TW201000130A - Anti-CD8 antibodies block priming of cytotoxic effectors and lead to generation of regulatory CD8+ T cells - Google Patents
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Description
201000130 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 概言之，本發明係關於調控型τ細胞領域，且具體而言 係關於製備並使用抗-CD8抗體之組合物及方法。 . 【先前技術】 '在不限制本發明範圍之情況下，結合免疫細胞耐受性來 •闡述本發明之背景。 頒予Reichert等人之美國專利第5,593,677號教示預防移 φ 植物抗宿主病之方法。該方法包括在人類中經由組合抗 CD8單株抗體及CD4+細胞滅活劑之使用來治療及預防移植 物抗宿主病。在欲實施骨髓移植之患者中（其中同種異體 供者之骨髓已針對HLA相容性與患者進行匹配）阻止或預 防GVHD之方法包含以下步驟：用一或多種抗CD8單株抗 體及補體以足以將T細胞毒殺/抑制性細胞消耗至1%以下之 量處理供者骨髓，將經處理骨髓移植至患者中，並向該患 者投與足以滅活CD4 +細胞之有效量之環孢菌素A。 ® 頒予Tykocinski等人之美國專利第5,601,828號係關於 CD8衍生物及用於細胞調節及促進細胞移植物植入之方 .法。藉由使用各種膜結合及溶解性CD8組合物來達成特異 性及非特異性免疫調節、促進細胞移植物植入、及非免疫 細胞之調節。在本專利中，特異性降低T細胞增殖或細胞 毒性之方法涉及同種異體抗原或MHC相關抗原，該方法包 括提供非天然存在之膜，其中或其表面上存在CD8之細胞 外結構域部分及同種異體抗原或MHC相關抗原，其中至少 140774.doc 201000130 包含免疫球蛋白v同系物結構域之CD8之細胞外結構域部 分共價連接至與細胞表面分子共價或非共價鍵結之分子； 及使該膜暴露於能對同種異體抗原或河11(：相關抗原起反應 之τ、·’田胞之間，暴露時間及條件足以降低τ細胞對同種異體 抗原或MHC相關抗原之特異性細胞免疫反應。 頒予Sachs之美國專利第5,876,7〇8號係關於誘導耐受性 之同種異體及異種移植及方法（其包括向接受者施用有助 於減少治療之短期輔助治療）以及藉由施用短期之免疫抑 制劑來延長對移植物之接受之方法。該方法包括在第一物 種之接受靈長類中藉由以下方式來誘導對得自第二物種哺 乳動物之移植物之耐受性：將第二物種之造血幹細胞引入 接受者’在接受者中植入移植物；使接受者之T細胞失 活；並且向接受者施用短期之免疫抑制劑，其中該試劑並 非抗T細胞抗體且短期療程等於或短於12〇天，由此誘導對 移植物之财受性。 亦頒予Sachs之美國專利第6,911220號係關於同種異體 及異種移植。本發明提供恢復或誘導免疫活性之方法，該 方法包括將供者胸腺組織引入接受者中之步驟。本發明亦 提供在接受者中誘導耐受性之方法，其包括將供者胸腺組 織引入接受者。本發明另外提供誘導耐受性之方法（其包 括向接受者施用有助於減少治療之短期輔助治療）以及藉 由施用短期之免疫抑制劑來延長對移植物之接受之方法。
Bushe11等人申請之美國專利申請案第20070166307號係 關於對移植排斥之抑制。簡言之，其教示在動物中可藉由 140774.doc 201000130 以下方式來抑制移植排斥：投與針對選自由以下組成之群 之細胞表面抗原之抗體、較佳抗CD4抗體以及非細胞蛋白 抗原而在動物中生成調控型T-淋巴細胞群：CD4、CD8、 CD154、LFA-1、CD80、CD86及 ICAM-1 ;藉由另外向動 物投與非細胞蛋白抗原來使調控型T-淋巴細胞群再活化； 及在活化調控型T-淋巴細胞群之同時移植器官或組織。可 藉由在呈遞同種異體抗原或非細胞蛋白抗原之細胞存在下 與針對選自由以下組成之群之細胞表面抗原之抗體一起培 養T細胞來在體外生成調控型T細胞：CD4、CD8、 CD154、LFA-1、CD80、CD86及 ICAM-1。體外生成之 τ- 淋巴細胞可用作克服移植排斥之替代方法或與體内方法組 合使用。可採用類似方法來治療自身免疫病況。
Qi等人申請之美國專利申請案第20050042217號係關於 對同種異體排斥的特異性抑制。該說明書提供特異性抑制 針對同種異體抗原之細胞及體液免疫反應二者之方法及組 合物’由此其可用於延長所移植同種異體移植物之存活期 及在移植接受者中治療移植物抗宿主病。該方法教示抑制 針對乾T細胞特同種異體抗原之主體免疫反應，其係藉由 使表現抗原之靶T細胞與編碼具有CD8 α-鏈之CD8多肽之 表現載體接觸來達成’其中該CD8多肽係由靶Τ細胞來表 現’且藉此特異性抑制針對靶Τ細胞之主體免疫反應。亦 即’把Τ細胞上CD8之增加可特異性抑制免疫反應。 【發明内容】 本發明包括在有需要的個體中誘導免疫耐受性之組合物 140774.doc 201000130 及方法。在一實施例中，可使用該等組合物及方法藉由向 個體提供有效量之足以誘導CD8+ T細胞針對抗原之免疫 耐受性的抗CD8抗體而在個體中誘導免疫耐受性。在一態 樣中，對抗CD8抗體實施人類化。在另一態樣中，抗CD8 抗體未耗盡。該方法亦可包括生成抑制性T細胞，其可藉 由量測或測定一或多種以下表型來測定：粒酶A之減少、 粒酶B之減少、穿孔素之減少、少量IL-2、IFN-γ或二者之 分泌、IL-10之分泌或其組合。在一態樣中，抑制性T細胞 之生成係分泌IL-10之抑制性T細胞之增殖。在另一態樣 中，抗CD8抗體選自 CM-T807、T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及OKT8。在一實例中，抗原係同種異體的。 在另一實施例中，本發明包括可在移植患者中降低移植 排斥同時維持其他免疫反應之組合物及方法，其係藉由以 下方式來達成：用一定量之可有效引發抑制性CD8+ Τ細 胞生成之抗CD8未耗盡阻斷抗體來處理經分離CD8+ Τ細 胞，該生成之特徵在於一或多種以下表型：粒酶Α之減 少、粒酶B之減少、穿孔素之減少、少量IL-2、IFN-γ或二 者之分泌、IL-10之分泌或其組合；且將抑制性CD8+ T細 胞引入移植患者中。在一態樣中，將CD8+ T細胞與得自 與GM-CSF及IFN-a-2b—起培養之單核細胞之經分離樹突 細胞（IFN-DC)—起培養。在另一態樣中，樹突細胞係藉由 將CD34+人類外周細胞與GM-CSF、Flt3-L及TNFa—起培 養9至10天在體外生成之朗格漢斯細胞（Langerhans cell) (LC)。樹突細胞之另一實例係CDla+CD14-LC。在另一態 140774.doc 201000130 樣中，抗CD8抗體可下調針對所移入器官之免疫反應，而 不影響針對病毒之免疫反應。在另一態樣中，經抗CD8抗 體處理之CD8+ T細胞係高親和性、抗原特異性天然T細 胞。在一非限制性實例中，抗CD8抗體選自CM-T807、 T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、OKT8及表 1 中所列之 抗-CD8抗體。在體外處理T細胞之一態樣中，以0.5-5,000 ng/ml在CD8+ T細胞培養物中提供抗CD8抗體。對於體内 應用，可端視個體體重來提供本發明以達成類似程度之等 效血液濃度。 在另一態樣中，本發明亦可包括以下步驟：分離外周血 單核細胞，自外周血單核細胞分離LC前體，將LC前體與 GM-CSF、Flt3-L、及TNFa—起培養以製備LC，自外周血 單核細胞分離T細胞並在抗CD8抗體存在下及在可生成抑 制性T細胞之條件下共培養L C與T細胞，及在移植之前、 同時或之後將T細胞、LC或二者再引入患者中。在另一態 樣中，該方法亦可包括以下步驟：自移植患者分離外周血 單核細胞，分離LC並培養LC與GM-CSF、FU3-L及TNFcx， 自移植患者分離T細胞並在抗CD8抗體存在下共培養LC及T 細胞以生成抑制性T細胞，及在移植之前、同時或之後將T 細胞、LC或二者再引入患者中。在一態樣中，抑制性 CD8+ T細胞中2型細胞素（IL-4、IL-5及IL-13)及IL-10之表 現量增加。 本發明之另一實施例包括製備抑制性T細胞之方法及藉 此製備之細胞，該方法包括分離外周血單核細胞，自該等 140774.doc 201000130 外周血單核細胞分離LC前體，將LC前體與GM-CSF、Flt3-L、及TNFa—起培養以製備LC，自外周血單核細胞分離T 細胞並在抗CD8抗體存在下及在可生成抑制性Τ細胞之條 件下共培養LC與Τ細胞。在一態樣中，抗CD8抗體可下調 針對所移入器官之免疫反應，而不影響針對病毒之免疫反 應。在一態樣中，CD8+ Τ細胞係高親和性抗原特異性天 然Τ細胞。在一態樣中，朗格漢斯細胞係CDla+CD14-LC。在另一態樣中，CDla+CD14-朗格漢斯細胞係藉由細 胞分選來獲得。在另一態樣中，朗格漢斯細胞係藉由將 CD34+ HPC 與 GM-CSF、FH3-L 及 TNFa —起培養 9 至 10 天在 體外生成。在一態樣中，抗CD8抗體選自CM-T807、T8、 RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。抗 CD8抗體亦可 以0.5-5,000 ng/ml在培養物中提供。 在另一實施例中，本發明包括製備抑制性T細胞之方法 及藉此製備之抑制性T細胞，其係藉由以下步驟來達成： 分離外周血單核細胞，自外周血單核細胞分離單核細胞， 將單核細胞與GM-CSF及IFN-a-2b —起培養以製備（IFN-DC)，自外周血單核細胞分離T細胞並在抗CD8抗體存在下 及在可生成抑制性T細胞之條件下共培養IFN-DC與T細 胞。 本發明之另一實施例係藉由投與包括抑制性T細胞之組 合物來影響免疫反應之方法，該等抑制性τ細胞係藉由以 下步驟來製備：分離外周血單核細胞，自該等外周血單核 細胞分離LC前體，將LC前體與GM-CSF、Flt3-L、及TNFa 140774.doc 201000130 一起培養以製備LC，自外周血單核細胞分離τ細胞並在抗 CD8抗體存在下及在可生成抑制性τ細胞之條件下共培養 LC與Τ細胞。 本發明之另一實施例係藉由引入抑制性Τ細胞在哺乳動 物中抑制對移植組織之排斥之方法，該抑制性Τ細胞係藉 由包括以下步驟之方法來製備：分離外周血單核細胞，自 該等外周血單核細胞分離LC前體，將LC前體與GM-CSF、 FU3-L、及TNFa—起培養以製備匕匸，自外周血單核細胞分 離τ細胞並在抗（：1)8抗體存在下及在可生成抑制性τ細胞之 條件下共培養LC與T細胞。 在另一實施例中，本發明係關於可降低移植排斥之組合 物，其包括有效量之足以降低移植排斥而不消除其他免疫 反應之抑制性τ細胞，其中該等抑制性τ細胞係自在抗CD8 抗體存在下及在可生成抑制性T細胞之條件下與成熟共 培養之經分離外周血T細胞生成。在一態樣中，抗CD8抗 體選自 CM-T807、T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。在另一態樣中，抗(::別抗體係以〇 55,〇〇() ng/ml在 培養物中提供。在一態樣中，將細胞冷凍起來並在使用前 將其再懸浮於注射用介質中。 【實施方式】 雖然下文詳述本發明多個實施例之製備及使用，但應瞭 解本發明可提供許多可在眾多種具體背景下實踐之實用發 明概念。本文所述具體實施例僅闈釋製備及使用本發明之 具體方式且並不限制本發明之範嘴。 140774.doc 201000130 為便於理解本發明，下文將定義多個術語。本文所定義 之術語具有熟習本發明相關領域技術者通常理解之含義。 諸如「一」及「該」等術語不欲僅指單數實體，而包含可 使用具體實例說明之一般類別。本文術語係用以闡述本發 明之具體實施例，而除申請專利範圍中所概述者之外，其 用法並不界定本發明。 樹突細胞（DC)係負責誘導Ag特異性免疫1之有效APC。 存在駐留在不同組織中之若干DC群，且其具有獨特功能 屬性1。健康皮膚具有至少兩種DC群，朗格漢斯細胞（LC) 存於表皮中且間質DC存於真皮中。該等DC遷移至引流淋 巴樣器官中，以在未活化時達成外周耐受性，且在已活化 時達成免疫。發現有其他DC駐留在次級淋巴樣器官中且 在血液中循環。使用在體外生成之DC進行施之研究為人 們對DC生物學之理解帶來很大進步。具體而言，在TNFa 及GM-CSF存在下培養CD34+造血祖細胞（HPC)可產生間質 DC及朗格漢斯細胞二者2。本發明已顯示LC而非IntDC可 尤其有效地起始（priming)原始CD8+ T細胞。同樣，兩個亞 類可等效地誘導記憶性反應，且經兩個亞類活化之CD8 + T細胞顯示可依同等程度表現CD8分子。
CD8係可用作與MHC I類分子（pMHCI)複合之肽抗原之 TCR識別共受體的表面糖蛋白。其表現為αα同二聚體或αβ 異二聚體3，兩種鏈皆表現單一細胞外Ig超家族（IgSF) V結 構域、近膜端鉸鏈區、跨膜結構域、及胞質尾區3。CD8使 用其β股及細胞外IgSF V結構域之互補決定區（CDR)與MHC 140774.doc -10- 201000130 I類分子之β2ιη及α2與α3結構域交互作用。此關聯增強T細 胞受體與其I類標靶之黏著性/親和性。此外，由與CD8a鏈 相關之酪胺酸蛋白激酶p561ck4’5介導之内部信號級聯導致 T細胞活化。原始CD8+ T細胞之活化及擴增需要Lck ;然 . 而其表現對記憶性CD8+ T細胞針對體内或體外次級抗原 刺激之反應而言並非必不可少6’7。如藉由CD8a或CD8P基 ^ 因靶向小鼠來顯示，CD8在MHC I類限制性T淋巴細胞之成 熟及功能實施中具有重要作用8’9。人們發現發生細菌反覆 ® 感染之患者由於CD8a基因中之單突變而顯示CD8不足。缺 乏CD8似乎對CD8+ T細胞之譜系定型或外周細胞溶解功能 無關緊要1()。 . 多種已知抗-CD8抗體中之任一種（包括單株抗體）皆可結 合本發明來使用，例如屬於國際人淋巴細胞分化抗原研討 會（HLDA)之彼等，包括：2D2、4D12.1、7B12 1G11、8E-1.7、8G5、14、21Thy、51.1、66.2、109-2D4、138-17、 143-44、278F24、302F27、AICD8.1、anti-T8、B9.1.1、 B9.2.4、B9.3.1、B9.4.1、B9.7.6、B9.8.6、B9.11、 B9.11.10、BE48、BL15、BL-TS8、BMAC8、BU88、 BW135/80、C1-11G3、C10、C12/D3、CD8-4C9、CLB-T8/1、CTAG-CD8, 3B5、F80-1D4D11、F101-87 (S-T8a)、 G10-1、G10-1.1、HI208、HI209、HI212、HIT8a、 HIT8b、HIT8d、ICO-31、ICO-122、IP48、ITI-5C2、 ITM8-1、JML-H7、JML-H8、L2、L533、Leu-2a、LT8、 LY17.2E7 > LY19.3B2、M236、M-T122、Μ·Τ415、M- 140774.doc -11· 201000130 T805、M-T806、M-T807、M-T808、M-T809、M-T1014、 MCD8、MEM-31、MEM-146、NU-Ts/c、OKT8、OKT8f、 P218、RPA-T8、SM4、T8、T8 /2T8-19、T8 /2T8-2A1、 T8 /2T8-1B5、T8 /2T8-1C1、T8 /7Pt3F9、T8 /21thy2D3、 T8 /21thy、T8 /TPE3FP、T8b、T41D8、T811、Ttt68、 Tttl02、UCHT4、VIT8、VIT8b、WuT8-l、X107、 YTC141.1、及 /或 YTC182.20. 表1.抗-CD8抗體之實例可包括彼等可自市場購得者，例 如得自Santa Cruz Biotechnology公司之彼等，且包括一或 多種以下抗原，或其人類化形式： 抗酸 同型物 表位 應用 物韁 CD8 (0.N.66) 小鼠IgGi C-末端(h) WB, IP, IF, IHC(P) 人類 CD8(1.BB.720) 小鼠IgGi FL (兔子） IF, FCM 兔子 CD8 (12.C7) 小鼠IgG! FL (兔子） IF, FCM 兔子 CD8 (14) 小鼠IgGi FL(h) IF 人類 CD8(15-11C5) 小鼠IgG2a FL(r) IF 大鼠 CD8 (2.43) 大鼠IgG2b FL(m) IF, FCM 小鼠 CD8 (32-M4) 小鼠IgG2a FL(h) WB, IP, IF, FCM 人類 CD8 (38.65) 小鼠IgG2a FL (綿羊） IP, IF, FCM 綿羊，牛 CD8 (5F10) 小鼠IgG1 FL(h) IF, IHC(P), FCM 人類 CD8 (5H10-1) 大鼠IgG2b FL(m) IF, FCM 人類 CD8 (6A238) 小鼠IgG, N/A FCM 馬 CD8 (6A243) 大鼠IgG, FL(i〇 FCM 人類，犬 CD8(6D17) 小鼠IgG2a FL(h) IP, FCM 人類 CD8 (733) 小鼠购 N/A FCM 人類 CD8 (8.F.36) 小鼠IgGi FL(h) FCM 人類 CD8 (B-H7) 小鼠IgG! FL⑻ IF 人類 CD8 (B334) 小鼠IgM N/A IF 人類 CD8 (C8/144B) 小鼠IgGi C-末端(h) WB, IP, IF, IHC(P) 人類 140774.doc -12- 201000130
抗艟 同型物 表位 應用 物種 CD8 (CT6) 小鼠IgGj FL (荷蘭豬） IF, FCM 荷蘭猪 CD8 (CVS8) 小鼠IgGi N/A FCM 馬 CD8 (DK25) 小鼠IgGi N/A IF 人類 CD8 (fCD8) 小鼠IgG! N/A IP, IF, FCM 描 CD8 (G28) 小鼠IgG2a FL(r) IP, IF, FCM 大鼠 CD8(H030-1.2) 小鼠IgM N/A IF 人類 CD8 (hCD8) 小鼠IgG2a FL(h) FCM 人類 CD8 (HIT8a) 小鼠IgGi FL(h) IF, FCM 人類 CD8 (ICO-31) 小鼠IgGi FL(h) FCM 人類 CD8 (JXYT8) 大鼠IgM FL (m) IF, IHC(P) 小鼠 CD8 (LT8) 小鼠IgG! FL(h) FCM 人類 CD8 (M211) 小鼠IgGi FL(h) IP 人類 CD8 (M236) 小鼠IgGi FL(h) IP 人類 CD8 (MCD8) 小鼠IgGi FL(h) IF, IHC(P), FCM 人類 CD8 (MEM-31) 小鼠IgG2a FL(h) IP, FCM 人類 CD8 (MEM-87) 小鼠IgG! FL(h) IP, FCM 人類 CD8 (MIL-12) 小鼠IgG2a N/A FCM 豬 CD8 (RAVB3) 小鼠IgGi Fl(h) WB, IF, FCM 人類 CD8 (RFT-8) 小鼠IgGi N/A IF, FCM 人類 CD8 (RIV11) 小鼠IgGi FL(h) IF, FCM 人類 CD8 (RPA-T8) 小鼠IgGi N/A IF, FCM 人類 CD8 (UCH-T4) 小鼠IgG2a FL(h) IP, IF, IHC(P), FCM 人類 CD8 (YCATE 55.9) 大鼠IgGi FL (犬） FCM 人類，犬 CD8 (YTC 141.1HL) 大鼠IgG2b FL(h) FCM 人類 CD8 (YTC 182.20) 大鼠IgG2b FL(h) FCM 人類 CD8 (YTS 156.7.7) 大鼠IgG2b FL(m) FCM 小鼠 CD8 (YTS 169.4) 大鼠IgG2b N/A IF, FCM 小鼠 CD8-a (76-2-11) 小鼠Ig〇2a N/A IP, FCM 豬 CD8-a (CT-8) 小鼠IgGi N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-a (EP72) 小鼠IgG2b N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-a (143-44) 小鼠IgGi FL(h) IF, FCM 人類 CD8-a (3-298) 小鼠IgG2b N/A IP, IF, FCM 雞 140774.doc -13- 201000130 抗tt 同型物 表位 應用 物種 CD8-a (3H842) 大鼠IgG2a FL(m) IP, IF, FCM 小鼠 CD8-a (4j9) 小 iJgGi N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-a (53-6.7) 大鼠IgG2a FL(m) IP, IF, FCM 小鼠 CD8-a (5J7) 小鼠IgGt FL(h) IF, FCM 人類 CD8-a (5K100) 小鼠IgG2b N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-a (5K97) 小鼠IgG2b N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-a (6A242) 小鼠IgGi FL(r) IP, IF, IHC(P), FCM 大鼠 CD8-a (C-19) 山羊IgG C-末端(h) WB,IF 人類 CD8-a (CA9.JD3) 小鼠IgG2a FL(々 IP, IF, FCM 犬 CD8-a (D-9) 小鼠IgG2a 22-182 (h) WB, IP, IF, IHC(P) m, r, h CD8-a(H-160) 兔子IgG 22-182 (h) WB, IP, IF m, r, h CD8-a (IBL-3/25) 大鼠IgG! FL(m) IP, IF, FCM 小鼠 CD8-a(KT15) 大鼠IgG2a FL(m) IF, FCM 小鼠 CD8-a (0X8) 小鼠IgG! FL(r) IP, IF, IHC(P), FCM 大鼠 CD8-a (R-15) 山羊 C-末端(r) WB, IP, IF m, r CD8-a (YTS105.18) 大鼠IgG2b FL(m) FCM 小鼠 CD8-a (YYEX) 小鼠IgG2b 細胞外（h) FCM 人類 CD8-P(1.BB.574) 小鼠IgG2a FL(h) FCM 人類 CD8-p (2ST8.5H7) 小鼠IgG2a FL(h) FCM 人類 CD8-P (341) 小鼠IgGi FL(r) WB, IP, FCM 大鼠 CD8-P (3H901) 小鼠IgG2a FL(h) FCM 人類 CD8-P (53-5.8) 大鼠IgG， FL(m) IP, IF, FCM 小鼠 CD8-P (5F2) 小鼠IgGi 内部（r) WB, IP, IF, IHC(P), FCM 人類 CD8-p(C-16) 山羊IgG C-末端（h) WB,IF 人類 CD8-p (EP42) 小鼠IgG2il N/A IP, IF, FCM 雞 CD8-P (F-5) 小鼠IgG2a 22-170 (h) WB, IP, IF, IHC(P) 人類 CD8-p (H-149) 兔子IgG 22-170 (h) WB, IP, IF m, r，h CD8-P (H35-17.2) 大鼠IgG2b FL (m) IP, IF, IHC(P), FCM 小鼠 CD8-P (M-20) 山羊IgG C-末端(m) WB, IP, IF 小鼠 CD8-p (R-20) 山羊IgG C-末端(r) WB,IF 大鼠 CD8a/p (vpg 9) 小鼠IgGi FL m IF, FCM 貓 人類化抗-CD8抗體之非限制性實例包括CM-T807 140774.doc -14- 201000130 (Centocor, ΜΑ)、及TRX2(牛津治療性抗體中心，牛津大 學，Oxford, United Kingdom) 〇 樹突細胞（DC)啟動並極化抗原特異性免疫反應。人類骨 髓DC (mDC)包括獨特亞類，例如朗格漢斯細胞及駐留於 • 人類皮膚中之間質（真皮）DC。已報導朗格漢斯細胞相對於 間質DC可尤其有效地針對同種異體及自體抗原起始原始 ‘ CD8+ T細胞，而兩個mDC亞類等效地誘導次級反應。實 施現有研究來分析可解釋LC誘導CD8+ T細胞起始之優良 © 功能之參數。LC起始之CD8+ T細胞相對於IntDC起始之 CD8+ T細胞表現較高量之CD8，而由兩個亞類誘導之抗原 特異性記憶性CD8+ T細胞表現相等程度之CD8。 . 本文中顯示，抗CD8單株抗體阻斷DC介導之自體及同種
異體抗原CTL之體外起始。在抗CD8存在下起始之CD8+ T 細胞不能消滅靶且產生2型（IL-4、IL-5、IL-13)及調控型
(IL-10)細胞素。此外，在抗CD8 mAb存在下起始之CD8+T 細胞能抑制同種異體反應且由此用作抑制性CD8+ T細 φ 胞。然而，其並不干擾次級CTL反應之誘導，例如針對流 感及CMV之反應。同樣，抗CD8 mAb不改變CD4+ T細胞 -反應。在人類-小鼠模型細胞群中，施用抗CD8 mAb以在 體内活化同種異體反應性CD8+ T細胞可防止因注射同種 異體CD8+ T細胞而發生移植物抗宿主病。因此，抗CD8抗 體療法可預防CD8+ T細胞介導之移植物排斥而不擾亂保 護性抗病毒反應，且因此可代表現有免疫抑制治療之重大 進步。本申請案證實，CD8連接可導致抑制T細胞起始且 140774.doc -15- 201000130 生成調控型τ細胞。 本發明發明者已證實，與間質DC相比LC可極有效地起 始原始CD8 T細胞，而兩個mDC亞類皆可等效地誘導次級 反應。實施現有研究來分析可解釋LC誘導CD8+ T細胞起 始之優良功能之參數。本文中證實，CD8連接不僅導致抑 制T細胞起始，且亦引發調控型T細胞之生成。 DC純化及培養。藉由在25 cm2燒瓶中於含有以下物質之 Yssel 氏培養基（Irvine Scientific，CA 或 Gemini BioProducts) 中以0.5x1 06/ml培養經G-CSF驅動之CD34-HPC來生成CD34 Ο 源DC : 5%自體血清、50 μΜ 2-β-酼基乙醇、1% L-麩胺醯 胺、1%青黴素（penicillin)/鍵黴素（streptomycin)、及細胞 素：GM-CSF(50 ng/ml ; Immunex 公司）、FLT3-L(100 ng/ml ; R&D)、及 TNF-α (10 ng/ml ; R&D)。在 37°C 及 5% C02下於加濕環境中培養培養物。在培養第5天將細胞轉移 至補加有細胞素之新鮮培養基中，且在第9或10天收穫。 對CDla+CD14、LC 及 CDla_CD14 + -IntDC實施分選。純度通 ❹ 常為 95-99%。 藉由在37°C及5% C02下於補加有1%青黴素/鏈黴素及 100 ng/ml GM-CSF (Berlex)及 500 U/ml IFN-a-2b(Schering 公司）之Cellgenix培養基（Cellgenix)中培養CD14+單核細胞 (純度 >90%)(1χ106 細胞/ml)來生成 IFN 源 DC (IFN-DC)，在 第1天添加新鮮培養基及細胞素，且在第3天收穫DC。 自正常人類皮膚樣品純化LC及真皮DC。在4°C下將樣品 於細菌蛋白酶分散酶2類（Roche)抗生素/抗真菌藥（Gibco) 140774.doc -16- 201000130 中培養18 h，然後在37°C下培養2 h。然後分離表皮層與真 皮層，將其切成小塊（約1-10 mm)且置於補加有10%胎牛血 清（FBS)之RPMI 1640 (Gibco)中。2天後，收集遷移至培養 基中之細胞且使用蔗聚糖（Ficoll)-泛影酸鹽梯度（1.077 g/dl)(LSM-淋巴細胞分離培養基，MP Biomedicals)使其進 一步富集。在用抗CDla FITC (OKT6; DAKO)及抗 CD14 • APC (LeuM3 ; Invitrogen) mAb染色後藉由細胞分選來純 化DC。 Φ T細胞分離。自藉由白細胞去除術得自成年志願供者之 冷凍卩81^(：分離細胞。在€04-、€056-、€016-及〇019-磁 性細胞耗盡（Miltenyi)後，原始CD8+ T細胞被分選為 CD45RA+CCR7+HLA-DR-CD8 +細胞。以相同方式獲得原始 CD4+ T細胞，但CD8 T細胞被耗盡且所得細胞被分選為 CD4+CCR7+CD45RA+CD4 CD16XD19· CD56。對於回憶反 應而言，自富集細胞群以陽性方式選擇CD8+ T細胞。 DC/CD8 T細胞共培養。自體CD8+ T細胞-DC共培養。進 m 行初級反應評價時，用與HLA-A201-限制性MART-1 (MART-1m26-35, ELAGIGILTV)或 gplOO (gpl〇〇Μ209·217, IMDQVPFSV)肽（3 μΜ)—起預培養 3 h之自體 mDC(5><104 細 胞/孔）來刺激原始€〇8+1\細胞（1\106細胞/孔）。在24孔板中 於補加有 10 U/ml IL-7 (R&D)及 100 ng/ml CD40L (R&D)之 Yssel氏完全培養基中將細胞培養9天。在第3天以10 U/ml 添加IL-2 (R&D);除非另外說明，否則在第0天添加抗CD8 或同型匹配對照。 140774.doc -17- 201000130 在培養階段終點藉由計數細胞結合肽/HLA-A201四聚體 (Beckman Coulter)之數量來測定肽特異性CD8+ T細胞之擴 增。評價回憶反應時，用載有HLA-A20卜限制性Flu-MP肽 (GILGFVFTL)之自體（5xl05細胞/ml)mDC亞類來刺激總 CD8+ T細胞（lxlO6細胞/ml)。在抗CD8或同型匹配對照存 在下，使用F1U-MP/HLA-A201四聚體來測定Flu-MP-特異 性CD8+ T細胞之頻度。 同種異體CD8 T細胞培養物。原始CD8+ T細胞之同種異 體增殖係藉由[H3]-胸苷納入或CFSE稀釋來評價。在圓底 96孔板中於補加有10%熱滅活混合AB人血清（Yssel氏完全 培養基）IL-7及IL-2 (10 IU/ml R&D)之Yssel氏培養基中培 養原始T細胞（lxl05細胞/孔），向其中添加2.5xl04(除非另 外說明）同種異體mDC亞類。使用CD40L來活化DC。在5天 後，將細胞與1 μ(：ί[Η3]-胸苷一起進行18小時之脈衝處 理，且測定示踉劑之納入作為持續增殖之指標。 藉由CFSE稀釋來評價增殖時，根據製造商程序用0.5 μΜ CFSE標記細胞。在7 d後，收穫細胞並藉由流式細胞 術分析增殖程度。此外，根據下文所述來評價經起始CD8 + T細胞之品質。 倘若指明，則將針對CD8(純系RPA-T8、OKT6、BD或 T8 Beckman Coulter)之阻斷抗體或同型對照抗體添加至共 培養物中。 對於次級同種異體CD8+ T細胞培養物而言，在添加有 IL-7及IL-2之96孔圓底板中培養5xl04原始CD8 T細胞與 140774.doc -18- 201000130 2.5x103 CD40配體活化DC。在6 d後，用來自初級培養中 所用相同供者之DC再次刺激細胞。經3天將抗CD8抗體或 同型匹配對照添加至培養物中，此後藉由[3H]胸苷納入來 評價細胞增殖。 . 細胞素之產生。分析CD8+ T細胞產生之細胞素時，在 第7天藉由自初級同種異體培養物進行細胞分選來分離增 殖 CD8+ T細胞（FSC*CDllc·或 CFSE 低 CDllc—)，且用經抗 CD3及抗CD28塗佈之微球再刺激一夜。藉由以多重標的微 瘳 珠為主之細胞素分析來量測上清液中之細胞素。 CD8+ T抑制劑分析。對於CD8+ T抑制劑功能分析而言， 在第7天藉由自初級同種異體培養物實施細胞分選來分離 . 增殖之CD8+ T細胞（FSC*CDllc_或CFSE低CDllc·)，且依分 級數量添加至5χ104個原始CD8+ T細胞及2.5xl03 CD40L活 化同種異體DC (LC)之共培養物中。在培養5 d後將1 μ/Ci [3H]胸苷添加至各孔中，且在1 8 h後測定細胞吸收量。 T細胞蛋白及基因分析。為效應物分子染色時，固定經 參 起始之CD8+ T細胞且實施可通透化處理，且用標記PE之抗 粒酶A、粒酶B及穿孔素（BD Biosciences)進行染色。 對於CD8+ T細胞表型分析而言，對細胞實施染色以供表 面表現皆來自 BD biosciences 之 CD25 (M-A251)、CD28 (CD28.2)、CCR7、CD103 (Ber-ACT8)。 對於微陣列基因分析而言，自初級同種異體培養物分選 增殖CD8 T細胞（CFSE_)且用經抗CD3及抗CD28塗佈之微球 實施再刺激。 140774.doc -19- 201000130 評估在體内抵抗移植物抗宿主病之抗CD8治療。在移植 10-12週後將驅動後之外周血（^^8)0034+細胞（3-6><106個 MPB CD34+細胞/動物）以靜脈内方式輸注入各實驗同齡組 之經非致命量輻照（300厘戈瑞之137Cs γ-輻照）之上述 NOD/SCID小鼠中，向小鼠皮下注射10 Μ自同種異體供者 分選之原始CD8+ Τ細胞。用IgGl對照mAb或抗CD8 mAb(RPA-T8 BD biosciences，在第0天施用 0 .75 mg 且在 第3天施用0.25 mg)以皮下方式治療小鼠。在兩個實驗中之 一中，在同種異體移植當天，經腹膜腔内注射抗CD40單 株抗體（MAB89，Schering-Plough) ’ 以活化DC。 每天觀察小鼠之存活情況及GVHD之臨床症狀，其表現 為腹瀉、體重減輕及皮膚發皺。在出現症狀時收集小鼠。 藉由流式細胞術來分析人類CD8+ T細胞。 使用在體外生成之LC ’在體外起始原始CD8+T細胞。在 GM-CSF、Flt3-L 及 TNFa 存在下，將CD34+ HPC 培養 9 至 10 天，而在體外生成HLA-A201+LC及IntDC。將細胞分選為 CDla+CD14 LC (LC)及 CDla CD14+ IntDC (IntDC)。進行 初級反應時，將載有3 μΜ HLA-A201-限制性黑素瘤肽 MART-1 (26-35)之DC亞類與自體原始CD8+ Τ細胞一起培 養9至10天。在培養終點使用特異性肽-MHC四聚體來量測 抗原特異性CD8+T細胞之頻率。 如圖la及圖lb中所示，經LC起始之原始CD8+ T細胞相 對於IntDC起始之CD8+ T細胞上調表面CD8表現。對於記 憶性反應而言，向DC亞類中載入1 μΜΗΕΑ-Α201限制性流 140774.doc -20- 201000130 感基質肽Ml »將DC與分選之自體記憶性CD8+ T細胞一起 培養。反之，兩個亞類對誘導針對病毒抗原之次級反應同 等有效，且任一亞類所活化之CD8+ Τ細胞均表現相等程度 之表面CD8(圖lc)。 . 抗CD8抗體阻止抗原特異性CD8+T細胞之起始。添加抗
CD8 mAb RPA-T8可有效阻斷藉由MART-1-脈衝處理之LC 來擴增Mart-Ι特異性CD8+ T細胞（圖2a)。動力學分析表 明，在將抗CD8 mAb添加至培養物中後，在第1天至第9天 © 觀察到極低抗原特異性CD8+T細胞增殖（圖2b：^對0口8+ T 細胞起始之抑制極有效，此乃因0· 1 pg/ml之抗體即可幾乎 完全抑制抗原特異性CD8+T細胞之擴增且50%抑制濃度 (IC50)在50-500 ng/ml範圍内（圖2c)。三種測試抗-CD8抗體 (T8、RPA-T8及OKT8)中之三種皆可抑制T細胞起始（圖 2d) ° 延遲至第70小時才將抗CD8 mAb添加至培養物中仍可導 致75%抑制黑素瘤特異性CD8+ T細胞起始（圖2e)。與初級 ^ 對照培養相比，在低濃度抗CD8存在下培養MART-1載肽 LC及原始CD8+ T細胞導致較低量之Mart-Ι特異性CD8+ T 細胞（圖2f)，此外暴露於抗CD8 mAb中之CD8+ T細胞與暴 露於對照抗體中之彼等相比顯示較低MART-1 MHC-四聚 體染色強度。添加至培養物中之抗CD8 mAb愈多，在抗原 特異性T細胞上所觀察到的四聚體結合強度愈低（圖2g)。 抗CD8 mAb亦能阻斷經藉由培養單核細胞與GM-CSF及 IFN (IFN-DC)生成之DC誘導之MART-1及gplOO-特異性 140774.doc -21 - 201000130 CD8+ T細胞之起始（圖2h)，此表明抑制效應既不依賴於DC 來源亦不依賴於所選用於起始之抗原。此外，即使在DC 上載有高濃度肽時或在抗原遍佈於培養物中時，抗CD8 mAb亦能阻斷起始（圖2i)。將該等數據彙集到一起可證 實，阻斷CD8可防止DC誘導之高親和性抗原特異性原始T 細胞之起始。 抗CD8抗體可抑制DC介導之CD8 T細胞之同種異體增 殖。將抗CD8 mAb或同型對照添加至原始CD8+ T細胞以及 分級數之體外生成的同種異體LC之培養物中。如圖3a使用 [3H]胸苷納入分析所示，抗CD8 mAb可抑制LC誘導之同種 異體原始CD8+ T細胞之增殖。對LC與同種異體原始CD4+ 及CD8+ T細胞之共培養物實施之CFSE稀釋分析證實了對 CD8+ T細胞增殖之抑制（圖3b上圖）。其另外揭示，同種異 體CD4+ T細胞之增殖不受抗CD8抗體影響（圖3b下圖）。實 際上，儘管可以30 ng/ml抑制CD8+ T細胞增殖（圖3c上 圖），但CD4+ T細胞對於所用任一濃度之抗CD8 mAb (0-3 pg/ml)皆不顯示增殖降低（圖3c下圖）。抗CD 8 mAb亦可阻 斷由真皮DC或自人類皮膚分離之LC誘導之同種異體T細胞 的旺盛增殖（圖3d及e)。在抗CD8 mAb存在下在CD8+T細胞 與DC之間僅形成少量分散性小團簇（圖3f)。然而，在不含 抗CD8 mAb之培養物中，旺盛增殖表現為DC及CD8+ T細 胞之許多大團簇（圖3g)。因此，抗CD8抗體可抑制DC介導 之同種異體CD8+T細胞之起始。 抗CD8不阻斷針對自體或同種異體抗原之次級反應。為 140774.doc •22- 201000130 測試抗CD8 mAb是否亦可抑制記憶性CD8+ T細胞反應，將 載有免疫顯性HLA_A2結合流感基質蛋白Ml肽（57_68)之 HLA-A2+ LC或IntDC與CD8+ T細胞以及抗CD8 mAb及其相 關對照一起培養。對於任一 DC亞類而言，藉由四聚體染 . 色量測之抗原特異性CD8+ T細胞之數量與抗CD8 mAb或 同型對照相當（圖4a及c)。甚至在抗CD8 mAb之濃度高至 ‘ 2.5 pg/ml時亦未檢測到抑制（圖4b及d)。所測試兩種其他抗 CD8 mAb(T8 Beckman、RPA-T8 BD)未抑制流感肽誘導之 參 記憶性細胞活化（圖4e)。 為證實記憶性同種異體CD8+ T細胞反應是否受抗CD8 mAb影響，用同種異體LC或IntDC將原始CD8+ T細胞起始7 . 天，且對T細胞實施三天之再刺激。如圖4f中所示，抗 CD8 mAb不能抑制以使用LC或IntDC之原始同種異體抗原 對CD8+ T細胞實施之再刺激。因此，該等數據證實，記憶 性CD8+T細胞反應係CD8-獨立性的。 用抗CD8 mAb起始CD8+T細胞產生具有低濃度溶細胞分 子之2類T細胞。如圖5中所示，在用同種異體DC起始期間 暴露於抗CD8 mAb中之CD8+ T細胞表現較低濃度之 CD25、ICOS、CD27、CD28且粒酶A及B及穿孔素之細胞 内表現較低（圖5a)。在用抗CD3以及抗CD28再刺激24 h 後’用LC及同型對照將CD8+ T細胞起始7天，產生IFN-7 (2,000-6,000 pg/ml)及 IL-2 (1,000-6000 pg/ml)以及低濃度 之 IL-4、IL-5、IL-13 及 IL-10。經 LC 及抗 CD8 起始之 CD8 + T細胞分泌等量之lFN-γ及IL-2但分泌大量IL-4 (100-600 140774.doc •23- 201000130 pg/ml)、IL-5 (500-2500 pg/ml)、IL-13 (1000-7000 pg/ml) 及 IL-10 (70-100 pg/ml)(圖 5b)。 數據共同表明，抗CD8 mAb可改變活化CD8+T細胞之表 型，產生可分泌2型細胞素且表現低濃度細胞毒殺分子之 細胞。 ， 在抗CD8存在下起始之同種異體反應性CD8+ T細胞可有 效抑制原始CD8+ T細胞反應。為4定在抗CD8 mAb存在 下起始之CD8+ T細胞是否顯示抑制劑功能，將CFSE標記 之原始CD8+T細胞（供者A)與同種異體LC(供者B)以及抗 © CD8 mAb或同型匹配對照一起培養7天。對活化CD8+ T細 胞（CFSE-CD1 lc-)實施分選且以分級數（3-300)將其添加至 5 0,000個來自供者A之自體原始CD8+ T細胞與2500個來自 供者B之同種異體LC之共培養物中。用抗CD8 mAb起始之 CD8+ T細胞以劑量依賴性方式強烈抑制原始CD8+T細胞因 應同種異體LC而增殖，其中少至100個細胞可抑制約80% 之同種異體反應且1 〇個細胞可阻斷50%。然而，經同型對 ❹ 照起始之CD8+ T細胞不顯示抑制（圖6a)。當向抗CD8 mAb 處理之CD8+T細胞施用其同種異體特異性DC時抑制尤其顯 著，而使用來自供者C之DC達成之抑制強度較低（圖6b)。 在體内，抗CD8 mAb抑制同種異體CD8+ T細胞活化及移 植物抗宿主病。在體外使用抗-CD8抗體時觀察到之對 CD8+ T細胞起始之強抑制性促使吾等測試此是否在免疫缺 陷型NOD-SCID小鼠體内亦會發生，該等小鼠移植有可分 化為pDC、mDC及B細胞而非T細胞之人類CD34+HPC。向 140774.doc • 24- 201000130 該等人類化小鼠皮下過繼轉移2〇χ 106個來自同種異體供者 之純化CD8+ Τ細胞以及0.75 mg抗CD8 mAb或同型匹配對 照抗體。在第3天注射另外0.25 mg抗體。在兩個實驗中之 一個中，腹膜腔内注射抗 CD40 (MAB89，Schering Plough, 100 pg)以供DC活化。定期檢查小鼠之疾病體徵。在轉移 CD8+ T細胞10週後，接受同型匹配對照抗體之小鼠出現慢 性移植物抗宿主病之臨床症狀，其眼周圍出疹，體重減輕 且身體虛弱（圖7a)。然而，用抗CD8抗體治療既可完全抑 © 制病原性T細胞之活化及擴增亦可完全抑制臨床症狀之出 現（圖7)。來自經同型對照治療之小鼠之骨髓的CD8+ T細 胞可上調CD 103，而經抗CD8 mAb治廉之小鼠並不如此（圖 7b) ° 該等數據共同表明，抗CD8 mAb療法可有效阻止CD8+ T 細胞之同種異體初級活化，該活化可在具有人類免疫系統 之免疫缺陷型小鼠中介導移植物抗宿主病。 實施當前研究以理解LC可比間質DC更有效地起始原始 CD8+ T細胞而mDC亞類可等效地誘導次級CD8+ T細胞反應 之原因。根據將抗CD8 mAb添加至原始CD8+ T細胞與DC 之共培養物中之結果得出若干個結論。首先人們發現可以 極低抗體濃度顯著抑制原始CD8+ T細胞之起始，同時甚至 在高抗體濃度下記憶性細胞之活化亦不受影響。其次殘餘 增殖細胞沿抑制劑路徑而非效應物路徑分化。 該等數據表明，在體外所測試全部抗CD8單株抗體皆可 以極低濃度阻斷DC介導之針對自體或同種異體MHC背景 140774.doc -25- 201000130 下所呈遞之抗原的CD8+ T細胞增殖。然而，針對病毒或同 種異體抗原之回憶反應不受抗CD8 mAb抑制。該等數據與 關於小鼠淋巴細胞之體外研究之早期報導一致，其顯示 抗-CD8抗體可阻斷原始CD8+ T細胞之增殖但不阻斷效應 物及記憶性細胞之增殖6。在人類化小鼠模型體内亦觀察 到抗CD8亦可阻斷同種異體反應性原始cd8+ T細胞之活 化，此導致消除移植物抗宿主病反應。可能最驚人的觀察 結果係添加抗CD8抗體可將反應類型之性質自效應物反應 改變為抑制劑反應。所生成抑制性細胞表現獨特表型，其 具有較低粒酶A及B及穿孔素表現以及較低CD28表現。此 外’該等細胞表現經改變表型模式，其具有較高2型細胞 素（IL-4、IL-5及IL-13)表現及il-10表現。此外，該等細胞 表現有效抑制能力，此乃因1 〇〇個該等細胞可阻斷8〇0/〇之 同種異體反應，在經同源APC活化時尤其如此。有趣的 是’如吾人在他處之報導，此表型與在CD14+IntDC上培養 之CD8+ T細胞的表型相當。 該等觀察結果具有臨床顯著性，此乃因T細胞係同種異 體移植物排斥之主要介質人們一直努力設計可在同 種異體移植物接受者中特異性阻斷T細胞原始活化之藥 物。已證實CD4+ T細胞依賴性及cd8+ T細胞依賴性路徑可 啟動同種異體移植物排斥。儘管諸如雷帕黴素 (Rapamycin)13、環孢菌素“、抗 CD4 mAbl5、抗 CD154 mAb16及CTLA4-Ig 17等免疫調節策略可極有效地抑制cd4 依賴性免疫活化，但在研究中CD8依賴性排斥路徑一直表 140774.doc -26- 201000130 現出對該等策略之抗性。在臨床研究中CD8+ τ細胞對鈣神 經素抑制劑之抑制的抗性亦始終與急性同種異體移植物排 斥之發病率升高相關18。此與在體内觀察到的CD4+及CD8 + τ細胞之不同共刺激需求一致。CD8依賴性同種異體移植 • 物排斥依賴於CD40/CD154共刺激且獨立於CD28/B7共刺激 路徑17。 第一代抗CD3 mAb在同種異體移植物接受者中可阻斷τ 細胞之原始活化而導致免疫抑制，如同大多數其他免疫抑 ® 制治療一樣，此與嚴重病毒感染（例如CMV)有關。因此抗 CD8阻斷效應物細胞起始同時使病毒特異性記憶性反應保 持完整之觀察結果可阻止生成侵襲移植物之同種異體反應 • 性CD8+ T細胞，同時使抗病毒次級反應保持完整。 在移植物位點藉由〇〇8+1：細胞上調〇〇103—直與〇〇8+丁 細胞介導同種異體移植物損傷之能力密切相關1 9。上皮細 胞特異性整合素CD 103(αΕ整合素）定義同種異體反應性 0 CD8 CTL之新穎亞類2G。同種異體移植物排斥（CD4獨立 性）CD8依賴性路徑之活化可引發劇烈免疫反應，其對免疫 調節具有高抗性。文獻中已闡述在患者腎臟排斥期間主要 CD8 + CTLA4+ T淋巴細胞之強局灶性浸潤。此表明CD8+ τ 細胞可避開免疫抑制並參與排斥過程。可能需要控制CD4 及CD8反應二者以促進耐受性及長期存活2i。 在諸如狼瘡或糖尿病等自身免疫疾病中CD8療法亦可有 益於阻止自體反應性CD8+ T細胞之起始。 本發明涵蓋，本說明書中所論述之任一實施例皆可參照 140774.doc -27· 201000130 本發明之任一方法、套組、試劑、或組合物來實施，且反 之亦然。此外，本發明組合物可用於達成本發明之方法。 應瞭解’本文所述之具體實施例係以說明方式展示而非 限制本發明。本發明之主要特徵可用於多個實施例中而不 背離本發明之範疇。熟習此項技術者僅使用常規實驗即可 瞭解或能確定本文所述具體程序之多種等效形式。該等等 效形式被認為屬於本發明範圍且為申請專利範圍所涵蓋。 本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案皆表示熟 習本發明所涉及之技術者之熟練程度。所有公開案及專利 申請案均係以引用方式併人本文中，其程度如同將每一個 別公開案或專利申請案特定地及個別地所指以引用方式併 入本文中。 在申請專利範圍及/或說明書中，詞語「一」在與術語 「包含」連用時可意指「一」，但亦舆「一或多」、「至 ^一」及「一或一以上」之含義吻合。儘管本發明揭示内 谷支持所用術語「或」僅指各選項與「及/或」之定義’ 但除非明料明此術語僅指各選項或該等選項相互排斥， 否則申請專利範圍中所用術語「或」皆係用於意指「及/ 或」在整個本申請案中，術語「約」係用於表明一數值 ^括用於/収该數值之裝置、方法之内在誤差變異或存在 於研究主體中之變異。 本說明書及申請專利範圍所用詞語「包含（com—㈣」 (及其任一形式，例如「c〇mprise」及「⑶叫㈠如」）、 「具有（having)」（及其任一形式，例如「以…」及 140774.doc 201000130 」）、 包括（including)」（及其任一形式，例如 「mClUdeSj 及「include」）或「含有（containing)」（及其 任形式例如「contains」及「contain」）皆係指囊括各 種情況或無限制’且不排除其他未列出之要素或方法步 驟。 本文所用術語「或其組合」意指在該術語前所列項目之 所有排列及組合。舉例而言，「A、B、c、或其組合」意 欲包括以下中之至少一種：A、B、C、AB、AC、BC、或 ABC，且在特定上下文中若順序很重要，則亦包括ba、 CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、或 CAB。同樣在該 實例中，其明確包括含有一或多個項目或術語之重複組 a ’ 例如 BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、 CBBAAA、CABABB等等。熟習此項技術者可瞭解，除非 上下文中另外指明，否則任一組合中之項目或術語數量通 常並無限制。 本文揭示及主張之所有組合物及/或方法皆可根據本揭 卞内谷來製備及實施而無需過度實驗。儘管已根據較佳實 施例闡述了本發明組合物及方法，但熟習此項技術者可明 瞭，可改變該等組合物及/或方法及本文所述方法之步驟 或步驟之順序，且並不背離本發明之概念、精神及範圍。 如隨附申請專利範圍所定義，熟習此項技術者所瞭解之所 有該等類似替代及修改皆涵蓋於本發明之精神、範圍及概 念中。 參考文獻 140774.doc 29· 201000130 1. Banchereau, J. & Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392，245-52 (1998) o 2. Caux，C.等人 CD34+ hematopoietic progenitors from human cord blood differentiate along two independent dendritic cell pathways in response to GM-CSF+TNF alpha. J Exp Med 184, 695-706 (1996) ° 3. Zamoyska, R. The CD8 coreceptor revisited: one chain good，two chains better. Immunity 1，243-6 (1994) ° 4. Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, E. M. & Bolen, J. ❹ B. The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p561ck.
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Eur J Immunol 20, 2747-55 (1990) o 【圖式簡單說明】 為更透徹地理解本發明之特徵及優點，現參閱本發明之 詳細說明以及附圖，在附圖中： 圖la至lc展示在LC起始之CD8+ T細胞上而非在IntDC起 始之CD8+ T細胞上誘導CD8表現增加。圖la展示在經 CD34-DC亞類起始之天然CD8+ T細胞上對CD8表現程度之 流式細胞術分析。在LC起始之CD8+ T細胞上之CD8(黑 線）；在IntDC起始之CD8+ T細胞上之CD8(灰線）。圖lb展 示，與IntDC起始之Mart-Ι特異性天然CD8+ T細胞相比， 經LC起始之天然Mart-Ι特異性CD8+ T細胞表現較高程度 CD8。圖lc展示，經兩個亞類（即LC或IntDC)活化之記憶性 Flu-MP特異性CD8+ T細胞表現相等程度之表面CD8 ; 圖2a至2h展示CD8在DC介導之自艎原始CD8+ T細胞起 始中之作用。圖2a展示自體Mart-Ι特異性CD8+ T細胞起始 依賴於CD8連接。圖2b展示在用LC起始之第1至9天期間所 量測Mart-Ι特異性CD8+ T細胞之百分比。圖2c展示在具有 至少3個不同供者之至少3個獨立實驗中之3種不同純系， 其顯示對由LC誘導之細胞素同種異體增殖之顯著阻斷。上 圖為T8 Beckman，t圖為RPA-T8，下圖為OKT8。圖2d展 示抗CD8以劑量依賴性方式阻斷自體原始CD8+ T細胞之起 140774.doc 03- 201000130 始。據測定IC50為50 ng/ml。圖2e展示Mart-1特異性CD8 Τ 細胞之百分比，甚至當在遲至共培養開始70 h後添加時抗 CD8亦可有效阻斷抗原特異性CD8 T細胞起始。圖2f展示 在低劑量抗CD8 Mab染色四聚體存在下經載肽LC起始之 Mart-Ι特異性CD8+ T細胞，與在同型對照存在下起始之抗 原特異性CD8+ T細胞相比其強度較低。圖2g展示四聚體 強度與所用抗CD8 Mab劑量之間之關聯。圖2h展示，即使 在與高濃度（100 μΜ)肽一起載入DC時或在肽遍佈於培養物 中時，抗CD8亦可阻斷MART-1特異性起始（左圖）；右圖： 經IFN-DC起始且載有所指示濃度肽之Mart-Ι特異性CD8+ T 細胞之數量。圖2i展示抗CD8阻斷IFN-DC對MART-1(上圖） 或gplOO(下圖）特異性CD8+T細胞之起始； 圖3a至3g顯示，CD8連接對同種異體原始CD8+ T細胞之 起始具有關鍵作用。圖3a展示藉由納入細胞胸苷來測定原 始CD8+ T細胞在抗CD8或同型對照存在下因應同種異體 DC而發生之增殖。圖3b展示藉由CFSE稀釋來測定原始T細 胞在抗CD8或同型對照存在下因應同種異體LC而發生之增 殖。在上圖中展示CD 8+ T細胞且在下圖中展示原始CD4+ T細胞if殖。圖3c展示30 ng/ml至3 pg/ml抗CD8之劑量滴 定，其顯示在30 ng/ml下對CD8 T細胞增殖產生最大抑制 (上圖）。在所用抗CD8 Mab之任何濃度下皆未檢測到對 CD4+ T細胞增殖之抑制（下圖）。圖3d及3e展示抗CD8 Mab 可阻止經皮膚源DC、表皮LC (3d)或真皮DC (3e)刺激之原 始CD8+ T細胞之同種異體增殖，在30 ng/ml下檢測到50% 140774.doc -34- 201000130 抑制。圖3f及3g展示載肽LC及原始CD8+ T細胞在共培養 第9天產生較明顯團鎮（3g) ’而在抗CD8存在下’團鎮形成 被抑制（3 f)。上圖放大20 x ’下圖放大40 x ; 圖4a至4f顯示’抗CD8不阻斷針對病毒或同種異體抗原 之次級CD8+ T細胞反應。圖4a展示在3 pg/ml抗CD8 Mab(左圖）或同型匹配對照（右圖）存在下’在用來自HLA_ A201供者之FluMP載肽LC活化後第9天’用FluMP-HLA-A201四聚體分析所得FluMP-特異性CD8+ T細胞之頻度。 圖4b顯示，根據F1U-MP-HLA-A201四聚體分析，在所用 Mab之任何濃度下，抗CD8 Mab皆不阻斷LC誘導之次級 Flu-Mp特異性反應。圖4c展示在3 pg/ml抗CD8 Mab(左圖） 或同型匹配對照（右圖）存在下，在經來自HLA-A201供者之 FluMP載肽IntDC活化後第9天，用FluMP-HLA-A201四聚 體分析所得FluMP-特異性CD8+ T細胞之頻度。圖4d顯 示，根據Flu-MP-HLA-A201四聚體分析’在所用Mab之任 何濃度下抗CD8 Mab皆不阻斷IntDC誘導之次級Flu-Mp特 異性反應。圖4e顯示抗CD8抑制之缺乏並不限於特定抗 CD8純系，此乃因在3 pg/ml所指示抗CD8純系或同型匹配 對照存在下培養9天後，2種不同純系（T8 beckman(左圖）及 RPA-T8(右圖））顯示不抑制載肽LC誘導之Flu-MP特異性 CD8+ T細胞增殖。圖4f顯示抗CD8不阻斷針對同種異體抗 原之記憶性反應。次級同種異體共培養之胸苷納入顯示， 不論在培養物中是否存在抗CD8 Mab或同型匹配對照，同 種異體LC(左圖）或IntDC(右圖）皆可有效誘導同種異體特異 140774.doc -35- 201000130 性次級反應； 圖5a及5b展示對在抗CD8 mAb存在下起始之CD8+ T細 胞實施之功能分析。在圖5 a中，在6 d後藉由流式細胞術 分析在抗CD8 mAb存在下起始之同種異體原始CD8+ T細 胞之活化及效應物分子之表現。在圖5b中，在抗CD 8 mAb 存在下起始之同種異體原始CD8+ T細胞分泌2型及調控型 細胞素。在存在或不存在抗CD8時，在LC上培養原始 CD8+ Τ細胞。在6 d後，對增殖（CFSElow)細胞實施分選且 用抗CD3及抗CD28微球將其再刺激24 h，且在luminex、 multiplex微球分析中量測 IFN-γ、IL-2-、IL-4、IL-5、IL-10、及IL-13。所呈現數據來自3個獨立研究； 圖6a及6b顯示，在抗CD8存在下起始之CD8+ T細胞係抑 制性T細胞。圖6a展示，藉由在少量同源T細胞存在下用同 種異體DC刺激原始CD8+ T細胞來測試經起始T細胞抑制原 始T細胞反應之能力，該等同源T細胞係在抗CD8或同型對 照存在下由體外LC起始。在6 d後評價3[H]胸苷納入。結 果代表三個獨立研究。圖6b展示，在CD8 Tr細胞存在下用 來自供者B之同種異體LC刺激原始CD8 T細胞（供者A)，該 等CD8 Tr細胞係在抗CD8或同型對照存在下由來自供者C 之體外LC起始。結果代表三個獨立實驗；及 圖7a及7b展示抗CD8處理在人類-小鼠模型體内預防移植 物抗宿主病之效應。圖7a展示使用注射有同種異體CD8+ T 細胞及抗CD8 MAb或同型對照之人類化小鼠的結果。在兩 個研究之一中，注射抗CD40以誘導活化。經同型對照抗 140774.doc 36- 201000130 體處理之小鼠產生慢性移植物抗宿主病之臨床症狀，其眼 周圍出疹（如圖所示），體重減輕且身體虛弱，而經抗CD8 處理之小鼠無該等症狀。圖7b展示，自小鼠收集結果且分 析來自BM及血液之CD8+ T細胞中活化標記CD25及CD103 . 之表現。
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Claims (1)
- 201000130 七、申請專利範圍： 一種在有需要之個體中誘導耐受性之方法，其包含： 在用可有效誘導耐受原性τ細胞之抗原實施τ細胞起始 期間’使經分離T細胞與一定量之未耗盡抗CD8抗體接 觸；及 向該需要耐受性之個體提供該等耐受原性T細胞。 . 2. 3. 〇 4. 如請求項1之方法，其中該抗CD8抗體係人類化抗體。 如請求項1之方法，其中該抗CD8抗體未耗盡。 如叫求項1之方法，其中抑制性T細胞之生成係藉由測定 或夕種以下表型來測定：粒酶A之減少、粒酶B之減 少、穿孔素之減少、少量IL-2、IFN-γ或二者之分泌、 IL-10之分泌或其組合。 5. 如明求項丨之方法，其中該抑制性τ細胞之生成係指可分 泌IL-10之抑制性τ細胞之增殖。 6. 如請求項1之方法’其中該抗CD8抗體係選自CM-T807、 丁8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。 如請求項1之方法，其中該抗原係同種異體抗原。 8· 一種在移植患者中降低移植排斥同時維持其他免疫反應 之方法，其包含： 在與抗原產生起始反應·期間，用一定量可有效引發抑 制性CD8+ T細胞生成之抗CD8未耗盡阻斷抗體來處理經 分離CD8+ T細胞’其中該等τ細胞之抑制作用之特徵在 於一或多種以下表型：粒酶A之減少、粒酶B之減少、穿 孔素之減少、少量IL-2、IFN-γ或二者之分泌、il-10之 140774.doc 201000130 分泌或其組合；及 將該等抑制性CD8+ T細胞引入該移植患者中。 9. 如請求項8之方法，其中將該等CD8+ T細胞與得自與 GM-CSF及IFN-a-2b—起培養的單核細胞之經分離樹突細 胞（IFN-DC)—起培養。 10. 如請求項9之方法，其中該等樹突細胞係朗格漢斯細胞 (Langerhans cell，LC)，其係藉由將CD34 +人類外周細胞 與GM-CSF、Flt3-L及TNFa—起培養9至10天而在體外生 成。 11. 如請求項9之方法，其中該等樹突細胞係CD la+CD 14-LC。 12. 如請求項8之方法，其中該抗CD8抗體下調針對所移入器 官之免疫反應而不影響針對病毒之免疫反應。 13 ·如請求項8之方法，其中該等經該抗CD8抗體處理之 CD8+ T細胞係高親和性、抗原特異性原始T細胞。 14. 如請求項8之方法，其中該抗CD8抗體係選自CM-T807、 T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。 15. 如請求項8之方法，其中在該培養物中提供0.5-5,000 ng/ml之該抗CD8抗體。 16. 如請求項8之方法，其另外包含以下步驟：分離外周血 單核細胞，自該等外周血單核細胞分離LC前體，將該等 LC前體與GM-CSF、FH3-L、及TNFa—起培養，以製備 LC，自外周血單核細胞分離T細胞，並在抗CD8抗體存 在下及在可生成抑制性T細胞之條件下共培養該等LC與 140774.doc 201000130 該等Τ細胞，及在移植之前、同時或之後將該等丁細胞、 該等LC或二者再引入患者中。 17. β 18. 19. ❹ 20. 21. 22. 23. 如明求項8之方法，其另外包含以下步驟：自該移植患 者分離外周血單核細胞’分離LC並培養該等LC與GM-CSF、Flt3-L及TNFcx，自該移植患者分離τ細胞並在抗 CD8抗體存在下共培養該等LC及該等Τ細胞，以生成抑 制性Τ細胞，及在移植之前、同時或之後將該等Τ細胞、 該等LC或二者再引入該患者中。 如請求項8之方法，其中該等抑制性CD8+ Τ細胞具有提 咼之2型細胞素（IL_4、IL_5&IL13)及IL1〇i表現。 一種製備抑制性T細胞之方法，其包含： 分離外周血單核細胞，自該等外周血單核細胞分離朗 格漢斯細胞（LC)前體’將該等LC前體與GM-CSF、Flt3-L、及TNFa —起培養以製備[匚，自外周血單核細胞分離 τ細胞並在抗CD8抗體存在下及在可生成抑制性τ細胞之 條件下共培養該等LC與該等Τ細胞。 如凊求項19之方法’其中該抗CD8抗體下調針對所移入 器官之免疫反應，而不影響針對病毒之免疫反應。 如請求項19之方法，其中該等CD8+ Τ細胞係高親和性、 抗原特異性原始τ細胞。 如請求項19之方法，其中該等朗格漢斯細胞係 CDla+CD14-LC。 如請求項19之方法，其中該等CDla+CD14_朗格漢斯細 胞係藉由細胞分選獲得。 140774.doc 201000130 24. 如請求項1 9之方法，其中該等朗格漢斯細胞係藉由將 CD34+ HPC 與 GM-CSF、Flt3-L 及 TNFa — 起培養 9 至 10 天 而在體外生成。 25. 如請求項19之方法，其中該抗CD8抗體係選自〇1^-T807、T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。 26. 如請求項19之方法，其中在該培養物中提供0.5-5,000 ng/ml之該抗CD8抗體。 27. —種製備抑制性T細胞之方法，其包含： 分離外周血單核細胞，自該等外周血單核細胞分離單 核細胞，將該等單核細胞與GM-CSF及IFN-a-2b—起培養 以製備（IFN-DC)，自外周血單核細胞分離T細胞並在抗 CD8抗體存在下及在可生成抑制性T細胞之條件下共培養 該等IFN-DC與該等T細胞，該等抑制性T細胞之生成可 藉由以下來量測：粒酶A之減少、粒酶B之減少、穿孔素 之減少、少量IL-2、IFN-γ或二者之分泌、IL-10之分泌 或其組合。 28. —種影響免疫反應之方法，其包含：投與包含抑制性T 細胞之組合物，該等抑制性T細胞係藉由以下步驟來製 備：分離外周血單核細胞，自該等外周血單核細胞分離 LC前體，將該等LC前體與GM-CSF、FU3-L、及TNFcx-起培養，以製備LC，自外周血單核細胞分離T細胞並在 抗CD8抗體存在下及在可生成該等抑制性T細胞之條件下 共培養該等LC與該等T細胞。 29. —種在哺乳動物中抑制對所移植組織之排斥的方法，該 140774.doc 201000130 方法包含： 引入藉由包含以下步驟之方法製備的抑制性τ細胞： 分離外周血單核細胞，自該等外周血單核細胞分離LC前 體，將該等LC前體與GM-CSF、Flt3-L、及TNFa—起培 養以製備LC，自外周血單核細胞分離T細胞並在抗CD8 抗體存在下及在可生成該等抑制性T細胞之條件下共培 養該等LC與該等T細胞。 3 0. —種可降低移植排斥之組合物，其包含有效量之足以降 低移植排斥而不消除其他免疫反應之抑制性T細胞，其 中該等抑制性T細胞係自在抗CD8抗體存在下及在可生成 該等抑制性T細胞之條件下與成熟LC共培養之經分離外 周jk T細胞生成。 3 1 ·如請求項30之組合物，其中該抗CD8抗體係選自^^!-T807、T8、RPA-T8、HIT8a、Leu 2、T8、及 OKT8。 32. 如請求項30之組合物，其中在該培養物中提供0.5-5,000 ng/ml之該抗CD8抗體。 33. 如請求項30之組合物，其中將該等細胞冷凍起來並在使 用前再懸浮於注射用介質中。 140774.doc
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