CN110913873A - 用于cd8+t细胞的体内扩增并预防或治疗gvhd的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了在造血细胞移植(HCT)后预防和治疗急性GVHD和慢性GVHD的方法，以及在HCT后在体内增强体内淋巴组织中供体CD8⁺T细胞的扩增的方法和在HCT后增强程序性死亡‑配体1(PD‑L1，或B7H1)的接受者组织表达的方法。该方法需要在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，或进行HCT后即刻向接受者施用一剂或更多剂有效量的治疗剂以暂时消耗CD4⁺T细胞或降低血清IL‑2。一些实例包括抗CD4抗体或抗CD4‑中间位免疫毒素，抗IL‑2抗体，阻断IL‑2R的试剂，和/或PD‑L1‑Ig。可施用一种或多种另外的治疗剂，例如IFN‑γ。

Description

用于CD8+T细胞的体内扩增并预防或治疗GVHD的方法

优先权声明

本申请要求2017年2月23日提交的美国临时申请号62/462,853的权益，其通过引用全文纳入本文。

政府利益声明

本发明是在国立卫生研究院(NIH)授予的批准号R01 AI066008，2R56AI66008-11，R01AI095239，和P30CA033572的政府支持下完成的。政府拥有发明的某些权利。

背景技术

同种异体造血细胞移植(HCT)是血液系统恶性肿瘤(即白血病和淋巴瘤)的治愈性疗法，得益于同种异体反应性T细胞介导的移植物抗(versus)白血病/淋巴瘤(GVL)效应。这些相同的T细胞还介导急性移植物抗宿主疾病(GVHD)和随后的慢性GVHD的发展(1-9)。同种异体反应性CD4⁺和CD8⁺ T细胞均可介导急性GVHD，Th1和Th17细胞在引发消化道(gut)GVHD中起关键作用(10-14)。流式细胞仪分选的供体CD4⁺ T细胞通过FASL的表达和促炎细胞因子(即IFN-γ和TNF-α)的产生来介导严重的GVHD(14-17)，分选的供体CD8⁺ T细胞防预移植物排斥并通过它们的穿孔素/颗粒酶的表达来介导GVL效应，而不会在几种小鼠模型中导致急性临床GVHD(2，18，19)。然而，纯化的同种异体反应性CD8⁺ T细胞介导GVL效应而不引起GVHD的机制在很大程度上仍是未知的。

程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7H1)作为与PD-1和CD80相互作用的免疫检查点(checkpoint)起作用(20，21)。PD-L1通常在炎性细胞因子(即IFN-γ)诱导下由造血细胞和实质细胞(parenchymal cells)表达(22)。CD80由T细胞进行结构性表达，并在T细胞活化后早期上调(23)，而PD-1在T细胞活化后的后期由T细胞表达(24)。PD-L1与PD-1的相互作用诱导活化的T细胞的失能，衰竭和凋亡(25，26)；另一方面，已报道PD-L1/CD80相互作用在体外抑制CD28/CTLA4缺陷型T细胞增殖(21)。

PD-L1在接受者组织中的表达降低常规TBI处理的(conditioned)同种异体接受者中GVHD的严重程度(27-29)，而供体T细胞PD-L1的表达通过增强供体CD4⁺和CD8⁺ T细胞的扩增和存活而增加GVHD的严重性(30)。结果显示PD-L1与CD80在不存在PD-1的情况下的相互作用通过增强同种异体反应性CD4⁺ T细胞增殖和扩增而使GVHD恶化，尽管PD-L1与CD80和PD-1的同时相互作用通过增强活化的同种异体反应性CD4⁺ T细胞凋亡而改善了GVHD(31)。

通过PD-L1与CD80和PD-1在同种异体HCT中的CD8⁺ T细胞上的相互作用来调节失能，衰竭，和凋亡尚未得到很好的表征。结果显示PD-L1的宿主组织表达的缺失导致具有GVHD和淋巴细胞的接受者的GVHD靶组织中的浸润性(infiltrating)CD8⁺ T细胞的扩增(27)。其他出版物已表明，PD-L1的宿主组织表达导致了GVHD接受者中同种异体反应性CD8⁺ T细胞的衰竭和GVL效应的降低(32，33)。然而，据报道，在GVHD发作之前HCT后初期淋巴组织(即脾)中同种异体反应性CD8⁺ T细胞的体内扩增不受PD-L1的宿主组织表达的影响(34)。

IFN-γ在急性GVHD发病机制中的作用仍存在争议。IFN-γ是消化道和肝中通过增强Th1分化和上调消化道和肝归巢趋化因子受体(α4β7，CCR9，CCR5和CXCR3的Th1表达)的CD4⁺T介导的急性GVHD所必需的(29，43，44)。与之相反，与CD4⁺ T细胞相比，相同数量的供体CD8⁺Tc1细胞几乎不诱导的消化道急性GVHD(11，64)。尽管IFN-γ并不直接杀死肿瘤细胞，但CD8⁺ T细胞产生的IFN-γ需要将GVHD与CD8⁺ T细胞介导的GVL效应分开(65，66)。

IFN-γ是调节程序性死亡配体1(PD-L1，也称为B7H1)的组织表达的关键细胞因子(22，67)。在非炎性条件下，造血细胞和淋巴细胞结构性表达PD-L1 mRNA和蛋白质，而实质细胞表达PD-L1 mRNA但没有蛋白质表达(22)。诸如IFN-γ的促炎细胞因子通过造血细胞，淋巴细胞和实质细胞增强PD-L1mRNA和蛋白的表达(22)。针对PD-L1的受体包括CD80和PD-1(20，21)。PD-L1与其受体PD-1和CD80的相互作用诱导活化的T细胞的失能，衰竭和凋亡(25，26)。此前的研究表明PD-L1的接受者组织表达下调常规TBI处理的(conditioned)同种异体HCT中的GVHD，尽管接受者仍然发展了GVHD(29，27，28)。据报道，在不存在PD-1的情况下PD-L1与CD80的相互作用通过增加同种异体反应性CD4⁺ T细胞增殖而不增加CD4⁺ T细胞凋亡来增强急性GVHD，而PD-L1与CD80和PD-1的同时相互作用通过增强同种异体反应性CD4⁺ T细胞增殖和凋亡来改善GVHD(31)。

因此，仍然需要改善CD8⁺ T细胞的体内扩增，而且不仅需要预防和治疗急性GVHD，还需预防和治疗慢性GVHD。本发明满足了本领域的需要。

发明概述

在一方面，本公开涉及在造血细胞移植(HCT)后增强体内供体CD8⁺ T细胞扩增的方法。该方法需要在即将进行HCT之前，进行HCT期间，或进行HCT后即刻将一剂或更多剂有效量的治疗剂施用于接受者，以暂时消耗(deplete)CD4⁺ T细胞或暂时降低血清IL-2。在一些实施方式中，治疗剂包括抗CD4抗体或抗CD4中间位免疫毒素。在一些实施方式中，抗CD4⁺抗体是单克隆抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，治疗剂包括抗IL-2抗体(例如，抗IL-2单克隆抗体和/或人源化抗体)或阻断IL-2R的药剂。在一些实施方式中，CD8⁺ T细胞在淋巴组织中选择性扩增，但不在受试者的GVHD靶组织中扩增。在一些实施方式中，与接受IgG的对照接受者相比，扩增的CD8⁺ T细胞产生增加量的IFN-γ。

另一方面，本公开涉及在HCT后防止受试者患上GVHD的困扰或治疗患有GVHD的受试者并同时保留GVL的方法。该方法需要在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，进行HCT后即刻将一剂或更多剂有效量的治疗剂施用于接受者，以暂时消耗CD4⁺ T细胞或暂时减少血清IL-2。在一些实施方式中，治疗剂包括但不限于抗CD4抗体，抗CD4-中间位免疫毒素，抗IL-2抗体，或IL-2R阻断剂。在一些实施方式中，抗CD4+抗体是单克隆抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，通过将单剂量的治疗剂施用于受试者来预防或治疗急性GVHD。在一些实施方式中，通过施用不超过三个剂量的治疗剂来预防或治疗GVHD。例如，三个剂量在一个月内以一周或两周的间隔施用。在一些实施方式中，可施用超过三个剂量的治疗剂以预防或治疗GVHD。在一些实施方式中，施用一剂或更多剂PD-L1-Ig以预防或治疗GVHD且同时保留GVL。在一些实施方式中，该方法除了暂时消耗CD4⁺ T细胞或降低血清IL-2外，还需要将一剂或更多剂IFN-γ施用于受试者。

另一方面，本公开涉及在HCT后预防或治疗GVHD并增强胸腺恢复的方法。该方法需要在进行HCT的同时，即将进行HCT前，或进行HCT后即刻将一剂或更多剂有效量的治疗剂施用于接受者，以在60天至120天的期间内暂时消耗移植物中的和重新生成的CD4⁺ T细胞或暂时降减少血清IL-2。在一些实施方式中，治疗剂包括抗CD4抗体，或抗CD4-中间位免疫毒素。在一些实施方式中，抗CD4⁺抗体是单克隆抗体或人源化抗体。在一些实施方式中，治疗剂包括抗IL2抗体或阻断IL-2R的药剂。在一些实施方式中，抗IL2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

在另一方面，本公开涉及在HCT后增强程序性死亡-配体1(PD-L1，或B7H1)的接受者组织表达的方法。该方法需要在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，进行HCT后即刻将一剂或更多剂有效量的治疗剂施用于接受者。在一些实施方式中，治疗剂包括暂时消耗CD4⁺ T细胞的药剂，例如抗CD4抗体(例如，单克隆或人源化抗CD4抗体)或抗CD4-中间位免疫毒素。在一些实施方式中，治疗剂包括暂时降低血清IL-2的药剂，例如抗IL-2抗体(例如，单克隆或人源化抗IL-2抗体)或阻断IL-2R的药剂。

附图简要说明

此申请包含至少一个以彩色绘制的绘图。向专利局(the Office)付费后可要求有偿提供本申请与彩色附图的副本。

图1A-1D显示少量供体CD4⁺ T细胞以IL-2依赖性方式增强GVHD靶组织中供体CD8⁺ T细胞的存活。图1A示出了将C57BL/6TCD-BM(2.5×10⁶)以及脾细胞(5×10⁶)或体外CD4⁺ T细胞消耗的脾细胞一起移植于致死照射过的BALB/c接受者，所述脾细胞含有的CD8⁺ T细胞的数量与全部5×10⁶个脾细胞中的数量相同。在进行HCT时向全部脾细胞的接受者注射消耗性(depleting)抗CD4 mAb(500μg/小鼠)以在体内消耗供体CD4⁺ T细胞。分析了来自进行HCT之前的供体脾细胞和来自进行HCT后7天的接受者的脾细胞的供体CD4⁺ T细胞的百分比和产量(yield)。示出了脾中供体CD4⁺ T细胞的百分比和产量的代表性模式和平均值±SEM。平均值±SEM；每组n＝4。图1B显示致死照射过的BALB/c接受者仅被注射TCD-BM(2.5×10⁶)，TCD-BM仅加流式细胞仪分选的CD4⁺ T细胞(0.075×10⁶)，TCD-BM仅加分选的CD8⁺ T细胞(1×10⁶)或TCD-BM加CD4⁺和CD8⁺ T这两种细胞。监测接受者的GVHD临床症状，例如腹泻和存活。示出了没有腹泻的小鼠百分比和与腹泻相关而死亡的小鼠的百分比；每组n＝6-8，组合自两次重复实验。图1C示出了仅移植了CD8⁺ T细胞或移植了CD8⁺ T细胞加CD4⁺ T细胞的接受者中的脾和结肠中供体CD8⁺ T细胞的产量和膜联蛋白V⁺供体CD8⁺ T细胞的百分比。每组N＝4-6。图1D示出了在HCT后第0，2，4和6天对致死照射过的BALB/c接受者注射CD8⁺ T(1×10⁶)和CD4⁺ T细胞(0.075×10⁶)及TCD-BM，然后对对照大鼠IgG或抗IL-2(500μg/小鼠)进行腹腔内注射(IP)。在第7天，分析浸润了脾和结肠组织的CD8⁺ T细胞的凋亡。N＝4-5。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。P值通过未配对双尾学生t检验(unpaired two-tailed Studentttests)(1A，1C和1D)或对数秩检验(log-rank)(1B)计算(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。

图2A和2B示出了在C57BL/6供体和BALB/c接受者的情况下，HCT后单次注射抗CD4 mAb可预防急性但非慢性GVHD。对移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)的致死照射过的BALB/c接受者，在HCT时进行大鼠-IgG或抗-CD4 mAb(500μg/小鼠)的单次静脉内注射。仅接受TCD-BM(2.5×10⁶)的接受者作为对照。监测接受者的GVHD临床症状，包括体重变化，腹泻，脱毛和存活(干表示一组中所有接受者死亡)。图2A显示了体重变化的百分比，没有腹泻的接受者的百分比，临床皮肤GVHD评分和存活的接受者的百分比。每组N＝8，组合自两次重复实验。图2B示出在HCT后7天，评估皮肤，唾液腺，肺，肝，小肠(Sm.Int.)和结肠组织的GVHD的组织病理学证据。显示了代表性的显微照片(原始放大倍数×200)，每组n＝6。箭头表示与对照接受者相比的GVHD接受者的变化。数据表示组合自两次重复实验的平均值±SE。P值通过未配对双尾学生t检验(2B)或对数秩检验(2A)计算(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图3示出了单次抗CD4 mAb治疗后CD4⁺ T细胞的恢复动力学。对于移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)的致死照射过的BALB/c接受者，在HCT时进行大鼠-IgG或抗-CD4 mAb(500μg/小鼠)的单次静脉注射。在HCT后第5，7，14，21和28天，分析来自接受者的脾细胞的CD4⁺ T细胞扩增和恢复。示出了脾中CD4⁺ T细胞的百分比和产量的代表性模式和平均值±SEM。平均值±SEM；每个时间点每组n＝4。

图4A-4C示出了抗CD4mAb的三次注射预防了急性和慢性GVHD这两者。对于移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)的致死照射过的BALB/c接受者，在HCT后第0，14和28天进行1至3次的大鼠-IgG或抗-CD4 mAb(500μg/小鼠)的静脉注射。仅给予TCD-BM(2.5×10⁶)的接受者作为对照。监测小鼠的GVHD临床迹象和存活。图4A示出了体重变化的百分比，没有腹泻的接受者的百分比，临床皮肤GVHD评分，和存活百分比；每组n＝8，组合自两次重复实验。图4B示出了在HCT后50-60天，评估皮肤，唾液腺，肺，肝，小肠和结肠的组织病理学。示出了代表性的显微照片(原始放大倍数200倍)和组织病理学评分的平均值±SEM；每组n＝6。箭头表示与对照接受者相比的GVHD接受者的变化。图4C示出了在HCT后第50-60天和第100天，从接受者获取脾脏，用抗-H-2K^b，TCRβ，CD4和CD8 mAb染色，并分析抗-CD4 mAb治疗后的CD4⁺ T细胞恢复。示出了由每组中4名接受者中的1位构成的代表图(panel)。数据表示组合自两次重复实验的平均值±SEM。通过未配对双尾学生t检验(4B)或对数秩检验(4A)计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图5A-5D示出了供体CD4⁺ T细胞的消耗使得胸腺上皮细胞再生。致死照射过的BALB/c接受者接受了如图7所述的HCT和抗-CD4或大鼠-IgG治疗。接受TCD-BM的接受者用作对照。在HCT后第7，14，21，28，45和60天，动态测量了CD4⁺CD8⁺(DP)胸腺细胞的百分比和产量。在第45天测量mTEC的百分比，产量，和组织免疫荧光染色。图5A示出了DP胸腺细胞的动力学分析。示出了4次重复实验中的1次的代表性流式细胞术模式；示出了总胸腺细胞中DP百分比和产量的平均值±SE。图5B显示在HCT后第45天，测量了CD4⁺CD8⁺胸腺细胞的百分比和产量，并通过流式细胞术分析进行比较。图5C示出了在HCT后第45天，测量了mTEC的百分比并通过流式细胞术分析进行了比较。示出了代表性模式和平均值±SE(N＝4)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图5D显示使用细胞角蛋白8(红色，cTEC)和UEA-I(绿色，mTEC)的mTEC和cTEC的组织免疫荧光染色。示出了4个重复实验中的1个的来自各组的代表性显微照片(初始放大倍数200×)。

图6A-6E显示三次注射抗CD4mAb在用C57BL/6供体和BALB/c接受者的HCT后预防了急性和慢性GVHD这两者，并且保留了GVL效应。致死照射过的BALB/c受体移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)。用BCL1/Luc细胞(5×10⁶/小鼠)的腹腔注射来激发接受者，并在HCT后第0，14和28天进行三次大鼠-IgG或抗-CD4mAb(500μg/小鼠)的静脉注射。仅给予TCD-BM细胞(2.5×10⁶)的接受者作为对照。使用体内生物发光成像(BLI)，GVHD的临床迹象和存活来监测小鼠的肿瘤生长。图6A显示了来自各组的每个时间点的代表性BLI图像。图6B显示了接受者的光子/秒的汇总。图6C显示了临床GVHD评分。图6D显示了存活的百分率(％)。图6E显示HCT后第7天和第12天的血清AST浓度。每组n＝4-8，组合自两个重复实验。数据表示平均值±SE。P值通过多重t检验(6B，6C)或对数秩检验(6D)或未配对双尾学生t检验(6E)来计算(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图7A至7E显示在用A/J供体和C57BL/6接受者进行HCT后供体CD4+T细胞的消耗保持了GVL效应，同时预防了GVHD。致死照射过的C57BL/6接受者移植有来自A/J供体的脾细胞(10×10⁶，20×10⁶或40×10⁶)和BM细胞(10×10⁶)。在第0天静脉注射eGFP阳性Blast-Crisis慢性粒细胞白血病细胞(eGFP⁺BC-CML，20×10³)。在HCT后第0，7，14，28，45和60天对接受者注射大鼠IgG或抗CD4mAb的任一者(μg/小鼠)。监测接受者的肿瘤负担和临床GVHD的迹象。数据组合自2-4次重复实验。图7A显示了存活百分比；每组n＝8-16。图7B显示针对在观察期间患有或不患有GVHD的垂死小鼠和在HCT后第100天的小鼠检查了脾，肝和骨髓中的BC-CML肿瘤细胞。示出了脾，肝和骨髓中BC-CML细胞的百分比；每组n＝6-12。图7C显示HCT后100天，用抗-H-2K^b，TCRβ，CD4和CD8 mAb将脾细胞染色，并分析了抗-CD4mAb治疗后的CD4⁺ T细胞恢复。示出了来自每组中四个接受者的一个代表图。图7D显示了移植有用大鼠IgG或抗CD4抗体治疗的40×10⁶个脾细胞的接受者的体重变化的百分比；每组n＝8-12。图7E显示在HCT后100天，评估皮肤，唾液腺，肺，肝(初始放大倍数200×)，小肠和结肠(初始放大倍数400×)的组织病理学。显示了代表性的显微照片和组织病理学评分的平均值±SEM；每组n＝6。数据表示组合自2-4个独立实验的平均值±SE。P值通过对数秩检验(7A)或不未配对双尾学生t检验(7B，7E)或多重t检验(7D)计算(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图8A和8B显示在从A/J供体移植并用GVL耐受的BC-CML细胞攻击C57BL/6接受者后，HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗保留了GVL。图8A显示了致死照射过的C57BL/6小鼠经过图7所示的移植和治疗。在垂死时(仅10×10⁶BM或与10×10⁶脾)或在HCT后100天(40×10⁶脾与10×10⁶BM)，从接受者获取脾，肝和骨髓。示出了eGFP+BC-CML细胞的百分比。每组n＝6-12。图8B显示在HCT后第0，7，14，28，45和60天，对致死照射过的C57BL/6小鼠移植10×10⁶BM和40×10⁶脾或含有与来自A/J供体静脉内抗CD4 mAb(μg/小鼠)的40×10⁶脾相同数量的单核细胞的CD8⁺ T细胞消耗的脾。监测了接受者的肿瘤生长和存活。示出了存活率。每组n＝8，组合自两次重复实验。

图9A-9C显示供体CD4⁺ T细胞的消耗在异种GVHD模型中保留了GVL效应，同时预防了GVHD。对移植有来自健康人供体的PBMC(20×10⁶i.p.)的NSG接受者注射IgG或抗人CD4 mAb(200μg/小鼠，每周两次，持续4周)。在第0天腹腔注射1×10⁶个eGFP⁺Raji细胞。监测接受者的肿瘤负荷和临床GVHD的迹象。图9A显示进行HCT后第50-60天的移植有20×10⁶个PBMC的小鼠的体重变化百分比，存活和代表性照片；每组n＝12。图9B显示在进行HCT后第50-100天，评估皮肤，唾液腺，肺，肝的组织病理学。在进行HCT后约50天，当受体已经垂死时，获取来自IgG治疗组的组织。在实验结束时，即HCT后第100天获取来自抗CD4治疗的接受者的组织。示出了代表性显微照片(初始放大倍数200×)和组织病理学评分的平均值±SEM；每组n＝6。图9C显示移植了具有IgG或抗人CD4 mAb的20×10⁶PBMC和1×10⁶Raji细胞的接受者的存活；每组n＝12。小图显示在小鼠垂死或在实验结束的进行HCT后第100天时，对eGFP染色以鉴别进行过或未进行过抗CD4治疗的脾，肝和BM中的治疗Raji细胞。示出了脾，肝和BM中Raji细胞的百分比；每组n＝4。数据代表来自两次重复实验的平均值±SE。P值通过未配对双尾学生t检验(9B，9C)或多重t检验和对数秩检验(9A，9C)计算(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图10显示，对于4个人PBMC供体中的1个，抗CD4 mAb治疗仅部分地预防了异种GVHD。如图9所示，对NSG接受者移植人PBMC。监测接受者的临床GVHD和存活。示出了体重变化百分比和存活百分比。每组n＝4。

图11A和11B显示供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了血清IFN-γ浓度但降低了IL-2浓度，并增强了淋巴组织中的CD8⁺ T细胞扩增，但是未增强GVHD靶组织中的CD8⁺ T细胞扩增。对移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM细胞的BALB/c接受者在HCT后第0天注射大鼠IgG或抗CD4mAb(500μg/小鼠)。图11A显示了HCT后7天接受者血清中IFN-γ，IL-2和TNF-α的浓度；每组n＝6。图11B显示来自HCT后第7天的接受者的脾细胞在H-2K^b+TCR^β+上门控，并以IFN-γ相对CD4或CD8的方式显示。显示了脾中IFN-γ⁺供体T细胞的百分比和产量的代表性模式和平均值±SEM；每组n＝8。图11C和11D显示了供体CD⁸⁺ T细胞扩增和浸润的动力学变化。在HCT后第5，7，10，14，21和28天，获取接受者的脾，PLN，MLN，肝，肺和结肠以分析供体CD8⁺ T产量。显示了H-2Kb⁺TCRβ⁺CD8⁺ T细胞产量的平均值±SEM；每组n＝4-6。数据代表来自两次重复实验的组合的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图12A和12B显示HCT后28天的IgG或抗CD4治疗过的受试者中的被注射的和重新(denovo)产生的T细胞。将纯化的thy1.2⁺CD45.2⁺ T细胞(1×10⁶)和CD45.1+TCD-BM细胞(2.5×10⁶)移植到致死照射过的BALB/c接受者中。在HCT后28天，用流式细胞术分析脾T细胞的CD45.2，CD45.1，和Foxp3。显示了两个重复实验的代表性模式。N＝4。数据代表来自两次重复实验的组合的平均值±SE。P值通过未配对双尾学生t检验计算(****p＜0.0001)。

图13A和13B显示CD4⁺ T细胞的体内消耗不影响供体CD8⁺ T细胞归巢和趋化因子受体表达。对于移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)的致死照射过的BALB/c接受者，在HCT时进行一次大鼠-IgG或抗-CD4 mAb(500μg/小鼠)的静脉注射。在HCT后第7天，获取接受者的脾，肠系膜淋巴结(MLN)，小肠(Sm.Int)和结肠。图13A显示了CCR9，CXCR3和α4β7在MLN的供体CD8⁺ T细胞上的表达。平均值±SE；每组n＝4，来自2次重复实验。图13B显示通过实时RT-PCR测量小肠和结肠中趋化因子mRNA的表达。示出了小肠组织中CCL25和结肠组织中CXCL9，CXCL10，CXCL11相对于管家基因(house keeping gene)GAPDH的表达。平均值±SE；每组N＝6。数据代表来自两次重复实验的组合的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01)。

图14A-14E显示供体CD4⁺ T细胞的消耗保护了Paneth细胞，结肠上皮细胞和肝细胞。对仅移植TCD-BM或移植有来自C57BL/6供体的TCD-BM细胞和脾细胞(2.5×10⁶)的致死照射过的WT BALB/c接受者在第0天注射大鼠IgG或抗CD4mAb(500μg/小鼠)。HCT后7天，分析肠和肝组织。图14A显示用抗-IL-22R(绿)，抗溶菌酶(红)和DAPI(蓝)对小肠石蜡切片进行了染色。图14B显示用抗细胞角蛋白(CK)和DAPI(蓝)对结肠石蜡切片进行了染色。对于图14A和14B，显示了每组4个当中的一个代表性显微照片(初始放大倍数400×)。图14C显示在第7，10和21天测定了接受者血清中的肝酶。平均值±SEM；每组n＝4-6。(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图14D显示用于肝细胞凋亡试验的原位末端标记(tunel)染色。显示了代表性免疫荧光显微照片(初始放大倍数400×)和Tunel+凋亡肝细胞百分比的平均值±SEM，每组n＝4。图14E显示在HCT后第21天处死接受者，并将分选的浸润肝脏的供体CD8⁺ T细胞(1×10⁶)与TCD-BM(5×10⁶)一起移植到次级200cGy-照射过的Rag2^-/-BALB/c小鼠中。监测小鼠的临床GVHD。显示了HCT后D60的小鼠的体重变化百分比，临床皮肤GVHD评分，存活曲线和代表性照片；每组n＝8，组合自两次重复实验。通过未配对双尾学生t检验(14C)和多重t检验和对数秩检验(14E)计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图15A-15E显示供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了肠中的供体CD8⁺ T细胞凋亡和肝中的失能/衰竭，但脾中没有。在第0天用IgG或抗CD4 mAb移植和治疗致死照射过的WT BALB/c小鼠，如图14所示。在HCT后第7天，获取来自接受者的脾，肝和结肠。图15A显示脾，肝和结肠中供体CD8⁺ T细胞的产量，膜联蛋白V染色和BrdU染色；每组n＝4-6。图15B和15C显示脾和肝中供体CD8⁺ T细胞的Grail，Tim3和IL7Rα表达；每组n＝4-6。图15D和15E显示脾和肝中Eomes⁺T-bet⁺和Eomes⁺PD1⁺供体CD8⁺ T细胞的百分比；每组n＝4。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图16A-16C显示代表性的流式细胞术模式。显示了来自每组4名接受者中的1个的代表图。

图17A-17E显示供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了肝中的供体CD8⁺ T失能/耗尽，但未出现在HCT后第10天的脾脏中。在第0天用IgG或抗CD4 mAb移植和治疗致死照射过的WTBALB/c，如图14所示。在HCT后第10天，获取来自接受者的脾和肝。图17A显示了脾和肝中CD8⁺ T细胞的产量和BrdU和膜联蛋白V染色；每组n＝4-8，来自2次重复实验。图17B和17C显示脾和肝中供体CD8⁺ T细胞的Grail，Tim3和IL7Rα表达；每组n＝5，来自2次重复实验。图17D和17E显示脾和肝中Eomes⁺ T-bet⁺和Eomes⁺PD1⁺供体CD8⁺ T细胞的百分比；每组n＝4。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图18显示了大鼠IgG-或抗-CD4-治疗的接受者中的血清IL-27浓度。如图11所示进行HCT，并且在HCT后7天，通过ELISA测量血清IL-27浓度。显示了4次重复实验的平均值±SE。

图19A-19C显示抗-CD4治疗未能在接受了IFN-γ^-/-供体移植的接受者中预防急性GVHD。对致死照射过的BALB/c接受者移植来自野生型或IFN-γ^-/-C57BL/6供体的脾细胞(5×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)，然后在HCT时进行抗CD4 mAb(500μg/小鼠)的单次静脉内注射。监测接受者的GVHD临床症状，包括体重变化，腹泻，脱毛和存活。图19A显示了体重变化的百分比，没有腹泻的接受者的百分比，临床皮肤GVHD评分，和存活接受者的百分比。每组n＝10，组合自两次重复实验。图19B显示在HCT后7天，分析脾和肝CD8⁺ T，CD11c⁺DC和Mac-1/Gr-1⁺骨髓细胞的表面PD-L1。显示了6个重复实验的一个代表性模式。图19C显示了PD-L1 MFI的平均值±SE，n＝6。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。P值通过未配对双尾学生t检验计算。(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。

图20A-20D显示供体CD4⁺ T细胞的消耗通过依赖于宿主组织中PD-L1表达的机制来预防肝损伤并保护Paneth细胞和结肠上皮细胞。在第0天对移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(5×10⁶)和TCD-BM细胞的WT或PD-L1^-/-BALB/c接受者注射抗CD4 mAb(500μg/小鼠)；作为对照，在第0天对WT BALB/c接受者注射大鼠IgG(500μg/小鼠)，并移植脾细胞和TCD-BM。监测接受者的急性GVHD和存活的临床症状(干表示一组中所有接受者死亡)。图20A显示对来自HCT后7天的接受者的结肠上皮细胞用抗CK，CD45和PD-L1 mAb进行染色；显示了在CK⁺CD45^-集落上皮细胞上的PD-L1表达和PD-L1的MFI的代表性模式(每组n＝4，平均值±SEM)。图20B显示了体重变化的百分比，没有腹泻的接受者的百分比和存活接受者的百分比。来自两次重复实验，每组n＝8。图20C显示在用抗CD4 mAb治疗的WT和PD-L1^-/-接受者中第7天的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)和白蛋白(ALB)浓度(来自3次实验，每组n＝6，平均值±SEM)；Tunel染色用于肝细胞凋亡试验。显示了代表性的免疫荧光显微照片(初始放大倍数400×)(每组n＝4；平均值±SEM)。图20D显示在如图14所述的小肠和结肠上进行免疫荧光染色。显示了代表性的显微照片(原始放大倍数400×)(每组n＝4)。数据代表组合自2-3个独立实验的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图21显示类似于CD4⁺ T细胞，CD8⁺ T细胞在PD-L1^-/-接受者中诱导致死性GVHD。对致死照射过的WT和PD-L1^-/-BALB/c接受者注射纯化的CD4⁺或CD8⁺ T细胞(2.5×10⁶和5×10⁶)和来自C57BL/6供体的TCD-BM(2.5×10⁶)。在不多于30天的期间内比较接受者的存活。N＝8，组合自两次重复实验。

图22A-22C显示供体CD4⁺ T细胞的消耗使得宿主组织PD-L1耐受GVHD靶组织中的CD8⁺T细胞但不耐受淋巴组织中的CD8⁺ T细胞。在第0天对致死照射过的WT或PD-L1^-/-BALB/c小鼠用抗-CD4 mAb进行移植和治疗，如图14所述。在HCT后第7天，获取来自接受者的脾，肝和结肠。图22A显示了SPL，肝和结肠中供体CD8⁺ T细胞的产量，膜联蛋白V染色和BrdU染色；每组n＝4-6。图22B显示脾和肝中供体CD8⁺ T细胞的Grail，Tim3和IL7Rα表达；每组n＝4-6。图22C显示脾和肝中供体CD8⁺ T细胞中Eomes⁺ T-bet⁺细胞和Eomes⁺PD1⁺细胞的百分比；每组n＝4。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图23A-23D显示代表性的流式细胞术模式。显示了来自每组4-6个接受者中的1个代表性小组成员。

图24显示在HCT后7天，分析来自肝的CD8⁺ T细胞的IL-7Rα，Eomes，T-bet，和PD-1的表达。示出了4次重复实验的MFI的平均值±SE。如图6所示设定HCT。

图25A-25D显示阻断抗PD-L1治疗导致抗CD4治疗的NSG小鼠中的异种GVHD。图25A显示人CD8⁺ T细胞与小鼠PD-L1-Ig结合。图25B显示来自3个健康供体的PBMC分配至15只NSG小鼠中，条件为5只小鼠/供体和20×10⁶PBMC/小鼠。用抗人CD4(200μg/小鼠，每周两次，持续4周)处理所有小鼠，并用抗小鼠PD-L1治疗9只小鼠(将分别来自3个供体的细胞给予由3只小鼠构成的组)(5μg/g体重，每周两次，持续4周)，并且用对照IgG治疗剩余的6只小鼠(将分别来自3个供体的细胞给予由2只小鼠构成的组)。监测小鼠的GVHD，体重和存活的临床迹象。所有抗PD-L1治疗的小鼠均显示体重减轻并在HCT后80天死亡，而对照小鼠未显示GVHD迹象。图25C和25D显示在HCT后60天，分析垂死GVHD小鼠和对照无GVHD小鼠的肝和肺中CD8⁺ T细胞百分比和产量以及PD-1的CD8⁺ T表达。显示了每组4只小鼠中的1只的代表性流式细胞术模式以及来自肝和肺的CD8⁺ T细胞的MFI和产量的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图26A-26D显示供体CD8⁺ T-T PD-L1/CD80相互作用增强了淋巴组织中的CD8⁺ T扩增和GVL效应。图26A显示致死照射过的WT BALB/c接受者接受图14所示的HCT。在HCT后第7天的脾，肝和结肠中供体CD8⁺ T细胞上的PD-L1，PD1和CD80表达；每组n＝4-6。图26B显示在第0天对WTBALB/c接受者移植来自WT或PD-L1^-/-C57BL/6供体的1×10⁶Thy1.2⁺脾细胞和来自WTC57BL/6的TCD-BM细胞并给予抗CD4 mAb(500μg/小鼠)。显示脾中供体CD8⁺ T细胞的产量，膜联蛋白V染色，Bcl-xl染色，％Eomes⁺PD1⁺细胞；每组n＝6-10，组合自两个重复实验。图26C显示来自CD80^-/-供体的1×10⁶个Thy1.2⁺脾细胞用于重复图26B中描述的实验；N＝8。图26D显示在HCT后第0天和第2天向抗CD4治疗过的WTBALB/c接受者注射IgG或PD-L1特异性mAb43H12(500μg/小鼠)。显示了脾中供体CD8⁺ T细胞的产量，膜联蛋白V染色，Bcl-xl染色和％Eomes⁺PD1⁺细胞；每组n＝4-6。图26E显示在第0天和第2天，用43H12 mAb或对照IgG治疗抗CD4治疗的脾细胞BALB/c接受者，TCD-BM和BCL1/Luc⁺细胞。如图6所示，监测接受者的存活和肿瘤负荷。显示了每组的代表性BLI，BLI的光子/秒，脾，肠系膜淋巴结，肝和肺中的存活和％Bcl-1细胞，每组n＝4-8。数据代表组合自两次重复实验的平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。

图27A-27D显示了代表性的流式细胞术模式。示出了来自每组中4-6位接受者中的1个的代表图。

图28A-28D显示了PD-L1和CD80的非T造血细胞表达。HCT后7天，分析了来自脾，肝和结肠的供体型CD11c⁺DC和Mac-1/Gr-1⁺骨髓细胞的PD-L1和CD80表达。显示了组合自3个重复实验的MFI平均值±SE。通过未配对双尾学生t检验计算P值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001)。

图29是PD-L1的供体和宿主组织细胞表达在调节供体CD8⁺ T在淋巴和GVHD靶组织中的扩增和耐受性的示意图。

图30A和30B显示在HCT后供体CD8⁺ T细胞的体内消耗未保护宿主胸腺。在第0，3和6天，对移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM的致死照射过的BALB/c接受体给予抗CD8 mAb(200μg/小鼠)。图30A显示，对HCT后第7天的接受者的脾细胞用抗H-2k^b，TCRβ，CD4和CD8βmAb进行染色。显示了供体T细胞的CD4和CD8百分比的一种代表性模式。图30B显示了HCT后第7，14，21和28天的CD4⁺CD8⁺胸腺细胞的动力学分析。显示了4次重复实验的一个代表性模式。

图31显示，供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了脾中的供体MNC，总T和CD8⁺ T细胞。在第0天，对移植有来自C57BL/6供体的脾细胞(2.5×10⁶)和TCD-BM的致死照射过的BALB/c受体给予大鼠IgG或抗CD4 mAb(500μg/小鼠)。在HCT后第7天，获取脾组织用于FACS分析。用抗H-2k^b，TCRβ和CD8αmAb对脾细胞进行染色。显示了单核(MNC)，总T细胞，和CD8⁺T细胞的产量的代表性模式和平均值±SE。来自2次重复实验，N＝4。未配对双尾学生t检验用于比较平均值(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。

图32A-32C显示，供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了脾中供体CD8⁺ T细胞的增殖和扩增，而没有增加失能或凋亡，这独立于接受者组织PD-L1。如图7所示，致死照射过的WT或PD-L1^-/-BALB/c接受者接受了HCT和抗CD4治疗，如图7所示。在HCT七天后，还分析了接受者脾中供体CD8⁺ T细胞的与失能和衰竭相关的表面标志物，并测定了增殖和凋亡。图32A以CD80，PD-1，GRAIL，IL-7Rα，和TIM3的直方图显示了门控(gated)供体CD8⁺ T细胞。显示了一种代表性的流式细胞术模式和MFI的平均值±SE；N＝6。图32B显示了相对于BrdU的CD8中的门控供体CD8⁺ T细胞；以及膜联蛋白V的直方图中的门控CD8⁺ T细胞。图12A和12B中显示了一种代表性的流式细胞术模式以及MFI，BrdU⁺的百分比，或AnnexinV⁺细胞的平均值±SE(N＝6)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图32C显示了脾中供体CD8⁺ T细胞的产量的平均值±SE(N＝6)。

图33A-33C显示了结肠组织中供体CD8⁺ T的扩增和凋亡的评估。显示了代表性的流动模式和MFI或细胞数的平均值±SE；N＝6，组合自3次重复实验(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图33A显示了在结肠供体CD8⁺ T细胞上的CD80和PD-1表达。图33B显示了在抗CD8相对于抗BrdU中首先显示了BrdU治疗的接受者的结肠供体CD8⁺ T细胞；门控CD8⁺ T细胞也显示在膜联蛋白V的直方图中。图33C显示了来自结肠组织的供体CD8⁺ T细胞的产量。

图34A-34D显示，供体CD4⁺ T细胞的消耗保护了肝细胞，并增强了肝浸润性CD8⁺ T细胞的失能和衰竭。图34A显示了肝浸润性供体CD8⁺ T细胞上CD80，PD-1，GRAIL，IL7Rα，和TIM-3的代表性直方图和MFI的平均值±SE。图34B显示了来自BrdU治疗过的接受者的供体CD8⁺ T细胞首先相对于BrdU显示为CD8；门控CD8⁺ T细胞也显示在膜联蛋白V的直方图中。图34C显示了肝浸润性供体CD8⁺ T细胞的产量。图34D显示了抗CD4治疗的WT或PD-L1^-/-接受者的ALT，AST，和ALB的血清水平。

图35A-35C显示，供体CD4⁺ T细胞的消耗使得肝浸润性供体CD8⁺ T细胞易于衰竭。WTBALB/c接受者接受了如图11所示的HCT和抗CD4 mAb治疗。在HCT后21天，分析了肝浸润性供体CD8⁺ T细胞的衰竭相关标志物(CD80，PD-1，和TIM-3)，细胞因子的产生，增殖，并测试了过继性(adoptive)接受者的GVHD能力。图35A和35B显示针对肝浸润性供体CD8⁺ T细胞的CD80，PD-1，和TIM-3以及细胞内IFN-γ和TNF-α进行染色。显示了代表性的流式细胞术模式和CD80，PD-1，和TIM-3的MFI平均值±SE或IFN-γ⁺TNF-α⁺细胞的百分比的平均值±SE；N＝6(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图35C显示了相对于BrdU的CD8中的门控供体CD8⁺ T细胞。显示了代表性的流动模式和BrdU⁺细胞百分比的平均值±SE。N＝6。

图36A-36C显示，供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了胸腺浸润性CD8⁺ T细胞的失能。经致死照射的WT或PD-L1^-/-BALB/c接受者接受了HCT，并用IgG或抗CD4 mAb进行治疗，如图14，20和33所示。在HCT后第7天，分析了总胸腺细胞产量和胸腺浸润性供体CD8⁺ T细胞。每组中有6只小鼠，组合自3次重复实验(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001)。图36A显示了总的活胸腺单核细胞(MNC)的产量。图36B显示了胸腺浸润性H-2K^b+TCRβ⁺CD8⁺供体T细胞上的CD80，PD-1，GRAIL，和IL7Rα表达。显示了代表性的模式和MFI的平均值±SE。图36C显示了在总的活胸腺单核细胞中H-2K^b+TCRβ⁺CD8⁺ T细胞的百分比和产量。

图37A和37B显示，在HCT之后注射抗IL-2 mAb可预防具有C57BL/6移植物的BALB/c接受者的急性GVHD。对移植有来自C57BL/6供体的纯化CD4⁺ T细胞(1或2×10⁶)和TCD-BM(2.5×10⁶)的致死照射过的BALB/c接受者进行静脉注射大鼠IgG或中和性抗IL2 mAb(500μg/小鼠)。第1组：1×10⁶CD4⁺ T细胞(从第0天到第6天，隔天)，第2组：2×10⁶组(从第0天到第21天，隔天)。监测接受者的GVHD的临床症状，包括体重变化，腹泻，和生存。图37A显示了组1中体重变化的百分比，无腹泻的接受者的百分比，以及存活的接受者的百分比。每组n＝5。图37B显示了第2组中体重变化的百分比，没有腹泻的接受者的百分比，以及存活的接受者的百分比。每组n＝4-6。

发明详述

本发明的以下描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。从而，所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行各种等同变化，改变，和修改，并且应理解这种等同的实施方式将被包括在本文中。

在HCT之后，许多因素和途径可能会导致急性GVHD或慢性GVHD。本文公开了在保持GVL效应的同时预防或治疗急性GVHD和慢性GVHD的方法，在HCT之后在体内淋巴组织中增强供体CD8⁺ T细胞的扩增的方法，以及在HCT之后增强PD-L1的接受者组织表达的方法。GVHD的预防和治疗，以及体内扩增的供体CD8⁺ T细胞可通过使用抗CD4试剂(例如抗CD4抗体或抗CD4中间表位免疫毒素)暂时消耗CD4⁺ T细胞，使用抗IIL2抗体中和IL-2，或施用其他阻断IL-2R的药物来实现。此外，可向接受HCT的受试者施用其他治疗剂，例如PD-L1抗体和/或IFN-γ。

PD-L1与PD-1和CD80相互作用，并充当调节动物模型和人类中免疫应答的检查点(checkpoint)。在此公开了在移植物抗宿主疾病(GVHD)的同种异体和异种鼠模型中，造血细胞移植(HCT)后供体CD4⁺ T细胞的即刻暂时消耗有效预防了GVHD，同时保留了强的移植物抗白血病(GVL)效应。供体CD4⁺ T细胞的消耗会增加血清IFN-γ，但会降低IL-2浓度，从而导致由接受者GVHD靶组织和供体CD8⁺ T细胞上调的PD-L1的表达。在GVHD靶组织中，PD-L1与PD-1在供体CD8⁺ T细胞上的相互作用通过效应T细胞的失能，衰竭和凋亡而诱导了耐受，从而预防GVHD。在淋巴组织中，PD-L1与CD80的相互作用增强了接受者中CD8⁺ T细胞的扩增和抗恶性细胞的活性，而没有增加失能，衰竭或凋亡，从而带来强的GVL效应。这些结果表明，CD8⁺ T细胞中PD-L1介导的信号转导的结果取决于CD4⁺ T细胞的存在与否，CD8⁺ T细胞表达的相互作用受体的性质，以及发生信号转导的组织环境。

如本公开中的详述，通过向接受者施用治疗剂来增强淋巴组织中的CD8⁺ T细胞以及在接受者组织中表达PD-L1不仅意外地预防或治疗了急性GVHD，而且还意外地预防或治疗了慢性GVHD。令人惊讶的是，单剂量的治疗剂足以预防或治疗急性GVHD，而在一个月内施用低至三剂的治疗剂就足以预防或治疗慢性GVHD。

如本文所用，术语“接受者(recipient)”，“宿主(host)”，“受试者(subject)”或“患者(patient)”是指接受造血细胞移植的受试者。这些术语可以指，例如，接受供体骨髓，供体T细胞，供体脾细胞，或其他供体细胞或组织的施用的受试者。在一些实施方式中，移植的细胞衍生自同种异体供体。接受者，宿主，受试者，或患者可以是动物，哺乳动物，或人。

如本文所用，术语“供体”是指从其获得细胞或组织以移植到接受者或宿主中的受试者。例如，供体可以是从其获得骨髓，T细胞，脾细胞，或其他待施用于接受者或宿主的细胞或组织的受试者。供体或受试者可以是动物，哺乳动物，或人。

如本文所用，关于GVHD病症的术语“治疗(treat)”，“治疗(treating)”，和“治疗(treatment)”是指部分或完全缓解该病症，或消除，减轻，或减缓与该病症相关的一种或多种症状的发展。在一些实施方式中，术语“治疗”，“治疗”，或“治疗”是指与不接受这种治疗的受试者相比，在接受本文公开的治疗的受试者中GVHD病症或并发症的一种或多种症状得到缓解。

如本文所用，关于GVHD病症的术语“预防(prevent)”，“预防(preventing)”，和“预防(prevention)”是指预防病症的发作和/或预防与病症相关的症状的发生，降低病症发生或复发的可能性，或减缓病症的进展或发展。

本文所用的短语“有效量”或“治疗有效量”是指产生所需治疗效果的治疗剂的量。例如，抗CD4抗体的有效量可指在接受者中预防或治疗GVHD，消耗CD4⁺ T细胞，增强CD8⁺ T细胞，或诱导PD-L1的组织表达的量。精确的有效量是在给定的受试者的功效方面将产生最有效结果的治疗剂的量。该量将取决于多种因素而变化，包括但不限于治疗剂的特征(包括活性，药代动力学，药效学，和生物利用度)，受试者的生理状况(包括年龄，性别，疾病类型和阶段，总体身体状况，对给定剂量的反应性，和药物类型)，制剂中一种或多种药学上可接受的载剂的性质，以及给药途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过常规实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对化合物施用的反应并相应地调整剂量。有关其他指导，请参阅《雷明顿：药学科学与实践》(Gennaro编，第20版，威廉姆斯与威尔金斯，宾夕法尼亚，美国)(Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Gennaro ed.20th edition，Williams&Wilkins PA，USA))(2000年)。

在一方面，本文公开涉及在HCT后预防或治疗慢性GVHD并同时保留GVL的方法。该方法需要在HCT同时或HCT后立即在接受者体内施用两剂或更多剂的有效量的治疗剂，以暂时消耗CD4⁺ T细胞。

如本文所用，关于施用，术语“同时”是指在HCT的同时或几乎同时将治疗剂施用于接受者。例如，如果治疗剂是通过造血细胞的单次联合给药，同时的两次或多次给药，或者连续且其间没有延长间隔的两次或更多次给药而施用，则被认为是“同时”施用。

当在即将进行HCT之前施用治疗剂时，可在HCT之前约10天以内的任何时间施用第一剂治疗剂。当在HCT之后立即施用治疗剂时，可在HCT之后约6周以内的任何时间施用第一剂治疗剂。在一些实施方式中，在HCT之前约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，或约10天施用第一剂治疗剂。在一些实施方式中，在进行HCT的同时施用第一剂治疗剂。在一些实施方式中，在HCT后约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约3周，约4周，约5周，或约6周施用第一剂治疗剂。

当施用多剂治疗剂时，调整施用方案以优化治疗效果在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可在即将进行HCT前施用一剂，然后在HCT期间和/或之后立即施用另外的剂量。在一些实施方式中，可在施用第一剂之后施用一剂或更多剂的治疗剂，例如在施用第一剂的一个月内。例如，可以以一周或两周的间隔施用后续剂量的治疗剂。

通过在HCT后立即施用一剂或更多剂消耗CD4⁺ T细胞的治疗剂，供体CD4⁺ T细胞以及重新产生的CD4⁺ T细胞被完全和暂时性消耗。例如，消耗了至少90％，至少95％，至少98％，或至少99％的CD4⁺ T细胞。CD4⁺ T细胞仅在短时间内消耗，少于10周，少于9周，少于8周，少于7周，少于6周，少于5周，少于4周，少于3周，或约2周。在一些实施方式中，CD4⁺ T细胞被消耗至少两周。

可以使用在体内有效地暂时消耗CD4⁺ T细胞的任何治疗剂。在一些实施方式中，治疗剂是抗CD4抗体，优选单克隆抗体或人源化抗体。例如，消耗性的抗人CD4 mAb在美国专利号8,399,621中公开，其内容通过引用整体并入本文。可以使用抗CD4抗体的功能片段，只要该片段在体内有效地消耗CD4⁺ T细胞。在一些实施方式中，可通过向受试者施用抗CD4-中间位-免疫毒素来消耗CD4⁺ T细胞。可根据本领域已知的技术来制备这样的中间位(68)。确定治疗剂的剂量以实现体内消耗CD4⁺ T细胞的期望持续时间在本领域普通技术人员的能力范围内。

在一些实施方式中，可以使用暂时在体内有效中和IL-2的治疗剂。这种试剂包括但不限于抗IL-2抗体，包括单克隆抗体和/或人源化抗体，或其他阻断IL-2R的试剂。某些抗IL-2受体抗体是本领域已知的(76，77)。据报道，IL-2的施用可以预防急性GVHD或慢性GVHD(69，70)。令人惊讶地，如本文所公开的，IL-2抗体的施用可有效预防或治疗急性GVHD。

在一些实施方式中，治疗剂包括PD-L1-Ig。施用一剂或更多剂治疗有效量的PD-L1-Ig也可预防或治疗GVHD。

在一些实施方式中，可以向不具有CD4⁺ T细胞的受试者或具有降低的IL-2血清水平的受试者施用一剂或更多剂的IFN-γ以帮助保留GVL。

在另一方面，本公开涉及在HCT后预防或治疗急性GVHD的同时保留GVL的方法。该方法需要在HCT的同时，即将进行HCT之前，或HCT之后立即向接受者体内施用有效量的治疗剂，以暂时消耗CD4⁺ T细胞或暂时减少血清IL-2。令人惊讶地，仅单剂量的治疗剂就足以预防或治疗急性GVHD。在一些实施方式中，单剂量的抗CD4抗体足以预防或治疗急性GVHD。在一些实施方式中，施用更多剂量的抗IL-2抗体。例如，可以在30天以内的期间内每隔一天将抗IL-2抗体注射至接受HCT的受试者，以有效预防消化道(gut)GVHD。

在一些实施方式中，如上所述，将单剂量的治疗剂与HCT同时施用于接受者。或者如上所述，在即将进行HCT之前或在HCT之后立即施用单剂量的治疗剂。

在另一方面，本公开涉及在HCT后在体内增强供体CD8⁺ T细胞在淋巴组织中的扩增的方法。该方法需要在HCT同时，即将进行HCT之前，或HCT之后立即向接受者体内施用有效量的治疗剂，以暂时消耗CD4⁺ T细胞或暂时减少血清IL-2。

在接受者淋巴组织中，供体CD8⁺ T细胞的增殖得以增强，而不会增加CD8⁺ T细胞的失能或凋亡，从而获得强的GVL效应。令人惊讶地，在GVHD靶组织中，浸润性CD8⁺ T细胞的失能和凋亡以取决于接受者PD-L1表达的方式增加，从而预防对肠Paneth细胞和干细胞，肝细胞，和胸腺髓质上皮细胞的损害。

在另一方面，本公开内容涉及在HCT后增强程序性死亡配体1(PD-L1，或B7H1)的接受者组织表达的方法。该方法需要在HCT同时，即将进行HCT之前，或HCT之后立即向接受者施用有效量的治疗剂，以暂时消耗CD4⁺ T细胞或暂时降低血清IL-2。

尽管此前已经报道在使用缺乏PD-L1的接受者的情况下宿主组织PD-L1导致GVHD下调(25，26)，但本发明首次证明可以通过在HCT之后立即施用CD4⁺ T细胞消耗剂以有效预防急性和慢性GVHD并保持强的GVL效应，从而实现PD-L1的宿主组织表达。供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了血清IFN-γ的浓度，并增强了PD-L1的接受者组织表达以及PD-L1受体CD80和PD-1的供体CD8⁺ T细胞表达。

如本公开中的详述，移植后即刻的供体CD4⁺ T细胞的暂时体内消耗增加了供体CD8⁺ T细胞对失能和凋亡的敏感性，这是由PD-L1在GVHD靶组织中的表达所介导的。HCT后即刻，PD-L1的宿主表达对淋巴组织中供体CD8+T细胞的扩增几乎没有影响。供体CD4⁺ T细胞的暂时体内消耗会增强供体CD8⁺ T的扩增，并在接受者淋巴组织中产生有效的CD8⁺ T细胞介导的GVL效应。PD-L1与CD80和PD-1的相互作用以组织特异性方式介导不同GVHD靶组织中供体CD8⁺ T细胞的失能，衰竭和凋亡。

利用反映人类急性和慢性GVHD的特征的同种异体GVHD的鼠模型和由人PBMC诱导的异种GVHD的鼠模型(11，39，53)，本文公开的有效实例证明了过继转移的成熟供体CD4⁺ T和重新产生的CD4⁺ T细胞在HCT后即刻的体内暂时消耗可预防急性和慢性GVHD这两者，同时可增强在淋巴组织中的供体早期CD8⁺ T扩增并保留强的GVL效应。这一结果不仅反映了识别接受者同种异体抗原的供体CD4⁺ T细胞的消耗，而且反映来自几种新近观察到的机制的结果。供体CD4⁺ T细胞的消耗导致血清IFN-γ升高和IL-2浓度降低。供体CD4⁺ T细胞的消耗还通过淋巴组织中T-T和PD-L1/CD80相互作用导致供体CD8⁺ T细胞扩增，它们在淋巴组织中介导了强的GVL效应。同时，供体CD4⁺ T细胞的消耗使PD-L1的宿主组织表达能够通过组织特异性方式的PD-L1/PD-1相互作用诱导浸润了GVHD靶组织的CD8⁺ T细胞的失能，衰竭和凋亡。

PD-L1在接受者组织中的表达可在HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的有效消耗后预防急性和慢性GVHD，而且在HCT后仅暂时消耗30-60天即足够。如有效实例所示，单次注射抗CD4可有效预防急性GVHD，但接受者仍会发展为慢性GVHD，损坏GVHD靶组织，尤其是损害唾液腺。有效实例进一步证明，至少需要注射三剂以有效预防慢性GVHD。三次注射抗CD4可使髓样胸腺上皮细胞(mTEC)恢复并恢复胸腺阴性选择，但单次注射是不够的。据报道，HCT后立即重新产生的CD4⁺ T细胞可使胸腺中CD8⁺介导的损伤永久存在，从而导致自免疫性慢性GVHD(11)。尽管单次注射抗CD4预防了急性GVHD并增强了供体型CD4⁺ T细胞的重新产生，但它并未预防HCT后立即由重新产生的供体CD4⁺ T细胞介导的胸腺损伤。另一方面，在不存在供体CD4⁺ T细胞的情况下，浸润胸腺组织的供体CD8⁺ T细胞被宿主组织PD-L1耐受，并且由供体CD8⁺ T细胞介导的胸腺损伤是自限性的。因此，抗CD4治疗具有重要的作用，即暂时消耗所注射的成熟CD4⁺ T细胞以及在HCT后于早期从骨髓重新产生的CD4⁺ T细胞，从而为mTEC留出足够的时间来恢复并恢复有效的胸腺阴性选择。此时间段为HCT之后约30-60天。在此时间点后，从供体骨髓产生的CD4⁺ T细胞不再引起慢性GVHD。

临床GVHD预防通常与减少同种异体反应性T细胞扩增和促炎性细胞因子(即IFN-γ和TNF-α)产生有关。有效实例表明，即使在供体CD4⁺ T细胞的消耗导致移植后立即显著增加了血清IFN-γ浓度的情况下，在HCT后立即单次注射消耗性抗CD4仍有效预防了急性GVHD。这些结果是出乎意料的，因为在移植有供体CD4⁺和CD8⁺ T细胞这两者的接受者中，PD-1阻断后IFN-γ促进消化道GVHD的发病机制并加重GVHD(41，54)。另一方面，这些结果与Yang等报道的结果一致(55)，他们发现在没有供体CD4⁺ T细胞的情况下，与WT供体CD8⁺ T细胞相比，缺乏IFN-γ的供体CD8⁺ T细胞增殖更为剧烈，并引起更严重的GVHD。

如有效实例所示，升高的IFN-γ浓度与结肠上皮细胞PD-L1的表达增强有关，而缺乏IFN-γ的供体细胞与PD-L1表达的下调有关。这些观察结果与此前研究的结果一致，表明在患有急性GVHD的接受者中，宿主组织中PD-L1表达的上调需要IFN-γ(29)。尽管宿主组织PD-L1对HCT后即刻的脾中的供体CD8⁺ T细胞增殖或存活几乎没有影响，但供体CD4⁺ T细胞的消耗导致在结肠组织中PD-L1诱导浸润的供体CD8⁺ T细胞凋亡并在肝组织中由PD-L1诱导失能和衰竭。PD-L1介导的信号转导对结肠和肝中供体CD8⁺ T细胞的差异作用与这些组织中供体CD8⁺ T细胞导致的PD-1和CD80差异表达有关。与肝相比，结肠中供体CD8⁺ T细胞上PD-1与CD80 MFI的比例明显更高。

NKT细胞，髓样抑制细胞(MDSC)和调节性T细胞可抑制GVHD(5，58)，其中一些细胞表达CD4，并可能通过抗CD4治疗而消耗。但是，有效实例表明，供体CD4⁺ T细胞和那些CD4⁺调节性细胞的消耗能够有效预防GVHD，这表明在没有供体CD4⁺ T细胞的情况下，组织保护机制足以预防CD8⁺ T细胞介导的GVHD，而且CD4⁺调节性T细胞是可有可无的。

这些有效实例表明，移植物中少量的供体CD4⁺ T细胞可通过显著减少浸润结肠的CD8⁺T细胞的凋亡来增强急性GVHD，并且该效果是依赖于IL-2的。此外，尽管分选的CD8⁺ T细胞几乎不诱导GVHD且分选的CD4⁺ T细胞在PD-L1充足的野生型接受者中诱导严重的急性GVHD，但分选的CD8⁺和CD4⁺ T细胞均诱导致命的急性GVHD，其严重程度与缺乏PD-L1的接受者类似。这些结果表明，CD8⁺ T细胞比CD4⁺ T细胞对宿主组织PD-L1介导的凋亡更敏感，并且HCT后CD4⁺ T细胞的即刻帮助使供体CD8⁺ T细胞对宿主组织PD-L1介导的凋亡具有抵抗力。该观察结果与此前的报道一致，即来自CD4⁺ T细胞的IL-2可能阻止由缺乏IL-1产生的CD8⁺T细胞中PD-1信号传导所诱导的凋亡(59)。这些结果支持PD-L1的宿主组织表达仅能在移植具有CD4⁺和CD8⁺ T细胞这两者的全部脾细胞时在一定程度上改善GVHD，正如WT和PD-L1^-/-接受者的对比所表明的那样(27，28)。如有效实例所示，在较低的IL-2浓度下，较高浓度的IFN-γ诱导的PD-L1的宿主组织表达的增加加上供体CD8⁺ T细胞对PD-L1诱导的凋亡的敏感性的增加可解释在移植后供体CD4⁺ T细胞立即被消耗时所发现的GVHD的高度有效预防。HCT后供体CD4⁺ T细胞的即刻消耗不仅可以预防GVHD，而且还可以使PD-L1进行供体CD8⁺ T细胞表达以介导其自身在淋巴组织中的扩增并介导强的GVL活性，从而可以克服“耐GVL”的BC-CML肿瘤细胞。Yang等人(55)表明在没有供体CD4⁺ T细胞的情况下缺乏IFN-γ的供体CD8⁺ T细胞的GVL活性低于WT供体CD8⁺ T细胞，从而与CD4⁺ T细胞消耗相关的高浓度IFN-γ可有助于保持GVL活性。

有效实例表明，HCT后立即进行抗CD4治疗可增强淋巴组织中供体CD8⁺ T细胞的扩增，这取决于PD-L1和CD80这两者的供体CD8⁺ T表达，且PD-L1的宿主组织表达的影响不大。宿主PD-L1缺乏影响可能是由于淋巴组织中表达PD-L1的宿主实质细胞的相对缺乏。尽管不能排除CD8⁺ T通过PD-L1/CD80与非T细胞相互作用的可能性，但供体CD8⁺ T细胞在淋巴组织中的扩增最可能是借助PD-L1/CD80与T-T的相互作用而引起的。首先，供体CD8⁺ T细胞上PD-L1缺乏，而非供体非T细胞上PD-L1缺乏(数据未显示)显著降低了供体CD8⁺ T细胞的存活和扩增。其次，供体CD8⁺ T细胞上的CD80缺乏也降低了存活基因BCL-XL的供体CD8⁺ T表达，并增加了CD8⁺ T细胞衰竭。第三，HCT后立即进行的抗CD4治疗上调了通过供体CD8⁺ T细胞而不是非T细胞(即DC和髓样细胞)的PD-L1和CD80表达。最后，抗PD-L1(43H12)对PD-L1/CD80相互作用的特异性阻断显著降低了脾中供体CD8⁺ T的存活和扩增，并消除了GVL效应。该结果与此前的发现一致，即CD8⁺ T细胞上的PD-L1是活化的CD8⁺ T细胞的生存所必需的(60)。相反，PD-L1/CD80相互作用增强了活化的CD4⁺ T细胞的凋亡(31)。

Saha等人表明，供体T细胞中PD-L1的缺乏降低了供体T细胞的增殖和存活，并延缓了接受CD4⁺和CD8⁺供体T细胞的接受者的GVHD致死(30)。该观察结果表明，虽然供体T细胞由于缺乏PD-L1的表达而降低了存活能力，但当供体CD4⁺和CD8⁺ T细胞均存在时，PD-L1的宿主组织表达仍不能耐受组织浸润性T细胞来预防GVHD。有效实例表明，在HCT之后立即消耗供体CD4⁺ T细胞使得宿主PD-L1有效耐受GVHD靶组织中的浸润性CD8⁺ T细胞并完全预防急性GVHD。同时，淋巴组织中供体CD8⁺ T细胞之间的PD-L1/CD80相互作用增强CD8⁺ T细胞的存活和扩增以及它们的GVL活性。

另一方面，使用由HY抗原特异性转基因CD8⁺ T细胞介导的GVHD的非致死鼠模型，Michonneau等人报道，由于PD-1⁺转基因CD8⁺ T细胞与PD-L1⁺CD11c⁺DC和F4/80⁺巨噬细胞之间的增强的PD-L1/PD-1相互作用，转基因CD8⁺ T细胞不能消除淋巴组织中的宿主型肿瘤细胞(52)。同样，Mueller等人表明造血细胞表达的PD-L1抑制了病毒特异性CD8⁺细胞的活化和扩增(61)。尽管有效实例表明，与肝相比，脾中的CD11⁺DC和MAC-1/Gr-1⁺髓样细胞表达的PD-L1水平高得多，而DC和髓样细胞中高水平的PD-L1似乎并未在抗CD4治疗的接受者的淋巴组织中干扰供体CD8⁺ T细胞的GVL活性，原因在于，抗CD4治疗的接受者中不同类型和剂量的肿瘤细胞全被消除。

与野生型同种反应性CD8⁺ T细胞相比，接受H-Y特异性CD8⁺ T细胞的接受者的淋巴组织中造血细胞表达的PD-L1对GVL效应的不同影响可能有几种解释。首先，造血细胞表达的PD-L1主要控制原初T细胞的活化和扩增(61)。在抗CD4治疗的接受者中，同种反应性CD8⁺ T细胞由被迅速消除的接受者APC激活。因此，供体造血来源的APC的PD-L1表达在供体T细胞的活化和扩增中不发挥重要作用。其次，男性接受者中的H-Y特异性转基因CD8⁺ T细胞似乎具有非常弱的同种异体反应性，正如即使在PD-1阻断后也缺乏GVHD死亡率所印证的那样。它们的同种异体性容易通过CD8⁺ T细胞与淋巴组织中DC和巨噬细胞之间的PD-L1/PD-1相互作用来控制。相反，野生型同种反应性CD8⁺ T细胞的同种异体反应性强得多，正如它们在PD-L1^-/-接受者中引起快速致死的GVHD的能力所表明的那样。它们的同种异体反应性不能通过CD8⁺ T与DC和巨噬细胞之间的PD-L1/PD-1相互作用来控制。第三，与野生型同种异体反应性T细胞不同，H-Y特异性转基因CD8⁺ T细胞可能不表达PD-L1，或者PD-L1在其存活和扩增中可能不起作用(30)。

如图29所示，在HCT后供体CD4⁺ T细胞的立刻消耗增加了血清IFN-γ，但降低了IL-2浓度。IFN-γ的增加增强了供体CD8⁺ T细胞和宿主组织的PD-L1表达，同时增加了供体CD8⁺ T细胞PD-1和CD80的表达。供体CD8⁺ T细胞在脾中表达较高水平的PD-L1和CD80，但表达较低水平的PD-1，从而促进供体CD8⁺ T细胞之间的PD-L1/CD80相互作用。相反，供体CD8⁺ T细胞在GVHD靶组织中表达较高水平的PD-1和较低水平的PD-L1及CD80，从而促进宿主组织PD-L1与PD-1在供体CD8⁺ T细胞上的相互作用。CD8⁺ T细胞在IL-2产生中有缺陷，并且在没有来自CD4⁺ T细胞的IL-2帮助的情况下，供体CD8⁺ T细胞可能对PD-L1/PD-1信号转导的耐受作用变得更为敏感。供体CD8⁺ T-T和PD-L1/CD80的相互作用增强淋巴组织中供体CD8⁺ T的存活和扩增，从而产生强大的GVL效应。主要宿主PD-L1与PD-1在CD8⁺ T细胞上的相互作用介导GVHD靶组织中的供体CD8⁺ T细胞失能，衰竭和凋亡，从而预防GVHD。

有效实例支持分选的供体CD8⁺ T细胞促进移植(engraftment)并介导GVL效应而不会引起GVHD(2，7)。结果还表明，在此前的一项人体试验中，供体CD4⁺ T细胞的离体消耗并未有效预防GVHD(62)，可能是因为移植物中极少量的供体CD4⁺ T细胞在HCT后本可扩增，并且它们本可在HCT后立即与从骨髓祖细胞产生的供体CD4⁺ T细胞供体作用，以帮助供体CD8⁺ T细胞抵抗宿主组织PD-L1介导的凋亡或其他耐受机制。结果还表明，HCT后供体CD4⁺ T细胞立刻在体内暂时消耗可能是一种预防GVHD同时又保留强的GVL效应的新方法。HCT后约30-60天的期间内供体CD4⁺ T细胞的体内暂时消耗不仅可使GVHD靶组织耐受浸润性供体CD8⁺ T细胞，同时在淋巴组织中保留GVL效应，而且还可使髓质胸腺上皮细胞再生并复原胸腺阴性选择，以持久预防慢性GVHD。

不需要使重新产生的CD4⁺ T细胞永久消耗来恢复mTEC。有效示例中的结果表明，mTEC的恢复需要时间。HCT后，可在mTEC充分恢复之前立即重新产生自反应性CD4⁺ T细胞，但随着时间的推移，mTEC百分比逐渐增加，阴性选择逐渐恢复。基于在此公开的结果，HCT后约45天以后重新产生的CD4⁺ T细胞不再引起自免疫或慢性GVHD。因此，HCT后立即重新产生的自身反应性CD4⁺ T细胞的消耗使得有时间恢复mTEC和复原胸腺中的阴性选择。尽管在年龄较大的接受者中CD4⁺ T细胞的重建可能会延迟，但在具有充分的胸腺功能的年轻接受者中，本文公开的方法应该不会引起长期CD4⁺ T细胞缺乏。

提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，并且不应将其解释为限制本发明的范围。就提及的特定材料的程度而言，其仅出于说明的目的，并不旨在限制本发明。本领域技术人员可以开发等同的方法或反应物，而无需测试创造性能力，也不会脱离本发明的范围。

实施例

材料和方法

急性GVHD和慢性GVHD的诱导和评分，体内生物发光成像，增殖性T细胞的体内BrdU标记(labeling)，TUNEL染色，组织细胞分离，细胞因子的细胞内染色，抗体，流式细胞术分析和分选，组织病理学，组织免疫荧光染色，以及实时PCR已在此前的出版物(11，27，29，31，63)进行了描述，并在下文详述。

数据显示为平均值±SEM。使用秩和检验或对数秩检验比较不同组中的体重，腹泻，皮肤损伤评分，GVHD和存活。使用未配对双尾学生t检验分析了两种方法的比较(Prism，版本6.0；GraphPad Software)(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0005)。

小鼠：C57BL/6(H-2^b)和BALB/c(H-2^d)小鼠购自国家癌症研究所(National CancerInstitute)的动物生产计划(Frederick，MD)。A/J小鼠(H-2^a)购自杰克逊实验室(JAX)。PD-L1^-/-BALB/c繁殖个体(breeders)由Lieping Chen博士(耶鲁大学)提供。PD-L1^-/-C57BL/6繁殖个体，脾和骨髓细胞由Haidong Dong博士(梅奥诊所)提供。同质CD45.1⁺C57BL/6小鼠，CD80^-/-C57BL/6繁殖个体和IFN-γ^-/-C57BL/6繁殖个体购自JAX实验室。Rag2^-/-BALB/c小鼠购自TaconicFarms(纽约州，日耳曼敦)。NSG小鼠由动物肿瘤模型核心(希望之城)(AnimalTumor Model Core(City of Hope))提供。将所有小鼠保持在希望城市动物资源中心的无病原体室。所有动物方案均已获得COH机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

GVHD的诱导和评估：在HCT前8-10小时，使用[¹³⁷Cs]源对BALB/c接受者进行850cGy全身照射(TBI)，然后静脉内(i.v.)注射C57BL/6供体脾细胞(2.5×10⁶或5.0×10⁶)和T细胞消耗了的BM(TCD-BM)(2.5×10⁶)。将C57BL/6接受者暴露于1100cGy TBI，然后静脉内注射A/J供体脾细胞(10×10⁶，20×10⁶或40×10⁶)或CD8⁺ TCD脾细胞和BM细胞(10×10⁶)。对NSG接受者进行腹膜内(i.p.)注射来自健康供体的人PBMC(20×10⁶)。对于二次移植，Rag2^-/-BALB/c小鼠在HCT前24h暴露于200cGy TBI，然后静脉内注射来自抗CD4治疗或大鼠IgG治疗的主要(primary)接受者的肝的分选出的CD8⁺ T细胞(1×10⁶)以及主要(primary)接受者菌株(strain)TCD-BM(5×10⁶)。使用生物素偶联的抗CD4和抗CD8 mAb，和抗生蛋白链菌素微珠(Miltenyi Biotec，德国)，然后通过autoMACS Pro细胞分选仪(Miltenyi Biotec，德国)，藉此完成骨髓中T细胞的消耗。使用小鼠抗CD90.2微珠(Miltenyi Biotec，德国)完成了来自脾的Thy1.2⁺细胞的富集。浓缩的纯度＞98％，而消耗的纯度＞99％。此前已对GVHD和临床皮肤GVHD的临床急性症状进行了评估和评分(1，2)。

从GVHD靶组织中分离细胞：将肝样品通过70μm细胞筛捣碎，并从包含淋巴细胞M的细胞悬液中分离出MNC。将消化缓冲液[RPMI包含5％牛胎，10mM HEPES，10U肝素，胶原酶D(1mg/ml)，和DNase I(1000U/ml)]小心地注入肺叶，并将样本在37℃下培育45分钟。在第二个消化周期后，通过70μm细胞筛将肺组织捣碎，并从包含淋巴细胞M的细胞悬液中分离出MNC。用PBS洗涤结肠样本，切成0.5毫米的小块，并悬浮在含1％牛血清和0.002M EDTA的PBS中，涡旋10分钟，通过70μm筛和玻璃棉，并以2000rpm离心5分钟以分离上皮细胞和淋巴细胞。

抗体，FACS分析和FACS分选：用于体内治疗的纯化的消耗性抗小鼠CD4 mAb(GK1.5)，阻断性抗小鼠PD-L1(10F.9G2)，中和性抗IL-2(JES6-1A12)，和CD8(53-6.72)购自Bio X Cell(新罕布什尔州西黎巴嫩)。用于体内治疗的消耗性抗人CD4 mAb(IT1208)由IDACTheranostics的Ito博士提供。H-2Kb(AF6-88.5)，α4β7(DATK32)，Ly51(6C3)和FITCAnnexinV购自BD Pharmingen(加利福尼亚州圣迭戈)。TCRβ(H57-597)，H-2K^b(AF6-88.5)，CD3(UCHTl)，CD4(RM4-5)，CD8a(SK1)，CD8a(53-6.7)，CD45(30-F11)，CD11b(M1/70)，CD11c(N418)，Gr-1(RB6-8C5)，B7H1(H1M5)，PD-1(RMP1-30)，CD44(IM7)，CD62L(MEL-14)，EpCAM(G8.8)，FASL(MFL3)，IL7Rα(A7R34)，TIM3(RMT3-23)，IFN-γ(XMG1.2)，EOMES(Dan11mag)和Foxp3(FJK-16s)的单克隆抗体(mAb)购自eBioscience(加利福尼亚州圣迭戈)。CCR9(克隆242503)和IL-22R(克隆496514)的单克隆抗体(mAb)购自R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯)。抗CXCR3mAb和抗T-bet(4B10)购自Biolegend(加利福尼亚州圣迭戈)。多克隆兔抗人溶菌酶EC 3.2.1.17购自DAKO(加利福尼亚州卡平特里亚)。抗RNF128：FITC(GRAIL)mAb(ARP43311_T100)购自AVIVA SYSTEMS BIOLOGY(加利福尼亚州圣迭戈)。抗细胞角蛋白mAb购自Sigma-Aldrich(密苏里州路易斯)。乌雷菌凝集素1(UEA-1)的mAb购自VectorLaboratories(加利福尼亚州伯林盖姆)。使用CyAn免疫细胞计数系统(DAKOCytomation，科罗拉多州柯林斯堡)和BD LSRFortessa(新泽西州富兰克林湖)进行流式细胞术分析，并使用FlowJo软件(Tree Star，俄勒冈州阿什兰)分析所得数据。用希望之城FACS设施的BD FACS Aria SORP分选仪进行T细胞分选。分选的细胞用于移植和实时RT-PCR。

GVHD靶组织细胞分离：如此前所述对来自肺，肝和消化道的单核细胞(MNC)进行治疗和收集(29)。如此前所述进行胸腺上皮细胞分离(11)。简而言之，将胸腺切成小块并置于带有胶原酶D和DNAse I的RPMI 1640培养基。将胸腺碎片通过1000ml移液器吸头的孔快速混合，并在37℃水浴中培育以消化胸腺并从细胞外基质释放上皮细胞。每隔15分钟获取一次细胞悬浮液，并将该过程重复两次。将收获的细胞与抗CD45微珠一同培育，然后通过MACS分离柱(Miltenyi Biotec)，并保留包含CD45^-mTEC细胞的阴性群落，用于后续的流式细胞术分析。根据先前的报道进行消化道上皮细胞分离(71)。简而言之，在PBS中洗涤结肠并切成0.5cm的小块。将结肠组织在5mM EDTA和1mM DTT的PBS中于37℃下培育30分钟，同时以200rpm的转速摇晃。在70μm筛中过滤样品，在30％Percoll上以1700rpm离心15分钟以分离上皮细胞，然后将其用于FACS分析。

体内BrdU标记和膜联蛋白V染色：HCT后第7天或第10天，在收集组织前3小时进行一次腹腔内(i.p)注射BrdU(2.5mg/小鼠，100mg/g)并测量T细胞增殖。HCT后第21天，在获取组织前72小时开始每24小时腹腔内注射一次BrdU(2.5mg/小鼠，100mg/g)并且共注射三次。根据制造商的说明(BD Pharmingen)分析供体CD8⁺ T细胞的BrdU导入。对于膜联蛋白V染色，根据制造商的说明(eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥)，通过流式细胞术评估了供体CD8⁺T细胞中膜联蛋白V⁺细胞的百分比。

实时RT-PCR：如此前的出版物(1，6)中所述，对CCL25，CXCL9，CXCL10，CXCL11的mRNA进行实时RT-PCR分析。使用的引物如下：

CCL25：

正(Forward)：5’-TTACCAGCACAGGATCAAATGG(SEQ ID NO：1)，

反(Reverse)：5’-CGGAAGTAGAATCTCACAGCAC-3’(SEQ ID NO：2)；

CXCL9：

正：5’-TCCTTTTGGGCATCATCTTC-3’(SEQ ID NO：3)，

反：5’-TTCCCCCTCTTTTGCTTTTT-3’(SEQ ID NO：4)；

CXCL10：

正：5’-CGATGACGGGCCAGTGAGAATG-3’(SEQ ID NO：5)，

反：5’-TCAACACGTGGGCAGGATAGGCT-3’(SEQ ID NO：6)；

CXCL11：

正：5’-AGTAACGGCTGCGACAAAGT-3’(SEQ ID NO：7)，

反：5’-GCATGTTCCAAGACAGCAGA-3’(SEQ ID NO：8)；

GAPDH：

正：5’-TCACCACCATGGAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：9)，

反：5’-GCTAAGCAGTTGGTGGTGCA-3’(SEQ ID NO：10).

将每个样品中基因的相对表达水平相对于管家基因GAPDH进行标准化。

血清中细胞因子和肝功能的测定：血清中的细胞因子通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测定。用于IFN-γ，TNF-α和IL-2的ELISA试剂盒购自R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯)。小鼠IL-27的ELISA试剂盒购自Biolegend(加利福尼亚州圣迭戈)。肝功能(AST，ALT和ALB)的测量由Charles River临床病理实验室(马萨诸塞州威尔明顿)进行。用购自abcam(马萨诸塞州剑桥)的天冬氨酸转氨酶活性测定试剂盒测定GVL实验期间的血清AST水平。

组织病理学：将组织样本固定在福尔马林中，然后包埋在石蜡块中，进行切片并用H&E染色。使用Olympus和Pixera(600CL)冷却的电荷耦合器件照相机(Pixera，加利福尼亚州洛斯盖多斯)以200倍或400倍放大倍数检查载物片并进行可视化。如前所述(1，2)，在评分系统上对组织损伤进行盲评。简而言之，通过表皮和真皮的组织损伤以及皮下脂肪的损失对皮肤GVHD进行评分；最高分为9分。唾液GVHD通过单核细胞浸润和滤泡破坏来评分；最高分为8分。肝GVHD根据淋巴细胞浸润的严重程度，涉及的道数(number of tracts)和肝细胞坏死的严重程度进行评分；最高分为9分。肺GVHD按管腔浸润，肺炎和肺组织损伤的严重程度进行评分；最高得分为9。消化道GVHD通过单核细胞浸润和形态异常(例如增生和隐窝丢失)进行评分，最高得分为8。

肠道Paneth细胞和上皮细胞以及胸腺上皮细胞的组织免疫荧光染色：获取小肠和结肠组织，用福尔马林固定并用石蜡包埋。小肠用大鼠抗小鼠IL-22Rα抗体(R&D Systems)和多克隆兔抗人溶菌酶(Dakocytomation)染色。结肠组织用抗细胞角蛋白-Pan(Sigma)染色。将冷冻的胸腺组织在4℃下置于PFA中过夜，然后在4℃下转移至蔗糖中过夜。48小时后，将样品包埋在OCT凝胶中，在干冰上冷冻并保存于-80℃。胸腺用髓质上皮细胞的抗UEA-1(Vector实验室)和皮质上皮细胞的抗细胞角蛋白8(DSHB)染色。

肝细胞凋亡的TUNEL试验：根据制造商的说明(Roche，印第安纳州印第安纳波利斯)用DAPI和TUNEL将石蜡切片染色，并使用Olympus IX81自动倒置显微镜进行成像。使用400倍物镜拍摄图像，然后使用Image-Pro Premier分析。

生物发光成像：对小鼠腹腔内注射荧光素酶⁺BCL1细胞(BCL1/Luc⁺)并使用生物发光成像监控这些细胞的扩增。此前已描述了肿瘤生长的体内成像(7)。简而言之，对小鼠腹腔内注射200μl萤火虫萤光素(CaliperLife Sciences，马萨诸塞州霍普金顿)，使用IVIS100(Xenogen)和AmiX(Spectral)成像系统进行麻醉并成像。使用购自WaveMetrics(LakeOswego，俄勒冈州)的Igor Pro 4.09A软件和购自Spectral Instruments Imaging(纽约州，纽约)的Amiview软件对数据进行分析。

小鼠B7H1-Fc的产生：表达B7H1-Fc的质粒获赠自Lieping Chen博士(耶鲁大学医学院)。该DNA质粒含有与人IgG1重链的CH2-CH3区融合的鼠B7H1胞外域的编码序列。使用Thermo Fisher Freestyle CHO表达系统作为制备方案，在中国仓鼠卵巢悬液(CHO-S)细胞系中瞬时表达B7H1-Fc融合蛋白。7天后收集瞬时转染的CHO-S的上清液，并使其通过已经在1XPBS pH.7.4中平衡的蛋白G琼脂糖珠(GenScript)填充柱。将B7H1-Fc结合的蛋白用pH7.4的1XPBS洗涤，用pH2.5的0.1M甘氨酸洗脱，在pH7.4的1XPBS中透析，并浓缩成1.0mg/ml等分试样，然后冷冻至-80℃直至进一步使用。

实施例1：供体CD4⁺ T细胞的消耗对GVHD预防和GVL保留的影响

该实施例表明，HCT后供体CD4⁺ T细胞即刻的暂时消耗保留了强的GVL效应，同时在多种模型中有效地预防了急性和慢性GVHD这两者。

此前的一项研究表明，来自C57BL/6供体的分选的CD8⁺ T细胞未诱导急性GVHD，但在致死照射过的BALB/c接受者中诱导慢性GVHD，如唾液腺(慢性GVHD的原型靶器官)的组织病理学所示。在第15天和第30天用抗CD4 mAb对CD4⁺ T细胞的消耗的治疗可预防慢性GVHD的发展，正如所有GVHD靶组织中，尤其是唾液腺中的组织损伤的预防所示(11)。本文公开了1)通过HCT后7天接受者脾中的供体CD4⁺ T的百分比和产量判断，与CD4⁺ T细胞的离体消耗相比，在HCT当天于体内施用抗CD4 mAb在消耗供体CD4⁺ T细胞方面更有效(图1A)。2)尽管单独的低剂量CD4⁺ T(0.075×10⁶)或CD8⁺ T(1×10⁶)未诱导腹泻迹象，但向CD8⁺ T细胞移植物中添加少量CD4⁺ T细胞却引起了所有接受者的严重腹泻和死亡(图1B)。添加少量的供体CD4⁺ T细胞显著减少了浸润结肠组织的CD8⁺ T细胞的凋亡，导致供体CD8⁺ T细胞在结肠组织中明显扩增(图1C)，并且这种作用是IL-2依赖性的(图1D)。3)HCT后立即单次注射抗CD4 mAb有效预防了急性GVHD，但未能预防慢性GVHD，这与HCT后第21天开始重建供体CD4⁺ T细胞有关(图2和图3)。4)在第0，14，28天注射三次抗CD4有效预防了急性和慢性GVHD，且供体CD4⁺ T细胞的恢复此后也不再引起慢性GVHD(图4A-4C)。在HCT后约60天，GVHD靶组织中没有组织损伤表明预防了慢性GVHD(图4B)。另外，抗CD4的3次注射而不是1次注射导致髓样胸腺上皮细胞(mTEC)的恢复(图5A-5D)。因此，与供体CD4⁺ T细胞的离体消耗相比，在HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的暂时体内消耗更有效地预防了GVHD，尤其是慢性GVHD。

评估了CD4⁺ T细胞的暂时体内消耗在针对BVL1肿瘤细胞的GVL效应方面的影响(35，36)。TBI处理的(conditioned)BALB/c接受者注射了萤光素酶转染的BCL1细胞(BCL1/Luc，5×10⁶/小鼠)以及单独的TCD-BM(2.5×10⁶)或TCD-BM⁺脾细胞(5×10⁶)。在HCT之后第0，14，和28天，用抗CD4 mAb或对照大鼠IgG治疗接受脾细胞的接受者。仅移植了TCD-BM的携带BCL1/Luc肿瘤细胞的接受者在HCT后20天时全部死亡并伴有进展性(progressive)的肿瘤生长(图6A-6D)。移植有BM和脾细胞并用对照大鼠IgG治疗的接受者在HCT后12天消除了BCL1/Luc肿瘤细胞，但在HCT后20天全部死亡并伴有急性GVHD和严重腹泻。相反，用抗CD4mAb治疗的接受者在HCT后12天消除了肿瘤细胞，并且所有接受者均存活超过100天且几乎没有GVHD的迹象(p＜0.001，图6A-6D)。这些结果表明，在HCT之后，供体CD4⁺ T细胞的体内消耗会保留GVL效应且同时预防GVHD。

抗CD8导致的供体CD8⁺ T细胞的消耗(图30A)未能保护胸腺或未能使DP胸腺细胞再生(图30B)。

白血病和淋巴瘤细胞也浸润肝组织。体内BLI表明，肿瘤负荷在HCT后第7天开始减少，并在第12天消失(图6A-6B)。另外，与仅接受TCD-BM的接受者相比，抗CD4治疗的接受者显示出轻度且短暂的急性GVHD迹象，在第7天达到峰值(图6C)。从而，测试了CD8⁺ T细胞介导的GVL活性是否与肝细胞损伤有关。比较了具有或没有BCL1细胞的抗CD4治疗的接受者的血清天冬氨酸转氨酶(AST)浓度。在HCT后第7天，与没有BCL1的接受者相比，具有BCL1细胞的抗CD4治疗的接受者的血清AST浓度显著升高(P＜0.01，图6E)。到第12天，AST浓度恢复正常，在接种或未接种BCL1的抗CD4治疗的接受者以及仅接受TCD-BM的接受者中未观察到差异。这些结果表明CD8⁺ T细胞的GVL效应与轻度肝细胞损伤有关，但该损伤是自限性的，并且在消灭肿瘤细胞后消失。

通过在C57BL/6背景中使用“GVL耐受的”的急变期-慢性粒细胞白血病(BC-CML)来测试该方案的GVL能力。通过bcr-abl的逆转录病毒转移和NUP98/HOXA9融合cDNA产生了获自W.Shlomchik的鼠BC-CML细胞。像人BC-CML一样，鼠BC-CML也相对抵抗GVL。在某些细胞剂量下，同种异体CD8⁺ T细胞无法挽救接种有BC-CML细胞的接受者，尽管相同数量的CD8⁺ T细胞挽救了几乎所有的接种有相同数量的慢性相慢性髓细胞性白血病(CP-CML)细胞的受体(37)。

将A/JBM(10×10⁶)和脾细胞(10×10⁶)移植入致死照射(1100cGy)过的C57BL/6接受者中(38)。在进行HCT时，通过BC-CML的静脉注射(20×10³细胞/小鼠)攻击接受者(37)。肿瘤细胞在30天内杀死了所有(12/12)无GVHD的仅接受TCD-BM的受体，且垂死小鼠的脾，肝和骨髓中BC-CML细胞的百分比高(图7A，7B，和8A)。相比之下，尽管在HCT后15天内它们均死于GVHD(8/8)，但IgG治疗的GVHD接受者肿瘤细胞被消除(图7A和7B)。与TCD-BM接受者相比，接受10×10⁶供体脾细胞的抗CD4治疗过的无GVHD接受者具有显著延长的生存(P＜0.01，图7A)，但在HCT后第100天，70％(7/10)的接受者死亡并伴有进展性肿瘤生长(图7A，7B，和8A)。在HCT后存活超过100天的三名接受者没有可检测到的肿瘤细胞。因此，在接受10×10⁶脾细胞的抗CD4治疗过的受体中，BC-CML细胞似乎对GVL效应具有部分抵抗力。

在进一步的实验中，供体脾细胞增加到20和40×10⁶，抗CD4治疗延长到HCT后60天。接受20×10⁶供体脾细胞的接受者的37.5％(6/16)死亡并伴有肿瘤进展性生长，62.5％(10/16)存活了100天以上且没有可检测到的肿瘤细胞(图7A和7B)。接受40×10⁶供体脾细胞的抗CD4治疗过的接受者全部(12/12)存活超过100天，且脾，肝或BM中没有可检测到的肿瘤细胞(图7A，7B，和8A)。给予40×10⁶供体脾细胞的抗CD4治疗的接受者在HCT后100天显示了与TCD-BM接受者相似水平的CD4⁺ T细胞的恢复(图7C)。他们未显示GVHD的临床证据。体重逐渐增加，且组织学评估显示在第100天没有组织损伤，类似于TCD-BM对照中的结果(图7D和7E)。抗肿瘤作用是供体CD8⁺ T细胞依赖性的，因为注射CD8⁺ T消耗了的脾细胞(40×10⁶)消除了抗CD4治疗过的无GVHD接受者中的GVL效应，且所有小鼠(8/8)在HCT后约25天死亡并伴有进展性肿瘤生长(图8B)。综上，这些结果表明，CD4⁺ T细胞暂时在体内消耗可使供体T细胞消除“GVL耐受的”的BC-CML白血病细胞，同时有效地预防GVHD。

测试了在GVHD的异种模型中，施用消耗性抗人CD4 mAb是否可以预防GVHD并保留GVL效应(39)。将没有或带有人类B细胞淋巴瘤Raji细胞(1×10⁶/小鼠)的NSG小鼠用于GVHD或GVL实验。将健康人PBMC(20×10⁶)腹腔内注射入小鼠，然后每周两次用消耗性抗人CD4(克隆IT1208，200μg/小鼠)或对照IgG进行治疗，持续4周(40)。测试了4个人类PBMC供体。针对每个供体，使用了16只NSG小鼠，8只用于GVHD实验，8只用于GVL实验。在每个实验中，用对照IgG治疗4位接受者，用抗CD4治疗4位接受者。

在对4个供体中的3个进行的实验中，抗CD4治疗有效地预防了异种GVHD，在PBMC注射后，12位无GVHD的抗CD4治疗的NSG接受者存活了100天以上(图9A)。对于来自一个供体的细胞，抗CD4 mAb治疗只能部分有效地预防异种GVHD(图10)。IgG治疗的对照NSG接受者均出现了GVHD并伴有体重减轻，皮毛皱纹和脱毛，并且在PBMC注射后约60天后全部死亡(P＜0.01，图9A)。抗CD4治疗可预防GVHD皮肤，唾液腺，肝和肺中的靶组织损伤(P＜0.01，图9B)。

在GVL实验中，仅接受Raji细胞的对照组接受者全部在35天内死亡并伴有进展性肿瘤生长。用IgG或抗CD4 mAb对接受Raji细胞和人PBMC的NSG小鼠进行治疗。PBMC注射后，所有12只无GVHD的抗CD4治疗的小鼠均存活超过100天(P＜0.01，图9C)，但IgG治疗过的小鼠均在PBMC注射后约65天死亡并伴有GVHD。死亡并伴有进展性肿瘤生长的对照NSG小鼠的脾，肝和骨髓中有Raji细胞浸润，而抗CD4治疗的无GVHD的NSG小鼠在这些组织中没有可检测到的肿瘤细胞(P＜0.01，图9C)。这些结果表明，HCT后即刻抗体介导的供体CD4⁺ T细胞的体内消耗可能能够预防GVHD，同时在针对人的同种异体HCT后保留GVL效应。

实施例2：供体CD4⁺ T细胞消耗对IFN-γ和IL-2的影响

该实施例表明HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了血清IFN-γ但降低了血清IL-2浓度。

在C57BL/6供体和BALB/c接受者的实验中，探索了HCT后即刻的体内供体CD4⁺ T细胞的消耗如何预防急性GVHD并同时保留GVL效应。已将高血清水平的IFN-γ和TNF-α与急性GVHD进行了关联(41)。与预期相反，供体CD4⁺ T细胞的消耗使HCT后7天的血清IFN-γ浓度增加了约3倍(p＜0.001)。血清IL-2浓度降低约50％(p＜0.05)，血清TNF-α浓度与基线无明显差异(图11A)。IFN-γ的血清水平升高归因于淋巴组织中供体CD8⁺ T细胞的扩增，因为抗CD4治疗的接受者的脾中IFN-γ⁺CD8⁺ T细胞的数量比大鼠IgG治疗的接受者高约3倍(p＜0.001)，尽管两组中CD8⁺ T细胞中IFN-γ⁺细胞的百分比相似(图11B)。这些结果表明，HCT后即刻体内CD4⁺ T细胞的消耗可能会在淋巴组织中扩增IFN-γ生产性的CD8⁺ T细胞。

实施例3：供体CD4⁺ T细胞的消耗对淋巴组织中供体CD8⁺ T细胞数量的影响

该实施例表明HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了淋巴组织中供体CD8⁺ T细胞的数量。

接着，从动力学方面评估了体内CD4⁺ T细胞消耗对供体CD8⁺ T细胞扩增和组织分布的影响。HCT后第5天，抗CD4治疗的接受者脾和MLN中H-2K^b+供体型CD8⁺ T细胞的数量低于大鼠IgG治疗的接受者(P＜0.01，图11C)。HCT后7-10天，抗CD4治疗的接受者脾，PLN，和MLN中供体CD8⁺ T细胞的数量比对照IgG治疗的接受者高约3倍(p＜0.01)，尽管HCT后14-21天的两组患者的人数减少，差异变小(图11C)。到第28天，供体CD8⁺ T细胞在抗CD4治疗的接受者的淋巴组织中再次扩增，但在IgG治疗的接受者中未扩增，且IgG治疗的接受者显示出严重的淋巴细胞减少症(图11C)。此外，通过使用同基因(congenic)标记(注射的T细胞为CD45.2，从供体骨髓重新产生的T细胞为CD45.1)，发现在HCT后第28天，IgG治疗的接受者的脾中的CD4⁺和CD8⁺ T细胞几乎全部来自移植物中的CD45.2⁺成熟T细胞。相反，抗CD4治疗的接受者的脾中的CD4⁺ T细胞几乎全部来自CD45.1⁺供体骨髓，而CD8⁺ T细胞来自注射的CD45.2⁺ T细胞和CD45.1⁺供体骨髓(图12A)。IgG治疗的接受者的脾中总CD4+和CD8⁺ T细胞的产量显著低于抗CD4治疗的接受者(P＜0.01，图12A)。IgG治疗的接受者中几乎没有来源于注射的CD4⁺ T细胞的Foxp3⁺Treg细胞，但在抗CD4治疗的接受者中，Treg细胞约占来源于供体骨髓的CD4⁺ T细胞总数的约10％(图12B)。这些结果表明，IgG治疗的接受者出现了急性GVHD和淋巴细胞减少。单次注射抗CD4可有效消耗注射的CD4⁺ T细胞并增强CD4⁺和CD8⁺ T细胞以及Treg细胞的重新再生。

实施例4：供体CD4⁺ T细胞消耗对不同器官中供体CD8⁺ T细胞数量的影响

该实施例表明HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗减少了肠和肺中供体CD8⁺ T细胞的数量，但没有减少肝中的供体CD8⁺ T细胞的数量。

HCT后5天，只有少数供体CD8⁺ T细胞浸润结肠，肺和肝脏，IgG或抗CD4治疗的接受者之间没有差异。从HCT后第7天到第28天，抗CD4治疗的接受者的结肠中供体CD8⁺ T细胞的数量明显低于IgG治疗的接受者(p＜0.01，图11D)。肺的模式与结肠类似。在肝中，HCT后10天的抗CD4治疗的接受者中供体CD8⁺ T细胞的数量高于IgG治疗的接受者(p＜0.01)，但到第21天时，IgG治疗的接受者中CD8⁺ T细胞的数量超过了抗CD4治疗的接受者的数量(p＜0.01，图11D)。IgG治疗的接受者的GVHD靶组织中供体CD4⁺和CD8⁺ T细胞的扩增与GVHD的复发有关(图11D和4A)。

据此前报道，消化道组织的供体T细胞浸润受消化道组织特异性归巢和趋化因子受体(α4β7，CCR9，CXCR3)的表达以及相应趋化因子(CCL25和Cxcl9-11)的组织释放的调节(42-45)。到HCT后7天，超过92％的供体型CD8⁺ T细胞在大鼠IgG治疗和抗CD4治疗的接受者中均表达CD44^hiCD62^lo效应子表型，表明两组中CD8⁺ T细胞均被完全激活。尽管在HCT后7天，抗CD4治疗的接受者中供体CD8⁺ T细胞对肠组织(即结肠)的浸润明显减少(图11C)，但供体CD8⁺ T细胞的α4β7，CCR9或CXCR3表达没有明显降低(图13A)。抗CD4治疗的接受者的小肠中CCL25的表达和结肠中Cxcl9-11的表达水平高于IgG治疗的接受者(p＜0.05，图13B)。这些结果表明，在消耗了供体CD4⁺ T细胞后，供体CD8⁺ T细胞对消化道组织的浸润不太可能减少，这是因为CD8⁺ T细胞向消化道组织的迁移减少。

实施例5：供体CD4⁺ T细胞消耗对供体CD8⁺ T细胞凋亡的影响

该实施例表明了HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了肠中供体CD8⁺ T细胞的凋亡和肝中的失能/衰竭，但脾中没有失能/衰竭。

对机理进行了探索，其中抗CD4治疗的无GVHD接受者的结肠中供体CD8⁺ T细胞数量减少，在肝脏中数量相似或更高，而在脾中供体CD8⁺ T细胞数量增加，如图11所示。在GVHD的发病机理中，同种反应性供体T细胞破坏小肠中的Paneth细胞并扰乱结肠中的上皮连接(46，47)。一致地，没有腹泻迹象的抗CD4治疗的接受者的小肠中Paneth细胞的损害很小，结肠中上皮连接的扰乱也很少(图14A和14B)。

同种反应性T细胞浸润在肝脏损伤中也起着关键作用(3)。尽管在HCT后第10天，抗CD4治疗的接受者的肝浸润CD8⁺细胞数量明显高于对照IgG治疗的接受者(图11D)，但与IgG治疗的对照受体相反，抗CD4治疗的接受者似乎对肝的损伤很小，或几乎没有肝细胞凋亡的证据(P＜0.01，图14C和14D)。此外，HCT后第21天，来自IgG治疗的接受者的肝浸润CD8⁺ T细胞在继发性过继接受者中诱导了GVHD，而来自抗CD4治疗的接受者的CD8⁺ T细胞则没有(图14E)。这些结果表明，肝浸润CD8⁺ T细胞可能失能或衰竭，从而它们变得不具致病性。

因此，比较了HCT后7天和10天供体CD8⁺ T细胞在脾，肝和结肠组织中的增殖和凋亡。在第7天，体内BrdU标记显示，与IgG治疗的接受者相比，供体CD8⁺ T细胞在抗CD4治疗的接受者的脾，肝，和肠组织中的增殖明显更快(P＜0.01，图15A，中间栏，以及图16A)。相反，与IgG治疗的接受者相比，抗CD4治疗的接受者中供体CD8⁺ T细胞的凋亡在脾中显著减少(P＜0.01)，在肝中无明显变化，而在结肠中显著增加(P＜0.01)(图15A，右栏，和图16B)。到第10天，尽管凋亡率仍然较低，但抗CD4治疗的接受者的脾和肝中的供体CD8⁺ T细胞不再更好地增殖(图17A)。因此，增加的增殖和减少的凋亡导致在HCT后立即在抗CD4治疗的接受者的脾和肝中增加供体CD8⁺ T细胞的数量。

为了评估供体CD8⁺ T细胞的失能和衰竭，比较了与失能/衰竭相关标记(包括Grail，Tim-3和IL-R7α)的CD8⁺ T细胞表达水平(平均荧光指数，MFI)。与IgG治疗的接受者相比，来自抗CD4治疗的接受者的脾的CD8⁺ T细胞在第7天的Grail，Tim-3或IL-7Rα的表达没有显著变化(图15B和16C)，但在第10天，具有显著下调的Tim-3表达和上调的IL-7Rα表达(图17B)。相反，在第7天，来自抗CD4治疗的接受者的肝的CD8⁺ T细胞显著增加了Grail并下调了IL-7Rα的表达，尽管变化似乎很小(图15B和16C)，并且在HCT后第10天，上调了Tim-3表达(图17B)。此外，当比较来自抗CD4治疗的接受者的肝和脾的CD8⁺ T细胞时，HCT后第7天，来自肝的CD8⁺ T细胞表达出明显更高的Grail和Tim-3水平，以及更低的IL-7Rα水平(P＜0.05，图15C)；在第10天，Tim-3的水平仍然更高(P＜0.01，图17C)。这些结果表明，抗CD4治疗的接受者肝中的供体CD8⁺ T细胞在HCT后7至10天变得失能和衰竭，而脾中的CD8⁺ T细胞则没有。

Eomes调节CD8⁺ T分化(48)。Eomes⁺ T-bet⁺CD8⁺ T细胞是具有强力溶细胞功能的效应细胞，而Eomes⁺PD-1⁺CD8⁺ T细胞是终末分化的衰竭细胞(49，50)。因此，评估了HCT后7天和10天CD4⁺ T细胞的消耗对脾和肝中Eomes，T-bet，和PD-1的CD8⁺ T表达的影响。与HCT后第7天和第10天的对照IgG治疗的接受者相比，来自抗CD4治疗的接受者的脾和肝的CD8⁺ T细胞的Eomes⁺ T-bet⁺和Eomes⁺PD-1⁺细胞百分比显著增加(P＜0.01，图15D，16D和17D)。在第7天和第10天，脾CD8⁺ T细胞中Eomes⁺ T-bet⁺细胞的增加占主导，而在第7天，肝中的CD8⁺ T细胞中Eomes⁺PD-1⁺细胞的增加占主导，在第10天没有区别(图15E和17E)。这些结果表明，HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的抗CD4消耗导致脾中CD8⁺ T细胞的优先细胞毒性分化，以及肝中CD8⁺ T细胞的优先终末分化和衰竭。

实施例6：供体CD4⁺ T细胞的消耗对PD-L1的宿主组织表达的影响

该实施例表明，HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗使得PD-L1的宿主组织表达能够耐受GVHD靶组织中的浸润性供体CD8⁺ T细胞，在淋巴样组织中则无法耐受。

HCT后即刻，PD-L1/PD-1相互作用导致T细胞失能和衰竭(24)，并且同时进行的PD-L1/PD-1和PD-L1/CD80相互作用会增强激活的同种反应性CD4⁺ T细胞的凋亡(31)。供体CD4⁺ T细胞的消耗增加了IFN-γ的血清水平(图11A)，并且IFN-γ诱导GVHD靶组织中PD-L1的组织表达(27，29)。尽管IL-27上调PD-L1表达(51)，但在接受或未接受抗CD4治疗的接受者中，血清IL-27的浓度没有差异(图18)。因此，首先测试了供体细胞IFN-γ的产生和PD-L1的组织表达是否有助于预防抗CD4治疗的接受者中的GVHD。如上所述，将来自IFN-γ^-/-和野生型C57BL/6供体的脾细胞(5×10⁶)移植到经致死照射的BALB/c接受者中。的确，抗CD4治疗未能预防由来自IFN-γ^-/-供体的移植物介导的急性GVHD。所有接受者均表现出严重的腹泻和体重减轻，约80％(8/10)的接受者在HCT后30天死亡(图19)。接受IFN-γ^-/-移植物的接受者的脾和肝中的CD8⁺ T细胞，CD11c⁺树突状细胞和Mac-1/Gr-1⁺髓样细胞均在HCT后立即显著下调了PD-L1的表达(图19)。这些结果表明，通过在HCT后立即施用抗CD4，IFN-γ的产生和组织PD-L1表达可帮助预防GVHD。

此外，发现在接受野生型C57BL/6移植物的抗CD4治疗的BALB/c接受者中IFN-γ的升高与PD-L1的宿主肠上皮细胞表达的上调有关(图20A)，并且与无急性GVHD的抗CD4治疗的野生型接受者相反，抗CD4治疗的PD-L1^-/-接受者表现出严重的急性GVHD，其通过HCT后10天内的体重减轻，严重腹泻，和死亡来判断(图20B)。急性GVHD与肝功能障碍，肝细胞凋亡，Paneth细胞损失和结肠上皮完整性有关(P＜0.01，图20C和20D)。PD-L1^-/-接受者中的急性GVHD的严重程度似乎与IgG治疗的对照WT接受者的严重程度相似(图20B-20D)。

此外，直接测试了宿主组织PD-L1在分选的CD4⁺或CD8⁺ T细胞诱导的急性GVHD严重性中的作用。尽管2.5或5×10⁶分选的CD8⁺ T细胞几乎没有诱导急性GVHD的证据，但是相同数量的供体CD4⁺ T细胞诱导了严重的致命急性GVHD，并且所有受体均在10天内死亡(P＜0.01，图21A)。相反，2.5×10⁶或5×10⁶分选的CD8⁺ T细胞在PD-L1^-/-接受者中诱导了严重的致命急性GVHD，其严重性与相同数量的供体CD4⁺ T细胞诱导的严重性相似(图21B)。综上，这些结果表明，在没有供体CD4⁺ T细胞的情况下，PD-L1的宿主组织表达在预防由供体CD8⁺T细胞介导的急性GVHD中起着关键作用。

在进一步的实验中，评估了HCT后第7天，PD-L1宿主组织表达对抗CD4治疗的受体的脾，肝和结肠组织中CD8⁺ T细胞的增殖，凋亡以及失能/衰竭的影响。与抗CD4治疗的WT接受者相比，抗CD4治疗的PD-Li^-/-接受者的脾中供体CD8⁺的增殖或凋亡没有变化(图22A，23A，和23B)，且PD-L1^-/-接受者与对照之间的CD8⁺ T细胞的数量没有差异。抗CD4治疗的PD-L1^-/-受体的肝和结肠中CD8⁺ T的增殖和凋亡显著减少，凋亡的减少大于增殖的减少(P＜0.01，图22A，23A，和23B)，使得与对照相比，更多数量的供体CD8⁺ T细胞浸润了PD-L1^-/-接受者的肝和结肠。

评估了HCT后第7天PD-L1的宿主组织表达对脾中供体CD8⁺ T扩增的影响。抗CD4治疗的WT接受者中脾单核细胞(MNC)，T细胞，和CD8⁺ T细胞的数量高于大鼠IgG治疗的WT接受者中的数量(p＜0.05-0.001，图31)。

抗CD4治疗的WT接受者脾中CD8⁺ T细胞的CD80和PD-1表达高于大鼠IgG治疗的接受者(p＜0.05-0.001，图32A)，而IL-7Rα和GRAIL，以及TIM3表达在两组中相似(p＞0.1，图32A)。抗CD4治疗后CD80和PD-1的较高表达与增加的CD8+ T细胞增殖有关(p＜0.01)，但凋亡没有显著增加(图32B)，这导致与大鼠IgG治疗的接受者相比，抗CD4治疗的接受者的脾中CD8⁺ T细胞数量更多。(p＜0.01，图32C)。

在抗CD4治疗后的第7天，PD-L1^-/-接受者脾中CD8⁺ T细胞的PD-1和IL7Rα的表达高于WT接受者(p＜0.001，图32A)。抗CD4治疗后CD80，GRAIL和TIM3的表达不受接受者中PD-L1缺失的影响，且脾中CD8+ T细胞的增殖，凋亡和数量在两组中无显著差异(图32B和32C)。

这些结果表明，PD-L1的宿主组织表达增加了肝和肠中浸润性CD8+ T细胞的凋亡，但在抗CD4治疗的接受者的脾中并非如此。

在抗CD4治疗的WT和PD-L1^-/-接受者中，通过渗透性CD8⁺ T细胞CD80和PD-1的表达高于在大鼠IgG治疗的WT接受者中的表达(p＜0.001，图33A)。抗CD4治疗的WT中供体CD8⁺ T细胞的增殖和浸润性CD8⁺ T细胞的凋亡高于大鼠IgG治疗的WT接受者(p＜0.01，图33B)。凋亡的增加超过增殖的增加，从而抗CD4治疗的WT接受者中的浸润性CD8+ T细胞数量少于大鼠IgG治疗的WT接受者(p＜0.01，图33C)。在PD-L1^-/-接受者中，抗CD4治疗对浸润性CD8⁺ T细胞的增殖作用减弱，且抗CD4治疗对浸润性CD8⁺ T细胞的促凋亡作用被阻断。结果，PD-L1^-/-接受者中抗CD4治疗后的浸润性CD8⁺ T细胞的数量多于WT接受者(p＜0.05，图33B和33C)。

这些结果表明，PD-L1的接受者组织表达有助于CD4⁺ T细胞消耗后结肠浸润性CD8⁺ T细胞凋亡的增加和肠GVHD的预防。

评估了HCT后第7天PD-L1的宿主组织表达对浸润肝的CD8⁺ T细胞的失能和衰竭的影响。失能CD8⁺ T细胞上调GRAIL的表达并下调IL-7Rα的表达且TIM3表达无明显变化，而衰竭的CD8⁺ T细胞同时表达高水平的PD-1和TIM3(72-75)。失能和衰竭的T细胞逐渐失去增殖能力和效应子(effector)功能(例如产生IFN-γ)(72，73)。与大鼠IgG治疗的接受者相比，抗CD4治疗的接受者的肝浸润性CD8⁺ T细胞表达更高水平的CD80，PD-1，和GRAIL(p＜0.01)，更低水平的IL-7Rα(p＜0.01)，以及类似水平的TIM3(图34A)。在结肠中，通过抗CD4接受者中渗透性CD8⁺ T细胞而增加CD80和PD-1的表达与增加的增殖和凋亡有关(图33B)。在肝中，通过在抗CD4治疗的接受者中浸润CD8⁺ T细胞而实现的CD80和PD-1的上调与增加的增殖相关(p＜0.01)，但与增加的凋亡无关(图34B)。浸润性CD8+ T细胞的增加的增殖与上调的GRAIL表达和下调的IL-7R表达相关(图34A)。

这些结果表明，HCT后即刻的抗CD4治疗的接受者的肝中的浸润性CD8⁺ T细胞变得失能。

在没有接受者PD-L1的情况下，在抗CD4治疗后，CD8⁺ T细胞的GRAIL表达没有显著上调，且IL-7Rα的表达没有下调(图34A)，表明接受者中PD-L1表达对于浸润肝的CD8⁺ T细胞的失能的发展是必需的。在没有接受者PD-L1的情况下，T细胞增殖的速度较慢，但是在抗CD4治疗后，CD8⁺ T细胞的凋亡减少了约50％(p＜0.01，图34B)。与这些结果一致，在PD-L1^-/-接受者中浸润抗CD4治疗的接受者的肝的CD8⁺ T细胞的数量显著高于WT接受者(p＜0.05，图34C)。相比WT接受者，PD-L1^-/-接受者的血清转氨酶浓度也更高，但血清ALB较低(p＜0.05)(图34D)。

在HCT后21天，抗CD4治疗的接受者中的浸润肝的CD8⁺ T细胞衰竭，而大鼠IgG治疗的受试者中则没有衰竭，正如根据它们的PD-1和TIM-3的上调(p＜0.01，图35A)，细胞内IFN-γ和TNF-α表达的显著降低(p＜0.01，图35B)，和增殖损失(p＜0.01，图35C)所判断的那样。

综上所述，这些结果表明，HCT后即刻的抗CD4治疗的接受者中的浸润肝的CD8⁺ T细胞因取决于接受者中PD-L1的表达的机制而逐渐失能和衰竭。

比较了HCT后7天时PD-L1^-/-接受者和对照的脾和肝中Grail，Tim-3，IL-7Rα的表达水平(MFI)以及Eomes⁺ T-bet⁺CD8⁺和Eomes⁺PD-1⁺CD8⁺ T细胞的百分比。缺乏PD-L1的宿主组织表达的情况下并未显著改变脾中Grail或Tim-3的供体CD8⁺ T表达，尽管PD-L1^-/-接受者中IL-7Rα的表达高于WT接受者(图22B和23C)。另一方面，缺乏PD-L1的宿主组织表达的情况下降低了肝中CD8⁺ T细胞的Grail表达并增加了IL-7Rα的表达，而Tim-3表达没有显著变化(图22B和23C)。缺乏宿主组织PD-L1并未显著改变脾中Eomes⁺T-bet⁺或Eomes⁺PD-1⁺CD8⁺ T细胞的百分比。缺乏宿主组织PD-L1未显著改变肝中Eomes⁺ T-bet⁺CD8⁺ T细胞的百分比，但在PD-L1^-/-接受者的肝中Eomes⁺PD-1⁺CD8⁺ T细胞的百分比低于野生型接受者(图22C和23D)。此外，BCL1肿瘤细胞的存在对诱导浸润肝的供体CD8⁺ T细胞的耐受性没有显著影响(图24)，表明肝组织中的供体CD8⁺ T细胞能够在完全失能和衰竭前消除浸润性肿瘤细胞。综上所述，这些结果表明，在抗CD4治疗的同种异体小鼠接受者中，PD-L1的宿主组织表达在诱导浸润肝的供体CD8⁺ T细胞的失能，衰竭和凋亡方面起着重要作用，但在脾中并非如此。

此外，发现人T细胞可以与小鼠PD-L1相互作用(图25A)，并且通过施用抗小鼠PD-L1阻断PD-L1与其受体的相互作用而导致了接受了人PBMC的抗人CD4治疗的NSG接受者中的致死性异种GVHD的发展，而没有抗PD-L1阻断的对照接受者没有异种GVHD的迹象(图25B)。用抗PD-L1阻断导致CD8⁺ T细胞的PD-1表达显著下调，并显著增强了肝和肺中CD8⁺ T细胞的扩增(图25C和25D)。这些结果表明PD-L1的组织表达有助于在缺乏人CD4⁺ T细胞的情况下对异种接受者中人供体CD8⁺ T细胞的耐受。

实施例7：供体CD4⁺ T细胞的消耗对PD-L1和CD80表达的影响

该实施例表明了HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗导致供体CD8⁺ T细胞上调了淋巴组织中PD-L1和CD80的表达，这保留了GVL效应。

由于PD-L1的供体T细胞表达增强了移植有CD4⁺和CD8⁺ T细胞这两者的接受者的急性GVHD致死性(30)，评价了PD-L1的供体CD8⁺ T表达对无GVHD的抗CD4治疗的接受者的CD8⁺ T细胞的扩增和GVL活性的影响。抗CD4治疗显著上调了脾和肝中PD-L1的CD8⁺ T细胞表达，但结肠中并非如此(图26A和27A)。抗CD4治疗也在HCT后立即显著上调了PD-1和CD80的CD8⁺ T细胞表达(图26A和27A)。脾中的CD8⁺ T细胞具有最高的PD-L1和CD80表达，而PD-1的表达最低。相反，结肠中CD8⁺ T细胞的PD-L1和CD80表达最低，而PD-1的表达最高。肝中CD8⁺ T细胞的模式介于两者之间，如PD-1/CD80的比例所示(图26A)。与此前的报道一致(52)，发现与肝和结肠相比，脾中的非T细胞(如CD11c⁺DC和CD11b/Gr-1⁺髓样细胞)表达的PD-L1水平高得多。抗CD4治疗不会显著改变脾中非T细胞的PD-L1的高表达(图28)。因此，测试了供体CD8⁺T PD-L1和CD80相互作用对供体CD8⁺ T扩增和GVL效应的影响。

与来自WT供体的Thy1.2⁺ T细胞相比，来自PD-L1^-/-C57BL/6供体的分选的Thy1.2⁺ T细胞和来自野生型C57BL/6供体的TCD-BM细胞的移植导致HCT后即刻的抗CD4治疗的接受者的脾中供体CD8⁺ T扩增的显著减少(P＜0.001，图26B)。该发现与增加的凋亡，下调的BCL-XL表达，以及表达PD-1和Eomes的CD8⁺ T细胞的百分比的增加相关(P＜0.01，图26B和27B)。同样，与来自WT供体的T细胞相比，来自CD80^-/-供体的Thy1.2⁺ T细胞和来自野生型供体的TCD-BM细胞的移植也导致BCL-XL的显著下调和表达PD-1的CD8⁺ T细胞的百分比的增加(P＜0.01)，尽管膜联蛋白V的表达和CD8⁺ T细胞的扩增在两组中相似(图26C和27C)。这些结果表明，供体CD8⁺ T细胞的PD-L1和CD80的表达都是必须的，以增强HCT后即刻的抗CD4治疗的接受者在脾中的存活和扩增。

为了进一步评估PD-L1/CD80相互作用对CD8⁺ T细胞存活和扩增的作用，使用了一种特异性阻断PD-L1/CD80相互作用而不会干扰PD-L1/PD-1相互作用的抗PD-L1 mAb(43H12)(26)。在HCT后第0天和第2天将43H12 mAb腹腔内注入抗CD4治疗的WT接受者。与对照IgG治疗相比，PD-L1/CD80相互作用的阻断也显著降低了脾中供体CD8⁺ T细胞的扩增。该发现与增强的凋亡，减少的BCL-XL表达，以及Eomes⁺PD-1⁺细胞的百分比的增加相关(图26D和27D)。综上所述，这些结果表明，供体CD8⁺ T-TPD-L1/CD80相互作用在HCT后即刻的抗CD4治疗的接受者的脾中供体CD8⁺ T存活和扩增的增强中起关键作用。

最后，评估了PD-L1/CD80相互作用对抗CD4治疗的接受者中GVL活性的影响。由于抗CD4治疗的接受者中的BCL1/luc⁺肿瘤细胞在HCT后12天内被清除，而在HCT后100天内没有复发(图6C)，因此比较了通过在HCT后第0天和第2天进行43H12 mAb治疗的接受者中的HCT后即刻的肿瘤负荷。用5×10⁶和10×10⁶BCL1/Luc细胞攻击抗CD4治疗的接受者。如通过体内BLI所观察到的，用抗PD-L1(43H12)治疗显著增强了肿瘤生长(P＜0.01，图26E)。尽管所有(8/8)接受抗CD4治疗的接受者在HCT后第12天之前都清除了肿瘤细胞，但如体内BLI所示，对PD-L1/CD80的阻断增强了肿瘤的生长，导致所有(8/8)在HCT后约第10天之前接受5×10⁶或10×10⁶BCL1/Luc细胞的接受者的死亡(图26E)。HCT后7天，43H12 mAb治疗还显著增加了脾，肠系膜淋巴结，肝和肺的肿瘤负荷。综上所述，这些结果表明PD-L1的供体CD8⁺ T细胞表达及其与CD80的相互作用增强了供体CD8⁺ T在脾中的存活和扩增，从而导致了强的GVL活性，而未在抗CD4治疗的接受者的HCT后立即引起GVHD。

实施例8：供体CD4⁺ T细胞的消耗对胸腺中CD8⁺ T细胞扩增的影响

该实施例证明，HCT后即刻的供体CD4⁺ T细胞的消耗增强了浸润胸腺的CD8⁺ T细胞的失能。

评价了PD-L1的宿主组织表达对胸腺中供体CD8⁺ T细胞扩增的影响。HCT后第7天，抗CD4治疗的WT接受者中胸腺单核细胞数量高于大鼠IgG治疗的WT接受者(p＜0.01，图36A)。在抗CD4治疗的PD-L1^-/-接受者中这种增加被减弱(p＜0.05)，表明CD4⁺ T细胞的体内消耗以依赖于宿主组织PD-L1的方式减少了CD8⁺ T细胞介导的胸腺损伤。抗CD4治疗通过浸润胸腺的CD8⁺ T细胞增加了CD80，PD-1和GRAIL的表达，并降低了IL-7Rα的表达(图36B)。在没有接受者PD-L1的情况下，GRAIL的表达未被上调(图36B)，IL-7Rα的表达未被下调(图36B)，且抗CD4治疗引起的浸润胸腺的CD8⁺ T细胞数量的增加被减弱(图36C)。

这些结果表明，在没有供体CD4⁺ T细胞的情况下，浸润胸腺的CD8⁺ T细胞通过CD80和PD-1与宿主组织PD-L1的相互作用导致供体CD8⁺ T细胞增殖和失能的发展，从而浸润的CD8⁺T细胞的积累未引起胸腺组织损伤。

实施例9：抗IL-2抗体对GYHD的效果

该实施例证实了在HCT之后注射抗IL-2mAb预防了具有C57BL/6移植物的BALB/c接受者中的急性GVHD。

如图37A和37B所示，与仅接受IgG的对照小鼠相比，注射抗IL-2mAb显著改善了所测试的小鼠的体重，腹泻和存活。这些结果表明抗IL-2抗体可有效预防急性GVHD。

如上所述，前述内容仅旨在说明本发明的各种实施方式。如此，以上讨论的特定修改不应被解释为对本发明范围的限制。对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的范围的情况下，可以做出各种等同，改变，和修改，并且应当理解，这样的等同实施方式将被包括在本文中。本文引用的所有参考文献都通过引用并入本文，如同在本文中进行了完整阐述一样。

参考文献

1.Appelbaum，F.R.2001.造血细胞移植作为免疫疗法(Haematopoietic celltransplantation as immunotherapy).《自然》(Nature)411：385-389.

2.Martin，P.J.1993.供体CD8细胞可预防小鼠的同种异体骨髓移植排斥反应：对人类骨髓移植的潜在影响(Donor CD8 cells prevent allogeneic marrow graft rejectionin mice：potential implications for marrow transplantation in humans).《实验医学杂志》(J Exp Med)178：703-712.

3.Ferrara，J.L.，Levine，J.E.，Reddy，P.，和Holler，E.2009.移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease).《柳叶刀》(Lancet)373：1550-1561.

4.Shlomchik，W.D.2007.移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease).《自然评论：免疫学》(Nat Rev Immunol)7：340-352.

5.Zeng，D.，Lewis，D.，Dejbakhsh-Jones，S.，Lan，F.，Garcia-Ojeda，M.，Sibley，R.，和Strober，S.1999.骨髓NK1.1(-)和NK1.1(+)T细胞相互调节急性移植物抗宿主病(BonemarrowNK1.1(-)andNK1.1(+)T cells reciprocally regulate acute graft versushost disease).《实验医学杂志》(J Exp Med)189：1073-1081.

6.Blazar，B.R.，Murphy，W.J.，和Abedi，M.2012.移植物抗宿主病的生物学和治疗进展(Advances in graft-versus-host disease biology and therapy).《自然评论：免疫学》(Nat Rev Immunol)12：443-458.

7.Ito，M.，和Shizuru，J.A.1999.异种造血干细胞移植模型中的移植物抗淋巴瘤作用(Graft-vs.-lymphoma effect in an allogeneic hematopoietic stem celltransplantation model).《血液与骨髓移植生物学》(Biol Blood Marrow Transplant)5：357-368.

8.Sung，A.D.，和Chao，N.J.2013.简要综述：急性移植物抗宿主病：免疫生物学，预防和治疗(Concise review：acute graft-versus-host disease：immunobiology，prevention，and treatment).Stem Cells Transl Med 2：23-32.

9.Chakraverty，R.，和Sykes，M.2007.抗原呈递细胞在引发移植物抗宿主病和移植物抗白血病中的作用(The role of antigen-presenting cells in triggering graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia).《血液》(Blood)110：9-17.

10.Zeng，D.，Hoffmann，P.，Lan，F.，Huie，P.，Higgins，J.，和Strober，S.2002.表面受体，细胞因子分泌和免疫功能的独特模式将骨髓中的T细胞与周围的T细胞区分开来：对同种异体骨髓移植的影响(Unique patterns of surface receptors，cytokine secretion，and immune functions distinguish T cells in the bone marrow from those in theperiphery：impact on allogeneic bone marrow transplantation).《血液》(Blood)99：1449-1457.

11.Wu，T.，Young，J.S.，Johnston，H.，Ni，X.，Deng，R.，Racine，J.，Wang，M.，Wang，A.，Todorov，I.，Wang，J.等人.2013.供体CD4+和CD8+ T细胞引起的胸腺损伤，阴性选择受损和慢性移植物抗宿主病的发展(Thymic damage，impaired negative selection，anddevelopment of chronic graft-versus-host disease caused by donor CD4+ and CD8+ T cells).J Immunol 191：488-499.

12.Withers，D.R.，Hepworth，M.R.，Wang，X.，Mackley，E.C.，Halford，E.E.，Dutton，E.E.，Marriott，C.L.，Brucklacher-Waldert，V.，Veldhoen，M.，Kelsen，J.，等人.2016.ROR-gammat的短暂抑制可通过减少TH17细胞并保留3组先天淋巴样细胞来治疗性地限制肠道炎症(Transient inhibition of ROR-gammat therapeutically limitsintestinal inflammation by reducing TH17 cells and preserving group 3 innatelymphoid cells).《自然医学》(Nat Med)22：319-323.

13.Yu，Y.，Wang，D.，Liu，C.，Kaosaard，K.，Semple，K.，Anasetti，C.，和Yu，X.Z.2011.通过靶向Th1和Th17转录因子T-bet和RORgammat在小鼠中预防GVHD并保留GVL作用(Prevention of GVHD while sparing GVL effect by targeting Th1 and Th17transcription factor T-bet and RORgammat in mice).《血液》(Blood)118：5011-5020.

14.Yi，T.，Zhao，D.，Lin，C.L.，Zhang，C.，Chen，Y.，Todorov，I.，LeBon，T.，Kandeel，F.，Forman，S.，和Zeng，D.2008.缺乏供体Th17会导致Th1分化增强并加剧急性移植物抗宿主病(Absence of donor Th17 leads to augmented Th1 differentiation andexacerbated acute graft-versus-host disease).《血液》(Blood)112：2101-2110.

15.Borsotti，C.，Franklin，A.R.，Lu，S.X.，Kim，T.D.，Smith，O.M.，Suh，D.，King，C.G.，Chow，A.，Liu，C.，Alpdogan，O.，等人.2007.缺乏供体T细胞衍生的可溶性TNF可降低移植物抗宿主病，而不会损害移植物抗肿瘤活性(Absence of donor T-cell-derivedsoluble TNF decreases graft-versus-host disease without impairing graft-versus-tumor activity).《血液》(Blood)110：783-786.

16.Na，I.K.，Lu，S.X.，Yim，N.L.，Goldberg，G.L.，Tsai，J.，Rao，U.，Smith，O.M.，King，C.G.，Suh，D.，Hirschhom-Cymerman，D.，等人.2010.鼠胸腺移植物抗宿主病需要溶细胞分子Fas配体和TRAIL(The cytolytic molecules Fas ligand and TRAIL are requiredfor murine thymic graft-versus-host disease).《临床研究杂志》(J Clin Invest)120：343-356.

17.Schmaltz，C.，Alpdogan，O.，Muriglan，S.J.，Kappel，B.J.，Rotolo，J.A.，Ricchetti，E.T.，Greenberg，A.S.，Willis，L.M.，Murphy，G.F.，Crawford，J.M.，等人.2003.骨髓移植后移植物抗宿主病和移植物抗肿瘤活性需要供体T细胞源性TNF(Donor Tcell-derived TNF is required for graft-versus-host disease and graft-versus-tumor activity after bone marrow transplantation).《血液》(Blood)101：2440-2445.

18.Graubert，T.A.，Russell，J.H.，和Ley，T.J.1996.颗粒酶B在急性移植物抗宿主病和移植物排斥反应的小鼠模型中的作用(The role of granzyme B in murine models ofacute graft-versus-host disease and graft rejection).《血液》(Blood)87：1232-1237.

19.Graubert，T.A.，DiPersio，J.F.，Russell，J.H.，和Ley，T.J.1997.穿孔素/粒酶依赖和独立机制对于鼠骨髓移植后移植物抗宿主病的发展均很重要(Perforin/granzyme-dependent and independent mechanisms are both important for the developmentof graft-versus-host disease after murine bone marrow transplantation).《临床研究杂志》(J Clin Invest)100：904-911.

20.Chen，L.，和Flies，D.B.2013.T细胞共刺激和共抑制的分子机制(Molecularmechanisms of T cell co-stimulation and co-inhibition).《自然评论：免疫学》(NatRev Immunol)13：227-242.

21.Butte，M.J.，Keir，M.E.，Phamduy，T.B.，Sharpe，A.H.，和Freeman，G.J.2007.程序性死亡1配体1与B7-1共刺激分子特异性相互作用以抑制T细胞反应(Programmed death-1ligand 1interacts specifically with the B7-1 costimulatory molecule toinhibit T cell responses).《免疫》(Immunity)27：111-122.

22.Dong，H.，Zhu，G.，Tamada，K.，和Chen，L.1999.B7家族的第三个成员B7-H1共同刺激T细胞增殖和白介素10分泌(B7-H1，a third member of the B7 family，co-stimulatesT-cell proliferation and interleukin-10 secretion).《自然医学》(Nat Med)5：1365-1369.

23.Yi，T.，Li，X.，Yao，S.，Wang，L.，Chen，Y.，Zhao，D.，Johnston，H.F.，Young，J.S.，Liu，H.，Todorov，I.，等人.2011.宿主APC通过同种异体受体中的B7H1/B7.1增强供体自然调节性T细胞的体内扩增(Host APCs augment in vivo expansion of donor naturalregulatory T cells via B7H1/B7.1in allogeneic recipients).J Immunol 186：2739-2749.

24.Schildberg，F.A.，Klein，S.R.，Freeman，G.J.，和Sharpe，A.H.2016.B7-CD28配体受体家族的共抑制途径(Coinhibitory Pathways in the B7-CD28 Ligand-ReceptorFamily).《免疫》(Immunity)44：955-972.

25.Keir，M.E.，Butte，M.J.，Freeman，G.J.，和Sharpe，A.H.2008.PD-1及其配体的耐受性和免疫性(PD-1 and itsligands in tolerance and immunity).Annu Rev Immunol26：677-704.

26.Park，J.J.，Omiya，R.，Matsumura，Y.，Sakoda，Y.，Kuramasu，A.，Augustine，M.M.，Yao，S.，Tsushima，F.，Narazaki，H.，Anand，S.，等人.2010.B7-H1/CD80相互作用是诱导和维持外周T细胞耐受性所必需的(B7-H1/CD80 interaction is required for theinduction and maintenance of peripheral T-cell tolerance).《血液》(Blood)116：1291-1298.

27.Li，X.，Deng，R.，He，W.，Liu，C.，Wang，M.，Young，J.，Meng，Z.，Du，C.，Huang，W.，Chen，L.，等人.2012.受体实质细胞B7-H1表达的丧失会导致供体CD8+ T细胞浸润的扩大以及移植物抗宿主病的持续存在(Loss of B7-H1 expression by recipient parenchymalcells leads to expansion of infiltrating donor CD8+ T cells and persistenceof graft-versus-host disease).J Immunol 188：724-734.

28.Saha，A.，Aoyama，K.，Taylor，P.A.，Koehn，B.H.，Veenstra，R.G.，Panoskaltsis-Mortari，A.，Munn，D.H.，Murphy，W.J.，Azuma，M.，Yagita，H.，等人.2013.在调节移植物抗宿主疾病致死率方面，宿主程序性死亡配体1在编程性死亡配体2的表达中占主导地位(Hostprogrammed death ligand 1 is dominant over programmed death ligand 2expression in regulating graft-versus-host disease lethality).《血液》(Blood)122：3062-3073.

29.Yi，T.，Chen，Y.，Wang，L.，Du，G.，Huang，D.，Zhao，D.，Johnston，H.，Young，J.，Todorov，I.，Umetsu，D.T.，等人.2009.移植物抗宿主病中Th1，Th2和Th17细胞的相互分化和组织特异性发病机制(Reciprocal differentiation and tissue-specificpathogenesis of Th1，Th2，and Th17 cells in graft-versus-host disease).《血液》(Blood)114：3101-3112.

30.Saha，A.，O′Connor，R.S.，Thangavelu，G.，Lovitch，S.B.，Dandamudi，D.B.，Wilson，C.B.，Vincent，B.G.，Tkachev，V.，Pawlicki，J.M.，Furlan，S.N.，等人.2016.供体T细胞上编程的死亡配体-1表达驱动移植物抗宿主疾病致死率(Programmed death ligand-1 expression on donor T cells drives graft-versus-host disease lethality).《临床研究杂志》(J Clin Invest)126：2642-2660.

31.Deng，R.，Cassady，K.，Li，X.，Yao，S.，Zhang，M.，Racine，J.，Lin，J.，Chen，L.，和Zeng，D.2015.B7H1/CD80相互作用增强了PD-1依赖性T细胞凋亡并改善了移植物抗宿主病(B7H1/CD80 interaction augments PD-1-dependent T cell apoptosis andameliorates graft-versus-host disease).J Immunol 194：560-574.

32.Flutter，B.，Edwards，N.，Fallah-Arani，F.，Henderson，S.，Chai，J.G.，Sivakumaran，S.，Ghorashian，S.，Bennett，C.L.，Freeman，G.J.，Sykes，M.，等人.2010.非造血性抗原会阻断同种反应性CD8+ T细胞的记忆编程，并在骨髓移植小鼠模型中驱动其最终衰竭(Nonhematopoietic antigen blocks memory programming of alloreactive CD8+ T cells and drives their eventual exhaustion in mouse models of bone marrowtransplantation).《临床研究杂志》(J Clin Invest)120：3855-3868.

33.Asakura，S.，Hashimoto，D.，Takashima，S.，Sugiyama，H.，Maeda，Y.，Akashi，K.，Tanimoto，M.，和Teshima，T.2010.非造血细胞上的同种抗原表达降低了小鼠的移植物抗白血病作用(Alloantigen expression on non-hematopoietic cells reduces graft-versus-leukemia effects in mice).《临床研究杂志》(J Clin Invest)120：2370-2378.

34.Habicht，A.，Kewalaramani，R.，Vu，M.D.，Demirci，G.，Blazar，B.R.，Sayegh，M.H.，和Li，X.C.2007.PD-L1和PD-L2途径在体内调节同种反应性CD4(+)和CD8(+)T细胞方面的惊人二分法(Striking dichotomy ofPD-L1and PD-L2 pathways in regulatingalloreactive CD4(+)and CD8(+)T cells in vivo).Am J Transplant 7：2683-2692.

35.Edinger，M.，Hoffmann，P.，Ermann，J.，Drago，K.，Fathman，C.G.，Strober，S.，和Negrin，R.S.2003.CD4+CD25+调节性T细胞保留了移植物抗肿瘤活性，同时抑制了骨髓移植后的移植物抗宿主病(CD4+CD25+regulatory T cells preserve graft-versus-tumoractivity while inhibiting graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation).《自然医学》(Nat Med)9：1144-1150.

36.Zhang，C.，Lou，J.，Li，N.，Todorov，I.，Lin，C.L.，Cao，Y.A.，Contag，C.H.，Kandeel，F.，Forman，S.，和Zeng，D.2007.供体CD8+ T细胞介导以抗CD3单克隆抗体为条件的接受者的移植物抗白血病活性而无移植物抗宿主病的临床迹象(Donor CD8+ T cellsmediate graft-versus-leukemia activity without clinical signs of graft-versus-host disease in recipients conditioned with anti-CD3 monoclonalantibody).J Immunol 178：838-850.

37.Matte-Martone，C.，Venkatesan，S.，Tan，H.S.，Athanasiadis，I.，Chang，J.，Pavisic，J.，和Shlomchik，W.D.2011.移植物抗白血病(GVL)对抗小鼠胚芽危机，慢性粒细胞性白血病(BC-CML)和慢性期慢性粒细胞性白血病(CP-CML)：T细胞杀伤的共同机制，但程序性死亡配体使CP-CML和不耐BC-CML GVL(Graft-versus-leukemia(GVL)against mouseblast-crisis chronic myelogenous leukemia(BC-CML)and chronic-phase chronicmyelogenous leukemia(CP-CML)：shared mechanisms of T cell killing，butprogrammed death ligands render CP-CML and not BC-CML GVL resistant).JImmunol187：1653-1663.

38.Sykes，M.，Szot，G.L.，Nguyen，P.L.，和Pearson，D.A.1995.白介素12抑制小鼠移植物抗宿主病(Interleukin-12inhibits murine graft-versus-host disease).《血液》(Blood)86：2429-2438.

39.Hatano，R.，Ohnuma，K.，Yamamoto，J.，Dang，N.H.，Yamada，T.，和Morimoto，C.2013.人源化抗CD26单克隆抗体预防急性移植物抗宿主病(Prevention of acute graft-versus-host disease by humanized anti-CD26 monoclonal antibody).Br J Haematol162：263-277.

40.Matsushima，K.，Ueha，S.，和Shono，Y.2015.用于感染的免疫重建促进剂或预防剂，每种都维持移植物抗肿瘤作用(Immunological reconstitution promoter orprophylactic agent for infections each of which maintains graft-versus-tumoreffect).Google Patents.

41.Hill，G.R.，和Ferrara，J.L.2000.胃肠道作为急性移植物抗宿主病的靶器官的首要地位：在异基因骨髓移植中使用细胞因子屏蔽的基本原理(The primacy of thegastrointestinal tract as a target organ of acute graft-versus-host disease：rationale for the use of cytokine shields in allogeneic bone marrowtransplantation).《血液》(Blood)95：2754-2759.

42.Yi，T.，Chen，Y.，Wang，L.，Du，G.，Huang，D.，Zhao，D.，Johnston，H.，Young，J.，Todorov，I.，Umetsu，D.，等人.2009.移植物与宿主疾病中Th1，Th2和Th17细胞的相互分化和组织特异性发病机制(Reciprocal differentiation and tissue-specificpathogenesis of Th1，Th2，and Th17 cells in graft versus host disease).《血液》(Blood)114：3101-3112.

43.Choi，J.，Ziga，E.D.，Ritchey，J.，Collins，L.，Prior，J.L.，Cooper，M.L.，Piwnica-Worms，D.，和DiPersio，J.F.2012.IFNgammaR信号传导介导同种反应性T细胞运输和GVHD(IFNgammaR sighaling mediates alloreactive T-cell trafficking andGVHD).《血液》(Blood)120：4093-4103.

44.Coghill，J.M.，Sarantopoulos，S.，Moran，T.P.，Murphy，W.J.，Blazar，B.R.，和Serody，J.S.2011.效应器CD4+ T细胞，它们产生的细胞因子和GVHD：有旧有新(EffectorCD4+ T cells，the cytokines they generate，and GVHD：something old and somethingnew).《血液》(Blood)117：3268-3276.

45.Koyama，M.，Cheong，M.，Markey，K.A.，Gartlan，K.H.，Kuns，R.D.，Locke，K.R.，Lineburg，K.E.，Teal，B.E.，Leveque-El Mouttie，L.，Bunting，M.D.，等人.2015.供体结肠CD103+树突状细胞决定急性移植物抗宿主病的严重程度(Donor colonic CD103+dendritic cells determine the severityofacute graft-versus-hostdisease).《实验医学杂志》(J Exp Med)212：1303-1321.

46.Eriguchi，Y.，Takashima，S.，Oka，H.，Shimoji，S.，Nakamura，K.，Uryu，H.，Shimoda，S.，Iwasaki，H.，Shimono，N.，Ayabe，T.，等人.2012.移植物抗宿主病通过抑制Paneth细胞产生α-防御素来破坏肠道微生物生态(Graft-versus-host disease disruptsintestinal microbial ecology by inhibiting Paneth cell production of alpha-defensins).《血液》(Blood)120：223-231.

47.Hanash，A.M.，Dudakov，J.A.，Hua，G.，O′Connor，M.H.，Young，L.F.，Singer，N.V.，West，M.L.，Jenq，R.R.，Holland，A.M.，Kappel，L.W.，等人.2012.白介素22保护肠道干细胞免受免疫介导的组织损伤并调节对移植物抗宿主疾病的敏感性(Interleukin-22protects intestinal stem cells from immune-mediated tissue damage andregulates sensitivity to graft versus host disease).《免疫》(Immunity)37：339-350.

48.Pearce，E.L.，Mullen，A.C.，Martins，G.A.，Krawczyk，C.M.，Hutchins，A.S.，Zediak，V.P.，Banica，M.，DiCioccio，C.B.，Gross，D.A.，Mao，C.A.，等人.2003.转录因子Eomesodermin对效应CD8+ T细胞功能的控制(Control of effector CD8+ T cellfunction by the transcription factor Eomesodermin).《科学》(Science)302：1041-1043.

49.Paley，M.A.，Kroy，D.C.，Odorizzi，P.M.，Johnnidis，J.B.，Dolfi，D.V.，Barnett，B.E.，Bikoff，E.K.，Robertson，E.J.，Lauer，G.M.，Reiner，S.L.，等人.2012.CD8+ T细胞的祖细胞和终末亚群协同控制慢性病毒感染(Progenitor and terminal subsets of CD8+T cells cooperate to contain chronic viralinfection).《科学》(Science)338：1220-1225.

50.Intlekofer，A.M.，Takemoto，N.，Wherry，E.J.，Longworth，S.A.，Northrup，J.T.，Palanivel，V.R.，Mullen，A.C.，Gasink，C.R.，Kaech，S.M.，Miller，J.D.，等人.2005.T-bet和eomesodermin偶联效应子和记忆CD8+ T细胞的命运(Effector and memory CD8+ Tccll fate coupled by T-bet and eomesodermin).《自然免疫学》(Nat Immunol)6：1236-1244.

51.Carbotti，G.，Barisione，G.，Airoldi，I.，Mezzanzanica，D.，Bagnoli，M.，Ferrero，S.，Petretto，A.，Fabbi，M.，和Ferrini，S.2015.IL-27诱导人癌细胞中IDO和PD-L1的表达(IL-27 induces the expression of IDO and PD-L1 in human cancercells).《肿瘤标靶》(Oncotarget)6：43267-43280.

52.Michonneau，D.，Sagoo，P.，Breart，B.，Garcia，Z.，Celli，S.，和Bousso，P.2016.PD-1轴增强了CTL活动的解剖隔离，该移植在异基因造血干细胞移植后形成了肿瘤Ni(The PD-1 Axis Enforces an Anatomical Segregation of CTL Activity thatCreates Tumor Niches after Allogeneic Hematopoietic Stem CellTransplantation).《免疫》(Immunity)44：143-154.

53.Socie，G.，和Ritz，J.2014.慢性移植物抗宿主病的当前问题(Current issues inchronic graft-versus-host disease).《血液》(Blood)124：374-384.

54.Blazar，B.R.，Carreno，B.M.，Panoskaltsis-Mortari，A.，Carter，L.，Iwai，Y.，Yagita，H.，Nishimura，H.，和Taylor，P.A.2003.程序性死亡-1参与的阻断通过IFN-γ依赖性机制加速了移植物抗宿主病的致死性(Blockade of programmed death-1 engagementaccelerates graft-versus-host disease lethality by an IFN-gamma-dependentmechanism).J Immunol 171：1272-1277.

55.Yang，Y.G.，Qi，J.，Wang，M.G.，和Sykes，M.2002.供体来源的干扰素γ分离了供体CD8 T细胞诱导的移植物抗白血病效应和移植物抗宿主病(Donor-derived interferongamma separates graft-versus-leukemia effects and graft-versus-host diseaseinduced by donor CD8 T cells).《血液》(Blood)99：4207-4215.

56.Jasperson，L.K.，Bucher，C.，Panoskaltsis-Mortari，A.，Mellor，A.L.，Munn，D.H.，和Blazar，B.R.2009.诱导色氨酸分解代谢途径，吲哚胺2，3-二加氧酶(IDO)，抑制移植物抗宿主病(GVHD)致死率(Inducing the tryptophan catabolic pathway，indoleamine 2，3-dioxygenase(IDO)，for suppression of graft-versus-host disease(GVHD)lethality).《血液》(Blood)114：5062-5070.

57.Shono，Y.，Ueha，S.，Wang，Y.，Abe，J.，Kurachi，M.，Matsuno，Y.，Sugiyama，T.，Nagasawa，T.，Imamura，M.，和Matsushima，K.2010.骨髓移植物抗宿主病：MHC不匹配的造血干细胞移植后造血生态位的早期破坏(Bone marrow graft-versus-host disease：earlydestruction of hematopoietic niche after MHC-mismatched hematopoietic stemcell transplantation).《血液》(Blood)115：5401-5411.

58.Hoffmann，P.，Ermann，J.，Edinger，M.，Fathman，C.G.，和Strober，S.2002.供体型CD4(+)CD25(+)调节性T细胞抑制同种异体骨髓移植后的致死性急性移植物抗宿主病(Donor-type CD4(+)CD25(+)regulatory T cells suppress lethal acute graft-versus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation).《实验医学杂志》(J Exp Med)196：389-399.

59.Carter，L.，Fouser，L.A.，Jussif，J.，Fitz，L.，Deng，B.，Wood，C.R.，Collins，M.，Horjo，T.，Freeman，G.J.，和Carreno，B.M.2002.PD-1：PD-L抑制途径影响CD4(+)和CD8(+)T细胞，并被IL-2克服(PD-1：PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)Tcells and is overcome by IL-2).Eur J Immunol 32：634-643.

60.Pulko，V.，Harris，K.J.，Liu，X.，Gibbons，R.M.，Harrington，S.M.，Krco，C.J.，Kwon，E.D.，和Dong，H.2011.活化的CD8 T细胞表达的B7-h1对它们的生存至关重要(B7-h1expressed by activated CD8 T cells is essential for their survival).J Immunol187：5606-5614.

61.Mueller，S.N.，Vanguri，V.K.，Ha，S.J.，West，E.E.，Keir，M.E.，Glickman，J.N.，Sharpe，A.H.，和Ahmed，R.2010.PD-L1在造血和非造血细胞中具有独特的功能，可调节小鼠慢性感染期间的T细胞反应(PD-L1 has distinct functions in hematopoietic andnonhematopoietic cells in regulating T cell responses during chronicinfection in mice).《临床研究杂志》(J Clin Invest)120：2508-2515.

62.Martin，P.J.，Rowley，S.D.，Anasetti，C.，Chauncey，T.R.，Gooley，T.，Petersdorf，E.W.，van Burik，J.A.，Flowers，M.E.，Storb，R.，Appelbaum，F.R.，等人.1999.I-II期临床试验，用于评估供体骨髓中HLA不匹配的无关受体的CD4细胞去除和CD8细胞的部分耗竭(A phase I-II clinical trial to evaluate removal of CD4 cellsand partial depletion of CD8 cells from donor marrow for HLA-mismatchedunrelated recipients).《血液》(Blood)94：2192-2199.

63.Li，N.，Chen，Y.，He，W.，Yi，T.，Zhao，D.，Zhang，C.，Lin，C.L.，Todorov，I.，Kandeel，F.，Forman，S.，等人.2009.抗CD3预处理可通过调节宿主TBI调节的宿主树突状细胞和供体T细胞迁移来将GVL与GVHD分离(Anti-CD3 preconditioning separates GVLfrom GVHD via modulating host dendritic cell and donor T-cell migration inrecipients conditioned with TBI).《血液》(Blood)113：953-962.

64.Fowler，D.H.，Breglio，J.，Nagel，G.，Eckhaus，M.A.，和Gress，R.E.1996.移植物抗白血病作用和移植物抗宿主病的同种异体CD8+Tc1和Tc2群体(Allospecific CD8+ Tc1and Tc2 populations in graft-versus-leukemia effect and graft-versus-hostdisease).J Immunol 157：4811-4821.

65.Yang，Y.G.，Dey，B.R.，Sergio，J.J.，Pearson，D.A.，和Sykes，M.1998.白细胞介素12抑制急性移植物抗宿主病需要供体来源的干扰素γ(Donor-derived interferon gammais required fbr inhibition of acute graft-versus-host disease by interleukin12).临床研究杂志(J Clin Invest)102：2126-2135.

66.Yang，Y.，Wang，H.，Yu，H.，Yeap，B.Y.，Liang，T.，Wang，G.，Cheng，T.，和Yang，Y.G.2011.异基因造血细胞移植后，IFN-γ可促进移植物抗白血病作用，而不会与小鼠中的白血病细胞直接相互作用(IFN-gamma promotes graft-versus-leukemia effectswithout directly interacting with leukemia cells in mice after allogeneichematopoietic cell transplantation).《血液》(Blood)118：3721-3724.

67.Yamazaki，T.，Akiba，H.，Iwai，H.，Matsuda，H.，Aoki，M.，Tanno，Y.，Shin，T.，Tsuchiya，H.，Pardoll，D.M.，Okumura，K.，等人.2002.小鼠T细胞和APC程序性死亡1配体的表达(Expression ofprogrammed death 1 ligands by murine T cells and APC).JImmunol 169：5538-5545.

68.Donaldson，J.，Zer C.，Avery K.，Bzymek K.，Horne D.，和Williams J.2013.在单克隆抗体的Fab框架中鉴定和移植独特的肽结合位点(Identification and grafting ofa unique peptide-binding site in the Fab frame work of monoclonalantibodies).PNAS 110(43)：17456-17461.

69.Sykes M.，Abraham V.，Harty M.和Pearson D.1993.IL-2通过选择性抑制CD4+T细胞活性来减少移植物抗宿主病并保留移植物抗白血病作用(IL-2 reduces graft-versus-host disease and preserves a graft-versus-leukemia effect by selectivelyinhibiting CD4+ T cell activity).J.Immunology 150：197-205.

70.Kekre N.，Antin JH.2016.移植物抗宿主病的新兴药物(Emerging drugs forgraft-versus-host disease).Expert Opin.Emerg.Drugs 21(2)：209-218.

71.Scandiuzzi，L.，Ghosh，K.，Hofmeyer，K.A.，Abadi，Y.M.，Lazar-Molnar，E.，Lin，E.Y.，Liu，Q.，Jeon，H.，Almo，S.C.，Chen，L.，等人.2014.组织表达的B7-H1可严格控制肠道炎症(Tissue-expressed B7-H1 critically controls intestinal inflammation).CellRep 6：625-632.

72.Sakuishi，K.，Apetoh，L.，Sullivan，J.M.，Blazar，B.R.，Kuchroo，V.K.，和Anderson，A.C.2010.靶向Tim-3和PD-1通路以逆转T细胞衰竭并恢复抗肿瘤免疫力(Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restoreanti-tumor immunity).《实验医学杂志》(J Exp Med)207：2187-2194.

73.Whiting，C.C.，Su，L.L.，Lin，J.T.，和Fathman，C.G.2011.GRAIL：CD4 T淋巴细胞无反应性的独特介体(GRAIL：a unique mediator of CD4 T-lymphocyteunresponsiveness).FEBS J 278：47-58.

74.Schietinger，A.，和Greenberg，P.D.2014.耐受和衰竭：定义T细胞功能障碍的机制(Tolerance and exhaustion：defining mechanisms of T cell dysfunction).《免疫趋势》(Trends Immunol)35：51-60.

75.Wherry，E.J.2011.T细胞衰竭(T cell exhaustion).《自然免疫学》(Nat Immunol)12：492-499.

76.Anasetti等人.1991，《骨髓移植》(Bone Marrow Transplant)7(5)：375-381.

77.Ferrant等人.1995，《骨髓移植》(Bone Marrow Transplant)16(4)：577-581.

序列表

<110> 希望之城

<120> 用于CD8+ T细胞的体内扩增并预防或治疗GVHD的方法

<130> 054435-8144.WO00

<150> US 62/462,853

<151> 2017-02-23

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 1

ttaccagcac aggatcaaat gg 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 2

cggaagtaga atctcacagc ac 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 3

tccttttggg catcatcttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 4

ttccccctct tttgcttttt 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 5

cgatgacggg ccagtgagaa tg 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 6

tcaacacgtg ggcaggatag gct 23

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 7

agtaacggct gcgacaaagt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 8

gcatgttcca agacagcaga 20

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向引物

<400> 9

tcaccaccat ggagaaggc 19

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向引物

<400> 10

gctaagcagt tggtggtgca 20

Claims (49)

1.一种在接受造血细胞移植(HCT)的受试者中预防或治疗移植物抗宿主疾病(GVHD)但保留移植物抗白血病/淋巴瘤(GVL)效应的方法，包括将一剂或更多剂治疗有效量的治疗剂施用于受试者以在体内暂时消耗CD4+T细胞或暂时减少受试者中的血清IL-2，其中在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，或进行HCT后即刻将治疗剂施用于受试者。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述治疗剂包括抗CD4抗体，抗CD4中间位免疫毒素，抗IL-2抗体，阻断IL-2R的药剂，和PD-L1-Ig。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述抗CD4抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

4.如权利要求2所述的方法，其中，所述抗IL-2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

5.如权利要求1所述的方法，还包括向受试者施用一剂或更多剂的IFN-γ。

6.如权利要求1所述的方法，其中，在HCT前约10天以内将第一剂治疗剂施用于受试者。

7.如权利要求1所述的方法，其中，在HCT前约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，或约10天将第一剂治疗剂施用于受试者。

8.如权利要求1所述的方法，其中，在HCT后约6周以内的任意时间将第一剂治疗剂施用于受试者。

9.如权利要求1所述的方法，其中，在HCT后约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约3周，约4周，约5周，或约6周将第一剂治疗剂施用于受试者。

10.如权利要求1所述的方法，其中，将单一剂量的治疗剂施用于受试者以有效预防急性GVHD。

11.如权利要求10所述的方法，其中，在接受HCT的同一天将单一剂量的治疗剂施用于受试者。

12.如权利要求1所述的方法，其中，将两剂或更多剂治疗剂施用于受试者以有效预防急性GVHD和慢性GVHD这两者。

13.如权利要求12所述的方法，其中，将三剂治疗剂施用于受试者。

14.如权利要求13所述的方法，其中，在接受HCT后一个月内将三剂治疗剂施用于受试者。

15.如权利要求13所述的方法，其中，以一周或两周的间隔将三剂治疗剂施用于受试者。

16.如权利要求13所述的方法，其中，在接受HCT的同一天将第一剂治疗剂施用于受试者。

17.在接受HCT的受试者中进行体内扩增CD8+T细胞的方法，包括将一剂或更多剂治疗有效量的治疗剂施用于受试者以在体内暂时消耗CD4⁺T细胞或暂时减少受试者中的血清IL-2，其中在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，或进行HCT后即刻将治疗剂施用于受试者。

18.如权利要求17所述的方法，其中，所述治疗剂包括抗CD4抗体，抗CD4中间位免疫毒素，抗IL-2抗体，阻断IL-2R的药剂，和PD-L1-Ig。

19.如权利要求18所述的方法，其中，抗CD4抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

20.如权利要求18所述的方法，其中，抗IL-2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

21.如权利要求17所述的方法，其中，在HCT前约10天以内将第一剂治疗剂施用于受试者。

22.如权利要求17所述的方法，其中，在HCT前约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，或约10天将第一剂治疗剂施用于受试者。

23.如权利要求17所述的方法，其中，在HCT后约6周以内的任意时间将第一剂治疗剂施用于受试者。

24.如权利要求17所述的方法，其中，在HCT后约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约3周，约4周，约5周，或约6周将第一剂治疗剂施用于受试者。

25.如权利要求17所述的方法，其中，在接受HCT的同一天将第一剂治疗剂施用于受试者。

26.如权利要求17所述的方法，其中，以一周或两周的间隔将两剂或更多剂治疗剂施用于受试者。

27.如权利要求17所述的方法，其中，与未接受治疗剂的对照受试者中的CD8⁺T细胞相比，扩增的CD8⁺T细胞产生增加量的IFN-γ。

28.如权利要求17所述的方法，其中，CD8+T细胞在受试者的淋巴组织中选择性扩增。

29.一种在接受造血细胞移植(HCT)的受试者中预防或治疗GVHD并增强胸腺恢复的方法，包括将一剂或更多剂治疗有效量的治疗剂施用于受试者以在体内暂时消耗CD4+T细胞或暂时减少受试者中的血清IL-2，其中在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，或进行HCT后即刻将治疗剂施用于受试者。

30.如权利要求29所述的方法，其中，CD4+T细胞在移植物中消耗以及在重新生成的过程中消耗。

31.如权利要求29所述的方法，其中，CD4+T细胞在HCT后约60天至约120天的期间内消耗。

32.如权利要求29所述的方法，其中，治疗剂包括抗CD4抗体，抗CD4中间位免疫毒素，抗IL-2抗体，阻断IL-2R的药剂，以及与PD-1和CD80这两者相互作用的拮抗PD-L1-Ig。

33.如权利要求32所述的方法，其中，抗CD4抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

34.如权利要求32所述的方法，其中，抗IL-2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

35.如权利要求29所述的方法，还包括将一剂或更多剂IFN-γ施用于受试者。

36.如权利要求29所述的方法，其中，在HCT前约10天以内将第一剂治疗剂施用于受试者。

37.如权利要求29所述的方法，其中，在HCT前约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，或约10天将第一剂治疗剂施用于受试者。

38.如权利要求29所述的方法，其中，在HCT后约6周以内的任意时间将第一剂治疗剂施用于受试者。

39.如权利要求29所述的方法，其中，在HCT后约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约3周，约4周，约5周，或约6周将第一剂治疗剂施用于受试者。

40.如权利要求29所述的方法，其中，在接受HCT的同一天将第一剂治疗剂施用于受试者。

41.一种在接受造血细胞移植(HCT)的受试者中增强程序性死亡-配体1(PD-L1)的接受者组织表达的方法，包括将一剂或更多剂治疗有效量的治疗剂施用于受试者以在体内暂时消耗CD4+T细胞或暂时减少受试者中的血清IL-2，其中在进行HCT的同时，即将进行HCT之前，或进行HCT后即刻将治疗剂施用于受试者。

42.如权利要求41所述的方法，其中，治疗剂包括抗CD4抗体，抗CD4中间位免疫毒素，抗IL-2抗体，和阻断IL-2R的药剂。

43.如权利要求42所述的方法，其中，抗CD4抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

44.如权利要求42所述的方法，其中，抗IL-2抗体是单克隆抗体或人源化抗体。

45.如权利要求41所述的方法，其中，在HCT前约10天以内将第一剂治疗剂施用于受试者。

46.如权利要求41所述的方法，其中，在HCT前约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，或约10天将第一剂治疗剂施用于受试者。

47.如权利要求41所述的方法，其中，在HCT后约6周以内的任意时间将第一剂治疗剂施用于受试者。

48.如权利要求41所述的方法，其中，在HCT后约1小时，约2小时，约3小时，约4小时，约5小时，约6小时，约7小时，约8小时，约9小时，约10小时，约11小时，约12小时，约24小时，约2天，约3天，约4天，约5天，约6天，约7天，约8天，约9天，约10天，约11天，约12天，约13天，约14天，约3周，约4周，约5周，或约6周将第一剂治疗剂施用于受试者。

49.如权利要求41所述的方法，其中，在接受HCT的同一天将第一剂治疗剂施用于受试者。

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