MX2010013265A - Anticuerpos anti-cd8 bloquean cebado de efectores citotoxicos y conducen a generacion de celulas t cd8+ reguladoras. - Google Patents

Anticuerpos anti-cd8 bloquean cebado de efectores citotoxicos y conducen a generacion de celulas t cd8+ reguladoras.

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MX2010013265A
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Eynav Klechevsky
Anna Karolina Palucka
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Baylor Res Inst
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Abstract

La presente invención incluye composiciones y métodos para inducir tolerancia en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende proveer al sujeto con una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-CD8 suficiente para inducir tolerancia inmune de célula T CD8+ a antígenos alogénicos.

Description

UERPOS ANTI-CD8 BLOQUEAN CEBADO DE EFECTORES CIT CONDUCEN A GENERACION DE CELULAS T CD8+ REGULAD CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente en g ampo de células T reguladoras, y más en parti siciones y métodos para la fabricación y uerpos anti-CD8.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Sin limitar el alcance de la inven edentes son descritos en relación con toleranci e. La patente estadounidense No. 5,593,677 e ert, et al., enseña un método para la prev medad de injerto contra huésped. El método i miento y prevención de enfermedad de injer ed en el hombre por medio del uso combinado de a istrar al paciente una cantidad efectiva de cicl íente para desactivar las células CD4+.
La patente estadounidense No. 5,601,828 e inski, et al., es concerniente con derivados os de uso para modulación celular y mejora de i ar. La inmunomodulación específica y no específi njertación celular, y modulación de células no nen al utilizar varias composiciones de CD8 de ana y solubles. En esta patente, el método pa íficamente la proliferación de célula T o cit ida a un aloantígeno o un antígeno MHC-asociad er una membrana que no se presenta de manera est aleza que presenta en o sobre su superficie, u ominio extracelular de CD8 y el aloantígeno o e sociado en donde la porción de dominio extracelu comprende por lo menos el dominio hom étodos para inducir tolerancia que inc istracion al paciente de un corto curso de trat ccion auxiliar, o administración de un curso corto prolongar la aceptación de un injerto al admi o corto de un in unosupresor . El método inclu rancia en un primate receptor de una primera es rto obtenido de un mamífero de una segunda e oducir al receptor, células de tallo hematopoy t da especie, implantar el injerto en el Ctivar las células T del receptor; y admin tor un curso corto de un agente inmunosupresor, gente no es un anticuerpo de célula anti-T y el c gual a o menos de 120 días, induciendo medi rancia al injerto.
La patente estadounidense No. 6,911,220 dida a Sachs es concerniente con trasplante al de un inmunosupresor .
La solicitud de patente estadounid 166307, presentada por Bushell, et al., es co la supresión de rechazo de trasplante. Breve azo de trasplante en un animal suprimido istración de un anticuerpo dirigido a un an rficie celular seleccionado del grupo que consis CD154, LFA-1, CD80, CD86 e ICAM-1, preferibl cuerpo anti-CD4, junto con un antígeno de pr lar para generar en el animal una población. de li ladores; reactivar la población de linfocitos T r ante la administración adicional al animal del a eína no celular y trasplantar el órgano o tejid la población de linfocitos T reguladores es act nseña. Células T reguladoras pueden ser generad ultivar células T con un anticuerpo dirigido a u 0042217, presentada por Qi, et al., para una ífica de alorechazo. La especificación provee siciones para inhibir específicamente tiene e celulares como humorales al aloantígeno, e nte esto uso en prolongar la supervivencia de a rasplante y tratamiento de enfermedad de inje ed en los receptores del trasplante. El método ición de una respuesta inmune del huésped a ífieos de célula objetivo, al poner en contacto tivo que expresa el antígeno con un vector de exp fica un polipéptido de CD8 con la cadena CD8 a, e éptido de CD8 es expresado por la célula o nte lo cual una respuesta inmune del huésped ia objetivo es inhibida específicamente. Est mento en CD8 sobre la célula objetiv íficamente la respuesta inmune. tro aspecto, el anticuerpo anti-CD8 es no a o puede también incluir la generación de esoras tal como se determina al medir o determi de los siguientes fenotipos: una reducción en g reducción en granzima B, una reducción de eción de cantidades reducidas de IL-2, IFN-? eción de IL-10 o una combinación de los mism cto, la generación de células T supresora iferación de células T supresoras que secretan aspecto, el anticuerpo anti-CD8 es selecciona T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8 y 0KT8. En un e geno es alogénico.
En otra modalidad, la presente invenció osiciones y métodos para reducir rechazo al tra paciente co trasplante en tanto que manti estas inmune al tratar las células T CD8+ aislad idas de monocitos cultivados con GM-CSF e IFN- En otro aspecto, las células dendríticas son rhans (LC) generadas in vitro al cultiva éricas humanas CD34+ por nueve a diez días co L y TNFa. Otro ejemplo de células dendrí CD14-LCS. En otro aspecto, el anticuerpo anti- nde temente la respuesta inmune al órgano inj ar la respuesta inmune a virus. En otro asp as T CD8+ tratadas con el anticuerpo anti-CD8 s turales antígeno-específicas de alta avidez. En mitante, los anticuerpos anti-CD8 son selecciona , T8, RPA-T8, HIT8a, Leu 2, T8 , 0 T8 y los a CD8 enlistados en la Tabla 1. En un aspecto de t células T in vitro, el anticuerpo anti-CD8 es p ltivo de célula T CD8+ de entre 0.5 a 5,000 ng/m in vivo, la presente invención puede ser prov cuerpo anti-CD8 bajo condiciones que generan soras, y reintroducir las células T, las LC o ente antes de, en conjunción con o después del tr tro aspecto, el método puede también incluir la r células mononucleares de sangre periférica de trasplante, aislar las LC y cultivar las GM-C -L y TNFa , aislar las células T del paciente de -cultivar las LC y células T en presencia de un -CD8 para generar células T supresoras, y reintr ias T, las LC o ambas al paciente antes de, en o después del transplante. En un aspecto, las cé supresoras tienen una expresión incrementada de 2 (IL-4, IL-5 y IL-13) e IL-10.
Todavía otra modalidad de la presente ye el método para fabricar células T supreso ias fabricadas por las mismas, el método incl specto, las células T de CD8+ son células T eno-específicas de alta avidez. En un aspecto, l angerhans son CDla+CDl4-LCs . En otro aspecto, l angerhans CDla+CDl4 son obtenidas mediante cía ar. En todavía otro aspecto, las células de Lang adas in vitro al cultivar por nueve a diez dí con GM-CSF, Flt3-L y TNF . En un aspecto, el CD8 es seleccionado de CM-T807, T8, RPA-T8 , HIT y 0KT8. El anticuerpo anti-CD8 puede también se cultivo a una concentración de entre 0.5 a 5,00 En todavía otra modalidad, la presente ye un método para fabricar células T supresor as T supresoras fabricadas por las mismas, as mononucleares de sangre periférica, aislar mo células mononucleares de sangre periférica, cul itos con GM-CSF e IFN- -2b para fabricar (IFN-D e periférica, cultivar los precursores de LC c L y TNFOÍ para fabricar LC, aislar células T de l ucleares de sangre periférica y co-cultivar las as T en presencia de un anticuerpo anti ciones que generan las T células supresoras .
Todavía otra modalidad de la presente inven o para inhibir el rechazo de un tejido trasplan ero al introducir una célula T supresora nte un método que comprende aislar células mon angre periférica, aislar precursores de LC a par as mononucleares de sangre periférica, cul rsores de LC con GM-CSF, Flt3-L y TNF para fa r células T a partir de células mononucleares érica y co-cultivar las LC y las células T en pr ticuerpo anti-CD8 bajo condiciones que generan resoras .
T8, HIT8a, Leu 2, T8 y 0 8. En otro aspecto, el -CD8 es provisto en el cultivo a una concentracio a 5,000 ng/ml . En un aspecto, las células son co spendidas en un medio para inyección antes del us BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Para un entendimiento más completo de los e ajas de la presente invención, se hace referenc escripción detallada de la invención junto con l tas y en las cuales : Las Figuras la a le muestran que la expré ementada es inducida sobre células T CD8+ LC-ce obre células T CD8+ cebadas con IntDC. La Figura nálisis de citometría de flujo del nivel de ex sobre células T CD8+ naturales cebadas por subco -DC. CD8 sobre células T CD8+ cebadas con LC (lín a 2a muestra que el cebado de células T C íficas autólogo es dependiente de la ligación a 2b muestra el porcentaje de células T C íficas medidas durante el cebado con LC entre lo a Figura 2c muestra 3 clones diferentes en por imentos independientes con por lo menos 3 entes, que muestra un bloqueo signific feración alogénica natural inducida por las LC . superior, RPA-T8 panel medio, 0KT8 panel inf a 2d muestra que anti-CD8 bloquea el cebado de naturales autólogas de manera dependiente de la tal como es determinada a 50 ng/ml . La Figura orcentaje de células T CD8+ Mart-1 específicas, ea eficientemente el cebado de célula T CD8 espe eno aún cuando es agregado en un tiempo tan tar después del inicio del co-cultivo. La Figura ente en todo el cultivo (panel izquierdo) ; pane ro de células T CD8+ MART-1 específicas cebadas rgadas con las concentraciones de péptido in ra 2i muestra que anti-CD8 bloquea el cebado de MART-1 específicas (panel superior) o gpl rior) mediante IFN-DC.
Las Figuras 3a a 3g muestran que la ligac crítica para el cebado de células T CD8+ énicas. La Figura 3a muestra la proliferación de naturales en respuesta a DC alogénicos en pr -CD8 o testigo de isotipo fue determinada rporación de timidina celular. La Figura 3b n iferación de células T naturales en respue énicas en presencia de anti-CD8 o testigo de i rmiñada mediante dilución de CFSE. Las células T i superior y proliferación de células T CD4+ na a 3f y 3g muestran LC cargadas por péptido y naturales crean grupos que son evidentes en el ltivo (3g) , mientras que en presencia de ant ción de grupos es inhibida (3f ) . Amplificación ior 40x panel inferior.
Las Figuras 4a a 4f muestran que anti-CD8 estas de células T CD8+ secundarias contra ies o alogénicos. La Figura 4a muestra la fre las T CD8+ FluMP-específicas analizada con tet P-HLA-A201 9 días después de activación con LC ca ido de FluMP de un donador de HLA-A201 en pres l de Mab anti-CD8 (panel izquierdo) o testigo cidente (panel derecho) . La Figura 4b muestra q -CD8 no bloquea la respuesta específica dario inducida por LC a cualquier concentraci , tal como es analizada mediante el tetrámero ra que la carencia de inhibición por anti-CD ada a un clon de anti-CD8 particular ya que entes; T8 beckman (panel izquierdo) y RPA- ho) no mostraron ninguna inhibición de prolif as T CD8+ Flu-MP específicas inducidas por las L péptido después de 9 días de cultivo en prese del clon anti-CD8 indicado o el testigo d idente. La Figura 5f muestra que la respuesta a el antígeno alogénico no es bloqueada por an poración de timidina de un co-cultivo alogénico tra que las LC alogénicas (panel izquierdo) o In ho) , fueron efectivas para inducir respuesta pecifica ya sea si Mab anti-CD8 o testigo d idente estaban presentes en el cultivo.
Las Figuras 5a y 5b muestran un análisis fu ias T CD8+ cebadas en presencia de mAb anti-C s anti-CD3 y anti-CD28 e IFN-g, IL-2, IL-4, IL-5 fueron medidos en análisis de perlas mul ex. Los datos presentados son de from 3 endientes .
Las Figuras 6a y 6b muestran que las célu as en presencia de anti-CD8 son células T supr a 6a muestra la capacidad de las células T ce imir respuestas de célula T primarias fue p ular células T CD8+ naturales con DC alog encía de números disminuidos de células T as mediante LC in vitro en presencia de anti-CD8 sotipo. La incoporación de 3[H]timidina fue d és de 6 días. Los resultados son representativ ios independientes. La Figura 6b muestra que las naturales (donador A) fueron estimuladas con LC donador B en presencia de células CD8 cebadas a L tado para inducir la activación. Los ratones tr uerpos testigo de isotipo desarrollaron síntoma nfermedad de injerto contra huésped crónica, edor de los ojos (mostrado) , pérdida de peso y ras que los ratones tratados con anti-CD8 no. La ra los resultados de ratones fueron cosecha as T CD8+ de BM y sangre fueron analizadas en c sión de marcadores de activación CD25 y CD103.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En tanto que la fabricación y uso dades de la presente invención son discutidos riormente en la presente, se debe apreciar que l ción provee muchos conceptos inventivos aplic n ser implementados en una amplia variedad de ífieos. Las modalidades específicas discutid ular, sino que incluyen la clase general de l e usar un ejemplo específico por ilustr inología usada en la presente es para describir m eíficas de la invención, pero su uso no de ción, excepto como se resume en las reivindicaci Las células dendríticas (DC) son APC onsables por inducir inmunidad Ag-específica 1 as poblaciones de DC que toman residencia en dos, y tienen atributos funcionales distintos x dable hospeda por lo menos dos poblaciones de D angerhans (LC) en la epidermis y DC interstici is. Estas DC migran a los órganos linfoides de d rancia periférica cuando son desactivados y la do son activados. Otras DC se encuentran resi os linfoides secundarios y circulantes en la san ce en el entendimiento de biología de DC vi sión de la molécula de CD8.
CD8 es una glicoproteína de superficie qu co-receptor para reconocimiento de TCR de an ido acomplejado con la molécula de Clase I de MH expresada ya sea como un homodímero o odímero aß 3, ambas cadenas que expresan un do rfamilia de Ig extracelular individual (IgSF) , ngozne próxima de membrana, un dominio de trans cola citoplásmica 3. CD8 interactúa con &2m y lo OÍ3 de moléculas de clase I de MHC utilizando su s regiones que determinan la complementareidad (C dominio V IgSF extracelular. Esta asociación inc sión/avidez del receptor de célula T con su o e I. Además, una cascada de señalización intern la cinasa de proteina de tirosina asociada a cade ck4,5 conduce a activación de célula T. Lck es esencial ya sea para el compromiso de linaje de o función citoligica periférica 10.
Cualquiera de un número de anticuerpos anti idos, en los que se incluyen anticuerpos mon n ser usados en conjunción con la presente como aquellos que son parte del Workshops cyte Differentiation Antigens {HLDA) , en lo yen: 2D2 ; 4D12.1; 7B12 1G11; 8E-1.7; 8G5; 14; 21 ; 109-2D4; 138-17; 143-44; 278F24; 302F27; AICD B9.1.1 ; B9.2.4 ; B9.3.1 ; B9.4.1 ; B9.7.6 ; B9.8. .10; BE48; BL15; BL-TS8; BMAC8 ; BU88; BW135/80; C12/D3; CD8-4C9; CLB-T8/1; CTAG-CD8 , 3B5; F 87 (S-T8a); G10-1; G10-1.1; HI208; HI209; HI21 ; HIT8d; ICO-31; ICO-122; IP48; ITI-5C2; ITM8- 8; L2; L533; Leu-2a; LT8 ; LY17.2E7; LY19.3B2;. ; M-T415; M-T805; M-T806; M-T807; M-T808; M-T809; 1. Ejemplos de anticuerpos anti-CD8 puede íos disponibles comercialmente tales como aq Cruz Biotechnology, Inc., e incluyen una o m entes versiones o versiones humanizadas de los m CUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES E Igd de (0.N.66) Término C (h) WB, IP, IF, IHC(P) H ratón IgGi de (1.BB.720) FL (conejo) IF , FCM C ratón Igd de (12.C7) FL (conejo) IF, FCM C ratón IgGi de (14) FL (h) IF H ratón' IgG2a de (15-11C5) FL (r) IF R ratón IgG2b de (2.43) FL (m) IF, FCM R rata IgG2a de (32-M4) FL (h) WB, IP, IF, FCM H ratón NTICUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES E IgGi de D8 (6A238) N/A FCM C ratón IgGi de h D8 (6A243) FL (perro) FCM rata p IgG2a de D8 (6D17) FL (h) IP, FCM H ratón IgGx de D8 (733) N/A FCM H ratón IgGi de D8 (8.F.36) FL (h) FCM H ratón IgGi de D8 (B-H7) FL (h) IF ratón Ig de D8 (B334) N/A IF NTICUERPO ISOTIPO EPXTOPO APLICACIONES E D8 (LT8) FL (h) FCM H ratón IgGi de D8 (M211) FL (h) IP H ratón IgGi de D8 (M236) FL (h) IP H ratón IgGi de D8 (MCD8) FL (h) IF, IHC(P), FCM H ratón IgG2a de D8 (MEM-31) FL (h) IP, FCM H ratón D8 (ME -87) FL (h) IP, FCM H ratón IgG2a de D8 .(MIL-12) N/A FCM P ICUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES ES IgGi de (RFT-8) N/A IF, FCM Hu ratón IgGi de (RIV11) FL (h) IF, FCM Hu ratón IgGi de (RPA-T8) N/A IF, FCM Hur ratón IgG2a de IP, I , IHC(P), (UCH-T4) FL (h) Hu ratón FCM {YGATOE IgGi de FL (perro) FCM , -9) rata {YTC IgG2b de FL <h) FCM Hu .1HL) rata {YTC IgG2b de FL <h) FCM Hu .20) rata ICUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES ES - (76-2- IgG2a de N/A IP, FCM Pu ratón Igd de - (CT-8) N/A IP, IF, FCM Po ratón IgG2b de - (??72) N/A IP, IF, FCM Po ratón IgG2 de - (143-44) FL (h) IF, FCM Hu ratón IgG2b de -a (3-298) N/A IP, IF, FCM Po ratón IgG2a de - (3?842) FL (m) IP, IF, FCM Ra rata IgGa de - (4j9) N/A IP, IF, FCM Po ratón ICUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES ES IgG2b de -a (5K100) N/A IP, IF, FC Po ratón gG2b de -a (5?97) N/A IP, IF, FCM Po ratón Igd de IP, IF , IHC(P), - (6?242) FL <r) Ra ratón FCM IgG de -a (C-19) Término C (h) WB, IF Hu cabra -a IgG2a de FL (perro) IP, IF, FCM Pe 9.JD3) ratón IgG2a de -a (D-9) 22-182 (h) WB, IP, IF, IHC(P) m, ratón IgG de -a (?-160) 22-182 (h) WB, IP, IF m, conejo ICUERPO ISOTIPO EPITOPO APLICACIONES ES IgGi de IP, IF, IHC(P), - (0X8) FL (r) Ra ratón FCM -a (R-15) cabra Término C (r) WB, IP, IF m, -a IgG2b de FL (m) FCM Ra S105.18) rata IgG2b de extracelular -a (????) FCM Hu ratón (h) -ß IgG2a de FL (h) FCM Hu ??.574) ratón -ß IgG2a de FL (h) FCM Hu T8.5H7) ratón IgGi de -ß (341) ' FL (r) WB, IP, FCM Ra ratón l G de peutic Antibody Centre, Oxford University, Oxf ) .
Las células dendríticas (DC) inicial y estas inmune antígeno-específicas . Las DC as (mDC) incluyen distintos subconjuntos t as de Langerhans y DC intersticiales (dérmica) q a piel humana. Se ha reportado que las c rhans cuando se comparan con DC interstic cularmente poderosas en el cebado de célula ales contra antígenos álogénicos y autólogos, mi subconjuntos de mDC fueron igualmente eficie ir una respuesta secundaria. El estudio actual f o para analizar los parámetros que podrían ex ones superiores de las LC para inducir el as T CD8+. Las células T CD8+ cebadas con LC es más altos de CD8 en comparación con célul ncia de mAb anti-CD8 fueron aptas de in acción y así actuaron como células T CD8+ supre go, la inducción de respuestas de CTL secunda aquellas a Influenza y CMV no fueron alteradas mAb anti-CD8 no alteraron las respuestas de Célu dministración del mAb anti-CD8 a la activación de aloreactivas in vivo, en una población de célu umano-ratón impidió el desarrollo de enfermedad a huésped inducida por la inyección de célul énicas . Así, la terapia de anticuerpo anti-C ir el rechazo de injerto moderado por células T ar respuestas antivirales protectoras y por co ía representar un avance significativo s mientos inmunosupresores actuales Esta solicitu la ligación de CD8 da como resultado una inhi o de célula T y la generación de células T regul a T sino también dispara la generación de 1adoras .
Purificación y Cultivo de DC. DC CD34 ? generadas al cultivar CD34-HPC G-CSF moviliza i en un matraz de 25 cm3 en un medio de Yss tific, CA o Gemini BioProducts) que contiene 5 logo, 2^-mercaptoetanol 50 µ?, L-glutamina cilina/estreptomicina al 1%, y las citocinas l; Immunex Corp.), FLT3-L (100 ng/ml; R&D) , y 1; R&D). Los cultivos fueron incubados a 37°C con un medio ambiente humidificado, las célul sferidas a un medio nuevo complementado con ci 5 de cultivo, y cosechadas en el día 9 ó 1 +CD14 y CDla"CDl4+-intDC fueron clasificadas. La emáticamente de 95-99%.
DC IFN-derivadas (IFN-DC) fueron gene riano (Roche) /antimicotico (Gibco) por 18 horas por 2 horas a 37°C. Las hojas epidérmicas y ? luego separadas, cortadas en pequeñas piezas locadas en RPMI 1640 (Gibco) complementado con su 1 al 10% (FBS) . Después de 2 días, las células qu edio fueron recolectadas y enriquecidas adic izando un gradiente de Ficoll-diatriazoato , 1.077 dio de Separación de Linfocito, MP Biomedicals ? purificadas mediante clasificación celular d o con anti-CDla FITC (OKT6; DAKO) y mAb ant 3 ; Invitrogen) .
Aislamiento de Célula T. Las células fuero BMC congeladas obtenidas de leukaferesis de tarios adultos. Las células T CD8+ natural ificadas como células CD45RA+CCR7+HLA-DR-CD8+ , en miento celular magnética de CD4~, CD56", CD16 ? estimuladas con mDC autologas (5 x 104 célula fueron preincubadas por 3 horas con el péptido M restringido (MART-lM26-35 , ELAGIGILTV) o gplOO (g PFSV) (3 µ?) . Las células fueron cultivadas por s de 24 cavidades en medio completo de Yssel com 10 U/ml,IL-7 (R&D) y 100 ng/ml CD40L (R&D). Se a ) a 10 U/ml en el día 3; anti-CD8 o testigo idente fue agregado en el día 0, a no ser que tra manera.
La expansión de células T CD8+ péptido-e eterminada al contar el número de células que se tetrámeros de péptido/HLA-A201 (Beckman Coulter) período de cultivo. Para la determinación de res rdo, el total de células T CD8+ (1 x 106 c n estimuladas con subconjuntos de mDC autólogos ias/mi) cargadas con péptido Flu-MP HLA-A2Olr camente al 10% (medio completo de Yssel) e IL-2 , al cual 2.5 x 104 subconjuntos de mDC alogéni que se indique de otra manera) fueron agregada para activar las DC . Después de 5 días, la n pulsadas por 18 horas con 1 µ?? [H3]-timi poración del trazador determinada como m iferacion en marcha.
Para la determinación de proliferación ción de CFSE, las células fueron marcadas con C cuerdo con el procedimiento del fabricante. Des las células fueron cosechadas y el nivel de pro analizado mediante citometría de flujo. A rminó la calidad de las células T CD8+ cebada ribe a continuación.
En donde se indica, el bloqueo de anticue (clon RPA-T8, OKT6, BD, o T8 Beckman Coulter) o rminada mediante incorporación de [3 ]timidina.
Producción de Citocinas . Para la determi cción de citocina de células T CD8+, las célu iferadas (FSChighCDllc~ o CFSElowCDllc~) fueron aisl 7 mediante clasificación celular de un cultivo ario y reestimulada durante toda la noche con m iertas con anti-CD3 y anti-CD28. Las citoci enadante fueron medidas mediante análisis de c de perla multiplex.
Análisis de T CD8+ Supresor. Para el an ión supresora de células T CD8+, las célula iferadas (FSChighCDllc" o CFSElowCDllc") fueron aisl 7 mediante clasificación celular de un cultivo ario y agregadas a números graduados a un co-cult células T CD8+ naturales y 2.5 x 103 DC alogé L-activadas . Se agregó 1 µ/Ci de [3H]timidin Para análisis de gen de microarreglo, las prolifera (CFSE-) de un cultivo alogénico prima ficadas y la re-estimulación con microperlas r nti-CD3 y anti-CD28.
Evaluación de tratamiento Anti-CD8 contra njerto contra huésped in vivo. Células CD34+ érica movilizada (MPB) (3-6 x 106 células CD34+ l) fueron sometidas a infusión intravenosamente imentales separados de ratones NOD/SCID irradi lmente (300 centigrays mediante irradiación ? se describe previamente 10-12 semanas de plante, los ratones fueron inyectados subcutáne de células T CD8+ naturales clasificadas de nico. Los ratones fueron tratados con un mAb o mAb anti-CD8 (RPA-T8 BD biosciences, 0.75 mg e .25 mg en el día 3) subcutáneamente. En un El cebado in vitro células T CD8+ natural adas in vitro. LC HLA-A201+ y IntDC fueron ge mediante cultivo por nueve a diez días de HPC d encia de GM-CSF, Flt3-L y TNFa. Las célul ificadas en LC CDla+CDl4" (LC) y CDla"CDl4+ IntD la respuesta primaria, subconjuntos de DC ca ido de melanoma HLA-A201-restringido 3 ? MART on cultivados con células T CD8+ naturales aut e a diez días . La frecuencia de las célul geno-específicas al final del cultivo fue medida etrámero de MHC péptido específico.
Como se muestra en la Figura la y Figur ias T CD8+ naturales cebadas mediante LC ndentemente la expresión de CD8 en la superficie ara con células T CD8 IntDC-cebadas . Para la re ria, subconjuntos de DC fueron cargados con eó eficientemente la expansión de células T C íficas mediante LC MART-l-pulsadas (Figura isis científico indica que se observa iferación de células T CD8+ antígeno-específicas uno y el día nueve cuando el anticuerpo mAb a ado al cultivo (Figura 2b) . La inhibición del ia T CD8+ fue muy efectiva ya que 0.1 µg/ml de omo resultado una inhibición casi completa de la élulas T CD8+ antígeno-específicas y la con idora al 50% (IC50) estuvo en el intervalo de 50 jra 2c) . Tres de tres anticuerpos anti-CD8 pro 8 y OKT8) inhibieron el cebado de célula T célu El retardo de la adición de mAb anti-C ivos hasta la hora setenta todavía dio como res ición del 75% del cebado de célula T CD8+ e de intensidad de tetrámero sobre las células T íficas (Figura 2g) .
El mAb anti-CD8 fue también apto de bl o de células T CD8+ MART-1 y gplOO-específicas C generadas al cultivar monocitos con GM-CSF e (Figura 2h) , indicando que el efecto inhibidor diente de la fuente de las DC ni de antígeno se el cebado. Además, el mAb anti-CD8 fue apto de b o aún cuando una alta concentración de péptido f las DC, o cuando el antígeno estaba presente vo (Figura 2i) . Tomados conjuntamente, es stran que el bloqueo de CD8 impide el cebado in células T naturales antígeno-específicas de alt El anticuerpo anti-CD8 inhibe la alopro ada por DC de células T CD8. MAb anti-CD8 o po fue agregado a los cultivos de células T CD8+ el anticuerpo ánti-CD8 (Figura 3b, panel infe sto, mientras que la proliferación de célula ida a 30 ng/ml (Figura 3c, panel superior) , las no mostraron proliferación disminuida par ntración de mAb de anti-CD8 utilizada (0-3 µg/m panel inferior) . La proliferación vigorosa de nicas inducida por DC dérmicas o LC aislada a fue también bloqueada por el mAb anti-CD8 (Fi En presencia de mAb anti-CD8 solamente poc ños dispersados fueron formados entre células T ra 3f ) . Sin embargo, en cultivos sin mAb ant iferación vigorosa fue asociada con grupos muy células T CD8+ (Figura 3g) . Asi, el anticuerp inhibir el cebado moderado por DC de célul nicas .
Anti-CD8 no bloquea la respuesta secunda ras 4a y c) . No se detectó ninguna inhibició ntración de mAb anti-CD8 tan alta como de ras 4b y d) . Los otros dos mAb anti-CD8 pro an, RPA-T8 BD) no inhibieron la activación induc do de flu de células de memoria (Figura 4e) .
Para demostrar si las respuestas de célu nica de memoria serían afectadas por los mAb as T CD8+ naturales fueron cebadas por LC alo por siete días, y las células T fueron reestim días. Como se muestra en la Figura 4f, el mAb a apto de inhibir la reestimulación de célula T C tígeno original, utilizando ya sea LC o IntDC. demuestran que las respuestas de célula T CD8+ ndependientes de CD8-.
El cebado de células T CD8+ células con MA ce células T Tipo 2 con bajos niveles de CD8 secretaron las mismas cantidades de IFN-? e cantidades de IL-4 (100-600 pg/ml), IL-5 ), IL-13 (1000-7000 pg/ml) e IL-10 (70-100 pg/m Colectivamente, los datos indican que el mA a el fenotipo de células T CD8+ activadas p as que segregan citocinas Tipo 2 y que expré es de moléculas citotóxicas .
Las células T CD8+ aloreactivas cebadas en ti-CD8 suprimen potentemente respuestas de cél ales. Para determinar si las células T CD8+ ncía de mAb anti-CD8 muestran funciones s as T CD8+ naturales CFSE-marcadas (donador vadas con LC alogénicas (donador B) con mAb ol de isotipo coincidente por siete dias. Las activadas (CFSE-CDllc- ) fueron clasificadas y ag cularmente sorprendente cuando las células T CD8 Ab anti-CD8 fueron dadas con DC aloespecificas , sion fue menos intensa con DC de donador C (Figu MAb anti-CD8 inhibe la activación de célu nica y la enfermedad de injerto contra huésped i te inhibición de cebado de célula T CD8+ observad anticuerpos anti-CD8 nos . condujo a probar si es ería in vivo en ratones NOD-SCID inmunod tados con HPC CD34+ humanos que diferencian a p ias B pero no células T. Estos ratones humaniza sferidos adoptivamente de manera subcutánea c ias T CD8+ purificadas de un donador alogénico c ea del mAb anti-CD8 o un anticuerpo testigo cidente. 0.25 mg adicionales de anticuerp etados en el d a tres . En uno de los dos exp -CD40 (MAB89, Schering Plough, 100 µg) fue rollo de síntomas clínicos (Figura 7) . Células édula ósea de ratones tratados con testigo d aron ascendentemente CD103 mientras que lo dos con mAb anti-CD8 no (Figura 7b) .
Colectivamente, estos datos indican que la anti-CD8 es eficiente para - impedir la activació nica de células T CD8+, que moderan la enfermed a huésped en ratones inmunodeficientes que ma inmune humano.
El estudio actual fue efectuado para entend LC son más potentes que las DC Intersticiales en lulas T CD8+ naturales, mientras que ambos subco fueron igualmente eficientes para inducir una re a T CD8+ secundaria. Varias conclusiones fueron os resultados de agregar mAb anti-CD8 a co-cu as T CD8+ naturales y DC. Primero, se encont contra antígeno presentado en el contexto de MH ogénico in vitro. Sin embargo, las respuestas d a antígenos virales o. alogénicos no fueron inh mAb anti-CD8. Estos datos están en línea con ior en estudios in vitro con linfocitos de ran que los anticuerpos anti-CD8 pueden bl feración de células T CD8+ naturales pero no células efectoras y de memoria 6. Anti-CD8 tambi ctivación de células T CD8+ naturales aloreac én observado in vivo en un modelo de ratón tante en la ablación de la respuesta de inje ed. Quizás la observación más sorprendente e ón de anticuerpos anti-CD8 modificó cualitati de respuesta de una respuesta efectora a una élulas supresoras generadas expresan un fenotipo sión disminuida de granzima A y B y perfori Estas observaciones son de significado clín células T son los mediadores primarios de r jerto '12, se ha dirigido mucho esfuerzo éuticos que bloquean específicamente la activaci élulas T en receptores de aloinjerto. Se ha demo rutas dependientes de células T CD4+ c dientes de células T CD8+ inician el r jerto. En tanto que las estrategias de inmuno como rapamicina 13 , ciclosporina 14 , mAb anti-C CD154 16 y CTLA4-Ig 17 son muy efectivos para s ación inmune CD4-dependiente, se ha demostrado q echazo CD8-dependíente en estudios es resis tencia de las células T CD8+ a supresión idores de calcineurina también ha sido correlac incidencia incrementada en rechazo de aloinjerto ios clínicos 18. Esto está en línea con los vación de que anti-CD8 bloquea el cebado tora en tanto que deja respuestas de memoria espe S intactas puede impedir la generación de célu activas que atacan un injerto en tanto que estas secundarias anti-virales intactas.
La regulación ascendente de CD103 por célu 1 sitio de injertación ha sido enlazada estrech abilidad de las células T CD8* para moderar los njerto 19. La integrina especifica de célula 3 (c¿E integrina) , define un nuevo subconjunto d eactivo 20. La activación de la ruta CD8 dependí endiente) de rechazo de aloinjerto produce una e vigorosa, que es altamente resis oregulación . Una infiltración focal in cipalmente linfocitos T de CD8+CTLA4+ durante el n ha sido descrita en pacientes. Esto sugier uier método, kit, reactivo o composición de la ceversa. Además, las composiciones de la invenc sadas para obtener los métodos de la invención.
Se comprenderá que las modalidades pa itas en la presente son mostradas a manera de i 0 como limitaciones de la invención. Los ipales de esta invención pueden ser empleados lidades sin desviarse del alcance de la invención imentados en el arte reconocerán, o serán aptos izando no más que experimentación de rutina, alentes a los procedimientos específicos descri nte. Se considera que tales equivalentes están ee de la invención y son cubiertos indicaciones .
Todas las publicaciones y solicitudes d ionadas en la especificación son indicadoras del también es consistente con el significado de "u lo menos uno", y "uno o más que uno". El uso d en las reivindicaciones es usado para dar a ente ser que se indique explícitamente para re nativas solamente o las alternativas son sivas, aunque la revelación soporta una definic re a solamente alternativas y "y/o" . En itud, el término "aproximadamente" es usado pa alor que incluye la variación de error inherent sitivo, el método que es empleado para dete , o la variación que existe entre los sujetos d se usan en esta especificación y reivindicació ras "que comprende" (y cualquier forma de que como "comprender" y "comprende"), "que tiene" (y de que tiene, tal como "tener" y "tiene"), "qu ualquier forma de que incluye, tal como "i es importante en un contexto particular , tambi CBA, BCA, ACB , BAC o CAB . Continuando con est idas expresamente están combinaciones que ticiones de uno o más ítems o términos , tales com BBC , AAABCCCC , CBBAAA, " CABABB y así sucesiva rimentado en el arte entenderá que comúnmente no te en cuanto al número de ítems o términos en inación , a no ser que sea evidente de otra exto .
Todas las composiciones y/o métodos revelados y r presente pueden ser elaborados y ejecutados sin exp ida a la luz de la presente revelación. En tan siciones y métodos de esta invención han sido descritos dalidades preferidas, será evidente para aquellos de hab que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/ s etapas o en la secuencia de etapas del método des 2. Caux, C. et al . CD34+ hematopoietic p humano cord blood differentiate along two i itic cell pathways in response to GM-CSF+TNF al 84, 695-706 (1996) . 3. Zamoyska, R. The CD8 coreceptor revis good, two chains better. Immunity 1, 243-6 (199 4. Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, , J. B. The CD4 and CD8 T cell surface ant iated with the internal membrane tyrosine-prot k. Cell 55, 301-8 (1988) . 5. Chalupny, N. J., Ledbetter, J. A. & Ka iation of CD8 with p561ck is required for ear lling events . Embo J 10, 1201-7 (1991). 6. Bachmann, M. F. et al. Developmental reg argeting to the CD8 coreceptor controls signalin emory T cells. J Exp Med 189, 1521-30 (1999). 9. Nakayama, K. et al . Requirement for CD8 ositive selection of CD8-lineage T cells. Sci -3 (1994) . 10. de la Calle-Martin, 0. et al . Fair ciency due to a mutation in the CD8 alpha gen st 108, 117-23 (2001) . 11. Hall, B. M. Cells mediating allograft splantation 51, 1141-51 (1991) . 12. Rosenberg, A. S. & Singer, A . Cellula allograft rejection: an in vivo model of immun ue destruction. Annu Rev Immunol 10, 333-58 (1992) 13. Slavik, J. M. , Lim, D. G. , Burakoff, er, D. A. Rapamycin-resistant proliferataion s correlates with p27kipl down-regulation a ction, and is prevented by an inhibitor of phosph nase activity. J Biol Chem 279, 910-9 (2004).
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un método para inducir tolerancia en cesidad del mismo, caracterizado porque comprend poner en contacto células T aisladas con un ticuerpo anti-CD8 no agotadora durante el cebado n un antígeno efectivo para¾ inducir célula T tol proveer al sujeto en necesidad o toleranci ias T tolerogénicas . 2. El método de conformidad con la reiv racterizado porque el anticuerpo anti-CD8 es hum 3. El método de conformidad con la reiv racterizado porque el anticuerpo anti-CD8 es no 4. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque la generación de células T eterminada al determinar uno o más de los -T807, T8, RPA- 8 , HIT8a, Leu 2, T8, y 0K 8. 7. El método de conformidad con la reiv racterizado porque el antígeno es alogénico. 8. Un método para reducir rechazo de traspl nte de trasplante/ en tanto que se mantie estas inmunes, caracterizado porque comprende: tratar células T CD8+ aisladas con una cant uerpo de bloqueo no agotador anti-CD8 efec rar la generación de células T CD8+ supresoras o con un antígeno, en donde la supresión de las caracterizada por uno o más de los siguientes reducción en granzima A, una reducción en granzi ción de perforina, secreción de cantidades re , lFN-? o ambas, secreción de IL-10 o combinació s ; y introducir las células T CD8+ supresoras a -L y TNFa . 11. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque las células dendríticas son 12. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque el anticuerpo anti-CD ndentemente la respuesta inmune al órgano i j tar la respuesta inmune a los virus. 13. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque las células T CD8+ tratad uerpo anti-CD8 son células T naturales, íficas de alta avidez. 14. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque el anticuerpo anti-CD8 es se -T807, T8, RPA-T8 , HIT8a, Leu 2, T8 y 0K 8. 15. El método de conformidad con la reiv ias T en presencia de un anticuerpo anti iciones que generan células T supresoras, y re células T, las LC o ambas a un paciente ant nción con o después del transplante. 17. El método de conformidad con la reiv aracterizado porque comprende además las etapas ias mononucleares de sangre periférica del pa lante, aislar las LC y cultivar las LC GM-CSF, , aislar células T del paciente de trasplante y c LC y células T en presencia de un anticuerpo ant rar células T supresoras, y reintroducir las célu ambas al paciente antes de, en conjunción con transplante. 18. El método de conformidad con la reiv aracterizado porejue las células T de CD8+ supreso expresión incrementada de citocinas tipo 2 (lL-iciones que generan células T supresoras . 20. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque el anticuerpo anti-C ndentemente la respuesta inmune al órgano inj tar la respuesta inmune a los virus . 21. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque las células T CD8+ son rales antígeno-especificas de alta avidez. 22. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque las células de Lange +CD14- LC. 23. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque las células de Langerhans obtenidas mediante clasificación celular. 24. El método de conformidad con la reiv caracterizado porque las células de Lange terizado porque comprende: aislar células mononucleares de sangre p r monocitos de las células mononucleares érica, cultivar los monocitos con G -CSF e IFN car (IFN-DC) , aislar células T de células mononu e periférica y co-cultivar las IFN-DC y las cél ncía de un anticuerpo anti-CD8 bajo condic an células T · supresoras, tal como es medido ción en granzima A, una reducción en granzi ción de perforina, secreción de cantidades re , IFN-? o ambos, secreción de IL-10 o combinació s . 28. Un método para afectar una respuest terizado porque comprende, administrar una compo ende células T supresoras elaboradas al aisla ucleares de sangre periférica, aislar precursore todo que comprende aislar células mononucleares érica , aislar precursores de LC de las ucleares de sangre periférica , cultivar los prec n GM-CSF , Flt3 -L y TNF para fabricar LC , aislar lulas mononucleares de sangre periférica y co-cu células T en presencia de un anticuerpo anti ciones que generan las células T supresoras . 30. Una composición que reduce el rechazo de t erizado porque comprende una cantidad efectiva de soras suficientes para reducir el rechazo de trasplante s respuestas inmune, en donde las células T supresoras s tir de células T de sangre periférica aisladas co-cultiv as en presencia de un anticuerpo anti-CD8 bajo cond an las células T supresoras . 31. La composición de conformidad con la reivmc terizada porque el anticuerpo anti-CD8 es seleccionado
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