まれる少なくとも第一の核酸セグメントを含む、請求項１〜２９のいずれか１項
    に記載の使用。
  31. 【請求項３１】 前記組成物が、少なくとも第一の薬学的に受容可能な賦形
    剤をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の使用。
  32. 【請求項３２】 前記組成物が、少なくとも第一の免疫刺激剤、または少な
    くとも第一のアジュバントをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載
    の使用。
  33. 【請求項３３】 前記組成物が、少なくとも第一の免疫刺激剤、または好ま
    しくはヒトにおいてＴ細胞応答を増強する少なくとも第一のアジュバントをさら
    に含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用。
  34. 【請求項３４】 前記組成物が、少なくとも第一の免疫刺激剤、またはＭｏ
    ｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５０、Ｓｅｐｐｉｃ Ｍｏｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０
    、サイトカイン、ミクロスフェア、ジメチルジオクタデシル臭化アンモニウムア
    ジュバント、ＡＳ−１、ＡＳ−２、Ｒｉｂｉアジュバント、ＱＳ２１、サポニン
    、ミクロ流動化Ｓｙｎｔｅｘアジュバント、ＭＶ、ｄｄＭＶ、免疫刺激複合体お
    よび不活化毒素からなる群より選択される少なくとも第一のアジュバントをさら
    に含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用。
  35. 【請求項３５】 前記医薬が、中皮腫を有する患者においてＴ細胞応答を作
    製することを意図される、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用。
  36. 【請求項３６】 前記医薬が、悪性胸膜中皮腫を有する患者への投与を意図
    される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の使用。
  37. 【請求項３７】 前記医薬が、非経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下
    投与、鼻腔内投与、経皮投与、または経口投与について処方される、請求項１〜
    ３６のいずれか１項に記載の使用。
  38. 【請求項３８】 前記組成物が、少なくとも第一の検出試薬をさらに含む、
    請求項１〜３７のいずれか１項に記載の使用。
  39. 【請求項３９】 前記組成物が、ＷＴ１ペプチドまたはポリペプチドに特異
    的に結合する、少なくとも第一の検出試薬をさらに含む、請求項１〜３８のいず
    れか１項に記載の使用。
  40. 【請求項４０】 前記組成物が、中皮腫を処置または予防するための少なく
    とも第二の治療剤をさらに含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用。
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