KR100858231B1 - Ｗｔ1 특이적 면역요법용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본원에는 악성 질병, 예를 들면, 백혈병 및 암의 치료 방법 및 조성물이 기재되어 있다. 이러한 조성물은 WT1 폴리뉴클레오티드, WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 표시하는 항원 표시 세포, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 또는 WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포 중의 하나 이상을 포함한다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 전이성 질병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
윌름 종양 유전자(WT1), 악성 질병, 백혈병, 암, 전이성 질병
Description
연방 정부에 의해 후원된 연구 또는 개발에 관한 진술서
본 발명은 NIH SBIR Phase I 허여 번호 IR43 CA81752-01A1 하에 정부 보조 하에 일부 만들어진 것이다. 따라서, 정부가 본 발명에 대한 특정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 일반적으로, 백혈병 및 암과 같은 악성 질병의 면역요법(immunotherapy)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 WT1에 대한 면역 반응을 발생 또는 증강시키기 위한 조성물, 및 악성 질병을 예방 및/또는 치료하기 위한 상기 조성물의 용도에 관한 것이다.
암과 백혈병은 미국과 전세계에 걸쳐 건강상의 중요한 문제가 되고 있다. 이러한 질병을 탐지하고 치료하는 기술이 진전되어 왔지만, 암과 백혈병을 예방 및 치료하기 위한 어떠한 백신이나 기타 널리 성공적인 방법도 현재 이용 가능하지 않 다. 이 질병의 관리는 현재, 초기 진단과, 수술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬 요법과 같은 각종 치료법 한 가지 이상을 포함할 수 있는 적극적인 치료를 병행하는 것에만 의존하고 있다. 특정 암에 대한 치료 과정은 종종, 특이적 종양 마커의 분석을 포함한 각종 예후 파라미터에 근거하여 선택된다. 그러나, 정립된 마커를 사용하게 되면, 종종 판단하기 어려운 결과가 야기되고, 많은 암 환자에게서 높은 사망율이 지속적으로 관찰된다.
면역요법은 암과 백혈병 치료 및 생존을 실질적으로 개선시켜주는 효능을 지니고 있다. 최근의 데이터는, 백혈병이 골수 이식(예를 들면, 공여자 림프구 주입) 맥락에서 면역요법에 의해 치유될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 이러한 치료법은 종양 관련 항원(TAA)에 대한 면역 반응을 발생 또는 증강시키는 것을 포함할 수 있다. 그러나, 현재까지, 비교적 적은 수의 TAA가 공지되어 있고, 이러한 항원에 대한 면역 반응의 발생도, 거의 드문 예외도 있긴 하지만, 치료학적으로 유익한 것으로 밝혀지지 않았다.
따라서, 당해 분야에서는, 백혈병과 암을 예방 및 치료하기 위한 개선된 방법이 요망된다. 본 발명은 이러한 요망을 충족시켜 주고, 또한 이와 관련된 기타 이점을 추가로 제공해준다.
발명의 개요
간략하게 언급하면, 본 발명은 백혈병 및 암과 같은 질병을 진단 및 치료하는 방법 및 조성물을 제공해준다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 본래의 WT1의 면 역원성 부분, 또는 한 가지 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이한 이의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 특정 양태 내에서, 상기 폴리펩티드는 본래의 WT1 폴리펩티드의 16개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 기타 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 본래의 WT1 폴리펩티드의 아미노산 잔기 1-174의 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함하는데, 이러한 폴리펩티드는 본래의 WT1 폴리펩티드의 아미노산 175 내지 449 내에 존재하는 16개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 면역원성 부분은 바람직하게는, MHC 부류 I 및/또는 부류 II 분자와 결합된다. 특정 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 (a) 표 II 내지 XLVI 중의 하나 이상에 인용된 서열, (b) 한 가지 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이한, 전술된 서열의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다) 및 (c) 상기 언급된 폴리펩티드의 모사체(mimetics)(이러한 모사체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다.
기타 양태 내에서는, 상기 폴리펩티드가 ALLPAVPSL (서열 번호 34), GATLKGVAA (서열 번호 88), CMTWNQMNL (서열 번호 49 및 258), SCLESQPTI (서열 번호 199 및 296), SCLESQPAI (서열 번호 198), NLYQMTSQL (서열 번호 147 및 284), ALLPAVSSL (서열 번호 35 및 255), RMFPNAPYL (서열 번호 185 및 293), VLDFAPPGA (서열 번호 241), VLDFAPPGAS (서열 번호 411), (b) 한 가지 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이한, 전술된 서열의 변이체(이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다) 및 (c) 상기 언급된 폴리펩티드의 모사체(이러한 모사체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 실질적으로 저하되지 않는다)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 서열을 포함한다. 모사체는 아미노산을 하나 이상의 아미노산 모사체와 조합하여 포함할 수 있거나 또는 전적으로 비펩티드 모사체일 수 있다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 WT1 단백질의 면역원성 부분의 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는데, 이러한 변이체는 해당 면역원성 부분 내의 1 내지 3번 아미노산 위치에서의 치환으로 인해 상기 면역원성 부분과 상이하며, 이러한 변이체가 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력은 본래의 WT1 단백질에 비해 증강된다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 암호화하는 WT1 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
기타 국면 내에서, 본 발명은 약제학적 조성물 및 백신을 제공한다. 약제학적 조성물은 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드 또는 모사체, 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오티드; (ii) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편; (iii) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포; 또는 (iv) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시(antigen-presenting) 세포 중의 하나 이상을, 약 제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 백신은 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드, 및/또는 (i) WT1 폴리뉴클레오티드, (ii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 또는 (iii) 항-개별특이형(anti-idiotype) 항체 중의 하나 이상을, 비-특이적 면역 반응 증강제와 함께 포함한다. 특정 양태 내에서, 본래의 WT1 폴리펩티드의 23개 미만의 연속되는 아미노산 잔기, 바람직하게는 17개 미만의 연속되는 아미노산 잔기가, 상기 약제학적 조성물 및 백신 내에 이용된 WT1 폴리펩티드 내에 존재한다. 상기 면역 반응 증강제는 아주반트(adjuvant)일 수 있다. 바람직하게는, 면역 반응 증강제가 T 세포 반응을 증강시킨다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 면역 반응을 증강 또는 유도시키는 방법을 제공해준다. 특정 양태에서는, 상기 환자가 사람이다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물 또는 백신을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법을 제공해준다. 악성 질병에는 백혈병(예: 급성 골수성, 급성 림프구성 및 만성 골수성 백혈병) 및 암(예: 유방, 폐, 갑상선 또는 위장암, 또는 흑색종)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 상기 환자는 악성 질병에 걸릴 수도 있지만, 반드시 그럴 필요는 없으며, 당해 약제학적 조성물 또는 백신의 투여는 이러한 질병의 개시를 억제시킬 수 있거나 또는 기존 질병의 진행 및/또는 전이를 억제시킬 수 있다.
본 발명은 추가로 기타 국면 내에서, 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈 의 일정 분획 내의 골수성 또는 림프계 세포 수의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 보다 바람직하게는 1% 미만이 되도록 WT1 양성 세포를 제거시키기에 충분한 시간 및 조건 하에, 상기 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획을, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, 상기 골수 및/또는 말초혈, 또는 이의 분획으로부터 WT1 발현성 세포를 제거하는 방법을 제공해준다. 골수, 말초혈, 및 이의 분획은 WT1 발현과 연관된 질병에 걸린 환자로부터 수득할 수 있거나 또는 이러한 질병에 걸리지 않은 사람 또는 사람이 아닌 포유류로부터 수득할 수 있다.
관련 국면 내에서, 본 발명은 골수, 말초혈, 또는 상기 언급된 바와 같이 준비된 골수 또는 말초혈의 일정 분획을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법을 제공해준다. 이러한 골수, 말초혈 또는 이의 분획은 자가유래성(autologous)이거나, 또는 관련되거나 관련되지 않은 사람 또는 사람이 아닌 동물(예:유전적동계(syngeneic) 또는 동종이형(allogeneic))으로부터 유래될 수 있다.
기타 국면에서는, 본 발명이 T 세포를 WT1 폴리펩티드와, T 세포의 자극 및/또는 증진을 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 T 세포를 자극(또는 프라이밍) 및/또는 증진시키는 방법을 추가로 제공한다. 이러한 T 세포는 자가유래성, 동종이형, 유전적동계 또는 관련되지 않은 WT1 특이적 T 세포일 수 있으며, 시험관내 또는 생체 내에서 자극시킬 수 있다. 증대된 T 세포는 특정 양태 내에서, 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획 내에 존재할 수 있고, 이는 클론성일 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다. 특정 양태 내에서, T 세포는 자극 및/또는 증진 동안 포유류에 존재할 수 있다. WT1 특이적 T 세포를, 예를 들면, 공여자 림프구 주입물 내에 사용할 수 있다.
관련 국면 내에서, 상기 언급된 바와 같이 준비된 T 세포를 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 이러한 환자에게서 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법이 제공된다. 이러한 T 세포는 특정 양태에서, 자가유래성, 유전적동계 또는 동종이형일 수 있다.
본 발명은 추가로, 기타 국면 내에서, 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병에 대한 면역화 또는 면역요법의 효능을 모니터하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 상기 환자에게서 항체, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포 반응을 모니터하는 것에 근거한다. 이러한 특정 국면 내에서, 특정 방법은 (a) 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득한 제1 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iiI) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온처리를 수행하는 단계; (b) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 상기 생물학적 샘플 중에서 WT1 폴리펩티드와 항체 간에 형성된 면역 복합체를 탐지하는 단계; (c) 요법 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 면역 복합체의 수를 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 해당 요법 또는 면역화의 효능을 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 양태 내에서, 상기 탐지 단계는 (a) 상기 면역 복합체와 결합할 수 있고 리포터 그룹을 포함하는 탐지용 시약을 상기 면역 복합체와 함께 항온처리하는 단계; (b) 결합되지 않은 탐지용 시약을 제거하는 단계; 및 (c) 상기 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 탐지하는 단계를 포함한다. 상기 탐지용 시약은, 예를 들면, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 결합할 수 있는 제2의 항체 또는 이의 항원 결합성 단편, 또는 단백질 A와 같은 분자를 포함할 수 있다. 기타 양태 내에서, 리포터 그룹은 WT1 폴리펩티드에 결합되고, 상기 탐지 단계는 결합되지 않은 WT1 폴리펩티드를 제거한 다음, 이러한 리포터 그룹의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함한다.
추가의 국면 내에서, 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병에 대한 면역화 또는 요법의 효능을 모니터하는 방법은 (a) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하고 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득한 제1 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해를 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온처리를 수행하는 단계; (b) 상기 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해의 양을 탐지하는 단계; (c) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하고 요법 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해의 양을 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 해당 요법 또는 면역화의 효능을 모니터하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로, (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온처리하여, 상기 T 세포를 증식시키는 단계; 및 (b) 이러한 환자에게 상기 증식된 T 세포의 유효량을 투여하고, 이로부터 환자에게서 악성 질병의 발생을 억제시키는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법을 제공한다. 특정 양태 내에서, 상기 T 세포의 항온처리 단계를 1회 이상 반복할 수 있다.
기타 국면 내에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온처리하여, 상기 T 세포를 증식시키는 단계; (b) 증식된 하나 이상의 세포를 클로닝하는 단계; 및 (c) 이러한 환자에게 상기 클로닝된 T 세포의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법을 제공한다.
기타 국면 내에서, (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과 함께 항온처리하는 단계; 및 (b) 상기 T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 탐지하고, 이로부 터 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 존재 또는 부재를 결정하는 방법이 제공된다. 특정 양태 내에서, 상기 탐지 단계가 T 세포 증식의 존재 또는 부재를 탐지하는 것을 포함한다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을, (i) WT1 폴리펩티드; (ii) WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 (iii) WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포 중의 하나 이상과, 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 항온처리를 수행하는 단계; 및 (b) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 상기 생물학적 샘플 중에서 WT1 폴리펩티드와 항체 간에 형성된 면역 복합체를 탐지하고, 이로부터 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는, 상기 환자에게서 WT1 발현과 연관된 악성 질병의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 기타 국면은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하여 명백해질 것이다. 본원에 언급된 모든 참조문헌은 각각이 개별적으로 삽입된 경우처럼 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
도 1은 마우스(MO)와 사람(HU) WT1 단백질 서열(각각 서열 번호 320 및 319) 비교를 도시한 것이다.
도 2는 혈액학적 악성 종양(AML)이 있는 환자에게서 WT1 특이적 항체의 탐지 를 예시해주는 웨스턴 블롯(Western blot)이다. 레인 1은 분자량 마커를 나타내고; 레인 2는 양성 대조군(WT1 특이적 항체로 면역침전된 WT1 양성 사람 백혈병 세포주)을 나타내며; 레인 3은 음성 대조군(마우스 혈청으로 면역침전된 WT1 양성 세포주)을 나타내고; 레인 4는 AML이 있는 환자의 혈청으로 면역침전된 WT1 양성 세포주를 나타낸다. 레인 2 내지 4의 경우, 면역침전물을 겔 전기영동함으로써 분리시키고, 이에 WT1 특이적 항체를 프로빙한다.
도 3은 WT1 양성 종양 세포주인 TRAMP-C로 면역시킨 B6 마우스에서 WT1 특이적 항체 반응의 탐지를 예시해주는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고; 레인 2, 4 및 6은 WT1 특이적 양성 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology; WT1 단백질의 N-말단 영역의 180 아미노산에 걸쳐 있고, 52kD 하의 웨스턴 블롯 상에서 이동하는 폴리펩티드)을 나타낸다. 사용된 1차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서의 면역화되지 않은 B6 마우스의 혈청, 및 레인 6에서의 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 4는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 WT1 특이적 항체의 탐지를 예시해주는 웨스턴 블롯이다. 레인 1, 3 및 5는 분자량 마커를 나타내고; 레인 2, 4 및 6은 WT1 특이적 양성 대조군(N180, Santa Cruz Biotechnology; WT1 단백질의 N-말단 영역의 180 아미노산에 걸쳐 있고, 52kD 하의 웨스턴 블롯 상에서 이동하는 폴리펩티드)을 나타낸다. 사용된 1차 항체는 레인 2에서의 WT180, 레인 4에서의 면역화되지 않은 B6 마우스의 혈청, 및 레인 6에서의 면역화된 B6 마우스의 혈청이다.
도 5A 내지 5C는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 예시하는 그래프이다. 지시된 바와 같은 1개의 T 세포주와 2개의 상이한 클론을 사용하여 티미딘 혼입 검정을 수행하고, 그 결과를 cpm으로 표현하였다. x축 상에 지시된 대조군은 항원이 없고(Ag가 없음) B6/배지이며; 사용된 항원은 p6-22 사람(p1), p117-139(p2) 또는 p244-262 사람(p3)이다.
도 6A 및 6B는 대표적인 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 증식성 T 세포 반응의 자극을 예시하는 히스토그램이다. 제3 면역화시킨지 3주 후에, 백신 A 또는 백신 B를 접종시킨 바 있는 마우스의 비장 세포를, 배지 단독(배지) 또는 비장 세포 및 배지(B6/항원 없음), 펩티드 p6-22(p6), p117-139(p117), p244-262(p244) (백신 A; 도 6A) 또는 p287-301(p287), p299-313(p299), p421-435(p421) (백신 B; 도 6B)가 펄싱된 비장 세포, 및 무관한 대조군 펩티드(무관한 펩티드)로 펄싱된 비장 세포와 함께 25㎍/ml로 배양하고, 증식시킨지 96시간 후에 (3H) 티미딘 혼입함으로써 검정한다. 막대는 자극 지수(SI)를 나타내는데, 이는 실험용 웰의 평균치를 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균치로 나눈 값으로 산정된다.
도 7A 내지 7D는 p117-139 및 p6-22에 특이적인 증식성 T 세포주 및 클론의 발생을 예시하는 히스토그램이다. 생체내에서 면역시킨 후, 백신 A 또는 B 각각의 3개 펩티드 모두를 사용하여, 초기 3가지 시험관내 자극(IVS)을 수행한다. 상기 2개의 관련된 펩티드 p117-139 및 p6-22 만을 사용하여 단일 펩티드 자극으로서 후속 IVS를 수행하였다. 클론을 지시된 바와 같이, p6-22 및 p117-139 특이적 T 세 포주 둘 다로부터 유도하였다. T 세포를 배지 단독(배지) 또는 비장 세포와 배지(B6/항원 부존재), 펩티드 p6-22(p6), p117-139(p117) 또는 무관한 대조군 펩티드(무관한 펩티드)로 펄싱된 B6 비장 세포와 함께 25㎍/ml로 배양하고, 증식시킨지 96시간 후에 (3H) 티미딘 혼입함으로써 검정한다. 막대는 자극 지수(SI)를 나타내는데, 이는 실험용 웰의 평균치를 대조군(항원이 없는 B6 비장 세포)의 평균치로 나눈 값으로 산정된다.
도 8A 및 8B는 Th 반응을 유발시킬 수 있는 펩티드에 대한 사람 WT1(서열 번호 319)의 TSITES 분석 결과를 도시한 것이다. "A"로 지시된 영역은 블록의 AMPHI 중간점이고, "R"은 로드바드/테일러(Rothbard/Taylor) 모티프에 부합되는 잔기를 지시하며, "D"는 IAd 모티프에 부합되는 잔기를 지시하고, 'd'는 IEd 모티프에 부합되는 잔기를 지시한다.
도 9A 및 9B는 WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 WT1 펩티드 특이적 CTL의 유발을 예시해주는 그래프이다. 도 9A는 동종이형 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 도시한 것이며, 도 9B는 펩티드 피복된 세포주의 용해를 도시한 것이다. 각 경우에 있어, 용해율(%)(표준 크롬 방출 검정으로써 결정된 바와 같음)은 3가지 지시된 효과기:표적 비로 제시된다. 림프종 세포(LSTRA 및 E10) 뿐만 아니라 E10 + p235-243(E210+P235)에 대한 결과가 제공된다. E10 세포는 또한 본원에서 EL-4 세포로서 지칭되기도 한다.
도 10A 내지 10D는 B6 마우스에 WT1 특이적 P117를 백신접종한 후에, WT1 양 성 종양 세포주는 사멸시키지만 WT1 음성 세포주는 사멸시키지 않는 WT1 특이적 CTL의 유발을 예시해주는 그래프이다. 도 10A는 면역화되지 않은 B6 마우스의 T 세포는 WT1 양성 종양 세포주를 사멸시키지 않는다는 것을 예시해준다. 도 10B는 동종이형성 세포주에 의한 표적 세포의 용해를 예시해준다. 도 10C 및 10D는 2가지 상이한 실험에서 WT1 음성 세포주와 비교한 바와 같은, WT1 양성 종양 세포주의 용해를 나타낸다. 또한, 도 10C 및 10D는 펩티드-피복된 세포주(관련된 WT1 펩티드 P117로 피복된 WT1 음성 세포주 E10)의 용해를 나타낸다. 각 경우에 있어, 용해율(%)(표준 크롬 방출 검정으로써 결정된 바와 같음)은 3가지 지시된 효과기:표적 비로 제시된다. 림프종 세포(E10), 전립선암 세포(TRAMP-C), 형질전환된 섬유아세포 세포주(BLK-SV40) 뿐만 아니라 E10 + p117에 대한 결과가 제공된다.
도 11A 및 11B는 WT1 양성 종양 세포를 용해시키는 대표적인 펩티드 P117-139 특이적 CTL의 능력을 예시해주는 히스토그램이다. 제3 면역시킨지 3주 후에, 펩티드 p235-243 또는 p117-139를 접종시킨 바 있는 마우스의 비장 세포를 관련 펩티드로 시험관 내에서 자극시키고, 이를 대상으로 하여, WT1 양성 및 음성 종양 세포 뿐만 아니라 WT1 펩티드와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험하였다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해%을 나타낸다. 도 11A는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); 관련된(재자극에 사용될 뿐만 아니라 면역화에도 사용됨) 펩티드 p235-243으로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p235); 무관한 펩티드 p117-139로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p117), p126-134로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p126) 또는 p130-138로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p130); 및 WT1 양성 종양 세포 BLK-SV40(BLK-SV40, WT1 양성) 및 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 양성)에 대한 p235-243 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 11B는 지시된 바와 같이, EL-4; 관련된 펩티드 P117-139로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p117); 및 무관한 펩티드 p123-131로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p123) 또는 p128-136로 펄싱된 EL-4(EL-4 + p128); BLK-SV40 및 TRAMP-C에 대한 p235-243 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 12A 및 12B는 한냉 표적 억제에 의해 입증된 바와 같이, WT1 양성 종양 세포의 용해 특이성을 예시해주는 히스토그램이다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해%을 나타낸다. 도 12A는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C(TRAMP-C, WT1 양성); 51Cr 표지화하지 않으면서 관련된 펩티드 p117-139으로 펄싱된 EL-4 세포의 10배 과량과 함께 항온처리된 TRAMP-C 세포(TRAMP-C + p117 한냉 표적); 및 51Cr 표지화하지 않으면서 무관한 펩티드로 펄싱된 EL-4와 함께 항온처리된 TRAMP-C 세포(TRAMP-C + 무관한 한냉 표적물)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 12B는 지시된 바와 같이, WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); WT1 양성 종양 세포주 BLK-SV40(BLK-SV40, WT1 양성); 관련된 한냉 표적물과 함께 항온처리된 BLK-SV40 세포(BLK-SV40 + p117 한냉 표적); 및 무관한 한냉 표적물과 함께 항온처리된 BLK-SV40 세포(BLK-SV40 + 무관한 한냉 표적물)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 13A 내지 13C는 p117-139 내에서의 9량체 CTL 에피토프의 평가를 도시한 히스토그램이다. p117-139 종양 특이적 CTL 주를 대상으로 하여, p126-134 또는 p130-138로 재자극한 후 적당한 H-2b 부류 I 결합성 모티프를 함유하거나 이것이 결여된 aa117-139 내의 펩티드에 대해 시험하였다. 막대는 25:1의 E:T 비를 이용하여 3회 수행된 크롬 방출 검정에서의 평균 특이적 용해%을 나타낸다. 도 13A는 WT1 음성 세포주 EL-4(EL-4, WT1 음성); 및 펩티드 p117-139로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p119-127로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p119), p120-128로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p120), p123-131로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p123), p126-134로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p126), p128-136로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p128) 및 p130-138로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p130)에 대한 p117-139 특이적 T 세포주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13B는 WT1 음성 세포주 EL-4, p117-139로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p126-134로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p126) 및 WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C에 대한, p126-134로의 재자극 후의 CTL 주의 세포독성 활성을 나타낸다. 도 13C는 EL-4, p117-139로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p117), p130-138로 펄싱된 EL-4 세포(EL-4 + p130) 및 WT1 양성 종양 세포주 TRAMP-C에 대한, p130-138로의 재자극 후의 CTL 주의 세포독성 활성을 나타낸다.
도 14는 AML에 걸린 63명 환자에게서 WT1에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/N-말단 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 제1 및 제2 레인은 각각 양성 및 음성 대조 군을 나타낸다. 상업적으로 수득되는 WT1 특이적 항체 WT180이 양성 대조군으로 사용되었다. 그 다음의 63개 레인은 각 개개 환자로부터의 혈청을 사용한 결과를 나타낸다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. 상기 도에는 3가지 별도의 실험으로부터의 누적 데이터가 포함되어 있다.
도 15는 AML에 걸린 2명의 환자에게서 WT1 단백질 및 대조군 단백질에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/완전한 길이, WT1N-말단, TRX 및 Ra12 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 2명의 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. AML-1 및 AML-2는 도 1에서의 개개 환자 중의 2명으로부터의 혈청을 의미하고, 이는 WT1/완전한 길이에 대한 항체 반응성을 나타내었다. WT1/완전한 길이의 단백질은 Ra12와의 융합 단백질로서 발현되었다. WT1/N-말단 단백질은 TRX와의 융합 단백질로서 발현되었다. 대조군 Ra12 및 TRX 단백질은 유사한 방식으로 정제되었다. 그 결과, WT1 융합 단백질에 대한 혈청 항체 방응성이 상기 단백질의 WT1 부분에 대해 지시된다는 사실이 확인되었다.
도 16은 CML에 걸린 81명 환자에게서 WT1에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/완전한 길이의 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 AML에 걸린 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 제1 및 제2 레인은 각각 양성 및 음성 대조군을 나타낸다. 상업적으로 수득되는 WT1 특이적 항체 WT180이 양성 대조군으로 사용되었다. 그 다음의 81개 레인은 각 개개 환자로부터의 혈청을 사용한 결과를 나타낸다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수 득된 것이다. 상기 도에는 3가지 별도의 실험으로부터의 누적 데이터가 포함되어 있다.
도 17은 CML에 걸린 2명의 환자에게서 WT1 단백질 및 대조군 단백질에 대한 혈청 항체 반응성을 도시한 것이다. WT1/완전한 길이, WT1/N-말단, TRX 및 Ra12 단백질에 대한 혈청 항체의 반응성은 CML에 걸린 2명의 환자를 대상으로 하여 ELISA함으로써 평가하였다. 도시된 OD 값은 1:500 혈청 희석율을 이용하여 ELISA로부터 수득된 것이다. CML-1 및 CML-2는 도 3에서의 개개 환자 중의 2명으로부터의 혈청을 의미하고, 이는 WT1/완전한 길이에 대한 항체 반응성을 나타내었다. WT1/완전한 길이의 단백질은 Ra12와의 융합 단백질로서 발현되었다. WT1/N-말단 단백질은 TRX와의 융합 단백질로서 발현되었다. 대조군 Ra12 및 TRX 단백질은 유사한 방식으로 정제되었다. 그 결과, WT1 융합 단백질에 대한 혈청 항체 방응성이 상기 단백질의 WT1 부분에 대해 지시된다는 사실이 확인되었다.
도 18은 혈청학적 분석에 사용된 재조합 WT1 단백질의 특징을 제공해준다.
도 19A 내지 19E는 상이한 용량의 WT1 단백질로 백신접종함으로써 유발된 마우스에서의 항체 반응을 도시하는 막대 그래프이다.
도 20A 및 20B는 WT1 단백질로 면역시킨 마우스에서의 증식성 T-세포 반응의 막대 그래프이다.
도 21은 아데노 WT1 및 백시니아 WT1 감염 후 WT1를 발현하는, 형광성 현미경으로 검사된 사람 DC의 사진이다.
도 22는 사람 DC에서의 WT1 발현이 아데노 WT1 감염 후에 재현될 수 있고, 이는 대조군 아데노 감염에 의해서는 유도되지 않는다는 것을 입증해주는 사진이다.
도 23은 WT1 완전 유전자의 시험관내 프라이밍이 WT1 특이적 T-세포 반응을 유발시킨다는 것을 보여주는 IFN-감마 ELISPOT 검정 사진이다.
앞서 인지된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로, 악성 질병의 면역요법 및 진단용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 조성물은 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드, WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포(APC, 예를 들면, 수지상 세포), WT1 폴리펩티드와 결합하는 항체와 같은 제제 및/또는 WT1에 특이적인 면역계 세포(예: T 세포)를 포함할 수 있다. 본 발명의 WT1 폴리펩티드는 일반적으로, 윌름(Wilms) 종양 유전자 생성물(WT1)의 적어도 일부분 또는 이의 변이체를 포함한다. 본 발명의 핵산 서열은 일반적으로, 상기 폴리펩티드의 전부 또는 일부분을 암호화하거나 또는 이러한 서열에 상보적인 DNA 또는 RNA 서열을 포함한다. 항체는 일반적으로, WT1 폴리펩티드의 일부분과 결합할 수 있는 면역계 단백질 또는 이의 항원 결합성 단편이다. 상기 조성물 내에 이용될 수 있는 T 세포는 일반적으로, WT1 폴리펩티드에 특이적인 T 세포(예: CD4+ 및/또는 CD8+)이다. 본원에 기재된 특정의 방법은 본원에 제공된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포를 추가로 이용한다.
본 발명은 윌름 종양(WT) 유전자 생성물(예: WT1)에 대해 유발된 면역 반응 이, WT1 유전자 발현 증가를 특징으로 하는 악성 질병에 걸린 환자에 대해 예방적 및/또는 치료적 이점을 제공해줄 수 있다는 발견에 근거한 것이다. 이러한 질병에는 백혈병[예: 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 급성 림프구성 백혈병(ALL) 및 어린이 ALL] 뿐만 아니라 폐암, 유방암, 갑상선암 및 위장암 및 흑색종과 같은 많은 암이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. WT1 유전자는 윌름 종양이 있는 환자의 염색체 11p13에서의 세포발생적 결실에 기준하여 최초로 동정 및 분리되었다[참조: Call et al., 미국 특허 제5,350,840호]. 상기 유전자는 10개 엑손으로 이루어지고, 아연 핑거 전사 인자를 암호화하며, 마우스 및 사람 WT1 단백질의 서열이 도 1 및 서열 번호 319 및 320에 제공되어 있다.
WT1 폴리펩티드
본 발명의 맥락에서, WT1 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은, 본래의 WT1(즉, 유전자 변형되지 않은 유기체에 의해 발현된 WT1 단백질)의 적어도 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩티드이다. WT1 폴리펩티드는 임의의 길이일 수 있는데, 단 본래의 단백질의 적어도 면역원성 부분 또는 이의 변이체를 포함해야 한다. 달리 말하면, WT1 폴리펩티드는 올리고펩티드(즉, 펩티드 결합에 의해 연결된, 비교적 적은 수의 아미노산 잔기, 예를 들면, 8 내지 10개 잔기로 이루어짐), 완전한 길이의 WT1 단백질(예를 들면, 사람 또는 사람이 아닌 동물, 예를 들면, 마우스 내에 존재함) 또는 중간 크기의 폴리펩티드일 수 있다. 특정 양태 내에서, 본래의 WT1 폴리펩티드의 적은 수의 연속되는 아미노산 잔기를 함유하는 WT1 폴리펩티드를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩티드는 T 세포 반응의 발생이 요망되는 특정 용도에 바람직하다. 예를 들면, 이러한 WT1 폴리펩티드는 본래의 WT1 폴리펩티드의 23개 미만, 바람직하게는 18개 이하, 보다 바람직하게는 15개 이하의 연속되는 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 본래의 WT1 폴리펩티드의 9개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드가 일반적으로 상기 목적에 적합하다. 상기 본래의 단백질로부터 유도된 부가의 서열 및/또는 이종 서열이 어떠한 WT1 폴리펩티드 내에도 존재할 수 있고, 이러한 서열이 추가의 면역원성 또는 항원성 특성을 보유할 수도 있지만, 반드시 그럴 필요는 없다. 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩티드는 기타 폴리펩티드 또는 비-폴리펩티드 화합물과 추가로 연합(공유적 또는 비공유적)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 부분"은 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는)폴리펩티드의 일부분이다. 특정의 바람직한 면역원성 부분은 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자와 결합된다. 본원에 사용된 바와 같이, 면역원성 부분은 해당 결합이 당해 분야에 공지된 어떠한 검정을 이용해서도 탐지 가능할 경우에, MHC 부류 I 또는 부류 II 분자와 "결합"되는 것으로 보인다. 예를 들면, 특정의 폴리펩티드가 MHC 부류 I과 결합하는 능력은, 125I 표지된 β2-마이크로글로빈(β2m)을 MHC 부류 I/β2m/펩티드 헤테로-삼량체성 복합체 내로 혼입시키는 것을 증진시키는 능력을 모니터함으로써 간접적으로 평가할 수 있다[참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994]. 또 다른 한편, 당해 분야에 공지되어 있는 작용성 펩티드 경쟁 검정을 이용할 수 있다. 특정의 면역원성 부분은 표 II 내지 XIV 중의 하나 이상 내에 인용된 하나 이상의 서열을 갖는다. 대표적인 면역원성 부분에는 RDLNALLPAVPSLGGGG(사람 WT1 잔기 6-22; 서열 번호 1), PSQASSGQARMFPNAPYLPSCLE(사람 및 마우스 WT1 잔기 117-139; 각각 서열 번호 2 및 3), GATLKGVAAGSSSSVKWTE(사람 WT1 잔기 244-262; 서열 번호 4), GATLKGVAA(사람 WT1 잔기 244-252; 서열 번호 88), CMTWNQMNL(사람 및 마우스 WT1잔기 235-243; 각각 서열 번호 49 및 258), SCLESQPTI(마우스 WT1잔기 136-144; 서열 번호 296), SCLESQPAI(사람 WT1 잔기 136-144; 서열 번호 198), NLYQMTSQL(사람 및 마우스 WT1 잔기 225-233; 각각 서열 번호 147 및 284); ALLPAVSSL(마우스 WT1 잔기 10-18; 서열 번호 255); RMFPNAPYL(사람 및 마우스 WT1 잔기 126-134; 각각 서열 번호 185 및 293), VLDFAPPGA(사람 WT1 잔기 37-45; 서열 번호 241), 또는 VLDFAPPGAS(사람 WT1 잔기 37-46; 서열 번호 411)이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 추가의 면역원성 부분이 본원에 제공되며, 기타 부분은 일반적으로, 널리 공지된 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 이에 인용된 참조문헌에 요약된 바와 같은 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 면역원성 부분을 동정하기 위한 대표적인 기술에는, 폴리펩티드를 대상으로 하여 이것이 항원-특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 스크리닝하는 것이 포함된다. 본래의 WT1 폴리펩티드의 면역원성 부분은 완전한 길이의 WT1의 반응성 보다 실질적으로 덜하지 않는 수준으로 상기 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다(예를 들면, ELISA 및/또 는 T-세포 반응성 검정으로 이루어짐). 달리 말하면, 면역원성 부분은 상기 검정 내에서 완전한 길이의 폴리펩티드의 반응성과 유사하거나 이보다 큰 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 일반적으로, 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다.
또 다른 한편, 면역원성 부분은 Th 반응을 유발시키는 효능을 지니고 있는 펩티드 모티프에 대해 연구 조사하는 Tsites 프로그램[참조: Rothbard and Taylor, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996]과 같은 컴퓨터 분석을 이용하여 동정할 수 있다. 쥐과 및 사람 부류 I 또는 부류 II MHC와 결합하기에 적당한 모티프를 갖는 CTL 펩티드는 BIMAS[참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994] 및 기타 HLA 펩티드 결합 예측 분석법에 따라서 동정할 수 있다. 면역원성을 확인하기 위해, HLA A2 형질전환성 마우스 모델 및/또는 수지상 세포, 섬유아세포 또는 말초혈 세포를 이용하는 시험관내 자극 검정을 사용하여 펩티드를 시험할 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 조성물은 본래의 WT1 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리펩티드 "변이체"는 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서만 본래의 폴리펩티드와 상이한 폴리펩티드이며, 이로써 이러한 폴리펩티드의 면역원성은 보유된다(즉, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 폴리펩티드에 비해 실질적으로 저하되지 않는다). 달리 말하면, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 단백질에 비해 증강되거나 변하지 않을 수 있거나, 또는 본래의 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만 정도 저하될 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로, 상기 폴리펩티드 서열 중의 하나를 변형시킨 다음, 이와 같이 변형된 폴리펩티드와, 본원에 기재된 바와 같은 항혈청 및/또는 T-세포와의 반응성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, WT1 폴리펩티드의 면역원성 부분 내에서의 비교적 적은 수의 치환(예를 들면, 1 내지 3)이, 면역 반응을 유발시키는 해당 폴리펩티드의 능력을 증강시키는 작용을 할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 적합한 치환은 일반적으로, 상기 언급된 바와 같은 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 동정할 수 있고, 상기 변형된 폴리펩티드와 본원에 기재된 바와 같은 항혈청 및/또는 T 세포와의 반응성에 근거하여 효과를 확인하였다. 따라서, 특정의 바람직한 양태 내에서, WT1 폴리펩티드는, 항원 특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력이, 변형되지 않은 폴리펩티드의 능력 보다 통계상 더 크도록 면역원성 부분 내에서의 1 내지 3개 아미노산 잔기가 치환된 변이체를 포함한다. 이러한 치환은 바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 MHC 결합성 부위 내에 위치하며, 이는 상기 언급된 바와 같이 동정할 수 있다. 바람직한 치환은 MHC 부류 I 또는 부류 II 분자에 대한 결합을 증가시켜 준다.
특정의 변이체는 보존적 치환을 함유한다. "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 지니고 있는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이어서, 펩티드 화학 분야의 당업자는 이러한 폴리펩티드의 2차 구조와 친수(hydropathic) 특성이 실질적으로 변화되지 않는다고 예상할 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에 있어서의 유사성에 근거하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양전하를 띤 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 가지고 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산에는 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 기타 그룹의 아미노산에는 다음이 포함된다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his. 변이체는 또한, 비-보존적 변화를 가질 수도 있다. 변이체는 또한, 예를 들면, 해당 폴리펩티드의 면역원성, 2차 구조 및 친수(hydropathic) 특성에 최소한의 영향을 미치는 아미노산을 결실 또는 부가함으로써 변형시킬 수 있다.
바람직한 양태에서, WT1 N-말단의 변이체 폴리펩티드(아미노산 1-249)를 작제하는데, 이러한 변이체 폴리펩티드는 완전한 길이의 WT1 및/또는 WT1 N-말단 폴리펩티드를 인식하는 항체와 결합할 수 있다. 항체의 비-제한적 예는 항 WT1 항체 WT180((Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)이다.
앞서 인지된 바와 같이, WT1 폴리펩티드는 해당 단백질의 전달을 해독과 동시에 또는 해독 후에 지시하는, 이러한 단백질의 N-말단부에서 시그날(또는 리더) 서열과 접합될 수 있다. 상기 폴리펩티드는 또한, 이러한 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해, 또는 고체 지지체에 대한 상기 폴리펩티드의 결합을 증강시키기 위해 링커 또는 기타 서열(예: 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합시킬 수 있다.
WT1 폴리펩티드는 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 재조합 폴리펩티드는 상기 폴리뉴클레오티드로부터 용이하게 제조할 수 있다. 일반적으로, 당업자에 공지된 각종의 발현 벡터를 이용하여 재조합 WT1 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 어떠한 적당한 숙주 세포에서도 발현을 달성할 수 있다. 적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵성 세포가 포함된다. 바람직하게는, 이용된 숙주 세포는 이. 콜라이(E. coli), 효모 또는 포유류 세포주, 예를 들면, COS 또는 CHO이다. 재조합 폴리펩티드 또는 단백질을 배양 배지 내로 분비시키는데 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 먼저, 시판용 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 이어서, 이러한 농축액을 적합한 정제용 매트릭스, 예를 들면, 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용할 수 있다. 최종적으로, 하나 이상의 역 상 HPLC 단계를 이용하여 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제할 수 있다. 이러한 기술을 사용하여 본래의 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 제조할 수 있다. 예를 들면, 본래의 폴리펩티드의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 표준 돌연변이 유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위 특이적 돌연변이 유발을 사용하여 제조할 수 있고, 이러한 DNA 서열의 단편을 제거하여 절두된(truncated) 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여, 합성 수단에 의해 특정 부분 및 기타 변이체를 발생시킬 수도 있다. 예를 들면, 약 500개 미만, 바람직하게는 약 100개 미만, 보다 바람직하게는 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 합성할 수 있다. 폴리펩티드는 시판되고 있는 고체 상 기술, 예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체 상 합성법[이러한 방법에서는, 아미노산을 성장하는 아미노산 쇄에 연속해서 가한다][참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]을 사용하여 합성할 수 있다. 폴리펩티드 자동화 합성 장비는 공급업자[예를 들면, Applied BioSystems, Inc., Foster, City, CA]로부터 시판중이며, 이는 제조업자의 지시에 따라서 작동될 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분리된다. "분리된" 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 이의 본래의 환경으로부터 제거되는 것이다. 예를 들면, 천연 단백질은, 이들이 천연 시스템 내의 공존하는 물질 전부 또는 일부로부터 분리되는 경우에 분리되어진다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩티드는 순도가 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 이것이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝된 경우에 분리된 것으로 간주된다.
추가의 국면 내에서, 본 발명은 WT1 폴리펩티드의 모사체를 제공한다. 이러한 모사체는 하나 이상의 모사체에 연결된 아미노산(즉, WT1 단백질 내의 하나 이상의 아미노산이 아미노산 모사체로 대체될 수 있다)을 포함할 수 있거나, 또는 이것이 전적으로 비펩티드 모사체일 수 있다. 아미노산 모사체는 항원 특이적 항혈 청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력을 실질적으로 저하시키지 않으면서 WT1 폴리펩티드 내의 아미노산을 대체할 수 있도록 이러한 아미노산과 입체구조적으로 유사한 화합물이다. 비펩티드 모사체는 WT1-특이적 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 모사체의 능력이 WT1 폴리펩티드의 능력에 비해 실질적으로 저하되지 않도록 WT1 폴리펩티드와 유사한 전체 입체구조를 지니고 있고, 아미노산을 함유하지 않는 화합물이다. 이러한 모사체는 펩티드 서열의 3차원 구조를 평가해주는 표준 기술(예: 핵 자기 공명 및 컴퓨터 이용 기술)에 근거하여 고안할 수 있다. WT1 폴리펩티드의 하나 이상의 측쇄 작용기를, 반드시 동일한 크기 또는 용적을 지닐 필요는 없지만 유사한 생물학적 반응을 유발시키는 유사한 화학적 및/또는 물리적 특성을 지니고 있는 그룹으로 대체시킨 모사체를 고안할 수 있다. 본원에 기재된 양태 내에서, 모사체가 WT1 폴리펩티드를 대체할 수 있다는 것은 물론이다.
기타 예시 양태 내에서, 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 다중의 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드 및 관련되지 않은 서열, 예를 들면, 공지된 종양 단백질을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는, 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 도와주거나, 또는 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 증강제)을 발현시키는 것을 도와줄 수 있다. 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이면서 발현 증강성인 융합 파트너이다. 기타 융합 파트너는 해당 폴리펩티드의 용해도를 증가 시키거나 해당 폴리펩티드가 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 선택될 수 있다. 또한, 추가의 융합 파트너에는 상기 폴리펩티드의 정제를 촉진시키는 친화성 태그가 포함된다.
융합 폴리펩티드는 일반적으로, 화학적 접합을 포함한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩티드는 비-융합된 폴리펩티드에 비해, 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성시켜 주는 재조합 폴리펩티드로서 발현된다. 간략하게 언급하면, 당해 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 별도로 어셈블리하여, 적당한 발현 벡터 내로 연결시킬 수 있다. 하나의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을, 펩티드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 제2의 폴리펩티드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결시켜, 이들 서열의 판독 프레임이 동일한 상에 있게 한다. 이로써, 양 성분 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유하고 있는 단일 융합 단백질로 해독될 수 있다.
펩티드 링커 서열을 사용하여, 각각의 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되도록 보장해주기에 충분한 거리 정도 만큼 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 성분을 분리시킬 수 있다. 이러한 펩티드 링커 서열은 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩티드 내로 혼입시킨다. 적합한 펩티드 링커 서열은 다음 요인들을 기준으로 하여 선택할 수 있다: (1) 가요성 연장된 입체 구조에 적응하는 이들의 능력; (2) 상기 제1 및 제2 폴리펩티드 상의 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조에 적응하지 못하는 이들의 능력; 및 (3) 폴리펩티드 작용성 에피토프와 반응할 수도 있는 소수성 또는 전하를 띤 잔기의 결여. 바람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 기타 밀접한 중성 아미노산, 예를 들면, Thr 및 Ala를 링커 서열에 사용할 수도 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 제4,751,180호]에 기재된 것들이 포함된다. 링커 서열은 일반적으로 길이가 1 내지 약 50개 아미노산일 수 있다. 상기 제1 및 제2 폴리펩티드가, 작용성 도메인을 분리시키고 입체 간섭을 방지시키기 위해 사용될 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에는, 상기 링커 서열이 요구되지 않는다.
이와 같이 연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절성 요소에 작동적으로 연결된다. DNA의 발현에 관여하는 조절성 요소는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치되어 있다. 유사하게, 말단 해독에 요구되는 정지 코돈 및 전사 종결 시그날은 제2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
당해 융합 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를, 관련되지 않은 면역원성 단백질, 예를 들면, 회상 반응(recall response)을 유발시킬 수 있는 면역원성 단백질과 함께 포함할 수 있다. 이러한 단백질의 예에는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질이 포함된다[참조: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
한 가지 바람직한 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 미코박테륨 종, 예를 들면, 미코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)-유도된 Ra12 단편으로부터 유래된다. 이들을 이종 폴리뉴클레오티드/폴리펩티드 서열의 발현 및/또는 면역원성을 증강시키는데 사용하기 위한 Ra12 조성물 및 방법이 미국 특허원 제60/158,585호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입되어 있다)에 기재되어 있다. 간략하게 언급하면, Ra12는 미코박테륨 튜베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 아서열(subsequence)인 폴리뉴클레오티드 영역을 지칭한다. MTB32A는 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis)의 독성 및 무독성 균주 내의 유전자에 의해 암호화된 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열이 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: 미국 특허원 제60/158,585호; Skeiky et al., Infection and Immun. (1990) 67:3998-4007; 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. MTB32A 암호화 서열의 C-말단 단편은 높은 수준으로 발현되고, 이는 정제 과정 내내 가용성 폴리펩티드로서 존재한다. 더우기, Ra12는 이와 융합되는 이종 면역원성 폴리펩티드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 한 가지 바람직한 Ra12 융합 폴리펩티드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14kD C-말단 단편을 포함한다. 기타 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, Ra12 폴리펩티드의 일부분을 암호화하는, 약 15개 이상의 연속되는 뉴클레오티드, 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 약 200개 이상의 뉴클레오티드 또는 약 300개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오티드는 본래의 서열(즉, Ra12 폴리펩티드 또는 이의 부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오티드 변이체는, 암호화된 융합 폴리펩티드의 생물학적 활성이 본래의 Ra12 폴리펩티드를 포함하는 융합 폴리펩티드에 비해 실질적으로 저하되지 않도록, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 바람직하게는, 본래의 Ra12 폴리펩티드 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열과 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 가장 바람직하게는 약 90%의 동일성을 나타낸다.
기타 바람직한 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가, 그람-음성 세균 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유래된다(WO 91/18926). 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략 상기 단백질의 1/3(예를 들면, 제1 N-말단 100-110 아미노산)을 포함하고, 단백질 D 유도체를 지질화될 수 있다. 특정의 바람직한 양태 내에서는, 지단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N 말단 상에 포함되어 부가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 제공하고 이. 콜라이에서의 발현 수준을 증가시킨다(이로써 발현 증강제로서 작용함). 상기 지질 말미(tail)는 항원 표시 세포에 대한 항원의 최적의 표시를 보장해준다. 기타 융합 파트너에는 인플루엔자 바이러스인 NS1로부터의 비-구조 단백질(헤마글루티닌)이 포함된다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수도 있지만, 전형적으로, N-말단 81개 아미노산을 사용한다.
또 다른 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 LYTA로서 공지된 단백질, 또는 이의 일부분(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA(LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43:265-292, 1986)로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성시키는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유래된다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 내의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 오토리 신(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린 동족체, 예를 들면, DEAE에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현성 플라스미드의 개발을 이끌어내었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 문헌에 보고되었다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태 내에서는, LYTA의 반복 서열 부분을 융합 폴리펩티드 내로 혼입할 수 있다. 반복 서열 부분은 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 서열 부분에는 잔기 188-305가 혼입되어 있다.
또 다른 예시 양태는 융합 폴리펩티드, 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 관련이 있는데, 여기서 융합 파트너는 미국 특허 제5,633,234호에 기재된 바와 같이, 특정 폴리펩티드를 엔도솜/리소솜 구획에 지시할 수 있는 표적화 시그날을 포함한다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드가 이러한 표적화 시그날과 융합되는 경우, 상기 폴리펩티드는 MHC 부류 II 분자와 보다 효율적으로 연합됨으로써, 해당 폴리펩티드에 특이적인 CD4+ T-세포의 생체내 자극을 증강시킬 것이다.
본 발명은 융합 파트너를 부가하지 않고서도 이. 콜라이에서 재조합적으로 발현될 수 있는 WT1 폴리펩티드의 절두된 형태를 제공한다. 이들 절두된 형태의 예가 서열 번호 342-346에 제시되어 있고, 이는 서열 번호 337-341에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된다. 이들 절두물의 변형에서는, WT1의 처음 76개 아미노산을 해당 단백질의 C-말단에 융합시켜, 이. 콜라이에서 보다 더 용이하게 발 현되는 재조합 단백질을 생성시킨다. 이. 콜라이 이외의 기타 숙주, 예를 들면, 비. 메가테륨(B. megaterium)을 사용할 수도 있다. 상기 단백질은 히스티딘 태그 없이 추가로 제조할 수 있다.
기타 양태에서는, 상이한 소단위체를 만들고, 이를 본래의 WT1와는 상이한 순서로 함께 융합시킬 수 있다. 또한, 예를 들면, Ra12와 융합시킬 수 있다. 예시되는 융합 단백질이 서열 번호 332-336에 제시되어 있고, 이는 서열 번호 327-331에 제시된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
WT1 폴리뉴클레오티드
본원에 기재된 바와 같은 WT1 폴리펩티드를 암호화하는 어떠한 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 의해 포괄되는 WT1 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥(암호화 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. 부가의 암호화 또는 비-암호화 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수도 있으나, 반드시 존재할 필요는 없으며, 폴리뉴클레오티드가 기타 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수도 있으나, 반드시 연결될 필요는 없다.
WT1 폴리뉴클레오티드는 본래의 WT1 단백질를 암호화할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같은 WT1의 변이체를 암호화할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 상기 암호화된 폴리펩티드의 면역원성이 본래의 WT1 단백질에 비해 저하되지 않게 하는, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 암호 화된 폴리펩티드의 면역원성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 바람직한 변이체는, 본래의 WT1 서열의 면역원성 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 부분의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하에서 뉴클레오티드 치환, 결실, 삽입 및/또는 결실을 함유한다. 특정의 변이체는 본래의 유전자 또는 이의 일부분과 실질적으로 상동성이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 적당히 엄격한 조건 하에서, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 천연 DNA 서열(또는 이의 상보 서열)과 하이브리드화할 수 있다. 적합한 적당히 엄격한 조건에는 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50 내지 65℃, 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화시킨 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC를 각각 사용하여 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것이 포함된다. 이와 같이 DNA 서열을 하이브리드화시키는 것 역시 본 발명의 범주 내에 속한다.
유전적 암호의 축퇴성(degeneracy) 결과로 인해, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 많은 뉴클레오티드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 인지할 것이다. 이들 폴리뉴클레오티드 중의 몇몇은 본래의 어떠한 유전자의 뉴클레오티드 서열과도 최소한의 상동성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 코돈 활용의 차이로 인해 다양해진 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다.
상기 언급된 바와 같이, WT1의 면역원성 부분이 일단 동정되면, WT1 폴리펩티드를 각종 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, WT1 폴리뉴클레오티드는, WT1을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 접근 방법의 경우에는, 상기 면역원성 부분의 서열을 기준으로 하여 서열-특이적 프라이머를 고안할 수 있고, 이는 구입하거나 합성할 수 있다. 예를 들면, 사람 WT1 유전자의 PCR 증폭에 적합한 프라이머에는 다음이 포함된다: 제1 단계 - P118 : 1434-1414: 5'GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (서열 번호 5) 및 P135: 5' CTG AGC CTC AGC AAA TGG GC 3' (서열 번호 6); 제2 단계 - P136: 5'GAG CAT GCA TGG GCT CCG ACG TGC GGG 3' (서열 번호 7) 및 P137: 5'GGG GTA CCC ACT GAA CGG TCC CCG A 3' (서열 번호 8). 마우스 WT1 유전자의 PCR 증폭에 적합한 프라이머에는 다음이 포함된다: 제1 단계 - P138: 5'TCC GAG CCG CAC CTC ATG 3' (서열 번호 9) 및 P139: 5'GCC TGG GAT GCT GGA CTG 3' (서열 번호 10), 제2 단계 - P140: 5'GAG CAT GCG ATG GGT TCC GAC GTG CGG 3' (서열 번호 11) 및 P141: 5'GGG GTA CCT CAA AGC GCC ACG TGG AGT TT 3' (서열 번호 12).
이어서, 상기와 같이 증폭된 부분을 사용하여, 널리 공지된 기술을 이용하여, 사람 게놈 DNA 라이브러리로부터 또는 적합한 cDNA 라이브러리로부터 완전한 길이의 유전자를 분리시킬 수 있다. 또 다른 한편, 완전한 길이의 유전자는 다중 PCR 단편으로부터 작제할 수 있다. WT1 폴리뉴클레오티드는 또한, 올리고뉴클레오티드 성분들을 합성하고, 이들 성분을 함께 연결하여 완전한 폴리뉴클레오티드를 발생시킴으로써 제조할 수 있다.
WT1 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성(예를 들면, 고체 상 포스포르아미다이트 화학적 합성)을 포함한, 당해 분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 합성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열 내의 변형은, 표준 돌연변이 유발 기술, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드-지시된 부위-특이적 돌연변이 유발[참조: Adelman et al., DNA 2:183, 1983]을 이용하여 도입할 수도 있다. 또 다른 한편으론, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열을 시험관내 또는 생체내 전사함으로써 RNA 분자를 생성시킬 수 있는데, 단 상기 DNA는 적합한 RNA 폴리머라제 프로모터(예: T7 또는 SP6)를 갖는 벡터 내로 혼입시킨다. 특정 부분을 이용하여, 본원에 기재된 바와 같은 암호화된 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 또한, 또는 또 다른 한편, 특정 부분을 환자에게 투여하여, 상기 암호화된 폴리펩티드를 생체내에서 생성시킨다(예를 들면, 항원 표시 세포, 예를 들면, 수지상 세포를, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA 작제물로 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 상기 환자에게 투여한다).
WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 일반적으로, 상기 폴리펩티드를 시험관내 또는 생체 내에서 생성시키기 위해 사용할 수 있다. 암호화 서열에 상보적인 WT1 폴리뉴클레오티드(즉, 안티센스 폴리뉴클레오티드)는 또한, 프로브로서 사용되거나 또는 WT1 발현을 억제시키기 위해 사용될 수 있다. 안티센스 RNA로 전사될 수 있는 cDNA 작제물을 또한, 조직 세포 내로 도입하여 안티센스 RNA의 생성을 촉진시킬 수 있다.
어떠한 폴리뉴클레오티드도 추가로 변형시켜 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형법에는 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열을 부가하는 방법; 주쇄 내에 포스포디에스테라제 연결이 아닌 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 방법; 및/또는 비-전통적인 염기, 예를 들면, 이노신, 쿠에오신 및 위부토신(wybutosine)을 봉입시킬 뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘 의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 변형된 형태를 봉입시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 바와 같은 뉴클레오티드 서열은 확립된 재조합 DNA 기술을 사용하여 각종의 기타 뉴클레오티드 서열에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 파아지미드, 람다 파아지 유도체 및 코스미드(cosmid)를 포함한, 각종의 어떠한 클로닝 벡터 내로도 클로닝시킬 수 있다. 특히 관심있는 벡터에는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 서열 분석 벡터가 포함된다. 일반적으로, 벡터는 하나 이상의 유기체 내에서 작용성인 복제 기점, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 함유할 것이다. 기타 요소들은 목적하는 용도에 좌우될 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
특정의 양태 내에서, 폴리뉴클레오티드는 포유류 세포 내로 유입될 수 있고 이 안에서 발현되도록 제형화시킬 수 있다. 이러한 제형은 다음에 기재되는 바와 같이, 치료 목적에 특히 유용하다. 당업자는 폴리뉴클레오티드를 표적 세포에서 발현시키는데 수 많은 방법이 있다는 것을 인지할 것이며, 적합한 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드를 바이러스성 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 레트로바이러스, 또는 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스(예를 들면, 조류 폭스 바이러스) 내로 혼입시킬 수 있다. DNA를 상기 벡터 내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 레트로바이러스성 벡터는 부가적으로, 선별 마커에 대한 유전자(형질도입된 세포의 동정 또는 선별을 도와주기 위함) 및/또는 표적화 잔기, 예를 들면, 특이적 표적 세포 상의 수 용체에 대한 리간드를 암호화하는 유전자를 전이 또는 혼입시켜, 이러한 벡터가 표적 특이적이 되도록 한다. 표적화는 또한, 당업자에게 공지된 방법에 의해 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 벡터 내의 cDNA 작제물을 사용하여, 예를 들면, WT1 양성 종양 모델을 확립하는데 사용하기 위한 사람 또는 동물 세포주를 형질감염시킬 수 있으며, 이를 사용하여, 상기 세포의 종양 또는 백혈병-성장 억제 또는 용해를 입증해주는 종양 예방 및 양자(adoptive) 면역요법 실험을 수행할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 기타 치료학적 제형에는 콜로이드성 분산 시스템, 예를 들면, 거대 분자 복합체, 나노캅셀제, 미세구, 비드 및 지질-이용 시스템(수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜 포함)이 포함된다. 시험관내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하는데 바람직한 콜로이드성 시스템은 리포솜(즉, 인공 막 소포)이다. 이러한 시스템의 제조 및 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
항체 및 이의 단편
본 발명은 추가로, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합되는 결합성 제제, 예를 들면, 항체 및 이의 항원-결합성 단편을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 제제는, 이것이 WT1 폴리펩티드와 탐지 가능한 수준(예를 들면, ELISA 내에서)으로 반응하고 유사한 조건 하에 관련되지 않은 단백질과는 탐지 가능한 수준으로 반응하지 않는 경우에, WT1 폴리펩티드와 "특이적으로 결합"되는 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같은 "결합성"은 "복합체"가 형성되도록 2개의 별개의 분자 간의 비공유적 연합을 지칭한다. 결합 능력은, 예를 들면, 상기 복합체의 형성을 위한 결합 상수를 결정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 결합 상수는 상기 복합체의 농도를 성분 생성물 농도로 나눈 값이다. 일반적으로, 복합체 형성을 위한 결합 상수가 약 103L/mol을 초과하는 경우에, 두 화합물은 본 발명의 맥락에서 "결합"된 것으로 간주된다. 결합 상수는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
상기 요구 사항을 충족시키는 어떠한 제제도 결합성 제제일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 결합성 제제가 항체 또는 이의 항원 결합성 단편이다. 특정 항체가 예를 들면, 공급업자[Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)]로부터 시판되고 있다. 또 다른 한편, 항체는 당업자에게 공지된 각종 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에 의해, 또는 재조합 항체의 생성을 허용하기 위해, 항체 유전자를 적합한 세균성 또는 포유류 세포 숙주 내로 형질감염시키는 것을 통하여 생성시킬 수 있다. 하나의 기술에서는, 당해 폴리펩티드를 포함하는 면역원을 광범위한 모든 포유류[예: 마우스, 랫트, 토끼, 양(sheep) 또는 염소(goat)]에게 초기에 주입한다. 이 단계에서는, 본 발명의 폴리펩티드가 변형되지 않고서도 면역원으로서 제공될 수 있다. 또 다른 한편, 특히, 비교적 짧은 폴리펩티드의 경우에는, 이러한 폴리펩티드를 소의 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanion)과 같은 운반 단백질에 연결시킨 경우에 뛰 어난 면역 반응이 유발될 수 있다. 이러한 면역원을, 바람직하게는 하나 이상의 부스터(booster) 면역화 과정이 들어간 예정된 스케쥴에 따라서 동물 숙주에게 주사하고, 이 동물로부터 주기적으로 채혈한다. 이어서, 당해 폴리펩티드에 특이적인 폴리클로날 항체를, 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩티드를 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
관심있는 항원성 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)]의 기술 및 이에 대한 개선 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 관심있는 폴리펩티드와의 반응성)을 지닌 항체를 생산할 수 있는 불멸의 세포주를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 면역시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 비장 세포를, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 상기 면역시킨 동물과 유전적동계인 것과 융합시킴으로써 불멸화시킨다. 각종 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수종 세포를 수 분 동안 비이온성 세정제에서 함께 배합한 다음, 하이브리드 세포의 성장은 뒷받침 해주지만 골수종 세포의 성장은 뒷받침 해주지 않는 선별 배지 상에서 저밀도로 도말한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 이용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이의 배양 상등액을 대상으로 하여, 당해 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 시험하였다. 높은 반응성과 특이성을 지닌 하이브리도마가 바람직하 다.
성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 모노클로날 항체를 분리할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포주를 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강 내로 주사하는 것과 같은 각종 기술을 이용하여 수율을 증가시킬 수 있다. 이어서, 복수 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 상기 항체로부터 오염물을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 단계로 정제 공정에 사용할 수 있다.
특정 양태 내에서는, 항체의 항원 결합성 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단편에는 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편이 포함된다. 간략하게 언급하면, 면역글로불린을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 래빗 혈청으로부터 정제할 수 있고[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], 파파인에 의해 분해시켜 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. 이러한 Fab 및 Fc 단편을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 분리시킬 수 있다.
모노클로날 항체 및 이의 단편을 하나 이상의 치료제에 커플링시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 제제에는 방사성 추적 표지 및 화학요법제가 포함된다. 대표적인 치료제에는 방사성핵종, 분화 유도제, 약제, 독소, 및 이들의 유도체가 포함된다. 바람직한 방사성핵종에는 90Y, 123I, 125I, 131I,
186Re, 188Re, 211At 및 212Bi가 포함된다. 바람직한 약제에는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 동족체가 포함된다. 바람직한 분화 유도체에는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 바람직한 독소에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라(Shigella) 독소 및 포크위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질이 포함된다. 진단 목적을 위해, 방사성 제제 커플링을 이용하여, 전이 추적을 촉진시키거나 또는 WT1-양성 종양의 우치를 결정할 수 있다.
치료제를 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통함) 커플링시킬 수 있다(예를 들면, 공유 결합시킴). 각각이 서로 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에는, 치료제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들면, 어느 하나의 친핵성 그룹, 예를 들면, 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은, 다른 하나의 우수한 이탈 그룹(예: 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹, 또는 카보닐 함유 그룹, 예를 들면, 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있다.
또 다른 한편, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통하여 커플링시키는 것이 요망될 수도 있다. 링커 그룹은 결합 능력이 간섭받는 것을 피하기 위해 항체와 치료제 사이에 간격을 두는 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시킴으로써, 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 화학적 반응성 증가로 인해, 가능하지 않았던, 제제 또는 제제 상의 작용성 그룹의 사용을 촉진시킬 수도 있다.
호모-작용성 및 헤테로-작용성인 각종 이작용성 또는 다작용성 시약(예를 들면, Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 카탈로그에 기재된 것)이 링커 그룹으로 서 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 커플링 반응은, 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에 관해 기재된 수 많은 참조문헌이 있다[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)].
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분으로부터 분리될 때 보다 효능이 큰 경우에는, 세포 내로의 내부 이행 동안 또는 내부 이행시 절단 가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 요망될 수 있다. 수 많은 상이한 절단 가능한 링커 그룹이 보고되었다. 이들 링커 그룹으로부터의 제제의 세포내 방출 기전에는 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 절단시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호(Spitler)], 광 불안정한 결합에 조사하는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호(Senter et al.)], 유도체화된 아미노산 측쇄를 가수분해시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호(Kohn et al.)], 혈청 보체 매개된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)] 및 산 촉매된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호(Blattler et al.)]이 포함된다.
하나 이상의 제제를 항체에 커플링시키는 것이 요망될 수 있다. 한 양태에서는, 제제의 다중 분자를 하나의 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 양태에서는, 한 가지 이상의 유형의 제제를 하나의 항체에 커플링시킬 수 있다. 특정 양태에 상관없이, 하나 이상의 제제와의 면역접합체를 각종 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 커플링시키거나, 또는 부착용 다중 부위를 제공해주는 링커를 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 담체를 사용할 수 있다. 담체는 직접적인 공유 결합 또는 링커 그룹을 통한 공유 결합을 포함한 각종 방법으로 상기 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체에는 단백질, 예를 들면, 알부민[참조: 미국 특허 제4,507,234호(Kato et al.)], 펩티드 및 폴리삭카라이드, 예를 들면, 아미노덱스트란[참조: 미국 특허 제4,699,784호(Shih et al.)]이 포함된다. 담체는 비공유 결합에 의해, 또는 리포솜 소포 내에서의 캡슐화에 의해 특정 제제를 보유할 수도 있다[참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,008호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체에는 방사성할로겐화 작은 분자 및 킬레이트화 화합물이 포함된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사성할로겐화 작은 분자 및 이의 합성법이 기재되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속 또는 금속 산화물 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이의 합성법이 기재되어 있다.
항체 및 면역접합체에 대한 각종 투여 경로를 이용할 수 있다. 전형적으로, 투여는 정맥내, 근육내, 피하, 또는 절개된 종양 층 내일 것이다. 항체/면역접합체의 정확한 용량은 사용된 항체, 종양 상의 항원 밀도, 및 항체의 소거(clearance) 속도에 따라서 다양할 것이라는 것은 명백하다.
WT1의 면역원성 부분을 모사하는 항-개별특이형 항체가 또한 본원에 제공된다. 이러한 항체는 널리 공지된 기술을 사용하여, WT1의 면역원성 부분과 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편에 대해 생성될 수 있다. WT1의 면역원성 부분을 모사하는 항-개별특이형 항체는 본원에 기재된 바와 같은, WT1의 면역원성 부분과 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원 결합성 단편에 결합되는 항체이다.
T 세포
면역치료학적 조성물은 또한, WT1에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 일반적으로, 표준 과정을 사용하여 시험관내 또는 생체 외에서 제조할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 공급업자[CellPro Inc., Bothell WA]로부터 입수 가능한 CEPRATE™ 시스템과 같은 시판용 세포 분리 시스템을 사용하여, 포유류, 예를 들면, 환자의 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 특정 분획 내에 존재하거나 이로부터 분리시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호; 제5,215,926호; WO 89/06280; WO 91/16116 및 WO 92/07243]. 또 다른 한편, T 세포는 관련되거나 관련되지 않은 사람, 비-사람 포유류, 세포주 또는 배양물로부터 유래될 수 있다.
T 세포는 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 WT1 폴리펩티드에 특이적인 T 세포를 발생시키는데 충분한 조건 및 시간 하에서 수행한다. 바람직하게는, WT1 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드는 전달 비히클, 예를 들면, 미세구 내에 존재하여 항원 특이적 T 세포의 발생을 촉진시킨다. 간략하게 언급하면, 통상적인 기술(예를 들면, 말초혈 림프구를 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리시킴)에 의해 환자, 또는 관련되거나 관련되지 않은 공여자로부터 분리시킬 수 있는 T 세포를 WT1 폴리펩티드와 함께 항온처리한다. 예를 들면, T 세포를 WT1 폴리펩티드(예: 5 내지 25㎍/ml) 또는 필적하는 양양의 WT1 폴리펩티드를 합성하는 세포와 함께 37℃에서 2 내지 9일 동안(전형적으로 4일 동안) 시험관내에서 항온처리할 수 있다. 대조군으로서 작용하는, WT1 폴리펩티드의 부재하에 별개의 분취량의 T 세포 샘플을 항온처리하는 것이 요망될 수 있다.
T 세포는, 이러한 T 세포가 WT1 폴리펩티드로 피복되거나 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 경우에, WT1 폴리펩티드에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 각종 표준 기술 중의 어떠한 것을 사용해서도 평가할 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 검정 또는 증식 검정 내에서는, 음성 대조군과 비교해서 용해 및/또는 증식을 2배 이상 증가시키는 자극 지수는 T 세포 특이성을 지시해준다. 이러한 검정은, 예를 들면, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또 다른 한편, T 세포 증식의 탐지는 공지된 각종 기술에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성 증가 속도를 측정함으로써(예를 들면, T 세포 배양물을 삼중수소화 티미딘으로 펄스-표지화시킨 다음, DNA 내로 혼입된 삼중수소화 티미딘의 양을 측정함으로써) 탐지할 수 있다. T 세포 증식을 탐지하는 기타 방법에는 인터루킨-2(IL-2) 생성 증가, Ca2+ 유출 증가 또는 염료 흡수 증가, 예를 들면, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐-테트라졸륨 흡수 증가를 측정하는 것이 포함된다. 또 다른 한편, 림포킨(예: 인터페론-감마)의 합성을 측정할 수 있거나, 또는 WT1 폴리펩티드에 반응할 수 있는 T 세포의 상대 수를 정량화할 수 있다. WT1 폴리펩티드(200ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 100ng/ml 내지 25㎍/ml)와 3 내지 7일 동안 접촉시키면, T 세포의 증식이 2배 이상 증가되어야 하고, 상기 언급된 바와 같이 2 내지 3시간 접촉시키면, T 세포가 활성화되어야 하는데, 이는 사이토킨 방출(예를 들면, TNF 또는 IFN-γ) 수준의 2배 증가가 T 세포 활성화를 지시해주는 표준 사이토킨 검정을 이용하여 측정하였다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience(Greene 1998)]. WT1 특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증대시킬 수 있다. 바람직한 양태 내에서, 이러한 T 세포는 환자, 또는 관련되거나 관련되지 않은 공여자로부터 유도시키고, 이를 자극 및 증진시킨 후에 환자에게 투여한다.
WT1 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 WT1-발현성 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포의 특이적 활성화는 각종 방식으로 탐지할 수 있다. 특이적 T 세포 활성화를 탐지하는 방법에는 T 세포의 증식, 사이토킨(예: 림포킨)의 생성 또는 세포용해 활성 발생(즉, WT1에 특이적인 세포독성 T 세포의 발생)을 탐지하는 방법이 포함된다. CD4+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 탐지하는 바람직한 방법은 T 세포의 증식을 평가함으로써 탐지하는 방법이다. CD8+ T 세포의 경우, 특이적 T 세포 활성화를 탐지하는 바람직한 방법은 세포용해 활성 발생을 탐지하는 방법이다.
치료 목적상, WT1 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포를 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 증대시킬 수 있다. 시험관내에서의 이러한 T 세포의 증식은 각종 방법으로 달성할 수 있다. T 세포는, T 세포 성장 인자, 예를 들면, 인터루킨-2, 및/또는 WT1 폴리펩티드를 합성하는 자극인자 세포를 부가하거나 부가하지 않으면서, WT1 폴리펩티드에 다시 노출시킬 수 있다. CD8+ T 세포 반응을 발생하는 경우에는, 자극인자 세포를 부가하는 것이 바람직하다. T 세포를, WT1 폴리펩티드로의 간헐적 재자극에 반응하여 특이성을 보존하면서 시험관 내에서 상당 수 성장시킬 수 있다. 간략하게 언급하면, 1차 시험관내 자극(IVS)의 경우에는, 다수의 림프구(예를 들면, 4 x 107 초과)를, 사람 혈청을 함유하는 배지가 있는 플라스크 내에 놓아둘 수 있다. WT1 폴리펩티드(예를 들면, 10㎍/ml에서의 펩티드)를 파상풍 톡소이드(예: 5㎍/ml)와 함께 직접 가할 수 있다. 이어서, 상기 플라스크를 항온처리한다(예를 들면, 37℃에서 7일 동안). 제2의 IVS의 경우에는, T 세포를 수거한 다음, 이를 2 내지 3 x 107개의 방사선조사된 말초혈 단핵 세포가 있는 새로운 플라스크에 놓아둘 수 있다. WT1 폴리펩티드(예를 들면, 10㎍/ml)를 직접 가한다. 상기 플라스크를 37℃에서 7일 동안 항온처리한다. 제2 IVS한지 2일 및 4일 후에, 2 내지 5단위의 인터루킨-2(IL-2)를 가할 수 있다. 제3 IVS의 경우에는, T 세포를 웰에 놓아두고, 상기 펩티드로 피복된 개개인 자신의 EBV 형질전환된 B 세포로 자극시킬 수 있다. 각 주기의 2일 및 4일째에 IL-2를 가할 수 있다. 상기 세포가 특이적 세포독성 T 세포인 것으로 밝혀지자 마자, 이들 세포를 대상으로 하여, 2, 4 및 6일째에 더 많은 양의 IL-2(20단위)로의 10일 자극 주기를 이용하여 증대시킬 수 있다.
또 다른 한편, WT1 폴리펩티드의 존재 하에 증식되는 하나 이상의 T 세포는 클로닝시킴으로써 수적으로 증대시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 제한 희석법이 포함된다. 반응인자 T 세포를 밀도 구배 원심분리 및 양(sheep) 적혈구 로세팅(rosetting)시킴으로써 감작화된 환자의 말초혈로부터 정제하고, 방사선조사된 자가유래성 충전제 세포의 존재 하에 공칭 항원으로 자극시킴으로써 배양물 내에 확립시킬 수 있다. CD4+ T 세포주를 생성시키기 위해, WT1 폴리펩티드를 항원성 자극으로서 사용하고, 엡슈타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus)로 감염시킴으로써 불멸화시킨 자가유래성 말초혈 림프구(PBL) 또는 림프아구성 세포주(LCL)을 항원 표시 세포로서 사용한다. CD8+ T 세포를 생성시키기 위해, WT1 폴리펩티드를 생산하는 발현 벡터로 형질감염된 자가유래성 항원 표시 세포를 자극인자 세포로서 사용할 수 있다. 확립된 T 세포주는, 1 x 106개의 방사선조사된 PBL 또는 LCL 세포 및 재조합 인터루킨-2(rIL-2)(50U/ml)를 96-웰 편평한 바닥 판에서 웰당 0.5개 세포 횟수로 자극된 T 세포에 도말함으로써 항원 자극을 수행한지 2 내지 4일 후에, 클로닝할 수 있다. 초기 도말한지 대략 2 내지 3주 후에, 확립된 클론성 성장을 나타내는 웰을 동정할 수 있으며, 자가유래성 항원 표시 세포의 존재 하에 적당한 항원으로 재자극한 다음, 항원 자극시킨지 2 내지 3일 후에 저용량의 rIL2(10U/ml)을 가함으로써 증대시킬 수 있다. 대 략 2주마다 항원 및 rIL2로 주기적으로 재자극시킴으로써, T 세포 클론을 24-웰 판에 유지시킬 수 있다.
특정 양태 내에서는, 동종이형 T 세포를 생체내 및/또는 시험관내에서 프라이밍시킬 수 있다(즉, WT1에 감작화시킴). 이러한 프라이밍은 T 세포를, T 세포의 프라이밍을 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에 WT1 폴리펩티드, 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리펩티드를 생산하는 세포와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다. 일반적으로, T 세포는, 예를 들면, WT1 폴리펩티드와의 접촉으로 인해, 본원에 기재된 바와 같은 표준 증식, 크롬 방출 및/또는 사이토킨 방출 검정으로 측정된 바와 같이 T 세포가 증식 및/또는 활성화되는 경우에 프라이밍된 것으로 간주된다. 음성 대조군과 비교해서, 증식 또는 용해가 2배 이상 증가하고 사이토킨 수준이 3배 이상 증가한 자극 지수는 T 세포 특이성을 지시해준다. 시험관내에서 프라이밍된 세포를, 예를 들면, 골수 이식에 이용하거나 또는 공여자 림프구 주입물로서 이용할 수 있다.
WT1에 특이적인 T 세포는 WT1 단백질을 발현하는 세포를 사멸시킬 수 있다. WT1에 대한 T 세포 수용체(TCR) 쇄를 암호화하는 유전자의 도입을, WT1 보유 백혈병 또는 암 세포에 대한 반응을 정량적 및 정성적으로 개선시키기 위한 수단으로서 사용한다. WT1 양성 세포와 반응할 수 있는 T 세포의 수를 증가시키기 위한 백신이 WT1 보유 세포를 표적화시키는 한 가지 방법이다. WT1에 특이적인 T 세포를 이용한 T 세포 요법이 또 다른 방법이다. 대체 방법은 상기 WT1에 특이적인 TCR 쇄를, T 세포 또는 용해 효능을 지니고 있는 기타 세포 내로 도입하는 것이다. 적합 한 양태에서는, 상기 TCR 알파 및 베타 쇄를 WT1 특이적 T 세포로부터 클로닝하고, 이를, 예를 들면, 본원에 참조문헌으로써 삽입된 WO 96/30516에 기재된 바와 같은 양자 T 세포 요법에 사용한다.
약제학적 조성물 및 백신
특정 국면 내에서, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 및/또는 T 세포를 약제학적 조성물 또는 백신에 혼입시킬 수 있다. 또 다른 한편, 약제학적 조성물은 항원 표시 세포가 WT1 폴리펩티드를 발현하도록 WT1 폴리뉴클레오티드로 형질감염시킨 상기 항원 표시 세포(예: 수지상 세포)를 포함할 수 있다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 상기 화합물 또는 세포와 생리학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 특정의 백신은 하나 이상의 상기 화합물 또는 세포와 비-특이적 면역 반응 증강제, 예를 들면, 아주반트 또는 리포솜(이 안으로 상기 화합물이 혼입된다)을 포함할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 전달 시스템, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기재된 생분해 가능한 미세구를 부가적으로 함유할 수 있다. 본 발명의 범위 내의 약제학적 조성물 및 백신은 생물학적 활성 또는 비활성일 수 있는 기타 화합물을 함유할 수도 있다.
특정의 양태 내에서, 약제학적 조성물 및 백신은 환자(예: 사람)에게서 WT1 폴리펩티드에 특이적인 T 세포 반응을 유발시키도록 고안된다. 일반적으로, T 세포 반응은 비교적 짧은 폴리펩티드(예를 들면, 본래의 WT1 폴리펩티드의 23개 미만의 연속되는 아미노산 잔기, 바람직하게는 4 내지 16개의 연속되는 잔기, 보다 바 람직하게는 8 내지 16개의 연속되는 잔기, 더 더욱 바람직하게는 8 내지 10개의 연속되는 잔기를 포함한다)를 사용하는 것을 선호할 수 있다. 또 다른 한편 또는 또한, 백신은 T 세포 반응을 우선적으로 증강시키는 비특이적 면역 반응 증강제를 포함할 수 있다. 달리 말하면, 면역 반응 증강제는, 항체 반응을 증강시키는 양 보다 비례적으로 큰 양에 의해 WT1 폴리펩티드에 대한 T 세포 반응 수준을 증강시킬 수 있다. 예를 들면, 표준 오일-기제 아주반트, 예를 들면, CFA와 비교해 보면, T 세포 반응을 우선적으로 증강시키는 면역 반응 증강제는, 항체 반응을 탐지 가능한 수준으로 증강시키지 않는 WT1-음성 대조군 세포주와 비교해서, 증식성 T 세포 반응을 2배 이상 증강시키고, 용해 반응을 10% 이상 증강시키고/시키거나 T 세포 활성화를 2배 이상 증강시킬 수 있다. WT1 폴리펩티드에 대한 T 세포 또는 항체 반응을 증강시키는 양은 일반적으로, 당해 분야에 공지된 대표적인 기술, 예를 들면, 본원에 기재된 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
약제학적 조성물 또는 백신은, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩티드가 동일계(in situ)에서 생성되도록 이러한 폴리펩티드 하나 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있다. 앞서 인지된 바와 같이, 상기 DNA는 핵산 발현 시스템, 세균성 및 바이러스성 발현 시스템 및 포유류 발현 시스템을 포함한, 당업자에게 공지된 각종 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현에 필요한 DNA, cDNA 또는 RNA 서열(예: 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균성 전달 시스템은 이의 세포 표면 상에서 당해 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하는 세균[예: Bacillus-Calmette-Guerrin]을 투여하는 것을 포함 한다. 바람직한 양태에서는, 상기 DNA를 바이러스성 발현 시스템(예: 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입할 수 있는데, 이는 비-병원성(결함있는)의 복제 적격한 바이러스를 사용하는 것을 포함할 수 있다. DNA를 상기 발현 시스템 내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 DNA는 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749(1993); and Cohen, Science 259:1691-1692(1993)]에 기재된 바와 같이 "나출된(naked)" 것일 수 있다. 나출된 DNA의 흡수는, 해당 세포 내로 효율적으로 수송시켜주는 생분해 가능한 비드 상에 상기 DNA를 피복시킴으로써 증가시킬 수 있다.
앞서 인지된 바와 같이, 약제학적 조성물 또는 백신은 WT1 폴리펩티드를 발현하는 항원 표시 세포를 포함할 수 있다. 치료 목적상, 앞서 기재된 바와 같이, 항원 표시 세포는 바람직하게는 자가유래성 수지상 세포이다. 이러한 세포는 표준 기술, 예를 들면, 문헌[참조: Reeves et al., Cancer Res. 56:5672-5677, 1996; Tuting et al., J. Immunol. 160:1139-1147, 1998, and Nair et al., Nature Biotechnol. 16:364-369, 1998]에 기재된 기술을 사용하여 제조 및 형질감염시킬 수 있다. WT1 폴리펩티드를 항원 표시 세포의 표면 상에 발현시키는 것은, 본원에 기재된 바와 같은 크롬 방출 검정 뿐만 아니라 시험관내 자극 및 표준 증식으로써 확인할 수 있다.
당업자에게 공지된 적합한 어떠한 담체도 본 발명의 약제학적 조성물에 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라서 결정될 것이다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한, 적당한 투여 방식을 위해 제형화할 수 있다. 비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사인 경우에는, 담체가 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우에는, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 탈큠, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고형 담체 또는 상기 담체 중의 어떠한 것도 이용할 수 있다. 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 이용할 수 있다. 특정한 국소 투여의 경우에는, 널리 공지된 성분을 이용한 크림 또는 로션으로서의 제형이 바람직하다.
상기 조성물은 완충제(예: 중성 완충된 식염수 또는 인산염 완충된 식염수), 탄수화물(예: 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩티드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신, 산화방지제, 킬레이트제, 예를 들면, EDTA 또는 글루타치온, 아주반트(예: 수산화알루미늄) 및/또는 방부제를 포함할 수도 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 조성물은 동결 건조물로서 제형화시킬 수 있다. 널리 공지된 기술을 사용하여 화합물을 리포솜 내에 캡슐화시킬 수도 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 조성물이, 트레할로즈, 말토즈, 슈크로즈, 프럭토즈 및 글루코즈를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 당을 포함하는 완충제를, 일반적으로 약 1 내지 25%, 전형적으로 약 7 내지 13%의 농도로 포함한다. 추가의 양태에서는, 상기 농도가 약 8 내지 약 12%이다. 또한 추가의 양태에서는, 상기 농도가 약 10%이다. 본 발명의 부가의 국면에서는, 상기 조성물이 에탄올아민; 시 스테인; 또는 폴리솔베이트-80을, 일반적으로 해당 제형의 효능, 안정성 및/또는 용해도를 증강시키기에 유효한 농도로 포함할 수 있다.
각종의 비특이적 면역 반응 증강제, 예를 들면, 아주반트를 본 발명의 백신에 사용할 수 있다. 대부분의 아주반트는 항원이 신속하게 이화되지 못하도록 고안된 물질, 예를 들면, 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들면, 지질 A, 보르타델라 페르튜시스(Bortadella pertussis) 또는 미코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다. 적합한 비특이적 면역 반응 증강제에는 백반(alum)-기제 아주반트(예를 들면, 알하이드로겔, 리하이드로겔, 인산알루미늄, 알가물린, 수산화알루미늄); 오일-기제 아주반트(프로인트 아주반트(FA)(Specol, RIBI, TiterMax); 몬타나이드 ISA50 또는 몬타나이드 ISA 720(공급처: Seppic, France); 사이토킨(예를 들면, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 미세구; 비이온성 블럭 공중합체-기제 아주반트; 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)-기제 아주반트 AS-1, AS-2(공급처: Smith Kline Beecham); 리비(Ribi) 아주반트 시스템-기제 아주반트; QS21(공급처: Aquila); 사포닌-기제 아주반트(조 사포닌, 사포닌 Quil A); 무라밀 디펩티드(MDP)-기제 아주반트, 예를 들면, SAF(이의 미세유동화 형태의 신텍스 아주반트(SAF-m)); 디메틸-디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA); 사람 보체-기제 아주반트 엠. 박새(m. vaccae) 및 유도체; 면역 자극 복합체(iscom) 이용 아주반트; 불활성화 독소; 및 약독화 감염성 제제(예: 엠. 튜베르쿨로시스)가 포함된다.
본 발명의 약제학적 조성물에 사용하기 위한 부가의 예시적인 아주반트에는, 현재 계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같은, SAF(공급처: Chiron, California, United States), ISCOMS(공급처: CSL), MF-59(공급처: Chiron), SBAS 시리즈의 아주반트[예를 들면, SBAS-2 또는 SBAS-4(공급처: SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)], Detox(인핸진(Enhanzyn)®)(공급처: Corixa, Hamilton, MT), RC-529(공급처: Corixa, Hamilton, MT) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트(AGPs); 및 WO 99/52549A1에 기재된 바와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 아주반트가 포함된다.
기타 바람직한 아주반트에는 다음 화학식 I의 아주반트 분자가 포함된다:
상기식에서,
n은 1 내지 50이고, A는 결합 또는 -C(O)-이며, R은 C1-50 알킬 또는 페닐 C1-50 알킬이다.
본 발명의 한 양태는, n이 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고; R 성분이 C1-50, 바람직하게는 C4-C20 알킬, 가장 바람직하게는 C12 알킬이고, A가 결합인 화학식 I의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 이루어진다. 상기 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%의 범위여야 한다. 바람직한 폴리옥 시에틸렌 에테르는 다음 그룹 중에서 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르가 머크 인덱스(12th 판: entry 7717)에 기재되어 있다. 이들 아주반트 분자는 WO 99/52549에 기재되어 있다.
상기 화학식 I에 따르는 폴리옥시에틸렌 에테르는 경우에 따라, 또 다른 아주반트와 조합할 수 있다. 예를 들면, 바람직한 아주반트 조합물은, 계류중인 영국 특허원 GB 9820956.2에 기재된 바와 같은 CpG를 갖는 것이 바람직하다.
앞서 인지된 바와 같이, 면역 반응 증강제는 WT1 폴리펩티드에 대한 T 세포 반응(예를 들면, CD4+ 및/또는 CD8+)을 우선적으로 유발시키거나 증강시키는 이들의 능력에 근거하여 선택한다. 이러한 면역 반응 증강제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 몬타나이드 ISA50 또는 Seppic 몬타나이드 ISA 720; 사이토킨(예를 들면, GM-CSF 또는 Flat3-리간드); 미세구; 디메틸 디옥타데실 암모늄브로마이드(DDA)-기제 아주반트 AS-1, AS-2(공급처: Smith Kline Beecham); 리비 아주반트 시스템-기제 아주반트; QS21(공급처: Aquila); 사포닌-기제 아주반트(조 사포닌, 사포닌 Quil A); 이의 미세유동화 형태의 신텍스 아주반트(SAF-m)); MV; ddMV(공급처: Genesis); 면역 자극 복합체(iscom)-기제 아주반트 및 불활성화 독소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 국면에서는, 조성물이, 주로 Th1 유형 반응을 유발시키기 위한 아주반트를 포함할 수 있다. 주로 Th1-유형 반응을 유발시키는데 사용하기 바람직한 특정의 아주반트에는, 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염과의 조합물이 있다. MPL® 아주반트, 예를 들면, MPL-SE는 다음 공급처(Corixa Corporation, Seattle, WA; 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조)로부터 입수 가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드(여기서, CpG 디뉴클레오티드는 메틸화되지 않는다)가 또한, 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있고, 예를 들면, WO 96/02555 및 WO 99/33488, 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열이 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Sato et al., Science 273:352, 1996]에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 아주반트는 사포닌, 예를 들면, Quil A, 또는 이의 유도체[QS21 및 QS7(공급처: Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); 에신; 디기토닌; 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 케노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌 포함]를 포함한다. 기타 바람직한 제형은 본 발명의 아주반트 조합물 내에 하나 이상의 사포닌을 포함하는데, 예를 들면, QS21, QS7, Quil A, β-에신 또는 디기토닌을 포함하는 그룹 중의 둘 이상의 조합물이다.
본원에 기재된 조성물 및 백신은 지속 방출형 제형[즉, 투여 후에 화합물을 서서히 방출시키는 제형, 예를 들면, 캅셀제 또는 스폰지]의 일부로서 투여할 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로, 널리 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있고, 예를 들면, 경구, 직장 또는 피하 주입하여 투여하거나 목적하는 표적 부위에 주입함으로써 투여할 수 있다. 지속 방출형 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나 속도 제어 막으로 둘러 싸인 저장기 내에 함유된, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 세포를 함유할 수 있다. 이러한 제형 내에 사용하기 위한 담체는 생체 적합성이고, 또한 생분해 가능할 수 있는데; 바람직하게는, 상기 제형이 비교적 일정 수준의 활성 성분 방출을 제공해준다. 지속 방출형 제형 내에 함유된 활성 화합물의 양은 주입 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료 또는 예방하고자 하는 질환의 종류에 좌우된다.
악성 질병의 치료법
본 발명의 추가의 국면에 있어서, 본원에 기재된 조성물 및 백신을 사용하여, 악성 질병(예를 들면, 진행성 또는 전이성 질병, 또는 최소 잔존 질병과 같은 작은 종양물을 특징적으로 나타내는 질병)의 발생을 억제시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 방법을 사용하여, WT1 발현과 연관된 질병을 예방, 지연 또는 치료할 수 있다. 달리 말하면, 본원에 제공된 치료 방법을 사용하여, 기존의 WT1와 연관된 질병을 치료할 수 있거나, 또는 질병이 없는 환자 또는 아직까지 WT1 발현과 연관되지는 않은 질병에 걸린 환자에게서 상기 질병의 발병을 예방 또는 지연시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 질병은, 이러한 질병 과정 동안의 어느 한 시점에서 병에 걸린 세포(예를 들면, 종양 세포)가 동일한 조직의 정상 세포 보다 높은 수준의 WT1 폴리펩티드를 탐지 가능한 수준으로 생성시키는 경우에, "WT1 발현과 연관된다"라고 지칭된다. WT1 발현이 악성 질병과 연관이 있다는 것은, WT1이 반드시 종양 상에 존재해야 한다는 것을 의미하지 않는다. 예를 들면, WT1의 과발현은 종양 개시와 관련될 수 있지만, 상기 단백질 발현은 이어서 상실될 수도 있다. 또 다른 한편, WT1 발현 증가를 특징으로 나타내지 않는 악성 질병은 나중에, WT1 발현 증가를 특징적으로 나타내는 질병으로 진행될 수 있다. 따라서, 병에 걸린 세포가 WT1을 미리 발현하였거나, 현재 발현하고 있거나, 또는 연속해서 증가 수준으로 발현될 것으로 예상되는 어떠한 악성 질병도 "WT1 발현과 연관되는 것으로" 간주된다.
본원에 제공된 화합물 또는 세포가 환자로부터 WT1 발현성 세포를 제거시키는 기능을 하는 면역요법은 각종 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 제거는 WT1에 특이적인 환자 또는 WT1을 발현하는 세포에서 면역 반응을 증강 또는 유도시킨 결과로서 일어날 수 있다. 또 다른 한편, WT1 발현성 세포를 생체 외에서 제거할 수 있다(예를 들면, 자가유래성 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획으로 처리시킴). 골수 또는 말초혈의 분획은 당해 분야의 표준 기술을 사용하여 수득할 수 있다.
이러한 방법 내에서는, 약제학적 조성물 및 백신을 환자에게 투여할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 지 칭한다. 환자는 악성 질병에 걸리거나 걸리지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 백신은 질병의 발병을 예방하거나 질병에 걸린 환자를 치료하기 위해(예를 들면, 기존 질병의 진행 및/또는 전이를 예방 또는 지연하기 위해) 사용될 수 있다. 질병에 걸린 환자는 최소한의 잔존 질병(예를 들면, 완전히 또는 부분적으로 차도가 있는 백혈병 환자, 또는 외과 방사선요법 및/또는 화학요법 후 종양물 크기가 감소된 암 환자에게서의 작은 종양물)을 나타낼 수 있다. 이러한 환자는 재발을 억제하기 위해(즉, 재발을 예방 또는 지연시키거나 또는 재발 중증도를 저하시키기 위해) 면역시킬 수 있다. 특정의 바람직한 양태 내에서, 상기 환자는 백혈병(예를 들면, AML, CML, ALL 또는 어린이 ALL), 척수이형성 증후군(MDS) 또는 암(예를 들면, 위장암, 폐암, 갑상선암 또는 유방암, 또는 흑색종)에 걸렸으며, 이러한 암 또는 백혈병은 WT1 양성(즉, 본원에 제공된 바와 같이, 항-WT1 항체와 탐지 가능한 수준으로 반응하거나, 또는 본원에 기재된 바와 같이, RT-PCR에 의해 탐지 가능한 수준으로 WT1 mRNA를 발현한다)이거나 또는 WT1-발현성 세포에 대해 지시된 자가면역 질병에 걸려 있다.
WT1 과발현과 연관된 기타 질병에는 문헌[참조: Satoh F., et al., Pathol. Int. 50(6):458-71(2000), and Campbell C. E. et al., Int. J. Cancer 78(2):182-8 (1998)]에 기재된 바와 같은 신장암(예를 들면, 신세포 암종, 또는 윌름 종양); 문헌[참조: Amin, K.M. et al., Am. J. Pathol. 146(2):344-56 (1995)]에 기재된 바와 같은 중피종(mesothelioma)이 포함된다. 문헌[참조: Harada et al. (Mol. Urol. 3(4):357-364 (1999)]에는 사람 고환 생식 세포 종양에서의 WT1 유전자 발현 이 기재되어 있다. 문헌[참조: Nonomura et al. Hinyokika Kiyo 45(8):593-7 (1999)]에는 고환암 특이적 유전자의 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 고환암의 분자상 단계가 기재되어 있다. 문헌[참조: Shimizu et al., Int. J. Gynecol. Pathol. 19(2):158-63 (2000)]에는 상피 난소 종양에서 윌름 종양 유전자(WT1)의 면역조직화학적 탐지 방법이 기재되어 있다.
결합조직형성의 작은 둥근 세포 종양에서의 WT1 과발현이 또한, 문헌[참조: Barnoud, R. et al., Am. J. Surg. Pathol. 24(6):830-6 (2000); and Pathol. Res. Pract. 194(10):693-700 (1998)]에 보고되었다. 신경교아종 및 기타 암에서의 WT1 과발현이 문헌[참조: Menssen, H.D. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126(4):226-32 (2000), "Wilms' tumor gene (WT1) expression in lung cancer, colon cancer and glioblastoma cell lines compared to freshly isolated tumor specimens."]에 보고되었다. WT1 과발현을 나타내는 기타 질병에는 EBV 관련 질병, 예를 들면, 부르키트 림프종 및 비인두암이 포함된다[참조: Spinsanti P. et al., Leuk. Lymphoma 38(5-6):611-9 (2000), "Wilms' tumor gene expression by normal and malignant human B lymphocytes."].
문헌[참조: Leukemia 14(9):1634-4 (2000), Pan et al.]에는 백혈병 또는 척수이형성 증후군을 나타내는 환자로부터의 말초혈 단핵 세포를 시험관내에서 IL12 처리하는 방법이 기재되어 있고, 이에는 세포독성 증가와 WT1 유전자 발현 저하가 보고되었다. 문헌[참조: Leukemia 13(6):891-900 (1999), Patmasiriwat et al. ]에는 척수이형성 증후군과 급성 백혈병에서의 WT1 및 GATA1 발현이 보고되었다. 문헌[참조: Leukemia 13(3):393-9 (1999), Tamaki et al.]에는 윌름 종양 유전자 WT1이 척수이형성 증후군의 질병 진행을 진단하는데 우수한 마커라는 것이 보고되어 있다. 문헌[참조: Oji et al., Jpn. J. Cancer Res. 90(2):194-204 (1999)]에는, 고형 종양에서의 윌름 종양 유전자 WT1의 발현 및 이것과 종양 세포 성장과의 연관성이 위암, 결장암, 폐암, 유방암 세포주, 생식 세포 종양 세포주, 난소암, 자궁암, 갑상선암 세포주, 간세포 암종과 관련하여 논의되어 있다.
본원에 제공된 조성물은 단독으로 사용되거나 또는 통상적인 치료 방법, 예를 들면, 외과적 수술, 방사선 조사, 화학요법 및/또는 골수 이식(자가유래성, 유전적동계, 동종이형 또는 관련이 없는)과 조합할 수 있다. 다음에 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 결합성 제제 및 T 세포는 자가유래성 줄기 세포를 퍼징(purging)하는데 사용할 수 있다. 이러한 퍼징은 예를 들어, 골수 이식, 또는 혈액 또는 이의 성분 주입에 앞서 수행하는 것이 유리할 수 있다. 본원에 제공된 결합성 제제, T 세포, 항원 표시 세포(APC) 및 조성물은 자가유래성, 동종이형, 유전적동계 또는 관련이 없는 WT1 특이적 T 세포를 시험관내 및/또는 생체 내에서 증대 및 자극(또는 프라이밍)시키는데 추가로 사용할 수 있다. 이러한 WT1 특이적 T 세포는, 예를 들어, 공여자 림프구 주입물 내에 사용될 수 있다.
투여 경로 및 투여 횟수 뿐만 아니라 투여량은 개개인마다 상이할 것이며, 이는 표준 기술을 사용하여 용이하게 정립할 수 있다. 일반적으로, 당해 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들면, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예를 들면, 흡인에 의함) 또는 경구 투여할 수 있다. 몇몇 종양에서는, 약제학적 조성물 또는 백신을 국부적으로 투여할 수 있다(예를 들면, 직장결장경 검사, 위경 검사, 비디오내시경 검사, 혈관형성술 또는 당해 분야에 공지된 기타 방법에 의함). 바람직하게는, 1 내지 10회분을 52주에 걸쳐 투여할 수 있다. 바람직하게는, 6회분을 1개월 간격으로 투여한 후, 부스터 백신접종을 주기적으로 제공할 수 있다. 또 다른 프로토콜이 개개 환자에 적당할 수 있다. 적합한 용량은 상기 언급된 바와 같이 투여될 때, 항-종양 면역 반응을 기저(즉, 처리되지 않은) 수준 보다 10 내지 50% 이상 향상시킬 수 있는, 화합물의 양이다. 이러한 반응은, 환자에게서 항-종양 항체를 측정하거나 또는 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 효과기 세포를 백신-의존적 발생시킴으로써 모니터할 수 있다. 이러한 백신은 또한, 백신접종되지 않은 환자와 비교해서, 백신접종된 환자에게서 개선된 임상 징후(예를 들면, 완전한 또는 부분적인 차도가 보다 빈번하게 발생하거나, 또는 병을 앓지 않는 기간이 더 길어지고/지거나 전체 생존 기간이 더 길어진다)를 가져다 주는 면역 반응을 유발시킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신의 경우, 용량 내에 존재하는 각 폴리펩티드의 양은 약 100㎍ 내지 5mg의 범위이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로 약 0.1ml 내지 약 5ml의 범위이다.
일반적으로, 적당한 투여량 및 치료 방법은 치료학적 및/또는 예방적 이점을 제공하기에 충분한 양의 활성 화합물(들)을 제공해준다. 이러한 반응은, 치료받지 않은 환자와 비교해서, 치료받은 환자에게서 개선된 임상 징후(예를 들면, 완전한 또는 부분적인 차도가 보다 빈번하게 발생하거나, 또는 병을 앓지 않는 기간이 더 길어지고/지거나 전체 생존 기간이 더 길어진다)를 정립함으로써 모니터할 수 있다. WT1에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로, 개선된 임상 징후와 상관이 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로, 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있는데, 이는 치료 전 및 후에 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
추가의 국면 내에서, WT1 발현과 연관된 악성 질병의 발생을 억제시키는 방법은 앞서 기재된 바와 같이, WT1 폴리펩티드 또는 WT1 발현성 APC에 반응하여 활성화시킨 자가유래성 T 세포를 투여하는 것을 포함한다. 이러한 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+일 수 있고, 상기 언급된 바와 같이 증식시킬 수 있다. T 세포는 악성 질병의 발생을 억제시키는데 유효한 양으로 개개인에게 투여할 수 있다. 전형적으로, 약 1 x 109 내지 1 x 1011개 T 세포/M2를 정맥내, 공동내, 또는 절개된 종양 층 내에 투여한다. 세포 수 및 투여 횟수가 환자의 반응에 좌우될 것이라는 사실은 당업자에게 명백할 것이다.
특정 양태 내에서는, 자가유래성 골수 이식에 앞서 T 세포를 자극할 수 있다. 이러한 자극은 생체내 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 시험관내 자극의 경우에는, 환자로부터 수득된 골수 및/또는 말초혈(또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획)을, 상기 언급된 바와 같이 T 세포의 자극을 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에, WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또 는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC와 접촉시킬 수 있다. 이어서, 골수, 말초혈 줄기 세포 및/또는 WT1 특이적 T 세포를, 표준 기술을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다.
관련 양태 내에서는, 관련이 있거나 관련이 없는 공여자의 T 세포를, 유전적동계 또는 동종이형(관련이 있거나 관련이 없는) 골수 이식에 앞서 자극시킬 수 있다. 이러한 자극은 생체내 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다. 시험관내 자극의 경우에는, 관련이 있거나 관련이 없는 공여자로부터 수득된 골수 및/또는 말초혈(또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획)을, 상기 언급된 바와 같이 T 세포의 자극을 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에, WT1 폴리펩티드, WT1 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC와 접촉시킬 수 있다. 이어서, 골수, 말초혈 줄기 세포 및/또는 WT1 특이적 T 세포를, 표준 기술을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다.
기타 양태 내에서는, 본원에 기재된 바와 같은 WT1 특이적 T 세포를 사용하여, 자가유래성 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 일정 분획(예를 들면, CD34+ 풍부한 말초혈(PB))으로부터 WT1 발현성 세포를 제거한 다음, 이를 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 방법은 WT1 발현 세포를, 골수 또는 말초혈 중의 골수성 또는 림프계 세포 총수의 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만, 더욱 바람직하게는 1% 미만으로 감소시켜 주기에 충분한 시간 및 조건 하에, 골수 또는 PB를 상기 T 세포와 접촉시킴으로써 수행할 수 있다. 이러한 세포가 제거되는 정도는 표준 방법, 예를 들면, 정성적 및 정량적 PCR 분석, 다형성, 면역조직화학 및 FACS 분석에 의 해 용이하게 결정할 수 있다. 이어서, 골수 또는 PB(또는 이들의 분획)를, 표준 기술을 사용하여 환자에게 투여할 수 있다.
진단 방법
본 발명은 추가로, WT1 발현과 연관된 악성 질병을 탐지하는 방법, 및 이러한 질병에 대한 면역화 또는 치료법의 효능을 모니터하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명 내에서, WT1 단백질에 특이적인 면역 반응이 상기 질병에 걸린 환자에게서 탐지될 수 있고, 이러한 면역 반응을 증강시키는 방법이 예방적 또는 치료적 이점을 제공해줄 수 있다는 발견에 근거한 것이다.
WT1 발현과 연관된 악성 질병의 존재 또는 부재를 결정하기 위해, 환자를 대상으로 하여, WT1에 특이적인 T 세포의 수준을 시험할 수 있다. 특정 방법 내에서는, 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC와 함께 항온처리하고, 이러한 T 세포의 특이적 활성화가 존재 또는 부재하는 지를 상기 언급된 바와 같이 탐지한다. 적합한 생물학적 샘플에는 분리된 T 세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들면, T 세포를 통상적인 기술(예를 들면, 말초혈 림프구를 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리시킴)에 의해 환자로부터 분리시킬 수 있다. T 세포를 WT1 폴리펩티드(예: 5 내지 25㎍/ml)와 함께 37℃에서 2 내지 9일 동안(전형적으로 4일 동안) 시험관내에서 항온처리할 수 있다. 대조군으로서 작용하는, WT1 폴리펩티드의 부재 하에 또 다른 분취량의 T 세포 샘플을 항온처리하는 것이 요망될 수 있다. CD4+ T 세포의 경우, 활성화는 T 세포의 증식을 평가함으로써 탐지하는 것이 바람직하다. CD8+ T 세포의 경우, 활성화는 세포용해 활성을 평가함으로써 탐지하는 것이 바람직하다. 질병에 걸리지 않은 환자에서 보다 2배 이상 큰 증식 수준 및/또는 20% 이상 큰 세포용해 활성 수준은 WT1 발현과 연관된 악성 질병이 존재한다는 것을 지시해준다. 추가의 상관 관계는, 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여, 증식 수준 및/또는 세포용해 활성 수준과 치료법에 대한 예상되는 반응 간에 이루어질 수 있다. 특히, 보다 높은 항체, 증식성 반응 및/또는 용해 반응을 나타내는 환자는 치료법에 보다 큰 반응을 나타내는 것으로 예상할 수 있다.
기타 방법 내에서는, 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 대상으로 하여, WT1에 특이적인 항체 수준을 시험한다. 이러한 생물학적 샘플을, 면역복합체를 형성하기에 충분한 시간 및 조건 하에, WT1 폴리펩티드, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC와 함께 항온처리한다. 이어서, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 생물학적 샘플 중의 항체와 상기 WT1 폴리펩티드 간에 형성된 면역복합체를 탐지한다. 상기 방법에 사용하기 위한 생물학적 샘플은 항체를 함유하는 것으로 예상될 수도 있는, 환자로부터 수득된 어떠한 샘플일 수도 있다. 적합한 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 복수, 골수, 흉막 유출액 및 뇌척수액이 포함된다.
상기 생물학적 샘플을, WT1에 특이적 항체와 WT1 폴리펩티드 간에 면역복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 반응 혼합물 중에서 상기 WT1 폴리펩 티드와 함께 항온처리한다. 예를 들면, 생물학적 샘플과 WT1 폴리펩티드를 4℃에서 24 내지 48시간 동안 항온처리할 수 있다.
항온처리를 수행한 후, 상기 반응 혼합물을 대상으로 하여, 면역복합체의 존재 여부를 시험한다. 생물학적 샘플 내에 존재하는 항체와 WT1 폴리펩티드 간에 형성된 면역복합체의 탐지는 각종 공지된 기술, 예를 들면, 방사성면역 검정(RIA) 및 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)에 의해 달성할 수 있다. 적합한 검정은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 과학지 및 특허 문헌에 상세히 기재되어 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 사용될 수 있는 검정에는 이중 모노클로날 항체 샌드위치 면역검정 기술[참조: Davis et al. 미국 특허 제4,376,110호]; 모노클로날-폴리클로날 항체 샌드위치 검정[참조: Wide et al., in Kirkham and Hunter, eds., Radioimmunoassay Methods, E. and S. Livingstone, Edinburgh, 1970]; "웨스턴 블롯" 방법[참조: Gordon et al. 미국 특허 제4,452,901호]; 표지된 리간드의 면역침전법[참조: Brown et al., J. Biol. Chem. 255:4980-4983, 1980]; 예를 들면, 문헌[참조: Raines and Ross, J. Biol. Chem. 257:5154-5160, 1982]에 기재된 바와 같은 효소 결합 면역 흡착 검정; 형광단의 사용을 포함한 면역세포화학 기술[참조: Brooks et al., Clin. Exp. Immunol. 39:477, 1980]; 및 활성의 중화[참조: Bowen-Pope et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:2396-2400, 1984]가 포함될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 기타 면역검정에는 미국 특허 제3,817,827호; 제3,850,752호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 및 제4,098,876호에 기재된 것들이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
탐지 목적을 위해서는, WT1 폴리펩티드를 표지시키거나 표지시키지 않을 수 있다. 표지되지 않은 WT1 폴리펩티드는 응집 반응에 사용할 수 있거나, 또는 면역복합체와 결합하는 표지된 탐지용 시약(예를 들면, WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 결합할 수 있는, 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 레시틴 및 2차 항체, 또는 이의 항원 결합성 단편)과의 조합물에 사용할 수 있다. WT1 폴리펩티드를 표지시킨 경우, 리포터 그룹은 방사성 동위원소, 형광성 그룹, 발광성 그룹, 효소, 바이오틴 및 염료 입자를 포함한, 당해 분야에 공지된 적합한 어떠한 리포터 그룹일 수 있다.
특정 검정 내에서, 표지되지 않은 WT1 폴리펩티드를 고체 지지체 상에 고정화시킨다. 이러한 고체 지지체는 상기 폴리펩티드가 부착될 수 있는 것으로 당업자에게 공지된 어떠한 물질일 수도 있다. 예를 들면, 상기 고체 지지체는 미세역가판 내의 시험용 웰 또는 니트로셀룰로즈 또는 기타 적합한 막일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들면, 유리, 섬유 유리, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예를 들면, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 지지체는 또한, 예를 들면, 미국 특허 제5,359,681호에 기재된 바와 같은 섬유 광 센서 또는 자기 입자일 수 있다. 당해 폴리펩티드는 특허 문헌과 과학지에 상세히 기재되어 있는, 당업자에게 공지된 각종 기술을 사용하여 고체 지지체에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "고정화"란 흡착과 같은 비공유적 결합과 공유적 부착(이는 지지체 상에서 상기 항원과 작용성 그룹 간의 직접적인 연결일 수 있거나 가교결합제에 의한 연결일 수 있다) 모두를 지칭한다. 미세역가판 내의 웰 또는 막에 흡착으로써 고정화시키는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충액 중의 WT1 폴리펩티드를 적합한 시간 동안 고체 지지체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가판(예: 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10ng 내지 약 10㎍, 바람직하게는 약 100ng 내지 약 1㎍ 범위의 폴리펩티드와 접촉시키는 것이 적당한 양의 폴리펩티드를 고정화시키는데 충분하다.
고정화시킨 후, 이러한 지지체 상의 나머지 단백질 결합 부위가 전형적으로 차단된다. 당업자에게 공지된 적합한 어떠한 차단제, 예를 들면, 소의 혈청 알부민(BSA), 트윈 20™(공급처: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 열-불활성화 정상 염소 혈청(NGS) 또는 BLOTTO(방부제, 염 및 소포제를 함유하기도 하는 비지방 분유의 완충 용액)도 이용할 수 있다. 이어서, 상기 지지체를, 특이적 항체를 함유하는 것으로 추정되는 생물학적 샘플과 함께 항온처리한다. 상기 샘플은 그 자체로 적용되거나, 또는 보다 종종, 통상적으로 소량(0.1 내지 5.0중량%)의 단백질, 예를 들면, BSA, NGS 또는 BLOTTO를 함유하는 완충 용액 중에서 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적당한 접촉 시간(즉, 항온처리 시간)은 상기 항체를 함유하는 샘플 내에 WT1과 특이적으로 결합하는 항체가 존재하는지를 탐지하기에 충분한 시간이 다. 바람직한 접촉 시간은 결합된 항체와 결합되지 않은 항체 간의 평형을 가져다준 결합 수준의 약 95% 이상을 달성하기에 충분한 시간이다. 당업자는 평형을 달성하는데 필요한 시간이, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실온에서는 일반적으로, 약 30분 동안 항온처리하면 충분하다.
0.1% 트윈 20™을 함유하는 PBS와 같은 적당한 완충액으로 고체 지지체를 세척함으로써, 결합되지 않은 샘플을 제거할 수 있다. 이어서, 면역복합체와 결합하고 리포터 그룹을 포함하는 탐지용 시약을 가할 수 있다. 이어서, 탐지용 시약을, 결합된 항체를 탐지하기에 충분한 시간 동안 상기 면역복합체와 함께 항온처리한다. 적당한 시간은 일반적으로, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 탐지용 시약을 제거하고, 리포터 그룹을 사용하여 결합된 탐지용 시약을 탐지한다. 리포터 그룹을 탐지하기 위해 이용되는 방법은 리포터 그룹의 종류에 의존한다. 방사성 그룹의 경우에는, 신틸레이션 계수 또는 자기방사법이 일반적으로 적당하다. 분광법을 이용하여 염료, 발광성 그룹 및 형광성 그룹을 탐지할 수 있다. 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사성 또는 형광성 그룹 또는 효소)과 커플링된 바이오틴은 아비딘을 사용하여 탐지할 수 있다. 효소 리포터 그룹(예를 들면, 서양고추냉이 퍼옥시다제, 베타-갈락토시다제, 알칼린 포스파타제 및 글루코즈 옥시다제)은 일반적으로, 기질을 가한 다음(일반적으로 특정 시간 동안), 이러한 반응 생성물을 분광법 또는 기타 분석법으 로 탐지할 수 있다. 이용된 특정 방법에 상관없이, 배경(즉, 질병에 걸리지 않은 개개인으로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해 관찰된 수준) 보다 2배 이상 큰, 결합된 탐지용 시약의 수준은 WT1 발현과 연관된 악성 질병이 존재한다는 것을 지시해준다.
일반적으로, 면역화 또는 요법의 효능을 모니터하는 방법은 환자에게서 WT1 특이적인 항체 또는 T 세포의 수준 변화를 모니터하는 것을 포함한다. 항체 수준을 모니터하는 방법은 (a) 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득한 제1 생물학적 샘플을, 면역 복합체를 형성시키기에 충분한 시간 및 조건 하에 WT1 폴리펩티드와 함께 항온처리를 수행하는 단계; (b) WT1 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 상기 생물학적 샘플 중에서의 상기 WT1 폴리펩티드와 항체 간에 형성된 면역복합체를 탐지하는 단계; (c) 요법 또는 면역화 후 상기 환자로부터 취한 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 면역복합체의 수를 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC를 WT1 폴리펩티드 대신 사용할 수도 있다. 이러한 방법 내에서, 상기 생물학적 샘플 중에서, 상기 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되거나 WT1 폴리펩티드에 의해 발현된 WT1 폴리펩티드와 항체 간의 면역복합체를 탐지한다.
T 세포 활성화 및/또는 WT1 특이적 전구체의 수를 모니터하는 방법은 (a) 요법 또는 면역화에 앞서 환자로부터 수득된, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포(예: 골수, 말초혈 또는 이의 분획)를 포함하는 제1 생물학적 샘플을, T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해를 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에 WT1 폴리펩티드와 함께 항온처리를 수행하는 단계; (b) 상기 T 세포의 특이적 활성화, 증식 및/또는 용해의 양을 탐지하는 단계; (c) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하고 요법 또는 면역화 후 동일한 환자로부터 수득된 제2 생물학적 샘플을 사용하여 상기 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계; 및 (d) 제1 및 제2 생물학적 샘플에서 탐지된 T 세포의 활성화, 증식 및/또는 용해의 양을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, WT1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 WT1 폴리펩티드를 발현하는 APC를 WT1 폴리펩티드 대신 사용할 수도 있다.
상기 방법에 사용하기 위한 생물학적 샘플은 항체, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 함유하는 것으로 예상될 수 있는 환자로부터 수득된 어떠한 샘플일 수도 있다. 적합한 생물학적 샘플에는 혈액, 혈청, 복수, 골수, 흉막 유출액 및 뇌척수액이 포함된다. 제1 생물학적 샘플은 요법 또는 면역화를 개시하기 이전 또는 요법 또는 백신접종 방법 중도에 수득할 수 있다. 제2 생물학적 샘플은 유사한 방식으로 수득하지만, 요법 또는 면역화를 수행한 후에 수득해야 한다. 이러한 제2 생물학적 샘플은 요법 또는 면역화를 완료한 후 또는 중도에 수득할 수 있지만, 요법 또는 면역화의 적어도 일부가 상기 제1 생물학적 샘플과 제2 생물학적 샘플 분리 사이에 일어나야만 한다.
두가지 샘플에 대한 항온처리 및 탐지 단계는 일반적으로, 상기 언급된 바와 같이 수행할 수 있다. 제1 샘플에 비해 제2 샘플에서의 면역복합체 수가 통계 유의적으로 증가한 것은 성공적인 요법 또는 면역화를 반영해준다.
다음 실시예는 예시로써 제공되는 것이며, 이로써 본 발명이 제한되지 않는다.
실시예 1
혈액학적 악성 종양이 있는 환자에게서 WT1에 대한 면역 반응 동정
본 실시예는 혈액학적 악성 종양이 있는 환자에게 존재하는 면역 반응을 동정하는 것을 예시해준다.
환자에게 기존 WT1 특이적 항체 반응이 존재하는지를 평가하기 위해, 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프구성 백혈병(ALL), 만성 골수성 백혈병(CML) 및 중증 재생불량성 빈혈이 있는 환자 혈청을 대상으로 하여, 웨스턴 블롯 분석법을 사용하여 분석한다. 이러한 혈청을 대상으로 하여, 사람 백혈병 세포주 K562(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터의 WT1를 면역침전시키는 능력에 대해 시험한다. 각 경우에 있어, 면역침전물을 겔 전기영동시킴으로써 분리시키고, 이를 막에 옮긴 다음, 항 WT1 항체 WT180(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA)로 프로빙한다. 이러한 웨스턴 블롯 분석 결과, 혈액학적 악성 종양이 있는 환자에게서 효능있는 WT1 특이적 항체를 동정하였다. AML에 걸린 환자에 대한 결과를 나타내는 대표적인 웨스턴 블롯이 도 2에 도시되어 있다. 환자 혈청을 사용하여 발생된 면역침전물 내의 52kD 단백질이 WT1 특이적 항체에 의해 인식되었다. 이러한 52kD 단백질은 양성 대조군과 동일한 크 기로 이동하였다.
부가의 연구는, 완전한 길이의 WT1 단백질 및 절두된 WT1 단백질에 대한 항체의 존재 여부를 알아보기 위해, AML 및 CML에 걸린 환자의 혈청을 분석하였다. 사람 WT1/완전한 길이(aa 1-449), N-말단(aa 1-249)(WT1/N-말단) 및 C-말단(aa 267-449)(WT1/C-말단) 영역을 나타내는 cDNA 작제물을, 변형된 pET28 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 상기 WT1/완전한 길이 및 WT1/N-말단 단백질은 Ra12 융합 단백질로서 발현되었다. Ra12는 MTB32B로서 표시된, 분비된 미코박테륨 튜베르쿨로시스 단백질의 C-말단 단편이다[참조: Skeiky et al., Infect Immun. 67;3998, 1999]. Ra12-WT1/완전한 길이 융합 영역을 히스티딘-태그 변형된 pET28 벡터에서 히스티딘-태그에 대해 3'에 클로닝시킨다. 상기 WT1/N-말단 영역을, 5' 히스티딘-태그에 이어 티오레독신(TRX)-WT1/N-말단 융합 영역, 그 다음에 3' 히스티딘-태그를 갖는 변형된 pET28 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 상기 WT1/C-말단 암호화 영역을, 5' 및 3' 히스티딘-태그만을 함유하는 융합 파트너를 갖지 않고, 또한 이에 이어 트롬빈과 EK 부위를 갖지 않는, 변형된 pET28 벡터 내로 서브클로닝시킨다.
BL21 pLysS 이. 콜라이(Stratagene, La Jolla, CA)를 3가지 WT1 발현 작제물로 형질전환시키고, 이를 밤새 성장시킨 다음, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG)로 유도시킨다. WT1 단백질을 다음과 같이 정제한다: 세포를 10mM 트리스, pH 8.0에서 37℃ 하에 완전한 프로테아제 억제인자 정제(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)과 함께 항온처리한 다음 여러 회 동안 초음파처리함으로써, 상기 세포를 수거 및 용해시킨다. 봉입체를 10mM 트리스, pH 8.0으로 2회 세척한다. 이어서, 단백질을 니켈-니트릴로트리아세트산 수지(QIAGEN Inc., Valencia, CA; Hochuli et al., Biologically Active Molecules :217, 1989) 상에서 금속 킬레이트 친화 크로마토그래피한 다음 공급원 Q 음이온 교환 수지(Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden) 상에서 크로마토그래피함으로써 정제한다. 이러한 WT1 단백질의 실체는 N-말단 서열 분석함으로써 확인하였다.
새로이 AML 또는 CML에 걸린 성인 환자로부터의 혈청을 대상으로 하여, WT1 특이적 Ab의 존재 여부에 대해 연구한다. 재조합 단백질을 TC 마이크로웰 판(Nunc, Roskilde, Denmark)에 흡착시킨다. 판을 PBS/0.5% 트윈 20으로 세척하고, 이를 1% BSA/PBS/0.1% 트윈 20으로 차단시킨다. 세척 후, 혈청 희석물을 가하고, 4℃에서 밤새 항온처리한다. 판을 세척하고, 당나귀(donkey) 항-사람 IgG-HRP 2차 항체를 가하고(Jackson-Immunochem, West Grove, PA) 실온에서 2시간 동안 항온처리한다. 판을 세척하고, TMB 퍼옥시다제 기질 용액(Kirkegaard and Perry Laboratories, MA)과 함께 항온처리하며, 1N H2SO4로 급냉시킨 다음, 즉시 판독한다(Cyto-Fluor 2350; Millipore, Bedford, MA).
혈청학적 조사를 위해, 사람 혈청을 대상으로 하여, 1:50 내지 1:20,000의 일련의 희석 범위에 걸쳐 ELISA함으로써 시험한다. 양성 반응은, 3가지(WT1/완전한 길이, WT1/C-말단) 표준 편차에 의해 정상 공여자(n=96)로부터의 혈청의 평균 OD 값을 초과하는, 1:500 희석된 혈청의 OD 값으로서 정의된다. WT1/N-말단 단백 질에 대한 정상 공여자에서의 보다 높은 배경으로 인해, WT1/N-말단에 대한 양성 반응은 4가지 표준 편차에 의해 정상 공여자로부터의 혈청의 평균 OD 값을 초과하는, 1:500 희석된 혈청의 OD 값으로서 정의된다. 상기 환자 Ab 반응이 WT1에 대해 지시된 것이고 상기 단백질의 Ra12 또는 TRX 융합부에 대해 지시된 것이 아니라는 사실을 입증하기 위해, 상기 Ra12 및 TRX 단백질 만을 포함하는 대조군을 유사한 방식으로 정제하였다. 상기 Ra12 및/또는 TRX 단백질에 대한 반응성을 나타내는 샘플을 상기 분석으로부터 제외시켰다.
WT1에 대한 면역성이 존재하는 지를 평가하기 위해, 정상적인 개개인과 백혈병에 걸린 환자의 혈청에서 재조합의 완전한 길이 및 절두된 WT1 단백질에 대한 Ab를 결정하였다. WT1/완전한 길이 단백질, WT1/N-말단 단백질 및 WT1/C-말단 단백질에 대한 ELISA 반응성에 의해, 항체 반응성을 분석하였다.
96명의 정상적인 공여자 중의 2명 만이 WT1/완전한 길이 단백질과 반응성인 혈청 항체를 가졌다(도 18). 이들 개개인 중의 1명은 WT1/N-말단 단백질에 대한 항체를 가지고 있고, 다른 1명은 WT1/C-말단 단백질에 대한 항체를 가지고 있다. 이와는 대조적으로, AML에 걸린 63명 환자 중의 16명(25%)이 WT1/완전한 길이 단백질과 반응성인 혈청 항체를 가졌다. 현저히 대조적으로, 63명 환자 중의 2명(3%) 만이 WT1/C-말단 단백질에 대한 반응성을 나타내었다. CML에 걸린 81명 환자 중의 15명(19%)이 WT1/완전한 길이 단백질과 반응성인 혈청 항체를 가지고, 81명 환자 중의 12명(15%)이 WT1/N-말단 단백질과 반응성인 혈청 항체를 가지고 있다. 81명 환자 중의 3명(3%) 만이, WT1/C-말단 단백질에 대한 반응성을 나타내었다(도 16 및 17).
이들 데이터는 WT1에 대한 Ab 반응이 AML 및 CML에 걸린 몇몇 환자에게서 탐지 가능하다는 것을 입증해준다. 백혈병 환자에게서 항체 발생 빈도가 더 높다는 것은, 환자가 WT1를 발현하거나 언젠가 WT1를 발현하게 될 악성 종양을 가짐으로써, 이러한 WT1 단백질에 대한 면역화가 이루어지고 있다는 강력한 증거를 제공해준다. 특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, WT1에 대해 관찰된 항체 반응은 대부분이, 환자가 자신의 백혈병 세포 상에서 WT1에 대한 면역을 지님으로써 비롯된 것이고, 이는 WT1이 "자가" 단백질임에도 불구하고 면역원성이 될 수 있다는 직접적인 증거를 제공해주는 것으로 여겨진다.
WT1에 대한 항체의 존재는 동시에 발생되는 헬퍼 T 세포 반응이 또한 동일한 환자에게 존재한다는 것을 의미한다. WT1은 내부 단백질이다. 따라서, CTL 반응은 백혈병 치료법 및 면역의 가장 독성인 암(arm)이라는 측면에서 가장 효율적인 것으로 예상된다. 따라서, 이들 데이터는, WT1에 대해 지시된 치료학적 백신이 WT1에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있을 것이라는 증거를 제공해준다.
탐지된 대다수의 항체는 N-말단 내의 에피토프와 반응성인 반면, 환자의 작은 아그룹은 C-말단에 대한 약한 항체 반응을 나타내었다. 이는, N-말단으로부터 유도된 펩티드로의 면역화가 항체, 헬퍼 T 세포 및 CTL 반응을 유발시킨 반면, C-말단으로부터 시험된 펩티드로의 면역화는 어떠한 항체 또는 T 세포 반응도 유발시키지 못하였다는, 동물 모델에서의 관찰 결과에 부합된다[참조: Gaiger et al., Blood 96:1334, 2000].
실시예 2
WT1을 발현하는 세포주로 면역시킨 마우스에서 WT1에 대한 항체 유도
본 실시예는 생체 내에서 WT1 특이적 항체 반응을 유도시키기 위해, WT1을 발현하는 세포를 사용하는 것을 예시하고 있다.
백혈병에 걸린 환자에게서 WT1에 대한 항체의 존재를 탐지하는 것은, WT1에 대한 면역을 유발시키기 위해 WT1 단백질에 대해 면역시키는 것이 가능하다는 것을 강력히 시사하고 있다. WT1에 대한 면역이 백신접종에 의해 발생될 수 있는지를 시험하기 위해, 마우스에게 B6 기원의 WT1 양성 종양 세포주인 TRAMP-C를 주사하였다. 간략하게 언급하면, 숫컷 B6 마우스를 5 x 106 TRAMP-C 세포로 피하 면역시키고, 3주 간격으로 5 x 106 세포로 2회 부스터하였다. 최종 면역시킨지 3주 후에, 혈청을 수득하고, 비장의 단일 세포 현탁액을, 25μM β-2-머캅토에탄올, 페니실린 200단위/ml, 10mM L-글루타민 및 10% 태아 소 혈청을 갖는 RPMI 1640 배지(GIBCO)에서 준비한다.
TRAMP-C에 대한 면역화 후, 이와 같이 면역시킨 동물에서의 WT1 특이적 항체 반응이 탐지될 수 있었다. 대표적인 웨스턴 블롯이 도 3에 도시되어 있다. 이들 결과는 WT1 단백질에 대한 면역화가 WT1 단백질에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 3
WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 Th 반응 및 항체 반응의 유도
본 실시예는 WT1에 특이적인 면역 반응을 유발시키기 위해 WT1 펩티드로 면역시키는 능력을 예시하고 있다.
Ab 및 증식성 T 세포 반응을 유발시키는데 적합한 펩티드는 Th 반응을 유발시키는 효능을 지니고 있는 펩티드 모티프에 대해 연구 조사하는 Tsites 프로그램[참조: Rothbard and Taylor, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996]에 따라서 동정하였다. 표 I에 제시된 펩티드를 합성하고 이의 서열을 분석하였다:
면역화시키기 위해, 펩티드를 다음과 같이 분류하였다:
그룹 A: p6-22 사람: 10.9mg/1ml(10㎕ = 100㎍)
pl17-139 사람/마우스: 7.6mg/ml(14㎕ = 100㎍)
p244-262 사람: 4.6mg/ml(22㎕ = 100㎍)
그룹 B : p287-301 사람/마우스: 7.2mg/ml(14㎕ = 100㎍)
마우스 p299-313: 6.6mg/ml(15㎕ = 100㎍)
p421-435 사람/마우스: 3.3mg/ml(30㎕ = 100㎍)
대조군: (FBL 펩티드 100㎍) + CFA/IFA
대조군: (CD45 펩티드 100㎍) + CFA/IFA
그룹 A는 WT1의 아미노 말단 부분 내에 존재하는 펩티드(엑손 1)를 함유하고 있고, 그룹 B는 기타 DNA-결합성 단백질과 서열 상동성을 나타내는 4가지 아연 핑거 영역을 함유하는, 카복시 말단 내에 존재하는 펩티드를 함유하고 있다. 그룹 B 내에서는, p287-301 및 p299-313을 엑손 7, 아연 핑거 I로부터 유도하였고, p421-435는 엑손 10, 아연 핑거 IV로부터 유도하였다.
B6 마우스를 WT1 펩티드 그룹 또는 대조군 펩티드로 면역시킨다. 펩티드를 주사용 멸균수 1ml에 용해시키고, B6 마우스를 3주 간격으로 3회 면역시킨다. 사용된 아주반트는 CFA/IFA, GM-CSF 및 몬타나이드이다. 이어서, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이, WT1에 특이적인 항체의 존재 여부를 결정하고, 표준 티미딘 혼입 검정을 사용하여 증식성 T 세포 반응을 평가하는데, 여기서는 세포를 항원의 존재 하에 배양하고, 혼입된 방사능을 측정함으로써 증식을 평가한다[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]. 특히, 림프구를, 4 x 105
방사선조사된(3000rads) 유전적동계 비장 세포 및 상기 분류된 펩티드와 함께, 웰당 2 x 105 세포로 96-웰 판에서 배양한다.
그룹 A로서 분류된 펩티드 그룹으로 마우스를 면역화시키면, WT1에 대한 항체 반응이 유발되었다(도 4). 백신 B에 대한 면역화 후에는 항체가 전혀 탐지되지 않았는데, 이는 백신 B로의 면역화로부터는 헬퍼 T 세포 반응이 없다는 관찰 결과와 부합된다. p117-139는 증식성 T 세포 반응을 유발시켰다(도 5A-5C). 자극 지수(SI)는 8 내지 72로 다양하다. 기타 펩티드(p6-22 및 p299-313) 또한, 증식성 T 세포 반응을 유발시키는 것으로 나타났다. p6-22로 면역화시키면, 자극 지수(SI)가 2.3이 되었고, p299-313으로 면역화시키면, SI가 3.3이 되었다. 양성 대조군은 ConA 자극된 T 세포 뿐만 아니라 공지된 항원, 예를 들면, CD45 및 FBL로 자극된 T 세포, 및 동종이형 T 세포주를 포함하고 있다[참조: DeBruijn et al., Eur. J. Immunol. 21:2963-2970, 1991].
도 6A 및 6B는 백신 A(도 6A) 및 백신 B(도 6B)를 이용한, 3가지 펩티드 각각에 대해 관찰된 증식성 반응을 도시한 것이다. 백신 A는 면역화 펩티드 p6-22 및 p117-139에 대한 증식성 T 세포 반응을 유발시켰는데, 자극 지수(SI)는 3 내지 8(벌크 주)로 다양하다. p244-262에 대한 증식성 반응은 전혀 탐지되지 않았다(도 6A).
p6-22 및 p117-139 만을 사용하여 단일 펩티드 자극으로서 후속 시험관내 자극을 수행하였다. p117-139를 이용하여 백신 A 특이적 T 세포주를 자극하면, p117-139에 대한 증식이 발생하지만, p6-22에 대한 반응은 전혀 일어나지 않는다(도 7A). 상기 주로부터 유도된 클론은 p117-139에 특이적이다(도 7B). 이와 대조적으로, p6-22를 이용하여 백신 A 특이적 T 세포주를 자극하면, p6-22에 대한 증식이 발생하지만, p117-139에 대한 반응은 전혀 일어나지 않는다(도 7C). 상기 주로부터 유도된 클론은 p6-22에 특이적이다(도 7D).
이들 결과는, WT1 펩티드로의 백신접종이 WT1 단백질에 대한 항체 반응과 면역성 펩티드에 대한 증식성 T 세포 반응을 유발시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4
WT1 펩티드로 면역시킨 마우스에서 CTL 반응 유도
본 실시예는 CTL 면역을 유발시키는 WT1 펩티드의 능력을 예시하고 있다.
부류 I MHC와 결합하기에 적당한 모티프를 갖는 펩티드(9량체)는, BIMAS HLA 펩티드 결합 예측 분석법을 사용하여 동정하였다[참조: Parker et al., J. Immunol. 152:163, 1994]. 이러한 분석법 내에서 동정된 펩티드가 표 II 내지 XLIV에 제시되어 있다. 이들 표 각각에서, 스코어는, 지시된 MHC 분자에 대한 펩티드의 이론적 결합 친화도(1/2 해리 시간)를 반영해준다.
Th 반응을 유발시키는 효능을 지니고 있는 펩티드 모티프에 대해 연구 조사하는 Tsites 프로그램[참조: Rothbard and Taylor, EMBO J. 7: 93-100, 1988; Deavin et al., Mol. Immunol. 33: 145-155, 1996]을 사용하여 동정된 펩티드는 도 8A 및 8B, 표 XLV에 추가로 제시되어 있다.
추가의 분석을 위해 특정의 CTL 펩티드(표 XLVI에 제시됨)를 선별하였다. 표 XLVI에서의 각 펩티드에 대해, BIMAS HLA 펩티드 결합 예측 분석을 이용하여 수득된 스코어가 제공된다.
C57Bl/6 마우스 MHC와 결합하는 펩티드는, 문헌[참조: Ljunggren et al., Nature 346:476-480, 1990]에 기재된 바와 같이, 백혈병 세포주 RMA-S를 사용하여 확인하였다. 간략하게 언급하면, RMA-S 세포를, 1% FCS가 보충된 완전 배지에서 26℃ 하에 배양한다. 총 106개의 RMA-S 세포를 24-웰 판의 각 웰에 가하고, 단독으로 항온처리하거나 상기 분류된 펩티드(25㎍/ml)와 함께, 완전 배지에서 26℃ 하에 16시간 동안 및 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다. 이어서, 세포를 3회 세척하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합된 항 Db 또는 항-Kb 항체(PharMingen, San Diego, CA)로 염색시킨다. 표지된 세포를 2회 세척하고, 1% 파라포름알데히드를 갖는 PBS 500㎕에 재현탁 및 고정시킨 다음, 유동 세포 계수기(Becton-Dickinson FACSCalibur®)로 형광 세기를 분석한다. RMA-S 세포 표면 상에서의 Db 또는 Kb 분자의 증가율은, 배지 단독에 항온처리된 세포와 비교해서 펩티드와 함께 항온처리된 세포의 평균 형광 세기 증가로써 측정한다.
쥐과(murine) 부류 I MHC와 결합할 수 있는 펩티드로 마우스를 면역시킨다. 면역화 후, 비장 세포를 시험관 내에서 자극시키고, 이를 대상으로 하여, WT1 펩티드와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험한다. 표준 크롬 방출 검정[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]을 이용하여 CTL을 평가한다. 106개 표적 세포를 37℃ 하에 특이적 펩티드의 존재 또는 부재 하에 150μCi의 나트륨 51Cr과 함께 90분 동안 항온처리한다. 세포를 3회 세척하고, 5% 태아 소 혈청을 함유하는 RPMI에 재현탁시킨다. 상기 검정을 위해, 104개 51Cr-표지된 표적 세포를, U자형 바닥의 96-웰 판에서 최종 용적 200㎕로 상이한 농도의 효과기 세포와 함께 항온처리한다. 37℃에서 4 내지 7시간 후, 상등액을 제거하고, 특이적 용해율을 다음 식으로써 결정하였다: 특이적 용해율(%) = 100 x (실험 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출).
표 XLVII에 제시된 결과는, 몇몇 WT1 펩티드가, CTL을 발생시키는데 필수적인 부류 I MHC 분자와 결합할 수 있다는 것을 제시해준다. 더우기, 몇몇 펩티드는 크롬 방출 검정을 사용하여 결정된 바와 같이, 펩티드 특이적 CTL을 유발시킬 수 있다(도 9A 및 9B). CTL 펩티드 p10-18 사람, p136-144 사람, p136-144 마우스 및 p253-243에 대한 면역화 후, 펩티드 특이적 CTL 주를 생성시키고, 클론을 정착시킨다. 이들 결과는 펩티드 특이적 CTL이 WT1을 발현하는 악성 종양 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 지시해준다.
실시예 5
마우스에서 WT1 특이적 CTL을 유발시키기 위한 WT1 폴리펩티드의 용도
본 실시예는 WT1 양성 종양 세포주를 사멸시킬 수 있는 CTL 면역을 유발시키는 대표적인 WT1 폴리펩티드의 능력을 예시해준다.
부류 I 및 부류 II MHC와 결합하기에 적당한 모티프를 갖는 펩티드인 p117- 139는, TSITES 및 BIMAS HLA 펩티드 결합 예측 분석법을 사용하여 상기 언급된 바와 같이 동정한다. 마우스를 실시예 3에 기재된 바와 같이 면역시킨다. 면역화시킨 후, 비장 세포를 시험관 내에서 자극시키고, 이를 대상으로 하여, WT1 폴리펩티드 뿐만 아니라 WT1 양성 및 음성 종양 세포와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험한다. 표준 크롬 방출 검정을 사용하여 CTL을 평가한다. 도 10A 내지 10D에 제시된 결과는, p117이 WT1 양성 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 WT1 특이적 CTL을 유발시킬 수 있는 반면, WT1 음성 세포의 사멸은 전혀 관찰되지 않았다는 것을 보여준다. 이들 결과는, 펩티드 특이적 CTL이 WT1을 발현하는 악성 종양 세포를 사실상 사멸시킨 다는 사실과, T 세포 치료법이 WT1을 발현하는 악성 종양에 대해 유효하다는 사실을 입증해주었다.
9량체 부류 I MHC 결합성 펩티드 p136-144, p225-233, p235-243 뿐만 아니라 23량체 펩티드 p117-139를 사용하여, 유사한 면역화를 수행한다. 면역화 후, 비장 세포를 시험관 내에서 상기 4개의 펩티드 각각으로 자극시키고, 이를 대상으로 하여, WT1 펩티드와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키는 능력에 대해 시험한다. p136-144, p235-243 및 p117-139에 특이적인 CTL이 발생되었지만, p235-233에 특이적인 CTL은 발생되지 않았다. p235-243 및 p117-139에 대한 CTL 데이터가 도 11A 및 11B에 제시되어 있다. p136-144 및 p225-233에 대한 데이터는 제시되지 않는다.
CTL 용해시키기 위해서는, 표적 WT1 펩티드가 내적으로 프로세싱되고 종양 세포 부류 I MHC 분자와 연합해서 표시되어야 한다. 상기 WT1 펩티드 특이적 CTL 을 대상으로 하여, WT1 양성 대 음성 종양 세포주를 용해시키는 능력에 대해 시험한다. p235-243에 특이적인 CTL은 p235-243 펩티드와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키지만, WT1 단백질을 발현하는 세포주는 용해시키지 못하였다(도 11A). 이와는 현저히 대조적으로, p117-139에 특이적인 CTL은 p117-139 펩티드와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키고, 또한 WT1을 발현하는 악성 종양 세포를 용해시킨다(도 11B). 음성 대조군으로서, p117-139에 특이적인 CTL은 WT1 음성 EL-4(본원에서 E10으로서 지칭되기도 함)를 용해시키지 못하였다.
WT1 특이적 용해의 특이성은 한냉 표적 억제에 의해 확인하였다(도 12A-12B). 효과기 세포를 각종 효과기:표적 비로 96-웰 U자형 바닥 판에 놓아둔다. 51Cr 표지화시키지 않은 지시된 펩티드-피복된 표적물 10배 과량(뜨거운 표적물과 비교해서)을 가한다. 최종적으로, 웰당 104개 51Cr-표지된 표적 세포를 가하고, 상기 판을 37℃에서 4시간 동안 항온처리한다. 웰당 총 용적은 200㎕이다.
p117-139 특이적 CTL에 의한 TRAMP-C의 용해는, 관련 펩티드 p117-139와 함께 항온처리된 EL-4에 의해서 58%에서 36%로 차단되었지만, 무관한 펩티드와 함께 항온처리된 EL-4에 의해서는 차단되지 않았다(도 12A). 유사하게, BLK-SV40의 용해는, 관련 펩티드 p117-139와 함께 항온처리된 EL-4에 의해서 18%에서 0%로 차단되었다(도 12B). 결과는, WT1 펩티드 특이적 CTL이, 프로세싱된 WT1을 인식함으로써 악성 종양 세포를 특이적으로 사멸시킨다는 사실을 확인시켜 준다.
추정상의 CTL 모티프를 갖는 몇몇 세그먼트가 p117-139 내에 함유되어 있다. CTL 에피토프의 정확한 서열을 결정하기 위해, p117-139 내의 모든 잠재적인 9량체 펩티드를 합성하였다(표 XLVIII). 이들 펩티드 중의 2개(p126-134 및 p130-138)은 H-2b 부류 I 분자와 결합하는 것으로 나타났다(표 XLVIII). p117-139로 면역시킴으로써 발생된 CTL은 p126-134 및 p130-138와 함께 항온처리된 표적물을 용해시키지만, p117-139 내의 기타 9량체 펩티드는 용해시키지 않는다(도 13A).
상기 p117-139 특이적 CTL 주를 p126-134 또는 p130-138로 재자극시킨다. p126-134 또는 p130-138로 재자극시킨 후, 모든 T 세포주는 펩티드 특이적 용해를 입증해주었지만, p130-138 특이적 CTL 만이 WT1 양성 종양 세포주의 용해를 나타내었다(도 13B 및 13C). 따라서, p130-138은 천연적으로 프로세싱된 에피토프인 것으로 여겨진다.
실시예 6
마우스 종양 세포주에서의 WT1 특이적 mRNA의 동정
본 실시예는 세포 및 세포주에서 WT1 특이적 mRNA를 탐지하기 위해 RT-PCR을 사용하는 것을 예시하고 있다.
밀도 구배 원심분리시킴으로써 단핵 세포를 분리하고, 이를, WT1 특이적 mRNA의 존재를 알아보기 위해 RT-PCR함으로써 분석할 때까지, 즉시 동결시킨 다음 -80℃에서 저장한다. RT-PCR은 일반적으로, 문헌[참조: Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995]에 기재된 바와 같이 수행한다. 전체 RNA를 표준 과정에 따라서 107개 세포로부터 추출한다. RNA 세포를 25㎕ 디에틸피로카보네이트 처리된 물 에서 재현탁시키고, 이를 역전사에 직접 사용한다. 아연 핑거 영역(엑손 7 내지 10)을 PCR에 의해 330bp 마우스 cDNA로서 증폭시킨다. 증폭을 PCR 1회전, 또는 필요에 따라 순차 회전 동안 열순환기(thermocycler)에서 수행한다. 총 반응 용적 50㎕ 중의 AmpliTaq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 2.5mM MgCl2 및 20pmol의 각 프라이머를 사용한다. 20㎕ 분취량의 PCR 생성물을, 에티듐 브로마이드로 염색된 2% 아가로즈 겔 상에서 전기영동시킨다. 폴라로이드 필름(Polaroid 667, Polaroid Ltd., Hertfordshire, England)를 이용하여 상기 겔의 사진을 찍는다. 문헌[참조: Kwok and Higuchi, Nature 339:237-238, 1989]의 권고에 따라서, 교차 오염에 대해 주의한다. 음성 대조군은 각 실험에서 cDNA 대신 물과 상기 cDNA- 및 PCR-시약과의 혼합물을 포함하고 있다. 가짜 음성물을 피하기 위해, 본래의 RNA와 적당한 DNA 발생물의 존재 여부는, β-악틴 프라이머를 사용하여 대조군 PCR에 의해 각 샘플에 대해 평가하였다. 이들 프라이머를 증폭시키지 않은 샘플은 분석으로부터 제외시킨다.
마우스 세포주에서 WT1의 증폭용 프라이머는 다음과 같다: P115:1458-1478: 5'CCC AGG CTG CAA TAA GAG ATA 3' (정방향 프라이머; 서열 번호 21); 및 P116: 1767-1787: 5'ATG TTG TGA TGG CGG ACC AAT 3' (역방향 프라이머; 서열 번호 22)[참조: Inoue et al, Blood 88:2267-2278, 1996; Fraizer et al., Blood 86:4704-4706, 1995].
대조군 영역에서 사용된 베타 악틴 프라이머는 다음과 같다: 5'GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3' (센스 프라이머; 서열 번호 23); 및 5'GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC 3' (안티센스 프라이머; 서열 번호 24).
사람 WT1을 증폭시키는데 사용하기 위한 프라이머에는 다음이 포함된다: P117:954-974: 5' GGC ATC TGA GAC CAG TGA GAA 3' (서열 번호 25); 및 P118:1434-1414: 5' GAG AGT CAG ACT TGA AAG CAGT 3' (서열 번호 5). 중첩된(nested) RT-PCR의 경우, 프라이머는 다음과 같을 수 있다: P119:1023-1043: 5'GCT GTC CCA CTT ACA GAT GCA 3' (서열 번호 26); 및 P120:1345-1365: 5'TCA AAG CGC CAG CTG GAG TTT 3' (서열 번호 27).
표 XLVIII은 마우스 종양 세포주의 WT1 PCR 분석 결과를 제시한 것이다. 표 IV 내에서, (+++)는 제1 단계 RT-PCR에서의 강력한 WT1 PCR 증폭 생성물을 지시해주고, (++)는 제1 단계 WT1 RT PCR에 의해 탐지 가능한 WT1 증폭 생성물을 지시해주며, (+)는 제2 단계의 WT RT PCR에서만 탐지 가능한 생성물을 지시해주고, (-)은 WT1 PCR 음성을 지시해준다.
실시예 7
WT1 TRX 융합 작제물의 이. 콜라이에서의 발현
WT1의 절두된 개방 판독 프레임(WT1B)을, 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다:
아미노산 2에서 출발하는 정방향 프라이머
P-37 (서열 번호 342) 5'ggctccgacgtgcgggacctg 3'Tm 64℃
중지 코돈 다음에 EcoRI 부위를 생성시키는 역방향 프라이머
P-23 (서열 번호 343) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 63℃
PCR을 다음 조건 하에서 수행하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 3분 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI 제한 효소로 분해시키고, 겔 정제한 다음, pTrx 2H 벡터(N-말단 상의 Trx 융합물 및 이러한 Trx 융합물을 둘러싸고 있는 2개의 His 태그를 갖는 변형된 pET28 벡터. Trx 융합물 다음에 트롬빈 및 엔테로키나제에 대한 프로테아제 절단 부위가 존재한다) 내로 클로닝시킨다. pTrx2H 작제물을 StuI 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨다. 정확한 작제물을 DNA 서열 분석함으로써 확인하고, 이를 BL21(DE3) pLysS 및 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포 내로 형질전환 시킨다.
실시예 8
WT1A His 태그 융합 작제물의 이. 콜라이에서의 발현
WT1의 N-말단 개방 판독 프레임(WT1A)을, 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다:
아미노산 2에서 출발하는 정방향 프라이머
P-37 (서열 번호 344) 5'ggctccgacgtgcgggacctg 3'Tm 64℃
아미노산 249 다음에 놓여진 인공 중지 코돈 다음에 EcoRI 부위를 생성시키는 역방향 프라이머
PDM-335 (서열 번호 345) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 63℃
PCR을 다음 조건 하에서 수행하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 1분 20초 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI 제한 효소로 분해시키고, 겔 정제한 다음, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨 pPDM 벡터(이는 동일 프레임 내에 His 태그를 갖는 변형된 pET28 벡터이다) 내로 클로닝시킨다. 이러한 PCR 생성물을 또한, pTrx 2H 벡터 내로 형질전환시킨다. pTrx2H 작제물을 StuI 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨다. 정확한 작제물을 DNA 서열 분석함으로써 확인하고, 이를 BL21(DE3) pLys S 및 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.
실시예 9
WT1B His 태그 융합 작제물의 이. 콜라이에서의 발현
WT1의 절두된 개방 판독 프레임(WT1A)을, 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다:
아미노산 250에서 출발하는 정방향 프라이머
PDM-346 (서열 번호 346) 5'cacagcacagggtacgagagc 3'Tm 58℃
중지 코돈 다음에 EcoRI 부위를 생성시키는 역방향 프라이머
P-23 (서열 번호 347) 5'gaattctcaaagcgccagctggagtttggt 3'Tm 63℃
PCR을 다음 조건 하에서 수행하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 1분 30초 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI 제한 효소로 분해시키고, 겔 정제한 다음, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨 pPDM 벡터(이는 동일 프레임 내에 His 태그를 갖는 변형된 pET28 벡터이다) 내로 클로닝시킨다. 이러한 PCR 생성물을 또한, pTrx 2H 벡터 내로 형질전환시킨다. pTrx2H 작제물을 StuI 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨다. 정확한 작제물을 DNA 서열 분석함으로써 확인하고, 이를 BL21(DE3) pLys S 및 BL21(DE3) CodonPlus 발현 숙주 세포 내로 형질전환시킨다.
실시예 7 내지 9에 대해, 다음 서열 번호가 기재된다:
서열 번호 327은 Trx_WT1_B에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 328은 Trx_WT1_A에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 329은 Trx_WT1에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 330은 WT1_A에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 331은 WT1_B에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 332은 서열 번호 327에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 333은 서열 번호 328에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 334은 서열 번호 329에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 335은 서열 번호 330에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 336은 서열 번호 331에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
실시예 10
이. 콜라이에서 발현된 WT1의 절두된 형태
WT1의 3가지 판독 프레임을, 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다:
WT1 Tr2 경우:
PDM-441 (서열 번호 348) 5'cacgaagaacagtgcctgagcgcattcac 3'Tm 63℃
PDM-442 (서열 번호 349) 5'ccggcgaattcatcagtataaattgtcactgc 3'TM 62℃
WT1 Tr3의 경우:
PDM-443 (서열 번호 350) 5'caggctttgctgctgaggacgccc 3'Tm 64℃
PDM-444 (서열 번호 351) 5'cacggagaattcatcactggtatggtttctcacc Tm 64℃
WT1 Tr4의 경우:
PDM-445 (서열 번호 352) 5'cacagcaggaagcacactggtgagaaac 3'Tm 63℃
PDM-446 (서열 번호 353) 5'ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3'TM 63℃
PCR을 다음 조건 하에서 수행하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 30초 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI 제한 효소로 분해시키고, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨 pPDM His(이는 5' 말단 상에서 동일 프레임 내에 His 태그를 갖는 변형된 pET28 벡터이다) 내로 클로닝시킨다. 이러한 작제물은 서열 분석을 통하여 정확한 것으로 확인되었고, 이를 BL21 pLys S 및 BL21 CodonPlus 세포 또는 BLR pLys S 및 BLR CodonPlus 세포 내로 형질전환시킨다.
실시예 11
이. 콜라이에서의 WT1C(아미노산 76-437) 및 WT1D(아미노산 91-437) 발현
WT1C 판독 프레임을, 다음 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다:
PDM-504 (서열 번호 354) 5'cactccttcatcaaacaggaac 3'Tm 61℃
PDM-446 (서열 번호 355) 5'ggatatctgcagaattctcaaagcgccagc 3'Tm 63℃
PCR을 다음 조건 하에서 수행하였다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
50ng DNA(pPDM FL WT1)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 2분 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI 제한 효소로 분해시키고, Eco72I 및 EcoRI 제한 효소로 분해시킨 pPDM His 내로 클로닝시킨다. 상기 서열은 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 CodonPlus RP와 함께 공동-형질전환되는 BLR pLys S 및 BLR 내로 형질전환시킨다.
실시예 12
중복 올리고의 어닐링에 의한 WT1 TR-1의 합성적 제조
본 실시예는 발현시의 프롤린 코돈 활용 변화 효과를 결정하기 위해 수행된 것이다.
다음 쌍의 올리고를 어닐링하였다:
1. PDM-505 (서열 번호 356) 5
ggttccgacgtgcgggacctgaacgcactgctg 3'
PDM-506 (서열 번호 357) 5'
ctgccggcagcagtgcgttcaggtcccgcacgtcggaacc 3'
2. PDM-507 (서열 번호 358) 5'
ccggcagttccatccctgggtggcggtggaggctg 3'
PDM-508 (서열 번호 359) 5'
cggcagtgcgcagcctccaccgccacccagggatggaa 3'
3. PDM-509 (서열 번호 360) 5'
cgcactgccggttagcggtgcagcacagtgggctc 3'
PDM-510 (서열 번호 361) 5'
cagaactggagcccactgtgctgcaccgctaac 3'
4. PDM-511 (서열 번호 362) 5'
cagttctggacttcgcaccgcctggtgcatccgcatac 3'
PDM-512 (서열 번호 363) 5'
cagggaaccgtatgcggatgcaccaggcggtgcgaagtc 3'
5. PDM-513 (서열 번호 364) 5'
ggttccctgggtggtccagcacctccgcccgcaacgcc 3'
PDM-514 (서열 번호 365) 5'
ggcggtgggggcgttgcgggcggaggtgctggaccacc 3'
6. PDM-515 (서열 번호 366) 5'
cccaccgcctccaccgcccccgcactccttcatcaaacag 3'
PDM-516 (서열 번호 367) 5'
ctaggttcctgtttgatgaaggagtgcgggggcggtgga 3'
7. PDM-517 (서열 번호 368) 5'
gaacctagctggggtggtgcagaaccgcacgaagaaca 3'
PDM-518 (서열 번호 369)] 5'
ctcaggcactgttcttcgtgcggttctgcaccaccccag3'
8. PDM-519 (서열 번호 370) 5'
gtgcctgagcgcattctgagaattctgcagat 3'
PDM-520 (서열 번호 371) 5'
gtgtgatggatatctgcagaattctcagaatgcg 3'.
각 올리고를 별개로 조합한 다음 어닐링시킨다. 이어서, 상기 쌍을 함께 연결시키고, 연결 혼합물 1㎕를 다음 PCR 조건 하에 사용한다:
10㎕ 10X Pfu 완충제
1㎕ 10mM dNTPs
2㎕ 10μM 각 올리고
83㎕ 멸균수
1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA)
96℃ 2분
96℃ 20초 63℃ 15초 72℃ 30초 x 40 주기
72℃ 4분
상기 PCR 생성물을 EcoRI로 분해시키고, Eco72I 및 EcoRI로 분해시킨 pPDM His 내로 클로닝시킨다. 상기 서열을 확인한 다음, 이를 CodonPlus RP와 함께 공동-형질전환되는 BLR pLys S 및 BLR 내로 형질전환시킨다.
실시예 10 내지 12에 대해, 다음 서열 번호가 기재된다:
서열 번호 337은 WT1_Tr1에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 338은 WT1_Tr2에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 339은 WT1_Tr3에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 340은 WT1_Tr4에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 341은 WT1_C에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 번호 342은 서열 번호 337에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 343은 서열 번호 338에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 344은 서열 번호 339에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 345은 서열 번호 340에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
서열 번호 346은 서열 번호 341에 의해 암호화된 예상된 아미노산 서열이다.
상기 WT1C 서열은 TR2, TR3 및 TR4의 암호화 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
WT1 TR-1 합성 서열은 프롤린에 대한 대체 코돈이 본래의 코돈을 대체하여, 이. 콜라이에서 WT1 TR-1을 발현할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 생성시키는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다.
실시예 13
마우스에서 WT1 면역화의 전신성 조직병리학적 및 독성학적 효과 평가
본 실시예의 목적은 마우스에서 다중 투여 역가측정에 있어서 WT1 단백질 면역화의 효능있는 전신성 조직병리학적 및 독성학적 효과, 및 면역원성을 분석하기 위한 것이다.
WT1 단백질로 마우스를 면역시키기 위한 실험적 고안이 다음 표 L에 요약되어 있다:
암컷 C57/B6 마우스에서 다중 투여 역가측정 연구(25㎍, 100㎍ 내지 1000㎍ WT1 단백질 범위의 용량)에서, 아주반트로서 MPL-SE를 사용한 WT1 단백질에 대한 백신접종은 강력한 WT1 특이적 항체 반응(도 19)과 세포성 T 세포 반응(도 20)을 유발시킨다.
WT1 단백질로의 면역화의 전신성 조직병리학적 또는 독성학적 효과는 전혀 관찰되지 않았다. 다음 조직에서는 독성에 대한 어떠한 조직학적 증거도 관찰되지 않았다: 부신선, 뇌, 맹장, 결장, 십이지장, 눈, 대퇴골 및 골수, 담낭, 심장, 회장, 공장, 신장, 후두, 누선, 간, 폐, 림프절, 근육, 식도, 난소, 췌장, 상피소체, 타액선, 흉골 및 골수, 비장, 위, 흉선, 기관지, 갑상선, 뇨 방광 및 자궁.
잠재적인 조혈 독성에 대한 평가를 특별히 강조하였다. 흉골 및 대퇴골 골 수에서의 골수성/적혈구성 비는 정상이었다. 평가 가능한 모든 혈액 세포 계수치와 혈액 화학(BUN, 크레아티닌, 빌리루빈, 알부민, 글로불린)은 정상적인 범위 내이다(표 LI).
WT1에 대해 실재하는 면역성이 백혈병에 걸린 몇몇 환자에게 존재하고, WT1 단백질에 대한 백신접종이, 정상 조직에 대한 독성을 나타내지 않으면서 마우스에서 WT1 특이적 Ab 및 세포성 T 세포 반응을 유발시킬 수 있는 경우, 이들 실험은 WT1이 종양/백혈병 백신으로서 유효하다는 것을 나타낸다.
약어: WBC: 백혈구; RBC: 적혈구; Hg: 헤모글로빈; HCT: 헤마토크릿; MCV: 평균 소체 용적; MCH: 평균 소체 헤모글로빈; MCHC: 평균 소체 헤모글로빈 농도; Plt: 혈소판; Abs: 절대; Baso: 호염기구; Eos: 호산구; Abs.Bands: 미숙한 호중구; Polys: 다형핵 세포; Lymph: 림프구; Mono: 단구; BUN: 혈액 우레아 질소.
실시예 14
시험관내 프라이밍에서 완전 유전자에 의한 사람 WT1 특이적 T 세포 반응 유발
본 실시예는 WT1 특이적 T 세포 반응이 정상적인 개개인의 혈액으로부터 발생될 수 있다는 것을 입증해준다.
수지상 세포(DC)를, 10% 사람 혈청, 50ng/ml GMCSF 및 30ng/ml IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4 내지 10일 동안 성장시킴으로써, 정상적인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단구 배양물로부터 분화시킨다. 배양 후, DC를 16시간 동안 재조합 WT1 발현성 백시니아 바이러스로 M.O.I. 5로 감염시키거나 또는 3일 동안 재조합 WT1 발현성 아데노바이러스로 M.O.I. 10으로 감염시킨다(도 21 및 22). UV 조사함으로써 백시니아 바이러스를 불활성화시킨다. 자기 비드를 사용하여 양성 선별함으로써 CD8+ T 세포를 분리시키고, 96-웰 판에서 프라이밍 배양을 개시한다. WT1을 발현하도록 아데노 또는 백시니아 감염시킨 자가유래성 수지상 세포를 사용하여, 배양물을 7 내지 10일마다 재자극시킨다. 3 내지 6회 자극시킨 후, 자가유래성 WT1 발현성 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극시킨 경우에 인터페론-감마를 특이적으로 생성시키는 CD8+ T 세포주들 동정할 수 있었다. 이들 주의 WT1 특이적 활성은 부가의 자극 주기 후에 유지될 수 있었다. 이들 주는 엘리스폿(Elispot) 검정에 의하면, 아데노 또는 백시니아 WT1 감염된 자가유래성 수지상 세포는 특이적으로 인식하지만, 아데노 또는 백시니아 EGFP-감염된 자가유래성 수지상 세포는 인식하지 못한 것으로 입증되었다(도 23).
실시예 15
주사용 Ra12-WT1의 제형화: 동결건조된 생성물을 안정화시키기 위한 부형제의 용도
본 실시예는 동결건조된 Ra12-WT1의 완전한 안정화를 허용해주는 제형화에 관한 것이다.
다음 제형화는 재조합 단백질 Ra12-WT1이, 무수 동결건조된 후에 수성 배지 내로 용해되도록 해준다:
재조합 Ral2-WT1 농도: 0.5-1.0mg/ml; 완충제: 10-20 mM 에탄올아민, pH 10.0; 1.0-5.0mM 시스테인; 0.05% 트윈-80(폴리솔베이트-80); 당: 10% 트레할로즈 (T5251, Sigma, MO) 10% 말토즈 (M9171, Sigma, MO) 10% 슈크로즈 (S7903, Sigma, MO) 10% 프럭토즈 (F2543, Sigma, MO) 10% 글루코즈 (G7528, Sigma, MO).
상기 당 부형제를 갖는 동결건조된 단백질은 이러한 당 부형제를 갖지 않는 것 보다 상당히 더 용해되는 것으로 밝혀졌다. 쿠마시(coomassie) 염색된 SDS-PAGE에 의한 분석 결과, 상기 용해된 물질 중에 고형물이 잔존하고 있다는 어떠한 징후도 나타나지 않았다.
실시예 16
WT1 단백질 백신의 제형화
본 실시예에는, WT1 단백질 및 2가지 상이한 아주반트 제형으로의 면역화 후 WT1 특이적 면역 반응의 유도가 기재되어 있다.
본 실시예에 따르면, WT1 단백질은 MPL-SE와 함께, WT1에 대한 강력한 Ab 및 인터페론-γ(IFN-γ) 반응을 유도시킨다. C57/B6 마우스에서 아주반트로서 MPL-SE 또는 인핸진을 사용하여 WT1 단백질 면역화시킨 후에 WT1 특이적 면역 반응을 유도시키기 위해 사용된 방법이 다음에 상세히 기재되어 있다.
C57BL/6 마우스는, 20㎍ rRa12-WT1을 MPL-SE 또는 인핸진 아주반트와 조합하여 면역시킨다. 대조군 마우스 한 그룹을 아주반트 없이 rRa12-WT1로 면역시키고, 다른 한 그룹을 식염수로만 면역시킨다. 3주 간격으로 3가지 근육내(IM) 면역화를 제공한다. 최종 면역시킨지 2주 후에 비장과 혈청을 수거한다. 혈청을 대상으로 하여, Ra12-WT1 융합물, Ra12 또는 WT1TRX로 피복된 판 상에서 ELISA함으로써 항체 반응에 대해 분석하였다. 유사한 수준의 IgG2a 및 IgG1 항체 역가가, Ra12-WT1 + MPL-SE 및 Ra12-WT1 + 인핸진으로 면역시킨 마우스에서 관찰되었다. 아주반트 없이 rRa12-WT1로 면역시킨 마우스는 보다 낮은 수준의 IgG2a 항체를 나타내었다.
비장 세포를 시험관 내에서 ra12-WT1, rRa12, 또는 WT1 펩티드 p6, p117 및 p287로 자극시킨 후에 인터페론-γ생성을 측정함으로써, CD4 반응을 평가한다. 모든 아주반트는 rRa12-WT1 단독으로 면역시킨 마우스 전반에 걸쳐 CD4 반응을 개선시켰다. 부가적으로, 상기 결과는 rRa12-WT1 + MPL-SE가 rRa12-WT1 + 인핸진 보다 강력한 CD4 반응을 유도시켰다는 것을 지시해준다. rRa12-WT1 + 인핸진으로 면역시킨 마우스에서의 IFN-γOD 판독치 1 내지 1.2와 비교해서, rRa12-WT1 + MPL-SE로 면역시킨 마우스에서의 IFN-γOD 판독치는 1.4 내지 1.6이다. 펩티드 반응은 p117에 대해서만 관찰되었고, 이어서 rRa12-WT1 + MPL-SE로 면역시킨 마우스에서만 관찰되었다. 양성 대조군 ConA에 대한 강력한 IFN-γ반응이 모든 마우스에서 관찰되 었다. 식염수로 면역시킨 음성 대조군에서는 ConA에 대한 반응만이 관찰되었는데, 이는 상기 반응이 rRa12-WT1에 특이적이라는 것을 지시해준다.
실시예 17
무작위로 돌연변이된 WT1 라이브러리의 작제
사람 WT1의 핵산 서열을, 8-옥소 dGTP 및 dPTP의 존재 하에 폴리머라제 연쇄 반응 방법을 사용하여 무작위로 돌연변이시킨다[참조: journal of Molecular Biology 1996; 255: 589-603]. 완전한 스플라이스되지 않은 사람 WT1 유전자가 서열 번호 380에 제시되어 있고, 상응하는 단백질 서열이 서열 번호 404에 제시되어 있다. WT1의 스플라이스 변이체가 해당 PCR 반응용 주형으로 사용되고, 이것이 서열 번호 381(DNA) 및 408(단백질)에 기재되어 있다. 핵산 변형 횟수가 아미노산 서열 표적화 변화, 통상적으로 PCR 생성물의 5 내지 30%를 가져다 주도록 조건을 선택한다. 이어서, 이와 같이 돌연변이된 PCR 생성물을, 4가지 정상적인 dNTPs를 사용하여 뉴클레오티드 동족체의 부재 하에 증폭시킨다. 이러한 PCR 생성물을 면역화시키기 위해 포유류 발현 벡터 및 바이러스성 벡터 내로 서브클로닝시킨다. 따라서, 이러한 라이브러리는 무작위로 돌연변이된 WT1 클론의 혼합 집단을 함유한다. 몇몇 클론을 선별하고 서열 분석한다. 돌연변이된 WT1 변이체 DNA 서열이 서열 번호 377-379에 기재되어 있고, 이러한 변이체의 예상되는 아미노산 서열은 서열 번호 405-407에 제시되어 있다. 이들 변형된 서열, 및 상기 라이브러리로부터의 기타 형태를 면역원으로서 사용하여, 암 세포에서 WT1 단백질에 대한 보다 강력한 T 세포 반응을 유도시킬 수 있다.
실시예 18
WT1-LAMP 융합물의 작제
폴리머라제 연쇄 반응, 및 사람 라이소솜-관련 막 단백질-1(LAMP-1)의 목적하는 연결부 및 사람 WT1 서열의 스플라이스 변이체를 함유하는 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 3부로 나뉘어진 융합물을 작제한다. 이들 융합에 사용된 WT1의 스클라이스 변이체 및 LAMP-1 서열은 서열 번호 381 및 383에 기재되어 있다. 구체적으로 언급하면, LAMP-1의 시그날 서열(LAMP의 염기 쌍 1-87)을 사람 WT1 개방 판독 프레임(길이가 1,290 염기쌍이다)의 5-프라임 말단에 융합시킨 다음, LAMP-1의 막관통(transmembrane) 및 세포질성 도메인(LAMP의 염기 쌍 1161 내지 1281)을 WT1 서열의 3-프라임 말단에 융합시킨다. 이로써 생성된 WT1-LAMP 작제물의 서열이 서열 번호 382(DNA) 및 서열 번호 409(단백질)에 제시되어 있다. 이러한 작제물은, 이것이 진핵 세포에서 발현될 때, 해당 단백질이 소포체(ER)로 향하도록 시그날 펩티드가 지시하는데, LAMP-1의 막관통 및 세포질성 도메인 내에서의 위치결정 시그날은 융합 단백질이, 펩티드가 부류 II MHC 분자 상으로 적재되는 라이소솜 위치로 수송되는 것을 지시하도록 고안된다.
실시예 19
MHC 부류 I 표시 증강을 위한 WT1-우비퀴틴 융합물의 작제
마지막 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드가 글리신 대신 알라닌을 암호화하도록, 사람 우비퀴틴 개방 판독 프레임(서열 번호 384)을 돌연변이시킨다. 이와 같이 돌연변이된 개방 판독 프레임을 동일 프레임 내에서, 사람 WT1의 스플라이스 변이체(서열 번호 381 및 408, 각각 DNA 및 단백질)의 제1 코돈 바로 상단부에 클로닝시킨다. G →A 돌연변이는, 해독 동안 폴리-우비퀴틴을 정상적으로 프로세싱하는 프로테아제에 의해 본래 단백질이 해독과 동시에 절단되는 것을 방지시켜 준다. 이로써 생성된 작제물에 대한 DNA 및 예상된 아미노산 서열이 서열 번호 385 및 410에 각각 제시되어 있다. 이로써 생성된 단백질은 이것이 사람 세포에게서 발현될 때 세포성 세포독성 감소를 나타내었다. 본래의 WT1를 발현하는 안정한 세포주를 발생시키는 것은 가능하지 않는 반면, 상기 융합 단백질을 발현하는 세포주는 용이하게 수득된다. 생성된 단백질은 부가된 우비퀴틴 분자를 통하여 프로테오솜에 표적화될 것으로 예상된다. 이로써, WT1 특이적 CD8+ T 세포에 의한 해당 단백질의 보다 효율적인 인식이 이루어져야 한다.
실시예 20
사람 WT1을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 작제
사람 WT1의 스플라이스 변이체(서열 번호 381)를 E1 및 E3 결실된 아데노바이러스 혈청형 5 벡터 내로 클로닝시킨다. WT1 유전자의 발현은 높은 수준의 WT1 단백질 발현을 매개해주는 CMV 프로모터에 의해 제어된다. 사람 세포를 이러한 시약으로 감염시키면, WT1 단백질이 높은 수준으로 발현된다. 후속 감염 동안 저수 준으로 생성된 숙주 세포 내로 도입된 아데노바이러스성 단백질의 항원성은 면역학적 표적으로서의 WT1의 면역 인식과 면역 감시를 증가시키는 작용을 할 수 있다. 상기 벡터는 또한, 사람 대상체에게 접종될 때, WT1 단백질에 대한 면역 반응을 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 이들 대상체가 WT1 발현성 종양 세포에 대해 양성인 경우, 해당 면역 반응은 질병 과정에 대한 치료학적 효과를 지닐 수 있다.
실시예 21
사람 WT1을 발현하는 백시니아 바이러스 벡터의 작제
완전한 길이의 사람 WT1 유전자의 스플라이스 변이체(서열 번호 381)를, pSC11 셔틀 벡터를 사용하여 백시니아 바이러스의 웨스턴 보존 균주의 티미딘 키나제 유전자좌 내로 클로닝시킨다. 상기 WT1 유전자는 백시니아 바이러스 감염 전반에 걸쳐 유전자 발현을 매개하는 하이브리드 백시니아 바이러스 프로모터의 제어 하에 있다. 상기 시약을 사용하여, 사람 세포 내에서 생체내 또는 시험관 내에서 WT1 단백질을 발현시킬 수 있다. WT1은 몇몇 사람 종양 세포에서 과발현되는 자가 단백질이다. 따라서, 단백질로서 전달된 WT1에 대한 면역학적 반응이, WT1의 주요 조직적합성 부류 I(MHC 부류 I)-매개된 인식을 유발시키는 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 백시니아 바이러스 벡터에 의한 세포내 구획에서의 상기 단백질의 발현으로 인해, CD8+ T 세포에 의한 WT1 단백질의 높은 수준의 MHC 부류 I 표시화 및 인식이 허용될 것이다. 상기 백시니아 바이러스 벡터에 의한 WT1 단백질의 발현은 또한, MHC 부류 II의 맥락에서 WT1 펩티드의 표시화를 유발함으로써, CD4+ T 세포 에 의한 인식을 유도할 것이다.
본 발명의 용도에는 암 백신으로서의 이의 용도가 포함된다. WT1 양성 종양을 보유하고 있는 사람 대상체를 면역화시키면, 치료학적 반응이 유발될 수 있을 것이다. 해당 세포 내에서의 WT1의 발현은 CD4 및 CD8 양성 T 세포 모두에 의한 상기 단백질의 인식을 가져다줄 것이다.
실시예 22
완전 유전자 프라이밍을 사용한 WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론의 발생
수지상 세포(DC)를, 10% 사람 혈청, 50ng/ml GM-CSF 및 30ng/ml IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4 내지 10일 동안 성장시킴으로써, 정상적인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단구 배양물로부터 분화시킨다. 배양 후, DC를 16시간 동안 재조합 WT1 발현성 백시니아 바이러스(실시예 21에 기재됨)로 감염 다중도(MOI) 5로 감염시키거나 또는 3일 동안 재조합 WT1 발현성 아데노바이러스로 MOI 10으로 감염시킨다. UV 조사함으로써 백시니아 바이러스를 불활성화시킨다. 자기 비드를 사용하여 음성 고갈시킴으로써 CD8+ T 세포를 분리시키고, 96-웰 판에서 프라이밍 배양을 개시한다. WT1을 발현하도록 공학적으로 처리시킨 아데노 또는 백시니아 바이러스로 감염시킨 자가유래성 수지상 세포를 사용하여, 배양물을 7 내지 10일마다 재자극시킨다. 4 내지 5회 자극시킨 후, 자가유래성 WT1 발현성 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극시킨 경우에 인터페론-감마를 특이적으로 생성시키는 CD8+ 세포주를 동정할 수 있었다. 이들 주는 엘리스폿 검정에 의하면, WT1 형질도입된 자가유 래성 섬유아세포는 특이적으로 인식하지만, EGFP 형질도입된 섬유아세포는 인식하지 못한 것으로 입증되었다.
윌름 종양(WT1) 유전자는 백혈병유발에 참여하고 대부분의 사람 백혈병 뿐만 아니라 몇몇 고형 종양에서 과발현된다. 사람을 대상으로 한 앞서의 연구 결과, 연구된 AML 환자 63명 중의 16명(25%) 및 CML 환자 81명 중의 15명(19%)에게서 WT1 특이적 항체(Ab)가 존재하는 것으로 입증되었다. 마우스를 대상으로 한 앞서의 연구는 WT1 펩티드계 백신이 WT1 특이적 Ab, Th 및 CTL 반응을 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 사람에게서 백신으로서의 펩티드의 용도는 이들의 HLA 제한에 의해 한정되고, 대다수의 환자 종양 특이적 CTL에서만 펩티드 특이적 반응을 유발시키는 경향에 의해 제한된다. 완전 유전자 면역화의 이점은, 몇몇 헬퍼 및 CTL 에피토프가 단일 백신에 포함될 수 있음으로써, 해당 백신이 특이적 HLA 유형에 제한되지 않는다는 점이다. 본원에 기재된 데이터는, 완전 유전자 시험관내 프라이밍을 사용하여 WT1 특이적 면역 반응을 유도시킬 수 있다는 것과, WT1 특이적 CD8+ T-세포 클론이 발생될 수 있다는 것을 입증해준다. WT1에 대해 실재하는 면역성이 백혈병이 걸린 몇몇 환자에게 존재하고, 쥐과 및 사람 WT1이 아미노산 수준에서 96% 동일하고 WT1 단백질, DNA 또는 펩티드에 대한 백신접종이 WT1 특이적 Ab, 및 마우스에서 정상 조직에 대한 독성 없이 마우스에서 세포성 T 세포 반응을 유발시키는 경우에는, 이들 사람 시험관내 프라이밍 실험은 WT1가 종양/백혈병 백신으로서 유효하다는 사실을 추가로 제공해준다. 더우기, WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론을 생성시키는 능력은, 유전공학적으로 처리된 T 세포를 사용하여 WT1 과발현과 연관된 악성 종양을 치료할 수 있게 한다.
실시예 23
WT1을 임상적으로 제작하기 위한 재조합 작제물
임상 등급의 WT1을 생성시키기 위해, 5개 작제물을 다음에 기재된 바와 같이 제조하였다:
His 태그를 갖지 않는 Ra12/WT-E(서열 번호 388(cDNA) 및 391(단백질)) 및 WT-1 E(서열 번호 386(cDNA) 및 395(단백질))의 고안
비-His 비 융합 작제물에 대한 다음 프라이머를 사용하여, WT-1 E 판독 프레임을 PCR 증폭시킨다:
PDM-780 (서열 번호 396) 5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tm 60℃
PDM-779 (서열 번호 397) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3'Tm 63℃
다음 PCR 주기 조건을 사용한다: 10㎕ 10X Pfu 완충제, 1㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 10μM 각 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 이 반응물을 96℃에서 2분 동안 초기에 변성시킨 다음, 96℃에서 20초, 62℃에서 15초 및 72℃에서 1분 40초 동안 40주기를 수행한다. 이어서, 72℃에서 4분 동안 최종 연장시킨다. 상기 PCR 생성물을 NdeI 및 EcoRI로 분해시키고, NdeI 및 EcoRI로 분해시킨 pPDM His(변형된 pET28 벡터) 내로 클로닝시킨다. 상기 작제물을 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포 내로 형질전환시킨다. 이어서, 이 러한 작제물 - pPDM WT-1 E를 NcoI 및 XbaI로 분해시키고, 이를 pPDM Ra12 WT-1 F(하기 참조)로부터의 NcoI 및 XbaI 삽입물에 대한 벡터 골격으로서 사용한다. 상기 작제물을 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포 내로 형질전환시킨다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다.
His 태그를 갖지 않는 Ra12/WT-1-F(aa 1-281)(서열 번호 389(cDNA) 및 393(단백질))의 고안
다음 프라이머를 사용하여, Ra12 WT-1 판독 프레임을 PCR 증폭시킨다:
PDM-777 (서열 번호 398) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 60℃
PDM-779 (서열 번호 399) 5' cgcgtgaattcatcactgaatgcctctgaag 3'Tm 63℃
다음 PCR 주기 조건을 사용한다: 10㎕ 10X Pfu 완충제, 1㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 10μM 각 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 이 반응물을 96℃에서 2분 동안 초기에 변성시킨 다음, 96℃에서 20초, 58℃에서 15초 및 72℃에서 3분 동안 40주기를 수행한다. 이어서, 72℃에서 4분 동안 최종 연장시킨다. 상기 PCR 생성물을 NdeI로 분해시키고, NdeI 및 EcoRI로 분해시킨 pPDM His 내로 클로닝시킨다. 상기 작제물을 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포 내로 형질전환시킨다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다.
His 태그를 갖지 않는 Ra12-WT-1(서열 번호 390(cDNA) 및 392(단백질))의 고안
다음 프라이머를 사용하여, Ra12 WT-1 판독 프레임을 PCR 증폭시킨다:
PDM-777 (서열 번호 400) 5' cgataagcatatgacggccgcgtccgataac 3' Tm 66℃
PDM-778 (서열 번호 401) 5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3'Tm 70℃
다음 PCR 주기 조건을 사용한다: 10㎕ 10X Pfu 완충제, 1㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 10μM 각 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 이 반응물을 96℃에서 2분 동안 초기에 변성시킨 다음, 96℃에서 20초, 68℃에서 15초 및 72℃에서 2분 30초 동안 40주기를 수행한다. 이어서, 72℃에서 4분 동안 최종 연장시킨다. 상기 PCR 생성물을 NotI 및 NdeI로 분해시키고, NdeI 및 NotI로 분해시킨 pPDM His 내로 클로닝시킨다. 상기 서열을 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포 내로 형질전환시킨다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다.
His 태그를 갖지 않는 이. 콜라이에서의 WT-1 C(aa 69-430)(서열 번호 387(cDNA) 및 394(단백질))의 고안
다음 프라이머를 사용하여, WT-1 C 판독 프레임을 PCR 증폭시킨다:
PDM-780 (서열 번호 402) 5' gacgaaagcatatgcactccttcatcaaac 3' Tm 60℃
PDM-778 (서열 번호 403) 5' gtctgcagcggccgctcaaagcgccagc 3'Tm 70℃
다음 PCR 주기 조건을 사용한다: 10㎕ 10X Pfu 완충제, 1㎕ 10mM dNTPs, 2㎕ 10μM 각 올리고, 83㎕ 멸균수, 1.5㎕ Pfu DNA 폴리머라제(Stratagene, La Jolla, CA), 50ng DNA(pPDMRa12 WT-1 No His). 이 반응물을 96℃에서 2분 동안 초기에 변성시킨 다음, 96℃에서 20초, 62℃에서 15초 및 72℃에서 2분 동안 40주기를 수행한다. 이어서, 72℃에서 4분 동안 최종 연장시킨다. 상기 PCR 생성물을 NdeI로 분해시키고, NdeI 및 Eco721로 분해시킨 pPDM His 내로 클로닝시킨다. 상기 서열을 서열 분석을 통하여 확인한 다음, 이를 BLR(DE3) pLys S 및 HMS 174(DE3) pLys S 세포 내로 형질전환시킨다. 쿠마시 염색된 SDS-PAGE 및 N-말단 단백질 서열 분석에 의해 단백질 발현을 확인하였다.
실시예 24
완전 유전자 프라이밍을 사용한 WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론의 발생 및 HLA-A2-제한된 WT1 에피토프의 동정
본 실시예에서는, 아데노 및 백시니아 바이러스 전달 비히클을 사용하여, WT1 특이적 T 세포주를 발생시킨다. 이러한 세포주로부터의 T 세포 클론은 WT1에 특이적인 것으로 밝혀졌으며, 추가로, 이러한 클론에 의해 인식된 에피토프를 동정하였다.
수지상 세포(DC)를, 10% 사람 혈청, 50ng/ml GM-CSF 및 30ng/ml IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 4 내지 6일 동안 성장시킴으로써, 정상적인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단구 배양물로부터 분화시킨다. 배양 후, DC를 16시간 동안 재조합 WT1 발현성 백시니아 바이러스로 감염 다중도(MOI) 5로 감염시키거나 또는 2 내지 3일 동안 재조합 WT1 발현성 아데노바이러스로 MOI 3 내지 10으로 감염시킨다. UV 조 사함으로써 백시니아 바이러스를 불활성화시킨다. CD4, CD14, CD16, CD19 및 CD56+ 세포에 대한 항체를 사용한 다음 이들 Ab의 Fc 부분에 특이적인 자기 비드를 사용하여 음성 고갈시킴으로써 CD8+ T 세포를 분리시킨다.
96-웰 판에서 프라이밍 배양을 개시한다. WT1을 발현하도록 공학적으로 처리시킨 아데노 또는 백시니아 바이러스로 감염시킨 자가유래성 수지상 세포를 사용하여, 배양물을 7 내지 14일마다 재자극시킨다. 4 내지 5회 자극시킨 후, 자가유래성 WT1 발현성 수지상 세포 또는 섬유아세포로 자극시킨 경우에 인터페론-감마(IFN-γ)를 특이적으로 생성시키는 CD8+ T 세포주를 동정할 수 있었다. 이들 주는 엘리스폿 검정에 의하면, WT1 형질도입된 자가유래성 섬유아세포는 특이적으로 인식하지만, 대조군 형질도입된 섬유아세포는 인식하지 못한 것으로 입증되었다.
이들 WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론을 추가로 분석하기 위해, 상기 T 세포를 확립시킨 공여자(D349)와 HLA-A2 대립형질 만을 공유하는 부가의 공여자(D475)로부터 유도된 섬유아세포에 WT1을 형질도입하였다. 엘리스폿 분석은, 이들 D475 표적 세포가 상기 T 세포 클론에 의해 인식된다는 것을 입증해준다. HLA A2 제한을 추가로 입증하고, 이러한 에피토프가 WT1를 "천연적으로" 과발현하는(이들의 악성 종양 형질전환의 일부로서) 종양 세포에 의해 발현된다는 것을 입증하기 위해, 백혈병 세포주 K562를 시험하였다. K562에 HLA A2 분자를 형질도입하고, HLA A2 음성 K562 세포를 비특이적 IFN-γ방출에 대한 대조군으로서 사용하였다. 엘리스폿 분석 결과, 상기 T 세포는 A2 양성 K562 세포주는 인식하지만, A2 음성 K562 세포는 인식하지 못한다는 것을 입증해준다. 이러한 인식의 특이성 및 HLA-A2 제한에 대한 추가의 증거가 HLA-A2 항체 차단 실험에 의해 증명되었다.
WT1 에피토프를 추가로 규정하기 위해, 4가지 절단된 WT1 레트로바이러스성 작제물을 생성시킨다. 이어서, 공여자 475 섬유아세포에 이들 작제물을 형질도입한다. 엘리스폿 분석 결과, WT1 Tr1 작제물(aa2-aa92)로 형질도입된 D475 섬유아세포의 인식이 입증되었으며, 이로써 WT1 에피토프가 WT1 단백질의 처음 91개 N-말단 아미노산 내에 위치한다는 것이 입증되었다. 이러한 에피토프를 정교하게 지도화하기 위해, 11개 아미노산이 중복되는, WT1 단백질의 15량체 펩티드를 합성하였다. 이러한 WT1 특이적 T 세포 클론은 2개의 중복 15량체 펩티드, 펩티드 9(QWAPVLDFAPPGASA) (서열 번호 412) 및 펩티드 10(VLDFAPPGASAYGSL) (서열 번호 413)을 인식하였다. 인식된 최소한의 에피토프의 성상을 추가로 확인하기 위해, 상기 15량체(총 5)의 공유된 9량체 및 10량체 펩티드를 사용하여, 상기 클론의 특이성을 분석하였다. 이 클론은 9량체 VLDFAPPGA (서열 번호 241), 및 10량체 VLDFAPPGAS (서열 번호 411)을 특이적으로 인식하였다.
실시예 25
WT1에 특이적인 CD8 T 세포로부터 유도된 TCR 알파 및 베타 쇄의 클로닝 및 서열 분석
WT1에 특이적인 CD8+ T 세포 클론으로부터의 T 세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 쇄를 클로닝한다. 서열 분석을 수행하여, 상기 TCR의 알파 및 베타 쇄의 계열 기원을 나타낸다. 부가적으로, 독특한 다양성과 연결 세그먼트(해당 반응의 특이성에 기여함)를 동정한다.
트리졸(Trizol) 시약을 사용하여, WT1 특이적 CD8+ T 세포 클론으로부터의 2 x 106개 세포로부터의 전체 mRNA를 분리하고, 즉시 수행하도록 준비된 키트(Pharmacia)를 사용하여 cDNA를 합성한다. 클론에서의 Vα및 Vβ 서열을 결정하기 위해, Vα및 Vβ아유형 특이적 프라이머의 패널을 합성하고(Clontech, Palo Alto, CA에 의해 생성된 프라이머 서열을 기준으로 함), 각 클론으로부터 발생된 cDNA와의 RT-PCR 반응에 사용한다. 이러한 RT-PCR 반응은 Vα및 Vβ서열이 각 클론에 의해 발현된다는 것을 입증해준다.
특정 클론으로부터 완전한 길이의 TCR 알파 및 베타 쇄를 클로닝하기 위해, 해당 개시제와 종결제 암호화 TCR 뉴클레오티드에 걸쳐 있는 프라이머를 고안한다. 교정 열안정성 폴리머라제 PWO(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 상기 프라이머 및 CTL 클론으로부터 합성된 cDNA를 사용하여, 표준 35주기 RT-PCR 반응을 정립시킨다. 이로써 생성된 특정한 밴드(알파의 경우 대략 850bp 및 베타의 경우 대략 950bp)를 PCR 평활 벡터(Invtrogen, Carlsbad, CA) 내로 연결시키고, 이. 콜라이 내로 형질전환시킨다. 완전한 길이의 알파 및 베타 쇄를 함유하는 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이를 동정하고, 상응하는 플라스미드의 대규모 제제를 생성시킨다. 이어서, 표준 방법을 사용하여, 완전한 길이의 TCR 알파 및 베타 쇄를 함유하는 플라스미드를 서열 분석한다. 이로써, TCR의 특이성에 기여하는 다양성- 연결성(DJ) 영역을 결정한다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정한 양태가 예시를 목적으로 본원에 기재되었지만, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않은 각종 변형이 일어날 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구의 범위로서만 제한된다.
<110> Corixa Corporation;
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<160> 413
<170> KopatentIn 1.71
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
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Gly
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5 10 15
Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
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<211> 23
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
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Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
20
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<212> PRT
<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<213> Homo sapien
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<212> DNA
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<213> Mus musculus
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<212> DNA
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<213> Mus musculus
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Val Arg Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
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Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser
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<213> Homo sapien
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<213> Mus musculus
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ggcatctgag accagtgaga a 21
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Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu
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1 5
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Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 142
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 144
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1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 145
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 148
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<213> Homo sapien
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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1 5
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1 5
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<213> Homo sapien
<400> 152
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1 5
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<213> Homo sapien
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1 5
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<400> 154
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<213> Homo sapien
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Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala
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Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe
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Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg
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Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr
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<400> 228
Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
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1 5
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<211> 9
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Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser
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Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
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Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
1 5
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Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys
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Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
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<211> 9
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Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 237
Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala
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<213> Homo sapien
<400> 238
Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
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Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 240
Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 241
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 242
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val
1 5
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<211> 9
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<213> Homo sapien
<400> 243
Val Arg His His Asn Met His Gln Arg
1 5
<210> 244
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 244
Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
1 5
<210> 245
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 245
Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
1 5
<210> 246
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 246
Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala
1 5
<210> 247
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 247
Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser
1 5
<210> 248
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 248
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
1 5
<210> 249
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 249
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala
1 5
<210> 250
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 250
Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
1 5
<210> 251
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 251
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
<210> 252
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 252
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
1 5
<210> 253
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 253
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
<210> 254
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 254
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 255
Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser Ser Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 256
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 257
Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr
1 5
<210> 258
<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 258
Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu
1 5
<210> 259
<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 259
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 260
Asp Gly Ala Pro Ser Tyr Gly His Thr
1 5
<210> 261
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 261
Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 262
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
<400> 263
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu
1 5
<210> 264
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 264
Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu
1 5
<210> 265
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 265
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu
1 5
<210> 266
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 266
Glu Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile
1 5
<210> 267
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 267
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 268
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu
1 5
<210> 269
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 269
Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
1 5
<210> 270
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 270
Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val
1 5
<210> 271
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 271
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Ala
1 5
<210> 272
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 272
His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met
1 5
<210> 273
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 273
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile
1 5
<210> 274
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 274
Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
1 5
<210> 275
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 275
Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
1 5
<210> 276
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 276
Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu
1 5
<210> 277
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 277
Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
1 5
<210> 278
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 278
Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met
1 5
<210> 279
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 279
Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 280
Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr
1 5
<210> 281
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 281
Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu
1 5
<210> 282
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 282
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu
1 5
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<211> 9
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<213> Mus musculus
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Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met
1 5
<210> 284
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 284
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
1 5
<210> 285
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 285
Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala Leu
1 5
<210> 286
<211> 9
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<213> Mus musculus
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Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu
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Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu
1 5
<210> 288
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 288
Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
1 5
<210> 289
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 289
Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
1 5
<210> 290
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 290
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val
1 5
<210> 291
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 291
Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val
1 5
<210> 292
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 292
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr
1 5
<210> 293
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 293
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 294
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 294
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu
1 5
<210> 295
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 295
Arg Val Ser Gly Val Ala Pro Thr Leu
1 5
<210> 296
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 296
Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
1 5
<210> 297
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 297
Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser
1 5
<210> 298
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 298
Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu
1 5
<210> 299
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 299
Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
1 5
<210> 300
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 300
Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser
1 5
<210> 301
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 301
Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile
1 5
<210> 302
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 302
Thr Leu His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
1 5
<210> 303
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 303
Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
1 5
<210> 304
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 304
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala
1 5
<210> 305
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 305
Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr
1 5
<210> 306
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 306
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met
1 5
<210> 307
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 307
Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys
1 5
<210> 308
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 308
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
1 5
<210> 309
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 309
Gly Ala Ala Gln Trp Ala
1 5
<210> 310
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 310
Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro
1 5 10
<210> 311
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 311
Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
1 5 10 15
<210> 312
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 312
His Ala Ala Gln Phe
1 5
<210> 313
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 313
Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
20 25 30
<210> 314
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 314
Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg
1 5 10 15
Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser
20 25 30
<210> 315
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 315
Arg Tyr Phe Lys
1
<210> 316
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 316
Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln
1 5 10
<210> 317
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 317
Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr
1 5 10 15
His Thr Gly Lys Thr Ser
20
<210> 318
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 318
Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn
1 5 10 15
Met His Gln Arg Asn
20
<210> 319
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapien
<400> 319
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Ser Thr Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
435 440 445
Leu
<210> 320
<211> 449
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 320
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Ser
1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Gly Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Leu His Phe
85 90 95
Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe
100 105 110
Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe
115 120 125
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Thr Ile
130 135 140
Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Ala Pro Ser Tyr
145 150 155 160
Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe
165 170 175
Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln
180 185 190
Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser
195 200 205
Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp
210 215 220
Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln
225 230 235 240
Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Met Ala Ala Gly Ser Ser Ser
245 250 255
Ser Val Lys Trp Thr Glu Gly Gln Ser Asn His Gly Ile Gly Tyr Glu
260 265 270
Ser Asp Asn His Thr Ala Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile
275 280 285
His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Ser
290 295 300
Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys
305 310 315 320
Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys
325 330 335
Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro
340 345 350
Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Ser Arg Ser Asp
355 360 365
Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln
370 375 380
Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr
385 390 395 400
His Thr Arg Thr His Thr Gly Lys Thr Ser Glu Lys Pro Phe Ser Cys
405 410 415
Arg Trp His Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
420 425 430
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu His Val Ala
435 440 445
Leu
<210> 321
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 321
Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala
1 5
<210> 322
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 322
Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
1 5
<210> 323
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 323
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro
1 5
<210> 324
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 324
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro
1 5
<210> 325
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 325
Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys
1 5
<210> 326
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapien and Mus musculus
<400> 326
Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
1 5
<210> 327
<211> 1029
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 327
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggcaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc 540
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc aggatgtgcg acgtgtgcct 600
ggagtagccc cgactcttgt acggtcggca tctgagacca gtgagaaacg ccccttcatg 660
tgtgcttacc caggctgcaa taagagatat tttaagctgt cccacttaca gatgcacagc 720
aggaagcaca ctggtgagaa accataccag tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt 780
tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa aggagacata caggtgtgaa accattccag 840
tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg tccgaccacc tgaagaccca caccaggact 900
catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg 960
tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa actccagctg 1020
gcgctttga 1029
<210> 328
<211> 1233
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 328
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggggct ccgacgttcg tgacctgaac gcactgctgc cggcagttcc gtccctgggt 540
ggtggtggtg gttgcgcact gccggttagc ggtgcagcac agtgggctcc ggttctggac 600
ttcgcaccgc cgggtgcatc cgcatacggt tccctgggtg gtccggcacc gccgccggca 660
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgccgcac tccttcatca aacaggaacc gagctggggt 720
ggtgcagaac cgcacgaaga acagtgcctg agcgcattca ccgttcactt ctccggccag 780
ttcactggca cagccggagc ctgtcgctac gggcccttcg gtcctcctcc gcccagccag 840
gcgtcatccg gccaggccag gatgtttcct aacgcgccct acctgcccag ctgcctcgag 900
agccagcccg ctattcgcaa tcagggttac agcacggtca ccttcgacgg gacgcccagc 960
tacggtcaca cgccctcgca ccatgcggcg cagttcccca accactcatt caagcatgag 1020
gatcccatgg gccagcaggg ctcgctgggt gagcagcagt actcggtgcc gcccccggtc 1080
tatggctgcc acacccccac cgacagctgc accggcagcc aggctttgct gctgaggacg 1140
ccctacagca gtgacaattt ataccaaatg acatcccagc ttgaatgcat gacctggaat 1200
cagatgaact taggagccac cttaaagggc tga 1233
<210> 329
<211> 1776
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 329
atgcagcatc accaccatca ccacatgagc gataaaatta ttcacctgac tgacgacagt 60
tttgacacgg atgtactcaa agcggacggg gcgatcctcg tcgatttctg ggcagagtgg 120
tgcggtccgt gcaaaatgat cgccccgatt ctggatgaaa tcgctgacga atatcagggc 180
aaactgaccg ttgcaaaact gaacatcgat caaaaccctg gcactgcgcc gaaatatggc 240
atccgtggta tcccgactct gctgctgttc aaaaacggtg aagtggcggc aaccaaagtg 300
ggtgcactgt ctaaaggtca gttgaaagag ttcctcgacg ctaacctggc cggttctggt 360
tctggccata tgcagcatca ccaccatcac cacgtgtcta tcgaaggtcg tgctagctct 420
ggtggcagcg gtctggttcc gcgtggtagc tctggttcgg gggacgacga cgacaaatct 480
agtaggatgg gctccgacgt tcgtgacctg aacgcactgc tgccggcagt tccgtccctg 540
ggtggtggtg gtggttgcgc actgccggtt agcggtgcag cacagtgggc tccggttctg 600
gacttcgcac cgccgggtgc atccgcatac ggttccctgg gtggtccggc accgccgccg 660
gcaccgccgc cgccgccgcc gccgccgccg cactccttca tcaaacagga accgagctgg 720
ggtggtgcag aaccgcacga agaacagtgc ctgagcgcat tcaccgttca cttctccggc 780
cagttcactg gcacagccgg agcctgtcgc tacgggccct tcggtcctcc tccgcccagc 840
caggcgtcat ccggccaggc caggatgttt cctaacgcgc cctacctgcc cagctgcctc 900
gagagccagc ccgctattcg caatcagggt tacagcacgg tcaccttcga cgggacgccc 960
agctacggtc acacgccctc gcaccatgcg gcgcagttcc ccaaccactc attcaagcat 1020
gaggatccca tgggccagca gggctcgctg ggtgagcagc agtactcggt gccgcccccg 1080
gtctatggct gccacacccc caccgacagc tgcaccggca gccaggcttt gctgctgagg 1140
acgccctaca gcagtgacaa tttataccaa atgacatccc agcttgaatg catgacctgg 1200
aatcagatga acttaggagc caccttaaag ggccacagca cagggtacga gagcgataac 1260
cacacaacgc ccatcctctg cggagcccaa tacagaatac acacgcacgg tgtcttcaga 1320
ggcattcagg atgtgcgacg tgtgcctgga gtagccccga ctcttgtacg gtcggcatct 1380
gagaccagtg agaaacgccc cttcatgtgt gcttacccag gctgcaataa gagatatttt 1440
aagctgtccc acttacagat gcacagcagg aagcacactg gtgagaaacc ataccagtgt 1500
gacttcaagg actgtgaacg aaggtttttt cgttcagacc agctcaaaag acaccaaagg 1560
agacatacag gtgtgaaacc attccagtgt aaaacttgtc agcgaaagtt ctcccggtcc 1620
gaccacctga agacccacac caggactcat acaggtgaaa agcccttcag ctgtcggtgg 1680
ccaagttgtc agaaaaagtt tgcccggtca gatgaattag tccgccatca caacatgcat 1740
cagagaaaca tgaccaaact ccagctggcg ctttga 1776
<210> 330
<211> 771
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 330
atgcagcatc accaccatca ccacggctcc gacgttcgtg acctgaacgc actgctgccg 60
gcagttccgt ccctgggtgg tggtggtggt tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag 120
tgggctccgg ttctggactt cgcaccgccg ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt 180
ccggcaccgc cgccggcacc gccgccgccg ccgccgccgc cgccgcactc cttcatcaaa 240
caggaaccga gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattcacc 300
gttcacttct ccggccagtt cactggcaca gccggagcct gtcgctacgg gcccttcggt 360
cctcctccgc ccagccaggc gtcatccggc caggccagga tgtttcctaa cgcgccctac 420
ctgcccagct gcctcgagag ccagcccgct attcgcaatc agggttacag cacggtcacc 480
ttcgacggga cgcccagcta cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttccccaac 540
cactcattca agcatgagga tcccatgggc cagcagggct cgctgggtga gcagcagtac 600
tcggtgccgc ccccggtcta tggctgccac acccccaccg acagctgcac cggcagccag 660
gctttgctgc tgaggacgcc ctacagcagt gacaatttat accaaatgac atcccagctt 720
gaatgcatga cctggaatca gatgaactta ggagccacct taaagggctg a 771
<210> 331
<211> 567
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 331
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc acagggtacg agagcgataa ccacacaacg 60
cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag 120
gatgtgcgac gtgtgcctgg agtagccccg actcttgtac ggtcggcatc tgagaccagt 180
gagaaacgcc ccttcatgtg tgcttaccca ggctgcaata agagatattt taagctgtcc 240
cacttacaga tgcacagcag gaagcacact ggtgagaaac cataccagtg tgacttcaag 300
gactgtgaac gaaggttttt tcgttcagac cagctcaaaa gacaccaaag gagacataca 360
ggtgtgaaac cattccagtg taaaacttgt cagcgaaagt tctcccggtc cgaccacctg 420
aagacccaca ccaggactca tacaggtgaa aagcccttca gctgtcggtg gccaagttgt 480
cagaaaaagt ttgcccggtc agatgaatta gtccgccatc acaacatgca tcagagaaac 540
atgaccaaac tccagctggc gctttga 567
<210> 332
<211> 342
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 332
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile
165 170 175
Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly
180 185 190
Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg
195 200 205
Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro
210 215 220
Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser
225 230 235 240
Arg Lys His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys
245 250 255
Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg
260 265 270
His Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe
275 280 285
Ser Arg Ser Asp His Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu
290 295 300
Lys Pro Phe Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg
305 310 315 320
Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr
325 330 335
Lys Leu Gln Leu Ala Leu
340
<210> 333
<211> 410
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 333
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val
165 170 175
Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala
180 185 190
Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala
195 200 205
Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro
210 215 220
Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly
225 230 235 240
Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His
245 250 255
Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro
260 265 270
Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met
275 280 285
Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala
290 295 300
Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser
305 310 315 320
Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser
325 330 335
Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln
340 345 350
Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp
355 360 365
Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser
370 375 380
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385 390 395 400
Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
405 410
<210> 334
<211> 591
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 334
Met Gln His His His His His His Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu
5 10 15
Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile
20 25 30
Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala
35 40 45
Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val
50 55 60
Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly
65 70 75 80
Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala
85 90 95
Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu
100 105 110
Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met Gln His His His
115 120 125
His His His Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Gly Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Ser
145 150 155 160
Ser Arg Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala
165 170 175
Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly
180 185 190
Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser
195 200 205
Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp
225 230 235 240
Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val
245 250 255
His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly
260 265 270
Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg
275 280 285
Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro
290 295 300
Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro
305 310 315 320
Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His
325 330 335
Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu
340 345 350
Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr
355 360 365
Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser
370 375 380
Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met Thr Trp
385 390 395 400
Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr
405 410 415
Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg
420 425 430
Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val
435 440 445
Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu
450 455 460
Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe
465 470 475 480
Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu Lys
485 490 495
Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg Ser
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515 520 525
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565 570 575
His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala Leu
580 585 590
<210> 335
<211> 256
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 335
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
65 70 75 80
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85 90 95
Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu
225 230 235 240
Glu Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly
245 250 255
<210> 336
<211> 188
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 336
Met Gln His His His His His His His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
5 10 15
Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
20 25 30
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg Arg Val Pro Gly Val
35 40 45
Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg Pro
50 55 60
Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met
165 170 175
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180 185
<210> 337
<211> 324
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 337
atgcagcatc accaccatca ccacggttcc gacgtgcggg acctgaacgc actgctgccg 60
gcagttccat ccctgggtgg cggtggaggc tgcgcactgc cggttagcgg tgcagcacag 120
tgggctccag ttctggactt cgcaccgcct ggtgcatccg catacggttc cctgggtggt 180
ccagcacctc cgcccgcaac gcccccaccg cctccaccgc ccccgcactc cttcatcaaa 240
caggaaccta gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattctga 300
gaattctgca gatatccatc acac 324
<210> 338
<211> 462
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 338
atgcagcatc accaccatca ccaccacgaa gaacagtgcc tgagcgcatt caccgttcac 60
ttctccggcc agttcactgg cacagccgga gcctgtcgct acgggccctt cggtcctcct 120
ccgcccagcc aggcgtcatc cggccaggcc aggatgtttc ctaacgcgcc ctacctgccc 180
agctgcctcg agagccagcc cgctattcgc aatcagggtt acagcacggt caccttcgac 240
gggacgccca gctacggtca cacgccctcg caccatgcgg cgcagttccc caaccactca 300
ttcaagcatg aggatcccat gggccagcag ggctcgctgg gtgagcagca gtactcggtg 360
ccgcccccgg tctatggctg ccacaccccc accgacagct gcaccggcag ccaggctttg 420
ctgctgagga cgccctacag cagtgacaat ttatactgat ga 462
<210> 339
<211> 405
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 339
atgcagcatc accaccatca ccaccaggct ttgctgctga ggacgcccta cagcagtgac 60
aatttatacc aaatgacatc ccagcttgaa tgcatgacct ggaatcagat gaacttagga 120
gccaccttaa agggccacag cacagggtac gagagcgata accacacaac gcccatcctc 180
tgcggagccc aatacagaat acacacgcac ggtgtcttca gaggcattca ggatgtgcga 240
cgtgtgcctg gagtagcccc gactcttgta cggtcggcat ctgagaccag tgagaaacgc 300
cccttcatgt gtgcttaccc aggctgcaat aagagatatt ttaagctgtc ccacttacag 360
atgcacagca ggaagcacac tggtgagaaa ccataccagt gatga 405
<210> 340
<211> 339
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 340
atgcagcatc accaccatca ccaccacagc aggaagcaca ctggtgagaa accataccag 60
tgtgacttca aggactgtga acgaaggttt tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa 120
aggagacata caggtgtgaa accattccag tgtaaaactt gtcagcgaaa gttctcccgg 180
tccgaccacc tgaagaccca caccaggact catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg 240
tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg 300
catcagagaa acatgaccaa actccagctg gcgctttga 339
<210> 341
<211> 1110
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 341
atgcagcatc accaccatca ccaccactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 60
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 120
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ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 360
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 420
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 480
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 540
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 600
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 660
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc 720
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg 780
tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc 840
aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat 900
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac 960
ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt 1020
tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga 1080
aacatgacca aactccagct ggcgctttga 1110
<210> 342
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 342
Met Gln His His His His His His Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn
5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala
20 25 30
Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro
50 55 60
Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys
65 70 75 80
Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu
85 90 95
Ser Ala Phe
<210> 343
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 343
Met Gln His His His His His His His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala
5 10 15
Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys
20 25 30
Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly
35 40 45
Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu
50 55 60
Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp
65 70 75 80
Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe
85 90 95
Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser
100 105 110
Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His
115 120 125
Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr
130 135 140
Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145 150
<210> 344
<211> 133
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 344
Met Gln His His His His His His Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
5 10 15
Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met Thr Ser Gln Leu Glu Cys Met
20 25 30
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
35 40 45
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
50 55 60
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
65 70 75 80
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
85 90 95
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
100 105 110
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115 120 125
Glu Lys Pro Tyr Gln
130
<210> 345
<211> 112
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 345
Met Gln His His His His His His His Ser Arg Lys His Thr Gly Glu
5 10 15
Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe Arg
20 25 30
Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys Pro
35 40 45
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50 55 60
Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys Arg
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
<210> 346
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 346
Met Gln His His His His His His His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro
5 10 15
Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe
20 25 30
Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg
35 40 45
Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr
130 135 140
Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro
145 150 155 160
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165 170 175
Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr
180 185 190
Gly Tyr Glu Ser Asp Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln
195 200 205
Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val Arg
210 215 220
Arg Val Pro Gly Val Ala Pro Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser Glu Thr
225 230 235 240
Ser Glu Lys Arg Pro Phe Met Cys Ala Tyr Pro Gly Cys Asn Lys Arg
245 250 255
Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His Thr Gly
260 265 270
Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asp Phe Lys Asp Cys Glu Arg Arg Phe Phe
275 280 285
Arg Ser Asp Gln Leu Lys Arg His Gln Arg Arg His Thr Gly Val Lys
290 295 300
Pro Phe Gln Cys Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp His
305 310 315 320
Leu Lys Thr His Thr Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Phe Ser Cys
325 330 335
Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Val
340 345 350
Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gln Leu Ala
355 360 365
Leu
<210> 347
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 347
ggctccgacg tgcgggacct g 21
<210> 348
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 348
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 349
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 349
ggctccgacg tgcgggacct g 21
<210> 350
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 350
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 351
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 351
cacagcacag ggtacgagag c 21
<210> 352
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 352
gaattctcaa agcgccagct ggagtttggt 30
<210> 353
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 353
cacgaagaac agtgcctgag cgcattcac 29
<210> 354
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 354
ccggcgaatt catcagtata aattgtcact gc 32
<210> 355
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 355
caggctttgc tgctgaggac gccc 24
<210> 356
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 356
cacggagaat tcatcactgg tatggtttct cacc 34
<210> 357
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 357
cacagcagga agcacactgg tgagaaac 28
<210> 358
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 358
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc 30
<210> 359
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 359
cactccttca tcaaacagga ac 22
<210> 360
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 360
ggatatctgc agaattctca aagcgccagc 30
<210> 361
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 361
ggttccgacg tgcgggacct gaacgcactg ctg 33
<210> 362
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 362
ctgccggcag cagtgcgttc aggtcccgca cgtcggaacc 40
<210> 363
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 363
ccggcagttc catccctggg tggcggtgga ggctg 35
<210> 364
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 364
cggcagtgcg cagcctccac cgccacccag ggatggaa 38
<210> 365
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 365
cgcactgccg gttagcggtg cagcacagtg ggctc 35
<210> 366
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 366
cagaactgga gcccactgtg ctgcaccgct aac 33
<210> 367
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 367
cagttctgga cttcgcaccg cctggtgcat ccgcatac 38
<210> 368
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 368
cagggaaccg tatgcggatg caccaggcgg tgcgaagtc 39
<210> 369
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 369
ggttccctgg gtggtccagc acctccgccc gcaacgcc 38
<210> 370
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 370
ggcggtgggg gcgttgcggg cggaggtgct ggaccacc 38
<210> 371
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 371
cccaccgcct ccaccgcccc cgcactcctt catcaaacag 40
<210> 372
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 372
ctaggttcct gtttgatgaa ggagtgcggg ggcggtgga 39
<210> 373
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 373
gaacctagct ggggtggtgc agaaccgcac gaagaaca 38
<210> 374
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 374
ctcaggcact gttcttcgtg cggttctgca ccaccccag 39
<210> 375
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 375
gtgcctgagc gcattctgag aattctgcag at 32
<210> 376
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 376
gtgtgatgga tatctgcaga attctcagaa tgcg 34
<210> 377
<211> 1292
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> 253,256,517,518,520,521,522,743,753,754,
758
<223> n = A,T,C or G
<400> 377
atgggctccg acgttcgtga cctgagcgcg ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtgat 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 120
gcaccgccgg gtgcatccgc acacggtccc ctgggtggtc cggcgccgcc gtcggcaccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac agggaccgag ctggggtggc 240
gcggaactgc ackaakaaca gtacctgagc gcgttcaccg ttcactcctc cggtcaggtt 300
cactggcacg gccggggcct gtcgctacgg gcccctcggc ccccctccgc ccagccaggc 360
gtcatccggc caggccagga tgtctcctag cgcgccctgc ctgcccagcc gcctcgagag 420
ccagcccgct acccgcaatc ggggctacag cacggtcacc ttcgacgggg cgtccggcta 480
cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttctcsmar yyactcgtta ggcgtgagga 540
tcccatgggc cagcagggtc cgctgggtga gcagcagtgc tcggcgccgc ccccggcctg 600
tggccgccac acccccgccg acagctgcgc cggcagccag gctttgctgc tgagggcgcc 660
ctgtagcagc gacggtttat accaagtgac gtcccagctt gagtgcatgg cctggagtca 720
gatgagcctc ggggccgcct tamcgggcca cakyacargg tacgagagcg atgatcacac 780
aacgcccggc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgcct tcaggggcgt 840
tcagggtgtg cgccgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg catctgaggc 900
cagtgaggaa cgccccctca tgtgtgctta cccaggctgc aataggaggt atctgaagct 960
gccccgctta cagatgcacg gtaggaagca cgctggtgag agaccatacc agtgtgactt 1020
caaggactgt ggacggaggt ttttctgctc agaccggctc aaaagacacc aggggaggca 1080
tacagatgtg aagccattcc agcgtaagac ctgtcagcga gggttctccc ggcccaacca 1140
cctgaagacc cacgccagga ctcatgcagg tgaaaagccc cccagctgtc ggtggtcaga 1200
ttgtcagaga aagcctgccc ggtcaagtga gttggtccgc catcgcgaca tgcatcagag 1260
gggcatgacc gaactccagc tggcgctttg aa 1292
<210> 378
<211> 1291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 378
atgggctccg acgttcgtga cctaaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cccgggtggt 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcaacacagt gggctccggt tctggacttc 120
gtaccgccgg gtgcgcctgt atgcggttcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccagcgccg 180
ccgccgctgc cgccgccgcc gtcgcactcc ttcaccaaac aggaaccgag ttggggtggt 240
acagagccgc acgcaggaca gggccggagc gcactcgtcg ctcactcctc cggccagttc 300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcatccaa gcatgaggac 540
cccatgggcc agcagggctc gccgggtgag cagcagtact cggcgccgcc cccggtctgc 600
ggctgccgca cccccaccgg cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gagggcgccc 660
tacagcggtg gcgatctaca ccaaacgaca tcccagcttg gacacatggc ctggaatcag 720
acgaacttag gagccacctt aaagggccac ggcacagggt acgagagcga tgaccacaca 780
acgcccatcc tctgcggaac ccagtacagg atacgcgcgc gcggcgtcct ccggggtact 840
caggatgtgc ggtgtgtgcc tggggtggcc ccgactcttg tgcggtcggc atctgagacc 900
agtgagaagc gccccctcat gtgtgcctac ccaggctgca ataagagaca ctttaagccg 960
tcccgcttgc gggtgcgcgg cagggagcgc actggtgaga aaccatacca gcgcgacttc 1020
aaggaccgtg gacgagggct tctccgtcca gaccagctca aaaggcacca gagggggcat 1080
acaggtgtga aacctctcca gtgtgaagct tgacggcgga ggcccccccg acccggccac 1140
ctgaaggtcc acaccaggac ccatacaggt ggagagccct tcagttgtcg gtggccaagt 1200
tgtcaggaga agtctgcccg gccagatgaa tcagcccgcc gtcataacat gcatcagaga 1260
aacatgacca aactccagct ggcgctttga a 1291
<210> 379
<211> 1281
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 379
atgggctccg acgttcgtga cctgagtgca ttgctaccga cggccccgtc cctgggtggt 60
ggcggtgact gcacactgcc ggttagcggt acagcacagt gggctccggt cccggcctcc 120
gcaccgccgg gcgcatccgc atacgattcc ctgggtggcc cggcaccgcc gccggcgccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc tgcggcgaac aggggccgag ctggggtggt 240
gcagaaccgc gcgaggggca atgcctgagt gcgcccgccg tccgcttctc cggccggttc 300
accggcacag tcggagcctg tcgctatggg cccctcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
ccatccggcc agaccaggat gttgcccagc gcgccctatc tgtcgagttg cctcaggagc 420
cggtccgcta tccgtagtca gggtcgcagc acggcacctt cagcggggcg cccagctatg 480
gcacccaccc tcgcaccacc ggcgcagtcc cactactccc aacatggggt cctacatggg 540
ccagcagggc tcgctgggtg agcagcagta ctcggtgccg cccccggtct atggctgcca 600
cacccccacc gacagctgca ccggcagcca ggctttgctg ctgaggacgc cctacagcag 660
tgacaattta taccaaatga catcccagct tgaatgcatg acctggaatc agatgaactt 720
aggagccacc ttaaagggcc acagcacagg gtacgagagc gataaccaca caacgcccat 780
cctctgcgga gcccaataca gaatacacac gcacggtgtc ttcagaggca ttcaggatgt 840
gcgacgtgtg cctggagtag ccccgactct tgtacggtag cacctgagac cagtgagaac 900
gccccttggt gtgtgttacc ggggctgcag taaggggtat tttaagccgt cccacttacg 960
ggtgcacagc aggaagcgca ttggtgagac gccacgccag tgcgactcca agggccgtgg 1020
acgagggcct ctccgttcgg gaccagccca agggacacca aaggagacat acaggtacgc 1080
aaccactcca gtgtaaggct tgtcagcgaa ggttcccccg gtccgaccac ctgagggccc 1140
acgccagggc ccacacgggt gggaagcccc tcagctgccg gtggccaagc tgccagagag 1200
ggttcgccca gtcagacgaa ttagtccgtc atcacaacat gtatcagcga aacatgacta 1260
aactccagct ggcgctttga a 1281
<210> 380
<211> 3020
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 380
gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt ccgctccccc 60
acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga gccgggacgg 120
cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc ctcttgctgc 180
aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc cgctccgggc 240
ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc atctgggcca 300
agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc cgcggggcgt 360
ccgggtctga gcctcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg ctgctgcccg 420
ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc gcggcgcagt 480
gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg ttgggcggcc 540
ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc ttcatcaaac 600
aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc gccttcactg 660
tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc 720
ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc 780
tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct 840
tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc 900
actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact 960
cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg 1020
ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg 1080
aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggagtt gctgctggga 1140
gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca cagcacaggg tacgagagcg 1200
ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg cacggtgtct 1260
tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt gtacggtcgg 1320
catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc aataagagat 1380
attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag aaaccatacc 1440
agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc agaccagctc aaaagacacc 1500
aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga aagttctccc 1560
ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt gaaaagccct 1620
tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc 1680
atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct ggcgctttga ggggtctccc 1740
tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa ctgctttcaa gtctgactct 1800
ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc ttcatccaac ttccaagaca 1860
agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa gagttggtct ctgccctgcc 1920
tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac aatgtctggt tagttaaaag 1980
cccattgcca tttggtctgg attttctact gtaagaagag ccatagctga tcatgtcccc 2040
ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta ttgtaccatt 2100
ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat gtaaactttg 2160
tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa tcagagagca aggcatcggg 2220
ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc taacctggaa agcaggatgt 2280
agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc agctgaagaa agaatcagaa 2340
ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac cattcagtta attcaatgtg 2400
aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga gatttttttg tgtatgtttt 2460
tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg tacatacctc cttgcacaaa 2520
tggaggggaa ttcattttca tcactgggac tgtccttagt gtataaaaac catgctggta 2580
tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga aaatagggga tggtccagga 2640
tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct ttgggtctac aagtatatgt 2700
gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt aaagatggtc gtgtgtgtgt 2760
gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgttgtgttt tgttttttaa gggagggaat ttattattta 2820
ccgttgcttg aaattactgt gtaaatatat gtctgataat gatttgctct ttgacaacta 2880
aaattaggac tgtataagta ctagatgcat cactgggtgt tgatcttaca agatattgat 2940
gataacactt aaaattgtaa cctgcatttt tcactttgct ctcaattaaa gtctattcaa 3000
aaggaaaaaa aaaaaaaaaa 3020
<210> 381
<211> 1291
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 381
atgggctccg acgttcgtga cctgaacgca ctgctgccgg cagttccgtc cctgggtggt 60
ggtggtggtt gcgcactgcc ggttagcggt gcagcacagt gggctccggt tctggacttc 120
gcaccgccgg gtgcatccgc atacggttcc ctgggtggtc cggcaccgcc gccggcaccg 180
ccgccgccgc cgccgccgcc gccgcactcc ttcatcaaac aggaaccgag ctggggtggt 240
gcagaaccgc acgaagaaca gtgcctgagc gcattcaccg ttcacttctc cggccagttc 300
actggcacag ccggagcctg tcgctacggg cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg 360
tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc 420
cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc acggtcacct tcgacgggac gcccagctac 480
ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat 540
cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat 600
ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc 660
tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag 720
atgaacttag gagccacctt aaagggccac agcacagggt acgagagcga taaccacaca 780
acgcccatcc tctgcggagc ccaatacaga atacacacgc acggtgtctt cagaggcatt 840
caggatgtgc gacgtgtgcc tggagtagcc ccgactcttg tacggtcggc atctgagacc 900
agtgagaaac gccccttcat gtgtgcttac ccaggctgca ataagagata ttttaagctg 960
tcccacttac agatgcacag caggaagcac actggtgaga aaccatacca gtgtgacttc 1020
aaggactgtg aacgaaggtt ttttcgttca gaccagctca aaagacacca aaggagacat 1080
acaggtgtga aaccattcca gtgtaaaact tgtcagcgaa agttctcccg gtccgaccac 1140
ctgaagaccc acaccaggac tcatacaggt gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt 1200
tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga 1260
aacatgacca aactccagct ggcgctttga g 1291
<210> 382
<211> 1491
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 382
atggcggccc ccggcgcccg gcggtcgctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60
ggcgcctcag cactctttga ggatctaatg ggctccgacg ttcgtgacct gaacgcactg 120
ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt ggtggttgcg cactgccggt tagcggtgca 180
gcacagtggg ctccggttct ggacttcgca ccgccgggtg catccgcata cggttccctg 240
ggtggtccgg caccgccgcc ggcaccgccg ccgccgccgc cgccgcactc cttcatcaaa 300
caggaaccga gctggggtgg tgcagaaccg cacgaagaac agtgcctgag cgcattcacc 360
gttcacttct ccggccagtt cactggcaca gccggagcct gtcgctacgg gcccttcggt 420
cctcctccgc ccagccaggc gtcatccggc caggccagga tgtttcctaa cgcgccctac 480
ctgcccagct gcctcgagag ccagcccgct attcgcaatc agggttacag cacggtcacc 540
ttcgacggga cgcccagcta cggtcacacg ccctcgcacc atgcggcgca gttccccaac 600
cactcattca agcatgagga tcccatgggc cagcagggct cgctgggtga gcagcagtac 660
tcggtgccgc ccccggtcta tggctgccac acccccaccg acagctgcac cggcagccag 720
gctttgctgc tgaggacgcc ctacagcagt gacaatttat accaaatgac atcccagctt 780
gaatgcatga cctggaatca gatgaactta ggagccacct taaagggcca cagcacaggg 840
tacgagagcg ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg 900
cacggtgtct tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt 960
gtacggtcgg catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc 1020
aataagagat attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag 1080
aaaccatacc agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttttcgttc agaccagctc 1140
aaaagacacc aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga 1200
aagttctccc ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg tgaaaagccc 1260
ttcagctgtc ggtggccaag ttgtcagaaa aagtttgccc ggtcagatga attagtccgc 1320
catcacaaca tgcatcagag aaacatgacc aaactccagc tggcgcttct taacaacatg 1380
ttgatcccca ttgctgtggg cggtgccctg gcagggctgg tcctcatcgt cctcattgcc 1440
tacctcattg gcaggaagag gagtcacgcc ggctatcaga ccatctagtg a 1491
<210> 383
<211> 1251
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 383
atggcgcccc gcagcgcccg gcgacccctg ctgctgctac tgcctgttgc tgctgctcgg 60
cctcatgcat tgtcgtcagc agccatgttt atggtgaaaa atggcaacgg gaccgcgtgc 120
ataatggcca acttctctgc tgccttctca gtgaactacg acaccaagag tggccccaag 180
aacatgacct ttgacctgcc atcagatgcc acagtggtgc tcaaccgcag ctcctgtgga 240
aaagagaaca cttctgaccc cagtctcgtg attgcttttg gaagaggaca tacactcact 300
ctcaatttca cgagaaatgc aacacgttac agcgttcagc tcatgagttt tgtttataac 360
ttgtcagaca cacacctttt ccccaatgcg agctccaaag aaatcaagac tgtggaatct 420
ataactgaca tcagggcaga tatagataaa aaatacagat gtgttagtgg cacccaggtc 480
cacatgaaca acgtgaccgt aacgctccat gatgccacca tccaggcgta cctttccaac 540
agcagcttca gcaggggaga gacacgctgt gaacaagaca ggccttcccc aaccacagcg 600
ccccctgcgc cacccagccc ctcgccctca cccgtgccca agagcccctc tgtggacaag 660
tacaacgtga gcggcaccaa cgggacctgc ctgctggcca gcatggggct gcagctgaac 720
ctcacctatg agaggaagga caacacgacg gtgacaaggc ttctcaacat caaccccaac 780
aagacctcgg ccagcgggag ctgcggcgcc cacctggtga ctctggagct gcacagcgag 840
ggcaccaccg tcctgctctt ccagttcggg atgaatgcaa gttctagccg gtttttccta 900
caaggaatcc agttgaatac aattcttcct gacgccagag accctgcctt taaagctgcc 960
aacggctccc tgcgagcgct gcaggccaca gtcggcaatt cctacaagtg caacgcggag 1020
gagcacgtcc gtgtcacgaa ggcgttttca gtcaatatat tcaaagtgtg ggtccaggct 1080
ttcaaggtgg aaggtggcca gtttggctct gtggaggagt gtctgctgga cgagaacagc 1140
acgctgatcc ccatcgctgt gggtggtgcc ctggcggggc tggtcctcat cgtcctcatc 1200
gcctacctcg tcggcaggaa gaggagtcac gcaggctacc agactatcta g 1251
<210> 384
<211> 228
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 384
atgcagatct tcgtgaagac tctgactggt aagaccatca ccctcgaggt ggagcccagt 60
gacaccatcg agaatgtcaa ggcaaagatc caagataagg aaggcattcc tcctgatcag 120
cagaggttga tctttgccgg aaaacagctg gaagatggtc gtaccctgtc tgactacaac 180
atccagaaag agtccacctt gcacctggta ctccgtctca gaggtggg 228
<210> 385
<211> 1515
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 385
atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctggaagt ggagcccagt 60
gacaccatcg aaaatgtgaa ggccaagatc caggataaag aaggcatccc tcccgaccag 120
cagaggctca tctttgcagg caagcagcta gaagatggcc gcactctttc tgactacaac 180
atccagaagg agtcgaccct gcacctggtc cttcgcctga gaggtgccat gggctccgac 240
gttcgtgacc tgaacgcact gctgccggca gttccgtccc tgggtggtgg tggtggttgc 300
gcactgccgg ttagcggtgc agcacagtgg gctccggttc tggacttcgc accgccgggt 360
gcatccgcat acggttccct gggtggtccg gcaccgccgc cggcaccgcc gccgccgccg 420
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gaacagtgcc tgagcgcatt caccgttcac ttctccggcc agttcactgg cacagccgga 540
gcctgtcgct acgggccctt cggtcctcct ccgcccagcc aggcgtcatc cggccaggcc 600
aggatgtttc ctaacgcgcc ctatctgccc agctgcctcg agagccagcc cgctattcgc 660
aatcagggtt acagcacggt caccttcgac gggacgccca gctacggtca cacgccctcg 720
caccatgcgg cgcagttccc caaccactca ttcaagcatg aggatcccat gggccagcag 780
ggctcgctgg gtgagcagca gtactcggtg ccgcccccgg tctatggctg ccacaccccc 840
accgacagct gcaccggcag ccaggctttg ctgctgagga cgccctacag cagtgacaat 900
ttataccaaa tgacatccca gcttgaatgc atgacctgga atcagatgaa cttaggagcc 960
accttaaagg gccacagcac agggtacgag agcgataacc acacaacgcc catcctctgc 1020
ggagcccaat acagaataca cacgcacggt gtcttcagag gcattcagga tgtgcgacgt 1080
gtgcctggag tagccccgac tcttgtacgg tcggcatctg agaccagtga gaaacgcccc 1140
ttcatgtgtg cttacccagg ctgcaataag agatatttta agctgtccca cttacagatg 1200
cacagcagga agcacactgg tgagaaacca taccagtgtg acttcaagga ctgtgaacga 1260
aggttttttc gttcagacca gctcaaaaga caccaaagga gacatacagg tgtgaaacca 1320
ttccagtgta aaacttgtca gcgaaagttc tcccggtccg accacctgaa gacccacacc 1380
aggactcata caggtgaaaa gcccttcagc tgtcggtggc caagttgtca gaaaaagttt 1440
gcccggtcag atgaattagt ccgccatcac aacatgcatc agagaaacat gaccaaactc 1500
cagctggcgc tttga 1515
<210> 386
<211> 648
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 386
atgcactcct tcatcaaaca ggaaccgagc tggggtggtg cagaaccgca cgaagaacag 60
tgcctgagcg cattcaccgt tcacttctcc ggccagttca ctggcacagc cggagcctgt 120
cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc agccaggcgt catccggcca ggccaggatg 180
tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc agcccgctat tcgcaatcag 240
ggttacagca cggtcacctt cgacgggacg cccagctacg gtcacacgcc ctcgcaccat 300
gcggcgcagt tccccaacca ctcattcaag catgaggatc ccatgggcca gcagggctcg 360
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agctgcaccg gcagccaggc tttgctgctg aggacgccct acagcagtga caatttatac 480
caaatgacat cccagcttga atgcatgacc tggaatcaga tgaacttagg agccacctta 540
aagggccaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc 600
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc agtgatga 648
<210> 387
<211> 1089
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 387
atgcactcct tcatcaaaca ggaaccgagc tggggtggtg cagaaccgca cgaagaacag 60
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tttcctaacg cgccctacct gcccagctgc ctcgagagcc agcccgctat tcgcaatcag 240
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gcggcgcagt tccccaacca ctcattcaag catgaggatc ccatgggcca gcagggctcg 360
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agctgcaccg gcagccaggc tttgctgctg aggacgccct acagcagtga caatttatac 480
caaatgacat cccagcttga atgcatgacc tggaatcaga tgaacttagg agccacctta 540
aagggccaca gcacagggta cgagagcgat aaccacacaa cgcccatcct ctgcggagcc 600
caatacagaa tacacacgca cggtgtcttc agaggcattc aggatgtgcg acgtgtgcct 660
ggagtagccc cgactcttgt acggtcggca tctgagacca gtgagaaacg ccccttcatg 720
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tttcgttcag accagctcaa aagacaccaa aggagacata caggtgtgaa accattccag 900
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catacaggtg aaaagccctt cagctgtcgg tggccaagtt gtcagaaaaa gtttgcccgg 1020
tcagatgaat tagtccgcca tcacaacatg catcagagaa acatgaccaa actccagctg 1080
gcgctttga 1089
<210> 388
<211> 1035
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 388
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
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ggccagttca ctggcacagc cggagcctgt cgctacgggc ccttcggtcc tcctccgccc 540
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ccggtctatg gctgccacac ccccaccgac agctgcaccg gcagccaggc tttgctgctg 840
aggacgccct acagcagtga caatttatac caaatgacat cccagcttga atgcatgacc 900
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agaggcattc agtga 1035
<210> 389
<211> 1263
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 389
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atcaagcttc ccaccgttca tatcgggcct 120
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gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg 240
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cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac 360
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ccgccgggtg catccgcata cggttccctg ggtggtccgg caccgccgcc ggcaccgccg 600
ccgccgccgc cgccgccgcc gcactccttc atcaaacagg aaccgagctg gggtggtgca 660
gaaccgcacg aagaacagtg cctgagcgca ttcaccgttc acttctccgg ccagttcact 720
ggcacagccg gagcctgtcg ctacgggccc ttcggtcctc ctccgcccag ccaggcgtca 780
tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag 840
cccgctattc gcaatcaggg ttacagcacg gtcaccttcg acgggacgcc cagctacggt 900
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cccatcctct gcggagccca atacagaata cacacgcacg gtgtcttcag aggcattcag 1260
tga 1263
<210> 390
<211> 1707
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 390
atgacggccg cgtccgataa cttccagctg tcccagggtg ggcagggatt cgccattccg 60
atcgggcagg cgatggcgat cgcgggccag atcaagcttc ccaccgttca tatcgggcct 120
accgccttcc tcggcttggg tgttgtcgac aacaacggca acggcgcacg agtccaacgc 180
gtggtcggga gcgctccggc ggcaagtctc ggcatctcca ccggcgacgt gatcaccgcg 240
gtcgacggcg ctccgatcaa ctcggccacc gcgatggcgg acgcgcttaa cgggcatcat 300
cccggtgacg tcatctcggt gacctggcaa accaagtcgg gcggcacgcg tacagggaac 360
gtgacattgg ccgagggacc cccggccgaa ttcccgctgg tgccgcgcgg cagcccgatg 420
ggctccgacg ttcgggacct gaacgcactg ctgccggcag ttccgtccct gggtggtggt 480
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ccgccgggtg catccgcata cggttccctg ggtggtccgg caccgccgcc ggcaccgccg 600
ccgccgccgc cgccgccgcc gcactccttc atcaaacagg aaccgagctg gggtggtgca 660
gaaccgcacg aagaacagtg cctgagcgca ttcaccgttc acttctccgg ccagttcact 720
ggcacagccg gagcctgtcg ctacgggccc ttcggtcctc ctccgcccag ccaggcgtca 780
tccggccagg ccaggatgtt tcctaacgcg ccctacctgc ccagctgcct cgagagccag 840
cccgctattc gcaatcaggg ttacagcacg gtcaccttcg acgggacgcc cagctacggt 900
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<210> 391
<211> 344
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 391
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
115 120 125
Ala Glu Phe His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala
130 135 140
Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser
145 150 155 160
Gly Gln Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly
165 170 175
Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro
180 185 190
Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg
195 200 205
Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly
210 215 220
His Thr Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys
225 230 235 240
His Glu Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr
245 250 255
Ser Val Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys
260 265 270
Thr Gly Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn
275 280 285
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290 295 300
Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser Asp
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Asn His Thr Thr Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr
325 330 335
His Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln
340
<210> 392
<211> 568
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 392
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu
85 90 95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
115 120 125
Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Met Gly Ser Asp Val
130 135 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
180 185 190
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
195 200 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
210 215 220
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
225 230 235 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
245 250 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
260 265 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
275 280 285
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290 295 300
His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu Asp Pro
305 310 315 320
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
325 330 335
Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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450 455 460
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485 490 495
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565
<210> 393
<211> 420
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 393
Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly
5 10 15
Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Lys
20 25 30
Leu Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val
35 40 45
Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val Gly Ser
50 55 60
Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Thr Ala
65 70 75 80
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85 90 95
Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys
100 105 110
Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro
115 120 125
Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Met Gly Ser Asp Val
130 135 140
Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro Val
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Gly
180 185 190
Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
195 200 205
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
210 215 220
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225 230 235 240
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
245 250 255
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
260 265 270
Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
275 280 285
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
290 295 300
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305 310 315 320
Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val Pro Pro
325 330 335
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370 375 380
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Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
405 410 415
Arg Gly Ile Gln
420
<210> 394
<211> 362
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 394
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
5 10 15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
20 25 30
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
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355 360
<210> 395
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 395
Met His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro
5 10 15
His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln
20 25 30
Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala
50 55 60
Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln
65 70 75 80
Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr
85 90 95
Pro Ser His His Ala Ala Gln Phe Pro Asn His Ser Phe Lys His Glu
100 105 110
Asp Pro Met Gly Gln Gln Gly Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val
115 120 125
Pro Pro Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly
130 135 140
Ser Gln Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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210
<210> 396
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> PCR primer
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<220>
<223> PCR primer
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<212> DNA
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<223> PCR primer
<400> 399
cgcgtgaatt catcactgaa tgcctctgaa g 31
<210> 400
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 400
cgataagcat atgacggccg cgtccgataa c 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 401
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<220>
<223> PCR primer
<400> 402
gacgaaagca tatgcactcc ttcatcaaac 30
<210> 403
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer
<400> 403
gtctgcagcg gccgctcaaa gcgccagc 28
<210> 404
<211> 449
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 404
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1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
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65 70 75 80
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Leu
<210> 405
<211> 428
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 405
Met Gly Ser Asp Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro
1 5 10 15
Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Thr
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Val Pro Pro Gly Ala Pro Val Cys
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro
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Pro Pro Pro Ser His Ser Phe Thr Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Thr Glu Pro His Ala Gly Gln Gly Arg Ser Ala Leu Val Ala His Ser
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANT
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<223> Xaa = Any Amino Acid
<400> 406
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65 70 75 80
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325 330 335
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340 345 350
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 407
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Ser Leu Gly Gly Gly Gly Asp Cys Thr Leu Pro Val Ser Gly Thr Ala
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65 70 75 80
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Gly Pro Pro Pro Pro Ser Gln Ala Pro Ser Gly Gln Thr Arg Met Leu
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Pro Ser Ala Pro Tyr Leu Ser Ser Cys Leu Arg Ser Arg Ser Ala Ile
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Arg Ser Gln Gly Arg Ser Thr Ala Pro Ser Ala Gly Arg Pro Ala Met
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Ala Pro Thr Leu Ala Pro Pro Ala Gln Ser His Tyr Ser Gln His Gly
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405 410 415
Glu
<210> 408
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 408
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1 5 10 15
Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala
20 25 30
Gln Trp Ala Pro Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr
35 40 45
Gly Ser Leu Gly Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro
50 55 60
Pro Pro Pro Pro His Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly
65 70 75 80
Ala Glu Pro His Glu Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe
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100 105 110
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115 120 125
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Arg Asn Gln Gly Tyr Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr
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195 200 205
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210 215 220
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Met Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly His Ser Thr Gly Tyr Glu Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<210> 409
<211> 495
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 409
Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Gly Leu Ala His Gly Ala Ser Ala Leu Phe Glu Asp Leu Met Gly Ser
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Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
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Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Gln Pro Ala Ile Arg Asn Gln Gly Tyr
165 170 175
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
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Pro Val Tyr Gly Cys His Thr Pro Thr Asp Ser Cys Thr Gly Ser Gln
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245 250 255
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Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg Ile His Thr His Gly Val Phe
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485 490 495
<210> 410
<211> 504
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 410
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35 40 45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
50 55 60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Ala Met Gly Ser Asp
65 70 75 80
Val Arg Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu Gly Gly
85 90 95
Gly Gly Gly Cys Ala Leu Pro Val Ser Gly Ala Ala Gln Trp Ala Pro
100 105 110
Val Leu Asp Phe Ala Pro Pro Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly
115 120 125
Gly Pro Ala Pro Pro Pro Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His
130 135 140
Ser Phe Ile Lys Gln Glu Pro Ser Trp Gly Gly Ala Glu Pro His Glu
145 150 155 160
Glu Gln Cys Leu Ser Ala Phe Thr Val His Phe Ser Gly Gln Phe Thr
165 170 175
Gly Thr Ala Gly Ala Cys Arg Tyr Gly Pro Phe Gly Pro Pro Pro Pro
180 185 190
Ser Gln Ala Ser Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr
195 200 205
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210 215 220
Ser Thr Val Thr Phe Asp Gly Thr Pro Ser Tyr Gly His Thr Pro Ser
225 230 235 240
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245 250 255
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275 280 285
Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser Ser Asp Asn Leu Tyr Gln Met
290 295 300
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<210> 411
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<212> PRT
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1 5 10 15
Claims (44)
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- 서열번호 408의 1번부터 281번의 아미노산을 갖는 윌름(Wilms) 종양 유전자 생성물(WT1) 단편과, Ra12, 단백질 D, LYTA, His 태그, 및 엔도솜/리소솜 구획으로 폴리펩티드를 지시할 수 있는 표적화 시그날로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 이종성 융합 파트너의 융합체로 이루어진 분리된 폴리펩티드.
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- 제2항에 있어서, 서열번호 393에 제공된 아미노산 서열로 이루어진 분리된 폴리펩티드.
- 제2항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 프로모터에 작동가능하게 연결된 제5항의 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
- 제2항에 따른 폴리펩티드를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 면역반응을 증진시키기 위한 약제학적 조성물.
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