WO2020032782A1 - 암항원 특이적 cd8+ t 세포의 제조 및 동결보존 방법 - Google Patents

암항원 특이적 cd8+ t 세포의 제조 및 동결보존 방법 Download PDF

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김문기
김광희
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Definitions

  • the present invention relates to techniques for isolating, proliferating and cryopreserving antigen specific CD8 + T cells.
  • CD8 + T cells have relatively simple functions compared to other cells such as dendritic cells, CD4 + T and NK cells, the side effects that are not expected in anticancer immunotherapy are less likely to occur.
  • MHC class I / peptide multimers are used to separate antigen-specific CD8 + T cells.However, in this method, a high amount of antigen-specific CD8 + T is caused by apoptosis after cell separation. There was a drawback to long term culture to produce cells. Therefore, a surrogate marker capable of separating antigen-specific CD8 + T cells by replacing MHC multimers that stimulate T cell receptor (TCR) is required.
  • Protein 4-1BB CD137
  • 4-1BB is expressed in activated T cells as inducible costimulatory molecules, in particular stimulation via 4-1BB not only enhances the activity of CD8 + T cells, but also Bcl-2, Bcl-XL, and Bfl-1 It is well known to exhibit the function of inhibiting activation-induced cell death (AICD) by increasing the expression of anti-apoptotic molecules such as the like.
  • AICD activation-induced cell death
  • the patent document isolates and isolates antigen-specific CD8 + T cells against foreign antigens, viral antigens (EBV / LMP2A, CMV / pp65) or autologous cancer antigens (WT-1, hTERT, NY-ESO-1, etc.).
  • EBV / LMP2A viral antigens
  • CMV / pp65 autologous cancer antigens
  • WT-1, hTERT, NY-ESO-1, etc. a technique for mass culturing cells.
  • the existing antigen-specific CD8 + T cell separation technique using an anti-4-1BB antibody coated plate greatly varies the purity of the isolated cells according to the skill of the operator, and the process of culturing the cells is also very complicated. .
  • the production process takes more than 30 days, and the ongoing challenge is to minimize the time required to produce cell therapy products for current clinical applications.
  • the present invention aims to provide a method for cancer antigen-specific CD8 + T cell production, which enables to maintain a high level of cell viability and cancer antigen specific activity even after cryopreservation of the produced CD8 + T cells.
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition comprising a CD8 + T cell prepared by the cryopreservation step.
  • the present invention can thaw frozen antigen-specific CD8 + T cells and perform mass culture again to obtain CD8 + T cells with more antigen specificity as well as maintain high levels of cell viability and cancer antigen specific activity. To provide a way to.
  • the cancer antigens hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, and WT1 from the group consisting of EBV at least one selected cancer antigen-specific CD8 + T cell production method.
  • step (b) a cancer antigen-specific CD8 + T cell production method is performed by using the (closed-system) flow cytometry closure from the environment.
  • the step (d) is a method of producing cancer antigen-specific CD8 + T cells that co-stimulating factor for the number of CD8 + T cells expressing frozen at greater than a predetermined number of cells per mL.
  • step (d) freezes when the number of CD8 + T cells is at least a predetermined number of cells per mL and the ratio of CD8 + T cells expressing the co-stimulatory factor is at least a predetermined rate.
  • Phosphorus Cancer Antigen Specific CD8 + T Cell Production Method.
  • step (d) is a CD8 + T cell count and the cancer-specific CD8 + T antigen comprising the step of detecting the proportion of CD8 + T cells the expression of co-stimulating factor is Cell preparation method.
  • CD8 + T cell preparation method is at least one selected from the group consisting of CD28, CTLA-4, ICOS, PD1, BTLA, HVEM, CD27, OX40, 4-1BB, CD30, and SLAM.
  • step (a) activating the CD8 + T cells in PBMCs containing cancer antigen specific CD8 + T cells to express co-stimulatory factors of the CD8 + T cells; (b) selecting CD8 + T cells expressing co-stimulatory factors among the cells activated in step (a); (c) increasing the number of CD8 + T cells selected in step (b); And (d) freezing the CD8 + T cells obtained in step (c).
  • step (d) The method of item 10, further comprising (e) thawing the frozen CD8 + T cells in step (d).
  • step (a) activating the CD8 + T cells in PBMCs containing cancer antigen specific CD8 + T cells to express co-stimulatory factors of the CD8 + T cells; (b) selecting CD8 + T cells expressing co-stimulatory factors among the cells activated in step (a); (c) increasing the number of CD8 + T cells selected in step (b); And (d) freezing the CD8 + T cells obtained in step (c), the cancer therapeutic composition comprising the cancer antigen-specific CD8 + T cells prepared.
  • step 14 (a) activating the CD8 + T cells in PBMCs containing cancer antigen specific CD8 + T cells to express co-stimulatory factors of the CD8 + T cells; (b) selecting CD8 + T cells expressing co-stimulatory factors among the cells activated in step (a); (c) increasing the number of CD8 + T cells selected in step (b); And (d) administering a composition for treating cancer comprising a cancer antigen-specific CD8 + T cell prepared by the step of freezing the CD8 + T cells obtained in step (c). How to treat cancer.
  • step (d) The method of item 14, comprising (e) thawing the frozen CD8 + T cells in step (d).
  • the CD8 + T cell production method of the present invention can be cryopreserved without degrading the performance of CD8 + T cells.
  • the method of the present invention can maintain a high level of cell viability and cancer antigen specific activity after cryopreservation of CD8 + T cells.
  • the method for producing CD8 + T cells of the present invention can selectively isolate and mass culture cancer antigen-specific CD8 + T cells with high purity.
  • the CD8 + T cell production method of the present invention can rapidly produce cancer antigen specific CD8 + T cells.
  • CD8 + T cell production method of the present invention can be applied to the GMP process.
  • the CD8 + T cell comprising drug composition of the present invention can maintain high levels of cell viability and cancer antigen specific activity even after cryopreservation.
  • the pharmaceutical composition comprising CD8 + T cells of the present invention may comprise cancer antigen specific CD8 + T cells in high purity.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing a process for producing cancer antigen-specific CD8 + T cells.
  • the present invention relates to cryopreservation methods of T cells and T cells prepared by such methods.
  • the present invention also provides a method for enabling cancer antigen-specific CD8 + T cell production, which enables to maintain a high level of cell viability and cancer antigen specific activity even after cryopreservation of the produced CD8 + T cells and T produced by such a method. It relates to a cell therapy.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises cytotoxic T cells specific for cancer antigens (eg, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, Neo-Antigen, etc.), from primary proliferation It may take 31 days to proceed to freezing after completion of the final T cell mass culture, and may be prepared by an improved process that takes 29 days, 26 days, 20 days or 15 days.
  • cancer antigens eg, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, Neo-Antigen, etc.
  • the PBMC contain activate the CD8 + T cells, the CD8 + T cells ( expressing a co-stimulatory factor; (b) selecting CD8 + T cells expressing co-stimulatory factors among the cells activated in step (a); (c) increasing the number of CD8 + T cells selected in step (b); (d) freezing the CD8 + T cells obtained in step (c); And optionally (e) thawing the frozen CD8 + T cells in step (d).
  • CD8 + T cells are activated in the following manner:
  • each fabtide derived from cancer antigen and PBMC isolated from blood are cultured together, wherein at least one selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 Activated by periodically processing cytokines of
  • Co-stimulatory factors of CD8 + T cells are proteins belonging to the CD28 family, for example CD28, CTLA-4, ICOS, PD1, and BTLA; As proteins belonging to the TNFR family, for example, HVEM, CD27, OX40, 4-1BB, GITR and CD30; And proteins belonging to the SLAM family, for example SLAM, 2B4, CD2, CD48, CD84, CD229, CRACC, NTB-A; And proteins belonging to the TIM family, for example, but not limited to, TIM-1 and TIM-3 (KC Beier, et al., European Respiratory Journal 2007 29: 804-812).
  • the co-stimulatory factor is 4-1BB.
  • activated CD8 + cells expressing co-stimulatory factors may be prepared by the following preparation method.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the screening or screening of cancer antigen CD8 + T cell epitopes is performed by cancer antigens having high avidity or low concentration of 0.1% or less in the blood.
  • a specific CD8 + that for increasing the concentration of T cells the first step capable of selectively removing the specific proliferation and CD8 + T cells to a cancer antigen.
  • epitopes from various cancer antigens eg EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, etc.
  • cancer antigens eg EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, etc.
  • the part that can act as an epitope in each patient is HLA-A type of each patient. And state.
  • cancer antigen CD8 + T cell epitopes present in the blood of individual cancer patients through epitope screening because the peptide portions that can act as antigen epitopes are different for each patient even within the same cancer antigen.
  • 3-4 types of peptides that act as epitopes are selected for the production of T cell therapeutics.
  • the method according to the present invention is directed to screening epitopes that are optimal for the selection and proliferation of individual CD8 + T cells from a variety of cancer antigens, including self or non-self which achieve this goal, depending on the carcinoma.
  • Various cancer antigens can be used.
  • autologous cancer antigens derived from the patient's own genes include hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence : NP_005353.1) and cancer specific mutant antigens such as neoantigens, mutated P53, RAS, etc. may include tumor suppressor or trigger genes, and as foreign cancer antigens cancer-causing virus antigens such as CMV, EBV, HPV, etc. It may include.
  • the present invention is not limited to the characteristics of the present invention, which selects an optimal efftope from various cancer antigens specific for each carcinoma and produces T cells using the same.
  • autologous cancer antigens for example, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, MAGE's and the like are known.
  • autologous antigen hTERT is an enzyme that synthesizes telomeric DNA at the end of chromosomes. Cancer cells function excessively to activate telomere-dependent cell death by activating this enzyme excessively and prevent lung cancer, gastric cancer and pancreatic cancer. It is known as a target antigen of various solid cancers (Kim NW, et al. Science.
  • WT1 is a gene associated with Wilms tumor, which encodes zinc finger transcription factors to proliferate, differentiate, and apoptosis .
  • a protein involved in the development of organs is known as a target antigen such as cerebrospinal cancer, lung cancer (Call KM, et al., Cell. 1990. 60: 509-520; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21: 113-6).
  • the NY-ESO1 is one of proteins belonging to cancer testis antigen (CTA), and is well known to express various cancer cells including germ cells, sarcoma and breast cancer (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res.
  • MAGE-A3 is a protein belonging to the melanoma-associated antigen family, and it is unknown what function it performs in normal cells, but it is known to overexpress various cancer cells including lung cancer, sarcoma, and melanoma. Is evaluated as antigen (Decoster L, et al., Ann Oncol. 2012 Jun; 23 (6): 1387-93). Therefore, cancer antigens known to be associated with a specific cancer can be used in the production of individual cancer antigen CD8 + T cells in the method of the present application.
  • Viral cancer antigens are also known as, for example, EBV, HPV, MC polyoma virus, HBV, HCV, and CMV, and Epstein-Barr virus antigens are Hodgkins lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, gastric cancer, Burkitt's lymphoma, It is known as a target antigen of NK / T lymphoma, human papilloma virus antigen is known as a target antigen of uterine cancer and head and neck cancer, and MC polyoma virus is known as a target antigen of Merkel cell cancer. Hepatitis B virus and hepatitis C virus are also known as target cells of liver cancer.
  • tissue specific cancer antigens tyrosanases, GP100, and MNRT-1 are known as melanoma target antigens, and PSMA, PAP, and PSA as prostate cancer target antigens.
  • Peptides derived from cancer antigens are used in two, three, four, five or more.
  • at least four peptides derived from cancer antigens are used. Five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more or more may be used, but are not limited thereto, and may be determined at the level of those skilled in the art in view of the features of the methods and techniques of the art. There will be.
  • Epitope screening step included in the method of the present invention may be to select the epitope by the method of selecting the activated T cells (e.g., 4-1BB + CD8 + T cells) in the selection of the epitope. .
  • activated T cells e.g., 4-1BB + CD8 + T cells
  • the activated T cells (eg, 4-1BB + CD8 + T cells) selection may be performed using an automatic cell sorter.
  • the automatic cell separator may be applicable to the GMP process. For example, it may be a closed-system automatic cell separator from the external environment.
  • PBMCs isolated from the blood of cancer patients are cultured in a medium containing a combination of the selected epitopes and cytokines to induce 4-1BB expression in the PBMCs.
  • the cytokine may be any one selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15 and IL-21. In another embodiment, the cytokine may be at least any two combinations selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21.
  • the cytokine may be a combination of IL-2 and IL-7, a combination of IL-2 and IL-15, a combination of IL-2 and IL-21, a combination of IL-7 and IL-15, IL-7 and Or a combination of IL-15 and IL-21.
  • step b) of the method according to the present disclosure may be performed for 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, or 14 days.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells used in the first and second steps of the method according to the invention are used from the same patient in consideration of the purpose according to the invention.
  • PBMCs can be isolated from whole blood using methods known in the art.
  • CD8 + T cells expressing the co-stimulatory factor among the activated CD8 + T cells are isolated after staining with anti-co-stimulatory factor antibody and anti-CD8 antibody. Separation can be separated using, for example, an automatic cell sorter. CD8 + T cell separation that expresses antigen-specific co-stimulating factors using an automatic cell separator can improve several problems, such as purity and workflow difficulty caused by the use of a plate coated with co-stimulating factors, a conventional process. Co-stimulatory factors are antigen-specific with both fluorescence after staining with anti-co-stimulatory factor antibodies and anti-CD8 antibodies bound to fluorescent markers for markers expressed only on antigen-stimulated CD8 + T cell surfaces. CD8 + T cells can be efficiently isolated.
  • the manufacturing method of selecting CD8 + T cells expressing co-stimulatory factors using an automatic cell sorter is based on cancer antigens such as EBV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, and MAGE-A3. It can be applied to the preparation of specific CD8 + T cells.
  • the pharmaceutical composition prepared by the method of selecting CD8 + T cells expressing a co-stimulatory factor using an automatic cell sorter is more than 90% (eg, 90%) of cancer antigen-specific cytotoxic T cells. %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%). More preferably 95% or more (eg, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%).
  • a pharmaceutical composition prepared by applying a manufacturing method for selecting CD8 + T cells expressing a co-stimulatory factor using an automatic cell sorter as described above has high purity of cancer antigen-specific cytotoxic T cells, and has excellent clinical efficacy (eg, anticancer efficacy) of T cell therapy.
  • the automatic cell sorter used in the above selection step may be applicable to the GMP process.
  • it may be a closed-system automatic cell separator from the external environment.
  • the number of selected CD8 + T cells can be increased through the culturing, and methods for culturing CD8 + T cells can use methods known in the art: For example, in one embodiment of the invention, RPMI medium in 6 well plates coated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies (inactivated FBS, l-glutamine, penicillin, streptomycin, 2-mercaptoethanol, 1% ITS: insulin, transferrin and sodium selenite) Plate and incubate for a predetermined time, incubate with the addition of IL-7, and IL-2, and then recover the cells and culture in fresh medium containing IL-7 and IL-2.
  • anti-CD3 and anti-CD28 antibodies inactivated FBS, l-glutamine, penicillin, streptomycin, 2-mercaptoethanol, 1% ITS: insulin, transferrin and sodium selenite
  • the number of CD8 + T cells can be increased by culturing: a) incubating each peptide derived from cancer antigen with a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) isolated from the blood of a cancer patient After, selecting the activated T cells to screen for cancer antigen CD8 + T cell epitopes; b) culturing PBMC isolated from blood of the cancer patient in a medium comprising at least one cytokine selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15 and IL-21 and the selected epitope Inducing 4-1BB expression in the PBMC; And c) staining the 4-1BB expression-induced cells with an anti-4-1BB antibody and an anti-CD8 antibody and then isolating the cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • the screening or screening of cancer antigen CD8 + T cell epitopes is performed by cancer antigens having high avidity or low concentration of 0.1% or less in the blood.
  • a specific CD8 + that for increasing the concentration of T cells the first step capable of selectively removing the specific proliferation and CD8 + T cells to a cancer antigen.
  • epitopes from various cancer antigens eg EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, etc.
  • cancer antigens eg EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, etc.
  • the part that can act as an epitope in each patient is HLA-A type of each patient. And state.
  • cancer antigen CD8 + T cell epitopes present in the blood of individual cancer patients through epitope screening because the peptide portions that can act as antigen epitopes are different for each patient even within the same cancer antigen.
  • 3-4 types of peptides that act as epitopes are selected for the production of T cell therapeutics.
  • the method according to the present invention involves the selection of an epitope that is optimal for the selection and proliferation of CD8 + T cells of an individual from various cancer antigens, and self or non-self which achieves this purpose depending on the carcinoma.
  • Various cancer antigens can be used, including.
  • autologous cancer antigens derived from the patient's own genes include hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence : NP_005353.1) and cancer specific mutant antigens such as neoantigens, mutated P53, RAS, etc. may include tumor suppressor or trigger genes, and as foreign cancer antigens cancer-causing virus antigens such as CMV, EBV, HPV, etc. It may include.
  • the present invention is not limited to the characteristics of the present invention, which selects an optimal efftope from various cancer antigens specific for each carcinoma and produces T cells using the same.
  • autologous cancer antigens for example, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, MAGE's and the like are known.
  • autologous antigen hTERT is an enzyme that synthesizes telomeric DNA at the end of chromosomes. Cancer cells function excessively to activate telomere-dependent cell death by activating this enzyme excessively and prevent lung cancer, gastric cancer and pancreatic cancer. It is known as a target antigen of various solid cancers (Kim NW, et al. Science.
  • WT1 is a gene associated with Wilms tumor, which encodes zinc finger transcription factors to proliferate, differentiate, and apoptosis .
  • a protein involved in the development of organs is known as a target antigen such as cerebrospinal cancer, lung cancer (Call KM, et al., Cell. 1990. 60: 509-520; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21: 113-6).
  • the NY-ESO1 is one of proteins belonging to cancer testis antigen (CTA), and is well known to express various cancer cells including germ cells, sarcoma and breast cancer (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res.
  • MAGE-A3 is a protein belonging to the melanoma-associated antigen family, and it is unknown what function it performs in normal cells, but it is known to overexpress various cancer cells including lung cancer, sarcoma, and melanoma. Is evaluated as antigen (Decoster L, et al., Ann Oncol. 2012 Jun; 23 (6): 1387-93). Therefore, cancer antigens known to be associated with a specific cancer can be used in the production of individual cancer antigen CD8 + T cells in the method of the present application.
  • Viral cancer antigens are also known as, for example, EBV, HPV, MC polyoma virus, HBV, HCV, and CMV, and Epstein-Barr virus antigens are Hodgkins lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, gastric cancer, Burkitt's lymphoma, It is known as a target antigen of NK / T lymphoma, human papilloma virus antigen is known as a target antigen of uterine cancer and head and neck cancer, and MC polyoma virus is known as a target antigen of Merkel cell cancer. Hepatitis B virus and hepatitis C virus are also known as target cells of liver cancer.
  • tissue specific cancer antigens tyrosanases, GP100, and MNRT-1 are known as melanoma target antigens, and PSMA, PAP, and PSA as prostate cancer target antigens.
  • Two, three, four, five or more peptides derived from cancer antigens are used.
  • at least four peptides derived from cancer antigens are used. Five or more, six or more, seven or more, eight or more, nine or more or more may be used, but are not limited thereto, and may be determined at the level of those skilled in the art in view of the features of the methods and techniques of the art. There will be.
  • Epitope screening step included in the method of the present invention may be to select the epitope by the method of selecting the activated T cells (e.g., 4-1BB + CD8 + T cells) in the selection of the epitope. .
  • activated T cells e.g., 4-1BB + CD8 + T cells
  • the activated T cells (eg, 4-1BB + CD8 + T cells) selection may be performed using an automatic cell sorter.
  • the automatic cell separator may be applicable to the GMP process. For example, it may be a closed-system automatic cell separator from the external environment.
  • PBMCs isolated from the blood of cancer patients are cultured in a medium containing a combination of the selected epitopes and cytokines to induce 4-1BB expression in the PBMCs.
  • cancer antigen specific CD8 + T cells are present in the blood at a low concentration of 0.1% or less, by adding 3-4 peptides selected from epitope screening and one or more cytokines to PBMCs isolated from blood, By incubating for 9 to 9 days, proliferation of CD8 + T cells specific to peptides derived from cancer antigens and induction of 4-1BB expression are possible (Fig. 1 B-1 and B-2). This can reduce the total incubation time to within 29 days, 26 days, 20 days, 18 days, especially 15 days.
  • the cytokine may be any one selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15 and IL-21. In another embodiment, the cytokine may be at least any two combinations selected from the group consisting of IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21.
  • the cytokine may be a combination of IL-2 and IL-7, a combination of IL-2 and IL-15, a combination of IL-2 and IL-21, a combination of IL-7 and IL-15, IL-7 and Or a combination of IL-15 and IL-21.
  • step b) of the method according to the present disclosure may be performed for 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, or 14 days.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells used in the first and second steps of the method according to the invention are used from the same patient in consideration of the purpose according to the invention.
  • PBMCs can be isolated from whole blood using methods known in the art.
  • antigen-specific cells induced with 4-1BB expression are isolated after staining with anti-4-1BB antibody and anti-CD8 antibody. Separation can be separated using, for example, an automatic cell sorter. Antigen-specific 4-1BB + CD8 + T cell separation using an automatic cell separator can ameliorate several problems such as purity and workflow difficulty caused by the use of plates coated with 4-1BB antibody, which is a conventional process.
  • 4-1BB protein is a fluorescent marker is bonded 4-1BB antibody and two kinds of antigen-specific CD8 + T cells with both the fluorescence and then stained with antibodies against CD8 marker that is expressed only in CD8 + T cell surface antigen stimulation It can be separated efficiently.
  • the production method for selecting 4-1BB + CD8 + T cells using an automatic cell sorter is specific for cancer antigens such as EBV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, and MAGE-A3. It can be applied to the production of CD8 + T cells.
  • the pharmaceutical composition prepared by the method for selecting 4-1BB + CD8 + T cells using an automatic cell sorter is more than 90% (eg, 90%, cancer antigen specific cytotoxic T cells). 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99%).
  • compositions prepared by applying the manufacturing method for screening 4-1BB + CD8 + T cells using an automatic cell sorter as described above eg, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, Or MAGE-A3 specific cytotoxic T-cell-containing composition
  • an automatic cell sorter eg, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, Or MAGE-A3 specific cytotoxic T-cell-containing composition
  • the automatic cell sorter used in the above selection step may be applicable to the GMP process.
  • it may be a closed-system automatic cell separator from the external environment.
  • the method according to the invention further comprises the step of mass propagating said isolated 4-1BB + CD8 + T cells.
  • Mass production step may comprise culturing the isolated cancer antigen specific CD8 + T cells and irradiated allogeneic PBMCs in a medium containing IL-2, anti-CD3 antibody and autologous plasma.
  • a medium containing IL-2, anti-CD3 antibody and autologous plasma can be.
  • 4-1BB + CD8 + T cells (5 ⁇ 10 5 to 3 ⁇ 10 6 cells) isolated in a 1L culture bag (G-Rex device), irradiated (irradiated allogeneic) PBMCs (1 10 ⁇ 10 8 to 3 ⁇ 10 8 cells), 1000 U / ml IL-2, 30 ng anti-CD3 mAb, adding medium at regular intervals of 7 to 11 days to bulk cells at levels above 1 ⁇ 10 9 cells / L Cultured and propagated to a level that can be administered to cancer patients.
  • the method according to the present invention comprises freezing expanded cancer antigen specific CD8 + T cells.
  • the freezing step is the expression of co-stimulatory molecules in the cells grown in the previous step, and the cryopreservative (eg, DMSO) is added when the number of preselected CD8 + T cells reaches a predetermined number of cells per mL. This can be done by.
  • cryopreservative eg, DMSO
  • the predetermined number of cells is 1 x 10 6 cell / mL, 2 x 10 6 cell / mL, 3 x 10 6 cell / mL, 4 x 10 6 cell / mL, 5 x 10 6 cell / mL, 6 x 10 6 cell / mL, 7 x 10 6 cell / mL, 8 x 10 6 cell / mL, 9 x 10 6 cell / mL, 1 x 10 7 cell / mL, 2 x 10 7 cell / mL, 3 x 10 7 cell / mL, 4 x 10 7 cell / mL, 5 x 10 7 cell / mL, 6 x 10 7 cell / mL, 7 x 10 7 cell / mL, 8 x 10 7 cell / mL, or 9 x 10 7 cell / may be mL.
  • CD8 + T cells expressing a co-stimulatory molecule may be, for example, a cell in which a co-stimulatory molecule is expressed in the antigen stimulation step, and may also be a cell in which a co-stimulatory molecule is expressed in the proliferation step, for example.
  • the freezing step may be performed when the number of CD8 + T cells is at least a predetermined number of cells per mL, and the ratio of CD8 + T cells selected to express co-stimulatory factors is at or above a predetermined rate. There is .
  • the predetermined number of cells is 1 x 10 6 cell / mL, 2 x 10 6 cell / mL, 3 x 10 6 cell / mL, 4 x 10 6 cell / mL, 5 x 10 6 cell / mL, 6 x 10 6 cell / mL, 7 x 10 6 cell / mL, 8 x 10 6 cell / mL, 9 x 10 6 cell / mL, 1 x 10 7 cell / mL, 2 x 10 7 cell / mL, 3 x 10 7 cell / mL, 4 x 10 7 cell / mL, 5 x 10 7 cell / mL, 6 x 10 7 cell / mL, 7 x 10 7 cell / mL, 8 x 10 7 cell / mL, or 9 x 10 7 cell / may be mL.
  • freeze-step according to the invention may comprise the step of detecting the ratio of the CD8 + T cell count, and CD8 + T cells the expression of co-stimulating factor is. At this time, all the numerical values existing within the said range are regarded as disclosed in this specification.
  • the method according to the present invention comprises thawing the frozen cancer antigen specific CD8 + T cells.
  • the method according to the present invention may further comprise propagating the thawed cancer antigen specific CD8 + T cells.
  • the propagation step after thawing may be performed the same as or similar to the propagation step before freezing.
  • the proliferation step after thawing may be to cultivate the cells at a level of> 1 ⁇ 10 9 cells / mL to proliferate to a level that can be administered to cancer patients.
  • the cancer antigen may be autologous cancer antigen, viral cancer antigen, or tissue specific cancer antigen.
  • autologous cancer antigens derived from the patient's own genes include hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence : NP_005353.1) and cancer specific mutant antigens such as neoantigens, mutated P53, RAS, etc. may include tumor suppressor or trigger genes, and as foreign cancer antigens cancer-causing virus antigens such as CMV, EBV, HPV, etc. It may include.
  • the present invention is not limited to the characteristics of the present invention, which selects an optimal efftope from various cancer antigens specific for each carcinoma and produces T cells using the same.
  • autologous cancer antigens for example, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, MAGE's and the like are known.
  • autologous antigen hTERT is an enzyme that synthesizes telomeric DNA at the end of chromosomes. Cancer cells function excessively to activate telomere-dependent cell death by activating this enzyme excessively and prevent lung cancer, gastric cancer and pancreatic cancer. It is known as a target antigen of various solid cancers (Kim NW, et al. Science.
  • WT1 is a gene associated with Wilms tumor, which encodes zinc finger transcription factors to proliferate, differentiate, and apoptosis .
  • a protein involved in the development of organs is known as a target antigen such as cerebrospinal cancer, lung cancer (Call KM, et al., Cell. 1990. 60: 509-520; Nakahara Y, et al., Brain Tumor Pathol. 2004. 21: 113-6).
  • the NY-ESO1 is one of proteins belonging to cancer testis antigen (CTA), and is well known to express various cancer cells including germ cells, sarcoma and breast cancer (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res.
  • MAGE-A3 is a protein belonging to the melanoma-associated antigen family, and it is unknown what function it performs in normal cells, but it is known to overexpress various cancer cells including lung cancer, sarcoma, and melanoma. Is evaluated as antigen (Decoster L, et al., Ann Oncol. 2012 Jun; 23 (6): 1387-93). Therefore, cancer antigens known to be associated with a specific cancer can be used in the production of individual cancer antigen CD8 + T cells in the method of the present application.
  • Viral cancer antigens are also known as, for example, EBV, HPV, MC polyoma virus, HBV, HCV, and CMV, and Epstein-Barr virus antigens are Hodgkins lymphoma, nasopharyngeal carcinoma, gastric cancer, Burkitt's lymphoma, It is known as a target antigen of NK / T lymphoma, human papilloma virus antigen is known as a target antigen of uterine cancer and head and neck cancer, and MC polyoma virus is known as a target antigen of Merkel cell cancer. Hepatitis B virus and hepatitis C virus are also known as target cells of liver cancer.
  • tissue specific cancer antigens tyrosanases, GP100, and MNRT-1 are known as melanoma target antigens, and PSMA, PAP, and PSA as prostate cancer target antigens.
  • composition of the present invention comprises a pharmaceutically effective amount of T cells. Determination of an effective amount can be readily made by one of ordinary skill in the art based on the disclosure herein. In general, a pharmaceutically effective amount is gradually increased until the first dose of the active ingredient is administered at a low concentration until a desired effect is achieved in the subject without any side effects (eg, a reduction or elimination of symptoms associated with cancer). Is determined by.
  • the method of administration of the composition according to the present invention may be determined in consideration of various factors such as the type of cancer, the age, weight, sex, medical condition of the subject, the severity of the disease, the route of administration, and the drug to be administered separately.
  • the method of administration varies widely, but can be determined according to the method generally used.
  • the amount of the composition according to the invention to be administered to a subject can be determined by a number of factors such as the method of administration, the subject's state of health, weight, and a doctor's prescription, all of which are knowledgeable to those skilled in the art. Is in the range of.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising cancer antigen-specific cytotoxic T cells is about 1 x 10 6 cells / mL or more, about 2 x 10 6 cells / mL or more, about 3 x 10 6 cells / mL or more, about 4 x 10 6 cells / mL or more, about 8 x 10 6 cells / mL or more, about 6 x 10 6 cells / mL or more, about 7 x 10 6 cells / mL or more, about 8 x 10 6 cells / mL or more, about 9 x 10 6 cells / mL or more, about 1 x 10 7 cells / mL or more, about 2 x 10 7 cells / mL or more, about 3 x 10 7 cells / mL or more, about 4 x 10 7 cells / mL or more, about 5 x 10 7 cells / mL or more, about 6 x 10 7 cells / mL or more, about 7 x 10 7 cells
  • the cancer antigen is OY-TES-1, hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1, PSMA, TARP, Mesothelin, tyrosinase, GP100, MNRT-1, PAP, PSA, CMV, HCV, HBV, MC At least one selected from the group consisting of polyoma virus, HPV and EBV.
  • the cancer antigen may be selected from the group consisting of hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1 and EBV.
  • compositions are inert ingredients such as natural or artificial carriers, labels or detectors or adjuvants, diluents, binders, stabilizers, buffers, salts, together with the cytotoxic T cells according to the invention as active ingredients. It means a combination with an active ingredient such as a lipophilic solvent, a preservative, and includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier may also contain pharmaceutical excipients and additional proteins, peptides, amino acids, lipids, and carbohydrates (e.g., monosaccharides; disaccharides; trisaccharides; tetrasaccharides; oligosaccharides; alditol, aldonic acid, esterified sugars) Derivatives, polysaccharides, or sugar polymers) may be included alone or in combination, and may comprise 1 to 99.99% by weight or volume%.
  • Protein excipients include, but are not limited to, for example, human serum albumin, recombinant human albumin, gelatin, casein, and the like.
  • Representative amino acid components that may act as buffers include, for example, alanine, arginine, glycine, betaine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, cysteine, lysine, leucine, isoleucine, valine, methionine, phenylalanine, aspartame, and the like. However, it is not limited thereto.
  • Carbohydrate excipients also include, for example, monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose; Disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose, polysaccharides such as raffinose, maltodextrin, textan, starch, and alditol such as mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, sorbitol, and myoinositol However, it is not limited thereto.
  • monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose
  • Disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose, polysaccharides such as raffinose, maltodextrin, textan, starch, and aldito
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a person skilled in the art by known methods. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid or injection of a suspension as needed.
  • pharmaceutically acceptable carriers or media in particular in sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders and the like in general, It can be formulated by admixing into the unit dosage form required for the pharmaceutical practice recognized.
  • the active ingredient amount in the formulation is such that a suitable dose in the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection may be prescribed according to a conventional formulation practice using an excipient such as distilled water for injection.
  • an excipient such as distilled water for injection.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose or other auxiliary agents, for example D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable dissolution aids, for example Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • suitable dissolution aids for example Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and it can be used in combination with benzyl benzoate and benzyl alcohol as a dissolution aid.
  • injection formulations can be administered, for example, by intravenous injection, intraarterial injection, selective intraarterial injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intraventricular injection, intracranial injection, intramedullary injection, etc. Preferably it is intravenous injection.
  • buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, analgesics such as procaine hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenols, antioxidants.
  • analgesics such as procaine hydrochloride
  • stabilizers such as benzyl alcohol, phenols, antioxidants.
  • Suspensions and emulsions may contain, for example, natural gums, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, or polyvinyl alcohol as carriers.
  • Suspensions or solutions for intramuscular injection, together with the active compound, are pharmaceutically acceptable carriers such as sterile water, olive oil, ethyl oleate, glycols such as propylene glycol, and, if necessary, in suitable amounts May contain lidocaine hydrochloride.
  • compositions comprising cytotoxic T cells according to the invention may be administered to a subject, for example, by bolus injection or continuous infusion.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 4 hours, at least 8 hours, at least 12 hours, at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days.
  • It may be administered four, or at least five times, continuously, at regular time intervals, or at time intervals determined by clinical judgment.
  • Injectables can be formulated in ampoules or in unit dosage forms of multiple dose containers. However, those skilled in the art will understand that the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the age, weight, height, sex, general medical condition and existing treatment history of the subject.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in sustained release form, and the sustained release formulation may be prepared by using a polymer which may be complexed with or contain cytotoxic T cells to be administered.
  • a polymer which may be complexed with or contain cytotoxic T cells to be administered for example, a matrix of poly (ethylene-co-vinyl acetate) or a matrix of stearic acid dimer and polyanhydride copolymer of sebacic acid can be used as the biocompatible polymer.
  • cancer refers to any number of diseases or disorders caused by abnormal, uncontrolled cell growth.
  • the cells that can cause cancer are called cancer cells, and have characteristics such as uncontrolled proliferation, immortality, possibility of metastasis, rapid growth and proliferation, and have unique morphological characteristics.
  • cancer cells may be in the form of a tumor, but such cells may be present alone in mammals or may be non-tumor cells, such as leukemia cells.
  • the cancer may be detected by the clinical or radiomedical methods to test for the presence of tumors, or to test cells from tumors or other biological samples obtained by means such as biopsies, CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA Cancer blood markers such as 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH, and NSE can be determined by detecting cancer marker genotypes such as TP53, and ATM.
  • a negative determination according to the above method is not necessarily diagnosed as non-cancer: for example, a subject who has been diagnosed with cancer can still have cancer and is identified as a form of relapse.
  • the term “about” can be understood within the range commonly used in the art, eg, within two standard deviations of the mean. “About” means 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, It can be understood to be within 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, or 0.01%.
  • compositions are inert ingredients such as natural or artificial carriers, labels or detectors or adjuvants, diluents, binders, stabilizers, buffers, salts, together with the cytotoxic T cells according to the invention as active ingredients. It means a combination with an active ingredient such as a lipophilic solvent, a preservative, and includes a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier may also contain pharmaceutical excipients and additional proteins, peptides, amino acids, lipids, and carbohydrates (e.g., monosaccharides; disaccharides; trisaccharides; tetrasaccharides; oligosaccharides; alditol, aldonic acid, esterified sugars) Derivatives, polysaccharides, or sugar polymers) may be included alone or in combination, and may comprise 1 to 99.99% by weight or volume%.
  • Protein excipients include, but are not limited to, for example, human serum albumin, recombinant human albumin, gelatin, casein, and the like.
  • Representative amino acid components that may act as buffers include, for example, alanine, arginine, glycine, betaine, histidine, glutamic acid, aspartic acid, cysteine, lysine, leucine, isoleucine, valine, methionine, phenylalanine, aspartame, and the like. However, it is not limited thereto.
  • Carbohydrate excipients also include, for example, monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose; Disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose, polysaccharides such as raffinose, maltodextrin, textan, starch, and alditol such as mannitol, xylitol, maltitol, lactitol, sorbitol, and myoinositol However, it is not limited thereto.
  • monosaccharides such as fructose, maltose, galactose, glucose, D-mannose, sorbose
  • Disaccharides such as lactose, sucrose, trehalose, cellobiose, polysaccharides such as raffinose, maltodextrin, textan, starch, and aldito
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a person skilled in the art by known methods. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid or injection of a suspension as needed.
  • pharmaceutically acceptable carriers or media in particular in sterile water or physiological saline, vegetable oils, emulsifiers, suspending agents, surfactants, stabilizers, excipients, vehicles, preservatives, binders and the like in general, It can be formulated by admixing into the unit dosage form required for the pharmaceutical practice recognized.
  • the active ingredient amount in the formulation is such that a suitable dose in the indicated range can be obtained.
  • a sterile composition for injection may be prescribed according to a conventional formulation practice using an excipient such as distilled water for injection.
  • an excipient such as distilled water for injection.
  • aqueous solution for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose or other auxiliary agents, for example D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride, and suitable dissolution aids, for example Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • suitable dissolution aids for example Alcohols, specifically ethanol, polyalcohols such as propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactants such as polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, and it can be used in combination with benzyl benzoate and benzyl alcohol as a dissolution aid.
  • injection formulations can be administered, for example, by intravenous injection, intraarterial injection, selective intraarterial injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, intraventricular injection, intracranial injection, intramedullary injection, etc. Preferably it is intravenous injection.
  • composition of the present invention comprises a pharmaceutically effective amount of T cells. Determination of an effective amount can be readily made by those of ordinary skill in the art based on the disclosure herein. In general, a pharmaceutically effective amount is gradually increased until the first dose of the active ingredient is administered at a low concentration until a desired effect is achieved in the subject without any side effects (eg, a reduction or elimination of symptoms associated with cancer). Is determined by.
  • the method of administration of the composition according to the present invention may be determined in consideration of various factors such as the type of cancer, the age, weight, sex, medical condition of the subject, the severity of the disease, the route of administration, and the drug to be administered separately.
  • the method of administration varies widely, but can be determined according to the method generally used.
  • the amount of the composition according to the invention to be administered to a subject can be determined by a number of factors such as the method of administration, the subject's state of health, weight, and a doctor's prescription, all of which are knowledgeable to those skilled in the art. Is in the range of.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising cancer antigen-specific cytotoxic T cells is about 1 x 10 6 cells / mL or more, about 2 x 10 6 cells / mL or more, about 3 x 10 6 cells / mL or more, about 4 x 10 6 cells / mL or more, about 8 x 10 6 cells / mL or more, about 6 x 10 6 cells / mL or more, about 7 x 10 6 cells / mL or more, about 8 x 10 6 cells / mL or more, about 9 x 10 6 cells / mL or more, about 1 x 10 7 cells / mL or more, about 2 x 10 7 cells / mL or more, about 3 x 10 7 cells / mL or more, about 4 x 10 7 cells / mL or more, about 5 x 10 7 cells / mL or more, about 6 x 10 7 cells / mL or more, about 7 x 10 7 cells
  • buffers such as phosphate buffers, sodium acetate buffers, analgesics such as procaine hydrochloride, stabilizers such as benzyl alcohol, phenols, antioxidants.
  • analgesics such as procaine hydrochloride
  • stabilizers such as benzyl alcohol, phenols, antioxidants.
  • Suspensions and emulsions may contain, for example, natural gums, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, or polyvinyl alcohol as carriers.
  • Suspensions or solutions for intramuscular injection, together with the active compound, are pharmaceutically acceptable carriers such as sterile water, olive oil, ethyl oleate, glycols such as propylene glycol, and, if necessary, in suitable amounts May contain lidocaine hydrochloride.
  • compositions comprising cytotoxic T cells according to the invention may be administered to a subject, for example, by bolus injection or continuous infusion.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is at least 1 hour, at least 2 hours, at least 3 hours, at least 4 hours, at least 8 hours, at least 12 hours, at least 1 day, at least 2 days, at least 3 days, at least 4 days.
  • It may be administered four, or at least five times, continuously, at regular time intervals, or at time intervals determined by clinical judgment.
  • Injectables can be formulated in ampoules or in unit dosage forms of multiple dose containers. However, those skilled in the art will understand that the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on various factors such as the age, weight, height, sex, general medical condition and existing treatment history of the subject.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in sustained release form, and the sustained release formulation may be prepared by using a polymer which may be complexed with or contain cytotoxic T cells to be administered.
  • a polymer which may be complexed with or contain cytotoxic T cells to be administered for example, a matrix of poly (ethylene-co-vinyl acetate) or a matrix of stearic acid dimer and polyanhydride copolymer of sebacic acid can be used as the biocompatible polymer.
  • cancer refers to any number of diseases or disorders caused by abnormal, uncontrolled cell growth.
  • the cells that can cause cancer are called cancer cells, and have characteristics such as uncontrolled proliferation, immortality, possibility of metastasis, rapid growth and proliferation, and have unique morphological characteristics.
  • cancer cells may be in the form of a tumor, but such cells may be present alone in mammals or may be non-tumor cells, such as leukemia cells.
  • the cancer may be detected by the clinical or radiomedical methods to test for the presence of tumors, or to test cells from tumors or other biological samples obtained by means such as biopsies, CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA Cancer blood markers such as 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH, and NSE can be determined by detecting cancer marker genotypes such as TP53, and ATM.
  • a negative determination according to the above method is not necessarily diagnosed as non-cancer: for example, a subject who has been diagnosed with cancer can still have cancer and is identified as a form of relapse.
  • the identification test in the present invention preferably according to the European Pharmacopeia 2.7.24 Flow cytometry (flow cytometry), it is determined that at least 65% CD8 + T cells and 80% or more CD45RO markers are identified among CD8 + T cells .
  • Purity test in the present invention is preferably tested according to the European Pharmacopeia 2.7.24 Flow cytometry (flow cytometry), the ratio of CD45RA in CD8 + T cells is 20% or less, CD57 or less 35%, PD-1 or less 20% Decide on
  • Cell function test or potency test in the present invention is preferably tested according to the European Pharmacopeia 2.7.24 Flow cytometry (flow cytometry), the IFN- ⁇ expression rate in CD8 + T cells 10% or more or Pharmacopeia 2.7.24 Flow cytometry ( Flow cytometry) and the LAMP1 expression rate in CD8 + T cells is determined to be at least 10%.
  • Cell viability test in the present invention is preferably European Pharmacopeia 2.7.29. Nucleated cell count and viability are tested according to the Manual Dye-exclusion method. The percentage of live cells is set to 70% or more.
  • the total cell count test in the present invention is preferably European Pharmacopoeia 2.7.29. Test according to Nucleated cell count and viability (Manual Dye-exclusion method) and determine the number of cells in 100 mL finished product at 1.4 x 10 9 cells / 100 mL ⁇ 20% (1.12 to 1.68 x 109 cells / 100 mL).
  • the quality test may be preferably defined as a test prescribed by the standards and test methods of the cell drug substance drug product and drug product, but is not necessarily based on the relevant regulations or guidelines.
  • anticancer includes “prevention” and “treatment”, where “prevention” means any action in which cancer is inhibited or delayed by administration of a composition comprising an antibody of the invention, and “treatment” Is any action that improves or beneficially alters the symptoms of cancer by administering the antibody of the present invention.
  • PBMCs were isolated from EBV positive normal blood as follows. 10 mL blood was slowly flowed into a 15 mL tube filled with 5 mL Ficoll (GE Healthcare, Ficoll paque plus, 17144002) and overlayed on top of the Ficoll solution. The tube was centrifuged at 800 x g for 20 minutes (break rate: 0), and only the white cell layer located between Ficoll and plasma was collected and washed and used as PBMC. Autoplasma (autologous plasma) was isolated from the light yellow layer on the upper layer of PBMC and used after filtration through a filter.
  • Ficoll GE Healthcare, Ficoll paque plus, 17144002
  • the isolated PBMCs were suspended at 1 ⁇ 10 6 cells / mL in CTL medium (WELGENE, LM011-77) containing 3% autologous plasma, and EBV peptide (Peptron) was added to a concentration of 2 ⁇ g / mL.
  • CTL medium WELGENE, LM011-77
  • EBV peptide Peptron
  • the cell suspension was dispensed in 1 mL aliquots in 14 mL round tubes to start incubation in a CO 2 incubator (Nuaire, NU-5841).
  • PBMCs in culture were harvested and washed in RPMI medium (WELGENE, LM011-01).
  • the washed PBMCs were stained with anti 4-1BB antibody (Biolegend, 309818) and anti CD8 antibody (Biolegend, 560347) at 4 ° C. for 30 minutes, and then washed with RPMI medium.
  • washed PBMCs were selectively isolated from cells expressing 4-1BB and CD8 using flow cytometry (BD Biosciences, FACSMelody).
  • flow cytometry BD Biosciences, FACSMelody
  • Selectively isolated cells were washed with RPMI medium and counted with an automatic cytometer (Logos Biosystems, LUNA-FL).
  • the isolated cells were suspended using ALyS505N medium (CELL SCIENCE & TECHNOLOYG INSTITUTE INC., 1020P10) and then proceeded to the next step.
  • PBMCs Normal donor blood is irradiated to induce cell death.
  • PBMCs are isolated, suspended at 1 x 10 7 cells / mL and frozen.
  • Irradiated PBMC allogenic PBMC
  • Alloplasma was separated from the light yellow layer on the upper layer of PBMC, and used after filtration through a filter.
  • CD8 + T cells and irradiated allogenic PBMCs were prepared in 200 mL of ALys505N medium containing 3% alloplasma in EBV peptides selectively isolated in 50 mL tubes. To this was added 1,000 IU / mL IL-2 and 30 ng / mL anti-CD3 antibody (BD biosciences, 555336). 30 mL of the cell suspension was then placed in a 75T flask and culture was started in a CO 2 incubator.
  • Example 1-1 of Example 1 was carried out in the same manner.
  • PBMCs in culture were harvested and washed in RPMI medium. The washed PBMCs were counted with an automatic cell counter, and the cells were suspended in CTL medium to incubate 2 x 10 6 cells / mL. 3% autoplasma and 100 IU / mL IL-2 were added to the CTL medium in which the cells were suspended, and the cells were suspended so that 2 x 10 6 cells were inserted into 1 mL of cells in a 24-well plate. Put it. EBV peptides added on the first day of culture were added to a concentration of 2 ⁇ g / mL and incubated in a CO 2 incubator.
  • PBMCs in culture were harvested and washed in RPMI medium.
  • the washed PBMCs were stained with anti 4-1BB antibody and anti CD8 antibody at 4 ° C. for 30 minutes, and then washed with RPMI medium.
  • washed PBMCs were selectively separated from the cells expressing 4-1BB and CD8 using an automatic cell separator.
  • Selectively isolated cells were washed with RPMI medium and cells were counted with an automatic cytometer.
  • the isolated cells were suspended in cells using ALyS505N medium and then proceeded to the next step.
  • PBMCs Normal donor blood was irradiated to induce cell death.
  • PBMCs were isolated, suspended at 1 ⁇ 10 7 cells / mL, and stored frozen.
  • Irradiated PBMC allogenic PBMC was used as a culture additive capable of providing co-stimulation necessary for inducing proliferation of T cells. Alloplasma was separated from the light yellow layer on the upper layer of PBMC, and used after filtration through a filter.
  • CD8 + T cells and irradiated allogenic PBMCs were prepared in 200 ml of ALys505N medium containing 3% alloplasma in EBV peptides selectively isolated in 50 mL tubes. To this was added 1,000 IU / ml IL-2 and 30 ng / ml anti-CD3 antibody. Subsequently, 30 mL of the cell suspension was placed in a 75T flask and cultured in a CO 2 incubator.
  • Test Items Test standard Existing production process (using plate coated with anti 4-1BB antibody) New production process (using automatic cell separator) Total cell count test 7.0 x 10 6 cell / ml ⁇ 10% 100ml / infusion bag 6.7 x 10 6 cell / ml, 200ml, 2 bags 6.9 x 10 6 cell / ml, 200ml, 2 bags Cell viability test ⁇ 70% ⁇ 92.3% ⁇ 95.0% Test CD8 T ⁇ 65% 65.0% ⁇ 85.0% ⁇ 95.0% CD45RA ⁇ 20% of CD8 T cells ⁇ 13.3% ⁇ 1.7% CD45RO ⁇ 80% of CD8 T cells ⁇ 98.5% ⁇ 99.7% Purity test CD57 ⁇ 35% of CD8 T cells ⁇ 19.5% ⁇ 16.8% PD-1 ⁇ 20% of CD8 T cells ⁇ 2.3% ⁇ 2.1% anti-CD3 mAb voice voice voice Voice Cell function test IFN- ⁇ production ⁇ 10% of CD8 T cells ⁇ 54.4% ⁇ 43% LAMP
  • Example 3 Semi-finished cell freeze on day 15 of 20 day process
  • the cells stored in the -196 ° C liquid nitrogen tank were taken out, and the cells were thawed by soaking in a 37 ° C constant temperature water bath (WB-2, Daehan Science, DH.WB000122) for 2 minutes 30 seconds to 3 minutes.
  • the thawed cells were transferred to a 15 mL tube, counted using an automatic cell counter, and cell numbers and viability of the thawed cells were checked.
  • 10 mL of warm RPMI medium was slowly overlayed on the thawed cells.
  • the tube was centrifuged at 1,800 rpm for 5 minutes to remove supernatant and cells were suspended in 1 mL of ALys505N medium. The number and viability of the cells suspended in 1 mL were counted again using an automatic cell counter, and as many cells as needed were used.
  • Example 1 process and the frozen cells using the Example 4 process was performed after 2, 4, 8, 12 weeks as described above to determine the recovery and survival rate, further confirmed, purity, titer The test was conducted.
  • Example 2 process and the frozen cells using the Example 5 process 2 weeks and 4 weeks after the procedure of Example 6 was carried out to measure the recovery and survival rate, further confirmed, purity, potency test Proceeded.
  • PBMCs Normal donor blood was irradiated to induce cell death.
  • PBMCs were isolated, suspended at 1 x 10 7 cells / mL, and stored frozen. Irradiated PBMC (allogenic PBMC) was used as a culture additive capable of providing co-stimulation necessary for inducing proliferation of T cells.
  • Cells were thawed according to the thawing method of the frozen cells of Example 6, counted and suspended in 30 mL of ALys505N medium containing 3% alloplasma. To this, 200 times as many cells as cells thawed with irradiated allogenic PBMC were added, and 1,000 IU / mL IL-2 and 30 ng / mL of anti-CD3 antibody were added. Cells to which all additives were added were transferred to 75T flasks and cultured in a CO 2 incubator. On the third day of culture, 20 mL of ALys505N medium containing 1,000 IU / mL IL-2, 3% alloplasma was added to the 75T flask.
  • Example 7 As a result of performing the procedure of Example 7 after 1, 2, and 3 months after the procedure of Example 3, it was confirmed that the cell viability was 92% or more after the mass culture as shown in Table 8 below, and the cell proliferation was 4800 times or more. I could see it done.
  • CD8 (%) Freezing period CD8 (%) ( ⁇ 80%) CD57: CD8 (%) ( ⁇ 35%) PD-1: CD8 (%) ( ⁇ 20%) CD45RA: CD8 (%) ( ⁇ 20%) CD45RO: CD8 (%) ( ⁇ 80%) 1 month 95.72 16.94 1.77 1.75 99.05 2 months 90.81 8.32 1.10 0.63 98.24 3 months 95.57 15.30 0.45 2.91 98.40
  • Example 7 As a result of performing the procedure of Example 7 after 4, 8, and 12 weeks after the procedure of Example 4, the cell survival rate was confirmed to be 89% or more after mass culture as shown in the following table, and the cell proliferation was 175 times or more. Can see.

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Abstract

본 발명은 (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 포함하는, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법에 관한 것이다.

Description

암항원 특이적 CD8+ T 세포의 제조 및 동결보존 방법
본 발명은 항원 특이적 CD8 + T 세포를 분리, 증식 및 동결보존하는 기술과 관련한 것이다.
CD8 + T 세포는 수지상세포, CD4+ T 및 NK 세포와 같은 다른 세포들에 비해 비교적 단순한 기능을 가지고 있기 때문에, 항암 면역치료시 기대하지 않았던 부작용이 나타날 가능성이 적다. 일반적으로 MHC class I/펩티드 다량체(multimer)를 이용하여 항원 특이적인 CD8 + T 세포를 분리하지만, 이 방법의 경우 세포 분리 후 세포자살에 의한 사멸율이 높아 충분한 양의 항원 특이적 CD8 + T 세포를 생산하기 위해 장기간 배양을 해야 하는 단점이 있었다. 따라서 T 세포 수용체 (T cell receptor; TCR)를 자극하는 MHC 다량체를 대체하여 항원 특이적 CD8 + T 세포를 분리할 수 있는 서로게이트 마커(surrogate marker)가 필요하고, 여기에 이용되는 것이 면역조절 단백질인 4-1BB (CD137)이다.
4-1BB는 유도성 공동자극 분자로서 활성화된 T 세포에서 발현되며, 특히 4-1BB를 통한 자극은 CD8 + T 세포의 활성을 증진시킬 뿐 아니라, Bcl-2, Bcl-XL, 및 Bfl-1 등과 같은 항-세포사멸 분자(anti-apoptotic molecules)의 발현을 증가시켜, 활성유도세포사멸(AICD; activation-induced cell death)을 억제하는 기능을 나타내는 것으로 잘 알려져 있다.
본 발명자에 의해 항원 특이적으로 활성화된 CD8 + T 세포의 4-1BB의 발현을 이용한, 항-4-1BB 항체 또는 오중합체 COMP-4-1BBL 단백질을 이용한 항원 특이적 CD8 + T 세포의 분리 및 증식 방법을 기존에 한 바 있다(확립 (대한민국 등록특허 제100882445, 제 101103603, 제 101503341호). 본 명세서의 기존의 방법은 상기 특허에 기재에 따른 T 세포 또는 그 제조방법으로 한다.
상기 특허문헌은 외래항원인 바이러스항원 (EBV/LMP2A, CMV/pp65) 또는 자가암항원 (WT-1, hTERT, NY-ESO-1 등)에 대한 항원 특이적 CD8 + T 세포의 분리와 분리된 세포를 대량 배양하는 기술을 개시하고 있다. 하지만, 항-4-1BB 항체가 코팅된 플레이트를 이용한 기존 항원 특이적 CD8 + T 세포의 분리 기술은 작업자의 숙련도에 따라 분리된 세포의 순도가 크게 달라지며, 세포를 배양하는 과정 또한 매우 복잡하다. 더욱이 생산 공정이 30일 이상 소요되어, 현재 임상 적용을 위한 세포치료제 생산에 요구되는 시간을 최대한 단축하는 것이 지속적인 과제이다.
또한, CD8 + T 세포의 제조에 있어서, 세포를 동결보존하였다가 필요 시 이를 해동하여 사용하는 것은 환자의 치료 스케쥴 및 반복 치료 등을 위해 필요하나, 아직까지는 T 세포의 동결 후 해동 시 T 세포의 생존율, 증식능, 암항원 특이적 활성 등이 감소되는 문제점이 있다.
따라서, 보다 효과적인 환자 치료를 위해서는, 항원 특이적 CD8 + T 세포를 보다 고순도로 쉽게 분리하고 이를 빠른 시간 내에 대량 증식시켜 전체 배양공정을 단축시킬 필요가 있으며, T 세포의 성능 저하를 최소화하는 T 세포 동결보존 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 암항원 특이적인 CD8 + T 세포 생산에 있어서, 생산된 CD8 + T 세포의 동결보존 후에도 높은 수준의 세포 생존력(viability) 및 암항원 특이적 활성을 유지할 수 있게 하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 동결보존 단계를 포함하여 제조된 CD8 + T 세포 포함 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 동결된 항원 특이적인 CD8 + T 세포를 해동 후 다시 대량 배양을 수행함으로써 더욱더 많은 항원 특이성을 높인 CD8 + T 세포를 얻을 뿐만이 아니라 높은 수준의 세포 생존력 및 암항원 특이적 활성을 유지할 수 있게 하는 방법을 제공하고자 한다.
1. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
2. 항목 1에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
3. 항목 1에 있어서, 상기 암항원은 hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1 및 EBV로 구성된 군에서 선택된 적어도 어느 하나인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
4. 항목 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 유세포분석기를 사용하여 수행되는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
5. 항목 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 수가 mL당 소정의 세포 수 이상일 때 동결시키는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
6. 항목 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 CD8 + T 세포의 수가 mL당 소정의 세포 수 이상이고, 상기 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율이 소정의 비율 이상일 때 동결시키는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
7. 항목 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 CD8 + T 세포의 수 및 상기 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율을 검지하는 단계를 포함하는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
8. 항목 2에 있어서, 상기 (e) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 (f) 단계를 더 포함하는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
9. 항목 1에 있어서, 공동 자극 인자는 CD28, CTLA-4, ICOS, PD1, BTLA, HVEM, CD27, OX40, 4-1BB, CD30, 및 SLAM로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
10. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 암 치료용 조성물의 제조 방법.
11. 항목 10에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암 치료용 조성물의 제조 방법.
12. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하여 제조된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 암 치료용 조성물.
13. 항목 12에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암 치료용 조성물.
14. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하여 제조된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 암 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
15. 항목 14에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
본 발명의 CD8 + T 세포 생산방법은 CD8 + T 세포의 성능 저하 없이 동결 보존할 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포의 생산방법은 CD8 + T 세포의 동결보존 후에도 높은 수준의 세포 생존력 및 암항원 특이적 활성을 유지할 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포의 생산방법은 암항원 특이적인 CD8 + T 세포를 고순도로 선택적으로 분리, 대량 배양할 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포 생산 방법은 암항원 특이적인 CD8 + T 세포를 신속하게 생산할 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포 생산방법은 GMP 공정에 적용될 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포 포함 약물 조성물은 동결보존 후에도 높은 수준의 세포 생존력 및 암항원 특이적 활성을 유지할 수 있다.
본 발명의 CD8 + T 세포 포함 약학 조성물은 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 고순도로 포함할 수 있다.
도 1은 암항원 특이적인 CD8 + T 세포를 생산하는 공정을 개략적으로 나타낸 도면이다.
본 발명은 T 세포의 동결보존 방법 및 그러한 방법으로 제조된 T 세포에 관한 것이다.
또한 본 발명은 암항원 특이적인 CD8 + T 세포 생산에 있어서, 생산된 CD8 + T 세포의 동결보존 후에도 높은 수준의 세포 생존력 및 암항원 특이적 활성을 유지할 수 있게 하는 방법 및 그러한 방법으로 제조된 T 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 암항원 (예컨대, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3, Neo-Antigen 등)에 특이적인 세포독성 T 세포를 포함하는 것으로서, 1차 증식으로부터 최종 T 세포 대량 배양 완료 후 동결까지 진행하는데 31일이 소요될 수도 있으며, 29일, 26일, 20일 또는 15일이 소요되는 개량된 공정으로 제조된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 암항원 특이적인 CD8 + T 세포의 제조 방법은 (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계; 및 선택적으로 (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 포함한다.
CD8 + T 세포는 하기와 같은 방법으로 활성화시킨다:
CD8+ T 세포를 활성화 하기 위해서는 혈액으로부터 분리된 PBMC와 암항원 유래의 각 팹타이드를 함께 배양하며, 이때 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 사이토카인을 주기적으로 처리함으로써 활성화 시킨다.
CD8 + T 세포의 공동 자극 인자는, CD28 패밀리에 속하는 단백질로서, 예를 들어, CD28, CTLA-4, ICOS, PD1, 및 BTLA; TNFR 패밀리에 속하는 단백질로서, 예를 들어, HVEM, CD27, OX40, 4-1BB, GITR및 CD30; 및 SLAM 패밀리에 속하는 단백질로서, 예를 들어, SLAM, 2B4, CD2, CD48, CD84, CD229, CRACC, NTB-A; 및 TIM 패밀리에 속하는 단백질로서, 예를 들어 TIM-1 및 TIM-3 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 (K. C. Beier, et al., European Respiratory Journal 2007 29: 804-812). 본 발명의 일 실시예에서, 상기 공동 자극 인자는 4-1BB 이다.
또는 공동 자극 인자가 발현된, 활성화된 CD8+ 세포는 하기의 제조방법으로 제조된 것일 수 있다.
일 구현예에서 a) 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)와 암항원 유래의 각 펩타이드를 함께 배양한 후, 활성화된 T 세포를 선별하여 암항원 CD8 + T 세포 에피토프를 선별하는 단계; b) 상기 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 사이토카인 및 상기 선별된 에피토프를 포함하는 배지에서 배양하여 상기 PBMC에서 4-1BB 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에서 암항원 CD8 + T 세포 에피토프를 선별 또는 스크리닝(Epitope screening, 사전선별검사)하는 단계는 암세포에 결합력(avidity)이 높거나 또는 혈액 내 0.1% 이하의 낮은 농도로 존재하는 암항원 특이적 CD8 + T 세포의 농도를 높이기 위한 것으로, 암항원에 특이적인 CD8 + T 세포를 선택적으로 증식 및 분리할 수 있는 첫 번째 단계이다.
이 단계에서는 CD8 + T 세포에 의해 인식될 수 있는 다양한 암항원 (예를 들면 EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3 등) 유래의 에피토프가 사용될 수 있다. 하지만 이는 환자 개개인의 상태에 따라 서로 다르다. 즉, 예를 들면 EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3 등과 같은 암 항원에서 동일한 종류의 암 항원이라도 각 환자에서 에피토프로 작용할 수 있는 부분은 환자 개개인의 HLA-A 유형 및 상태에 따라 달라진다. 따라서 동일한 암 항원 내에서도 각 환자별로 항원 에피토프로 작용할 수 있는 펩티드 부분이 상이하기 때문에 에피토프 스크리닝을 통해 암환자 개개인의 혈액 내에 존재하는 암항원 CD8 + T cell 에피토프를 선별하여 사용하는 것이 중요하다. 일반적으로 T 세포치료제 제조용으로는 에피토프로 작용하는 펩티드 3-4종류를 선별한다.
본원에 따른 방법은 다양한 암항원으로부터 개인의 CD8 + T 세포 선별 및 증식에 최적인 에피토프를 선별하는 것으로, 암종에 따라 이러한 목적을 달성하는 자가(self) 또는 비자가(non-self)를 포함하는 다양한 암항원이 사용될 수 있다.
예를 들면 환자 자신의 유전자에서 유래된 자가 암항원은 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) 등과 암 특이적 돌연변이 항원 예를 들면 neoantigens, mutated P53, RAS 등의 종양억제 또는 유발유전자를 포함할 수 있으며, 외래 암항원으로 암유발 바이러스 항원 예를 들면 CMV, EBV, HPV 등을 포함할 수 있다.
하지만, 암종별로 특이한 다양한 암항원에서 개인별로 최적의 에프토프를 선별하고 이를 이용하여 T 세포를 생산하는 본원 발명의 특징상 이로 제한하는 것은 아니다. 자가 암 항원으로는, 예를 들어, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, 및 MAGE's 등이 알려져 있다. 예를 들면 자가암항원인 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암 세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포 사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고 (Kim NW, et al. Science. 1994;266:2011-2015), WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 zinc finger 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다 (Call KM, et al., Cell. 1990. 60:509-520; Nakahara Y, et al.,Brain Tumor Pathol. 2004. 21:113-6). 또한 상기 NY-ESO1은 cancer testis antigen (CTA)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포(germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있다 (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006;95:1-30). MAGE-A3은 melanoma-associated antigen family에 속하는 단백질로 정상세포에서 어떤 기능을 수행하는지에 대해서는 알려진 것이 없지만, 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있어 암의 면역치료에 적합한 표적 항원으로 평가되고 있다 (Decoster L, et al.,Ann Oncol. 2012 Jun;23(6):1387-93). 따라서 특정 암과의 연관성이 알려진 암항원은 본원의 방법에서 개인별 암항원 CD8 + T cell 생산에 사용될 수 있다.
또한 바이러스성 암 항원은, 예를 들어, EBV, HPV, MC polyoma 바이러스, HBV, HCV, 및 CMV 등이 알려져 있고, 엡스타인-바 바이러스 항원은 호치킨스 림프종, 코인두암종, 위암, 버키트 림프종, NK/T 림프종의 타겟 항원으로 알려져 있고, 인유두종 바이러스 항원은 자궁암 및 두경부암의 타겟 항원으로 알려져 있으며, MC 폴리오마 바이러스는 메르켈 세포암의 타겟 항원으로 알려져 있다. 또한, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스는 간암의 표적 세포로 알려져 있다.
조직 특이적 암 항원으로서, 타이로사나아제, GP100, 및 MNRT-1은 흑색종 타겟 항원으로, PSMA, PAP, 및 PSA는 전립선암 표적 항원으로서 알려져 있다.
암항원 유래의 펩타이드는 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 그 이상이 사용된다. 특히 일반적으로 T 세포치료제 제조용으로는 에피토프로 작용하는 펩티드 3-4종류가 사용되는 것을 고려하면, 사용되는 암항원 유래의 펩타이드는 적어도 4개 이상. 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 그 이상 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원 방법의 특징 및 당업계의 기술을 고려하여 당업자의 수준에서 결정될 수 있을 것이다.
본원의 방법에 포함되는 에피토프 스크리닝 단계는 기존의 에피토프 스크리닝 공정과는 달리 에피토프의 선별 시, 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포)를 선별하는 방법으로 에피토프를 선별하는 것일 수 있다. 예컨대, 항원 자극 후 활성화된 T 세포를 선별하여, 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포)의 존재 여부 및 얼마나 많은 양이 존재하는지를 검지하여 이러한 세포들을 유도할 수 있는 항원 에피토프를 선정할 수 있다. 상기 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포) 선별은 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 자동세포분리기는 GMP 공정에 적용 가능한 것일 수 있다. 예컨대 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 자동세포분리기일 수 있다.
다음의 단계에서는 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 상기 선별된 에피토프 및 사이토카인의 조합을 포함하는 배지에서 배양하여 상기 PBMC에서 4-1BB 발현을 유도한다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또 다른 일 구현예에서 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 두 개의 조합일 수 있다. 예컨대, 상기 사이토카인은 IL-2 및 IL-7의 조합, IL-2 및 IL-15의 조합, IL-2 및 IL-21의 조합, IL-7 및 IL-15의 조합, IL-7 및 IL-21의 조합, 또는 IL-15 및 IL-21의 조합으로 사용될 수 있다.
반면, 기존의 암항원 특이적 CD8 + T 세포의 증식은 14일 배양을 통해 이루어지며, 배양 14일째 항원 특이적 CD8 + T 세포에서 4-1BB 발현을 유도하기 위해 24시간 추가 재활성화 작업을 필요로 한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 b)단계는 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 수행될 수 있다.
본원에 따른 방법의 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 사용되는 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)는 본원에 따른 목적을 고려하여 동일 환자 유래의 것이 사용된다. PBMC는 당업계의 공지된 방법을 이용하여 전혈로부터 분리될 수 있다.
다음으로, 활성화된 CD8 + T 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포는 항-공동 자극 인자 항체 및 항-CD8 항체로 염색한 후 분리된다. 분리는 예를 들면 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 분리될 수 있다. 자동세포분리기를 사용한 항원 특이적인 공동 자극 인자를 발현하는 CD8 + T 세포 분리는 기존 공정인 공동 자극 인자가 코팅된 플레이트 사용에 의해 발생하는 순도, 작업공정 난이도 등 여러 문제점들을 개선할 수 있다. 공동 자극 인자는 항원에 의하여 자극된 CD8 + T 세포 표면에서만 발현되는 마커에 대하여 형광 표지인자가 결합된 항-공동 자극 인자 항체 그리고 항-CD8 항체로 염색한 후 두 가지 형광을 모두 가지는 항원 특이적인 CD8 + T 세포를 효율적으로 분리할 수 있다.
위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 공동 자극 인자를 발현하는 CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법은 EBV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, 및 MAGE-A3 등의 암항원에 특이적인 CD8 + T 세포 제조에 적용될 수 있다. 위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 공동 자극 인자를 발현하는 CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법으로 제조된 약학 조성물은 암항원 특이적 세포독성 T 세포를 90% 이상 (예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 포함하는 것일 수 있다. 보다 바람직하게는 95% 이상 (예컨대, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 포함하는 것일 수 있다.
위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 공동 자극 인자를 발현하는 CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법을 적용하여 제조된 약학 조성물 (예컨대, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, 또는 MAGE-A3 특이적 세포독성 T 세포 포함 조성물)은 암항원 특이적 세포독성 T 세포의 순도가 높아 T 세포치료제 임상효능 (예컨대, 항암 효능 등)이 우수하다.
위의 선별 단계에 사용되는 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)는 GMP 공정에 적용 가능한 것일 수 있다. 예컨대 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 자동세포분리기일 수 있다.
선별된 CD8 + T 세포의 수는 배양을 통하여 증가시킬 수 있으며, CD8 + T 세포의 배양 방법은 당업계에 알려진 방법을 이용할 수 있다: 예를 들어, 본 발명의 일 실시예에서, T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 코팅된 6웰 플레이트의 RPMI 배지 (불활성화된 FBS, l-글루타민, 페니실린, 스트렙토마이신, 2-머캅토에탄올, 1% ITS: 인슐린, 트랜스페린 및 소듐 셀레나이트)에 플레이팅하고 소정의 시간동안 배양하고, IL-7, 및 IL-2를 첨가하여 배양한 후, 세포를 회수하고 IL-7 및 IL-2를 포함하는 신선한 배지에서 재배양한다. 그러나 상기의 방법은 하나의 예시이고, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시 예에서, CD8 + T 세포의 수는 배양을 통하여 증가시킬 수 있다: a) 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC(peripheral blood mononuclear cell)와 암항원 유래의 각 펩티드를 함께 배양한 후, 활성화 된 T 세포를 선별하여 암항원 CD8 + T 세포 에피토프를 선별하는 단계; b) 상기 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 사이토카인 및 상기 선별된 에피토프를 포함하는 배지에서 배양하여 상기 PBMC에서 4-1BB 발현을 유도하는 단계; 및 c) 상기 4-1BB 발현이 유도된 세포를 항 4-1BB 항체 및 항 CD8 항체로 염색한 후 분리하는 단계를 포함한다.
이하, 본 발명의 항원 특이적 CD8 + T 세포 생산을 위한 항원 에피토프 선별, 항원 특이적 CD8 + T 세포의 분리 및 증식방법을 단계별로 설명한다.
본원에 따른 방법에서 암항원 CD8 + T 세포 에피토프를 선별 또는 스크리닝(Epitope screening, 사전선별검사)하는 단계는 암세포에 결합력(avidity)이 높거나 또는 혈액 내 0.1% 이하의 낮은 농도로 존재하는 암항원 특이적 CD8 + T 세포의 농도를 높이기 위한 것으로, 암항원에 특이적인 CD8 + T 세포를 선택적으로 증식 및 분리할 수 있는 첫 번째 단계이다.
이 단계에서는 CD8 + T 세포에 의해 인식될 수 있는 다양한 암항원 (예를 들면 EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3 등) 유래의 에피토프가 사용될 수 있다. 하지만 이는 환자 개개인의 상태에 따라 서로 다르다. 즉, 예를 들면 EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, MAGE-A3 등과 같은 암 항원에서 동일한 종류의 암 항원이라도 각 환자에서 에피토프로 작용할 수 있는 부분은 환자 개개인의 HLA-A 유형 및 상태에 따라 달라진다. 따라서 동일한 암 항원 내에서도 각 환자별로 항원 에피토프로 작용할 수 있는 펩티드 부분이 상이하기 때문에 에피토프 스크리닝을 통해 암환자 개개인의 혈액 내에 존재하는 암항원 CD8 + T cell 에피토프를 선별하여 사용하는 것이 중요하다. 일반적으로 T 세포치료제 제조용으로는 에피토프로 작용하는 펩티드 3-4종류를 선별한다.
본원에 따른 방법은 다양한 암항원으로부터 개인의 CD8 + T 세포 선별 및 증식에 최적인 에피토프를 선별하는 것을 포함하고, 암종에 따라 이러한 목적을 달성하는 자가(self) 또는 비자가(non-self)를 포함하는 다양한 암항원이 사용될 수 있다.
예를 들면 환자 자신의 유전자에서 유래된 자가 암항원은 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) 등과 암 특이적 돌연변이 항원 예를 들면 neoantigens, mutated P53, RAS 등의 종양억제 또는 유발유전자를 포함할 수 있으며, 외래 암항원으로 암유발 바이러스 항원 예를 들면 CMV, EBV, HPV 등을 포함할 수 있다.
하지만, 암종별로 특이한 다양한 암항원에서 개인별로 최적의 에프토프를 선별하고 이를 이용하여 T 세포를 생산하는 본원 발명의 특징상 이로 제한하는 것은 아니다. 자가 암 항원으로는, 예를 들어, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, 및 MAGE's 등이 알려져 있다. 예를 들면 자가암항원인 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암 세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포 사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고 (Kim NW, et al. Science. 1994;266:2011-2015), WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 zinc finger 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다 (Call KM, et al., Cell. 1990. 60:509-520; Nakahara Y, et al.,Brain Tumor Pathol. 2004. 21:113-6). 또한 상기 NY-ESO1은 cancer testis antigen (CTA)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포(germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있다 (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006;95:1-30). MAGE-A3은 melanoma-associated antigen family에 속하는 단백질로 정상세포에서 어떤 기능을 수행하는지에 대해서는 알려진 것이 없지만, 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있어 암의 면역치료에 적합한 표적 항원으로 평가되고 있다 (Decoster L, et al.,Ann Oncol. 2012 Jun;23(6):1387-93). 따라서 특정 암과의 연관성이 알려진 암항원은 본원의 방법에서 개인별 암항원 CD8 + T cell 생산에 사용될 수 있다.
또한 바이러스성 암 항원은, 예를 들어, EBV, HPV, MC polyoma 바이러스, HBV, HCV, 및 CMV 등이 알려져 있고, 엡스타인-바 바이러스 항원은 호치킨스 림프종, 코인두암종, 위암, 버키트 림프종, NK/T 림프종의 타겟 항원으로 알려져 있고, 인유두종 바이러스 항원은 자궁암 및 두경부암의 타겟 항원으로 알려져 있으며, MC 폴리오마 바이러스는 메르켈 세포암의 타겟 항원으로 알려져 있다. 또한, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스는 간암의 표적 세포로 알려져 있다.
조직 특이적 암 항원으로서, 타이로사나아제, GP100, 및 MNRT-1은 흑색종 타겟 항원으로, PSMA, PAP, 및 PSA는 전립선암 표적 항원으로서 알려져 있다.
암항원 유래의 펩티드는 두 개, 세 개, 네 개, 다섯 개 또는 그 이상이 사용된다. 특히 일반적으로 T 세포치료제 제조용으로는 에피토프로 작용하는 펩티드 3-4종류가 사용되는 것을 고려하면, 사용되는 암항원 유래의 펩티드는 적어도 4개 이상. 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 그 이상 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, 본원 방법의 특징 및 당업계의 기술을 고려하여 당업자의 수준에서 결정될 수 있을 것이다.
본원의 방법에 포함되는 에피토프 스크리닝 단계는 기존의 에피토프 스크리닝 공정과는 달리 에피토프의 선별 시, 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포)를 선별하는 방법으로 에피토프를 선별하는 것일 수 있다. 예컨대, 항원 자극 후 활성화된 T 세포를 선별하여, 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포)의 존재 여부 및 얼마나 많은 양이 존재하는지를 검지하여 이러한 세포들을 유도할 수 있는 항원 에피토프를 선정할 수 있다. 상기 활성화된 T 세포 (예컨대, 4-1BB+ CD8 + T 세포) 선별은 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 사용하여 수행될 수 있다. 상기 자동세포분리기는 GMP 공정에 적용 가능한 것일 수 있다. 예컨대 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 자동세포분리기일 수 있다.
다음의 단계에서는 암 환자의 혈액으로부터 분리된 PBMC를 상기 선별된 에피토프 및 사이토카인의 조합을 포함하는 배지에서 배양하여 상기 PBMC에서 4-1BB 발현을 유도한다.
암항원 특이적 CD8 + T 세포는 혈액 내에 0.1% 이하의 낮은 농도로 존재하므로, 혈액으로부터 분리된 PBMC에 에피토프 스크리닝을 통해 선별된 펩티드 3-4종 및 사이토카인 1종 또는 그 이상을 첨가하여 7 내지 9일간 배양함으로써 암항원으로부터 유래된 펩티드에 특이적인 CD8 + T 세포의 증식 및 4-1BB 발현의 유도가 가능하다 (도 1. B-1, B-2). 이로 인해 총 배양시간은 29일 이내, 26일 이내, 20일 이내, 18일 이내, 특히 15일로 단축시킬 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또 다른 일 구현예에서 상기 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-15 및 IL-21으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 두 개의 조합일 수 있다. 예컨대, 상기 사이토카인은 IL-2 및 IL-7의 조합, IL-2 및 IL-15의 조합, IL-2 및 IL-21의 조합, IL-7 및 IL-15의 조합, IL-7 및 IL-21의 조합, 또는 IL-15 및 IL-21의 조합으로 사용될 수 있다.
반면, 기존의 암항원 특이적 CD8 + T 세포의 증식은 14일 배양을 통해 이루어지며, 배양 14일째 항원 특이적 CD8 + T 세포에서 4-1BB 발현을 유도하기 위해 24시간 추가 재활성화 작업을 필요로 한다.
일 구현예에서 본원에 따른 방법의 b)단계는 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 동안 수행될 수 있다.
본원에 따른 방법의 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 사용되는 PBMC (peripheral blood mononuclear cell)는 본원에 따른 목적을 고려하여 동일 환자 유래의 것이 사용된다. PBMC는 당업계의 공지된 방법을 이용하여 전혈로부터 분리될 수 있다.
세 번째 단계로 4-1BB 발현이 유도된 항원 특이적인 세포는 항 4-1BB 항체 및 항 CD8 항체로 염색한 후 분리된다. 분리는 예를 들면 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 분리될 수 있다. 자동세포분리기를 사용한 항원 특이적인 4-1BB +CD8 + T 세포 분리는 기존 공정인 4-1BB 항체가 코팅된 플레이트 사용에 의해 발생하는 순도, 작업공정 난이도 등 여러 문제점들을 개선할 수 있다. 4-1BB 단백질은 항원 자극된 CD8 + T 세포 표면에서만 발현되는 마커에 대하여 형광 표지인자가 결합된 4-1BB 항체 그리고 CD8 항체로 염색한 후 두 가지 형광을 모두 가지는 항원 특이적인 CD8 + T 세포를 효율적으로 분리할 수 있다.
위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 4-1BB + CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법은 EBV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, 및 MAGE-A3 등의 암항원에 특이적인 CD8 + T 세포 제조에 적용될 수 있다. 위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 4-1BB + CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법으로 제조된 약학 조성물은 암항원 특이적 세포독성 T 세포를 90% 이상 (예컨대, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 포함하는 것일 수 있다.
위와 같이 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)를 이용하여 4-1BB + CD8 + T 세포를 선별하는 제조방법을 적용하여 제조된 약학 조성물 (예컨대, EBV, CMV, hTERT, NY-ESO-1, WT1, 또는 MAGE-A3 특이적 세포독성 T 세포 포함 조성물)은 암항원 특이적 세포독성 T 세포의 순도가 높아 T 세포치료제 임상효능 (예컨대, 항암 효능 등)이 우수하다.
위의 선별 단계에 사용되는 자동세포분리기 (Automatic cell sorter)는 GMP 공정에 적용 가능한 것일 수 있다. 예컨대 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 자동세포분리기일 수 있다.
본원에 따른 방법은 상기 분리된 4-1BB +CD8 + T 세포를 대량 증식시키는 단계를 추가로 포함한다.
대량 생산하는 단계는 전단계에서 분리된 암항원 특이적 CD8 + T 세포 및 방사선 조사된 동종이계(allogeneic) PBMC를 IL-2, 항-CD3 항체 및 자가혈장이 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구현예에서는 1L 배양용기 (culture bag 또는 G-Rex device)에 분리된 4-1BB +CD8 + T 세포 (5×10 5 ~ 3×10 6 세포), 방사선 조사된(irradiated allogeneic) PBMCs (1×10 8 ~ 3×10 8 세포), 1000U/ml IL-2, 30ng 항-CD3 mAb를 혼합하여 7 ~ 11일간 정기적으로 배지를 첨가하여 1×10 9 세포/L 초과의 수준으로 세포를 대량 배양하여, 암환자에게 투여 가능한 수준으로 증식시킨다. 본 발명의 일 실시예에서, 약 1 x 10 6 cells/mL 이상, 약 2 x 10 6 cells/mL 이상, 약 3 x 10 6 cells/mL 이상, 약 4 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 6 x 10 6 cells/mL 이상, 약 7 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 9 x 10 6 cells/mL 이상, 약 1 x 10 7 cells/mL 이상, 약 2 x 10 7 cells/mL 이상, 약 3 x 10 7 cells/mL 이상, 약 4 x 10 7 cells/mL 이상, 약 5 x 10 7 cells/mL 이상, 약 6 x 10 7 cells/mL 이상, 약 7 x 10 7 cells/mL 이상, 약 8 x 10 7 cells/mL 이상, 약 9 x 10 7 cells/mL 이상, 약 1 x 10 8 cells/mL 이상, 약 2 x 10 8 cells/mL 이상, 약 3 x 10 8 cells/mL 이상, 약 4 x 10 8 cells/mL 이상, 약 5 x 10 8 cells/mL 이상, 약 6 x 10 8 cells/mL 이상, 약 7 x 10 8 cells/mL 이상, 약 8 x 10 8 cells/mL 이상, 또는 약 9 x 10 8 cells/mL 이상의 세포를 포함하도록 증식시킨다.
본원에 따른 방법은 증식 (expansion)된 암항원 특이적인 CD8 + T 세포를 동결하는 단계를 포함한다.
동결 단계는 전단계에서 증식된 세포 중 공동 자극 분자(co-stimulatory molecule)가 발현된 것으로 기 선별된 CD8 + T 세포의 수가 mL 당 소정의 세포 수 이상이 되었을 때 동결보존제 (예컨대, DMSO)를 첨가함으로써 수행될 수 있다. 상기 소정의 세포 수는, 1 x 10 6 cell/mL, 2 x 10 6 cell/mL, 3 x 10 6 cell/mL, 4 x 10 6 cell/mL, 5 x 10 6 cell/mL, 6 x 10 6 cell/mL, 7 x 10 6 cell/mL, 8 x 10 6 cell/mL, 9 x 10 6 cell/mL, 1 x 10 7 cell/mL, 2 x 10 7 cell/mL, 3 x 10 7 cell/mL, 4 x 10 7 cell/mL, 5 x 10 7 cell/mL, 6 x 10 7 cell/mL, 7 x 10 7 cell/mL, 8 x 10 7 cell/mL, 또는 9 x 10 7 cell/mL일 수 있다. 그러나 통상의 기술자는 필요에 따라 동결 시기를 조절할 수 있다. 상기 DMSO는, 예를 들어, 10%, 7.5%, 5%, 또는 2.5%로 첨가될 수 있다. 공동 자극 분자가 발현된 CD8 + T 세포는 예컨대 상기 항원 자극 단계에서 공동 자극 분자가 발현된 세포일 수 있고, 또한 예컨대 상기 증식단계에서 공동 자극 분자가 발현된 세포일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 동결 단계는 CD8 + T 세포의 수가 mL당 소정의 세포 수 이상이면서, 공동 자극 인자가 발현된 것으로 선별된 CD8 + T 세포의 비율이 소정의 비율 이상일 때 수행될 수 있다 .
상기 소정의 세포 수는, 1 x 10 6 cell/mL, 2 x 10 6 cell/mL, 3 x 10 6 cell/mL, 4 x 10 6 cell/mL, 5 x 10 6 cell/mL, 6 x 10 6 cell/mL, 7 x 10 6 cell/mL, 8 x 10 6 cell/mL, 9 x 10 6 cell/mL, 1 x 10 7 cell/mL, 2 x 10 7 cell/mL, 3 x 10 7 cell/mL, 4 x 10 7 cell/mL, 5 x 10 7 cell/mL, 6 x 10 7 cell/mL, 7 x 10 7 cell/mL, 8 x 10 7 cell/mL, 또는 9 x 10 7 cell/mL일 수 있다. 그러나 통상의 기술자는 필요에 따라 동결 시기를 조절할 수 있다. 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율은, 예를 들어, 1% 내지 10%, 10% 내지 20%, 20% 내지 30%, 30% 내지 40%, 40% 내지 50%, 50% 내지 60%, 60% 내지 70%, 70% 내지 80%, 80% 내지 90%, 또는 90% 내지 100%일 수 있다. 이를 위하여, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 동결 단계는 CD8 + T 세포의 수 및 상기 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율을 검지하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 범위 내에 존재하는 모든 수치가 본 명세서에 개시된 것으로 본다.
본원에 따른 방법은 상기 동결된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법은 상기 해동된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 증식시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 해동 후의 증식 단계는 동결 전의 증식 단계와 동일하거나 유사하게 수행될 수 있다. 해동 후의 증식 단계는 > 1 x 10 9 cell/mL 수준으로 세포를 대량 배양하여, 암환자에게 투여 가능한 수준으로 증식시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 암 항원은 자가 암항원, 바이러스성 암항원, 또는 조직 특이적 암항원일 수 있다.
예를 들면 환자 자신의 유전자에서 유래된 자가 암항원은 hTERT (GenBank: BAC11010.1), WT1 (GenBank: AAO61088.1), NY-ESO1 (GenBank: CAA05908.1), MAGE-A3 (NCBI Reference Sequence: NP_005353.1) 등과 암 특이적 돌연변이 항원 예를 들면 neoantigens, mutated P53, RAS 등의 종양억제 또는 유발유전자를 포함할 수 있으며, 외래 암항원으로 암유발 바이러스 항원 예를 들면 CMV, EBV, HPV 등을 포함할 수 있다.
하지만, 암종별로 특이한 다양한 암항원에서 개인별로 최적의 에프토프를 선별하고 이를 이용하여 T 세포를 생산하는 본원 발명의 특징상 이로 제한하는 것은 아니다. 자가 암 항원으로는, 예를 들어, WT1, hTERT, NY-ESO1, Mesothelin, 및 MAGE's 등이 알려져 있다. 예를 들면 자가암항원인 hTERT는 염색체 말단에서 텔로미어 DNA(telomeric DNA)를 합성하는 효소로서 암 세포는 이 효소를 과도하게 활성화시켜 텔로미어 의존적 세포 사멸을 회피할 수 있도록 기능하고 폐암, 위암, 췌장암을 포함하는 다양한 고형암의 타겟 항원으로 알려져 있고 (Kim NW, et al. Science. 1994;266:2011-2015), WT1은 Wilms tumor와 관련된 유전자로서 zinc finger 전사인자를 암호화하여 세포의 증식과 분화, 자멸사, 기관의 발생에 관여를 하는 단백질로서 뇌척수암, 폐암 등의 타겟 항원으로 알려져 있다 (Call KM, et al., Cell. 1990. 60:509-520; Nakahara Y, et al.,Brain Tumor Pathol. 2004. 21:113-6). 또한 상기 NY-ESO1은 cancer testis antigen (CTA)에 속하는 단백질 중 하나로 주로 생식세포(germ cell)와 육종(sarcoma), 유방암을 포함한 다양한 암세포에 발현하는 것으로 잘 알려져 있다 (Gnjatic S, et al., Adv Cancer Res. 2006;95:1-30). MAGE-A3은 melanoma-associated antigen family에 속하는 단백질로 정상세포에서 어떤 기능을 수행하는지에 대해서는 알려진 것이 없지만, 폐암, 육종 및 흑색종을 포함한 다양한 암세포에 과발현하는 것으로 알려져 있어 암의 면역치료에 적합한 표적 항원으로 평가되고 있다 (Decoster L, et al., Ann Oncol. 2012 Jun;23(6):1387-93). 따라서 특정 암과의 연관성이 알려진 암항원은 본원의 방법에서 개인별 암항원 CD8 + T cell 생산에 사용될 수 있다.
또한 바이러스성 암 항원은, 예를 들어, EBV, HPV, MC polyoma 바이러스, HBV, HCV, 및 CMV 등이 알려져 있고, 엡스타인-바 바이러스 항원은 호치킨스 림프종, 코인두암종, 위암, 버키트 림프종, NK/T 림프종의 타겟 항원으로 알려져 있고, 인유두종 바이러스 항원은 자궁암 및 두경부암의 타겟 항원으로 알려져 있으며, MC 폴리오마 바이러스는 메르켈 세포암의 타겟 항원으로 알려져 있다. 또한, B형 간염 바이러스 및 C형 간염 바이러스는 간암의 표적 세포로 알려져 있다.
조직 특이적 암 항원으로서, 타이로사나아제, GP100, 및 MNRT-1은 흑색종 타겟 항원으로, PSMA, PAP, 및 PSA는 전립선암 표적 항원으로서 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적 유효량의 T 세포를 포함한다. 유효량의 결정은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 개시된 내용을 기반으로 용이하게 결절될 수 있다. 일반적으로 약제학적 유효량은 유효 성분을 낮은 농도로 1차 투여한 후, 대상체에서 부작용이 없으면서도 요망되는 효과 (예를 들어, 암과 관련된 증상이 감소되거나 제거되는 것)를 얻을 때까지 점진적으로 증량시킴으로써 결정된다. 본 발명에 따른 조성물의 투여를 위한 적절한 투여량이나 투여 간격을 결정하는 방법은 예를 들어, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005)에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 방법은 암의 종류, 대상체의 나이, 체중, 성별, 의학적 상태, 질환의 중증도, 투여 경로, 및 별도로 투여되는 약물과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다. 따라서, 투여 방법은 매우 다양하지만, 일반적으로 사용되는 방법에 따라 결정될 수 있다.
대상체에 투여되는 본 발명에 따른 조성물의 양은 투여 방법, 대상체의 건강 상태, 체중, 의사의 처방과 같은 많은 인자에 의하여 결정될 수 있으며, 이러한 모든 인자는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 갖는 지식의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 암항원 특이적 세포독성 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약 1 x 10 6 cells/mL 이상, 약 2 x 10 6 cells/mL 이상, 약 3 x 10 6 cells/mL 이상, 약 4 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 6 x 10 6 cells/mL 이상, 약 7 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 9 x 10 6 cells/mL 이상, 약 1 x 10 7 cells/mL 이상, 약 2 x 10 7 cells/mL 이상, 약 3 x 10 7 cells/mL 이상, 약 4 x 10 7 cells/mL 이상, 약 5 x 10 7 cells/mL 이상, 약 6 x 10 7 cells/mL 이상, 약 7 x 10 7 cells/mL 이상, 약 8 x 10 7 cells/mL 이상, 약 9 x 10 7 cells/mL 이상, 약 1 x 10 8 cells/mL 이상, 약 2 x 10 8 cells/mL 이상, 약 3 x 10 8 cells/mL 이상, 약 4 x 10 8 cells/mL 이상, 약 5 x 10 8 cells/mL 이상, 약 6 x 10 8 cells/mL 이상, 약 7 x 10 8 cells/mL 이상, 약 8 x 10 8 cells/mL 이상, 또는 약 9 x 10 8 cells/mL 이상의 세포를 포함하나, 통상의 기술자는 동일한 효과를 얻기 위하여 변형 가능한 범위 내에서 조성물 내의 세포독성 T 세포의 농도를 조절할 수 있을 것이다.
상기 암항원은 OY-TES-1, hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1, PSMA, TARP, Mesothelin, 타이로시나아제, GP100, MNRT-1, PAP, PSA, CMV, HCV, HBV, MC 폴리오마 바이러스, HPV 및 EBV로 구성된 군에서 선택된 적어도 어느 하나이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 암항원은 hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1 및 EBV로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 기재된 “조성물”은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 세포 독성 T 세포와 함께 천연 또는 인공의 담체, 라벨 또는 탐지제와 같은 불활성 성분 또는 애주번트, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지방성 용매, 보존제와 같은 활성 성분과의 조합을 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 담체는 또한 약학적 부형제 및 부가적인 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류; 이당류; 삼당류; 사당류; 올리고당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 설탕과 같은 설탕의 유도체, 폴리사카라이드, 또는 당 중합체 등)을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있으며, 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%로 포함할 수 있다. 단백질 부형제는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 완충 역할을 할 수 있는 대표적인 아미노산 성분은, 예를 들어, 알라닌, 알기닌, 글리신, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 루신, 아이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 탄수화물 부형제는 또한, 예를 들어, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스와 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스와 같은 이당류, 라피노스, 말토덱스트린, 텍스트란, 전분과 같은 다당류, 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨, 및 마이오이노시톨과 같은 알디톨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당업자에 의해 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 또는 그 외의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화할 수 있다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다.
주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다.
또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.
현탁액 및 유탁액은, 담체로서, 예를 들어, 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐알코올을 함유할 수 있다. 근육 내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은, 활성 화합물과 함께, 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 필요하다면 적합한 양의 리도카인 염산염을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 세포독성 T 세포를 포함하는 약학 조성물은 예를 들어, 정맥 주사 (bolus injection) 또는 연속 주입 (continuous infusion)으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상에 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 또는 적어도 5회에 걸쳐, 연속적으로, 또는 일정 시간 간격으로, 또는 임상적 판단에 의하여 결정된 시간 간격을 두고 투여될 수 있다. 주사제는 앰플형으로, 또는 복수회 투여 용기의 단위 용량형으로 제형화될 수 있다. 그러나 통상의 기술자는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적 의학적 상태 및 기존 치료 이력과 같은 다양한 인자들에 따라 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 서방형으로 제제화될 수 있고, 서방형 제제는 투여되는 세포독성 T 세포와 복합되거나 세포독성 T 세포를 함유할 수 있는 중합체를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체 적합성 중합체로서 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 또는 스테아르산 이량체 및 세바스산의 폴리무수 공중합체의 매트릭스를 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “암”은 비 정상적인, 제어되지 않는 세포 성장에 의해 야기되는 임의의 수 많은 질환 또는 질병을 의미한다. 암을 유발할 수 있는 세포를 암 세포라 하며, 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식과 같은 특성을 갖으며, 독특한 형태적 특성을 갖는다. 종종, 암 세포는 종양의 형태에 존재할 수 있으나, 이러한 세포는 포유류에서 단독으로 존재하거나 백혈병 세포와 같은 비-종양성 세포일 수 있다. 암은 임상적 또는 방사선 의학적인 방법에 의해 종양의 존재를 검출하거나, 생검 등과 같은 수단으로 수득한 종양 또는 다른 생물학적 시료로부터의 세포를 시험하거나, CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH, 및 NSE와 같은 암 혈액 표지를 측정하거나, TP53, 및 ATM와 같은 암 표지 유전자형을 검출함으로써 확인할 수 잇다. 그러나 상기의 방법에 따라 음성으로 판별되더라도 반드시 암이 아닌 것으로 진단되는 것은 아니다: 예를 들어, 암 완치 판정을 받은 대상체는 여전히 암을 가질 수 있으며, 재발의 형태로 확인된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “약”은 당해 기술 분야에서 통상적으로 관용되는 범위, 예를 들어, 평균의 2 표준 편차 내로 이해될 수 있다. “약”은 언급된 값의 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내로 이해될 수 있다.
본 발명에 기재된 “조성물”은 활성 성분으로서 본 발명에 따른 세포 독성 T 세포와 함께 천연 또는 인공의 담체, 라벨 또는 탐지제와 같은 불활성 성분 또는 애주번트, 희석제, 결합제, 안정화제, 완충제, 염, 친지방성 용매, 보존제와 같은 활성 성분과의 조합을 의미하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 담체는 또한 약학적 부형제 및 부가적인 단백질, 펩티드, 아미노산, 지질, 및 탄수화물 (예를 들어, 단당류; 이당류; 삼당류; 사당류; 올리고당류; 알디톨, 알돈산, 에스테르화된 설탕과 같은 설탕의 유도체, 폴리사카라이드, 또는 당 중합체 등)을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있으며, 1 내지 99.99 중량% 또는 부피%로 포함할 수 있다. 단백질 부형제는, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민, 젤라틴, 카제인 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 완충 역할을 할 수 있는 대표적인 아미노산 성분은, 예를 들어, 알라닌, 알기닌, 글리신, 베타인, 히스티딘, 글루탐산, 아스파르트산, 시스테인, 라이신, 루신, 아이소루신, 발린, 메티오닌, 페닐알라닌, 아스파탐 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 탄수화물 부형제는 또한, 예를 들어, 프룩토스, 말토스, 갈락토스, 글루코스, D-만노스, 솔보스와 같은 단당류; 락토스, 수크로스, 트레할로스, 셀로비오스와 같은 이당류, 라피노스, 말토덱스트린, 텍스트란, 전분과 같은 다당류, 및 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 소르비톨, 및 마이오이노시톨과 같은 알디톨을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당업자에 의해 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 또는 그 외의 약학적으로 허용되는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리 식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클(vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화할 수 있다. 상기 제제에 있어서 유효 성분량은 지시받은 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있도록 하는 것이다.
또한, 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 부형액을 이용해 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수가 있다. 주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리 식염수, 포도당이나 그 외의 보조약을 포함한 등장용액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화 나트륨을 들 수 있어 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리 알코올, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50으로 병용할 수 있다. 유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있어 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질 알코올과 병용할 수 있다.
주사제형의 예로서는 예를 들면, 정맥내 주사, 동맥내 주사, 선택적 동맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사, 뇌실내 주사, 뇌내 주사, 골수액강내 주사 등에 의해 투여할 수가 있지만, 바람직하게는 정맥내 주사이다.
본 발명의 조성물은 약제학적 유효량의 T 세포를 포함한다. 유효량의 결정은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 명세서에 개시된 내용을 기반으로 용이하게 결절될 수 있다. 일반적으로 약제학적 유효량은 유효 성분을 낮은 농도로 1차 투여한 후, 대상체에서 부작용이 없으면서도 요망되는 효과 (예를 들어, 암과 관련된 증상이 감소되거나 제거되는 것)를 얻을 때까지 점진적으로 증량시킴으로써 결정된다. 본 발명에 따른 조성물의 투여를 위한 적절한 투여량이나 투여 간격을 결정하는 방법은 예를 들어, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman et al., eds., 11th Edition, McGraw-Hill 2005, and Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th and 21st Editions, Gennaro and University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippencott Williams & Wilkins (2003 and 2005)에 설명되어 있다.
본 발명에 따른 조성물의 투여 방법은 암의 종류, 대상체의 나이, 체중, 성별, 의학적 상태, 질환의 중증도, 투여 경로, 및 별도로 투여되는 약물과 같은 다양한 인자를 고려하여 결정될 수 있다. 따라서, 투여 방법은 매우 다양하지만, 일반적으로 사용되는 방법에 따라 결정될 수 있다.
대상체에 투여되는 본 발명에 따른 조성물의 양은 투여 방법, 대상체의 건강 상태, 체중, 의사의 처방과 같은 많은 인자에 의하여 결정될 수 있으며, 이러한 모든 인자는 당해 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 갖는 지식의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 암항원 특이적 세포독성 T 세포를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약 1 x 10 6 cells/mL 이상, 약 2 x 10 6 cells/mL 이상, 약 3 x 10 6 cells/mL 이상, 약 4 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 6 x 10 6 cells/mL 이상, 약 7 x 10 6 cells/mL 이상, 약 8 x 10 6 cells/mL 이상, 약 9 x 10 6 cells/mL 이상, 약 1 x 10 7 cells/mL 이상, 약 2 x 10 7 cells/mL 이상, 약 3 x 10 7 cells/mL 이상, 약 4 x 10 7 cells/mL 이상, 약 5 x 10 7 cells/mL 이상, 약 6 x 10 7 cells/mL 이상, 약 7 x 10 7 cells/mL 이상, 약 8 x 10 7 cells/mL 이상, 약 9 x 10 7 cells/mL 이상, 약 1 x 10 8 cells/mL 이상, 약 2 x 10 8 cells/mL 이상, 약 3 x 10 8 cells/mL 이상, 약 4 x 10 8 cells/mL 이상, 약 5 x 10 8 cells/mL 이상, 약 6 x 10 8 cells/mL 이상, 약 7 x 10 8 cells/mL 이상, 약 8 x 10 8 cells/mL 이상, 또는 약 9 x 10 8 cells/mL 이상의 세포를 포함하나, 통상의 기술자는 동일한 효과를 얻기 위하여 변형 가능한 범위 내에서 조성물 내의 세포독성 T 세포의 농도를 조절할 수 있을 것이다.
또한, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질 알코올, 페놀, 산화 방지제와 배합할 수 있다. 조제된 주사액은 통상, 적당한 앰플에 충전시킨다.
현탁액 및 유탁액은, 담체로서, 예를 들어, 천연 검, 한천, 알긴산 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 또는 폴리비닐알코올을 함유할 수 있다. 근육 내 주사를 위한 현탁액 또는 용액은, 활성 화합물과 함께, 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 멸균수, 올리브 오일, 에틸 올레에이트, 글리콜, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 및 필요하다면 적합한 양의 리도카인 염산염을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 세포독성 T 세포를 포함하는 약학 조성물은 예를 들어, 정맥 주사 (bolus injection) 또는 연속 주입 (continuous infusion)으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 약학 조성물은 1시간 이상, 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 1일 이상, 2일 이상, 3일 이상, 4일 이상, 5일 이상, 6일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 3주 이상, 4주 이상, 1개월 이상, 3개월 이상, 6개월 이상에 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 또는 적어도 5회에 걸쳐, 연속적으로, 또는 일정 시간 간격으로, 또는 임상적 판단에 의하여 결정된 시간 간격을 두고 투여될 수 있다. 주사제는 앰플형으로, 또는 복수회 투여 용기의 단위 용량형으로 제형화될 수 있다. 그러나 통상의 기술자는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 대상체의 나이, 체중, 키, 성별, 일반적 의학적 상태 및 기존 치료 이력과 같은 다양한 인자들에 따라 변경될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 서방형으로 제제화될 수 있고, 서방형 제제는 투여되는 세포독성 T 세포와 복합되거나 세포독성 T 세포를 함유할 수 있는 중합체를 사용함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 생체 적합성 중합체로서 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스 또는 스테아르산 이량체 및 세바스산의 폴리무수 공중합체의 매트릭스를 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 “암”은 비 정상적인, 제어되지 않는 세포 성장에 의해 야기되는 임의의 수 많은 질환 또는 질병을 의미한다. 암을 유발할 수 있는 세포를 암 세포라 하며, 제어되지 않은 증식, 불멸성, 전이 가능성, 빠른 성장 및 증식과 같은 특성을 갖으며, 독특한 형태적 특성을 갖는다. 종종, 암 세포는 종양의 형태에 존재할 수 있으나, 이러한 세포는 포유류에서 단독으로 존재하거나 백혈병 세포와 같은 비-종양성 세포일 수 있다. 암은 임상적 또는 방사선 의학적인 방법에 의해 종양의 존재를 검출하거나, 생검 등과 같은 수단으로 수득한 종양 또는 다른 생물학적 시료로부터의 세포를 시험하거나, CA125, PAP, PSA, CEA, AFP, HCG, CA 19-9, CA 15-3, CA 27-29, LDH, 및 NSE와 같은 암 혈액 표지를 측정하거나, TP53, 및 ATM와 같은 암 표지 유전자형을 검출함으로써 확인할 수 잇다. 그러나 상기의 방법에 따라 음성으로 판별되더라도 반드시 암이 아닌 것으로 진단되는 것은 아니다: 예를 들어, 암 완치 판정을 받은 대상체는 여전히 암을 가질 수 있으며, 재발의 형태로 확인된다.
본 발명에서 확인시험은, 바람직하게는 유럽약전 2.7.24 Flow cytometry (유세포 분석법)에 따라서 시험하며, CD8+ T 세포가 65 % 이상 확인되어야 하고 CD8+ T 세포 중 CD45RO 마커가 80 % 이상 확인된 것으로 정한다.
본 발명에서 순도시험은 바람직하게는 유럽약전 2.7.24 Flow cytometry (유세포 분석법)에 따라서 시험하며, CD8+ T 세포 중 CD45RA 의 비율은 20 % 이하, CD57 는 35 % 이하, PD-1은 20 % 이하 로 정한다.
본 발명에서 세포기능시험 또는 역가시험은 바람직하게는 유럽약전 2.7.24 Flow cytometry (유세포 분석법)에 따라서 시험하며, CD8+ T 세포 내 IFN-γ발현율이 10 % 이상 또는 유럽약전 2.7.24 Flow cytometry (유세포 분석법)에 따라서 시험하며, CD8+ T 세포 내 LAMP1 발현율이 10 % 이상으로 정한다.
본 발명에서 세포생존율시험은 바람직하게는 유럽약전 2.7.29. Nucleated cell count and viability 중 Manual Dye-exclusion method 에 따라서 시험하며 살아있는 세포의 비율은 70 % 이상으로 정한다.
본 발명에서 총세포수 측정시험은 바람직하게는 유럽약전 2.7.29. Nucleated cell count and viability (Manual Dye-exclusion method) 에 따라서 시험하며 100mL 완제품 내 세포수는 1.4 x 10 9 cells/100 mL ± 20 % (1.12 ~ 1.68 x 109 cells/100 mL) 으로 정한다.
본 발명에서 품질검사는 바람직하게는 세포치료제 원료의약품 및 완제의약품의 기준 및 시험방법에서 정하는 시험으로 정할 수 있으나, 반드시 관련 규정 또는 가이드라인에 의할 것은 아니다.
본 발명에서 용어, “항암”이란 “예방” 및 “치료”를 포함하며, 여기서 "예방"이란 본 발명의 항체를 포함하는 조성물 투여에 의해 암이 억제되거나 지연되는 모든 행위을 의미하고, "치료"란 본 발명의 항체 투여에 의해 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 이들 실시예로 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 본원의 방법에 따른 EBV 특이적 CD8+ T세포치료제의 시험제조 (20일 공정)
1-1. EBV 특이적 CD8+ T 세포의 증식
EBV 양성 정상인 혈액으로부터 PBMC를 다음과 같이 분리하였다. 5 mL 피콜 (GE Healthcare, Ficoll paque plus, 17144002)이 채워진 15 mL 튜브에 10 mL 혈액을 천천히 흘려보내 피콜 용액 상층에 오버레이 하였다. 튜브를 상온 800 x g에서 20 분간 원심분리 하였으며 (브레이크 속도:0), 피콜과 혈장 사이에 위치한 흰색의 세포층만을 수거하여 세척한 후 PBMC로 사용하였다. Autoplasma (자가혈장)는 PBMC 위층에 있는 밝은 노란색 층에서 분리되었으며, 필터를 이용하여 여과한 후 사용하였다.
분리된 PBMC를 3% 자가혈장이 포함된 CTL 배지 (WELGENE, LM011-77)에 1 x 10 6 cell/mL로 세포를 현탁하고, EBV 펩타이드 (Peptron)를 2 μg/mL 농도가 되도록 첨가하였다. 세포 현탁액을 14 mL round tube에 1 mL씩 분주하여 CO 2 인큐베이터 (Nuaire, NU-5841)에서 배양을 시작하였다.
배양 이틀째 100 IU/ml IL-2 (Novartis, Proleukin) 와 3% 자가혈장이 포함된 CTL 배지를 각 튜브에 1 mL씩 첨가하였다. 그리고 배양 7일째 1 mL 상층배지를 제거한 후, 새로 만든 100 IU/ml IL-2 와 3% 자가혈장이 포함된 CTL 배지를 1 mL씩 첨가하여 2일 동안 추가 배양하였다
1-2. EBV 특이적 CD8+ T 세포의 선택적 분리
배양 9일째, 배양 중인 PBMC를 수거하여 RPMI 배지 (WELGENE, LM011-01)에 세척하였다. 세척된 PBMC를 항 4-1BB 항체 (Biolegend, 309818)와 항 CD8 항체 (Biolegend, 560347)로 4℃에서 30 분간 염색 후, 다시 RPMI 배지로 세척하였다. 염색 후 세척된 PBMC를 유세포분리분석기 (BD Biosciences, FACSMelody)를 이용해서 4-1BB와 CD8을 발현하는 세포를 선택적으로 분리하였다. 선택적으로 분리된 세포는 RPMI 배지로 세척하고, 자동세포계수기 (Logos Biosystems, LUNA-FL)로 세포를 계수하였다. 분리된 세포는 ALyS505N 배지 (CELL SCIENCE&TECHNOLOYG INSTITUTE INC., 1020P10)를 이용하여 세포를 현탁 한 후 다음 단계를 진행하였다.
1-3. 항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량배양
정상 공여자 혈액을 방사선 조사하여 세포의 사멸을 유도하고, PBMC를 분리하여 1 x 10 7 cells/mL로 현탁 후 냉동하여 보관한다. 방사선이 조사된 PBMC (allogenic PBMC)는 T 세포의 증식 유도에 필요한 공동자극을 제공할 수 있는 배양 첨가물로 사용한다. 이때 분리한 alloplasma는 PBMC 위층에 있는 밝은 노란색 층에서 분리되었으며, 필터를 이용하여 여과한 후 사용하였다.
50 mL 튜브에 선택적으로 분리된 EBV 펩타이드에 특이적 CD8 + T 세포와 방사선 조사된 allogenic PBMC를 분리된 세포 수의 200배만큼 수를 준비해서 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 30 mL에 현탁 하였다. 여기에 1,000 IU/mL IL-2와 항 CD3 항체 (BD biosciences, 555336) 30 ng/mL을 첨가하였다. 이어 30 mL의 세포 현탁액을 75T 플라스크에 넣고 CO 2 인큐베이터에서 배양을 시작하였다.
배양 3일째 1,000 IU/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 20 mL을 75T 플라스크에 추가로 넣어준다. 배양 5일째부터 11일째가 되는 날까지 2~3일 간격으로, 1,000 IU/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지를 동량만큼 추가로 넣어준다. 배양 11일째, 모든 배양중인 세포를 수거하였다.
실시예 2: 본원의 방법에 따른 EBV 특이적 CD8+ T세포치료제의 시험제조 (26일 공정)
2-1. EBV 특이적 CD8+ T 세포의 증식
실시예 1의 1-1 과정을 동일하게 수행하였다.
2-2. EBV 특이적 CD8+ T 세포의 선택적 분리
배양 14일째, 배양 중인 PBMC를 수거하여 RPMI 배지에 세척하였다. 세척된 PBMC를 자동세포계수기로 계수하고, 세포를 2 x 10 6 cell/mL씩 배양할 수 있도록 CTL 배지에 현탁 하였다. 세포를 현탁한 CTL 배지에 3% 자가혈장(autoplasma)과 100 IU/mL IL-2를 넣어준 후, 24웰 플레이트의 칸마다 2 x 10 6 만큼의 세포가 1 mL씩 들어가도록 현탁 한 세포를 넣어주었다. 배양 첫째 날 첨가했던 EBV 펩티드 들을 2 μg/mL 농도가 되도록 첨가하고, CO 2 인큐베이터에서 배양하였다.
배양 15일째, 배양 중인 PBMC를 수거하여 RPMI 배지에 세척하였다. 세척된 PBMC를 항 4-1BB 항체 와 항 CD8 항체로 4℃에서 30분간 염색 후, 다시 RPMI 배지로 세척하였다. 염색 후 세척된 PBMC를 자동세포분리기를 이용해서 4-1BB와 CD8을 발현하는 세포를 선택적으로 분리하였다. 선택적으로 분리된 세포를 RPMI 배지로 세척하고, 자동세포계수기로 세포를 계수하였다. 분리된 세포는 ALyS505N 배지를 이용하여 세포를 현탁 한 후 다음 단계를 진행하였다.
2-3. 항원 특이적 CD8+ T 세포의 대량배양
정상 공여자 혈액을 방사선 조사하여 세포의 사멸을 유도하고, PBMC를 분리하여 1 x 10 7 cell/mL로 현탁 후 냉동하여 보관하였다. 방사선이 조사된 PBMC (allogenic PBMC)는 T 세포의 증식 유도에 필요한 공동자극을 제공할 수 있는 배양 첨가물로 사용하였다. 이때 분리한 alloplasma는 PBMC 위층에 있는 밝은 노란색 층에서 분리되었으며, 필터를 이용하여 여과한 후 사용하였다.
50 mL 튜브에 선택적으로 분리된 EBV 펩타이드에 특이적 CD8 + T 세포와 방사선 조사된 allogenic PBMC를 분리된 세포 수의 200배만큼 수를 준비해서 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 30ml에 현탁 하였다. 여기에 1,000 IU/ml IL-2와 항 CD3 항체 30 ng/ml을 첨가하였다. 이어 30 mL의 세포 현탁액을 75T flask에 넣고 CO 2 인큐베이터에서 배양을 시작하였다.
배양 3일째 1,000 IU/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 20ml을 75T flask에 추가로 넣어주었다. 배양 5일째부터 11일째가 되는 날까지 2~3일 간격으로, 1,000 IU/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지를 동량만큼 추가로 넣어주었다. 배양 11일째, 모든 배양중인 세포를 수거하였다.
상기와 같이, 26일 공정으로 생산된 항원 특이적 CD8 + T세포에 대하여 확인 및 순도를 확인하기 위한 시험을 진행한 결과, 표 1에 제시된 기준을 모두 만족하는 것을 확인하였다.
시험항목 시험기준 기존 생산 공정(항 4-1BB 항체가 코팅된 plate를 이용) 신규 생산 공정(자동세포 분리기 이용)
총세포수측정시험 7.0 x 10 6 cell/ml ± 10%100ml/infusion bag 6.7 x 10 6 cell/ml,200ml, 2 bags 6.9 x 10 6 cell/ml,200ml, 2 bags
세포생존율시험 ≥ 70% ~ 92.3% ~ 95.0%
확인시험 CD8 T ≥ 65% 65.0% ~ 85.0% ~ 95.0%
CD45RA CD8 T 세포 중 ≤ 20 % ~ 13.3% ~1.7%
CD45RO CD8 T 세포 중 ≥ 80% ~98.5% ~99.7%
순도시험 CD57 CD8 T 세포 중 ≤ 35% ~19.5% ~16.8%
PD-1 CD8 T 세포 중 ≤ 20% ~2.3% ~2.1%
anti-CD3 mAb 음성 음성 음성
세포기능시험 IFN-γ production CD8 T 세포 중 ≥ 10% ~ 54.4% ~43%
LAMP1 expression CD8 T 세포 중 ≥ 10% ~83.2% ~65%
품질검사 무균시험 음성 - -
앤도톡신시험 ≤ 1.0 EU/ml - -
마이코플라즈마시험 음성 - -
외래성바이러스부정시험 음성 - -
또한 역가시험을 진행한 결과 아래 표에 나온 것처럼 표 1의 역가시험 기준을 충족하는 것을 확인하였다.
실시예 3: 20일 공정 중 15일째의 반제품 세포 동결
전체 공정 중 15일 째에 대량 배양 중이던 세포의 절반을 수거한 후, RPMI 배지에 세척하고 자동세포계수기로 계수하였다. 세포를 상온 1,800 rpm에서 5분간 원심분리해서 상층액은 제거하고 5 x 10 5 cell/mL 세포로 나눠 동결할 수 있도록 CS-5 동결 배지 (Biolife solution, 205102)에 세포를 현탁 하였다. 5 x 10 5 cell/mL로 세포 동결 튜브에 담아진 세포는 세포 동결 컨테이너(Biocision, BCS-170)에 넣고 -80℃초저온 냉동고 (deep freezer) (ThermoFisher, IU28886D) 에 하루 동안 넣어두었다. 하루 동안 동결된 세포는 다시 꺼내어 -196℃액체질소 탱크 (Chart, 10650197)에 사용기한까지 보관하였다.
실시예 4: 20일 공정 완제품의 세포동결
배양 마지막날, 모든 배양중인 세포를 수거하여 RPMI 배지에 세척하고 자동세포계수기로 계수하였다. 2 x 10 7 세포는 덜어서 T 세포 치료제의 품질 검사를 위해 표현형 분석과 효능 시험에 사용하였다. 남은 세포들은 CS-5 동결 배지 5 mL에 현탁 하고 자동세포계수기로 계수해서 3 x 10 7 cell/mL 과 5 x 10 6 cells/mL 세포로 나눠 동결할 수 있도록 50 mL 튜브에 나눠 담았다. 3 x 10 7 cell/mL 과 5 x 10 6 cells/mL로 세포 동결 튜브에 담아진 세포는 세포 동결 컨테이너에 넣고 -80℃초저온 냉동고에 하루 동안 넣어두었다. 하루 동안 동결된 세포는 다시 꺼내서 -196℃액체질소 탱크에 사용기한까지 보관하였다.
실시예 5: 26일 공정 완제품의 세포동결
배양 마지막날, 모든 배양중인 세포를 수거하여 RPMI 배지에 세척하고 자동세포계수기로 계수하였다. 2 x 10 7 세포는 덜어서 T 세포 치료제의 품질 검사를 위해 표현형 분석과 효능 시험에 사용하였다. 남은 세포들은 CS-5 동결 배지 5 mL에 현탁 하고 자동세포계수기로 계수해서 3 x 10 7 cell/mL 과 5 x 10 6 cells/mL 세포로 나눠 동결할 수 있도록 50 mL 튜브에 나눠 담았다. 3 x 10 7 cell/mL 과 5 x 10 6 cells/mL로 세포 동결 튜브에 담아진 세포는 세포 동결 컨테이너에 넣고 -80℃초저온 냉동고에 하루 동안 넣어두었다. 하루 동안 동결된 세포는 다시 꺼내서 -196℃액체질소 탱크에 사용기한까지 보관하였다.
실시예 6: 동결 세포의 해동
6-1. 20일 공정으로 제조된 T세포치료제의 동결 후 해동
-196℃액체질소 탱크에 보관중인 세포를 꺼내서 37℃항온수조(WB-2, ㈜대한과학, DH.WB000122)에 2분 30초에서 3분 동안 담궈서 세포를 해동하였다. 해동된 세포를 15 mL 튜브에 옮기고 자동세포계수기를 이용해서 계수하고 해동된 세포의 세포수와 생존율을 확인하였다. 해동한 세포위에 따듯한 RPMI 배지 10 mL을 천천히 오버레이 하였다. 튜브를 상온 1,800 rpm에서 5 분간 원심분리해서 상층액은 제거하고 세포를 ALys505N 배지 1 mL에 현탁 하였다. 1 mL에 현탁한 세포의 수와 생존율을 다시 자동세포계수기를 이용해서 계수하고 필요한 만큼의 세포를 사용하였다.
상기의 실시예 1과정을 수행하고 실시예 4 과정을 이용하여 동결한 세포를 2, 4, 8, 12주 후에 상기와 같이 해동을 수행하여 회수율 및 생존율을 측정하였으며, 추가로 확인, 순도, 역가 시험을 진행하였다.
20일 완제품의 해동 결과는 아래 표 2와 같이 64% 이상의 회수율을 확인할 수 있었으며, 생존율의 경우 가장 낮을 경우 약 77.0%인 것을 확인할 수 있다.
동결 기간 회수율 (%) 생존율 (%)
2주 75 ± 10 87 ± 5
4주 72 ± 10 83 ± 5
8주 66 ± 10 81 ± 5
12주 64 ± 10 77 ± 5
또한 확인 및 순도 시험 결과는 아래 표 3과 같이 모두 자체 기준을 통과하는 것을 확인할 수 있었다.
동결 기간 CD8 (%)( ≥ 80%) CD57 : CD8 (%)( ≤ 35%) PD-1 : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RA : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RO : CD8 (%)( ≥ 80%)
0주 96.65 11.21 5.36 3.45 86.00
1주 96.08 9.40 3.80 0.74 92.97
2주 95.40 10.95 4.88 0.93 88.18
3주 90.60 12.49 6.65 0.93 86.66
4주 98.91 10.04 2.49 0.73 93.95
8주 99.5 11.02 3.45 1.22 94.83
12주 98.83 12.61 11.23 1.21 96.65
위 실험에 추가로 역가 시험을 수행한 결과도 모두 자체 기준을 통과하는 것을 확인하였다 (표 4).
동결 기간 LAMP-1 (%)( ≥ 10%) IFN-g (%)( ≥ 10%)
0주 15.15 16.33
1주 12.34 15.08
2주 23.22 23.24
3주 18.07 20.42
4주 22.26 34.75
8주 28.62 15.75
12주 19.28 14.86
6-2. 26일 공정으로 제조된 T세포치료제의 동결 후 해동
상기 실시예 2 과정을 수행하고 실시예 5 과정을 이용하여 동결된 세포를 2주 및 4주 후에 상기 실시예 6의 과정을 수행 해여 회수율 및 생존율을 측정하였으며, 추가로 확인, 순도, 역가 시험을 진행하였다.
26일 완제품의 해동 결과는 아래 표 5와 같이 80%의 회수율을 확인할 수 있었으며, 생존율의 경우 91% 이상인 것을 확인하였다.
동결기간 회수율 (%) 생존율 (%)
2주 80 ± 10 91 ± 10
4주 80 ± 10 91 ± 10
또한 확인 및 순도 시험 결과 아래 표 6과 같이 자체 기준을 통과하는 것을 확인하였다.
동결 기간 CD8 (%)( ≥ 80%) CD57 : CD8 (%)( ≤ 35%) PD-1 : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RA : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RO : CD8 (%)( ≥ 80%)
0주 97.47 4.60 6.97 1.03 98.49
2주 98.4 5.9 15.3 0.6 92.2
4주 98.5 7.4 8.4 0.8 98.5
역가 시험 결과도 아래 표 7과 같이 자체 기준을 통과하는 것을 확인하였다.
동결 기간 LAMP-1 (%)( ≥ 10%) IFN-g (%)( ≥ 10%)
0주 22.28 24.19
2주 15.7 21
4주 15.3 24
실시예 7: 동결 세포를 이용한 대량 배양 공정
정상 공여자 혈액을 방사선 조사하여 세포의 사멸을 유도하고, PBMC를 분리하여 1 x 10 7 cells/mL로 현탁 후 냉동하여 보관하였다. 방사선이 조사된 PBMC (allogenic PBMC)는 T 세포의 증식 유도에 필요한 공동자극을 제공할 수 있는 배양 첨가물로 사용하였다.
상기 실시예 6의 동결된 세포의 해동 방법에 따라 세포를 해동하고 세포를 계수해서 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 30 mL에 현탁 하였다. 여기에 방사선 조사된 allogenic PBMC를 해동한 세포의 200배만큼의 세포를 첨가하고, 1,000 IU/mL IL-2와 항 CD3 항체 30 ng/mL을 첨가하였다. 모든 첨가물이 첨가된 세포는 75T 플라스크에 옮겨서 CO 2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 3일째, 1,000 IU/mL IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 20 mL을 75T 플라스크에 추가로 넣어주었다. 배양 5일째, 1,000 IU/mL IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 50ml을 75T 플라스크에 추가로 넣어주었다. 배양 7일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 100ml을 만들고 배양중이던 세포와 함께 175T 플라스크로 옮겨서 배양하였다. 배양 9일째, 1,000 U/ml IL-2, 3% alloplasma가 포함된 ALys505N 배지 200 mL을 첨가하고, 175T 플라스크 2개에 나눠서 배양하였다. 배양 11일째, 모든 배양중인 세포를 수거하였다.
상기 실시예 3의 과정 수행 후 1, 2, 3개월 후에 실시예 7의 과정을 수행한 결과 아래 표 8과 같이 대량배양 후에 세포 생존율은 92% 이상인 것을 확인할 수 있었으며, 세포의 증식도 4800 배 이상 이루어지는 것을 볼 수 있었다.
동결 기간 대량 배양된 세포 생존율 (%)≥ 70% 대량 배양에 의한 총 세포 증가 배수≥ 4000 fold
1 개월 99 12000
2 개월 93 7000
3 개월 92 4800
또한 확인 및 순도 시험 결과 아래 표 9와 같이 모두 자체 기준을 통과하였다.
동결 기간 CD8 (%)( ≥ 80%) CD57 : CD8 (%)( ≤ 35%) PD-1 : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RA : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RO : CD8 (%)( ≥ 80%)
1 개월 95.72 16.94 1.77 1.75 99.05
2 개월 90.81 8.32 1.10 0.63 98.24
3 개월 95.57 15.30 0.45 2.91 98.40
여기에 추가로 역가 시험을 수행한 결과도 아래 표 10과 같이 모두 자체 기준을 통과하였다.
동결 기간 LAMP-1 : CD8 (%)( ≥ 10%) IFN-g : CD8 (%)( ≥ 10%)
1 개월 40.81 21.94
2 개월 19.77 15.68
3 개월 14.18 17.70
상기 실시예 4의 과정 수행 후 4, 8, 12주 후에 실시예 7의 과정을 수행한 결과 아래 표와 같이 대량배양 후에 세포 생존율은 89% 이상인 것을 확인할 수 있었으며, 세포의 증식도 175 배 이상 이루어지는 것을 볼 수 있었다.
동결 기간 생존율 (%) 세포 증가 배수
4주 89.1 175.4
8주 96.27 1291
12주 93.52 988
또한 확인 및 순도 시험 결과 아래 표 12와 같이 모두 자체 기준을 통과하였다.
동결 기간 CD8 (%)( ≥ 80%) CD57 : CD8 (%)( ≤ 35%) PD-1 : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RA : CD8 (%)( ≤ 20%) CD45RO : CD8 (%)( ≥ 80%)
4주 94.92 2.57 1.21 2.13 94.67
8주 98.76 1.90 1.32 0.47 99.57
12주 95.29 2.67 4.83 4.10 99.55
여기에 추가로 역가 시험을 수행한 결과도 아래 표 13과 같이 모두 자체 기준을 통과하였다.
동결 기간 LAMP-1 (%)( ≥ 10%) IFN-g (%)( ≥ 10%)
4주 22.11 41.28
8주 20.43 21.51
12주 26.29 30.00
예를 들어, 청구항 구성 목적을 위해, 이하 기재되는 청구항은 어떤 식으로든 이의 문자 그대로의 언어보다 좁게 해석되어선 안 되고, 따라서 명세서로부터의 예시적 구현예가 청구항으로 읽혀서는 안 된다. 따라서, 본 발명은 예시로서 기재되었고, 청구항의 범위에 대한 제한이 아님이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구항에 의해서만 제한된다. 본 출원에 인용된 모든 간행물, 발행된 특허, 특허 출원, 서적 및 저널 논문은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 각각 포함된다.

Claims (15)

  1. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 암항원은 hTERT, NY-ESO1, MAGE-A3, WT1 및 EBV로 구성된 군에서 선택된 적어도 어느 하나인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 외부 환경으로부터 폐쇄된 (closed-system) 유세포분석기를 사용하여 수행되는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 수가 mL당 소정의 세포 수 이상일 때 동결시키는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 CD8 + T 세포의 수가 mL당 소정의 세포 수 이상이고, 상기 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율이 소정의 비율 이상일 때 동결시키는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 CD8 + T 세포의 수 및 상기 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포의 비율을 검지하는 단계를 포함하는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  8. 청구항 2에 있어서, 상기 (e) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 (f) 단계를 더 포함하는 것인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 공동 자극 인자는 CD28, CTLA-4, ICOS, PD1, BTLA, HVEM, CD27, OX40, 4-1BB, CD30, 및 SLAM로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 암항원 특이적 CD8 + T 세포 제조 방법.
  10. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하는, 암 치료용 조성물의 제조 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암 치료용 조성물의 제조 방법.
  12. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하여 제조된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 암 치료용 조성물.
  13. 청구항 12에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 더 포함하는, 암 치료용 조성물.
  14. (a) 암항원 특이적 CD8 + T 세포가 포함된 PBMC 중 상기 CD8 + T 세포를 활성화시켜 상기 CD8 + T 세포의 공동 자극 인자(co-stimulatory factor)를 발현시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 활성화된 세포들 중 공동 자극 인자가 발현된 CD8 + T 세포를 선별하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 CD8 + T 세포의 수를 증가시키는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계에서 수득된 CD8 + T 세포를 동결시키는 단계를 포함하여 제조된 암항원 특이적 CD8 + T 세포를 포함하는 암 치료용 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, (e) 상기 (d) 단계에서 동결된 CD8 + T 세포를 해동하는 단계를 포함하는, 암 치료 방법.
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