KR20110025812A - 세포독성 효과인자의 프라이밍을 차단하고 조절성 ｃｄ8+ ｔ 세포의 생성을 유도하는 항-ｃｄ8 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 대상체에게 동종이계 항원에 대해 CD8+ T 세포 면역 내성을 유도하기에 충분한 유효량의 항-CD8 항체를 제공함을 포함하여, 내성을 유도하는 것이 요구되는 대상체에서 내성을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
Description
본 발명은 일반적으로 조절성 T 세포, 및 보다 특히, 항-CD8 항체를 제조하여 사용하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명의 영역을 제한하지 않으면서, 본 발명의 배경은 면역 세포 내성과 관련하여 기술되어 있다. 라이헤르트(Reichert) 등에게 허여된 미국 특허 제5,593,677호는 이식체 대 숙주병의 예방 방법을 교시하고 있다. 당해 방법은 항-CD8 모노클로날 항체 및 CD4+ 세포 불활성인자의 조합 사용을 통한 사람에서 이식체 대 숙주병의 치료 및 예방을 포함한다. 동종이계(allogeneic) 공여자의 골수가 HLA 적합성에 있어서 환자와 일치하는, 골수 이식한 환자에서 GVHD의 방지 또는 이에 대한 예방 방법은 공여자의 골수를 T 세포독성/억제인자 세포를 1% 미만으로 고갈시키기에 충분한 양의 하나 이상의 항-CD8 모노클로날 항체 및 보체로 처리하는 단계, 처리된 골수를 환자에게 이식시키는 단계, 및 환자에게 CD4+ 세포를 불활성화시키기에 충분한 유효량의 사이클로스포린 A를 투여하는 단계를 포함한다.
타이코킨스키(Tykocinski) 등에게 허여된 미국 특허 제5,601,828호는 CD8 유도체 및 세포 조절 및 세포 이식과정(engraftment)의 증진을 위한 사용 방법에 관한 것이다. 특이적이고 비특이적인 면역조절, 세포 이식과정의 증진, 및 비면역 세포의 조절은 각종의 막-결합 및 가용성 CD8 조성물을 사용함으로써 달성된다. 당해 특허에서, 동종항원 또는 MHC-관련 항원에 대해 지시된 T-세포 증식 또는 세포 독성을 특이적으로 감소시키는 방법은, 이의 표면내에 또는 이의 표면 상에, CD8 및 동종항원 또는 MHC-관련 항원의 세포외 도메인 부위를 발현하는 비-천연적으로 존재하는 막을 제공하는 단계(여기서, 적어도 면역글로불린 V 동족체 도메인을 포함하는 CD8의 세포외 도메인 부위는 세포 표면 분자와 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합하는 분자에 공유 결합되어 있다), 및 당해 막을 동종항원 또는 MHC-관련 항원에 반응할 수 있는 T-세포에, 동종항원 또는 MHC-관련 항원에 대한 T-세포의 특이적인 세포 면역 반응을 감소시키기에 충분한 시간 동안 및 조건하에 노출시키는 단계를 포함한다.
사츠(Sachs)에게 허여된 미국 특허 제5,876,708호는 동종이계 및 이종발생 골수이식 및 수용체에게 짧은 과정의 보조 완화 치료(help reducing treatment)를 투여하거나 짧은 과정을 투여함을 포함하여 내성을 유도하는 방법 및 짧은 과정의 면역억제제를 투여함으로써 이식체의 허용성(acceptance)을 연장시키는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 제1 종의 수용체 영장류내로 제2 종의 포유동물의 조혈 줄기 세포를 도입시키고; 수용체내에서 이식체를 이식하고; 수용체의 T 세포를 불활성화시키며, 수용체에게 짧은 과정의 면역억제제를 투여함으로써 이식체에 대해 내성을 유도시킴에 의해, 제2 종의 포유동물로부터 수득한 이식체에 대해 제1 종의 수용체 영장류에서 내성을 유도함을 포함하며, 여기서, 면역억제제는 항-T 세포 항체가 아니며 짧은 과정은 120일 이하이다.
사츠에게 또한 허여된 미국 특허 제6,911,220호는 동종이계 및 이종발생 이식에 관한 것이다. 당해 발명은 면역적격을 복원하거나 유도하는 방법을 제공하며, 당해 방법은 공여자 흉선 조직을 수용체내로 도입시키는 단계를 포함한다. 당해 발명은 또한 공여자 흉선 조직을 수용체내로 도입시킴을 포함하여, 수용체에서 내성을 유도하는 방법을 제공한다. 당해 발명은 또한 수용체에게 짧은 과정의 보조 완화 치료를 투여하거나 짧은 과정을 투여함을 포함하여 내성을 유도하는 방법 및 짧은 과정의 면역억제제를 투여함으로써 이식체의 허용성을 연장시키는 방법을 제공한다.
부쉘(Bushell) 등에 의해 출원된 미국 특허원 제20070166307호는 이식 거부의 제어에 관한 것이다. 요약하면, CD4, CD8, CD154, LFA-1, CD80, CD86 및 ICAM-1으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포 표면 항원에서 지시된 항체, 바람직하게는, 항-CD4 항체를 조절성 T-림프구의 집단을 동물에서 생성시키기 위한 비-세포성 단백질 항원과 함께 투여하고; 동물에게 비-세포성 단백질 항원을 추가로 투여함으로써 조절성 T-림프구의 집단을 재활성화시키며; 기관 또는 조직을 이식시킴에 의해 동물에서 이식 거부를 제어하는 한편, 조절성 T-림프구의 집단은 활성화시키는 것이 교시되어 있다. 조절성 T 세포는 T 세포를 CD4, CD8, CD154, LFA-1, CD80, CD86 및 ICAM-1으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세포 표면 항원에서 지시된 항체와 함께, 동종항원 또는 비-세포성 단백질 항원을 발현하는 세포의 존재하에 배양함으로써 생성시킬 수 있다. 생체외에서 생성된 T-림프구는 이식 거부를 극복하는 대체 방법으로서 또는 생체내 방법과 함께 사용될 수 있다. 유사한 시도를 자가면역 상태의 치료를 위해 채택할 수 있다.
퀴(Qi) 등에 의해 출원된 미국 특허원 제20050042217호는 동종이식거부의 특이적인 억제에 관한 것이다. 당해 특허원의 명세서는 동종항원에 대한 세포성 및 체액성 면역 반응 둘다를 특이적으로 억제함으로써 이식된 동종이식체의 생존을 연장시키는데 있어서의 용도를 발견하여 이식된 수용체에서 이식체 대 숙주병을 치료하는 방법 및 조성물을 제공한다. 당해 방법은 항원을 발현하는 표적 세포를 CD8α-쇄를 가진 CD8 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터와 접촉시킴으로써 표적 세포-특이적인 항원에 대한 숙주 면역 반응을 억제하는 것을 교시하고 있으며, 여기서, CD8 폴리펩타이드는 표적 세포에 의해 발현됨으로써 표적 세포에 대한 숙주 면역 반응이 특이적으로 억제된다. 즉, 표적 세포상에서 CD8의 증가는 면역 반응을 특이적으로 억제한다.
본 발명은 면역 내성이 요구되는 대상체에서 면역 내성을 유도하기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 당해 조성물 및 방법은 항원에 대한 CD8+ T 세포 면역 내성을 유도하는데 충분한 유효량의 항-CD8 항체를 대상체에게 제공함으로써 상기 대상체에서 면역 내성을 유도하는데 사용될 수 있다. 하나의 측면에서, 항-CD8 항체는 사람화되어 있다. 다른 측면에서, 항-CD8 항체는 비-고갈성(non-depleting)이다. 당해 방법은 또한 하나 이상의 다음 표현형을 측정하거나 확인함에 의해 결정된 것으로서 억제인자 T 세포의 생성을 포함할 수 있다: 그랜자임(granzyme) A에 있어서의 감소, 그랜자임 B에 있어서의 감소, 퍼포린(perforin)의 감소, 감소된 양의 IL-2, IFN-γ 또는 이들 둘다의 분비, IL-10의 분비 또는 이들의 조합. 하나의 측면에서, 억제인자 T 세포의 생성은 IL-10을 분비하는 억제인자 T 세포의 증식이다. 다른 측면에서, 항-CD8 항체는 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8 및 OKT8로부터 선택된다. 하나의 예에서, 항원은 동종이계이다.
다른 양태에서, 분리된 CD8+ T 세포를, 그랜자임 A에 있어서의 감소, 그랜자임 B에 있어서의 감소, 퍼포린의 감소, 감소된 양의 IL-2, IFN-γ 또는 이들 둘다의 분비, IL-10의 분비 또는 이들의 조합의 표현형 중 하나 이상을 특징으로 하는 억제인자 CD8+ T 세포의 생성을 개시(trigger)하는데 효과적인 양의 항-CD8 비-고갈성 차단 항체로 처리하고; 억제인자 CD8+ T 세포를 이식 환자내로 도입시킴으로써 이식 환자에서 이식 거부를 감소시키는 한편 다른 면역 반응은 유지시키기 위한 조성물 및 방법을 포함한다. 하나의 측면에서, CD8+ T 세포는 GM-CSF 및 IFN-α-2b와 함께 배양된 단핵구로부터 수득한 분리된 수지상 세포(IFN-DC)와 함께 배양된다. 다른 측면에서, 수지상 세포는 CD34+ 사람 말초 세포를 9 내지 10일 동안 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양함으로써 시험관내에서 생성시킨 랑게르한스 세포[Langerhans cell(LC)]이다. 수지상 세포의 다른 예는 CD1a+CD14- LC이다. 다른 측면에서, 항-CD8 항체는 바이러스에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않으면서 이식된 기관에 대한 면역 반응을 하향-조절한다. 다른 측면에서, 항-CD8 항체로 처리된 CD8+ T 세포는 고-항원항체결합력(high-avidity), 항원-특이적인 미감작(naive) T 세포이다. 하나의 비-제한적 예에서, 항-CD8 항체는 표 1에 나열된 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, OKT8 및 항-CD8 항체 중에서 선택된다. 시험관내에서 T 세포를 처리하는 하나의 측면에서, 항-CD8 항체는 CD8+ T 세포 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공된다. 생체내 사용을 위해, 본 발명은 개인의 체중에 따라 혈중 동일한 농도에서 유사한 수준을 달성하기 위해 제공될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계, 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하는 단계, LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양하여 LC를 제조하는 단계, 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하고 LC 및 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에서 억제인자 T 세포를 생성시키는 조건하에 공동-배양하는 단계, 및 T 세포, LC 또는 이들 둘다를, 이식 전에, 이식과 함께 또는 이식 후에 환자내로 재도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 당해 방법은 또한 이식 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계, LC를 분리하고 LC GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα를 배양하는 단계, 이식 환자로부터 T 세포를 분리하고 LC 및 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에 공동-배양하여 억제인자 T 세포를 생성시키는 단계, 및 T 세포, LC 또는 이들 둘다를, 이식 전에, 이식과 함께 또는 이식 후에 환자내로 재도입시키는 단계를 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 억제인자 CD8+ T 세포는, 제2형 사이토킨(IL-4, IL-5 및 IL-13) 및 IL-10의 발현이 증가되어 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 억제인자 T 세포를 제조하는 방법 및 이에 의해 제조된 세포를 포함하며, 당해 방법은 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하며, LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양함으로써 LC를 제조하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하여 LC 및 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에서 억제인자 T 세포를 생성시키는 조건하에 공동-배양함을 포함한다. 하나의 측면에서, 항-CD8 항체는 바이러스에 대한 면역반응에 영향을 미치지 않고 이식된 기관에 대한 면역 반응을 하향-조절한다. 하나의 측면에서, CD8+ T 세포는 고-항원항체결합력의 항원-특이적인 미감작(naive) T 세포이다. 하나의 측면에서, 랑게르한스 세포는 CD1a+CD14- LC이다. 다른 측면에서, CD1a+CD14- 랑게르한스 세포는 세포 분류에 의해 수득된다. 또 다른 측면에서, 랑게르한스 세포는 시험관내에서 CD34+ HPC를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 9 내지 10일 동안 배양함으로써 생성된다. 하나의 측면에서, 항-CD8 항체는 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 OKT8로부터 선택된다. 항-CD8 항체는 또한 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 단핵구를 분리하고, 단핵구를 GM-CSF 및 IFN-α-2b와 함께 배양하여 IFN-DC를 제조하고, T 세포를 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리하고 IFN-DC와 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에서 공동-배양함으로써 억제인자 T 세포를 제조하는 방법, 및 이에 의해 제조된 억제인자 T 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 양태는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하며, LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양함으로써 LC를 제조하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하고, LC와 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에서 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에 공동-배양함으로써 제조된 억제인자 T 세포를 포함하는 조성물을 투여하여 면역 반응에 영향을 미치는 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 말초 혈액 단핵 세포를 분리하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하며, LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양하여 LC를 제조하고, 말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하며 LC와 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에서 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에 공동-배양함을 포함하는 방법에 의해 제조된 억제인자 T 세포를 도입시킴으로써 포유동물에서 이식된 조직의 거부를 억제하는 방법이다.
다른 양태에서, 본 발명은 다른 면역 반응을 제거하지 않고, 이식 거부를 감소시키기에 충분한 유효량의 억제인자 T 세포를 포함하는, 이식 거부를 감소시키는 조성물이며, 여기서, 억제인자 T 세포는 항-CD8 항체의 존재하에 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에서 성숙한 LC와 공동-배양된 분리된 말초 혈액 T 세포로부터 생성된다. 하나의 측면에서, 항-CD8 항체는 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 KT8로부터 분리된다. 다른 측면에서, 항-CD8 항체는 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공된다. 하나의 측면에서, 세포는 동결되고 사용 전에 주사용 매질 중에 재현탁된다.
본 발명의 특징 및 장점을 보다 완전히 이해하기 위하여, 이제 본 발명의 상세한 설명과 함께 첨부되는 도면을 참조한다.
도 1a 내지 도 1c는, 증가된 CD8 발현이 LC-프라이밍된 CD8+ T 세포에서 유도되지만 IntDC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서는 유도되지 않음을 나타낸다. 도 1a는 CD34-DC 아그룹에 의해 프라이밍된 미감작 CD8+ T 세포에서 CD8 발현 수준의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. LC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서 CD8(검은색 선); IntDC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서 CD8(회색 선). 도 1b는, LC에 의해 프라이밍된 미감작 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포가 IntDC-프라이밍된 Mart-1 특이적인 미감작 CD8+ T 세포와 비교하여 보다 높은 수준의 CD8을 발현함을 나타낸다. 도 1c는, 아그룹 둘다, 예를 들면, LC 또는 IntDC에 의해 활성화된 기억 Flu-MP 특이적인 CD8+ T 세포가 동일한 수준의 표면 CD8을 발현함을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2h는 DC-매개된 자가 미감작 CD8+ T 세포 프라이밍에서 CD8의 역할을 나타낸다. 도 2a는, 자가 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포 프라이밍이 CD8 연결에 의존적임을 나타낸다. 도 2b는 1 내지 9일 사이에 LC를 사용한 프라이밍 동안 측정된 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 2c는, 적어도 3개의 상이한 공여자를 이용한 적어도 3개의 별개 실험에서 3개의 상이한 클론이 LC에 의해 유도된 미감작 동종이계 증식을 현저히 차단하였음을 나타낸다. T8 베크만(Beckman) 상부 패널, RPA-T8 중간 패널, OKT8 하부 패널. 도 2d는, 항-CD8이 자가 미감작 CD8+ T 세포의 프라이밍을 투여량 의존적 양식으로 차단함을 나타낸다. IC50은 50ng/ml에서 측정되었다. 도 2e는, Mart-1 특이적인 CD8 T 세포인, 항-CD8이 공동-배양 개시한지 70시간 후로 늦게 가해지는 경우에서조차 항원 특이적인 CD8 T 세포 프라이밍을 효율적으로 차단함을 나타낸다. 도 2f는 이소타입 대조군의 존재하에서 프라이밍된 항원 특이적인 CD8+ T 세포와 비교하여 보다 낮은 강도의 항-CD8 Mab 염색 사량체의 저 투여량의 존재하에서 펩타이드 로딩된 LC에 의해 프라이밍된 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포를 나타낸다. 도 2g는 사용된 항-CD8 Mab의 투여량에 대한 사량체 강도 사이의 관련성을 나타낸다. 도 2h는, MART-1 특이적인 프라이밍이 심지어 DC를 고 농도 100μM의 펩타이드로 로딩하는 경우 또는 펩타이드가 배양 전체에 존재하는 경우(좌측 패널)에서 조차 항-CD8에 의해 차단됨을 나타낸다; 우측 패널: IFN-DC에 의해 프라이밍되고 나타낸 펩타이드 농도로 로딩된 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포의 수. 도 2i는 IFN-DC에 의한 MART-1(상부 패널) 또는 gp100(하부 패널) 특이적인 CD8+ T 세포의 항-CD8 차단 프라이밍을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3g는, CD8 연결이 동종이계 미감작 CD8+ T 세포 프라이밍에 중요함을 나타낸다. 도 3a는, 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 동종이계 DC에 대한 반응시 미감작 CD8+ T 세포 증식이 세포 티미딘 혼입에 의해 측정되었음을 나타낸다. 도 3b는, 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 동종이계 LC에 대한 반응시 미감작 T 세포 증식이 CFSE 희석에 의해 측정되었음을 나타낸다. CD8+ T 세포는 상부 패널이고 미감작 CD4+ T 세포는 하부 패널이다. 도 3c는 30ng/ml(상부 패널)에서 CD8 T 세포 증식의 최대 억제를 나타낸 30 ng/ml 내지 3 ㎍/ml 항-CD8의 투여량 적정을 나타낸다. CD4+ T 세포 증식의 억제는 사용된 항-CD8 Mab의 어떠한 농도에서도 검출되지 않았다(하부 패널). 도 3d 및 3e는, 항-CD8 Mab가 피부 기원한 DC, 상피 LC(3d) 또는 진피 DC(3e)에 의해 자극된 미감작 CD8+ T 세포의 동종증식을 방지함을 나타낸다. 50% 억제는 30ng/ml에서 검출되었다. 도 3f 및 도 3g는, 펩타이드-로딩된 LC 및 미감작 CD8+ T 세포가 공동-배양(3g)의 9일째에 명백해지는 클러스터를 생성하는 반면, 항-CD8의 존재하에서, 클러스터 형성이 억제됨(도 3f)을 나타낸다. 상부 패널 20x 확대 하부 패널 40x 확대.
도 4a 내지 도 4f는, 항-CD8이 바이러스 또는 동종이계 항원에 대한 2차 CD8+ T 세포 반응을 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4a는 3㎍/ml의 항-CD8 Mab(좌측 패널) 또는 이소타입 매치된 대조군(우측 패널)의 존재하에서 HLA-A201 공여자로부터의 FluMP 펩타이드-로딩된 LC를 사용한 활성화 후 9일째에 FluMP-HLA-A201 사량체로 분석한 FluMP-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 4b는, 항-CD8 Mab가 Flu-MP-HLA-A201 사량체에 의해 분석된 것으로서, 사용된 Mab의 특정 농도에서 2차 Flu-Mp 특이적인 반응을 유도한 LC를 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4c는 3㎍/ml의 항-CD8 Mab(좌측 패널) 또는 이소타입 매치된 대조군(우측 패널)의 존재하에서 HLA-A201 공여자로부터의 FluMP 펩타이드-로딩된 IntDC를 사용한 활성화 후 9일째에 FluMP-HLA-A201 사량체로 분석한 FluMP-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 4d는, 항-CD8 Mab가 Flu-MP-HLA-A201 사량체에 의해 분석된 것으로서, 사용된 Mab의 어떠한 농도에서도 IntDC 유도된 2차 Flu-Mp 특이적인 반응을 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4e는, 항-CD8에 의한 억제의 결여가 2개의 상이한 클론으로서 특정 항-CD8 클론에 한정되지 않음을 나타낸다; T8 베크만(좌측 패널) 및 RPA-T8(우측 패널)은 3㎍/ml의 나타낸 항-CD8 클론 또는 이소타입 매치된 대조군의 존재하에서 배양 9일 후 펩타이드 로딩된 LC에 의해 유도된 Flu-MP 특이적인 CD8+ T 세포의 억제를 나타내지 않았다. 도 5f는, 동종이계 항원에 대한 기억 반응이 항-CD8에 의해 차단되지 않음을 나타낸다. 2차 동종이계 공동-배양물의 티미딘 혼입은, 동종이계 LC(좌측 패널) 또는 IntDC(우측 패널)이, 항-CD8 Mab 또는 이소타입 매치된 대조군이 배양물 중에 존재하는지에 상관없이 동종특이적인 2차 반응을 유도하는데 효과적이었음을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포의 작용적 분석을 나타낸다. 도 5a에서 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 동종이계 미감작 CD8+ T 세포를 활성화 및 효과인자 분자의 발현에 대해 유동 세포분석법으로 6일 후 분석하였다. 도 5b에서, 항-CD8 Mab의 존재하에서 프라이밍된 동종이계 미감작 CD8+ T 세포는 제2형 및 조절성 사이토킨을 분비한다. 미감작 CD8+ T 세포는 항-CD8의 존재 또는 부재하에서 LC에 걸쳐 배양하였다. 6일 후, 증식된(CFSElow) 세포를 분류하고 24시간 동안 항-CD3 및 항-CD28 비드를 사용하여 재자극시키고, IFN-γ, IL-2-, IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13을 루미넥스, 다중 비드 검정(luminex, multiplex bead assay)에서 측정하였다. 나타낸 데이터는 3개의 독립된 시험 결과이다.
도 6a 및 도 6b는, 항-CD8의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포가 억제인자 T 세포임을 나타낸다. 도 6a는, 1차 T 세포 반응을 억제하는 프라이밍된 T 세포의 능력을 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 시험관내 LC에 의해 프라이밍된 감소하는 수의 동종이계 T 세포의 존재하에서 미감작 CD8+ T 세포를 동종이계 DC로 자극시킴에 의해 시험하였음을 나타낸다. 3[H]티미딘 혼입은 6일 후 평가하였다. 결과는 3개의 독립된 연구를 대표한다. 도 6b는, 미감작 CD8 T 세포(공여자 A)를 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 공여자 C로부터의 시험관내 LC에 대해 프라이밍된 CD8 Tr 세포의 존재하에서 공여자 B로부터의 동종이계 LC로 자극시켰음을 나타낸다. 결과는 3회의 독립된 실험을 대표한다.
도 7a 및 도 7b는, 항-CD8 치료의 효과가 생체내에서 사람-마우스 모델에서 이식체 대 숙주 반응을 방지함을 나타낸다. 도 7a는 동종이계 CD8+ T 세포 및 항-CD8 MAb 또는 이소타입 대조군을 주사한 사람화된 마우스를 사용한 결과를 나타낸다. 2개 연구 중 하나에서, 항-CD40을 주사하여 활성화를 유도하였다. 이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스는 눈 주변 발진(나타냄), 체중 감소 및 약화를 동반한, 만성 이식체 대 숙주병의 임상 증상으로 발전한 반면, 항-CD8로 처리한 마우스는 그렇지 않았다. 도 7b는 마우스를 수거하여 BM 및 혈액으로부터의 CD8+ T 세포를 활성화 마커 CD25 및 CD103의 발현에 대해 분석한 결과를 나타낸다.
도 1a 내지 도 1c는, 증가된 CD8 발현이 LC-프라이밍된 CD8+ T 세포에서 유도되지만 IntDC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서는 유도되지 않음을 나타낸다. 도 1a는 CD34-DC 아그룹에 의해 프라이밍된 미감작 CD8+ T 세포에서 CD8 발현 수준의 유동 세포측정 분석을 나타낸다. LC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서 CD8(검은색 선); IntDC 프라이밍된 CD8+ T 세포에서 CD8(회색 선). 도 1b는, LC에 의해 프라이밍된 미감작 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포가 IntDC-프라이밍된 Mart-1 특이적인 미감작 CD8+ T 세포와 비교하여 보다 높은 수준의 CD8을 발현함을 나타낸다. 도 1c는, 아그룹 둘다, 예를 들면, LC 또는 IntDC에 의해 활성화된 기억 Flu-MP 특이적인 CD8+ T 세포가 동일한 수준의 표면 CD8을 발현함을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2h는 DC-매개된 자가 미감작 CD8+ T 세포 프라이밍에서 CD8의 역할을 나타낸다. 도 2a는, 자가 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포 프라이밍이 CD8 연결에 의존적임을 나타낸다. 도 2b는 1 내지 9일 사이에 LC를 사용한 프라이밍 동안 측정된 Mart-1 특이적인 CD8+ T 세포의 퍼센트를 나타낸다. 도 2c는, 적어도 3개의 상이한 공여자를 이용한 적어도 3개의 별개 실험에서 3개의 상이한 클론이 LC에 의해 유도된 미감작 동종이계 증식을 현저히 차단하였음을 나타낸다. T8 베크만(Beckman) 상부 패널, RPA-T8 중간 패널, OKT8 하부 패널. 도 2d는, 항-CD8이 자가 미감작 CD8+ T 세포의 프라이밍을 투여량 의존적 양식으로 차단함을 나타낸다. IC50은 50ng/ml에서 측정되었다. 도 2e는, Mart-1 특이적인 CD8 T 세포인, 항-CD8이 공동-배양 개시한지 70시간 후로 늦게 가해지는 경우에서조차 항원 특이적인 CD8 T 세포 프라이밍을 효율적으로 차단함을 나타낸다. 도 2f는 이소타입 대조군의 존재하에서 프라이밍된 항원 특이적인 CD8+ T 세포와 비교하여 보다 낮은 강도의 항-CD8 Mab 염색 사량체의 저 투여량의 존재하에서 펩타이드 로딩된 LC에 의해 프라이밍된 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포를 나타낸다. 도 2g는 사용된 항-CD8 Mab의 투여량에 대한 사량체 강도 사이의 관련성을 나타낸다. 도 2h는, MART-1 특이적인 프라이밍이 심지어 DC를 고 농도 100μM의 펩타이드로 로딩하는 경우 또는 펩타이드가 배양 전체에 존재하는 경우(좌측 패널)에서 조차 항-CD8에 의해 차단됨을 나타낸다; 우측 패널: IFN-DC에 의해 프라이밍되고 나타낸 펩타이드 농도로 로딩된 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포의 수. 도 2i는 IFN-DC에 의한 MART-1(상부 패널) 또는 gp100(하부 패널) 특이적인 CD8+ T 세포의 항-CD8 차단 프라이밍을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3g는, CD8 연결이 동종이계 미감작 CD8+ T 세포 프라이밍에 중요함을 나타낸다. 도 3a는, 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 동종이계 DC에 대한 반응시 미감작 CD8+ T 세포 증식이 세포 티미딘 혼입에 의해 측정되었음을 나타낸다. 도 3b는, 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 동종이계 LC에 대한 반응시 미감작 T 세포 증식이 CFSE 희석에 의해 측정되었음을 나타낸다. CD8+ T 세포는 상부 패널이고 미감작 CD4+ T 세포는 하부 패널이다. 도 3c는 30ng/ml(상부 패널)에서 CD8 T 세포 증식의 최대 억제를 나타낸 30 ng/ml 내지 3 ㎍/ml 항-CD8의 투여량 적정을 나타낸다. CD4+ T 세포 증식의 억제는 사용된 항-CD8 Mab의 어떠한 농도에서도 검출되지 않았다(하부 패널). 도 3d 및 3e는, 항-CD8 Mab가 피부 기원한 DC, 상피 LC(3d) 또는 진피 DC(3e)에 의해 자극된 미감작 CD8+ T 세포의 동종증식을 방지함을 나타낸다. 50% 억제는 30ng/ml에서 검출되었다. 도 3f 및 도 3g는, 펩타이드-로딩된 LC 및 미감작 CD8+ T 세포가 공동-배양(3g)의 9일째에 명백해지는 클러스터를 생성하는 반면, 항-CD8의 존재하에서, 클러스터 형성이 억제됨(도 3f)을 나타낸다. 상부 패널 20x 확대 하부 패널 40x 확대.
도 4a 내지 도 4f는, 항-CD8이 바이러스 또는 동종이계 항원에 대한 2차 CD8+ T 세포 반응을 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4a는 3㎍/ml의 항-CD8 Mab(좌측 패널) 또는 이소타입 매치된 대조군(우측 패널)의 존재하에서 HLA-A201 공여자로부터의 FluMP 펩타이드-로딩된 LC를 사용한 활성화 후 9일째에 FluMP-HLA-A201 사량체로 분석한 FluMP-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 4b는, 항-CD8 Mab가 Flu-MP-HLA-A201 사량체에 의해 분석된 것으로서, 사용된 Mab의 특정 농도에서 2차 Flu-Mp 특이적인 반응을 유도한 LC를 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4c는 3㎍/ml의 항-CD8 Mab(좌측 패널) 또는 이소타입 매치된 대조군(우측 패널)의 존재하에서 HLA-A201 공여자로부터의 FluMP 펩타이드-로딩된 IntDC를 사용한 활성화 후 9일째에 FluMP-HLA-A201 사량체로 분석한 FluMP-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 나타낸다. 도 4d는, 항-CD8 Mab가 Flu-MP-HLA-A201 사량체에 의해 분석된 것으로서, 사용된 Mab의 어떠한 농도에서도 IntDC 유도된 2차 Flu-Mp 특이적인 반응을 차단하지 않음을 나타낸다. 도 4e는, 항-CD8에 의한 억제의 결여가 2개의 상이한 클론으로서 특정 항-CD8 클론에 한정되지 않음을 나타낸다; T8 베크만(좌측 패널) 및 RPA-T8(우측 패널)은 3㎍/ml의 나타낸 항-CD8 클론 또는 이소타입 매치된 대조군의 존재하에서 배양 9일 후 펩타이드 로딩된 LC에 의해 유도된 Flu-MP 특이적인 CD8+ T 세포의 억제를 나타내지 않았다. 도 5f는, 동종이계 항원에 대한 기억 반응이 항-CD8에 의해 차단되지 않음을 나타낸다. 2차 동종이계 공동-배양물의 티미딘 혼입은, 동종이계 LC(좌측 패널) 또는 IntDC(우측 패널)이, 항-CD8 Mab 또는 이소타입 매치된 대조군이 배양물 중에 존재하는지에 상관없이 동종특이적인 2차 반응을 유도하는데 효과적이었음을 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포의 작용적 분석을 나타낸다. 도 5a에서 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 동종이계 미감작 CD8+ T 세포를 활성화 및 효과인자 분자의 발현에 대해 유동 세포분석법으로 6일 후 분석하였다. 도 5b에서, 항-CD8 Mab의 존재하에서 프라이밍된 동종이계 미감작 CD8+ T 세포는 제2형 및 조절성 사이토킨을 분비한다. 미감작 CD8+ T 세포는 항-CD8의 존재 또는 부재하에서 LC에 걸쳐 배양하였다. 6일 후, 증식된(CFSElow) 세포를 분류하고 24시간 동안 항-CD3 및 항-CD28 비드를 사용하여 재자극시키고, IFN-γ, IL-2-, IL-4, IL-5, IL-10, 및 IL-13을 루미넥스, 다중 비드 검정(luminex, multiplex bead assay)에서 측정하였다. 나타낸 데이터는 3개의 독립된 시험 결과이다.
도 6a 및 도 6b는, 항-CD8의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포가 억제인자 T 세포임을 나타낸다. 도 6a는, 1차 T 세포 반응을 억제하는 프라이밍된 T 세포의 능력을 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 시험관내 LC에 의해 프라이밍된 감소하는 수의 동종이계 T 세포의 존재하에서 미감작 CD8+ T 세포를 동종이계 DC로 자극시킴에 의해 시험하였음을 나타낸다. 3[H]티미딘 혼입은 6일 후 평가하였다. 결과는 3개의 독립된 연구를 대표한다. 도 6b는, 미감작 CD8 T 세포(공여자 A)를 항-CD8 또는 이소타입 대조군의 존재하에서 공여자 C로부터의 시험관내 LC에 대해 프라이밍된 CD8 Tr 세포의 존재하에서 공여자 B로부터의 동종이계 LC로 자극시켰음을 나타낸다. 결과는 3회의 독립된 실험을 대표한다.
도 7a 및 도 7b는, 항-CD8 치료의 효과가 생체내에서 사람-마우스 모델에서 이식체 대 숙주 반응을 방지함을 나타낸다. 도 7a는 동종이계 CD8+ T 세포 및 항-CD8 MAb 또는 이소타입 대조군을 주사한 사람화된 마우스를 사용한 결과를 나타낸다. 2개 연구 중 하나에서, 항-CD40을 주사하여 활성화를 유도하였다. 이소타입 대조군 항체로 처리된 마우스는 눈 주변 발진(나타냄), 체중 감소 및 약화를 동반한, 만성 이식체 대 숙주병의 임상 증상으로 발전한 반면, 항-CD8로 처리한 마우스는 그렇지 않았다. 도 7b는 마우스를 수거하여 BM 및 혈액으로부터의 CD8+ T 세포를 활성화 마커 CD25 및 CD103의 발현에 대해 분석한 결과를 나타낸다.
비록 본 발명의 각종 양태의 제조 및 사용 방법을 하기에 상세히 논의하였지만, 본 발명이 광범위하게 다양한 특정 내용에 포함될 수 있는 많은 적용가능한 발명 개념을 제공한다는 것이 인식되어야 한다. 본원에서 논의된 특정 양태는 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 특정 방법의 단순한 예시이며 본 발명의 영역을 제한하지는 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어들이 하기에 정의되어 있다. 본원에 정의된 용어들은 본 발명과 관련된 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 단수로 된 용어들은 단지 단수를 말하는 것이 아니라, 예시를 위해 사용될 수 있는 특정 예의 일반적인 부류를 포함한다. 본원의 전문용어는 본 발명의 특정 양태를 기술하기 위해 사용되지만, 이들의 용도는 특허청구범위에 요약된 것을 제외하고는, 본 발명을 한정하지 않는다.
수지상 세포(DC)는 Ag-특이적인 면역1을 유도하는데 관여하는 강력한 APC이다. 상이한 조직에서 잔류하며, 명백한 기능적 속성을 갖는 DC의 몇몇 집단이 존재한다1. 건강한 피부는 표피내 적어도 2개의 DC 집단 랑게르한스 세포(LC) 및 진피내 사이질 DC를 갖는다. 이들 DC는 불활성화되는 경우 말초 내성 및 활성화되는 경우 면역에 대한 배출 림프 기관(draining lymphoid organ)내로 이주한다. 다른 DC는 제2의 림프 기관내에 잔류하며 혈액 중에서 순환하는 것으로 밝혀졌다. DC 생물학의 이해에 있어서 많은 진전은 시험관내에서 생성된 DC로 수행된 연구로부터 왔다. 특히, TNFα 및 GM-CSF의 존재하에서 CD34+ 조혈 전구 세포(HPC)의 배양은 사이질 DC 및 랑게르한스 세포 둘다를 생성한다2. 본 발명자들은, IntDC가 아닌 LC가 미감작 CD8+ T 세포를 프라이밍하는데 특히 효율적임을 밝혀내었다. 또한, 아그룹 둘다는 기억 반응을 유도하는데 있어서 동등하게 효율적이며 아그룹 둘다에 의해 활성화된 CD8+ T 세포는 CD8 분자의 동등한 발현을 나타낸다.
CD8은 MHC 제I 부류 분자(pMHCI)와 복합체화된 펩타이드 항원의 TCR 인식을 위한 공동수용체(coreceptor)로서 작용하는 표면 당단백질이다. 이는 αα 동종이량체 또는 αβ 이종이량체3로 표현되며, 이들 쇄 둘다는 단일 세포외 Ig 상과(IgSF) V 도메인, 막 근접 힌지 영역, 막관통(transmembrane) 도메인, 및 세포질 테일(tail)3을 발현한다. CD8은 세포외 IgSF V 도메인내에서 자체의 β 쇄와 상보성 결정 영역(CDR)을 사용하여 MHC 제I 부류 분자의 α2 및 α3 도메인, 및 β2m과 상호작용한다. 당해 연합은 자체의 제I 부류 표적과의 T 세포 수용체의 부착/항원항체결합력을 증가시킨다. 또한, 타이로신 단백질 키나제 p56lck4 ,5와 연합된 CD8α 쇄에 의해 매개된 내부 시그널링 케스케이드는 T 세포 활성화를 이끈다. Lck는 미감작 CD8+ T 세포의 활성화 및 증대에 요구되지만; 이의 발현은 생체내 또는 시험관내에서 제2 항원성 자극에 대한 기억 CD8+ T 세포의 반응에 필수적이지 않다6 ,7. CD8α 또는 CD8β 유전자 표적화된 마우스에 의해 밝혀진 바와 같이, CD8은 MHC 제I 부류-제한된 T 림프구의 성숙 및 작용에 있어 중요한 역할을 한다8 ,9. 반복된 세균 감염으로 고생하는 한 명의 환자는 CD8α 유전자에 있어서의 단일 돌연변이로 인하여 CD8 결핍을 나타내는 것으로 밝혀졌다. CD8의 결여는 CD8+ T 세포 계통 결정(lineage commitment) 또는 말초 세포 용해 작용에 필수적인 것으로 여겨지지 않았다10.
2D2; 4D12.1; 7B12 1G11; 8E-1.7; 8G5; 14; 21Thy; 51.1; 66.2; 109-2D4; 138-17; 143-44; 278F24; 302F27; AICD8.1; 항-T8; B9.1.1; B9.2.4; B9.3.1; B9.4.1; B9.7.6; B9.8.6; B9.11; B9.11.10; BE48; BL15; BL-TS8; BMAC8; BU88; BW135/80; C1-11G3; C10; C12/D3; CD8-4C9; CLB-T8/1; CTAG-CD8, 3B5; F80-1D4D11; F101-87 (S-T8a); G10-1; G10-1.1; HI208; HI209; HI212; HIT8a; HIT8b; HIT8d; ICO-31; ICO-122; IP48; ITI-5C2; ITM8-1; JML-H7; JML-H8; L2; L533; Leu-2a; LT8; LY17.2E7; LY19.3B2; M236; M-T122; M-T415; M-T805; M-T806; M-T807; M-T808; M-T809; M-T1014; MCD8; MEM-31; MEM-146; NU-Ts/c; OKT8; OKT8f; P218; RPA-T8; SM4; T8; T8 /2T8-19; T8 /2T8-2A1; T8 /2T8-1B5; T8 /2T8-1C1; T8 /7Pt3F9; T8 /21thy2D3; T8 /21thy; T8 /TPE3FP; T8b; T41D8; T811; Tu68; Tu102; UCHT4; VIT8; VIT8b; WuT8-1; X107; YTC141.1; 및/또는 YTC182.20을 포함하는, International Workshops on Human Leucocyte Differentiation Antigens(HLDA)의 일부인 것들과 같은, 모노클로날 항체를 포함하는, 다수의 익히 공지된 항-CD8 항체 중 어느 것도 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
사람화된 항-CD8 항체의 비-제한적 예는 cM-T807[제조원: 센토코르(Centocor), 미국 매사추세츠 소재], 및 TRX2[제조원: 옥스포드 써라퓨틱 안티바디 센터(Oxford Therapeutic Antibody Centre), 옥스포드대, 영국 옥스포드 소재]를 포함한다. 수지상 세포(DC)는 항원-특이적인 면역 반응을 개시하고 분극화한다. 사람 골수 DC(mDC)는 사람 피부에 잔류하는 랑게르한스 세포 및 사이질(진피) DC와 같은 명백한 아그룹을 포함한다. 본 출원인은, 간질 DC와 비교하는 경우, 랑게르한스 세포가 동종이계 및 자가 항원에 대해 미감작 CD8+ T 세포를 프라이밍하는데 있어 특히 강력한 반면, mDC 아그룹 둘다는 제2 반응을 유도하는데 있어서 동등하게 효율적임을 보고하였다. 본 연구는 CD8+ T 세포 프라이밍을 유도하는데 있어서 LC의 우세한 작용을 설명할 수 있는 매개변수를 분석하기 위해 수행하였다. LC 프라이밍된 CD8+ T 세포는 IntDC 프라이밍된 CD8+ T 세포와 비교하여 보다 높은 수준의 CD8을 발현하는 반면, 항원 특이적인 기억 CD8+ T 세포는 아그룹 둘다에 의해 유도되었으며, 동등한 수준의 CD8을 발현하였다.
본원에서 항-CD8 모노클로날 항체가 자가 및 동종이계 항원 CTL의 DC-매개된 시험관내 프라이밍을 차단함이 밝혀졌다. 항-CD8의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포는 표적을 사멸시키는데 실패하였고 제2형(IL-4, IL-5, IL-13) 및 조절성(IL-10) 사이토킨을 생산하였다. 또한, 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포는 동종반응(alloreaction)을 억제할 수 있으므로 억제인자 CD8+ T 세포로서 작용하였다. 그러나, 인플루엔자 및 CMV에 대한 것들과 같은 제2의 CTL 반응의 유도는 방해되지 않았다. 유사하게, 항-CD8 mAb는 CD4+ T 세포 반응을 변경시키지 않았다. 사람-마우스 모델 세포 집단에서, 동종반응성 CD8+ T 세포의 생체내 활성화에 대한 항-CD8 mAb의 투여는 동종이계 CD8+ T 세포의 주사로 유도된 이식체-대-숙주병의 진행을 방지하였다. 따라서, 항-CD8 항체 치료요법은 보호성 항-바이러스 반응을 교란시키지 않으면서, CD8+ T 세포-매개된 이식 거부를 방지할 수 있으므로 현재의 면역억제 치료보다도 현저히 발전된 것임을 나타낸다. 이러한 적용은, CD8 연결이 T 세포 프라이밍의 억제 및 조절성 T 세포의 생성을 초래함을 입증하였다.
본 발명자들은, LC가 간질 DC와 비교하여 미감작 CD8 T 세포를 프라이밍하는데 있어 매우 효율적인 반면, mDC 아그룹 둘다는 제2 반응을 유도하는데 있어 동등하게 효율적임을 입증하였다. 현재의 연구는 CD8+ T 세포 프라이밍을 유도하는데 있어 LC의 우수한 작용을 설명할 수 있는 매개변수를 분석하기 위해 수행되었다. 본원에서, CD8 연결이 T 세포 프라이밍의 억제뿐만 아니라 조절성 T 세포의 생성을 개시함이 입증되었다.
DC 정제 및 배양. CD34-기원한 DC는 G-CSF 가동화된(mobilized) CD34-HPC를 0.5 x 106/ml으로 25 cm2 플라스크 속에서 5% 자가 혈청, 50 μM 2-β-머캅토에탄올, 1% L-글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 사이토킨; GM-CSF[50 ng/ml; 제조원: 임뮤넥스 코포레이션(Immunex Corp.)], FLT3-L[100 ng/ml; 제조원: 알앤드디(R&D)], 및 TNF-α(10 ng/ml; 제조원: 알앤드디)를 함유하는 이쎌 배지(Yssel's media)[제조원: 이르빈 사이언티픽(Irvine Scientific), 미국 캘리포니아주 소재 또는 게미니 바이오프로덕츠(Gemini BioProducts)]내에서 배양함으로써 생성시켰다. 배양물을 37℃에서 5% CO2와 함께 습윤화 환경에서 배양하고, 세포를 배양 5일째에 사이토킨이 보충된 신선한 배지로 이전시키고, 9 또는 10일째에 수거하였다. CD1a+CD14--LC 및 CD1a-CD14+-intDC를 분류하였다. 순도는 대략 95 내지 99%이었다.
IFN-기원한 DC(IFN-DC)는 CD14+ 단핵구(순도 >90%)(1x106 세포/ml)를 1% 페니실린/스트렙토마이신, 및 100 ng/ml GM-CSF[제조원: 베를렉스(Berlex)] 및 500 U/ml IFN-α-2b[제조원: 쉐링 코포레이션(Schering Corp)]가 보충된 셀게닉스 배지[제조원: 셀게닉스(Cellgenix)] 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 배양함으로써 생성시키고, 신선한 배지 및 사이토킨을 1일째에 가하고, DC를 3일째에 수거하였다.
LC 및 피부 IntDC를 정상 사람 피부 시료로부터 정제하였다. 시료를 세균 프로테아제 디스파제 제2형[제조원: 로슈(Roche)] 항생제/항진균제[제조원: 기브코(Gibco)] 중에서 18시간 동안 4℃에서 및, 이후에 2시간 동안 37℃에서 배양하였다. 이어서, 상피 및 진피 판을 분리하고, 작은 조각(약 1 내지 10mm)으로 잘라 10% 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 RPMI 1640[제조원: 기브코(Gibco)] 중에 두었다. 2일 후, 배지내로 이주한 세포를 수집하고 피콜-디아트리조에이트 구배(Ficoll-diatrizoate gradient), 1.077 g/dl[LSM-림프구 분리 배지, 제조원: 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals)]를 사용하여 추가로 농축시켰다. DC는 항-CD1a FITC(OKT6; DAKO) 및 항-CD14-APC[LeuM3; 제조원: 인비트로겐(Invitrogen)] mAb를 사용하여 염색한 후 세포 분류에 의해 정제하였다.
T 세포 분리. 세포는 성인 자원자 공여자로부터 백혈구성분채집술에 의해 수득한 동결된 PBMC로부터 분리하였다. 미감작 CD8+ T 세포는 CD45RA+CCR7+HLA-DR-CD8+ 세포에 이어 CD4-, CD56-, CD16- 및 CD19-자기 세포 고갈[magnetic cell depletion: 제조원: 밀테나이(Miltenyi)]로 분류하였다. 미감작 CD4+ T 세포를 동일한 방식으로 수득하였으나, 단, CD8 T 세포가 고갈되었고 수득되는 세포는 CD4+CCR7+CD45RA+CD4-CD16-CD19-CD56-으로서 분류하였다. 회상 반응(recall response)을 위해, CD8+ T 세포를 농축된 집단으로부터 양성적으로 선택하였다.
DC/CD8 T 세포 공동배양. 자가 CD8+ T 세포-DC 공동배양. 1차 반응 평가를 위해, 미감작 CD8+ T 세포(1 x106 세포/웰)을 3시간 동안 HLA-A201-제한된 MART-1 (MART-1M26-35, ELAGIGILTV) 또는 gp100 (gp100M209 -217, IMDQVPFSV) 펩타이드(3 μM)와 함께 예비배양시킨 자가 mDC (5 x 104 세포/웰)로 자극시켰다. 세포를 9일 동안 24-웰 플레이트 속에서 10 U/ml IL-7(제조원: 알앤드디) 및 100 ng/ml CD40L(제조원: 알앤드디)이 보충된 이쎌 완전 배지 내에서 배양하였다. IL-2(제조원: 알앤드디)를 10 U/ml로 3일째에 가하고; 항-CD8 또는 이소타입 매치된 대조군을 달리 나타내지 않는 한, 0일째에 가하였다.
펩타이드-특이적인 CD8+ T 세포의 증대는 배양 기간의 말기에 세포 결합 펩타이드/HLA-A201 사량체[제조원: 베크만 코울터(Beckman Coulter)]의 수를 계수함으로써 측정하였다. 회상 반응의 평가를 위해, 총 CD8+ T 세포(1 x 106 세포/ml)를 항-CD8 또는 이소타입 매치된 대조군의 존재하에 HLA-A201-제한된 Flu-MP 펩타이드(GILGFVFTL)로 로딩된 자가(5 x105 세포/ml) mDC 아그룹으로 자극시켰다. Flu-MP-특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 Flu-MP/HLA-A201 사량체를 사용하여 측정하였다.
동종이계 CD8 T 세포 배양. 미감작 CD8+ T 세포의 동종이계 증식을 [H3]-티미딘 혼입 또는 CFSE 희석으로 평가하였다. 미감작 T 세포(1 x 105 세포/웰)을 환저 96-웰 플레이트 속에서 10% 열-불활성화시킨 혼주된 AB 사람 혈청(이쎌 완전 배지) IL-7 및 IL-2(10 IU/ml(제조원: 알앤드디)으로 보충되고, 2.5 x 104(달리 나타내지 않는 한) 동종이계 mDC 아그룹이 첨가된 이쎌 배지 내에서 배양하였다. CD40L을 사용하여 DC를 활성화시켰다. 5일 후, 세포를 18시간 동안 1 μCi [H3]-티미딘으로 펄스시키고 추적자의 혼입을 진행중인 증식의 척도로서 측정하였다.
CFSE 희석에 의한 증식의 평가를 위해, 세포를 0.5 μM CFSE로 제조업자의 공정에 따라 표지하였다. 7일 후, 세포를 수거하고, 증식 수준을 유동 세포측정법으로 분석하였다. 또한, 프라이밍된 CD8+ T 세포의 질을 하기 기술한 바와 같이 평가하였다.
나타내는 경우, CD8에 대한 차단 항체(클론 RPA-T8, OKT6, BD, 또는 T8; 제조원: 베크만 코울터) 또는 이소타입 대조군 항체를 공동배양물에 가하였다.
2차 동종이계 CD8+ T 세포 배양을 위해, 5 x 104 미감작 CD8 T 세포를 2.5 x 103 CD40 리간드-활성화된 DC와 함께 96-웰 환저 플레이트 속에서 IL-7 및 IL-2를 첨가하면서 배양하였다. 6일 후, 세포를 1차 배양에 사용된 동일한 공여자로부터의 DC로 재자극시켰다. 항-CD8 항체 또는 이소타입 매치된 대조군을 배양물에 3일 동안 가한 후, 세포 증식을 [3H]티미딘 혼입으로 평가하였다.
사이토킨 생산. CD8+ T 세포 사이토킨 생산 평가를 위해, 증식된 CD8+ T 세포(FSChighCD11c- 또는 CFSElowCD11c-)를 7일째에 1차 동종이계 배양물로부터 세포 분류에 의해 분리하고 항-CD3 및 항-CD28 피복시킨 미세비드로 밤새 재자극시켰다. 상청액중 사이토킨을 멀티플렉스 비드-계(multiplex bead-based) 사이토킨 검정으로 평가하였다.
CD8+ T 억제인자 검정. CD8+ T 억제인자 작용 검정을 위해, 증식시킨 CD8+ T 세포(FSChighCD11c- 또는 CFSElowCD11c-)를 1차 동종이계 배양물로부터 세포 분류에 의해 분리하고 구배된 수로 5 x 104 미감작 CD8+ T 세포 및 CD40L-활성화된 2.5 x 103 동종이계 DC(LC)의 공동배양물에 가하였다. 1μ/Ci의 [3H]티미딘을 각각의 웰에 가하였다. 배양 5일 후, 세포 혼입을 18시간 후에 측정하였다.
T-세포 단백질 및 유전자 분석. 효과인자 분자 염색을 위해, 프라이밍된 CD8+ T 세포를 고정시키고 PE-표지된 항-그랜자임 A, 그랜자임 B 및 퍼포린[제조원: 비디 사이언시스(BD Biosciences)]로 투과화시키고 염색하였다.
CD8+ T 세포 표현형 분석을 위해, 세포를 모두 비디 바이오사이언스로부터 입수한 CD25 (M-A251), CD28 (CD28.2), CCR7, CD103(Ber-ACT8)의 표면 발현을 위해 염색하였다.
마이크로어레이 유전자 분석을 위해, 1차 동종이계 배양물로부터 증식하는 CD8 T 세포(CFSE-)를 분류하고 항-CD3 및 항-CD28 표지된 미세비드로 재-자극시켰다.
생체내에서 이식체 대 숙주병에 대한 항-CD8 처리의 평가. 가동화된 말초 혈액(Mobilized peripheral blood: MPB) CD34+ 세포(3-6 x 106 MPB CD34+ 세포/동물)을 앞서 기술된 것으로서 준치사적으로 조사된[137Cs γ-조사에 의한 300 센티그레이(centigray)] NOD/SCID 마우스의 별도의 실험 코호트(cohort)내로 이식후 10 내지 12주째에 정맥내 주입하고, 마우스에게 동종이계 공여자로부터의 10M 분류된 미감작 CD8+ T 세포를 피하 주사하였다. 마우스를 IgG1 대조군 mAb 또는 항-CD8 mAb(RPA-T8, 제조원: 비디 바이오사이언시스, 0일째에 0.75 mg 및 3일째에 0.25 mg)로 피하 처리하였다. 2개 실험 중 하나에서, 항-CD40 모노클로날 항체[MAB89, 제조원: 쉐링-플라우(Schering-Plough)]를 동종이계 이식일에 복강내 주입하여 DC를 활성화하였다.
마우스를 생존 및 설사, 체중 감소 및 주름잡힌 피부에 의해 나타나는, GVHD의 임상 징후에 대해 매일 평가하였다. 증상이 나타난 경우, 마우스를 수거하였다. 사람 CD8+ T 세포를 유동 세포측정법으로 분석하였다.
시험관내 생성된 LC를 사용한 미감작 CD8+ T 세포의 시험관내 프라이밍. HLA-A201+LC 및 IntDC는 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα의 존재하에 9 내지 10일 동안 CD34+ HPC를 배양함으로써 시험관내에서 생성시켰다. 세포를 CD1a+CD14- LC(LC) 및 CD1a-D14+ IntDC(IntDC)로 분류하였다. 1차 반응의 경우, 3 μM HLA-A201-제한된 흑색종 펩타이드 MART-1(26-35)로 로딩시킨 DC 아그룹을 자가 미감작 CD8+ T 세포와 함께 9 내지 10일 동안 배양하였다. 배양 말기에 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 빈도를 특이적인 펩타이드-MHC 사량체를 사용하여 측정하였다.
도 1a 및 도 1b에 나타낸 바와 같이, LC로 프라이밍된 미감작 CD8+ T 세포는 IntDC-프라이밍된 CD8+ T 세포와 비교하여 표면 CD8 발현을 상향조절한다. 기억 반응을 위해, DC 아그룹을 1μM의 HLA-A201 제한된 인플루엔자 매트릭스 펩타이드 M1으로 로딩하였다. DC를 분류된 자가 기억 CD8+ T 세포와 함께 배양하였다. 대조적으로, 아그룹 둘다는 바이러스 항원에 대한 2차 반응을 유도하는데 있어서 동등하게 효율적이며, 아그룹에 의해 활성화된 CD8+ T 세포는 동등한 수준의 표면 CD8를 발현한다(도 1c).
항-CD8 항체는 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 프라이밍을 방지한다. 항-CD8 mAb RPA-T8의 첨가는 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포의 증대를 MART-1-펄스된 LC에 의해 효율적으로 차단하였다(도 2a). 역학적 분석은, 매우 적은 항원-특이적인 CD8+ T 세포 증식이, 항-CD8 mAb를 배양물에 가하는 경우 1일 내지 9일째에 관측됨을 나타낸다(도 2b). CD8+ T 세포 프라이밍의 억제는, 0.1 ㎍/ml의 항체가 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 증대를 거의 완전하게 억제하였으므로 매우 효과적이었으며, 50% 억제 농도(IC50)는 50 내지 500 ng/ml의 범위였다(도 2c). 시험한 항-CD8 항체(T8, RPA-T8 및 OKT8) 중 3개가 T 세포 프라이밍을 억제하였다(도 2d).
70시간까지 배양물에 항-CD8 mAb의 첨가를 지연시킴에 의해 흑색종 특이적인 CD8+ T 세포 프라이밍의 75%가 억제되었다(도 2e). 저 농도의 항-CD8의 존재하에서 MART-1 펩타이드-로딩된 LC 및 미감작 CD8+ T 세포의 배양으로 1차 대조군 배양물과 비교하여 감소된 수의 MART-1 특이적인 CD8+ T 세포가 수득되었다(도 2f). 또한, 항-CD8 mAb에 노출된 CD8+ T 세포는 대조군 항체에 노출된 것들과 비교하는 경우, 보다 낮은 MART-1 MHC-사량체 강도 염색을 나타내었다. 추가의 항-CD8 mAb를 배양물에 가할수록, 항원-특이적인 T 세포상에 사량체 강도 결합이 덜 관측되었다(도 2g).
항-CD8 mAb는 또한 GM-CSF 및 IFN(IFN-DC)와 함께 단핵구를 배양함으로써 생성시킨 DC에 의해 유도된 MART-1 및 gp100-특이적인 CD8+ T 세포의 프라이밍을 차단할 수 있었으며(도 2h), 이는, 억제 효과가 프라이밍을 위해 선택한 DC의 공급원 또는 항원에 의존적이지 않음을 나타낸다. 또한, 항-CD8 mAb는, 심지어 고 농도의 펩타이드를 DC 상에 로딩하거나, 항원이 배양 전체에 존재하는 경우에도 프라이밍을 차단할 수 있었다(도 2i). 이들 데이터는, CD8을 차단하는 것이 고-항원항체결합성 항원-특이적인 미감작 T 세포의 DC-유도된 프라이밍을 방지함을 입증한다.
항-CD8 항체는 CD8 T 세포의 DC 매개된 동종증식을 억제한다. 항-CD8 mAb 또는 이소타입 대조군을 미감작 CD8+ T 세포의 배양물에 구배된 수의 시험관내 생성된 동종이계 LC와 함께 가하였다. [3H]티미딘 혼입 검정을 사용하는 도 3a에 나타낸 바와 같이, 동종이계 미감작 CD8+ T 세포의 LC 유도된 증식은 항-CD8 mAb에 의해 억제되었다. LC와 동종이계 미감작 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 공동배양물에서 수행된 CFSE 희석 검정은 CD8+ T 세포 증식의 억제를 입증하였다(도 3b 상부 패널). 이는 또한, 동종이계 CD4+ T 세포의 증식이 항-CD8 항체에 의해 영향받지 않았음을 나타내었다(도 3b 하부 패널). 또한, CD8+ T 세포 증식은 30 ng/ml에서 억제되었지만(도 3c 상부 패널), CD4+ T 세포는 사용된 항-CD8 mAb의 어떠한 농도(0-3 μg/ml)에 대해서도 감소된 증식을 나타내지 않았다(도 3c 하부 패널). 사람 피부로부터 분리한 진피 DC 또는 LC에 의해 유도된 동종이계 T 세포의 격렬한 증식은 또한 항-CD8 mAb에 의해 차단되었다(도 3d 및 e). 항-CD8 mAb의 존재하에서, 단지 약간의 분산된 작은 클러스터(cluster)가 CD8+ T 세포 및 DC 사이에 형성되었다(도 3f). 그러나, 항-CD8 mAb의 부재하에서의 배양시, 격렬한 증식은 DC 및 CD8+ T 세포의 많은 큰 클러스터들과 관련되었다(도 3g). 따라서, 항-CD8 항체는 동종이계 CD8+ T 세포의 DC-매개된 프라이밍을 억제할 수 있다.
항-CD8은 자가 또는 동종이계 항원에 대한 2차 반응을 차단하지 않는다. 기억 CD8+ T 세포 반응이 항 CD8 mAb, HLA-A2+ LC 또는 IntDC에 의해 억제되는지를 시험하기 위하여, 면역우세 HLA-A2 결합 인플루엔자 매트릭스 단백질 M1 펩타이드(57-68)와 함께 로딩시킨 HLA-A2+ LC 또는 IntDC를 CD8+ T 세포와 항-CD8 mAb 및 이의 관련 대조군과 함께 배양하였다. DC 아그룹의 경우, 사량체 염색에 의해 측정한 것으로서, 항원 특이적인 CD8+ T 세포의 수는 항-CD8 mAb 또는 이소타입 대조군과 필적하였다(도 4a 및 c). 심지어 2.5㎍/ml로 높은 항-CD8 mAb의 농도로도 억제가 검출되지 않았다(도 4b 및 d). 시험한 2개의 다른 항-CD8 mAb(T8 베크만, RPA-T8 BD)는 기억 세포의 flu 펩타이드-유도된 활성화를 억제하지 않았다(도 4e).
기억 동종이계 CD8+ T 세포 반응이 항-CD8 mAb에 의해 영향을 받는지를 입증하기 위해, 미감작 CD8+ T 세포를 동종이계 LC 또는 IntDC에 의해 7일 동안 프라이밍하고 T 세포를 3일 동안 재자극시켰다. 도 4f에 나타낸 바와 같이, 항-CD8 mAb는 LC 또는 IntDC를 사용하는 원래의 동종항원을 사용한 CD8+ T 세포 재자극을 억제할 수 없었다. 따라서, 이들 데이터는, 기억 CD8+ T 세포 반응이 CD8-비의존성임을 입증한다.
항-CD8 mAb를 사용한 CD8+ T 세포의 프라이밍으로 낮은 수준의 세포분해 분자를 갖는 제2형 T 세포가 수득된다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 동동이계 DC를 사용한 프라이밍 동안에 항-CD8 mAb에 노출된 CD8+ T 세포는 낮은 수준의 CD25, ICOS, CD27, CD28 및 그랜자임 A 및 B 및 퍼포린의 보다 낮은 세포내 발현을 발현하였다(도 5a). LC 및 이소타입 대조군으로 7일 동안 프라이밍된 CD8+ T 세포는 항-CD3 및 항-CD28로 24시간 동안 재자극한 후, IFN-γ(2,000 내지 6,000 pg/ml) 및 IL-2(1,000-6000 pg/ml) 및 낮은 수준의 IL-4, IL-5, IL-13 및 IL-10을 생산하였다. LC 및 항-CD8로 프라이밍된 CD8+ T 세포는 동일한 양의 IFN-γ 및 IL-2와 그러나 많은 양의 IL-4 (100-600 pg/ml), IL-5 (500-2500 pg/ml), IL-13 (1000-7000 pg/ml) 및 IL-10 (70-100 pg/ml)를 분비하였다(도 5b).
총괄적으로, 당해 데이터는, 항-CD8 mAb가 활성화된 CD8+ T 세포의 표현형을 변경시켜 제2형 사이토킨을 분비하고 낮은 수준의 세포독성 분자를 발현하는 세포를 생산함을 나타낸다.
항-CD8의 존재하에서 프라이밍된 동종반응성 CD8+ T 세포는 미감작 CD8+ T 세포 반응을 강력하게 억제한다. 항-CD8 mAb의 존재하에서 프라이밍된 CD8+ T 세포가 억제인자 작용을 나타내는지를 입증하기 위하여, CFSE-표지된 미감작 CD8+T 세포(공여자 A)를 동종이계 LC(공여자 B)와 항-CD8 mAb 또는 이소타입 매치된 대조군과 함께 7일 동안 배양하였다. 활성화된 CD8+ T 세포(CFSE-CD11c-)를 분류하고 구배된 수(3 내지 300)에서 공여자 A로부터의 50,000개의 자가 미감작 CD8+ T 세포와 공여자 B로부터의 2500개 동종이계 LC의 공동배양물에 가하였다. 항-CD8 mAb로 프라이밍된 CD8+ T 세포는 100개의 적은 세포로 동종반응을 약 80% 억제하고 10개 세포로 50% 차단하는, 투여량-의존적 방식으로 동종이계 LC에 대한 미감작 CD8+ T 세포의 증식을 강력히 억제하였다. 그러나, 이소타입 대조군으로 프라이밍된 CD8+ T 세포는 억제를 나타내지 않았다(도 6a). 당해 억제는, 억제가 공여자 C로부터의 DC를 사용하여 덜 강력하므로, 항-CD8 mAb 처리된 CD8+ T 세포가 자체의 동종특이적인 DC로 제공된 경우 특히 놀라운 것이다(도 6b).
항-CD8 mAb는 동종이계 CD8+ T 세포 활성화 및 이식체-대-숙주병을 생체내에서 억제한다. 항-CD8 항체를 사용하여 시험관내에서 관측한 CD8+ T 세포 프라이밍의 강력한 억제는, 이것이 pDC, mDC 및 B 세포로 분화되지만 T 세포로는 분화되지 않는 사람 CD34+HPC로 이식된 면역결핍성 NOD-SCID 마우스내에서 생체내 발생할 수 있는지를 시험하도록 하였다. 이들 사람화된 마우스를 동종이계 공여자로부터 20x106개의 정제된 CD8+ T 세포로 항-CD8 mAb 또는 이소타입-매치된 대조군 항체 0.75mg과 함께 피하로 적절하게 이전시켰다. 추가의 0.25 mg의 항체를 3일째에 주사하였다. 2개 실험중 하나에서, 항-CD40(MAB89, 제조원: 쉐링 플라우, 100 ㎍)을 DC 활성화를 위해 복강내 주사하였다. 마우스를 아픔의 신호에 대해 정규적으로 실험하였다. CD8+ T 세포 이전후 10주 째에, 이소타입-매치된 대조군 항체를 제공받은 마우스는 눈 주변의 발진, 체중 감소 및 약화를 동반한 만성 이식체-대-숙주병의 임상 증상으로 발전하였다(도 7a). 그러나, 항-CD8 항체를 사용한 처리는 병원성 T 세포의 활성화 및 증대 둘다 및 임상 증상의 발전을 완전히 억제하였다(도 7). 이소타입 대조군 처리된 마우스의 골수로부터의 CD8+ T 세포는 CD103을 상향조절한 반면, 항-CD8 mAb로 처리한 마우스는 그렇지 않았다(도 7b).
총체적으로, 이들 데이터는, 항-CD8 mAb 치료요법이 사람 면역 시스템을 수반하는 면역결핍성 마우스에서 이식체-대-숙주병을 매개하는, CD8+ T 세포의 동종이계 1차 활성화를 방지하는데 효과적임을 나타낸다.
본 연구는, LC가 미감작 CD8+ T 세포를 프라이밍하는데 있어서 간질 DC보다 더 강력한 반면, mDC 아그룹 둘다는 2차 CD8+ T 세포 반응을 유도하는데 있어서 동등하게 효율적인 이유를 이해하기 위해 수행되었다. 몇가지 결론이 CD8+ T 세포 및 DC의 공동배양물에 항-CD8 mAb를 가한 결과로부터 귀결되었다. 우선, 미감작 CD8+ T 세포의 프라이밍은 매우 낮은 농도의 항체에서도 완전히 억제되는 반면, 기억 세포의 활성화는 높은 농도의 항체에서조차 영향받지 않았음이 밝혀졌다. 둘째로 잔류성의 증식하는 세포는 효과인자 경로보다는 오히려 억제인자 경로를 따라 분화되었다.
이들 데이터는, 전체의 시험한 항-CD8 모노클로날 항체가 시험관내 자가 또는 동종이계 MHC의 측면에서 발현된 항원에 대한 CD8+ T 세포의 DC-매개된 증식을 매우 낮은 농도에서 차단함을 입증하였다. 그러나, 바이러스 또는 동종이계 항원에 대한 회상 반응은 항-CD8 mAb에 의해 억제되지 않았다. 이들 데이터는, 항-CD8 항체가 미감작 CD8+ T 세포의 증식을 차단할 수 있지만 효과인자 및 기억 세포의 증식을 차단할 수 없음을 나타내는 마우스 림프세포를 사용한 시험관내 연구에서의 앞서의 보고와 일치한다6. 동종반응성 미감작 CD8+ T 세포의 활성화를 또한 차단한 항-CD8은 또한 이식체 대 숙주 반응을 제거하는 사람화된 마우스 모델에서 생체내 관측되었다. 아마도 대부분의 놀랄만한 관측은, 항-CD8 항체가 억제인자 반응에 대한 효과인자 반응으로부터의 반응 유형을 정성적으로 변형시킨다는 것이다. 일반적인 억제인자 세포는 그랜자임 A 및 B와 퍼포린의 낮은 발현 및 낮은 CD28을 갖는 독특한 표현형을 발현한다. 또한, 이들 세포는 제2형 사이토킨(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 증가된 발현 및 IL-10의 증가된 발현의 변경된 표현형 패턴을 발현한다. 또한, 이들 세포는, 특히 동족 APC에 의해 활성화되는 경우, 이들 세포 중 100개가 동종반응의 80%를 차단할 수 있으므로 강력한 억제능을 발현한다. 흥미롭게도, 이러한 표현형은, 본 출원인이 또한 보고한 CD14+IntDC를 능가하는 배양된 CD8+ T 세포의 표현형과 비교할만하다.
이들 관측은, T 세포가 동종이식거부의 주요 매개인자이므로 임상적 중요성을 갖는다11 , 12. 많은 노력이 동종이식체 수용체에서 T 세포의 초기 활성화를 특이적으로 차단하는 치료요법을 설계하는데 집중되어 왔다. CD4+ T 세포-의존성 및 CD8+ T 세포-의존성 경로는 동종이식 거부를 개시하는 것으로 입증되었다. 라파마이신13, 사이클로스포린14, 항-CD4 mAb15, 항-CD154 mAb16 및 CTLA4-Ig17과 같은 면역조절 방법은 CD4-의존성 면역 활성화를 억제하는데 있어서 매우 효과적이지만, 거부의 CD8-의존성 경로는 연구에서 내성인 것으로 입증되었다. 칼시뉴린 억제제에 의한 제어에 대한 CD8+ T 세포의 내성은 또한 임상 연구에서 급성 동종이식 거부의 증가된 출현과 관련되어 있다18. 이는, 생체내에서 관측된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 상이한 공동자극성 요구도에 일치한다. CD8-의존성 동종이식 거부는 CD40/CD154 공동자극에 의존하며 CD28/B7 공동자극 경로와는 독립적이다17.
제1 세대 항-CD3 mAb는 동종이식 수용체에서 T 세포의 초기 활성화를 차단하여, 대부분의 다른 면역억제 치료를 사용하는 것과 같이, CMV와 같은 심각한 바이러스 감염과 관련된 면역억제를 초래한다. 따라서, 항-CD8이 효과인자 세포 프라이밍을 차단하는 반면 바이러스 특이적인 기억 반응을 완전하게 남긴다는 관측은 이식체를 공격하는 동종반응성 CD8+ T 세포의 생성을 방지하는 반면 항-바이러스 2차 반응은 완전히 둘 수 있다.
이식 부위에서 CD8+ T 세포에 의한 CD103의 상향-조절은 동종이식 손상을 매개하는 CD8+ T 세포의 능력과 밀접하게 연관되어 있다19. 상피 세포-특이적인 인테그린, CD103(αE 인테그린)은 동종반응성 CD8+ CTL의 신규 아그룹을 정의한다20. 동종이식 거부의 (CD4-비의존성) CD8-의존성 경로의 활성화는 면역조절에 대해 매우 내성인, 격렬한 면역 반응을 유발한다. 신장 거부 동안 주로 CD8+CTLA4+ T 림프구의 강력한 국소 침윤이 환자에서 기술되어 왔다. 이는, CD8+ T 세포가 면역억제로부터 탈출하여 거부 과정에 관여함을 제안한다. CD4 및 CD8 반응 둘다의 제어는 내성 및 장기간 생존을 촉진하는데 필수적일 수 있다21.
CD8 치료요법은 또한 루푸스 또는 당뇨병과 같은 자가면역병에서 자가반응성 CD8+ T 세포의 프라이밍을 방지하는데 있어서 유리할 수 있다.
본 명세서에 논의된 임의의 양태는 본 발명의 어떠한 방법, 키트, 시약 또는 조성물과 관련하여 및 역으로 시행될 수 있음이 고려된다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 특정 양태가 본 발명의 예시의 방식으로 본 발명을 제한함이 없이 제시되어 있음이 이해될 것이다. 당해 발명의 주요 특징은 본 발명의 영역에서 벗어남이 없이 각종 양태에서 사용될 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 통상의 실험, 본원에 기술된 특정 과정에 대한 다수의 동등물을 사용하여 인지하거나 추정할 수 있을 것이다. 이러한 동등물은 본 발명의 영역내에 있는 것으로 고려되며 특허청구범위에 포함된다.
명세서에 언급된 모든 공보 및 특허원은 본 발명이 속한 당해 분야의 숙련가의 수준의 지표이다. 모든 공보 및 특허원은, 각각의 개개 공보 또는 특허원이 참조로 인용될 것으로 구체적으로 및 개별적으로 나타낸 경우와 동일한 정도로 참조로 본원에 인용된다.
특허청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 관련하여 사용되는 경우, 단수의 사용은 하나를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나보다 많은"의 의미와 일치한다. 특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 비록 기술이 단지 대안 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다고 해도, 대안만을 언급하거나 대안이 상호 제외되는 것으로 명백하게 나타내지 않는 한, "및/또는"을 의미하는데 사용된다. 당해 명세서 전체에서, 용어 "약"은 값이, 당해 값을 측정하는데 사용된 장치, 방법의 경우 고유의 오차 변화, 또는 연구 대상체 중에 존재하는 변화를 포함함을 나타내는데 사용된다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용된 것으로서, 용어 "포함하는"(및 "포함하다"와 같은 "포함하는"의 어떠한 형태), "갖는"(및 "가지다"와 같은 "갖는"의 어떠한 다른 형태), "포괄하는"(및 "포괄하다"와 같이 "포괄하는"의 어떠한 다른 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유하다"와 같은 "함유하는"의 다른 형태)는 포괄적이거나 개방형이며 추가의, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계들을 제외하지는 않는다.
본원에 사용된 것으로서, 용어 "또는 이들의 조합"은 용어에 앞선 나열된 용어들의 모든 순열 및 조합을 말한다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC, 및 특정 내용에서 순서가 중요한 경우, 또한 BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB 중 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도된다. 당해 예와 연속하여, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB, 등과 같은 하나 이상의 항목의 반복을 함유하는 조합이 명백히 포함된다. 당해 분야의 숙련가들은, 내용으로부터 달리 명확하지 않는 한, 통상적으로 어떠한 조합으로도 항목 또는 용어의 수를 제한하지 않음을 이해할 것이다.
본원에 기술되고 청구된 조성물 및/또는 방법 모두는 본 기재내용의 측면에서 과도한 실험없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 측면에서 기술되었지만, 당해 분야의 숙련가에게는, 변형이 본 발명의 요지, 취지 및 영역에 벗어남이 없이 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법 및 방법의 단계들 또는 단계들의 순서에 적용될 수 있음이 명확할 것이다. 당해 분야의 숙련가에게 명확한 모든 이러한 유사한 치환 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 것으로서 본 발명의 취지, 영역 및 요지내에 있는 것으로 고려된다.
참고문헌
Claims (33)
- 분리된 T 세포를 관용원성(tolerogenic) T 세포를 유도하는데 효과적인 양의 비-고갈성(non-depleting) 항-CD8 항체와 항원과의 T 세포 프라이밍 동안 접촉시키는 단계; 및
내성이 요구되는 대상체에게 상기 관용원성 T 세포를 제공하는 단계
를 포함하여, 내성이 요구되는 대상체에서 내성을 유도하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 사람화된 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 비-고갈성인 방법.
- 제1항에 있어서, 억제인자 T 세포의 생성이 그랜자임 A에 있어서의 감소, 그랜자임 B에 있어서의 감소, 퍼포린의 감소, 감소된 양의 IL-2, IFN-γ 또는 둘다의 분비, IL-10의 분비 또는 이들의 조합의 표현형들 중 하나 이상을 측정함에 의해 측정되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 억제인자 T 세포의 생성이 IL-10을 분비하는 억제인자 T 세포의 증식인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 OKT8로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 항원이 동종이계(allogeneic)인 방법.
- 분리된 CD8+ T 세포를 억제인자 CD8+ T 세포의 생성을 개시하기에 효과적인 양의 항-CD8 비-고갈성 차단 항체로 항원과의 프라이밍 동안 처리하는 단계(여기서, 상기 T 세포의 억제는 그랜자임 A에 있어서의 감소, 그랜자임 B에 있어서의 감소, 퍼포린의 감소, 감소된 양의 IL-2, IFN-γ 또는 둘다의 분비, IL-10의 분비 또는 이들의 조합의 표현형들 중 하나 이상에 의해 특징지어진다); 및
상기 억제인자 CD8+ T 세포를 이식 환자내로 도입시키는 단계
를 포함하여, 다른 면역 반응은 유지시키면서 이식 환자에서 이식 거부를 감소시키는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포를, GM-CSF 및 IFN-α-2b와 함께 배양시킨 단핵구로부터 수득한 분리된 수지상 세포(IFN-DC)와 함께 배양하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 수지상 세포는 CD34+ 사람 말초 세포를 9 내지 10일 동안 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양함에 의해 시험관내에서 생성된 랑게르한스 세포(Langerhans cell: LC)인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 수지상 세포가 CD1a+CD14- LC인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 바이러스에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않으면서 이식된 기관에 대한 면역 반응을 하향-조절하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 항-CD8 항체로 처리한 상기 CD8+ T 세포가 고-항원항체결합성(high-avidity), 항원-특이적인 미감작(naive) T 세포인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 OKT8 중에서 선택되는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공되는 방법.
- 제8항에 있어서,
말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하는 단계,
상기 LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양하여 LC를 제조하는 단계,
말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하여, 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에 상기 LC와 상기 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에서 공동-배양하는 단계, 및
상기 T 세포, 상기 LC 또는 이들 둘다를, 이식 전에, 이식과 함께 또는 이식 후에 환자내로 재도입시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 이식 환자로부터 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
LC를 분리하여 LC GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα를 배양하는 단계,
상기 이식 환자로부터 T 세포를 분리하고, 상기 LC와 상기 T 세포를 항-CD8 항체의 존재하에 공동-배양하여 억제인자 T 세포를 생성시키는 단계, 및
상기 T 세포, 상기 LC 또는 이들 둘다를, 이식 전에, 이식과 함께 또는 이식 후에 상기 환자내로 재도입시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 억제인자 CD8+ T 세포가 제2형 사이토킨(IL-4, IL-5 및 IL-13) 및 IL-10의 증가된 발현을 갖는 방법.
- 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 랑게르한스 세포(LC) 전구체를 분리하는 단계,
상기 LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 배양하여 LC를 제조하는 단계,
말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하는 단계, 및
상기 LC 및 상기 T 세포를 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에 항-CD8 항체의 존재하에서 공동-배양하는 단계
를 포함하는, 억제인자 T 세포의 제조 방법. - 제19항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 바이러스에 대한 면역 반응에 영향을 미치지 않으면서 이식된 기관에 대한 면역 반응을 하향-조절하는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 CD8+ T 세포가 고-항원항체결합성 항원-특이적인 미감작 T 세포인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 랑게르한스 세포가 CD1a+CD14- LC인 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 CD1a+CD14- 랑게르한스 세포가 세포 분류에 의해 수득되는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 랑게르한스 세포가 9 내지 10일 동안 CD34+ HPC를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양함에 의해 시험관내에서 생성되는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 OKT8 중에서 선택되는 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공되는 방법.
- 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 단핵구를 분리하는 단계,
상기 단핵구를 GM-CSF 및 IFN-α-2b와 함께 배양하여 IFN-DC를 제조하는 단계,
말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하는 단계, 및
상기 IFN-DC와 상기 T 세포를, 그랜자임 A에 있어서의 감소, 그랜자임 B에 있어서의 감소, 퍼포린의 감소, 감소된 양의 IL-2, IFN-γ 또는 이들 둘다의 분비, IL-10의 분비 또는 이들의 조합으로 측정되는 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에 항-CD8 항체의 존재하에서 공동-배양하는 단계
를 포함하여, 억제인자 T 세포를 제조하는 방법. - 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하는 단계,
상기 LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양하여 LC를 제조하는 단계,
말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하는 단계, 및
상기 LC와 상기 T 세포를 억제인자 T 세포를 생성시키는 조건하에 항-CD8 항체의 존재하에 공동-배양시키는 단계
에 의해 제조된 억제인자 T 세포를 포함하는 조성물을 투여함
을 포함하여, 면역 반응에 영향을 미치는 방법. - 말초 혈액 단핵 세포를 분리하는 단계,
상기 말초 혈액 단핵 세포로부터 LC 전구체를 분리하는 단계,
상기 LC 전구체를 GM-CSF, Flt3-L 및 TNFα와 함께 배양하여 LC를 제조하는 단계,
말초 혈액 단핵 세포로부터 T 세포를 분리하는 단계, 및
상기 LC와 상기 T 세포를 억제인자 T 세포를 생성시키는 조건하에 항-CD8 항체의 존재하에 공동-배양시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조된 억제인자 T 세포를 도입함
을 포함하여, 포유동물에서 이식된 조직의 거부를 억제하는 방법. - 다른 면역 반응을 제거하지 않으면서 이식 거부를 감소시키기에 충분한 유효량의 억제인자 T 세포를 포함하는, 이식 거부를 감소시키는 조성물로서, 상기 억제인자 T 세포는 억제인자 T 세포를 생성하는 조건하에서 항-CD8 항체의 존재하에 성숙한 LC와 함께 공동-배양시킨 분리된 말초 혈액 T 세포로부터 생성되는, 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 cM-T807, T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8, 및 OKT8 중에서 선택되는, 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 항-CD8 항체가 배양물 중에 0.5 내지 5,000 ng/ml로 제공되는, 조성물.
- 제30항에 있어서, 상기 세포가 동결되고, 사용 전에 주사용 매질 중에 재현탁되는, 조성물.
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