ES2326311T3 - Composiciones y metodos para inmunoterapia especifica con wt1. - Google Patents

Abstract

Una proteína de fusión que comprende una porción inmunógena de un antígeno de tumor de Wilms (WT1), en la que dicha porción inmunógena de WT1 consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 144, 241, 414-451, 461, 478 y 502, y un compañero de fusión, caracterizada por que el compañero de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 506.

Description

Composiciones y métodos para inmunoterapia específica con WT1.

Declaración con respecto a investigación o desarrollo financiado por el gobierno federal de los estados unidos

Esta invención se realizó en parte con ayuda del Gobierno de los Estados Unidos bajo la subvención NIH SBIR Fase I número IR43 CA81752-01A1. El Gobierno de los Estados Unidos puede tener ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere, en general, a la inmunoterapia de enfermedades malignas tales como leucemia y cánceres. La invención se refiere más específicamente a composiciones para generar o potenciar una respuesta inmune frente a WT11, y al uso de dichas composiciones para prevenir y/o tratar enfermedades malignas.

Descripción de la técnica relacionada

El cáncer y la leucemia son problemas de salud significativos en los Estados Unidos y en todo el mundo. Aunque se han hecho avances en la detección y el tratamiento de dichas enfermedades, actualmente no está disponible ninguna vacuna u otro método universalmente eficaz para la prevención o el tratamiento del cáncer y la leucemia. La gestión de las enfermedades depende actualmente de una combinación de diagnóstico precoz y tratamiento agresivo, que puede incluir uno o más de una diversidad de tratamientos tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapia hormonal. El ciclo de tratamiento para un cáncer particular se selecciona, frecuentemente, basándose en una diversidad de parámetros de pronóstico, incluyendo un análisis de marcadores tumorales específicos. Sin embargo, el uso de marcadores establecidos conduce con frecuencia a un resultado que es difícil de interpretar y se continúa observando una alta mortalidad en muchos pacientes con cáncer.

Las inmunoterapias tienen el potencial de mejorar sustancialmente el tratamiento de cáncer y leucemia y la supervivencia. Datos recientes demuestran que la leucemia puede curarse mediante inmunoterapia en el contexto de un transplante de médula ósea (por ejemplo, infusiones de linfocitos de donante). Dichas terapias pueden implicar la generación o potenciación de una respuesta inmune contra un antígeno asociado a tumor (TAA). Sin embargo, hasta la fecha se conocen relativamente pocos TAA y, con raras excepciones, no se ha demostrado que la generación de una respuesta inmune contra dichos antígenos sea terapéuticamente beneficiosa.

Por consiguiente, existe la necesidad en la técnica de métodos mejorados para la prevención y terapia de la leucemia y el cáncer. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona además otras ventajas relacionadas. En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una proteína de fusión que comprende una porción inmunógena de un antígeno del tumor de Wilms (WT1), en el que dicha porción inmunógena de WT1 consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 144, 241, 414-451, 461, 478 y 502, y un compañero de fusión caracterizado por que el compañero de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 506.

También se proporciona un polinucleótido aislado que codifica las proteínas de fusión de la presente invención.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona además una composición que comprende la proteína de fusión de la presente invención en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona una vacuna que comprende el polipéptido de la presente invención en combinación con un potenciador de la respuesta inmune inespecífica.

En un aspecto adicional, se proporciona un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la presente invención unido operativamente a una secuencia de expresión controlada. También se proporciona una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la presente invención.

En aspectos adicionales, se proporciona una composición que comprende un primer componente que comprende el polipéptido de la presente invención y un segundo componente seleccionado de uno cualquiera o ambos de un vehículo fisiológicamente aceptable o un inmunoestimulante, para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un paciente.

También se proporciona una composición, que comprende un primer componente que comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido de la presente invención y un segundo componente que comprende el polipéptido de la presente invención, para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un paciente.

También se proporciona el uso del polipéptido y polinucleótidos de la presente invención para el uso en el tratamiento de una enfermedad maligna.

Expresado brevemente, esta invención proporciona composiciones y su uso en métodos para la terapia de enfermedades tales como leucemia y cáncer. En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos de fusión que comprenden una porción inmunógena de un WT1 nativo, como se expone en la reivindicación 1, junto con el compañero de fusión expuesto en la SEC ID Nº 506.

Dentro de ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido comprende al menos una porción inmunógena de WT1, en las que la porción inmunógena está contenida en los aminoácidos 2-281 de WT1. Dentro de ciertas realizaciones, el polipéptido comprende no más de 16 restos aminoacídicos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo. Dentro de otras realizaciones, el polipéptido comprende una porción inmunógena de los restos aminoacídicos 1-174 de un polipéptido WT1 nativo o una VARIANTEe del mismo, en las que el polipéptido comprende no más de 16 restos aminoacídicos consecutivos presentes dentro de los aminoácidos 175 a 449 del polipéptido WT1 nativo. La porción inmunógena se une preferiblemente a una molécula de MHC clase I y/o clase II. Dentro de ciertas realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en (a) secuencias enumeradas en una o más de cualquiera de las Tablas II-XLVI, (b) VARIANTEes de las secuencias anteriores que difieren en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de modo que no se disminuye sustancialmente la capacidad de la VARIANTEe para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno y (c) miméticos de los polipéptidos enumerados anteriormente, de modo que no se disminuye sustancialmente la capacidad del mimético para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno.

Dentro de otras realizaciones, el polipéptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:

(a) VLDFAPPGA (SEC ID Nº: 241), SEC ID Nº: 414-450, ALLPAVPSL (SEC ID Nº: 451).

Dentro de aspectos adicionales, la presente descripción proporciona polipéptidos que comprenden una VARIANTEe de una porción inmunógena de una proteína WT1, en los que la VARIANTEe difiere de la porción inmunógena debido a sustituciones entre las posiciones de aminoácidos 1 y 3 dentro de la porción inmunógena, de modo que no se reduce sustancialmente ni se aumenta la capacidad de la VARIANTEe para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno en relación con una proteína WT1 nativa.

La presente invención proporciona además polinucleótidos de WT1 que codifican un polipéptido WT1 de la invención como se ha descrito anteriormente.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas y vacunas. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un polipéptido como se ha descrito anteriormente y/o uno o más de (i) un polinucleótido de WT1; (ii) un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido WT1; (iii) una célula T que reacciona específicamente con un polipéptido WT1 o (iv) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las vacunas comprenden un polipéptido como se ha descrito anteriormente y/o uno o más de (i) un polinucleótido de WT1, (ii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1 o (iii) un anticuerpo anti-idiotípico y un potenciador de la respuesta inmune inespecífica. Dentro de ciertas realizaciones, están presentes menos de 23 restos aminoacídicos consecutivos, preferiblemente menos de 17 restos aminoacídicos, de un polipéptido WT1 nativo dentro de un polipéptido WT1 empleado en dichas composiciones farmacéuticas y vacunas. El potenciador de la respuesta inmune puede ser un adyuvante. Preferiblemente, un potenciador de la respuesta inmune potencia una respuesta de células T.

La presente invención proporciona además el uso de las vacunas y composiciones farmacéuticas de la presente invención en métodos para potenciar o inducir una respuesta inmune en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se ha descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, el paciente es un ser humano. La presente invención proporciona además el uso de las composiciones farmacéuticas y vacunas de la invención en métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente una composición farmacéutica o vacuna como se ha descrito anteriormente. Las enfermedades malignas incluyen, pero sin limitación, leucemias (por ejemplo, mieloide aguda, linfocítica aguda y mieloide crónica) y cánceres (por ejemplo, cáncer de mama, pulmón, tiroides o gastrointestinal o un melanoma). El paciente puede estar, pero no necesariamente, aquejado de la enfermedad maligna y la administración de la composición farmacéutica o vacuna puede inhibir la aparición de dicha enfermedad o puede inhibir el avance y/o la metástasis de una enfermedad existente.

La presente descripción proporciona además, dentro de otros aspectos, métodos para eliminar células que expresan WT1 de la médula ósea y/o la sangre periférica o fracciones de la misma, que comprenden poner en contacto la médula ósea, sangre periférica o una fracción de la médula ósea o sangre periférica con células T que reaccionan específicamente con un polipéptido WT1, en los que la etapa de contacto se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación de las células positivas para WT1 hasta menos del 10%, preferiblemente menos del 5% y, más preferiblemente, menos del 1% del número de células mieloides o linfáticas en la médula ósea, sangre periférica o una fracción. Pueden obtenerse médula ósea, sangre periférica y fracciones de un paciente aquejado de una enfermedad asociada con la expresión de WT1, o pueden obtenerse de un mamífero humano o no humano no aquejado de dicha enfermedad.

\newpage

Dentro de aspectos relacionados, la presente descripción proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica preparada como se ha descrito anteriormente. Dicha médula ósea, sangre periférica o fracciones pueden ser autólogas o pueden obtenerse de un ser humano o animal no humano relacionado o no relacionado (por ejemplo, singénico o alogénico).

En otros aspectos, la presente descripción proporciona métodos para estimular (o sensibilizar) y/o expandir células T, que comprenden poner en contacto células T con un polipéptido WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación y/o expansión de células T. Dichas células T pueden ser células T específicas de WT1 autólogas, alogénicas, singénicas o no relacionadas y pueden estimularse in vitro o in vivo. Dentro de ciertas realizaciones, las células T expandidas pueden encontrarse dentro de la médula ósea, la sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica, y pueden ser (pero no necesariamente) clonales. Dentro de ciertas realizaciones, las células T pueden estar presentes en un mamífero durante la estimulación y/o expansión. Se pueden usar células T específicas de WT1, por ejemplo, dentro de infusiones de linfocitos de donante.

Se describen métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en un paciente, que comprenden administrar a un paciente células T preparadas como se ha descrito anteriormente. Dentro de ciertas realizaciones, dichas células T pueden ser autólogas, singénicas o alogénicas.

La presente descripción proporciona además, dentro de otros aspectos, métodos para controlar la eficacia de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente. Dichos métodos se basan en controlar respuestas de anticuerpos, células T CD4+ y/o células T CD8+ en el paciente. Dentro de ciertos de dichos aspectos, un método puede comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, en el que la primera muestra biológica se obtiene de un paciente antes de una terapia o inmunización, y en el que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; (b) detectar los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica obtenida del mismo paciente después de una terapia o inmunización; y (d) comparar el número de inmunocomplejos detectados en la primera y segunda muestras biológicas y, de ahí, controlar la eficacia de la terapia o inmunización en el paciente.

Dentro de ciertas realizaciones de los métodos anteriores, la etapa de detección comprende (a) incubar los inmunocomplejos con un reactivo de detección que es capaz de unirse a los inmunocomplejos, en la que el reactivo de detección comprende un grupo indicador, (b) eliminar el reactivo de detección no unido y (c) detectar la presencia o ausencia del grupo indicador. El reactivo de detección puede comprender, por ejemplo, un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, capaz de unirse a los anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido WT1 o a una molécula tal como la Proteína A. Dentro de otras realizaciones, se une un grupo indicador al polipéptido WT1, y la etapa de detección comprende eliminar el polipéptido WT1 no unido y, posteriormente, detectar la presencia o ausencia del grupo indicador.

Los métodos descritos para controlar la eficacia de una inmunización o terapia para una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente puede comprender las etapas de: (a) incubar una primera muestra biológica con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, en las que la muestra biológica comprende células T CD4+ y/o células T CD8+ y se obtiene de un paciente antes de una terapia o inmunización, y en las que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la activación, proliferación y/o lisis específica de células T; (b) detectar una cantidad de activación, proliferación y/o lisis de las células T; (c) repetir las etapas (a) y (b) usando una segunda muestra biológica que comprende células T CD4+ y/o CD8+, en las que la segunda muestra biológica se obtiene del mismo paciente después de una terapia o inmunización; y (d) comparar la cantidad de activación, proliferación y/o lisis de células T en la primera y segunda muestras biológicas y, de ahí, controlar la eficacia de la terapia o inmunización en el paciente.

La presente invención proporciona además métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, para que proliferen las células T; y (b) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T que han proliferado y, de ahí, inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna en el paciente. Dentro de ciertas realizaciones, la etapa de incubar las células T puede repetirse una o más veces.

Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, para que proliferen las células T; (b) clonar una o más células que hayan proliferado; y (c) administrar al paciente una cantidad eficaz de las células T clonadas.

Dentro de otros aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprenden las etapas de (a) incubar células T CD4+ y/o CD8+ aisladas de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1; y (b) detectar la presencia o ausencia de activación específica de las células T, determinando a partir de ahí la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1. Dentro de ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende detectar la presencia o ausencia de proliferación de las células T.

Dentro de aspectos adicionales, la presente descripción proporciona métodos para determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 en un paciente, que comprenden las etapas de: (a) incubar una muestra biológica obtenida de un paciente con uno o más de: (i) un polipéptido WT1; (ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1; o (iii) una célula presentadora de antígeno que expresa un polipéptido WT1, en las que la incubación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que se formen inmunocomplejos; y (b) detectar los inmunocomplejos formados entre el polipéptido WT1 y anticuerpos en la muestra biológica que se unen específicamente al polipéptido WT1; y de ahí determinar la presencia o ausencia de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1.

Estos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes después tras la consulta de la siguiente descripción detallada y dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa una comparación de las secuencias de la proteína WT1 de ratón (MO) y humana (HU) (SEC ID Nº: 320 y 319, respectivamente).

La Figura 2 es una transferencia de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos de WT1 en pacientes con una neoplasia hematológica (AML). El carril 1 muestra marcadores de peso molecular; el carril 2 muestra un control positivo (línea celular de leucemia humana positiva para WT1 inmunoprecipitada con un anticuerpo específico de WT1); el carril 3 muestra un control negativo (línea celular positiva para WT1 inmunoprecipitada con sueros de ratón); y el carril 4 muestra una línea celular positiva para WT1 inmunoprecipitada con sueros de un paciente con AML. Para los carriles 2-4, se separó el inmunoprecipitado mediante electroforesis en gel y se sondó con un anticuerpo específico de WT1.

La Figura 3 es una transferencia de Western que ilustra la detección de una respuesta de anticuerpos específica de WT1 en ratones B6 inmunizados con TRAMP-C, una línea celular tumoral positiva para WT1. Los carriles 1, 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular, y los carriles 2, 4 y 6 muestran un control positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, un polipéptido que abarca 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína WT1, que migra en la transferencia de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado era WT180 en el carril 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en el carril 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en el carril 6.

La Figura 4 es una transferencia de Western que ilustra la detección de anticuerpos específicos de WT1 en ratones inmunizados con péptidos WT1 representativos. Los carriles 1, 3 y 5 muestran marcadores de peso molecular y los carriles 2, 4 y 6 muestran un control positivo específico de WT1 (N180, Santa Cruz Biotechnology, un polipéptido que abarca 180 aminoácidos de la región N-terminal de la proteína WT1, que migra en la transferencia de Western a 52 kD). El anticuerpo primario usado era WT180 en el carril 2, sueros de ratones B6 no inmunizados en el carril 4 y sueros de los ratones B6 inmunizados en el carril 6.

Las Figuras 5A a 5C son gráficas que ilustran la estimulación de respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos WT1 representativos. Se realizaron ensayos de incorporación de timidina usando una línea de células T y dos clones diferentes, como se indica, y los resultados se expresaron como cpm. Los controles indicados en el eje x eran sin antígeno (Sin Ag) y B6/medios; los antígenos usados eran el humano p6-22 (p1), p117-139 (p2) o el humano p244-262 (p3).

Las Figuras 6A y 6B son histogramas que ilustran la estimulación de respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con péptidos WT1 representativos. Tres semanas después de la tercera inmunización, células de bazo de ratones a los que se les había inoculado Vacuna A o Vacuna B se cultivaron sólo con medio (medio) o células de bazo y medio (B6/sin antígeno), células de bazo de B6 estimuladas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117), p244-262 (p244) (Vacuna A; Figura 6A) o p287-301 (p287), p299-313 (p299), p421-435 (p421) (Vacuna B; Figura 6B) y células de bazo estimuladas con un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 \mug/ml y se ensayaron después de 96 horas para determinar la proliferación por incorporación de (^{3}H) timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), que se calcula como la media de los pocillos experimentales divida por la media del control (células de bazo de B6 sin antígeno).

Las Figuras 7A-7D son histogramas que ilustran la generación de líneas de células T proliferativas y clones específicos para p117-139 y p6-22. Después de la inmunización in vivo, las tres estimulaciones in vitro (IVS) iniciales se llevaron a cabo usando los tres péptidos de la Vacuna A o B, respectivamente. Se llevaron a cabo IVS posteriores como estimulaciones de un solo péptido usando solamente los dos péptidos relevantes p117-139 y p6-22. Se obtuvieron clones de las líneas de células T específicas tanto de p6-22 como de p117-139, como se indica. Las células T se cultivaron sólo con medio (medio) o células de bazo y medio (B6/sin antígeno), células de bazo de B6 estimuladas con los péptidos p6-22 (p6), p117-139 (p117) o un péptido de control irrelevante (péptido irrelevante) a 25 \mug/ml y se ensayaron después de 96 horas para determinar la proliferación por incorporación de (^{3}H) timidina. Las barras representan el índice de estimulación (SI), que se calcula como la media de los pocillos experimentales divida por la media del control (células de bazo de B6 sin antígeno).

Las Figuras 8A y 8B presentan los resultados del Análisis TSITES de WT1 humana (SEC ID Nº: 319) para péptidos que tienen el potencial de generar respuestas Th. Las regiones indicadas por "A" son puntos medios de bloques AMPHI, "R" indica restos que coinciden con el motivo de Rothbard/Taylor. "D" indica restos que coinciden con el motivo IAd y "d" indica restos que coinciden con el motivo IEd.

Las Figuras 9A y 9B son gráficas que ilustran la generación de CTL específicos de péptido WT1 en ratones inmunizados con péptidos WT1. La Figura 9A ilustra la lisis de células diana por líneas celulares alogénicas y la Figura 9B muestra la lisis de líneas celulares recubiertas de péptido. En cada caso, el % de lisis (como se determina por ensayos de liberación de cromo convencionales) se muestra a tres proporciones de efector:diana (E:T) indicadas. Se proporcionan resultados para células de linfoma (LSTRA y E10), así como para E10 + p253-243 (E10 + P235). Las células E10 también se denominan en este documento células EL-4.

Las Figuras 10A-10D son gráficas que ilustran la generación de CTL específicos de WT1, que destruyen líneas celulares tumorales positivas para WT1 pero no destruyen líneas celulares negativas para WT1, después de la vacunación de ratones B6 con el péptido WT1 P117. La Figura 10A ilustra que las células T de ratones B6 no inmunizados no destruyen líneas celulares tumorales positivas para WT1. La Figura 10B ilustra la lisis de las células diana por líneas celulares alogénicas. Las Figuras 10C y 10D demuestran la lisis de líneas celulares tumorales positivas para WT1, en comparación con líneas celulares negativas para WT1 en dos experimentos diferentes. Además, las Figuras 10C y 10D muestran la lisis de líneas celulares recubiertas de péptido (línea celular negativa para WT1 E10 recubierta con el péptido WT1 relevante P117). En cada caso, el % de lisis (como se determina por ensayos de liberación de cromo convencionales) se muestra a tres proporciones de efector:diana indicadas. Se proporcionan resultados para células de linfoma (E10), células de cáncer de próstata (TRAMP-C), una línea celular de fibroblastos transformada (BLK-SV40), así como E10 + p117.

Las Figuras 11A y 11B son histogramas que ilustran la capacidad de CTL específicos del péptido representativo P117-139 para lisar células tumorales positivas para WT1. Tres semanas después de la tercera inmunización, se estimularon in vitro células de bazo de ratones a los que se les habían inoculado los péptidos p235-243 o p117-139 con el péptido relevante y se ensayaron para determinar su capacidad para lisar dianas incubadas con péptidos WT1, así como con células tumorales positivas y negativas para WT1. Las barras representan el % medio de lisis específica en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una proporción de E:T de 25:1. La Figura 11A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica de p235-243 contra la línea celular negativa para WT1 EL-4 (EL-4, negativa para WT1); EL-4 estimuladas con el péptido relevante p235-243 (usado para la inmunización, así como para la reestimulación) (EL-4 + p235); EL-4 estimuladas con los péptidos irrelevantes p117-139 (EL-4 + p117), p126-134 (EL-4 + p126) o p130-138 (EL-4 + p130) y las células tumorales positivas para WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, positiva para WT1) y TRAMP-C (TRAMP-C, positiva para WT1), como se indica. La Figura 11 B muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica de p117-139 contra EL-4; EL-4 estimuladas con el péptido relevante p117-139 (EL-4 + p117) y EL-4 estimuladas con los péptidos relevantes p123-131 (EL-4 + p123) o p128-136 (EL-4 + p128); BLK-SV40 y TRAMP-C, como se indica.

Las Figuras 12A y 12B son histogramas que ilustran la especificidad de lisis de células tumorales positivas para WT1, como se demuestra por inhibición de diana fría. Las barras representan el % medio de lisis específica en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una proporción de E:T de 25:1. La Figura 12A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica de p117-139 contra la línea celular negativa para WT1 EL-4 (EL-4, negativa para WT1); la línea celular tumoral positiva para WT1 TRAMP-C (TRAMP-C, positiva para WT1); células TRAMP-C incubadas con un exceso de diez veces (en comparación con la diana caliente) de células EL-4 estimuladas con el péptido relevante p117-139 (TRAMP-C + diana fría p117) sin marcaje con ^{51}Cr y células TRAMP-C incubadas con EL-4 estimuladas con un péptido relevante sin marcaje con ^{51}Cr (TRAMP-C+ diana fría irrelevante), como se indica. La Figura 12B muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica de p117-139 contra la línea celular negativa para WT1 EL-4 (EL-4, negativa para WT1); la línea celular tumoral positiva para WT1 BLK-SV40 (BLK-SV40, positiva para WT1); células BLK-SV40 incubadas con la diana fría relevante (BLK-SV40 + diana fría p117) y células BLK-SV40 incubadas con la diana fría relevante (BLK-SV40 + diana fría irrelevante), como se indica.

Las Figuras 13A-13C son histogramas que representan una evaluación del epítopo de CTL nonamérico dentro de p117-139. La línea de CTL específica de tumor p117-139 se ensayó contra péptidos dentro de los aminoácidos 117-139 que contenían o carecían de un motivo de unión a clase I H-2^{b} apropiado y después de la reestimulación con p126-134 o p130-138. Las barras representan el % medio de lisis específica en ensayos de liberación de cromo realizados por triplicado con una proporción de E:T de 25:1. La Figura 13A muestra la actividad citotóxica de la línea de células T específica de p117-139 contra la línea celular negativa para WT1 EL-4 (EL-4, negativa para WT1) y células EL-4 estimuladas con los péptidos p117-139 (EL-4 + p117), p119-127 (EL-4 + P119), p120-128 (EL-4 + p120), p123-131 (EL-4 + p123), p126-134 (EL-4 + p126), p128-136 (EL-4 + p128) y p130-138 (EL-4 + p130). La Figura 13B muestra la actividad citotóxica de la línea de CTL después de la reestimulación con p126-134 contra la línea celular negativa para WT1 EL-4, células EL-4 estimuladas con p117-139 (EL-4 + p117), p126-134 (EL-4 + p126) y la línea celular tumoral positiva para WT1 TRAMP-C. La Figura 13C muestra la actividad citotóxica de la línea de CTL después de la reestimulación con p130-138 contra EL-4, células EL-4 estimuladas con p117-139 (EL-4 + p117), p130-138 (EL-4 + p130) y la línea celular tumoral positiva para WT1 TRAMP-C.

La Figura 14 representa la reactividad de anticuerpos séricos contra WT1 en 63 pacientes con AML. La reactividad de anticuerpos séricos contra proteína WT1/extremo N-terminal se evaluó mediante ELISA en pacientes con AML. El primer y segundo carriles representan los controles positivo y negativo, respectivamente. Se usó el anticuerpo específico de WT1 WT180 obtenido en el mercado para el control positivo. Los siguientes 63 carriles representan resultados usando sueros de cada paciente individual. Los valores de DO representados eran de ELISA usando una dilución de suero 1:500. La figura incluye datos acumulativos de 3 experimentos distintos.

La Figura 15 representa reactividad de anticuerpos séricos contra proteínas WT1 y proteínas de control en 2 pacientes con AML. La reactividad de anticuerpos séricos contra WT1/longitud completa, extremo N-terminal de WT1 y proteínas TRX y Ra12 se evaluó mediante ELISA en 2 pacientes con AML. Los valores de DO representados eran de ELISA usando una dilución de suero 1:500. AML-1 y AML-2 indican suero de 2 de los pacientes individuales de la Figura 1, con reactividad de anticuerpos demostrada contra WT1/longitud completa. La proteína WT1 de longitud completa se expresaba como una proteína de fusión con Ra12. La proteína WT1/extremo N-terminal se expresaba como una proteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra12 y TRX se purificaron de una forma similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpos séricos contra las proteínas de fusión de WT1 se dirige contra las porciones WT1 de la proteína.

La Figura 16 representa la reactividad de anticuerpos séricos contra WT1 en 81 pacientes con CML. La reactividad de anticuerpos séricos contra la proteína WT1/longitud completa se evaluó mediante ELISA en pacientes con AML. El primer y segundo carriles representan los controles positivo y negativo, respectivamente. El anticuerpo específico de WT1 WT180 obtenido en el mercado se usó para el control positivo. Los siguientes 81 carriles representan resultados usando sueros de cada paciente individual. Los valores de DO representados eran de ELISA usando una dilución de suero 1:500. La figura incluye datos acumulativos de 3 experimentos distintos.

La Figura 17 representa la reactividad de anticuerpos séricos contra proteínas WT1 y proteínas de control en 2 pacientes con CML. La reactividad de anticuerpos séricos contra WT1/longitud completa, WT1/extremo N-terminal y proteínas TRX y Ra12 se evaluó mediante ELISA en 2 pacientes con CML. Los valores de DO representados eran de ELISA usando una dilución de suero 1:500. CML-1 y CML-2 indican suero de 2 de los pacientes individuales de la Figura 3 con reactividad de anticuerpos demostrada contra WT1/longitud completa. La proteína WT1/longitud completa se expresaba como una proteína de fusión con Ra12. La proteína WT1/extremo N-terminal se expresaba como una proteína de fusión con TRX. Las proteínas de control Ra12 y TRX se purificaron de una forma similar. Los resultados confirman que la reactividad de anticuerpos séricos contra las proteínas de fusión WT1 se dirige contra las porciones WT1 de la proteína.

La Figura 18 proporciona las características de las proteínas WT1 recombinantes usadas para análisis serológicos.

La Figura 19A-19E es una gráfica de barras que representa las respuestas de anticuerpos en ratones generadas por la vacunación con dosis diferentes de proteína WT1.

La Figura 20 es una gráfica de barras de las respuestas de células T proliferativas en ratones inmunizados con proteína WT1.

La Figura 21 es una fotografía de DC humanas, examinadas por microscopía fluorescente, que expresan WT1 después de la infección con adeno WT1 y Vaccinia WT1.

La Figura 22 es una fotografía que demuestra que la expresión de WT1 en DC humanas es reproducible después de la infección con adeno WT1 y que no se induce por una infección con Adenovirus de control.

La Figura 23 es una gráfica de un ensayo ELISPOT de IFN-gamma que muestra que la sensibilización in vitro con el gen completo de WT1 genera respuestas de células T específicas de WT1.

La Figura 24 muestra los aminoácidos 2-281 (SEC ID Nº: 461) de la proteína WT1 y el ADNc que codifica estos restos aminoacídicos (SEC ID Nº: 460). Esta proteína WT1 truncada se denomina WT1-F.

Descripción detallada de la invención

Como se ha señalado anteriormente, la presente invención se refiere generalmente a composiciones y métodos para la inmunoterapia y el diagnóstico de enfermedades malignas. Las composiciones descritas en este documento pueden incluir polipéptidos WT1, polinucleótidos de WT1, células presentadoras de antígeno (APC, por ejemplo, células dendríticas) que expresan un polipéptido WT1, agentes tales como anticuerpos que se unen a un polipéptido WT1 y/o células del sistema inmune (por ejemplo, células T) específicas para WT1. Los polipéptidos WT1 de la presente invención comprenden generalmente al menos una porción de un producto génico de tumor de Wilms (WT1) o una VARIANTEe del mismo. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invención comprenden generalmente una secuencia de ADN o ARN que codifica toda o una porción de dicho polipéptido o que es complementaria a dicha secuencia. Generalmente los anticuerpos son proteínas del sistema inmune, o fragmentos de unión a antígeno de las mismas, que son capaces de unirse a una porción de un polipéptido WT1. Las células T que pueden emplearse dentro de dichas composiciones son generalmente células T (por ejemplo, CD4^{+} y/o CD8^{+}) que son específicas para un polipéptido WT1. Ciertos métodos descritos en este documento emplean además células presentadoras de antígeno que expresan un polipéptido WT1 como se proporciona en este documento.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que una respuesta inmune generada contra un producto génico de tumor de Wilms (WT) (por ejemplo, WT1) puede proporcionar un beneficio profiláctico y/o terapéutico para pacientes aquejados de enfermedades malignas caracterizadas por una expresión génica de WT1 aumentada. Dichas enfermedades incluyen, pero sin limitación, leucemias, (por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica aguda (ALL) y ALL infantil), así como muchos cánceres tales como cánceres de pulmón, mama, tiroides y gastrointestinales y melanomas. El gen de WT1 se identificó originariamente y se aisló en base a una deleción citogenética en el cromosoma 11p13 en pacientes con tumor de Wilms (véase Call et al., Patente de Estados Unidos Nº 5.350.840). El gen consiste en 10 exones y codifica un factor de transcripción con dedos de cinc y se proporcionan secuencias de proteínas WT1 de ratón y humana en la Figura 1 y en las SEC ID Nº: 319 y 320.

Polipéptidos WT1

Dentro del contexto de la presente invención, un polipéptido WT1 es un polipéptido que comprende al menos una porción inmunógena de una WT1 nativa (es decir, una proteína WT1 expresada por un organismo que no está modificado genéticamente), o una VARIANTEe de la misma, como se describe en este documento. Un polipéptido WT1 puede ser de cualquier longitud, con tal de que comprenda al menos una porción inmunógena de una proteína nativa o una VARIANTEe de la misma. En otras palabras, un polipéptido WT1 puede ser un oligopéptido (es decir, que consiste en un número de restos aminoacídicos relativamente pequeño, tal como 8-10 restos, unidos por enlaces peptídicos), una proteína WT1 de longitud completa (por ejemplo, presente en el interior de una animal humano o no humano, tal como ratón) o un polipéptido de tamaño intermedio. Dentro de ciertas realizaciones, se prefiere el uso de polipéptidos WT1 que contienen un número pequeño de restos aminoacídicos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo. Dichos polipéptidos se prefieren para ciertos usos en los que se desea la generación de una respuesta de células T. Por ejemplo, dicho polipéptido WT1 puede contener menos de 23, preferiblemente no más de 18 y, más preferiblemente, no más de 15 restos aminoacídicos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo. Los polipéptidos que comprenden nueve restos aminoacídicos consecutivos de un polipéptido WT1 nativo son generalmente adecuados para dichos fines. Pueden estar presentes secuencias adicionales obtenidas de la proteína nativa y/o secuencias heterólogas dentro de cualquier polipéptido WT1, y dichas secuencias pueden (pero no necesariamente) poseer propiedades inmunógenas o antigénicas adicionales. Los polipéptidos, como se proporcionan en este documento, pueden asociarse adicionalmente (covalentemente o no covalentemente) con otros compuestos polipeptídicos o no polipeptídicos.

Una "porción inmunógena", como usa en este documento, es una porción de un polipéptido que es reconocida (es decir, que se une específicamente) por un receptor de antígeno de superficie de célula B y/o célula T. Ciertas porciones inmunógenas preferidas se unen a una molécula de MHC clase I o clase II. Como se usa en este documento, se dice que una porción inmunógena "se une" a una molécula de MHC clase I o clase II si dicha unión es detectable usando cualquier ensayo conocido en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de un polipéptido para unirse a MHC clase I puede evaluarse indirectamente por control de la capacidad para promover la incorporación de \beta2-microglobulina marcada con ^{125}I (\beta2m) en complejos heterotriméricos MHC clase I/\beta2m/péptido (véase Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994). Como alternativa, pueden emplearse ensayos de competición peptídica funcionales que son conocidos en la técnica. Ciertas porciones inmunógenas tienen una o más de las secuencias enumeradas dentro de una o más de las Tablas II-XIV. Las porciones inmunógenas representativas incluyen, pero sin limitación, RDLNALLPAVPSLGGGG (restos 6-22 de WT1 humana; SEC ID Nº: 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE (restos 117-139 de WT1 humana y de ratón; SEC ID Nº: 2 y 3, respectivamente) GATLKGVAAGSSSSVKWTE (restos 244-262 de WT1 humana; SEC ID Nº: 4), GATLKGVAA (restos 244-252 de WT1 humana; SEC ID Nº: 88), CMTWNQMNL (restos 235-243 de WT1 humana y de ratón; SEC ID Nº: 49 y 258, respectivamente), SCLESQPTI (restos 136-144 de WT1 de ratón; SEC ID Nº: 296), SCLESOPAI (restos 136-144 de WT1 humana; SEC ID Nº: 198), NLYQMTSQL (restos 225-233 de WT1 humana y de ratón; SEC ID Nº: 147 y 248 respectivamente); ALLPAVSSL (restos 10-18 de WT1 de ratón; SEC ID Nº: 255); RMFPNAPYL (restos 126-134 de WT1 humana y de ratón; SEC ID Nº: 185 y 293 respectivamente), VLDFAPPGA (restos 37-45 de WT1 humana; SEC ID Nº: 241) o VLDFAPPGAS (restos 37-46 de WT1 humana; SEC ID Nº: 411). Se proporcionan porciones inmunógenas adicionales en las SEC ID Nº: 414-451. Se proporcionan en este documento porciones inmunógenas adicionales y otras pueden identificarse en general usando técnicas bien conocidas, tales como las que se resumen en Paul, Fundamental Immunology, 3ª ed., 243-247 (Raven Press, 1993) y referencias citadas en el mismo. Las técnicas representativas para identificar porciones inmunógenas incluyen explorar polipéptidos para determinar su capacidad para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno. Una porción inmunógena de un polipéptido WT1 nativo es una porción que reacciona con dichos antisueros y/o células T a un nivel que no es sustancialmente menor que la reactividad del WT1 de longitud completa (por ejemplo, en un ensayo de ELISA y/o de reactividad de células T). En otras palabras, una porción inmunógena puede reaccionar dentro dichos ensayos a un nivel que es similar a o superior a la reactividad del polipéptido de longitud completa. Dichas exploraciones pueden realizarse generalmente usando métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica, tales como los descritos en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Como alternativa, pueden identificarse porciones inmunógenas usando análisis informático, tal como el programa Tsites (véase Rothbard y Taylor, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tengan el potencial de generar respuestas Th. Pueden identificarse péptidos CTL con motivos apropiados para la unión a MHC clase I o clase II murino y humano de acuerdo con BIMAS (Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994) y otros análisis de predicción de la unión peptídica a HLA. Como alternativa, pueden identificarse porciones inmunógenas que se unen a una molécula de MHC particular mediante el uso de motivos de unión peptídicos definidos tales como los descritos en Rammensee et al., Immunogenetics 41: 178-228, 1995. Para confirmar la unión peptídica a moléculas de MHC clase I o clase II murinas y humanas, pueden usarse ensayos de unión peptídica conocidos en la técnica. Para confirmar la inmunogenicidad, puede ensayarse un péptido usando un HLA A2 u otro modelo de ratón transgénico y/o un ensayo de estimulación in vitro usando células dendríticas, fibroblastos o células sanguíneas periféricas.

Como se ha indicado anteriormente, una composición puede comprender una VARIANTEe de una proteína WT1 nativa. Una "VARIANTEe" polipeptídica, como se usa en este documento, es un polipéptido que difiere de un polipéptido nativo en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones, de modo que se conserva la inmunogenicidad del polipéptido (es decir, la capacidad de la VARIANTEe para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno no disminuye sustancialmente respecto al polipéptido nativo). En otras palabras, la capacidad de una VARIANTEe para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno puede aumentarse o no variarse respecto al polipéptido nativo, o puede disminuirse en menos de 50% y, preferiblemente, menos de 20% respecto al polipéptido nativo. En una realización, la capacidad de una VARIANTEe para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno puede disminuirse en menos de 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o 0,5% respecto al polipéptido nativo. Dichas VARIANTEes pueden identificarse generalmente por modificación de una de las secuencias polipeptídicas anteriores y evaluación de la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describen en este documento. En una realización de la presente invención, una VARIANTEe puede identificarse por evaluación de su capacidad para unirse a una molécula HLA humana o murina. En una realización preferida, un polipéptido VARIANTEe tiene una modificación tal que la capacidad del polipéptido VARIANTEe para unirse a una molécula de MHC clase I o clase II, por ejemplo, HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 o HLA-CW07, se aumenta respecto a la de un polipéptido WT1 de tipo silvestre (no modificado). En una realización adicional, la porción N-terminal de WT1 de los aminoácidos 1-281 se modifica de modo que la capacidad de gran cantidad de polipéptidos en la misma que pueden unirse a HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 o HLA-CW07, se aumenta respecto a la de la secuencia del polipéptido WT1 de tipo silvestre (no modificado). En una realización adicional, un polipéptido que comprende al menos una porción inmunógena (epítopo) se modifica de modo que se aumenta su capacidad para unirse a una molécula de MHC, tal como HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 o HLA-CW07. El Ejemplo 30 describe VARIANTEes ilustrativas que pueden generarse. El especialista reconocerá fácilmente que éstas son VARIANTEes ilustrativas y que pueden generase otras VARIANTEes de forma similar para péptidos que se unen a moléculas HLA distintas de HLA-A2. En una realización adicional, la capacidad del polipéptido VARIANTEe para unirse a una molécula HLA se aumenta en al menos 2 veces, preferiblemente al menos 3 veces, 4 veces o 5 veces respecto a la de un polipéptido WT1 nativo. Se ha descubierto, dentro del contexto de la presente invención, que un número relativamente pequeño de sustituciones (por ejemplo, de 1 a 3) dentro una porción inmunógena de un polipéptido WT1 pueden servir para aumentar la capacidad del polipéptido para generar una respuesta inmune. Generalmente pueden identificarse sustituciones adecuadas mediante el uso de programas informáticos, como se han descrito anteriormente, y el efecto confirmarse basándose en la reactividad del polipéptido modificado con antisueros y/o células T como se describe en este documento. Por consiguiente, dentro de ciertas realizaciones preferidas, un polipéptido WT1 comprende una VARIANTEe en la que de 1 a 3 restos aminoacídicos dentro de una porción inmunógena se sustituyen de modo que la capacidad para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno sea estadísticamente superior que la del polipéptido no modificado. Dichas sustituciones se localizan preferiblemente dentro de un sitio de unión a MHC del polipéptido, que puede identificarse como se ha descrito anteriormente. Las sustituciones preferidas permiten una unión aumentada a moléculas de MHC clase I o clase II.

Ciertas VARIANTEes contienen sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de modo que un especialista en la técnica de la química de péptidos esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambiasen sustancialmente. Pueden realizarse en general sustituciones de aminoácidos en base a una similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfifática de los restos. Por ejemplo, los aminoácidos negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos positivamente cargados incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina, asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una VARIANTEe puede contener también, o como alternativa, cambios no conservativos. También (o como alternativa) pueden modificarse VARIANTEes mediante, por ejemplo, la deleción o adición de aminoácidos que tengan una influencia mínima sobre la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido.

En una realización preferida, se construye un polipéptido VARIANTEe del extremo N-terminal de WT1 (aminoácidos 1-249), en el que el polipéptido VARIANTEe es capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce el polipéptido WT1 de longitud completa y/o el extremo N-terminal de WT1. Un ejemplo no limitante de un anticuerpo es un anticuerpo anti-WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA).

Como se ha indicado anteriormente, pueden conjugarse polipéptidos WT1 con una secuencia señal (o líder) en el extremo N-terminal de la proteína que dirige co-traduccionalmente o post-traduccionalmente la transferencia de la proteína. Un polipéptido también, o como alternativa, puede conjugarse con un enlazador u otra secuencia para facilidad de síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His) o para aumentar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido puede conjugarse con una región Fc de inmunoglobulina.

Pueden prepararse polipéptidos WT1 usando cualquiera de una diversidad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos recombinantes codificados por un polinucleótido de WT1 como se describe en este documento pueden prepararse fácilmente a partir del polinucleótido. En general, puede emplearse cualquiera de una diversidad de vectores de expresión conocidos por los especialistas en la técnica para expresar polipéptidos WT1 recombinantes. La expresión puede conseguirse en cualquier célula hospedadora apropiada que se haya transformado o transfectado con un vector de expresión que contiene una molécula de ADN que codifica un polipéptido recombinante. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células procariotas, de levaduras y eucariotas superiores. Preferiblemente, las células hospedadoras empleadas son E. coli, levaduras o una línea celular de mamífero tal como COS o CHO. Los sobrenadantes de sistemas de hospedador/vector adecuados que secretan una proteína o polipéptido recombinante hacia el medio de cultivo pueden concentrarse primero usando un filtro disponible en el mercado. El concentrado puede aplicarse después a una matriz de purificación adecuada tal como una matriz de afinidad o una resina de intercambio iónico. Por último, pueden emplearse una o más etapas de HPLC de fase inversa para purificar adicionalmente un polipéptido recombinante. Dichas técnicas pueden usarse para preparar polipéptidos nativos o VARIANTEes de los mismos. Por ejemplo, pueden prepararse en general polinucleótidos que codifiquen una VARIANTEe de un polipéptido nativo usando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis específica de sitio dirigida por oligonucleótidos y pueden eliminarse secciones de la secuencia de ADN para permitir la preparación de polipéptidos truncados.

También pueden generarse ciertas porciones y otras VARIANTEes mediante medios sintéticos, usando procedimientos bien conocidos por los especialistas en la técnica. Por ejemplo, pueden sintetizarse polipéptidos que tengan menos de aproximadamente 500 aminoácidos, preferiblemente menos de aproximadamente 100 aminoácidos y, más preferiblemente, menos de aproximadamente 50 aminoácidos. Pueden sintetizarse polipéptidos usando cualquiera de las técnicas en fase sólida disponibles en el mercado, tales como el método de síntesis en fase sólida de Merrifield, en el que se añaden secuencialmente aminoácidos a una cadena de aminoácidos en crecimiento. Véase Merrifield, J. Arn. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. El equipamiento para la síntesis automatizada de polipéptidos está disponible en el mercado en proveedores tales como Applied BioSystems, Inc. (Foster City, CA) y puede hacerse funcionar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

En general, se aíslan polipéptidos y polinucleótidos como se describen en este documento. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" es uno que se retira de su entorno original. Por ejemplo, una proteína de origen natural se aísla si se separa de algunos o todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Preferiblemente, dichos polipéptidos tienen una pureza de al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente una pureza de al menos aproximadamente 95% y, más preferiblemente, una pureza de al menos aproximadamente 99%. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, está clonado en un vector que no es parte del entorno natural.

Dentro de aspectos adicionales, la presente invención proporciona miméticos de polipéptidos WT1. Dichos miméticos pueden comprender aminoácidos unidos a uno o más miméticos de aminoácidos (es decir, uno o más aminoácidos dentro de la proteína WT1 pueden sustituirse por un mimético de aminoácido) o pueden ser miméticos totalmente no peptídicos. Un mimético de aminoácido es un compuesto que es conformacionalmente similar a un aminoácido de modo que puede sustituir a un aminoácido dentro de un polipéptido WT1 sin disminuir sustancialmente la capacidad para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de antígeno. Un mimético no peptídico es un compuesto que no contiene aminoácidos y que tiene una conformación global que es similar a un polipéptido WT1, de modo que la capacidad del mimético para reaccionar con antisueros y/o líneas o clones de células T específicos de WT1 no se disminuye sustancialmente respecto a la capacidad de un polipéptido WT1. Dichos miméticos pueden diseñarse basándose en técnicas convencionales (por ejemplo, técnicas computacionales y de resonancia magnética nuclear) que evalúen la estructura tridimensional de una secuencia peptídica. Pueden diseñarse miméticos en los que una o más de las funcionalidades de cadena lateral del polipéptido WT1 se sustituyen por grupos que no necesariamente tienen el mismo tamaño o volumen, pero que tienen propiedades químicas y/o físicas similares que producen respuestas biológicas similares. Debería entenderse que, dentro de las realizaciones que se describen en este documento, un mimético puede sustituir a un polipéptido WT1.

Dentro de otras realizaciones ilustrativas, un polipéptido puede ser un polipéptido de fusión que comprende múltiples polipéptidos como se describen en este documento, o que comprende al menos un polipéptido como se describe en este documento y una secuencia no relacionada, tal como una proteína tumoral conocida. Un compañero de fusión puede, por ejemplo, ayudar a proporcionar epítopos auxiliares T (un compañero de fusión inmunológico), -preferiblemente epítopos auxiliares T reconocidos por seres humanos, o puede ayudar a expresar la proteína (un potenciador de la expresión) a rendimientos superiores que la proteína recombinante nativa. Ciertos compañeros de fusión preferidos son compañeros de fusión tanto inmunológicos como potenciadores de la expresión. Pueden seleccionarse otros compañeros de fusión de modo que se aumente la solubilidad del polipéptido o para permitir que el polipéptido se dirija a compartimentos intracelulares deseados. Otros compañeros de fusión adicionales incluyen marcadores de afinidad, que facilitan la purificación del polipéptido.

Generalmente pueden prepararse polipéptidos de fusión usando técnicas convencionales, incluyendo conjugación química. Preferiblemente, un polipéptido de fusión se expresa como un polipéptido recombinante, permitiendo la producción de niveles aumentados respecto a un polipéptido no fusionado en un sistema de expresión. En resumen, pueden ensamblarse por separado secuencias de ADN que codifiquen los componentes polipeptídicos y ligarse en un vector de expresión apropiado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica un componente polipeptídico se liga, con o sin un enlazador peptídico, con el extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica el segundo componente polipeptídico, de modo que las fases de lectura de las secuencias estén en la misma fase de lectura. Esto permite la traducción en un solo polipéptido de fusión que conserve la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Puede emplearse una secuencia enlazadora peptídica para separar el primer y segundo componentes polipeptídicos una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundaria y terciaria. Dicha secuencia enlazadora peptídica se incorpora en el polipéptido de fusión usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Pueden seleccionarse secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas basándose en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que pudiera interaccionar con epítopos funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la ausencia de restos hidrófobos o cargados que podrían reaccionar con los epítopos funcionales del polipéptido. Las secuencias enlazadoras peptídicas preferidas contienen restos Gly, Asn y Ser. También pueden usarse otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala en la secuencia enlazadora. Las secuencias de aminoácidos que pueden emplearse provechosamente como enlazadores incluyen las descritas en Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; Patente de Estados Unidos Nº 4.935.233 y Patente de Estados Unidos Nº 4.751.180. La secuencia enlazadora puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No son necesarias secuencias enlazadoras cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácidos N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y evitar la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas se unen operativamente a elementos reguladores de la transcripción o de la traducción adecuados. Los elementos reguladores responsables de la expresión de ADN se localizan solamente 5' a la secuencia de ADN que codifica los primeros polipéptidos. De forma similar, los codones de terminación necesarios para terminar las señales de terminación de la traducción y la transcripción sólo están presentes 3' a la secuencia de ADN que codifica el segundo polipéptido.

El polipéptido de fusión puede comprender un polipéptido como se describe en este documento junto con una proteína inmunógena no relacionada, tal como una proteína inmunógena capaz de generar una respuesta de memoria. Los ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas del tétanos, la tuberculosis y la hepatitis (véase, por ejemplo, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997).

En una realización preferida, el compañero de fusión inmunológico procede de un Mycobacterium sp., tal como un fragmento Ra12 obtenido de Mycobacterium tuberculosis. Se describen composiciones de Ra12 y métodos para su uso en la potenciación de la expresión y/o la inmunogenicidad de secuencias polinucleotídicas/polipeptídicas heterológas en el documento WO 01/25401. En resumen, Ra12 se refiere a una región polinucleotídica que es una subsecuencia de un ácido nucleico de MTB32A de Mycobacterium tuberculosis. MTB32A es una serina proteasa de un peso molecular de 32 KD codificada por un gen en cepas virulentas y avirulentas de M. tuberculosis. Se ha descrito la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos de MTB32A (por ejemplo, documento WO 01/25401, véase también Skeiky et al., Infection y Immun. (1999) 67: 3998-4007). Los fragmentos C-terminales de la secuencia codificante de MTB32A expresan a altos niveles y permanecen como polipéptidos solubles durante todo el proceso de purificación. Además, Ra12 puede potenciar la inmunogenicidad de polipéptidos inmunógenos heterólogos con los que se fusione. Un polipéptido de fusión con Ra12 preferido comprende un fragmento C-terminal de 14 KD que se corresponde con los restos aminoacídicos 192 a 323 de MTB32A. Otros polinucleótidos de Ra12 preferidos comprenden generalmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos consecutivos, al menos aproximadamente 30 nucleótidos, al menos aproximadamente 60 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos o al menos aproximadamente 300 nucleótidos que codifican una porción de un polipéptido Ra12. Los polinucleótidos de Ra12 pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica un polipéptido Ra12 o una porción del mismo) o pueden comprender una VARIANTEe de dicha secuencia. Las VARIANTEes polinucleotídicas de Ra12 pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de modo que no se disminuya sustancialmente la actividad biológica del polipéptido de fusión codificado, respecto a un polipéptido de fusión que comprende un polipéptido Ra12 nativo. Las VARIANTEes presentan preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 70%, más preferiblemente una identidad de al menos aproximadamente 80% y, más preferiblemente, una identidad de al menos aproximadamente 90% con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido Ra12 nativo o una porción del mismo.

\newpage

Dentro de otras realizaciones preferidas, un compañero de fusión inmunológico procede de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa Haemophilus influenza B (documento WO 91/18926). Preferiblemente, un derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer tercio de la proteína (por ejemplo, los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales) y un derivado de proteína D puede estar lipidado. Dentro de ciertas realizaciones preferidas, los primeros 109 restos de un compañero de fusión de Lipoproteína D se incluyen en el extremo N-terminal para proporcionar al polipéptido epítopos de células T exógenos adicionales y para aumentar el nivel de expresión en E. coli (funcionando por lo tanto como un potenciador de la expresión). La cola lipídica asegura una presentación óptima del antígeno a células presentadoras de antígeno. Otros compañeros de fusión incluyen la proteína no estructural del virus influenza, NS1 (hemaglutinina). Típicamente, se usan los 81 aminoácidos N-terminales, aunque pueden usarse diferentes fragmentos que incluyen epítopos auxiliares T.

En otra realización, el compañero de fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA, o una porción de la misma (preferiblemente una porción C-terminal). LYTA procede de Streptococcus pneumoniae, que sintetiza una N-acetil-L-alanina amidasa conocida como amidasa LYTA (codificada por el gen LytA; Gen 43: 265-292, 1986). LYTA es una autolisina que degrada específicamente ciertos enlaces en la estructura de peptidoglicano. El dominio C-terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad con la colina o con algunos análogos de colina tales como DEAE. Esta propiedad se ha aprovechado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA en E. coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen el fragmento C-LYTA en el extremo amino-terminal (véase Biotechnology 10: 795-798, 1992). Dentro de una realización preferida, puede incorporarse una porción repetida de LYTA en un polipéptido de fusión. Se encuentra una porción repetida en la región C-terminal partiendo del resto 178. Una porción repetida particularmente preferida incorpora los restos 188-305.

Dentro de otra realización ilustrativa, el compañero de fusión comprende un péptido señal de translocación de la doble arginina (TAT) del péptido señal TorA en E. coli en el extremo N-terminal; véase J. Mol. Microbiol. (2000) 2(2): 179-189; Journal of Bacteriology, ene 2001 págs. 604-610 Vol. 183, Nº 2; Journal of Biochemistry Vol. 276, 16 marzo 2001 págs. 8159-8164).

Otra realización ilustrativa más implica polipéptidos de fusión y los polinucleótidos que los codifican, en la que el compañero de fusión comprende una señal de dirección capaz de dirigir a un polipéptido hacia el compartimento endosomal/lisosomal, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.633.234. Un polipéptido inmunógeno de la invención, cuando se fusiona con esta señal de dirección, se asociará más eficazmente con moléculas de MHC clase II y por lo tanto proporcionará una estimulación in vivo aumentada de células T CD4^{+} específicas para el polipéptido.

La invención proporciona formas truncadas de polipéptidos WT1 que pueden expresarse de forma recombinante en E. coli sin la adición de un compañero de fusión. Se muestran ejemplos de estas formas truncadas en las SEC ID Nº: 342-346 y están codificadas por polinucleótidos que se muestran en las SEC ID Nº: 337-341. En variaciones de estos truncamientos, los primeros 76 aminoácidos de WT1 pueden fusionarse con el extremo C-terminal de la proteína, generando una proteína recombinante que es más fácil de expresar en E. coli. También pueden usarse otros hospedadores además de E. coli, tales como, por ejemplo, B. megaterium. La proteína puede prepararse adicionalmente sin un marcador de histidina.

En otras realizaciones, pueden generarse subunidades diferentes y fusionarse entre sí en un orden que difiera de la WT1 nativa. Además, pueden realizarse fusiones, por ejemplo, con Ra12. Se muestran proteínas de fusión ejemplares en las SEC ID Nº: 332-336 y pueden estar codificadas por los polinucleótidos que se muestran en las SEC ID Nº: 327-331.

Polinucleótidos de WT1

Cualquier polinucleótido que codifique un polipéptido WT1 como se describe en este documento es un polinucleótido de WT1 incluido en la presente invención. Dichos polinucleótidos pueden ser monocatenarios (codificantes o antisentido) o bicatenarios y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o de ARN. Pueden estar presentes, pero no necesariamente, secuencias codificantes o no codificantes adicionales en el interior de un polinucleótido de la presente invención y un polinucleótido puede unirse, pero no necesariamente, a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos de WT1 pueden codificar una proteína WT1 nativa o pueden codificar una VARIANTEe de WT1 como se describe en este documento. Las VARIANTEes polinucleotídicas pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones de modo que no se disminuya la inmunogenicidad del polipéptido codificado respecto a una proteína WT1 nativa. El efecto sobre la inmunogenicidad del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en este documento. Las VARIANTEes preferidas contienen sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de nucleótidos en no más de 20%, preferiblemente en no más de 10% de las posiciones de nucleótidos que codifican una porción inmunógena de una secuencia de WT1 nativa. Ciertas VARIANTEes son sustancialmente homólogas a un gen nativo, o a una porción del mismo. Dichas VARIANTEes polinucleotídicas son capaces de hibridar en condiciones moderadamente rigurosas con una secuencia de ADN de origen natural que codifica un polipéptido WT1 (o una secuencia complementaria). Las condiciones moderadamente rigurosas adecuadas incluyen prelavado en una solución de SSC 5X, SDS a 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 08); hibridación a 50ºC-65ºC, SSC 5X, durante una noche; seguido de lavado dos veces a 65ºC durante 20 minutos con cada uno de SSC 2X, 0,5X y 0,2X que contiene SDS a 0,1%. Dichas secuencias de ADN que hibridan también se incluyen en el alcance de esta invención.

Los especialistas en la técnica apreciarán que, como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido WT1. Algunos de estos polinucleótidos conservan una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de cualquier gen nativo. No obstante, se contemplan específicamente en la presente invención polinucleótidos que varían debido a diferencias en el uso de codones.

Por lo tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones polinucleotídicas que comprenden algunas o todas las secuencias polinucleotídicas expuestas en este documento, complementarias de una secuencia polinucleotídica expuesta en este documento y VARIANTEes degeneradas de una secuencia polinucleotídica expuesta en este documento. En ciertas realizaciones preferidas, las secuencias polinucleotídicas expuestas en este documento codifican polipéptidos inmunógenos como se ha descrito anteriormente.

Una vez que se identifica una porción inmunógena de WT1, como se ha descrito anteriormente, puede prepararse un polinucleótido de WT1 usando cualquiera de una diversidad de técnicas. Por ejemplo, puede amplificarse un polinucleótido de WT1 a partir de ADNc preparado a partir de células que expresen WT1. Dichos polinucleótidos pueden amplificarse mediante la reacción en cadena a la polimerasa (PCR). Para esta estrategia, pueden diseñarse cebadores específicos de secuencia basándose en la secuencia de la porción inmunógena y pueden adquirirse o sintetizarse. Por ejemplo, los cebadores adecuados para la amplificación por PCR de un gen de WT1 humana incluyen: primera etapa - P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAGA CT TGA AAG C AGT 3' (SEC ID Nº: 5) y P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (SEC ID Nº: 6); segunda etapa - P136: 5' GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (SEC ID Nº: 7) y P137: 5' GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (SEC ID Nº: 8). Los cebadores para amplificación por PCR de un gen de WT1 de ratón incluyen: primera etapa - P138: 5' TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (SEC ID Nº: 9) y P139: 5' GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (SEC ID Nº: 10), segunda etapa - P140: 5' GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (SEC ID Nº: 11) y P141: 5' GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (SEC ID Nº: 12).

Después puede usarse una porción amplificada para aislar un gen de longitud completa a partir de una genoteca de ADN genómico humano o a partir de una genoteca de ADNc adecuada usando técnicas bien conocidas. Como alternativa, puede construirse un gen de longitud completa a partir de múltiples fragmentos de PCR. También pueden prepararse polinucleótidos de WT1 por síntesis de componentes oligonucleotídicos y ligación de los componentes entre sí para generar el polinucleótido completo.

También pueden sintetizarse polinucleótidos de WT1 por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo síntesis química (por ejemplo, síntesis química de fosforamidita en fase sólida). También pueden introducirse modificaciones en una secuencia polinucleotídica usando técnicas de mutagénesis convencionales, tales como mutagénesis especifica de sitio dirigida por oligonucleótidos (véase Adelman et al., DNA 2: 183, 1983). Como alternativa, pueden generarse moléculas de ARN mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican un polipéptido WT1, con tal de que el ADN se incorpore en un vector con un promotor de ARN polimerasa adecuado (tal como T7 o SP6). Pueden usarse determinadas porciones para preparar un polipéptido codificado, como se describe en este documento. Además, o como alternativa, puede administrarse una porción a un paciente de modo que el polipéptido codificado se genere in vivo (por ejemplo, por transfección de células presentadoras de antígeno tales como células dendríticas con una construcción de ADNc que codifica un polipéptido WT1 y administración de las células transfectadas al paciente).

Generalmente pueden usarse polinucleótidos que codifican un polipéptido WT1 para la producción del polipéptido, in vitro o in vivo. También pueden usarse polinucleótidos de WT1 que sean complementarios a una secuencia codificante (es decir, polinucleótidos antisentido) como una sonda o para inhibir la expresión de WT1. También pueden introducirse construcciones de ADNc que pueden transcribirse en ARN antisentido en células de tejidos para facilitar la producción de ARN antisentido.

Cualquier polinucleótido puede modificarse adicionalmente para aumentar la estabilidad in vivo. Las modificaciones posibles incluyen, pero sin limitación, la adición de secuencias flanqueantes en los extremos 5' y/o 3'; el uso de enlaces fosforotioato o 2' O-metilo en lugar de fosfodiesterasa en la estructura; y/o la inclusión de bases no tradicionales tales como inosina, queosina y wybutosina, así como formas acetil-, metil-, tio-adenina, citidina, guanina, timina y uridina y otras formas modificadas de las mismas.

Las secuencias de nucleótidos como se describen en este documento pueden unirse a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos usando técnicas de ADN recombinante establecidas. Por ejemplo, un polinucleótido puede clonarse en cualquiera de una diversidad de vectores de clonación, incluyendo plásmidos, fagémidos, derivados de fago lambda y cósmidos. Los vectores de interés particular incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas y vectores de secuenciación. En general, un vector contendrá un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios de endonucleasas de restricción convenientes y uno o más marcadores de selección. Otros elementos dependerán del uso deseado y serán evidentes para los especialistas en la técnica. En particular, una realización de la invención comprende vectores de expresión que incorporan las moléculas de ácido nucleico de la invención, en unión operativa (es decir, "unidas operativamente") a una secuencia de control de la expresión (promotor). La construcción de dichos vectores, tales como vectores virales (por ejemplo, adenovirus o virus Vaccinia) o virales atenuados está bien dentro de la técnica especialista, al igual que la transformación o transfección de células, para producir líneas celulares eucariotas o cepas de células procariotas que codifican la molécula de interés. Son ejemplares de las células hospedadoras que pueden emplearse de esta forma células COS, células CHO, células de levadura, células de insecto (por ejemplo, células de Spodoptera frugiperda o Sf-9), células NIH 3T3 y así sucesivamente. También pueden usarse células procariotas tales como E. coli y otras bacterias.

Dentro de ciertas realizaciones, pueden formularse polinucleótidos para permitir la entrada en una célula de un mamífero y la expresión en la misma. Dichas formulaciones son particularmente útiles para fines terapéuticos, como se describe a continuación. Los especialistas en la técnica apreciarán que hay muchas formas de conseguir la expresión de un polinucleótido en una célula diana y puede emplearse cualquier método adecuado. Por ejemplo, puede incorporarse un polinucleótido en un vector viral tal como, pero sin limitación, adenovirus, virus adenoasociados, retrovirus o virus vaccinia u otros poxvirus (por ejemplo, poxvirus aviar). Los especialistas en la técnica conocen bien procedimientos para incorporar ADN en dichos vectores. Una vector retroviral puede transferir o incorporar adicionalmente un gen para un marcador de selección (para ayudar a la identificación o selección de las células transducidas) y/o un resto de dirección, tal como un gen que codifica un ligando para un receptor en una célula diana específica para hacer al vector específico de diana. La dirección también puede conseguirse usando un anticuerpo, por métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Pueden usarse construcciones de ADNc dentro de dicho vector, por ejemplo, para transfectar líneas celulares humanas o animales para el uso en el establecimiento de modelos de tumores positivos para WT1 que pueden usarse para realizar experimentos de protección tumoral e inmunoterapia adoptiva para demostrar inhibición del desarrollo de tumores o leucemia o la lisis de dichas células.

Otras formulaciones terapéuticas para polinucleótidos incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para el uso como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y el uso de dichos sistemas son bien conocidos en la técnica.

Composiciones de Anticuerpos, Fragmentos de los Mismos y Otros Agentes de Unión

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención proporciona además agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos que presentan unión inmunológica a un polipéptido WT1 descrito en este documento, o a una porción, VARIANTEe o derivado del mismo. Se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, "se une específicamente", "se une inmunológicamente" y/o es "inmunológicamente reactivo" con un polipéptido WT1 de la invención si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ensayo de ELISA) con el polipéptido y no reacciona de forma detectable con polipéptidos no relacionados en condiciones similares.

La unión inmunológica, como se usa en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que aparecen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que es específica la inmunoglobulina. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (K_{d}) de la interacción, en la que una K_{d} más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Un método de este tipo supone medir las velocidades de formación y disociación del complejo de sitio de unión a antígeno/antígeno, en el que esas velocidades dependen de las concentraciones de los compañeros del complejo, la afinidad de la interacción, y de los parámetros geométricos que influyen por igual en la velocidad en ambas direcciones. Por lo tanto, tanto la "constante de asociación" (K_{on}) como la "constante de disociación" (K_{off}) pueden determinarse por cálculo de las concentraciones y de las velocidades reales de asociación y disociación. La relación de K_{off}/K_{on} permite la anulación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad y, por lo tanto, es equivalente a la constante de disociación K_{d}. Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59: 439-473.

Un "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" de un anticuerpo se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión a antígeno. El sitio de unión a antígeno se forma por restos aminoacídicos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres extensiones altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables" que están interpuestas entre extensiones flanqueantes más conservadas conocidas como "regiones flanqueantes" o "FR". Por lo tanto, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácidos que se encuentran de forma natural entre y adyacentes a regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada se disponen entre sí en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión a antígeno. La superficie de unión a antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada cadena pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR".

Los agentes de unión pueden ser capaces además de diferenciar entre pacientes con y sin un cáncer asociado a WT1, usando los ensayos representativos que se proporcionan en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos u otros agentes de unión que se unen a una proteína tumoral generarán preferiblemente una señal que indica la presencia de un cáncer en al menos aproximadamente 20% de los pacientes con la enfermedad, más preferiblemente al menos aproximadamente 30% de los pacientes. Como alternativa, o además, el anticuerpo generará una señal negativa que indique la ausencia de la enfermedad en al menos aproximadamente 90% de los individuos sin el cáncer. Para determinar si un agente de unión cumple este requerimiento, pueden ensayarse muestras biológicas (por ejemplo, sangre, sueros, esputo, orina y/o biopsias tumorales) de pacientes con y sin cáncer (como se determina usando ensayos clínicos convencionales) como se describe en este documento para determinar la presencia de polipéptidos que se unen al agente de unión. Preferiblemente, se ensayará un número estadísticamente significativo de muestras con y sin la enfermedad. Cada agente de unión debería cumplir los criterios anteriores; sin embargo, los especialistas en la técnica reconocerán que pueden usarse agentes de unión en combinación para mejorar la sensibilidad.

Cualquier agente que cumpla los requerimientos anteriores puede ser un agente de unión. Por ejemplo, un agente de unión puede ser un ribosoma, con o sin un componente peptídico, una molécula de ARN o un polipéptido. En una realización preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Pueden prepararse anticuerpos por cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1998. En general, pueden producirse anticuerpos mediante técnicas de cultivo celular, incluyendo la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en este documento, o mediante transfección de genes de anticuerpos en hospedadores de células bacterianas o de mamífero adecuadas, para permitir la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, se inyecta inicialmente un inmunógeno que comprende el polipéptido en cualquiera de una amplia diversidad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En esta etapa, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunógeno sin modificación. Como alternativa, particularmente para polipéptidos relativamente cortos, puede generarse una respuesta inmune superior si el polipéptido está unido a una proteína transportadora, tal como albúmina sérica bovina o hemocianina de lapa californiana. El inmunógeno se inyecta en el hospedador animal, preferiblemente de acuerdo con un programa predeterminado que incorpora una o más inmunizaciones de refuerzo, y se les extrae sangre a los animales periódicamente. Después pueden purificarse anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido a partir de dichos antisueros, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido antigénico de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976 y mejoras en la misma. En resumen, estos métodos implican la preparación de líneas celulares inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas celulares puedan producirse, por ejemplo, a partir de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se ha descrito anteriormente. Después, las células de bazo se inmortalizan, por ejemplo, por fusión con un compañero de fusión de célula de mieloma, preferiblemente una que sea singénica con el animal inmunizado. Pueden emplearse una diversidad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico durante unos pocos minutos y después sembrarse en placas a baja densidad en un medio selectivo que mantenga el crecimiento de células híbridas pero no de células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan colonias individuales y sus sobrenadantes de cultivo se ensayan para determinar la actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren hibridomas que tienen una alta reactividad y especificidad.

Pueden aislarse anticuerpos monoclonales a partir de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en cultivo. Además pueden emplearse diversas técnicas para aumentar el rendimiento, tales como inyección de la línea celular de hibridoma en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado adecuado, tal como un ratón. Después pueden recogerse anticuerpos monoclonales del líquido ascítico o de la sangre. Pueden eliminarse los contaminantes de los anticuerpos mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Pueden usarse los polipéptidos de esta invención en el proceso de purificación, por ejemplo, en una etapa de cromatografía de afinidad.

Se conocen en la técnica varias moléculas terapéuticamente útiles que comprenden sitios de unión a antígeno que son capaces de presentar propiedades de unión inmunológica de una molécula de anticuerpo. La enzima proteolítica papaína escinde preferentemente moléculas de IgG para dar varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos "F(ab)") comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión a antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de escindir moléculas de IgG para proporcionar varios fragmentos, incluyendo el fragmento "F(ab')_{2}" que comprende ambos sitios de unión a antígeno. Un fragmento "Fv" puede producirse por escisión proteolítica preferencial de una IgM y en raras ocasiones una molécula de inmunoglobulina IgG o IgA. Sin embargo, los fragmentos Fv se obtienen más comúnmente usando procedimientos recombinantes conocidos en la técnica. El fragmento Fv incluye un heterodímero V_{H}::V_{L} no covalente que incluye un sitio de unión a antígeno que conserva gran parte de las capacidades de reconocimiento y unión a antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096.

Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("sFv") es un heterodímero V_{H}::V_{L} unido covalentemente que se expresa a partir de una fusión génica que incluye los genes que codifican V_{H} y V_{L} unidos mediante un enlanzador que codifica un péptido. Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85 (16): 5879-5883. Se han descrito varios métodos para localizar estructuras químicas para convertir las cadenas polipeptídicas ligera y pesada naturalmente agregadas -pero químicamente separadas- de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión a antígeno. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados
Unidos Nº 5.091.513 y 5.132.405, de Huston et al.; y la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778 de Ladner et al.

Cada una de las moléculas descritas anteriormente incluye un conjunto de CDR de cadena pesada y de cadena ligera, interpuestas respectivamente entre un conjunto de FR de cadena pesada y de cadena ligera que sirve de soporte para las CDR y define la relación espacial de las CDR entre sí. Como se usa en este documento, la expresión "conjunto de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de una región V de cadena pesada o ligera. Obteniéndose a partir del extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se indican como "CDR1", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Por lo tanto, un sitio de unión a antígeno incluye seis CDR que comprenden el conjunto de CDR de cada región V de cadena pesada y ligera. Un polipéptido que comprende una sola CDR (por ejemplo, una CDR1, CDR2 o CDR3) se denomina en este documento "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de varios complejos de antígeno-anticuerpo ha demostrado que los restos aminoacídicos de las CDR están en amplio contacto con el antígeno unido, donde el contacto más amplio del antígeno es con la CDR3 de la cadena pesada. Por lo tanto, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de unión a antígeno.

Como se usa en este documento, la expresión "conjunto de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos flanqueantes que flanquean las CDR de un conjunto de CDR de una región V de cadena pesada o ligera. Algunos restos de la FR pueden contactar con el antígeno unido; sin embargo, las FR son principalmente responsables del plegamiento de la región V en el sitio de unión a antígeno, particularmente los restos de la FR directamente adyacentes a las CDR. Dentro de las FR, ciertos restos amino y ciertas características estructurales están muy altamente conservados. A este respecto, todas las secuencias de la región V contienen un bucle disulfuro interno de aproximadamente 90 restos aminoacídicos. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDR se presentan como motivos de bucle salientes que forman una superficie de unión a antígeno. Generalmente se reconoce que hay regiones estructurales conservadas de FR que influyen en la forma plegada de los bucles de CDR en ciertas estructuras "canónicas" -independientemente de la secuencia de aminoácidos exacta de la CDR. Además, se sabe que ciertos restos de la FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo.

Se han descrito varias moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de unión a antígeno procedente de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDR asociadas fusionadas con dominios constantes humanos (Winters et al. (1991) Sature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138: 4534-4538; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47: 3577-3583), CDR de roedor injertadas en una FR de soporte humana antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano apropiado (Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525) y CDR de roedor soportadas por FR de roedor recombinantemente revestidas (Publicación de Patente Europa Nº 519.596, publicada el 23 de diciembre de 1992). Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para minimizar la respuesta inmunológica no deseada contra moléculas de anticuerpo de roedor anti-humano que limita la duración y la eficacia de aplicaciones terapéuticas de esos restos en destinatarios humanos.

Como se usan en este documento, las expresiones "FR revestidas" y "FR revestidas recombinantemente" se refieren a la sustitución selectiva de restos de FR, por ejemplo, de una región V de cadena pesada o ligera de roedor con restos de FR humana para proporcionar una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión a antígeno que conserva sustancialmente toda la estructura de plegamiento polipeptídico de FR nativa. Las técnicas de revestimiento se basan en el entendimiento de que las características de unión a ligando de un sitio de unión a antígeno están determinadas principalmente por la estructura y la disposición relativa de los conjuntos de CDR de cadena pesada y ligera dentro de la superficie de unión a antígeno. Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59: 439-473. Por lo tanto, la especificidad de la unión a antígeno puede preservarse en un anticuerpo humanizado solamente cuando las estructuras de CDR, su interacción entre sí y su interacción con el resto de los dominios de la región V se mantienen cuidadosamente. Mediante el uso de técnicas de revestimiento, los restos de FR exteriores (por ejemplo, accesibles por el disolvente) con los que se encuentra fácilmente el sistema inmune se sustituyen selectivamente con restos humanos para proporcionar una molécula híbrida que comprende una superficie revestida débilmente inmunógena o sustancialmente no inmunógena.

El proceso de revestimiento hace uso de los datos de secuencia disponibles para dominios variables de anticuerpos humanos recopilados por Kabat et al., en Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4ª ed., (U.S. Dept. of Health y Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987), actualizaciones de la base de datos de Kabat y otras bases de datos accesibles de los Estados Unidos y del extranjero (tanto de ácidos nucleicos como de proteínas). Las accesibilidades al disolvente de aminoácidos de la región V pueden deducirse a partir de la estructura tridimensional conocida para fragmentos de anticuerpos humanos y murinos. Existen dos etapas generales en el revestimiento de un sitio de unión a antígeno murino. Inicialmente, las FR de los dominios variables de una molécula de anticuerpo de interés se comparan con las secuencias de FR correspondientes de dominios variables humanos obtenidas de las fuentes identificadas anteriormente. Las regiones V humanas más homólogas se comparan después resto por resto con los aminoácidos murinos correspondientes. Los restos en la FR murina que difieren del homólogo humano se sustituyen por los restos presentes en el resto humano usando procedimientos recombinantes bien conocidos en la técnica. El intercambio de restos se lleva a cabo solamente con restos que están al menos parcialmente expuestos (accesibles al disolvente) y se tiene cuidado en la sustitución de restos aminoacídicos que puedan tener un efecto significativo sobre la estructura terciaria de dominios de la región V, tales como prolina, glicina y aminoácidos cargados.

De esta forma, los sitios de unión a antígeno murinos "revestidos" resultantes están, por lo tanto, diseñados para conservar los restos de CDR murinas, los restos sustancialmente adyacentes a las CDR, los restos identificados como enterrados o casi enterrados (inaccesibles al disolvente), los restos que se piensa que participan en contactos no covalentes (por ejemplo, electrostáticos e hidrófobos) entre dominios de la cadena pesada y ligera y los restos de regiones estructurales conservadas de las FR que se piensa que influyen en las estructuras terciarias "canónicas" de los bucles de CDR. Estos criterios de diseño se usan después para preparar secuencias de nucleótidos recombinantes que combinan las CDR tanto de la cadena pesada como ligera de un sitio de unión a antígeno murino en FR que parecen humanas que pueden usarse para transfectar células de mamífero para la expresión de anticuerpos humanos recombinantes que presenten la especificidad de antígeno de la molécula de anticuerpo murina.

En otra realización de la invención, pueden acoplarse anticuerpos monoclonales de la presente invención con uno o más agentes terapéuticos. Los agentes adecuados a este respecto incluyen radionúclidos, inductores de la diferenciación, fármacos, toxinas y derivados de los mismos. Los radionúclidos preferidos incluyen ^{90}Y, ^{123}I, ^{125}I, ^{131}I, ^{186}Re, ^{188}Re, ^{211}At y ^{212}Bi. Los fármacos preferidos incluyen metotrexato y pirimidina y análogos de purina. Los inductores de la diferenciación preferidos incluyen ésteres de forbol y ácido butírico. Las toxinas preferidas incluyen ricina, abrina, toxina diftérica, toxina del cólera, gelonina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de Shigella y proteína antiviral de hierba carmín.

Un agente terapéutico puede acoplarse (por ejemplo, unirse covalentemente) con un anticuerpo monoclonal adecuado directamente o indirectamente (por ejemplo, mediante un grupo enlazador). Es posible una reacción directa entre un agente y un anticuerpo cuando cada uno posee un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleófilo tal como un grupo amino o sulfhidrilo en uno puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contiene carbonilo, tal como un anhídrido o un haluro de ácido, o con un grupo alquilo que contiene un buen grupo saliente (por ejemplo, un haluro) en el otro.

Como alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo mediante un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un espaciador para distanciar un anticuerpo de un agente para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un grupo enlazador también puede servir para aumentar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo y, por lo tanto, aumentar la eficacia de acoplamiento. Un aumento en la reactividad química también puede facilitar el uso de agentes, o grupos funcionales en agentes, que de otro modo no sería posible.

Será evidente para los especialistas en la técnica que pueden emplearse una diversidad de reactivos bifuncionales o polifuncionales, tanto homo- como hetero-funcionales (tales como los descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL), como el grupo enlazador. El acoplamiento puede efectuarse, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o restos carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958 de Rodwell et al.

Cuando un agente terapéutico es más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo enlazador que sea escindible durante o tras la internalización en una célula. Se han descrito varios grupos enlazadores escindibles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos enlazadores incluyen la escisión por reducción de un enlace disulfuro (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.489.710 de Spitler), por irradiación de un enlace fotosensible (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.625.014 de Sender et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizados (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.638.045 de Kohn et al.), por hidrólisis mediada por el complemento sérico (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.671.958 de Rodwell et al.) e hidrólisis catalizada por ácido (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.569.789 de Blattler et al.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una realización, se acoplan múltiples moléculas de un agente a una molécula de anticuerpo. En otra realización, puede acoplarse más de un tipo de agente con un anticuerpo. Independientemente de la realización particular, pueden prepararse inmunoconjugados con más de un agente de una diversidad formas. Por ejemplo, puede acoplarse más de un agente directamente con una molécula de anticuerpo o pueden usarse enlazadores que proporcionen múltiples sitios para la unión. Como alternativa, puede usarse un vehículo.

Un vehículo puede llevar los agentes de una diversidad de formas, incluyendo la unión covalente directamente o mediante un grupo enlazador. Los vehículos adecuados incluyen proteínas tales como albúminas (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.507.234 de Kato et al.), péptidos y polisacáridos tales como aminodextrano (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.699.784, de Shih et al.). Un vehículo también puede llevar un agente por unión no covalente o por encapsulación, tal como dentro de una vesícula de liposoma (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nº 4.429.008 y 4.873.088). Los vehículos específicos para agentes radionúclidos incluyen moléculas pequeñas radiohalogenadas y compuestos quelantes. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.735.792 describe moléculas pequeñas radiohalogenadas representativas y su síntesis. Puede formarse un quelado de radionúclido a partir compuestos quelantes que incluyen los que contienen átomos de nitrógeno y azufre como los átomos donadores para la unión del radionúclido de metal u óxido metálico. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 4.673.562 de Davison et al. describe compuestos quelantes representativos y su síntesis.

\newpage

Células T

Las composiciones inmunoterapéuticas también, o como alternativa, pueden comprender células T específicas para WT1. Dichas células pueden prepararse generalmente in vitro o ex vivo, usando procedimientos convencionales. Por ejemplo, pueden estar presentes células T dentro de (o aislarse de) la médula ósea, la sangre periférica o una fracción de la médula ósea o la sangre periférica de un mamífero, tal como un paciente, usando un sistema de separación de células disponible en el mercado, tal como el sistema CEPRATE^{TM}, disponible en CellPro Inc., Bothell WA (véase también la Patente de Estados Unidos Nº 5.240.856, Patente de Estados Unidos Nº 56.215.926; documentos WO 89/06280; WO 91/16116 y WO 92/07243). Como alternativa, pueden obtenerse células T de seres humanos, animales no humanos, líneas celulares o cultivos relacionados o no relacionados.

Pueden estimularse células T con polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica un polipéptido WT1 y/o una célula presentadora de antígeno (APC) que exprese un polipéptido WT1. Dicha estimulación se realiza en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la generación de células T que sean específicas para el polipéptido WT1. Preferiblemente, un polipéptido o polinucleótido de WT1 está presente en el interior de un vehículo de suministro, tal como una microesfera, para facilitar la generación de células T específicas de antígeno. En resumen, se incuban células T, que pueden aislarse de un paciente o un donante relacionado o no relacionado mediante técnicas de rutina (tal como mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica), con polipéptido WT1. Por ejemplo, pueden incubarse células T in vitro durante 2-9 días (típicamente 4 días) a 37ºC con polipéptido WT1 (por ejemplo, 5 a 25 \mug/ml) o células que sinteticen una cantidad comparable de polipéptido WT1. Puede ser deseable incubar una alícuota separada de una muestra de células T en ausencia de polipéptido WT1 para servir como control.

Se considera que las células T son específicas para un polipéptido WT1 si las células T destruyen células diana recubiertas con un polipéptido WT1 o que expresan un gen que codifica dicho polipéptido. Puede evaluarse la especificidad de células T usando cualquiera de una diversidad de técnicas convencionales. Por ejemplo, dentro de un ensayo de liberación de cromo o ensayo de proliferación, un aumento del índice de estimulación de más de dos veces en la lisis y/o proliferación en comparación con controles negativos indica especificidad de células T. Dichos ensayos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe en Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994. Como alternativa, la detección de la proliferación de células T puede conseguirse mediante una diversidad técnicas conocidas. Por ejemplo, puede detectarse la proliferación de células T por medición de una velocidad aumentada de síntesis de ADN (por ejemplo, mediante marcaje por pulsos de cultivos de células T con timidina tritiada y medición de la cantidad de timidina tritiada incorporada en el ADN). Otras formas de detectar la proliferación de células T incluyen medir aumentos en la producción de interleuquina-2 (IL-2), flujo de Ca^{2+}, o captación decolorante, tal como 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio. Como alternativa, puede medirse la síntesis de linfoquinas (tales como interferón-gamma) o puede cuantificarse el número relativo de células T que pueden responder a un polipéptido WT1. El contacto con un polipéptido WT1 (200 ng/ml-100 \mug/ml, preferiblemente 100 ng/ml-25 \mug/ml) durante 3-7 días debería dar como resultado un aumento de al menos dos veces en la proliferación de las células T y/o el contacto como se ha descrito anteriormente durante 2-3 horas debería dar como resultado la activación de las células T, según se mide usando ensayos de citoquinas convencionales en los que un aumento de dos veces en el nivel de liberación de citoquinas (por ejemplo, TNF o IFN-\gamma) es indicativo de la activación de células T (véase Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998). Pueden expandirse células T específicas de WT1 usando técnicas convencionales. Dentro de realizaciones preferidas, las células T proceden de un paciente o un donante relacionado o no relacionado y se administran al paciente después de la estimulación y expansión.

Las células T que se han activado en respuesta a un polipéptido WT1, polinucleótido o APC que expresa WT1 pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+}. La activación específica de células T CD4^{+} o CD8^{+} puede detectarse de una diversidad de formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citoquinas (por ejemplo, linfoquinas) o la generación de actividad citolítica (es decir, generación de células T citotóxicas específicas para WT1). Para células T CD4^{+}, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para células T CD8^{+}, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica.

Para fines terapéuticos, las células T CD4^{+} o CD8^{+} que proliferan en respuesta al polipéptido, polinucleótido o APC de WT1 pueden expandirse en número in vitro o in vivo. La proliferación de dichas células T in vitro puede conseguirse de una diversidad de formas. Por ejemplo, las células T pueden volver a exponerse a polipéptido WT1 con o sin adición de factores de crecimiento de células T, tales como interleuquina-2 y/o células estimuladoras que sintetizan un polipéptido WT1. Se prefiere la adición de células estimuladoras cuando se generan respuestas de células T CD8^{+}. Pueden cultivarse células T en grandes cantidades in vitro con conservación de la especificidad en la respuesta a una reestimulación intermitente con polipéptido WT1. En resumen, para la estimulación primaria in vitro (IVS), pueden colocarse grandes cantidades de linfocitos (por ejemplo, más de 4 x 10^{7}) en matraces con medios que contienen suero humano. Puede añadirse polipéptido WT1 (por ejemplo, péptido a 10 \mug/ml) directamente, junto con toxoide tetánico (por ejemplo, 5 \mug/ml). Después, los matraces pueden incubarse (por ejemplo, 37ºC durante 7 días). Para una segunda IVS, las células T se recogen después y se colocan en nuevos matraces con 2-3 x 10^{7} células mononucleares de sangre periférica irradiadas. El polipéptido WT1 (por ejemplo, 10 \mug/ml) se añade directamente. Los matraces se incuban a 37ºC durante 7 días. El día 2 y día 4 después de la segunda IVS, pueden añadirse 2-5 unidades de interleuquina-2 (IL-2). Para una tercera IVS, las células T pueden colocarse en pocillos y estimularse con las propias células B del individuo transformadas con EBV recubiertas con el péptido. Puede añadirse IL-2 los días 2 y 4 de cada ciclo. Tan pronto como las células demuestren ser células T citotóxicas específicas, pueden expandirse usando un ciclo de estimulación de 10 días con mayor cantidad de IL-2 (20 unidades) los días 2, 4 y 6.

Como alternativa, una o más células T que proliferan en presencia de polipéptido WT1 pueden expandirse en número por clonación. Se conocen bien en la técnica métodos para clonar células e incluyen la dilución limitante. Pueden purificarse células T respondedoras a partir de la sangre periférica de pacientes sensibilizados mediante centrifugación en gradiente de densidad y formación de rosetas con eritrocitos de oveja, y establecerse en cultivo por estimulación con el antígeno nominal en presencia de células de relleno autólogas irradiadas. Para generar líneas de células T CD4^{+}, se usa polipéptido WT1 como el estímulo antigénico y se usan linfocitos autólogos de sangre periférica (PBL) o líneas celulares linfoblastoides (LCL) inmortalizadas por infección con el virus de Epstein Barr como células presentadoras de antígeno. Para generar líneas de células T CD8^{+}, pueden usarse células presentadoras de antígeno autólogas transfectadas con un vector de expresión que produce polipéptido WT1 como células estimuladoras. Las líneas de células T establecidas pueden clonarse 2-4 días después de la estimulación con antígeno por siembra en placas de células T estimuladas a una frecuencia de 0,5 células por pocillo en placas de fondo plano de 96 pocillos con 1 x 10^{6} células PBL o LCL irradiadas e interleuquina-2 recombinante (rIL2) (50 U/ml). Pueden identificarse pocillos con crecimiento clonal establecido aproximadamente 2-3 semanas después de la siembra en placas inicial y reestimularse con antígeno apropiado en presencia de células presentadoras de antígeno autólogas, después expandirse posteriormente mediante la adición de bajas dosis de rIL2 (10 U/ml) 2-3 días después de la estimulación con antígeno. Pueden mantenerse clones de células T en placas de 24 pocillos mediante reestimulación periódica con antígeno y rIL2 aproximadamente cada dos semanas.

Dentro de ciertas realizaciones, pueden sensibilizarse células T alogénicas (es decir, sensibilizadas a WT1) in vivo y/o in vitro. Dicha sensibilización puede conseguirse por contacto de células T con un polipéptido WT1, y un polinucleótido que codifica dicho polipéptido o una célula que produce dicho polipéptido en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la sensibilización de células T. En general, se considera que las células T están sensibilizadas si, por ejemplo, el contacto con un polipéptido WT1 da como resultado la proliferación y/o activación de las células T, según se mide mediante ensayos de proliferación, liberación de cromo y/o liberación de citoquinas convencionales como se describen en este documento. Un aumento del índice de estimulación de más de dos veces en la proliferación o la lisis y un aumento de más de tres veces en el nivel de citoquinas, en comparación con controles negativos, indica especificidad de células T. Pueden emplearse células sensibilizadas in vitro, por ejemplo, dentro de un trasplante de médula ósea o como infusión de linfocitos de donante.

Las células T específicas para WT1 pueden destruir células que expresen proteína WT1. Se usa la introducción de genes que codifican cadenas de receptores de células T (TCR) para WT1 como un medio para mejorar cuantitativamente y cualitativamente respuestas contra células de leucemia y cancerosas que llevan WT1. Las vacunas para aumentar el número de células T que pueden reaccionar contra células positivas para WT1 son un método de dirección a células que llevan WT1. La terapia de células T con células T específicas para WT1 es otro método. Un método alternativo es introducir las cadenas de TCR específicas para WT1 en células T u otras células con potencial lítico. En una realización adecuada, las cadenas alfa y beta de TCR se clonan a partir de una línea de células T específicas de WT1 y se usan para una terapia adoptiva de células T, tal como se describe en el documento WO 96/30516.

Composiciones de Receptor de Células T

El receptor de células T (TCR) consiste en 2 cadenas polipeptídicas diferentes altamente variables denominadas las cadenas \alpha y \beta del receptor de células T, que se unen mediante un enlace disulfuro (Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Cuarta Ed., 148-159. Elsevler Science Ltd/Garland Publishing. 1999). El heterodímero \alpha/\beta forma un complejo con las cadenas CD3 invariables en la membrana celular. Este complejo reconoce péptidos antigénicos específicos unidos a moléculas de MHC. La enorme diversidad de especificidades de TCR se genera de forma muy similar a la diversidad de inmunoglobulinas, a través de reorganización de genes somáticos. Los genes de la cadena \beta contienen más de 50 segmentos variables (V), 2 de diversidad (D), más de 10 de unión (J) y 2 segmentos de la región constante (C). Los genes de la cadena \alpha contienen más de 70 segmentos V y más de 60 segmentos J pero ningún segmento D, así como un segmento C. Durante el desarrollo de células T en el timo, se produce la reorganización génica de D a J de la cadena \beta, seguida de la reorganización del segmento génico V con el DJ. Este exón VDJ\beta funcional se transcribe y se corta y empalma para unirse a un C\beta. Para la cadena \alpha, un segmento génico V\alpha se reorganiza con un segmento génico J\alpha para generar el exón funcional que después se transcribe y se corta y empalma en el C\alpha. La diversidad se aumenta adicionalmente durante el proceso de recombinación mediante la adición aleatoria de P y N-nucleótidos, entre los segmentos V, D y J de la cadena \beta y entre los segmentos V y J en la cadena \alpha (Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Cuarta Ed., 98 y 150. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999).

La presente invención, en otro aspecto, proporciona TCR específicos para un polipéptido descrito en este documento o para una VARIANTEe o derivado del mismo. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan secuencias polinucleotídicas y de aminoácidos para las regiones de unión V-J o V-D-J, o partes de las mismas, para las cadenas alfa y beta del receptor de células T que reconocen polipéptidos tumorales descritos en este documento. En general, este aspecto de la invención se refiere a receptores de células T que reconocen o se unen a polipéptidos tumorales presentados en el contexto de MHC. En una realización preferida, los antígenos tumorales reconocidos por los receptores de células T comprenden un polipéptido de la presente invención. Por ejemplo, puede aislarse un ADNc que codifica un TCR específico para un péptido WT1 a partir de células T específicas para un polipéptido tumoral usando técnicas de biología molecular y de ADN recombinante convencionales.

Esta invención incluye además los receptores de células T o análogos de los mismos que tienen sustancialmente la misma función o actividad que los receptores de células T de esta invención, que reconocen o se unen a polipéptidos tumorales. Dicho receptores incluyen, pero sin limitación, un fragmento del receptor, o un mutante de sustitución, adición o deleción de un receptor de célula T proporcionado en este documento. Esta invención también incluye polipéptidos o péptidos que son sustancialmente homólogos a los receptores de células T proporcionados en este documento o que conservan sustancialmente la misma actividad. El término "análogo" incluye cualquier proteína o polipéptido que tenga una secuencia de restos aminoacídicos sustancialmente idéntica a los receptores de células T proporcionados en este documento en la que uno o más restos, preferiblemente no más de 5 restos, más preferiblemente no más de 25 restos se han sustituido conservativamente con un resto funcionalmente similar, y que presenta los aspectos funcionales del receptor de células T como se describe en este documento.

La presente invención proporciona además células hospedadoras de mamífero adecuadas, por ejemplo, células T inespecíficas que se transfectan con un polinucleótido que codifica TCR específicos para un polipéptido descrito en este documento, volviendo de este modo a la célula hospedadora específica para el polipéptido. Las cadenas \alpha y \beta del TCR pueden estar contenidas en vectores de expresión separados o, como alternativa, en un solo vector de expresión que también contiene un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para la traducción independiente de caperuza del gen cadena abajo del IRES. Dichas células hospedadoras que expresan TCR específicos para el polipéptido pueden usarse, por ejemplo, para inmunoterapia adoptiva de un cáncer asociado a WT1, como se analiza adicionalmente a continuación.

En aspectos adicionales de la presente invención, pueden usarse TCR clonados específicos para un polipéptido enumerado en este documento en un kit para el diagnóstico de un cáncer asociado a WT1. Por ejemplo, puede usarse la secuencia de ácido nucleico, o porciones de la misma, de TCR específicos de tumor como sondas o cebadores para la detección de la expresión de los genes reorganizados que codifican el TCR específico en una muestra biológica. Por lo tanto, la presente invención proporciona además un ensayo para detectar ARN mensajero o ADN que codifica el TCR específico para un polipéptido.

Complejos Tetraméricos de Péptido-MHC

La presente invención, en otro aspecto, proporciona complejos tetraméricos (tetrámeros) péptido-MHC específicos para células T que reconocen un polipéptido descrito en este documento, o para una VARIANTEe o derivado de la misma. En una realización, pueden usarse tetrámeros en la detección de células T específicas de WT1. Pueden usarse tetrámeros en el control de respuestas inmunes específicas de WT1, la detección temprana de tumores malignos asociados con WT1 y para el control de una enfermedad mínima residual. La tinción de tetrámeros se lleva a cabo típicamente con el análisis citométrico de flujo y puede usarse para identificar grupos dentro una población de pacientes que padecen una enfermedad asociada a WT1 con un mayor riesgo de recaída o avance de la enfermedad.

Composiciones Farmacéuticas

En realizaciones adicionales, la presente invención se refiere a la formulación de uno o más de las composiciones de polinucleótidos, polipéptidos, células T, TCR y/o anticuerpos descritos en este documento en vehículos farmacéuticamente aceptables para la administración a una célula o a un animal, en solitario o en combinación con una u otras modalidades más de terapia.

Se entenderá que, si se desea, puede administrarse una composición como se describe en este documento en combinación con otros agentes también, tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. De hecho, prácticamente no existe limitación de otros componentes que también pueden incluirse, siempre que los agentes adicionales no causen un efecto adverso significativo tras el contacto con las células diana o tejidos del hospedador. Por lo tanto, las composiciones pueden suministrarse junto con diversos otros agentes según sea necesario en el caso particular. Dichas composiciones pueden purificarse a partir de células hospedadoras u otras fuentes biológicas, o como alternativa pueden sintetizarse químicamente como se describe en este documento. Asimismo, dichas composiciones puede comprender además composiciones de ARN o ADN sustituido o derivatizado.

Por lo tanto, en otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden una o más de las composiciones de polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, TCR y/o células T descritas en este documento en combinación con un vehículo fisiológicamente aceptable. En ciertas realizaciones preferidas, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden composiciones inmunógenas de polinucleótidos y/o polipéptidos de la invención para el uso en aplicaciones de vacunas profilácticas y terapéuticas. La preparación de vacunas se describe en general, por ejemplo, en M. F. Powell y M. J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit y adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995). Generalmente, dichas composiciones comprenderán una o más composiciones de polinucleótidos y/o polipéptidos de la presente invención en combinación con uno o más inmunoestimulantes.

Será evidente que cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento puede contener sales farmacéuticamente aceptables de los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. Dichas sales pueden prepararse, por ejemplo, a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases orgánicas (por ejemplo, sales de aminas primarias, secundarias y terciarias y aminoácidos básicos) y bases inorgánicas (por ejemplo, sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio y magnesio).

En otra realización, las composiciones inmunógenas ilustrativas, por ejemplo, composiciones de vacunas de la presente invención, comprenden ADN que codifica uno o más de los polipéptidos que se han descrito anteriormente, de modo que el polipéptido se genera in situ. Como se ha indicado anteriormente, el polinucleótido puede administrarse dentro de cualquiera de una diversidad de sistemas de suministro conocidos por los especialistas en la técnica. De hecho, son bien conocidas en la técnica numerosos procedimientos de suministro de genes, tales como los descritos por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998, y referencias citadas en el mismo. Los sistemas de expresión de polinucleótidos apropiados contendrán, por supuesto, las secuencias reguladoras de ADN reguladoras necesarias para la expresión en un paciente (tal como un promotor y una señal de terminación adecuados). Como alternativa, los sistemas de suministro bacteriano pueden implicar la administración de una bacteria (tal como Bacillus-Calmette-Guerrin) que expresa una porción inmunógena del polipéptido en su superficie celular o secreta dicho epítopo.

Por lo tanto, en ciertas realizaciones, los polinucleótidos que codifican polipéptidos inmunógenos descritos en este documento se introducen en células hospedadoras de mamífero adecuadas para la expresión usando cualquiera de varios sistemas basados en virus conocidos. En una realización ilustrativa, los retrovirus proporcionan una plataforma conveniente y eficaz para sistemas de suministro de genes. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polipéptido de la presente invención puede insertarse en un vector y empaquetarse en partículas retrovirales usando procedimientos conocidos en la técnica. Después, el virus recombinante puede aislarse y suministrarse a un sujeto. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.

Además, también se han descrito varios sistemas basados en adenovirus ilustrativos. A diferencia de los retrovirus que se integran en el genoma del hospedador, los adenovirus persisten extracromosómicamente minimizando por lo tanto los riesgos asociados con la mutagénesis insercional (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57: 267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67: 5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68: 933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6: 616-629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476).

También se han desarrollado diversos sistemas vector de virus adenoasociados (AAV) para suministro de polinucleótidos. Los vectores de AAV pueden construirse fácilmente usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales Nº WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. y Immunol. 158: 97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875.

Los vectores virales adicionales útiles para el suministro de los polinucleótidos que codifican polipéptidos de la presente invención mediante transferencia génica incluyen los derivados de la familia de poxvirus, tales como virus vaccinia y poxvirus aviares. A modo de ejemplo, pueden construirse de la forma siguiente virus vaccinia recombinantes que expresen las nuevas moléculas. El ADN que codifica un polipéptido se inserta primero en un vector apropiado de modo que sea adyacente a un promotor de vaccinia y flanquee secuencias de ADN de vaccinia, tales como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Después, este vector se usa para transfectar células que se infectan simultáneamente con vaccinia. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor de vaccinia más el gen que codifica el polipéptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante puede seleccionarse mediante cultivo de las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y selección de placas virales resistentes a la misma.

Puede usarse convenientemente un sistema de infección/transfección basado en vaccinia para proporcionar una expresión o coexpresión transitoria inducible de uno o más polipéptidos descritos en este documento en células hospedadoras de un organismo. En este sistema particular, las células se infectan primero in vitro con un virus vaccinia recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteriófago T7. Esta polimerasa presenta una especificidad exquisita en el sentido de que sólo transcribe moldes que lleven promotores de T7. Después de la infección, las células se transfectan con el polinucleótido o polinucleótidos de interés, dirigidos por un promotor de T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus vaccinia recombinante transcribe el ADN transfectado en ARN que después se traduce en un polipéptido por la maquinaria de traducción del hospedador. El método proporciona un alto nivel de producción citoplásmica transitoria de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción. Véase, por ejemplo, Elroy-Stein y Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-B 126.

Como alternativa, también pueden usarse avipoxvirus tales como los virus de la viruela aviar y de la viruela del canario, para suministrar las secuencias codificantes de interés. Se sabe que los avipoxvirus recombinantes, que expresan inmunógenos de patógenos de mamíferos, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector de Avipoxvirus es particularmente deseable en seres humanos y otras especies de mamíferos puesto que los miembros del género Avipoxvirus sólo pueden replicarse de forma productiva en especies aviares susceptibles y, por lo tanto, no son infecciosos en células de mamífero. Se conocen en la técnica métodos para producir Avipoxvirus recombinantes y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente con respecto a la producción de virus vaccinia. Véase, por ejemplo, los documentos WO 91/12882; WO 89/03429; y WO 92/03545. Se han desarrollado varios poxvirus como vectores virales vivos para la expresión de proteínas heterólogas (Cepko et al., Cell 37: 1053-1062 (1984); Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4626-4630 (1987); Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 3896-3900 (1987); Panicali y Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 4927-4931 (1982); Machett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 7415-7419 (1982)). Están disponibles virus de la viruela aviar y de la viruela porcina representativos a través de la ATCC bajos los números de acceso VR-229 y VR-363, respectivamente. Está disponible un vaccinia-CEA recombinante a través de la ATCC bajo el número de acceso VR2323. Otros vectores virales ilustrativos también incluyen, pero sin limitación, los descritos por Therion Biologics (Cambridge, MA, Estados Unidos), por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.051.410, 5.858.726, 5.656.465, 5.804.196, 5.747.324, 6.319.496, 6.165.460.

También puede usarse cualquiera de varios vectores de alfavirus para el suministro de composiciones de polinucleótidos de la presente invención, tales como los vectores descritos en las Patentes de Estados Unidos 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. También pueden usarse ciertos vectores basados en la Encefalitis Equina Venezolana (VEE), pudiendo encontrarse ejemplos ilustrativos de los mismos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.505.947 y 5.643.576.

Además, también pueden usarse para el suministro de genes en la invención vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103.

Puede encontrarse información ilustrativa adicional sobre éstos y otros sistemas de suministro basados en virus conocidos, por ejemplo, en Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321,1989; Flexner et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; Patente de Estados Unidos Nº 4.603.112, 4.769.330, y 5.017.487; WO 89/01973; Patente de Estados Unidos Nº 4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993.

Como apreciará fácilmente el especialista en la técnica, pueden estar presentes gran cantidad de componentes adicionales en un vector de ADN o retroviral que exprese un polipéptido WT1 o cualquier porción del mismo, como se describe en este documento. Por ejemplo, un vector de expresión para el suministro de un polinucleótido o péptido de la presente invención puede incluir gran cantidad de una diversidad de moléculas coestimuladoras, incluyendo, pero sin limitación CD28, B7-1, ICAM-1 y LFA-3. Un vector de suministro también puede incluir gran cantidad de citoquinas, por ejemplo, IFN-\gamma, GM-CSF o IL-2. En una realización ilustrativa, un vector viral recombinante, por ejemplo, un vector de vaccinia o virus de la viruela aviar incluye B7-1, ICAM-1 y LFA-3.

La presente invención también comprende el uso de cualquier combinación de los vectores de ADN y/o virales descritos en este documento para el uso en el tratamiento de tumores malignos asociados con la expresión de WT1. En una realización ilustrativa, se administra un vector viral de vaccinia recombinante a un animal o paciente humano aquejado de un tumor maligno asociado con WT1, seguido de la administración de un vector de virus de la viruela aviar recombinante. En otra realización de la presente invención, el virus de la viruela aviar recombinante se administra dos veces después de la administración del vector de vaccinia (por ejemplo, un régimen de vacunación de sensibilización/refuerzo/refuerzo).

En ciertas realizaciones, un polinucleótido puede integrarse en el genoma de una célula diana. Esta integración puede ser en la localización y orientación específica mediante recombinación homóloga (sustitución de genes) o puede integrarse en una localización inespecífica aleatoria (aumento de genes). En otras realizaciones adicionales, el polinucleótido puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento episomal separado de ADN. Dichos segmentos polinucleotídicos o "episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y la replicación independiente de o en sincronización con el ciclo de la célula hospedadora. La forma en la que se suministra la construcción de expresión a una célula y dónde permanece el polinucleótido en la célula dependen del tipo de construcción de expresión que se emplee.

En otra realización de la invención, se administra/suministra un polinucleótido como ADN "desnudo", por ejemplo, como se describe en Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993 y se revisa por Cohen, Science 259: 1691-1692, 1993. La captación de ADN desnudo puede aumentarse por recubrimiento del ADN sobre perlas biodegradables que se transportan eficazmente al interior de las células.

En otra realización más, puede suministrarse una composición de la presente invención mediante una estrategia de bombardeo de partículas, habiéndose descrito muchas de ellas. En un ejemplo ilustrativo, puede conseguirse una aceleración de partículas impulsada por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, Reino Unido) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), describiéndose algunos ejemplos de los mismos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807 y la Patente EP Nº 0500 799. Este enfoque ofrece una estrategia de suministro sin aguja en la que una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, tales como partículas polinucleotídicas o polipeptídicas, se acelera a alta velocidad dentro de un chorro de gas helio generado mediante un dispositivo de mano, propulsando las partículas hacia un tejido diana de interés.

En una realización relacionada, otros dispositivos y métodos que pueden ser útiles para la inyección sin aguja impulsada por gas de composiciones de la presente invención incluyen los proporcionados por Bioject, Inc. (Portland, OR), describiéndose algunos de los ejemplos de los mismos en las Patentes de Estados Unidos Nº. 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.51; 5.399.163; 5.520.639 y 5.993.412.

De acuerdo con otra realización, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento comprenderán uno o más inmunoestimulantes además de las composiciones inmunógenas de polinucleótidos, polipéptidos, anticuerpos, células T, TCR y/o APC de esta invención. Un inmunoestimulante se refiere esencialmente a cualquier sustancia que aumente o potencie una respuesta inmune (de anticuerpos y/o mediada por células) contra un antígeno exógeno. Un tipo preferido de inmunoestimulante comprende un adyuvante. Muchos adyuvantes contienen una sustancia diseñada para proteger al antígeno de un catabolismo rápido, tal como hidróxido de aluminio o aceite mineral, y un estimulador de respuestas inmunes, tal como lípido A, proteínas derivadas de Bordetella pertussis o Mycobacterium tuberculosis. Ciertos adyuvantes están disponibles en el mercado, por ejemplo, Adyuvante Incompleto y Adyuvante Completo de Freund (Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante 65 de Merck (Merck y Company, Inc, Raahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); sales de aluminio tales como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, sales de calcio, hierro o cinc; una suspensión insoluble de tirosina acilada; azúcares acilados; polisacáridos derivatizados catiónicamente o aniónicamente; polifosfacenos; microesferas biodegradables; monofosforil lípido A y quil A. También pueden usarse como adyuvantes citoquinas, tales como GM-CSF, interleuquina-2, -7, -12 y otros factores de crecimiento similares.

Dentro de ciertas realizaciones de la invención, la composición adyuvante es preferiblemente una que induce una respuesta inmune predominantemente del tipo Th1. Altos niveles de citoquinas de tipo Th1 (por ejemplo, IFN-\gamma, TNF-\alpha, IL-2 e IL-12) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes mediadas por células contra un antígeno administrado. Por el contrario, altos niveles de citoquinas de tipo Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunes humorales. Después de la aplicación de una vacuna como se proporciona en este documento, un paciente mantendrá una respuesta inmune que incluye respuestas de tipo Th1 y Th2. Dentro de una realización preferida, en la que una respuesta es predominantemente de tipo Th1, el nivel de citoquinas de tipo Th1 aumentará en mayor medida que el nivel de citoquinas de tipo Th2. Los niveles de estas citoquinas pueden evaluarse fácilmente usando ensayos convencionales. Para una revisión de las familias de citoquinas, véase Mosmann y Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989.

Ciertos adyuvantes preferidos para generar una respuesta predominantemente de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, junto con una sal de aluminio. Están disponibles adyuvantes MPL® en Corixa Corporation (Seattle, WA; véase, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 y 4.912.094). Los oligonucleótidos que contienen CpG (donde el dinucleótido CpG no está metilado) también inducen una respuesta predominantemente Th1. Dichos oligonucleótidos son bien conocidos y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/02555, WO 99/33488 y las Patentes de Estados Unidos Nº 6.008.200 y 5.856.462. También se describen secuencias de ADN inmunoestimuladoras, por ejemplo, por Sato et al., Science 273: 352, 1996. Otro adyuvante preferido comprende una saponina, tal como Quil A, o derivados de la misma, incluyendo QS21 y QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); Escina; Digitonina; o saponinas de Gypsophila o Chenopodium quinoa. Otras formulaciones preferidas incluyen más de una saponina en las combinaciones de adyuvantes de la presente invención, por ejemplo combinaciones de al menos dos del siguiente grupo que comprende QS21, QS7, Quil A, \beta-escina o digitonina.

Como alternativa, las formulaciones de saponina puede combinarse con vehículos de vacunas compuestos por quitosana u otros polímeros policatiónicos, partículas de polilactida y polilactida-co-glicolida, matriz polimérica basada en poli-N-acetil glucosamina, partículas compuestas por polisacáridos o polisacáridos modificados químicamente, liposomas y partículas a base de lípidos, partículas compuestas por monoésteres de glicerol, etc. Las saponinas también pueden formularse en presencia de colesterol para formar estructuras particuladas tales como liposomas o ISCOM. Además, las saponinas pueden formularse junto con un éter o éster de polioxietileno, en una solución o suspensión no particulada o en una estructura particulada tal como un liposoma paucilaminar o ISCOM. Las saponinas también pueden formularse con excipientes tales como Carbopol^{R} para aumentar la viscosidad, o pueden formularse en forma de polvo seco con un excipiente en polvo tal como lactosa.

En una realización preferida, el sistema adyuvante incluye la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, tal como la combinación de adyuvante QS21 y 3D-MPL®, como se describe en el documento WO 94/00154 o una composición menos reactógena en la que el QS21 se inactiva con colesterol, como se describe en el documento WO 96/33739. Otras formulaciones preferidas comprenden una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Se describe otra formulación de adyuvante particularmente preferida que emplea QS21, adyuvante 3D-MPL® y tocoferol en una emulsión de aceite en agua en el documento WO 95/17210.

Otro sistema adyuvante mejorado implica la combinación de un oligonucleótido que contiene CpG y un derivado de saponina, particularmente la combinación de CpG y QS21 se describe en el documento WO 00/09159. Preferiblemente, la formulación comprende adicionalmente una emulsión de aceite en agua y tocoferol.

Los adyuvantes ilustrativos adicionales para el uso en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen Montanide ISA 720 (Seppic, Francia), SAF (Chiron, California, Estados Unidos), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), la serie SBAS de adyuvantes (por ejemplo, SBAS-2 o SBAS-4, disponibles en SmithKline Beecham, Rixensart, Bélgica), Detox (Enhanzyn®) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) y otros 4-fosfatos de aminoalquil glucosaminida (AGP), tales como los descritos en las Patentes de Estados Unidos en trámite Nº 6.113.918 y 6.355.257 y en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.303.347 y adyuvantes de éter de polioxietileno tales como los descritos en el documento WO 99/52549A1. Los adyuvantes ilustrativos adicionales para el uso en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen isotucerosol.

Otros adyuvantes preferidos incluyen moléculas adyuvantes de la fórmula general

(I)HO(CH_{2}CH_{2}O)_{n}-A-R,

en la que, n es 1-50, A es un enlace o -C(O)-, R es alquilo C_{1-50} o Fenil alquilo C_{1-50}.

Una realización de la presente invención consiste en una formulación de vacuna que comprende un éter de polioxietileno (I), en la que n está entre 1 y 50, preferiblemente 4-24, más preferiblemente 9; el componente R es C_{1-50}, preferiblemente alquilo C_{4}-C_{20} y, más preferiblemente alquilo C_{12} y A es un enlace. La concentración de los éteres de polioxietileno debería estar en el intervalo de 0,1-20%, preferiblemente de 0,1-10% y, más preferiblemente en el intervalo de 0,1-1%. Los éteres de polioxietileno preferidos se seleccionan de grupo siguiente:

éter de polioxietilen-9-laurilo, éter de polioxietilen-9-esteorilo

éter de polioxietilen-8-esteorilo, éter de polioxietilen-4-laurilo

éter de polioxietilen-35-laurilo y éter de polioxietilen-23-laurilo. Se describen éteres de polioxietileno tales como lauril éter de polioxietileno en el Índice Merck (12ª edición: entrada 7717). Estas moléculas adyuvantes se describen en el documento WO 99/525549.

\vskip1.000000\baselineskip

El éter de polioxietileno de acuerdo con la fórmula general (I) anterior puede, si se desea, combinarse con otro adyuvante. Por ejemplo, una combinación de adyuvantes preferida es preferiblemente con CpG, como se describe en la Solicitud de Patente del Reino Unido en trámite GB 9820956.2

De acuerdo con otra realización de esta invención, se suministra una composición inmunógena descrita en este documento a un hospedador mediante células presentadoras de antígeno (APC), tales como células dendríticas, macrófagos, células B, monocitos y otras células que pueden modificarse por ingeniería genética para ser APC eficaces. Dichas células pueden, pero no necesariamente, modificarse genéticamente para aumentar la capacidad para presentar el antígeno, para mejorar la activación y/o el mantenimiento de la respuesta de células T, para tener efectos antitumorales por sí mismas y/o para ser inmunológicamente compatibles con el receptor (es decir, de haplotipo HLA compatible). Generalmente pueden aislarse APC a partir de cualquiera de una diversidad de fluidos biológicos y órganos, incluyendo tejidos tumorales y peritumorales, y pueden ser células autólogas, alogénicas, singénicas o xenogénicas.

Ciertas realizaciones preferidas de la presente invención usan células dendríticas o progenitoras de las mismas como células presentadoras de antígeno. Las células dendríticas son APC altamente potentes (Banchereau y Steinman, Nature 392: 245-251, 1998) y se ha demostrado que son eficaces como adyuvante fisiológico para generar una inmunidad antitumoral profiláctica o terapéutica (véase, Timmerman y Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999). En general, pueden identificarse células dendríticas basándose en su forma típica (estrellada in situ, con prolongaciones citoplasmáticas marcadas (dendritas) visibles in vitro), su capacidad para captar, procesar y presentar antígenos con alta eficacia y su capacidad para activar respuestas de células T sin tratamiento previo. Por supuesto, las células dendríticas pueden modificarse por ingeniería genética para expresar receptores de superficie celular específicos o ligandos que no se encuentren comúnmente en células dendríticas in vivo o ex vivo, y dichas células dendríticas modificadas se contemplan en la presente invención. Como una alternativa a células dendríticas, pueden usarse células dendríticas cargadas con antígenos de vesículas secretadas (denominadas exosomas) dentro de una vacuna (véase Zitvogel et al., Nature Med. 4: 594-600,1998).

Pueden obtenerse células dendríticas y progenitoras a partir de sangre periférica, médula ósea, células infiltrantes de tumores, células infiltrantes de tejidos peritumorales, ganglios linfáticos, bazo, piel, sangre de cordón umbilical y cualquier otro tejido o fluido adecuado. Por ejemplo, pueden diferenciarse células dendríticas ex vivo por adición de una combinación de citoquinas tales como GM-CSF, IL-4, IL-13 y/o TNF\alpha a cultivos de monocitos recogidos de sangre periférica. Como alternativa, células positivas para CD34 recogidas de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o médula ósea pueden diferenciarse en células dendríticas por adición al medio de cultivo de combinaciones de GM-CSF, IL-3, TNF\alpha, ligando CD40, LPS, ligando flt3 y/o otros u otros compuestos que inducen diferenciación, maduración y proliferación de células dendríticas.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que permite una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debería interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las fases intermedias posibles de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan como APC con una alta capacidad para captación y procesamiento de antígenos, que se correlaciona con la alta expresión de receptor Fc\gamma y receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de células T, tales como MHC clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).

Generalmente pueden transfectarse APC con un polinucleótido de la invención (o porción u otra VARIANTEe del mismo) de modo que el polipéptido codificado, o una porción inmunógena del mismo, se exprese en la superficie celular. Dicha transfección puede tener lugar ex vivo y después puede usarse una composición farmacéutica que comprende dichas células transfectadas para fines terapéuticos, como se describe en este documento. Como alternativa, puede administrarse a un paciente un vehículo de suministro de genes que se dirija a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno, dando como resultado una transfección que se produce in vivo. La transfección in vivo y ex vivo de células dendríticas, por ejemplo, puede realizarse generalmente usando cualquier método conocido en la técnica, tal como los descritos en el documento WO 97/24447, o la estrategia de pistola de genes descrita por Mahvi et al., Immunology y cell Biology 75: 456-460, 1997. Puede conseguirse la carga con antígenos de células dendríticas por incubación de células dendríticas o células progenitoras con el polipéptido tumoral, ADN (desnudo o en el interior de un vector plasmídico) o ARN; o con una bacteria o virus recombinante que exprese antígeno (por ejemplo, vectores de vaccinia, virus de la viruela aviar, adenovirus o lentivirus). Antes de la carga, el polipéptido puede conjugarse covalentemente con un compañero inmunológico que proporcione ayuda de células T (por ejemplo, una molécula transportadora). Como alternativa, una célula dendrítica puede estimularse con un compañero inmunológico no conjugado, por separado o en presencia del polipéptido.

Aunque puede emplearse cualquier vehículo adecuado conocido por los especialistas en la técnica en las composiciones farmacéuticas de esta invención, el tipo de vehículo variará típicamente dependiendo del modo de administración. Pueden formularse composiciones de la presente invención para cualquier forma de administración apropiada, incluyendo, por ejemplo, administración tópica, oral, nasal, mucosa, intravenosa, intracraneal, intraperitoneal, subcutánea e intramuscular.

Los vehículos para el uso dentro de dichas composiciones farmacéuticas son biocompatibles y también pueden ser biodegradables. En ciertas realizaciones, la formulación proporciona preferiblemente un nivel relativamente constante de liberación de componente activo. En otras realizaciones, sin embargo, puede desearse una velocidad de liberación más rápida inmediatamente tras la administración. La formulación de dichas composiciones está bien dentro del nivel de especialidad normal en la técnica usando procedimientos conocidos. Los vehículos ilustrativos útiles a este respecto incluyen micropartículas de poli(lactida-co-glicolida), poliacrilato, látex, almidón, celulosa, dextrano y similares. Otros vehículos de liberación retardada ilustrativos incluyen biovectores supramoleculares, que comprenden un núcleo hidrófilo no líquido (por ejemplo, un polisacárido u oligosacárido reticulado), y opcionalmente una capa externa que comprende un compuesto anfífilo, tal como un fosfolípido (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.151.254 y las Solicitudes PCT WO 94/20078, WO/94/23701 y WO 96/06638). La cantidad de compuesto activo contenido en el interior de una formulación de liberación sostenida depende del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de la liberación y la naturaleza de la afección que se vaya a tratar o prevenir.

En otra realización ilustrativa, se emplean microesferas biodegradables (por ejemplo, polilactato poliglicolato) como vehículos para las composiciones de esta invención. Se describen microesferas biodegradables adecuadas, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.897.268; 5.075.109; 5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344. 5.407.609 y 5.942.252. También serán útiles para muchas aplicaciones sistemas de vehículo de proteína del núcleo de la hepatitis B modificados, tales como se describen en el documento WO 99 40934 y referencias citadas en el mismo. Otro sistema de vehículo/suministro ilustrativo emplea un vehículo que comprende complejos de particulado-proteína, tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.928.647, que son capaces de inducir una respuesta de linfocitos T citotóxicos restringida por clase I en un hospedador.

En otra realización ilustrativa, se emplean partículas de núcleo de fosfato de calcio como vehículos, adyuvantes de vacuna o como matrices de liberación controlada para las composiciones de esta invención. Se describen partículas de fosfato de calcio ejemplares, por ejemplo, en la Solicitud de Patente publicada Nº WO/0046147.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenderán con frecuencia además uno o más tampones (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen a la formulación isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes de suspensión, agentes espesantes y/o conservantes. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.

Las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o multidosis, tales como ampollas o viales sellados. Típicamente dichos recipientes se cierran herméticamente de un modo que conserven la esterilidad y estabilidad de la formulación hasta el uso. En general, las formulaciones pueden almacenarse como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos. Como alternativa, una composición farmacéutica puede almacenarse en una condición secada por congelación que sólo requiera la adición de un vehículo líquido estéril inmediatamente antes del uso.

El desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para el uso de las composiciones particulares descritas en este documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, se conoce bien en la técnica, analizándose brevemente algunos de los mismos a continuación con fines ilustrativos en general.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en este documento pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable o pueden incluirse en una cápsula de gelatina de carcasa dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

Los compuestos activos pueden incluso incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares (véase, por ejemplo Mathiowitz et al., Nature 27 mar 1997; 386 (6623): 410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998; 15 (3): 243-84; Patente de Estados Unidos Nº 5.641.515; Patente de Estados Unidos Nº 5.580.579 y Patente de Estados Unidos Nº 5.792.451). Los comprimidos, trociscos, píldoras, cápsulas y similares también pueden contener cualquiera de una diversidad de componentes adicionales, por ejemplo, puede añadirse un aglutinante, tal como, goma tragacanto, goma arábiga, almidón de maíz o gelatina; excipientes, tales como fosfato dicálcico; un agente disgregante, tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante, tal como estearato magnesio; y un agente edulcorante, tal como sacarosa, lactosa o sacarina, o un agente saporífero, tal como menta, aceite de gaulteria o aroma de cereza. Cuando la forma unitaria de dosificación es una cápsula, puede contener, además de materiales del tipo anterior, un vehículo líquido. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, pueden recubrirse comprimidos, píldoras o cápsulas con goma laca, azúcar o ambos. Por supuesto, cualquier material usado en la preparación de cualquier forma unitaria de dosificación debería ser farmacéuticamente puro y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Típicamente, estas formulaciones contendrán al menos aproximadamente 0,1% del compuesto activo o más, aunque, por supuesto, el porcentaje del ingrediente o ingredientes activos puede variarse y puede estar convenientemente entre aproximadamente 1 ó 2% y aproximadamente 60% o 70% o más del peso o volumen de la formulación total. Naturalmente, la cantidad de compuesto o compuestos activos en cada composición terapéuticamente útil puede prepararse de tal forma que se obtendrá una dosificación adecuada en cualquier dosis unitaria dada del compuesto. Un especialista en la técnica de la preparación de dichas formulaciones farmacéuticas contemplará factores tales como solubilidad, biodisponibilidad, semivida biológica, vía de administración, vida útil del producto, así como otras consideraciones farmacológicas y, como tales, pueden ser deseables una diversidad de dosificaciones y regímenes de tratamiento.

Para la administración oral las composiciones de la presente invención pueden incorporar como alternativa uno o más excipientes en forma de un enjuague bucal, dentífrico, comprimido bucal, pulverización oral o formulación administrada por vía oral sublingual. Como alternativa, el ingrediente activo puede incorporarse en una solución oral tal como una que contiene borato de sodio, glicerina y bicarbonato de potasio o dispersarse en un dentífrico, o añadirse en una cantidad terapéuticamente eficaz a una composición que puede incluir agua, aglutinantes, abrasivos, agentes saporíferos, agentes espumantes y humectantes. Como alternativa, las composiciones pueden conformarse en una forma de comprimido o solución que puede colocarse bajo la lengua o disolverse de otro modo en la boca.

En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas descritas en este documento por vía parenteral, intravenosa intramuscular o incluso intraperitoneal. Dichas estrategias son bien conocidas por el especialista, describiéndose algunas de ellas adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.543.158; Patente de Estados Unidos Nº 5.641.515 y Patente de Estados Unidos Nº 5.399.363. En ciertas realizaciones, pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como bases libres o sales farmacológicamente aceptables en agua mezclada convenientemente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. También pueden prepararse dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contendrán generalmente un conservante para evitar el desarrollo de microorganismos.

Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase la Patente de Estados Unidos Nº 5.466.468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto de que exista facilidad de inyección. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. Puede provocarse una absorción prolongada de las composiciones inyectables mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasen la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En una realización, para la administración parenteral en una solución acuosa, la solución debería tamponarse convenientemente si es necesario y el diluyente líquido hacerse primero isotónico con solución salina o glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los especialistas en la técnica conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de líquido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15ª Edición, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente cierta variación en la dosificación dependiendo del estado del sujeto que se trate. Además, para la administración a seres humanos, las preparaciones cumplirán por supuesto preferiblemente las normas de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales requeridas por la Office of Biologics standards de la FDA.

En otra realización de la invención, las composiciones descritas en este documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz.

Los vehículos pueden comprender además cualquiera o todos los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, tampones, soluciones excipientes, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse ingredientes activos complementarios en las composiciones. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen ninguna reacción alérgica o adversa similar cuando se administran a un ser humano.

En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse mediante pulverizadores intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Se han descrito métodos para el suministro de genes, ácidos nucleicos y composiciones peptídicas directamente a los pulmones mediante pulverizaciones nasales de aerosol, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos 5.756.353 y en la Patente de Estados Unidos 5.804.121. Asimismo, también es bien conocido en las técnicas farmacéuticas el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas intranasales (Takenaga et al., J Controlled Release 2 Mar 1998, 52 (1-2): 81-7) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (Patente de Estados Unidos 5.725.871). Asimismo, se describe el suministro farmacológico transmucoso ilustrativo en forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno en la Patente de Estados Unidos 5.780.045.

En ciertas realizaciones, se usan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospedadoras/organismos adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para el suministro encapsuladas en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden unirse, covalentemente o no covalentemente, a la superficie dichos vehículos transportadores.

La formación y el uso de de liposomas y preparaciones similares a liposomas como vehículos farmacológicos potenciales se conoce en general por los especialistas en la técnica (véase, Lasic, Trends Biotechnol jul 1998; 16 (7): 307-21; Takakura, Nippon Rinsho mar 1998; 56 (3): 691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. ag 1997; 35 (8): 801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12 (2-3): 233-61; Patente de Estados Unidos 5.567.434; Patente de Estados Unidos 5.552.157; Patente de Estados Unidos 5.565.213; Patente de Estados Unidos 5.738.868 y Patente de Estados Unidos 5.795.587).

Se han usado con éxito liposomas con varios tipos celulares que normalmente son difíciles de transfectar mediante otros procedimientos, incluyendo suspensiones de células T, cultivos de hepatocitos primarios y células PC 12 (Renneisen et al., J Biol Chem. 25 sep 1990; 265 (27): 16337-42; Muller et at., DNA Cell Biol. abr 1990; 9 (3): 221-9). Además, los liposomas están libres de las limitaciones de longitud del ADN que son típicas de sistemas de suministro basados en virus. Se han usado eficazmente liposomas para introducir genes, diversos fármacos, agentes radioterapéuticos, enzimas, virus, factores de transcripción, efectores alostéricos y similares en una diversidad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, el uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o una toxicidad inaceptable después del suministro sistémico.

En ciertas realizaciones, se forman liposomas a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas mutilaminares (MLV)).

Como alternativa, en otras realizaciones, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas generalmente pueden incluir compuestos de una forma estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. dic 1998; 24 (12): 1113-28). Para evitar los efectos secundarios debidos a una sobrecarga polimérica intracelular, pueden diseñarse tales partículas ultrafinas (de un tamaño de aproximadamente 0,1 \mum) usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988; 5(1): 1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. mar 1998; 45 (2): 149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 2 ene 1998; 50 (1-3): 31-40; y la Patente de Estados Unidos 5.145.684.

Terapia de Enfermedades Malignas

Las estrategias inmunológicas para la terapia del cáncer se basan en el reconocimiento de que con frecuencia las células cancerosas pueden eludir las defensas del cuerpo contra células y moléculas anormales o extrañas, y que estas defensas podrían estimularse terapéuticamente para recuperar el fondo perdido, por ejemplo, págs. 23-648 en Klein, Immunology (Wiley-lnterscience, Nueva York, 1982). Numerosas observaciones recientes de que diversos efectores inmunes pueden inhibir directamente o indirectamente el desarrollo de tumores ha conducido a un interés renovado en esta estrategia para la terapia del cáncer, por ejemplo, Jager, et al., Oncology 2001;60 (1): 1-7; Renner, et al., Ann Hematol dic 2000; 79 (12): 651-9.

Son cuatro tipos celulares básicos cuya función se ha asociado con la inmunidad celular antitumoral y la eliminación de células tumorales del cuerpo: i) linfocitos B que secretan inmunoglobulinas hacia el plasma sanguíneo para identificar y marcar las células invasoras extrañas; ii) monocitos que secretan las proteínas del complemento que son responsables de la lisis y del procesamiento de las células invasoras diana recubiertas con inmunoglobulina; iii) linfocitos asesinos naturales que tienen dos mecanismos para la destrucción de células tumorales, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y destrucción natural; y iv) linfocitos T que poseen receptores específicos de antígeno y que tienen la capacidad para reconocer una célula tumoral que lleva moléculas marcadoras complementarias (Schreiber, H., 1989, en Fundamental Immunology (ed). W. E. Paul, págs. 923-955).

La inmunoterapia del cáncer se centra generalmente en la inducción de respuestas inmunes humorales, respuestas inmunes celulares o ambas. Además, está bien establecido que la inducción de células auxiliares T CD4^{+} es necesaria para inducir de forma secundaria anticuerpos o células T CD8^{+} citotóxicas. Los antígenos polipeptídicos que son selectivos o idealmente específicos para células cancerosas, particularmente células cancerosas asociadas con expresión de WT1, ofrecen una estrategia poderosa para inducir respuestas inmunes contra un cáncer asociado con la expresión de WT1 y son un aspecto importante de la presente invención.

En aspectos adicionales de la presente invención, las composiciones y vacunas descritas en este documento pueden usarse para inhibir el desarrollo de enfermedades malignas (por ejemplo, enfermedades progresivas o metastásicas o enfermedades caracterizadas por una pequeña carga tumoral tal como una enfermedad mínima residual). En general, dichos métodos pueden usarse para prevenir, retrasar o tratar una enfermedad asociada con la expresión de WT1. En otras palabras, los métodos terapéuticos que se proporcionan en este documento pueden usarse para tratar una enfermedad asociada a WT1 existente, o pueden usarse para prevenir o retrasar la aparición de dicha enfermedad en un paciente que esté libre de enfermedad o que esté aquejado de una enfermedad que aún no está asociada con la expresión de WT1.

Como se usa en este documento, una enfermedad está "asociada con la expresión de WT1" si las células enfermas (por ejemplo, células tumorales) en algún momento durante el transcurso de la enfermedad generan niveles detectablemente superiores de un polipéptido WT1 que células normales del mismo tejido. La asociación de la expresión de WT1 con una enfermedad maligna no requiere que WT1 esté presente en un tumor. Por ejemplo, la sobreexpresión de WT1 puede estar implicada con el inicio de un tumor, pero la expresión de proteína puede perderse posteriormente. Como alternativa, una enfermedad maligna que no se caracteriza por un aumento en la expresión de WT1 puede, en un momento posterior, evolucionar hacia una enfermedad que se caracterice por una expresión de WT1 aumentada. Por consiguiente, se considera que cualquier enfermedad maligna en la que las células enfermas expresaban antes, expresan actualmente o se espera que expresen posteriormente niveles aumentados de WT1 está "asociada con la expresión de WT1".

Puede realizarse una inmunoterapia usando cualquiera de una diversidad de técnicas, en las que los compuestos o células proporcionados en este documento funcionan eliminando las células que expresan WT1 de un paciente. Dicha eliminación puede tener lugar como resultado de la potenciación o inducción de una respuesta inmune en un paciente específica para WT1 o una célula que exprese WT1. Como alternativa, pueden eliminarse ex vivo células que expresen WT1 (por ejemplo, mediante tratamiento de médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica autóloga). Pueden obtenerse fracciones de médula ósea o sangre periférica usando cualquier procedimiento convencional en la técnica.

Dentro de dichos métodos, pueden administrarse a un paciente composiciones farmacéuticas y vacunas. Como se usa en este documento, un "paciente" se refiere a cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un ser humano. Un paciente puede o no estar aquejado de una enfermedad maligna. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas y vacunas anteriores pueden usarse para prevenir la aparición de una enfermedad (es decir, profilácticamente) o para tratar a un paciente aquejado de una enfermedad (por ejemplo, para prevenir o retrasar el avance y/o la metástasis de una enfermedad existente). Un paciente aquejado de una enfermedad puede tener una enfermedad mínima residual (por ejemplo, una carga tumoral baja en un paciente con leucemia en remisión completa o parcial o un paciente con cáncer después de la reducción de la carga tumoral después de una cirugía, radioterapia y/o quimioterapia). Dicho paciente puede inmunizarse para inhibir una recaída (es decir, prevenir o retrasar la recaída o disminuir la gravedad de una recaída). Dentro de ciertas realizaciones preferidas, el paciente está aquejado de leucemia (por ejemplo, AML, CML, ALL o ALL infantil), un síndrome mielodisplásico (MDS) o un cáncer (por ejemplo, cáncer gastrointestinal, de pulmón, tiroides o mama o un melanoma), donde el cáncer o leucemia es positivo para WT1 (es decir, reacciona de forma detectable con un anticuerpo anti-WT1, como se proporciona en este documento, o expresa ARNm de WT1 a un nivel detectable mediante RT-PCR, como se describe en este documento) o padece una enfermedad autoinmune dirigida contra células que expresan WT1.

Otras enfermedades asociadas con la sobreexpresión de WT1 incluyen cáncer de riñón (tal como carcinoma de células renales o tumor de Wilms) como se describe en Satoh F., et al., Pathol. Int. 50 (6): 458-71 (2000), y Campbell C. E. et al., Int. J. Cancer 78 (2): 182-8 (1998); y mesotelioma, como se describe en Amin, K. M. et al., Am, J. Pathol. 146 (2): 344-56(1995). Harada et al. (Mol. Urol. 3 (4): 357-364 (1999) describen la expresión génica de WT1 en tumores de células germinales testiculares humanas. Nonomura et al. Hinyokika Kiyo 45 (8): 593-7 (1999), describen la clasificación molecular en fases del cáncer testicular usando la reacción en cadena de la polimerasa de los genes específicos de cáncer testicular. Shimizu et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 19 (2): 158-63 (2000) describen la detección inmunohistoquímica del gen del tumor de Wilms (WT1) en tumores ováricos epiteliales.

También se describió la sobreexpresión de WT1 en tumores desmoplásicos de células pequeñas redondas, por Barnoud, R. et al., Am, J. Surg. Pathol. 24 (6): 830-6 (2000); y Pathol, Res. Pract. 194(10): 693-700 (1998). La sobreexpresión de WT1 en glioblastoma y otros cánceres se describió por Menssen, H. D. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126 (4): 226-32 (2000), "Wilms' tumor gene (WT1) expression in lung cancer, colon cancer y glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens.". Otras enfermedades que muestran sobreexpresión de WT1 incluyen enfermedades asociadas con EBV, tales como linfoma de Burkitt y cáncer nasofaríngeo (Spinsanti P. et al., Leuk. Lymphoma 38 (5-6): 611-9 (2000), "Wilms' tumor gene expression by normal y malignant human B lymphocytes".

En Leukemia 14 (9): 1634-4 (2000), Pan et al., describen el tratamiento con IL-12 in vitro de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con leucemia o síndromes mielodisplásicos y describieron un aumento en la citotoxicidad y una reducción en la expresión génica de WT1. En Leukemia 13 (6): 891-900 (1999), Patmasiriwat et al. describieron expresión de WT1 y GATA1 en el síndrome mielodisplásico y la leucemia aguda. En Leukemia 13 (3): 393-9 (1999), Tamaki et al., describieron que el gen del tumor de Wilms WT1 es un buen marcador para el diagnóstico del avance de la enfermedad de síndromes mielodisplásicos. La expresión del gen del tumor de Wilms WT1 en tumores sólidos y su implicación en el desarrollo de células tumorales se analizó en relación con cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer pulmonar, líneas celulares de cáncer de mama, línea celular de tumor de células germinales, cáncer ovárico, el cáncer uterino, línea celular de cáncer de tiroides, carcinoma hepatocelular, en Oji et al., Jpn. J. Cancer Res. 90 (2): 194-204 (1999).

Las composiciones que se proporcionan en este documento pueden usarse en solitario o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales, tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado). Como se analiza en más detalle a continuación, pueden usarse agentes de unión y células T como se proporcionan en este documento para la purga de células madre autólogas. Dicha purga puede ser beneficiosa antes de, por ejemplo, un trasplante de médula ósea o transfusión de sangre o componentes de la misma. Pueden usarse adicionalmente agentes de unión, células T, células presentadoras de antígeno (APC) y composiciones proporcionadas en este documento para expandir y estimular (o sensibilizar) células T específicas de WT1 autólogas, alogénicas, singénicas o no relacionadas in vitro y/o in vivo. Dichas células T específicas de WT1 pueden usarse, por ejemplo, en infusiones de linfocitos de donante.

Las vías y frecuencia de administración, así como la dosificación, variarán de un individuo a otro y pueden establecerse fácilmente usando técnicas convencionales. En general, las composiciones farmacéuticas y vacunas pueden administrarse mediante inyección (por ejemplo, intracutánea, intramuscular, intravenosa o subcutánea), por vía intranasal (por ejemplo, por aspiración) o por vía oral. En algunos tumores, las composiciones farmacéuticas o vacunas pueden administrarse localmente (por ejemplo, mediante rectocoloscopia, gastroscopia, videoendoscopia, angiografía u otros métodos conocidos en la técnica). Preferiblemente, pueden administrarse entre 1 y10 dosis a lo largo de un periodo de 52 semanas. Preferiblemente, se administran 6 dosis a intervalos de 1 mes y pueden administrarse vacunaciones de refuerzo periódicamente después de eso. Pueden ser apropiados protocolos alternativos para pacientes individuales. Una dosis adecuada es una cantidad de un compuesto que, cuando se administra como se ha descrito anteriormente, es capaz de promover una respuesta inmune antitumoral que esté al menos 10-50% por encima del nivel basal (es decir, sin tratar). Dicha respuesta puede controlarse midiendo los anticuerpos anti-tumorales en un paciente o por generación dependiente de vacuna de células efectoras citolíticas capaces de destruir las células tumorales del paciente in vitro. Dichas vacunas también deberían ser capaces de causar una respuesta inmune que conduzca a un desenlace clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes o supervivencia sin enfermedad y/o global más prolongada) en pacientes vacunados en comparación con pacientes no vacunados. En general, para composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden uno o más polipéptidos, la cantidad de cada polipéptido presente en un intervalo de dosis de aproximadamente 100 \mug a 5 mg. Los tamaños de dosis adecuados variarán con el tamaño del paciente, pero típicamente variarán de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 5 ml.

En general, un régimen de dosificación y tratamiento apropiado proporciona el compuesto o compuestos activos en una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico y/o profiláctico. Dicha respuesta puede controlarse estableciendo un desenlace clínico mejorado (por ejemplo, remisiones completas o parciales más frecuentes o supervivencia sin enfermedad y/o global más prolongada) en pacientes tratados en comparación con pacientes sin tratar. Los aumentos en las respuestas inmunes preexistentes contra WT1 se correlacionan generalmente con un desenlace clínico mejorado. Dichas respuestas inmunes pueden evaluarse generalmente usando ensayos de proliferación, citotoxicidad o citoquinas convencionales que pueden realizarse usando muestras obtenidas de un paciente antes y después del tratamiento.

Dentro de ciertas realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia activa, en la que el tratamiento depende de la estimulación in vivo del sistema inmune endógeno del hospedador para reaccionar contra tumores con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmune (tales como polipéptidos y polinucleótidos que se proporcionan en este documento).

Dentro de otras realizaciones, la inmunoterapia puede ser una inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento implica el suministro de agentes con una reactividad inmune contra tumores establecida (tales como células efectoras o anticuerpos) que pueden mediar directa o indirectamente efectos antitumorales y que no dependen necesariamente de un sistema inmune intacto del hospedador. Los ejemplos de células efectoras incluyen células T, como se han analizado anteriormente, linfocitos T (tales como linfocitos T citotóxicos CD8^{+} y linfocitos infiltrantes de tumores auxiliares T CD4^{+}), células asesinas (tales como células asesinas naturales y células asesinas activadas por linfoquinas), células B y células presentadoras de antígeno (tales como células dendríticas y macrófagos) que expresan un polipéptido proporcionado en este documento. Los receptores de células T y receptores de anticuerpos específicos para los polipéptidos enumerados en este documento pueden clonarse, expresarse y transferirse a otros vectores o células efectoras para una inmunoterapia adoptiva. Los polipéptidos proporcionados en este documento también pueden usarse para generar anticuerpos o anticuerpos anti-idiotípicos (como se ha descrito anteriormente y en la Patente de Estados Unidos Nº 4.918.164) para una inmunoterapia pasiva.

Los anticuerpos monoclonales pueden marcarse con cualquiera de una diversidad de marcadores para usos selectivos deseados en la detección, ensayos de diagnóstico o aplicaciones terapéuticas (como se describen en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.090.365; 6.015.542; 5.843.398; 5.595.721; y 4.708.930). En cada caso, la unión del anticuerpo monoclonal marcado al sitio determinante del antígeno señalizará la detección o suministro de un agente terapéutico particular contra el determinante antigénico sobre la célula anormal. Un objeto adicional de esta invención es proporcionar el anticuerpo monoclonal específico convenientemente marcado para lograr dichos usos selectivos deseados del mismo.

Generalmente pueden obtenerse células efectoras en cantidades suficientes para una inmunoterapia adoptiva por cultivo in vitro como se describe en este documento. Las condiciones de cultivo para expandir células efectoras específicas de antígeno individuales hasta varios miles de millones en número con conservación del reconocimiento de antígenos in vivo son bien conocidas en la técnica. Dichas condiciones de cultivo in vitro usan típicamente una estimulación intermitente con antígeno, con frecuencia en presencia de citoquinas (tales como IL-2) y células alimentadoras que no están en división. Como se ha indicado anteriormente, pueden usarse polipéptidos inmunorreactivos como se proporcionan en este documento para expandir rápidamente cultivos de células T específicas de antígeno para generar un número suficiente de células para inmunoterapia. En particular, pueden estimularse células presentadoras de antígeno, tales como células dendríticas, macrófagos, monocitos, fibroblastos y/o células B con polipéptidos inmunorreactivos o transfectarse con uno o más polinucleótidos usando procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden transfectarse células presentadoras de antígeno con un polinucleótido que tenga un promotor apropiado para aumentar la expresión en un virus recombinante u otro sistema de expresión. Las células efectoras cultivadas para uso en terapia deben ser capaces de crecer y distribuirse ampliamente y de sobrevivir a largo plazo in vivo. Los estudios han demostrado que las células efectoras cultivadas pueden inducirse para crecimiento in vivo y para supervivencia a largo plazo en cantidades sustanciales mediante la estimulación repetida con antígeno complementada con IL-2 (véase, por ejemplo, Cheever et al., Immunological Reviews 157: 177, 1997).

Como alternativa, puede introducirse un vector que exprese un polipéptido enumerado en este documento en células presentadoras de antígeno obtenidas de un paciente y propagadas clonalmente ex vivo para el trasplante de nuevo en el mismo paciente. Pueden reintroducirse células transfectadas en el paciente usando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril mediante administración intravenosa, intracavitaria, intraperitoneal o intratumoral.

Dentro de aspectos adicionales, los métodos para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna asociada con la expresión de WT1 implican la administración de células T autólogas que se hayan activado en respuesta a un polipéptido WT1 o APC que exprese WT1, como se ha descrito anteriormente. Dichas células T pueden ser CD4^{+} y/o CD8^{+} y pueden proliferar como se ha descrito anteriormente. Las células T pueden administrarse al individuo en una cantidad eficaz para inhibir el desarrollo de una enfermedad maligna. Típicamente, se administran por vía intravenosa, intracavitaria o en el lecho de un tumor resecado aproximadamente 1 x 10^{9} a 1 x 10^{11} células T/M^{2}. Será evidente para los especialistas en la técnica que el número de células y la frecuencia de administración dependerán de la respuesta del paciente.

Dentro de ciertas realizaciones, pueden estimularse células T antes de un trasplante de médula ósea autólogo. Dicha estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para la estimulación in vitro, pueden ponerse en contacto médula ósea y/o sangre periférica (o una fracción de médula ósea o sangre periférica) obtenidas de un paciente con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifique un polipéptido WT1 y/o una APC que exprese un polipéptido WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T como se ha descrito anteriormente. Después, pueden administrarse células madre de médula ósea, sangre periférica y/o células T específicas de WT1 a un paciente usando técnicas convencionales.

Dentro de realizaciones relacionadas, pueden estimularse células T de un donante relacionado o no relacionado antes de un trasplante singénico o alogénico (relacionado o no relacionado) de médula ósea. Dicha estimulación puede tener lugar in vivo o in vitro. Para la estimulación in vitro, pueden ponerse en contacto la médula ósea y/o la sangre periférica (o una fracción de médula ósea o sangre periférica) obtenidas de un donante relacionado o no relacionado con un polipéptido WT1, polinucleótido de WT1 y/o APC que exprese un polipéptido WT1 en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la estimulación de células T, como se ha descrito anteriormente. Después pueden administrarse a un paciente células madre de médula ósea, sangre periférica y/o células T específicas de WT1 usando técnicas convencionales.

Dentro de otras realizaciones, pueden usarse células T específicas de WT1, como se describen en este documento, para eliminar células que expresen WT1 de la médula ósea, sangre periférica o una fracción de médula ósea o sangre periférica autóloga (por ejemplo, sangre periférica (PB) enriquecida para CD34^{+} antes de la administración a un paciente). Dichos métodos pueden realizarse por contacto de la médula ósea o PB con dichas células T en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir la reducción de células que expresen WT1 hasta menos de 10%, preferiblemente menos del 5% y, más preferiblemente, menos de 1% del número total de células mieloides o linfáticas en la médula ósea o la sangre periférica. El grado en el que se han eliminado dichas células puede determinarse fácilmente mediante métodos convencionales tales como, por ejemplo, análisis de PCR cualitativa o cuantitativa, morfología, inmunohistoquímica y análisis de FACS. Después puede administrarse médula ósea o PB (o una fracción de las mismas) a un paciente usando técnicas convencionales.

Detección de Cáncer y Composiciones, Métodos y Kits de Diagnóstico

En general, puede detectarse un cáncer asociado con la expresión de WT1 en un paciente basándose en la presencia de una o más proteínas WT1 y/o polinucleótidos que codifican dichas proteínas en una muestra biológica (por ejemplo, sangre, sueros, esputo, orina y/o biopsias tumorales) obtenida del paciente. En otras palabras, dichas proteínas WT1 pueden usarse como marcadores para indicar la presencia o ausencia de un cáncer. Los agentes de unión proporcionados en este documento generalmente permiten la detección del nivel de antígeno que se une al agente en la muestra biológica.

Pueden usarse cebadores y sondas polinucleotídicos para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína WT1, que también es indicativo de la presencia o ausencia de un cáncer. En general, debería estar presente una secuencia de WT1 a un nivel que sea al menos dos veces, preferiblemente tres veces y, más preferiblemente, cinco veces o más en tejido tumoral que en tejido normal del mismo tipo del que surgió el tumor. Los niveles de expresión de WT1 en tipos tisulares diferentes de aquel en el que surgió el tumor son irrelevantes en ciertas realizaciones de diagnóstico, puesto que la presencia de células tumorales puede confirmarse por observación de niveles de expresión diferenciales predeterminados, por ejemplo, de 2 veces, 5 veces, etc., en tejido tumoral respecto a niveles de expresión en tejido normal del mismo tipo.

Pueden utilizarse ventajosamente otros patrones de expresión diferencial para fines de diagnóstico. Por ejemplo, en un aspecto de la invención, la sobreexpresión de secuencia de WT1 en tejido tumoral y tejido normal del mismo tipo, pero no en otros tipos tisulares normales, por ejemplo, PBMC, puede aprovecharse diagnósticamente. En este caso, la presencia de células tumorales metastásicas, por ejemplo, en una muestra tomada de la circulación o algún otro sitio tisular diferente de aquel en el que surgió el tumor, puede identificarse y/o confirmarse detectando la expresión de la secuencia tumoral en la muestra, por ejemplo, usando análisis de RT-PCR. En muchos casos, se deseará enriquecer para células tumorales la muestra de interés, por ejemplo, PBMC, usando captura celular y otras técnicas
similares.

Existen una diversidad de formatos de ensayo conocidos por los especialistas en la técnica para el uso de un agente de unión para detectar marcadores de polipéptido WT1 en una muestra. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, la presencia o ausencia de un cáncer asociado con WT1 en un paciente puede determinarse por (a) contacto de una muestra biológica obtenida de un paciente con un agente de unión; (b) detección en la muestra de un nivel de polipéptido WT1 que se une al agente de unión; y (c) comparación del nivel de polipéptido WT1 con un valor de corte predeterminado.

En una realización preferida, el ensayo implica el uso de un agente de unión inmovilizado en un soporte sólido para unirse a y eliminar el polipéptido WT1 del resto de la muestra. El polipéptido WT1 unido puede detectarse después usando un reactivo de detección que contiene un grupo indicador y que se une específicamente al complejo de agente de unión/polipéptido WT1. Dichos reactivos de detección pueden comprender, por ejemplo, un agente de unión que se une específicamente a un polipéptido WT1 o un anticuerpo u otro agente que se une específicamente al agente de unión, tal como una anti-inmunoglobulina, proteína G, proteína A o una lectina. Como alternativa, puede utilizarse un ensayo competitivo, en el que un polipéptido WT1 se marca con un grupo indicador y se deja que se una al agente de unión inmovilizado después de la incubación del agente de unión con la muestra. El grado en el que los componentes de la muestra inhiben la unión del polipéptido WT1 marcado con el agente de unión es indicativo de la reactividad de la muestra con el agente de unión inmovilizado. Los polipéptidos adecuados para el uso dentro de dichos ensayos incluyen proteínas WT1 de longitud completa y porciones polipeptídicas de las mismas a las que se une el agente de unión, como se ha descrito anteriormente.

El soporte sólido puede ser cualquier material conocido por los especialistas en la técnica al que pueda unirse la proteína WT1. Por ejemplo, el soporte sólido puede ser un pocillo de ensayo en una placa de microtitulación o una membrana de nitrocelulosa u otra membrana adecuada. Como alternativa, el soporte puede ser una perla o disco, tal como un material de vidrio, fibra de vidrio, látex o plástico tal como poliestireno o cloruro de polivinilo. El soporte también puede ser una partícula magnética o un detector de fibra óptica, tal como los descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.359.681. El agente de unión puede inmovilizarse sobre el soporte sólido usando una diversidad de procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica, que están ampliamente descritos en la bibliografía de patentes y científica. En el contexto de la presente invención, el término "inmovilización" se refiere tanto a una asociación no covalente, tal como adsorción, como a una unión covalente (que puede ser un enlace directo entre el agente y grupos funcionales en el soporte o puede ser un enlace por medio de un agente entrecruzante). Se prefiere la inmovilización por adsorción a un pocillo en una placa de microtitulación o una membrana. En dichos casos, la adsorción puede conseguirse por contacto del agente de unión, en un tampón adecuado, con el soporte sólido durante una cantidad de tiempo adecuada. El tiempo de contacto varía con la temperatura, pero típicamente es de entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 1 día. En general, el contacto de un pocillo de una placa de microtitulación de plástico (tal como poliestireno o cloruro de polivinilo) con una cantidad de agente de unión que varía de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 \mug y, preferiblemente de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 \mug, es suficiente para inmovilizar una cantidad adecuada de agente de unión.

La unión covalente de agente de unión a un soporte sólido puede conseguirse generalmente haciendo reaccionar primero el soporte con un reactivo bifuncional que reaccionará tanto con el soporte como con un grupo funcional, tal como un grupo hidroxilo o amino, sobre el agente de unión. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse covalentemente a soportes que tengan un recubrimiento polimérico apropiado usando benzoquinona o por condensación de un grupo aldehído en el soporte con una amina y un hidrógeno activo en el compañero de unión (véase, por ejemplo, Pierce Immunotechnology Catalog y Handbook, 1991, en A12-A13).

En ciertas realizaciones, el ensayo es un ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos. Este ensayo puede realizarse poniendo primero en contacto un anticuerpo que se ha inmovilizado en un soporte sólido, comúnmente el pocillo de una placa de microtitulación, con la muestra, de modo que se permita que los polipéptidos WT1 dentro de la muestra se unan al anticuerpo inmovilizado. Después se elimina la muestra no unida de los complejos polipéptido-anticuerpo inmovilizados y se añade un reactivo de detección (preferiblemente un segundo anticuerpo capaz de unirse a un sitio diferente en el polipéptido) que contiene un grupo indicador. Después se determina la cantidad de reactivo de detección que permanece unido al soporte sólido usando un método apropiado para el grupo indicador específico.

Más específicamente, una vez que se inmoviliza el anticuerpo en el soporte como se ha descrito anteriormente, típicamente se bloquean los sitios de unión a proteínas restantes en el soporte. Cualquier agente bloqueante adecuado conocido por los especialistas en la técnica, tal como albúmina sérica bovina o Tween 20^{TM} (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Después, el anticuerpo inmovilizado se incuba con la muestra y se deja que el polipéptido se una al anticuerpo. La muestra puede diluirse con un diluyente adecuado, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de la incubación. En general, un tiempo de contacto apropiado (es decir, tiempo de incubación) es un periodo de tiempo que es suficiente para detectar la presencia de polipéptido WT1 dentro de una muestra obtenida de un individuo con un cáncer asociado con WT1 al menos aproximadamente 95% del alcanzado en el equilibrio entre polipéptido unido y no unido. Los especialistas en la técnica reconocerán que el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio puede determinarse fácilmente mediante ensayo del nivel de unión que se produce a lo largo de un periodo de tiempo. A temperatura ambiente, generalmente es suficiente un tiempo de incubación de aproximadamente 30 minutos.

Después puede eliminarse la muestra no unida por lavado del soporte sólido con un tampón apropiado, tal como PBS que contiene Tween 20^{TM} a 0,1%. El segundo anticuerpo que contiene un grupo indicador, puede añadirse después al soporte sólido. Los grupos indicadores preferidos incluyen los grupos enumerados anteriormente.

Después, el reactivo de detección se incuba con el complejo anticuerpo-polipéptido inmovilizado durante una cantidad de tiempo suficiente para detectar el polipéptido unido. Generalmente puede determinarse una cantidad de tiempo apropiada por ensayo del nivel de unión que se produce durante un periodo de tiempo. Después, se elimina el reactivo de detección no unido y se detecta el reactivo de detección unido usando el grupo indicador. El método empleado para detectar el grupo indicador depende de la naturaleza del grupo indicador. Para grupos radiactivos, generalmente son apropiados métodos de recuento de centelleo o autorradiográficos. Pueden usarse métodos espectroscópicos para detectar colorantes, grupos luminiscentes y grupos fluorescentes. Puede detectarse biotina usando avidina, acoplada a un grupo indicador diferente (comúnmente un grupo radiactivo o fluorescente o una enzima). Generalmente pueden detectarse grupos indicadores enzimáticos mediante la adición de sustrato (generalmente durante un periodo de tiempo específico) seguido de análisis espectroscópico o de otro tipo de los productos de reacción.

Para determinar la presencia o ausencia de un cáncer asociado con expresión de WT1, la señal detectada a partir del grupo indicador que permanece unida al soporte sólido se compara generalmente con una señal que se corresponde con un valor de corte predeterminado. En una realización preferida, el valor de corte para la detección de un cáncer asociado con WT1 es la señal media promedio obtenida cuando el anticuerpo inmovilizado se incuba con muestras de pacientes sin el cáncer. En general, una muestra que genera una señal que está tres desviaciones típicas por encima del valor de corte predeterminado se considera positiva para el cáncer. En una realización preferida alternativa, el valor de corte se determina usando una Curva Receptor Operador de acuerdo con el método de Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown y Co., 1985, págs. 106-7. En resumen, en esta realización, el valor de corte puede determinarse a partir de una representación de parejas de índices de verdaderos positivos (es decir, sensibilidad) e índices de falsos positivos (especificidad del 100%) que se corresponden con cada valor de corte posible para el resultado del ensayo de diagnóstico. El valor de corte en la representación que está más próximo a la esquina superior izquierda (es decir, el valor que incluye el área más amplia) es el valor de corte más exacto y una muestra que genere una señal que sea superior que el valor de corte determinado por este método puede considerarse positiva. Como alternativa, el valor de corte puede desplazarse a la izquierda a lo largo de la representación para minimizar el índice de falsos positivos, o hacia la derecha para minimizar el índice de falsos negativos. En general, una muestra que genere una señal que sea superior al valor de corte determinado por este método se considera positiva para un cáncer.

En una realización relacionada, el ensayo se realiza en un formato de ensayo de flujo a través o de tiras, en el que el agente de unión se inmoviliza en una membrana, tal como de nitrocelulosa. En el ensayo de flujo a través, los polipéptidos dentro de la muestra se unen al agente de unión inmovilizado a medida que la muestra pasa a través de la membrana. Después, un segundo agente de unión marcado se une al complejo de agente de unión-polipéptido a medida que una solución que contiene el segundo agente de unión fluye a través de la membrana. La detección del segundo agente de unión unido puede realizarse después como se ha descrito anteriormente. En el formato de ensayo de tiras, un extremo de la membrana a la que está unida el agente de unión se sumerge en una solución que contiene la muestra. La muestra migra a lo largo de la membrana a través de una región que contiene el segundo agente de unión y hacia el área de agente de unión inmovilizado. La concentración del segundo agente de unión en el área de anticuerpo inmovilizado indica la presencia de un cáncer. Típicamente, la concentración del segundo agente de unión en ese sitio genera un patrón, tal como una línea, que puede interpretarse visualmente. La ausencia de dicho patrón indica un resultado negativo. En general, la cantidad de agente de unión inmovilizado en la membrana se selecciona para generar un patrón visualmente discernible cuando la muestra biológica contiene un nivel de polipéptido que sería suficiente para generar una señal positiva en el ensayo de tipo sándwich de dos anticuerpos, en el formato analizado anteriormente. Son agentes de unión preferidos para el uso en dichos ensayos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Preferiblemente, la cantidad de anticuerpo inmovilizado en la membrana varía de aproximadamente 25 ng a aproximadamente 1 \mug y, más preferiblemente, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 500 ng. Dichos ensayos pueden realizarse típicamente con una cantidad muy pequeña de muestra biológica.

Por supuesto, existen numerosos otros protocolos de ensayo que son adecuados para el uso con las proteínas WT1 o agentes de unión de la presente invención. Las descripciones anteriores pretenden ser solamente ejemplares. Por ejemplo, será evidente para los especialistas en la técnica que los protocolos anteriores pueden modificarse fácilmente para usar polipéptidos tumorales para detectar anticuerpos que se unen a dichos polipéptidos en una muestra biológica. La detección de dichos anticuerpos específicos de WT1 puede correlacionarse con la presencia de un cáncer asociado con la expresión de WT1.

También, o como alternativa, puede detectarse un cáncer asociado con la expresión de WT1 basándose en la presencia de células T que reaccionen específicamente con una proteína tumoral en una muestra biológica. Dentro de ciertos métodos, se incuba una muestra biológica que comprende células T CD4^{+} y/o CD8^{+} aisladas de un paciente con un polipéptido WT1, un polinucleótido que codifica dicho polipéptido y/o una APC que expresa al menos una porción inmunógena de dicho polipéptido y se detecta la presencia o ausencia de activación específica de las células T. Las muestras biológicas adecuadas incluyen, pero sin limitación, células T aisladas. Por ejemplo, pueden aislarse células T de un paciente mediante técnicas de rutina (tales como mediante centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll/Hypaque de linfocitos de sangre periférica). Pueden incubarse células T in vitro durante 2-9 días, (típicamente 4 días) a 37ºC con el polipéptido (por ejemplo, 5-25 \mug/ml). Puede ser deseable incubar otra alícuota de una muestra de células T en ausencia de polipéptido WT1 para servir como control. Para células CD4^{+}, la activación se detecta preferiblemente por evaluación de la proliferación de las células T. Para células T CD8^{+}, la activación se detecta preferiblemente por evaluación de la actividad citolítica. Un nivel de proliferación que es al menos dos veces superior y/o un nivel de actividad citolítica es al menos 20% superior que en pacientes sin enfermedad indica la presencia de un cáncer asociado con la expresión de WT1 en el paciente.

Como se ha indicado anteriormente, también, o como alternativa, puede detectarse un cáncer basándose en el nivel de ARNm que codifica una proteína WT1 en una muestra biológica. Por ejemplo, pueden emplearse al menos dos cebadores oligonucleotídicos en un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una porción de un ADNc de WT1 obtenido de una muestra biológica, en el que al menos uno de los cebadores oligonucleotídicos es específico para (es decir, hibrida con) un polinucleótido que codifica la proteína WT1. Después, el ADNc amplificado se separa y se detecta usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel.

De forma similar, pueden usarse sondas oligonucleotídicas que hibridan específicamente con un polinucleótido que codifica una proteína WT1 en un ensayo de hibridación para detectar la presencia de un polinucleótido que codifica la proteína WT1 en una muestra biológica.

\newpage

Para permitir la hibridación en condiciones de ensayo, los cebadores y sondas oligonucleotídicas deberían comprender una secuencia oligonucleotídica que tenga una identidad de al menos aproximadamente 60%, preferiblemente de al menos aproximadamente 75% y, más preferiblemente, de al menos aproximadamente 90% con una porción de un polinucleótido que codifica una proteína WT1 de la invención que es de al menos 10 nucleótidos, y preferiblemente de al menos 20 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, los cebadores y/o sondas oligonucleotídicas hibridan con un polinucleótido que codifica un polipéptido descrito en este documento en condiciones moderadamente rigurosas, como se han definido anteriormente. Los cebadores y/o sondas oligonucleotídicas que pueden emplearse provechosamente en los métodos de diagnóstico descritos en este documento son preferiblemente de al menos 10-40 nucleótidos de longitud. En una realización preferida, los cebadores oligonucleotídicos comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos contiguos de una molécula de ADN que tiene una secuencia como se describe en este documento. Son bien conocidos en la técnica procedimientos para tanto ensayos basados en PCR como ensayos de hibridación (véase, por ejemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant, Biol., 51: 263, 1987; Erlich ed., PCR, Technology, Stockton Press, NY, 1989).

Un ensayo preferido emplea una RT-PCR, en el que se aplica una PCR junto con una transcripción inversa. Típicamente, se extrae el ARN de una muestra biológica, tal como un tejido de biopsia y se realiza una transcripción inversa para producir moléculas de ADNc. La amplificación por PCR usando al menos un cebador específico genera una molécula de ADNc, que puede separarse y visualizarse usando, por ejemplo, electroforesis en gel. La amplificación puede realizarse en muestras biológicas obtenidas de un paciente de ensayo y de un individuo que no esté aquejado de un cáncer. La reacción de amplificación puede realizarse en varias diluciones de ADNc que abarquen dos órdenes de magnitud. Un aumento de dos veces o superior en la expresión en varias diluciones de la muestra del paciente de ensayo en comparación con las mismas diluciones de la muestra no cancerosa se considera típicamente positivo.

En otro aspecto de la presente invención, pueden usarse tecnologías de captura celular junto con, por ejemplo, PCR a tiempo real para proporcionar una herramienta más sensible para la detección de células metastásicas que expresen antígenos WT1. La detección de células cancerosas asociadas a WT1 en muestras biológicas, por ejemplo, muestras de médula ósea, sangre periférica y muestras de aspiración con aguja fina, es deseable para el diagnóstico y el pronóstico en pacientes con cáncer asociados con la expresión de WT1.

Pueden usarse perlas inmunomagnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales específicos para marcadores de superficie celular, o complejos de anticuerpos tetraméricos para enriquecer primero o seleccionar positivamente células cancerosas en una muestra. Pueden usarse diversos kits disponibles en el mercado, incluyendo Dynabeads® Epithelial Enrich (Dynal Biotech, Oslo, Noruega), StemSep^{TM} (StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC) y RosetteSep (StemCell Technologies). Un especialista reconocerá que también pueden usarse otras metodologías y kits para enriquecer o seleccionar positivamente poblaciones celulares deseadas. El Dynabeads® Epithelial Enrich contiene perlas magnéticas recubiertas con mAb específicos para dos antígenos de glicoproteínas de membrana expresados en tejidos epiteliales normales y neoplásicos. Las perlas recubiertas pueden añadirse a una muestra y después aplicarse la muestra a un imán, capturando de este modo las células unidas a las perlas. Las células no deseadas se retiran por lavado y las células aisladas magnéticamente se eluyen de las perlas y se usan en análisis adicionales.

Puede usarse el RosetteSep para enriquecer células directamente a partir de una muestra de sangre y consiste en un combinado de anticuerpo tetraméricos que se dirige a una diversidad de células no deseadas y las entrecruza con glicoforina A en eritrocitos (RBC) presentes en la muestra, formando rosetas. Cuando se centrifuga sobre Ficoll, las células diana se sedimentan junto con los RBC libres. La combinación de anticuerpos en el combinado de reducción determina qué células se eliminarán y, por consiguiente, qué células se recuperarán. Los anticuerpos que están disponibles incluyen, pero sin limitación: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE y TCR\alpha\beta.

En otra realización, las composiciones descritas en este documento pueden usarse como marcadores para la evolución del cáncer. En esta realización, los ensayos como se han descrito anteriormente para el diagnóstico de un cáncer asociado con la expresión de WT1 pueden realizarse a lo largo del tiempo, y evaluarse el cambio a nivel de polipéptido o polipéptidos o polinucleótido o polinucleótidos reactivos. Por ejemplo, los ensayos pueden realizarse cada 24-72 horas durante un periodo de 6 meses a 1 año, y después de eso realizarse según sea necesario. En general, un cáncer está avanzando en los pacientes en los que el nivel de polipéptido o polinucleótido de WT1 detectado aumenta con el tiempo. Por el contrario, el cáncer no está avanzando cuando el nivel de polipéptido o polinucleótido reactivo permanece constante o disminuye con el tiempo.

Pueden realizarse ciertos ensayos de diagnóstico in vivo directamente en un tumor. Un ensayo de este tipo implica poner en contacto células tumorales con un agente de unión. El agente de unión unido puede detectarse después directamente o indirectamente mediante un grupo indicador. Dichos agentes de unión también pueden usarse en aplicaciones histológicas. Como alternativa, pueden usarse sondas polinucleotídicas dentro de dichas aplicaciones.

La presente invención proporciona además kits para el uso dentro de cualquiera de los métodos de diagnóstico anteriores. Dichos kits comprenden típicamente dos o más componentes necesarios para realizar un ensayo de diagnóstico. Los componentes pueden ser compuestos, reactivos, recipientes y/o equipamiento. Por ejemplo, un recipiente dentro de un kit puede contener un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que se une específicamente a una proteína WT1. Dichos anticuerpos o fragmentos pueden proporcionarse unidos a un material de soporte, como se ha descrito anteriormente. Uno o más recipientes adicionales pueden incluir elementos, tales como reactivos o tampones, para usarse en el ensayo. Dichos kits también, o como alternativa, pueden contener un reactivo de detección como se ha descrito anteriormente que contenga un grupo indicador adecuado para la detección directa o indirecta de la unión de anticuerpo.

Como alternativa, puede diseñarse un kit para detectar el nivel de ARNm que codifica una proteína WT1 en una muestra biológica. Dichos kits comprenden generalmente al menos una sonda o cebador oligonucleotídico, como se ha descrito anteriormente que hibrida con un polinucleótido que codifica una proteína WT1. Dicho oligonucleótido puede usarse, por ejemplo, en un ensayo de PCR o de hibridación. Los componentes adicionales que pueden estar presentes dentro de dichos kits incluyen un segundo oligonucleótido y/o un reactivo de diagnóstico o recipiente para facilitar la detección de un polinucleótido que codifica una proteína WT1.

Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación de una respuesta inmune contra WT1 en pacientes con neoplasias hematológicas

Este Ejemplo ilustra la identificación de una respuesta inmune existente en pacientes con una neoplasia hematológica.

Para evaluar la presencia de respuestas de anticuerpos específicos para WT1 preexistentes en pacientes, se analizaron sueros de pacientes con leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica agua (ALL), leucemia mielógena crónica (CML) y anemia aplásica grave usando análisis de transferencia de Western. Se ensayaron sueros para determinar la capacidad para inmunoprecipitar WT1 de la línea celular leucémica humana K562 (Colección Americana de Cultivos Tipo, Manassas, VA). En cada caso, se separaron los inmunoprecipitados mediante electroforesis en gel, se transfirieron a una membrana y se sondaron con el anticuerpo anti-WT1 WT180 (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, CA). Este análisis de transferencia Western identificaba anticuerpos específicos de WT1 potenciales en pacientes con una neoplasia hematológica. Se muestra una transferencia de Western representativa que muestra los resultados para un paciente con AML en la Figura 2. Se reconoció una proteína de 52 kD en el inmunoprecipitado generado usando los sueros de pacientes mediante el anticuerpo específico de WT1. La proteína de 52 kD migraba al mismo tamaño que el control positivo.

Estudios adicionales analizaron los sueros de pacientes con AML y CML para determinar la presencia de anticuerpos contra proteínas WT1 de longitud completa y truncadas. Se subclonaron construcciones de ADNc que representaban la WT1/longitud completa humana (aminoácidos 1-449), la región del extremo N-terminal (aminoácidos 1-249) (WT1/extremo N-terminal) y del extremo C-terminal (aminoácidos 267-449) (WT1/extremo C-terminal) en vectores pET28 modificados. Las proteínas WT1/longitud completa y WT1/extremo N-terminal se expresaron como proteínas de fusión con Ral2. Ral2 es el fragmento C-terminal de una proteína de Mycobacterium tuberculosis secretada, indicada como MTB32B (Skeiky et al., Infect Immun. 67; 3998, 1999). La región de fusión de Ra12-WT1/longitud completa se clonó 3' a un marcador de histidina en un vector pET28 modificado con un marcador de histidina. La región WT1/extremo N-terminal se subclonó en un vector pET28 modificado que tiene un marcador de histidina 5', seguido de la región de fusión de tiorredoxina (TRX)-WT1/extremo N-terminal, seguida de un marcador de histidina 3'. La región codificante de WT1/extremo C-terminal se subclonó en un vector pET28 modificado sin un compañero de fusión, que contenía solamente el marcador de histidina 5' y 3', seguido de un sitio de trombina y EK.

Se transformaron E. coli BL21 pLysS (Stratagene, La Jolla, CA) con las tres construcciones de expresión de WT1, se cultivaron durante una noche y se indujeron con isopropil-\beta-D-tiogalactósido (IPTG). Se purificaron proteínas WT1 de la forma siguiente: se recogieron células y se lisaron por incubación en Tris 10 mM, pH 8,0 con Comprimidos Inhibidores de Proteasas Complete (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianápolis, IN) a 37ºC seguida de rondas repetidas de sonicación. Se lavaron dos veces los cuerpos de inclusión con Tris 10 mM, pH 8,0. Después se purificaron las proteínas mediante cromatografía de afinidad de quelato metálico sobre resina de níquel-ácido nitrilotriacético (QIAGEN Inc., Valencia, CA; Hochuli et al., Biologically Active Molecules: 217, 1989), seguida de cromatografía en una resina de intercambio aniónico Source Q (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Suecia). La identidad de las proteínas WT1 se confirmó mediante secuenciación N-terminal.

Se estudiaron sueros de pacientes adultos con AML o CML de novo para determinar la presencia de Ab específicos de WT1. Se adsorbieron proteínas recombinantes en placas de micropocillos TC (Nunc, Roskilde, Dinamarca). Las placas se lavaron con PBS/Tween 20 a 0,5% y se bloquearon con BSA a 1%/PBS/Tween 20 a 0,1%. Después del lavado, se añadieron diluciones de suero y se incubaron durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron y se añadió un anticuerpo secundario de burro anti-IgG humana con HRP (Jackson-Immunochem, West Grove, PA) y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron, se incubaron con solución sustrato de TMB Peroxidasa (Kirkegaard y Perry Laboratories, MA), se inactivó con H_{2}SO_{4} 1 N y se leyeron inmediatamente (Cyto-Fluor 2350; Millipore, Bedford, MA).

\newpage

Para el estudio serológico, se ensayaron sueros humanos mediante ELISA a lo largo de un intervalo de diluciones seriadas de 1:50 a 1:20.000. Se definió una reacción positiva como un valor de DO de un suero diluido 1:500 que superaba el valor de DO medio de sueros de donantes normales (n = 96) en tres desviaciones típicas (WT1/longitud completa, WT1/extremo C-terminal). Debido a un mayor fondo en donantes normales para la proteína WT1/extremo N-terminal, se definió una reacción positiva contra WT1/extremo N-terminal como un valor de DO de un suero diluido 1:500 que superaba el valor de DO medio de sueros de donantes normales en cuatro desviaciones típicas. Para verificar que la respuesta de Ab del paciente se dirigía contra WT1 y no contra la parte de fusión con Ra12 o TRX de la proteína o posibles proteínas contaminantes de E. coli, los controles incluían la proteína Ra12 y TRX purificada en solitario de una forma similar. Las muestras que mostraban reactividad contra las proteínas Ra12 y/o TRX se excluyeron del análisis.

Para evaluar la presencia de inmunidad contra WT1, se determinaron los Ab contra proteínas WT1 recombinantes de longitud completa y truncadas en los sueros de individuos normales y pacientes con leucemia. Se analizó la reactividad de anticuerpos mediante la reactividad de ELISA contra proteína WT1/longitud completa, proteína WT1/extremo N-terminal y proteína WT1/extremo C-terminal.

Sólo 2 de 96 donantes normales tenían anticuerpos séricos reactivos con proteína WT1/longitud completa (Figura 18). Uno de los individuos tenía anticuerpos contra proteína WT1/extremo N-terminal y uno tenía anticuerpos contra proteína WT1/extremo C-terminal. Por el contrario, 16 de 63 pacientes (25%) con AML tenían anticuerpos séricos reactivos con proteína WT1/longitud completa. Notablemente por el contrario, sólo 2 de 63 pacientes (3%) tenían reactividad contra proteína WT1/extremo C-terminal. Quince de 81 pacientes (19%) con CML tenían anticuerpos séricos reactivos con proteína WT1/longitud completa y 12 de 81 pacientes (15%) tenían anticuerpos séricos reactivos con WT1/extremo N-terminal. Sólo 3 de 81 pacientes (3%) tenían reactividad contra proteína WT1/extremo C-terminal. (Figuras 16 y 17).

Estos datos demuestran que son detectables respuestas de Ab contra WT1 en algunos pacientes con AML y CML. La mayor incidencia de anticuerpos en pacientes con leucemia proporciona fuertes evidencias de que la inmunización contra la proteína WT1 se producía como resultado de pacientes que llevan tumores malignos que expresan o en algún momento expresaban WT1. Sin limitarse a una teoría específica, se piensa que las respuestas de anticuerpos observadas contra WT1 son más probablemente el resultado de pacientes que se están volviendo inmunes contra WT1 en sus propias células de leucemia y proporcionan pruebas directas de que WT1 puede ser inmunógena a pesar de ser una proteína propia.

La presencia de anticuerpos contra WT1 implica claramente que también están presentes respuestas de células T auxiliares concurrentes en los mismos pacientes. WT1 es una proteína interna. Por lo tanto, es probable que las respuestas de CTL sean las más eficaces en términos de terapia de leucemia y el brazo más tóxico de la inmunidad. Por lo tanto, estos datos proporcionan pruebas de que las vacunas terapéuticas dirigidas contra WT1 serán capaces de generar una respuesta inmune contra WT1.

La mayoría de los anticuerpos detectados eran reactivos con epítopos dentro del extremo N-terminal, mientras que sólo un pequeño subgrupo de pacientes mostraba una débil respuesta de anticuerpos contra el extremo C-terminal. Esto concuerda con las observaciones en el modelo animal, en el que la inmunización con péptidos procedentes del extremo N-terminal generaba respuestas de anticuerpos, células T auxiliares y CTL, mientras que ninguno de los péptidos ensayados del extremo C-terminal generaba respuestas de anticuerpos o células T (Gaiger et al., Blood 96: 1334, 2000).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Inducción de anticuerpos contra WT1 en ratones inmunizados con líneas celulares que expresan WT1

Este Ejemplo ilustra el uso de células que expresan WT1 para inducir una respuesta de anticuerpos específicos de WT1 in vivo.

La detección de anticuerpos existentes contra WT1 en pacientes con leucemia implicaba claramente que es posible inmunizar contra proteína WT1 para generar inmunidad contra WT1. Para ensayar si la inmunidad contra WT1 puede generarse por vacunación, se inyectó TRAMP-C, una línea celular tumoral positiva para WT1 de origen de B6, a ratones. En resumen, se inmunizaron ratones B6 macho con 5 x 10^{6} células TRAMP-C por vía subcutánea y se reforzaron dos veces con células 5 x 10^{6} a intervalos de tres semanas. Tres semanas después de la última inmunización, se obtuvieron sueros y se prepararon suspensiones de una sola célula de bazos en medio RPMI 1640 (GIBCO) con \beta-2-mercaptoetanol 25 \muM, 200 unidades de penicilina por ml, L-glutamina 10 mM y suero fetal bovino a 10%.

Después de la inmunización contra TRAMP-C, era detectable una respuesta de anticuerpos específicos de WT1 en los animales inmunizados. Se muestra una transferencia de Western representativa en la Figura 3. Estos resultados muestran que la inmunización contra proteína WT1 puede generar una respuesta inmune contra proteína WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3 Inducción de respuestas TH y de anticuerpos en ratones inmunizados con péptidos WT1

Este Ejemplo ilustra la capacidad de la inmunización con péptidos WT1 para generar una respuesta inmune específica para WT1.

Se identificaron péptidos adecuados para generar respuestas de Ab y células T proliferativas de acuerdo con el programa Tsites (Rothbard y Tailer, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tengan el potencial de generar respuestas Th. Se sintetizaron y secuenciaron los péptidos que se muestran en la Tabla I.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA I

1

\newpage

Para la inmunización, los péptidos se agruparon de la forma siguiente:

Grupo A:

p-6-22 humano: 10,9 mg en 1 ml (10 \mul = 100 \mug)

\quad

p-177-139 humano/ratón: 7,6 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad

p244-262 humano: 4,6 mg en 1 ml (22 \mul = 100 \mug)

Grupo B:

P287-301 humano/ratón: 7,2 mg en 1 ml (14 \mul = 100 \mug)

\quad

p299-313 de ratón: 6,6 mg en 1 ml (15 \mul = 100 \mug)

\quad

P241-435 humano/ratón: 3,3 mg en 1 ml (30 \mul = 100 \mug)

Control:

(péptido FBL 100 \mug) + CFA/IFA

Control:

(péptido CD45 100 \mug) + CFA/IFA

El Grupo A contenía péptido presentes en la porción amino-terminal de WT1 (exón 1) y el Grupo B contenía péptidos presentes en el extremo carboxi-terminal, que contiene una región de cuatro dedos de cinc con homología de secuencia con otras proteínas de unión a ADN. Dentro del grupo B, p287-301 y p299-313 procedían del exón 7, dedo de cinc 1 y p421-435 procedía del exón 10, dedo de cinc IV.

Se inmunizaron ratones B6 de un grupo de péptidos WT1 o con un péptido de control. Los péptidos se disolvieron en 1 ml de agua estéril para inyección y se inmunizaron ratones B6 3 veces a intervalos de tiempo de tres semanas. Los adyuvantes usados eran CFA/IFA, GM-CSF y Montanide. Después se determinó la presencia de anticuerpos específicos para WT1, como se describe en los Ejemplos 1 y 2, y se evaluaron las respuestas de células T proliferativas usando un ensayo de incorporación de timidina convencional en el que se cultivaron células en presencia de antígeno y se evaluó la proliferación por medición de la radiactividad incorporada (Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994). En particular, se cultivaron linfocitos en placas de 96 pocillos a 2 x 10^{5} células por pocillo con 4 x 10^{5} células de bazo singénicas irradiadas (3000 rads) y el péptido designado.

La inmunización de ratones con el grupo de péptidos designados como Grupo A generó una respuesta de anticuerpos contra WT1 (Figura 4). No se detectaron anticuerpos después de la inmunización contra Vacuna B, que concuerda con una ausencia de respuestas de células T auxiliares a partir de la inmunización con Vacuna B. P117-139 generaba respuestas de células T proliferativas (Figuras 5A-5C). Los índices de estimulación (SI) variaban entre 8 y 72. Se demostró también que otros péptidos (P6-22 y P299-313) generaban respuestas de células T proliferativas. La inmunización con P6-22 dada como resultado un índice de estimulación (SI) de 2,3 y la inmunización con P299-313 daba como resultado un SI de 3,3. Los controles positivos incluían células T estimuladas con ConA, así como células T estimuladas con antígenos conocidos, tales como CD45 y FBL y líneas de células T alogénicas (DeBrujin et al., Eur. J. Immunol. 21: 2963-2970, 1991).

Las Figuras 6A y 6B muestran la respuesta proliferativa observada para cada uno de los tres péptidos dentro de la vacuna A (Figura 6A) y de la vacuna B (Figura 6B). La vacuna A generaba respuestas de células T proliferativas contra los péptidos inmunizantes p6-22 y p117-139, con índices de estimulación (SI) que varían entre 3 y 8 (líneas gruesas). No se detectaron respuestas proliferativas contra p244-262 (Figura 6A).

Se llevaron a cabo estimulaciones in vitro posteriores como estimulaciones de un solo péptido usando solamente p6-22 y p117-139. La estimulación de la línea celular T específica de Vacuna A con p117-139 dio como resultado la proliferación contra p117-139, sin respuesta contra p6-22 (Figura 7A). Los clones derivados de la línea eran específicos para p117-139 (Figura 7B). Por el contrario, la estimulación de la línea celular T específica de Vacuna A con p6-22 dio como resultado la proliferación contra p6-22, sin respuesta contra p117-139 (Figura 7C). Los clones derivados de la línea eran específicos para p6-22 (Figura 7D).

Estos resultados muestran que la vacunación con péptidos WT1 puede generar respuestas de anticuerpos contra proteína WT1 y respuestas de células T proliferativas contra los péptidos inmunizantes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 4 Inducción de respuestas de CTL en ratones inmunizados con péptidos WT1

Este Ejemplo ilustra la capacidad de péptidos WT1 para generar inmunidad de CTL.

Se identificaron péptidos (nonámeros) con motivos apropiados para la unión a MHC clase I usando un análisis de predicción de la unión peptídica a HLA BIMAS (Parker et al., J. Immunol. 152: 163, 1994). Se muestran péptidos identificados dentro de dichos análisis en las Tablas II-XLIV. En cada una de estas tablas, la puntuación refleja la afinidad de unión teórica (semivida de disociación) del péptido con la molécula de MHC indicada. También se indican en las tablas los motivos de unión peptídicos definidos como se describen por Rammensee, et al., Immunogenetics 41: 178-228, 1995. El motivo de unión peptídico para HLA-B14 se describe en DiBrino et al., J. Biol. Chem. 269: 23462-23434, 1994, también incorporado en este documento en su totalidad. Las posiciones peptídicas se abrevian como P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8 y P9.

Los péptidos identificados usando el programa Tsites (Rotharbard y Taylor, EMBO, J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol 33: 145-155, 1996), que busca motivos peptídicos que tengan el potencial de generar respuestas Th se muestran adicionalmente en las Figuras 8A y 8B y en la Tabla XLV.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA II

3

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA III

6

7

TABLA IV

8

TABLA V

10

TABLA VI

11

TABLA VII

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA VIII

14

15

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IX

17

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA X

20

21

TABLA XI

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XII

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XIII

27

28

TABLA XIV

29

TABLA XV

31

TABLA XVI

32

TABLA XVII

33

TABLA XVIII

34

TABLA XIX

35

TABLA XX

36

TABLA XXI

37

TABLA XXII

38

TABLA XXIII

39

TABLA XXIV

40

TABLA XXV

41

TABLA XXVI

42

TABLA XXVII

43

TABLA XXVIII

44

TABLA XXIX

45

TABLA XXX

46

TABLA XXXI

47

TABLA XXXII

50

TABLA XXXIII

51

TABLA XXXIV

52

TABLA XXXV

54

TABLA XXXVI

56

TABLA XXXVII

58

TABLA XXXVIII

59

TABLA XXXIX

60

TABLA XL

61

TABLA XLI

62

TABLA XLII

63

TABLA XLIII

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XLIV

66

67

TABLA XLV

68

Se seleccionaron ciertos péptidos CTL (que se muestran en la Tabla XLVI) para un estudio adicional. Para cada péptido en la Tabla XLVI se proporcionan las puntuaciones obtenidas usando el análisis de predicción de la unión peptídica a HLA BIMAS.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA XLVI

69

70

Se confirmó la unión peptídica a MHC murino de C57BI/6 usando la línea celular de leucemia RMA-S como se describe por Ljunggren et al., Nature 346: 476-480, 1990. En resumen, se cultivaron células RMA-S durante 7 horas a 26ºC en medio completo complementado con FCS a 1%. Se añadieron un total de 10^{6} RMA-S a cada pocillo de una placa de 24 pocillos y se incubaron en solitario o con el péptido designado (25 \mug/ml) durante 16 horas a 26ºC y 3 horas adicionales a 37ºC en medio completo. Después, las células se lavaron tres veces y se tiñeron con anticuerpo anti-D^{b} o anti-K^{b} conjugado con isotiocianato de fluoresceína (PharMingen, San Diego, CA). Las células marcadas se lavaron dos veces, se resuspendieron y se fijaron en 500 \mul de PBS con paraformaldehído a 1% y se analizaron para determinar la intensidad de fluorescencia en un citómetro de flujo (Becton-Dickinson FACSCalibur®). El porcentaje de aumento de moléculas D^{b} o K^{b} en la superficie de las células RMA-S se midió mediante una intensidad fluorescente media aumentada de células incubadas con péptido en comparación con la de células incubada en medio
solamente.

Se inmunizaron ratones con los péptidos capaces de unirse a MHC clase I murino. Después de la inmunización, se estimularon células de bazo in vitro y se ensayaron para determinar la capacidad para lisar dianas incubadas con péptidos WT1. Se evaluaron CTL con un ensayo de liberación de cromo convencional (Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994). Se incubaron 10^{6} células diana a 37ºC como 150 \muCi de ^{51}Cr de sodio durante 90 minutos, en presencia o ausencia de péptidos específicos. Se lavaron células tres veces y se resuspendieron en RPMI con suero fetal bovino a 5%. Para el ensayo, se incubaron 10^{4} células diana marcadas con ^{51}Cr con diferentes concentraciones de células efectoras en un volumen final de 200 \mul en placas de 96 pocillos con fondo en U. Se eliminaron los sobrenadantes después de 4 a 7 horas a 37ºC y se determinó el porcentaje de lisis específica mediante la fórmula:

% lisis específica = 100 x (liberación experimental - liberación espontánea)/ (liberación máxima - liberación espontánea)

Los resultados que se presentan en la Tabla XLVII, muestran que algunos péptidos WT1 pueden unirse a moléculas de MHC clase I, que es esencial para generar CTL. Además, varios de los péptidos eran capaces de generar CTL específicos de péptido (Figuras 9A y 9B), como se determinó usando ensayos de liberación de cromo. Después de la inmunización contra péptidos CTL p10-18 humano, p136-144 humano, p136-144 de ratón y p235-243, se generaron líneas de CTL específicos de péptido y se establecieron clones. Estos resultados indican que los CTL específicos de péptido pueden destruir células malignas que expresen WT1.

TABLA XLVII

71

Ejemplo 5 Uso de un polipéptido WT1 para generar CTL específicos de WT1 en ratones

Este Ejemplo ilustra la capacidad de un polipéptido WT1 representativo para generar una inmunidad de CTL capaz de destruir líneas celulares tumorales positivas para WT1.

Se identificó el P117-139, un péptido con motivos apropiados para la unión a MHC clase I y clase II, como se ha descrito anteriormente usando análisis de predicción de la unión peptídica a HLA TSITES y BIMAS. Se inmunizaron ratones como se ha descrito en el Ejemplo 3. Después de la inmunización, se estimularon células de bazo in vitro y se ensayaron para determinar la capacidad para lisar dianas incubadas con péptidos WT1, así como células tumorales positivas y negativas para WT1. Se evaluaron CTL con un ensayo de liberación de cromo convencional. Los resultados que se presentan en las Figuras 10A-10D muestran que P117 puede generar CTL específicos de WT1 capaces de destruir células tumorales positivas para WT1, mientras que no se observó destrucción de células negativas para WT1. Estos resultados demuestran que los CTL específicos de péptido destruyen de hecho células malignas que expresan WT1 y que la vacuna y la terapia de células T son eficaces contra tumores malignos que expresen WT1.

Se realizaron inmunizaciones similares usando los péptidos de unión a MHC clase I nonaméricos p136-144, p225-233, p235-243, así como el péptido de 23 aminoácidos p117-139. Después de la inmunización, se estimularon células de bazo in vitro con cada uno de los 4 péptidos y se ensayaron para determinar la capacidad para lisar dianas incubadas con péptidos WT1. Se generaron CTL específicos para p136-144, p235-243 y p117-139, pero no para p225-233. Se presentan los datos de CTL para p235-243 y p117-139 en las Figuras 11A y 11B. Los datos para los péptidos p136-144 y p225-233 no están representados.

La lisis de CTL demanda que los péptidos WT1 diana se procesen endógenamente y se presenten en asociación con moléculas de MHC clase I de células tumorales. Los CTL específicos de péptido WT1 anteriores se ensayaron para determinar la capacidad para lisar líneas celulares tumorales positivas frente a negativas para WT1. Los CTL específicos para p235-243 lisaron dianas incubadas con los péptidos p235-243 pero no lisaron líneas celulares que expresaban proteínas WT1 (Figura 11A). Notablemente por el contrario, los CTL específicos para p117-139 lisaron dianas incubadas con péptidos p117-139 y también lisaron células malignas que expresaban WT1 (Figura 11B). Como control negativo, los CTL específicos para p117-139 no lisaron EL-4 negativas para WT1 (también denominadas en este documento E10).

La especificidad de la lisis específica de WT1 se confirmó mediante inhibición con diana fría (Figuras 12A-12B). Se sembraron en placas células efectoras para diversas proporciones de efector:diana en placas de fondo en U de 96 pocillos. Se añadió un exceso de diez veces (en comparación con la diana caliente) de la diana recubierta con el péptido indicado sin marcaje con ^{51}Cr. Por último, se añadieron 10^{4} células diana marcadas con ^{51}Cr y las placas se incubaron a 37ºC durante 4 horas. El volumen total por pocillo era de 200 \mul.

La lisis de TRAMP-C por CTL específicos de p117-139 se bloqueó de 58% a 36% por EL-4 incubadas con el péptido relevante p117-139, pero no con EL-4 incubadas con un péptido irrelevante (Figura 12A). De forma similar, la lisis de BLK-SV40 se bloqueó de 18% a 0% mediante EL-4 incubadas con el péptido relevante p117-139 (Figura 12B). Los resultados validan que los CTL específicos de péptido WT1 destruyen específicamente células malignas por reconocimiento de WT1 procesado.

Están contenidos varios segmentos con supuestos motivos de CTL en el interior de p117-139. Para determinar la secuencia exacta del epítopo de CTL se sintetizaron todos los péptidos nonaméricos potenciales en p117-139 (Tabla XLVIII). Se demostró que dos de estos péptidos (p126-134 y p130-138) se unían a moléculas clase I H-2^{b} (Tabla XLVIII). Los CTL generados por inmunización con p117-139 lisaban dianas incubadas con p126-134 y p130-138, pero no con los otros péptidos nonaméricos dentro de p117-139 (Figura 13A).

La línea de CTL específica de p117-139 se volvió a estimular con p126-134 o p130-138. Después de la reestimulación con p126-134 o p130-138, ambas líneas de células T demostraron lisis específica de péptido, pero solamente los CTL específicos de p130-138 mostraron lisis de una línea celular tumoral positiva para WT1 (Figuras 13B y 13C). Por lo tanto, parece que p130-138 es el epítopo procesado de forma natural.

TABLA XLVIII

73

Ejemplo 6 Identificación de ARNm específico de WT1 en líneas celulares tumorales de ratón

Este Ejemplo ilustra el uso de RT-PCR para detectar ARNm específico de WT1 en células y líneas celulares.

Se aislaron células mononucleares mediante centrifugación en gradiente de densidad y se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80ºC hasta que se analizaron mediante RT-PCR para determinar la presencia de ARNm específico de WT1. La RT-PCR se realizó en general como se describe por Fraizer et al., Blood 86: 4704-4706, 1995. Se extrajo el ARN total de 10^{7} células de acuerdo con procedimientos convencionales. Se resuspendieron sedimentos de ARN en 25 \mul de agua tratada con dietilpirocarbonato y se usaron directamente para la transcripción inversa. Se amplificó la región con dedos de cinc (exones 7 a 10) mediante PCR como un ADNc de ratón de 330 pb. Se realizó la amplificación en un termociclador durante una o, cuando era necesario, dos rondas secuenciales de PCR. Se usó ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), MgCl_{2} 2,5 mM y 20 pmol de cada cebador en un volumen de reacción total de 50 \mul. Se sometieron a electroforesis alícuotas de veinte \mul de los productos de PCR en geles de agarosa a 2% teñidos con bromuro de etidio. Los geles se fotografiaron con una película Polaroid (Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, Inglaterra). Se tomaron precauciones contra contaminaciones cruzadas siguiendo las recomendaciones de Kwok y Higuchi, Nature 339: 237-238, 1989. Los controles negativos incluían las mezclas de reactivos de ADNc y PCR con agua en lugar de ADNc en cada experimento. Para evitar falsos negativos, se evaluó la presencia de ARN intacto y la generación de ADNc adecuado para cada muestra mediante una PCR de control usando cebadores de \beta-actina. Las muestras que no se amplificaron con estos cebadores se excluyeron del análisis.

Los cebadores para la amplificación de WT1 en líneas celulares de ratón eran: P115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (cebador directo; SEC ID Nº: 21); y P116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (cebador inverso; SEC ID Nº: 22) (véase Inoue et al. Blood 88: 2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86: 4704-4706, 1995).

Los cebadores de beta actina usados en las reacciones de control eran: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (cebador sentido; SEC ID Nº: 23); y 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (cebador antisentido; SEC ID Nº: 24).

Los cebadores para usar en la amplificación de WT1 humana incluyen: P117: 954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (SEC ID Nº: 25); y P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (SEC ID Nº: 5). Para RT-PCR anidada, los cebadores pueden ser: P119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (SEC ID Nº: 26); y P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (SEC ID Nº: 27).

La Tabla XLVIII muestra los resultados del análisis por PCR de WT1 de líneas celulares tumorales de ratón. Dentro de la Tabla IV, (+++) indica un intenso producto de amplificación por PCR de WT1 en la primera etapa de RT PCR, (++) indica un producto de amplificación de WT1 que es detectable mediante la primera etapa de RT PCR de WT1, (+) indica un producto que es detectable solamente en la segunda etapa de RT PCR de WT1 y (-) indica negativo por PCR para WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

TABLA XLIX

74

Ejemplo 7 Expresión en E. coli de una construcción de fusión de WT1-TRX

La fase de lectura abierta truncada de WT1 (WT1 B) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo partiendo del aminoácido 2

P-37 (SEC ID Nº: 342) 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tm 64ºC

Cebador inverso que genera un sitio EcoRI después del codón de terminación

P-23 (SEC ID Nº: 343) 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tm 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 3 minutos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en el vector pTrx 2H (un vector pET28 modificado con una fusión con Trx en el N-terminal y dos marcadores His rodeando la fusión con Trx. Después de la fusión con Trx existen sitios de escisión de proteasas para trombina y enteroquinasa). La construcción pTRx2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia de ADN y después se usaron para transformar células hospedadoras de expresión BL21 (DE3) pLys y BL21 (DE3) CodonPlus.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 8 Expresión en E. coli de construcciones de fusión de WT1 A-marcador His

La fase de lectura abierta N-terminal de WT1 (WT1 A) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo partiendo del aminoácido 2

P-37 (SEC ID Nº: 344) 5' ggctccgacgtgcgggacctg 3' Tm 64ºC

Cebador inverso que genera un sitio EcoRI después de un codón de terminación artificial situado después del aminoácido 249.

PDM-335 (SEC ID Nº: 345)

5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3' Tm 64ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 1 minuto 20 segundos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en pPDM, un vector pET28 modificado con un marcador His en fase de lectura que se había digerido con las enzimas de restricción Eco721 y EcoRI. El producto de PCR también se transformó en el vector pTrx 2H. La construcción pTrx2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia de ADN y después se usaron para transformar células hospedadoras de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 9 Expresión en E. coli de construcciones de fusión de WT1 B-marcador His

La fase de lectura abierta truncada de WT1 (WT1 A) se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

Cebador directo partiendo del aminoácido 250

PDM-346 (SEC ID Nº: 346) 5' cacagcacagggtacgagagc 3'

Tm 58ºC

Cebador inverso que genera un sitio de EcoRI después del codón de terminación

P-23 (SEC ID Nº: 347) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'

Tm 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 1 minuto 30 segundos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con la enzima de restricción EcoRI, se purificó en gel y después se clonó en pPDM, un vector pET28 modificado con un marcador His en fase de lectura, que se había digerido con las enzimas de restricción Eco721 y EcoRI. El producto de PCR se transformó también en el vector pTrx 2H. La construcción pTrx 2H se digirió con las enzimas de restricción StuI y EcoRI. Las construcciones correctas se confirmaron mediante análisis de la secuencia de ADN y después se usaron para transformar células hospedadoras de expresión BL21 (DE3) pLys S y BL21 (DE3) CodonPlus.

Para los Ejemplos 7-9, se describen las siguientes SEC ID Nº:

La SEC ID Nº: 327 es la secuencia de ADNc determinada para Trx_WT1_B

La SEC ID Nº: 328 es la secuencia de ADNc determinada para Trx_WT1_A

La SEC ID Nº: 329 es la secuencia de ADNc determinada para Trx_WT1

La SEC ID Nº: 330 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_A

La SEC ID Nº: 331 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_B

La SEC ID Nº: 332 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 327

La SEC ID Nº: 333 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 328

La SEC ID Nº: 334 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 329

La SEC ID Nº: 335 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 330

La SEC ID Nº: 336 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 331

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 10 Formas truncadas de WT1 expresadas en E. coli

Se amplificaron tres fases de lectura de WT1 mediante PCR usando los siguientes cebadores:

Para WT1 Tr2:

PDM-441 (SEC ID Nº: 348) 5'

cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3' Tm 63ºC

PDM-442 (SEC ID Nº: 349) 5'

ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3' TM 62ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Para WT1 Tr3:

PDM-443 (SEC ID Nº: 350) 5'

caggctttgctgctgaggacgccc 3' Tm 64ºC

PDM-444 (SEC ID Nº: 351) 5'

cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc Tm 64ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Para WT1 Tr4:

PDM-445 (SEC ID Nº: 352) 5'

cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3' Tm 63ºC

PDM-446 (SEC ID Nº: 353) 5'

ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' TM 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 30 segundos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

Los productos de PCR se digirieron con EcoRI y se clonaron en pPDM His, (un vector pET28 modificado con un marcador His en fase de lectura en el extremo 5') que se había digerido con Eco721 y EcoRI. Se confirmó que las construcciones eran correctas a través del análisis de secuencia y se usaron para transformar células BL21 pLys S y BL21 CodonPlus o células BLR pLys S y BLR CodonPlus.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 11 Expresión de WT1 C (aminoácidos 76-437) y WT1 D (aminoácidos 91-437) en E. coli

Se amplificó la fase de lectura de WT1 C mediante PCR usando los siguientes cebadores:

PDM-504 (SEC ID Nº: 354) 5' cactccttcatcaaacaggaac 3'

Tm 61ºC

PDM-446 (SEC ID Nº: 355) 5'

ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3' Tm 63ºC

\vskip1.000000\baselineskip

La PCR se realizó en las siguientes condiciones:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

50 ng de ADN (pPDM FL WT1)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 2 minutos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His que se había digerido con Eco721 y EcoRI. La secuencia se confirmó a través de análisis de secuencia y después se usó para transformar BLR pLys S y BLR que se cotransformaron con CodonPlus RP.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 12 Producción sintética de WT1 TR-1 por hibridación de oligonucléotidos solapantes

Este ejemplo se realizó para determinar el efecto del cambio del uso de codones de prolina sobre la expresión.

Se hibridaron las siguientes parejas de oligonucleótidos:

1.

PDM-505 (SEC ID Nº: 356) 5'

ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3'

PDM-506 (SEC ID Nº: 357) 5'

ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3'

\vskip1.000000\baselineskip

2.

PDM-507 (SEC ID Nº: 358) 5'

ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3'

PDM-508 (SEC ID Nº: 359) 5'

cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3'

\vskip1.000000\baselineskip

3.

PDM-509 (SEC ID Nº: 360) 5'

cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3'

PDM-510 (SEC ID Nº: 361) 5'

cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3'

\vskip1.000000\baselineskip

4.

PDM-511 (SEC ID Nº: 362) 5'

cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3'

PDM-512 (SEC ID Nº: 363) 5'

cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3'

\vskip1.000000\baselineskip

5.

PDM-513 (SEC ID Nº: 364) 5'

ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3'

PDM-514 (SEC ID Nº: 365) 5'

ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3'

\vskip1.000000\baselineskip

6.

PDM-515 (SEC ID Nº: 366) 5'

cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3'

PDM-516 (SEC ID Nº: 367) 5'

ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3'

\vskip1.000000\baselineskip

7.

PDM-517 (SEC ID Nº: 368) 5'

gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3'

PDM-518 (SEC ID Nº: 369) 5'

ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3'

\vskip1.000000\baselineskip

8.

PDM-519 (SEC ID Nº: 370) 5'

gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3'

PDM-520 (SEC ID Nº: 371) 5'

gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3'

\vskip1.000000\baselineskip

Cada pareja de oligonucleótidos se combinó por separado y después se hibridó. Las parejas se ligaron después entre sí y se usó un \mul de mezcla de ligación para las condiciones de PCR siguientes:

10 \mul de tampón de Pfu 10X

1 \mul de dNTP 10 mM

2 \mul de cada oligonucleótido 10 \muM

83 \mul de agua estéril

1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA)

96ºC 2 minutos

96ºC 20 segundos, 63ºC 15 segundos, 72ºC 30 segundos x 40 ciclos

72ºC 4 minutos

\vskip1.000000\baselineskip

El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM His que se había digerido con Eco721 y EcoRI. La secuencia se confirmó y después se usó para transformar BLR pLys S y BLR que se cotransformaron con CodonPlus RP.

Para los ejemplos 10-12, se describen las siguientes SEC ID Nº:

La SEC ID Nº: 337 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_Tr1

La SEC ID Nº: 338 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_Tr2

La SEC ID Nº: 339 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_Tr3

La SEC ID Nº: 340 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_Tr4

La SEC ID Nº: 341 es la secuencia de ADNc determinada para WT1_C

La SEC ID Nº: 342 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 337

La SEC ID Nº: 343 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 338

La SEC ID Nº: 344 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 339

La SEC ID Nº: 345 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 340

La SEC ID Nº: 346 es la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la SEC ID Nº: 341

La secuencia de WT1 C representa un polinucleótido que tiene las regiones codificantes de TR2, TR3 y TR4.

La secuencia sintética de WT1 C representa un polinucleótido que tiene las regiones codificantes de TR2, TR3 y TR4.

La secuencia sintética de WT1 de TR-1 representa un polinucleótido en el que codones alternativos para prolina sustituyeron a los codones nativos, produciendo un polinucleótido capaz de expresar WT1 TR-1 en E. coli.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 13 Evaluación de los efectos hispatológicos y toxicológicos sistémicos de la inmunización con WT1 en ratones

El propósito de este ejemplo era analizar la inmunogenicidad y los efectos histopatológicos y toxicológicos sistémicos potenciales de la inmunización con proteína WT1 en una valoración de dosis múltiples en ratones.

El diseño experimental para la inmunización de ratones con proteína WT1 se describe en la Tabla L.

TABLA L

75

La vacunación contra proteína WT1 usando MPL-SE como adyuvante, en un estudio de valoración de dosis múltiples (dosis que oscilaban de 25 \mug, 100 \mug a 1000 \mug de proteína WT1) en ratones C57/B6 hembra generó una fuerte respuesta de anticuerpos específicos de WT1 (Figura 19) y respuestas celulares de células T (Figura 20).

No se observaron efectos histopatológicos ni toxicológicos sistémicos de la inmunización con proteína WT1. No se observaron pruebas histológicas de toxicidad en los siguientes tejidos: glándula adrenal, cerebro, ciego, colon, duodeno, ojo, fémur y médula, vesícula biliar, corazón, íleon, yeyuno, riñón, laringe, glándula lagrimal, hígado, pulmón, ganglio linfático, músculo, esófago, ovario, páncreas, paratiroides, glándula salivar, esternón y médula, bazo, estómago, timo, tráquea, tiroides, vejiga urinaria y útero.

Se puso un énfasis especial en la evaluación de la toxicidad hematopoyética potencial. La proporción mieloide/eritroide en médula de esternón y fémur era normal. Todos los recuentos de células sanguíneas evaluables y la química sanguínea (BUN, creatinina, bilirrubina, albúmina, globulina) estaban dentro del intervalo normal (Tabla LI).

Dado que está presente una inmunidad existente contra WT1 en algunos pacientes con leucemia y que la vacunación contra proteína WT1 puede generar respuestas de Ab y celulares de células T específicas de WT1 en ratones sin toxicidad para tejidos normales, estos experimentos validan a WT1 como una vacuna para tumor/leucemia.

TABLA LI Análisis Clínico Químico y Hematológico

76

77

78

\vskip1.000000\baselineskip

79

80

81

82

83

84

85

86

Abreviaturas: WBC: glóbulos blancos; RBC: glóbulos rojos; Hg.: hemoglobina; HCT; hematocrito; MCV: Volumen corpuscular medio; MCH: hemoglobina corpuscular media; MCHC: concentración de hemoglobina corpuscular media; Plq.: plaquetas; Abs.: absoluto; Baso: basófilos; Eos: eosinófilos; En banda Abs.: neutrófilos inmaduros; Polis: células polimorfonucleares; Linf: linfocitos; Mono; monocitos; BUN: nitrógeno de urea en sangre.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 14 Generación de respuestas de células T específicas de WT1 humana mediante sensibilización in vitro con gen completo

Este ejemplo demuestra que pueden generarse respuestas de células T específicas de WT1 a partir de la sangre de individuos normales.

Se diferenciaron células dendríticas (DC) a partir de cultivos de monocitos obtenidos de PBMC de donantes normales por cultivo durante 4-10 días en medio de RPMI que contenía suero humano a 10%, GMCSF 50 ng/ml e IL-4 30 ng/ml. Después del cultivo, se infectaron DC 16 horas con virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante a una M.O.I. de 5, o durante 3 días con adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una M.O.I. de 10 (Figuras 21 y 22). Se inactivó el virus vaccinia mediante irradiación U.V. Se aislaron células T CD8^{+} por selección positiva usando perlas magnéticas y se iniciaron cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Los cultivos se volvieron a estimular cada 7-10 días usando células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o vaccinia para expresar WT1. Después de 3-6 ciclos de estimulación, podían identificarse líneas CD8^{+} que producían específicamente interferón-gamma cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos que expresaban WT1 autóloga. La actividad específica de WT1 de estas líneas podía mantenerse después de ciclos de estimulación adicionales. Se demostró que estas líneas reconocían específicamente células dendríticas autólogas infectadas con adeno o vaccinia WT1, pero no células dendríticas autólogas infectadas con adeno o vaccinia EGFP mediante ensayos de Elispot
(Figura 23).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 15 Formulación de Ra12-WT1 para inyección: uso de excipientes para estabilizar el producto liofilizado

Este ejemplo describe la formulación que permite la solubilización completa de Ra12-WT1 liofilizada.

La siguiente formulación permitía que la proteína recombinante Ra12-WT1 se disolviera en un medio acuoso después de liofilizarse hasta sequedad:

Concentración de Ra12-WT1 recombinante: 0,5-1,0 mg/ml; Tampón: Etanolamina 10-20 mM, pH 10,0; Cisteína 1,0-5,0 mM; Tween-80 a 0,05% (Polisorbato-80); Azúcar: Trehalosa a 10% (T5251, Sigma, MO); Maltosa a 10% (M9171, Sigma, MO), Sacarosa a 10% (S7903, Sigma, MMO); Fructosa a 10% (F2543, Sigma, MO); Glucosa a 10% (G7528, Sigma, MO).

Se descubrió que la proteína liofilizada con el excipiente de azúcar se disolvía significativamente más que sin el excipiente de azúcar. El análisis mediante SDS-PAGE teñido con coomassie no mostraba signos de sólidos restantes en el material disuelto.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 16 Formulación de una vacuna de proteína WT1

Este ejemplo describe la inducción de respuestas inmunes específicas de WT1 después de la inmunización con proteína WT1 y 2 formulaciones de adyuvante diferentes.

De acuerdo con este ejemplo, la proteína WT1 en combinación con MPL-SE induce una fuerte respuesta de Ab e Interferón-\gamma (IFN-\gamma) contra WT1. A continuación se describen en detalle los métodos usados para inducir respuestas inmunes específicas de WT1 después de una inmunización con proteína WT1 usando MPL-SE o Enhanzyn como adyuvante en ratones C57/B6.

Se inmunizaron ratones C57BL/6 con 20 \mug de rRa12-WT1 combinada con los adyuvantes MPL-SE o Enhanzyn. Se inmunizó un grupo de ratones de control con rRa12-WT1 sin adyuvante y se inmunizó un grupo con solución salina en solitario. Se administraron tres inmunizaciones intramusculares (IM), separadas por tres semanas. Se recogieron bazos y sueros 2 semanas después de la inmunización final. Se analizaron los sueros para respuestas de anticuerpos mediante ELISA en placas recubiertas con fusión de rRa12-WT1, Ra12 o WT1TRX. Se observaron niveles similares de títulos de anticuerpos IgG2a e IgG1 en ratones inmunizados con Ra12-WT1 + MPL-SE y Ra12-WT1 + Enhanzyn. Los ratones inmunizados con rRa12-WT1 sin adyuvante mostraban niveles menores de anticuerpos
IgG2a.

Se evaluaron las respuestas de CD4 por medición de la producción de interferón-\gamma después de la estimulación de esplenocitos in vitro con rRa12-WT1, rRa12 o con péptidos WT1 p6, p117 y p287. Ambos adyuvantes mejoraron las respuestas de CD4 sobre los ratones inmunizados con rRA12-WT1 en solitario. Adicionalmente, los resultados indican que rRA12-WT1 + MPL-SE inducía una respuesta de CD4 más fuerte que rRA12-WT1 + Enhanzyn. Las lecturas de DO de IFN-\gamma variaban de 1,4-1,6 en los ratones inmunizados con rRA12-WT1 + MPL-SE en comparación con 1-1,2 en los ratones inmunizados con rRa12-WT1 + Enhanzyn. Sólo se observaron respuestas contra péptidos contra p117, y después solamente en ratones inmunizados con rRa12-WT1 + MPL-SE. Se observaron fuertes respuestas de IFN-\gamma contra el control positivo, ConA, en todos los ratones. Sólo se observaron respuestas contra ConA en los ratones de control negativo inmunizados con solución salina, indicando que las respuestas eran específicas para
rRA12-WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 17 Construcción de una genoteca de WT1 mutada aleatoriamente

La secuencia de ácido nucleico de WT1 humana se mutó aleatoriamente usando un método de reacción en cadena de la polimerasa en presencia de 8-oxo dGTP y dPTP (Journal of Molecular Biology 1996; 255: 589-603). El gen de WT1 humana completo no cortado ni empalmado se describe en la SEC ID Nº: 380 y la secuencia proteica correspondiente se expone en la SEC ID Nº: 404. Se usó una VARIANTEe de corte y empalme de WT1 como molde para las reacciones de PCR y se describe en las SEC ID Nº: 381 (ADN) y 408 (proteína). Se seleccionaron condiciones de modo que la frecuencia de alteraciones en el ácido nucleico condujera a un cambio dirigido en la secuencia de aminoácidos, habitualmente de 5-30% del producto de PCR. Después se amplificó el producto de PCR mutado en ausencia de los análogos de nucleótidos usando los cuatro dNTP normales. Este producto se subclonó en vectores de expresión de mamíferos y vectores virales para la inmunización. Esta genoteca, por lo tanto, contiene una población mixta de clones de WT1 aleatoriamente mutados. Se seleccionaron y se secuenciaron varios clones. Las secuencias de ADN VARIANTEes de WT1 mutada se describen en las SEC ID Nº: 377-379 y las secuencias de aminoácidos predichas de las VARIANTEes se exponen en las SEC ID Nº: 405-407. Estas secuencias alteradas, y otras de la genoteca, pueden usarse como inmunógenos para inducir respuestas de células T más intensas contra proteína WT1 en células cancerosas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 18 Construcción de fusiones de WT1-LAMP

Se construyó una fusión tripartita usando la reacción en cadena de la polimerasa y oligonucleótidos sintéticos que contienen las uniones deseadas de la proteína de membrana asociada a lisosomas humana 1 (LAMP-1) y una VARIANTEe de corte y empalme de la secuencia de WT1 humana. La VARIANTEe de corte y empalme de WT1 y la secuencia de LAMP-1 usadas para estas fusiones se describen en las SEC ID Nº: 381 y 383. En concreto, el péptido señal de LAMP-1 (pares de bases 1-87 de LAMP) se fusionó con el extremo 5 prima de la fase de lectura abierta de WT1 humana (1.290 pares de bases de longitud), después el dominio transmembrana y citoplasmático de LAMP-1 (pares de bases 1161 a 1281 de LAMP) se fusionaron con el extremo 3 prima de la secuencia de WT1. La secuencia de la construcción de WT1-LAMP resultante se expone en la SEC ID Nº: 382 (ADN) y la SEC ID Nº 409 (proteína). La construcción se diseñó de modo que cuando se expresa en células eucariotas, el péptido señal dirige a la proteína hacia el retículo endoplásmico (RE) donde las señales de localización en el dominio transmembrana y citoplasmático de LAMP-1 dirigen el transporte de la proteína de fusión hacia la localización lisosomal donde los péptidos se cargan en moléculas de MHC Clase II.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 19 Construcción de fusiones de WT1-ubitquina para presentación aumentada de MHC clase I

La fase de lectura abierta de ubiquitina humana (SEC ID Nº: 384) se mutó de modo que los nucleótidos que codifican el último aminoácido codificasen una alanina en lugar de una glicina. Esta fase de lectura abierta mutada se clonó en fase de lectura justo cadena arriba del primer codón de una VARIANTEe de corte y empalme de WT1 humana (SEC ID Nº: 381 y 408, ADN y proteína, respectivamente). La mutación G->A evita la escisión a co-traduccional de la proteína naciente por las proteasas que normalmente procesan poli-ubiquitina durante la traducción. El ADN y la secuencia de aminoácidos predicha para la construcción resultante se exponen en las SEC ID Nº: 385 y 410, respectivamente. La proteína resultante demostraba una citotoxicidad celular disminuida cuando se expresaba en células humanas. Aunque no era posible generar líneas estables que expresasen WT1 nativa, se obtuvieron fácilmente líneas celulares que expresaban la proteína de fusión. Se predice que la proteína resultante se dirige al proteosoma en virtud de la molécula de ubiquitina añadida. Esto debería dar como resultado un reconocimiento más eficaz de la proteína por células T CD8+ específicas de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 20 Construcción de un vector de adenovirus que exprese WT1 humana

Se clonó una VARIANTEe de corte y empalme de WT1 humana (SEC ID Nº: 381) en un vector de adenovirus de serotipo 5 con E1 y E3 delecionados. La expresión del gen de WT1 está controlada por el promotor de CMV que media altos niveles de expresión de proteína WT1. La infección de células humanas con este reactivo conduce a un alto nivel de expresión de la proteína WT1. La naturaleza antigénica de las proteínas adenovirales introducidas en la célula hospedadora durante, y producidas a bajos niveles posteriormente a la infección, puede actuar aumentando la vigilancia inmune y el reconocimiento inmune de WT1 como una diana inmunológica. Este vector también puede usarse para generar respuestas inmunes contra la proteína WT1 cuando se inocula en sujetos humanos. Si estos sujetos son positivos para células tumorales que expresan WT1, la respuesta inmune podría tener un efecto terapéutico o curativo sobre el curso de la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 21 Construcción de un vector de virus vaccinia que expresa WT1 humana

Se clonó una VARIANTEe de corte y empalme del gen de WT1 humana de longitud completa (SEC ID Nº: 381) en el locus de la timidina quinasa de la cepa Western Reserve del virus vaccinia usando el vector lanzadera pSC11. El gen de WT1 está bajo el control de un promotor híbrido de virus vaccinia que media la expresión génica a lo largo del curso de una infección por virus vaccinia. Este reactivo puede usarse para expresar la proteína WT1 en células humanas in vivo o in vitro. La WT1 es una proteína propia que se sobreexpresa en algunas células tumorales humanas. Por lo tanto, es improbable que las respuestas inmunológicas contra WT1 suministrada como una proteína conduzcan a un reconocimiento de WT1 mediado por el Complejo Mayor de Histocompatibilidad Clase I (MHC clase I). Sin embargo, la expresión de la proteína en el compartimento intracelular mediante el vector de virus vaccinia permitirá un alto nivel de presentación de MHC clase I y el reconocimiento de la proteína WT1 por células T CD8+. La expresión de la proteína WT1 mediante el vector de virus vaccinia también conducirá a la presentación de péptidos WT1 en el contexto de MHC clase II y, por lo tanto, al reconocimiento por células T CD4+.

Los usos de esta invención incluyen su uso como una vacuna contra el cáncer. La inmunización de sujetos humanos que llevan tumores positivos para WT1 conduciría a una respuesta terapéutica o curativa. La expresión de WT1 dentro de la célula conducirá al reconocimiento de la proteína por células T positivas tanto para CD4 como CD8.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 22 Generación de clones de células T CD8+ específicos de WT1 usando sensibilización con gen completo

Se diferenciaron células dendríticas (DC) a partir de cultivos de monocitos obtenidos de PBMC de donantes normales por cultivo durante 4-6 días en medio RPMI que contenía suero humano a 10%, GM-CSF 50 ng/ml e IL-4 30 ng/ml. Después del cultivo, se infectaron DC 16 horas con virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante (descrito en el Ejemplo 21) a una multiplicidad de infección (MOI) de 5, o durante 3 días con adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una MOI de 10. Se inactivó el virus vaccinia mediante irradiación U.V. Se aislaron células T CD8+ mediante reducción negativa usando perlas magnéticas y se iniciaron los cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Los cultivos se reestimularon cada 7-10 días usando células dendríticas autólogas infectadas con virus adeno o vaccinia modificados genéticamente para expresar WT1. Después de 4-5 ciclos de estimulación, podían identificarse líneas de células T CD8+ que producían específicamente interferón-gamma cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos que expresaban WT1 autóloga. Estas líneas se clonaron y demostraron que reconocían específicamente fibroblastos autólogos transducidos con WT1 pero no fibroblastos transducidos con EGFP mediante ensayos de Elispot.

El gen del tumor de Wilms (WT1) participa en la leucemogénesis y está sobreexpresado en la mayoría de leucemias humanas, así como en varios tumores sólidos. Estudios previos en seres humanos han demostrado la presencia de respuestas de anticuerpos (Ab) específicos de WT1 en 16/63 (25%) de pacientes con AML y en 15/81 (19%) de pacientes con CML estudiados. Estudios previos en ratones han demostrado que las vacunas basadas en péptido WT1 generan respuestas de Ab, Th y CTL específicos de WT1. El uso de péptidos como vacunas en seres humanos está limitado por su restricción por HLA y la tendencia a generar respuestas específicas de péptido, y solamente en una minoría de los pacientes, CTL específicos de tumor. Las ventajas de la inmunización con gen completo son que pueden incluirse en una sola vacuna varios epítopos CTL y auxiliares, por lo tanto, no restringiendo la vacuna por tipos de HLA específicos. Los datos descritos en este documento demuestran la inducción de respuestas inmunes específicas de WT1 usando sensibilización in vitro con gen completo, y que pueden generarse clones de células T CD8+ específicas de WT1. Dado que está presente una inmunidad existente contra WT1 en algunos pacientes con leucemia y que la WT1 murina y humana tienen una identidad de 96% a nivel de aminoácidos y la vacunación contra proteína, ADN o péptidos WT1 puede generar respuestas de Ab y celulares de células T específicas de WT1 en ratones sin toxicidad para tejidos normales en ratones, estos experimentos de sensibilización in vitro en seres humanos proporcionan una validación adicional de WT1 como una vacuna contra tumor/leucemia. Además, la capacidad para generar clones de células T CD8+ específicas de WT1 puede conducir al tratamiento de tumores malignos asociados con una sobreexpresión de WT1 usando células T modificadas genéticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 23 Construcciones recombinantes para fabricación clínica de WT1

Se generaron cinco construcciones como se describen en detalle a continuación para la producción de WT1 de uso clínico.

Diseño de Ra12/WT-E (SEC ID Nº: 388 (ADNc) y 391 (proteína)) y WT-1 E (SEC ID Nº: 386 (ADNc) y 395 (proteína)) sin marcador His:

La fase de lectura de WT-1 E se amplificó por PCR con los siguientes cebadores para la construcción no de fusión sin His:

2000

Se usaron las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 1 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 1 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 1 minuto y 40 segundos. Esto se siguió de una extensión final de 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y EcoRI y se clonó con pPDM His (un vector pET28 modificado) que se había digerido con NdeI y EcoRI. La construcción se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. Esta construcción - pPDM WT-1 E se digirió después con NcoI y XbaI y se usó como la estructura de vector para el inserto de NcoI y Xbal de pPDM Ra12 WT-1 F (véase a continuación). La construcción se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. Se confirmó la expresión de proteína mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie y análisis de secuencia de proteína
N-terminal.

Diseño de Ra12-WT-1-F (aminoácidos 1-281) sin marcador His (SEC ID Nº: 389 (ADNc) y 393 (proteína)):

La fase de lectura de Ra12 WT-1 se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

2001

Se usaron las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 1 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 1 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 58ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 3 minutos. Esto se siguió de una extensión final de 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y se clonó en pPDM His que se había digerido con NdeI y Eco72I. La secuencia se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLysS. Se confirmó la expresión de proteína mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

Diseño de Ra12-WT-1 sin marcador His (SEC ID Nº: 390 (ADNc) y 392 (proteína)):

La fase de lectura de Ra12 WT-1 se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

2002

Se usaron las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 1 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 1 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 68ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 2 minutos y 30 segundos. Esto se siguió de una extensión final de 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NotI y NdeI y se clonó en pPDM His que se digirió con NdeI y NotI. La secuencia se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLysS. La expresión de proteína se confirmó mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

Diseño de WT-1 C (aminoácidos 69-430) en E. coli sin marcador His (SEC ID Nº: 387 (ADNc) y 394 (proteína)):

La fase de lectura de WT-1 C se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

2003

Se usaron las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 1 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 1 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDMRa12 WT-1 No His). La reacción se desnaturalizó inicialmente a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 62ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 2 minutos. Esto se siguió de una extensión final de 72ºC durante 4 minutos. El producto de PCR se digirió con NdeI y se clonó en pPDM His que se había digerido con NdeI y Eco721. La secuencia se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLys S. La expresión de proteína se confirmó mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie y análisis de secuencia de proteína N-terminal.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 24 Generación de clones de células T CD8+ específicas de WT1 usando sensibilización con gen completo e identificación de un epítopo de WT1 restringido por HLA-A2

En este ejemplo, se usaron vehículos de suministro de virus Adeno y Vaccinia para generar líneas de células T específicas de WT1. Se demostró que un clon de células T de la línea era específico para WT1 y, además, se identificó el epítopo reconocido por este clon.

Se diferenciaron células dendríticas (DC) a partir de cultivos de monocitos obtenidos de PBMC de donantes normales por cultivo durante 4-6 días en medio RPMI que contenía suero humano a 10%, GM-CSF 50 ng/ml e IL-40 30 ng/ml. Después del cultivo, se infectaron DC 16 horas con virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 5, o durante 2-3 días con adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una MOI de 3-10. El virus vaccinia se inactivó mediante irradiación U.V. Se aislaron células T CD8+ mediante reducción negativa usando anticuerpos contra células CD4, CD14, CD16, CD19 y CD56+, seguido de perlas magnéticas específicas para la porción Fc de estos Ab.

Se iniciaron cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Se reestimularon los cultivos cada 7-14 días usando células dendríticas autólogas infectadas con virus adeno o vaccinia modificados genéticamente para expresar WT1. Después de 4-5 ciclos de estimulación, podían identificarse líneas de células T CD8+ que producían específicamente interferón-\gamma (IFN-\gamma) cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos que expresaban WT1 autóloga. Estas líneas se clonaron y se demostró que reconocían específicamente fibroblastos autólogos transducidos con WT1 pero no fibroblastos transducidos con control mediante ensayos de Elispot.

Para analizar adicionalmente la restricción por HLA de estos clones de células T CD8+ específicas de WT1, se transdujeron con WT1 fibroblastos obtenidos de un donante adicional (D475) que compartía solamente el alelo HLA-A2 con el donante (D349) a partir del que se estableció el clon de células T. El análisis de ELISPOT demostraba reconocimiento de estas células diana D475 por el clon de células T. Para demostrar adicionalmente la restricción por HLA-A2 y demostrar que este epítopo se expresaba por células tumorales que sobreexpresaban "de forma natural" WT1 (como parte de su transformación maligna), se ensayó la línea celular de leucemia K562. Se transdujo K562 con la molécula HLA-A2 y se usaron células K562 negativas para HLA-A2 como controles para la liberación inespecífica de IFN-\gamma. Los análisis de ELISPOT demostraron que las células T reconocían la línea celular K562 positiva para A2 pero no las células K562 negativas para A2. Se documentó una prueba adicional de la especificidad y restricción por HLA-A2 del reconocimiento mediante experimentos de bloqueo de anticuerpos HLA-A2.

Para definir adicionalmente el epítopo de WT1, se generaron 4 construcciones retrovirales de WT1 truncada. Después se transdujeron fibroblastos de donante 475 con estas construcciones. Los ensayos de ELISPOT demostraban reconocimiento de fibroblastos D475 transducidos con la construcción WT1 Tr1 (aminoácido 2-aminoácido 92), demostrando de este modo que el epítopo de WT1 se localiza en los primeros 91 aminoácidos N-terminales de la proteína WT1. Para mapear con precisión el epítopo, se sintetizaron péptidos de 15 aminoácidos de la proteína WT1, solapantes en 11 aminoácidos. El clon de células T específico de WT1 reconocía dos péptidos solapantes de 15 aminoácidos, el péptido 9 (QWAPVLDFAPPGASA) (SEC ID Nº: 412) y el péptido 10 (VLDFAPPGASAYGSL) (SEC ID Nº: 413). Para caracterizar adicionalmente el epítopo mínimo reconocido, se usaron péptidos que compartían 9 y 10 aminoácidos de los 15 aminoácidos (5 total) para analizar la especificidad del clon. El clon reconocía específicamente el nonámero VLDFAPPGA (SEC ID Nº: 241) y el decámero VLDFAPPGAS (SEC ID Nº: 411).

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 25 Clonación y secuenciación de cadenas alfa y beta de TCR obtenidas de una célula T CD8 específica para WT1

Se clonaron las cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR) a partir de clones de células T CD8+ específicas para WT1. Se llevó a cabo un análisis de secuencia para demostrar el origen de familia de las cadenas alfa y beta del TCR. Además, se identificaron segmentos de diversidad y unión únicos (que contribuyen a la especificidad de la respuesta).

Se aisló el ARNm total de 2 x 10^{6} células de un clon de células T CD8+ específico de WT1 usando reactivo Trizol y se sintetizó ADNc usando kits Ready-togo (Pharmacia). Para determinar las secuencias de V\alpha y V\beta en un clon, se sintetizó un panel de cebadores específicos de subtipo V\alpha y V\beta (basándose en secuencias de cebadores generados por Clontech, Palo Alto, CA) y se usaron en reacciones de RT-PCR con ADNc generado de cada clon. Las reacciones de RT-PCR demuestran que se expresa la secuencia de V\beta y V\alpha por cada clon.

Para clonar las cadenas alfa y beta de TCR de longitud completa a partir de un clon, se diseñaron cebadores que abarcan los nucleótidos de TCR que codifican el inicio y la terminación. Se establecieron reacciones de RT-PCR de 35 ciclos convencionales usando ADNc sintetizado a partir del clon de CTL y los cebadores anteriores, usando la polimerasa termoestable con corrección de errores PWO (Roche, Basel, Suiza). Las bandas específicas resultantes (\sim850 pb para alfa y \sim950 para beta) se ligan en el vector romo de PCR (Invitrogen, Carisbad, CA) y se usan para transformar E. coli. Se identifican E. coli transformadas con plásmidos que contienen las cadenas alfa y beta de longitud completa y se generan preparaciones a gran escala de los plásmidos correspondientes. Después se secuencian los plásmidos que contienen las cadenas alfa y beta de TCR de longitud completa usando métodos convencionales. Se determina por lo tanto la región de diversidad-unión (DJ) que contribuye a la especificidad del
TCR.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 26 El clon de células T CD8+ específico de WT1 lisa blastos leucémicos que expresan WT1

El clon de células T CD8+ descrito inicialmente en el Ejemplo 24 que reconoce la secuencia peptídica VLDFAPPGA (restos 37-45 de WT1 humana; SEC ID Nº: 241) se ensayó adicionalmente para determinar la capacidad para destruir (lisar) células diana de leucemia que expresan WT1 de un modo restringido por HLA A2. Se usaron células diana K562 transducidas con la molécula HLA A2, GFP, A2Kb o no transducidas en un ensayo de liberación de ^{51}Cromo de 4,5 horas convencional con proporciones de célula efectora respecto a diana (E:T) de 25:1 y 5:1. A una proporción de E:T de 25:1, el clon de células T CD8+ lisaba las células K562/A2 y K562/A2Kb (40% y 49% de lisis específica, respectivamente) mientras que las células transducidas con GFP de control y las K562 no se lisaron. A una E:T de 5:1, la lisis específica de las células K562/A2 y K562/A2Kb era de 21% y 24%, respectivamente. Por lo tanto, este clon de células T CD8+ reconoce y lisa células leucémicas que expresan WT1 de una forma restringida por HLA-A2. La capacidad para generar clones de células T CD8+ específicas de WT1 tiene utilidad en el tratamiento de tumores malignos asociados con sobreexpresión de WT1 usando células T modificadas
genéticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 27 Construcción de complejos tetraméricos de HLA-A2-péptido-MHC

Este ejemplo describe la clonación y expresión de HLA-A2 soluble en células de insecto y la purificación y ensamblaje de HLA-A2 en complejos tetraméricos fluorescentes multivalentes de péptido-MHC para la detección y aislamiento de células T CD8 específicas de antígeno.

Este sistema es similar al desarrollado y descrito por Altman, et al. (Altman, J., et al., Science, 1996 274 (5284): 94-6) en el sentido de que el HLA-A2 soluble estaba biotinilado por separado en una secuencia de reconocimiento birA y se ensamblaba posteriormente en multímeros en un armazón de estreptavidina conjugada con ficoeritrina. Los materiales descritos en este documento difieren en que el HLA-A2 se expresaba en una forma soluble y glicosilada a partir de células de insecto y el heterodímero se purificaba usando una columna de afinidad de anticuerpos anti-MHC clase I humano.

El gen de la cadena pesada de HLA-A2, al que se le ha añadido la secuencia de biotinilación birA, y el gen de la beta-2-microglobulina humana se clonaron en el vector de expresión de baculovirus pFASTBAC-dual. Tras la infección de células de insecto, los genes se transcribieron simultáneamente a partir de promotores divergentes y se secretó heterodímero de HLA-A2 soluble glicosilado completamente ensamblado hacia el medio de cultivo. Las células de insecto infectadas se cultivaron en fábricas de células durante 4 días a 21ºC antes de que se recogieran los sobrenadantes. La producción de HLA-A2 se controló mediante un ELISA de captura que emplea los anticuerpos W6/32 y B9.12.1 biotinilado. Se purificó HLA-A2 a partir del sobrenadante de cultivo hasta una pureza >90% en una etapa mediante cromatografía de afinidad usando 2 anticuerpos monoclonales anti-MHC clase I humano unidos a perlas de Sepharose. Los anticuerpos usados eran PA2.1 y W6/32. El HLA-A2 purificado se biotiniló por separado en la secuencia de reconocimiento birA en el extremo C-terminal de la cadena pesada usando la enzima birA disponible en el mercado. La eficacia de la biotinilación se evaluó esencialmente como se describe (Crawford et al (1998) Immunity junio; 8 (6): 675-82) y el material se purificó adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se saturó estreptavidina conjugada con ficoeritrina con bio-HLA-A2 y el reactivo de tinción multivalente se purificó a partir de HLA-A2 libre mediante SEC. Se incubó el tetrámero de HLA-A2 durante 48 horas a temperatura ambiente con un exceso molar de 10 veces de péptido Her-2/neu E75 o péptido MI de la matriz de Influenza, antes de que los clones de células T específicos se tiñeran a 4ºC durante 30 minutos en presencia de tetrámero cargado de péptido y anticuerpo anti-COB. Los resultados indicaban que los tetrámeros incubados en presencia de un exceso molar del péptido de influenza M1 58-66 M1 teñían específicamente un clon de células T específico de influenza y los tetrámeros incubados con un exceso del péptido Her-2/neu E75 teñían específicamente el clon de células T específico de Her-2/new.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 28 Detección de células T específicas de wt1 usando tetrámeros de MHC-péptido de WT1

Los tetrámeros de HLA-A2 descritos en el Ejemplo 27 se incubaron con un exceso molar del péptido p37-45 de WT1 (VLDFAPPGA) (restos 37-45 de WT1 humana; SEC ID Nº: 241) previamente demostrado en el Ejemplo 24 que estaba restringido por HLA-A2. Este tetrámero se usó para teñir el clon de células T CD8+ específico de WT1 descrito en el Ejemplo 24. Se demostró que este clon reconocía específicamente el epítopo p37-45. Cuando los tetrámeros se incubaron con un exceso de péptido p37-45, teñían específicamente el clon de células T CD8+, mientras que para los tetrámeros incubados con un exceso de péptidos de HLA-2 irrelevantes (Her2/neu, WT1 p38-46, WT1 p39-47), los tetrámeros no teñían el clon de células T CD8+. Por lo tanto, el clon de células T CD8+ específico de WT1 p37-45 se reconoce específicamente por el tetrámero de HLA-A2-péptido p37-45 MHC.

Una línea de células T específicas de WT1 generadas como se describe en el Ejemplo 24 se tiñó después con los tetrámeros HLA-A2-p37-45, Her2/neu irrelevante o WT1 p37-46. Los tetrámeros de HLA-A2-p37-45 teñían 1% de la población total de esta línea de células T específica de WT1 y 7% de la población CD8+ activada, mientras que el tetrámero HLA-A2-p37-45 de control teñía a los mismos niveles de fondo que los tetrámeros HLA-A2-Her2/neu de control.

Estos resultados indican que los tetrámeros de MHC-péptido son altamente sensibles y una herramienta específica para detectar respuestas inmunes específicas de WT1. Los tetrámeros de péptido-MHC pueden usarse para una detección precoz de tumores malignos asociados a WT1, control de respuestas específicas de WT1 y para control de enfermedad mínima residual. La detección de células T específicas de WT1 mediante tinción con tetrámero también es una herramienta útil para identificar grupos dentro de una población de pacientes que padecen una enfermedad asociada a WT1 con mayor riesgo de recaída o avance de la enfermedad.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 29 Generación de una línea de células T CD8+ específica de WT1 a partir de un donante positivo para HLA-A24 usando sensibilización con gen completo

En este ejemplo, se usaron vehículos de suministro de virus Adeno y Vaccinia para generar líneas de células T específicas de WT1 a partir de un donante positivo para HLA-A24. Se demostró que esta línea de células T estaba restringida por MHC clase I. Estos experimentos confirman adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína WT1 y respaldan su uso como diana para vacunas y/u otras estrategias inmunoterapéuticas.

Se diferenciaron células dendríticas (DC) a partir de cultivos de monocitos obtenidos de PBMC de un donante normal positivo para HLA-A24 mediante cultivo durante 4-6 días en medio RPMI que contenía suero humano a 10%, GM-CSF 50 ng/ml e IL-4 30 ng/ml. Después del cultivo, se infectaron DC 16 horas con virus vaccinia que expresaba WT1 recombinante a una multiplicidad de infección (MOI) de 5, o durante 3 días con adenovirus que expresaba WT1 recombinante a una MOI de 3-10. El virus vaccinia se inactivó mediante irradiación U.V. Se aislaron células T CD8+ mediante reducción negativa usando anticuerpos contra células CD4, CD14, CD16, CD19 y CD56+, seguido de perlas magnéticas específicas para la porción Fc de estos Ab.

Se iniciaron cultivos de sensibilización en placas de 96 pocillos. Los cultivos se reestimularon cada 7-14 días usando células dendríticas autólogas infectadas con adenovirus o virus vaccinia modificados genéticamente para expresar WT1. Después de 4-5 ciclos de estimulación, podían identificarse líneas de células T CD8+ que producían específicamente interferón-\gamma (IFN-\gamma) cuando se estimulaban con células dendríticas o fibroblastos que expresaban WT1 autóloga. Estas líneas se clonaron y mediante ensayos de Elispot se demostró que reconocían específicamente fibroblastos autólogos transducidos con WT1 pero no fibroblastos transducidos con control de una forma restringida por MHC clase I.

\newpage

Estos experimentos demuestran que la proteína WT1 puede usarse para generar una respuesta de células T y, por lo tanto, confirman adicionalmente la inmunogenicidad del antígeno WT1 y respaldan su uso como diana para vacunas y otras estrategias inmunoterapéuticas.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 30 Identificación de epítopos de WT1 de alta afinidad por HLA-A2

Este experimento describe la identificación por ordenador de epítopos de WT1 que se ha predicho que se unen a HLA-A2 con mayor afinidad que epítopos procesados de forma natural. Los epítopos identificados en este documento tienen utilidad en vacunas y/o estrategias inmunoterapéuticas para el tratamiento de cánceres asociados con la expresión de WT1.

Se construyeron análogos peptídicos del epítopo p37-45 de WT1 restringido por HLA A2 procesado de forma natural (VLDFAPPGA; restos 37-45 de WT1 humana; SEC ID Nº: 241; previamente demostrado en el Ejemplo 24 que estaba restringido por HLA-A2) con motivos para la unión a HLA-A2.1 con mayor afinidad que el péptido procesado de forma natural, como se describe en más detalle a continuación.

Se usó un programa de búsqueda de motivos peptídicos basado en algoritmos desarrollados por Rammensee et al (Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic: SYFPEITHI: database for MHC ligands y peptide motifs. Immunogenetics (1999) 50: 213-219) y por Parker, et al (Parker, K. C. M. A. Bednarek, y J. E. Coligan. 1994, Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152:163) para identificar análogos del epítopo peptídico p37-45 de WT1 que se predice que se unen a HLA-A2 con mayor afinidad que el péptido p37-45 natural. Los péptidos que se muestran en la Tabla LII tienen puntuaciones de unión peptídica predichas iguales o superiores que el péptido p37-45 procesado de forma natural. La puntuación de unión procede de una semivida de disociación predicha con la molécula HLA-A2 clase I. El análisis se basa en tablas de coeficientes deducidas de la bibliografía publicada por Dr. Kenneth Parker kparker@atias.niaid.nih.gov, NIAID, NIH.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA LII

87

88

En un análisis separado, se usó modelado por ordenador para identificar análogos de epítopos peptídicos del epítopo de WT1 p37-45. Las coordenadas de la estructura nativa de HLA-A2 se descargaron de la base de datos de proteínas Brookhaven (pdb I.D.: 3HLA) (L. L. Walsh, "Annotated PDB File Listing", Protein Science 1:5, Diskette Appendix (1992). Este archivo se usó como molde para manipulaciones con el programa SwissModel (Peitsch MC (1996) ProMod y SwissModel: Internet-based tools for automated comparative protein modeling. Biochem. Soc. Trans. 24: 274-279) disponible a través del sitio web Expasy (Appel R. D., Bairoch A., Hochstrasser D. F. A new generation of information retrieval tools for biologists: the example of the ExPASy WWW server. Trends Biochem. Sci. 19: 258-260(1994). El péptido unido a la proteína se mutó manualmente para dar el péptido p37-45 WT unido. La nueva estructura se sometió a tres rondas de minimización de la energía con la aplicación GROMOS96 del Swiss-PdbViewer; se realizaron dos minimizaciones de la energía sobre la estructura completa, seguidas de una ronda con los restos desfavorables seleccionados. Una evaluación final mostraba un estado de energía global favorable para el modelo. La representación de Ramachandran indicaba que sólo un resto no glicinilo está lejos en regiones desestimadas. Los péptidos identificados usando el método de modelado descrito en este documento se exponen en la Tabla LIII a continuación.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA LIII

89

Después se ensayaron varios péptidos identificados usando los dos métodos descritos anteriormente para determinar la capacidad para ser reconocidos por el clon de CTL específico de p37-45 (véase el Ejemplo 24). El análisis de ELISPOT mostraba que los péptidos p37-1 (SEC ID Nº: 426) y modelo 1 (SEC ID Nº: 445) eran reconocidos por el clon de CTL p37-45. Estos resultados sugieren que se predice que estos 2 análogos peptídicos se unen a HLA-A2 con mayor afinidad que el epítopo procesado de forma natural y todavía son reconocidos por un receptor de células T nativo.

Por lo tanto, este experimento describe la identificación por ordenador de epítopos WT1 que se ha predicho que se unen a HLA-A2 con mayor afinidad que epítopos procesados de forma natural. Se ensayaron dos de los epítopos identificados y se demostró que eran reconocidos por un clon de CTL generado con el epítopo p37-45 de WT1 nativo. Los epítopos identificados en este documento tienen utilidad en vacunas y/o estrategias inmunoterapéuticas para el tratamiento de cánceres asociados con la expresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 31 La inmunogenicidad in vivo del antígeno WT1

Este ejemplo describe tres estudios de inmunogenicidad in vivo para evaluar estrategias de vacunación con WT1 en ratones. Las tres estrategias comprendían: 1) una sensibilización y refuerzo con vacuna de ADN desnudo; 2) una sensibilización con adenovirus atenuado seguida de un refuerzo con alfavirus atenuado; o 3) una sensibilización con ADN desnudo seguida de un refuerzo con adenovirus. El ADNc de longitud completa de la VARIANTEe de corte y empalme de WT1 usado en estos estudios se expone en la SEC ID Nº: 381. Los resultados descritos en este documento proporcionan respaldo para el uso de regímenes de sensibilización/refuerzo de ADN/ADN, ADN/adenovirus o adenovirus/alfavirus de WT1 como estrategias vacunales para tratar cánceres asociados con la expresión de WT1.

En el primero estudio, se inmunizaron ratones C57/B16 3 veces a intervalos de 2 semanas con 100 \mug de ADN desnudo que codifica WT11. Se sacrificaron los ratones 2-3 semanas después de la inmunización final y se evaluaron los CTL mediante ensayo de liberación de cromo convencional. El primer estudio mostraba que la inmunización con ADN de WT1 genera respuestas de células T citotóxicas específicas de WT1 en estos ratones con una proporción de E:T de 25:1 que mostraba una lisis de 40%.

En el segundo estudio, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2/Kb una vez con 5 x 10^{8} UFP de adenovirus atenuado que codifica WT1 (como se describe en el Ejemplo 20), seguido 4 semanas después de un refuerzo con 5 x 10^{6} UFP de alfavirus (AlphaVax) que codifica WT1. Se sacrificaron los ratones 2-3 semanas después de la inmunización final y se evaluaron los CTL mediante un ensayo de liberación de cromo convencional. Los resultados mostraban que los CTL específicos de WT1 en ratones transgénicos HLA-A2/Kb lisaban específicamente células dendríticas (DC) transducidas con una construcción viral que expresa WT1 así como DC estimuladas con péptidos WT1. Por lo tanto, esta estrategia de inmunización también genera eficazmente CTL específicos de WT1 in vivo.

En el tercer estudio, se inmunizaron ratones transgénicos C57/Bl6 y HLA-A2/Kb dos veces con 100 \mug de ADN de WT1 desnudo separadas 2 semanas, seguido 3 semanas después de un refuerzo con 7 x10^{8} UFP de adenovirus que codifica WT1. Los ratones se sacrificaron 2-3 semanas después de la inmunización final y se evaluaron los CTL mediante ensayo de ELISPOT de IFN-\gamma. Los resultados mostraban que la sensibilización-refuerzo con adenovirus y ADN de WT1 genera una respuesta de células T CD8 específicas para WT1 en ratones transgénicos HLA-A2/Kb. Aproximadamente 42% de las células positivas para CD8 se teñían positivas para IFN-\gamma después de una estimulación de 7 días con DC transducidas con WT-1. Los resultados de los ratones C57/BL6 mostraban que esta estrategia de inmunización genera respuestas de CD8 detectables en esplenocitos recién preparados. Se estimularon esplenocitos durante 6 horas con combinaciones de 10 péptidos de 15 aminoácidos solapantes en 11 aminoácidos que abarcan la proteína WT1 completa. Sólo las células estimuladas con el p121-171 mostraban tinción de IFN-\gamma. Aproximadamente 1,1% de estas células T CD8 estimuladas con la combinación de péptido p121-171 se teñían positivas para IFN-\gamma. Este péptido contiene el péptido p117-139 (SEC ID Nº: 2) que se muestra en el Ejemplo 3 que genera respuestas de CTL, células T auxiliares y anticuerpos en ratones.

En resumen, estos resultados muestran que las tres estrategias de inmunización ensayadas en este documento generan respuestas de células T in vivo. Por lo tanto, estos estudios confirman adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína WT1 y proporcionan respaldo para el uso de regímenes de sensibilización/refuerzo de ADN/ADN, ADN/adenovirus o adenovirus/alfavirus de WT1 como estrategias vacunales para tratar cánceres asociados con la expresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 32 Reducción en el crecimiento de tumores WT1+ en ratones transgénicos HLA-A2/Kb inmunizados con proteína WT1

Este ejemplo describe la reducción de tumores WT1+ en ratones transgénicos inmunizados con una vacuna de WT1. Estos resultados validan adicionalmente a WT1 como una diana vacunal y proporcionan respaldo para el uso de WT1 en estrategias vacunales para el tratamiento de cánceres asociaciones con la expresión de WT1.

La línea de células dendríticas murinas (DC) DC2.4 se transdujo de forma estable con una construcción WT1-LAMP (véase el Ejemplo 18, las secuencias de ADNc y proteína expuestas en las SEC ID Nº 382 y 409, respectivamente). Después se inocularon ratones por vía subcutánea (s. c.) o por vía intraperitoneal (i. p.) con 2 x 10^{6}. Esto dio como resultado un crecimiento tumoral en 80-100% de los ratones. Los tumores establecidos en ratones in vivo conservaban su expresión de WT1. Por lo tanto, este modelo proporciona un sistema en el que validar la eficacia de estrategias vacunales de WT1.

Después se inmunizaron tres grupos de ratones A2/Kb 3 veces, separadas por 2 semanas de la forma siguiente:

Grupo 1: solución salina en solitario s. c. (control, n = 10 ratones)

Grupo 2: 10 \mug de MPL-SE en solitario s. c. (control, n = 10 ratones)

Grupo 3: 100 \mug de proteína Ra12/WT1 + 10 \mug de MPL-SE s. c. (n = 9 ratones).

De dos a tres semanas después de la última inmunización con WT1, se inoculó a los ratones 2 x 10^{6} células tumorales A2/Kb DC2.4 que sobreexpresaban WT1. Después de la exposición a tumores se controlaron los ratones y se midió el tamaño tumoral dos veces por semana hasta cuatro semanas después de la exposición a tumor.

Los resultados mostraban que el porcentaje de ratones con crecimiento tumoral en el grupo que recibió la vacuna de proteína WT1 se reducía de aproximadamente 100% (control de solución salina) o 90% (control de adyuvante MPL-SE) a 45% (grupo inmunizado con proteína WT1). Además, el volumen medio tumoral se redujo en este grupo de un tamaño medio tumoral de 1233 cmm (control de solución salina) o 753 cmm (control de adyuvante MPL-SE) observado en el grupo de control a 226 cmm en el grupo inmunizado con proteína WT1. Los análisis histopatológicos mostraban que los márgenes tumorales en animales vacunados estaban mezclados con reacciones inmunológicas del hospedador que incluían histiocitos, eosinófilos, linfocitos, mastocitos y células plasmáticas. En conjunto, los resultados demuestran que la inmunización con proteína WT1 protege contra o retrasa el crecimiento de tumores positivos para WT1 en los animales inmunizados con WT1. Por lo tanto, estos resultados respaldan el uso de proteína WT1 como una vacuna para tumores malignos asociados con expresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 33 Identificación de un epítopo de células T citotóxicas contra WT1 procesado de forma natural

Este ejemplo describe la identificación de un epítopo procesado de forma natural de la proteína WT1 reconocido por células T citotóxicas. Este experimento confirma adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína WT1 y proporciona respaldo para su uso como una diana para vacunas y/u otras estrategias inmunoterapéuticas. Además, este experimento identifica epítopos de la proteína WT1 que pueden usarse en estas aplicaciones.

Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-A2/Kb dos veces con 100 \mug de ADN WT1 desnudo separadas por 2 semanas, seguido 3 semanas después de un refuerzo con 10^{7} UFP de adenovirus que codifica WT1. Se sacrificaron ratones 2-3 semanas después de la inmunización final y se evaluaron los CTL mediante ensayo de liberación de cromo convencional. Como se ha observado en experimentos previos, la inmunización con ADN de WT1 seguida de refuerzo adenoviral generaba una respuesta de CTL específicos de WTL1 en ratones transgénicos HLA-A2. Para identificar qué epítopos eran reconocidos por las células T, se generaron líneas de CTL y se clonaron mediante dilución limitante usando protocolos convencionales. Después se ensayó un clon positivo usando como células diana células DC2.4 A2/Kb estimuladas con péptidos que se corresponden con los 20 mejores epítopos de CTL restringidos por HLA-A2 predichos. Los resultados mostraban que el péptido nonamérico p10-18 de WT1 (aminoácidos: ALLPAVPSL, expuesto en la SEC ID. Nº 451) era reconocido por este clon de CTL. Se había predicho anteriormente que este epítopo era un epítopo, como se describe en la Tabla XLVI, SEC ID Nº: 34. En un experimento adicional, se observaron respuestas de CTL contra el péptido p10 en 4 de 5 animales inmunizados con WT1 ensayados. Por lo tanto, este experimento demuestra que el epítopo de WT1 p10-18 predicho se procesa de forma natural y se reconoce por CTL. Además, este experimento confirma la inmunogenicidad de la proteína WT1 y define adicionalmente un epítopo de CTL restringido por HLA-A2 procesado de forma natural que puede usarse en estrategias vacunales e inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores malignos asociados con la sobreexpresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 34 Construcciones de expresión de WT1 usando péptido señal de translocación de la doble arginina (TAT)

Este ejemplo describe la construcción de vectores WT1-TAT y la expresión de WT1-TAT a partir de estos vectores. Estas construcciones tienen utilidad en la expresión de moléculas WT1-TAT para el uso en estrategias de
vacunación.

Se construyeron WT-1-F (aminoácidos 2-281 de la proteína WT1; el ADNc y la secuencia de aminoácidos de 2-281 de WT1 se exponen en las SEC ID Nº: 460 y 461, respectivamente) y WT-1 de longitud completa como fusiones con pTAT sin marcador His, como se describe a continuación. Las secuencias de ADNc y aminoácidos de las fusiones resultantes se exponen en las SEC ID Nº: 452 y 453 y SEC ID Nº: 454 y 455, respectivamente.

La fase de lectura abierta de WT-1-F se amplificó por PCR con los siguientes cebadores:

90

La fase de lectura abierta de longitud completa WT-1 se amplificó con los siguientes cebadores:

91

Las condiciones de PCR eran las siguientes: 10 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada oligonucleótido 1 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA), 50 ng de ADN (pPDM FL WT-1). La reacción se desnaturalizó a 96ºC durante 2 minutos, seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 64ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 2 minutos, 30 segundos y una única extensión final de 4 minutos a 72ºC.

Los productos de PCR se digirieron con EcoRI y se clonaron en pTAT (un vector pET28 modificado con un péptido señal de Translocación de la Doble Arginina (TAT) del péptido señal TorA en E. coli en el extremo N-terminal; véase, Mol. Microbiol. (2000) 2 (2): 179-189; Journal of Bacteriology, ene 2001 págs. 604-610 Vol 183, Nº 2; Journal of Biochemistry Vol 276, 16 marzo 2001 págs. 8159-8164) en los sitios Eco72I y EcoRI. La secuencia se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S y HMS 174 (DE3) pLysS. La expresión de las proteínas WT1-TAT se confirmó mediante análisis de Western.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 35 El extremo N-terminal de WT1 es la porción inmunógena dominante in vivo de la proteína

En este Ejemplo, se inmunizaron ratones con diferentes construcciones de proteína WT-1 (truncamiento F (2-281) y longitud completa (2-430), como se describen en el Ejemplo 34)) formuladas con adyuvante MPL-SE. Se generaron respuestas de CD4 mejoradas mediante las construcciones truncadas respecto a la proteína de longitud completa. Por lo tanto, este ejemplo demuestra que la porción N-terminal de la proteína WT1 que abarca desde el aminoácido 2 hasta el 281 es la porción inmunógena dominante de la proteína WT1 in vivo.

Se inmunizaron grupos de cuatro ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 20 \mug de proteínas WT-1: WT-1-F o WT-1 de longitud completa (FL) con fusiones de R12, HIS o TAT. Se realizaron inmunizaciones las semanas 0, 3 y 9 y se extirparon los bazos la semana 11. Después se estimularon los esplenocitos in vitro durante 6 horas con medio en solitario, con un péptido de 15 aminoácidos "p32" (ARMFPNAPYLPSCLE, aminoácidos 125-139 de WT-1; que se encuentra dentro del péptido p117-139 expuesto en la SEC ID Nº: 2), con la línea celular DC2.4-WT-1/LAMP o con rRa12. Después las células CD4 se tiñeron para interferón-gamma intracelular y se cuantificaron mediante análisis de FACS. Una porción de estos esplenocitos se estimularon después in vitro durante 8 días, después de lo cual se enumeraron las células CD4+ IFN+. Después de la estimulación de 6 horas con p32, 0,33% de las células positivas para CD4 eran positivas para tinción de IFN-gamma intracelular en ratones inmunizados con la construcción N-terminal truncada rWT1-F-TAT. Por el contrario, sólo 0,10% de células positivas para CD4 se tiñeron positivas para IFN-gamma intracelular en ratones inmunizados con rWT1-FL-TAT. Después de la estimulación de 8 días, los ratones inmunizados con la construcción rWT1-F-TAT mostraban tinción de IFN-gamma en 10,72% de las células CD4+. Por el contrario, 0,24% de las células positivas para CD4 de ratones inmunizados con la construcción WT1 de longitud completa-TAT se tiñeron positivas para IFN-gamma intracelular. Estos datos indican que se generaron respuestas de CD4
mejoradas mediante la construcción rWT1 truncada-TAT respecto a la construcción rWT1 de longitud completa-TAT.

En un segundo ensayo se estimularon esplenocitos in vitro con el péptido de 23 aminoácidos, p117-139 (SEC ID Nº: 2; PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE, que contiene un epítopo de CD4 conocido y que incluye "p32"), durante 3 días, después de los cuales se ensayaron los sobrenadantes para determinar el IFN-gamma secretado mediante ELISA. No había secreción de IFN-gamma detectable a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con las construcciones de WT1 de longitud completa. Por el contrario, se detectó un promedio de 2477 pg/ml de IFN-gamma a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con rWT1-F sin marcador HIS. Se detectó un promedio de 4658 pg/ml de IFN-gamma a partir de esplenocitos de ratones inmunizados con rWT1-F-TAT. Estos datos confirman adicionalmente la observación de que se generaban respuestas de CD4 mejoradas mediante las construcciones de WT1 truncada N-terminalmente respecto a la proteína de longitud completa.

La proteína WT1 es un factor de transcripción que está compuesto por dos dominios funcionales: un dominio rico en prolina-glutamina en el extremo N-terminal y un dominio de dedo de cinc compuesto por cuatro de dedos de cinc en el extremo C-terminal con homología con la familia de EGR1/Sp1 de factores de transcripción. WT1 es una proteína propia. El extremo C-terminal es homólogo a otras proteínas propias y por lo tanto es menos inmunógeno, es decir, está sujeto a un menor grado de tolerancia inmunológica. Cabe señalar que los 4 dominios de dedos de cinc dentro del extremo C-terminal tienen homología con miembros de la familia de EGR. Los resultados descritos en este ejemplo indican que la tolerancia variará entre porciones diferentes de una proteína, posiblemente dependiendo de las homologías de secuencia y de dominios funcionales.

En resumen, los datos descritos en este ejemplo confirman la idea de que la vacuna de WT1 más eficaz comprenderá el extremo N-terminal de WT1, como una proteína recombinante o una construcción basada en genes.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 36 Construcciones de expresión de baculovirus para la expresión del fragmento N-terminal de WT1 (WT-1-F: aminoácidos 1-281) y producción a gran escala de proteína usando células de insecto

El ADNc para el fragmento N-terminal de WT-1, junto con una secuencia de consenso de Kozak, se obtuvieron mediante PCR usando el plásmido WT1-F como molde (WT-1-F: aminoácidos 2-281 de la proteína WT1 clonados cadena abajo de una metionina de inicio; el ADNc y la secuencia de aminoácidos de 2-281 de WT1 se exponen en las SEC ID Nº: 460 y 461, respectivamente. La construcción de fusión pTAT usada como molde en los experimentos descritos en este documento se describe en el Ejemplo 34. El ADNc de esta construcción se expone en la SEC ID Nº: 452). Se usaron los siguientes cebadores para amplificación:

92

El ADNc para la misma ORF más un marcador His de 10 restos C-terminal se obtuvo por PCR de forma similar a anteriormente excepto por el uso de WT1 RV3 (SEC ID Nº: 468) como cebador inverso (5' CGGCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGATGCTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG).

Los productos de PCR purificados se clonaron en el sitio Xba I del plásmido donante, pFastBac1. El plásmido donante recombinante pFBWT1-F (secuencias de ADNc y aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 463 y 465, respectivamente) y pFBWT1-FH (con el marcador His 10X; secuencias de ADNc y aminoácidos expuestas en las SEC ID Nº: 462 y 464, respectivamente) se usaron para transformar la cepa de DH10Bac de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) para hacer bácmidos recombinantes en E. coli a través de una transposición específica de sitio. Los bácmidos recombinantes se confirmaron mediante análisis de PCR y después se transfectaron en células de insecto Sf-9 para preparar baculovirus recombinantes BVWT1-F y BVWT1-FH. Los virus recombinantes se amplificaron hasta una reserva viral de alto título en células Sf-9.

Se usó la línea celular de insecto High Five para optimizar las condiciones para la expresión de proteína y para la producción a gran escala de las proteínas recombinantes. Para optimizar las condiciones para la expresión de proteína, se infectaron monocapas de células de insecto High 5 con los baculovirus recombinantes BVWT-F y BVWT1-FH a diferentes multiplicidades de infección (MOI) y se recogieron las células transducidas a diferentes periodos de tiempo. Se confirmaron las identidades de las proteínas mediante análisis de transferencia de Western con un anticuerpo policlonal de conejo anti-WT1 [nº 942-32 (799L)]. Las proteínas recombinantes tanto WT1-F como WT1-FH se expresaban bien a 48 horas o 54 horas post-infección cuando se infectaron células High 5 mediante los virus recombinantes a una MOI de 1,0 ó 2,0.

La amplificación de los baculovirus recombinantes y la expresión de las proteínas WT1-F y WT1-FH recombinantes se optimizaron adicionalmente. Se amplificaron tanto BVWT1-F como BVWT1-FH en la línea celular de insecto Sf9 en medio ESF921 que contenía suero fetal de ternera a 2% y PSF 0,5X. La amplificación se llevó a cabo durante 4 días a una MOI de 0,05 a 28ºC. Se usó la línea celular de insecto High Five para optimizar las condiciones para la expresión de proteína. Se infectaron células de insecto High 5 mediante los baculovirus recombinantes a una MOI de 0,5, 1 ó 2 durante 30, 48, 54 ó 72 horas antes de la recogida. La identidad de la proteína recombinante se confirmó mediante análisis de transferencia de Western con un anticuerpo policlonal de conejo específico contra WT1 (Anticuerpo nº 942-32) y mediante CL capilar-ES-espectrometría de masas en tándem. Estos experimentos indican que la expresión de proteína óptima para la producción a gran escala de WT1-F y WT1-FH se produce a las 43 horas post-infección cuando se infectaban células High 5 mediante los virus recombinantes a una MOI de 0,5-1,0.

En resumen, pueden usarse los baculovirus de WT1 anteriores para la producción de proteína a gran escala de la porción N-terminal de WT1 para el uso en una diversidad de estrategias vacunales para el tratamiento de tumores malignos asociados con la expresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 37 Inducción de respuestas de células T CD4 y CD8 in vivo en ratones usando vectores de vaccinia y virus de la viruela aviar TRICOM recombinantes

Este ejemplo describe estudios de inmunogenicidad in vivo para evaluar estrategias de vacunación con WT1 en ratones. El propósito de estos experimentos era ensayar la capacidad de rV-WT1/TRICOM y rF-WT1/TRICOM para inducir inmunidad, en particular inmunidad de células T, contra WT1. Los resultados descritos en este documento proporcionan respaldo para el uso de vectores de vaccinia y virus de la viruela aviar TRICOM que expresan WT1 y que contienen una tríada de moléculas coestimuladoras (B7-1, ICAM-1 y LFA-3) en estrategias vacunales para tratar cánceres asociados con la expresión de WT1.

En el primer estudio, se inmunizaron ratones C57BI/6 (12 ratones por grupo) dos o tres veces con 14 días entre las inmunizaciones primaria, secundaria y terciaria como se muestra a continuación en la Tabla 1. Los ratones se recogieron a los 21 días después de las inmunizaciones secundaria y terciaria. Se ensayaron las respuestas de células T CD8 y CD4 mediante tinción de citoquina intracelular IFN-\gamma de células de bazo activadas por péptido WT1, como se describe con más detalle a continuación. Adicionalmente, se ensayaron las respuestas de células T CD4 mediante liberación de IFN-\gamma a partir de células de bazo estimuladas con proteína rWT1. Se ensayaron por ELISA las respuestas de anticuerpos séricos IgG_{1} e IgG_{2b}. Se evaluaron las respuestas de células T usando cultivos de esplenocitos combinados (4 ratones/grupo/punto de tiempo). Se determinaron los títulos de anticuerpos para ratones individuales (4 ratones/grupo/punto de tiempo).

TABLA 1 Estrategia de vacunación

93

El ADNc de longitud completa de la VARIANTEe de corte y empalme de WT1 usada en estos estudios se expone en la SEC ID Nº: 381. El adenovirus con WT1 usado en este documento es como se describe en el Ejemplo 20. Ambos vectores de virus de la viruela aviar recombinante rF-WT1/TRICOM y de vaccinia recombinante rVWT1/TRICOM que expresaban WT1 y contenían una tríada de moléculas coestimuladoras (B7-1, ICAM-1 y LFA-3) se generaron por Therion Biologics (Cambridge, MA, Estados Unidos).

Para evaluar respuestas de células T, se estimularon esplenocitos in vitro con péptido WT1 "p32" (ARMFPNAPYLPSCLE, aminoácidos 125-139 de WT-1; que se encuentra dentro del péptido p117-139 expuesto en la SEC ID Nº: 2) que se sabe que contiene un epítopo de CTL y células T auxiliares. La tinción de citoquinas intracelulares para IFN-\gamma de esplenocitos activados por p125-139 a los 21 días después de la inmunización secundaria mostraba un porcentaje significativo de células T CD4^{+} y CD8^{+} sensibles a WT1 en ratones inmunizados con rV-WT1/TRICOM (sensibilización) y rF-WT1/TRICOM (refuerzo), mientras que ningún otro grupo mostraba respuestas inmunes de células T específicas de WT1 significativas. Obsérvese que el grupo de ADN se sensibilizó y reforzó con ADN solamente. El mismo grupo tenía posteriormente una inmunización terciaria con rWT1-Adv.

Después de la inmunización terciaria, se evaluaron las respuestas contra combinaciones de péptidos de 15 aminoácidos solapantes más que las respuestas contra el péptido individual nº 32. Se descubrió que las células T CD8^{+} y CD4^{+} contra péptido WT1 específicas para la combinación de péptidos nº 32-36 respondían a niveles similares a las respuestas después de la inmunización secundaria en ratones vacunados con rV-WT1/TRICOM (sensibilización) y rF-WT1/TRICOM (refuerzo X2). Además, se descubrió que las células T CD4^{+} y CD8^{+} de estos ratones respondían, aunque a un nivel mucho menor que al péptido nº 32, contra un segundo epítopo de WT1 contenido dentro de dos péptidos solapantes de 15 aminoácidos nº 57-58 (Péptido 57: DNLYQMTSQLECMTWN (aminoácidos 224-239); Péptido 58: MTSQLECMTWNQMNL (aminoácidos 229-243); el solapamiento se corresponde con los restos aminoacídicos 224-243 de WT1.

Se evaluaron las respuestas de anticuerpos usando un ELISA convencional. Eran medibles niveles reducidos de anticuerpos séricos IgG_{2b} contra WT1 en los 8 ratones 21 días después de la inmunización secundaria (título de 1:1350) y 21 días después de la inmunización terciaria (título de 1:3325) en ratones inmunizados con rWT1 + MPL-SE. Por el contrario, en todos los demás grupos los títulos de anticuerpos séricos IgG_{2b} eran de <1:100 (Tabla 2).

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2 Respuestas de anticuerpos en ratones inmunizados con WT1

95

En resumen, la inmunización de ratones C57BI/6 con rV-WT1/TRICOM (sensibilización) seguida de rF-WT1/
TRICOM (refuerzo) o mediante WT1-ADN (sensibilización) seguida de WT1-Adeno (refuerzo) generaba respuestas de células T tanto CD8 como CD4 contra WT1. Las respuestas de células T contra rV-WT1/TRICOM seguido de rF-WT1/TRICOM frente a WT1-ADN seguido de WT1-Adeno eran equivalentes dentro de la potencia del diseño experimental. Sin ligarse a teoría alguna, una ventaja principal de rF-WT1/TRICOM es que los refuerzos múltiples pueden continuar aumentando el nivel de inmunidad. Por lo tanto, estos estudios confirman adicionalmente la inmunogenicidad de la proteína WT1 y proporcionan respaldo para el uso de regímenes de inmunización de WT1-ADN/adenovirus o rv-WT1/TRICOM/rF-WT1/TRICOM en estrategias vacunales para tratar cánceres asociados con la expresión de WT1.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 38 Construcción del vector STUMPY-WT1-F para la expresión de WT1-F en E. coli

Este ejemplo describe la construcción de un vector de expresión que contiene un péptido señal de translocación de la doble arginina (TAT) truncado fusionado con la fase de lectura de WT1-F (porción N-terminal 2-281 de la proteína WT1). Este vector puede usarse para producir una sola especie de proteína TAT-WT1-F truncada para el uso en estrategias de inmunización para el tratamiento de tumores malignos asociados con la expresión de WT1.

Cómo se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 34, la secuencia señal TAT se usó para preparar diversos vectores de WT1. Cuando se usaron estos vectores TAT en la expresión, se observaron múltiples formas de la proteína. La secuenciación N-terminal de estas formas mostraba que cada una de las tres proteínas separadas que se estaban expresando eran truncamientos del péptido TAT. Estas escisiones se estaban produciendo en cada uno de los sitios de doble arginina. Por lo tanto, se construyó un vector de TAT truncado para acortar el péptido señal TAT de 39 aminoácidos a 12 aminoácidos, para evitar la generación de estos productos de escisión durante la expresión. Se generó el vector corto "Stumpy" de TAT manteniendo los primeros 12 restos del péptido señal TAT hasta la primera doble arginina. Este vector se construyó de la forma siguiente:

Se combinaron las siguientes parejas de oligonucleótidos y después se hibridaron.

Pareja 1:

96

Pareja 2:

97

Después las parejas se ligaron entre sí con pPDM, un vector pET28 modificado que se había digerido con NdeI y EcoRI. El plásmido resultante, pStumpy, se expone en la SEC ID Nº: 471. La secuencia de aminoácidos de la proteína TAT truncada se expone en la SEC ID Nº: 506. El polinucleótido de TAT de longitud completa se expone en la SEC ID Nº: 503 y codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido TAT expuesto en la SEC ID Nº: 504.

Después se usó el vector pStumpy para construir el vector Stumpy-WT1-F para expresar la porción N-terminal de WT1 sin productos de escisión. Se construyó el vector Stumpy-WT1-F de la forma siguiente:

La región codificante de WT1-F se amplificó por PCR con el siguiente conjunto de cebadores:

98

La reacción de amplificación contenía 10 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada cebador 10 \muM, 83 \mul de agua estéril y 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA). La reacción se desnaturalizó primero durante 2 minutos a 96ºC seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 63ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Después la reacción se prolongó durante una extensión final de 72ºC durante 4 minutos.

El producto de PCR se digirió después con EcoRI y se clonó en el vector pStumpy que se había digerido con Eco72I y EcoRI. La construcción se confirmó mediante análisis de secuencia y después se transformó en células BLR (DE3) pLys S. La proteína de fusión TAT truncada WT1-F resultante se expresaba como una sola especie. La secuencia polinucleotídica de la región codificante de pStumpy WT1-F se expone en la SEC ID Nº: 469, que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 470.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 39 Construcción de vectores WT1-F GMP, WT1-G, y WT1-Delta G para la expresión en E. coli

Este ejemplo describe la construcción de vectores WT1-F, WT1-G, y WT1-Delta G optimizados para la producción de proteínas en E. coli.

Se optimizaron los codones de la secuencia de ADN de TAT WT-1 F y se modificaron sintéticamente por Blue Heron Biotechnology (Bothel, WA) para optimizarse para la expresión en E. coli. Esta secuencia de ADNc de WT1-F de codones optimizados se expone en la SEC ID Nº: 477 y codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 479. El plásmido que contenía esta secuencia se digirió después con NdeI y EcoRI y se subclonó en un vector pET28 modificado que se había digerido con NdeI y EcoRI para la expresión en E. coli. Se confirmó que esta construcción era correcta mediante análisis de secuencia de ADN y después se usó para transformar células BLR (DE3) pLys S para expresión. Esta construcción es una fuente rastreable puramente sintética de ADN molde de TAT WT1-F.

La secuencia de codones optimizados se usó después como molde para PCR para delecionar una región rica en prolina de catorce aminoácidos de la región N-terminal (deleción de aminoácidos 54-67 de la secuencia de WT-1 F expuesta en la SEC ID Nº: 461; que se corresponde con los aminoácidos 55-68 de la WT1 de longitud completa), generando la secuencia de ADNc de WT-1 G expuesta en la SEC ID Nº: 473 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 478. Esto se realizó generando primero la construcción pTAT-WT-1 G de la forma siguiente:

La región codificante 5' de WT-1 G se amplificó por PCR usando el siguiente conjunto de cebadores:

99

La región codificante 3' de la región de WT-1 G se amplificó por PCR usando el siguiente conjunto de cebadores:

100

La reacción de PCR para la amplificación de WT1-G contenía 10 \mul de tampón de Pfu 10X, 1 \mul de dNTP 10 mM, 2 \mul de cada cebador 10 \muM, 83 \mul de agua estéril, 1,5 \mul de ADN polimerasa Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) y 50 ng de molde de ADN (pTAT WT1-F de codones optimizados como se expone en la SEC ID Nº: 477). La reacción se desnaturalizó primero durante 2 minutos a 96ºC seguido de 40 ciclos de 96ºC durante 20 segundos, 63ºC durante 15 segundos y 72ºC durante 30 segundos. Después la reacción se prolongó durante una extensión final de 72ºC durante 4 minutos.

El primer producto de PCR se digirió después con XbaI y se clonó en pPDM (un vector pET28 modificado) que se había digerido con XbaI y Eco72I. La construcción resultante (pTAT WT1-GA) se digirió después con SrfI y EcoRI. La segunda construcción de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en la construcción plasmídica pTAT WT1-GA. Al mismo tiempo se llevó a cabo una ligación de tres vías digiriendo la primera construcción de PCR con XbaI y SrfI y digiriendo la segunda construcción de PCR con EcoRI y clonándola en pPDM que se había digerido con XbaI y EcoRI. Se confirmó que la construcción pTAT-WT1-G resultante era correcta mediante análisis de secuencia y después se usó para transformar un hospedador de expresión. El ADNc de pTAT-WT1-G se expone en la SEC ID Nº: 475 y codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 482.

Debido a la digestión incompleta con SrfI durante el segundo método descrito anteriormente, se generó una forma inesperada de WT-1 G (WT-1 Delta G) que tenía delecionados 14 aminoácidos (aminoácidos 55-68 de WT-1 F) y añadidos tres aminoácidos adicionales (secuencia polinucleotídica de WT-1 Delta G expuesta en la SEC ID Nº: 505 que codifica la secuencia polipeptídica expuesta en la SEC ID Nº: 502). Esta construcción TAT WT-1 Delta G dio como resultado una sobreexpresión inesperada de 5 veces en comparación con las construcciones de TAT WT-1 F. El ADN de la construcción pTAT-WT1 Delta G se expone en la SEC ID Nº: 476 y codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 481.

Después de la generación de pTAT-WT1 G, pStumpy-WT1 G y WT1-G, se construyeron con y sin un marcador His usando el pTAT-WT1 G como molde en las reacciones de PCR que se describen a continuación.

La región codificante de la región WT1-G se amplificó por PCR usando los siguientes conjuntos de cebadores:

PCR 1:

101

PCR 2:

102

La reacción de PCR y las condiciones de amplificación eran como se han descrito anteriormente usando el pTAT-WT-1 G expuesto en la SEC ID Nº: 475 como molde. El primer producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en pPDM (un vector pET28 modificado con un marcador his en fase de lectura) y pSTUMPY (un vector pET28 modificado con un péptido líder de TAT truncado de 12 aminoácidos en fase de lectura expuesto en la SEC ID Nº: 471) que se digirieron con EcoRI y Eco721. El segundo producto de PCR se digirió con NdeI y EcoRI y se clonó en un vector pET28 modificado (pPDM) que se había digerido con NdeI y EcoRI. Se confirmó que las construcciones eran correctas mediante análisis de secuencia y después se usaron para transformar un hospedador de expresión. Las construcciones resultantes eran las siguientes: El polinucleótido de WT1-G con marcador His se expone en la SEC ID Nº: 472 y codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 480. El polinucleótido de WT1-G sin marcador His se expone en la SEC ID Nº: 473 que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 478. La secuencia polinucleotídica de pStumpy-WT1-G se expone en la SEC ID Nº: 474 y codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 483.

En un experimento relacionado, se construyó el vector pStumpy WT-1 F GMP (de codones optimizados) de la forma siguiente:

La región codificante de la región WT-1 F se amplificó usando los siguientes cebadores

1200

La reacción de PCR y las condiciones de amplificación eran como se han descrito anteriormente usando pTAT WT-1 F GMP como molde. El producto de PCR se digirió con EcoRI y se clonó en el vector pStumpy descrito en el Ejemplo 38 que se digirió con EcoRI y Eco72I. Se confirmó que la construcción era correcta mediante análisis de secuencia y después se usó para transformar un hospedador de expresión. La secuencia polinucleotídica de pStumpy WT-1 F GMP se expone en la SEC ID Nº: 498 que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 499.

En resumen, los vectores de expresión descritos en este documento pueden usarse para la expresión y producción optimas de WT1, WT1 truncada y proteínas de fusión de WT1 para el uso en estrategias vacunales para el tratamiento de tumores malignos asociados con la expresión de WT1.

A partir de lo anterior se apreciará que, aunque se han descrito realizaciones específicas de la invención en este documento con fines ilustrativos, pueden realizarse diversas modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones adjuntas.

<110> Corixa Corporation

\hskip1cm

Gaiger, Alexander

\hskip1cm

McNeill, Patricia D.

\hskip1cm

Jaya, Nomalie

\hskip1cm

Carter, Darrick

\vskip0.400000\baselineskip

<120> COMPOSITIONS y METHODS FOR WT1 SPECIFIC IMMUNOTHERAPY

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 210121.46502PC

\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT

\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2002-10-30

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 506

\vskip0.400000\baselineskip

<170> FastSEQ for Windows Version 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

147

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

148

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

149

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

151

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

152

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

153

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

157

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

158

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

159

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

160

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

163

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

165

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

166

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

169

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

171

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

172

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

173

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

174

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

175

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

176

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

177

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

178

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

185

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

186

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

187

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

188

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

190

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

191

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

192

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

193

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

194

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

195

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

196

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

197

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

198

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

199

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

200

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

201

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

202

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

203

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

204

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

205

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

206

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

207

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

208

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

209

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

211

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

212

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

213

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

214

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

216

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

217

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

218

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

219

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

220

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

221

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

222

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

223

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

224

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

225

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

226

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

227

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

228

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

229

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

230

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

231

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

232

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

233

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

234

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

235

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

236

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

237

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

238

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

239

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

240

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

241

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

242

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

243

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

244

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

245

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

246

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

247

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

248

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

249

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

250

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

251

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

252

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

253

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

254

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

255

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

256

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

257

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

258

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

259

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<273> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

260

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

261

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

262

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

263

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

264

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

265

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

266

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

267

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

268

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

269

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

270

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

271

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

272

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

273

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

274

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

275

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

276

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

277

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

278

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

279

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

280

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

282

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

283

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

284

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

285

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

286

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

287

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

288

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

289

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

290

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

291

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

292

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

293

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

294

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

295

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

296

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

297

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

298

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

299

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

300

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

301

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

302

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

303

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

304

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

305

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

306

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

307

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

308

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

309

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

310

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

311

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

312

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

313

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

314

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

315

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

316

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

317

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

318

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

319

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

320

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

321

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

322

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

323

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

324

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

325

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

326

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

327

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

328

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

329

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

330

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

331

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

332

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

333

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

334

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

335

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

336

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

337

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

338

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

339

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

340

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

341

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

342

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

343

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

344

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

345

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

346

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

347

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

348

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

349

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

350

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

351

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

352

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

353

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

354

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

355

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

356

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

357

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

358

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 258

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 258

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

359

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 259

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 259

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

360

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 260

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 260

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

361

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 261

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 261

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

362

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 262

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 262

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

363

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 263

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

364

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 264

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 264

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

365

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 265

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 265

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

366

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 266

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 266

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

367

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 267

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

368

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 268

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 268

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

369

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 269

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 269

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

370

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 270

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

371

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 271

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 271

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

372

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 272

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 272

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

373

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 273

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 273

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

374

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 274

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

375

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 275

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 275

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

376

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 276

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 276

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

377

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 277

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 277

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

378

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 278

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

379

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 279

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 279

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

380

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 280

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

381

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 281

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

382

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 282

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 282

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

383

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 283

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 283

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

384

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 284

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 284

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

385

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 285

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 285

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

386

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 286

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 286

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

387

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 287

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 287

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

388

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 288

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 288

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

389

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 289

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 289

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

390

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 290

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 290

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

391

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 291

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

392

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 292

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

393

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 293

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

394

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 294

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 294

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

395

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 295

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 295

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

396

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 296

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 296

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

397

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 297

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 297

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

398

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 298

\vskip0.400000\baselineskip

<217> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 298

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

399

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 299

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 299

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 300

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 300

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

401

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 301

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 301

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

402

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 302

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 302

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

403

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 303

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 303

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

404

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 304

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 304

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

405

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 305

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 305

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

406

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 306

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 306

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

407

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 307

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

408

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 308

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 308

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

409

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 309

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 309

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

410

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 310

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

411

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 311

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 311

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

412

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 312

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 312

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

413

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 313

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 313

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

414

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 314

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 314

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

415

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 315

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 315

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

4150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 316

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 316

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

416

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 317

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 317

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

417

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 318

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 318

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

418

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 319

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 319

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

419

\hskip1cm

420

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 320

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 320

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

421

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 321

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

4210

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 322

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 322

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 323

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 323

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1001

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 324

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1002

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 325

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 325

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1003

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 326

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens y Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 326

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1004

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 327

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1029

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 327

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

422

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 328

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 328

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

423

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 329

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1776

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 329

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

424

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 330

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 330

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

425

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 331

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 567

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 331

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

426

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 332

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 332

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

427

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 333

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 333

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

428

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 334

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 591

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 334

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

429

\hskip1cm

430

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 335

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 335

\hskip1cm

431

\hskip1cm

432

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 336

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 336

\hskip1cm

433

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 337

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 324

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 337

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

434

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 338

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 338

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

435

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 339

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

436

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 340

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 339

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 340

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

437

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 341

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1110

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 341

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

438

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 342

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 342

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

439

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 343

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 343

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

440

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 344

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

441

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 345

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 345

\hskip1cm

442

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 346

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 346

\hskip1cm

443

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 347

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 347

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1005

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 348

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 348

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1006

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 349

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

444

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 350

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 350

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

445

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 351

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 351

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

446

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 352

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 352

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

447

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 353

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 353

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

448

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 354

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 354

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

449

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 355

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 355

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

450

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 356

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 356

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

451

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 357

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 357

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

452

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 358

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 358

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

453

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 359

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

454

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 360

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 360

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

455

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 361

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 361

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

456

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 362

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

457

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 363

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 363

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

458

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 364

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 364

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

459

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 365

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 365

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

460

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 366

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 366

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

461

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 367

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 367

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

462

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 368

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 368

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

463

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 369

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 369

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

464

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 370

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 370

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

465

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 371

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

466

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 372

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 372

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

467

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 373

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 373

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

468

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 374

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 374

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

469

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 375

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 375

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1007

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 376

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 376

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1008

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 377

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 253,256,517,518,520,521,522,743,753,754, 758

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n = A,T,C or G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 377

\hskip1cm

470

\hskip1cm

4700

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 378

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 378

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

471

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 379

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1281

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 379

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

472

\hskip1cm

4720

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 380

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3020

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 380

\hskip1cm

473

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 381

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

474

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 382

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1491

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 382

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

475

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 383

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1251

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 383

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

476

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 384

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 384

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

477

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 385

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1515

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 385

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

478

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 386

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 648

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 386

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

479

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 387

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1089

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 387

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

480

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 388

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1035

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 388

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

481

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 389

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1263

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 389

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

482

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 390

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1707

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 390

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

483

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 391

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 391

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

484

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 392

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 568

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 392

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

485

\hskip1cm

486

\hskip1cm

487

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 393

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 393

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

488

\hskip1cm

489

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 394

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 362

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 394

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

490

\hskip1cm

491

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 395

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 395

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

492

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 396

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 396

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

493

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 397

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 397

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

494

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 398

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 398

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

495

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 399

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 399

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

496

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 400

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 400

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

497

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 401

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 401

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

498

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 402

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 402

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

499

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 403

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

500

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 404

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

501

\hskip1cm

5010

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 405

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 405

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

502

\hskip1cm

5020

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 406

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 85, 86, 172, 173, 242, 245, 246, 247

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 406

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

503

\hskip1cm

5030

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 407

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 407

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

504

\hskip1cm

505

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 408

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 408

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

506

\hskip1cm

507

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 409

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 409

\hskip1cm

508

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 410

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 504

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 410

\hskip1cm

509

\hskip1cm

510

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 411

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 411

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1009

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 412

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 412

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

511

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 413

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 413

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

512

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 414

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 414

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

513

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 415

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 415

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

514

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 416

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 416

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

515

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 417

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

516

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 418

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 418

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

517

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 419

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 419

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

518

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 420

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 420

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

519

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 421

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 421

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

520

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 422

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 422

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

521

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 423

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 423

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

522

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 424

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 424

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

523

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 425

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

524

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 426

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 426

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

525

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 427

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 427

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

526

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 428

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 428

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

527

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 429

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 429

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

528

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 430

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

529

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 431

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 431

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

530

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 432

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 432

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

531

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 433

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

532

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 434

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 434

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

533

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 435

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 435

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

534

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 436

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 436

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

535

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 437

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 437

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

536

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 438

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

537

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 439

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 439

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

538

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 440

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 440

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

539

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 441

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 441

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

540

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 442

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 442

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

541

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 443

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 443

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

542

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 444

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 444

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

543

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 445

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

544

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 446

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 446

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

545

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 447

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 447

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

546

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 448

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 448

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

547

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 449

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 449

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

548

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 450

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido sintético

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 450

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

549

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 451

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 451

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1010

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 452

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 969

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 452

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

550

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 453

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 453

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

551

\hskip1cm

552

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 454

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 469

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 454

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

553

\hskip1cm

554

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 455

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 455

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

555

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 456

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 456

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1011

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 457

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 457

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1012

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 458

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1013

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 459

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 459

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1014

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 460

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 843

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 460

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

556

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 461

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 461

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

557

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 462

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 462

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

558

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 463

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 846

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 463

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

559

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 464

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 464

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

560

\hskip1cm

561

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 281

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 465

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

562

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 466

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 466

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1015

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 467

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 467

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

563

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 468

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 468

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

564

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 469

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 882

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 469

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

565

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 470

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 470

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

566

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 471

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5315

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E Coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 471

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

567

\hskip1cm

568

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 472

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 828

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 472

\hskip1cm

569

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 473

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 811

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 473

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

570

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 474

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 844

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 474

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

571

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 475

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 927

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 475

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

572

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 476

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 936

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 476

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

573

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 969

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 477

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

574

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 478

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 478

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

575

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 479

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 479

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

576

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 480

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 274

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 480

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

577

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 481

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 481

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

578

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 482

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 307

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 482

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

579

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 483

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 278

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 483

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

580

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 484

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1016

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 485

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 485

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

581

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 486

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido usado en la construcción del vector TAT "Stumpy".

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 486

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

582

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 487

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido usado en la construcción del vector TAT "Stumpy".

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 487

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

583

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 488

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido usado en la construcción del vector TAT "Stumpy".

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 488

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

584

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 489

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Oligonucleótido usado en la construcción del vector TAT "Stumpy".

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 489

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

585

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 490

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 490

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

586

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 491

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 491

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

587

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 492

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 492

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

588

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 493

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 493

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

589

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 494

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 494

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

590

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 495

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 495

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

591

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 496

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 496

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

592

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 497

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 497

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

593

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 498

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 882

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 498

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

594

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 499

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 292

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 499

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

595

\hskip1cm

596

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 500

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 500

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1017

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador de PCR

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 501

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1018

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 502

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 270

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 502

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

597

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 503

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5400

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 503

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

598

\hskip1cm

599

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 504

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> E. coli

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTEE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = Cualquier Aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 504

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

600

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 505

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 816

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 505

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

601

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 506

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 506

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

1019

Claims (18)

1. Una proteína de fusión que comprende una porción inmunógena de un antígeno de tumor de Wilms (WT1), en la que dicha porción inmunógena de WT1 consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID Nº: 2, 144, 241, 414-451, 461, 478 y 502, y un compañero de fusión, caracterizada por que el compañero de fusión consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 506.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que la porción inmunógena de WT1 consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 461.

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEC ID Nº: 470.

4. Un polinucleótido aislado que codifica las proteínas de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

5. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4, en el que el polinucleótido comprende la secuencia expuesta en la SEC ID Nº: 469.

6. El polinucleótido aislado de la reivindicación 4 ó 5, en el que el polinucleótido se ha sometido a optimización de codones para la expresión en E. coli.

7. Una composición que comprende un polipéptido de la reivindicación 1, 2 ó 3 en combinación con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.

8. Una vacuna que comprende un polipéptido de la reivindicación 1, 2 ó 3 en combinación con un potenciador de la respuesta inmune inespecífica.

9. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el potenciador de la respuesta inmune inespecífica potencia preferentemente una respuesta de células T en un paciente.

10. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el potenciador de la respuesta inmune se selecciona del grupo que consiste en 3d-MPL, MPL, RC-529, AGP, Montanide ISA50, Seppic Montanide ISA 720, una citoquina, una microesfera, adyuvantes basados en bromuro de dimetil dioctadecil amonio (DDA), AS-1, AS-2, adyuvante basado en el sistema adyuvante Ribi, QS21, adyuvantes basados en saponina, adyuvante Syntex en su forma microfluidizada, MV, ddMV, adyuvantes basados en complejo inmunoestimulante (iscom) y toxinas inactivadas.

11. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 4 a 6 unido operativamente a una secuencia de control de la expresión.

12. Una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una composición que comprende un primer componente que comprende un polipéptido de la reivindicación 1, 2 ó 3 y un segundo componente seleccionado de uno cualquiera o ambos de un vehículo o inmunoestimulante fisiológicamente aceptable para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un paciente.

14. Una composición que comprende un primer componente que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de la reivindicación 1, 2 ó 3 y un segundo componente que comprende un polipéptido de la reivindicación 1, 2 ó 3 para el uso en la inducción de una respuesta inmune en un paciente.

15. El polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el uso en el tratamiento de una enfermedad maligna.

16. El polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 para el uso en el tratamiento de una enfermedad maligna.

17. El uso del polipéptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento de una enfermedad maligna.

18. El uso del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 para la fabricación de un medicamento para el uso en el tratamiento de una enfermedad maligna.