KR20050042226A - Ｗｔ１ 특이적 면역요법용 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
본원에는 악성 질환, 예를 들면, 백혈병 및 암 치료용 조성물 및 치료 방법이 기재되어 있다. 당해 조성물은 WT1 폴리뉴클레오티드, WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 표시하는 항원-표시 세포, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포 중의 하나 이상을 포함한다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 전이성 질환을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 일반적으로, 백혈병 및 암과 같은 악성 질환의 면역요법(immunotherapy)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 WT1에 대한 면역 반응을 발생 또는 증강시키기 위한 조성물, 및 악성 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
암과 백혈병은 미국과 전세계에 걸쳐 건강 상의 중요한 문제가 되고 있다. 이러한 질환을 탐지하고 치료하는 기술이 진전되어 왔지만, 암과 백혈병을 예방 또는 치료하기 위한 어떠한 백신이나 다른 널리 성공적인 방법도 현재 이용 가능하지 않다. 이들 질환의 관리는 현재, 초기 진단과, 수술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬 요법과 같은 각종 치료법 중의 한 가지 이상을 포함할 수 있는 적극적인 치료를 병행하는 것에만 의존하고 있다. 특정 암에 대한 치료 과정은 종종, 특이적 종양 마커의 분석을 포함한 각종 예후 파라미터에 근거하여 선택된다. 그러나, 정착된 마커를 사용하게 되면, 종종 판단하기 어려운 결과가 야기되고, 많은 암 환자에게서 높은 사망율이 지속적으로 관찰된다.
면역요법은 암과 백혈병 치료 및 생존률을 실질적으로 개선시켜주는 효능을 지니고 있다. 최근의 데이터는, 백혈병이 골수 이식(예를 들면, 공여자 림프구 주입) 맥락에서 면역요법에 의해 치유될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 이러한 치료법은 종양 관련 항원(TAA)에 대한 면역 반응을 발생 또는 증강시키는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 현재까지, 비교적 적은 수의 TAA가 공지되어 있고, 이러한 항원에 대한 면역 반응의 발생은 거의 드문 예외도 있긴 하지만, 치료학적으로 유익한 것으로 밝혀지지 않았다.
따라서, 당해 분야에서는, 백혈병과 암을 예방 및 치료하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시켜 주고, 또한 이와 관련된 다른 이점을 추가로 제공해준다.
발명의 요약
간략히, 본 발명은 백혈병 및 암과 같은 질환을 진단 및 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공해준다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 본래의 WT1의 면역원성 부분, 또는 한 가지 이상의 치환물, 결실물, 부가물 및/또는 삽입물에 있어서 상이한 이의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 특정 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 적어도 WT1의 면역원성 부분을 포함하는데, 이러한 면역원성 부분은 WT1의 아미노산 2-281 내에 함유되어 있다. 특정 양태에서는, 상기 폴리펩티드가 본래의 WT1 폴리펩티드의 16개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 다른 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 본래의 WT1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1-174의 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드는 본래의 WT1 폴리펩티드의 아미노산 175 내지 449 내에 존재하는 16개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 면역원성 부분은 바람직하게 MHC 유형 I 및/또는 유형 II 분자와 결합한다. 특정 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 (a) 표 II 내지 XLVI 중의 하나 이상에 인용된 서열, (b) 한 가지 이상의 치환물, 결실물, 부가물 및/또는 삽입물에 있어서 상이한, 전술된 서열의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다) 및 (c) 상기 언급된 폴리펩티드의 모사체(mimetics)(이러한 모사체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
다른 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 (a) ALLPAVPSL (서열 번호 34), GATLKGVAA (서열 번호 88), CMTWNQMNL (서열 번호 49 및 258), SCLESQPTI (서열 번호 199 및 296), SCLESQPAI (서열 번호 198), NLYQMTSQL (서열 번호 147 및 284), ALLPAVSSL (서열 번호 35 및 255), RMFPNAPYL (서열 번호 185 및 293), VLDFAPPGA (서열 번호 241), VLDFAPPGAS (서열 번호 411), 서열 번호 414-450, ALLPAVPSL (서열 번호 451), (b) 한 가지 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이한, 전술된 서열의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다) 및 (c) 상기 언급된 폴리펩티드의 모사체(이러한 모사체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다. 모사체는 아미노산을 하나 이상의 아미노산 모사체와 배합하여 포함할 수 있거나 또는 전적으로 비펩티드 모사체일 수 있다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 WT1 단백질의 면역원성 부분의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이러한 변이체는 해당 면역원성 부분 내의 1 내지 3번 아미노산 위치에서의 치환으로 인해 상기 면역원성 부분과 상이하며, 이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않거나 또는 본래의 WT1 단백질에 비해 증강된다.
본 발명은 추가로, 상기 기술된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 암호화하는 WT1 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 국면 내에서, 본 발명은 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 약제학적 조성물은 상기 기술된 바와 같은 폴리펩티드 또는 모사체, 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오티드; (ii) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편; (iii) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포; 또는 (iv) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상을, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합하여 포함할 수 있다. 백신은 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드, 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오티드, (ii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 또는 (iii) 항-유전형 항체 중의 하나 이상을, 비-특이적 면역 반응 증강제와 함께 포함한다. 특정 양태 내에서, 본래의 WT1 폴리펩티드의 23개 미만의 연속되는 아미노산 잔기, 바람직하게는 17개 미만의 연속되는 아미노산 잔기가, 상기 약제학적 조성물 및 백신 내에 이용된 WT1 폴리펩티드 내에 존재한다. 상기 면역 반응 증강제는 보조제일 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응 증강제가 T 세포 반응을 증강시킨다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 환자에게서 면역 반응을 증강 또는 유도시키는 방법을 제공해준다. 특정 양태에서는, 상기 환자가 사람이다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 환자에게서 악성 질환의 발생을 억제시키는 방법을 제공해준다. 악성 질환에는 백혈병(예: 급성 골수성, 급성 림프구성 및 만성 골수성 백혈병) 및 암(예: 유방, 폐, 갑상선 또는 위장암, 또는 흑색종)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 환자는 악성 질환에 걸릴 수도 있지만, 반드시 그럴 필요는 없으며, 당해 약제학적 조성물 또는 백신의 투여는 이러한 질환의 개시를 억제시킬 수 있거나 또는 기존 질환의 진행 및/또는 전이를 억제시킬 수 있다.
본 발명은 추가로 다른 국면 내에서, 골수, 말초혈, 또는 이의 일정 분획 내의 골수성 또는 림프계 세포 수의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만이 되도록 WT1 양성 세포를 제거시키기에 충분한 시간 및 조건 하에, 상기 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획을, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 골수 및/또는 말초혈, 또는 이의 분획으로부터 WT1 발현성 세포를 제거하는 방법을 제공해준다. 골수, 말초혈 및 이의 분획은 WT1 발현과 연관된 질환에 걸린 환자로부터 수득할 수 있거나 또는 이러한 질환에 걸리지 않은 사람 또는 사람이 아닌 포유류로부터 수득할 수 있다.
관련 국면 내에서, 본 발명은 골수, 말초혈, 또는 상기 기술된 바와 같이 제조된 골수 또는 말초혈의 일정 분획을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 악성 질환의 발전을 억제시키는 방법을 제공해준다. 이러한 골수, 말초혈 또는 이의 분획은 자가 유래성(autologous)이거나, 또는 관련되거나 관련되지 않은 사람 또는 사람이 아닌 동물(예: 공통유전자형 또는 동종이계)로부터 유도시킬 수 있다.
다른 국면에서는, 본 발명이 T 세포의 자극 및/또는 증대를 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 T 세포를 WT1 폴리펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 T 세포를 자극(또는 프라이밍) 및/또는 증대시키는 방법을 제공한다. 이러한 T 세포는 자가 유래성, 동종이계, 공통 유전형 또는 관련되지 않은 WT1 특이적 T 세포일 수 있으며, 시험관내 또는 생체 내에서 자극시킬 수 있다. 증대된 T 세포는, 특정 양태 내에서, 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획 내에 존재할 수 있고, 이는 클론일 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 양태 내에서, T 세포는 자극 및/또는 증대되는 동안 포유류에 존재할 수 있다. WT1 특이적 T 세포를, 예를 들면, 공여자 림프구 주입물 내에 사용할 수 있다.
관련 국면 내에서, 상기 기술된 바와 같이 제조된 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 환자에게서 악성 질환의 발전을 억제시키는 방법이 제공된다. 이러한 T 세포는, 특정 양태에서, 자가 유래성, 공통 유전형 또는 동종이계일 수 있다.
본 발명은 추가로, 다른 국면 내에서, 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환에 대한 면역화 또는 면역요법의 효능을 모니터하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 환자에게서 항체, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 모니터하는 것에 근거한다. 이러한 특정 국면 내에서, 특정 방법은 (a) 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득한 제1 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온 배양을 수행하는 단계; (b) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 상기 생물학적 샘플 중의 항체와 WT1 폴리펩티드 간에 형성된 면역 복합체를 탐지하는 단계; (c) 요법 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 면역 복합체의 수를 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 해당 요법 또는 면역화의 효능을 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 양태 내에서, 상기 탐지 단계는 (a) 상기 면역 복합체와 결합할 수 있고 리포터(reporter) 그룹을 포함하는 탐지용 시약을 상기 면역 복합체와 함께 항온 배양하는 단계; (b) 결합되지 않은 탐지용 시약을 제거하는 단계; 및 (c) 상기 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함한다. 상기 탐지용 시약은, 예를 들면, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 결합할 수 있는 제2의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편, 또는 단백질 A와 같은 분자를 포함할 수 있다. 다른 양태 내에서, 리포터 그룹은 WT1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 탐지 단계는 결합되지 않은 WT1 폴리펩티드를 제거한 다음, 이러한 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함한다.
추가의 국면 내에서, 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환에 대한 면역화 또는 요법의 효능을 모니터하는 방법은 (a) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하고 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득한 제1 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해를 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온 배양을 수행하는 단계; (b) 상기 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해 량을 탐지하는 단계; (c) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하고 요법 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해 량을 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 해당 요법 또는 면역화의 효능을 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로, (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온 배양하여, 상기 T 세포를 증식시키는 단계; 및 (b) 이러한 환자에게 증식된 T 세포의 유효량을 투여하고, 이로부터 환자에게서 악성 질환의 발전을 억제시키는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 발전을 억제시키는 방법을 제공한다. 특정 양태 내에서, 상기 T 세포의 항온 배양 단계를 1회 이상 반복할 수 있다.
다른 국면 내에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온 배양하여, 상기 T 세포를 증식시키는 단계; (b) 증식된 하나 이상의 세포를 클로닝하는 단계; 및 (c) 이러한 환자에게 상기 클로닝된 T 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 발전을 억제시키는 방법을 제공한다.
다른 국면 내에서, (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온 배양하는 단계; 및 (b) 상기 T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 탐지하고, 이로부터 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다. 특정 양태 내에서, 상기 탐지 단계가 T 세포 증식의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함한다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온 배양을 수행하는 단계; 및 (b) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 상기 생물학적 샘플 중의 항체와 WT1 폴리펩티드 간에 형성된 면역 복합체를 탐지하고, 이로부터 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질환의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 국면은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하여 명백해질 것이다. 본원에 공지된 모든 참조문헌은 각각이 개별적으로 삽입된 경우처럼 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
도 1은 마우스(MO)와 사람(HU) WT1 단백질 서열(각각 서열 번호 320 및 319) 비교를 도시한 것이다.
도 2는 혈액학적 악성 종양(AML)이 있는 환자에게서 WT1 특이적 항체의 탐지를 예시해주는 웨스턴 블롯(Western blot)이다. 레인 1은 분자량 마커를 나타내고; 레인 2는 양성 대조군(WT1 특이적 항체로 면역침전된 WT1 양성 사람 백혈병 세포주)을 나타내며; 레인 3은 음성 대조군(마우스 혈청으로 면역침전된 WT1 양성 세포주)을 나타내고; 레인 4는 AML이 있는 환자의 혈청으로 면역침전된 WT1 양성 세포주를 나타낸다. 레인 2 내지 4의 경우, 면역침전물을 겔 전기영동함으로써 분리시키고, 이에 WT1 특이적 항체를 프로빙한다.
도 3은 WT1 양성 종양 세포주인 TRAMP-C로 면역시킨 B6 마우스에서 WT1 특이적 항체 반응의 탐지를 예시해주는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고; 레인 2, 4 및 6은 WT1 특이적 양성 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology; WT1 단백질의 N-말단 영역의 180개 아미노산에 걸쳐 있고, 52kD 하의 웨스턴 블롯 상에서 이동하는 폴리펩티드)을 나타낸다. 사용된 1차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서의 면역화되지 않은 B6 마우스의 혈청, 및 레인 6에서의 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 4는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 WT1 특이적 항체의 탐지를 예시해주는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고; 레인 2, 4 및 6은 WT1 특이적 양성 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology; WT1 단백질의 N-말단 영역의 180개 아미노산에 걸쳐 있고, 52kD 하의 웨스턴 블롯 상에서 이동하는 폴리펩티드)을 나타낸다. 사용된 1차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서의 면역화되지 않은 B6 마우스의 혈청, 및 레인 6에서의 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 5A 내지 5C는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 예시하는 그래프이다. 지시된 바와 같은 1개의 T 세포주와 2개의 상이한 클론을 사용하여 티미딘 혼입 검정을 수행하고, 그 결과를 cpm으로 표현하였다. x축 상에 지시된 대조군은 항원이 없고(Ag가 없음) B6/배지이며; 사용된 항원은 p6-22 사람(p1), p117-139(p2) 또는 p244-262 사람(p3)이다.
도 6A 및 6B는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 예시하는 히스토그램(histogram)이다. 제3 면역화시킨지 3주 후에, 백신 A 또는 백신 B를 접종시킨 바 있는 마우스의 비장 세포를, 배지 단독(배지) 또는 비장 세포 및 배지(B6/항원 없음); 펩티드 p6-22(p6), p117-139(p117), p244-262(p244) (백신 A; 도 6A) 또는 p287-301(p287), p299-313(p299), p421-435(p421) (백신 B; 도 6B)가 펄스된 B6 비장 세포, 및 무관한 대조군 펩티드(무관한 펩티드)로 펄스된 비장 세포와 함께 25㎍/ml로 배양하고, 증식시킨지 96시간 후, (3H) 티미딘 혼입량으로써 증식에 대해 검정하였다. 막대는 자극 지수(SI)를 나타내는데, 이는 실험용 웰의 평균치를 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균치로 나눈 값으로 산정된다.
도 7A 내지 7D는 p117-139 및 p6-22에 특이적인 증식성 T 세포주 및 클론의 발생을 예시하는 히스토그램이다. 생체내에서 면역시킨 후, 백신 A 또는 B 각각의 3개 펩티드 모두를 사용하여, 초기 3가지 시험관내 자극(IVS)을 수행한다. 상기 2개의 관련된 펩티드 p117-139 및 p6-22 만을 사용하여 단일 펩티드 자극으로서 후속 IVS를 수행하였다. 클론을 지시된 바와 같이, p6-22 및 p117-139 특이적 T 세포주 모두로부터 유도하였다. T 세포를 배지 단독(배지) 또는 비장 세포와 배지(B6/항원 없음); 펩티드 p6-22(p6), p117-139(p117) 또는 무관한 대조군 펩티드(무관한 펩티드)로 펄스된 B6 비장 세포와 함께 25㎍/ml로 배양하고, 증식시킨지 96시간 후, (3H) 티미딘 혼입량으로써 증식에 대해 검정하였다. 막대는 자극 지수(SI)를 나타내는데, 이는 실험용 웰의 평균치를 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균치로 나눈 값으로 산정된다.
도 8A 및 8B는 Th 반응을 유발시키는 효능을 지닌 펩티드에 대한 사람 WT1(서열 번호 319)의 TSITES 분석 결과를 도시한 것이다. "A"로 지시된 영역은 블록의 AMPHI 중간점이고, "R"은 로드바드/테일러(Rothbard/Taylor) 모티프에 부합되는 잔기를 지시하며, "D"는 IAd 모티프에 부합되는 잔기를 지시하고, 'd'는 IEd 모티프에 부합되는 잔기를 지시한다.
도 9A 및 9B는 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 WT1 펩티드 특이적 CTL의 유발을 예시해주는 그래프이다. 도 9A는 동종이계성 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 도시한 것이며, 도 9B는 펩티드 피복된 세포주의 용해를 도시한 것이다. 각 경우에 있어, 용해율(%)(표준 크롬 방출 검정으로써 결정된 바와 같음)은 3가지 지시된 효과 인자:표적 비로 제시된다. 림프종 세포(LSTRA 및 E10) 뿐만 아니라 E10 + p235-243(E10+P235)에 대한 결과가 제공된다. E10 세포는 또한 본원에서 EL-4 세포로서 지칭되기도 한다.
도 10A 내지 10D는 B6 마우스에 WT1 펩티드 P117를 백신 접종한 후에, WT1 양성 종양 세포주는 사멸시키지만 WT1 음성 세포주는 사멸시키지 않는 WT1 특이적 CTL의 유발을 예시해주는 그래프이다. 도 10A는 면역화되지 않은 B6 마우스의 T 세포는 WT1 양성 종양 세포주를 사멸시키지 않는다는 것을 예시해준다. 도 10B는 동종이계성 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 예시해준다. 도 10C 및 10D는 2가지 상이한 실험에서 WT1 음성 세포주와 비교한 바와 같은, WT1 양성 종양 세포주의 용해를 나타낸다. 또한, 도 10C 및 10D는 펩티드-피복된 세포주(관련된 WT1 펩티드 P117로 피복된 WT1 음성 세포주 E10)의 용해를 나타낸다. 각 경우에 있어, 용해율(%)(표준 크롬 방출 검정으로써 결정된 바와 같음)은 3가지 지시된 효과 인자:표적 비로 제시된다. 림프종 세포(E10), 전립선암 세포(TRAMP-C), 형질전환된 섬유아세포 세포주(BLK-SV40) 뿐만 아니라 E10 + p117에 대한 결과가 제공된다.
도 11A 및 11B는 WT1 양성 종양 세포를 용해시키는 대표적인 펩티드 P117-139 특이적 CTL의 능력을 예시해주는 히스토그램이다. 제3 면역시킨지 3주 후에, 펩티드 p235-243 또는 p117-139를 접종시킨 바 있는 마우스의 비장 세포를 관련 펩티드로 시험관 내에서 자극시키고, 이를 대상으로 하여, WT1 양성 및 음성 종양 세포 뿐만 아니라 WT1 펩티드와 함께 항온 배양된 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해율%을 나타낸다. 도 11A는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); 관련된(재자극에 사용될 뿐만 아니라 면역화에도 사용됨) 펩티드 p235-243으로 펄스된 EL-4(EL-4 + p235); 무관한 펩티드 p117-139로 펄스된 EL-4(EL-4 + p117), p126-134로 펄스된 EL-4(EL-4 + p126) 또는 p130-138로 펄스된 EL-4(EL-4 + p130); 및 WT1 양성 종양 세포 BLK-SV40(BLK-SV40, WT1 양성) 및 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 양성)에 대항한 p235-243 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 11B는 지시된 바와 같이, EL-4; 관련된 펩티드 P117-139로 펄스된 EL-4(EL-4 + p117); 및 무관한 펩티드 p123-131로 펄스된 EL-4(EL-4 + p123) 또는 p128-136로 펄스된 EL-4(EL-4 + p128); BLK-SV40 및 TRAMP-C에 대항한 관련 펩티드 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 한냉 표적 억제에 의해 입증된 바와 같이, WT1 양성 종양 세포의 용해 특이성을 예시해주는 히스토그램이다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해율%을 나타낸다. 도 12A는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 양성); 51Cr 표지화하지 않으면서 관련된 펩티드 p117-139으로 펄스된 EL-4 세포의 10배 과량(가열 표적과 비교한 것임)과 함께 항온 배양된 TRAMP-C 세포(TRAMP-C + p117 한냉 표적); 및 51Cr 표지화하지 않으면서 무관한 펩티드로 펄스된 EL-4와 함께 항온 배양된 TRAMP-C 세포(TRAMP-C + 무관한 한냉 표적물)에 대항한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 12B는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); WT1 양성 종양 세포주 BLK-SV40(BLK-SV40, WT1 양성); 관련된 한냉 표적물과 함께 항온 배양된 BLK-SV40 세포(BLK-SV40 + p117 한냉 표적); 및 무관한 한냉 표적물과 함께 항온 배양된 BLK-SV40 세포(BLK-SV40 + 무관한 한냉 표적물)에 대항한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 13A 내지 13C는 p117-139 내에서의 9량체 CTL 에피토프의 평가를 도시한 히스토그램이다. p117-139 종양 특이적 CTL 주를 대상으로 하여, p126-134 또는 p130-138로 재자극한 후 적당한 H-2b 유형 I 결합성 모티프를 함유하거나 이것이 결여된 aa117-139 내의 펩티드에 대해 시험하였다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해율%을 나타낸다. 도 13A는 WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); 및 펩티드 p117-139로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p119-127로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p119), p120-128로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p120), p123-131로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p123), p126-134로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p126), p128-136로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p128) 및 p130-138로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p130)에 대항한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13B는 WT1 음성 세포주 EL-4, p117-139로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p126-134로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p126) 및 WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C에 대항한, p126-134로의 재자극 후의 CTL 주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13C는 EL-4, p117-139로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p130-138로 펄스된 EL-4 세포(EL-4 + p130) 및 WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C에 대항한, p130-138로의 재자극 후의 CTL 주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 14는 AML에 걸린 63명 환자에게서 WT1에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/N-말단 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 제1 및 제2 레인은 각각 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. 시판되는 WT1 특이적 항체 WT180이 양성 대조군으로 사용되었다. 그 다음의 63개 레인은 각 개개 환자로부터의 혈청을 사용한 결과를 나타낸다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. 상기 도에는 3가지 별도의 실험으로부터의 누적 데이터가 포함되어 있다.
도 15는 AML에 걸린 2명의 환자에게서 WT1 단백질 및 대조군 단백질에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/전장, WT1N-말단, TRX 및 Ra12 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 2명의 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. AML-1 및 AML-2는 도 1에서의 개개 환자 중의 2명으로부터의 혈청을 의미하고, 이는 WT1/전장에 대한 항체 반응성을 나타낸다. WT1/전장의 단백질은 Ra12와의 융합 단백질로서 표현되었다. WT1/N-말단 단백질은 TRX와의 융합 단백질로서 표현되었다. 대조군 Ra12 및 TRX 단백질은 유사한 방식으로 정제되었다. 그 결과, WT1 융합 단백질에 대한 혈청 항체 방응성이 상기 단백질의 WT1 부분에 대해 지시된다는 사실이 확인되었다.
도 16은 CML에 걸린 81명 환자에게서 WT1에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/전장의 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 제1 및 제2 레인은 각각 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. 시판되는 WT1 특이적 항체 WT180이 양성 대조군으로 사용되었다. 그 다음의 81개 레인은 각 개개 환자로부터의 혈청을 사용한 결과를 나타낸다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. 상기 도에는 3가지 별도의 실험으로부터의 누적 데이터가 포함되어 있다.
도 17은 CML에 걸린 2명의 환자에게서 WT1 단백질 및 대조군 단백질에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/전장, WT1/N-말단, TRX 및 Ra12 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 CML에 걸린 2명의 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. CML-1 및 CML-2는 도 3에서의 개개 환자 중의 2명으로부터의 혈청을 의미하고, 이는 WT1/전장에 대한 항체 반응성을 나타내었다. WT1/전장의 단백질은 Ra12와의 융합 단백질로서 표현되었다. WT1/N-말단 단백질은 TRX와의 융합 단백질로서 표현되었다. 대조군 Ra12 및 TRX 단백질은 유사한 방식으로 정제되었다. 그 결과, WT1 융합 단백질에 대한 혈청 항체 방응성이 상기 단백질의 WT1 부분에 대해 지시된다는 사실이 확인되었다.
도 18은 혈청학적 분석에 사용된 재조합 WT1 단백질의 특성을 제공해준다.
도 19A 내지 19E는 상이한 용량의 WT1 단백질로 백신 접종함으로써 유발된 마우스에서의 항체 반응을 도시하는 막대 그래프이다.
도 20은 WT1 단백질로 면역시킨 마우스에서의 증식성 T-세포 반응의 막대 그래프이다.
도 21은 아데노 WT1 및 우두 WT1 감염 후 WT1를 발현하는, 형광성 현미경으로 검사된 사람 DC의 사진이다.
도 22는 사람 DC에서의 WT1 발현이 아데노 WT1 감염 후에 재현될 수 있고, 이는 대조군 아데노 감염에 의해서는 유도되지 않는다는 것을 입증해주는 사진이다.
도 23은 WT1 완전 유전자 시험관내 프라이밍이 WT1 특이적 T-세포 반응을 유발시킨다는 것을 보여주는 IFN-감마 ELISPOT 검정 사진이다.
도 24는 WT1 단백질의 아미노산 2-281(서열 번호 461) 및 이들 아미노산 잔기를 암호화하는 cDNA(서열 번호 460)을 도시한 것이다. 이와 같이 절단된 WT1이 WT1-F로서 지칭된다.
본 명세서에 지칭되고/되거나 적용 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 공보, 미국 특허원, 외국의 특허, 외국의 특허원 및 비-특허 공개 문헌은 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로, 악성 질환의 면역요법 및 진단용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 조성물은 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드, WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포(APC, 예를 들면, 수지상 세포), WT1 폴리펩티드와 결합하는 항체와 같은 제제 및/또는 WT1에 특이적인 면역계 세포(예: T 세포)를 포함할 수 있다. 본 발명의 WT1 폴리펩티드는 일반적으로, 윌름(Wilms) 종양 유전자 생성물(WT1)의 적어도 일정 부분 또는 이의 변이체를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 일반적으로, 상기 폴리펩티드의 전부 또는 일정 부분을 암호화하거나 또는 이러한 서열에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 항체는 일반적으로, WT1 폴리펩티드의 일정 부분과 결합할 수 있는 면역계 단백질 또는 이의 항원 결합성 단편이다. 상기 조성물 내에 이용될 수 있는 T 세포는 일반적으로, WT1 폴리펩티드에 특이적인 T 세포(예: CD4+ 및/또는 CD8+)이다. 본원에 기재된 특정의 방법은 본원에 제공된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포를 추가로 이용한다.
본 발명은 윌름 종양(WT) 유전자 생성물(예: WT1)에 대해 유발된 면역 반응이, WT1 유전자 발현 증가를 특징적으로 나타내는 악성 질환에 걸린 환자에 대해 예방적 및/또는 치료적 이점을 제공해줄 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 이러한 질환에는 백혈병[예: 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 어린이 ALL] 뿐만 아니라 폐암, 유방암, 갑상선암 및 위장암 및 흑색종과 같은 많은 암이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. WT1 유전자는 윌름 종양이 있는 환자의 염색체 11p13에서의 세포발생적 결실에 기준하여 최초로 동정 및 분리되었다[참조: Call et al., 미국 특허 제5,350,840호]. 상기 유전자는 10개 엑손으로 이루어지고, 아연 핑거 전사 인자(zinc finger transcription factor)를 암호화하며, 마우스 및 사람 WT1 단백질의 서열이 도 1 및 서열 번호 319 및 320에 제공되어 있다.
WT1 폴리펩티드
본 발명의 맥락에서, WT1 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은, 본래의 WT1(즉, 유전적으로 변형되지 않은 유기체에 의해 발현된 WT1 단백질)의 적어도 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드이다. WT1 폴리펩티드는 어떠한 길이일 수 있는데, 단 본래의 단백질의 적어도 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함해야 한다. 달리 말하면, WT1 폴리펩티드는 올리고펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 연결된, 비교적 적은 수의 아미노산 잔기, 예를 들면, 8 내지 10개 잔기로 이루어짐), 전장의 WT1 단백질(예를 들면, 사람 또는 사람이 아닌 동물, 예를 들면, 마우스 내에 존재함) 또는 중간 크기의 폴리펩티드일 수 있다. 특정 양태 내에서, 본래의 WT1 폴리펩티드의 적은 수의 연속되는 아미노산 잔기를 함유하는 WT1 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩티드는 T 세포 반응의 발생이 요망되는 특정 용도에 바람직하다. 예를 들면, 이러한 WT1 폴리펩티드는 본래의 WT1 폴리펩티드의 23개 미만, 바람직하게는 18개 이하, 보다 바람직하게는 15개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 본래의 WT1 폴리펩티드의 9개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 일반적으로 상기 목적에 적합하다. 상기 본래의 단백질로부터 유도된 부가의 서열 및/또는 이종 서열이 모든 WT1 폴리펩티드 내에 존재할 수 있고, 이러한 서열이 추가의 면역원성 또는 항원성 특성을 보유할 수도 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 화합물과 추가로 연합(공유적 또는 비공유적)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 부분"은 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는)폴리펩티드의 일정 부분이다. 특정의 바람직한 면역원성 부분은 MHC 유형 I 또는 유형 II 분자와 결합된다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 부분은 해당 결합이 당해 분야에 공지된 어떠한 검정을 이용해서도 탐지 가능할 경우에, MHC 유형 I 또는 유형 II 분자와 "결합"되는 것으로 보인다. 예를 들면, 특정의 폴리펩티드가 MHC 유형 I과 결합하는 능력은, 125I 표지된 β2-마이크로글로빈(β2m)을 MHC 유형 I/β2m/펩티드 이종-삼량체성 복합체 내로 혼입시키는 것을 증진시키는 능력을 모니터함으로써 간접적으로 평가할 수 있다[참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994]. 또한, 당해 분야에 공지되어 있는 작용성 펩티드 경쟁 검정을 이용할 수 있다. 특정의 면역원성 부분은 표 II 내지 XIV 중의 하나 이상 내에 인용된 하나 이상의 서열을 갖는다. 대표적인 면역원성 부분에는 RDLNALLPAVPSLGGGG(사람 WT1 잔기 6-22; 서열 번호 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(사람 및 마우스 WT1 잔기 117-139; 각각 서열 번호 2 및 3), GATLKGVAAGSSSSVKWTE(사람 WT1 잔기 244-262; 서열 번호 4), GATLKGVAA(사람 WT1 잔기 244-252; 서열 번호 88), CMTWNQMNL(사람 및 마우스 WT1잔기 235-243; 각각 서열 번호 49 및 258), SCLESQPTI(마우스 WT1 잔기 136-144; 서열 번호 296), SCLESQPAI(사람 WT1 잔기 136-144; 서열 번호 198), NLYQMTSQL(사람 및 마우스 WT1 잔기 225-233; 각각 서열 번호 147 및 284); ALLPAVSSL(마우스 WT1 잔기 10-18; 서열 번호 255); RMFPNAPYL(사람 및 마우스 WT1 잔기 126-134; 각각 서열 번호 185 및 293), VLDFAPPGA(사람 WT1 잔기 37-45; 서열 번호 241), 또는 VLDFAPPGAS(사람 WT1 잔기 37-46; 서열 번호 411)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 면역원성 부분이 서열 번호 414-451에 제공된다. 추가의 면역원성 부분이 본원에 제공되며, 다른 부분은 일반적으로, 예를 들면, 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 이에 인용된 참조문헌에 요약된 바와 같은 널리 공지된 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 면역원성 부분을 동정하기 위한 대표적인 기술에는, 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩티드를 스크리닝하는 것이 포함된다. 본래의 WT1 폴리펩티드의 면역원성 부분은 전장의 WT1의 반응성 보다 실질적으로 덜하지 않는 수준으로 상기 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다(예를 들면, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정으로 이루어짐). 달리 말하면, 면역원성 부분은 상기 검정 내에서 전장의 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 이보다 큰 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 일반적으로, 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
또한, 면역원성 부분은 Th 반응을 유발시키는 효능을 지니고 있는 펩티드 모티프에 대해 연구 조사하는 Tsites 프로그램[참조: Rothbard and Taylor, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996]과 같은 컴퓨터 분석을 이용하여 동정할 수 있다. 쥐 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC와 결합하기에 적당한 모티프를 갖는 CTL 펩티드는 BIMAS[참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994] 및 다른 HLA 펩티드 결합성 예상 분석에 따라서 동정할 수 있다. 또한, 특정의 MHC 분자와 결합하는 면역원성 부분은, 문헌[참조: Rammensee et al., Immunogenetics 41:178-228, 1995]에 기재된 바와 같이 규정된 펩티드 결합성 모티프를 사용함으로써 동정할 수 있다. 쥐 및 사람 유형 I 또는 유형 II MHC 분자와 결합하는 펩티드를 확인하기 위해, 당해 분야에 공지된 펩티드 결합성 검정을 사용할 수 있다. 면역원성을 확인하기 위해, HLA A2 또는 다른 형질전환성 마우스 모델, 및/또는 수지상 세포, 섬유아세포 또는 말초혈 세포를 이용하는 시험관내 자극 검정을 사용하여 펩티드를 시험할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 조성물은 본래의 WT1 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리펩티드 "변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서만 본래의 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드이며, 이로써 이러한 폴리펩티드의 면역원성은 보유된다(즉, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 폴리펩티드에 비해 실질적으로 저하되지 않는다). 달리 말하면, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 단백질에 비해 증강되거나 변하지 않을 수 있거나, 또는 본래의 폴리펩티드에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만 정도 저하될 수 있다. 한 양태에서, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 폴리펩티드에 비해 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5% 미만 정도 저하될 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로, 상기 폴리펩티드 서열 중의 하나를 변형시킨 다음, 변형된 폴리펩티드와, 본원에 기재된 바와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와의 반응성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 변이체는 사람 또는 쥐의 HLA 분자와 결합하는 이의 능력을 평가함으로써 동정할 수 있다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 특정의 변이체 폴리펩티드가 유형 I 또는 유형 II MHC 분자, 예를 들면, HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 또는 HLA-CW07과 결합하는 능력이 야생형(변형되지 않은) WT1 폴리펩티드에 비해 증가되도록 하는 변형을 상기 변이체 폴리펩티드가 지닌다. 추가의 양태에서는, 아미노산 1-281로부터의 WT1의 N-말단 부분이, HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 또는 HLA-CW07과 결합할 수 있는, 상기 내의 모든 수의 폴리펩티드의 능력이 야생형(변형되지 않은) WT1 폴리펩티드 서열과 비교해서 증가되도록 변형된다. 추가의 양태에서는, 하나 이상의 면역원성 부분(에피토프)을 포함하는 폴리펩티드가, MHC 분자, 예를 들면, HLA-A2, HLA-A24, HLA-A1, HLA-A3, HLA-A68, HLA-A11, HLA-A31, HLA-A33, HLA-B14, HLA-B40, HLA-B60, HLA-B62, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B27, HLA-B3501, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B44, HLA-B51, HLA-B52, HLA-B58, HLA-CW03, HLA-CW04, HLA-CW06 또는 HLA-CW07와 결합하는 능력이 증가되도록 변형된다. 실시예 30에는 생성될 수 있는 예시적 변이체가 기재되어 있다. 당업자는 이들이 예시적 변이체이고, HLA-A2 이외의 HLA 분자와 결합하는 펩티드에 대해 유사한 방식으로 생성될 수 있는 다른 변이체를 용이하게 인지할 것이다. 추가의 양태에서는, HLA 분자와 결합하는 상기 변이체 폴리펩티드의 능력은 본래의 WT1 폴리펩티드에 비해 2배 이상, 바람직하게는 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상 증가된다. 본 발명의 맥락에서, WT1 폴리펩티드의 면역원성 부분 내에서의 비교적 적은 수의 치환(예를 들면, 1 내지 3)이, 면역 반응을 유발시키는 해당 폴리펩티드의 능력을 증강시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 적합한 치환물은 일반적으로, 상기 언급된 바와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 동정할 수 있고, 상기 변형된 폴리펩티드와 본원에 기재된 바와 같은 항혈청 및/또는 T 세포와의 반응성에 근거하여 효과를 확인하였다. 따라서, 특정의 바람직한 양태 내에서, WT1 폴리펩티드는, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력이, 변형되지 않은 폴리펩티드의 능력 보다 통계상 더 크도록 면역원성 부분 내에서의 1 내지 3개 아미노산 잔기가 치환된 변이체를 포함한다. 이러한 치환물은 바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 MHC 결합성 부위 내에 위치하며, 이는 상기 언급된 바와 같이 동정할 수 있다. 바람직한 치환물은 MHC 유형 I 또는 유형 II 분자에 대한 결합을 증가시켜 준다.
특정의 변이체는 보존적 치환물을 함유한다. "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 지니고 있는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이어서, 펩티드 화학 분야의 업자는 이러한 폴리펩티드의 2차 구조와 수치료 성질이 실질적으로 변화되지 않는다고 예상할 것이다. 아미노산 치환물은 일반적으로, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽친매성 성질에 있어서의 유사성에 근거하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양전하를 띤 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 가지고 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산에는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 다른 그룹의 아미노산에는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his가 포함된다. 변이체는 또한, 비-보존적 변화를 가질 수도 있다. 변이체는 또한, 예를 들면, 해당 폴리펩티드의 면역원성, 2차 구조 및 수치료 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산을 결실 또는 부가함으로써 변형시킬 수 있다.
바람직한 양태에서, WT1 N-말단의 변이체 폴리펩티드(아미노산 1-249)를 작제하는데, 이러한 변이체 폴리펩티드는 전장의 WT1 및/또는 WT1 N-말단 폴리펩티드를 인식하는 항체와 결합할 수 있다. 항체의 비-제한적 예는 항 WT1 항체 WT180(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)이다.
앞서 인지된 바와 같이, WT1 폴리펩티드는 해당 단백질의 전이를 해독과 동시에 또는 해독 후에 지시하는, 단백질의 N-말단부에서 시그널(또는 리더) 서열과 접합될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한, 이러한 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해, 또는 고체 지지체에 대한 상기 폴리펩티드의 결합을 증강시키기 위해 링커 또는 다른 서열(예: 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합시킬 수 있다.
WT1 폴리펩티드는 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 용이하게 제조할 수 있다. 일반적으로, 당업자에 공지된 각종의 발현 벡터를 이용하여 재조합 WT1 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 적당한 어떠한 숙주 세포에서도 발현을 달성할 수 있다. 적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵성 세포가 포함된다. 바람직하게는, 이용된 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유류 세포주, 예를 들면, COS 또는 CHO이다. 재조합 단백질 또는 폴리펩티드를 배양 배지 내로 분비시키는데 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 먼저, 시판용 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 이어서, 이러한 농축액을 적합한 정제용 매트릭스, 예를 들면, 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용할 수 있다. 최종적으로, 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 이용하여 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 본래의 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본래의 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 표준 돌연변이 유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위 특이적 돌연변이 유발을 사용하여 제조할 수 있고, 이러한 DNA 서열의 부분을 제거하여 절단된 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여, 합성 수단에 의해 특정 부분 및 다른 변이체를 생성시킬 수도 있다. 예를 들면, 약 500개 미만, 바람직하게는 약 100개 미만, 보다 바람직하게는 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 합성할 수 있다. 폴리펩티드는 시판되고 있는 고체 상 기술, 예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성법(이러한 방법에서는, 아미노산을 성장하는 아미노산 쇄에 연속해서 가한다)[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩티드 자동화 합성 장비는 공급업자[예를 들면, Applied BioSystems, Inc., Foster, City, CA]로부터 시판중이며, 이는 제조업자의 지시에 따라서 작동될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된 것이다. "분리된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 본래의 환경으로부터 제거되는 것이다. 예를 들면, 천연 단백질은, 이들이 천연 시스템 내의 공존하는 물질 전부 또는 일부로부터 분리되는 경우에 분리되어진다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드는 순도가 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 이것이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝된 경우에 분리된 것으로 간주된다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 WT1 폴리펩티드의 모사체를 제공한다. 이러한 모사체는 하나 이상의 아미노산 모사체에 연결된 아미노산(즉, WT1 단백질 내의 하나 이상의 아미노산이 아미노산 모사체로 대체될 수 있다)을 포함할 수 있거나, 또는 이것이 전적으로 비-펩티드 모사체일 수 있다. 아미노산 모사체는 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력을 실질적으로 저하시키지 않으면서 WT1 폴리펩티드 내의 아미노산을 대체할 수 있도록 아미노산과 입체구조적으로 유사한 화합물이다. 비-펩티드 모사체는 WT1-특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 모사체의 능력이 WT1 폴리펩티드의 능력에 비해 실질적으로 저하되지 않도록 WT1 폴리펩티드와 유사한 전체 입체구조를 지니고 있고, 아미노산을 함유하지 않는 화합물이다. 이러한 모사체는 펩티드 서열의 3차원 구조를 평가해주는 표준 기술(예: 핵 자기 공명 및 컴퓨터 이용 기술)에 근거하여 고안할 수 있다. WT1 폴리펩티드의 하나 이상의 측쇄 작용기가, 반드시 동일한 크기 또는 용적을 지닐 필요는 없지만 유사한 생물학적 반응을 생성하는 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 지니고 있는 그룹으로 대체시킨 모사체를 고안할 수 있다. 본원에 기재된 양태 내에서, 모사체가 WT1 폴리펩티드를 대체할 수 있다는 것을 인지해야 한다.
다른 예시 양태 내에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 다중 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 및 관련되지 않은 서열, 예를 들면, 공지된 종양 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드일 수 있다. 융합 파트너는, 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 도와주거나, 또는 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 증강인자)을 발현시키는 것을 도와줄 수 있다. 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이면서 발현 증강성인 융합 파트너 모두이다. 다른 융합 파트너는 해당 폴리펩티드의 용해도를 증가시키거나 해당 폴리펩티드가 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 선택될 수 있다. 또한, 추가의 융합 파트너에는 상기 폴리펩티드의 정제를 촉진시키는 친화성 태그가 포함된다.
융합 폴리펩티드는 일반적으로, 화학적 접합을 포함한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩티드는 비-융합된 폴리펩티드에 비해, 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성시켜 주는 재조합 폴리펩티드로서 발현된다. 간략히, 당해 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 별도로 어셈블리하여, 적당한 발현 벡터 내로 연결시킬 수 있다. 하나의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을, 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 제2의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결시켜, 이들 서열의 판독 프레임이 동일한 상에 있게 한다. 이로써, 양 성분 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있는 단일 융합 폴리펩티드로 해독될 수 있다.
펩티드 링커 서열을 사용하여, 각각의 폴리펩티드가 2차 및 3차 구조로 폴딩되도록 보장해주기에 충분한 거리 정도 만큼 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 성분을 격리시킬 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩티드 내로 혼입시킨다. 적합한 펩티드 링커 서열은 다음 요인들, (1) 가요성 연장된 입체 구조에 적응하는 이들의 능력; (2) 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조에 적응하지 못하는 이들의 능력; 및 (3) 폴리펩티드 작용성 에피토프와 반응할 수도 있는 소수성 또는 전하를 띤 잔기의 결여를 기준으로 하여 선택할 수 있다. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 다른 밀접한 중성 아미노산, 예를 들면, Thr 및 Ala를 링커 서열에 사용할 수도 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 제4,751,180호]에 기재된 것들이 포함된다. 링커 서열은 일반적으로 길이가 1 내지 약 50개 아미노산일 수 있다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가 작용성 도메인을 분리시키고 입체 간섭을 방지시키기 위해 사용될 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에는, 상기 링커 서열이 요구되지 않는다.
이와 같이 연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절성 요소에 작동적으로 연결된다. DNA의 발현에 관여하는 조절성 요소는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치되어 있다. 유사하게, 말단 해독에 요구되는 정지 코돈 및 전사 종결 시그널은 제2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
당해 융합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를, 관련되지 않은 면역원성 단백질, 예를 들면, 회복 반응을 유발시킬 수 있는 면역원성 단백질과 함께 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 예에는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질이 포함된다[참조: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
한 가지 바람직한 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 미코박테륨 종, 예를 들면, 미코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)-유도된 Ra12 단편으로부터 유도된다. 이들을 이종 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증강시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 방법이 미국 특허원 제60/158,585호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)에 기재되어 있다. 간략히, Ra12는 미코박테륨 튜베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 부서열(subsequence)인 폴리뉴클레오티드 영역을 지칭한다. MTB32A는 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 독성 및 무독성 균주 내의 유전자에 의해 암호화된 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: 미국 특허원 제60/158,585호; Skeiky et al., Infection and Immun. (1990) 67:3998-4007; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. MTB32A 암호화 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현되고, 이는 정제 과정 내내 가용성 폴리펩티드로서 존재한다. 더우기, Ra12는 이와 융합되는 이종 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 한 가지 바람직한 Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14KD C-말단 단편을 포함한다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 Ra12 폴리펩티드의 일정 부분을 암호화하는, 약 15개 이상의 연속되는 뉴클레오티드, 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 약 200개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 본래의 서열(즉, Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일정 부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는, 암호화된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 본래의 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 비해 실질적으로 저하되지 않도록, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입물을 함유할 수 있다. 변이체는 바람직하게는, 본래의 Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일정 부분를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일률을 나타낸다.
다른 바람직한 양태에서는, 면역학적 융합 파트너를, 그람-음성 세균 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도시킨다(WO 91/18926). 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략 상기 단백질의 1/3(예를 들면, 제1 N-말단 100-110 아미노산)을 포함하고, 단백질 D 유도체를 지질화할 수 있다. 특정의 바람직한 양태 내에서는, 리포프로테인 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N 말단 상에 포함되어 부가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 제공하고 이. 콜라이에서의 발현 수준을 증가시킨다(이로써 발현 증강인자로서 작용함). 상기 지질 말미(tail)는 항원 표시 세포에 대한 항원의 최적의 표시를 보장해준다. 다른 융합 파트너에는 인플루엔자 바이러스인 NS1로부터의 비-구조 단백질(헤마글루티닌)이 포함된다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수도 있지만, 전형적으로, N-말단 81개 아미노산을 사용한다.
또 다른 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 LYTA로서 공지된 단백질, 또는 이의 일정 부분(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA(LytA 유전자에 의해 암호화됨; 참조: Gene 43:265-292, 1986)로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성시키는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유도시킨다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 내의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 오토리신(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린 동족체, 예를 들면, DEAE에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현성 플라스미드의 개발을 이끌어내었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 문헌에 보고되었다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태 내에서는, LYTA의 반복 서열 부분을 융합 폴리펩티드 내로 혼입할 수 있다. 반복 서열 부분은 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 서열 부분에는 잔기 188-305가 혼입되어 있다.
또 다른 예시 양태 내에서는, 융합 파트너가 N-말단 상에 이. 콜라이 중의 T 또는 A 시그널 펩티드로부터의 쌍둥이 아르기닌 전좌(TAT) 시그널 펩티드를 포함한다[참조: J. Mol. Microbiol. (2000) 2(2): 179-189; Journal of Bacteriology, Jan 2001 p604-610 Vol 183, No.2; Journal of Biochemistry Vol 276, March 16 2001 pp 8159-8164; 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다].
또 다른 예시 양태는 융합 폴리펩티드, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 관련이 있는데, 여기서 융합 파트너는 미국 특허 제5,633,234호에 기재된 바와 같이, 폴리펩티드를 엔도솜성/리소솜성 구획에 지시할 수 있는 표적화 시그널을 포함한다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드가 이러한 표적화 시그널과 융합되는 경우, 상기 폴리펩티드는 MHC 유형 II 분자와 보다 효율적으로 연합됨으로써, 해당 폴리펩티드에 특이적인 CD4+ T-세포의 생체내 자극을 증강시킬 것이다.
본 발명은 융합 파트너를 부가하지 않고서도 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현될 수 있는 WT1 폴리펩티드의 절단된 형태를 제공한다. 이들 절단된 형태의 예가 서열 번호 342-346에 제시되어 있고, 이는 서열 번호 337-341에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 이들 절단물의 변형에서는, WT1의 처음 76개 아미노산을 해당 단백질의 C-말단에 융합시켜, 이. 콜라이에서 보다 더 용이하게 발현되는 재조합 단백질을 생성시킨다. 이. 콜라이 이외의 다른 숙주, 예를 들면, 비. 메가테륨(B. megaterium)을 사용할 수도 있다. 상기 단백질은 히스티딘 태그 없이 추가로 제조할 수 있다.
다른 양태에서는, 상이한 소단위체를 만들고, 이를 본래의 WT1와는 상이한 순서로 함께 융합시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, Ra12와 융합시킬 수 있다. 예시되는 융합 단백질이 서열 번호 332-336에 제시되어 있고, 이는 서열 번호 327-331에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
WT1 폴리뉴클레오티드
본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 암호화하는 어떠한 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 의해 포괄되는 WT1 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 부가의 암호화 또는 비-암호화 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수도 있으나, 반드시 존재할 필요는 없으며, 폴리뉴클레오티드가 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수도 있으나, 반드시 연결될 필요는 없다.
WT1 폴리뉴클레오티드는 본래의 WT1 단백질를 암호화할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 WT1의 변이체를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 상기 암호화된 폴리펩티드의 면역원성이 본래의 WT1 단백질에 비해 저하되지 않게 하는, 하나 이상의 치환물, 부가물, 결실물 및/또는 삽입물을 포함할 수 있다. 암호화된 폴리펩티드의 면역원성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 바람직한 변이체는, 본래의 WT1 서열의 면역원성 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 위치의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 결실물을 함유한다. 특정의 변이체는 본래의 유전자 또는 이의 일정 부분과 실질적으로 상동성이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 적당히 엄격한 조건 하에서, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 이의 상보 서열)과 하이브리드화할 수 있다. 적당하게 엄격한 적합한 조건에는 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50 내지 65℃, 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화시킨 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC를 각각 사용하여 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것이 포함된다. 이와 같이 DNA 서열을 하이브리드화시키는 것 역시 본 발명의 범주 내에 속한다.
유전적 암호의 축퇴성 결과로 인해, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중의 몇몇은 본래의 어떠한 유전자의 뉴클레오티드 서열과도 최소한의 상동성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 코돈 활용의 차이로 인해 다양해진 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다.
따라서, 본 발명의 또 다른 국면에 따라서, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열 중의 몇몇 또는 모두를 포함하는 폴리뉴클레오티드 조성물, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드의 상보체, 및 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열의 축퇴성 변이체가 제공된다. 특정의 바람직한 양태에서는, 본원에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열이 상기 언급된 바와 같은 면역원성 폴리펩티드를 암호화한다.
상기 언급된 바와 같이, WT1의 면역원성 부분이 일단 동정되면, 각종 기술을 이용하여 WT1 폴리뉴클레오티드를 제조할 수 있다. 예를 들면, WT1 폴리뉴클레오티드는, WT1을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 접근법의 경우에는, 상기 면역원성 부분의 서열을 기준으로 하여 서열-특이적 프라이머를 고안할 수 있고, 이는 구입하거나 합성할 수 있다. 예를 들면, 사람 WT1 유전자의 PCR 증폭에 적합한 프라이머에는 다음이 포함된다: 제1 단계 - P118 : 1434-1414: 5'GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (서열 번호 5) 및 P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (서열 번호 6); 제2 단계 - P136: 5'GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (서열 번호 7) 및 P137: 5'GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (서열 번호 8). 마우스 WT1 유전자의 PCR 증폭을 위한 프라이머에는 다음이 포함된다: 제1 단계 - P138: 5'TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (서열 번호 9) 및 P139: 5'GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (서열 번호 10), 제2 단계 - P140: 5'GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (서열 번호 11) 및 P141: 5'GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (서열 번호 12).
이어서, 증폭된 부분을 사용하여, 널리 공지된 기술을 이용하여, 사람 게놈 DNA 라이브러리로부터 또는 적합한 cDNA 라이브러리로부터 전장의 유전자를 분리시킬 수 있다. 또한, 전장의 유전자는 다중 PCR 단편으로부터 작제할 수 있다. WT1 폴리뉴클레오티드는 또한, 올리고뉴클레오티드 성분들을 합성하고, 이들 성분을 함께 연결하여 완전한 폴리뉴클레오티드를 발생시킴으로써 제조할 수 있다.
WT1 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성(예를 들면, 고체 상 포스포르아미다이트 화학적 합성)을 포함한, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 합성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 내의 변형은, 표준 돌연변이 유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이 유발[참조: Adelman et al., DNA 2:183, 1983]을 이용하여 도입할 수도 있다. 또한, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 시험관내 또는 생체내 전사함으로써 RNA 분자를 생성시킬 수 있는데, 단 상기 DNA는 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터(예: T7 또는 SP6)를 갖는 벡터 내로 혼입시킨다. 특정 부분을 이용하여, 본원에 기재된 바와 같은 암호화된 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 또는 또한, 특정 부분을 환자에게 투여하여, 상기 암호화된 폴리펩티드를 생체내에서 생성시킨다(예를 들면, 항원 표시 세포, 예를 들면, 수지상 세포를, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 작제물로 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 상기 환자에게 투여한다).
WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 상기 폴리펩티드를 시험관내 또는 생체 내에서 생성시키기 위해 사용할 수 있다. 암호화 서열에 상보적인 WT1 폴리뉴클레오티드(즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드)는 또한, 프로브로서 사용되거나 또는 WT1 발현을 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 RNA 내로 전사될 수 있는 cDNA 작제물을 또한, 조직 세포 내로 도입하여 안티센스 RNA의 생성을 촉진시킬 수 있다.
어떠한 폴리뉴클레오티드도 추가로 변형시켜 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형법에는 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열을 부가하는 방법; 주쇄 내에 포스포디에스테라제 연결 이외의 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 방법; 및/또는 비-전통적인 염기, 예를 들면, 이노신, 쿠에오신 및 위부토신(wybutosine)을 포함시킬 뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 다른 변형된 형태를 포함시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 확립된 재조합 DNA 기술을 사용하여 각종의 다른 뉴클레오티드 서열에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파아지미드, 람다 파아지 유도체 및 코스미드(cosmid)를 포함한, 각종의 어떠한 클로닝 벡터 내로도 클로닝시킬 수 있다. 특히 관심있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열 분석용 벡터가 포함된다. 일반적으로, 벡터는 하나 이상의 유기체 내에서 작용성인 복제 기점, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선별성 마커를 함유할 것이다. 다른 요소들은 목적하는 용도에 좌우될 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 특히, 본 발명의 한 양태는 작동성 연결 중인(즉, "작동적으로 연결된") 본 발명의 핵산 분자를 발현 제어 서열(프로모터)에 혼입시키는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 벡터, 예를 들면, 바이러스성(예: 아데노바이러스 또는 우두 바이러스) 또는 약독화된 바이러스성 벡터의 작제는, 관심있는 분자를 암호화하는 원핵 세포 균주 또는 진핵 세포주를 생성시키기 위한, 세포의 형질전환 또는 형질감염과 같이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이러한 방식으로 이용될 수 있는 숙주 세포의 예는 COS 세포, CHO 세포, 효모 세포, 곤충 세포(예: 스포도프테라 프루기페드라(Spodoptera frugiperda) 또는 Sf-9 세포), NIH 3T3 세포 등이다. 원핵 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 및 다른 세균을 사용할 수도 있다.
특정의 양태 내에서, 폴리뉴클레오티드는 포유류의 세포 내로 유입될 수 있고 이 안에서 발현되도록 제형화시킬 수 있다. 이러한 제형은 다음에 기재되는 바와 같이, 치료 목적에 특히 유용하다. 당업자는 폴리뉴클레오티드를 표적 세포에서 발현시키는데 수 많은 방법이 있다는 것을 인지할 것이며, 적합한 어떠한 방법도 이용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 바이러스성 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 또는 우두 또는 다른 폭스 바이러스(예를 들면, 조류 폭스 바이러스) 내로 혼입시킬 수 있다. DNA를 상기 벡터 내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 레트로바이러스성 벡터는 부가적으로, 선별성 마커에 대한 유전자(형질도입된 세포의 동정 또는 선별을 도와주기 위함) 및/또는 표적화 잔기, 예를 들면, 특이적 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자를 전이 또는 혼입시켜, 이러한 벡터가 표적 특이적이 되도록 한다. 표적화는 또한, 당업자에게 공지된 방법에 의해 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 벡터 내의 cDNA 작제물을 사용하여, 예를 들면, WT1 양성 종양 모델을 확립하는데 사용하기 위한 사람 또는 동물 세포주를 형질감염시킬 수 있으며, 이를 사용하여, 상기 세포의 종양 또는 백혈병-성장 억제 또는 용해를 입증해주는 양자 면역요법 실험 및 종양 예방을 수행할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 다른 치료학적 제형에는 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들면, 거대 분자 복합체, 나노캅셀제, 미세구, 비드 및 지질-이용 시스템(유중수 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜 포함)이 포함된다. 시험관내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하는데 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜(즉, 인공 막 소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체 조성물, 이의 단편 및 다른 결합성 제제
또 다른 국면에 따르면, 본 발명은 본원에 기재된 WT1 폴리펩티드, 또는 이의 일정 부분, 변이체 또는 유도체에 대한 면역학적 결합을 나타내는 결합성 제제 예를 들면, 항체 및 이의 항원-결합성 단편을 제공한다. 항체, 또는 이의 항원-결합성 단편은, 이것이 WT1 폴리펩티드와 탐지 가능한 수준(예를 들면, ELISA 검정 내에서)으로 반응하고 유사한 조건 하에 관련되지 않은 단백질과는 탐지 가능한 수준으로 반응하지 않는 경우에, 본 발명의 WT1 폴리펩티드와 "특이적으로 결합"되고/되거나, "면역학적으로 결합"되고/되거나, 이러한 폴리펩티드와 "면역학적으로 반응성"인 것으로 여겨진다.
이러한 맥락에서 사용된 바와 같은 면역학적 결합성은 일반적으로, 면역글로불린 분자와, 이러한 면역글로불린에 특이적인 항원 간에 발생되는 유형의 비-공유적 상호작용을 지칭한다. 면역학적 결합성 상호작용의 강도 또는 친화도는 이러한 상호작용의 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있는데, 보다 작은 Kd가 보다 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩티드의 면역학적 결합 특성은 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 정량화할 수 있다. 이러한 방법 중의 한 가지가 항원 결합성 부위/항원 복합체 형성 및 해리 속도를 측정하는 것을 수반하는데, 이들 속도는 복합체 파트너의 농도, 상호작용의 친화도, 및 양 방향으로 해당 속도에 동등하게 영향을 미치는 기하 파라미터에 좌우된다. 따라서, "온 속도 상수(on rate constant)"(Kon)와 "오프 속도 상수(off rate constant)"(Koff) 둘 다는 연합 및 해리의 실제적 속도 및 농도를 산정함으로써 결정할 수 있다. Koff/Kon 비는 친화도와 관계되지 않은 모든 파라미터를 상쇄시킬 수 있게 해주므로, 해리 상수 Kd와 등가이다[참조: Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59:439-473].
특정 항체의 "항원 결합성 부위" 또는 "결합성 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합성 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내의 3개의 고도로 발산된 연장물이 "고가변" 영역으로 지칭되는데, 이는 "프레임워크(framework) 영역" 또는 "FRs"로서 공지된 보다 보존된 플랭킹 연장물 사이에 놓여져 있다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내의 고가변 영역에 인접하고 이들 사이에서 천연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서는, 경쇄의 3가지 고가변 영역과 중쇄의 3가지 고가변 영역이 서로에 대해 3차원 공간으로 놓여져 있어 항원-결합성 표면을 형성한다. 이러한 항원 결합성 표면은 결합된 항원의 3차원적 표면에 상보적이고, 중쇄와 경쇄 각각의 3가지 고가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDRs"로서 지칭된다.
결합성 제제는 추가로, 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여, WT1-관련 암이 있는 환자와 이러한 암이 없는 환자를 구별시켜줄 수 있다. 예를 들면, 종양 단백질과 결합하는 항체 또는 다른 결합성 제제는 바람직하게는, 암이 있는 환자의 약 20% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상에게서 암을 지시해주는 시그널을 발생시킬 것이다. 또한, 또는 또한, 항체는 암이 없는 개개인의 약 90% 이상에게서 이러한 질환의 부재를 지시해주는 음성 시그널을 발생시킬 것이다. 특정 결합성 제제가 이러한 요구 사항을 충족시키는지를 결정하기 위해, 암이 있는 환자와 암이 없는 환자(이는 표준 임상 시험을 사용하여 결정한다)로부터의 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈청, 담, 뇨 및/또는 종양 생검)을 대상으로 하여, 상기 결합성 제제와 결합하는 폴리펩티드의 존재에 대해 상기 언급된 바와 같이 검정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 질환이 있는 샘플과 상기 질환이 없는, 통계상 유의적 수의 샘플을 검정할 것이다. 각각의 결합성 제제는 상기 기준을 충족시켜야 하지만, 당업자는 결합성 제제가 민감도를 개선시키기 위해 배합하여 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
상기 요구 사항을 충족시키는 어떠한 제제도 결합성 제제일 수 있다. 예를 들면, 결합성 제제는 펩티드 성분을 갖거나 갖지 않는 리보솜, RNA 분자 또는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 결합성 제제가 항체 또는 이의 항원 결합성 단편이다. 항체는 당업자에게 공지된 각종 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에 의해, 또는 재조합 항체의 생성을 허용하기 위해, 항체 유전자를 적합한 세균성 또는 포유류 세포 숙주 내로 형질감염시키는 것을 통하여 생성시킬 수 있다. 하나의 기술에서는, 당해 폴리펩티드를 포함하는 면역원을 광범위한 모든 포유류[예: 마우스, 랫트, 래빗, 쉽(sheep) 또는 고우트(goat)]에게 초기에 주입한다. 이 단계에서는, 본 발명의 폴리펩티드가 변형되지 않고서도 면역원으로서 제공될 수 있다. 또한, 특히, 비교적 짧은 폴리펩티드의 경우에는, 이러한 폴리펩티드를 소의 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)과 같은 캐리어 단백질에 연결시킨 경우에 뛰어난 면역 반응이 유발될 수 있다. 이러한 면역원을, 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화 과정이 들어간 예정된 스케쥴에 따라서 동물 숙주에게 주사하고, 이 동물로부터 주기적으로 피를 뺀다. 이어서, 당해 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체를, 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩티드를 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
관심있는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)]의 기술 및 이에 대한 개선 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 간략히, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 관심있는 폴리펩티드와의 반응성)을 지닌 항체를 생산할 수 있는 불멸의 세포주를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 면역시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 비장 세포를, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 상기 면역시킨 동물과 공통 유전형인 것과 융합시킴으로써 불멸화시킨다. 각종 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수종 세포를 수 분 동안 비이온성 세정제에서 함께 배합한 다음, 하이브리드 세포의 성장은 뒷받침 해주지만 골수종 세포의 성장은 뒷받침 해주지 않는 선별 배지 상에서 저밀도로 도말한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 이용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이의 배양 상등액을 대상으로 하여, 당해 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 시험하였다. 높은 반응성과 특이성을 지닌 하이브리도마가 바람직하다.
성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 모노클로날 항체를 분리할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포주를 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강 내로 주사하는 것과 같은 각종 기술을 이용하여 수율을 증가시킬 수 있다. 이어서, 복수 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 상기 항체로부터 오염물을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 단계로 정제 공정에 사용할 수 있다.
항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타낼 수 있는 항원 결합성 부위를 포함하는, 치료학적으로 유용한 수 많은 분자가 당해 분야에 공지되어 있다. 단백질 분해 효소 파파인은 IgG 분자를 우선적으로 절단시켜 몇 가지 단편을 생성시키는데, 이들 중의 2개("F(ab)" 단편)는 각각, 본래의 항원 결합성 부위를 포함하는 공유적 헤테로다이머를 포함한다. 상기 효소 파파인은 IgG 분자를 절단하여 몇 가지 단편을 제공할 수 있는데, 이러한 단편에는 양 항원 결합성 부위를 포함하는 "F(ab)2" 단편이 포함된다. "Fv" 단편은 IgM, 및 드문 경우긴 하지만, IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자를 우선적으로 단백질 분해적 절단시킴으로써 생성될 수 있다. 그러나, Fv 단편은 당해 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 보다 통상적으로 유도된다. Fv 단편은 본래 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력을 많이 보유하고 있는 항원 결합성 부위를 포함한 비-공유적 VH::VL 헤테로다이머를 포함한다[참조: Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69:2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091-4096].
단일 쇄 Fv("sFv") 폴리펩티드는 펩티드-암호화 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL-암호화 유전자를 포함한 유전자 융합으로부터 발현되는, 공유적으로 연결된 VH::VL 헤테로다이머이다[참조: Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16):5879-5883]. 천연적으로 응집된(그러나, 화학적으로 분리된) 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 항체 V 영역으로부터, 항원 결합성 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원적 구조로 폴딩될 sFv 분자로 전환시키기 위한 화학 구조를 식별하는 수 많은 방법이 보고되었다[참조: 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호(Huston et al.); 및 미국 특허 제4,946,778호(Ladner et al.)].
상기 언급된 각각의 분자에는, CDRS에 대한 지지를 제공해주고 서로에 대해 CDRs의 공간적 관계를 규정해주는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에 각각 삽입된, 중쇄 및 경쇄 CDR 세트가 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 3가지 고가변 영역을 지칭한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 진행하여, 이들 영역이 "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"로서 각각 정의된다. 따라서, 항원 결합성 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하는 6개의 CDRs를 포함한다. 단일 CDR(예: CDR1, CDR2 또는 CDR3)을 포함하는 폴리펩티드가 본원에서 "분자 인식 단위"로서 지칭된다. 수 많은 항원-항체 복합체를 결정학상 분석한 결과, CDRs의 아미노산 잔기가, 결합된 항원과의 광범위한 접촉을 형성하며, 가장 광범위한 항원 접촉이 중쇄 CDR3과 이루어진다는 것이 입증되었다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원 결합성 부위의 특이성에 주로 관여한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDRs를 프레임하는 4개의 플랭킹 아미노산을 지칭한다. 몇몇 FR 잔기는 결합된 항원과 접촉할 수 있지만, FRs는 항원 결합성 부위, 특히 CDRS에 직접적으로 인접한 FR 잔기 내로의 V 영역의 폴딩에 주로 관여한다. FRs 내에서는, 특정의 아미노산 잔기 및 특정의 구조적 특징이 극히 고도로 보존된다. 이와 관련하여, 모든 V 영역 서열은 약 90개 아미노산 잔기의 내부 디설파이드 루프를 함유한다. V 영역이 결합성 부위 내로 폴딩되면, CDRs는 항원 결합성 표면을 형성하는 사출성 루프 모티프로서 표시된다. (정확한 CDR 아미노산 서열에 상관없이) 특정의 "표준" 구조로 폴딩된 CDR 루프의 외형에 영향을 미치는 FRs의 보존된 구조적 영역이 존재하는 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 추가로, 특정의 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화시키는 비-공유적 도메인간 접촉에 참여하는 것으로 공지되어 있다.
설치류 V 영역과, 사람 불변 도메인에 융합된 이들과 연합된 CDRs를 갖는 키메라 항체[참조: Winter et al. (1991) Nature 349:293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534-4538; and Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577-3583], 적당한 사람 항체 불변 도메인과의 융합에 앞서 사람 지지성 FR 내로 그래프트된 설치류 CDRs[참조: Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536; and Jones et al. (1986) Nature 321:522-525], 및 재조합적으로 미장된(veneered) 설치류 CDRs에 의해 지지된 설치류 CDRs[참조: European Patent Publication No. 519,596, published Dec. 23, 1992]를 포함한, 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 항원 결합성 부위를 포함하는 수 많은 "사람 적응화(humanized)" 항체 분자가 보고되었다. 이들 "사람 적응화" 분자는 사람 수용자에게 이들 잔기의 치료학적 적용 기간과 효능을 제한하는 설치류 항-사람 항체 분자에 대한 바람직하지 못한 면역학적 반응을 최소화하도록 고안된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "미장된 FRs" 및 "재조합적으로 미장된 FRs"는 본래의 FR 폴리펩티드 폴딩 구조를 실질적으로 전부 보유하고 있는 항원 결합성 부위를 포함하는 이종발생성 분자를 제공하기 위해, 예를 들어, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기를 사람 FR 잔기로 선택적으로 대체하는 것을 지칭한다. 미장 기술은 항원 결합성 부위의 리간드 결합성 특징이 항원 결합성 표면 내에서의 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적 배치에 의해 주로 결정된다는 이해에 기초한다[참조: Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59:439-473]. 따라서, 항원 결합 특이성은, CDR 구조, 이들 서로와의 상호작용, 및 이들과 V 영역 도메인의 나머지 부분과의 상호작용이 조심스럽게 유지되는 경우에만, 사람 적응화 항체에 보존될 수 있다. 미장 기술을 사용함으로써, 면역 시스템에 의해 용이하게 직면하게 되는 외부(예: 용매-접근 가능함) FR 잔기를 사람 잔기로 선택적으로 대체시켜, 약하게 면역원성이거나 또는 실질적으로 비-면역원성인 미장된 표면을 포함하는 하이브리드 분자를 제공한다.
미장 방법은 문헌[참조: Kabat et al., in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987]에 의해 집계된 사람 항체 가변 도메인에 대한 입수 가능한 서열 데이터, 상기 카뱃(Kabat) 데이터베이스에 대한 업데이트, 및 다른 수집 가능한 미국 및 외국 데이터베이스(핵산과 단백질 둘다)를 이용한다. V 영역 아미노산의 용매 접근능은 사람 및 쥐의 항체 단편에 대한 공지된 3차원 구조로부터 추론할 수 있다. 쥐의 항원 결합성 부위를 미장하는데 있어 2가지 일반적인 단계가 있다. 초기에는, 관심있는 항체 분자의 가변 도메인의 FRs를 상기 언급된 공급원으로부터 수득된 사람 가변 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교한다. 이어서, 가장 상동성인 사람 V 영역을 상응하는 쥐의 아미노산과 잔기마다 비교한다. 사람 대응물과는 상이한 쥐의 FR 내의 잔기를, 당해 분야에 널리 공지된 재조합 기술을 사용하여, 사람 잔기에 존재하는 잔기로 대체시킨다. 잔기 스위칭은 적어도 부분적으로 노출되는(용매 접근 가능성) 잔기를 이용해서만 수행되고, V 영역 도메인의 3차 구조에 대해 상당한 영향을 미칠 수 있는 아미노산 잔기, 예를 들면, 프롤린, 글리신 및 전하를 띤 아미노산을 대체시키는 데에는 주의가 기울여야 한다.
이러한 방식으로 생성된 "미장된" 쥐의 항원 결합성 부위는 따라서, 쥐의 CDR 잔기, CDRs에 실질적으로 인접한 잔기, 매립되거나 대부분 매립된(용매 접근 불가능) 것으로 동정된 잔기, 중쇄와 경쇄 도메인 간의 비-공유적(예: 정전기 및 소수성) 접촉에 참여하는 것으로 여겨지는 잔기, 및 CDR 루프의 "표준" 3차 구조에 영향을 미치는 것으로 여겨지는, FRs의 보존된 구조적 영역으로부터의 잔기를 보유하도록 고안된다. 이어서, 이들 고안 기준을 사용하여, 쥐의 항원 결합성 부위의 중쇄와 경쇄 둘 다의 CDRs를, 쥐의 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 사람 항체의 발현을 위해 포유류 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있는 사람-유사 FRs 내로 배합시키는 재조합 뉴클레오티드 서열을 제조한다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 본 발명의 모노클로날를 한 가지 이상의 치료제에 커플링시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제에는 방사성핵종, 분화 유도제, 약제, 독소, 및 이들의 유도체가 포함된다. 바람직한 방사성핵종에는 90Y, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 211At 및 212Bi가 포함된다. 바람직한 약제에는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 동족체가 포함된다. 바람직한 분화 유도체에는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 바람직한 독소에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라(Shigella) 독소 및 포크위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질이 포함된다.
치료제를 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통함) 커플링시킬 수 있다(예를 들면, 공유 결합시킴). 각각이 서로 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에는, 치료제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들면, 어느 하나의 친핵성 그룹, 예를 들면, 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은, 카보닐 함유 그룹, 예를 들면, 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있거나, 또는 우수한 이탈 그룹(예: 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
또한, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통하여 커플링시키는 것이 요망될 수도 있다. 링커 그룹은 결합 능력이 간섭받는 것을 피하기 위해 항체와 치료제 사이에 간격을 두는 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시킴으로써, 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 화학적 반응성 증가로 인해, 가능하지 않았던, 제제 또는 제제 상의 작용성 그룹의 사용을 촉진시킬 수도 있다.
동종-작용성 및 이종-작용성인 각종 이작용성 또는 다작용성 시약(예를 들면, Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 카탈로그에 기재된 것)이 링커 그룹으로서 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 커플링 반응은, 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에 관해 기재된 수 많은 참조문헌이 있다[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)].
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분으로부터 분리될 때 보다 효능이 큰 경우에는, 세포 내로의 내부 이행 동안 또는 내부 이행시 절단 가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 요망될 수 있다. 수 많은 상이한 절단 가능한 링커 그룹이 보고되었다. 이들 링커 그룹으로부터의 제제의 세포내 방출 기전에는 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 절단시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호(Spitler)], 광 불안정한 결합에 조사하는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호(Senter et al.)], 유도체화된 아미노산 측쇄를 가수분해시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호(Kohn et al.)], 혈청 보체 매개된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)] 및 산 촉매된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호(Blattler et al.)]이 포함된다.
한 가지 이상의 제제를 항체에 커플링시키는 것이 요망될 수 있다. 한 양태에서는, 제제의 다중 분자를 하나의 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 양태에서는, 한 가지 이상의 유형의 제제를 하나의 항체에 커플링시킬 수 있다. 특정 양태에 상관없이, 한 가지 이상의 제제와의 면역접합체를 각종 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 이상의 제제를 항체 분자에 직접 커플링시키거나, 또는 부착용 다중 부위를 제공해주는 링커를 사용할 수 있다. 또한, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적인 공유 결합 또는 링커 그룹을 통한 공유 결합을 포함한 각종 방법으로 상기 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체에는 단백질, 예를 들면, 알부민[참조: 미국 특허 제4,507,234호(Kato et al.)], 펩티드 및 폴리삭카라이드, 예를 들면, 아미노덱스트란[참조: 미국 특허 제4,699,784호(Shih et al.)]이 포함된다. 담체는 비공유 결합에 의해, 또는 리포솜 소포 내에서의 캡슐화에 의해 특정 제제를 보유할 수도 있다[참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,008호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체에는 방사성할로겐화 작은 분자 및 킬레이트화 화합물이 포함된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사성할로겐화 작은 분자 및 이의 합성법이 기재되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속 또는 금속 산화물 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이의 합성법이 기재되어 있다.
T 세포
면역요법 조성물은 또한, 또는 또한 WT1에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체외에서 제조될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 환자와 같은 포유동물의 골수, 말초혈 또는 골수나 말초혈의 분획내에 존재할 수 있거나, CEPRATETM 시스템(CellPro Inc.로부터 입수 가능, Bothell WA) (또한 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제 5,215,926호; WO 89/06280; WO 91/16116 및 WO 92/07243 참조)과 같은 시판되고 있는 분리 시스템을 사용하여 그들로부터 분리될 수 있다. 또한, T 세포는 혈연 관계 또는 비 혈연관계의 인간, 비-인간 동물, 세포주 또는 배양균으로부터 유래될 수 있다.
T 세포는 WT1 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포(APC)로 자극될 수 있다. 이러한 자극은 WT1 폴리펩티드에 특이적인 T 세포의 생성을 허용하기에 충분한 시간 및 조건하에서 수행된다. 바람직하게는, WT1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 항원-특이성 T 세포의 생성을 촉진하기 위하여 미소체와 같은 운반 비히클내에 존재한다. 간략히 말해서, T 세포는 (말초혈 림프구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리에 의한 방법 등의) 일상적인 기술에 의해 환자 또는 혈연 관계 또는 비혈연 관계의 공여자로부터 분리될 수 있으며, WT1 폴리펩티드와 항온처리된다. 예를 들면, T 세포는 시험관내에서 2 내지 9일간(통상적으로 4일) 37℃에서 WT1 폴리펩티드(예를 들면, 5 내지 25 ㎍/ml) 또는 필적할 만한 양의 WT1 폴리펩티드를 합성하는 세포와 항온처리될 수 있다. 대조군으로 쓰기 위하여 WT1 폴리펩티드의 부재하에서 T 세포 샘플의 별도의 분취량을 항온처리하는 것이 바람직할 수 있다.
T 세포는 이들이 WT1 폴리펩티드로 피복되거나 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 죽일 경우 WT1 폴리펩티드에 특이성이 있는 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 다양한 표준 기술을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 분석 또는 증식 분석에서, 음성 대조군에 비해 용해 및/또는 증식에 있어서 두 배 이상 증가의 자극 지수로 T 세포 특이성을 표시한다. 이러한 검정은 예를 들면, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한, T 세포의 증식 검출은 다양한 공지 기술로 달성될 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가된 속도를 측정함으로써(예를 들면, 삼중수소처리된 티미딘으로 T 세포의 펄스-표지 배양 및 DNA 중으로 혼입된 삼중수소처리된 티미딘 양의 측정에 의해) 검출될 수 있다. T 세포 증식 검출을 위한 다른 방법으로는 인터류킨-2 (IL-2) 생산의 증가, Ca2+ 플럭스, 또는 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸리움 같은 염료 흡수를 측정하는 것이 포함된다. 또한, (감마 인터페론 같은) 림포카인의 합성이 측정될 수 있거나 WT1 폴리펩티드에 반응할 수 있는 T 세포의 상대적인 수가 정량될 수 있다. 3 내지 7일간 WT1 폴리펩티드(200 ng/ml - 100 ㎍/ml, 바람직하게는 100 ng/ml - 25 ㎍/ml)와 접촉시키면 T 세포의 증식이 두 배 이상증가하고/하거나 2 내지 3시간 동안 상기와 같이 접촉시키면, 사이토카인 방출(예를 들면, TNF 또는 IFN-γ) 수준의 두 배 증가가 T 세포 활성화[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]의 지표인 표준 사이토카인 검정을 사용하여 측정시, T 세포의 활성화가 일어난다. WT1 특이성 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증대시킬 수 있다. 바람직한 양태에서, T 세포는 혈연 관계 또는 비혈연 관계의 공여자로부터 유래되며 자극 및 증대 후 환자에 투여된다.
WT1 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 WT1-발현 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있다. CD4+ or CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 다양한 방식으로 검출될 수 있다. 특이적 T 세포 활성화의 검출방법은 T 세포의 증식, 사이토카인(예를 들면, 림포카인)의 생산, 또는 세포용해 활성의 생성(예를 들면, WT1에 특이적인 세포독성 T 세포의 생성)의 검출을 포함한다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적인 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 T 세포 증식의 검출이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적인 T 세포 활성화를 검출하는 바람직한 방법은 세포용해 활성 생성의 검출이다.
치료 목적상, WT1 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 증대시킬 수 있다. 시험관내에서의 이러한 T 세포의 증식은 다양한 방식으로 성취될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 인터류킨-2 같은 T 성장인자의 첨가 또는 비첨가하에 WT1 폴리펩티드에 및/또는 WT1 폴리펩티드를 합성하는 자극자 세포에 재노출시킬 수 있다. 자극자 세포의 첨가는 CD8+ T 세포 반응을 생성하는 경우에 바람직하다. T 세포는 WT1 폴리펩티드로의 간헐적인 재자극에 반응하여 특이성을 유지한 채로 시험관내에서 다수로 증식시킬 수 있다. 간략히 말해서, 1차 시험관내 자극(IVS)의 경우, 다수의 림프구(예를 들면, 4 x 107 이상)가 인간 혈청을 함유하는 배지와 함께 플라스크에 안치될 수 있다. WT1 폴리펩티드(예를 들면, 10 ㎍/ml의 펩티드)를 파상풍 톡소이드(예를 들면, 5 ㎍/ml)와 함께 직접 첨가할 수 있다. 이어서, 플라스크를 항온처리시킬 수 있다(예를 들면 37℃, 7일). 2차 IVS의 경우, 이어서 T 세포를 수거하여 2-3 x 107개의 방사선 처리한 말초혈 단핵구와 같이 새로운 플라스크에 안치한다. WT1 폴리펩티드(10 ㎍/ml)를 직접 가한다. 플라스크를 37℃에서 7일간 배양시킨다. 2차 IVS 후 2일째 및 4일째 되는 날에, 2 내지 5 단위의 인터류킨-2(IL-2)를 첨가할 수 있다. 3차 IVS를 위해, T 세포를 웰에 넣고 펩티드로 코팅된 개체 자신의 EBV 형질전환 B 세포로 자극시킬 수 있다. IL-2가 각 사이클의 2일째 및 4일째 되는 날에 첨가될 수 있다. 세포가 특이적인 세포독성 T 세포인 것으로 나타나면 바로 이들을 2일째, 4일째 및 6일째에 더 많은 IL-2(20 단위)를 가지고 10일간의 자극 사이클을 사용하여 증대시킬 수 있다.
또한, WT1 폴리펩티드의 존재하에 증식하는 하나 이상의 T 세포를 클로닝에 의해 수를 증대시킬 수 있다. 세포 클로닝 방법은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 제한 희석을 포함한다. 반응자 T 세포는 밀도 구배 원심분리와 양 적혈구 로제팅에 의해 감작 환자의 말초혈으로부터 정제되고 방사선 처리된 자가유래성 필러(filler) 세포의 존재하에 공칭 항원으로 자극시킴으로써 배양액에 확립될 수 있다. CD4+ T 세포주를 생성하기 위하여, WT1 폴리펩티드가 항원 자극으로 사용되고 자가유래성 말초혈 림프구(PBL) 또는 엡스타인 바 바이러스로 감염시켜 불멸화시킨 림프아구성 세포주(LCL)가 항원 표시 세포로 사용된다. CD8+ T 세포주를 생성하기 위하여, WT1 폴리펩티드를 생산하는 발현 벡터로 형질감염된 자가유래성 항원-제시 세포가 자극자 세포로 사용될 수 있다. 확립된 T 세포주는 96웰 평저 플레이트내 웰당 0.5 세포의 빈도로 있는 자극된 T 세포를 1 x 106 방사선 처리 PBL 또는 LCL 세포 및 재조합 인터류킨-2(rIL2)(50 U/ml)로 플레이팅하여 항원 자극을 수행한지 2 내지 4일 뒤에 클로닝시킬 수 있다. 확립된 클론이 성장하는 웰은 초기 플레이팅한지 대략 2 내지 3주 후에 동정될 수 있으며 자가유래성 항원-제시 세포의 존재하에 적절한 항원으로 다시 자극시킨 다음 계속해서 항원 자극 2 내지 3일 뒤에 저용량의 rIL2(10 U/ml)를 첨가하여 증대시킨다. T 세포 클론은 대략 2주마다 항원과 rIL2로 주기적으로 재자극에 의해 24웰 플레이트에서 유지시킬 수 있다.
특정 양태에서, 동종이계성 T 세포를 생체내 및/또는 시험관내에서 프라이밍시킬 수 있다(즉, WT1에 감작화). 이러한 프라이밍은 T 세포의 프라이밍을 허용하기에 충분한 시간 및 조건하에서 T 세포를 WT1 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 이러한 폴리펩티드를 생성하는 세포와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 기재된 바와 같은 표준 증식, 크롬 방출 및/또는 사이토카인 방출 검정으로 측정하였을 때, 예를 들면, WT1 폴리펩티드와의 접촉으로 T 세포의 증식 및/또는 활성화가 일어나면 T 세포가 프라이밍된 것으로 간주한다. 음성 대조군과 비교하여, 증식 또는 용해에 있어 두 배 이상 증가, 및 사이토카인 수준에 있어 세 배 이상 증가의 자극 지수는 T 세포 특이성을 표시한다. 시험관내에서 프라이밍된 세포는 예를 들면, 골수 이식에 또는 공여자 림프구 주입액으로서 사용될 수 있다.
WT1 세포에 특이적인 T 세포는 WT1 단백질을 발현하는 세포를 죽일 수 있다. WT1에 대한 T 세포 수용체(TCR) 쇄를 암호화하는 유전자의 도입이 WT1을 보유하는 백혈병 및 암세포에 대한 반응을 정량/정성적으로 향상시키기 위한 수단으로 사용된다. WT1 양성 세포에 반응할 수 있는 T 세포의 수를 증가시키는 백신이 WT1 보유 세포를 표적화하는 한 방법이다. WT1에 특이적인 T 세포를 이용한 T 세포 요법이 또다른 방법이다. 대안의 방법은 WT1에 특이적인 TCR 쇄를 T 세포 또는 용해능이 있는 타 세포에 도입시키는 것이다. 적합한 양태에서, 본원에서 참조로 인용되는 WO96/30516에 기재된 바와 같이, TCR 알파 및 베타 쇄는 WT1 특이성 T 세포주로부터 클로닝되어 입양 T 세포 요법용으로 사용된다.
T 세포 수용체 조성물
T 세포 수용체(TCR)는 디설파이드 결합에 의해 연결되는 T 세포 수용체 α쇄와 β쇄로 명명된 2개의 상이하고 고가변성 폴리펩티드 쇄로 이루어져 있다[참조: Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Fourth Ed., 148-159. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999]. α/β 헤테로다이머는 세포막에서 불변성 CD3 쇄와 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 MHC 분자에 결합된 특이적 항원 펩티드를 인지한다. TCR 특이성의 거대한 다양성은 체세포 유전자 재배열을 통해서 면역글로불린 다양성 만큼이나 많이 생성된다. β쇄 유전자는 50개 이상의 가변성(V), 2개의 다양성(D), 10개 이상의 연결(J) 단편, 및 2개의 일정 영역 단편(C)을 함유한다. α쇄 유전자는 70개 이상의 V 단편, 및 60개 이상의 J 단편을 함유하지만 D 단편은 없고 1개의 C 단편을 함유한다. 흉선에서의 T 세포 발생 동안, β쇄의 D-J 유전자 재배열이 일어나고, 그 뒤에 DJ로의 V 유전자 단편 재배열이 따른다. 이러한 작용성 VDJβ 엑손은 전사되고 스플라이싱되어 Cβ에 연결된다. α쇄의 경우, Vα 유전자 단편이 Jα 유전자 단편으로 재배열하여 작용성 엑손을 생성하고 이어서 이는 전사되고 Cα에 스플라이싱된다. β쇄의 V, D 및 J 단편 사이에 및 α쇄에서 V 단편과 J 단편 사이에 P 및 N-뉴클레오티드의 무작위 첨가에 의한 재조합 과정 동안 다양성은 더욱 증가된다[참조: Janeway, Travers, Walport. Immunobiology. Fourth Ed., 98 and 150. Elsevier Science Ltd/Garland Publishing. 1999].
다른 일면으로서 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드에, 또는 이의 변이체 또는 유도체에 특이적인 TCR을 제공한다. 본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드와 아미노산 서열이 본원에 기술된 종양 폴리펩티드를 인지하는 T 세포 수용체의 알파 및 베타 쇄에 대한 V-J 또는 V-D-J 연접 영역 또는 이의 부분에 대해 제공된다. 일반적으로, 본 발명의 이러한 일면은 MHC의 맥락에서 제공된 종양 폴리펩티드를 인지하거나 그에 결합하는 T 세포 수용체에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, T 세포 수용체에 의해 인지된 종양 항원은 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, WT1 펩티드에 특이적인 TCR을 암호화하는 cDNA는 표준 분자생물학적 기술과 재조합 DNA 기술을 사용하여 종양 세포에 특이성을 띠는 T 세포로부터 분리해 낼 수 있다.
본 발명은 또한 T 세포 수용체 또는 종양 폴리펩티드를 인지하거나 그와 결합하는 본 발명의 T 세포 수용체와 실질적으로 동일한 기능이나 활성을 지닌 이의 동족체를 포함한다. 이러한 수용체로는 수용체의 단편, 또는 본원에 제공된 T 세포 수용체의 치환, 첨가 또는 결실 돌연변이체가 포함되며 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 또한 본원에 제공된 T 세포 수용체와 실질적으로 상동성이거나 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다. "동족체"란 용어는 하나 이상의 잔기, 바람직하게는 5개 이하의 잔기, 바람직하게는 25개 이상의 잔기가 작용적으로 유사한 잔기로 보존적으로 치환되고 본원에 기재된 T 세포 수용체의 작용적인 면을 보이는 본원에 제공된 T 세포 수용체와 실질적으로 동일한 아미노산 잔기 서열을 지닌 임의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명은 또한 적합한 포유동물 숙주 세포, 예를 들면 본원에 기재된 폴리펩티드에 특이적인 TCR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염되고, 그에 따라 숙주 세포를 폴리펩티드에 특이성을 띠게 하는, 비-특이성 T 세포를 제공한다. TCR의 α 및 β쇄는 별도의 발현 벡터 상에 또는 또한 내부 리보솜 유입 부위(IRES)의 하류에 있는 유전자의 cap-독립성 해독을 위한 IRES를 또한 함유하는 단일 발현 벡터 상에 함유될 수 있다. 폴리펩티드에 특이적인 TCR을 발현하는 상기 숙주 세포는 예를 들면, 하기에서 좀더 상세히 논의되는 WT1-관련된 암의 입양 면역요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 추가 일면으로서, 본원에서 언급된 폴리펩티드에 특이적인 클로닝된 TCR을 WT1-관련된 암의 진단용 키트에 사용할 수 있다. 예를 들면, 종양 특이성 TCR의 핵산 서열 또는 이의 부분을 생물학적 샘플내 특이적 TCR을 암호화하는 재배열된 유전자의 발현 검출용 탐침 또는 프라이머로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 폴리펩티드에 특이적인 TCR을 암호화하는 mRNA 또는 DNA 검출용 분석법을 제공한다.
펩티드-MHC 테트라머 복합체
또다른 일면으로서, 본 발명은 본원에 개시된 폴리펩티드를 인지하는 T 세포 또는 이의 변이체나 유도체에 특이성을 띠는 펩티드-MHC 테트라머 복합체를 제공한다. 일 양태에서, 테트라머는 WT1 특이성 T 세포의 검출에 사용될 수 있다. 테트라머는 WT1 특이성 면역반응의 모니터링, WT1 관련된 악성 종양의 조기 검출 및 최소 잔류 질환의 모니터링에 사용될 수 있다. 테트라머 염색은 통상적으로 유동 세포측정 분석으로 수행되며 병의 재발 또는 질환의 진행에 대해 비교적 위험한 상태에 처한 WT1 관련 질환을 앓고 있는 환자 집단내 그룹을 동정하는 데 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
추가적인 양태에서, 본 발명은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 요법과 병행하여 세포 또는 동물에 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체 중의 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, T 세포, TCR 및/또는 항체 조성물의 제형에 관한 것이다.
필요하다면, 본원에 개시된 조성물은 예를 들면, 다른 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다양한 약제학적 활성제와 같은 다른 제제와 병행하여 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 사실상, 부가적인 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과 접촉될 때 심각한 부작용을 일으키지 않는 한, 포함될 수 있는 다른 성분에는 실질적으로 제한이 없다. 조성물은 따라서 특정한 경우에 요구되는 바에 따라 다양한 타 제제와 함께 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성될 수도 있다. 마찬가지로, 이러한 조성물은 또한 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 일면으로서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, TCR, 및/또는 T 세포 조성물 중 하나 이상을 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정의 바람직한 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및 치료 백신 적용에 사용하기 위한 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 조성물을 포함한다. 백신 제조는 일반적으로, 예를 들면 문헌[참조: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)," Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어 있다. 일반적으로, 이러한 조성물은 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드 조성물을 하나 이상의 면역자극제와 함께 포함할 것이다.
본원에 기재된 약제학적 조성물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다. 이러한 염은 예를 들면, 유기 염기(예를 들면, 1급, 2급 및 3급 아민과 염기성 아미노산의 염) 및 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 포함하여, 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 발명의 예시적인 면역원성 조성물, 예를 들면 백신 조성물은 폴리펩티드가 본래의 장소에서 생성되도록, 전술한 폴리펩티드 중 하나 이상을 암호화하는 DNA를 포함한다. 전술한 바와 같이, 폴리뉴클레오티드는 당업자에 공지된 다양한 전달 시스템으로 투여될 수 있다. 사실, 문헌[참조: Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998], 및 거기에 인용된 참조문헌에 기재된 것들과 같이, 다수의 유전자 전달 기술이 당업계에 익히 공지되어 있다. 물론 적절한 폴리뉴클레오티드 발현 시스템은 환자에서의 발현에 필요한 조절 DNA 조절 서열(예를 들면, 적합한 프로모터 및 종결 시그널)을 함유할 것이다. 또한, 박테리아 운반 시스템은 세포 표면 상에 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하거나 이러한 에피토프를 분비하는 박테리아(예를 들면, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 수반할 수 있다.
따라서, 특정 양태에서, 본원에 기재된 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 다수의 공지된 바이러스계 시스템을 사용하여 발현용의 적합한 포유동물 숙주 세포 중으로 도입된다. 하나의 예시적인 양태에서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리하고 효과적인 플랫폼이다. 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 선택된 뉴클레오티드 서열은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 레트로바이러스 입자에 패키징되거나 벡터 중으로 삽입될 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스는 분리시킨 다음 피검자에게 전달될 수 있다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기재되어 있다[참조: 미국 특허 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109].
또한, 다수의 예증적인 아데노바이러스계 시스템도 기재되어 있다. 숙주 게놈 중으로 통합되는 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 염색체 외적으로 존속하고 이에 따라 삽입성 돌연변이 생성과 관련된 위험을 최소화한다[참조: Haj-Ahmad andGraham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; and Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476].
각종 아데노-수반 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 개발되어 왔다. AAV 벡터는 당업계에 익히 공지된 기술을 이용하여 용이하게 작제할 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,173,414호 and 제5,139,941호; 국제특허공보 WO 92/01070 and WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; and Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875].
유전자 전달에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 전달하는 데 유용한 다른 바이러스 벡터로는 우두바이러스 및 조류 폭스바이러스와 같은 폭스 계통의 바이러스로부터 유래된 것들이 포함된다. 예시적으로, 신규 분자를 발현하는 우두바이러스 재조합체는 다음과 같이 작제될 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 먼저 적당한 벡터 중으로 삽입시켜 우두프로모터와 플랭킹 우두DNA 서열, 예를 들면 티미딘 키나제(TK)를 암호화하는 서열에 인접되게 한다. 이어서 이 벡터를 백시니아로 동시에 감염되는 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 상동성 재조합은 우두프로모터+해당 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 바이러스 게놈 중으로 삽입시키는 역할을 한다. 생성되는 TK- 재조합체는 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 세포를 배양한 다음 그에 내성을 띠는 바이러스 플라크를 골라냄으로써 선별될 수 있다.
우두계 감염/형질감염 시스템은 유기체의 숙주 세포 중에 본원에서 기재한 하나 이상의 폴리펩티드의 유도성, 일시적 발현 또는 동시발현을 제공하는 데 편리하게 사용될 수 있다. 이러한 특정 시스템에서, 세포는 먼저 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 우두바이러스 재조합체로 시험관내에서 감염시킨다. 이러한 폴리머라제는 T7 프로모터를 보유한 주형만을 전사한다는 점에서 정교한 특이성을 보인다. 감염 후, 세포를 T7 프로모터에 의해 구동되는 해당 폴리뉴클레오티드(들)로 형질감염시킨다. 우두 바이러스 재조합체로부터 세포질에 발현된 폴리머라제는 형질감염된 DNA를 RNA로 전사하고 이는 이어서 숙주 해독 기구에 의해 폴리펩티드로 해독된다. 방법은 다량의 RNA 및 이의 해독 산물의 고수준의 일시적인 세포질 생성을 제공한다. [참조: Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122-8126].
또한, 계두 및 카나리폭스 바이러스 같은 아비폭스바이러스도 해당 암호화 서열의 전달에 사용될 수 있다. 포유동물 병원체로부터 면역원을 발현하는 재조합 아비폭스 바이러스는 비-조류 종에 투여될 때 보호성 면역을 부여하는 것으로 알려져 있다. 아비폭스 벡터의 사용은 인간 및 타 포유동물 종에서 특히 바람직한데 이유는 아비폭스 속의 멤버들이 감수성 조류 종에서만 생산적으로 복제할 수 있고 따라서 포유동물 세포에서는 비감염성이기 때문이다. 재조합 아비폭스바이러스의 제조방법은 당업계에 공지되어 있으며 우두바이러스의 생산에 관하여 전술한 바와 같이 유전자 재조합을 이용한다. [참조: WO 91/12882; WO 89/03429; 및 WO 92/03545]. 다수의 폭스 바이러스가 이종 단백질 발현용 생 바이러스 벡터로서 개발되어 왔다[참조: Cepko et al., Cell 37:1053-1062 (1984); Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4626-4630 (1987); Lowe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:3896-3900 (1987); Panicali & Paoletti, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 79:4927-4931 (1982); Machett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:7415-7419 (1982)]. 대표적인 계두 및 돈두 바이러스는 각각 수탁번호 VR-229 및 VR-363하에 ATCC를 통해 입수할 수 있다. 재조합 우두--CEA는 수탁번호 VR2323하에 ATCC를 통해 입수 가능하다. 다른 예시적인 바이러스 벡터로는 또한 예를 들면, 미국 특허 제6,051,410호, 제5,858,726호, 제5,656,465호, 제5,804,196호, 제5,747,324호, 제6,319,496호, 제6,165,460호에서 Therion Biologics (Cambridge, MA, USA)에 의해 기술된 것들이 포함되며 이에 한정되지 않는다.
미국 특허 제5,843,723호; 제6,015,686호; 제6,008,035호 및 제6,015,694호에 기재된 벡터들과 같이, 다수의 알파바이러스 벡터가 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드 조성물의 운반에 사용될 수 있다. 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis (VEE))에 기초한 특정 벡터도 사용될 수 있으며, 이의 예시적인 예는 미국 특허 제5,505,947호 및 제5,643,576호에서 찾아볼 수 있다.
또한, 문헌[참조: Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866-6869 and Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099-6103]에 기술된 아데노바이러스 키메릭 벡터와 같은 분자 접합체 벡터도 본 발명하에 유전자 전달에 사용될 수 있다.
이들 및 다른 공지의 바이러스계 전달 시스템에 관한 추가의 예시적인 정보는 예를 들면, 문헌[참조: Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:1721, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 및 제5,017,487호; WO89/01973; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 특허 제GB2,200,651호; 유럽 특허 제EP0,345,242호; WO91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215219, 1994; KassEisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1149811502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:28382848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73:12021207, 1993]에서 찾아볼 수 있다.
당업자에게 용이하게 이해되겠듯이, 다수의 부가 성분이 본원에서 기재된 바와 같이 WT1 폴리펩티드 또는 이의 부분을 발현하는 DNA 또는 레트로바이러스 벡터에 존재할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드의 전달용 발현 벡터는 CD28, B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3를 포함하여(이에 한정되지 않음) 다수의 각종 동시자극성(costimulatory) 분자를 포함할 수 있다. 전달 벡터는 또한 다수의 사이토카인, 예를 들면, IFN-γ, GM-CSF, 또는 IL-2를 포함할 수 있다. 하나의 예시적인 양태에서, 재조합 바이러스 벡터, 예를 들면, 우두 또는 계두 바이러스 벡터는 B7-1, ICAM-1, 및 LFA-3을 포함한다.
본 발명은 또한 WT1의 발현과 관련된 악성 종양의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 DNA 및/또는 바이러스 벡터의 임의 배합의 사용을 포함한다. 하나의 예시적인 양태에서, 재조합 우두 바이러스 벡터는 WT1-관련 악성 종양에 시달리는 동물 또는 인간 환자에 투여되며, 뒤이어 재조합 계두 바이러스 벡터가 투여된다. 본 발명의 또다른 양태에서, 재조합 계두 바이러스는 우두 벡터의 투여 뒤에 2회 투여된다(예를 들면, 프라임/부스트/부스트 백신접종 처방).
특정 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 표적 세포의 게놈 중으로 통합될 수 있다. 이러한 통합은 상동성 재조합을 통해 특정 위치와 배향으로(유전자 대체) 일어날 수 있거나 무작위, 비-특이적 위치에 통합될 수 있다(유전자 증대). 추가의 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 DNA의 분리된 에피솜 단편으로서 세포에서 안정하게 유지될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 단편 또는 "에피솜"은 숙주 세포 사이클과 무관하게 또는 그와 동시성으로 유지 및 복제를 허용하기에 충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물이 세포에 전달되고 세포내 어디에 폴리뉴클레오티드가 잔류하는가 하는 방식은 사용되는 발현 작제물의 종류에 좌우된다.
본 발명의 또다른 양태에서, 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에서 기술되고 문헌[참조: Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에서 검토된 바와 같이 "네이키드" DNA로서 투여/전달된다. 네이키드 DNA의 흡수는 DNA를 생분해성 비드 상에 코팅함으로써 증가시킬 수 있으며, 이들 비드는 세포 중으로 효율적으로 수송된다.
또다른 양태에서, 본 발명의 조성물은 다수가 기재된 입자 충격법을 통해 전달될 수 있다. 하나의 예시적인 예에서, 가스-추진 입자 가속은 Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) 및 Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI)에 의해 제조된 것들과 같은 장치로 달성될 수 있으며, 이런 장치의 일부가 미국 특허 제5,846,796호; 제6,010,478호; 제5,865,796호; 제5,584,807호; 및 유럽 특허 제 0500 799호에 기재되어 있다. 이러한 접근방법은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 입자 같은 미세 입자의 건조 분말 제형이 손에 들고 쓰는 장치에 의해 생성된 헬륨 가스내에서 고속으로 가속되어, 입자를 해당 표적 이슈로 추진하는 무침 전달법을 제공한다.
관련 양태에서, 본 발명 조성물의 가스-추진 무침 주사에 유용할 수 있는 다른 장치와 방법은 Bioject, Inc. (Portland, OR)에 의해 제공된 것들이 포함되며, 이중 일부 예가 미국 특허 제4,790,824호; 제5,064,413호; 제5,312,335호; 제5,383,851호; 제5,399,163호; 제5,520,639호 및 제5,993,412호에 기재되어 있다.
또다른 양태에 따라, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 항체, T-세포, TCR 및/또는 APC 조성물과 더불어 하나 이상의 면역자극제를 포함할 것이다. 면역자극제는 본질적으로, 외인성 항원에 대한 면역반응(항체 및/또는 세포-매개성)을 증대 또는 강화하는 물질을 말한다. 면역자극제의 바람직한 하나의 유형은 보조제를 포함한다. 다수의 보조제는 수산화알루미늄 또는 미네럴 오일 같이 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질, 및 지질 A, 보르타델라 퍼투시스 또는 마이코박테리움 투버쿨로시스 유래 단백질 같은 면역반응 자극제를 함유한다. 특정 보조제, 예를 들면 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제(Difco Laboratories, Detroit, MI); Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄 겔 (알룸) 또는 인산알루미늄 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연의 염; 아실화 타이로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미소체; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A가 시판되고 있다. GM-CSF, 인터류킨-2, -7, -12, 및 다른 유사 성장인자도 보조제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 보조제 조성물은 바람직하게는, 주로 Th1형의 면역반응을 유도하는 것이다. 고 수준의 Th1형 사이토카인(예를 들면, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여 항원에 대한 세포 매개성 면역반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 이와는 대조적으로, 고 수준의 Th2형 사이토카인(예를 들면, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 본원에서 제공되는 백신의 적용 뒤에, 환자는 Th1형 및 Th2형 반응을 포함하는 면역반응을 지원하게 된다. 반응이 주로 Th1형인 바람직한 양태에서, Th1형 사이토카인의 수준은 Th2형 사이토카인의 수준보다 좀더 큰 범위로 증가하게 된다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 분석법을 이용하여 용이하게 평가될 수 있다. 사이토카인의 계통의 개관을 위해서는 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989] 참조.
주로 Th1형 반응을 유도하기 위한 특정의 바람직한 보조제는 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염의 배합물을 포함한다. MPLR 보조제는 Corixa Corporation (Seattle, WA; 예를 들면, 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조)으로부터 입수 가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드(여기에서, CpG 디뉴클레오티드는 비-메틸화된다)는 또한 지배적으로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 잘 알려져 있으며 예를 들면, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열 또한 예를 들면, 문헌[참조: Sato et al., Science 273:352, 1996]에 의해 기재되었다. 또다른 바람직한 보조제는 Quil A, 또는 QS21 및 QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)을 포함한 이의 유도체와 같은 사포닌; 에신(Escin); 디지토닌(Digitonin); 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 케노포디움 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 본 발명의 보조제 배합물에 하나 이상의 사포닌, 예를 들면, QS21, QS7, Quil A, 에신, 또는 디지토닌을 포함하는 상기 그룹 중 적어도 둘의 배합을 포함한다.
또한, 사포닌 제형은 키토산 또는 다른 폴리양이온 중합체, 폴리락타이드 및 폴리락타이드-코-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민계 중합체 매트릭스, 폴리사카라이드 또는 화학적으로 변형된 폴리사카라이드로 구성된 입자, 리포솜 및 지질계 입자, 글리세롤 모노에스테르로 구성된 입자 등으로 이루어지는 백신 비히클과 배합될 수 있다. 사포닌은 또한 리포솜 또는 ISCOM 같은 미립자 구조를 형성하기 위하여 콜레스테롤의 존재하에 제형될 수 있다. 또한, 사포닌은 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께, 비-미립자 용액 또는 현탁액에서, 또는 포시라멜라(paucilamelar) 리포솜 또는 ISCOM 같은 미립자 구조로 제형될 수 있다. 사포닌은 또한 점도를 증가시키기 위하여 CarbopolR 같은 부형제를 사용하여 제형될 수 있거나, 또는 락토스와 같은 분상 부형제를 사용하여 건조 분말 형태로 제형될 수 있다.
하나의 바람직한 양태에서, 보조제 시스템은 WO 94/00153에 기술된 바와 같이 QS21과 3D-MPLR 보조제의 배합물 같은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 또는 WO 96/33739에 기재된 바와 같이 QS21이 콜레스테롤로 퀀칭되는 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀션 중의 QS21, 3D-MPLR 보조제 및 토코페롤을 사용하는 또다른 특히 바람직한 보조제 제형이 WO 95/17210에 기술되어 있다.
또다른 증강된 보조제 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오티드와 사포닌 유도체의 배합물을 포함하며 특히 CpG와 QS21의 배합물이 WO 00/09159에 개시되어 있다. 바람직하게는, 제형은 수중유 에멀션과 토코페롤을 부수적으로 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 추가적인 예의 보조제로는 Montanide ISA 720 (Seppic, France), SAF (Chiron, California, United States), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), SBAS 시리즈의 보조제 (예를 들면, SBAS-2 또는 SBAS-4, 입수처: SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox (EnhanzynR) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) 및 개시내용이 전부 본원에 참조로 인용되는 계류 중인 미국 특허출원 제08/853,826호 및 제09/074,720호, 및 미국 특허 제6,303,347호에 기재된 것들과 같은 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트 (AGP), 및 WO 99/52549A1에 기재된 것들과 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 보조제가 포함된다. 본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 부가적인 예의 보조제로는 이소투세로졸이 포함된다.
다른 바람직한 보조제로는 하기 화학식의 보조제 분자가 포함된다:
상기식에서,
n은 1 내지 50이고,
A는 결합 또는 -C(O)-이며,
R은 C1-50 알킬 또는 페닐 C1-50 알킬이다.
본 발명의 일 양태는 n이 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분이 C1-50, 바람직하게는 C4-20 알킬, 가장 바람직하게는 C12
알킬이며, A는 결합인 화학식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 구성된다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1% 범위에 있어야 한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 하기 그룹: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르 중에서 선택된다, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 Merck index (12th edition: entry 7717)에 기재되어 있다. 이들 보조제 분자는 WO 99/52549에 기재되어 있다.
상기 화학식 (I)에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는 필요에 따라, 또다른 보조제와 배합될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 보조제 배합물은 바람직하게는 계류중인 영국 특허출원 제GB 9820956.2호에 기재된 바와 같은 CpG와의 배합물이다.
본 발명의 또다른 양태에 따라, 본원에 기재된 면역원성 조성물은 수지상 세포, 마크로파지, B 세포, 단핵구 및 효율적인 APC가 되도록 공학처리될 수 있는 다른 세포와 같은 항원 표시 세포(APC)를 통해 숙주에 전달된다. 이러한 세포는 항원 제시능을 증가시키기 위하여, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키기 위하여, 그 자체로 항종양 효과를 보유하도록 및/또는 수령자(즉, 매치된 HLA 반수체형)와 면역학적으로 적합해지도록 유전자 변형시킬 수 있으며, 꼭 필요한 것은 아니다. APC는 일반적으로, 종양 및 주위종양 조직을 포함한 각종 생물학적 유체와 기관으로부터 분리될 수 있으며, 자가유래성, 동종이계, 유전적 동계 또는 이종발생성 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 양태는 항원-제시 세포로서 수지상 세포 또는 이의 선조 세포를 사용한다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC이며(Banchereau and Steinman, Nature 392:245-251, 1998) 예방 또는 치료용 항종양 면역성 도출을 위한 생물학적 보조제로서 유효한 것으로 나타났다[참조: Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 형태(시험관내에서 가시적인 현저한 세포질 과정(수지상)과 함께, 본래의 장소에서 방사상 형태), 고효율로 항원을 흡수, 가공 및 제시하는 이들의 능력 및 이들의 나이브 T 세포 반응 활성화능을 기초로 동정될 수 있다. 수지상 세포는 물론, 생체내 또는 생체외에서 수지상 세포 상에서는 일반적으로 발견되지 않는 특이적인 세포 표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 공학처리될 수 있으며, 이러한 변형된 수지상 세포는 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포에 대한 대안으로서, 분비된 소낭 항원-탑재 수지상 세포(엑소솜으로 호칭)가 백신에 사용될 수 있다[참조: Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998].
수지상 세포 및 선조 세포는 말초혈, 골수, 종양-침윤 세포, 주위종양 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 탯줄 혈액 또는 여타의 적합한 조직이나 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 말초혈으로부터 수거한 단핵구의 배양물에 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNF-α 같은 사이토카인의 배합물을 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 또한, 말초혈, 탯줄 혈액 또는 골수로부터 수거한 CD34 양성 세포는 GM-CSF, IL-3, TNF-α, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 타 화합물의 배합물을 배양 배지에 가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 간단한 방식으로 두 잘 성상확인된 표현형간을 구별하게 하는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 편의상 분류된다. 그러나, 이러한 명명법은 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 미성숙 수지상 세포는 Fcγ 수용체 및 만노스 수용체의 높은 발현과 상관관계가 있는, 항원 흡수 및 가공에 대한 역량이 높은 APC로 특징지워 진다. 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커를 낮게 발현하지만, 유형 I 및 유형 II MHC와 같은 T 세포 활성화를 관장하는 세포 표면 분자, 부착 분자(예를 들면, CD54 및 CD11) 및 동시자극성 분자(예를 들면, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)를 높게 발현함을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로, 암호화된 폴리펩티드, 또는 이의 면역원성 부분이 세포 표면상에 발현되도록 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (또는 이의 일부 또는 다른 변이체)로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 일어날 수 있으며, 이어서 이러한 형질감염된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 본원에 기재된 바와 같이 치료용으로 사용될 수 있다. 또한, 수지상 또는 타 항원 표시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클이 환자에 투여될 수 있으며, 이에 따라 생체내에서 발생하는 형질감염이 유도된다. 예를 들면, 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 WO 97/24447에 기재된 것들과 같이 당업계에 공지된 임의 방법, 또는 문헌[참조: Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 의해 기재된 유전자 건 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 수지상 세포의 항원 탑재는 수지상 세포 또는 선조 세포를 종양 폴리펩티드, DNA(네이키드 상태 또는 플라스미드 벡터내에 있는 상태) 또는 RNA; 또는 항원 발현 재조합 박테리아 또는 바이러스(예를 들면, 우두, 계두, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 배양시킴으로써 달성될 수 있다. 탑재에 앞서서, 폴리펩티드는 T 세포 조력을 제공하는 면역학적 파트너(예를 들면, 담체 분자)에 공유적으로 접합시킬 수 있다. 또한, 수지상 세포는 비-접합성 면역학적 파트너로, 별도로 또는 폴리펩티드의 존재하에 펄싱될 수 있다.
당업자에 공지된 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약제학적 조성물에 사용될 수 있지만, 담체 유형은 통상적으로 투여 방식에 따라 다양하다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 국소, 경구, 비강, 점막, 정맥내, 두개내, 복막내, 피하 및 근육내 투여를 포함하여 임의의 적당한 투여 방식을 위해 제형될 수 있다.
이러한 약제학적 조성물에 사용할 담체는 생체적합성이고 또는 생분해성일 수 있다. 특정 양태에서, 제형은 바람직하게는 비교적 일정 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 그러나, 다른 양태에서, 투여 즉시 더 신속한 방출속도가 요망될 수도 있다. 이러한 조성물의 제형은 공지 기술을 사용하는 당업자 수준의 범주에 있다. 이와 관련하여 유용한 예시적인 담체로는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란 등의 미립자가 포함된다. 다른 예시적인 서방성 담체는 비-액성 친수성 코어(예를 들면, 가교된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드)를 포함하는 초분자성(supramolecular) 바이오벡터, 및 임의로는 인지질 같은 양쪽친화성 화합물을 포함하는 외층을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 WO 94/20078, WO 94/23701 및 WO 96/06638 참조). 서방성 제형에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출속도와 예상 지속기간 및 치료 또는 예방될 증상의 특성에 따라 좌우된다.
또다른 예시적인 양태에서, 생분해성 미소체(예를 들면, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)가 본 발명 조성물에 대한 담체로서 사용된다. 적합한 생분해성 미소체는 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호에 개시되어 있다. WO 99/40934, 및 거기에 인용된 참조문헌에 기재된 바와 같은 변형된 B형 간염 코어 단백질 담체 시스템도 다수의 적용에 유용할 것이다. 또다른 예시적인 담체/전달 시스템은 숙주에서 유형 I-제한 세포독성 T 림프구 반응을 유도할 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기재된 것들과 같은 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용한다.
또다른 예시적인 양태에서, 인산칼슘 코어 입자가 담체, 백신 보조제, 또는 본 발명의 조성물에 대한 조절된 방출 매트릭스로서 사용된다. 예시적인 인산칼슘 입자는 예를 들면, 공개된 특허출원 No. WO/0046147에 개시되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종종 하나 이상의 완충제(예를 들면, 중성 완충된 생리식염수 또는 인산염 완충된 생리식염수), 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 글리신 같은 아미노산, 항산화제, 정균제, EDTA 또는 글루타치온 같은 킬레이트화제, 보조제(예를 들면, 수산화알루미늄), 제형을 수령인의 혈액으로 등장성, 저장성 또는 약한 고장성으로 만드는 용질, 현탁제, 증점제 및/또는 방부제를 추가로 포함하게 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형될 수 있다.
본원에서 기재된 약제학적 조성물은 밀봉 앰플 또는 바이얼 같은 단위-용량 또는 다용량 용기로 제공될 수 있다. 이러한 용기는 전형적으로 사용시까지 제형의 멸균성과 안정성을 보존하기 위한 방식으로 밀봉된다. 일반적으로, 제형은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀션으로 보관될 수 있다. 또한, 약제학적 조성물은 사용 직전에 멸균액 담체를 첨가만 하면 되는 동결건조 상태로 저장될 수도 있다.
예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 비내, 및 근육내 투여 및 제형을 포함한 다양한 처치법으로 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투약 및 처치 방법의 개발이 당업계에 익히 공지되어 있으며, 이중 일부가 일반적인 설명을 위하여 간단히 후술된다.
특정한 적용에서, 본원에 개시된 약제학적 조성물은 경구 투여를 통해 동물에 전달될 수 있다. 따라서, 이들 조성물은 불활성 희석제로 또는 동화성 식용 담체로 제형될 수 있거나, 또는 이들은 경질 또는 연질 껍질 캡슐에 내장될 수 있거나, 이들은 정제로 타정될 수 있거나, 또는 이들은 음식물과 직접 병합될 수 있다.
활성 화합물은 또한 부형제와 병합되어 섭취 가능한 정제, 볼 정제(buccal tablet), 트로키제, 캡슐제, 엘릭서제, 현탁액제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다(예를 들면, Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27;386(6623):410-4; Hwang et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998;15(3):243-84; 미국 특허 제5,641,515호; 미국 특허 제5,580,579호 및 미국 특허 제5,792,451호 참조). 정제, 트로키제, 환제, 캡슐제 등은 또한 각종 부가 성분을 함유할 수 있으며, 예를 들면, 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴 같은 결합제; 인산이칼슘 같은 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 같은 윤활제; 및 수크로스, 락토스 또는 사카린 같은 감미제가 첨가될 수 있거나 페퍼민트, 동록유, 또는 체리 향 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 투약 단위형이 캡슐인 경우, 이는 전술한 유형의 물질 외에도 액상 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질이 코팅으로서 또는 또한 투약 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위하여 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 또는 캡슐은 셸락, 당, 또는 양자 모두로 코팅시킬 수 있다. 물론, 투약 단위형의 제조에 사용되는 물질은 약제학적으로 순수하고 사용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형 중으로 혼입될 수 있다.
전형적으로, 이들 제형은 활성 화합물을 적어도 약 0.1% 또는 그 이상 함유하겠지만, 활성 성분(들)의 %는 물론 변동될 수 있으며 편의상 전체 제형의 중량 또는 용적의 약 1 또는 2% 내지 약 60% 또는 70% 또는 그 이상일 수 있다. 당연하게, 각각의 치료적으로 유용한 조성물내 활성 화합물의 양은 적당한 투여량이 화합물의 주어진 단위 용량으로 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 반감기 같은 요인, 및 다른 약리학적 고려사항이 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 감안될 것이며, 따라서 다양한 투여량 및 처치법이 바람직할 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 구강세척제, 치마제, 볼 정제, 구강용 스프레이, 또는 설하 경구-투여 제형과 병합될 수 있다. 또한, 활성 성분은 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 함유하는 것과 같이 경구액 중으로 혼입될 수 있거나, 또는 치마제에 분산되거나, 또는 물, 결합제, 마모제, 향미제, 발포제, 및 보습제를 포함할 수 있는 조성물에 치료 유효량으로 첨가될 수 있다. 또한, 조성물은 혀 밑에 배치되거나 입 안에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태로 만들 수 있다.
특정한 상황에서는 본원에 개시된 약제학적 조성물을 비경구적으로, 정맥내, 근육내, 또는 심지어 복막내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 접근법은 당업자에 익히 공지되어 있으며, 이중 일부가 좀더 상세하게, 예를 들면, 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5,641,515호 및 미국 특허 제5,399,363호에 기재되어 있다. 특정 양태에서, 유리 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액이 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적절하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액 또한 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 일반적으로 미생물 증식을 방지하기 위하여 방부제를 함유하게 된다.
주사용으로 적합한 예시적인 제약 형태는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다(예를 들면, 미국 특허 제5,466,468호 참조). 모든 경우에, 제약 형태는 멸균성이어야 하고 용이한 주사성이 존재하는 정도로 유동성이어야 한다. 제조 및 저장 조건에서 안정하여야 하고 박테리아 및 진균 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적당한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 예를 들면, 레시틴 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및/또는 계면활성제의 사용에 의해 적당한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔빈산, 티머로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들면 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 장기적인 흡수는 조성물에 흡수를 지연하는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 일어날 수 있다.
일 양태에서, 수용액으로 비경구 투여하기 위해서는, 용액은 필요에 따라 적당히 완충시켜야 하며 액상 희석제를 우선 충분량의 생리식염수나 글루코스로 등장성이 되게 만든다. 이들 특정의 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본원의 개시내용에 비추어 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 1회 투여량을 1 ml의 NaCl 등장액에 용해시키거나 1000 ml의 대량피하주사액에 가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580 참조). 치료될 환자의 상태에 따라 투여량의 일부 변동이 있게 마련이다. 더욱이, 인간에 투여할 경우, 제제는 물론 바람직하게는, FDA Office of Biologics standards에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성과 일반적인 안전 및 순도 기준을 충족할 것이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성)을 포함하며, 예를 들면, 염산 또는 인산 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등의 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 철 수산화물 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형시에, 용액은 투약 제형과 상용하는 방식으로 및 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다.
담체는 임의의 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 익히 공지되어 있다. 통상의 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란 인간에 투여될 때 알레르기 또는 그와 유사한 불리한 반응을 일으키지 않는 분자상 실재물 및 조성물을 말한다.
특정 양태에서, 약제학적 조성물은 비내 스프레이, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 운반 비히클에 의해 전달될 수 있다. 유전자, 핵산, 및 펩티드 조성물을 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐로 직접 전달하는 방법이 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호에 기술되어 있다. 마찬가지로, 비내용 마이크로 입자 수지(Takenaga et al., J Controlled Release 1998 Mar 2;52(1-2):81-7) 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물 (미국 특허 제5,725,871호)을 사용하여 약제를 전달하는 방법 또한 제약업계에 익히 공지되어 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태의 예시적인 점막횡단 약제 전달이 미국 특허 제5,780,045호에 기재되어 있다.
특정 양태에서, 리포솜, 나노캡슐, 마이크로 입자, 지질 입자, 소낭 등이 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체 중으로 도입하는 데 사용된다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소낭, 나노스피어, 또는 나노 입자 등에 캡슐화하여 운반하도록 제형될 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 이러한 담체 비히클의 표면에 공유 또는 비공유 결합될 수 있다.
가능성 있는 약제 담체로서의 리포솜 및 리포솜-유사 제제의 형성 및 사용은 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다(예를 들면, Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul;16(7):307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar;56(3):691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug;35(8):801-9; Margalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995;12(2-3):233-61; 미국 특허 제5,567,434호; 미국 특허 제5,552,157호; 미국 특허 제5,565,213호; 미국 특허 제5,738,868호 및 미국 특허 제5,795,587호 참조, 각각은 전체로 본원에서 참조로 인용된다).
리포솜은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양액 및 PC 12 세포를 포함하여, 정상적으로는 다른 절차에 의해 형질감염시키기가 곤란한 다수의 세포형에 성공적으로 사용되어 왔다(문헌: Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25;265(27):16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr;9(3):221-9). 또한, 리포솜은 바이러스계 운반 시스템에 전형적인 DNA 길이의 제약이 없다. 리포솜은 유전자, 각종 약제, 방사선치료제, 효소, 바이러스 전사 인자, 알로스테릭 효과 인자 등을 각종 배양 세포주 및 동물 중으로 효과적으로 도입하는 데 사용되어 왔다. 또한, 리포솜의 사용은 전신 전달 후 자가면역 반응 또는 용인될 수 없는 독성과 관련되어 있는 것으로 보이지는 않는다.
특정 양태에서, 리포솜은 수성 매질에 분산되어 멀티라멜라 동심원성 이중층 소낭(멀티라멜라 소낭(MLV)으로도 불림)을 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다.
또한, 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현 가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다(예를 들면, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec;24(12):1113-28 참조). 세포내 중합체 과잉 탑재에 기인한 부작용을 피하기 위하여, 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 이러한 극미세 입자(약 0.1 ㎛ 크기)를 디자인할 수 있다. 그런 입자는 예를 들면, 문헌[참조: Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1):1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar;45(2):149-55; Zambaux et al. J Controlled Release. 1998 Jan 2;50(1-3):31-40; 및 미국 특허 제5,145,684호]에 기재된 바와 같이 하여 제조될 수 있다.
악성 질환의 치료요법
암 요법에 대한 면역학적 접근은 암 세포가 종종 변종 또는 이종 세포 및 분자에 대한 신체 방어선을 교묘히 피할 수 있고, 이들 방어선이 실지 회복을 위해 치료적으로 자극될 수 있다(pgs. 623-648 in Klein, Immunology, Wiley-Interscience, New York, 1982)는 인식에 기초한다. 다양한 면역 효과 인자가 종양의 성장을 직접 또는 간접적으로 억제할 수 있다는 최근의 수많은 관찰은 암 요법에 대한 이러한 접근방식에 있어서 관심을 부활시켰다[참고: Jager, et al., Oncology 2001;60(1):1-7; Renner, et al., Ann Hematol 2000 Dec;79(12):651-9].
기능이 항종양 세포 면역성 및 신체로부터 종양 세포의 제거와 연관되어 있는 4종의 기본적인 세포형은: i) 비자기 침입자 세포를 확인하고 표지하기 위하여 혈장 중으로 면역글로불린을 분비하는 B-림프구; ii) 면역글로불린-코팅된 표적 침입자 세포의 용해 및 처리를 담당하는 보체 단백질을 분비하는 단핵구; iii) 종양 세포의 파괴를 위한 두 가지 기전, 항체-의존성 세포 독성 및 자연 살해성을 지닌 내추럴 킬러 림프구; 및 iv) 항원-특이성 수용체를 보유하며, 상보적인 마커 분자를 운반하는 종양 세포를 인지하는 능력을 지닌 T-림프구이다(Schreiber, H., 1989, in Fundamental Immunology (ed). W. E. Paul, pp. 923-955).
암 면역요법은 일반적으로 체액성 면역반응, 세포성 면역 반응, 또는 양자 모두의 유도에 초점을 맞추고 있다. 더욱이, CD4+ T 헬퍼 세포의 유도가 항체 또는 세포독성 CD8+ T 세포를 2차적으로 유도하는 데 필수적임이 잘 확립되어 있다. 암 세포, 특히 WT1 발현과 연관된 암 세포에 선택적이고 이상적으로 특이적인 폴리펩티드 항원은 WT1 발현과 연관된 암에 대한 면역반응을 유도하기 위한 강력한 방법을 제공하며 본 발명의 중요한 일면이다.
본 발명의 추가의 일면에서, 본원에 기재된 조성물과 백신은 악성 질환(예를 들면, 진행성 또는 전이성 질환 또는 최소 잔존 질환과 같이 작은 종양 크기를 특징으로 하는 질환)의 발병을 억제하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 WT1 발현과 연관된 질환의 예방, 지연 또는 치료에 사용될 수 있다. 환언하면, 본원에 제공된 치료법은 기존 WT1-관련 질환의 치료에 사용될 수 있거나, 또는 병이 없거나 WT1 발현과 아직 관련되지 않은 질환으로 고생하는 환자에서 이러한 질환의 발병을 지연시키거나 예방하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 질환의 진행 동안 어떤 시기에 병에 걸린 세포(예를 들면, 종양 세포)가 동일 조직의 정상 세포보다 높은 수준의 WT1 폴리펩티드를 검출 가능하게 생성하면 질환은 "WT1 발현과 연관되어 있다". WT1 발현과 악성 질환의 연관은 WT1이 종양 상에 존재할 것을 요하지 않는다. 예를 들면, WT1의 과발현은 종양의 개시와 관계가 있을 수 있지만, 단백질 발현은 후속적으로 손실될 수 있다. 또한, WT1 발현의 증가를 특징으로 하지 않는 악성 질환은 추후에, 증가된 WT1 발현을 특징으로 하는 질환으로 진행한다. 따라서, 병에 걸린 세포가 이전에 발현하였거나, 현재 발현하거나, 또는 차후에 증가된 수준의 WT1을 발현할 것으로 예상되는 악성 질환은 "WT1 발현과 연관이 있다"고 생각된다.
면역요법은 본원에 제공된 화합물 또는 세포가 WT1-발현 세포를 환자로부터 제거하는 기능을 발휘하는 다양한 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 제거는 WT1에 특이적인 환자 또는 WT1을 발현하는 세포에서 면역반응을 증대시키거나 유도하는 결과로서 일어날 수 있다. 또한, WT1-발현 세포는 생체외에서 (자가 유래의 골수, 말초혈 또는 골수나 말초혈의 분획 처리에 의해) 제거될 수 있다. 골수 또는 말초혈의 분획은 당해 분야의 표준 기술을 사용하여 수득될 수 있다.
이러한 방법에서, 약제학적 조성물 및 백신이 환자에 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "환자"란 온혈동물, 바람직하게는 인간을 말한다. 환자는 악성 질환으로 시달리고 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 백신은 발병 예방에(즉, 예방 차원으로) 또는 질환으로 시달리는 환자의 치료에(예를 들면, 기존 질환의 진행 및/또는 전이를 방지하거나 지연시키기 위하여) 사용될 수 있다. 질환으로 시달리는 환자는 최소한의 잔존 질환을 보유할 수 있다(예를 들면, 완전 또는 부분적인 회복 국면에 있는 백혈병 환자 또는 수술, 방사능요법 및/또는 화학요법 후 종양 크기의 감소가 따르는 암 환자에 있어서 작은 종양 크기). 이러한 환자는 재발 억제를 위하여(즉, 재발 방지 또는 지연, 또는 재발 정도의 감소를 위하여) 면역시킬 수 있다. 특정의 바람직한 양태에서, 환자는 백혈병(예를 들면, AML, CML, ALL 또는 유아기 ALL), 골수형성이상 증후군(MDS) 또는 암(예를 들면, 위장암, 폐암, 갑상선암 또는 유방암 또는 흑색종)으로 시달리거나(여기에서 암 또는 백혈병은 WT1 양성이거나(즉, 본원에서 제공되는 항-WT1 항체와 검출 가능하게 반응하거나 본원에서 기재되는 바와 같이 RT-PCR에 의해 검출 가능한 수준으로 WT1 mRNA를 발현한다)) 또는 WT1-발현 세포에 대해 지향된 자가면역 질환을 앓는다.
WT1 과발현과 관련된 타 질환으로는 문헌[참조: Satoh F., et al., Pathol. Int. 50(6):458-71(2000), and Campbell C. E. et al., Int. J. Cancer78(2):182-8 (1998)]에 기재된 바와 같이 신장암(신장세포 암종, 또는 윌름 종양) ; 및 문헌[참조: Amin, K.M. et al., Am. J. Pathol. 146(2):344-56 (1995)]에 기재된 바와 같이 중피종을 포함한다. 문헌[참조: Harada et al. (Mol. Urol. 3(4):357-364 (1999)]은 인간의 고환 생식세포 종양에서의 WT1 유전자 발현을 기술하고 있다. 문헌[참조: Nonomura et al. Hinyokika Kiyo 45(8):593-7 (1999)]에는 고환암-특이성 유전자의 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하는 고환암의 분자적 스테이징이 기재되어 있다. 문헌[참조: Shimizu et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 19(2):158-63 (2000)]은 상피 난소 종양에서의 윌름 종양 유전자 (WT1)의 면역조직화학적 검출을 기술하고 있다.
WT1 과발현이 또한 결합조직형성 소형 라운드 세포 종양에서 Barnoud, R. 등(Am. J. Surg. Pathol. 24(6):830-6 (2000); and Pathol. Res. Pract. 194(10):693-700 (1998))에 의해 기술되었다. 교아종 및 다른 암에서의 WT1 발현이 Menssen, H.D. 등(J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126(4):226-32 (2000), "Wilms' tumor gene (WT1) expression in lung cancer, colon cancer and glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens.")에 의해 기술되었다. WT1 과발현을 보이는 다른 질환으로는 버킷 림프종 및 비인두암 같은 EBC 관련 질환이 포함된다(Spinsanti P. et al., Leuk. Lymphoma38(5-6):611-9 (2000), "Wilms' tumor gene expression by normal and malignant human B lymphocytes.").
Leukemia 14(9):1634-4 (2000)에서 Pan 등은 백혈병 또는 골수형성이상 증후군이 있는 환자로부터의 말초혈 단핵구의 IL-12 처리를 기술하고 있으며, 세포독성의 증가 및 WT1 유전자 발현의 감소를 보고하였다. Leukemia 13(6):891-900 (1999)에서 Patmasiriwat 등은 골수형성이상 증후군과 급성 백혈병에서의 WT1 및 GATA1 발현을 보고하였다. Leukemia13(3):393-9 (1999)에서, Tamaki 등은 윌름 종양 유전자 WT1이 골수형성이상 증후군의 질환 진행의 진단을 위한 훌륭한 마커임을 보고하였다. 고형암에서 윌름 종양 유전자 WT1의 발현, 및 종양 세포 증식에의 개입이 위암, 대장암, 폐암, 유방암 세포주, 생식 세포 종양 세포주, 난소암, 자궁암, 갑상선암 세포주, 간세포 암종에 관하여 논의되었다[참조: Oji et al., Jpn. J. Cancer Res. 90(2):194-204 (1999)].
본원에 제공된 조성물은 단독으로 또는 수술, 방사선 처리, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가유래성, 유전적 동계, 동종이계 또는 비혈연 관계)과 같은 통상의 치료처방과 병행하여 사용될 수 있다. 하기에서 좀더 상세히 논의되는 바와 같이, 본원에서 제공되는 결합제 및 T 세포는 자가유래성 줄기 세포의 퍼징(purging)에 사용될 수 있다. 이러한 퍼징은 예를 들면, 골수 이식 또는 혈액 또는 이의 성분의 수혈 전이 유익할 수 있다. 본원에 제공된 결합제, T 세포, 항원 표시 세포(APC) 및 조성물은 또한 시험관내 및/또는 생체내에서 자가유래성, 동종이계, 유전적 동계 또는 무혈연 관계의 WT1-특이성 T 세포를 증대 및 자극 (또는 프라이밍)시키는 데에도 사용될 수 있다. 이러한 WT1-특이성 T 세포는 예를 들면, 공여자 림프구 주입에 사용될 수 있다.
투여 경로와 빈도, 및 용량은 개체별로 다양할 것이며, 표준기술을 이용하여 용이하게 설정할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들면, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예를 들면, 흡인에 의해) 또는 경구 투여될 수 있다. 일부 종양에서, 약제학적 조성물 또는 백신은 국소 투여될 수 있다(예를 들면, 직결장 내시경, 위내시경, 비디오내시경, 혈관조영술 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의해). 바람직하게는, 52주 기간에 걸쳐서 1 내지 10 용량이 투여될 수 있다. 바람직하게는, 6 용량이 1개월 간격으로 투여되고, 그 후에 부스터 백신접종이 주기적으로 부여될 수 있다. 다른 프로토콜이 개별 환자에 적절할 수도 있다. 적당한 용량은 전술한 바와 같이 투여될 때, 기저(즉, 비처리) 수준보다 적어도 10 내지 50% 이상인 항종양 면역반응을 촉진할 수 있는 화합물의 양이다. 이러한 반응은 환자에서의 항종양 항체를 측정함으로써 또는 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 효과 인자 세포의 백신-의존성 생성에 의해 모니터링될 수 있다. 이러한 백신은 또한, 백신 비접종 환자와 비교하여 백신접종 환자에서 향상된 임상적 결과(예를 들면, 좀더 빈번한 완전 또는 부분적 회복, 또는 좀더 장기적인 무질환 및/또는 전체 생존)를 이끄는 면역반응을 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신의 경우에, 투여용량에 존재하는 각 폴리펩티드의 양은 약 100 ㎍ 내지 5 mg이다. 적당한 투여량 크기는 환자의 크기에 따라 변동될 것이며 전형적으로는 약 0.1 내지 약 5 mL 범위가 될 것이다.
일반적으로, 적정 용량과 처리 처방은 치료 및/또는 예방 효과를 제공하기에 충분한 양의 활성 화합물을 제공한다. 이러한 반응은 비처리 환자와 비교하여 처리 환자에서 향상된 임상적 결과(예를 들면, 좀더 빈번한 완전 또는 부분적 회복, 또는 좀더 장기적인 무질환 및/또는 전체 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. WT1에 대한 기존 면역반응의 증가는 향상된 임상적 결과와 일반적으로 상관이 있다. 이러한 면역반응은 일반적으로, 처리 전후의 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 분석법을 이용하여 평가될 수 있다.
특정 양태에서, 면역요법은 치료가 면역반응-변형제(예를 들면, 본원에서 제공되는 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드)의 투여로 종양에 대항하여 반응할 내인성 숙주 면역 시스템의 생체내 자극에 의존하는 능동 면역요법일 수 있다.
다른 양태에서, 면역요법은 치료가 항암 효과를 직접 또는 간접적으로 매개할 수 있고 반드시 온전한 숙주 면역 시스템에 의존하지는 않는 확립된 종양-면역 반응성을 갖는 제제(예를 들면, 효과 인자 세포 또는 항체)의 전달을 수반하는 수동 면역요법일 수 있다. 효과 인자 세포의 예로는 전술한 바와 같은 T 세포, T 림프구(예를 들면, CD8+ 세포독성 T 림프구 및 CD4+ T-헬퍼 종양-침윤성 림프구), 킬러 세포(예를 들면, 내추럴 킬러 세포 및 림포카인-활성화 킬러 세포), B 세포 및 본원에서 제공되는 폴리펩티드를 발현하는 항원-제시 세포(예를 들면, 수지상 세포 및 마크로파지)가 포함된다. 본원에서 언급되는 폴리펩티드에 특이성인 T 세포 수용체 및 항체 수용체를 클로닝하고 발현시킨 다음 입양 면역요법을 위한 다른 벡터 또는 효과 인자 세포로 전달시킬 수 있다. 본원에서 제공된 폴리펩티드는 또한 수동 면역요법을 위한 항체 또는 항-이디오타입 항체(전술 및 미국 특허 제 4,918,164호)의 생성에 사용될 수 있다.
모노클로날 항체는 검출, 진단 분석 또는 치료적 적용에서의 목적하는 선택적인 사용을 위해 다양한 표지물로 표지시킬 수 있다(각각이 개별적으로 인용되는 것처럼 전체가 본원에서 참조로 인용되는, 미국 특허 제6,090,365호; 제6,015,542호; 제5,843,398호; 제5,595,721호; 및 제4,708,930호에 기재). 각각의 경우에, 항원의 결정기 부위에의 표지된 모노클로날 항체의 결합은 특정 치료제의 검출 또는 전달을 비-정상 세포 상의 항원 결정기로 시그널링할 것이다. 본 발명의 추가 목적은 이러한 목적하는 선택적인 사용을 성취하기 위해 적절히 표지된 특이성 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.
효과 인자 세포는 일반적으로, 본원에서 기술된 바와 같이 시험관내 증식에 의하여 입양 면역요법을 위한 충분량으로 수득될 수 있다. 생체내 항원 인지를 유지하면서 단일 항원 특이성 효과 인자 세포를 수십 억개로 증대시키기 위한 배양 조건은 당업계에 익히 공지되어 있다. 이러한 시험관내 배양 조건은 종종 사이토카인(예를 들면, IL-2) 및 비-분할 피더(feeder) 세포의 존재하에, 전형적으로 항원으로의 간헐적인 자극을 이용한다. 전술한 바와 같이, 본원에 제공된 면역반응성 폴리펩티드는 면역요법을 위한 충분한 수의 세포를 생성하기 위하여 항원 특이성 T 세포 배양균을 신속히 증대시키는 데 사용될 수 있다. 특히, 수지상, 마크로파지, 단핵구, 섬유아세포 및/또는 B 세포와 같은 항원-제시 세포는 당업계에 익히 공지된 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키거나 면역반응성 폴리펩티드로 펄싱시킬 수 있다. 예를 들면, 항원-제시 세포는 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템내 발현을 증가시키기에 적당한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킬 수 있다. 치료요법에 사용하기 위한 배양된 효과 인자 세포는 광범위하게 성장 분포할 수 있고, 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야 한다. 연구 결과 배양된 효과 인자 세포는 IL-2로 보충한 항원으로의 반복된 자극에 의해 상당수로 장기간 생존하고 생체내에서 성장하도록 유도시킬 수 있는 것으로 나타났다(예를 들면, Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997 참조).
또한, 본원에서 언급되는 폴리펩티드를 발현하는 벡터는 환자로부터 취한 항원 표시 세포로 도입시킨 다음 동일 환자에게 다시 이식하기 위해 생체외에서 클론으로 증식시킬 수 있다. 형질감염된 세포는 당업계에 공지된 임의 수단을 이용하여 환자 중으로, 바람직하게는 정맥내, 공동내, 복막내 또는 종양내 주사에 의해 멸균 형태로 재도입시킬 수 있다.
추가의 양태에서, WT1 발현과 연관된 악성 질환의 발병을 억제하는 방법은 전술한 바와 같이 WT1 폴리펩티드 또는 WT1-발현 APC에 반응하여 활성화된 자가유래성 T 세포의 투여를 수반한다. 이러한 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있고, 전술한 바와 같이 증식시킬 수 있다. T 세포는 악성 질환의 발병 억제 유효량으로 개체에 투여될 수 있다. 전형적으로, 약 1 x 109 내지 1 x 1011 T 세포/M2가 정맥내, 공동내 또는 절제된 종양의 층에 투여될 수 있다. 세포수 및 투여 빈도는 환자의 반응에 좌우될 것임이 당업자에게는 자명할 것이다.
특정 양태에서, T 세포는 자가유래성 골수 이식 전에 자극시킬 수 있다. 이러한 자극은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 시험관내 자극의 경우, 환자로부터 수득된 골수 및/또는 말초혈(또는 골수 또는 말초혈의 분획)과 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC를 전술한 바와 같이 T 세포의 자극을 허용하기에 충분한 시간 동안 이러한 조건하에 접촉시킬 수 있다. 이어서, 골수, 말초혈 줄기 세포 및/또는 WT1-특이성 T 세포를 표준 기술을 사용하여 환자에 투여할 수 있다.
관련 양태에서, 혈연 관계가 있거나 없는 공여자의 T 세포를 유전적 동계 또는 동종이계(혈연 관계 또는 비혈연 관계) 골수 이식에 앞서 자극시킬 수 있다. 이러한 자극은 생체내 또는 시험관내에서 일어날 수 있다. 시험관내 자극을 위해, 혈연 관계 또는 비혈연 관계의 공여자로부터 수득한 골수 및/또는 말초혈(또는 골수 또는 말초혈의 분획)과 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC를 전술한 바와 같이 T 세포의 자극을 허용하기에 충분한 시간 동안 이러한 조건하에 접촉시킬 수 있다. 이어서, 골수, 말초혈 줄기 세포 및/또는 WT1-특이성 T 세포를 표준 기술을 사용하여 환자에 투여할 수 있다.
다른 양태에서, 본원에서 기술한 WT1-특이성 T 세포를 사용하여 자가유래성 골수, 말초혈 또는 골수 또는 말초혈의 분획(예를 들면, 환자에의 투여 전 CD34+가 풍부한 말초혈(PB))으로부터 WT1을 발현하는 세포를 제거시킬 수 있다. 이러한 방법은 WT1 발현 세포를 골수 또는 말초혈 중의 골수세포 또는 림프세포의 총수의 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하, 더욱 바람직하게는 1% 이하로 감소시키기에 충분한 시간 동안 이러한 조건하에서 골수 또는 PB를 이러한 T 세포와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 그런 세포가 제거되는 정도는 예를 들면, 정성 및 정량 PCR 분석, 형태, 면역조직화학 및 FACS 분석과 같은 표준 방법에 의해 용이하게 측정될 수 있다. 이어서, 골수 또는 PB(또는 이들의 분획)를 표준 기술을 사용하여 환자에 투여할 수 있다.
암의 검출과 진단 조성물, 방법 및 키트
일반적으로, WT1 발현과 연관된 암은 환자로부터 수득한 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액, 혈청, 객담, 뇨 및/또는 종양 생검)내 하나 이상의 WT1 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재에 기초하여 환자에서 검출될 수 있다. 환언하면, 이러한 WT1 단백질은 암의 존재 또는 부재를 표시하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. 본원에서 제공되는 결합제는 일반적으로, 생물학적 샘플내 제제와 결합하는 항원의 수준 검출을 허용한다.
폴리뉴클레오티드 프라이머 및 탐침을 사용하여 WT1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있으며, 이는 또한 암의 존재 유무를 나타내는 지표이다. 일반적으로, WT1 서열은 종양이 발생하는 동일 유형의 정상 조직에서보다 종양 조직에서 적어도 두 배, 바람직하게는 세 배, 더욱 바람직하게는 다섯 배인 수준으로 존재하여야 한다. 종양이 발생하는 조직형과는 상이한 조직형에서 WT1의 발현 수준은 특정 진단 양태에서는 문제가 되지 않는데 이유는 종양 세포의 존재가 동일 유형의 정상 조직에서의 발현 수준에 대해 종양 조직에서의 일정한 차등적인 발현 수준, 예를 들면, 2배, 5배 등의 관찰에 의해 확인될 수 있기 때문이다.
다른 차등적인 발현 패턴이 진단 목적에 유리하게 이용될 수 있다. 예를 들면, 발명의 일면에서, 다른 정상 조직형, 예를 들면 PBMC에서가 아니라, 동일 유형의 종양 조직과 정상 조직에서의 WT1 서열의 과발현이 진단적으로 이용될 수 있다. 이 경우에, 예를 들면, 종양이 발생하는 부위와는 상이한 일부 타 조직 부위 또는 순환으로부터 취한 샘플내 전이성 종양 세포의 존재는 예를 들면, RT-PCR 분석을 이용하여 샘플내 종양 서열의 발현을 검출함으로써 동정 및/또는 확인될 수 있다. 다수의 경우에, 세포 포획 또는 다른 유사 기술을 이용하여 해당 샘플, 예를 들면, PBMC 중의 종양 세포를 농축시키는 것이 요망될 것이다.
샘플 중의 WT1 폴리펩티드 마커 검출을 위해 시약을 사용하기 위한 당업자에 공지된 다수의 분석 포맷이 존재한다. [참고: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자 중의 WT1과 연관된 암의 존재 유무는 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키고; (b) 결합제에 결합하는 WT1 폴리펩티드의 수준을 샘플에서 검출한 다음; (c)예정된 컷-오프 값과 WT1 폴리펩티드의 수준을 비교함으로써 측정될 수 있다.
바람직한 양태에서, 분석법은 결합시켜 샘플의 나머지로부터 WT1 폴리펩티드를 제거하기 위하여 고체 지지체 상에 고정화된 결합제의 사용을 수반한다. 이어서, 결합된 WT1 폴리펩티드는 결합제/WT1 폴리펩티드 복합체에 특이적으로 결합하고 리포터 그룹을 함유하는 검출 시약을 사용하여 검출될 수 있다. 이러한 검출 시약은 예를 들면, WT1 폴리펩티드 또는 항체에 결합하는 결합제 또는 결합제에 특이적으로 결합하는 타 제제, 예를 들면, 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴을 포함할 수 있다. 또한, WT1 폴리펩티드를 리포터 그룹으로 표지시키고 결합제를 샘플과 배양 후 고정화된 결합제에 결합하도록 허용시키는 경쟁 분석법이 사용될 수 있다. 샘플의 성분이 표지된 WT1 폴리펩티드의 결합제에의 결합을 억제하는 정도는 고정화된 결합제와 샘플의 반응성 지표이다. 이러한 분석에 사용하기 적합한 폴리펩티드는 전술한 바와 같이, 결합제가 결합하는 표준 길이의 WT1 단백질 및 이의 폴리펩티드 부분을 포함한다.
고체 지지체는 WT1 단백질이 부착될 수 있는 당업자에 공지된 임의 물질일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 미세역가판 중의 테스트 웰 또는 니트로셀룰로스 또는 다른 적당한 막일 수 있다. 또한, 지지체는 유리, 화이버글래스, 라텍스 또는 폴리스티렌이나 폴리비닐 클로라이드 등의 플라스틱 물질과 같은 비드 또는 디스크일 수 있다. 지지체는 또한, 예를 들면 미국 특허 제5,359,681호에 개시된 것들과 같은 자성 입자 또는 섬유 광학 센서일 수 있다. 결합제는 특허 및 과학 문헌에 풍부하게 설명되어 있는, 당업자에 공지된 다양한 기술을 이용하여 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "고정화"란 용어는 흡착과 같은 비공유 연합 및 (지지체 상의 작용 그룹과 제제 간의 직접 결합일 수 있거나 가교제에 의한 결합일 수 있는) 공유 부착 모두를 말한다. 미세역가판의 웰 또는 막에의 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 이 경우에, 흡착은 결합제를 적당한 완충제 중에서, 적당량의 시간 동안 고체 지지체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 통상적으로는 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가판(예를 들면, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10 ng 내지 약 10 ㎍, 바람직하게는 약 100 ng 내지 약 1 ㎍ 범위량의 결합제와 결합시키면 적당량의 결합제를 고정화하기에 충분하다.
고체 지지체에 결합제의 공유 부착은 먼저 지지체를, 지지체 및 하이드록실 그룹 또는 아미노 그룹 같은 결합제 상의 작용 그룹, 양자 모두와 반응하게될 이작용성 시약과 반응시킴으로써 일반적으로 달성된다. 예를 들면, 결합제는 벤조퀴논을 사용하거나 지지체 상의 알데하이드 그룹과 결합 파트너 상의 아민 및 활성 수소와의 축합[참고: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13]에 의해 적당한 중합체 코팅을 갖는 지지체에 공유적으로 부착될 수 있다.
특정 양태에서, 분석법은 2-항체 샌드위치 분석이다. 이러한 검정은 샘플내의 WT1 폴리펩티드가 고정화된 항체와 결합되도록, 우선 고체 지지체, 통상적으로 미세역가판 웰 상에 고정화된 항체를 샘플과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 비결합 샘플은 이어서 고정화된 폴리펩티드-항체 복합체로부터 제거시키고 리포터 그룹을 함유하는 검출 시약(바람직하게는 폴리펩티드 상의 상이한 부위에 결합할 수 있는 제 2 항체)을 첨가한다. 이어서, 고체 지지체에 결합된 채로 잔류하는 검출 시약의 양을 특이적 리포터 그룹에 적당한 방법을 사용하여 측정한다.
좀더 구체적으로, 일단 항체가 전술한 바의 지지체 상에 고정화되면, 지지체 상의 남아있는 단백질 결합 부위는 통상적으로 블로킹시킨다. 소 혈청 알부민 또는 트윈 20TM(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 같은 당업자에게 공지된 적합한 블로킹제. 이어서, 고정화된 항체를 샘플과 배양시킨 다음, 폴리펩티드를 항체와 결합되게 한다. 샘플은 배양에 앞서 인산염 완충 생리식염수(PBS)와 같은 적당한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적당한 접촉시간(즉, 배양시간)은 WT1과 연관된 암을 지닌 개체로부터 수득한 샘플내 WT1 폴리펩티드의 존재를 결합 및 비결합 폴리펩티드 간의 평형상태에서 달성된 것의 적어도 약 95%를 검출하기에 충분한 시간이다. 당업자는 평형 달성에 필요한 시간이 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합의 수준을 분석함으로써 용이하게 측정될 수 있음을 인지할 것이다. 실온에서, 약 30분의 배양시간이면 일반적으로 충분하다.
이어서, 비결합 샘플은 0.1% 트윈 20TM을 함유하는 PBS와 같은 적당한 완충제로 고체 지지체를 세척함으로써 제거될 수 있다. 리포터 그룹을 함유하는 제 2 항체를 이어서 고체 지지체에 가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹은 전술한 그룹을 포함한다.
이어서, 검출 시약을 결합 폴리펩티드의 검출에 충분한 시간량 동안 고정화된 항체-폴리펩티드 복합체와 배양시킨다. 시간의 적정량은 일반적으로, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합의 수준을 분석함으로써 측정될 수 있다. 이어서, 비결합 검출 시약이 제거되고 결합된 검출 시약이 리포터 그룹을 사용하여 검출된다. 리포터 그룹의 검출에 사용되는 방법은 리포터 그룹의 성질에 좌우된다. 방사능 그룹의 경우, 신틸레이션 카운팅 또는 자동방사능촬영법이 일반적으로 적당하다. 분광법은 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹의 검출에 사용될 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터 그룹(통상적으로, 방사능 또는 형광 그룹 또는 효소)에 커플링된 아비딘을 사용하여 검출될 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 첨가하고(일반적으로 특정 기간 동안), 이어서 반응 산물의 분광분석 또는 다른 분석에 의해 검출될 수 있다.
WT1 발현과 연관된 암의 존재 유무를 측정하기 위하여, 고체 지지체에 결합된 채 남아있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그널을 일반적으로 소정의 컷-오프 값에 상응하는 시그널과 비교한다. 하나의 바람직한 양태에서, WT1과 연관된 암의 검출을 위한 컷-오프 값은 고정화된 항체가 암이 없는 환자로부터의 샘플과 배양될 때 수득된 평균 시그널이다. 일반적으로, 소정의 컷-오프 값을 넘는 3개의 표준편차인 시그널을 생성하는 샘플을 암에 대해 양성인 것으로 간주된다. 대안의 바람직한 양태에서, 컷-오프 값은 문헌[참조: Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p.106-7]의 방법에 따라, Receiver Operator Curve를 이용하여 측정된다. 간략히 말해서, 본 양태에서, 컷-오프 값은 진단 시험 결과를 위한 각각의 가능한 컷-오프 값에 상응하는 진(true)양성 비율(즉, 감수성)과 의(false) 양성 비율(100%-특이성)의 쌍의 플롯으로부터 측정될 수 있다. 상단의 좌측 코너에 최근접한 플롯 상의 컷-오프 값(즉, 최대 면적을 포괄하는 값)이 가장 정확한 컷-오프 값이며, 이 방법에 의해 측정된 컷-오프 값보다 높은 시그널을 생성하는 샘플은 양성으로 간주될 수 있다. 또한, 컷-오프 값은 의양성 비율을 최소화하기 위하여 플롯을 따라 좌측으로, 또는 의음성 비율을 최소화하기 위하여 우측으로 이동시킬 수 있다. 일반적으로, 이 방법으로 측정한 컷-오프 값보다 높은 시그널을 생성하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 간주된다.
관련 양태에서, 분석은 플로우-쓰루(flow-through) 또는 스트립 테스트 포맷으로 수행되며, 여기에서 결합제는 니트로셀룰로스와 같은 막 상에 고정화된다. 플로우-쓰루 테스트에서, 샘플이 막을 통과함에 따라 샘플내의 폴리펩티드는 고정화된 결합제에 결합한다. 이어서, 제 2 결합제를 함유하는 용액이 막을 통해 유동함에 따라 제 2의 표지된 결합제가 결합제-폴리펩티드 복합체에 결합한다. 결합된 제 2 결합제의 검출은 전술한 바와 같이 수행될 수 있다. 스트립 테스트 포맷에서, 결합제가 결합되는 막의 일단을 샘플을 함유하는 용액에 침지시킨다. 샘플은 막을 따라서 제 2 결합제를 함유하는 영역을 통해, 그리고 고정화된 결합제의 영역으로 이동한다. 고정화된 항체의 영역에서 제 2 결합제의 농축은 암의 존재를 시사한다. 전형적으로, 그 부위에서 제 2 결합제의 농축은 라인과 같은 패턴을 생성하며, 가시적으로 판독될 수 있다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 표시한다. 일반적으로, 전술한 포맷에서, 생물학적 샘플이 2-항체 샌드위치 분석에서 양성 시그널을 생성하기에 충분할 폴리펩티드의 수준을 함유할 때, 막 상에 고정화된 결합제의 양은 가시적으로 식별가능한 패턴을 생성하도록 선택된다. 이러한 검정에 사용하기 위한 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 막에 고정화된 항체의 양은 약 25 ng 내지 약 1 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 50 ng 내지 약 500 ng 범위이다. 상기 테스트는 보통 매우 소량의 생물학적 샘플을 가지고 수행될 수 있다.
물론, 본 발명의 WT1 단백질 또는 결합제와 사용하기에 적합한 다수의 다른 검정 프로토콜이 존재한다. 상기 설명은 단지 예시를 위한 것이다. 예를 들면, 당업자에게는 상기 프로토콜이 생물학적 샘플 중의 이러한 폴리펩티드와 결합하는 항체를 검출하기 위하여 종양 폴리펩티드를 사용하도록 용이하게 변형시킬 수 있음이 자명해진다. 이러한 WT1-특이성 항체의 검출은 WT1 발현과 연관된 암의 존재와 상관이 있을 수 있다.
WT1 발현과 연관된 암은 또한, 또는 또한, 생물학적 샘플내 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재에 기초하여 검출될 수 있다. 특정 방법에서, 환자로부터 분리한 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 WT1 폴리펩티드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 이러한 폴리펩티드의 적어도 면역원성 부분을 발현하는 APC와 항온처리시키고, T 세포의 특이적 활성화의 존재 유무를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플은 분리된 T 세포를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 예를 들면, T 세포는 (말초혈 림프구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리와 같이) 일상적인 기술에 의해 환자로부터 분리될 수 있다. T 세포는 시험관내에서 2 내지 9일간(보통 4일), 37℃에서 폴리펩티드(예를 들면, 5 내지 25 ㎍/ml)와 배양될 수 있다. 대조군으로 쓰기 위하여 WT1 폴리펩티드의 부재하에서 T 세포 샘플의 또다른 분취량을 배양하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+ T 세포의 경우, 활성화는 바람직하게는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출된다. CD8+ T 세포의 경우, 활성화는 바람직하게는 세포용해 활성을 평가함으로써 검출될 수 있다. 무질환 환자에서 보다 적어도 20% 큰 세포용해 활성의 수준 및/또는 적어도 두 배 이상 더 큰 증식 수준은 환자에서 WT1 발현과 연관된 암의 존재를 표시한다.
전술한 바와 같이, 암은 또한, 또는 또한, 생물학적 샘플내 WT1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준에 기초하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 적어도 두 올리고뉴클레오티드 프라이머가 생물학적 샘플로부터 유래한 WT1 cDNA의 일부를 증폭시키기 위하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 기초한 분석법에 사용될 수 있으며, 여기에서 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적이다(즉, 하이브리드화한다). 증폭된 cDNA를 이어서 분리한 다음 겔 전기영동과 같이 당업계에 익히 공지되어 있는 기술을 이용하여 검출한다.
유사하게, WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드 탐침이 생물학적 샘플내 WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 존재를 검출하기 위한 하이브리드화 분석에 사용될 수 있다.
분석 조건하에서 하이브리드화를 허용하기 위하여, 올리고뉴클레오티드와 탐침은 길이가 적어도 10 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 20 뉴클레오티드인 본 발명의 WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 일부와 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성을 갖는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함하여야 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 탐침은 전술한 바와 같이, 적당하게 엄격한 조건하에서 본원에 기재된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화 한다. 본원에 기재된 진단방법에 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 탐침은 적어도 10 내지 40 뉴클레오티드 길이이다. 바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 본원에 개시되는 서열을 갖는 DNA 분자의 적어도 10개의 연속적인 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 적어도 15개의 연속적인 뉴클레오티드를 포함한다. 두 PCR계 분석 및 하이브리드화 검정에 대한 기술은 당업계에 익히 공지되어 있다(예를 들면, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989 참조).
하나의 바람직한 분석법은 RT-PCR을 이용하며, 여기에서 PCR은 역전사와 공동으로 적용된다. 전형적으로, RNA는 생검 조직 같은 생물학적 샘플로부터 추출되며, 역전사 되어 cDNA 분자를 생성한다. 적어도 하나의 특이적 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 cDNA 분자를 생성하며, 이는 예를 들면 겔 전기영동을 이용하여 분리되고 가시화될 수 있다. 증폭은 테스트 환자로부터 및 암으로 시달리지 않는 개체로부터 취한 생물학적 샘플 상에서 수행될 수 있다. 증폭 반응은 20배를 스패닝하는 cDNA의 수회 희석액 상에서 수행될 수 있다. 비-암성 샘플의 동일 희석액과 비교하여 테스트 환자 샘플의 수회 희석액에서 발현의 2배 이상의 증가는 전형적으로 양성으로 간주된다.
본 발명의 또다른 일면에서, 세포 포획술은 WT1 항원을 발현하는 전이성 세포의 검출을 위한 더욱 민감한 도구를 제공하기 위하여 예를 들면, 실시간 PCR과 공동으로 사용될 수 있다. 생물학적 샘플, 예를 들면 골수 샘플, 말초혈, 및 소형 니들 흡인 샘플 중의 WT1-연관 암세포의 검출은 WT1 발현과 연관된 암이 있는 환자에서의 진단 및 예후에 바람직하다.
표면 세포 마커에 대한 특이적 모노클로날 항체로 코팅된 면역마그네틱 비드, 또는 테트라머 항체 복합체는 샘플내 암 세포를 우선적으로 농축하거나 양성적으로 선별하는 데 사용될 수 있다. DynabeadsR Epithelial Enrich (Dynal Biotech, Oslo, Norway), StemSepTM(StemCell Technologies, Inc., Vancouver, BC), 및 RosetteSep (StemCell Technologies)을 포함한 다양한 시판 키트가 사용될 수 있다. 당업자는 다른 방법론 및 키트도 목적하는 세포 집단을 농축하거나 양성적으로 선별하는 데 사용될 수 있음을 인지할 것이다. DynabeadsR Epithelial Enrich는 정상 및 종양 상피 조직 상에 발현된 두 당단백질 막 항원에 특이성인 mAb로 코팅된 마그네틱 비드를 함유한다. 코팅된 비드는 샘플에 첨가될 수 있고 이어서 샘플은 자석에 적용되어, 비드에 결합된 세포를 포획하게 된다. 원치 않는 세포는 세척해 버리고 자석으로 분리된 세포를 비드로부터 용출시켜 추가 분석에 사용한다.
RosetteSep은 혈액 샘플로부터 직접 세포를 농축하는 데 사용될 수 있으며 다양한 원치 않는 세포를 표적화하여 그들을 샘플에 존재하는 적혈구(RBC) 상의 글리코포린 A에 가교시켜 로제트를 형성하는 테트라머 항체의 칵테일로 이루어진다. Ficoll 상에서 원심분리하였을 때, 표적화된 세포는 유리 RBC와 함께 펠릿을 형성한다. 고갈 칵테일 중의 항체의 배합은 어느 세포가 제거되고 어느 세포가 회수될 것인지를 결정한다. 이용될 수 있는 항체에는 CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD24, CD25, CD29, CD33, CD34, CD36, CD38, CD41, CD45, CD45RA, CD45RO, CD56, CD66B, CD66e, HLA-DR, IgE, and TCRαβ가 포함되며 이에 한정되지 않는다.
또다른 양태에서, 본원에 기재된 조성물은 암의 진행에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 양태에서, WT1 발현과 연관된 암의 진단을 위한 전술한 분석법은 일정 시간에 걸쳐 수행될 수 있으며, 반응성 폴리펩티드(들) 또는 폴리뉴클레오티드(들)의 수준 변화가 평가된다. 예를 들면, 검정은 24 내지 72 시간마다 6개월 내지 1년간 수행될 수 있고, 그 후에도 필요에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로, 검출된 WT1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 수준이 시간이 경과함에 따라 증가하는 환자에서 암은 진행중이다. 반대로, 반응성 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 수준이 시간이 지남에 따라 일정하거나 감소할 경우 암은 진행 중이 아니다.
특정의 생체내 진단 분석은 종양 상에서 직접 수행될 수 있다. 하나의 이러한 분석법은 종양 세포와 결합제의 접촉을 수반한다. 이어서, 결합된 결합제는 리포터 그룹을 통해 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 이러한 결합제는 또한 조직학적 적용에 사용될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 탐침이 이러한 적용에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 진단방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로 진단 분석을 수행하는 데 필요한 둘 이상의 성분을 포함한다. 성분은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들면, 키트 안의 하나의 용기는 WT1 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편은 전술한 바와 같이 지지 물질에 부착되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 용기가 분석에 사용될 시약 또는 완충제 같은 요소들을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 또한, 또는 또한, 항체 결합의 직접 또는 간접 검출에 적합한 리포터 그룹을 함유하는 전술한 바와 같은 검출 시약을 함유할 수 있다.
또한, 키트는 생물학적 샘플내 WT1 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 설계될 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로, WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 하이브리드화하는, 전술한 바와 같은 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 탐침 또는 프라이머를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, PCR 또는 하이브리드화 분석에 사용될 수 있다. 이러한 키트에 존재할 수 있는 부가 성분으로는 WT1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 검출을 촉진하기 위하여 제 2 올리고뉴클레오티드 및/또는 진단 시약 또는 용기를 포함한다.
하기 실시예는 설명의 목적으로 제공되며 이에 한정되지 않는다.
실시예 1
혈액학적 악성종양 환자에서 WT1에 대한 면역반응의 동정
본 실시예에서는 혈액학적 악성종양 환자에서 현존 면역 반응의 동정을 설명한다.
환자에서 선재 WT1 특이적 항체 반응의 존재를 평가하기 위하여, 급성 골수성 백혈병(AIVIL), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CIVIL), 중증 재생불량성 빈혈 환자의 혈청을 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였다. 혈청은 사람 백혈병 세포주 K562(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 WT1을 면역침전시키는 능력을 검사하였다. 각 경우에, 면역침전물은 겔 전기영동으로 분리하고 막으로 이전하며 항-WT1 항체 WT180(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)으로 탐침하였다. 상기 웨스턴 블랏 분석으로 혈액학적 악성종양 환자에서 강력한 WT1 특이적 항체가 동정되었다. AML 환자의 결과를 보여주는 대표적인 웨스턴 블랏은 도 2에 도시한다. 환자 혈청을 이용하여 발생된 면역침전물에서 52 kD 단백질은 WT1 특이적 항체로 인식하였다. 52 kD 단백질은 양성 대조와 동일한 크기로 이동하였다.
다른 연구에서는 AML과 CML 환자의 혈청에서 전장과 절두된 WT1 단백질에 대한 항체의 존재를 분석하였다. 사람 WT1/전장(aa. 1-449), N-말단(aa 1-249)(WT1/N-말단), G-말단(aa 267-449)(WT1/C-말단) 영역을 대표하는 cDNA 작제물은 변형된 pET28 벡터에 서브클로닝하였다. WT1/전장과 WT1/N-말단 단백질은 Ra12 융합 단백질로 발현되었다. Ra12는 분비된 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 단백질, MTB32B의 C-말단 단편이다(Skeiky et al., Infect Immun. 67;3998, 1999). Ra12-WT1/전장 융합 영역은 히스티딘-태그 변형된 pET28 벡터에서 히스티딘-태그에 3' 클로닝하였다. WT1/N-말단 영역은 5' 히스티딘-태그, 티오레독신(thioredoxin)(TRX)-WT1/N-말단 융합 영역 및 3' 히스티딘-태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터에 서브클로닝하였다. WT1/C-말단 코딩 영역은 융합 파트너없이 5'와 3' 히스티딘-태그 및 트롬빈과 EK 부위만을 보유하는 변형된 pET28 벡터에 서브클로닝하였다.
BL21 pLysS 대장균(Stratagene, La Jolla, CA)은 3가지 WT1 발현 작제물로 형질전환시키고 하룻밤동안 성장시키며 이소프로필-β-티오갈락토시드(IPTG)로 유도하였다. WT1 단백질은 아래와 같이 정제하였다.
세포는 수집하고 Complete Protease Inhibitor Tablet(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)을 함유하는 1O mM Tris(pH 8.0)에서 배양으로 용해시키며, 이후 초음파처리를 수회 반복하였다. 봉입체는 1O mM Tris(pH 8.0)로 2회 세척하였다. 이후, 단백질은 니켈-니트릴로트리아세트산 수지(QIAGEN Inc., Valencia, CA; Hochuli et al., Biologically Active Molecules:217, 1989)에서 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 및 Source Q 음이온 교환 수지(Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)에서 크로마토그래피로 정제하였다. WT1 단백질의 실체는 N-말단 서열분석으로 확인하였다.
신생 AML 또는 CML을 앓는 성인 환자의 혈청은 WT1 특이적 Ab의 존재를 조사하였다. 재조합 단백질은 TC 마이크로웰 평판(Nunc, Roskilde, Denmark)에 흡수시켰다. 평판은 PBS/0.5% Tween 20으로 세척하고 1% BSA/PBS/0.1% Tween 20으로 차단하였다. 세척이후, 혈청 희석액을 첨가하고 4??에서 하룻밤동안 배양하였다. 평판은 세척하고 당나귀 항-사람 IgG-HRP 2차 항체(Jackson-Immunochem, West Grove, PA)를 첨가하고 실온에서 2시간동안 배양하였다. 평판은 세척하고 TMB 과산화물 기질 용액(Kirkegaard and Perry Laboratories, MA)과 함께 배양하며 1 N H2S04로 급냉시키고 즉시 판독하였다(Cyto-Fluor 2350; Millipore, Bedford, MA).
혈청학적 조사를 위하여, 사람 혈청은 사람 혈청은 1:50 내지 1:20,000 범위의 연속 희석액에서 ELISA로 검사하였다. 양성 반응은 3가지(WT1/전장, WT1 C-말단) 표준 편차에 의해 정상 공여자(n=96) 혈청의 평균 OD 값을 초과하는 1:500 희석된 혈청의 OD 값으로 정의하였다. 정상 공여자에서 WT1/N-말단 단백질에 대한 높은 배경으로 인하여, WT1/N-말단에 대한 양성 반응은 4가지 표준 편차에 의해 정상 공여자 혈청의 평균 OD 값을 초과하는 1:500 희석된 혈청의 OD 값으로 정의하였다. 환자 Ab 반응이 상기 단백질 또는 대장균 오염 단백질의 WT1을 지향하고 Ra12 또는 Trx 융합 부분을 지향하지 않는다는 것을 검증하기 위하여, 대조는 유사한 방식으로 정제된 Ra12와 Trx 단백질만을 보유하였다. Ra12 및/또는 TRX 단백질에 반응을 보이는 시료는 분석에서 배제하였다.
WT1에 대한 면역의 존재를 평가하기 위하여, 정상 개체와 백혈병 환자의 혈청에서 재조합 전장과 절두된 WT1 단백질에 대한 Ab를 결정하였다. 항체 반응은 WT1/전장 단백질, WT1/N-말단 단백질, WT1/C-말단 단백질에 대한 ELISA 반응으로 분석하였다.
96명의 정상 공여자중에서 2명만 WT1/전장 단백질과 반응하는 혈청 항체를 보유하였다(도 18). 이들 개체중 1명은 WT1/N-말단 단백질에 대한 항체를 보유하였고, 1명은 WT1/C-말단 단백질에 대한 항체를 보유하였다. 대조적으로, 63명의 AML 환자중에서 16명(25%)이 WT1/전장 단백질과 반응하는 혈청 항체를 보유하였다. 극히 대조적으로, 63명의 환자중 2명(3%)만 WT1/C-말단 단백질에 반응을 보였다. 81명의 CML 환자중에서 15명(19%)은 WT1/전장 단백질과 반응하는 혈청 항체를 보유하였고, 81명의 환자중에서 12명(15%)은 WT1/N-말단과 반응하는 혈청 항체를 보유하였다. 81명의 환자중에서 3명(3%)만 WT1/C-말단 단백질에 반응을 보였다(도 16과 17).
이들 데이터는 WT1에 대한 Ab 반응이 일부 AML과 CML 환자에서 탐지된다는 것을 입증한다. 백혈병 환자에서 좀더 높은 항체 발생률은 높을수록 WT1을 발현하거나 발현한 적이 있는 악성종양 환자에서 WT1 단백질에 대한 면역화가 진행된다는 강력한 증거를 제공한다. 특정 이론에 한정됨없이, WT1에 대한 관찰된 항체 반응은 환자가 자가 백혈병 세포에서 WT1에 면역되기 때문에 발생하는 것으로 생각되며, WT1이 "자가"단백질임에도 불구하고 면역원성을 나타낼 수 있다는 직접적인 증거를 제공한다.
WT1에 대한 항체의 존재는 협력적 보조 T 세포 반응 역시 동일 환자에 존재한다는 것을 강하게 암시한다. WT1은 내재 단백질이다. 따라서, CTL 반응은 백혈병 치료의 측면에서 가장 효과적이고 면역의 가장 강한 무기이다. 이런 이유로, 이들 데이터는 WT1에 대한 치료 백신이 WT1에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다는 증거를 제공한다.
탐지된 대부분의 항체는 N-말단내에서 에피토프와 반응하지만, 일부 환자군은 C-말단에 약한 항체 반응을 보였다. 이는 N-말단으로부터 유래된 펩티드로 면역화가 항체, 보조 T 세포, CTL 반응을 유도한 반면, C-말단으로부터 유래된 펩티드가 항체 또는 T 세포 반응을 유도하지 않았던 동물 모델에서 관찰 결과와 일치한다(Gaiger et al., Blood 96:1334, 2000).
실시예 2
WT1을 발현하는 세포주로 면역된 마우스에서 WT1에 대한 항체의 유도
본 실시예에서는 생체내에서 WT1 특이적 항체 반응을 유도하는데 사용되는 WT1 발현 세포를 설명한다.
백혈병 환자에서 WT1에 대한 현존 항체의 탐지는 WT1 단백질에 면역하여 WT1에 대한 면역을 유도하는 것이 가능함을 강하게 암시하였다. WT1에 대한 면역이 예방접종으로 발생될 수 있는 지를 검사하기 위하여, 마우스는 B6 기원의 WT1 양성 종양 세포주인 TRAMP-C로 주사하였다. 간단히 말하면, 수컷 B6 마우스는 5 x 106
TRAMP-C 세포로 피하 면역시키고 3주 간격으로 5 x 106 세포로 2회 추가 면역하였다. 최종 면역 3주후 혈청을 수득하고, 25 μM β-2-멀캡토에탄올, 200 unit 페닐시린/㎖, 1O mM L-글루타민, 10% 소 태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지(GIBCO)에서 비장의 단일 세포 현탁액을 준비하였다.
TRAMP-C에 면역화이후, 면역된 동물에서 WT1 특이적 항체 반응이 탐지되었다. 대표적인 웨스턴 블랏은 도 3에 도시한다. 이들 결과는 WT1 단백질에 대한 면역화가 WT1 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 3
WT1 펩티드로 면역된 마우스에서 Th와 면역 반응의 유도
본 실시예에서는 WT1에 특이적인 면역반응을 유도하는 WT1 펩티드 면역화의 능력을 설명한다.
Ab와 증식성 T 세포 반응을 유도하는데 적합한 펩티드는 Th 반응을 유도하는 잠재력을 가진 펩티드 모티프를 검색하는 Tsites 프로그램(Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol Immunol. 33:145-155, 1996))에 따라 동정하였다. 표 Ⅰ의 펩티드를 합성하고 세열 측정하였다.
면역화를 위해, 펩티드를 다음과 같이 그룹지었다:
Group A: p6-22 사람: 1ml 중 10.9mg (10ml = 100mg)
p117-139 사람/마우스: 1ml 중 7.6mg (14ml = 100mg)
p244262 사람: 1ml 중 4.6.mg (22ml = 100mg)
Group B: p287-301 사람/마우스: 1ml 중 7.2mg (14ml = 100mg)
마우스 p299-313: 1ml 중 6.6.mg (15ml = 100mg)
p421-435 사람/마우스: 1ml 중 3.3mg (30ml = 100mg)
대조군: (FBL 펩티드 100mg) + CFA/IFA
대조군: (CD45 펩티드 100mg) + CFA/IFA
A 군에는 WT1의 아미노 말단 영역(엑손 1)내에 존재하는 펩티드가 포함되고, B 군에는 카르복시 말단내에 존재하는 펩티드가 포함되는데, 상기 펩티드는 다른 DNA-결합 단백질에 서열 상동성을 갖는 4개의 징크 핑거(zinc finger) 영역을 보유한다. B 군에서 p287-301과 p299-313은 엑손 7, 징크 핑거 1로부터 유래되고, p421-435는 엑손 10, 징크 핑거 IV로부터 유래되었다.
B6 마우스는 WT1 펩티드 군 또는 대조 펩티드로 면역하였다. 펩티드는 1 ㎖ 무균 주사액에 용해시키고, B6 마우스는 3주 간격으로 3회 면역하였다. 사용된 어쥬번트는 CFA/IFA, GM-CSF, Montinide이었다. 이후, WT1에 특이적인 항체의 존재는 실시에 1과 2에서 밝힌 바와 같이 결정하고, 증식성 T 세포 반응은 표준 티미딘 함입 분석으로 평가하였는데, 여기서 세포는 항원의 존재하에 배양하고 증식은 함입된 방사능을 측정하여 평가하였다(Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994). 특히, 림프구는 4 x 105 조사된(3000 rad) 동계 비장 세포와 지정된 펩티드와 함께, 웰당 2 x 105 세포로 96-웰에 배양하였다.
A 군으로 지정된 펩티드 군으로 마우스를 면역하면 WT1에 대한 항체 반응이 유도되었다(도 4). 백신 B에 대한 면역화이후 어떤 항체도 탐지되지 않았는데, 이는 백신 B로 면역화로부터 보조 T 세포 반응의 부재와 일치한다. P117-139는 증식성 T 세포 반응을 유도하였다(도 5A-5C). 자극 지수(SI)는 8에서 72까지 변하였다. 다른 펩티드(P6-22와 P299-313) 역시 증식성 T 세포 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다. P6-22로 면역화는 2.3의 자극 지수(SI)를 결과하고, P299-313으로 면역화는 3.3의 SI를 결과하였다. 양성 대조에는 ConA 자극된 T 세포 및 공지된 항원, 예를 들면 CD45와 FBL로 자극된 T 세포와 동종 T 세포주 등이 포함된다(DeBruijn et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970, 1991).
도 6A와 6B에서는 백신 A(도 6A)와 백신 B(도 6B)내에 각 3개의 펩티드에서 관찰된 증식성 반응을 도시한다. 백신 A는 3에서 8까지의 자극 지수(SI)로 면역화 펩티드 p6-22와 p1l 17-139에 증식성 T 세포 반응을 유도하였다(벌크 세포주). p244-262에 대한 증식성 반응은 관찰되지 않았다(도 6A).
후속 시험관내 자극은 p6-22와 p117-139만을 이용한 단일 펩티드 자극으로 실시하였다. p117-139로 백신 A 특이적 T 세포를 자극하면 p117-139에 대한 증식이 유도되지만, p6-22에 대하여 어떤 반응도 나타나지 않았다(도 7A). 상기 세포주로부터 유래된 클론은 p117-139에 특이적이었다(도 7B). 대조적으로, p6-22로 백신 A 특이적 T 세포주를 자극하면 p6-22에 대한 증식이 유도되지만, p117-139에 대하여 어떤 반응도 나타나지 않았다(도 7C). 상기 세포주로부터 유래된 클론은 p6-22에 특이적이었다(도 7D).
이들 결과는 WT1 펩티드로 면역화가 WT1 단백질에 대한 항체 반응 및 면역화 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 4
WT1 펩티드로 면역된 마우스에서 CTL 반응의 유도
본 실시예에서는 CTL 면역을 유도하는 WT1 펩티드의 능력을 설명한다.
클래스 I MHC에 결합하는데 적합한 모티프를 보유하는 펩티드(9-mer)는 BIMAS HLA 펩티드 결합 예측 분석법(Parker et al., J. Immunol 152:163, 1994)으로 동정하였다. 이런 분석법으로 동정된 펩티드는 표 Ⅱ - XLⅣ에 도시한다. 이들 표에서 스코어는 지시된 MHC 분자에 대한 펩티드의 이론적 결합 친화성(분리 반감기)을 나타낸다. 이들 표에서는 Rammensee, et al., Immunogenetics 41:178-228, 1995에서 밝힌 바와 같이 규정된 펩티드 결합 모티프를 또한 표시한다. HLA-B14에 대한 펩티드 결합 모티프는 DiBrino et al, J. Biol. Chem. 269:23426-23434, 1 994에서 기술한다. 펩티드 위치는 P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, P8, P9로 약칭한다.
이에 더하여, Th 반응을 유도하는 잠재력을 가진 펩티드 모티프를 검색하는 Tsites 프로그램(Rothbard and Taylor, EMBO J. 7:93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33:145-155, 1996)으로 동정된 펩티드는 도 8A와 8B 및 표 XLV에 도시한다.
특정 CTL 펩티드(표 XLVI)는 추가 연구를 위하여 선별하였다. 표 XLVI의 각 펩티드에 대하여 BIMAS HLA 펩티드 결합 예상 분석법으로 얻은 기록을 제공한다.
C57/BL6 쥐 MHC에 결합하는 펩티드는 Ljunggren et al., Nature 346:4764809, 1990에서 밝힌 바와 같이 백혈병 세포주 RMA-S를 이용하여 확인하였다. 간단히 말하면, RMA-S 세포는 1% ECS로 보충된 완전 배지에서 26℃에서 7시간동안 배양하였다. 총 106 RMA-S 세포는 24-웰 평판의 각 웰에 첨가하고 완전 배지에서 26℃에서 16 시간동안, 37℃에서 추가로 3시간동안 단독으로 또는 지정된 펩티드(25 ㎍/㎖)와 함께 배양하였다. 이후, 세포는 3회 세척하고 플루레신 이소티오시아네이트-공액된 항-Db 또는 항-Kb 항체(PharMingen, San Diego, CA)로 착색하였다. 표지된 세포는 2회 세척하고 재현탁시키며 500 ㎕ PBS에서 1% 파라포름알데하이드로 고정시키고 유세포분석기(Becton-Dickinson FACSCalibur??에서 형광 강도를 분석하였다. RMA-S 세포의 표면에서 Db 또는 Kb 분자의 증가 비율은 배지 단독에서 배양된 세포의 평균 형광 강도와 비교하여 펩티드와 함께 배양된 세포의 증가된 평균 형광 강도로 측정하였다.
마우스는 쥐 유형 I MHC에 결합할 수 있는 펩티드로 면역하였다. 면역화이후, 비장 세포는 시험관내에서 자극하고 WT1 펩티드와 함께 배양된 표적을 용해시키는 능력을 검사하였다. CTL은 표준 크롬 방출 분석법(Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994)으로 평가하였다. 106 표적 세포는 특정 펩티드의 존부하에 37℃에서 90분동안 150 μCi 나트륨 51Cr과 함께 배양하였다. 세포는 3회 세척하고 5% 소 태아혈청을 함유하는 RPMI에 재현탁하였다. 상기 분석을 위하여, 104
51Cr-표지된 표적 세포는 U-바닥 96-웰 평판에서 200 ㎕ 최종 부피의 서로 다른 농도의 주효체 세포와 함께 배양하였다. 상층액은 37℃에서 4 내지 7시간후 제거하고, 특이적인 용해%는 아래의 공식으로 측정하였다: 특이적인 용해% = 100 x (실험적 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출).
표 XLVII에 제시된 결과는 일부 WT1 펩티드가 CTL을 발생시키는데 필수적인 유형 I MHC 분자에 결합할 수 있음을 보여준다. 게다가, 여러 펩티드가 크롬 방출 분석에 의한 측정에서 펩티드 특이적 CTL을 유도할 수 있었다(도 9A와 9B). CTL 펩티드 p10-18 사람, p136-144 사람, p136-144 마우스, p235-243에 대한 면역화이후, 펩티드 특이적 CTL 세포주를 발생시키고 클론을 확립하였다. 이들 결과는 펩티드 특이적 CTL이 WT1을 발현하는 악성 세포를 죽일 수 있음을 시사한다.
실시예 5
마우스에서 WT1 특이적 CTL을 유도하기 위한 WT1 폴리펩티드의 활용
본 실시예에서는 WT1 양성 종양 세포주를 죽일 수 있는 CTL 면역을 유도하는 대표적 WT1 폴리펩티드의 능력을 설명한다.
유형 Ⅰ과 유형 Ⅱ에 결합하는데 적합한 모티프를 보유하는 펩티드인 P117-139는 앞서 밝힌 바와 같이 TSITES와 BIMAS HLA 펩티드 결합 예측 분석법으로 동정하였다. 마우스는 실시예 3에서 밝힌 바와 같이 면역하였다. 면역화이후, 비장 세포는 시험관내에서 자극하고 WT1 펩티드 및 WT1 양성과 음성 종양 세포와 함께 배양된 표적을 용해시키는 능력을 검사하였다. CTL은 표준 크롬 방출 분석으로 평가하였다. 도 1OA-1OD에 제시된 결과는 P117이 WT1 양성 종양 세포를 죽일 수 있는 WT1 특이적 CTL를 유도할 수 있지만 WT1 음성 세포의 사멸은 관찰되지 않는다는 것을 보여준다. 이들 결과는 펩티드 특이적 CTL이 WT1을 발현하는 악성 세포를 실제로 죽이고 백신과 T 세포 요법이 WT1을 발현하는 악성종양에 효과적이라는 것을 입증한다.
유사한 면역화는 9량체 유형 I MHC 결합 펩티드 p136-144, p225-233, p235-243 및 23량체 펩티드 p117-139를 이용하여 실시하였다. 면역화이후, 비장 세포는 시험관내에서 4가지 펩티드 각각으로 자극하고 WT1 펩티드와 함께 배양된 표적을 용해시키는 능력을 검사하였다. p136-144, p235-243, p117-139에는 특이적이지만 p225-233에는 특이적이지 않은 CTL을 발생시켰다. p235-243과 p117-139에 대한 CTL 데이터는 도 11A와 11B에 제시한다. 펩티드 p136-144와 p225-233에 대한 데이터는 기술하지 않는다.
CTL 용해에서 표적 WT1 펩티드는 내생적으로 처리되고 종양 세포 유형 I MHC 분자와 연관하여 제시된다. 상기 WT1 펩티드 특이적 CTL은 WT1 양성 vs. 음성 종양 세포주를 용해시키는 능력을 검사하였다. p235-243에 특이적인 CTL은 p235-243 펩티드와 함께 배양된 표적을 용해시키지만 WT1 단백질을 발현하는 세포주를 용해시키지 못한다(도 11A). 극히 대조적으로, p117-139에 특이적인 CTL은 p117-139 펩티드와 함께 배양된 표적을 용해시키고, 또한 WT1을 발현하는 악성 세포를 용해시켰다(도 11B). 음성 대조로서, p117-139에 특이적인 CTL은 WT1 음성 EL-4(이후, El0)를 용해시키지 않았다.
WT1 특이적 용해의 특이성은 저온 표적 저해로 확인하였다(도 12A-12B). 주효체 세포는 96-웰 U-바닥 평판에서 다양한 주효체:표적 비율로 도말하였다. 51Cr 표지없는 10배 과량(고온 표적과 비교하여)의 지시된 펩티드-피복된 표적을 첨가하였다. 최종적으로, 104 51Cr-표지된 표적 세포/웰을 첨가하고, 평판은 37℃에서 4시간동안 배양하였다. 웰당 전체 부피는 200㎕이었다.
p117-139 특이적 CTL에 의한 TRAMP-C의 용해는 유관한 펩티드 p117-139와 함께 배양된 EL-4에 의해 58% 내지 36% 차단되었지만 무관한 펩티드와 함께 배양된 EL-4에 의해서는 차단되지 않았다(도 12A). 유사하게, BLK-SV40의 용해는 유관한 펩티드 p117-139와 함께 배양된 EL-4에 의해 18% 내지 0% 차단되었다(도 12B). 결과는 WT1 펩티드 특이적 CTL이 처리된 WT1의 인식에 의해 악성 세포를 특이적으로 죽임을 확인한다.
추정 CTL 모티프를 보유하는 여러 분절은 p117-139에 포함된다. CTL 에피토프의 정확한 서열을 결정하기 위하여 p117-139내의 모든 잠재적 9량체 펩티드를 합성하였다(표 XLVⅢ). 이들 펩티드중 2가지(p126-134와 p130-138)는 H-2b 유형 I 분자에 결합하는 것으로 밝혀졌다(표 XLVⅢ). p117-139 면역화로 발생된 CTL은 p126-134 및 p130-138과 함께 배양된 표적을 용해시키지만, p117-139내의 다른 9량체 펩티드에서는 그렇지 않았다(도 13A).
p117-139 특이적 CTL 세포주는 p126-134 또는 p130-138로 재자극하였다. p126-134 또는 p13O-l38로 재자극이후, 양 T 세포주가 펩티드 특이적 용해를 나타내긴 하지만, p130-138 특이적 CTL만 WT1 양성 종양 세포주의 용해를 보였다(도 13B와 13C). 따라서, p130-138은 자연적으로 처리된 에피토프인 것으로 생각된다.
실시예 6
마우스 종양 세포주에서 WT1 특이적 mRNA의 동정
본 실시예에서는 세포와 세포주에서 WT1 특이적인 mRNA를 탐지하는데 이용되는 RT-PCR을 설명한다.
단핵 세포는 밀도 구배 원심분리로 분리하고 즉시 동결시키며 WT1 특이적 mRNA의 존재를 RT-PCR로 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다. RT-PCR은 Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995에서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 전체 RNA는 표준 절차에 따라 107 세포로부터 추출하였다. RNA 펠렛은 25 ㎕ 디에틸피로카보네이트 처리된 물에 재현탁시키고 역전사에 직접 사용하였다. 징크-핑거 영역(엑손 7 내지 10)은 PCR에 의해 330 bp 마우스 cDNA로 증폭하였다. 증폭은 1회 PCR 또는 필요한 경우 2회 연속 PCR동안 DNA증폭장치(thermocycler)에서 증폭하였다. AmpliTaq DNA 주합효소(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 2.5 mM MgCl2, 50 ㎕의 전체 반응 부피에서 20 pmol의 각 프라이머가 사용되었다. PCR 산물의 20 ㎕ 분량은 브롬화 에티듐으로 착색된 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하였다. 겔은 폴라로이드 필름(Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, England)으로 사진을 촬영하였다. Kwok and Higuchi, Nature 339:237-238, 1989의 권고에 따라 교차 오염(cross examination)을 주의하였다. 음성 대조는 각 실험에서 cDNA 대신에 cDNA-와 PCR-반응물과 물의 혼합물을 포함하였다. 가음성(false negative)을 예방하기 위하여, 원형(原形) RNA의 존재 및 적합한 cDNA 발생은 β-액틴 프라이머를 이용한 대조 PCR에 의해 각 시료에서 평가하였다. 이들 프라이머로 증폭되지 않는 시료는 분석에서 배제하였다.
마우스 세포주에서 WT1 증폭을 프라이머는 아래와 같다: P115: 1458-1478: 5' CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3'(선행 프라이머; 서열 번호 21); P116: 1767-1787: 5' ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3'(역행 프라이머; 서열 번호 22)(참조: Inoue et al, Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995).
대조 반응에 사용된 베타 액틴 프라이머는 아래와 같다: 5' GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3'(센스 프라이머; 서열 번호 23); 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3'(안티센스 프라이머; 서열 번호 24)
사람 WT1을 증폭하는데 사용되는 프라이머는 아래와 같다: P117: 954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3'(서열 번호 25); P118: 1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3'(서열 번호 5). nested RT-PCR를 위한 프라이머는 아래와 같다: P119: 1023-1043: 5' GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3'(서열 번호 26); P120: 1345-1365: 5' TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3'(서열 번호 27).
표 XLVIII에서는 마우스 종양 세포주의 WT1 PCR 분석의 결과를 도시한다. 표 IV에서, (+++)는 1단계 RT-PCR에서 강한 WT1 PCR 증폭 산물을 표시한다. (++)는 1단계 WT1 RT-PCR에 의해 탐지되는 ET1 증폭 산물을 표시하고, (+)는 2단계 WT1 RT- PCR에서만 탐지되는 산물을 표시하고, (-)는 WT1 PCR 음성을 표시한다.
실시예 7
대장균(
E. coli
)에서 WT1 Trx 융합 작제물의 발현
WT1의 절두된 개방 해독틀 (WT1 B)은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
아미노산 2에서 개시되는 선행 프라이머
P-37 (서열 번호 342) 5'ggctccgacgtgcgggacctg 3'Tm 64℃
종결 코돈 이후 EcoRI 부위를 형성하는 역행 프라이머
P-23 (서열 번호 343) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 63℃
PCR은 하기 조건에서 수행되었다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 3 분 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 겔 정제하며, 이후 pTrx 2H 벡터(N-말단에 Trx 융합 및 Trx 융합 주변에 2개의 His 태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터. Trx 융합이후에 트롬빈과 엔테로키나아제에 대한 프로테아제 절단 부위가 존재한다)에 클로닝하였다. pTrx2H 작제물은 StuI과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 정확한 작제물은 DNA 서열 분석으로 확인하고, 이후 BL21(DE3) pLys S와 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포에 형질전환시켰다.
실시예 8
대장균(
E. coli
)에서 WT1 A His 태그 융합 작제물의 발현
WT1의 N-말단 개방 해독틀(WT1 A)은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
아미노산 2에서 개시하는 선행 프라이머
P-37 (서열 번호 344) 5'gctccgacgtgcgggacctg 3'Tm 64℃
아미노산 249 이후에 놓인 인공적인 종결 코돈 이후의 EcoRI 부위를 형성하는 역행 프라이머.
PDM-335 (서열 번호 345) 5'aattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 64℃
PCR은 하기 조건에서 수행되었다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 1 분 20 초 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 겔 정제하며, 이후 프레임에 His 태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터인 pPDM에 클로닝하고, 상기 벡터는 Eco72I과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. PCR 산물은 또한, pTrx2H 벡터에 형질전환시켰다. pTrx2H 작제물은 StuI과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 정확한 작제물은 DNA 서열 분석으로 확인하고, 이후 BL21(DE3) pLys S와 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포에 형질전환시켰다.
실시예 9
대장균(
E. coli
)에서 WT1 B His 태그 융합 작제물의 발현
WT1의 절두된 개방 해독틀(WT1 A)은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
아미노산 250에서 개시하는 선행 프라이머
PDM-346 (서열 번호 346) 5'cacagcacagggtacgagagc 3'Tm 58℃
종결 코돈 이후의 EcoRI 부위를 형성하는 역행 프라이머.
P-23 (서열 번호 347) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 64℃
PCR은 하기 조건에서 수행되었다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 1 분 20 초 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 겔 정제하며, 이후 프레임에 His 태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터인 pPDM에 클로닝하고, 상기 벡터는 Eco72I과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. PCR 산물은 또한, pTrx2H 벡터에 형질전환시켰다. pTrx2H 작제물은 StuI과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 정확한 작제물은 DNA 서열 분석으로 확인하고, 이후 BL21(DE3) pLys S와 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포에 형질전환시켰다.
실시예 7-9의 경우에, 아래의 서열 번호를 개시한다.
서열 번호 327은 Trx_WT1_B에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 328은 Trx_WT1_A에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 329는 Trx_WT1에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 330은 WT1_A에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 331은 WT1_B에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 332는 서열 번호 327로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 333은 서열 번호 328로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 334는 서열 번호 329로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 335는 서열 번호 330로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 336은 서열 번호 331로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
실시예 10
대장균(
E. coli
)에서 발현되는 절두된 형태의 WT1
WT1의 3가지 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
WT1 Tr2에 대한:
PDM-441 (서열 번호 348) 5'cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3'Tm 63℃
PDM-442 (서열 번호 349) 5'ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3'TM 62℃
WT1 Tr3에 대한:
PDM-443 (서열 번호 350) 5'caggctttgctgctgaggacgccc 3'Tm 64℃
PDM-444 (서열 번호 351) 5'cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc 3'TM 64℃
WT1 Tr4에 대한:
PDM-445 (서열 번호 352) 5'cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3'Tm 63℃
PDM-446 (서열 번호 353) 5'ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3'TM 63℃
PCR은 하기 조건에서 수행되었다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 1 분 20 초 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 pPDM His(프레임에서 5' 말단에 His 태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터)에 클로닝하고, 상기 벡터는 Eco72I과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 정확한 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BL21 pLys S와 BL21 CodonPlus 세포 또는 BLR pLys S와 BLR CodonPlus 세포에 형질전환시켰다.
실시예 11
대장균(
E. coli
)에서 WT1 C(아미노산 76-437)와 WT1 D(아미노산 91-437) 발현
WT1 C 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
PDM-504 (서열 번호 354) 5'cactccttcatcaaacaggaac 3'Tm 61℃
PDM-446 (서열 번호 355) 5'ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3'TM 63℃
PCR은 하기 조건에서 수행되었다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 1 분 20 초 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 pPDM His에 클로닝하고, 상기 벡터는 Eco72I과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 CodonPlus RP로 동시-형질전환된 BLR pLys S와 BLR에 형질전환시켰다.
실시예 12
부분 중복되는 올리고의 어닐링(annealing)에 의한 WT1 TR-1의 합성
본 실시예는 발현에 대한 변화되는 프롤린 코돈 사용의 효과를 결정하기 위하여 실시하였다.
아래의 올리고 쌍이 어닐링되었다:
1. PDM-505 (서열 번호 356)
5'ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3'
PDM-506 (서열 번호 357)
5' ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3'
2. PDM-507 (서열 번호 358)
5'ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3'
PDM-508 (서열 번호 359)
5' cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3'
3. PDM-509 (서열 번호 360)
5' cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3'
PDM-510 (서열 번호 361)
5' cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3'
4. PDM-511 (서열 번호 362)
5' cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3'
PDM-512 (서열 번호 363)
5' cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3'
5. PDM-513 (서열 번호 364)
5' ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3'
PDM-514 (서열 번호 365)
5' ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3'
6. PDM-515 (서열 번호 366)
5' cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3'
PDM-516 (서열 번호 367)
5' ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3'
7. PDM-517 (서열 번호 368)
5' gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3'
PDM-518 (서열 번호 369)
5' ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag 3'
8. PDM-519 (서열 번호 370)
5' gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3'
PDM-520 (서열 번호 371)
5' gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3'
각 올리고 쌍은 독립적으로 결합시키고 어닐링하였다. 이후, 이들 쌍은 서로 결찰시키고, 1 ㎕ 결찰 혼합물은 아래의 PCR 조건에 사용하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충액
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 개개의 올리고
83㎕ 정제수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제 (Stratagene, La Jolla, CA)
50 ng DNA (pPDM FL WT1)
96℃ 2 분
96℃ 20 초 63℃ 15 초 72℃ 1 분 20 초 x 40 회전
72℃ 4 분
PCR 산물은 EcoRI 제한 효소로 절단하고 pPDM His에 클로닝하고, 상기 벡터는 Eco72I과 EcoRI 제한 효소로 절단하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 CodonPlus RP로 동시-형질전환된 BLR pLys S와 BLR에 형질전환시켰다.
실시예 10-12의 경우에, 아래의 서열 번호를 개시한다.
서열 번호 337은 WT1_Tr1에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 338은 WT1_Tr2에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 339는 WT1_Tr3에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 340은 WT1_Tr4에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 341은 WT1_C에 대한 결정된 cDNA서열이다
서열 번호 342는 서열 번호 337로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 343은 서열 번호 338로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 344는 서열 번호 339로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 345는 서열 번호 340로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
서열 번호 346은 서열 번호 341로 암호화되는 예상된 아미노산 서열이다
WT1 C 서열은 TR2, TR3, TR4의 코딩 영역을 보유하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
WT1 TR-1 합성 서열은 프롤린에 대한 고유 코돈이 다른 코돈으로 대체되어 대장균(E. coli)에서 WT1 TR-1을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
실시예 13
마우스에서 WT1 면역화의 전신 조직병리학적ㆍ독물학적 효과의 평가
본 실시예의 목적은 마우스의 반복 투여 적정에서 WT1 단백질 면역화의 면역원성 및 잠재적 전신 조직병리학적ㆍ독물학적 효과를 분석하는 것이다.
WT1 단백질로 마우스 면역화를 위한 실험 설계는 표 L에서 개설한다.
암컷 C57/B6 마우스의 반복 투여 적정 연구(25 ㎍에서 100 ㎍ 내지 1000 ㎍ 용량 범위의 WT1 단백질)에서 MPL-SE를 어쥬번트로 하는 WT1 단백질의 예방접종은 강한 WT1-특이적 항체 반응(도 19) 및 세포 T-세포 반응(도 20)을 유도하였다.
WT1 단백질 면역화의 전신 조직병리학적 또는 독물학적 효과는 관찰되지 않았다. 아래의 조직에서 독성에 대한 조직학적 증거는 관찰되지 않았다: 부신, 뇌, 맹장, 결장, 십이지장, 눈, 대퇴골과 골수, 방광, 심장, 회장, 공장, 신장, 후두, 눈물샘, 간, 폐, 림프절, 근육, 식도, 난소, 췌장, 부갑상선, 침샘, 흉골과 골수, 비장, 위, 흉선, 기관지, 갑상선, 방광, 자궁.
잠재적 조혈 독성을 중점적으로 평가하였다. 흉골과 대퇴골에서 골수/적혈구 비율은 정상이었다. 모든 평가가능한 적혈구 개체수와 혈액 화학(BUN, 크레아티닌, 빌리루빈, 알부민, 글로불린)은 정상 범위이내이었다(표 LI).
WT1에 대한 현존 면역이 일부 백혈병 환자에 존재하고 WT1 단백질에 대한 예방접종이 마우스에서 정상적인 조직에 대한 독성없이 WT1 특이적 Ab 및 세포 T-세포 반응을 유도할 수 있다는 점을 고려하면, 이들 실험은 종양/백혈병 백신으로 WT1을 확립한다.
약어:
WBC: 백혈구 세포
RBC: 적혈구 세포
Hg: 헤모글로빈
HCT: 혈구 분리 원심분리기
MCV: 평균 미립자 용적
MCH: 평균 미립자 헤모글로빈
MCHC: 평균 미립자 헤모글로빈 농도
Plt.: 혈소판
Abs.: 절대치
Baso: 호염기구
Eos: 호산구
Abs. Bands: 미성숙 호중구
Polys: 다핵세포
Lymph: 림프구
MoNO: 단핵구
BUN: 혈액 뇨 질소
실시예 14
전체 유전자 시험관내 프라이밍(priming)에 의한 사람 WT1-특이적 T-세포 반응의 유도
본 실시예에서는 WT1 특이적 T-세포 반응이 정상 개체의 혈액으로부터 발생될 수 있다는 것을 설명한다.
수지상 세포(DC)는 10% 사람 혈청, 50 ng/㎖ GM-CSF, 30 ng/㎖ IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4-10일동안 성장으로 정상 공여자의 PBMC로부터 유래된 단핵구 배양액으로부터 분화시켰다. 배양이후, DC는 5 M.O.I의 재조합 WT1-발현 우두 바이러스로 16시간동안 또는 10 M.O.I의 재조합 WT1-발현 아데노바이러스로 3일동안 감염시켰다(도 21과 22). 우두 바이러스는 U.V. 조사로 불활화시켰다. CD8+ T-세포는 자성 비드를 이용한 양성 선택으로 분리하고, 배양액 프라이밍은 96-웰 평판에서 개시하였다. 배양액은 WT1을 발현하도록 아데노바이러스 또는 우두 바이러스 감염된 자가 수지상 세포로 7-10일마다 재자극하였다. 3-6회 자극이후, 자가-WT1-발현 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극되면 인터페론-감마를 특이적으로 생산하는 CD8+ 세포주가 동정되었다. 이들 세포주의 WT1-특이적 활성은 추가 자극 주기이후 유지될 수 있었다. 이들 세포주는 Elispot 분석에서 아데노바이러스 또는 우두 WT1 감염된 자가 수지상 세포를 특이적으로 인식하지만 아데노바이러스 또는 우두 EGFP-감염된 자가 수지상 세포는 인식하지 못함을 확인하였다(도 23).
실시예 15
주사용 RA12-WT1의 제형: 동결건조 산물을 안정시키는 부형제의 활용
본 실시예에서는 동결건조된 Ra12-WT1의 완전한 안정화가 가능한 제형(formulation)을 설명한다.
아래의 제형에서 재조합 단백질 Ra12-WT1은 동결건조이후에 수성 매체에 용해되었다:
재조합 Ra12-WT1 농도: 0.5 - 1.0 ㎎/㎖; 완충액: 10-20 mM 에탄올아민, pH 10.0; 1.0-5.0 mM 시스테인; 0.05% Tween-80(Polysorbate-80); 당: 10% 트레할로스(T5251, Sigma, MO), 10% 말토오스(M9171, Sigma, MO), 10% 수크로오스(S7903, Sigma, MO), 10% 과당(F2543, Sigma, MO), 10% 글루코오스(G7528, Sigma, MO).
당 부형제를 함유하는 동결건조 단백질은 당 부형제가 없는 경우보다 훨씬 많이 용해되는 것으로 밝혀졌다. 쿠마씨(coomassie) 착색된 SDS-PAGE에 의한 분석에서 용해된 물질에 잔류하는 고체는 관찰되지 않았다.
실시예 16
WT1 단백질 백신의 제형
본 실시예에서는 WT1 단백질과 2가지 상이한 보조제 제형으로 면역화이후 WT1-특이적 면역반응의 유도를 설명한다.
본 실시예에 따라, MPL-SE와 조합된 WT1 단백질은 WT1에 대한 강한 Ab와 인터페론-γ(IFN-γ) 반응을 유도한다. C57/B6 마우스에서 MPL-SE 또는 Enhanzyn을 보조제로 하는 WT1 단백질 면역화이후 WT1 특이적 면역 반응을 유도하는데 이용되는 방법은 아래에 상세하게 기술한다.
C57/BL6 마우스는 MPL-SE 또는 Enhanzyn 보조제와 결합된 20 ㎍ rRa12-WT1로 면역하였다. 일군의 대조 마우스는 보조제없는 rRa12-WT1로 면역하고, 일군은 염수 단독으로 면역하였다. 3주 간격으로 근육내(IM) 면역을 3회 실시하였다. 비장과 혈청은 최종 면역 2주후에 수거하였다. 혈청은 Ra12-WT1 융합체, Ra12 또는 WT1TRX로 피복된 평판에서 ELISA로 항체 반응을 분석하였다. Ra12-WT1 + MPLSE 및 Ra12-WT1 +Enhanzyn으로 면역된 마우스에서 유사한 수준의 IgG2a와 IgG1 항체 역가 관찰되었다. 보조제없는 rRa12-WT1로 면역된 마우스는 좀더 낮은 수준의 IgG2a 항체를 보였다.
CD4 반응은 시험관내에서 rRa12-WT1, rRa12 또는 WT1 펩티드 p6, p117, p287로 비장세포의 자극이후 인터페론-γ 생산을 측정하여 평가하였다. 양 보조제는 rRA12-WT1 단독으로 면역된 마우스에서 CD4 반응을 개선하였다. 이런 결과는 rRA12-WT1 + MPL-SE가 rRA12-WT1 + Enhanzyn보다 강한 CD4 반응을 유도한다는 것을 시사한다. IFN-γ OD 시도(readings)는 rRA12-WT1 + Enhanzyn으로 면역된 마우스에서 1-1,2와 비교하여 rRA12-WT1 + MPL-SE로 면역된 마우스에서 1.4-1.6이었다. 펩티드 반응은 p117에 대해서만 관찰되었고, 또한 rRa12-WT1 + MPL-SE로 면역된 마우스에서만 관찰되었다. 양성 대조, ConA에 대한 강한 IFN-γ 반응이 모든 마우스에서 관찰되었다. 염수로 면역된 음성 대조 마우스에서는 ConA에 대한 반응만 관찰되었는데, 이는 상기 반응이 rRa12-WT1에 특이적임을 시사한다.
실시예 17
임의로 돌연변이된 WT1 라이브러리의 작제
사람 WT1의 핵산 서열은 8-옥소 dGTP와 dPTP의 존재하에 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 임의로 돌연변이시켰다(journal of Molecular Biology 1996; 255:589-603). 절단접합되지 않은 완전한 사람 WT1 유전자는 서열 번호 380에 제시하고, 상응하는 단백질 서열은 서열 번호 404에 제시한다. WT1의 절단접합 변이체는 PCR 반응의 주형으로 사용하고 서열 번호 381(DNA)과 408(단백질)에 제시한다. 핵산 변형의 빈도가 PCR 산물의 대략 5-30%에서 아미노산 서열에 표적된 변화를 유도하는 조건을 선택하였다. 이후, 돌연변이된 PCR 산물은 뉴클레오티드 유사체의 부재하에 4가지 정상 dNTP를 사용하여 증폭하였다. PCR 산물은 면역화를 위하여 포유동물 발현 벡터와 바이러스 벡터에 서브클로닝하였다. 따라서, 상기 라이브러리는 임의로 돌연변이된 WT1 클론의 혼성 개체군을 포함한다. 여러 클론이 선별되고 서열화되었다. 돌연변이된 WT1 변이체 DNA 서열은 서열 번호 377-379에 제시하고, 이들 변이체의 예상 아미노산 서열은 서열 번호 405-407에 제시한다. 이들 변형된 서열 및 상기 라이브러리의 다른 서열은 암 세포에서 WT1 단백질에 대하여 좀더 강한 T 세포 반응을 유도하는 면역원으로 사용될 수 있다.
실시예 18
WT1-LAMP 융합체의 작제
3자간 융합체는 중합효소 연쇄 반응 및 사람 리소좀 결합된 막 단백질-1(LAMP-1)의 소요 접합(junction)과 사람 WT1 서열의 절단접합 변이체를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 이용하여 작제하였다. 이들 융합체에 사용되는 WT1의 절단접합 변이체 및 LAMP-1 서열은 서열 번호 381과 383에 제시한다. 구체적으로, LAMP-1의 신호 펩티드(LAMP의 1-87 염기쌍)를 사람 WT1 개방 해독틀의 5'-말단(1,290 염기쌍)에 융합하고, 이후 LAMP-1의 막통과 세포질 도메인(LAMP의 1161 내지 1281 염기쌍)을 WT1 서열의 3'-말단에 융합하였다. 생성된 WT1-LAMP 작제물 서열은 서열 번호 382(DNA)와 서열 번호 409(단백질)에 제시한다. 상기 작제물은 진핵세포에서 발현될 때 신호 펩티드가 상기 단백질을 소포체(ER)로 지향시키도록 설계되는데, 상기 소포체에서 LAMP-1의 막통과 세포질 도메인에서 국소화 신호는 펩티드가 유형 Ⅱ MHC 분자에 적하되는 리소좀 위치로 융합 단백질이 전달되도록 조정한다.
실시예 19
강화된 MHC 유형 I 제시를 위한 WT1-유비퀴틴 융합체의 작제
사람 유비퀴틴(ubiquitin) 개방 해독틀(서열 번호 384)은 마지막 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 글리신 대신에 알라닌을 암호화하도록 돌연변이시켰다. 돌연변이된 개방 해독틀은 사람 WT1의 첫 번째 코돈의 직상류 프레임에 클로닝하였다(서열 번호 381과 408, 각각 DNA와 단백질). G->A 돌연변이는 번역동안 폴리-유비퀴틴을 정상적으로 처리하는 프로테아제에 의한 단백질의 동시-번역 절단을 예방한다. 생성 작제물의 DNA와 예상 아미노산 서열은 각각 서열 번호 385와 410에 제시한다. 생성 단백질은 사람 세포에서 발현될 때 감소된 세포독성을 보였다. 고유 WT1을 발현하는 안정적인 세포주를 발생시킬 수는 없었지만, 융합 단백질을 발현하는 세포주는 용이하게 수득되었다. 생성 단백질은 부가된 유비퀴틴 분자에 의해 프로테오솜으로 이동할 것으로 예상된다. 이는 WT11 특이적 CD8+ T 세포에 의한 상기 단백질의 좀더 효율적인 인식을 초래한다.
실시예 20
사람 WT1을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 작제
사람 WT1의 절단접합 변이체(서열 번호 381)는 E1과 E3 결실된 아데노바이러스 혈청형 5 벡터에 클로닝하였다. WT1 유전자의 발현은 높은 수준의 WT1 단백질 발현을 매개하는 CMV 프로모터로 조절한다. 상기 반응물로 사람 세포를 감염시켜 WT1 단백질의 발현을 높은 수준으로 유도한다. 감염동안 숙주 세포에 도입되고 감염이후에 낮은 수준으로 생산되는 아데노바이러스 단백질의 항원 특성은 면역학적 표적으로서 WT1의 면역 감시와 면역 인식을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 상기 벡터는 사람 개체에 접종되는 경우에 WT1 단백질에 대한 면역 반응을 발생시키는 데에도 사용될 수 있다. 이들 개체가 WT1 발현 종양 세포에 양성이면, 면역 반응은 이런 질환의 과정에 치료 효과를 나타낼 수 있다.
실시예 21
사람 WT1을 발현하는 우두 바이러스 벡터의 작제
전장 사람 WT1 유전자(서열 번호 381)의 절단접합 변이체는 pSC11 셔틀 벡터를 이용하여 우두 바이러스의 Western Reserve 균주의 티미딘 키나아제 좌위에 클로닝하였다. WT1 유전자는 우두 바이러스 감염 과정동안 유전자 발현을 매개하는 하이브리드 우두 바이러스 프로모터의 조절하에 위치한다. 상기 반응물은 사람 세포에서 WT1 단백질을 생체내 또는 시험관내 발현하는데 사용될 수 있다. WT1은 일부 사람 종양 세포에서 과다발현되는 자가 단백질이다. 따라서, 단백질로 전달된 WT1에 대한 면역 반응은 WT1의 주조직적합성 유형 I(MHC 유형 I)-매개된 인식을 유도하지 않는 것으로 생각된다. 하지만, 세포내 구획에서 우두 바이러스 벡터에 의한 상기 단백질의 발현은 높은 수준의 MHC 유형 I 제시 및 CD8+ T 세포에 의한 WT1 세포의 인식을 유도한다. 우두 바이러스 벡터에 의한 WT1 단백질의 발현은 MHC 유형 Ⅱ의 배경에서 WT1 펩티드의 제시 및 CD4+ T 세포에 의한 인식을 또한 유도한다.
본 발명의 용도에는 암 백신으로서 용도가 포함된다. WT1 양성 종양을 보유하는 사람 개체의 면역화는 치료 반응을 유도할 수 있다. 세포내에서 WT1의 발현은 CD4와 CD8 양성 T 세포에 의한 상기 단백질의 인식을 유도한다.
실시예 22
전체 유전자 프라이밍을 이용한 WT1-특이적 CD8+ T-세포 클론의 발생
수지상 세포(DC)는 10% 사람 혈청, 50 ng/㎖ GM-CSF, 30 ng/㎖ IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4-6일동안 성장으로 정상 공여자의 PBMC로부터 유래된 단핵구 배양액으로부터 분화시켰다. 배양이후, DC는 5 감염 다중도(M.O.I)의 재조합 WT1-발현 우두 바이러스(실시예 21)로 16시간동안 또는 10 M.O.I의 재조합 WT1-발현 아데노바이러스로 3일동안 감염시켰다. 우두 바이러스는 U.V. 조사로 불활화시켰다. CD8+ T-세포는 자성 비드를 이용한 음성 고갈(negative depletion)로 분리하고, 배양액 프라이밍은 96-웰 평판에서 개시하였다. 배양액은 WT1을 발현하도록 조작된 아데노바이러스 또는 우두 바이러스로 감염된 자가 수지상 세포로 7-10일마다 재자극하였다. 4-5회 자극이후, 자가-WT1-발현 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극되면 인터페론-감마를 특이적으로 생산하는 CD8+ T-세포주가 동정되었다. 이들 세포주는 클로닝하고, Elispot 분석에서 WT1 형질도입된 자가 섬유아세포를 특이적으로 인식하지만 EGFP 형질도입된 섬유아세포는 인식하지 못함을 확인하였다.
윌름 종양(WT1) 유전자는 백혈병발생에 관여하고 대부부의 사람 백혈병 및 여러 고형 종양에서 과다발현된다. 인체에서 실시된 기존 연구에서는 조사된 AML 환자의 16/63(25%)과 CML 환자의 15/81(19%)에서 WT1 특이적 항체(Ab) 반응의 존재를 확인하였다. 마우스에서 실시된 기존 연구에서는 WT1 펩티드 기초한 백신이 WT1 특이적 Ab, Th, CTL 반응을 유도한다고 밝혔다. 인체에서 백신으로 펩티드의 사용은 이들의 HLA 한정 및 펩티드 특이적 반응을 유도하고 소수의 환자에서만 종양 특이적 CTL을 유도하는 경향으로 제한된다. 전체 면역화의 이점은 여러 보조와 CTL 에피토프가 단일 백신에 포함되어 특정 HLA 유형에 백신을 한정시키지 않는다는 점이다. 본원에 개시된 데이터는 전체 유전자 시험관내 프라이밍이 WT1 특이적 면역 반응을 유도하고 WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론이 발생될 수 있음을 입증한다. WT1에 대한 현존 면역이 일부 백혈병 환자에 존재하고 쥐과 사람 WT1이 아미노산 수준에서 96% 상동하며 WT1 단백질, DNA 또는 펩티드에 대한 예방접종이 마우스에서 정상 조직에 독성없이 WT1 특이적 Ab 및 세포 T-세포 반응을 유도할 수 있는 점을 고려하면, 이들 사람 시험관내 프라이밍 실험은 종양/백혈병 백신으로서 WT1을 더욱 확립한다. 더 나아가, WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론을 발생시키는 능력은 유전자 조작된 T-세포를 이용한 WT1 과다발현과 연관된 악성종양의 치료를 유도할 수 있다.
실시예 23
WT1의 임상적 제조를 위한 재조합 작제물
임상 등급 WT1의 생산을 위한 5가지 작제물은 아래와 같이 만들었다.
Ra12/WT-E(서열 번호 388(cDNA)과 391(단백질)) 및 His 태그없는 WT-1 E(서열 번호 386(cDNA)과 395(단백질))의 설계:
PDM-780 (서열 번호 396) 5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tm 6oC
PDM-779 (서열 번호 397) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tm 63oC
아래의 PCR 사이클링 조건이 이용되었다: 1㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 1μM 각 올리고, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 반응물은 먼저 96oC에서 2분간 변성시키고, 96oC에서 20초간, 62oC에서 15초간, 72oC에서 1분 40초간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72oC에서 4분간 최종 신장시켰다. PCR 산물은 NdeI과 EcoRI으로 절단하고, NdeI과 EcoRI으로 절단된 pPDM His(변형된 pET28 벡터)에 클로닝하였다. 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 상기 작제물-pPDM WT-1E는 NcoI과 XbaI으로 절단하고, pPDM Ra12 WT-1F(하기 참조)로부터 NcoI과 XbaI 삽입체의 기준 벡터로 이용하였다. 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 단백질 발현은 쿠마씨(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석으로 확인하였다.
His 태그없는 Ra12-WT-1-F(a.a. 1-281)(서열 번호 389(cDNA)와 393(단백질))의 설계.
Ra12 WT-1 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
PDM-777 (서열 번호 398) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 66oC
PDM-779 (서열 번호 399) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tm 63oC
아래의 PCR 사이클링 조건이 이용되었다: 1㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 1μM 각 올리고, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 반응물은 먼저 96??에서 2분간 변성시키고, 96oC에서 20초간, 58oC에서 15초간, 72oC에서 3분간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72oC에서 4분간 최종 신장시켰다. PCR 산물은 NdeI으로 절단하고, NdeI과 Eco72I으로 절단된 pPDM His에 클로닝하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 단백질 발현은 쿠마씨(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석으로 확인하였다.
His 태그없는 Ra12-WT-1(서열 번호 390(cDNA)과 392(단백질))의 설계.
Ra12 WT-1 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
PDM-777 (서열 번호 400) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 66oC
PDM-778 (서열 번호 401) 5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3' Tm 7oC
아래의 PCR 사이클링 조건이 이용되었다: 1㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 1μM 각 올리고, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 반응물은 먼저 96oC에서 2분간 변성시키고, 96oC에서 20초간, 68oC에서 15초간, 72oC에서 2분 30초간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72oC에서 4분간 최종 신장시켰다. PCR 산물은 NotI과 NdeI으로 절단하고, NdeI과 NotI으로 절단된 pPDM His에 클로닝하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 단백질 발현은 쿠마씨(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석으로 확인하였다.
대장균에서 His 태그없는 WT-1C(a.a. 69-430)(서열 번호 387(cDNA)과 394(단백질))의 설계.
WT-1C 판독틀은 하기 프라이머로 PCR 증폭시켰다:
PDM-780 (서열 번호 402) 5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tm 6oC
PDM-778 (서열 번호 403) 5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3' Tm 7oC
아래의 PCR 사이클링 조건이 이용되었다: 1㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 1μM 각 올리고, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 반응물은 먼저 96oC에서 2분간 변성시키고, 96oC에서 20초간, 62oC에서 15초간, 72oC에서 2분간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72oC에서 4분간 최종 신장시켰다. PCR 산물은 NdeI으로 절단하고, NdeI과 Eco72I으로 절단된 pPDM His에 클로닝하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 단백질 발현은 쿠마씨(Coomassie) 착색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석으로 확인하였다.
실시예 24
전체 유전자 프라이밍을 이용한 WT1-특이적 CD8
+
T 세포 클론의 발생 및 HLA-A2-한정된 WT1 에피토프의 확인
본 실시예에서, WT1-특이적 T 세포주를 발생시키는데 아데노바이러스와 우두 바이러스 전달 운반체를 사용하였다. 상기 세포주로부터 T 세포 클론은 WT1에 특이적인 것으로 밝혀졌고, 상기 클론에 의해 인식된 에피토프가 확인되었다.
수지상 세포(DC)는 10% 사람 혈청, 50 ng/㎖ GM-CSF, 30 ng/㎖ IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4-6일동안 성장으로 정상 공여자의 PBMC로부터 유래된 단핵구 배양액으로부터 분화시켰다. 배양이후, DC는 5 감염 다중도(M.O.I)의 재조합 WT1-발현 우두 바이러스로 16시간동안 또는 3-10 M.O.I의 재조합 WT1-발현 아데노바이러스로 2-3일동안 감염시켰다. 우두 바이러스는 U.V. 조사로 불활화시켰다. CD8+ T-세포는 CD4, CD14, CD16, CD19, CD56+ 세포에 대한 항체를 이용한 음성 고갈(negative depletion), 이후 이들 Ab의 Fc 영역에 특이적인 자성 비드로 분리하였다.
배양액 프라이밍은 96-웰 평판에서 개시하였다. 배양액은 WT1을 발현하도록 조작된 아데노바이러스 또는 우두 바이러스로 감염된 자가 수지상 세포로 7-14일마다 재자극하였다. 4-5회 자극이후, 자가-WT1-발현 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극되면 인터페론-γ(IFN-γ)를 특이적으로 생산하는 CD8+ T-세포주가 동정되었다. 이들 세포주는 클로닝하고, Elispot 분석에서 WT1 형질도입된 자가 섬유아세포를 특이적으로 인식하지만 대조 형질도입된 섬유아세포는 인식하지 못함을 확인하였다.
이들 WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론의 HLA 한정을 추가 분석하기 위하여, T-세포 클론이 확립된 공여자(D349)와 HLA-A2 대립형질만을 공유하는 다른 공여자(D475)로부터 유래된 섬유아세포는 WT1로 형질도입하였다. ELISPOT 분석으로 T-세포 클론에 의한 이들 D475 표적 세포의 인식을 확인하였다. HLA A2 한정을 더욱 뒷받침하고 상기 에피토프가 WT1을 "자연적으로" 과다발현하는(악성 형질전환의 일부로) 종양 세포에 의해 발현됨을 입증하기 위하여, 백혈병 세포주 K562를 검사하였다. K562는 HLA A2 분자로 형질도입하고, HLA-A2 음성 K562 세포는 비특이적 IFN-γ 방출에 대한 대조로 이용하였다. ELISPOT 분석에서 상기 T 세포가 A2 양성 K562 세포주를 인식하지만 A2 음성 K562 세포를 인식하지 못함을 확인하였다. 특이성 및 HLA-A2 인식 한정의 다른 증거는 HLA-A2 항체 차단 실험으로 보고되었다.
WT1 에피토프를 더욱 규정하기 위하여, 4가지 절두된 WT1 레트로바이러스 작제물을 만들었다. 이후, 공여자 475 섬유아세포는 이들 작제물로 형질도입하였다. ELISPOT 분석에서 WT1 Trl 작제물(aa2-aa92)로 형질도입된 D475 섬유아세포의 인식을 확인하고, 따라서 WT1 에피토프가 WT1 단백질의 첫 91개 N-말단 아미노산내에 위치함을 확인하였다. 에피토프를 상세하게 나타내기 위하여, 11개 아미노산에 의해 부분 중복되는 WT1 단백질의 15량체 펩티드를 합성하였다. WT1 특이적 T-세포 클론은 2가지 부분중복 15량체 펩티드, 펩티드 9(QWAPVLDFAPPGASA)(서열 번호 412) 및 펩티드 10(VLDFAPPGASAYGSL)(서열 번호 413)을 인식하였다. 최소 에피토프를 더욱 특성화하기 위하여, 15량체의 공유된 9-와 10량체 펩티드(총 5개)를 사용하여 상기 클론의 특이성을 분석하였다. 상기 클론은 9량체, VLDFAPPGA(서열 번호 241) 및 1O량체, VLDFAPPGAS(서열 번호 411)를 특이적으로 인식하였다.
실시예 25
WT1에 특이적인 CD8 T-세포로부터 유래된 TCR 알파와 베타 사슬의 클로닝과 서열분석
WT1에 특이적인 CD8+ T-세포 클론으로부터 유래된 T 세포 수용체(TCR) 알파와 베타 사슬은 클로닝한다. 서열분석을 실시하여 TCR의 알파와 베타 사슬의 기원 계통을 확인한다. 또한, 독특한 변이 및 연결 단편(반응의 특이성에 기여한다)을 확인한다.
WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론의 2 x 106 세포로부터 전체 mRNA는 Trizol 시약을 이용하여 분리하고 cDNA는 Ready-to-go 키트(Pharmacia)를 이용하여 합성한다. 클론에서 Vα와 Vβ 서열을 결정하기 위하여, Vα와 Vβ 아형 특이적 프라이머 패널을 합성하고(Clontech, Palo Alto, CA에서 생산된 프라이머 서열에 기초한다) 각 클론으로부터 발생된 cDNA와의 RT-PCR 반응에 사용한다. RT-PCR 반응은 Vβ 와 Vα서열이 각 클론에 의해 발현됨을 입증한다.
클론으로부터 전장 TCR 알파와 베타 사슬을 클로닝하기 위하여, 개시코돈과 종결코돈-코딩 TCR 뉴클레오티드를 아우르는 프라이머를 설계한다. 표준 35회 RT-PCR 반응은 교정(proofreading) 열안정성 중합효소 PWO(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 CTL 클론 및 상기 프라이머로부터 합성된 cDNA를 이용하여 확립한다. 결과의 특정 밴드(알파의 경우 ~850 bp; 베타의 경우 ~950 bp) PCR 블런트 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 결찰하고 대장균에 형질도입한다. 전장 알파와 베타 사슬을 보유하는 플라스미드로 형질전환된 대장균은 동정하고, 상응하는 플라스미드 제제는 대량으로 발생시킨다. 이후, 전장 TCR 알파와 베타 사슬을 보유하는 플라스미드는 표준 방법으로 서열화한다. 따라서, TCR의 특이성에 기여하는 변이-연결(DJ) 영역이 결정된다.
실시예 26
WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론은 WT1-발현 백혈병 모세포를 용해시킨다
펩티드 서열 VLDFAPPGA(사람 WT1 잔기 37-45; 서열 번호 241)를 인식하는 실시예 24에 처음 개시된 CD8+ T 세포 클론은 HLA A2 한정된 방식으로 WT1 발현 백혈병 표적 세포를 죽이는(용해시키는) 능력을 추가로 검사하였다. HLA A2 분자, GFP, A2Kb로 형질도입되거나 형질도입되지 않은 K562 표적 세포는 25:1과 5:1의 주효체 대 표적 세포(E:T) 비율로 표준 4.5 시간 51크롬 방출 분석에 사용하였다. 25:1의 E:T 비율에서, CD8+ T-세포 클론은 K562/A2와 K562/A2Kb 세포(각각, 40%와 49% 특이적 용해)를 용해시키지만 GFP 형질도입된 대조와 K562 세포는 용해되지 않았다. 5:1의 E:T에서, K562/A2와 K562/A2Kb 세포의 특이적 용해는 각각 21%와 24%이었다. 따라서, 상기 CD8+ T 세포 클론은 HLA-A2-한정된 방식으로 WT1을 발현하는 백혈병 세포를 인식하고 용해시킨다. WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론을 발생시키는 능력은 유전자 조작된 T-세포를 이용한 WT1 과다발현과 연관된 악성종양의 치료에 효과적이다.
실시예 27
HLA-A2-펩티드-MHC 4합체의 작제
본 실시예에서는 곤충 세포에서 가용성 HLA-A2의 클로닝과 발현 및 항원-특이적 CD8 T 세포의 탐지와 분리를 위한 HLA-A2의 형광 다가 펩티드-MHC 4합체의 정제와 조립을 설명한다.
상기 시스템은 가용성 HLA-A2가 birA 인식 서열에서 단일 비오틴화되고 피코에리트린-공액된 스트렙타비딘 골격에서 다합체로 조립된다는 점에서 Altman 등(Altman, J., et al., Science, 1996 274(5284):94-6)에 의해 개발되고 기술된 시스템과 유사하다. 본원에 개시된 물질은 HLA-A2가 곤충 세포로부터 당화된 가용성 형태로 발현되고 이형이합체가 항-사람 유형 I MHC 항체 친화성 칼럼에서 정제된다는 점에서 구별된다.
birA 비오틴화 서열이 부가된 HLA-A2 중쇄 유전자 및 사람 베타-2-마이크로글로불린 유전자는 바쿨로바이러스 발현 벡터 pFASTBAC-dual에 클로닝하였다. 곤총 세포의 감염직후에 이들 유전자는 서로 다른 프로모터로부터 동시에 전사되고 완전히 조립되며, 당화된 가용성 HLA-A2 이형이합체가 성장 배지로 분비되었다. 감염된 곤충 세포는 상층액을 수거하기에 앞서 21℃에서 4일동안 세포 공장에서 배양하였다. HLA-A2 생산은 W6/32 및 비오틴화된 B9.12.1 항체를 이용한 포획 ELISA로 모니터하였다. HLA-A2는 세파로오스 비드에 결합된 2가지 항-사람 유형 I MHC 단클론 항체를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의한 1단계로 배양 상층액으로부터 >90% 순도로 정제하였다. 사용된 항체는 PA2.1과 W6/32이었다. 정제된 HLA-A2는 상업적으로 입수가능한 birA 효소를 사용하여 중쇄의 C-말단에서 birA 인식 서열에 단일 비오틴화시켰다. 비오틴화 효율은 기존 문헌(Crawford et al.(1998) Immunity June; 8(6):675-82)에서 밝힌 바와 같이 평가하고, 상기 물질은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가 정제하였다. 피코에리트린-공액된 스트렙타비딘은 bio-HLA-A2로 포화시키고, 다가 착색 반응물은 SEC에 의해 유리 HLA-A2로부터 정제하였다. HLA-A2 4합체는 10배 과몰의 Her-2/neu E75 펩티드 또는 인플루엔자 매트릭스 M1 펩티드와 함께 실온에서 48시간동안 배양하고, 이후 특이적인 T 세포 클론은 펩티드 적하된 4합체와 항-CD8 항체의 존재하에 4℃에서 30분동안 착색하였다. 이의 결과는 과몰의 M1 58-66 M1 인플루엔자 펩티드의 존재하에 배양된 4합체가 인플루엔자-특이적 T 세포 클론을 특이적으로 착색하고 과몰의 Her-2/neu E75 펩티드와 함께 배양된 4합체가 Her-2/new 특이적 T 세포 클론을 특이적으로 착색한다는 것을 시사한다.
실시예 28
WT1 MHC-펩티드 4합체를 이용한 WT1 특이적 T-세포의 탐지
실시예 27에 기술된 HLA-A2 4합체는 HLA-A2에 의해 한정되고 실시예 24에서 앞서 도시된 과몰의 WT1 p37-45 펩티드(VLDFAPPGA)(사람 WT1 잔기 37-45; 서열 번호 241)와 함께 배양하였다. 상기 4합체는 실시예 24에 기술된 WT1-특이적 CD8+ T 세포 클론을 착색하는데 사용하였다. 상기 클론은 p37-45 에피토프를 특이적으로 인식하는 것으로 밝혀졌다. 이들 4합체는 과량의 p37-45 펩티드와 함께 배양하면 CD8+ T 세포 클론을 특이적으로 착색하고, 과량의 무관한 HLA-A2 펩티드(Her2/neu, WT1 p38-46, WT1 p39-47)와 함께 배양하면 CD8+ T 세포 클론을 착색하지 않았다. 따라서, WT1 p37-45-특이적 CD8+ T 세포 클론은 HLA-A2-p37-45 펩티드 MHC 4합체에 의해 특이적으로 인식된다.
이후, 실시예 24에서 밝힌 바와 같이 만들어진 WT1-특이적인 T 세포주는 HLA-A2-p37-45, 무관한 Her2/neu 또는 WT1 p37-46 4합체로 착색하였다. HLA-A2-p37-45 4합체는 상기 WT1-특이적 T 세포주의 전체 개체군중 1% 및 개폐(gated) CD8+ 개체군의 7%를 착색시키는 반면, 대조 HLA-A2-p37-46 4합체는 대조 HLA-A2-Her2/neu 4합체와 동일한 배경 수준으로 착색하였다.
이들 결과는 MHC-펩티드 4합체가 WT1 특이적 면역반응을 탐지하는 매우 민감하고 특이적인 도구임을 시사한다. 이들 펩티드-MHC 4합체는 WT1 연관된 악성종양의 조기 탐지, WT1-특이적 반응 모니터링, 미세 잔여 암세포(minimal residual disease) 모니터링에 사용할 수 있다. 4합체 착색에 의한 WT1 특이적 T-세포의 탐지는 WT1 연관된 질환으로 고생하고 재발 또는 발병의 위험이 높은 환자 개체군을 확인하는 데에도 유효한 도구이다.
실시예 29
전체 유전자 프라이밍을 이용한 HLA-A24-양성 공여자로부터 WT1-특이적 CD8+ T 세포주의 발생
본 실시예에서, HLA-A24 양성 공여자로부터 WT1-특이적 T 세포주를 발생시키는데 아데노바이러스와 우두 바이러스 전달 운반체를 사용하였다. 상기 T 세포주는 MHC 유형 I 한정되는 것으로 밝혀졌다. 이들 실험은 WT1 단백질의 면역원성을 더욱 확증하고 백신 및/또는 다른 면역치료 방법의 표적으로서 이의 용도를 뒷받침한다.
수지상 세포(DC)는 10% 사람 혈청, 50 ng/㎖ GM-CSF, 30 ng/㎖ IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4-6일동안 성장으로 정상 HLA-A24 양성 공여자의 PBMC로부터 유래된 단핵구 배양액으로부터 분화시켰다. 배양이후, DC는 5 감염 다중도(M.O.I)의 재조합 WT1-발현 우두 바이러스로 16시간동안 또는 3-10 M.O.I의 재조합 WT1-발현 아데노바이러스로 2-3일동안 감염시켰다. 우두 바이러스는 U.V. 조사로 불활화시켰다. CD8+ T-세포는 CD4, CD14, CD16, CD19, CD56+ 세포에 대한 항체를 이용한 음성 고갈(negative depletion), 이후 이들 Ab의 Fc 영역에 특이적인 자성 비드로 분리하였다.
배양액 프라이밍은 96-웰 평판에서 개시하였다. 배양액은 WT1을 발현하도록 조작된 아데노바이러스 또는 우두 바이러스로 감염된 자가 수지상 세포로 7-14일마다 재자극하였다. 4-5회 자극이후, 자가-WT1-발현 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극되면 인터페론-γ(IFN-γ)를 특이적으로 생산하는 CD8+ T-세포주가 동정되었다. 이들 세포주는 클로닝하고, Elispot 분석에서 MHC 유형 I-한정된 방식으로 WT1 형질도입된 자가 섬유아세포를 특이적으로 인식하지만 대조 형질도입된 섬유아세포는 인식하지 못함을 확인하였다.
이들 실험은 WT1 단백질이 T 세포 반응을 발생시키는데 사용될 수 있음을 보여주고, 따라서 WT1 항원의 면역원성을 더욱 확증하고 백신 및 다른 면역치료 방법의 표적으로서 이의 용도를 뒷받침한다.
실시예 30
HLA-A2 고친화성 WT1 에피토프의 확인
본 실시예에서는 자연적으로 처리된 에피토프보다 높은 친화성으로 HLA-A2에 결합할 것으로 예상되는 WT1 에피토프의 in silico 확인을 설명한다. 여기서 확인된 에피토프는 WT1 발현과 연관된 암의 치료를 위한 백신 및/또는 면역치료 전략에 유효하다.
자연적으로 처리된 펩티드보다 높은 친화성을 갖고 HLA-A2.1에 결합하는 모티프를 보유하는 자연적으로 처리된 HLA A2 한정된 WT1 에피토프 p37-45(VLDFAPPGA; 사람 WT1 잔기 37-45; 서열 번호 241; 실시예 24에서 HLA-A2에 의해 한정되는 것으로 밝혀짐)의 펩티드 유사체는 아래에 밝힌 바와 같이 작제하였다.
Rammensee 등(Hans-Georg Rammensee, Jutta Bachmann, Niels Nikolaus Emmerich, Oskar Alexander Bachor, Stefan Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics(1999) 50: 213-219) 및 Parker 등(Parker, K. C., M. A. Bednarek, and J. E. Coligan. 1994. Scheme for ranking potential HLA-A2 binding peptides based on independent binding of individual peptide side-chains. J. Immunol. 152:163.)에 의해 개발된 알고리즘에 기초한 펩티드 모티프 검색 프로그램을 이용하여 자연 p37-45보다 높은 친화성으로 HLA-A2에 결합할 것으로 예상되는 WT1 p37-45 펩티드 에피토프의 유사체를 동정하였다. 표 LII에 도시된 펩티드는 자연적으로 처리된 p37-45 펩티드와 동등하거나 이보다 높은 예상 펩티드 결합 스코어를 갖는다. 결합 스코어는 HLA-A2 유형 I 분자에 대한 예상 분리 반감기(half-time of dissolution)로부터 추론한다. 이런 분석은 Dr. Kenneth Parker kparker@atlas.niaid.nih.gov, NIAID, NIH에 의해 간행된 연구 보고서로부터 유래된 계수 표에 기초한다.
별도의 분석에서, 컴퓨터 모델링을 이용하여 p37-45 WT1 에피토프의 펩티드 에피토프 유사체를 동정하였다. HLA-A2 고유 구조의 등위는 Brookhaven 단백질 데이터베이스(pdb I.D.: 3HLA)(L. L. Walsh, "Annotated PDB File Listing", Protein Science 1:5, Diskette Appendix(1992))로부터 다운로드하였다. 상기 파일은 Expasy 웹사이트(Appel R.D., Bairoch A., Hochstrasser D.F.A new generation of information retrieval tools for biologists: the example of the ExPASy WWW.server.Trends Biochem. Sci. 19:258-260(1994))로부터 입수가능한 SwissModel(Peitsch MC(1996) ProMod and SwissModel: Internet-based tools for automated comparative protein modeling. Biochem. Soc. Trans. 24:274) 프로그램으로 조작을 위한 주형으로 사용하였다. 상기 단백질에 결합된 펩티드는 수동으로 돌연변이시켜 결합된 WT p37-45 펩티드를 산출하였다. 상기 새로운 구조는 Swiss-PdbViewer의 GROMOS96 실행으로 에너지 최소화를 3회 실시하였다: 에너지 최소화는 전체 구조에서 2회 실시하고, 이후 선별된 불량한 잔여물질에서 1회 실시하였다. 최종 평가는 상기 모델에서 전반적으로 긍정적인 에너지 상태를 보였다. Ramachandran 플랏팅(plotting)은 1개의 비-글리시닐 잔기만 멀리 금지된 영역에 위치한다는 것을 시사하였다. 이런 모델링 방법으로 동정된 펩티드는 하기 표 LⅢ에 제시한다.
이후, 앞서 기술된 2가지 방법으로 동정된 여러 펩티드는 p37-45 특이적 CTL 클론에 의해 인식되는 능력을 검사하였다(실시예 24 참조). ELISPOT 분석에서 펩티드 p37-1(서열 번호 426)과 모델-1(서열 번호 445)은 p37-45 CTL 클론에 의해 인식되는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 이들 2가지 펩티드 유사체가 자연적으로 처리된 에피토프보다 높은 친화성으로 HLA-A2에 결합하고 고유 T 세포 수용체에 의해 여전히 인식된다는 것을 암시한다.
따라서, 본 실시예에서는 자연적으로 처리된 에피토프보다 높은 친화성으로 HLA-A2에 결합할 것으로 예상되는 WT1 에피토프의 in silico 확인을 설명한다. 확인된 에피토프중 2가지를 검사하였는데, 이들은 고유 WT1 p37-45 에피토프로 발생된 CTL 클론에 의해 인식되는 것으로 밝혀졌다. 여기서 확인된 에피토프는 WT1 발현과 연관된 암의 치료를 위한 백신 및/또는 면역치료 전략에 유효하다.
실시예 31
WT1 항원의 생체내 면역원성
본 실시예에서는 마우스에서 WT1을 이용한 예방접종 전략을 평가하는 3가지 생체내 면역원성 조사를 설명한다. 3가지 전략은 1) 나신 DNA 백신 프라임(prime)과 부스트(boost); 2) 약독화된 아데노바이러스 프라임, 이후 약독화된 알파바이러스 부스트; 또는 3) 나신 DNA 프라임, 이후 아데노바이러스 부스트이다. 이들 연구에 사용된 WT1의 절단접합 변이체의 전장 cDNA는 서열 번호 381에 제시한다. 여기에 기술된 결과는 WT1 발현과 연관된 암을 치료하는 백신 전략으로서 WT1 DNA/DNA, DNA/아데노바이러스 또는 아데노바이러스/알파바이러스 프라임/부스트 요법의 용도를 뒷받침한다.
첫 번째 연구에서, C57/BL6 마우스는 2주 간격으로 WT1을 인코딩하는 100㎍ 나신 DNA로 3회 면역하였다. 마우스는 최종 면역화 2-3주후에 죽이고, CTL은 표준 크롬 방출 분석으로 평가하였다. 상기 연구에서는 이들 마우스에서 WT1 DNA 면역화가 25:1 E:T 비율에서 40% 용해로 WT1-특이적 세포독성 T 세포 반응을 유도함을 보였다.
두 번째 연구에서, HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스는 WT1을 인코딩하는 5 X 108 PFU 약독화된 아데노바이러스(실시예 20)로 1회 면역하고, 4주후 WT1을 인코딩하는 5 X 106 PFU 알파바이러스(AlphaVax)로 1회 추가 면역하였다. 마우스는 최종 면역화 2-3주후에 죽이고, CTL은 표준 크롬 방출 분석으로 평가하였다. 이의 결과는 HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스에서 WT1-특이적 CTL은 WT1-발현 바이러스 작제물로 형질도입된 수지상 세포(DC) 및 WT1 펩티드로 펄스된 DC를 특이적으로 용해시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 이러한 면역화 전략은 생체 내에서 또한 WT1-특이적 CTL을 효과적으로 유도한다.
세 번째 연구에서, C57/BL6과 HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스는 2주 간격으로 100㎍ 나신 WT1 DNA로 2회 면역하고, 3주후 WT1을 인코딩하는 7 X 108 PFU 아데노바이러스로 추가 면역하였다. 마우스는 최종 면역화 2-3주후에 죽이고, CTL은 IFN-γ ELISPOT 분석으로 평가하였다. 이의 결과는 WT1 DNA와 아데노바이러스 프라임-부스트가 HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스에서 WT1-특이적 CD8 T 세포를 발생시킨다는 것을 보여준다. CD8 양성 세포중 대략 42%는 WT-1로 형질도입된 DC로 7일 자극후 IFN-γ에 양성으로 착색되었다. C57/BL6 마우스의 결과는 이런 면역화 전략이 새로운 비장세포에서 탐지가능한 CD8 반응을 발생시킨다는 것을 보여준다. 비장세포는 전체 WT1 단백질을 아우르는 11개 아미노산에 의해 부분 중복되는 10개의 15량체 펩티드 집단으로 6시간동안 자극하였다. p121-171로 자극된 세포만 IFN-γ 착색을 보였다. p12l-171 펩티드 집단으로 자극된 이들 CD8 T 세포의 대략 1.1%는 IFN-γ에 대하여 양성으로 착색되었다. 상기 펩티드는 실시예 3에 도시된 p117-139 펩티드(서열 번호 2)를 보유하고 마우스에서 CTL, T 보조 세포, 항체 반응을 유도한다.
요약하면, 이들 결과는 본 실시예에서 검사된 3가지 면역화 전략이 생체내에서 T 세포 반응을 발생시킨다는 것을 보여준다. 따라서, 이들 연구는 WT1 단백질의 면역원성을 더욱 확증하고 WT1 발현과 연관된 암을 치료하는 백신 전략으로서 WT1 DNA/DNA, DNA/아데노바이러스 또는 아데노바이러스/알파바이러스 프라임/부스트 요법의 용도를 뒷받침한다.
실시예 32
WT1 단백질로 면역된 HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스에서 WT1+종양 성장의 감소
본 실시예에서는 WT1 백신으로 면역된 유전자도입 마우스에서 WT1+종양의 감소를 설명한다. 이들 결과는 백신 표적으로서 WT1를 더욱 확립하고 WT1 발현과 연관된 암을 치료하는 백신 전략에서 WT1의 용도를 뒷받침한다.
쥐 수지상(DC) 세포주 DC2는 WT1-LAMP 작제물(실시예 18 참조, cDNA와 단백질 서열은 각각 서열 번호 382와 및 409에 제시한다)로 안정적으로 형질도입하였다. 이후, 마우스는 2 X lO6 세포로 피하(s.c.) 또는 복강내(i.p.) 접종하였다. 이는 마우스의 80-100%에서 종양 성장을 유발하였다. 마우스에서 생체내 확립된 종양은 WT1 발현을 유지하였다. 따라서, 상기 모델은 WT1 백신 전략의 효율을 검증하는 시스템을 제공한다.
이후, 3가지 A2/Kb 마우스군은 아래와 같이 2주 간격으로 3회 면역하였다.
그룹 1: 식염수 만 s.c. (대조군, n= 10 마리 마우스)
그룹 2: MPL-SE 10㎍ 만 s.c. (대조군, n= 10 마리 마우스)
그룹 3: Ra12/WT1 단백질 100 ㎍ + 10㎍ MPL-SE s.c. (n= 9 마리 마우스)
최종 WT1 면역화 2-3주후, 마우스는 WT1을 과다발현하는 2 X 1O6 A2/Kb DC2.4 종양 세포로 접종하였다. 종양 공격후 마우스는 모니터하고, 종양 크기는 종양 자극후 최대 4주까지 주 2회 측정하였다.
이의 결과는 WT1 단백질 백신을 섭취한 군에서 종양이 성장한 마우스의 비율이 대략 100%(염수 대조) 또는 90%(MPL-SE 보조제 대조)에서 45%(WT1 단백질 면역된 군)로 감소한다는 것을 보여준다. 또한, 상기 군에서 평균 종양 체적이 대조군에서 관찰되는 1233cmm(염수 대조) 또는 753cmm(MPL-SE 보조제 대조)에서 WT1 단백질 면역된 군에서 226 cmm로 감소하였다. 조직병리학적 분석에서 예방접종된 동물에서 종양 한계가 조직구(histiocyte), 호산구, 림프구, 비만 세포, 형질구(plasmacyte)를 비롯한 숙주 면역 반응물과 혼합되는 것으로 밝혀졌다. 종합하면, 이런 결과는 WT1 단백질 면역화가 WT1로 면역된 동물에서 WT1-양성 종양의 성장을 저해하거나 지연시킨다는 것을 입증한다. 따라서, 이들 결과는 WT1 발현과 연관된 악성종양에 대한 백신으로서 WT1 단백질의 용도를 뒷받침한다.
실시예 33
자연적으로 프로세싱된 WT1 세포독성 T 세포 에피토프의 확인
본 실시예에서는 세포독성 T 세포에 의해 인식되는 WT1 단백질의 자연적으로 처리된 에피토프의 확인을 설명한다. 본 실험은 WT1 단백질의 면역원성을 더욱 확증하고 백신 및/또는 다른 면역치료 방법에 대한 표적으로서 이의 용도를 뒷받침한다. 이에 더하여, 본 실험에서는 이들 분야에 사용될 수 있는 WT1 단백질의 에피토프를 확인한다.
HLA-A2/Kb 유전자도입 마우스는 2주 간격으로 100㎍ 나신 WT1 DNA로 2회 면역하고, 3주후 WT1을 인코딩하는 107 PFU 아데노바이러스로 추가 면역하였다. 마우스는 최종 면역화 2-3주후에 죽이고, CTL은 표준 크롬 방출 분석으로 평가하였다. 앞선 실험에서 관찰된 바와 같이, WT1 DNA, 이후 아데노바이러스 부스트로 면역화는 HLA-A2 유전자도입 마우스에서 WT1-특이적 CTL 반응을 유도하였다. 어떤 에피토프가 T 세포에 의해 인식되는 지를 확인하기 위하여, CTL 세포주를 발생시키고 표준 프로토콜을 이용한 제한 희석(limiting dilution)으로 클로닝하였다. 이후, 양성 클론은 상위 20개의 예상 HLA-A2 한정된 CTL 에피토프에 상응하는 펩티드로 펄스된 DC2.4 A2/Kb 세포를 표적 세포로 하여 검사하였다. 이의 결과는 WT1 p10-18 9mer 펩티드(아미노산: ALLPAVPSL, 서열 번호 451)가 상기 CTL 클론에 의해 인식된다는 것을 보여준다. 상기 에피토프는 표 XLVI, 서열 번호 34에서 밝힌 바와 같이 에피토프인 것으로 앞서 예측되었다. 다른 실험에서, p10 펩티드에 대한 CTL 반응이 5마리의 WT1 면역된 검사 동물중 5마리에서 관찰되었다. 따라서, 본 실험은 예상 p10-18 WT1 에피토프가 자연적으로 프로세싱되고 CTL에 의해 인식된다는 것을 입증한다. 게다가, 본 실험은 WT1 단백질의 면역원성을 확증하고 WT1 과다발현과 연관된 악성종양의 치료를 위한 백신과 면역치료 전략에 사용될 수 있는 자연적으로 프로세싱된 HLA-A2-한정된 CTL 에피토프를 더욱 규정한다.
실시예 34
쌍둥이 아르기닌 전위인자(TAT) 신호 펩티드를 이용한 WT1 발현 작제물
본 실시예에서는 WT1-TAT 벡터의 작제 및 이들 벡터로부터 WT1-TAT의 발현을 설명한다. 이들 작제물은 예방접종 전략에 사용되는 WT1-TAT 분자의 발현에 유효하다.
WT-1-F(WT1 단백질의 a.a. 2-281; WT1 2-281의 cDNA와 아미노산 서열은 각각 서열 번호 460과 461에 제시한다) 및 전장 WT-1은 아래에 밝힌 바와 같이 His 태그없는 pTAT 융합체로 작제하였다. 생성 융합체의 cDNA와 아미노산 서열은 각각 서열 번호 452와 453 및 서열 번호 454와 455에 제시한다.
WT-1-F 개방 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
PDM-439 (서열 번호 456) 5' ggctccgacgtgcgggacctgaac 3' Tm 66oC
PDM-779 (서열 번호 457) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3' Tm 63oC
WT-1 전장 개방 해독틀은 아래의 프라이머로 PCR 증폭하였다:
p37 (서열 번호 458) 5' GGCTCCGACGTGCGGGACCTG 3'
p23 (서열 번호 459) 5' gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'
아래의 PCR 사이클링 조건이 이용되었다: 1㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 1μM 각 올리고, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDM FL WT-1). 반응물은 먼저 96oC에서 2분간 변성시키고, 96oC에서 20초간, 64oC에서 15초간, 72oC에서 2분간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72oC에서 4분간 최종 신장시켰다.
PCR 산물은 EcoRI으로 절단하고, Eco72I과 EcoRI 부위에서 pTAT[대장균(E. coli)에서 N-말단에 TorA 신호 펩티드로부터 유래된 쌍둥이 아르기닌 전위(TAT) 신호 펩티드를 보유하는 변형된 pET28 벡터; J. Mol. Microbiol. (2000) 2(2): 179-189; Journal of Bacteriology, Jan 2001 p6O4-610 Vol 183, No 2; Journal of Biochemistry Vol 276, March 16 2001 pp 8159-8164]에 클로닝하였다. 서열은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. WT1-TAT 단백질의 발현은 웨스턴 분석으로 확인하였다.
실시예 35
WT1의 N-말단은 상기 단백질의 주도적인 생체내 면역원성 영역이다
본 실시예에서 마우스는 MPL-SE 보조제로 제제화된 WT-1의 서로 다른 단백질 작제물(실시예 34에서 밝힌 F 절두(2-281)와 전장(2-430))로 면역하였다. 개선된 CD4 반응은 전장 단백질에 상대적인 절두된 작제물로 유도되었다. 따라서, 본 실시예는 아미노산 2 내지 281을 아우르는 WT1 단백질의 N-말단 영역이 생체내에서 WT1 단백질의 주도적인 면역원성 영역임을 입증한다.
4가지 C57/BL6 마우스군은 20㎍ WT-1 단백질: WT-1-F 또는 WT-1 전장(FL), Ra12, HIS, 또는 TAT 융합체로 피하 면역하였다. 면역화는 0, 3, 9주에 실시하고, 비장은 11주에 수거하였다. 이후, 비장세포는 배지 단독, 15량체 펩티드 "p32"(ARMFPNAPYLPSCLE, WT-1의 아미노산 125-139; 서열 번호 2에 제시된 p117-139 펩티드에서 발견됨), DC2.4-WT-1/LAMP 세포주, 또는 rRa12로 6시간동안 시험관내에서 자극하였다. 이후, CD4 세포는 세포내 인터페론-감마로 착색하고 FACS 분석으로 정량하였다. 그 다음, 이들 비장세포의 일부는 8일동안 시험관내에서 자극하고, 이후 CD4+ IFN+ 세포를 계수하였다. p32로 6시간 자극후, 절두된 N-말단 작제물 rWT1-F-TAT로 면역된 마우스에서 CD4-양성 세포는 0.33%가 세포내 IFN-감마 착색에서 양성이었다. 대조적으로, rWT1-FL-TAT로 면역된 마우스에서 CD4-양성 세포는 0.10%만 세포내 IFN-감마에 대하여 양성으로 착색되었다. 8일 자극후, rWT1-F-TAT 작제물로 면역된 마우스는 10.72%의 CD4+ 세포에서 IFN-감마 착색을 보였다. 대조적으로, 전장 WT1-TAT 작제물로 면역된 마우스는 0.24%의 CD4 양성 세포에서 세포내 IFN-감마에 대하여 양성으로 착색되었다. 이들 결과는 개선된 CD4 반응이 전장 rWT1-TAT 작제물와 비교하여 절두된 rWT1-TAT 작제물에 의해 유도된다는 것을 시사한다.
두 번째 분석에서, 비장세포는 3일동안 23량체 펩티드, p117-139(서열 번호 2; PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE, 공지된 CD4 에피토프를 보유하고 "p32"를 포괄함)로 시험관내 자극하고, 이후 상층액은 분비된 IFN-감마를 ELISA로 분석하였다. 전장 WT1 작제물로 면역된 마우스의 비장세포로부터 IFN-감마 분비는 탐지되지 않았다. 대조적으로, His 태그없는 rWT1-F로 면역된 마우스의 비장세포로부터 평균 2477 pg/㎖ IFN-감마가 탐지되었다. rWT1-F-TAT로 면역된 마우스의 비장세포로부터 평균 4658 pg/㎖ IFN-감마가 탐지되었다. 이들 데이터는 개선된 CD4 반응이 전장 단백질과 비교하여 절두된 N-말단 WT1 작제물에 의해 유도된다는 관찰 결과를 더욱 뒷받침한다.
WT1 단백질은 2가지 기능적 도메인으로 구성 전사 인자이다: N-말단에 프롤린-글루타민 풍부한 도메인 및 EGR1/Sp1 계통의 전사 인자와 상동성을 갖는 C-말단에서 4개의 징크 핑거로 구성되는 징크 핑거 도메인. WT1은 자가-단백질이다. C-말단은 다른 자가-단백질과 상동하고, 따라서 면역원성이 덜하다, 다시 말하면 좀더 높은 면역 관용(immunological tolerance)의 주체이다. 주목할 점은 C-말단내에서 4개의 징크-핑거 도메인이 EGR 계통 구성원과 상동성을 갖는다는 점이다. 본 실시예에 기술된 이런 결과는 서열 상동성과 기능적 도메인에 따라 단백질의 서로 다른 영역에서 관용이 변한다는 것을 시사한다.
요약하면, 본 실시예에 기술된 데이터는 가장 효과적인 WT1 백신이 재조합 단백질 또는 유전자-기초한 작제물로 WT1 N-말단을 포함한다는 개념을 뒷받침한다.
실시예 36
WT1의 N-말단 단편(WT-1-F: 아미노산 1-281)의 발현을 위한 바쿨로바이러스 발현 작제물 및 곤충 세포를 이용한 단백질의 대규모 생산
Kozak 공통 서열과 함께, WT-1의 N-말단 단편에 대한 cDNA는 WT1-F 플라스미드를 주형으로 하는 PCR로 수득하였다(WT-1-F: 출발 메티오닌의 하류에 클로닝된 WT1 단백질의 아미노산 2-281; WT1 2-281의 cDNA와 아미노산 서열은 각각 서열 번호 460과 461에 제시한다. 여기에 기술된 실험에서 주형으로 사용되는 pTAT 융합 작제물은 실시예 34에 기술한다. 상기 작제물의 cDNA는 서열 번호 452에 제시한다). 아래의 프라이머가 증폭에 사용되었다:
WT1F1 (서열 번호 466) 5' CGGCTCTAGAGCCGCCACCATGGGCTCCGACGTGCG
WT1RV4 (서열 번호 467) 5' CGGCTCTAGACTACTGAATGCCTCTGAAGACACCGTG
동일한 ORF + C-말단 10개 잔기 His 태그에 대한 cDNA는 WT1RV3(서열 번호 468)을 역행 프라이머(5' CGGCTCTAGACTAATGGTGATGGTGATGATGATGGTGATGATGCTGA ATGCCTCTGAAGACACCGTG)으로 이용한 점을 제외하고 앞서 밝힌 바와 유사하게 PCR로 수득하였다.
정제된 PCR 산물은 공여 플라스미드, pFastBac1의 XbaI 부위에 클로닝하였다. 재조합 공여자 플라스미드 pFBWT1-F(cDNA와 아미노산은 각각 서열 번호 463과 465에 제시한다) 및 pFBWT1-FH(1OX His 태그 보유; cDNA와 아미노산은 각각 서열 번호 462와 464에 제시한다)는 대장균 균주 DH1OBac(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 형질전환시켜 부위-특이적 전위(transposition)를 통하여 대장균(E. coli)에 재조합 백미드(bacmid)를 만들었다. 재조합 백미드는 PCR 분석으로 확증하고, 이후 Sf-9 곤충 세포에 트랜스펙션시켜 재조합 바쿨로바이러스 BVWT1-F와 BVWT1-FH를 만들었다. 상기 재조합 바이러스는 Sf-9 세포에서 높은 역가 바이러스 균주로 증폭시켰다.
High Five 곤충 세포주를 이용하여 단백질 발현 및 재조합 단백질의 대규모 생산을 위한 조건을 최적화시켰다. 단백질 발현을 위한 조건을 최적화시키기 위하여, 서로 다른 감염 다중도(MOI)의 재조합 바쿨로바이러스 BVWT1-F와 BVWT1-FH로High 5 곤충 세포 단층(monolayer)을 감염시키고, 형질도입된 세포를 서로 다른 시점에서 수거하였다. 상기 단백질의 실체는 토끼 항-WT1 다클론 항체[#942-32(799L)]을 이용한 웨스턴 블랏 분석으로 확인하였다. High 5 세포가 1.0 또는 2.0 MOI의 재조합 바이러스에 의해 감염되는 경우에, WT1-F와 WT1-FH 재조합 단백질 둘 모두 감염후 48시 또는 54시에 충분히 발현되었다.
이후, 재조합 바쿨로바이러스의 증폭 및 재조합 WT1-F와 WT1-FH 단백질의 발현은 더욱 최적화시켰다. BVWT1-F와 BVWT1-FH 둘 모두 2% 소 태아혈청과 0.5X PSF를 함유하는 ESF921 배지에서 Sf9 곤충 세포주에 증폭시켰다. 이런 증폭은 0.05 MOI로 28℃에서 4일동안 실시하였다. High 5 곤충 세포주를 이용하여 단백질 발현을 위한 조건을 최적화시켰다. High 5 곤충 세포주는 수거에 앞서 0.5, 1 또는 2 MOI의 재조합 바쿨로바이러스로 30, 48, 54 또는 72 시간동안 감염시켰다. 재조합 단백질의 실체는 WT1에 대한 특정 토끼 다클론 항체(항체 #942-32)를 이용한 웨스턴 블랏 분석 및 모세관 LC-ESI-2단계 질량 분석법(tandem mass spectrometry)으로 확인하였다. 이들 실험은 High 5 세포가 0.5-1.0 MOI의 재조합 바이러스에 의해 감염되는 경우에, WT1-F와 WT1-FH의 대규모 생산을 위한 최적 단백질 발현이 감염후 43시에 진행된다는 것을 시사한다.
요약하면, 상기 WT1 바쿨로바이러스는 WT1 발현과 연관된 악성종양의 치료를 위한 다양한 백신 전략에 사용되는 WT1 N-말단 영역의 대규모 단백질 생산에 사용될 수 있다.
실시예 37
마우스에서 재조합 TRICOM 우두와 수두 벡터를 이용한 생체내 CD4와 CD8 T 세포 반응의 유도
본 실시예에서는 마우스에서 WT1로 예방접종 전략을 평가하는 생체내 면역원성 연구를 설명한다. 이들 실험의 목적은 WT1에 대한 면역성, 특히 T 세포 면역성을 유도하는 rV-WT1/TRICOM과 rF-WT1/TRICOM의 능력을 검사하는 것이었다. 여기에 기술된 결과는 WT1 발현과 연관된 암을 치료하는 백신 전략에서 WT1을 발현하고 3가 원소의 보조자극 분자(B7-1, ICAM-1, LFA-3)를 보유하는 TRICOM 우두와 수두 벡터의 용도를 뒷받침한다.
첫 번째 연구에서, C57/BL6 마우스(군당 12마리 마우스)는 하기 표 1에 도시된 바와 같이 14일 간격의 1차, 2차, 3차 면역화로 2회 또는 3회 면역하였다. 마우스는 2차와 3차 면역화후 21일에 수거하였다. CD8과 CD4 T 세포 반응은 아래에 상세하게 밝힌 바와 같이 WT1-펩티드 활성화된 비장 세포의 IFN-γ 세포내 사이토킨 착색으로 분석하였다. CD4 T 세포 반응은 rWT1 단백질 자극된 비장 세포로부터 IFN-γ방출로 추가 분석하였다. 혈청 IgG1과 IgG2b 항체 반응은 ELISA로 분석하였다. T 세포 반응은 합동된 비장세포 배양액(4마리 마우스/군/시점)을 이용하여 평가하였다. 항체 역가는 개별 마우스에서 측정하였다(4마리 마우스/군/시점).
이들 조사에 사용된 WT1의 절단접합 변이체의 전장 cDNA는 서열 번호 381에 제시한다. 여기에 사용된 WT1-아데노바이러스는 실시예 20에서 밝힌 바와 동일하다. WT1을 발현하고 3가 원소의 보조자극 분자(B7-1, ICAM-1, LFA-3)를 보유하는 rF-WT1/TRICOM 재조합 수두와 rV-WT1/TRICOM 재조합 우두 벡터는 Therion Biologics(Cambridge, MA, USA)에서 만들었다.
T 세포 반응을 평가하기 위하여, 비장세포는 CTL과 보조 T 세포 에피토프를 보유하는 것으로 알려진 WT1 펩티드 "p32"(ARMFPNAPYLPSCLE, WT-1의 아미노산 125-139; 서열 번호 2에 제시된 p117-139 펩티드에서 발견됨)로 시험관내 자극하였다. 2차 면역화이후 21일에 p125-139 활성화된 비장세포의 IFN-??에 대한 세포내 사이토킨 착색은 rV-WT1/TRICOM(프라임)과 rF-WT1/TRICOM(부스트)으로 면역된 마우스에서 현저한 비율 WT1 반응성 CD4+와 CD8+ T 세포를 보였지만 다른 군은 현저한 WT1 특이적 T 세포 면역 반응을 보이지 않았다. DNA 군은 DNA로만 프라임하고 추가 면역하였다. 이후, 이들 군은 rWT1-Adv 3차 면역을 실시하였다.
3차 면역화이후, 단일 펩티드 #32에 대한 반응보다는 부분 중복하는 15량체 펩티드 집단에 대한 반응을 평가하였다. 펩티드 집단 #32-36에 특이적인 WT1 펩티드 CD8+과 CD4+ T-세포는 rV-WT1/TRICOM(프라임)과 rF-WT1/TRICOM(부스트X2)으로 예방접종된 마우스에서 2차 면역화이후의 반응과 유사한 수준으로 반응하는 것으로 밝혀졌다. 이에 더하여, 이들 마우스로부터 유래된 CD4+와 CD8+ T-세포는 2가지 부분 중복하는 15량체 펩티드 #57-58(펩티드 57: DNLYQMTSQLECMTWN(아미노산 224-239); 펩티드 58: MTSQLECMTWNQMNL(아미노산 224-243); 부분 중복은 WT1의 아미노산 잔기 224-243에 상응한다)내에 포함된 2번째 WT1 에피토프에 대하여 펩티드 #32보다 훨씬 낮은 수준으로 반응하는 것으로 밝혀졌다.
항체 반응은 표준 ELISA로 평가하였다. WT1에 대한 낮은 수준의 혈청 IgG2b 항체는 2차 면역화이후 21일(1:1350의 역가) 및 rWT1 + MPL-SE로 면역된 마우스에서 3차 면역화이후 21일(1:3325의 역가)에 8마리 모든 마우스에서 측정되었다. 대조적으로, 모든 다른 군에서 혈청 lgG2b 항체 역가는 <1:100이었다(표 2).
* 혈청 역가는 그룹 당 4마리 마우스의 평균이다. <50, <75 또는 <100으로 기재된 역가 또한 평균이지만 모든 경우 4마리 이하의 마우스가 검출가능한 역가를 나타냈다. ND는 어떠한 마우스에서도 항체가 검출되지 않았음을 나타낸다.
요약하면, rV-WT1/TRICOM(프라임), 이후 rF-WT1/TRICOM(부스트)으로 또는 WT1-DNA(프라임), 이후 WT1-Adeno(부스트)로 C57/BL6 마우스의 면역화는 WT1에 대한 CD8과 CD4 T 세포 반응 모두를 유도하였다. rV-WT1/TRICOM, 이후 rF-WT1/TRICOM vs. WT1-DNA, 이후 WT1-Adeno에 대한 T 세포 반응은 실험 설계 효력에서 균등하였다. 이론에 제한됨없이, rV-WT1/TRICOM의 주요 이점은 반복 추가 면역이 면역 수준을 지속적으로 증가시킬 수 있다는 점이다. 따라서, 이들 연구는 WT1 단백질의 면역원성을 더욱 확증하고 WT1 발현과 연관된 암을 치료하는 백신 전략에서 WT1 DNA/아데노바이러스 또는 rv-WT1/TRIC0M/rF-WT1/TRICOM 면역화 요법의 용도를 뒷받침한다.
실시예 38
대장균에서 WT1-F의 발현을 위한 Stumpy-WT1-F 벡터의 작제
본 실시예에서는 WT1-F 해독틀(WT1 단백질의 2-281 N-말단 영역)에 융합된 절두된 쌍둥이 아르기닌 전이인자(TAT) 신호 펩티드를 보유하는 발현 벡터의 작제를 설명한다. 상기 벡터는 WT1의 발현과 연관된 악성종양의 치료를 위한 면역화 전략에 사용되는 단일 종 절두된 TAT-WT1-F 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다.
실시예 34에서 이미 밝힌 바와 같이, TAT 신호 서열을 사용하여 다양한 WT1 벡터를 만들었다. 이들 TAT 벡터를 발현에 사용하면, 여러 형태의 단백질이 관찰되었다. 이들 형태의 N-말단 서열분석에서 발현되는 3가지 개별 단백질 각각은 TAT 펩티드의 절두인 것으로 밝혀졌다. 이들 절단은 쌍둥이 아르기닌 부위 각각에서 발생하였다. 따라서, 절두된 TAT 벡터는 TAT 신호 펩티드를 39개 아미노산에서 12개 아미노산으로 짧게 작제하여 발현동안 이들 절단 산물의 발생을 회피하였다. TAT "Stumpy" 벡터는 TAT 신호 펩티드의 첫 12개 잔기를 첫 쌍둥이 아르기닌까지 유지시켜 만들었다. 상기 벡터는 아래와 같이 작제하였다:
아래의 올리고뉴클레오티드 쌍은 결합시키고, 이후 어닐링시켰다.
쌍 1:
Stumpy 1 (서열 번호 486) 5' tatgaacaataacgatctgtttcaggc 3'
Stumpy 3 (서열 번호 487) 5' CTGAAACAGATCGTTATTGTTCA 3'
쌍 2:
Stumpy 4 (서열 번호 488) 5' aattcttggtcattcacgtggcggctcgc 3'
Stumpy 2 (서열 번호 489) 5' gagccgccacgtgaatgaccaag 3'
이후, 이들 쌍은 NdeI과 EcoRI으로 절단된 변형된 pET28 벡터인 pPDM과 함께 결찰시켰다. 생성된 플라스미드 pStumpy는 서열 번호471에 제시한다. 절두된 TAT 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 506에 제시한다. 전장 TAT 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 503에 제시하는데, 이는 서열 번호 504에 제시된 TAT 폴리펩티드의 아미노산 서열을 암호화한다.
이후, 이들 pStumpy 벡터를 사용하여 절단 산물없이 WT1의 N-말단 영역을 발현하는 Stumpy-WT1-F 벡터를 작제하였다. Stumpy-WT1-F 벡터는 아래와 같이 작제하였다:
WT1-F의 코딩 영역은 아래의 프라이머 세트로 PCR 증폭하였다:
PDM-1005 (서열 번호 484) 5' GGCTCCGACGTTCGGGACCTGAACGCACTG 3'
PDM-1004 (서열 번호 485) 5' CTGCAGAATTCATCACTGAATGCCTCTGAAG 3'
증폭 반응물은 10㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 10μM 각 프라이머, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA)를 함유하였다. 반응물은 먼저 96℃에서 2분간 변성시키고, 96℃에서 20초간, 63℃에서 15초간, 72℃에서 30초간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72℃에서 4분간 최종 신장시켰다.
PCR 산물은 EcoRI으로 절단하고, Eco72I과 EcoRI으로 절단된 pStumpy 벡터에 클로닝하였다. 상기 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 BLR(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 생성된 절두 TAT WT1-F 융합 단백질은 단일 종으로 발현되었다. pStumpy WT1-F 코딩 영역의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 469에 제시하고, 이의 아미노산 서열은 서열 번호 470에 제시한다.
실시예 39
대장균에서 발현을 위한 WT1-F GMP, WT1-G, WT1-DELTA G 벡터의 작제
본 실시예에서는 대장균에서 단백질 생산을 위하여 최적화된 WT1-F, WT1-G, WT1-Delta G 벡터의 작제를 설명한다.
TAT WT-1F DNA 서열은 대장균에서 발현에 적합하도록 Blue Heron Biotechnology(Bothel, WA)에 의해 코돈 최적화되고 합성 조작되었다. WT1-F의 이런 코돈 최적화 cDNA 서열은 서열 번호 477에 제시하는데, 이는 서열 번호 479에 제시도니 아미노산 서열을 암호화한다. 이후, 상기 서열을 보유하는 플라스미드는 NdeI과 EcoRI으로 절단하고, 대장균(E. coli)에서 발현을 위하여 NdeI과 EcoRI으로 절단된 변형된 pET28 벡터에 서브-클로닝하였다. 상기 작제물은 DNA 서열 분석으로 확인하고, 이후 발현을 위하여 BLR(DE3) pLys S 세포에 형질도입하였다. 상기 작제물은 TAT WT1-F 주형 DNA의 추적가능한 순수 합성원이다.
이후, 코돈 최적화 서열은 N-말단 영역으로부터 14개 아미노산의 프롤린 풍부한 영역을 결실시켜(서열 번호 461에 제시된 WT-1F 서열의 아미노산 54-67의 결실; 전장 WT1의 아미노산 55-68에 상응), 서열 번호 478에 제시된 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 473에 제시된 WT-1G cDNA 서열을 발생시키기 위한 PCR 주형으로 사용하였다. 이는 아래와 같이 pTAT-WT-1G 작제물을 먼저 발생시켜 달성하였다:
WT-1G의 5' 코딩 영역은 아래의 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
PDM-1007 (서열 번호 490) 5' caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc 3' Tm 76℃
PDM-1006 (서열 번호 491) 5' cataaatttgcccgggcccgcccagagagccg 3' Tm 76℃
WT-1 G영역의 3' 암호화 영역은 하기 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭되었다:
PDM-1008 (서열 번호 492) 5' cattcattcatcaaacaggagcc 3' Tm 61℃
PDM-1009 (서열 번호 493) 5' ccattaagaattcatcactgaatacc 3' Tm 60℃
WT1-G 증폭을 위한 PCR 반응물은 10㎕ 1OX Pfu 완충액, 1㎕ 1OmM dNTP, 2㎕ 10μM 각 프라이머, 83㎕ 무균수, 1.5㎕ Pfu DNA 중합효소(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA 주형을 함유하였다. 반응물은 먼저 96℃에서 2분간 변성시키고, 96℃에서 20초간, 63℃에서 15초간, 72℃에서 30초간 변성시키는 사이클을 40회 실시하였다. 이후, 72℃에서 4분간 최종 신장시켰다.
제 1 PCR 산물은 XbaI으로 절단하고, XbaI과 Eco72I으로 절단된 pPDM(변형된 pET28 벡터)에 클로닝하였다. 이후, 생성된 작제물(PTAT WT1-GA)는 SrfI과 EcoRI으로 절단하였다. 제 2 PCR 작제물은 EcoRI으로 절단하고, PTAT WT1-GA 플라스미드 작제물에 클로닝하였다. 이와 동시에, 제 1 PCR 작제물을 XbaI과 SrfI으로 절단하고 제 2 PCR 작제물을 EcoRI으로 절단하며 XbaI과 EcoRI으로 절단된 pPDM으로 클로닝함으로써 3원 결찰을 실시하였다. 생성된 pTAT-WT1-G 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 발현 숙주에 형질전환시켰다. pTAT-WT1-G의 cDNA는 서열 번호 475에 제시하는데, 이는 서열 번호 482의 아미노산 서열을 암호화한다.
앞서 밝힌 2차 방법동안 불완전 SrfI 절단으로 인하여, 14개 아미노산(WT-1F의 아미노산 55-68)이 결실되고 3개의 아미노산이 부가된 예상치 못한 형태의 WT-1G(WT-1 Delta G)가 발생되었다(서열 번호 502에 제시된 폴리펩티드 서열을 암호화하는 서열 번호 505에 제시된 WT-1 Delta G 폴리뉴클레오티드 서열). 상기 TAT WT-1 Delta G 작제물은 TAT WT-1F 작제물와 비교하여 예상치 못한 5배 과다발현을 유도하였다. pTAT-WT1 Delta G 작제물의 cDNA는 서열 번호 476에 제시하는데, 이는 서열 번호 481에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다.
pTAT-WT-1G의 발생이후, His 태그를 보유하거나 보유하지 않는 pStumpy-WT1-G와 WT1-G는 아래에 밝힌 PCR 반응에서 pTAT-WT1 G를 주형으로 하여 작제하였다:
WT1-G 영역의 코딩 영역은 아래의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭하였다:
PCR 1:
PDM-1010 (서열 번호 494) 5' ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3' Tm 68℃
PDM-1011 (서열 번호 495) 5' caaagaattcatcactgaataccgcg 3' Tm 63℃
PCR 2:
PDM-1023 (서열 번호 496) 5' gcttttggcatatgggttcggatgtacgcgatc 3' Tm 71℃
PDM-1011 (서열 번호 497) 5' caaagaattcatcactgaataccgcg 3' Tm 63℃
PCR 반응 및 증폭 조건은 서열 번호 475에 제시된 pTAT-WT1 G를 주형으로 하여 앞서 밝힌 바와 같이 실시하였다. 제 1 PCR 산물은 EcoRI으로 절단하고, EcoRI과 Eco72I으로 절단된 pPDM(프레임에 His 태그를 보유하는 변형된 pET28 벡터) 및 pStumpy(서열 번호 471에 제시된 프레임에 12개 아미노산 절두된 TAT 리더 펩티드를 보유하는 변형된 pET28 벡터)에 클로닝하였다. 제 2 PCR 산물은 NdeI과 EcoRI으로 절단하고, NdeI과 EcoRI으로 절단된 변형된 pET28 벡터(pPDM)에 클로닝하였다. 상기 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 발현 숙주에 형질전환시켰다. 생성된 작제물은 아래와 같다: His 태그를 보유하는 WT1-G의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 472에 제시하는데, 이는 서열 번호 480에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다. His 태그를 보유하지 않는 WT1-G의 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 473에 제시하는데, 이는 서열 번호 478에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다. pStumpy-WT1 G 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 474에 제시하는데, 이는 서열 번호 483에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다.
관련된 실험에서, pStumpy WT-1F GMP(코돈 최적화) 벡터는 아래와 같이 작제하였다.
WT-1F 영역의 코딩 영역은 아래의 프라이머를 이용하여 증폭하였다:
PDM-1010 (서열 번호 500) 5' ggttcggatgtacgcgatctgaacg 3' Tm 68℃
PDM-1011 (서열 번호 501) 5' caaagaattcatcactgaataccgcg 3' Tm 63℃
PCR 반응 및 증폭 조건은 pTAT-WT-1F GMP를 주형으로 하여 앞서 밝힌 바와 같이 실시하였다. PCR 산물은 EcoRI으로 절단하고, EcoRI과 Eco72I으로 절단된 실시예 38에 기술된 pStumpy에 클로닝하였다. 상기 작제물은 서열 분석으로 확인하고, 이후 발현 숙주에 형질전환시켰다. pStumpy WT-1F GMP의 폴리뉴클레오티드 서열은 서열 번호 498에 제시하는데, 이는 서열 번호 499에 제시된 아미노산 서열을 암호화한다.
요약하면, 여기에 기술된 발현 벡터는 WT1의 발현과 연관된 악성종양의 치료를 위한 백신 전략에 사용되는 WT1, 절두된 WT1, WT1 융합 단백질의 최적 발현과 생산에 사용될 수 있다.
본원에서 본 발명의 특정 구체예를 설명 목적으로 기술하긴 했지만, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
연방 정부에 의해 후원된 연구 또는 개발에 관한 진술서
본 발명은 NIH SBIR Phase I 허여 번호 IR43 CA81752-01A1 하에 정부 보조 로 일부 만들어졌다. 따라서, 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 가질 수 있다.
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<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 1
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 2
<211> 23
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 2
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
<210> 3
<211> 23
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
<210> 4
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 4
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
1 5 10 15
Trp Thr Glu
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 5
gagagtcaga cttgaaagca gt 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 6
ctgagcctca gcaaatgggc 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 7
gagcatgcat gggctccgac gtgcggg 27
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 8
ggggtaccca ctgaacggtc cccga 25
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 9
tccgagccgc acctcatg 18
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 10
gcctgggatg ctggactg 18
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 11
gagcatgcga tgggttccga cgtgcgg 27
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 12
ggggtacctc aaagcgccac gtggagttt 29
<210> 13
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 14
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
1 5 10 15
Trp Thr Glu
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 15
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
1 5 10 15
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
1 5 10 15
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
1 5 10
<210> 18
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 18
Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
1 5 10
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 19
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His
1 5 10 15
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21
cccaggctgc aataagagat a 21
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22
atgttgtgat ggcggaccaa t 21
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 23
gtggggcgcc ccaggcacca 20
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 24
gtccttaatg ctacgcacga tttc 24
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<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 25
ggcatctgag accagtgaga a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 26
gctgtcccac ttacagatgc a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> Homo sapien
<400> 27
tcaaagcgcc agctggagtt t 21
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 28
Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 29
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 30
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys Trp
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
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<212> PRT
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<211> 9
<212> PRT
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Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
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Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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<400> 46
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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<400> 47
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 48
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
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<211> 9
<212> PRT
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Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys
1 5
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Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 52
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 53
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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<400> 55
Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe
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<211> 9
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Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
1 5
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<211> 9
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Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
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Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
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Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
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Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
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1 5
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<213> Homo sapien
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Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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1 5
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1 5
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<400> 246
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala
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Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
1 5
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Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
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<211> 9
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Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
1 5
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Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
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Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
1 5
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<211> 9
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Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
1 5
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Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
1 5
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<211> 9
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Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
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Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5
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<211> 9
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1 5
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<211> 9
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Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
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<211> 9
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Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
1 5
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<211> 9
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Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
1 5
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<211> 9
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Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
1 5
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<211> 9
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1 5
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<211> 9
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<211> 9
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Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
1 5
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<211> 9
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Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
1 5
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<211> 9
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Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
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<211> 9
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Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala
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<211> 9
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His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
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His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
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<211> 9
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<400> 275
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
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<211> 9
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Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
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<211> 9
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1 5
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<211> 9
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1 5
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Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met
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Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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1 5
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<211> 9
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<400> 287
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1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 288
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 289
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1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 290
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 294
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
1 5
<210> 295
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 295
Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 297
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 298
Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
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<400> 300
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
1 5
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<211> 9
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<211> 9
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Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
1 5
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<211> 9
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Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
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<211> 9
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Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
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<211> 9
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1 5
<210> 310
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 310
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 311
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 311
Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 312
His Ala Ala Gln Phe
1 5
<210> 313
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 313
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
20 25 30
<210> 314
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 314
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
1 5 10 15
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser
20 25 30
<210> 315
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 315
Arg Tyr Phe Lys
1
<210> 316
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 316
Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
1 5 10
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 317
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
1 5 10 15
His Thr Gly Lys Thr Ser
20
<210> 318
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 318
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
1 5 10 15
Met His Gln Arg Asn
20
<210> 319
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 319
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 320
<211> 449
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 320
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala
435 440 445
Leu
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 321
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 322
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
1 5
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 323
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 324
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
1 5
<210> 325
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 325
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 326
Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
1 5
<210> 327
<211> 1029
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 327
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggcaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc 540
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc aggatgtgcg acgtgtgcct 600
ggagtagccc cgactcttgt acggtcggca tctgagacca gtgagaaacg ccccttcatg 660
tgtgcttacc caggctgcaa taagagatat tttaagctgt cccacttaca gatgcacagc 720
aggaagcaca ctggtgagaa accataccag tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt 780
tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa aggagacata caggtgtgaa accattccag 840
tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg tccgaccacc tgaagaccca caccaggact 900
catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg 960
tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa actccagctg 1020
gcgctttga 1029
<210> 328
<211> 1233
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 328
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggggct ccgacgttcg tgacctgaac gcactgctgc cggcagttcc gtccctgggt 540
ggtggtggtg gttgcgcact gccggttagc ggtgcagcac agtgggctcc ggttctggac 600
ttcgcaccgc cgggtgcatc cgcatacggt tccctgggtg gtccggcacc gccgccggca 660
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgcac tccttcatca aacaggaacc gagctggggt 720
ggtgcagaac cgcacgaaga acagtgcctg agcgcattca ccgttcactt ctccggccag 780
ttcactggca cagccggagc ctgtcgctac gggcccttcg gtcctcctcc gcccagccag 840
gcgtcatccg gccaggccag gatgtttcct aacgcgccct acctgcccag ctgcctcgag 900
agccagcccg ctattcgcaa tcagggttac agcacggtca ccttcgacgg gacgcccagc 960
tacggtcaca cgccctcgca ccatgcggcg cagttcccca accactcatt caagcatgag 1020
gatcccatgg gccagcaggg ctcgctgggt gagcagcagt actcggtgcc gcccccggtc 1080
tatggctgcc acacccccac cgacagctgc accggcagcc aggctttgct gctgaggacg 1140
ccctacagca gtgacaattt ataccaaatg acatcccagc ttgaatgcat gacctggaat 1200
cagatgaact taggagccac cttaaagggc tga 1233
<210> 329
<211> 1776
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 329
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggatgg gctccgacgt tcgtgacctg aacgcactgc tgccggcagt tccgtccctg 540
ggtggtggtg gtggttgcgc actgccggtt agcggtgcag cacagtgggc tccggttctg 600
gacttcgcac cgccgggtgc atccgcatac ggttccctgg gtggtccggc accgccgccg 660
gcaccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg cactccttca tcaaacagga accgagctgg 720
ggtggtgcag aaccgcacga agaacagtgc ctgagcgcat tcaccgttca cttctccggc 780
cagttcactg gcacagccgg agcctgtcgc tacgggccct tcggtcctcc tccgcccagc 840
caggcgtcat ccggccaggc caggatgttt cctaacgcgc cctacctgcc cagctgcctc 900
gagagccagc ccgctattcg caatcagggt tacagcacgg tcaccttcga cgggacgccc 960
agctacggtc acacgccctc gcaccatgcg gcgcagttcc ccaaccactc attcaagcat 1020
gaggatccca tgggccagca gggctcgctg ggtgagcagc agtactcggt gccgcccccg 1080
gtctatggct gccacacccc caccgacagc tgcaccggca gccaggcttt gctgctgagg 1140
acgccctaca gcagtgacaa tttataccaa atgacatccc agcttgaatg catgacctgg 1200
aatcagatga acttaggagc caccttaaag ggccacagca cagggtacga gagcgataac 1260
cacacaacgc ccatcctctg cggagcccaa tacagaatac acacgcacgg tgtcttcaga 1320
ggcattcagg atgtgcgacg tgtgcctgga gtagccccga ctcttgtacg gtcggcatct 1380
gagaccagtg agaaacgccc cttcatgtgt gcttacccag gctgcaataa gagatatttt 1440
aagctgtccc acttacagat gcacagcagg aagcacactg gtgagaaacc ataccagtgt 1500
gacttcaagg actgtgaacg aaggtttttt cgttcagacc agctcaaaag acaccaaagg 1560
agacatacag gtgtgaaacc attccagtgt aaaacttgtc agcgaaagtt ctcccggtcc 1620
gaccacctga agacccacac caggactcat acaggtgaaa agcccttcag ctgtcggtgg 1680
ccaagttgtc agaaaaagtt tgcccggtca gatgaattag tccgccatca caacatgcat 1740
cagagaaaca tgaccaaact ccagctggcg ctttga 1776
<210> 330
<211> 771
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 330
atgcagcatc accaccatca ccacggctcc gacgttcgtg acctgaacgc actgctgccg 60
gcagttccgt ccctgggtgg tggtggtggt tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag 120
tgggctccgg ttctggactt cgcaccgccg ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt 180
ccggcaccgc cgccggcacc gccgccgccg ccgccgccgc cgccgcactc cttcatcaaa 240
caggaaccga gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattcacc 300
gttcacttct ccggccagtt cactggcaca gccggagcct gtcgctacgg gcccttcggt 360
cctcctccgc ccagccaggc gtcatccggc caggccagga tgtttcctaa cgcgccctac 420
ctgcccagct gcctcgagag ccagcccgct attcgcaatc agggttacag cacggtcacc 480
ttcgacggga cgcccagcta cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttccccaac 540
cactcattca agcatgagga tcccatgggc cagcagggct cgctgggtga gcagcagtac 600
tcggtgccgc ccccggtcta tggctgccac acccccaccg acagctgcac cggcagccag 660
gctttgctgc tgaggacgcc ctacagcagt gacaatttat accaaatgac atcccagctt 720
gaatgcatga cctggaatca gatgaactta ggagccacct taaagggctg a 771
<210> 331
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 331
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc acagggtacg agagcgataa ccacacaacg 60
cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag 120
gatgtgcgac gtgtgcctgg agtagccccg actcttgtac ggtcggcatc tgagaccagt 180
gagaaacgcc ccttcatgtg tgcttaccca ggctgcaata agagatattt taagctgtcc 240
cacttacaga tgcacagcag gaagcacact ggtgagaaac cataccagtg tgacttcaag 300
gactgtgaac gaaggttttt tcgttcagac cagctcaaaa gacaccaaag gagacataca 360
ggtgtgaaac cattccagtg taaaacttgt cagcgaaagt tctcccggtc cgaccacctg 420
aagacccaca ccaggactca tacaggtgaa aagcccttca gctgtcggtg gccaagttgt 480
cagaaaaagt ttgcccggtc agatgaatta gtccgccatc acaacatgca tcagagaaac 540
atgaccaaac tccagctggc gctttga 567
<210> 332
<211> 342
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 332
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
165 170 175
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
180 185 190
Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg
195 200 205
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro
210 215 220
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser
225 230 235 240
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys
245 250 255
Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
260 265 270
His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe
275 280 285
Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu
290 295 300
Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg
305 310 315 320
Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr
325 330 335
Lys Leu Gln Leu Ala Leu
340
<210> 333
<211> 410
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 333
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
165 170 175
Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
180 185 190
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
195 200 205
Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro
210 215 220
Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly
225 230 235 240
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His
245 250 255
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro
260 265 270
Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
275 280 285
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala
290 295 300
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser
305 310 315 320
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser
325 330 335
Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln
340 345 350
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp
355 360 365
Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser
370 375 380
Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn
385 390 395 400
Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
405 410
<210> 334
<211> 591
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 334
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala
165 170 175
Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly
180 185 190
Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
195 200 205
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
225 230 235 240
Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
245 250 255
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
260 265 270
Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
275 280 285
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro
290 295 300
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro
305 310 315 320
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
325 330 335
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
340 345 350
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
355 360 365
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
370 375 380
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
385 390 395 400
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr
405 410 415
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
420 425 430
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
435 440 445
Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu
450 455 460
Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
465 470 475 480
Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
485 490 495
Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser
500 505 510
Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe
515 520 525
Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys
530 535 540
Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp
545 550 555 560
Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His
565 570 575
His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
580 585 590
<210> 335
<211> 256
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 335
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
85 90 95
Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
100 105 110
Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser
115 120 125
Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
130 135 140
Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr
145 150 155 160
Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala
165 170 175
Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln
180 185 190
Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly
195 200 205
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
210 215 220
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
225 230 235 240
Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
245 250 255
<210> 336
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 336
Met Gln His His His His His His His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
5 10 15
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
20 25 30
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
35 40 45
Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro
50 55 60
Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser
65 70 75 80
His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln
85 90 95
Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu
100 105 110
Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys
115 120 125
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr
130 135 140
Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys
145 150 155 160
Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
165 170 175
His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
180 185
<210> 337
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 337
atgcagcatc accaccatca ccacggttcc gacgtgcggg acctgaacgc actgctgccg 60
gcagttccat ccctgggtgg cggtggaggc tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag 120
tgggctccag ttctggactt cgcaccgcct ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt 180
ccagcacctc cgcccgcaac gcccccaccg cctccaccgc ccccgcactc cttcatcaaa 240
caggaaccta gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattctga 300
gaattctgca gatatccatc acac 324
<210> 338
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 338
atgcagcatc accaccatca ccaccacgaa gaacagtgcc tgagcgcatt caccgttcac 60
ttctccggcc agttcactgg cacagccgga gcctgtcgct acgggccctt cggtcctcct 120
ccgcccagcc aggcgtcatc cggccaggcc aggatgtttc ctaacgcgcc ctacctgccc 180
agctgcctcg agagccagcc cgctattcgc aatcagggtt acagcacggt caccttcgac 240
gggacgccca gctacggtca cacgccctcg caccatgcgg cgcagttccc caaccactca 300
ttcaagcatg aggatcccat gggccagcag ggctcgctgg gtgagcagca gtactcggtg 360
ccgcccccgg tctatggctg ccacaccccc accgacagct gcaccggcag ccaggctttg 420
ctgctgagga cgccctacag cagtgacaat ttatactgat ga 462
<210> 339
<211> 405
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 339
atgcagcatc accaccatca ccaccaggct ttgctgctga ggacgcccta cagcagtgac 60
aatttatacc aaatgacatc ccagcttgaa tgcatgacct ggaatcagat gaacttagga 120
gccaccttaa agggccacag cacagggtac gagagcgata accacacaac gcccatcctc 180
tgcggagccc aatacagaat acacacgcac ggtgtcttca gaggcattca ggatgtgcga 240
cgtgtgcctg gagtagcccc gactcttgta cggtcggcat ctgagaccag tgagaaacgc 300
cccttcatgt gtgcttaccc aggctgcaat aagagatatt ttaagctgtc ccacttacag 360
atgcacagca ggaagcacac tggtgagaaa ccataccagt gatga 405
<210> 340
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 340
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc aggaagcaca ctggtgagaa accataccag 60
tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa 120
aggagacata caggtgtgaa accattccag tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg 180
tccgaccacc tgaagaccca caccaggact catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg 240
tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg 300
catcagagaa acatgaccaa actccagctg gcgctttga 339
<210> 341
<211> 1110
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 341
atgcagcatc accaccatca ccaccactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 60
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 120
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 180
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 240
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 300
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 360
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 420
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 480
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 540
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 600
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 660
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc 720
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg 780
tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc 840
aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat 900
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac 960
ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt 1020
tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga 1080
aacatgacca aactccagct ggcgctttga 1110
<210> 342
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 342
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
85 90 95
Ser Ala Phe
<210> 343
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 343
Met Gln His His His His His His His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
5 10 15
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
20 25 30
Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly
35 40 45
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
50 55 60
Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp
65 70 75 80
Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
85 90 95
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
100 105 110
Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His
115 120 125
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
130 135 140
Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145 150
<210> 344
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 344
Met Gln His His His His His His Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
5 10 15
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
20 25 30
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
35 40 45
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
50 55 60
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
65 70 75 80
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
85 90 95
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
100 105 110
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly
115 120 125
Glu Lys Pro Tyr Gln
130
<210> 345
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 345
Met Gln His His His His His His His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu
5 10 15
Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg
20 25 30
Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro
35 40 45
Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu
50 55 60
Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
65 70 75 80
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg
85 90 95
His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
100 105 110
<210> 346
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 346
Met Gln His His His His His His His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
5 10 15
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
20 25 30
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
35 40 45
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
50 55 60
Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser
65 70 75 80
Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly
85 90 95
Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro
100 105 110
Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
115 120 125
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
130 135 140
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
165 170 175
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
180 185 190
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
195 200 205
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
210 215 220
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
225 230 235 240
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
245 250 255
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly
260 265 270
Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe
275 280 285
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
290 295 300
Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
305 310 315 320
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys
325 330 335
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
340 345 350
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
355 360 365
Leu
<210> 347
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 347
ggctccgacg tgcgggacct g 21
<210> 348
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 348
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 349
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 349
ggctccgacg tgcgggacct g 21
<210> 350
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 350
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 351
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 351
cacagcacag ggtacgagag c 21
<210> 352
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 352
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 353
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 353
cacgaagaac agtgcctgag cgcattcac 29
<210> 354
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 354
ccggcgaatt catcagtata aattgtcact gc 32
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 355
caggctttgc tgctgaggac gccc 24
<210> 356
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 356
cacggagaat tcatcactgg tatggtttct cacc 34
<210> 357
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 357
cacagcagga agcacactgg tgagaaac 28
<210> 358
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 358
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc 30
<210> 359
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 359
cactccttca tcaaacagga ac 22
<210> 360
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 360
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc 30
<210> 361
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 361
ggttccgacg tgcgggacct gaacgcactg ctg 33
<210> 362
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 362
ctgccggcag cagtgcgttc aggtcccgca cgtcggaacc 40
<210> 363
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 363
ccggcagttc catccctggg tggcggtgga ggctg 35
<210> 364
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 364
cggcagtgcg cagcctccac cgccacccag ggatggaa 38
<210> 365
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 365
cgcactgccg gttagcggtg cagcacagtg ggctc 35
<210> 366
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 366
cagaactgga gcccactgtg ctgcaccgct aac 33
<210> 367
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 367
cagttctgga cttcgcaccg cctggtgcat ccgcatac 38
<210> 368
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 368
cagggaaccg tatgcggatg caccaggcgg tgcgaagtc 39
<210> 369
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 369
ggttccctgg gtggtccagc acctccgccc gcaacgcc 38
<210> 370
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 370
ggcggtgggg gcgttgcggg cggaggtgct ggaccacc 38
<210> 371
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 371
cccaccgcct ccaccgcccc cgcactcctt catcaaacag 40
<210> 372
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 372
ctaggttcct gtttgatgaa ggagtgcggg ggcggtgga 39
<210> 373
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 373
gaacctagct ggggtggtgc agaaccgcac gaagaaca 38
<210> 374
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 374
ctcaggcact gttcttcgtg cggttctgca ccaccccag 39
<210> 375
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 375
gtgcctgagc gcattctgag aattctgcag at 32
<210> 376
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 376
gtgtgatgga tatctgcaga attctcagaa tgcg 34
<210> 377
<211> 1292
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> 253,256,517,518,520,521,522,743,753,754,
758
<223> n = A,T,C or G
<400> 377
atgggctccg acgttcgtga cctgagcgcg ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtgat 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 120
gcaccgccgg gtgcatccgc acacggtccc ctgggtggtc cggcgccgcc gtcggcaccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac agggaccgag ctggggtggc 240
gcggaactgc ackaakaaca gtacctgagc gcgttcaccg ttcactcctc cggtcaggtt 300
cactggcacg gccggggcct gtcgctacgg gcccctcggc ccccctccgc ccagccaggc 360
gtcatccggc caggccagga tgtctcctag cgcgccctgc ctgcccagcc gcctcgagag 420
ccagcccgct acccgcaatc ggggctacag cacggtcacc ttcgacgggg cgtccggcta 480
cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttctcsmar yyactcgtta ggcgtgagga 540
tcccatgggc cagcagggtc cgctgggtga gcagcagtgc tcggcgccgc ccccggcctg 600
tggccgccac acccccgccg acagctgcgc cggcagccag gctttgctgc tgagggcgcc 660
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gatgagcctc ggggccgcct tamcgggcca cakyacargg tacgagagcg atgatcacac 780
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tcagggtgtg cgccgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg catctgaggc 900
cagtgaggaa cgccccctca tgtgtgctta cccaggctgc aataggaggt atctgaagct 960
gccccgctta cagatgcacg gtaggaagca cgctggtgag agaccatacc agtgtgactt 1020
caaggactgt ggacggaggt ttttctgctc agaccggctc aaaagacacc aggggaggca 1080
tacagatgtg aagccattcc agcgtaagac ctgtcagcga gggttctccc ggcccaacca 1140
cctgaagacc cacgccagga ctcatgcagg tgaaaagccc cccagctgtc ggtggtcaga 1200
ttgtcagaga aagcctgccc ggtcaagtga gttggtccgc catcgcgaca tgcatcagag 1260
gggcatgacc gaactccagc tggcgctttg aa 1292
<210> 378
<211> 1291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 378
atgggctccg acgttcgtga cctaaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cccgggtggt 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcaacacagt gggctccggt tctggacttc 120
gtaccgccgg gtgcgcctgt atgcggttcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccagcgccg 180
ccgccgctgc cgccgccgcc gtcgcactcc ttcaccaaac aggaaccgag ttggggtggt 240
acagagccgc acgcaggaca gggccggagc gcactcgtcg ctcactcctc cggccagttc 300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcatccaa gcatgaggac 540
cccatgggcc agcagggctc gccgggtgag cagcagtact cggcgccgcc cccggtctgc 600
ggctgccgca cccccaccgg cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gagggcgccc 660
tacagcggtg gcgatctaca ccaaacgaca tcccagcttg gacacatggc ctggaatcag 720
acgaacttag gagccacctt aaagggccac ggcacagggt acgagagcga tgaccacaca 780
acgcccatcc tctgcggaac ccagtacagg atacgcgcgc gcggcgtcct ccggggtact 840
caggatgtgc ggtgtgtgcc tggggtggcc ccgactcttg tgcggtcggc atctgagacc 900
agtgagaagc gccccctcat gtgtgcctac ccaggctgca ataagagaca ctttaagccg 960
tcccgcttgc gggtgcgcgg cagggagcgc actggtgaga aaccatacca gcgcgacttc 1020
aaggaccgtg gacgagggct tctccgtcca gaccagctca aaaggcacca gagggggcat 1080
acaggtgtga aacctctcca gtgtgaagct tgacggcgga ggcccccccg acccggccac 1140
ctgaaggtcc acaccaggac ccatacaggt ggagagccct tcagttgtcg gtggccaagt 1200
tgtcaggaga agtctgcccg gccagatgaa tcagcccgcc gtcataacat gcatcagaga 1260
aacatgacca aactccagct ggcgctttga a 1291
<210> 379
<211> 1281
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 379
atgggctccg acgttcgtga cctgagtgca ttgctaccga cggccccgtc cctgggtggt 60
ggcggtgact gcacactgcc ggttagcggt acagcacagt gggctccggt cccggcctcc 120
gcaccgccgg gcgcatccgc atacgattcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccggcgccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc tgcggcgaac aggggccgag ctggggtggt 240
gcagaaccgc gcgaggggca atgcctgagt gcgcccgccg tccgcttctc cggccggttc 300
accggcacag tcggagcctg tcgctatggg cccctcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
ccatccggcc agaccaggat gttgcccagc gcgccctatc tgtcgagttg cctcaggagc 420
cggtccgcta tccgtagtca gggtcgcagc acggcacctt cagcggggcg cccagctatg 480
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ccagcagggc tcgctgggtg agcagcagta ctcggtgccg cccccggtct atggctgcca 600
cacccccacc gacagctgca ccggcagcca ggctttgctg ctgaggacgc cctacagcag 660
tgacaattta taccaaatga catcccagct tgaatgcatg acctggaatc agatgaactt 720
aggagccacc ttaaagggcc acagcacagg gtacgagagc gataaccaca caacgcccat 780
cctctgcgga gcccaataca gaatacacac gcacggtgtc ttcagaggca ttcaggatgt 840
gcgacgtgtg cctggagtag ccccgactct tgtacggtag cacctgagac cagtgagaac 900
gccccttggt gtgtgttacc ggggctgcag taaggggtat tttaagccgt cccacttacg 960
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acgagggcct ctccgttcgg gaccagccca agggacacca aaggagacat acaggtacgc 1080
aaccactcca gtgtaaggct tgtcagcgaa ggttcccccg gtccgaccac ctgagggccc 1140
acgccagggc ccacacgggt gggaagcccc tcagctgccg gtggccaagc tgccagagag 1200
ggttcgccca gtcagacgaa ttagtccgtc atcacaacat gtatcagcga aacatgacta 1260
aactccagct ggcgctttga a 1281
<210> 380
<211> 3020
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 380
gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt ccgctccccc 60
acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga gccgggacgg 120
cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc ctcttgctgc 180
aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc cgctccgggc 240
ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc atctgggcca 300
agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc cgcggggcgt 360
ccgggtctga gcctcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg ctgctgcccg 420
ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc gcggcgcagt 480
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aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc gccttcactg 660
tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc 720
ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc 780
tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct 840
tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc 900
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ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgtct 1260
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ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt gaaaagccct 1620
tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc 1680
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tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa ctgctttcaa gtctgactct 1800
ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc ttcatccaac ttccaagaca 1860
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tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac aatgtctggt tagttaaaag 1980
cccattgcca tttggtctgg attttctact gtaagaagag ccatagctga tcatgtcccc 2040
ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta ttgtaccatt 2100
ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat gtaaactttg 2160
tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa tcagagagca aggcatcggg 2220
ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc taacctggaa agcaggatgt 2280
agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc agctgaagaa agaatcagaa 2340
ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac cattcagtta attcaatgtg 2400
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tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg tacatacctc cttgcacaaa 2520
tggaggggaa ttcattttca tcactgggac tgtccttagt gtataaaaac catgctggta 2580
tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga aaatagggga tggtccagga 2640
tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct ttgggtctac aagtatatgt 2700
gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt aaagatggtc gtgtgtgtgt 2760
gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgttgtgttt tgttttttaa gggagggaat ttattattta 2820
ccgttgcttg aaattactgt gtaaatatat gtctgataat gatttgctct ttgacaacta 2880
aaattaggac tgtataagta ctagatgcat cactgggtgt tgatcttaca agatattgat 2940
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aaggaaaaaa aaaaaaaaaa 3020
<210> 381
<211> 1291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 381
atgggctccg acgttcgtga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 120
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg 180
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atggcggccc ccggcgcccg gcggtcgctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 384
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 385
atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctggaagt ggagcccagt 60
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caccatgcgg cgcagttccc caaccactca ttcaagcatg aggatcccat gggccagcag 780
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accttaaagg gccacagcac agggtacgag agcgataacc acacaacgcc catcctctgc 1020
ggagcccaat acagaataca cacgcacggt gtcttcagag gcattcagga tgtgcgacgt 1080
gtgcctggag tagccccgac tcttgtacgg tcggcatctg agaccagtga gaaacgcccc 1140
ttcatgtgtg cttacccagg ctgcaataag agatatttta agctgtccca cttacagatg 1200
cacagcagga agcacactgg tgagaaacca taccagtgtg acttcaagga ctgtgaacga 1260
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gcggcgcagt tccccaacca ctcattcaag catgaggatc ccatgggcca gcagggctcg 360
ctgggtgagc agcagtactc ggtgccgccc ccggtctatg gctgccacac ccccaccgac 420
agctgcaccg gcagccaggc tttgctgctg aggacgccct acagcagtga caatttatac 480
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<211> 1089
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 387
atgcactcct tcatcaaaca ggaaccgagc tggggtggtg cagaaccgca cgaagaacag 60
tgcctgagcg cattcaccgt tcacttctcc ggccagttca ctggcacagc cggagcctgt 120
cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt catccggcca ggccaggatg 180
tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc agcccgctat tcgcaatcag 240
ggttacagca cggtcacctt cgacgggacg cccagctacg gtcacacgcc ctcgcaccat 300
gcggcgcagt tccccaacca ctcattcaag catgaggatc ccatgggcca gcagggctcg 360
ctgggtgagc agcagtactc ggtgccgccc ccggtctatg gctgccacac ccccaccgac 420
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caaatgacat cccagcttga atgcatgacc tggaatcaga tgaacttagg agccacctta 540
aagggccaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc 600
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc aggatgtgcg acgtgtgcct 660
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tgtgcttacc caggctgcaa taagagatat tttaagctgt cccacttaca gatgcacagc 780
aggaagcaca ctggtgagaa accataccag tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt 840
tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa aggagacata caggtgtgaa accattccag 900
tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg tccgaccacc tgaagaccca caccaggact 960
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tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa actccagctg 1080
gcgctttga 1089
<210> 388
<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 388
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
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<210> 389
<211> 1263
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 389
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
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tga 1263
<210> 390
<211> 1707
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 390
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atcaagcttc ccaccgttca tatcgggcct 120
accgccttcc tcggcttggg tgttgtcgac aacaacggca acggcgcacg agtccaacgc 180
gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg 240
gtcgacggcg ctccgatcaa ctcggccacc gcgatggcgg acgcgcttaa cgggcatcat 300
cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac 360
gtgacattgg ccgagggacc cccggccgaa ttcccgctgg tgccgcgcgg cagcccgatg 420
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt 480
ggtggttgcg cactgccggt tagcggtgca gcacagtggg ctccggttct ggacttcgca 540
ccgccgggtg catccgcata cggttccctg ggtggtccgg caccgccgcc ggcaccgccg 600
ccgccgccgc cgccgccgcc gcactccttc atcaaacagg aaccgagctg gggtggtgca 660
gaaccgcacg aagaacagtg cctgagcgca ttcaccgttc acttctccgg ccagttcact 720
ggcacagccg gagcctgtcg ctacgggccc ttcggtcctc ctccgcccag ccaggcgtca 780
tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag 840
cccgctattc gcaatcaggg ttacagcacg gtcaccttcg acgggacgcc cagctacggt 900
cacacgccct cgcaccatgc ggcgcagttc cccaaccact cattcaagca tgaggatccc 960
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tgccacaccc ccaccgacag ctgcaccggc agccaggctt tgctgctgag gacgccctac 1080
agcagtgaca atttatacca aatgacatcc cagcttgaat gcatgacctg gaatcagatg 1140
aacttaggag ccaccttaaa gggccacagc acagggtacg agagcgataa ccacacaacg 1200
cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag 1260
gatgtgcgac gtgtgcctgg agtagccccg actcttgtac ggtcggcatc tgagaccagt 1320
gagaaacgcc ccttcatgtg tgcttaccca ggctgcaata agagatattt taagctgtcc 1380
cacttacaga tgcacagcag gaagcacact ggtgagaaac cataccagtg tgacttcaag 1440
gactgtgaac gaaggttttt tcgttcagac cagctcaaaa gacaccaaag gagacataca 1500
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aagacccaca ccaggactca tacaggtgaa aagcccttca gctgtcggtg gccaagttgt 1620
cagaaaaagt ttgcccggtc agatgaatta gtccgccatc acaacatgca tcagagaaac 1680
atgaccaaac tccagctggc gctttga 1707
<210> 391
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 391
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
115 120 125
Ala Glu Phe His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
130 135 140
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser
145 150 155 160
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly
165 170 175
Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
180 185 190
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
195 200 205
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly
210 215 220
His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
225 230 235 240
His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
245 250 255
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys
260 265 270
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
275 280 285
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Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
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Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
325 330 335
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
340
<210> 392
<211> 568
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 392
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
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Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
195 200 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
210 215 220
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
225 230 235 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
245 250 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
260 265 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
275 280 285
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290 295 300
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
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Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
325 330 335
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355 360 365
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420 425 430
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450 455 460
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Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
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545 550 555 560
Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
565
<210> 393
<211> 420
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 393
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
115 120 125
Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Met Gly Ser Asp Val
130 135 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
180 185 190
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
195 200 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
210 215 220
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
225 230 235 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
245 250 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
260 265 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
275 280 285
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
290 295 300
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
385 390 395 400
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
405 410 415
Arg Gly Ile Gln
420
<210> 394
<211> 362
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 394
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
5 10 15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
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Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
35 40 45
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130 135 140
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
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Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
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Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met
225 230 235 240
Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
245 250 255
Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp
260 265 270
Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg
275 280 285
His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys
290 295 300
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
305 310 315 320
His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys
325 330 335
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340 345 350
Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
355 360
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<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 395
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
5 10 15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
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Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
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Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
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100 105 110
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
115 120 125
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145 150 155 160
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
165 170 175
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
180 185 190
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
195 200 205
Val Phe Arg Gly Ile Gln
210
<210> 396
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 396
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<210> 397
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 397
cgcgtgaatt catcactgaa tgcctctgaa g 31
<210> 398
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 398
cgataagcat atgacggccg cgtccgataa c 31
<210> 399
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 399
cgcgtgaatt catcactgaa tgcctctgaa g 31
<210> 400
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 400
cgataagcat atgacggccg cgtccgataa c 31
<210> 401
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 401
gtctgcagcg gccgctcaaa gcgccagc 28
<210> 402
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 402
gacgaaagca tatgcactcc ttcatcaaac 30
<210> 403
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 403
gtctgcagcg gccgctcaaa gcgccagc 28
<210> 404
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 404
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
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His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
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Leu
<210> 405
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 405
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1 5 10 15
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Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Cys
35 40 45
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65 70 75 80
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130 135 140
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165 170 175
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<220>
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<400> 432
Tyr Leu Asp Lys Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 433
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 433
Phe Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 434
Lys Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
1 5
<210> 435
<211> 9
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 435
Tyr Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Val
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<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 436
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<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 437
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<220>
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<400> 438
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<400> 439
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<400> 440
Lys Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Val
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<220>
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<400> 441
Tyr Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Val
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<220>
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<400> 442
Phe Leu Asp Glu Ala Pro Pro Gly Leu
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<400> 443
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<220>
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<400> 444
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<223> Synthetic peptide
<400> 445
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 446
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<220>
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<400> 447
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Val
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<220>
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<400> 448
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Leu
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 449
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic peptide
<400> 450
Val Leu Asp Phe Ala Thr Pro Gly Ala
1 5
<210> 451
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 451
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu
1 5
<210> 452
<211> 969
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 452
atgaacaaca acgacctgtt ccaggcttct cgtcgtcgtt tcctggctca gctgggtggt 60
ctgaccgttg ctggtatgct gggtccgtct ctgctgaccc cgcgtcgtgc taccgctgct 120
cacggctccg acgttcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 180
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 240
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg 300
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 360
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 420
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 480
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 540
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 600
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 660
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 720
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 780
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 840
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 900
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 960
cagtgatga 969
<210> 453
<211> 1410
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 453
atgaacaaca acgacctgtt ccaggcttct cgtcgtcgtt tcctggctca gctgggtggt 60
ctgaccgttg ctggtatgct gggtccgtct ctgctgaccc cgcgtcgtgc taccgctgct 120
cacggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 180
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 240
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg 300
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 360
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 420
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 480
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 540
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 600
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 660
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 720
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 780
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 840
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 900
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 960
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc 1020
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg 1080
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aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat 1200
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac 1260
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tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga 1380
aacatgacca aactccagct ggcgctttga 1410
<210> 454
<211> 469
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 454
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
50 55 60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
85 90 95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
100 105 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
115 120 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
130 135 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
165 170 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
180 185 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
195 200 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
210 215 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225 230 235 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
245 250 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
260 265 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
275 280 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
290 295 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305 310 315 320
Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
325 330 335
Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly
340 345 350
Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg
355 360 365
Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu
370 375 380
Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His
385 390 395 400
Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser
405 410 415
Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys
420 425 430
Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
435 440 445
Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys
450 455 460
Leu Gln Leu Ala Leu
465
<210> 455
<211> 321
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 455
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
50 55 60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
85 90 95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
100 105 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
115 120 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
130 135 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
165 170 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
180 185 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
195 200 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
210 215 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225 230 235 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
245 250 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
260 265 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
275 280 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
290 295 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305 310 315 320
Gln
<210> 456
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 456
ggctccgacg tgcgggacct gaac 24
<210> 457
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 457
cgcgtgaatt catcactgaa tgcctctgaa g 31
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 458
ggctccgacg tgcgggacct g 21
<210> 459
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 459
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 460
<211> 843
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 460
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt 60
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ccgccgccgc cgccgccgcc gcactccttc atcaaacagg aaccgagctg gggtggtgca 240
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tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag 420
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cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag 840
tga 843
<210> 461
<211> 280
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 461
Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser
1 5 10 15
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln
20 25 30
Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly
35 40 45
Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
65 70 75 80
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser
85 90 95
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly
100 105 110
Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
115 120 125
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
130 135 140
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly
145 150 155 160
His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
165 170 175
His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
180 185 190
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys
195 200 205
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
210 215 220
Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
225 230 235 240
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
245 250 255
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
260 265 270
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
275 280
<210> 462
<211> 876
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 462
atgggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 60
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ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 540
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 600
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 660
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 840
cagcatcatc accatcatca tcaccatcac cattag 876
<210> 463
<211> 846
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 463
atgggctccg acgtgcggga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 120
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 240
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 540
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 600
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 660
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 840
cagtag 846
<210> 464
<211> 291
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 464
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
245 250 255
Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
260 265 270
Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln His His His His His His His
275 280 285
His His His
290
<210> 465
<211> 281
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 465
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
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Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
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100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
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130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
245 250 255
Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His
260 265 270
Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
275 280
<210> 466
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 466
cggctctaga gccgccacca tgggctccga cgtgcg 36
<210> 467
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 467
cggctctaga ctactgaatg cctctgaaga caccgtg 37
<210> 468
<211> 67
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 468
cggctctaga ctaatggtga tggtgatgat gatggtgatg atgctgaatg cctctgaaga 60
caccgtg 67
<210> 469
<211> 882
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 469
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggct ccgacgttcg ggacctgaac 60
gcactgctgc cggcagttcc gtccctgggt ggtggtggtg gttgcgcact gccggttagc 120
ggtgcagcac agtgggctcc ggttctggac ttcgcaccgc cgggtgcatc cgcatacggt 180
tccctgggtg gtccggcacc gccgccggca ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgcac 240
tccttcatca aacaggaacc gagctggggt ggtgcagaac cgcacgaaga acagtgcctg 300
agcgcattca ccgttcactt ctccggccag ttcactggca cagccggagc ctgtcgctac 360
gggcccttcg gtcctcctcc gcccagccag gcgtcatccg gccaggccag gatgtttcct 420
aacgcgccct acctgcccag ctgcctcgag agccagcccg ctattcgcaa tcagggttac 480
agcacggtca ccttcgacgg gacgcccagc tacggtcaca cgccctcgca ccatgcggcg 540
cagttcccca accactcatt caagcatgag gatcccatgg gccagcaggg ctcgctgggt 600
gagcagcagt actcggtgcc gcccccggtc tatggctgcc acacccccac cgacagctgc 660
accggcagcc aggctttgct gctgaggacg ccctacagca gtgacaattt ataccaaatg 720
acatcccagc ttgaatgcat gacctggaat cagatgaact taggagccac cttaaagggc 780
cacagcacag ggtacgagag cgataaccac acaacgccca tcctctgcgg agcccaatac 840
agaatacaca cgcacggtgt cttcagaggc attcagtgat ga 882
<210> 470
<211> 292
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 470
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
5 10 15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
35 40 45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
65 70 75 80
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
100 105 110
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
130 135 140
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
165 170 175
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
180 185 190
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
195 200 205
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
210 215 220
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
225 230 235 240
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
245 250 255
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
260 265 270
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
275 280 285
Arg Gly Ile Gln
290
<210> 471
<211> 5315
<212> DNA
<213> E Coli
<400> 471
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaacaat aacgatctgt ttcaggcgag 5100
ccgccacgtg aatgaccaag aattctgcag atatccatca cactggcggc cgctcgagca 5160
ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 5220
tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 5280
gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggat 5315
<210> 472
<211> 828
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 472
atgcagcatc accaccatca ccacggttcg gatgtacgcg atctgaacgc gcttcttccg 60
gcggtcccaa gcttgggcgg gggaggtgga tgcgccctgc ccgtgagcgg cgccgcgcaa 120
tgggccccgg tccttgattt tgctccgccg ggtgcgagcg catacggctc tctgggcggg 180
ccccattcat tcatcaaaca ggagcccagc tggggtggcg ccgaacctca tgaagaacaa 240
tgtctgtctg cttttaccgt acatttttca ggccagttta ccggaactgc cggtgcatgt 300
cgctatggcc cattcggtcc gccgccaccg tcacaagcct cttcgggaca agcccgcatg 360
tttccgaatg caccctacct gccgtcttgt ctggaaagcc aacccgcgat ccgtaaccaa 420
ggctacagca ccgtcacgtt tgatggtacc ccgagctatg gtcatacgcc gagtcatcat 480
gcagcacagt tcccgaacca ctcgttcaaa cacgaagatc ctatgggcca gcagggtagt 540
ctgggcgaac aacagtatag cgtcccacca ccagtttatg gttgccatac cccaacggat 600
tcctgtactg gtagccaagc gctcctgctc cgcaccccct attcttctga taatctctat 660
cagatgacca gccaactgga atgtatgacg tggaaccaaa tgaacctggg cgcaaccctg 720
aaaggccaca gtaccggcta tgagtcagat aaccacacaa cacccatttt gtgcggcgct 780
caatatcgta ttcataccca tggcgttttt cgcggtattc agtgatga 828
<210> 473
<211> 811
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 473
atgggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg 60
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 120
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc cccattcatt catcaaacag 180
gagcccagct ggggtggcgc cgaacctcat gaagaacaat gtctgtctgc ttttaccgta 240
catttttcag gccagtttac cggaactgcc ggtgcatgtc gctatggccc attcggtccg 300
ccgccaccgt cacaagcctc ttcgggacaa gcccgcatgt ttccgaatgc accctacctg 360
ccgtcttgtc tggaaagcca acccgcgatc cgtaaccaag gctacagcac cgtcacgttt 420
gatggtaccc cgagctatgg tcatacgccg agtcatcatg cagcacagtt cccgaaccac 480
tcgttcaaac acgaagatcc tatgggccag cagggtagtc tgggcgaaca acagtatagc 540
gtcccaccac cagtttatgg ttgccatacc ccaacggatt cctgtactgg tagccaagcg 600
ctcctgctcc gcacccccta ttcttctgat aatctctatc agatgaccag ccaactggaa 660
tgtatgacgt ggaaccaaat gaacctgggc gcaaccctga aaggccacag taccggctat 720
gagtcagata accacacaac acccattttg tgcggcgctc aatatcgtat tcatacccat 780
ggcgtttttc gcggtattca gtgatgaatt c 811
<210> 474
<211> 844
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 474
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggtt cggatgtacg cgatctgaac 60
gcgcttcttc cggcggtccc aagcttgggc gggggaggtg gatgcgccct gcccgtgagc 120
ggcgccgcgc aatgggcccc ggtccttgat tttgctccgc cgggtgcgag cgcatacggc 180
tctctgggcg ggccccattc attcatcaaa caggagccca gctggggtgg cgccgaacct 240
catgaagaac aatgtctgtc tgcttttacc gtacattttt caggccagtt taccggaact 300
gccggtgcat gtcgctatgg cccattcggt ccgccgccac cgtcacaagc ctcttcggga 360
caagcccgca tgtttccgaa tgcaccctac ctgccgtctt gtctggaaag ccaacccgcg 420
atccgtaacc aaggctacag caccgtcacg tttgatggta ccccgagcta tggtcatacg 480
ccgagtcatc atgcagcaca gttcccgaac cactcgttca aacacgaaga tcctatgggc 540
cagcagggta gtctgggcga acaacagtat agcgtcccac caccagttta tggttgccat 600
accccaacgg attcctgtac tggtagccaa gcgctcctgc tccgcacccc ctattcttct 660
gataatctct atcagatgac cagccaactg gaatgtatga cgtggaacca aatgaacctg 720
ggcgcaaccc tgaaaggcca cagtaccggc tatgagtcag ataaccacac aacacccatt 780
ttgtgcggcg ctcaatatcg tattcatacc catggcgttt ttcgcggtat tcagtgatga 840
attc 844
<210> 475
<211> 927
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 475
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc 60
cttaccgtgg ccggtatgct gggtccgtcg cttttaacac cgcgccgcgc aaccgccgct 120
catggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg 180
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 240
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc cccattcatt catcaaacag 300
gagcccagct ggggtggcgc cgaacctcat gaagaacaat gtctgtctgc ttttaccgta 360
catttttcag gccagtttac cggaactgcc ggtgcatgtc gctatggccc attcggtccg 420
ccgccaccgt cacaagcctc ttcgggacaa gcccgcatgt ttccgaatgc accctacctg 480
ccgtcttgtc tggaaagcca acccgcgatc cgtaaccaag gctacagcac cgtcacgttt 540
gatggtaccc cgagctatgg tcatacgccg agtcatcatg cagcacagtt cccgaaccac 600
tcgttcaaac acgaagatcc tatgggccag cagggtagtc tgggcgaaca acagtatagc 660
gtcccaccac cagtttatgg ttgccatacc ccaacggatt cctgtactgg tagccaagcg 720
ctcctgctcc gcacccccta ttcttctgat aatctctatc agatgaccag ccaactggaa 780
tgtatgacgt ggaaccaaat gaacctgggc gcaaccctga aaggccacag taccggctat 840
gagtcagata accacacaac acccattttg tgcggcgctc aatatcgtat tcatacccat 900
ggcgtttttc gcggtattca gtgatga 927
<210> 476
<211> 936
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 476
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc 60
cttaccgtgg ccggtatgct gggtccgtcg cttttaacac cgcgccgcgc aaccgccgct 120
catggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg 180
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 240
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc ccgggcaaat tcattcattc 300
atcaaacagg agcccagctg gggtggcgcc gaacctcatg aagaacaatg tctgtctgct 360
tttaccgtac atttttcagg ccagtttacc ggaactgccg gtgcatgtcg ctatggccca 420
ttcggtccgc cgccaccgtc acaagcctct tcgggacaag cccgcatgtt tccgaatgca 480
ccctacctgc cgtcttgtct ggaaagccaa cccgcgatcc gtaaccaagg ctacagcacc 540
gtcacgtttg atggtacccc gagctatggt catacgccga gtcatcatgc agcacagttc 600
ccgaaccact cgttcaaaca cgaagatcct atgggccagc agggtagtct gggcgaacaa 660
cagtatagcg tcccaccacc agtttatggt tgccataccc caacggattc ctgtactggt 720
agccaagcgc tcctgctccg caccccctat tcttctgata atctctatca gatgaccagc 780
caactggaat gtatgacgtg gaaccaaatg aacctgggcg caaccctgaa aggccacagt 840
accggctatg agtcagataa ccacacaaca cccattttgt gcggcgctca atatcgtatt 900
catacccatg gcgtttttcg cggtattcag tgatga 936
<210> 477
<211> 969
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 477
atgaacaata acgatctctt ccaagcttcc cgtcgtcgtt tcctggcgca gctcggcggc 60
cttaccgtgg ccggtatgct gggtccgtcg cttttaacac cgcgccgcgc aaccgccgct 120
catggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg 180
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 240
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcggtc cggcacctcc tccagcaccg 300
cctccaccgc caccgccgcc gccgcattca ttcatcaaac aggagcccag ctggggtggc 360
gccgaacctc atgaagaaca atgtctgtct gcttttaccg tacatttttc aggccagttt 420
accggaactg ccggtgcatg tcgctatggc ccattcggtc cgccgccacc gtcacaagcc 480
tcttcgggac aagcccgcat gtttccgaat gcaccctacc tgccgtcttg tctggaaagc 540
caacccgcga tccgtaacca aggctacagc accgtcacgt ttgatggtac cccgagctat 600
ggtcatacgc cgagtcatca tgcagcacag ttcccgaacc actcgttcaa acacgaagat 660
cctatgggcc agcagggtag tctgggcgaa caacagtata gcgtcccacc accagtttat 720
ggttgccata ccccaacgga ttcctgtact ggtagccaag cgctcctgct ccgcaccccc 780
tattcttctg ataatctcta tcagatgacc agccaactgg aatgtatgac gtggaaccaa 840
atgaacctgg gcgcaaccct gaaaggccac agtaccggct atgagtcaga taaccacaca 900
acacccattt tgtgcggcgc tcaatatcgt attcataccc atggcgtttt tcgcggtatt 960
cagtgatga 969
<210> 478
<211> 267
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 478
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
50 55 60
Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
65 70 75 80
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
85 90 95
Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
100 105 110
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro
115 120 125
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro
130 135 140
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
145 150 155 160
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
165 170 175
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
180 185 190
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
195 200 205
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
210 215 220
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr
225 230 235 240
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
245 250 255
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
260 265
<210> 479
<211> 321
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 479
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
50 55 60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
85 90 95
Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile
100 105 110
Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys
115 120 125
Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala
130 135 140
Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala
145 150 155 160
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
165 170 175
Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val
180 185 190
Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
195 200 205
Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln
210 215 220
Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
225 230 235 240
Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu
245 250 255
Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln
260 265 270
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys
275 280 285
Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu
290 295 300
Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
305 310 315 320
Gln
<210> 480
<211> 274
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 480
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser Phe
50 55 60
Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln
65 70 75 80
Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr
85 90 95
Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln
100 105 110
Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
115 120 125
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr
130 135 140
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His
145 150 155 160
Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly
165 170 175
Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
180 185 190
Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
195 200 205
Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser
210 215 220
Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
225 230 235 240
Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
245 250 255
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
260 265 270
Ile Gln
<210> 481
<211> 310
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 481
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
50 55 60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Gly Gln
85 90 95
Ile His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
100 105 110
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
115 120 125
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
145 150 155 160
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
165 170 175
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
180 185 190
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
195 200 205
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
210 215 220
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
225 230 235 240
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
245 250 255
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
260 265 270
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
275 280 285
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
290 295 300
Val Phe Arg Gly Ile Gln
305 310
<210> 482
<211> 307
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 482
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Leu Leu
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Ala Thr Ala Ala His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu
35 40 45
Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys
50 55 60
Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe
65 70 75 80
Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro His Ser
85 90 95
Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu
100 105 110
Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly
115 120 125
Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser
130 135 140
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
145 150 155 160
Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser
165 170 175
Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His
180 185 190
His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
195 200 205
Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro
210 215 220
Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
225 230 235 240
Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr
245 250 255
Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
260 265 270
Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro
275 280 285
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg
290 295 300
Gly Ile Gln
305
<210> 483
<211> 278
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 483
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
5 10 15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
35 40 45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
50 55 60
Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
65 70 75 80
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
85 90 95
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
100 105 110
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
115 120 125
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
130 135 140
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
145 150 155 160
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
165 170 175
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
180 185 190
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
195 200 205
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
210 215 220
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
225 230 235 240
Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His
245 250 255
Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly
260 265 270
Val Phe Arg Gly Ile Gln
275
<210> 484
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 484
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg 30
<210> 485
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 485
ctgcagaatt catcactgaa tgcctctgaa g 31
<210> 486
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide used in construction of the TAT
"Stumpy" vector.
<400> 486
tatgaacaat aacgatctgt ttcaggc 27
<210> 487
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide used in construction of the TAT
"Stumpy" vector.
<400> 487
ctgaaacaga tcgttattgt tca 23
<210> 488
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide used in construction of the TAT
"Stumpy" vector.
<400> 488
aattcttggt cattcacgtg gcggctcgc 29
<210> 489
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Oligonucleotide used in construction of the TAT
"Stumpy" vector.
<400> 489
gagccgccac gtgaatgacc aag 23
<210> 490
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 490
caagcgctca tgagcccgaa gtggcgagcc c 31
<210> 491
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 491
cataaatttg cccgggcccg cccagagagc cg 32
<210> 492
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 492
cattcattca tcaaacagga gcc 23
<210> 493
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 493
ccattaagaa ttcatcactg aatacc 26
<210> 494
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 494
ggttcggatg tacgcgatct gaacg 25
<210> 495
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 495
caaagaattc atcactgaat accgcg 26
<210> 496
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 496
gcttttggca tatgggttcg gatgtacgcg atc 33
<210> 497
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 497
caaagaattc atcactgaat accgcg 26
<210> 498
<211> 882
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 498
atgaacaata acgatctgtt tcaggcgagc cgccacggtt cggatgtacg cgatctgaac 60
gcgcttcttc cggcggtccc aagcttgggc gggggaggtg gatgcgccct gcccgtgagc 120
ggcgccgcgc aatgggcccc ggtccttgat tttgctccgc cgggtgcgag cgcatacggc 180
tctctgggcg gtccggcacc tcctccagca ccgcctccac cgccaccgcc gccgccgcat 240
tcattcatca aacaggagcc cagctggggt ggcgccgaac ctcatgaaga acaatgtctg 300
tctgctttta ccgtacattt ttcaggccag tttaccggaa ctgccggtgc atgtcgctat 360
ggcccattcg gtccgccgcc accgtcacaa gcctcttcgg gacaagcccg catgtttccg 420
aatgcaccct acctgccgtc ttgtctggaa agccaacccg cgatccgtaa ccaaggctac 480
agcaccgtca cgtttgatgg taccccgagc tatggtcata cgccgagtca tcatgcagca 540
cagttcccga accactcgtt caaacacgaa gatcctatgg gccagcaggg tagtctgggc 600
gaacaacagt atagcgtccc accaccagtt tatggttgcc ataccccaac ggattcctgt 660
actggtagcc aagcgctcct gctccgcacc ccctattctt ctgataatct ctatcagatg 720
accagccaac tggaatgtat gacgtggaac caaatgaacc tgggcgcaac cctgaaaggc 780
cacagtaccg gctatgagtc agataaccac acaacaccca ttttgtgcgg cgctcaatat 840
cgtattcata cccatggcgt ttttcgcggt attcagtgat ga 882
<210> 499
<211> 292
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 499
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His Gly Ser Asp Val
5 10 15
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
35 40 45
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
65 70 75 80
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
85 90 95
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
100 105 110
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
115 120 125
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
130 135 140
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
145 150 155 160
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
165 170 175
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
180 185 190
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
195 200 205
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
210 215 220
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
225 230 235 240
Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala
245 250 255
Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr
260 265 270
Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
275 280 285
Arg Gly Ile Gln
290
<210> 500
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 500
ggttcggatg tacgcgatct gaacg 25
<210> 501
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 501
caaagaattc atcactgaat accgcg 26
<210> 502
<211> 270
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 502
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Gly Gln Ile His Ser Phe Ile Lys Gln Glu
50 55 60
Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
65 70 75 80
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
85 90 95
Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly
100 105 110
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
115 120 125
Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp
130 135 140
Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
145 150 155 160
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
165 170 175
Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His
180 185 190
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
195 200 205
Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
210 215 220
Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser
225 230 235 240
Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala
245 250 255
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
260 265 270
<210> 503
<211> 5400
<212> DNA
<213> E. coli
<400> 503
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg aattaattct tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat 600
tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660
actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720
gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780
aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840
agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900
cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960
aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020
tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080
tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140
taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200
ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260
tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320
tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380
cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440
cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500
gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560
gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620
agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680
aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740
agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800
cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860
accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920
aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980
ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040
cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100
gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160
tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220
agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280
tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340
caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400
ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580
gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640
aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700
ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760
acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820
ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880
tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940
tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000
cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060
gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120
ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180
catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240
ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300
gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360
gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420
ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480
atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600
tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660
ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720
aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780
atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840
cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900
gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960
tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020
agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080
gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140
ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200
catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260
tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320
tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380
gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440
ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500
tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560
catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620
cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680
tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740
ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860
cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920
gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980
aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040
ttttgtttaa ctttaagaag gagatataca tatgaacaac aacgacctgt tccaggcttc 5100
tcgtcgtcgt ttcctggctc agctgggtgg tctgaccgtt gctggtatgc tgggtccgtc 5160
tctgctgacc ccgcgtcgtg ctaccgctgc tcacgtgccc atctgaattc tgcagatatc 5220
catcacactg gcggccgctc gagcaccacc accaccacca ctgagatccg gctgctaaca 5280
aagcccgaaa ggaagctgag ttggctgctg ccaccgctga gcaataacta gcataacccc 5340
ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt ttttgctgaa aggaggaact atatccggat 5400
<210> 504
<211> 39
<212> PRT
<213> E. coli
<220>
<221> VARIANT
<222> 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39
<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 504
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg Arg Arg Phe Leu Ala
1 5 10 15
Gln Leu Gly Gly Leu Thr Val Ala Gly Met Leu Gly Pro Ser Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
35
<210> 505
<211> 816
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 505
atgggttcgg atgtacgcga tctgaacgcg cttcttccgg cggtcccaag cttgggcggg 60
ggaggtggat gcgccctgcc cgtgagcggc gccgcgcaat gggccccggt ccttgatttt 120
gctccgccgg gtgcgagcgc atacggctct ctgggcgggc ccgggcaaat tcattcattc 180
atcaaacagg agcccagctg gggtggcgcc gaacctcatg aagaacaatg tctgtctgct 240
tttaccgtac atttttcagg ccagtttacc ggaactgccg gtgcatgtcg ctatggccca 300
ttcggtccgc cgccaccgtc acaagcctct tcgggacaag cccgcatgtt tccgaatgca 360
ccctacctgc cgtcttgtct ggaaagccaa cccgcgatcc gtaaccaagg ctacagcacc 420
gtcacgtttg atggtacccc gagctatggt catacgccga gtcatcatgc agcacagttc 480
ccgaaccact cgttcaaaca cgaagatcct atgggccagc agggtagtct gggcgaacaa 540
cagtatagcg tcccaccacc agtttatggt tgccataccc caacggattc ctgtactggt 600
agccaagcgc tcctgctccg caccccctat tcttctgata atctctatca gatgaccagc 660
caactggaat gtatgacgtg gaaccaaatg aacctgggcg caaccctgaa aggccacagt 720
accggctatg agtcagataa ccacacaaca cccattttgt gcggcgctca atatcgtatt 780
catacccatg gcgtttttcg cggtattcag tgatga 816
<210> 506
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 506
Met Asn Asn Asn Asp Leu Phe Gln Ala Ser Arg His
1 5 10
Claims (38)
- 서열 번호 414-450, 478 및 502로 이루어진 그룹 중에서 선택된 윌름(Wilms') 종양 항원의 면역원성 부분, 또는 한 가지 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이하지만 WT1-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않은 이의 변이체를 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제1항에 있어서, MHC 분자와 결합하는 면역원성 부분의 능력이, 변형되지 않은 면역원성 부분에 비해 증가되도록 상기 면역원성 부분을 변형시킨, 분리된 폴리펩티드.
- 제2항에 있어서, HLA-A2와 결합하는 면역원성 부분의 능력이, 변형되지 않은 면역원성 부분에 비해 증가되도록 상기 면역원성 부분을 변형시킨, 분리된 폴리펩티드.
- 프롤린 풍부 영역이 결실된 윌름 종양 항원을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제4항에 있어서, 프롤린 풍부 영역이 윌름 종양 항원의 아미노산 위치 약 54번에서부터 68번까지인 분리된 폴리펩티드.
- 제5항에 있어서, 서열 번호 478 및 502 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제1항, 제2항 및 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
- 제7항에 있어서, 융합 파트너가 Ra12, 단백질 D, LYTA, HIS 태그, 특정 폴리펩티드를 엔도솜성/라이소솜성 구획으로 지시할 수 있는 표적화 시그널, 쌍둥이 아르기닌 전좌 인자, 및 절단된 쌍둥이 아르기닌 전좌 인자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 쌍둥이 아르기닌 전좌 인자 시그널 펩티드를 포함하는 융합 단백질.
- 제8항에 있어서, 융합 파트너가 서열 번호 504 및 506 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
- 제10항에 있어서, 서열 번호 453, 455, 470, 479-483 및 499 중의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질.
- 제7항, 제9항 및 제11항 중의 어느 한 항에 따르는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 코돈을 최적화시킨 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제12항에 있어서, 서열 번호 452, 454, 469, 471 및 472-477, 503 및 505 중의 어느 하나의 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제1항, 제4항, 제6항 및 제11항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합하여 포함하는 조성물.
- 제1항, 제4항, 제6항 및 제11항 중의 어느 한 항의 폴리펩티드를, 비-특이적 면역 반응 증강제와 배합하여 포함하는 백신.
- 제15항에 있어서, 비-특이적 면역 반응 증강제가 환자에게서 T 세포 반응을 우선적으로 증강시키는 백신.
- 제15항에 있어서, 면역 반응 증강제가 3d-MPL, MPL, RC-529, AGP's, 몬타니드 ISA50, 셉픽 몬타니드 ISA 720, 사이토킨, 미세구, 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)계 보조제, AS-1, AS-2, 리비 보조제 시스템계 보조제, QS21, 사포닌계 보조제, 미세유동화 형태의 신텍스 보조제, MV, ddMV, 면역 자극성 복합체(iscom)계 보조제, 및 불활성화된 독소로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 백신.
- 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 제12항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제19항에 따르는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
- 폴리펩티드가 HLA-A2와 결합하는 능력이 증가되도록 폴리펩티드를 변형시키고, 당해 폴리펩티드의 면역원성이 서열 번호 241의 면역원성에 비해 증가된, 윌름 종양 항원의 면역원성 부분을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제21항에 있어서, 서열 번호 414-450 중의 어느 하나로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제21항에 있어서, 변형이 서열 번호 241의 위치 1번 내지 9번중의 어느 하나에서의 하나 이상의 치환을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제23항에 있어서, 변형이 서열 번호 241의 위치 6번(P6)에서의 치환을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제24항에 있어서, 서열 번호 445에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- 제23항에 있어서, 변형이 서열 번호 241의 위치 9번(P9)에서의 치환을 포함하는, 분리된 폴리펩티드.
- 제26항에 있어서, 서열 번호 426에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
- (a) 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 WT1 폴리뉴클레오티드의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 제1 바이러스성 벡터를 포함하는 제1 조성물을 동물에게 투여하는 단계;(b) 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된 WT1 폴리뉴클레오티드의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 제2 바이러스성 벡터를 포함하는 제2 조성물을 상기 동물에게 투여하는 단계; 및이로써 상기 동물에게서 면역 반응을 유도시키는 단계를 포함하는, 해당 동물에게서 면역 반응을 유도시키는 방법.
- 제28항에 있어서, 제1 및 제2 바이러스성 벡터가 우두 벡터, 전염성 상피종(fowlpox virus) 벡터, 및 아데노바이러스성 벡터로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제29항에 있어서, 제1 바이러스성 벡터가 재조합 우두 벡터를 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제1 바이러스성 벡터가 rV-WT1/TRICOM을 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제2 바이러스성 벡터가 재조합 전염성 상피종 벡터를 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제2 바이러스성 벡터가 rF-WT1/TRICOM을 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제1 및 제2 바이러스성 벡터가 동시자극성 분자를 암호하하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 동시자극성 분자가 B7-1, ICAM-1 및 LFA-3으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
- 제28항에 있어서, 제1 조성물이 제1 시점에 투여되고, 제2 조성물이 제2 및 제3 시점에 후속적으로 투여되는 방법.
- 서열 번호 414-450, 453, 455, 470, 478, 479-483, 499 및 502 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 성분, 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 면역자극제 중의 어느 하나 또는 모두에서 선택된 제2 성분을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 환자에게서 면역 반응을 유도시키는 방법.
- 서열 번호 414-450, 453, 455, 470, 478, 479-483, 499 및 502 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 성분, 및 서열 번호 414-450, 453, 455, 470, 478, 479-483, 499 및 502 중의 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 제2 성분을 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 이러한 환자에게서 면역 반응을 유도시키는 방법.
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