CN109069539A - 用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法 - Google Patents

用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法 Download PDF

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Abstract

本文公开的组合物及其方法用于抑制或降低经受CAR T细胞疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率，其中所述受试者被施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物。在某些情况下，本文公开的组合物及其方法不降低CAR T细胞疗法的功效。本文还公开了用于抑制或降低经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的受试者中细胞因子产生的组合物和方法，包括施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物。

Description

用于癌症治疗的联合免疫疗法和细胞因子控制疗法
技术领域
本文公开了用于在CAR T细胞癌疗法期间维持或增加表达嵌合抗原受体的T细胞的增殖率的组合物及其方法。此外，本文公开了增加嵌合抗原受体T细胞癌症疗法的功效的组合物及其方法，其中，受试者经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率得以降低或抑制。本文所公开的方法包括：包含施用CAR T细胞和附加剂方法，该附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或免疫调节剂、或其任何组合。
背景技术
虽然癌症的标准治疗是手术，化学疗法和放射疗法，但目前正在开发和测试改进的方法，诸如靶向免疫疗法。一种很有前景的的技术使用了过继细胞转移(ACT)，其中免疫细胞进行了修饰以识别和攻击它们的肿瘤。ACT的一个实例是当患者自身的细胞毒性T细胞或供体被工程改造以表达靶向肿瘤细胞表面上表达的肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR T细胞)。然后，这些CAR T细胞仅对表达肿瘤特异性抗原的细胞具有细胞毒性。临床试验已经表明，CAR T细胞疗法在控制晚期急性淋巴细胞白血病(ALL)和淋巴癌等疾病方面具有巨大潜力。
然而，一些施用CAR T细胞疗法和其他免疫疗法的患者会发生危险且有时常常是危及生命的副作用，该副作用称为细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴，其中输注的活化T细胞产生了细胞因子快速且大量释放到血流中的全身炎症反应，从而导致危险的低血压，高烧和寒战。
在严重的CRS情况下，患者会发生细胞因子风暴(也称之为细胞因子级联或高细胞因子血症)，其中在细胞因子和具有高水平细胞因子的白细胞之间存在正反馈回路。这会导致潜在危及生命的并发症，该并发症包括心脏功能障碍，成人呼吸窘迫综合征，神经毒性，肾和/或肝衰竭，肺水肿和弥散性血管内凝血。
例如，在最近的I期临床试验中，施用与T细胞上的CD28受体结合的单克隆抗体TGN1412的6名患者，显示为严重细胞因子风暴和多器官衰竭的情况。尽管TGN1412剂量比动物安全剂量低500倍，但仍然发生了这种情况(St.Clair EW:The calm after thecytokine storm:Lessons from the TGN1412trial.JClin Invest118:1344-1347,2008)。
具有对CD19特异性的嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞已显示出高度抗难治性血液恶性肿瘤的显着前景。据报道，患有复发/难治性急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和成人的临床反应完全缓解率高达90％。然而，现在已经观察到非常显著的毒性，并且多达30％的施用CAR-T细胞的受试者出现严重的CRS情形和可能的相关神经毒性。CRS是由于主要来自巨噬细胞/单核细胞的促炎细胞因子的大量分泌而发生，并且类似于巨噬细胞活化综合征和噬血细胞增多症，其响应于CAR-T分泌干扰素-γ(IFN-γ)和可能的其他细胞因子。
迄今为止，正在评估皮质类固醇，诸如抗IL6疗法的生物疗法和抗炎药以控制施用CAR T细胞疗法的患者的细胞因子释放综合征。然而，类固醇可能影响CAR T细胞的活性和/或增殖，并使患者处于败血症和机会性感染的危险之中。抗炎药可能无法有效控制细胞因子释放综合征或细胞因子风暴，因为细胞因子风暴包括非常大量的细胞因子，而向患者输注抗炎药受到了限制。需要新的策略来控制细胞因子释放综合征，尤其是细胞因子风暴，以实现CAR T细胞疗法的潜力。
在其他感染性和非感染性刺激之后，细胞因子风暴也是一个问题。在细胞因子风暴中，许多促炎性细胞因子，诸如白细胞介素-1(IL-1)，IL-6，干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNFα)被释放，导致低血压，出血，最终导致多器官衰竭。此外，IFN-γ还激发巨噬细胞，反过来，其可以分泌大量的促炎性细胞因子，包括IL-6和TNF-α。
CRS是与CAR T细胞相关的最常见的潜在严重毒性，但它发生在与T细胞一起杀死癌细胞的其他疗法中，其他疗法包括双特异性T细胞结合(BiTE)抗体诸如blinatumomab，甚至发生在非T细胞疗法诸如利妥昔单抗中。然而，80-100％的患者中发生CAR T细胞是独特的，其中30％的ALL患者有严重的毒性，在某些患者中这可能是致命的。
在1918年H1N1流感大流行和最近的禽流感H5N1感染中，可能具有健康免疫系统的年轻人有相对高的死亡率，这归因于细胞因子风暴。还已知该综合征发生在严重急性呼吸综合征(SARS)，Epstein-Barr病毒相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增多症，革兰氏阴性败血症，疟疾和许多其他传染病(包括埃博拉病毒感染)的晚期或终末病例中。细胞因子风暴也可能源于非感染性原因，诸如急性胰腺炎，严重烧伤或创伤，或急性呼吸窘迫综合征。
神经毒性可以单独地或作为综合征的一部分来考虑，包括精神状态改变，可逆性谵妄和类似癫痫发作的活动。患者可能会逐渐出现混乱、找词困难和失语症，最终变得迟钝。在这三种情况下，这些神经系统并发症需要插管和机械通气以保护气道。对患有神经系统并发症的患者进行脑部CT和MRI评估，除了可能的脑白质病在某些情况下，以及脑电图(EEG)和腰椎穿刺外，并没有发现变化。脑电图证实有癫痫样活动，在抗癫痫治疗后消退。通过腰椎穿刺获得在明显发生神经系统并发症时的三名患者的脑脊液(CSF)，分析显示淋巴细胞增多，通过进一步的qPCR分析，发现其由CAR T细胞组成，至少部分地由CAR T细胞组成。
尽管在CAR-T细胞输注后CRS的发生率很高，但对该综合征的潜在生物学知之甚少。该病症类似于噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)和巨噬细胞活化综合征(MAS)，并且与细胞因子和趋化因子的显着升高有关。
目前，很少有方法用于治疗CRS。托珠单抗是一种IL-6受体拮抗剂，用于治疗风湿性疾患。它被用于在临床试验中治疗CRS相关的毒性，现在广泛用于治疗CAR T细胞输注后说明书之外的毒性。托珠单抗可能在CAR T细胞输注后减轻或消除CRS相关的毒性。不受控制的研究表明，治疗ALL患者，当他们接受托珠单抗治疗由CAR T细胞引起的CRS时仍然会发生完全缓解。但是，仍然存在一些担忧，托珠单抗可能巧妙地削弱由CAR T细胞引起的抗恶性反应的深度或持续时间，因为尚未对托珠单抗对抗恶性肿瘤结果的影响进行正式研究。此外，大多数已公开的托珠单抗经验与ALL有关。托珠单抗可能损害CAR T细胞抗淋巴瘤或其他恶性肿瘤的功效，即使它不会损害CAR T细胞抗ALL的活性。
普遍的共识是，如果施用初始托珠单抗时CRS没有改善，则应施用额外剂量的托珠单抗，或者应考虑使用另一种免疫抑制剂诸如皮质类固醇。当超过特定的血液动力学和器官功能阈值时，施用托珠单抗，而不是为了某一等级的CRS。这表明，由于担心其穿过血脑屏障的能力，并且在相当少的患者中托珠单抗并没有改善神经毒性，因此托珠单抗不应应用于神经毒性。
系统性皮质类固醇已有效用于消除与CRS相关的毒性，有证据表明皮质类固醇可能抑制CAR T细胞持久性和抗恶性肿瘤的功效，正如之前在抗CD19CAR T细胞输注后ALL患者中报道的那样。为此，皮质类固醇疗法已用于托珠单抗失败后改善CRS。在CRS管理中使用或考虑的其他免疫抑制剂包括司妥昔单抗(siltuximab)，依那西普，英夫利昔单抗和阿那白滞素。由于缺乏数据，因此不建议使用二线药物。
CAR T细胞可通过几种机制引起额外的，不太显著的毒性。如果CAR靶向的肿瘤相关抗原在正常组织中表达，就像正常B细胞被抗CD19CAR T细胞耗尽，这些组织可能受损。CAR T细胞可能通过与肿瘤细胞上不表达的蛋白质意外地交叉反应而损伤正常组织。输注CAR T细胞后发生急性过敏反应和肿瘤溶解综合征(TLS)；然而，与CRS相比，这些毒性的频率要低得多。
除了影响CAR T细胞疗法安全性的因素外，多种其他因素也影响CAR T细胞的功效。功效可能取决于许多因素，包括遗传修饰的CAR T细胞的持久性和存活率，细胞剂量(因为最终稳态细胞数似乎是与患者特异性有关)和靶向抗原表达的丧失或下调。
因此需要新的策略，该策略维持或提高CAR T细胞疗法的功效，同时控制安全性问题，该安全性问题包括细胞因子释放综合征，尤其是细胞因子风暴。此外，需要开发具有和不具有CAR修饰的T细胞的CRS的体外和体内模型。本文公开了CRS的体外和体内模型，其中测试了早期凋亡细胞群对细胞因子释放和CAR T细胞毒性的有效性。
发明内容
在一方面，本文公开了在CAR T细胞癌疗法期间维持或增加表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的增殖率的方法，该方法包括给经受CAR T细胞疗法的受试者施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的步骤，并且其中与经受CAR T细胞癌疗法并且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中所述增殖率得以维持或增加。
在相关方面，该方法不会降低或抑制所述CAR T细胞癌症疗法的功效。在另一相关方面，与未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率被抑制或降低。
在相关方面，所述凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一相关方面，所述凋亡细胞与通过所述CAR T细胞疗法治疗的受试者是自体同源的，或者是合并的第三方供体细胞。
在相关方面，包含所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的所述组合物的施用发生在CAR T细胞疗法之前，同时或之后。在另一相关方面，所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的施用发生在CAR T细胞疗法之前，同时或之后。
在相关方面，凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与凋亡细胞。在另一相关方面，白细胞选自吞噬细胞，巨噬细胞，树突细胞，单核细胞，B细胞，T细胞和NK细胞。
在相关方面，与经受CAR T细胞癌症疗法且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，该方法维持或增加了受试者中IL-2的水平。
在一方面，本文公开了增加嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)癌症疗法功效的方法，该方法包括施用CAR T细胞和附加剂的步骤，该附加剂选自凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，其中，与经受CAR T细胞癌疗法并且不施用所述附加剂的受试者相比，受试者中所述CAR T细胞的所述功效得以增加。在相关方面，与接受CAR T细胞癌症疗法并且未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的促炎细胞因子水平相比，降低了至少一种促炎细胞因子的产生水平。在另一相关方面，促炎细胞因子包括IL-6。
在相关方面，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与经受CAR T细胞癌症疗法且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，该方法维持或增加了受试者中IL-2的水平。在另一相关方面，与未施用所述附加剂的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率被抑制或降低。
在相关方面，CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物中。在另一相关方面，CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在至少两种组合物中。在另一相关方面，其中所述附加剂或其任何试剂组合包含在不包括所述CAR T细胞的组合物中，包含所述一种或多种试剂的所述组合物的施用发生在所述CAR T细胞施用之前，同时或之后。
在相关方面，所述凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一相关方面，所述凋亡细胞与通过所述CAR T细胞疗法治疗的受试者是自体同源的，或者是合并的第三方供体细胞。在另一方面，包含所述试剂的所述组合物的施用发生在所述CAR T细胞施用之前，同时或之后。
在相关方面，所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与凋亡细胞。在另一相关方面，提供的白细胞选自吞噬细胞，巨噬细胞，树突细胞，单核细胞，B细胞，T细胞和NK细胞。
在一方面，本文公开了治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的方法，包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和附加剂的步骤，所述附加剂包括凋亡细胞，凋亡上清液或CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，其中与施用CAR T细胞且未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤。
在相关方面，与施用CAR T细胞且未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法在治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤中具有增加的功效。
在另一相关方面，与施用所述CAR T细胞并且未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的促炎细胞因子水平相比，降低了至少一种促炎细胞因子的产生水平。在另一相关方面，所述促炎细胞因子包括IL-6。在另一相关方面，所述附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液，与经受CAR T细胞癌症疗法且未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法维持或增加了受试者中IL-2的水平。
在另一相关方面，所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物中。在又一相关方面，所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在至少两种组合物中。在另一相关方面，其中所述附加剂或其任何试剂组合包含在不包括所述CAR T细胞的组合物中，包含所述一种或多种试剂的所述组合物的施用发生在所述CAR T细胞施用之前，同时或之后。
在相关方面，所述附加剂的施用发生在所述CAR T细胞施用之前，同时或之后。在另一相关方面，所述凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一相关方面，所述凋亡细胞与所述受试者是自体同源的，或是合并的第三方供体细胞。
在相关方面，所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与凋亡细胞。在另一相关方面，所提供的白细胞选自吞噬细胞，巨噬细胞，树突细胞，单核细胞，B细胞，T细胞和NK细胞。
附图说明
在说明书的结论部分中特别指出并清楚地要求保护本文所公开的主题。然而，当结合附图阅读时，就操作的组织和方法，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本文所公开的组合物和方法，以及其目的，特征和优点。
图1.在早期凋亡细胞群的制造过程的一个实施方案中呈现步骤的流程图，其中抗凝血剂包括在该过程中。
图2A-2B.显示了标准CAR T细胞疗法(图2A)和在使用受试者自身细胞(自体)(图2B)产生凋亡细胞或凋亡细胞上清液的受试者中安全有效的CAR T细胞癌症治疗方法的实施例的示意图。
图3.显示了在使用供体细胞产生凋亡细胞或凋亡上清液的受试者中安全有效的CAR T细胞癌治疗方法的实施例的示意图。
图4.验证了T细胞的转导，显示了转导的T4+CAR-T细胞的抗CD124分析的流式细胞术结果。
图5.SKOV3-luc在24孔板中生长。将3.8xl04-3.8xl05SKOV3-luc细胞/孔接种在24孔板中，每天记录荧光素酶活性。
图6.T4+CAR-T细胞减少了SKOV3-luc卵巢腺癌细胞的增殖。细胞毒性测定的结果，其中单层SKOV3-luc细胞通过未转导的T细胞或通过T4+CAR-T细胞培养，以条形图呈现。
图7.凋亡细胞不会消除T4+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。结果基于细胞毒性试验，其中单层SKOV3-luc细胞在载体(Hartmann溶液)或凋亡细胞(Apocell)或凋亡细胞的上清液(ApoSup)，或凋亡细胞和单核细胞/巨噬细胞共培养的上清液(ApoMon Sup)的存在下与未转导的T细胞或T4+CAR-T细胞一起培养。
图8.在CAR-T细胞毒性期间以高水平分泌的IL-6通过凋亡细胞或ApoCell上清液(ApoSup)或凋亡细胞和单核细胞/巨噬细胞共培养物(ApoMon Sup)进行下调。这里显示的结果证明了在癌症和CAR-19存在下，SKOV3-luc和人单核细胞/巨噬细胞的共培养物暴露于凋亡细胞(ApoCell)或ApoCell上清液(ApoSup)或凋亡细胞和单核细胞/巨噬细胞共培养(ApoMon Sup)的效果，
图9A-9J.凋亡细胞在癌症环境中的巨噬细胞激活综合征的LPS-无菌模型中诱导的细胞因子风暴的体外模型中预防细胞因子风暴。图9A显示在癌症存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-10水平的降低。图9B显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-6水平的降低。图9C显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的ΜΙΡ-Ια水平的降低。图9D显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-8水平的降低。图9E显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的TNF-a水平的降低。图9F显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:4，1:8，1:16，1:32和1:64，24小时施用Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的ΜΙΡ-1β水平的降低。图9G显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:4，1:8，1:16，1:32和1:64，24小时施用Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的MCP-1水平的降低。图9H显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:8和1:16，分两个时间段施用(6小时和24小时)Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-9水平的降低。图9I显示在癌症和CAR-19存在的情况下，以巨噬细胞/单核细胞：Apocell的比率为1:4，1:8，1:16，1:32和1:64，24小时施用Apocell后，巨噬细胞活化综合征模型中LPS诱导的IL-2R水平的降低。图9J显示凋亡细胞并没有下调细胞中IL-2的释放。在癌症和CAR-19存在的情况下，凋亡细胞与巨噬细胞/单核细胞一起孵育24小时以上，同时凋亡细胞的剂量递增(n＝3)。空心柱(只有轮廓)-每孔2.5×106个凋亡细胞；黑色-每孔5×106个凋亡细胞；灰色-每孔10×106个凋亡细胞。
图10.在模拟CAR T细胞临床疗法的CAR T细胞治疗期间，LPS暴露后，凋亡细胞或凋亡细胞上清液或凋亡细胞和单核细胞共培养物的作用。将脂多糖(LPS)添加到细胞毒性试验时，记录了极高的IL-6分泌。结果显示暴露于凋亡细胞(Apocell)，或凋亡细胞的上清液(ApoSup)或凋亡细胞和单核细胞/巨噬细胞(ApoMon Sup)共培养的上清液，会使IL-6下调，其中IL-6降低至可接受的水平。
图11A-11B.剃毛时小鼠的体重和肿瘤大小。图11A显示了实验时间期间的重量变化。蓝色-对照，没有施用4.5xl06SKOV3-luc细胞。红色-0.5x106SKOV3-luc细胞。绿色-l.0x106SKOV3-luc细胞。紫色-4.5x106SKOV3-luc细胞。图11B显示了注射后39天接受4.5x106SKOV3-luc细胞的小鼠的代表性SKOV3-luc肿瘤。
图12.SKOV3-luc肿瘤生长。携带SKOV3-luc肿瘤的小鼠，通过生物发光成像(BLI)成像，显示出对照(PBS)和接种0.5x106，lx106,和4.5x106SKOV3-luc细胞之间的差异。
图13A-13D.SKOV3-luc肿瘤负荷。体内SKOV3-luc肿瘤的生物发光(BLI)的定量分析(参见图12)。按照制造商的说明书实施600光子计数截止。图13A，使用0.5x106SKOV3-luc接种的小鼠。图13B，使用1x106SKOV3-luc接种的小鼠。图13C，使用4.5x106SKOV3-luc接种的小鼠。图13D，平均SKOV3-luc肿瘤生长。
图14.Raji Burkett淋巴瘤细胞的细胞毒性校准。将Raji细胞以各种细胞密度接种，在离心之前立即进行细胞裂解。结果显示Raji细胞数(x轴)对492nm处的吸光度(y轴)。所有细胞数相对于未接种的对应物显示出显着的读数。
图15.早期凋亡细胞的添加不影响CAR T细胞抗肿瘤活性。E/T比例显示的是CD19+CAR T细胞与HeLa细胞比例。存活率是CD19+肿瘤细胞的存活率。实心圆CD19+Hela；空心三角形CD19+Hela+初始T细胞；实心三角形CD19+Hela+CAR T-CD19；空心圆CD19+Hela+CAR T-CD19+ApoCells。
图16.在存在和不存在凋亡细胞的RajiBurkett淋巴瘤细胞中的细胞因子分析(GM-CSF)。该柱状图显示了细胞因子GM-CSF的浓度测量值(pg/ml)，该细胞因子GM-CSF发现于单核细胞和LPS存在下孵育的Raji细胞培养物上清液中，然后加入初始T细胞(Raji+NaiveT)，CD19+CAR T-细胞(Raji+CAR T)，1:8CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:8)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)，1:32CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:32)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)，和1:64CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:64)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)。
图17.在存在和不存在凋亡细胞的RajiBurkett淋巴瘤细胞中的细胞因子分析(TNF-α)。该柱状图显示了细胞因子TNF-α(TNF-a)的浓度测量值(pg/ml)，该细胞因子TNF-α发现于单核细胞和LPS存在下孵育的Raji细胞培养物上清液中，然后加入初始T细胞(Raji+NaiveT)，CD19+CAR T-细胞(Raji+CAR T)，1:8CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:8)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)，1:32CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:32)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)，和1:64CAR T细胞:ApoCells(Raji+CAR T+ApoCell1:64)比例的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)。
图18A和图18B.图18A显示了分析凋亡细胞对CAR T细胞疗法影响的实验方案。在第1天用Raji癌症细胞注射SCID小鼠，然后在第6天给SCID小鼠施用CAR T-CD19细胞(CAR T细胞疗法)和凋亡细胞。图18B显示共同施用ApoCells不会对CAR T细胞疗法产生负面影响。存活曲线：在添加或不添加早期凋亡细胞的情况下向SCID小鼠注射CD19+Raji细胞。
图19A，19B和19C显示在实体瘤体内模型中，促炎细胞因子从肿瘤中的释放增加。图19A显示从BALB/c和SCID小鼠的腹膜中存在的实体瘤释放的IL-6的轻微增加，其中在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞存在下，IL-6释放显着增加。类似地，图19B显示从BALB/c和SCID小鼠的腹膜中存在的实体瘤释放的IP-10略微增加，其中在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞存在下IP-10释放显着增加，图19C显示，令人惊讶的是，即使在HeLa CAR-CD-19CAR T细胞存在下TNF-a释放也增加。
具体实施方案
在以下详细描述中，阐述了许多具体细节以便提供对本文所公开方法的彻底理解。然而，本领域技术人员应理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践这些方法。在其他情况下，没有详细描述公知的方法，过程和组件，以免模糊本文所公开的方法。
在一个实施方案中，本文公开了在CAR T细胞癌治疗期间维持或增加表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)的增殖率的方法，该方法包括给所述受试者施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的步骤，并且其中，与经受CAR T细胞癌治疗且未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中所述增殖率保持或增加。
在相关实施方案中，该方法没有降低或抑制所述CAR T细胞癌症疗法的功效。在另一相关实施方案中，与未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率被抑制或降低。
在一个实施方案中，自发发生CRS。在另一个实施方案中，响应于LPS，发生CRS。在另一个实施方案中，响应于IF-γ，发生CRS。
在一个实施方案中，本文公开了增加嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)癌症疗法功效的方法，该方法包括施用CAR T细胞和附加剂的步骤，该附加剂选自凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，其中，与经受CAR T细胞癌治疗并且不施用所述附加剂的受试者相比，所述CART细胞的所述功效在受试者中得以增加。在相关实施方案中，与接受CAR T细胞癌疗法并且未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的促炎细胞因子水平相比，降低了至少一种促炎细胞因子的产生水平。在另一相关实施方案中，促炎细胞因子包括IL-6。
在相关实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与经受CAR T细胞癌症疗法且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，该方法增加受试者中IL-2的水平。在另一实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与经受CAR T细胞癌症疗法且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，该方法保持受试者中IL-2的水平。在另一实施方案中，当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与经受CAR T细胞癌症疗法且不施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法保持或增加了受试者中IL-2的水平。在另一相关实施方案中，与未施用所述附加剂的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率被抑制或降低。
在相关实施方案中，CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物中。在另一相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在至少两种组合物中。
在一实施方案中，本文公开了治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的方法，该方法包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和附加剂的步骤，所述附加剂包括凋亡细胞，凋亡上清液或CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合，其中与施用CAR T细胞且未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤。
在相关实施方案中，与施用CAR T细胞且未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法在治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤中具有增加的功效。在另一相关实施方案中，与接受CAR T细胞癌治疗并且未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的促炎细胞因子水平相比，降低了至少一种促炎细胞因子的产生水平。在另一相关实施方案中，所述促炎细胞因子包括IL-6。在另一相关实施方案中，所述附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液，与施用所述CAR T细胞且未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法增加了受试者中IL-2的水平。在另一相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物中。在又一相关实施方案中，所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在至少两种组合物中。
在相关实施方案中，所述附加剂的施用发生在所述CAR T细胞施用之前，同时或之后。在另一相关实施方案中，所述凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一相关实施方案中，所述凋亡细胞与所述受试者是自体同源的，或者是合并的第三方供体细胞。
在相关实施方案中，所述凋亡细胞上清液通过包括以下步骤的方法获得：(a)提供凋亡细胞，(b)培养步骤(a)的细胞，和(c)将上清液与细胞分离。在另一相关实施方案中，所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，并且所述方法还包括以下步骤：(d)提供白细胞，(e)任选地，清洗凋亡细胞和白细胞，(f)共培养凋亡细胞和白细胞，其中用步骤(d)-(f)代替步骤(b)。在另一个相关实施例，所提供的白细胞选自吞噬细胞，巨噬细胞，树突细胞，单核细胞，B细胞，T细胞和NK细胞。因此，在一些实施方案中，凋亡上清液包含通过用巨噬细胞培养凋亡细胞产生的上清液，其中巨噬细胞摄取凋亡细胞，并使用由该共培养产生的上清液。在一些实施方案中，凋亡上清液包含通过培养凋亡细胞产生的上清液，其中上清液由凋亡细胞分泌的物质产生。
遗传修饰的免疫细胞
众所周知，免疫细胞的遗传修饰是免疫细胞治疗癌症的策略。这些免疫细胞疗法是基于对需要的受试者操纵和施用自体或同种异体免疫细胞。基于免疫细胞的疗法包括天然杀伤细胞疗法，树突细胞疗法和T细胞免疫疗法(包括使用初始T细胞，效应T细胞(也称为T辅助细胞)，细胞毒性T细胞和调节性T细胞(Tregs)的那些)。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物包含遗传修饰的免疫细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始CD4+T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始CD8+T细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是树突细胞。在又一实施方案中，遗传修饰的T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一实施方案中，遗传修饰的T细胞是调节性T细胞(Treg)。在另一实施方案中，遗传修饰的T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的T细胞是遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物包含遗传修饰的免疫细胞和附加剂，并且该附加剂选自凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合。在另一实施方案中，本文所公开的组合物包含遗传修饰的免疫细胞，凋亡细胞和附加剂，并且该附加剂选自CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合。在另一实施方案中，本文所公开的组合物包含遗传修饰的免疫细胞，凋亡细胞上清液和附加剂，并且该附加剂选自CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合。
在一个实施方案中，免疫细胞具有细胞毒性。在另一实施方案中，用于遗传修饰的细胞毒性细胞可以从受试者的骨髓(自体的)或供体(同种异体的)获得。在其他情况下，细胞从干细胞中获得。例如，细胞毒性细胞可以衍生自人多能干细胞，诸如人胚胎干细胞或人诱导多能T细胞。在诱导性多能干细胞(IPSC)的情况下，可以使用来自受试者(向所述受试者提供遗传修饰细胞毒性细胞)的体细胞获得这种多能T细胞。在一个实施方案中，免疫细胞可以通过收获细胞从受试者或供体中获得，收获细胞可以通过静脉穿刺，通过单采血液成分法，通过白细胞动员，然后进行单采血液成分或静脉穿刺，或通过骨髓抽吸的方法进行。
在一个实施方案中，免疫细胞，例如T细胞，通过体内特定因子的存在而产生和扩增。在另一实施方案中，T细胞的产生和维持受体内细胞因子的影响。在另一实施方案中，细胞因子影响体内T辅助细胞的产生和维持，所述细胞因子包括IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-25，IL-33和TGF。在另一实施方案中，Treg细胞通过体内细胞因子诱导，从初始T细胞中产生。在又一实施方案中，TGF-β和/或IL-2在分化初始T细胞成为Treg细胞中起作用。
在另一实施方案中，细胞因子选自IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-25，IL-33和TGF，细胞因子的存在维持或增加体内T细胞的增殖率，或维持且增加体内T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGF的存在维持或增加体内T细胞的增殖率，或维持且增加体内T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子选自IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-25，IL-33和TGF，该细胞因子的存在维持或增加体内CAR T细胞的增殖率，或维持且增加体内CAR T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGF的存在维持或增加体内CART细胞的增殖率，或维持且增加体内CAR T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子选自IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-25，IL-33和TGF，该细胞因子的存在维持或增加体内TCR T细胞的增殖率，或维持且增加体内TCR T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGF的存在维持或增加体内TCR T细胞的增殖率，或维持且增加体内TCR T细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子选自IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-12，IL-21，IL-23，IL-25，IL-33和TGF，该细胞因子的存在维持或增加体内T-reg细胞的增殖率，或维持且增加体内T-reg细胞的增殖率。在另一实施方案中，细胞因子IL-2和/或TGF的存在维持或增加体内T-reg细胞的增殖率，或维持且增加体内T-reg细胞的增殖率。
在一个实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白或BACH2编码蛋白的改变的表达或形式，该T细胞维持延长的时间段或具有增加的增殖率，或维持延长的时间段且具有增加的增殖率。在另一实施方案中，所述改变的表达增加了STAT5B多肽的表达。在另一实施方案中，所述改变的表达增加了BACH2多肽的表达。
在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白的改变的表达，该T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白的改变的表达，该T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。
在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过1年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过2年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过3年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过4年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过5年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过10年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过20年。
在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过1年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过2年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过3年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过4年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过5年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过10年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过20年。
在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过1年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过2年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过3年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过4年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过5年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过10年。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过20年。
在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过1年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过2年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过3年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过4年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过5年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过10年。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率超过20年。
在另一实施方案中，CAR T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该CAR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，CAR T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该CAR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，CAR T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该CAR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，CAR T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该CART细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。
在另一实施方案中，TCR T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该TCR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，TCR T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该TCR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，TCR T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该TCR T细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。在另一实施方案中，TCR T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该TCRT细胞维持延长的时间段或具有增加的体内增殖率。
在另一实施方案中，Treg细胞具有STAT5B编码蛋白改变的表达，该Treg细胞在体内维持或增加其增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的表达，该T细胞在体内维持或增加其增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有STAT5B编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率。在另一实施方案中，T细胞具有BACH2编码蛋白改变的形式，该T细胞在体内维持或增加其增殖率。
在一个实施方案中，本文公开了用于维持或增加遗传修饰免疫细胞的增殖率的方法，其中该方法包括施用凋亡细胞或凋亡上清液的步骤。在另一个实施方案中，本文公开了用于增加遗传修饰免疫细胞功效的方法，其中该方法包括施用附加剂的步骤，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合。在另一实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻癌症或肿瘤的方法，施用遗传修饰免疫细胞和附加剂，其中所述附加剂包括凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或免疫调节剂，或其任意组合。
表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)
在一个实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)是一种抗原靶向受体，其包括与细胞外肿瘤结合部分融合的细胞内T细胞信号传导结构域，最常见的是来自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)。CAR直接识别细胞表面抗原，而不依赖于MHC介导的呈递，允许在所有受试者中使用对任何给定抗原具有特异性的单一受体构建体。初始CAR将抗原识别结构域融合到T细胞受体(TCR)复合物的CD3ζ活化链中。虽然这些第一代CAR在体外诱导了T细胞效应子功能，但它们在很大程度上受到体内抗肿瘤功效差的限制。随后的CAR迭代包括与CD3ζ串联的次级共刺激信号，包括来自CD28的细胞内结构域或多种TNF受体家族分子，诸如4-1BB(CD137)和OX40(CD134)。此外，第三代受体除CD3ζ外还包括两个共刺激信号，最常见的是CD28和4-1BB。第二代和第三代CAR显着提高了抗肿瘤功效，在某些情况下，在晚期癌症受试者中诱导完全消失。
在一个实施方案中，CAR T细胞是包含抗原受体的免疫应答细胞，当其受体与其抗原结合时被激活。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第一代CART细胞。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第二代CAR T细胞。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第三代CAR T细胞。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞是第四代CAR T细胞。在一个实施方案中，每代CAR T细胞比前几代CAR T细胞更有效。
在一个实施方案中，第一代CAR具有一个信号传导结构域，通常是CD3TCRζ链的细胞质信号传导结构域。
在另一实施方案中，本文所公开的CAR T细胞是第二代CAR T细胞。在另一实施方案中，本文所公开的CAR T细胞包含三联嵌合受体(TPCR)。在一个实施方案中，本文所公开的CAR T细胞包含一种或多种信号传导部分，该信号传导部分以共刺激的独立方式激活初始T细胞。在另一实施方案中，CAR T细胞还编码肿瘤坏死因子受体家族的一个或多个成员，在一个实施方案中，是CD27，4-1BB(CD137)或OX40(CD134)，或其组合。
第三代CAR T细胞试图利用2个共刺激结构域的信号传导潜力：在一个实施方案中，CD28结构域后面是4-IBB或OX-40信号传导结构域。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞进一步编码共刺激信号传导结构域，在一个实施方案中该CAR T细胞是CD28。在另一实施方案中，信号传导结构域是CD3ζ链，CD97，GDI Ia-CD18，CD2，ICOS，CD27，CD154，CDS，OX40，4-1BB，CD28信号传导结构域或其组合。
在一个实施方案中，端粒长度和复制能力与过继转移的T细胞系的植入(engraftment)效率和抗肿瘤功效相关。在一个实施方案中，CD28刺激维持了T细胞中的端粒长度。
在一个实施方案中，通过引入附加基因可以进一步增强CAR修饰T细胞的效力，该附加基因包括编码增殖细胞因子(即IL-12)或共刺激配体(即4-1BBL)，从而产生“装甲”第四代CAR修饰T细胞。在一个实施方案中，“装甲CAR T细胞”为免受抑制性肿瘤微环境影响的CAR T细胞。在另一实施方案中，“装甲”CAR技术结合可溶性信号传导蛋白的局部分泌，以扩增肿瘤微环境内的免疫应答，目的是使全身副作用最小化。在一个实施方案中，信号传导蛋白信号是IL-12，其可以刺激T细胞激活和募集。在一个实施方案中，“装甲”CAR技术在实体肿瘤适应症中特别有用，其中微环境和有效的免疫抑制机制具有使得建立强大的抗肿瘤反应更具挑战性的潜力。
在一个实施方案中，对CAR T细胞进行遗传修饰以编码分子，该分子参与预防细胞凋亡，肿瘤微环境的重塑，稳态增殖的诱导，和促进定向T细胞归巢的趋化因子受体的诱导。
在另一实施方案中，通过使用细胞因子转基因的表达，与小分子抑制剂或单克隆抗体的组合疗法，增强了本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞疗法。在另一实施方案中，其他旨在改善CAR T细胞疗法的策略，包括使用双CAR和趋化因子受体来更特异地靶向肿瘤细胞，这被认为是本文所公开的CAR T细胞和CAR T细胞疗法的一部分。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法的CAR T细胞包含第二结合结构域，其可以产生抑制或扩增信号，以增加癌细胞对正常细胞的CAR T细胞的特异性。例如，可以工程改造CAR T细胞，从而CAR T细胞在一种靶蛋白存在的情况下被触发，但如果存在第二种蛋白质，则会受到抑制。或者，也可以工程改造CAR T细胞，从而对于最大活化需要两种靶蛋白。相对于正常组织，这些方法可以增加CAR对肿瘤的特异性。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的CAR T细胞编码了基于抗体的外部受体结构和胞质结构域，其编码包括基于免疫受体酪氨酸的活化基序组成的信号转导模块。
在一个实施方案中，CAR T细胞还编码了单链可变片段(scFv)，该单链可变片段(scFv)结合具有免疫抑制活性的多肽。在另一实施方案中，具有免疫抑制活性的多肽是CD47，PD-1，CTLA-4或其组合。
在一个实施方案中，CAR T细胞还编码了单链可变片段(scFv)，该单链可变片段(scFv)结合具有免疫刺激活性的多肽。在另一实施方案中，具有免疫刺激活性的多肽是CD28，OX-40，4-1BB或其组合。在另一实施方案中，CAR T细胞还编码了CD40配体(CD40L)，在一个实施方案中，CD40配体增强了抗原的免疫刺激活性。
在一个实施方案中，本文所公开的方法包括从受试者中获得免疫细胞，并遗传修饰免疫细胞以表达嵌合抗原受体。在另一实施方案中，本文所公开的方法包括从受试者获得免疫细胞，遗传修饰免疫细胞以表达嵌合抗原受体以及与凋亡细胞群组合，导致受试者中细胞因子产生减少，但相对于未与凋亡细胞群施用的表达CAR的免疫细胞，细胞毒性基本上上不受影响(图2A-2B和3)。在一个实施方案中，本文所公开的方法包括从受试者中获得免疫细胞，遗传修饰免疫细胞以表达嵌合抗原受体，以及与凋亡细胞上清液或包含上清液的组合物组合，导致受试者中细胞因子产生减少，但相对于未与凋亡细胞上清液施用的表达CAR的免疫细胞，细胞毒性基本上不受影响。在另一实施方案中，施用凋亡细胞群或来自凋亡细胞的上清液不会降低表达嵌合抗原受体的免疫细胞的功效。
因此，本文所公开的一个实施方案涉及包含嵌合抗原受体(CAR)的细胞毒性免疫细胞(例如，NK细胞或T细胞)，由此细胞保留其细胞毒性功能。在另一实施方案中，嵌合抗原受体相对于T细胞为外源性的。在另一实施方案中，CAR是重组表达的。在另一实施方案中，CAR由载体表达。
在一个实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是初始CD4+T细胞。在另一实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是初始CD8+T细胞。在另一实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是效应T细胞。在另一实施方案中，用于产生CART细胞的T细胞是调节性T细胞。在另一实施方案中，用于产生CAR T细胞的T细胞是细胞毒性T细胞。
CAR T细胞已在文献中广泛描述，例如，参见示例Themelli et al.(2015)NewCell Sources for T Cell Engineering and Adoptive Immunotherapy.Cell Stem Cell16:357-366；Sharpe and Mount(2015)Genetically modified T cells in cancertherapy:opportunities and challenges.Diseas Models&Mechanisms 8:337-350；Hanet al.(2013)Journal of Hematology&Oncology 6:47-53；Wilkie et al.(2010)J BioChem285(33):25538-25544；以及van de Stegen et al.(2013)J.Immunol 191:4589-4598。CAR T细胞可从商业来源进行购买，诸如Creative Biolabs(NY USA)为嵌合抗原受体(CAR)提供定制构建和生产服务，并且还提供了预制CAR构造库存，其可以通过重组腺病毒疫苗诱导保护性免疫编码。
T细胞受体(TCR)细胞
本文所公开的组合物和方法利用设计的T细胞受体(TCR)细胞作为CAR T细胞的补充或替代。TCR是一种介导T细胞抗原特异性活化的多亚基跨膜复合物。TCR包括两条不同的多肽链。TCR通过识别靶细胞(例如肿瘤或癌细胞)上的抗原表位赋予T细胞抗原特异性。在与肿瘤或癌症细胞上存在的抗原接触后，T细胞增殖并获得表型和功能以允许它们消除癌症或肿瘤细胞。
在一个实施方案中，TCR T细胞疗法包括将对目标蛋白质的表位特异的T细胞受体(TCR)引入T细胞。在另一实施方案中，目标蛋白质是肿瘤相关抗原。在另一实施方案中，工程改造的TCR识别由肿瘤细胞上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肿瘤抗原表位以及T细胞活化结构域。在另一实施方案中，T细胞受体识别抗原，而与其细胞内或膜定位无关。在另一实施方案中，TCR识别细胞内表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞。在一个实施方案中，TCR识别内部抗原。在另一实施方案中，TCR识别血管生成因子。在另一实施方案中，血管生成因子是参与新血管形成的分子。各种遗传修饰的T细胞受体及其制备方法在本领域是已知的。
在一个实施方案中，TCR T细胞疗法用于治疗，预防，抑制，改善，降低癌症或肿瘤的发生率，或减轻癌症或肿瘤。在一个实施方案中，TCR T细胞疗法用于治疗，预防，抑制，改善，降低晚期转移性疾病的发生率，或缓解晚期转移性疾病，该疾病包括具有血液学(淋巴瘤和白血病)和实体瘤(难治性黑色素瘤，肉瘤)的那些疾病。在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法中使用的TCR T细胞疗法治疗Sadelain等人的表1中列出的恶性肿瘤(Cancer Disco v.2013Apr；3(4):388-398)。
在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合NY-ESO-1表位，并且TCR工程改造的T细胞是抗NY-ESO-1。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合HPV-16E6表位，并且TCR工程改造的T细胞是抗HPV-16E6。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合HPV-16E7表位，并且TCR工程改造的T细胞是抗HPV-16E7。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰，以结合MAGEA3/A6表位，TCR工程改造的T细胞是抗MAG A3/A6。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合MAGEA3表位，并且TCR工程改造的T细胞是抗MAGE A3。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合SSX2表位，并且TCR工程改造的T细胞是抗SSX2。在另一实施方案中，对T细胞受体进行遗传修饰以结合本文所公开的靶向抗原。使用本领域已知的工具，技术人员将理解，可以对T细胞受体进行遗传修饰以结合存在于癌症或肿瘤细胞上的靶向抗原，其中TCR工程改造的T细胞包含抗肿瘤或抗癌症细胞。
在一个实施方案中，本文所公开的方法包括从受试者中获得免疫细胞，遗传修饰免疫细胞以表达重组T细胞受体(TCR)。在另一实施方案中，本文所公开的方法包括从受试者中获得免疫细胞，遗传修饰免疫细胞以表达重组T细胞受体(TCR)，以及与附加剂结合，其中所述附加剂包括凋亡细胞群，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂或其任何组合。
在一个实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是初始CD4+T细胞。在另一实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是初始CD8+T细胞。在另一实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是效应T细胞。在另一实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是调节性T细胞(Treg)。在另一实施方案中，用于产生TCR T细胞的T细胞是细胞毒性T细胞。
TCR T细胞已在文献中广泛描述，例如，参见Sharpe and Mount(2015)ibid.；Essand M,Loskog ASI(2013)Genetically engineered T cells for the treatment ofcancer(Review).J Intern Med 273:166-181；以及Kershaw et al.(2014)Clinicalapplication of genetically modified T cells in cancer therapy.Clinical&Translational Immunology3:1-7。
靶向抗原
在一个实施方案中，CAR通过针对抗原的抗体或抗体片段与抗原的表位结合。在另一实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一实施方案中，抗体是多克隆抗体。在另一实施方案中，抗体片段是单链可变片段(scFv)。
在一个实施方案中，TCR通过遗传修饰的T细胞受体结合抗原的表位。
在另一实施方案中，本文所公开的组合物的CAR T细胞结合肿瘤相关抗原(TAA)。在另一实施方案中，所述肿瘤相关抗原是：粘蛋白1，细胞表面相关(MUCI)或多形性上皮粘蛋白(PEM)，在早期肿瘤中突变富含精氨酸(Armet)，热休克蛋白60(HSP60)，钙联蛋白(CANX)，亚甲基四氢叶酸脱氢酶(NADP+依赖性)2，甲基四氢叶酸环化水解酶(MTHFD2)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，基质金属肽酶(MMP6)，B黑色素瘤抗原-1(BAGE-1)，N-乙酰葡糖胺基转移酶V的异常转录物(GnTV)，Q5H943，癌胚抗原(CEA)，Pmel，激肽释放酶-4，乳腺球蛋白-1，MART-1，GPR143-OA1，前列腺特异性抗原(PSA)，TRP1，酪氨酸酶，FGP-5，NEU原癌基因，Aft，MMP-2，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，端粒酶相关蛋白-2，前列腺酸性磷酸酶(PAP)，尿溶蛋白II或蛋白酶3。
在另一实施方案中，在想要如白血病中那样破坏B细胞的情况下，CAR结合CD19或CD20以靶向B细胞。CD19是B细胞谱系特异性表面受体，其从pro-B细胞到早期浆细胞的广泛表达使其成为B细胞恶性肿瘤免疫疗法的一种有吸引力的靶标。在另一实施方案中，CAR结合ROR1，CD22或GD2。在另一实施方案中，CAR结合NY-ESO-1。在另一实施方案中，CAR结合MAGE家族蛋白。在另一实施方案中，CAR结合间皮素。在另一实施方案中，CAR结合c-erbB2。在另一实施方案中，CAR结合肿瘤特异性的突变抗原，诸如BRAFV600E突变和BCR-ABL易位。在另一实施方案中，CAR结合肿瘤特异性的病毒抗原，诸如HD中的EBV，宫颈癌中的HPV和Merkel癌中的多瘤病毒。在另一实施方案中，CAR T细胞结合Her2/neu。在另一实施方案中，CAR T细胞结合EGFRvIII。
在一个实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞结合CD19抗原。在另一实施方案中，CAR结合CD22抗原。在另一实施方案中，CAR结合α-叶酸受体。在另一实施方案中，CAR结合CAIX。在另一实施方案中，CAR结合CD20。在另一实施方案中，CAR结合CD23。在另一实施方案中，CAR结合CD24。在另一实施方案中，CAR结合CD30。在另一实施方案中，CAR结合CD33。在另一实施方案中，CAR结合CD38。在另一实施方案中，CAR结合CD44v6。在另一实施方案中，CAR结合CD44v7/8。在另一实施方案中，CAR结合CD123。在另一实施方案中，CAR结合CD171。在另一实施方案中，CAR结合癌胚抗原(CEA)。在另一实施方案中，CAR结合EGFRvIII。在另一实施方案中，CAR结合EGP-2。在另一实施方案中，CAR结合EGP-40。在另一实施方案中，CAR结合EphA2。在另一实施方案中，CAR结合Erb-B2。在另一实施方案中，CAR结合Erb-B2,3,4。在另一实施方案中，CAR结合Erb-B3/4。在另一实施方案中，CAR结合FBP。在另一实施方案中，CAR结合胎儿乙酰胆碱受体。在另一实施方案中，CAR结合GD2。在另一实施方案中，CAR结合GD3。在另一实施方案中，CAR结合HER2。在另一实施方案中，CAR结合HMW-MAA。在另一实施方案中，CAR结合IL-11Rα。在另一实施方案中，CAR结合IL-13Rα1。在另一实施方案中，CAR结合KDR。在另一实施方案中，CAR结合κ-轻链。在另一实施方案中，CAR结合Lewis Y。在另一实施方案中，CAR结合LI-细胞粘附分子。在另一实施方案中，CAR结合MAGE-A1。在另一实施方案中，CAR结合间皮素。在另一实施方案中，CAR结合CMV感染的细胞。在另一实施方案中，CAR结合MUC1。在另一实施方案中，CAR结合MUC16。在另一实施方案中，CAR结合NKG2D配体。在另一实施方案中，CAR结合NY-ESO-1(氨基酸157-165)。在另一实施方案中，CAR结合癌胚抗原(h5T4)。在另一实施方案中，CAR结合PSCA。在另一实施方案中，CAR结合PSMA。在另一实施方案中，CAR结合ROR1。在另一实施方案中，CAR结合TAG-72。在另一实施方案中，CAR结合VEGF-R2或其他VEGF受体。在另一实施方案中，CAR结合B7-H6。在另一实施方案中，CAR结合CA9。在另一实施方案中，CAR结合ανβ6整联蛋白。在另一实施方案中，CAR结合8H9。在另一实施方案中，CAR结合NCAM。在另一实施方案中，CAR结合胎儿乙酰胆碱受体。
在另一实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)T细胞靶向CD19抗原，并且对患有B细胞恶性肿瘤，ALL，滤泡性淋巴瘤，CLL和淋巴瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CART细胞靶向CD22抗原，并且对患有B细胞恶性肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向α-叶酸受体或叶酸受体α，并且对患有卵巢癌或上皮癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CAIX或G250/CAIX，并且对患有肾细胞癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD20，并且对患有淋巴瘤，B细胞恶性肿瘤，B细胞淋巴瘤，套细胞淋巴瘤和惰性B细胞淋巴瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD23，并且对患有CLL的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD24，并且对患有胰腺癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD30，并且对患有淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD33，并且对患有AML的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CART细胞靶向CD38，并且对患有非霍奇金淋巴瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v6，并且对具有几种恶性肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD44v7/8，并且对患有宫颈癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD123，并且对患有髓样恶性肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CEA，并且对患有结肠直肠癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向EGFRvIII，并且对患有胶质母细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-2，并且对患有多种恶性肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向EGP-40，并且对患有结肠直肠癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向EphA2，并且对患有胶质母细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B2或ErbB3/4，并且对患有乳腺癌等，前列腺癌，结肠癌，各种肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向Erb-B2,3,4，并且对患有乳腺癌等的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向FBP，并且对患有卵巢癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向胎儿乙酰胆碱受体，并且对患有横纹肌肉瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向GD2，并且对具有神经母细胞瘤，黑色素瘤或尤文氏肉瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向GD3，并且对患有黑色素瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向HER2，并且对具有成神经管细胞瘤，胰腺癌，成胶质细胞瘤，骨肉瘤或卵巢癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向HMW-MAA，并且对患有黑色素瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向IL-11Rα，并且对患有骨肉瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13Rα1，并且对患有神经胶质瘤，成胶质细胞瘤或成神经管细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向IL-13受体α2，并且对患有几种恶性肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向KDR，并且通过靶向肿瘤新血管系统对患有肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向κ-轻链，并且对患有B细胞恶性肿瘤(B-NHL，CLL)的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向LewisY，并且对患有各种癌或上皮细胞衍生的肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向LI-细胞粘附分子，并且对患有神经母细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向MAGE-A1或HLA-A1MAGEA1，并且对患有黑色素瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向间皮素，并且对患有间皮瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CMV感染的细胞，并且对患有CMV的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向MUC1，并且对患有乳腺癌或卵巢癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向MUC16，并且对患有卵巢癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向NKG2D配体，并且对患有骨髓瘤，卵巢和其他肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向NY-ESO-1(157-165)或HLA-A2NY-ESO-1，并且对患有多发性骨髓瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向癌胚抗原(h5T4)，并且对患有各种肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向PSCA，并且对患有前列腺癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向PSMA，并且对患有前列腺癌/肿瘤脉管系统的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CART细胞靶向ROR1，并且对患有B-CLL和套细胞淋巴瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向TAG-72，并且对患有腺癌或胃肠癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向VEGF-R2或其他VEGF受体，并且通过靶向肿瘤新血管系统对患有肿瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CA9，并且对患有肾细胞癌的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向CD171，并且对患有肾神经母细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向NCAM，并且对患有神经母细胞瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR T细胞靶向胎儿乙酰胆碱受体，并且对患有横纹肌肉瘤的受试者具有治疗效果。在另一实施方案中，CAR结合Sadelain等人的表1中列出的靶向抗原之一癌症(Cancer Discov.2013Apr；3(4):388-398)，其通过引用将全部内容并入本文。在另一实施方案中，CAR T细胞结合碳水化合物或糖脂结构。
在一个实施方案中，CAR结合血管生成因子，从而靶向肿瘤脉管系统。在一个实施方案中，血管生成因子是VEGFR2。在另一实施方案中，血管生成因子是内皮糖蛋白。在另一实施方案中，本发明的血管生成因子是血管生成素；血管生成素-1；Del-1；成纤维细胞生长因子：酸性(aFGF)和碱性(bFGF)；卵泡抑素；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；肝细胞生长因子(HGF)/分散因子(SF)；白细胞介素-8(IL-8)；瘦素；中期因子；胎盘生长因子；血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)；血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)；多效生长因子(PTN)；颗粒蛋白前体抗原；增殖蛋白；转化生长因子-α(TGF-α)；转化生长因子-β(TGF-β)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)；血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透因子(VPF)。在另一实施方案中，血管生成因子是血管生成蛋白。在一个实施方案中，生长因子是血管生成蛋白。在一个实施方案中，用于本发明组合物和方法的血管生成蛋白是成纤维细胞生长因子(FGF)；VEGF；VEGFR和神经纤毛蛋白1(NRP-1)；血管生成素1(AngI)和Tie2；血小板衍生生长因子(PDGF；BB-同源二聚体)和PDGFR；转化生长因子-β(TGF-β)，内皮糖蛋白和TGF-β受体；单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)；整合素αVβ3，αVβ5和α5β1；VE-钙粘蛋白和CD31；肝配蛋白；纤溶酶原激活剂；纤溶酶原激活剂抑制剂-1；一氧化氮合酶(NOS)和COX-2；AC133；或IdI/Id3。在一个实施方案中，用于本发明组合物和方法的血管生成蛋白是血管生成素，在一个实施方案中，其是血管生成素1，血管生成素3，血管生成素4或血管生成素6。在一个实施方案中，内皮糖蛋白(endoglin)也称为CD105；EDG；HHT1；ORW；或ORW1。在一个实施方案中，内皮糖蛋白是TGF-β共受体。
在另一实施方案中，CAR T细胞结合感染因子相关的抗原。在一个实施方案中，感染因子是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在一个实施方案中，所述结核分枝杆菌相关抗原是：抗原85B，脂蛋白IpqH，ATP依赖性解旋酶推测的未表征的蛋白质Rv0476/MTO4941前体或未表征的蛋白质Rv1334/MT1376前体。
在另一实施方案中，CAR结合抗体。在一个实施方案中，CAR T细胞是“抗体偶联的T细胞受体”(ACTR)。根据该实施例，CAR T细胞是通用CAR T细胞。在另一实施方案中，具有抗体受体的CAR T细胞在施用抗体之前，之后或同时施用，然后与抗体结合，使T细胞紧邻肿瘤或癌症。在另一实施方案中，抗体针对肿瘤细胞抗原。在另一实施方案中，抗体针对CD20。在另一实施方案中，抗体是利妥昔单抗。
在另一实施方案中，抗体是曲妥珠单抗(Herceptin；Genentech)：人源化IgG1，其针对ERBB2。在另一实施方案中，抗体是贝伐单抗(Avastin；Genentech/Roche)：人源化IgG1，其针对VEGF。在另一实施方案中，抗体是西妥昔单抗(Erbitux；Bristol-MyersSquibb)：嵌合人-鼠IgG1，其针对EGFR。在另一实施方案中，抗体是帕尼单抗(Vectibix；Amgen)：人IgG2，其针对EGFR。在另一实施方案中，抗体是伊匹单抗(Yervoy；Bristol-MyersSquibb)：IgG1，其针对CTLA4。
在另一实施方案中，抗体是阿仑单抗(Campam；Genentech)：人源化IgG1，其针对CD52。在另一实施方案中，抗体是奥法木单抗(Arzerra；Genmab)：人IgG1，其针对CD20。在另一实施方案中，抗体是吉妥珠单抗奥唑米星(Mylotarg；Wyeth)：人源化IgG4，其针对CD33。在另一实施方案中，抗体是本妥昔单抗(Adcetris；Seattle Genetics)：嵌合IgG1，其针对CD30。在另一实施方案中，抗体是90Y标记的替伊莫单抗(Zevalin；IDECPharmaceuticals)：鼠IgG1，其针对CD20。在另一实施方案中，抗体是131I标记的托西莫单抗(Bexxar；GlaxoSmithKline)：小鼠IgG2，其针对CD20。
在另一实施方案中，抗体是雷莫芦单抗，其针对血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)。在另一实施方案中，抗体是雷莫芦单抗(Cyramza Injection，Eli Lilly andCompany)，博纳吐单抗(BLINCYTO，Amgen Inc.)，派姆单抗(KEYTRUDA，Merck Sharp&DohmeCorp.)，阿托珠单抗(GAZYVA，Genentech，Inc.；以前称为GA101)，帕妥珠单抗注射液(PERJETA，Genentech，Inc.)或地诺单抗(Xgeva，Amgen Inc.)。在另一实施方案中，抗体是巴利昔单抗(Simulect；Novartis)。在另一实施方案中，抗体是达利珠单抗(Zenapax；Roche)。
在另一实施方案中，CAR T细胞偶联的抗体针对肿瘤或癌症抗原或其部分，其在本文中描述和/或本领域已知的。在另一实施方案中，CAR T细胞偶联的抗体针对肿瘤相关抗原。在另一实施方案中，CAR T细胞偶联的抗体针对肿瘤相关抗原或其部分，其是血管生成因子。
本领域技术人员将理解的是，可以工程改造的遗传修饰的TCR以识别CAR结合的上述任何抗原。在一个实施方案中，TCR T细胞结合上述抗原作为CAR T细胞结合靶标。在另一实施方案中，TCR识别本文所公开的任何抗原。在另一实施方案中，TCR识别的抗原是肿瘤或癌症抗原或其部分，其在本文中描述和/或本领域已知的。在另一实施方案中，TCR识别肿瘤相关抗原。在另一实施方案中，TCR识别肿瘤相关抗原或其部分，其是血管生成因子。
树突细胞
在一个实施方案中，树突细胞(DC)是哺乳动物免疫系统的抗原产生及呈递细胞，该呈递细胞加工抗原材料并将其在细胞表面上呈递给免疫系统的T细胞，从而能够使T细胞对新抗原和回忆抗原敏感。在另一实施方案中，DC是最有效的抗原产生细胞，充当先天免疫系统和适应性免疫系统之间的信使。在一个实施方案中，可以使用DC细胞通过产生攻击和裂解肿瘤的效应细胞来引发特异性抗肿瘤免疫。
树突细胞存在于与外部环境接触的那些组织中，诸如皮肤(其中存在称为朗格汉斯细胞的特定树突细胞类型)和鼻，肺，胃和肠的内膜(inner lining)。它们也可以在血液中以未成熟状态存在。一旦被活化，它们就会迁移到淋巴结，在那里它们与T细胞和B细胞相互作用，从而启动并塑造适应性免疫应答。在某些发育阶段，它们会生长出支化的突起，即赋予细胞其名字的树突。可以工程改造树突细胞以表达特定的肿瘤抗原。
T细胞活化所需的三种信号是：(i)在自身MHC分子中呈递同源抗原；(ii)膜结合受体-配体对的共刺激；以及(iii)可溶性因子，以针对确保免疫应答的极化。树突细胞(DC)能够提供T细胞活化所需的所有三种信号，使其成为优秀的癌症疫苗平台。
因此，在一个实施方案中，本文所公开了包含树突细胞和附加剂的组合物，其中所述附加剂包括凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段，或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合。
在另一实施方案中，本文所公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的方法，包括施用树突细胞和包括附加剂的组合物的步骤，其中所述附加剂包括凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任意组合。
细胞因子风暴和细胞因子释放综合征
在一个实施方案中，本文所公开的方法包括提供免疫细胞，诸如NK细胞，树突细胞，TCR T细胞或包含工程改造嵌合抗原受体(CAR T细胞)的T细胞，与至少一种附加剂以降低可能在受试者中发生的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。在另一实施方案中，由于施用免疫细胞而发生CRS，sCRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，CRS，sCRS或细胞因子风暴是与免疫细胞分开的刺激，病症或综合征的结果(见下文)。在另一实施方案中，细胞因子风暴，细胞因子级联或高细胞因子血症是更严重形式的细胞因子释放综合征。
在一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括CTLA-4阻断剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和CTLA-4阻断剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括碲基化合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和碲基化合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括免疫调节剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和免疫调节剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括Treg细胞。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和Treg细胞。
技术人员将理解的是，减少毒性细胞因子释放或毒性细胞因子水平包括减少或抑制受试者中毒性细胞因子水平的产生，或抑制或降低受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率。在另一实施方案中，在CRS或细胞因子风暴期间，降低了毒性细胞因子水平。在另一实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括预防CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括减轻CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，减少或抑制毒性细胞因子水平的产生包括改善CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，毒性细胞因子包括促炎性细胞因子。在另一实施方案中，促炎性细胞因子包括IL-6。在另一实施方案中，促炎性细胞因子包括IL-Iβ。在另一实施方案中，促炎性细胞因子包括TNF-a。在另一实施方案中，促炎性细胞因子包括IL-6，IL-1β或TNF-a，或其任何组合。
在一个实施方案中，细胞因子释放综合征的特征在于受试者中几种炎性细胞因子和不良物理反应的水平升高，诸如低血压，高烧和寒战。在另一实施方案中，炎性细胞因子包括IL-6，IL-Iβ和TNF-a。在另一实施方案中，CRS的特征在于IL-6，IL-Iβ或TNF-a或其任何组合的水平的升高。在另一实施方案中，CRS的特征在于IL-8或IL-13或其任何组合的水平的升高。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于在TNF-α，IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-13，GM-CSF，IL-5，分形趋化因子(fracktalkine)，或其组合或其子集中的增加。在又一实施方案中，IL-6包括CRS或细胞因子风暴的标志物。在另一实施方案中，肿瘤负荷较大的受试者具有较高的细胞因子释放综合征的发生率和严重性。
在另一实施方案中，人和小鼠中CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子可包含下表1和2中列出的细胞因子的任何组合。
表1：人和/或小鼠中CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子的表
在一个实施方案中，表1的细胞因子Flt-3L，趋化因子，GM-CSF，IFN-γ，IL-Iβ，IL-2，IL-2Ra，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12和IL-13被认为在CRS或细胞因子风暴中是显著的。在另一实施方案中，表1中的IFN-a，IFN-β，IL-1和IL-IRa似乎在CRS或细胞因子风暴中是重要的。在另一实施方案中，M-CSF具有未知的重要性。在另一实施方案中，表1中列出的任何细胞因子或其组合可用作CRS或细胞因子风暴的标志物。
表2：人和/或小鼠中CRS或细胞因子风暴中增加的细胞因子的表。
在一个实施方案中，表2中的IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，IL-22，IP-10，MCP-1，MIP-1α，MIP-1β和TNF-α被认为在CRS或细胞因子风暴中具有重要意义。在另一实施方案中，表2中的IL-27，MCP-3，PGE2，RANTES，TGF-β，TNF-αR1和MIG似乎在CRS或细胞因子风暴中是重要的。在另一实施方案中，IL-23和IL-25具有未知的重要性。在另一实施方案中，表2中列出的任何细胞因子或其组合可用作CRS或细胞因子风暴的标志物。在另一实施方案中，小鼠细胞因子IL-10，IL-1β，IL-2，IP-10，IL-4，IL-5，IL-6，IFNα，IL-9，IL-13，IFN-γ，IL-12p70，GM-CSF，TNF-α，MIP-1α，MIP-1β，IL-17A，IL-15/IL-15R和IL-7似乎在CRS或细胞因子风暴中是重要的。
技术人员将理解的是，术语“细胞因子”可包括细胞因子(例如，干扰素γ(IFN-γ)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，肿瘤坏死因子α)，趋化因子(例如，MIP1α，MIP1β，RANTES)和其他可溶性炎症介质，诸如活性氧簇和一氧化氮。
在一个实施方案中，特定细胞因子的增加的释放，无论是显著的，重要的还是具有未知的重要性，不是先前意味着特定细胞因子是细胞因子风暴的一部分。在一个实施方案中，至少一种细胞因子的增加不是细胞因子风暴或CRS的结果。在另一实施方案中，CAR T细胞可以是特定细胞因子或细胞因子组水平升高的来源。
在另一实施方案中，细胞因子释放综合征的特征在于任何或所有以下症状：伴有或不伴有严重的发烧，不适，疲劳，厌食，肌痛，眩晕，恶心，呕吐，头痛皮疹，恶心，呕吐，腹泻，呼吸急促，低氧血症心血管性心动过速，脉压加宽，低血压，心输出量增加(早期)，心输出量减少(晚期)，D-二聚体升高，有或无出血的低纤维蛋白原血症，氮质血症肝转氨酶，高胆红素血症，头痛，精神状态改变，困惑，谵妄，找字困难或坦率失语，幻觉，震颤，dymetria，步态改变，癫痫。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于IL-2释放和淋巴细胞增殖。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于CAR T细胞释放的细胞因子的增加。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于除CAR T细胞之外的细胞释放的细胞因子的增加。
在另一实施方案中，细胞因子风暴导致潜在危及生命的并发症，该并发症包括心脏功能障碍，成人呼吸窘迫综合征，神经毒性，肾和/或肝衰竭，肺水肿和弥散性血管内凝血。
本领域技术人员将理解的是，细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的特征估计在触发CRS或细胞因子风暴后几天至几周发生。在一个实施方案中，CAR T细胞是CRS或细胞因子风暴的触发因素。在另一实施方案中，CRS或细胞因子风暴的触发因素不是CAR T细胞。
在一个实施方案中，细胞因子水平或浓度的测量值，作为细胞因子风暴的指标，可以表示为细胞因子水平或浓度的倍增，百分比(％)增加，净增加或变化速率。在另一实施方案中，超过某一水平或浓度的绝对细胞因子水平或浓度可以是受试者进行或即将经历细胞因子风暴的指示。在另一实施方案中，在一定水平或浓度下的绝对细胞因子水平或浓度，例如通常在未进行CAR-T细胞疗法的对照受试者中发现的水平或浓度，可以是抑制或降低经受CAR T细胞的受试者中细胞因子风暴发生率方法的指示。
技术人员将理解的是，术语“细胞因子水平”可以包括浓度的量度，倍数变化的量度，百分比(％)变化的量度或速率变化的量度。此外，用于测量血液，唾液，血清，尿液和血浆中细胞因子的方法是本领域熟知的。
在一个实施方案中，尽管认识到细胞因子风暴与几种炎性细胞因子的升高有关，但IL-6水平可用作细胞因子风暴的常用量度和/或作为治疗细胞因子风暴效果的常用量度。技术人员会理解的是，其他细胞因子可用作细胞因子风暴的标志物，例如TNF-a，IB-Ia，IL-8，IL-13或INF-γ。此外，用于测量细胞因子的测定方法是本领域已知的。技术人员会理解的是，影响细胞因子风暴的方法可以类似地影响细胞因子释放综合征。
在一个实施方案中，本文公开了减少或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的受试者中细胞因子产生的方法。在另一实施方案中，本文公开了减少或抑制易于经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的受试者中细胞因子产生的方法。在另一实施方案中，本文公开的方法减少或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的受试者中细胞因子的产生，其中表1和/或2中列出的任何细胞因子或细胞因子组的产生被减少或抑制。在另一实施方案中，减少或抑制细胞因子IL-6的产生。在另一实施方案中，减少或抑制细胞因子IL-β的产生。在另一实施方案中，减少或抑制细胞因子IL-8的产生。在另一实施方案中，减少或抑制细胞因子IL-13的产生。在另一实施方案中，减少或抑制细胞因子TNF-α的产生。在另一实施方案中，降低或抑制细胞因子IL-6产生，IL-1β产生或TNF-α产生，或其任何组合。
在一个实施方案中，对细胞因子释放综合征进行了分级。在另一实施方案中，1级描述细胞因子释放综合征，其中症状不是危及生命的并且仅需要对症治疗，诸如发烧，恶心，疲劳，头痛，肌痛，不适。在另一实施方案中，2级症状需要并响应中度干预，诸如氧气，液体或血管加压剂用于低血压。在另一实施方案中，3级症状需要并响应积极干预。在另一实施方案中，4级症状是危及生命的症状并且需要呼吸机和受试者显示器官毒性。
在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于IL-6和干扰素γ释放。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于表1和2中列出的任何细胞因子或其组合的释放。在另一实施方案中，细胞因子风暴的特征在于本领域已知的任何细胞因子或其组合的释放。
在一个实施方案中，症状发作在输注开始后数分钟至数小时开始。在另一实施方案中，症状与峰值细胞因子水平一致。
在一个实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可以辅助CAR T细胞疗法。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于预防CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于改善CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物可有助于减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法且施用凋亡细胞群或凋亡细胞上清液或其组合物的受试者中，细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法，包括施用附加剂。在另一实施方案中，附加剂可以辅助CAR T细胞疗法。在另一实施方案中，附加剂可以辅助抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一实施方案中，附加剂可以辅助治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以预防治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以辅助改善CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以辅助减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中的细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率的方法，其包括施用附加剂。在另一实施方案中，附加剂可以辅助CAR T细胞疗法。在一个实施方案中，抑制或降低经受CART细胞癌疗法的受试者中的细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率的方法，其包括施用附加剂。在另一实施方案中，附加剂可以辅助TCR T细胞疗法。在一个实施方案中，抑制或降低经历受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用附加剂。在另一实施方案中，附加剂可以辅助在一个实施方案中，抑制或降低经历NK细胞疗法的受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率的方法包括施用附加剂。在另一实施方案中，附加剂可以辅助NK细胞疗法。
在另一实施方案中，附加剂可以辅助抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一实施方案中，附加剂可以辅助治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以辅助治疗CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以辅助改善CRS或细胞因子风暴。在另一实施方案中，附加剂可以辅助减轻CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或包含所述凋亡细胞的组合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞上清液或包含所述上清液的组合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括CTLA-4阻断剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和CTLA-4阻断剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括碲基化合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和碲基化合物。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括免疫调节剂。在另一实施方案中，用于减少有害细胞因子释放的附加剂包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物，和免疫调节剂。
在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用CAR T细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂(诸如伊匹单抗)的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包含凋亡细胞，CAR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用TCR T细胞与一种或多种CTLA-4阻断剂(诸如伊匹单抗)的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包括凋亡细胞，TCR T细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包括树突细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂(诸如伊匹单抗)的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包括凋亡细胞，树突细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用NK细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂(诸如伊匹单抗)的组合疗法。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包括凋亡细胞，NK细胞和一种或多种CTLA-4阻断剂的组合疗法。
在另一实施方案中，CTLA-4是有效的T细胞活化抑制剂，其有助于维持自身耐受性。在另一实施方案中，施用抗CTLA-4阻断剂，在另一实施方案中，其是产生T细胞活化净效应的抗体。
在另一实施方案中，通过本文所公开的组合物和方法来进行治疗，预防，抑制，改善，降低发生率或减轻的因施用CAR T细胞，TCR T细胞，树突细胞或NK细胞的其他毒性包括B细胞发育不全或肿瘤溶解综合征(TLS)。
在一个实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中的细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率的方法不会影响CAR T细胞癌疗法的功效。在另一实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中CRS或细胞因子风暴发生率的方法确实降低CAR T细胞疗法功效超过约5％。在另一实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中CRS或细胞因子风暴发生率的方法确实降低CAR T细胞疗法功效超过约10％。在另一实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中CRS或细胞因子风暴发生率的方法确实降低CAR T细胞疗法功效超过约15％。在另一实施方案中，抑制或降低经受CAR T细胞癌疗法的受试者中CRS或细胞因子风暴发生率的方法确实降低CAR T细胞疗法功效超过约20％。
可以使用任何适当的定量细胞毒性的方法来确定修饰以表达CAR的免疫细胞中的活性是否保持基本不变。例如，细胞毒性可以使用基于细胞培养的测定法定量分析，诸如实施例中所描述的细胞毒性测定法。细胞毒性测定法可以使用优先染色死细胞DNA的染料。在其他情况下，可以使用测量细胞群中活细胞和死细胞相对数量的荧光和发光测定法。对于此类测定法，蛋白酶活性用作细胞活力和细胞毒性的标记物，并且标记的细胞可渗透肽产生与样品中活细胞数成比例的荧光信号。例如，细胞毒性测定法可以在流式细胞术分析中使用7-AAD。用于各种细胞毒性测定法的试剂盒购自制造商，诸如Promega，Abeam和LifeTechnologies。
在另一实施方案中，细胞毒性的测量可以是定性的。在另一实施方案中，细胞毒性的测量可以是定量的。在又一实施方案中，细胞毒性的测量可能与细胞毒性细胞因子的表达变化有关。在另一实施方案中，细胞毒性的测量可以通过骨髓和肝脏中的存活曲线和肿瘤负荷来进行确定。
在一个实施方案中，本文所公开的方法包括附加步骤，其可用于克服同种异体供体细胞的排斥。在一个实施方案中，该方法包括在施用CAR T细胞之前完全或部分淋巴细胞清除的步骤，在一个实施方案中，该CAR T细胞是同种异体CAR T细胞。在另一实施方案中，调节淋巴细胞清除以使其延迟宿主抗移植物反应(host versus graft reaction)一段时间，足以使所述同种异体T细胞攻击它们所针对的肿瘤，但程度不足以要求拯救经骨髓移植的宿主免疫系统。在另一实施方案中，延迟同种异体T细胞从淋巴结中排出的试剂，诸如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)，5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]-1,2,4-恶二唑(SEW2871)，3-(2-(-己基苯基氨基)-2)-氧乙基氨基)丙酸(W123)，2-铵基-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯硫基)苯基)-2-(羟甲基)丁基磷酸氢酯(KRP-203磷酸酯)或其他本领域已知的试剂，可以用于本文所公开的组合物和方法的一部分，以允许使用具有功效并且缺乏移植物抗宿主病的同种异体CAR T细胞。在一个实施方案中，同种异体T细胞的MHC表达被沉默以降低同种异体细胞的排斥。在另一实施方案中，凋亡细胞阻止同种异体细胞的排斥。
与CAR T细胞疗法相关的细胞因子释放
在一个实施方案中，细胞因子释放发生在施用免疫疗法(诸如CAR T细胞疗法)后几天至2周之间。在一个实施方案中，低血压和其他症状遵循细胞因子释放，即从几天到几周。因此，在一个实施方案中，将凋亡细胞或凋亡细胞上清液与免疫疗法同时施用于受试者以作为预防。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3小时向受试者施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在替代实施方案中，在免疫治疗之前将凋亡细胞或凋亡细胞上清液施用给受试者以作为预防。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前1天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3小时向受试者施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，可以治疗性地施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证明细胞因子释放综合征开始的细胞因子释放，可以施用凋亡细胞或上清液。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可终止增加的细胞因子水平或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液可以在多个时间点治疗性施用。在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液的施用至少在本文所述的两个时间点。在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液的施用至少在本文所述的三个时间点。在另一实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液在CRS或细胞因子风暴之前，并且一旦发生细胞因子释放综合征，及其任何组合。
在一个实施方案中，一起施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法和凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液后施用CAR T细胞疗法。在另一实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液前施用CAR T细胞疗法。根据本方面并且在一个实施方案中，在CAR T细胞疗法后约2-3周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约6-7周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约9周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后长达数月施用凋亡细胞疗法。
因此，在一个实施方案中，将凋亡细胞或凋亡细胞上清液与免疫疗法同时施用给受试者以作为预防。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3小时向受试者施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在替换实施方案中，在免疫治疗之前将凋亡细胞或凋亡细胞上清液施用给受试者以作为预防。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前1天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14天向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3小时向受试者施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14小时向受试者施用凋亡细胞或上清液。
在另一实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，可以治疗性地施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证明细胞因子释放综合征开始的细胞因子释放，可以施用凋亡细胞或上清液。在一个实施方案中，凋亡细胞或上清液可终止增加的细胞因子水平或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液可以在多个时间点治疗性施用。在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液的施用至少在本文所述的两个时间点。在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液的施用至少在本文所述的三个时间点。在另一实施方案中，凋亡细胞或凋亡细胞上清液的施用在CRS或细胞因子风暴之前，并且一旦发生细胞因子释放综合征，及其任何组合。
在一个实施方案中，一起施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法和凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液后施用CAR T细胞疗法。在另一实施方案中，在凋亡细胞疗法或上清液前施用CAR T细胞疗法。根据本方面并且在一个实施方案中，在CAR T细胞疗法后约2-3周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约6-7周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约9周施用凋亡细胞疗法或上清液。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后长达数月施用凋亡细胞疗法。
在其他实施方案中，同时向受试者施用免疫疗法和附加剂以作为预防。在一个实施方案中，附加剂包括凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节化合物，或任何组合。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14天向受试者施用附加剂。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-3小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后7小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后10小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后14小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法后2-14小时向受试者施用附加剂。
在替代实施方案中，在免疫治疗之前将附加剂施用于受试者以作为预防。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前1天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14天向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14天向受试者施用附加剂。
在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-3小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前7小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前10小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前14小时向受试者施用附加剂。在另一实施方案中，在施用免疫疗法前2-14小时向受试者施用附加剂。
在另一实施方案中，一旦发生细胞因子释放综合征，治疗性地施用附加剂。在一个实施方案中，一旦检测到导致或证明细胞因子释放综合征开始的细胞因子释放，可以施用附加剂。在一个实施方案中，附加剂可终止增加的细胞因子水平或细胞因子释放综合征，并避免其后遗症。
在另一实施方案中，附加剂可以在多个时间点治疗性施用。在另一实施方案中，附加剂的施用至少在本文所述的两个时间点。在另一实施方案中，附加剂的施用至少在本文所述的三个时间点。在另一实施方案中，附加剂的施用在CRS或细胞因子风暴之前，并且一旦发生细胞因子释放综合征，及其任何组合。
在一个实施方案中，一起施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法和附加剂。在另一实施方案中，向CAR T细胞疗法施用附加剂。在另一实施方案中，在附加剂之前施用CAR T细胞疗法。根据本方面并且在一个实施方案中，在CAR T细胞疗法后约2-3周施用附加剂。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约6-7周施用附加剂。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后约9周施用附加剂。在另一实施方案中，在CAR T细胞疗法后长达数月施用附加剂。
在一个实施方案中，CAR T细胞相对于受试者是异源的。在一个实施方案中，CAR T细胞衍生自一种或多种供体。在一个实施方案中，CAR T细胞衍生自一种或多种骨髓供体。在另一实施方案中，CAR T细胞衍生自一种或多种血库捐赠。在一个实施方案中，供体是匹配的供体。在一个实施方案中，CAR T细胞是通用的同种异体CAR T细胞。在另一实施方案中，CAR T细胞是同源的(syngeneic)CAR T细胞。在另一实施方案中，CAR T细胞来自不匹配的第三方供体。在另一实施方案中，CAR T细胞来自合并的第三方供体T细胞。在一个实施方案中，供体是骨髓供体。在另一实施方案中，供体是血库供体。在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法的CAR T细胞包括一种或多种MHC非限制性肿瘤定向嵌合受体。在一个实施方案中，可以根据本领域已知的方案工程改造或施用非自体T细胞以预防或最小化自身免疫反应，诸如美国专利申请号20130156794中所述，该专利申请通过引用整体并入本文。
在另一实施方案中，CAR T细胞相对于受试者是自体同源的。在一个实施方案中，使用受试者自己的细胞。在本实施方案中，如果使用受试者自身的细胞，则在凋亡细胞疗法后施用CAR T细胞疗法。
在一个实施方案中，凋亡细胞相对于受试者是异源的。在一个实施方案中，凋亡细胞衍生自一种或多种供体。在一个实施方案中，凋亡细胞衍生自一种或多种骨髓供体。在另一实施方案中，凋亡细胞衍生自一种或多种血库捐赠。在一个实施方案中，供体是匹配的供体。在另一实施方案中，凋亡细胞来自不匹配的第三方供体。在一个实施方案中，凋亡细胞是通用的同种异体凋亡细胞。在另一实施方案中，凋亡细胞来自同源的供体。在另一实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体。在一个实施方案中，供体是骨髓供体。在另一实施方案中，供体是血库供体。在另一实施方案中，凋亡细胞相对于受试者是自体同源的。在一个实施方案中，使用受试者自己的细胞。
根据一些实施例，将本文所公开的治疗性富含单核细胞的细胞制剂或凋亡细胞上清液全身施用于受试者。在另一实施方案中，通过静脉途径给药。或者，治疗性富含单核细胞的细胞或上清液可根据各种其他途径施用给受试者，包括但不限于肠胃外，腹膜内，关节内，肌肉内和皮下途径。每种可能性代表本文所公开的单独实施例。
根据一些实施例，将本文所公开的治疗性富含单核细胞的细胞制剂或附加剂全身施用于受试者。在另一实施方案中，通过静脉途径给药。或者，治疗性富含单核细胞的细胞或附加剂可根据各种其他途径施用给受试者，包括但不限于肠胃外，腹膜内，关节内，肌肉内和皮下途径。每种可能性代表本文所公开的单独实施例。
在一个实施方案中，制剂以局部而非全身方式施用，例如，通过将制剂直接注射到受试者身体的特定区域中。在另一实施方案中，特定区域包含肿瘤或癌症。
在另一实施方案中，将治疗性富含单核细胞的的细胞或上清液施用于悬浮在合适的生理缓冲液中的对象，诸如但不限于盐水溶液，PBS，HBSS等。此外，悬浮培养基还可以包括有助于维持细胞活力的补充剂。在另一实施方案中，将附加剂施用于悬浮在合适的生理缓冲液中的受试者，诸如但不限于盐水溶液，PBS，HBSS等。
根据一些实施例，药物组合物是静脉施用。根据另一实施例，药物组合物以单一剂量施用。根据替代实施例，药物组合物以多剂量施用。根据另一实施例，药物组合物以两个剂量施用。根据另一实施例，药物组合物以三个剂量施用。根据另一实施例，药物组合物以四个剂量施用。根据另一实施例，药物组合物以五个或更多剂量施用。根据一些实施例，配制药物组合物用于静脉注射。
在一个实施方案中，向受试者提供经修饰的表达CAR的免疫细胞的任何合适方法可用于本文所述的方法。在一个实施方案中，向受试者提供细胞的方法包括造血细胞移植(HCT)，将供体来源的NK细胞输注到癌症受试者中，或其组合。
在另一实施方案中，本文公开了抑制或降低进行表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，其中该方法包括将包括凋亡细胞的组合物施用给所述受试者的步骤。
在另一实施方案中，本文公开了抑制或降低进行表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，其中该方法包括将凋亡细胞上清液(诸如凋亡细胞吞噬细胞上清液)施用给所述受试者的步骤。
在另一实施方案中，本文公开了抑制或降低进行表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，其中该方法包括将至少一种附加剂施用给所述受试者的步骤。
在特定实施方案中，CAR T细胞疗法包括施用本文所公开的组合物，该组合物包括CAR T细胞，和或凋亡细胞或凋亡细胞上清液，或本文所公开的另一种附加剂或附加剂的组合。在替换实施方案中，CAR T细胞疗法包括施用本文所公开的组合物，该组合物包括CAR T细胞和组合物，该组合物包括或凋亡细胞或凋亡细胞上清液，或本文所公开的另一种附加剂或附加剂的组合。
与非CAR T细胞应用相关的细胞因子释放
在一个实施方案中，本文公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，该方法包括施用包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物给所述受试者的步骤，其中所述施用减少或抑制所述受试者中细胞因子的产生。在另一实施方案中，将细胞因子产生的减少或抑制与经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响且未施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液的受试者进行比较。在另一实施方案中，用于降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制了促炎细胞因子的产生。在另一实施方案中，用于降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制了至少一种促炎细胞因子的产生。在另一实施方案中，用于降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制了至少细胞因子IL-6的产生。在另一实施方案中，用于降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制了至少细胞因子IL-Iβ的产生。在另一实施方案中，用于降低或抑制细胞因子产生的方法降低或抑制了至少细胞因子TNF-α的产生。在另一实施方案中，与经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴而不施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液的受试者相比，本文公开的用于减少或抑制细胞因子产生的方法导致所述受试者中细胞因子IL-6，IL-Iβ或TNF-a或任何组合产生的减少或抑制。
癌症或肿瘤也可影响细胞因子(包括促炎细胞因子)的绝对水平。受试者的肿瘤负荷水平可能影响细胞因子水平，特别是促炎细胞因子。本领域技术人员将理解的是，短语“减少或抑制”或其语法变体可包括细胞因子产生倍数的减少或抑制，或细胞因子产生的净减少或抑制，或减少或抑制的百分比(％)，或可包括细胞因子产生减少或抑制的变化率。
在另一实施方案中，本文公开了减少或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，该方法包括施用凋亡细胞或含凋亡细胞的组合物给所述受试者的步骤。
在另一实施方案中，本文公开了减少或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，该方法包括施用凋亡细胞上清液(诸如凋亡细胞-吞噬细胞上清液)或包括所述上清液的组合物给所述受试者的步骤。
在另一实施方案中，本文公开了减少或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，该方法包括施用凋亡细胞上清液(诸如附加剂，其选自凋亡细胞，凋亡细胞上清液，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合)或包括所述上清液的组合物给所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，感染引起了受试者中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，感染是流感感染。在一个实施方案中，流感感染是H1N1。在另一实施方案中，流感感染是H5N1禽流感。在另一实施方案中，感染是严重急性呼吸综合症(SARS)。在另一实施方案中，受试者患有Epstein-Barr病毒相关的噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HLH)。在另一实施方案中，感染是败血症。在一个实施方案中，败血症是革兰氏阴性。在另一实施方案中，感染是疟疾。在另一实施方案中，感染是埃博拉病毒感染。在另一实施方案中，感染是天花病毒。在另一实施方案中，感染是全身性革兰氏阴性细菌感染。在另一实施方案中，感染是Jarisch-Herxheimer综合征。
在一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)。在另一实施方案中，HLH是散发性HLH。在另一实施方案中，HLH是巨噬细胞活化综合征(MAS)。在另一实施方案中，引发受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是MAS。
在一个实施方案中，引发受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是慢性关节炎。在另一实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是全身型幼年特发性关节炎(sJIA)，也称为斯蒂尔病。
在一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是隐热蛋白-相关周期综合征(cryopyrin associated periodic syndrome；CAPS)。在另一个实施方案中，CAPS包括家族性冷自身炎症综合征(FCAS)，也称为家族性冷荨麻疹(FCU)。在另一实施方案中，CAPS包括Muckle-Well综合征(MWS)。在另一实施方案中，CAPS包括慢性婴儿神经皮肤和关节(CINCA)综合征。在又一个实施方案中，CAPS包含FCAS，FCU，MWS或CINCA综合征，或是它们的任意组合。在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCAS。在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCU。在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是MWS。在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是CINCA综合征。在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是FCAS，FCU，MWS或CINCA综合征，或是它们的任意组合。
在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是冷炎素病，其包括遗传或从头获得的NLRP3基因功能突变，NLRP3基因也被称为CIASI基因。
在另一个实施方案中，引发受试者细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的原因是遗传性自身炎症性疾病。
在一个实施方案中，释放炎性细胞因子的触发因素是脂多糖(LPS)，革兰氏阳性毒素，真菌毒素，糖基磷脂酰肌醇(GPI)或RIG-1基因表达的调节。
在另一个实施方案中，经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的受试者不具有传染病。在一个实施方案中，受试者患有急性胰腺炎。在另一个实施方案中，受试者患有组织损伤，其在实施方案中是严重烧伤或创伤。在另一个实施方案中，受试者患有急性呼吸窘迫综合征。在另一个实施方案中，受试者患有继发于药物使用的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在另一个实施方案中，受试者患有继发于毒素吸入的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。
在另一个实施方案中，受试者患有继发于接受免疫疗法的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴，其在一个实施方案中是用超兴奋剂CD28特异性单克隆抗体(CD28SA)进行的免疫疗法。在一个实施方案中，CD28SA是TGN1412。在另一个实施方案中，免疫疗法是CAR T细胞疗法。在另一个实施方案中，免疫疗法是。
在另一个实施方案中，可以使用凋亡细胞或上清液或CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合控制由施用药物组合物引起的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，药物组合物是奥沙利铂，阿糖胞苷，来那度胺或其任意组合。
在另一个实施方案中，凋亡细胞或上清液或CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合可以被用来控制由施用抗体引起的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。在一个实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是多克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗体所述抗体是利妥昔单抗(rituximab)。在另一个实施方案中，所述抗体是Orthoclone OKT3(muromonab CD3)。在另一个实施方案中，抗体是阿仑单抗，托西单抗，CP-870,893，LO-CD2a/BTI-322或TGN1412。
在另一个实施方案中，控制炎性细胞因子产生可能有益的疾病的实例包括癌症，过敏症，任何类型的感染，中毒性休克综合征，败血症，任何类型的自身免疫疾病，关节炎，克罗恩病，狼疮，牛皮癣或任何其他疾病(其标志性特征是毒性细胞因子释放，在受试者中引起有害作用)。
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)
α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是一种循环的52kDa糖蛋白，主要由肝脏产生。AAT主要被称为丝氨酸蛋白酶抑制剂，由SERPINA1基因编码。AAT抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，并且循环AAT中遗传的缺乏导致肺组织恶化和肝脏疾病。健康个体中的血清AAT浓度在炎症期间增加两倍。
AAT水平与几种炎性疾病的严重程度之间存在负相关。例如，已经在患有HIV感染，糖尿病，丙型肝炎感染诱导的慢性肝病和几种类型的血管炎的受试者中描述了降低的AAT水平或活性。
越来越多的证据表明，人血清来源的α-1-抗胰蛋白酶(AAT)减少了促炎细胞因子的产生，诱导了抗炎细胞因子，并干扰了树突细胞的成熟。
实际上，向人外周血单核细胞(PBMC)中添加AAT抑制LPS诱导的TNF-α和IL-1β的释放，但增加IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)和IL-10的产生。
AAT降低体外IL-1β介导的胰岛毒性，并且AAT单一疗法延长胰岛同种异体移植物存活，促进小鼠中的抗原特异性免疫耐受，并延迟非肥胖糖尿病(NOD)小鼠中糖尿病的发展。在实验模型中显示出了AAT抑制LPS诱导的急性肺损伤。最近，显示AAT在急性心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型中减少梗塞的大小和心力衰竭的严重性。
临床级人AAT(hAAT)的单一疗法减少了循环促炎细胞因子，减少了移植物抗宿主病(GvHD)的严重程度，并且在实验性同种异体骨髓移植后延长了动物存活率(田原等，美国科学院院刊，2012年1月10日；109(2):564-9)，在此被引入作为参考。AAT治疗减少了同种异体反应性T效应细胞的扩增，但增强了T调节性T细胞(Tregs)的恢复，从而改变了供体T效应细胞与T调节细胞的比例，有利于减少病理过程。在体外，AAT抑制LPS诱导的促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β的体外分泌，增强抗炎细胞因子IL-10的产生，并损害宿主树突细胞中的NF-κB易位。Marcondes,血液.2014年(10月30日；124(18)：2881-91)，通过引用这篇文章表明，用AAT治疗不仅改善了GvHD，而且保留了甚至增强了移植物抗白血病(GVL)效应。
在一个实施方案中，本文公开了包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物。在另一个实施方案中，CAR T细胞和α-1-抗胰蛋白酶(AAT)是在分开的组合物中。在另一个实施方案中，AAT包含全长AAT或其功能片段。在另一个实施方案中，AAT包含全长AAT或其功能片段的类似物。在另一个实施方案中，包含AAT的组合物还包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在另一个实施方案中，本文公开了治疗，预防，抑制，降低受试者中癌症或肿瘤发生率，改善或减轻受试者中癌症或肿瘤的方法，包括施用表达嵌合抗原受体的T细胞的步骤(CAR T-细胞)和包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者。在另一个实施方案中，该方法还包括凋亡细胞或凋亡细胞上清液。
在另一个实施方案中，本文公开了抑制或降低经历嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。在另一个实施方案中，治疗经历嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。在另一个实施方案中，预防经历嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。在另一个实施方案中，改善经历嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。在另一种实施方案中，减轻经历嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。
在另一个实施方案中，公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，包括施用包含α-1-抗胰蛋白酶(AAT)的组合物给所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，AAT被单独施用以控制细胞因子的释放。在另一个实施方案中，施用AAT和凋亡细胞或其组合物，或凋亡细胞上清液或其组合物以控制细胞因子释放。
免疫调节剂
技术人员将理解，免疫调节剂可包括细胞外介质，受体，细胞内信号传导途径的介质，翻译和转录的调节剂，以及免疫细胞。在一个实施方案中，本文公开的附加剂是本领域已知的免疫调节剂。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用免疫调节剂降低至少一种细胞因子的水平。在另一个实施方案中，在本文公开的方法中使用免疫调节剂降低或抑制CRS或细胞因子风暴。
在一个实施方案中，免疫调节剂包含阻断，抑制或减少细胞因子或趋化因子释放的化合物。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含阻断、抑制或减少IL-21或IL-23或其任意组合释放的化合物。在另一个实施方案中，免疫调节剂包括趋化因子受体-5(CCR5)受体拮抗剂类中的抗逆转录病毒药物，例如马拉维罗克。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含抗DNAM-1抗体。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含选自硫酸肝素、ATP和尿酸或其任何组合的损伤/病原体相关分子(DAMP/PAMP)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含结合唾液酸的Ig样凝集素(Siglecs)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含耐受的细胞介质，例如调节性CD4+CD25+T细胞(Tregs)或不变的天然杀伤T细胞(iNK T细胞)。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含树突细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含单核细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含巨噬细胞。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含选自鲁索替尼和托法替尼的JAK2或JAK3抑制剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含脾酪氨酸激酶(Syk)的抑制剂，例如fostamatinib。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白脱乙酰酶抑制剂伏立诺他乙酰化STAT3。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含类泛素化修饰抑制剂，例如MLN4924。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含miR-142拮抗剂。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含胞苷的化学类似物，例如阿扎胞苷。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白去乙酰化酶的抑制剂，例如伏立诺他。在另一个实施方案中，免疫调节剂包含组蛋白甲基化抑制剂。
碲基化合物
碲是在人体中发现的微量元素。各种碲化合物具有免疫调节特性，并且在各种临床前和临床研究中已经显示出具有有益效果。例如，特别有效的含碲化合物家族公开于美国专利No.4,752,614；4,761,490；4,764,461and4,929,739.。例如，该含碲化合物家族的免疫调节特性描述于美国专利No.4,962,207,5,093,135,5,102,908和5,213,899，这些都通过引用并入，如同在此完全阐述一样。
一种很有前景的化合物是三氯(二氧乙烯-O,O')碲酸铵，其在本文和本领域中也称为AS101。AS101，作为上文讨论的含碲化合物家族的代表性实例，其显示出抗病毒性(自然，免疫学，细胞生长调节。7(3):163-8,1988；艾滋病研究和人类逆转录酶病毒。8(5):613-23,1992),和杀肿瘤活性(自然，330(6144):173-6,1987；临床肿瘤学杂志13(9):2342-53,1995；免疫学，161(7):3536-42,1998)。此外，AS101的特征在于低毒性。
在一个实施方案中，包含含碲的免疫调节剂化合物的组合物可用于本文公开的方法中，其中碲基化合物刺激免疫应答的先天和后天的获得(arm)。例如，已经证明AS101是小鼠中干扰素(IFN)的有效激活剂(国家癌症研究所杂志，88(18):1276-84,1996)和人类(自然，免疫学，细胞生长调节，9(3):182-90,1990；免疫学70(4):473-7,1990；国家癌症研究所杂志，88(18):1276-84,1996.)
在另一个实施方案中，碲基化合物诱导分泌一系列细胞因子，例如IL-1α，IL-6和TNF-α。
在另一个实施方案中，碲基化合物包含本领域已知的具有免疫调节性质的碲基化合物。在另一个实施方案中，碲基化合物包含三氯(二氧乙烯-O,O')碲酸铵。
在一个实施方案中，碲基化合物抑制至少一种细胞因子的分泌。在一个实施方案中，碲基化合物减少至少一种细胞因子的分泌。在另一个实施方案中，碲基化合物抑制或减少细胞因子风暴的细胞因子释放综合征(CRS)。
在一个实施方案中，本文公开了包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和碲基化合物的组合物。在另一个实施方案中，CAR T细胞和碲基化合物是在分开的组合物中。在另一个实施方案中，AAT包含全长AAT或其功能片段。在另一个实施方案中，AA包含全长AAT的类似物或其功能片段。
在另一个实施方案中，本文公开了一种治疗、预防、抑制、降低受试者中癌症或肿瘤发生率，改善或减轻受试者中癌症或肿瘤的方法，包括向所述受试者施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含碲基化合物的组合物的步骤。
在另一个实施方案中，本文公开了抑制或降低经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生率的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给受试者的步骤。在另一个实施方案中，治疗经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给受试者的步骤。在另一个实施方案中，预防经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给受试者的步骤。在另一个实施方案中，改善经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给受试者的步骤。在另一个实施方案中，减轻经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)疗法的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给受试者的步骤。
在另一个实施方案中，公开了降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法，包括施用包含碲基化合物的组合物给所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，碲基化合物被单独施用以控制细胞因子的释放。在另一个实施方案中，碲基化合物和凋亡细胞或其组合物，或凋亡细胞上清液或其组合物被施用以控制细胞因子释放。
遗传修饰
在一个实施方案中，可以使用RNA，DNA，重组病毒或其组合完成T细胞、树突细胞和/或凋亡细胞的遗传修饰。在一个实施方案中，衍生自γ逆转录病毒或慢病毒的载体用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，这些载体可以整合到宿主基因组中，可能永久表达转基因并具有低的内在免疫原性。在另一个实施方案中，整合到宿主基因组中和/或具有低内在免疫原性的另一种载体可以用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，非病毒载体介导的睡美人转座子系统用于将CAR和其他基因插入T细胞中。在另一个实施方案中，“自杀基因”整合到T细胞中，其中促凋亡基因的表达在响应于全身递送的药物的诱导型启动子的控制下。
在一个实施方案中，遗传修饰可以是瞬时的。在另一个实施方案中，遗传修饰可以利用信使RNA(mRNA)。在另一个实施方案中，可以在瞬时工程改造的T细胞中多次输注大量细胞，例如mRNA转染的T细胞。在另一个实施方案中，使用体外转录mRNA进行的基于RNA的淋巴细胞电穿孔介导蛋白质的瞬时表达约一周，并且避免整合病毒载体的风险。在另一个实施方案中，mRNA转导的树突细胞或mRNA电穿孔的T和NK淋巴细胞。
已经证明，遗传修饰的T细胞可以在过继转移后持续超过十年没有副作用，这表明遗传修饰人T细胞基本上是安全的。
在另一个实施方案中，组合物的遗传修饰和本文公开的方法可以是本领域已知的任何方法。
凋亡细胞
在一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞(Apocell)如WO2014/087408中所述，该文献的全部内容通过引用并入本文。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞以本领域已知的任何方式产生。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞与进行治疗的受试者是自体同源的。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞与进行治疗的受试者是同种异体的。在另一个实施方案中，包含凋亡细胞的组合物包含本文公开的或本领域已知的凋亡细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞包括含有富含单核细胞的细胞制剂，其中所述制剂包含至少85％的单核细胞，其中所述制剂中至少40％的细胞处于早期凋亡状态，其中制剂中至少85％的细胞是活细胞，并且其中制剂包含不超过15％的CD15高表达细胞。
本领域技术人员将理解，术语“早期凋亡状态”可以包括显示细胞凋亡的早期迹象而没有晚期凋亡迹象的细胞。细胞凋亡的早期迹象的实例包括磷脂酰丝氨酸(PS)的暴露和线粒体膜电位的丧失。晚期事件的实例包括碘化丙啶(PI)进入细胞和最终的DNA切割。为了证明细胞处于“早期凋亡”状态，在一个实施方案中，使用膜联蛋白-V和PI染色的PS暴露检测，并且用膜联蛋白V但不用PI染色的细胞被认为是“早期的凋亡细胞“。在另一个实施方案中，被膜联蛋白-V FITC和PI染色的细胞被认为是“晚期凋亡细胞”。在另一个实施方案中，不被膜联蛋白-V或PI染色的细胞被认为是非凋亡的活细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中细胞的至少90％处于早期凋亡状态的所述细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中细胞的至少80％处于早期凋亡状态的所述细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中细胞的至少70％处于早期凋亡状态的所述细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中细胞的至少60％处于早期凋亡状态的所述细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含其中细胞的至少50％处于早期凋亡状态的所述细胞。
在另一个实施方案中，早期凋亡细胞是稳定的。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过24小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过36小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过48小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定至少72小时。在另一个实施方案中，早期凋亡细胞稳定超过72小时。
本领域技术人员会理解，术语“稳定”包括保持PS阳性的凋亡细胞(磷脂酰丝氨酸阳性)仅具有非常小百分比的PI阳性(碘化丙啶阳性)。PI阳性细胞表明膜的稳定性，其中PI阳性细胞允许进入细胞，表明膜不太稳定。在一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持早期凋亡至少24小时，至少36小时，至少48小时，或至少72小时。在一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持早期凋亡24小时，36小时，48小时，或72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞保持早期凋亡超过24小时，超过36小时，超过48小时，或超过72小时。在另一个实施方案中，稳定的早期凋亡细胞在延长的时间段内维持其状态。在一个实施方案中，包含凋亡细胞的组合物还包含抗凝血剂。
在一个实施方案中，抗凝血剂选自：肝素，柠檬酸葡萄糖(ACD)式A及其组合。
在一个实施方案中，组合物还包含甲基强的松龙。在一个实施方案中，甲基强的松龙的浓度不超过30μg/ml。在一个实施方案中，施用约140×106-210×106个凋亡细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞以高剂量使用。在一个实施方案中，凋亡细胞在高浓度下使用。在一个实施方案中，使用人凋亡的多形核嗜中性粒细胞(PMN)。在一个实施方案中，使用一组细胞，其中50％是凋亡细胞。在一个实施方案中，通过May-Giemsa染色的细胞质样蛋白验证凋亡细胞。在一个实施方案中，通过台盼蓝拒染法评估细胞的存活力。在一个实施方案中，细胞的凋亡和坏死状态通过膜联蛋白V/碘化丙锭染色并通过FACS检测来确认。
在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞不包含坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于1％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于2％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于3％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于4％的坏死细胞。在一些实施方案中，本文公开的凋亡细胞包含少于5％的坏死细胞。
在一个实施方案中，施用10x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x107个凋亡细胞的剂量。在另一实施方案中，施用10x108个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x109凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x1010凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x1011凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x1012凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x105凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x104凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x103凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用10x102凋亡细胞的剂量。
在一个实施方案中，施用高剂量的凋亡细胞。在一个实施方案中，施用35x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用210x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用70x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用剂量为140x106的凋亡细胞。在另一个实施方案中，施用35-210×106个凋亡细胞的剂量。
根据一些实施方案，根据本文公开的制备方法，获得富含单核细胞的细胞组合物通过白细胞去除术实现。技术人员会理解，术语“白细胞分离术”可以包括单采血液成分术，其中白细胞与供体的血液分离。根据一些实施方案，供体的血液经历白细胞分离，因此根据本文公开的制备方法获得富含单核细胞的细胞组合物。应注意，如本领域已知的，需要在白细胞分离期间使用至少一种抗凝血剂，以防止收集的细胞凝结。
根据一些实施方案，白细胞分离术程序被配置为允许根据本文公开的制备方法收集富含单核细胞的细胞组合物。根据一些实施方案，通过白细胞分离术获得的细胞集合包含至少65％。在其他实施方案中，至少70％或至少80％的单核细胞。每种可能性代表本文公开的单独实施方案。根据一些实施方案，平行收集来自细胞供体的血浆，以获得根据本文公开的制备方法的富含单核细胞的细胞组合物。根据一些实施方案，平行收集来自细胞供体的约300-600ml血浆，以获得根据本文公开的制备方法的富含单核细胞的细胞组合物。根据一些实施方案，平行收集的血浆与根据本文公开的制备方法获得富含单核细胞的细胞组合物一起用作冷冻和/或培养基的一部分。每种可能性代表本文公开的单独实施方案。获得用于本文公开的组合物和方法的富含的凋亡细胞群的其他详细方法可以在WO2014/087408中找到，该文献的全部内容通过引用并入本文。
应注意，根据一些实施方案，虽然最初的富含单核细胞的细胞制剂包含至少65％的单核细胞，至少70％或至少80％的单核细胞，但本文公开的根据本文制备方法制得的最终药物组合物包含至少85％。在另一个实施方案中，至少90％或至少95％的单核细胞。每种可能性代表本文公开的单独实施方案。
在一个实施方案中，凋亡细胞可以通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内，皮下，结内，瘤内，鞘内，胸膜内，腹膜内和直接施用于胸腺。
在一个实施方案中，凋亡细胞是同种异体的。在一个实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体。在一个实施方案中，本文公开的方法包括可用于克服同种异体供体细胞排斥的另外步骤，包括美国专利申请20130156794中描述的一个或多个步骤，该专利申请通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，所述方法包括在施用凋亡细胞之前完全或部分淋巴细胞清除的步骤，在一个实施方案中，所述凋亡细胞是同种异体凋亡细胞。在一个实施方案中，调节淋巴细胞清除以使其延迟宿主对移植物反应的时间足以使同种异体凋亡细胞控制细胞因子释放。在另一个实施方案中，所述方法包括施用延迟同种异体凋亡T细胞从淋巴结中排出的药剂的步骤，例如2-氨基-2-[2-(4-辛基苯基)乙基]丙烷-1,3-二醇(FTY720)，5-[4-苯基-5-(三氟甲基)噻吩-2-基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]-1,2,4-恶二唑(SEW2871)，3-(2-(-己基苯基氨基)-2-氧代乙基氨基)丙酸(W123)，2-铵基-4-(2-氯-4-(3-苯氧基苯硫基)苯基)-2-(羟甲基)丁基磷酸氢盐(KRP-203磷酸盐)或本领域已知的其他试剂可用作本文公开的组合物和方法的一部分，以允许使用具有功效且没有移植物抗宿主病发生的同种异体凋亡细胞。在另一个实施方案中，同种异体凋亡T细胞的MHC表达被沉默以减少同种异体细胞的排斥。
在另一个实施方案中，所述方法包括在施用受体之前照射来自供体白细胞的凋亡细胞的步骤。在一个实施方案中，以避免凋亡细胞群内残留活细胞的增殖和/或活化的方式照射细胞。在另一个实施方案中，经照射的凋亡细胞保留其所有早期凋亡，免疫调节，稳定性性质。在另一个实施方案中，照射步骤使用紫外线照射。在另一个实施方案中，照射步骤使用伽马照射。在另一个实施方案中，凋亡细胞包含降低百分比的活的非凋亡细胞，包含具有抑制凋亡细胞制剂中存在的任何活的非凋亡细胞的细胞活化的制剂，或包含具有减少的凋亡细胞制剂中存在的任何活的非凋亡细胞的增殖的制剂，或其任何组合。
在一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂包含处于早期凋亡状态的单核细胞，其中所述合并的单核细胞凋亡细胞包含降低百分比的活的非凋亡细胞，具有抑制任何活的非凋亡细胞的细胞活化的制剂，或具有任何活的非凋亡细胞增殖减少的制剂，或其任何组合。在另一个实施方案中，已经照射了合并的单核细胞凋亡细胞。在另一个实施方案中，本文公开了合并的单核凋亡细胞制剂，其在一些实施方案中源自获自捐献的血液的白细胞部分(WBC)。
在一个实施方案中，照射凋亡细胞制剂。在另一个实施方案中，所述照射包括γ照射或UV照射。在另一个实施方案中，与未照射的凋亡细胞制剂相比，经照射的制剂具有减少数量的非凋亡细胞。在另一个实施方案中，与未照射的凋亡细胞制剂相比，经照射的制剂具有减少数量的增殖细胞。在另一个实施方案中，与未照射的凋亡细胞群相比，经照射的制剂具有减少数量的潜在免疫活性细胞。
在一个实施方案中，合并的血液包含供体和受体之间不匹配的第三方血液。
本领域技术人员将理解，术语“合并”可包括从多个供体收集的血液，制备并可能储存以供以后使用。然后可以处理该组合的血液池以产生合并的单核细胞凋亡细胞制剂。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂确保可获得单核凋亡细胞的持续供应。在另一个实施方案中，在孵育步骤之前合并细胞，其中诱导细胞凋亡。在另一个实施方案中，在重悬浮步骤的孵育步骤后合并细胞。在另一个实施方案中，在照射步骤之前合并细胞。在另一个实施方案中，在照射步骤后合并细胞。在另一个实施方案中，在制备方法的任何步骤合并细胞。
在一个实施方案中，合并的凋亡细胞制剂衍生自存在于约2至25单位血液中的细胞。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制剂包含存在于约2-5、2-10、2-15、2-20、5-10、5-15、5-20、5-25、10-15、10-20、10-25、6-13、或6-25单位血液的细胞。在另一个实施方案中，所述合并的凋亡细胞制剂包含存在于约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19、20、21、22、23、24或25个单位血液的细胞。所需血液单位的数量还取决于从血液中回收WBC的效率。例如，低效率WBC回收将导致需要额外的单位，而高效WBC回收将导致需要的单位更少。在一些实施方案中，每个单位是一袋血。在另一个实施方案中，合并的凋亡细胞制剂包含至少25单位血液，至少50单位血液或至少100单位血液中存在的细胞。每种可能性代表本文公开的单独实施方案。
在一个实施方案中，血液单位包括来自献血的白细胞(WBC)碎片。在另一个实施方案中，捐赠可以来自血液中心或血库。在另一个实施方案中，所述捐赠可以来自在制备合并的凋亡细胞制剂时收集的医院中的供体。在另一个实施方案中，将包含来自多个供体的WBC的血液单位保存并维持在为本文公开的组合物及其方法的目的而建造的独立血库中。在另一个实施方案中，为本文公开的组合物及其方法开发的血库能够供应来自多个供体的包含WBC的血液单位并且包含白细胞去除单位。
在一个实施方案中，合并的WBC的单位不受HLA匹配的限制。因此，所得的合并的凋亡细胞制剂包含不受HLA匹配限制的细胞群。因此，在某些实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂包含同种异体细胞。
衍生自不受HLA匹配限制的合并的WBC的合并的单核细胞凋亡细胞制剂的优点是WBC来源容易获得并且降低了获得WBC的成本。
在一个实施方案中，合并的血液包含来自不依赖于HLA匹配的多个供体的血液。在另一个实施方案中，合并的血液包含来自多个供体的血液，其中已经考虑了与受体的HLA匹配。例如，其中1个HLA等位基因，2个HLA等位基因，3个HLA等位基因，4个HLA等位基因，5个HLA等位基因，6个HLA等位基或7个HLA等位基因在供体和受体之间匹配。在另一个实施方案中，多个供体部分匹配，例如一些供体已经与HLA匹配，其中1个HLA等位基因，2个HLA等位基因，3个HLA等位基因，4个HLA等位基因，5个HLA等位基因，6个HLA等位基因或7个HLA等位基因具有在一些捐助者和接受者之间进行了匹配。每种可能性包括如本文所公开的实施例。
在某些实施方案中，可以保留一些活的非凋亡细胞(抗凋亡)在下面描述的诱导凋亡步骤之后。在一个实施方案中，在照射步骤之前观察这些存活的非凋亡细胞的存在。这些存活的非凋亡细胞可能增殖或被激活。在一个实施方案中，衍生自多个供体的合并的单核细胞凋亡细胞制剂可以针对宿主激活，彼此激活，或两者都可以激活。
在一个实施方案中，与未照射的细胞制剂相比，本文公开的经照射的细胞制剂抑制细胞活化和减少增殖。在另一个实施方案中，照射包括γ照射或UV照射。在另一个实施方案中，与未照射的细胞制剂相比，经照射的细胞制剂具有减少数量的非凋亡细胞。在另一个实施方案中，照射包含约15格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约20格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约25格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约30格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约35格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约40格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约45格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约50格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约55格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约60格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含约65格雷单位(Gy)。在另一个实施方案中，照射包含高达2500Gy。在另一个实施方案中，经照射的合并的凋亡细胞制剂保持与未经照射的合并的凋亡细胞制剂相同或相似的凋亡特征，稳定性和功效。
在一个实施方案中，如本文所公开的合并的单核细胞凋亡细胞制剂可稳定长达24小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定至少24小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定超过24小时。在一个实施方案中，如本文所公开的合并的单核细胞凋亡细胞制剂可稳定长达36小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定至少36小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定超过36小时。在一个实施方案中，如本文所公开的合并的单核细胞凋亡细胞制剂可稳定长达48小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定至少48小时。在另一个实施方案中，合并的单核细胞凋亡细胞制剂稳定超过48小时。
在一个实施方案中，产生合并细胞制剂的包含照射步骤的方法保留了在单一匹配供体衍生的凋亡制剂中观察到的早期凋亡，免疫调节和稳定性特性，其中细胞制剂可以不包括照射步骤。在另一个实施方案中，如本文公开的合并的单核细胞凋亡细胞制剂不引起移植物抗宿主病(GVHD)反应。
在本领域中认为细胞制剂的照射是安全的。目前，照射程序按常规进行以捐献血液，防止对WBC的反应。
在另一个实施方案中，如本文所公开的合并的单核细胞凋亡细胞制剂中凋亡细胞的百分比接近100％，从而降低细胞制剂中活的非凋亡细胞的比例。在一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少40％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少50％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少60％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少70％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少80％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少90％。在另一个实施方案中，凋亡细胞的百分比为至少99％。因此，在一个实施方案中，包含减少的或不存在的活的非凋亡细胞部分的细胞制剂可以提供合并的单核细胞凋亡细胞制剂，其在受体中不引发GVHD。每种可能性代表本文公开的实施方案。
或者，在另一个实施方案中，通过特异性除去活细胞群，例如通过靶向沉淀，降低活的非凋亡WBC的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合磷脂酰丝氨酸的磁珠减少活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用结合非凋亡细胞的细胞表面上的标记但不结合凋亡细胞的磁珠来减少活的非凋亡细胞的百分比。在另一个实施方案中，可以使用磁珠来选择凋亡细胞用于进一步制备，所述磁珠结合凋亡细胞但不结合非凋亡细胞的细胞表面上的标记。在另一个实施方案中，通过使用超声来降低活的非凋亡WBC的百分比。
一个实施方案中，凋亡细胞来自合并的第三方供体。
在一个实施方案中，合并的细胞制剂包含至少一种选自下组的细胞类型：淋巴细胞，单核细胞和天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，合并的细胞制剂包含富含的单核细胞群。在一个实施方案中，合并的单核是富含单核细胞的细胞制剂，其包含选自下组的细胞类型：淋巴细胞，单核细胞和天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，富含单核细胞的细胞制剂包含不超过15％，或者不超过10％，通常不超过5％的多形核白细胞，也称为粒细胞(即嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。在另一个实施方案中，合并的单核细胞制剂不含粒细胞。每种可能性代表本文公开的实施方案。
在另一个实施方案中，合并的富含单核细胞的细胞制剂包含不超过15％，或者不超过10％，通常不超过5％的CD15高表达细胞。在一个实施方案中，合并的凋亡细胞制剂包含少于15％的CD15高表达细胞。每种可能性代表本文公开的单独实施方案。
在一个实施方案中，本文公开的合并的富含单核细胞的细胞制剂包含至少80％的单核细胞，至少85％的单核细胞，或者至少90％的单核细胞，或至少95％的单核细胞，其中每种可能性是本文公开的单独实施方案。根据一些实施方案，本文公开的合并的富含单核细胞的细胞制剂包含至少85％的单核细胞。
在另一个实施方案中，具有至少80％的最终合并百分比的单核细胞的任何合并细胞制剂被认为是如本文公开的合并的富含单核细胞的细胞制剂。因此，将具有增加的多形核细胞(PMN)的细胞制剂与具有高单核细胞的细胞制剂合并，产生至少80％单核细胞的“库”，包括本文公开的制剂。根据一些实施方案，单核细胞包含淋巴细胞和单核细胞。
技术人员会理解，术语“单核细胞”可包括具有单叶核的白细胞。在另一个实施方案中，如本文所公开的合并的凋亡细胞制剂包含少于5％的多形核白细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞是T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自与CAR T细胞相同的合并的第三方供体T细胞。在另一个实施方案中，凋亡细胞衍生自CAR T细胞群。
令人惊讶的是，凋亡细胞减少与细胞因子风暴相关的细胞因子的产生，包括但不限于IL-6和干扰素-γ(IFN-γ)，单独或组合，同时保持CAR T细胞疗法的有效性(实施例2)。在一个实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中的细胞因子表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞降低巨噬细胞中的细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞抑制(suppress)巨噬细胞中的细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞抑制(inhibit)巨噬细胞中的细胞因子表达水平。在一个实施方案中，凋亡细胞维持IFN-γ水平以匹配或几乎匹配CAR-T细胞施用之前存在的水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响巨噬细胞中的细胞因子表达水平，但不影响CAR T细胞中的细胞因子表达水平。在另一个实施方案中，凋亡细胞影响DC中的细胞因子表达水平，但不影响CAR T细胞中的细胞因子表达水平。因此出乎意料的是，凋亡细胞可用于维持CAR T细胞疗法的有效性。
在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致CRS的减少。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致严重CRS的减少。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致严重CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致严重CRS的抑制。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致CRS的预防。在另一个实施方案中，凋亡细胞对巨噬细胞，DC或其组合中细胞因子表达水平的影响导致预防严重的CRS。
在另一个实施方案中，凋亡细胞引发T细胞死亡，但不通过细胞因子表达水平的变化。
在另一个实施方案中，凋亡细胞拮抗巨噬细胞和树突细胞的致敏以分泌细胞因子，否则细胞因子会放大细胞因子风暴。在另一个实施方案中，凋亡细胞增加Treg，其抑制炎症反应和/或防止细胞因子的过量释放。
在一个实施方案中，凋亡细胞的施用抑制一种或多种促炎细胞因子。在一个实施方案中，促炎细胞因子包括IL-1β，IL-6，TNF-α或IFN-γ，或其任何组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用促进一种或多种抗炎细胞因子的分泌。在一个实施方案中，抗炎细胞因子包括TGF-β，IL10或PGE2，或其任何组合。
在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用抑制在暴露TLR配体后树突细胞成熟。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用产生潜在致耐受性树突细胞，其在一个实施方案中能够迁移，并且在一个实施方案中，迁移归因于CCR7。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用引发各种信号传导事件，在一个实施方案中是TAM受体信号传导(Tyro3，Axl和Mer)，其在一个实施方案中抑制抗原呈递细胞中的炎症。在一个实施方案中，Tyro-3，Axl和Mer构成受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族，其特征在于激酶结构域和粘附分子样细胞外结构域内的保守序列。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用通过MerTK激活信号传导。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径，其在一个实施方案中负调节NF-κB。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用负调节炎性体，在一个实施方案中，其导致抑制促炎细胞因子分泌，DC成熟或其组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用上调抗炎基因，例如Nr4a，Thbs1或其组合的表达。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用诱导高水平的AMP，在一个实施方案中，其以Pannexin1依赖性方式积累。在另一个实施方案中，凋亡细胞的施用抑制炎症。
凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoSup Mon)
在一个实施方案中，用于本文公开的方法和治疗的组合物包括本文公开的凋亡细胞上清液。
在一些实施方案中，通过包括以下步骤的方法获得凋亡细胞上清液：a)提供凋亡细胞，b)培养步骤a)的凋亡细胞，和c)将上清液与细胞分离。
在一个实施方案中，用于制备如本文公开的凋亡细胞上清液的凋亡细胞与进行治疗的受试者是自体同源的。在另一个实施方案中，用于制备本文公开的凋亡细胞上清液的凋亡细胞和正在接受治疗的受试者是同种异体的。
获得凋亡细胞上清液的凋亡细胞可以是选自受试者的任何细胞类型的细胞，或任何可商购的细胞系，使用的是本领域技术人员已知的诱导细胞凋亡的方法。诱导细胞凋亡的方法可以是缺氧，臭氧，热，照射，化学品，渗透压，pH变化，X射线照射，γ射线照射，UV照射，血清剥夺，肾上腺皮质激素或其组合，或本文所述或本领域已知的任何其他方法。在另一个实施方案中，诱导细胞凋亡的方法产生处于早期凋亡状态的凋亡细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞是白细胞。
在一个实施方案中，所述凋亡白细胞源自外周血单核细胞(PBMC)。在另一个实施方案中，所述白细胞来自合并的第三方供体。在另一个实施方案中，所述白细胞是同种异体的。
根据一个实施方案，通过选择非粘附性白细胞并使其进行凋亡诱导，然后在培养基中进行细胞培养步骤来提供凋亡细胞。用于制备凋亡细胞-吞噬细胞上清液的“白细胞”可以源自免疫系统和/或造血系统的有核细胞的任何谱系或亚谱系，包括但不限于树突细胞，巨噬细胞，masT细胞，嗜碱性粒细胞，造血干细胞，骨髓细胞，自然杀伤细胞等。根据应用和目的，所需白细胞谱系等，根据各种常用方法中的任何一种，白细胞可以以各种合适的方式从任何各种合适的解剖隔室中获得或获得。在一个实施方案中，来源白细胞是原代白细胞。在另一个实施方案中，源白细胞是原代外周血白细胞。
原代淋巴细胞和单核细胞可以方便地来自外周血。外周血白细胞包括70-95％的淋巴细胞和5-25％的单核细胞。
常规地实施从血液中获得特定类型的源白细胞的方法。获得源淋巴细胞和/或单核细胞可以通过例如在抗凝血剂(例如肝素或柠檬酸盐)存在下收集血液来实现。然后将收获的血液在聚蔗糖垫上离心以分离梯度界面处的淋巴细胞和单核细胞，以及沉淀中的中性粒细胞和红细胞。
白细胞可以根据其特异性表面标志物通过标准免疫磁性选择或免疫荧光流式细胞术技术彼此分离，或通过离心淘洗。例如，可以选择单核细胞作为CD14+级分，可以选择T淋巴细胞作为CD3+级分，可以选择B淋巴细胞作为CD19+级分，巨噬细胞作为CD206+级分。
淋巴细胞和单核细胞可以通过使这些细胞经受基质粘附条件而彼此分离，例如通过在组织培养物处理的培养受体中的静态培养，这导致单核细胞而不是淋巴细胞的选择性粘附在细胞粘附基质上。
白细胞也可以从外周血单核细胞(PBMCs)获得，其可以如本文所述分离。
本领域普通技术人员将具有适当培养原代白细胞以产生如本文所公开的所需量的培养的源白细胞的必要专业知识，并且在本领域的文献中可获得用于实施这种培养方法的充分指导。
本领域普通技术人员将进一步拥有建立，购买或以其他方式获得合适的已确定的白细胞细胞系(从中获得凋亡白细胞)的必要专业知识。合适的白细胞细胞系可以从商业供应商获得，例如美国菌种保藏中心(ATCC)。本领域技术人员明白，不应通过显着干扰其产生凋亡白细胞的能力的技术获得来源白细胞。
在一个实施方案中，凋亡细胞包含含有单核细胞的细胞制剂，其中所述制剂包含至少85％的单核细胞，其中制剂中至少40％的细胞处于早期凋亡状态，其中制剂中至少85％的细胞是活细胞，并且制剂包含不超过15％的CD15高表达细胞。
在另一个实施方案中，凋亡细胞可以是凋亡的淋巴细胞。通过用血清剥夺，皮质类固醇或照射处理初级淋巴细胞可以诱导淋巴细胞(例如原代淋巴细胞)的细胞凋亡。在另一个实施方案中，通过用皮质类固醇处理诱导原代淋巴细胞的凋亡是通过用地塞米松处理原代淋巴细胞来实现的。在另一个实施方案中，使用浓度为约1微摩尔的地塞米松。在另一个实施方案中，通过用γ-照射处理原代淋巴细胞来实现通过照射诱导原代淋巴细胞的凋亡。在另一个实施方案中，剂量为约66rad。这种治疗导致适合与吞噬细胞共培养步骤的凋亡淋巴细胞的产生。
在进一步的实施方案中，凋亡细胞可以是凋亡单核细胞，例如原代单核细胞。为了产生凋亡单核细胞，在血清剥夺的条件下使单核细胞经受底物/表面粘附的体外条件。这种治疗导致产生适于与吞噬细胞共培养步骤的非促炎性凋亡单核细胞。
在其他实施方案中，凋亡细胞可以是本文所述的任何凋亡细胞，包括同种异体凋亡细胞，第三方凋亡细胞和凋亡细胞库。
在其他实施方案中，凋亡细胞上清液可以通过凋亡细胞与其他细胞的共培养获得。
因此，在一个实施方案中，凋亡细胞上清液是通过包括以下步骤的方法获得的凋亡细胞上清液：a)提供凋亡细胞，b)提供其他细胞，c)任选地清洗来自步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，和任选地e)将上清液与细胞分离。
在一个实施方案中，与凋亡细胞共培养的其他细胞是白细胞。
因此，在一个实施方案中，凋亡细胞上清液是通过包括以下步骤的方法获得的凋亡细胞-白细胞上清液：a)提供凋亡细胞，b)提供白细胞，c)任选地清洗来自步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，和任选地e)将上清液与细胞分离。
在一个实施方案中，白细胞可以是吞噬细胞，例如巨噬细胞，单核细胞或树突细胞。
在一个实施方案中，白细胞可以是B细胞，T细胞或自然杀伤细胞(NK细胞)。
因此，在一个实施方案中，用于本文公开的方法和治疗的组合物包括WO2014/106666中描述的凋亡细胞-吞噬细胞上清液，其通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，用于本文公开的组合物和方法的凋亡细胞-吞噬细胞上清液以本领域已知的任何方式产生。
在一些实施方案中，凋亡上清液包含凋亡细胞-吞噬细胞上清液，其从吞噬细胞与凋亡细胞的共培养物获得。
在一些实施方案中，凋亡细胞-吞噬细胞上清液通过包括以下步骤的方法获得：a)提供吞噬细胞，b)提供凋亡细胞，c)任选地清洗来自步骤a)和b)的细胞，d)共培养步骤a)和b)的细胞，和任选地e)将上清液与细胞分离。在一些实施方案中，凋亡上清液包含由摄取凋亡细胞的吞噬细胞产生的上清液。
术语“吞噬细胞”表示通过摄取(吞噬)有害的外来颗粒、细菌和死亡或垂死的细胞来保护身体的细胞。吞噬细胞包括例如称为嗜中性粒细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突细胞和肥大T细胞的细胞，优选树突细胞和单核细胞/巨噬细胞。吞噬细胞可以是树突细胞(CD4+HLA-DR+谱系-BDCA1/BDCA3+)，巨噬细胞(CD14+CD206+HLA-DR+)，或源自单核细胞(CD14+)。区分这些不同吞噬细胞的技术是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，通过塑料粘附步骤获得单核细胞。所述单核细胞可以用标记CD14+与B和T细胞区分，而不需要的B细胞表达CD19+和T细胞CD3+。在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导成熟后，在一个实施方案中，获得的巨噬细胞对标志物CD14+，CD206+，HLA-DR+呈阳性。
在一个实施方案中，所述吞噬细胞衍生自外周血单核细胞(PBMC)。
可以通过本领域已知的获得吞噬细胞的任何方法提供吞噬细胞。在一个实施方案中，吞噬细胞如巨噬细胞或树突细胞可以直接从受试者中分离或通过成熟步骤从前体细胞衍生。
在一个实施方案中，巨噬细胞可以直接从受试者的腹膜腔分离并在整个RRPMI培养基中培养。巨噬细胞也可以从脾中分离。
吞噬细胞也可从外周血单核细胞中获得。在所述实施方案中，培养的单核细胞在向细胞培养基中加入(但不限于)巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)后分化成单核细胞衍生的巨噬细胞。
例如，吞噬细胞可以源自外周血单核细胞(PBMC)。例如，可以通过Ficoll梯度离心从个体的细胞净化袋中分离PBMC，在完整的RPMI培养基(10％FBS，1％青霉素/链霉素)中在细胞粘附步骤中铺板90分钟。通过塑料粘附步骤除去非贴壁T细胞，并在补充有重组人M-CSF的完全RPMI环境中培养贴壁T细胞。培养期后，获得单核细胞衍生的巨噬细胞。
可以通过细胞粘附步骤选择吞噬细胞。所述“细胞粘附步骤”是指通过培养条件选择吞噬细胞或可成熟为吞噬细胞的细胞，使培养细胞粘附于表面、细胞粘附表面(例如组织培养皿，基质，囊或袋(具有适当类型的尼龙或塑料))。本领域技术人员将理解，术语“细胞粘附表面”可包括亲水性和带负电荷，并且可以以本领域已知的各种方式获得。在另一个实施方案中，通过使用例如电晕放电或气体等离子体改性聚苯乙烯表面。这些过程产生高能氧离子，其接枝到表面上的聚苯乙烯链上，使得表面变得亲水和带负电。旨在促进细胞粘附的培养受体可从各种商业供应商获得(例如康宁，珀金埃尔默，飞世尔科技公司，常绿科技，能肯公司等)。
可以通过本领域已知的任何用于获得此类细胞的方法来提供B细胞，T细胞和NK细胞。在一个实施方案中，B细胞，T细胞或NK细胞可以直接从受试者中分离或通过成熟步骤从前体细胞衍生。在另一个实施方案中，B，T或NK细胞可以来自B，T或NK细胞系。本领域普通技术人员将拥有建立，购买或以其他方式获得合适的已建立的B细胞，T细胞和NK细胞系的必要专业知识。合适的细胞系可以从商业供应商获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
在一个实施方案中，在共培养步骤d)之前单独培养所述凋亡细胞和所述白细胞，例如吞噬细胞，B，T或NK细胞。
吞噬细胞的细胞成熟发生在细胞培养期间，例如由于向培养基中添加成熟因子。在一个实施方案中，所述成熟因子是M-CSF，其可以用于例如获得单核细胞衍生的巨噬细胞。
用于成熟或选择吞噬细胞的培养步骤可能需要数小时至数天。在另一个实施方案中，所述早熟吞噬细胞在适当的培养基中培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58小时。
用于吞噬细胞的培养基是本领域技术人员已知的，并且可以是例如但不限于RPMI，DMEM，X-vivo和Ultraculture milieus。
在一个实施方案中，凋亡细胞和吞噬细胞的共培养在生理溶液中发生。
在该“共培养”之前，可以将细胞进行清洗步骤。在一个实施方案中，在共培养步骤之前清洗白细胞(例如吞噬细胞)和凋亡细胞。在另一个实施方案中，用PBS清洗细胞。
在所述共培养期间，白细胞(例如，吞噬细胞如巨噬细胞，单核细胞或吞噬细胞，或B，T或NK细胞)和凋亡细胞可以10:1、9:18:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1的比例混合，或者比例为(白细胞：凋亡细胞)1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一个实例中，白细胞与凋亡细胞的比例为1:5。
细胞的共培养可能持续数小时至数天。在一些实施方案中，所述凋亡细胞培养2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52小时。本领域技术人员可以通过测量抗炎化合物的存在、白细胞的存活量和尚未消除的凋亡细胞的量来评估共培养的最佳时间。
由于凋亡细胞的消失，可以用光学显微镜观察吞噬细胞对凋亡细胞的消除。
在一个实施方案中，凋亡细胞的培养物，例如与白细胞培养物共培养(例如吞噬细胞如巨噬细胞，单核细胞或吞噬细胞，或B，T或NK细胞)在培养基和/或与给药(例如注射给受试者)相容的生理溶液中进行。
本领域技术人员会理解，“生理溶液”可包括在培养时间内不会导致白细胞死亡的溶液。在一些实施方案中，在2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52小时内，生理溶液不会导致死亡。在其他实施方案中，是48小时或30小时。
在一个实施方案中，白细胞(例如吞噬细胞如巨噬细胞，单核细胞或吞噬细胞，或B，T或NK细胞)和凋亡细胞在生理溶液中温育至少30分钟。这个培养时间允许吞噬作用开始和细胞因子和其他有益物质的分泌。
在一个实施方案中，这种生理溶液不抑制白细胞衍生的巨噬细胞消除凋亡的白细胞。
在培养或共培养步骤结束时，任选地将上清液与培养的凋亡细胞或共培养细胞分离。将上清液与细胞分离的技术是本领域已知的。例如，可以收集和/或过滤和/或离心上清液以消除细胞和碎片。例如，可以将上清液在室温下以3000rpm离心15分钟以将其与细胞分离。
上清液可在使用前“灭活”，例如通过照射。因此，制备凋亡细胞上清液的方法可包括任选的另外的照射步骤f)。所述“照射”步骤可以被认为是消毒方法，其使用X射线照射(25-45Gy)以足够的级别(rate)来杀死微生物，作为常规进行血液制品灭活。
在本领域中认为上清液的照射是安全的。目前，照射程序对于捐献血液是常规进行的，以防止对WBC的反应。
在一个实施方案中，将凋亡细胞上清液配制成适于施用于受试者的药物组合物，如本文详细所述。
在一个实施方案中，最终产物储存在+4℃。在另一个实施方案中，最终产物用于接下来的48小时。
在一个实施方案中，可以将凋亡细胞上清液(例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液)或包含上清液的药物组合物冻干，例如用于在-80℃下储存。
在一个具体实施方案中，如WO2014/106666的实施例1中所述，可以使用胸腺细胞作为凋亡细胞制备凋亡细胞-吞噬细胞上清液。分离后，照射胸腺细胞(例如用35X灰度照射)并在完全DMEM培养基中培养例如6小时，以允许发生细胞凋亡。平行地，从腹膜腔分离巨噬细胞，在完全RPMI(10％胎牛血清，Peni-Strepto，EAA，Hepes，NaP和2-巯基乙醇)中清洗和培养。然后清洗巨噬细胞和凋亡细胞，并在无酚X-体内培养基中以1/5巨噬细胞/凋亡细胞比例共培养48小时。然后，收集上清液，离心以除去碎片，并且可以冷冻或冻干以进行保存。通过FACS对F4/80的阳性染色可以确认富含巨噬细胞。可以通过FACS使用膜联蛋白-V和7AAD排除的阳性染色来确认细胞凋亡。
在一个实施方案中，与从分别培养的巨噬细胞或凋亡细胞获得的上清液相比，凋亡细胞上清液富含TGF-β的活性和潜伏形式的TGF-β水平。在一个实施方案中，与单独培养的巨噬细胞相比，IL-10水平也增加，并且与单独培养的凋亡细胞相比显著增加。在另一个实施方案中，炎性细胞因子如IL-6是不可检测的，并且IL-1β和TNF是不可检测的或非常低的水平。
在一个实施方案中，与单独培养的巨噬细胞或单独培养的凋亡细胞的上清液相比，凋亡细胞上清液具有增加的IL-1ra，TIMP-1，CXCL1/KC和CCL2/JE/MCP1水平，除TGF-β和IL-10外，这可能提示控制炎症的上清液的耐受作用。
在另一具体实施方案中，如WO2014/106666的实施例3中所述，人凋亡细胞-吞噬细胞上清液可以由源自用凋亡PBMC培养的外周血单核细胞(PBMC)的巨噬细胞的共培养物制备。因此，通过例如Ficoll梯度离心从健康志愿者的细胞净化袋中分离PBMC。然后将PBMC在完全RPMI培养基(10％胎牛血清，1％青霉素链霉素)中铺板90分钟。然后，使用例如35Gy剂量的X射线照射去除非粘附细胞并使其凋亡，并在完全RPMI环境中培养4天(包括培养的第一个48小时后的细胞清洗)，以允许细胞凋亡发生。平行地，非贴壁T细胞在补充有50μg/mL重组人M-CSF的完全RPMI环境中培养4天，包括在最初48小时后的细胞清洗。在4天培养期结束时，将单核细胞衍生的巨噬细胞和凋亡细胞一起清洗并在X-体内培养基中以巨噬细胞和凋亡细胞的比例为1:5再培养48小时。然后收集来自后一种培养物的上清液，离心以除去细胞和碎片，并且可以冷冻或冻干以保存随后使用。
在一个实施方案中，如WO2014/106666中所述，可以在外周血单核细胞(PBMC)的6天内获得人凋亡细胞-吞噬细胞上清液。4天用于在培养物中使用M-CSF添加获得PBMC衍生的巨噬细胞，并且2天多用于PBMC衍生的巨噬细胞与凋亡细胞共培养，对应于在第0天分离的非粘附PBMC。
在一个实施方案中，如WO2014/106666中所述，可以独立于PBMC的供体或来源(细胞净化或血沉棕黄层)获得标准化的人凋亡细胞-吞噬细胞上清液。塑性粘附步骤足以获得显着的富含单核细胞的起始群体(在塑料培养皿上粘附后20至93％的CD14+细胞)。此外，这种贴壁细胞表现出非常低的B和T细胞存在(1.0％的CD19+B细胞和12.8％的CD3+T细胞)。在M-CSF存在下培养T细胞4天后，单核细胞衍生的巨噬细胞与CD14+CD206+HLA-DR+巨噬细胞的比例从0.1％显着增加至77.7％。此时，单核细胞衍生的巨噬细胞可以与凋亡的非贴壁PBMC共培养(47.6％凋亡，如膜联蛋白V染色和7AAD排除所示)，以在48小时内产生凋亡细胞-吞噬细胞上清液。
在一个实施方案中，收集的凋亡细胞-吞噬细胞上清液含有比单独的单核细胞衍生的巨噬细胞的培养上清液或在炎性条件下处理的单核细胞衍生的巨噬细胞(+LPS)包含更多的潜在TGF，并且仅含有痕量或低水平的炎性细胞因子如IL-1β或TNF。
在一个实施方案中，包含凋亡细胞上清液的组合物还包含抗凝血剂。在一个实施方案中，抗凝血剂选自：肝素，柠檬酸酸葡萄糖(ACD)式A及其组合。
在另一个实施方案中，在制造凋亡细胞的过程中加入抗凝血剂。在另一个实施方案中，添加的抗凝血剂选自ACD和肝素，或其任何组合。在另一个实施方案中，ACD的浓度为1％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为2％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为3％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为4％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为5％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为6％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为7％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为8％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为9％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为10％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为约1-10％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为约2-8％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为约3-7％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为约1-5％。在另一个实施方案中，ACD的浓度为约5-10％。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为约0.1U/ml-1.0U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度约为0.2U/ml-0.9U/ml.在另一个实施方案中，肝素的终浓度约为0.3U/ml-0.7U/ml.在另一个实施方案中，肝素的终浓度约为0.1U/ml-0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度约为0.5U/ml-1.0U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度约为0.01U/ml-1.0U/ml.。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.1U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.2U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.3U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.4U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.5U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.6U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.7U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.8U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为0.9U/ml。在另一个实施方案中，肝素的终浓度为1.0U/ml。在另一个实施方案中，ACD的浓度为5％，肝素的终浓度为0.5U/ml。
在一个实施方案中，包含凋亡细胞上清液的组合物还包含甲基强的松龙。在一个实施方案中，甲基强的松龙的浓度不超过30μg/ml。
在一个实施方案中，组合物可以以总剂量或等分试样的凋亡细胞上清液使用，所述凋亡细胞上清液来源于通过细胞分离术(cytapheresis)获得的约14x109个CD45+细胞的共培养物，相当于每千克体重约2亿个细胞(对于70公斤的受试者)。在一个实施方案中，这样的总剂量作为单位剂量的上清液施用，所述上清液衍生自每千克体重约1亿个细胞，和/或以每周间隔作为单位剂量施用。在另一个实施方案中，两者都是如此。根据该实施方案的合适的总剂量包括源自每千克体重约1000万至约40亿个细胞的上清液的总剂量。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约4,000万至约10亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约8,000万至约5亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约1.6亿至约2.5亿个细胞。根据该实施方案的合适的单位剂量包括单位剂量的上清液，其衍生自每千克体重约4百万至约4亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约8百万至约2亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约1600万至约1亿个细胞。在另一个实施方案中，上清液衍生自每千克体重约3200万至约5000万个细胞。
在另一个实施方案中，施用源自约10x106个凋亡细胞的共培养物的一定剂量的凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，施用源自10x107个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x108个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x109个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x1010个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x1011个凋亡细胞的剂量。在另一种实施方案中，施用源自10x1012个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x105个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x104个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x103个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自10x102凋亡细胞的剂量。
在一个实施方案中，施用源自35×106个凋亡细胞的一定剂量的凋亡细胞上清液。在另一个实施方案中，施用源自210×106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自70x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自140x106个凋亡细胞的剂量。在另一个实施方案中，施用源自35-210x106个凋亡细胞的剂量。
在一个实施方案中，凋亡细胞上清液或包含所述凋亡细胞上清液的组合物可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于静脉内，皮下，结内，瘤内，鞘内，胸膜内，腹膜内和直接至胸腺，如本文所详细讨论的。
令人惊讶的是，凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，减少了与细胞因子风暴相关的细胞因子如IL-6的产生。另一种细胞因子IL-2不参与细胞因子释放综合征，尽管由少量DC和巨噬细胞分泌。然而，它是CAR-T细胞存活和增殖所必需的，并且主要由这些T细胞产生。出乎意料的是，凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，不能充分降低IL-2水平，从而对CAR T细胞的存活产生负面影响。
在一个实施方案中，凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，影响巨噬细胞和DC中的细胞因子表达水平，但不影响T细胞自身中的细胞因子表达水平。因此出乎意料的是，凋亡细胞上清液可用于增强CAR T细胞疗法。
在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液引发T细胞死亡，但不通过细胞因子表达水平的变化。
在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，拮抗巨噬细胞和树突细胞的致敏以分泌细胞因子，否则细胞因子将放大细胞因子风暴。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液增加Tregs，其抑制炎症反应和/或防止细胞因子的过量释放。
在一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，抑制一种或多种促炎细胞因子。在一个实施方案中，促炎细胞因子包括IL-1β，IL-6，TNF-α或IFN-γ，或其任何组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用促进一种或多种抗炎细胞因子的分泌。在一个实施方案中，抗炎细胞因子包括TGF-β，IL10或PGE2，或其任何组合。
在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液，例如凋亡细胞-吞噬细胞上清液，在暴露于TLR配体后抑制树突细胞成熟。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用产生潜在的致耐受性树突细胞，在一个实施方案中，其能够迁移，并且在一个实施方案中，迁移归因于CCR7。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用引发各种信号传导事件，在一个实施方案中是TAM受体信号传导(Tyro3，Axl和Mer)，其在一个实施方案中抑制抗原呈递细胞中的炎症。在一个实施方案中，Tyro-3，Axl和Mer构成受体酪氨酸激酶(RTK)的TAM家族，其特征在于激酶结构域和粘附分子样细胞外结构域内的保守序列。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用通过MerTK激活信号传导。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT途径，其在一个实施方案中负调节NF-κB。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用负调节炎性体，在一个实施方案中，其导致抑制促炎细胞因子分泌，DC成熟或其组合。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用上调抗炎基因如Nr4a，Thbs1或其组合的表达。在另一个实施方案中，凋亡细胞上清液的施用诱导高水平的AMP，在一个实施方案中，其以Pannexinl依赖性方式积累。在另一个实施方案中，施用凋亡细胞上清液抑制炎症。
组合物
在一个实施方案中，本文公开了用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物。在另一个实施方案中，本文公开的药物组合物用于维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖率。在另一个实施方案中，用于维持或增加遗传修饰的免疫细胞的增殖率的方法还包括降低或抑制细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，本文公开了用于增加遗传修饰的免疫细胞疗法的功效的药物组合物。在另一个实施方案中，用于增加免疫细胞疗法功效的方法中的组合物还包括降低或抑制CRS或细胞因子风暴的发生率。在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中肿瘤的癌症发生率，改善或减轻受试者中肿瘤的癌症的方法的组合物。在另一个实施方案中，用于治疗，预防，降低受试者中肿瘤或癌症发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的方法中的组合物还包括降低或抑制CRS或细胞因子风暴的发生率。
在另一个实施方案中，药物组合物包含遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体CAR T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体TCR T细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含细胞毒性T淋巴细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含树突细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的免疫细胞包含天然杀伤细胞。在另一个实施方案中，遗传修饰的受体包含遗传修饰的T细胞受体。
在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体，如本文所述在药学上可接受的赋形剂中。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的CAR T细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的TCR T细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的细胞毒性T细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的遗传修饰的树突细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的遗传修饰的天然杀伤细胞和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，用于治疗如本文所述的病症或疾病的药物组合物包含有效量的如本文所述的遗传修饰的T细胞受体和药学上可接受的赋形剂。
在另一个实施方案中，如本文所述的病症或疾病是肿瘤或癌症。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞或其受体的组合物，例如CAR T细胞，其结合如本文所述的目的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，本文公开了包含遗传修饰的免疫细胞或其受体的组合物，例如TCR T细胞，其识别和结合如本文所述的目的蛋白质或肽。在另一个实施方案中，目的蛋白质或肽包含肿瘤抗原或其片段。
在另一个实施方案中，本文公开并用于本文公开的方法的组合物包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液，和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体的组合物可以是与包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的组合物相同的组合物。在另一个实施方案中，包含有效量的CAR T细胞，或TCR T细胞，或细胞毒性T细胞，或遗传修饰的树突细胞，或遗传修饰的天然杀伤细胞的组合物可以是与包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的组合物相同的组合物。在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的T细胞受体的组合物可以是与包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的组合物相同的组合物。在又一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的免疫细胞的(所述免疫细胞选自CAR T细胞，TCR T细胞，细胞毒性T细胞，天然杀伤细胞或树突细胞)组合物与包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的组合物不同。在另一个实施方案中，组合物包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液，以及药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，组合物包含表达遗传修饰的T细胞受体的T细胞(TCR T细胞)和凋亡细胞或凋亡细胞上清液，以及药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，包含有效量的遗传修饰的T细胞受体的组合物与包含凋亡细胞群或凋亡细胞上清液的组合物不同。
在另一个实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞包含处于早期凋亡状态的凋亡细胞。在另一个实施方案中，组合物中包含的凋亡细胞是合并的第三方供体细胞。在另一个实施方案中，包含在本文公开的组合物中的凋亡细胞上清液收集自早期凋亡细胞。在另一个实施方案中，包含在本文公开的组合物中的凋亡细胞上清液收集自合并的第三方供体细胞。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)和凋亡细胞的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)和凋亡细胞上清液的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如TCR T细胞)的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如TCR T细胞)和凋亡细胞的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如TCR T细胞)和凋亡细胞上清液的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如树突细胞)的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如树突细胞)和凋亡细胞的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如树突细胞)和凋亡细胞上清液的组合物还包含用于预防，抑制或调节细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如NK细胞)的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中的细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如NK细胞)和凋亡细胞的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的受试者中细胞因子释放的另外的药物组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如NK细胞)和凋亡细胞上清液的组合物还包含用于预防，抑制或调节患有细胞因子释放综合征或经历细胞因子风暴的病人的细胞因子释放的另外的药物组合物。
在一个实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂，其在一个实施方案中是Ipilimumab。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含如本文中公开的α-1抗胰蛋白酶，或其片段，或其类似物。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含本文公开的碲基化合物。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含如本文所公开的免疫调节剂。在另一个实施方案中，另外的药物组合物包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节化合物，或其任何组合。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂中任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如CAR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合中任一种的药物组合物包含多种组合物，其中每种遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是CAR T细胞)，CTLA-4种阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，包含在单独的组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是CAR T细胞)的组合物，并且包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合中的任一种的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是CAR T细胞)，CTLA-4-阻断剂，或α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合，或其任何组合存在于遗传修饰的免疫细胞中，例如CAR T细胞，组合物和凋亡细胞，或凋亡细胞上清液，包含在单独的组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如TCR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如TCR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合中的任一种的药物组合物包含多种组合物，其中每种遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是TCR T细胞)，CTLA-4种阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，包含在单独的组合物中。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(其在一个实施方案中是TCR T细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合中的任一种的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是TCR T细胞)，CTLA-4-阻断剂，或α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物，或免疫调节剂，或其任何组合，或其任何组合存在于遗传修饰的免疫细胞中，例如，TCR T细胞，组合物和凋亡细胞，或凋亡细胞上清液包含在单独的组合物中，或其任何组合，包含在单独的组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如树突细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如树突细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合中的任一种的药物组合物包含多种组合物，其中每种遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是树突细胞)，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合包含在单独的组合物中。在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是树突细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合中的任何一种的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是树突细胞)，CTLA-4阻断剂，或α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，或其任何组合存在于遗传修饰的免疫细胞中，例如，树突细胞，组合物和凋亡细胞，或凋亡细胞上清液包含在单独的组合物中。
在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如NK细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂中的任一种的药物组合物包含单一组合物。在另一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(例如NK细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞或凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任意组合中的任一种的药物组合物包含多种组合物，其中每种遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是NK细胞)，CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂或其任何组合包含在单独的组合物中。在一个实施方案中，包含遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是NK细胞)的组合物和包含CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，凋亡细胞，凋亡细胞上清液，碲基化合物或免疫调节剂，或其任意组合中的任何一种的药物组合物包含多种组合物，其中遗传修饰的免疫细胞(在一个实施方案中是NK细胞)，CTLA-4阻断剂，或α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或其任何组合，或其任何组合存在于遗传修饰的免疫细胞中，例如，NK细胞，组合物和凋亡细胞，或凋亡细胞上清液包含在单独的组合物中。
本领域技术人员将理解，“药物组合物”可包括本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分(例如生理学上合适的载体和赋形剂)的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向生物体的给药。
本领域技术人员会理解，术语“生理学上可接受的载体”，“药学上可接受的载体”，“生理学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的赋形剂”可以互换使用，可以包括不对生物体造成显著刺激且不会消除所施用的活性成分的生物活性和性质的载体，赋形剂或稀释剂。
技术人员会理解，“赋形剂”可包括添加到药物组合物中的惰性物质，以进一步促进活性成分的给药。在一个实施方案中，赋形剂包括碳酸钙，磷酸钙，各种糖和各种类型的淀粉，纤维素衍生物，明胶，植物油和聚乙二醇。
用于配制和施用药物的技术可在“雷明顿的医药科学”，马克出版有限公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州，最新版本中找到，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，组合物同时施用。在另一个实施方案中，组合物在不同时间给药。在另一个实施方案中，在输注或遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在细胞毒性T细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在自然杀伤细胞输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在树突输注之前施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的T细胞受体之前施用包含凋亡细胞的组合物。
在另一个实施方案中，在输注或遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在细胞毒性T细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在自然杀伤细胞输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在树突输注之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的T细胞受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。
在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其受体之前施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在遗传修饰的免疫细胞或其受体输注之前约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注之前约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注之前约24小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，包含凋亡细胞的组合物在CAR-T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体注射之前约2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时20小时，22小时，24小时，36小时，48小时，60小时或72小时施用。在另一个实施方案中，包含凋亡细胞上清液的组合物在CAR T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注之前约2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时20小时，22小时，24小时，36小时，48小时，60小时或72小时施用。每种可能性代表本文所公开的单独实施例。
在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体后施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后，施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体后施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后，施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后约24小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在输注遗传修饰的免疫细胞或其遗传修饰的受体后施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后约24小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后数小时约2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，36小时，48小时，60小时或72小时施用包含凋亡细胞的组合物。在另一个实施方案中，在CAR-T细胞或细胞毒性T细胞，或TCR T细胞，或天然杀伤细胞，或树突细胞或遗传修饰的T细胞受体输注后数小时约2小时，4小时，6小时，8小时，10小时，12小时，14小时，16小时，18小时，20小时，22小时，24小时，36小时，48小时，60小时或72小时施用包含凋亡细胞上清液的组合物。每种可能性代表本文所公开的单独实施例。
配方
本文公开的包含遗传修饰的免疫应答细胞或包含凋亡细胞或包含凋亡细胞上清液或其任何组合的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液，悬浮液，乳液，分散体或粘性组合物，可以将其缓冲至选定的pH值。液体制剂通常比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物稍微更方便给药，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，多元醇(例如甘油，丙二醇，液体聚乙二醇等)和其合适的混合物。
根据需要，通过将用于实施本文公开的方法的遗传修饰的免疫应答细胞或凋亡细胞上清液掺入所需量的适当溶剂和不同量的其它成分，可以制备无菌可注射溶液。这些组合物可以与合适的载体，稀释剂或赋形剂混合，例如无菌水，生理盐水，葡萄糖，右旋糖等。组合物也可以冻干。该组合物可含有辅助物质，例如润湿剂，分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)，pH缓冲剂，胶凝或粘度增强添加剂，防腐剂，调味剂，着色剂等，这取决于给药途径和想要的制剂。可以参考标准文本，例如“雷明顿的医药科学”，第17版，1985，通过引用并入本文，以制备合适的制剂，而无需过多的实验。
可以加入各种增强组合物稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂，抗氧化剂，螯合剂和缓冲剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射药物形式的延长吸收。然而，根据本文的公开内容，使用的任何载体，稀释剂或添加剂必须与遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞相容。
组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本文公开的组合物的所需等渗性可以使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂如葡萄糖，硼酸，酒石酸钠，丙二醇或其他无机或有机溶质来完成。特别是对于含有钠离子的缓冲剂，氯化钠可能是优选的。
如果需要，可以使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定的水平。甲基纤维素可能是优选的，因为它易于和经济地获得并且易于使用。
其他合适的增稠剂包括，例如，黄原胶，羧甲基纤维素，羟丙基纤维素，卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选的试剂。重要的是使用能达到所选粘度的量。显然，合适的载体和其他添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型的性质，例如液体剂型(例如，组合物是否配制成溶液，悬浮液，凝胶，或另一种液体形式，比如定时释放形式或液体填充形式)。
本领域技术人员将认识到，组合物的组分应选择为化学惰性的，并且不会影响本文公开的方法中描述的遗传修饰的免疫应答细胞的活力或功效。这对于化学和药学原理的技术人员来说没有问题，或者通过参考标准文本或通过简单实验(不涉及过度实验)，从本公开和本文引用的文献中可以容易地避免问题。
关于本文公开的遗传修饰的免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑因素是达到最佳效果所必需的细胞数量。待施用的细胞的量将根据所治疗的受试者而变化。在一个实施方案中，将本文公开的104至1010、105至109或106至108个遗传修饰的免疫应答细胞施用于人受试者。更有效的细胞可以以更小的数量施用。在一些实施方案中，将本文公开的至少约1×108、2×108、3×108、4×108和5×108个遗传修饰的免疫应答细胞施用于人受试者。精确确定什么是有效剂量可以基于每个受试者个体的因素，包括它们的大小，年龄，性别，体重和特定受试者的状况。本领域技术人员可以从本公开内容和本领域的知识容易地确定剂量。
技术人员可以容易地确定组合物中细胞和任选的添加剂，媒介物和/或载体的量，并且可以用本文公开的方法施用。通常，任何添加剂(除活性细胞和/或药剂外)在磷酸盐缓冲盐水中的含量为0.001至50％(重量)，活性成分按微克至毫克顺序存在，例如约0.0001至约5％重量分数。在另一个实施方案中，约0.0001至约1％重量分数。在另一个实施方案中，约0.0001至约0.05％或约0.001至约20％重量分数。在进一步的实施方案中，约0.01至约10％重量分数。在另一个实施方案中，约0.0001至约5％重量分数。当然，对于任何施用动物或人的组合物，以及任何特定的给药方法，优选因此确定：毒性，例如通过在合适的动物模型中测定致死剂量(LD)和LD50，例如，鼠标啮齿动物；以及组合物的剂量，其中组分的浓度和施用组合物的时间，其引起合适的反应。根据本领域技术人员，本公开内容和本文引用的文献的知识，这样的测定不需要过多的实验。并且，无需过度实验即可确定顺序管理的时间。
核酸序列，载体，细胞
在一个实施方案中，本文公开了编码如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸序列，其用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，本文公开了包含编码如本文所述的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列的载体。
在一个实施方案中，本文公开了编码如本文所述的遗传修饰的T细胞受体(TCR)的分离的核酸序列，其用于本文公开的组合物和方法中。在另一个实施方案中，本文公开了包含编码如本文所述的遗传修饰的T细胞受体(TCR)的核酸序列的载体。
免疫应答细胞(例如，T细胞，CTL细胞，NK细胞，树突细胞)的遗传修饰可以通过用重组DNA构建体转导基本上同种的细胞组合物来完成。在一个实施方案中，使用逆转录病毒载体(γ-逆转录病毒或慢病毒)将DNA构建体导入细胞。例如，可以将编码结合抗原的受体(例如，肿瘤抗原，或其抗原，或其片段)的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以从其内源启动子驱动表达，来自逆转录病毒长末端重复，或来自对目标靶细胞类型特异的启动子。也可以使用非病毒载体。
非病毒方法也可用于在细胞中表达蛋白质。例如，可以通过在脂质转染存在下施用核酸将核酸分子引入细胞中(Feigner等，美国国家科学院院刊，84：7413,1987；奥诺等，神经科学通讯，17：259,1990；布里格姆等，美国医学杂志，298：278,1989；Staubinger等，酶学方法，101：512,1983)，脱唾液酸血清类粘蛋白-赖氨酸结合(吴等，生物化学杂志，263：14621，1988；吴等，生物化学杂志，264：16985,1989)，或在手术条件下通过微注射(沃尔夫等，科学，247：1465,1990)。用于基因转移的其他非病毒手段包括使用磷酸钙，DEAE葡聚糖，电穿孔和原生质体融合体外转染。脂质体也可能有利于将DNA递送到细胞中。正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸转移到离体培养细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中来实现，然后将细胞(或其后代)注射到目标组织中或全身注射。还可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如锌指核酸酶，大范围核酸酶或TALE核酸酶)衍生或获得重组受体。可以通过RNA电穿孔获得瞬时表达。用于多核苷酸治疗方法的cDNA表达可以来自任何合适的启动子(例如，人巨细胞病毒(CMV)，猿猴病毒40(SV40)或金属硫蛋白启动子)，并且受任何适当的哺乳动物调节元件或内含子的调节(例如，延伸因子la增强子/启动子/内含子结构)。例如，如果需要，已知优先指导特定细胞类型中基因表达的增强子可用于指导核酸的表达。使用的增强子可包括但不限于表征为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。或者，如果基因组克隆用作治疗构建体，则调节可以通过同源调节序列介导，或者如果需要，可以通过源自异源来源的调节序列介导，包括上述任何启动子或调节元件。
在另一个实施方案中，本文公开了包含载体的细胞，所述载体包含编码本文公开的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列。在另一个实施方案中，本文公开了包含载体的细胞，所述载体包含编码如本文所公开的遗传修饰的T细胞受体(TCR)的核酸序列。
试剂盒
在一个实施方案中，本文公开了用于治疗瘤形成，病原体感染，自身免疫病症或同种异体移植的试剂盒，所述试剂盒包含单独或预混合的本文公开的CAR T细胞和凋亡细胞。
在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所公开的CAR T细胞和凋亡细胞，或者单独或预先混合。在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所公开的CAR T细胞和凋亡细胞上清液，单独或预先混合。
在一个实施方案中，本文公开了用于治疗瘤形成，病原体感染，自身免疫病症或同种异体移植的试剂盒，所述试剂盒包含如本文公开的TCR T细胞和凋亡细胞，单独或预先混合。
在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含本文公开的TCR T细胞和凋亡细胞，或者单独或预先混合。在另一个实施方案中，本文公开了用于治疗，预防，抑制，降低受试者中的癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含如本文所公开的TCR T细胞和凋亡细胞上清液，单独或预先混合。
本文公开了用于治疗或预防瘤形成，病原体感染，免疫病症或同种异体移植，或用于治疗，预防，抑制，降低癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻癌症或肿瘤的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含治疗或预防组合物，其含有本文公开的有效量的免疫应答细胞和单位剂型的凋亡细胞。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含治疗或预防组合物，其含有本文公开的有效量的免疫应答细胞和单位剂型的凋亡细胞上清液。在特定的实施方案中，细胞还包含共刺激配体。在另一个实施方案中，试剂盒还包含选自CTLA-4阻断剂，α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，碲基化合物或免疫调节剂，或任何其组合的任何其他试剂。在一些实施方案中，试剂盒包含无菌容器，其含有治疗性或预防性疫苗；这种容器可以是盒子，安瓿，瓶子，小瓶，管子，袋子，小袋，泡罩包装或本领域已知的其它合适的容器形式。这种容器可以由塑料，玻璃，层压纸，金属箔或适于容纳药物的其他材料制成。
如果需要，提供免疫应答细胞和凋亡细胞或凋亡细胞上清液以及将细胞施用患有或有发展瘤形成，病原体感染，免疫疾病或同种异体移植或肿瘤或癌症风险的受试者的说明书。说明书通常包括关于组合物用于治疗或预防瘤形成，病原体感染，免疫病症，同种异体移植，肿瘤或癌症的信息。在其他实施方案中，说明书包括以下中的至少一种：治疗剂的描述；剂量方案和施用用于治疗或预防瘤形成，病原体感染，免疫紊乱或同种异体移植，癌症，肿瘤或其症状；注意事项；预防措施；警告；适应症；禁忌；超剂量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或作为应用于容器的标签，或作为在容器中或与容器一起提供的单独的薄片，小册子，卡片或文件夹。
技术人员会理解，术语“抗原识别受体”可以包括能够响应抗原结合而激活免疫细胞(例如T细胞)的受体。示例性的抗原识别受体可以是天然或内源性T细胞受体或嵌合抗原受体，其中肿瘤抗原结合结构域与能够激活免疫细胞(例如T细胞)的细胞内信号传导结构域融合。
技术人员会理解，术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，还指保留免疫原结合能力的抗体分子的片段。此类片段也是本领域熟知的，并且通常在体外和体内使用。因此，技术人员会理解，术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，还指众所周知的活性片段F(ab1)2和Fab。F(ab')25和Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，从循环中更快地清除，并且可能具有较少的完整抗体的非特异性组织结合(沃尔等，核医学杂志,24：316-325(1983)。本文公开的抗体包括全天然抗体，双特异性抗体；嵌合抗体，Fab，Fab'，单链V区片段(scFv)，融合多肽和非常规抗体。
本领域技术人员将理解，术语“单链可变片段”或“scFv”包括免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，其共价连接以形成VH::VL异二聚体。重链(VH)和轻链(VL)直接连接或通过编码肽的接头(例如，30、15、20、25个氨基酸)连接，其连接VH的N-末端和VL的C-末端，或具有VL的N末端的VH的C末端，连接子通常富含甘氨酸以获得弹性，以及丝氨酸或苏氨酸以获得溶解性。尽管去除了恒定区并引入了接头，scFv蛋白保留原始免疫球蛋白的特异性。单链Fv多肽抗体可以由包括VH和VL编码序列的核酸表达，如Huston等人所述。(美国国家科学院院刊，85：5879-5883,1988)。还参见美国专利No.5,091,513,5,132,405和4,956,778；和美国专利公开号20050196754和20050196754。已经描述了具有抑制活性的拮抗性scFv(参见，例如，赵等，水瘤(Larchmt)2008 27(6)：455-51；彼得等人，恶病质性肌肉萎缩2012年8月12日；谢等，免疫学杂志2009 183(4)：2277-85；焦马雷利等，血栓形成和止血杂志2007 97(6)：955-63；伊芙等，临床消化杂志2006 1 16(8)：2252-61；布罗克斯等，免疫技术1997 3(3)：173-84；莫斯迈耶等，免疫学1995 2(10：31-40)。已经描述了具有刺激活性的激动性scFv(参见，例如，皮特等，生物化学杂志2003 25278(38)：36740-7；谢等，国家生物技术1 97 15(8):768-71；莱德贝特等，重症免疫学评论1997 1(5-6)-.427-55；霍等，生物化学生物物理学报20031638(3):257-66)。
“亲和力”是指结合强度的量度。不受理论束缚，亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学拟合的接近程度，它们之间的接触面积的大小，以及带电和疏水基团的分布。亲和力还包括术语“亲合力”，其是指在形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。计算抗体对抗原的亲和力的方法是本领域已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能测定(例如，流式细胞术测定)中的抗体活性也反映了抗体亲和力。可以使用功能测定(例如，流式细胞术测定)对抗体和亲和力进行表型表征和比较。
技术人员会理解，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”可以包括与能够激活或刺激免疫细胞的细胞内信号传导结构域融合的抗原结合结构域。在一个实施方案中，CAR的细胞外结合结构域包括衍生自融合鼠或人源化单克隆抗体的可变重和轻区的单链可变片段(scFv)。或者，可以使用衍生自Fab的scFv(而不是来自抗体，例如，从Fab文库获得)，在各种实施方案中，该scFv融合至跨膜结构域，然后融合至细胞内信号传导结构域。在各种实施方案中，选择CAR以对抗原具有高亲和力(affinity)或亲合力(avidity)。
多肽和类似物
本文公开的方法还包括抗-MUC1，CD28，和各种scFv多肽或其片段，其在免疫应答细胞中表达时以增强其抗肿瘤活性的方式(例如人源化单克隆抗体)进行修饰。在某些实施方案中，本文公开的方法包括通过产生序列的改变来优化氨基酸序列或核酸序列。此类改变可包括某些突变，缺失，插入或翻译后修饰。本文提供的公开内容还包括本文公开的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异，翻译后修饰或两者与本文公开的天然存在的多肽不同。本文公开的类似物通常表现出与全部或部分相同的本文公开的天然存在的氨基酸序列至少85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或更多的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15或20个氨基酸残基。在另一个实施方案中，至少25、50或75个氨基酸残基。在另一个实施方案中，超过100个氨基酸残基。同样，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中概率得分在e”3和e”100之间，表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化，羧化，磷酸化或糖基化；在多肽合成或加工过程中或用分离的修饰酶处理后，可以发生这种修饰。类似物也可以通过一级序列的改变而与本文公开的天然存在的多肽不同。这些包括天然和诱导的遗传变异(例如，通过照射或暴露于乙烷甲基硫酸盐的随机诱变或通过萨姆布鲁克，弗里奇和马尼亚蒂斯，分子克隆：实验室手册(第2版)CSH出版社，1989中描述的位点特异性诱变产生)，或奥苏贝尔等，同上)。还包括环化肽，分子和类似物，其含有除L-氨基酸以外的残基，例如D-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸，例如beta(β)或gamma(γ)氨基酸。
非蛋白质类似物具有设计用于模拟本文公开的蛋白质的功能活性的化学结构。根据本文公开的方法施用这些类似物。此类类似物可能超过原始多肽的生理活性。类似物设计的方法是本领域熟知的，并且类似物的合成可以根据这些方法通过修饰化学结构来进行，使得当在免疫应答细胞中表达时，所得类似物增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代备选R基团并改变参考多肽的特定碳原子处的饱和度。在另一个实施方案中，蛋白质类似物对体内降解具有相对抗性，导致施用后更长时间的治疗效果。用于测量功能活性的测定包括但不限于以下实施方案中描述的那些。
术语“免疫抑制活性”描述了细胞(例如，活化的免疫应答细胞)中信号转导的诱导或蛋白质表达的变化，导致免疫应答的降低。已知通过其结合抑制或降低免疫应答的多肽包括CD47，PD-1，CTLA-4及其相应的配体，包括SIRPa，PD-L1，PD-L2，B7-1和B7-2。此类多肽存在于肿瘤微环境中并抑制对肿瘤细胞的免疫应答。在各种实施方案中，抑制、阻断或拮抗免疫抑制多肽和/或其配体的相互作用增强免疫应答细胞的免疫应答。
术语“免疫刺激活性”描述了细胞(例如，活化的免疫应答细胞)中信号转导的诱导或蛋白质表达的变化，导致免疫应答增加。免疫刺激活性可包括促炎活性。已知通过其结合刺激或增加免疫应答的多肽包括CD28，OX-40,4-IBB及其相应的配体，包括B7-1，B7-2，OX-40L和4-1BBL。此类多肽存在于肿瘤微环境中并激活对肿瘤细胞的免疫应答。在各种实施方案中，促进，刺激或激动促炎多肽和/或其配体增强免疫应答细胞的免疫应答。
可用于本文公开的方法的核酸分子包括编码本文公开的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但通常表现出基本的同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下配对以在互补多核苷酸序列(例如，本文所述基因)或其部分之间形成双链分子。(参见，例如，沃尔，G.M.和S.L.伯杰(1987)酶学方法152：399；殷麦曼，A.R.(1987)酶学方法152：507)。
技术人员将理解，术语“基本上相同”可包括与参考氨基酸序列(例如，本文所述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列显示出至少50％同一性的多肽或核酸分子(例如，本文描述的任何一种核酸序列)。在一个实施方案中，这种序列在氨基酸水平或与用于比较的序列的核酸上具有至少60％，80％或85％，90％，95％或甚至99％的同一性。
序列同一性通常使用序列分析软件测量(例如，威斯康星大学生物技术中心遗传学计算机组的序列分析软件包，1710大学路，麦迪逊，Wis.53705，搜寻工具，最佳配合，间隙或堆积/PRETTYBOX程序)。通过将同源性程度指定为各种取代，缺失和/或其他修饰，此类软件匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组内的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其中e-3和e-100之间的概率分数表示密切相关的序列。
技术人员将理解，术语“类似物”可包括具有参考多肽或核酸分子功能的结构相关多肽或核酸分子。
技术人员会理解，术语“配体”可包括结合受体的分子。特别地，配体结合另一细胞上的受体，允许细胞-细胞识别和/或相互作用。
技术人员会理解，术语“组成型表达”可包括在所有生理条件下的表达。
技术人员会理解，术语“疾病”包括损害或干扰细胞，组织或器官的正常功能的任何病症或病症。疾病的实例包括瘤形成或细胞的病原体感染。
技术人员会理解，术语“有效量”可以包括足以具有治疗效果的量。在一个实施方案中，“有效量”是足以阻止，改善或抑制瘤形成的持续增殖，生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。
本领域技术人员将理解，术语“瘤形成”可以包括以细胞或组织的病理性增殖及其随后迁移或侵入其他组织或器官为特征的疾病。瘤形成通常是不受控制的和进行性的，并且在不会引起或将导致正常细胞增殖停止的条件下发生。瘤形成可以影响多种细胞类型，组织或器官，包括但不限于选自膀胱，骨，脑，乳房，软骨，神经胶质，食道，输卵管，胆囊，心脏，肠，肾，肝，肺，淋巴结，神经组织，卵巢，胰腺，前列腺，骨骼肌，皮肤，脊髓，脾，胃，睾丸，胸腺，甲状腺，气管，泌尿生殖道，输尿管，尿道，子宫和阴道的器官，或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，例如肉瘤，癌或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。
技术人员会理解，术语“病原体”可包括能够引起疾病的病毒，细菌，真菌，寄生虫或原生动物。
本领域技术人员将理解，术语“肿瘤抗原”或“肿瘤相关抗原”可包括与正常或非IS肿瘤细胞相比在肿瘤细胞上独特或差异表达的抗原(例如，多肽)。参考本文公开的组合物和方法，肿瘤抗原包括由肿瘤表达的任何多肽，其能够通过抗原识别受体(例如CD19，MUCI)激活或诱导免疫应答，或能够通过受体-配体结合(例如，CD47，PD-L1/L2，B7.1/2)抑制免疫应答。
技术人员会理解，术语“病毒抗原”可包括由能够诱导免疫应答的病毒表达的多肽。
术语“包括”，“包含”，并且旨在具有美国专利法中赋予它们的广泛含义，并且可以表示“包括”，“包括”等。类似地，术语“由......组成”和“基本上由...组成”具有美国专利法中赋予它们的含义。预期本文公开的组合物和方法包含活性成分或特定步骤，由活性成分或特定步骤组成，或基本上由活性成分或特定步骤组成。
本领域技术人员将会了解的是，术语“治疗”可以包括试图改变被治疗个体或细胞的病程的临床干预，且可以是为了预防而进行或者在临床病理学过程中进行。治疗的治疗效果包括但不限于：预防疾病发生或复发，缓解症状，消除任何直接或间接的疾病病理学后果，预防转移，降低疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，以及症状缓解或改善的预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以预防受到影响或诊断了的受试者或被怀疑具有该病症的受试者中由于病症而引起的恶化，而且治疗还可以预防具有病症风险的受试者或者被怀疑具有该病症的受试者中病症的发作或病症症状。
本领域技术人员将会了解的是，术语“受试者”可以包括脊椎动物，在一个实施方案中包括哺乳动物，且在一个实施方案中包括人类。在一个实施方案中，受试者还可以指家养动物诸如牛、羊、马、猫、狗以及实验动物诸如小鼠、大鼠、沙土鼠、仓鼠等。
在一个实施方案中，本文所公开了TCR T细胞，其中TCR针对目标肽。在一个实施方案中，TCR结合目标肽。在另一实施方案中，TCR识别目标肽。在另一实施方案中，TCR是目标肽的配体。在另一实施方案中，目标肽是TCR的配体。这些实施方案中的每一个都应视为是本文所公开的部分。
在一个实施方案中，本文所公开的免疫细胞不是T细胞。在另一实施方案中，本文所公开的免疫细胞不是NK细胞。在另一实施方案中，本文所公开的免疫细胞不是CTL。在另一实施方案中，本文所公开的免疫细胞不是调节性T细胞。在另一实施方案中，本文所公开的免疫细胞不是人胚胎干细胞。在另一实施方案中，免疫细胞不是可以分化出淋巴样细胞的多能干细胞。
使用方法
免疫治疗的一种方法涉及对患者自身的免疫细胞进行改造，以产生能识别并攻击其肿瘤的遗传修饰的免疫细胞。如本文所描述的，收集免疫细胞并进行遗传修饰，以便例如在它们的细胞表面产生将允许免疫细胞例如T细胞识别肿瘤或癌细胞上的特异性蛋白抗原的嵌合抗原受体(CAR)。然后将扩增的遗传修饰的免疫细胞群体例如CAR T细胞施用于患者。在一个实施方案中，所施用的细胞在患者体内增殖并识别和杀死表面上含有该抗原的癌和肿瘤细胞。在另一实施方案中，所施用的细胞在患者体内增殖并识别和杀死肿瘤相关抗原，这导致癌和肿瘤细胞的死亡。
在一个实施方案中，本文公开用于治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包含施用本文所公开的组合物的步骤。
在另一实施方案中，本文公开用于治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包含施用遗传修饰的免疫细胞和包含附加剂的组合物的步骤，其中所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗、预防、抑制、降低受试者中癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中癌症或肿瘤。在另一实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞包含遗传修饰的T细胞、细胞毒性T细胞、Treg细胞、效应T细胞、辅助T细胞、NK细胞或树突细胞。
在另一实施方案中，本文公开用于治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包含施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)和包含附加剂的组合物的步骤，其中所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗、预防、抑制、降低受试者中癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中癌症或肿瘤。
在另一实施方案中，本文公开用于治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包含施用遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR T细胞)和包含附加剂的组合物的步骤，其中所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，其中与施用所述遗传修饰的免疫细胞但未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗、预防、抑制、降低受试者中癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中癌症或肿瘤。
在另一实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物不降低所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一实施方案中，施用包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或者免疫调节剂或它们的任意组合的附加剂或者它们的组合物不降低所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。
在另一实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物增加所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。在另一实施方案中，施用包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或者免疫调节剂凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物的附加剂增加所述施用表达嵌合抗原受体的T细胞治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的功效。
在一个实施方案中，增加遗传修饰的免疫细胞癌症疗法功效的方法包含施用所述遗传修饰的免疫细胞和附加剂，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或者免疫调节剂或它们的任意组合，或者它们的组合物，其中功效与未施用所述附加剂的受试者相比有增加。在另一实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞是T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始CD4+T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始CD8+T细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是天然杀伤(NK)细胞。在另一实施方案中，遗传修饰的免疫细胞是树突细胞。在又一实施方案中，遗传修饰T细胞是细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)。在另一实施方案中，遗传修饰T细胞是调节性T细胞(Treg)。在另一实施方案中，遗传修饰T细胞是嵌合抗原受体(CAR)T细胞。在另一实施方案中，遗传修饰T细胞是遗传修饰的T细胞受体细胞(TCR T细胞)。在另一实施方案中，增加CART细胞癌症疗法功效的方法包含施用所述遗传修饰的免疫细胞和附加剂，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物或者免疫调节剂或它们的任意组合，或者它们的组合物，其中该功效与未施用所述附加剂的受试者相比有增加。
在另一实施方案中，与接受免疫癌症疗法但未施用附加剂的受试者中的促炎细胞因子水平相比，本文的方法降低至少一种促炎细胞因子的产生水平。在另一实施方案中，本文的方法抑制或减少经历遗传修饰的免疫细胞癌症疗法但未施用附加剂的受试者中细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的发生。
在另一实施方案中，本文所公开的方法减少了IL-6。
在另一实施方案中，与接受免疫癌症疗法但未施用附加剂的受试者的致炎细胞因子水平相比，本文的方法增加至少一种细胞因子的生成。在一些实施方案中，附加剂是凋亡细胞，在其他实施方案中，附加剂是凋亡细胞上清。在另一实施方案中，本文所公开的方法增加了IL-2。
本领域技术人员会认识到，本文涉及细胞因子所用的术语“产生(production)”可以包括细胞因子的表达以及从细胞分泌细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子产生增加引起细胞增加细胞因子的分泌。在一个实施方案中，细胞因子产生降低引起细胞降低细胞因子的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法降低至少一种细胞因子的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法降低IL-6的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法增加至少一种细胞因子的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法增加IL-2的分泌。
在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肿瘤细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是T细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是免疫细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是巨噬细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是B淋巴细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是肥大细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是内皮细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是成纤维细胞。在另一实施方案中，分泌至少一种细胞因子的细胞是基质细胞。本领域技术人员会认识到，细胞因子的水平在细胞因子分泌细胞中可以根据细胞周围的环境而增加或降低。
在又一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂增加至少一种细胞因子的分泌。在又一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持至少一种细胞因子的分泌。在还有另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂不降低至少一种细胞因子的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂增加IL-2的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂增加IL-2R的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持IL-2的分泌水平。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持IL-2R的分泌水平。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂不降低IL-2R的分泌水平。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持或增加IL-2的分泌水平。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持或增加IL-2R的分泌水平。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂不降低IL-2R的分泌水平。
在还有另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂降低IL-6的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持、增加或不降低IL-2的分泌水平，同时降低IL-6的分泌。在另一实施方案中，本文所公开的方法中使用的附加剂维持、增加或不降低IL-2R的分泌水平，同时降低IL-6的分泌。
在一个实施方案中，本文所公开的增加CAR T细胞癌症疗法功效的方法包含降低所述受试者的IL-6水平，所述方法包含施用CAR T细胞和附加剂，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，或者碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物，其中功效与未施用所述附加剂的受试者相比有增加。在另一实施方案中，本文所公开的增加CAR T细胞癌症疗法功效的方法包含增加所述受试者的IL-2水平，所述方法包含施用CAR T细胞和附加剂，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，或者碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物，其中功效与未施用所述附加剂的受试者相比有增加。在另一实施方案中，本文所公开的增加CAR T细胞癌症疗法功效的方法包含增加所述CAR T细胞的增殖，所述方法包含施用CAR T细胞和附加剂，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物，或者碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物，其中功效和所述CAR T细胞的增殖与未施用所述附加剂的受试者相比有增加。
在一个实施方案中，增加CAR T细胞癌症疗法功效的方法降低或抑制受试者中细胞因子的产生，所述方法包含施用组合物的步骤，所述组合物包含CAR T细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物。在另一实施方案中，治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法还降低或抑制受试者中细胞因子的产生，所述方法包含施用组合物的步骤，所述组合物包含CAR T细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物。
在另一实施方案中，本文公开对经受CAR T细胞癌症疗法的受试者中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴进行治疗的方法。
在另一实施方案中，治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法还降低或抑制受试者中细胞因子的产生，所述方法包含施用组合物的步骤，所述组合物包含CAR T细胞和CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物，或者免疫调节剂，或者它们的任意组合，或者它们的组合物。
在另一实施方案中，本文公开对经受CAR T细胞癌症疗法的受试者中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴进行预防的方法。在另一实施方案中，本文公开减轻经受CAR T细胞癌症疗法的受试者中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一实施方案中，本文公开改善经受CAR T细胞癌症疗法的受试者中的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴的方法。在另一实施方案中，施用凋亡细胞或凋亡上清液或其组合物不降低CAR T细胞疗法的功效。
在一个实施方案中，本文公开了抑制或降低经历表达嵌合抗原受体的T细胞(CART细胞)癌症疗法的受试者中的细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的方法，其中该方法包含将包含凋亡细胞或凋亡细胞上清或其组合物的组合物施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，抑制或降低细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴发生率通过测量经历表达嵌合抗原受体的T细胞癌症疗法且施用凋亡细胞或凋亡上清液的受试者中细胞因子的水平来确定。在另一实施方案中，将测得的细胞因子水平与未施用CAR T细胞癌症疗法的受试者中的细胞因子水平进行比较。在另一实施方案中，将测得的细胞因子水平与未施用凋亡细胞或凋亡上清液的受试者中的细胞因子水平进行比较。在又一实施方案中，将测得的细胞因子水平与对照受试者进行比较。
在另一实施方案中，与经受CAR T细胞癌症疗法但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清或其组合物的受试者相比，受试者中促炎细胞因子的水平有所减少。在另一实施方案中，与经受CAR T细胞癌症疗法但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清或其组合物的受试者相比，本文所公开的方法降低或抑制受试者中至少一种促炎细胞因子生成的水平。
在另一实施方案中，本文所公开的方法可以进一步包含施用附加剂。可选地，本文所公开的方法可以包含施用附加剂且不是凋亡细胞或凋亡细胞上清。在还有进一步的实施方案中，附加剂可以是对CAR T细胞癌症疗法进行维持、提高或改善或者它们的任意组合的那些化合物或组合物。在又进一步的实施方案中，维持、提高或改善CAR T细胞癌症疗法的附加剂包括CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其功能片段或者其类似物、碲基化合物，或免疫调节剂，或者它们的任意组合。在另一实施方案中，附加剂包括凋亡细胞或凋亡上清。在另一实施方案中，如本文所描述的，附加剂的施用在所述CAR T细胞癌症疗法之前、同时或之后。
在一个实施方案中，在一个实施方案中为托珠单抗的IL-6受体拮抗剂被用于本文所公开的组合物和方法。
在一个实施方案中，过继转移的T细胞在淋巴细胞减少的宿主中更有效地植入和扩增。因此，在一个实施方案中，受试者在转移CAR T细胞或其他修饰的免疫细胞之前经受淋巴耗竭。在另一实施方案中，接受CAR T细胞的受试者被施用T细胞支持的细胞因子。
在一个实施方案中，T细胞是效应T细胞。在另一实施方案中，T细胞是初始T细胞。在另一实施方案中，T细胞是中枢记忆(TCM)T细胞。在另一实施方案中，T细胞是Thl7细胞。在另一实施方案中，T细胞是T记忆干细胞。在另一实施方案中，T细胞是调节性T细胞。在另一实施方案中，T细胞是细胞毒性T细胞。在另一实施方案中，T细胞具有高复制能力。在另一实施方案中，T细胞扩增发生在受试者中。在另一实施方案中，少量细胞可以转移至受试者。在另一实施方案中，T细胞扩增发生在体外。在另一实施方案中，大量细胞可以转移至受试者，细胞和/或上清液可以多次转移至受试者，或者它们组合起来。
在一个实施方案中，CAR T细胞的优势在于，因为它们呈细胞-表面分子特异性，所以它们克服了MHC限制的TCR识别的限制，并且避免肿瘤通过抗原呈递或人白细胞抗原表达的损伤逃逸。
在一个实施方案中，本文公开一种减少受试者中肿瘤负荷的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，减少肿瘤负荷包含减少受试者中的肿瘤细胞数。在另一实施方案中，减少肿瘤负荷包含减小受试者中肿瘤的大小。在另一实施方案中，减少肿瘤负荷包含根除受试者中的肿瘤。
在另一实施方案中，本文公开一种诱发受试者中肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文所公开的用于诱导受试者中肿瘤细胞死亡的方法包含施用免疫细胞(诸如包含工程化的嵌合抗原受体的NK细胞或T细胞)以及至少一种附加剂，以降低受试者中的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(sCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一实施方案中，本文公开一种增加或延长具有肿瘤的受试者生存的方法，其包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文所公开的用于增加或延长受试者生存的方法包含施用免疫细胞(诸如包含工程化的嵌合抗原受体的NK细胞或T细胞)以及至少一种附加剂，以降低受试者中的毒性细胞因子释放或“细胞因子释放综合征”(CRS)或“严重细胞因子释放综合征”(SCRS)或“细胞因子风暴”。
在另一实施方案中，本文公开一种增加或延长具有瘤形成(neoplasia)的受试者生存的方法，其包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。
在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中预防受试者中瘤形成的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，瘤形成选自由血癌、B细胞白血病、多发性骨髓瘤、淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌或它们的组合组成的组。
在另一实施方案中，本文公开一种在有需要的受试者中治疗血癌的方法，其包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在一个实施方案中，血癌选自由B细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病以及非霍奇金淋巴瘤组成的组。
在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中治疗癌症或肿瘤的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中预防癌症或肿瘤的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中抑制癌症或肿瘤的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中减少癌症或肿瘤的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中改善癌症或肿瘤的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。在另一实施方案中，本文公开一种在受试者中减轻癌症或肿瘤荷的方法，所述方法包含将本文所述组合物中的任一种施用于所述受试者的步骤。
在一个实施方案中，本文公开了维持或增加免疫疗法期间遗传修饰的免疫细胞增殖率的方法，该方法包含在免疫疗法期间施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物的步骤。在另一实施方案中，所述遗传修饰的免疫细胞包含T细胞、初始T细胞、初始CD4+T细胞、初始CD8+T细胞、天然杀伤(NK)细胞、树突细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)、调节性T细胞(Treg)、嵌合抗原受体(CAR)T细胞，或者遗传修饰的T细胞受体(TCR)细胞。在另一实施方案中，本文公开了维持或增加免疫疗法期间CAR T细胞增殖率的方法，该方法包含在免疫治疗期间施用包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物的步骤。
在另一实施方案中，维持或增加遗传修饰的免疫细胞增殖率的方法不降低或抑制免疫疗法的功效。例如，在另一实施方案中，维持或增加CAR T细胞增殖率的方法不降低或抑制CAR T细胞癌症疗法的功效。在另一实施方案中，维持或增加遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞增殖率的方法降低或抑制受试者中的细胞因子产生。
在一个实施方案中，如本文所公开的，降低或抑制经历细胞因子释放综合征或细胞因子风暴或者易受细胞因子释放综合征或细胞因子风暴影响的受试者中细胞因子产生的方法降低或抑制细胞因子产生。在另一实施方案中，该方法降低或抑制促炎细胞因子产生。在进一步的实施方案中，该方法降低或抑制至少一种促炎细胞因子。在另一实施方案中，其中受试者正在经受CAR T细胞癌症疗法，该方法不降低CAR T细胞疗法的功效。
本文所提供的方法包含以可有效达到期望效果的量施用本文所公开的T细胞、NK细胞或CTL细胞，不论是减轻现状还是预防复发。对于治疗，施用的量是能有效产生期望效果的量。有效量可以以一次或系列施用而提供。有效量可以以推注或通过连续灌注来提供。
本领域技术人员将理解的是，“有效量”(或者，“治疗有效量”)可以包括足以获得有益的或期望的临床结果的量。有效量可以以一个或多个剂量施用于受试者。就治疗而言，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展，或减少疾病病理学后果的量。有效量通常由医生根据个案情况来确定，且是本领域内技术人员已知的。当确定合适的剂量以达到有效量时，通常考虑若干个因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重，所治疗的病症，病症的严重性以及所施用的抗原结合片段的形式和有效浓度。
在一个实施方案中，本文所公开的方法包含施用包含于单一组合物中的包含遗传修饰的细胞以及附加剂或其组合的组合物。在另一实施方案中，方法包含施用包含于单一组合物中的包含CAR T细胞以及附加剂或其组合的组合物。在另一实施方案中，方法包含施用包含于单一组合物中的包含TCR T细胞以及附加剂或其组合的组合物。
在一个实施方案中，本文所公开的方法包含施用包含于至少两种组合物中的包含遗传修饰的细胞以及附加剂或其组合的组合物。在另一实施方案中，方法包含施用包含于至少两种组合物中的包含CAR T细胞以及附加剂或其组合的组合物。在另一实施方案中，方法包含施用包含于至少两种组合物中的包含TCR T细胞以及附加剂或其组合的组合物。
对于使用抗原特异性T细胞(例如，CAR T细胞)的过继免疫治疗，通常输注在106～1010(例如，109)范围内的细胞剂量。将遗传修饰的细胞施用于宿主并随后分化后，诱导特异性针对特异抗原的T细胞。T细胞的“诱导”可以包括抗原特异性T细胞的失活，诸如通过缺失或失能。失活对于例如在自身免疫性疾病中建立或重建耐受性特别有用。可以通过本领域已知的任何方法来施用修饰的细胞，包括但不限于：静脉内、皮下、节结内、瘤体内、鞘内、胸腔、腹腔以及直接到胸腺。在一个实施方案中，T细胞不是腹腔给药。在一个实施方案中，T细胞是瘤体内给药。
包含本文所公开的遗传修饰的免疫应答细胞(例如，T细胞、N细胞、CTL细胞或它们的祖细胞)的组合物可以系统地或直接提供给受试者用于治疗瘤形成、病原体感染或感染性疾病。在一个实施方案中，本文所公开的细胞被直接注射到目标器官(例如，受瘤形成影响的器官)。可选地，包含遗传修饰的免疫应答细胞的组合物直接提供到目标器官，例如通过施用到循环系统(例如，肿瘤脉管系统)。可以在施用细胞之前、期间或之后提供扩增和分化剂，以增加T细胞、NK细胞或CTL细胞在体外或体内的产生。
在如上述本文所公开的方法中，可以在施用遗传修饰的免疫细胞之前、同时或之后提供包含附加剂的组合物。在一个实施方案中，在本文所公开的方法中，在本文所公开的附加剂之前施用遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞。在另一实施方案中，在本文所公开的方法中，与本文所公开的附加剂同时施用遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞。在另一实施方案中，在本文所公开的方法中，在施用附加剂之后施用遗传修饰的免疫细胞例如CAR T细胞。
在一个实施方案中，本文所公开的方法施用本文所公开的包含凋亡细胞的组合物。在另一实施方案中，本文所公开的方法施用本文所公开的包含凋亡细胞上清液的组合物。
修饰的细胞可以在任何生理上可接受的载体中施用，通常是血管内施用，尽管它们也可以被引入到细胞可以找到合适的再生和分化部位的骨骼或其他方便的部位(例如，胸腺)。通常，至少将施用1x105个细胞，最终达到1x1010或更多。本文所公开的遗传修饰的免疫应答细胞可以包含纯化的细胞群体。本领域技术人员可以使用各种公知的方法诸如荧光激活细胞分选(FACS)容易地确定群体中遗传修饰的免疫应答细胞的百分比。在一些实施方案中，包含遗传修饰的免疫应答细胞的群体的纯度范围约为50％～约55％、约55％～约60％以及约65％～约70％。在其他实施方案中，纯度为约70％～约75％，约75％～约80％，约80％～约85％。在进一步的实施方案中，纯度为约85％～约90％，约90％～约95％，约95％～100％。剂量可由本领域技术人员容易地调节(例如，纯度的降低可能需要增加剂量)。细胞可以通过注射、导管等引入。如果需要，还可以包括各种因子，包括但不限于：白细胞介素(例如，IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL7、IL12、ILIS、IL21以及其他白介素)，集落刺激因子(诸如，G-CSF、M-CSF以及GM-CSF)，干扰素(例如，干扰素-γ和促红细胞生成素)。
组合物包括包含遗传修饰的免疫应答细胞或其祖细胞以及药学上可接受的载体的药物组合物。施用可以是自体的或异体的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以从一个受试者获取，然后施用于同一受试者或者不同的相容受试者。本文所公开的源自外周血的免疫应答细胞或者子代(例如，源自体内、离体或体外)可以经过局部注射而施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉注射或肠胃外施用。当施用本文所公开的治疗性组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，它通常配制成单位剂量的可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
在另一实施方案中，本文公开一种制备包含本文所公开的CAR T细胞或其他免疫细胞以及凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的方法，该方法包含将编码结合目标抗原的CAR的核酸序列引入到T细胞或免疫细胞。在可选实施方案中，从包含凋亡细胞或凋亡上清液的组合物中分离包含本文所公开的CAR T细胞或其他免疫细胞的组合物。
在一个实施方案中，本文公开一种治疗、预防、抑制、降低恶性肿瘤发生、改善或减轻恶性肿瘤的方法，其包含施用包含表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以及凋亡细胞或凋亡细胞上清的组合物的步骤。
本领域技术人员将理解的是，由遗传修饰的免疫细胞(例如CAR修饰的T细胞)引发的抗肿瘤免疫应答可以是主动或被动的免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可能是过继免疫治疗方案的一部分，其中CAR修饰的T细胞诱发对CAR中抗原结合部分特异性的免疫应答。
本领域技术人员将理解的是，免疫治疗可以包括使用免疫效应细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的某些标志物特异的抗体。该抗体可以单独地作为治疗的效应物，或者它可以募集其他细胞来实际影响细胞杀伤。该抗体也可与药物或毒素(化疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)偶联，并且仅作为靶向剂。可选地，效应物可以是携带直接或间接与肿瘤细胞靶标相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
恶性肿瘤
在一个实施方案中，本文公开一种治疗、预防、抑制、降低癌症或肿瘤发生率、改善或减轻癌症或肿瘤的方法，其包含施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以及包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液或其组合物的组合物的步骤。如本文所公开的，这些方法可以进一步包含施用附加剂以努力抑制或降低CRS或细胞因子风暴的发生率。
在一个实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一个实施方案中，B细胞恶性肿瘤是白血病。在另一实施方案中，B细胞恶性肿瘤是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一实施方案中，B细胞恶性肿瘤是慢性淋巴细胞白血病。
在一个实施方案中，癌症是白血病。在一个实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一个实施方案中，淋巴瘤是大B细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。在另一实施方案中，实体瘤是缺乏囊肿或液体区域的异常组织块。在另一实施方案中，实体瘤是由血液、骨髓或淋巴细胞以外的身体组织细胞的异常生长形成的赘生物(新的细胞生长物)或病变(解剖结构的损伤或生理功能的紊乱)。在另一实施方案中，实体瘤由异常细胞团块组成，该异常细胞团块来源于不同组织类型诸如肝脏、结肠、乳腺或肺部，且最初生长在其细胞起源的器官中。然而，这样的癌症在疾病晚期可以通过转移性肿瘤生长扩散至其他器官。
在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。在另一实施方案中，实体瘤的实例是肉瘤、恶性肿瘤和淋巴瘤。在一个实施方案中，实体瘤是腹腔内肿瘤。
在另一实施方案中，实体瘤包含肾上腺皮质肿瘤(腺瘤和癌)、癌、大肠癌、硬纤维瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、内分泌肿瘤、尤文肉瘤、生殖细胞肿瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、横纹肌肉瘤以外的软组织肉瘤以及肾母细胞瘤。在一个实施方案中，实体瘤是乳腺肿瘤。在另一实施方案中，实体瘤是前列腺癌。在另一实施方案中，实体瘤是结肠癌。在一个实施方案中，肿瘤是脑肿瘤。在另一实施方案中，肿瘤是胰腺肿瘤。在另一实施方案中，肿瘤是大肠肿瘤。
在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法对肉瘤和癌(例如，纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、肺癌、肾细胞癌、肝癌、nile duct carcinoma、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞瘤、宫颈癌、子宫癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤以及视网膜母细胞瘤)具有治疗和/或预防效果。本文所公开的组合物和方法可以用于治疗、预防、抑制、改善、降低任何本领域已知的实体瘤的发生率，或者减轻任何本领域已知的实体瘤。
在另一实施方案中，肿瘤是血液肿瘤。在一个实施方案中，血液肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。血液肿瘤可以源于两大血液细胞谱系：髓样细胞系和淋巴样细胞系。髓样细胞系通常生成粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞，而淋巴细胞系生成B、T、NK和血浆细胞。淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤)、淋巴细胞白血病以及骨髓瘤源自于淋巴系，而急性和慢性骨髓性白血病(AML，CML)、骨髓增生异常综合征以及骨髓增生性疾病起源于髓系。
在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法对白血病(例如，急性白血病、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性成髓细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病、急性粒-单核细胞白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、华氏巨球蛋白血症、重链病具有治疗和/或预防功效。本文所公开的组合物和方法可以用于治疗、预防、抑制、改善、降低任何本领域已知的血液肿瘤的发生率，或者减轻任何本领域已知的血液肿瘤。
在一个实施方案中，本文公开了本文所公开的多肽或肽结构域中任一个的活性片段。本领域技术人员将理解的是，术语“片段”可以包括至少5、10、13或15个氨基酸。在其他实施方案中，片段为至少20个连续的氨基酸。本文所公开的片段可以通过本领域已知的方法生成或者可以产生于正常的蛋白质处理(例如，从不是生物活性所需的新生多肽去除氨基酸或者通过可变mRNA剪接或可变蛋白质处理事件除去氨基酸)。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在最广泛的意义上可互换地使用，并且具体指多克隆抗体、单克隆抗体或其保留抗体结合活性的任何片段。在某些实施方案中，本文所公开的方法包含嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的使用。
本领域技术人员将理解的是，术语“多克隆抗体(或抗体)”可以包括针对同一抗原不同决定簇(表位)的不同抗体的群。
本领域技术人员将理解的是，术语“单克隆抗体(或抗体)”可以包括基本同种的抗体的群，即包含该群的各个抗体是相同的，除了可能少量出现的自然发生的突变之外。单克隆抗体直接针对单一的抗原性位点。
本文所公开的单克隆抗体可以使用首次由Kohler等人(《自然》，256:495(1975))描述的杂交瘤方法制得，或者可以通过重组DNA法(例如第4,816,567号美国专利)制得。
在杂交瘤方法中，小鼠或其他适当的宿主动物诸如仓鼠被免疫以诱导产生或能够产生抗体的淋巴细胞，该抗体会特异结合用于进行免疫的蛋白质。目标蛋白质的抗体通常通过皮下(sc)或腹腔(ip)注射期望的目标蛋白质和佐剂而在动物中产生。在一个实施方案中，用偶联到作为载体蛋白质的匙孔血蓝蛋白(KLH，Sigma Aldrich)的目标蛋白质对动物进行免疫。
使用本领域公知的方法制备用于动物免疫的目标蛋白质。例如，目标蛋白质可以通过重组方法或通过肽合成方法来生产。
可选地，可在体外对淋巴细胞进行免疫，然后使用合适的融合剂诸如聚乙二醇与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice，第59～103页(美国学术出版社，1986))。
单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人的Scatchard分析(AnalBiochem.,107:220(1980))来确定。
本文所公开的抗体可以通过使用组合库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来生产。原则上，通过筛选噬菌体库来选择合成抗体克隆，该噬菌体库含有使用本领域公知的方法展示融合于噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)各片段的噬菌体。
本领域技术人员将理解的是，术语“其保持抗体结合活性的任何片段”可以包括抗体的一部分，其可以包含能与完整抗体的靶抗原结合的其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段。
这些抗体片段可以通过重组技术或者通过传统手段诸如酶消化来生成。木瓜蛋白酶消化6个抗体产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段具有单一结合位点)和残余的“Fc”片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原的F(ab')2片段。”Fv“是包含完整的抗原识别和结合位点的最小的抗体片段。
本文所公开的多克隆抗体和单克隆抗体是使用本领域公知的方法制备的。
在一个实施方案中，本文公开CAR T细胞或相关组合物，在该相关组合物中CAR是T细胞内源性的。在一个实施方案中，”内源性“包含核酸分子(例如，cDNA、DNA或RNA分子)或者在细胞或组织中正常表达的多肽。
在另一实施方案中，本文公开CAR T细胞或相关组合物，其中CAR是外源于T细胞的。在一个实施方案中，”外源“包含不是内源存在于细胞或不是以足以实现人工过表达时获得的功能效果的水平存在的核酸分子或多肽。本领域技术人员将理解的是，术语”外源“将因此包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，诸如外来的、异源的和过表达的核酸分子以及多肽。
在一个实施方案中，本文公开免疫细胞，在一个实施方案中是CAR T细胞，在该CART细胞中T细胞与受试者是自体同源。在另一实施方案中，CAR T细胞与受试者是异源的。在一个实施方案中，CAR T细胞是同种异体的。在一个实施方案中，CAR T细胞是通用的同种异体CAR T细胞。在另一实施方案中，T细胞可以是自体、同种异体或者体外衍生自工程化祖细胞或干细胞。
在另一实施方案中，本文所公开的CAR T细胞和凋亡细胞是从相同来源获得的。在进一步实施方案中，本文所公开的CAR T细胞和凋亡细胞都是从受试者获得的(图2B)。在可选实施方案中，本文所公开的CAR T细胞和凋亡细胞是从不同来源获得的。在又一实施方案中，CAR T细胞是自体的，而本文所公开的凋亡细胞是同种异体的(图3)。本领域技术人员将理解的是，类似地，凋亡细胞上清液可以由从与CAR T细胞相同来源获得的细胞制得，其在一个实施方案中可以是自体细胞，或者凋亡细胞上清液可以由从与CAR T细胞的来源不同的来源获得的细胞制得。另外，凋亡细胞上清液可以是从不同来源得到的。在一些实施方案中，凋亡上清液是从正在经历凋亡的细胞得到的。在一些实施方案中，凋亡上清液是从组合细胞培养物得到的，其中凋亡细胞与巨噬细胞共同培养然后收集上清液。
在一些实施方案中，供体包含HLA匹配的供体。在一些实施方案中，供体是不匹配的HLA供体。
本领域技术人员将理解的是，术语“异源”可以包括从不同器官获得的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一个实施方案中，异源蛋白是最初从不同的T细胞类型或与受体不同的物种克隆或获得的蛋白质，并且通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中。
本领域技术人员将理解的是，术语“自体”可以包括供体和受体为同一个人的组织、细胞、核酸分子或多肽。
本领域技术人员将理解的是，术语“同种异体”可以包括从相同物种的不同个体获得的组织、细胞、核酸分子或多肽。在一个实施方案中，同种异体供体细胞与受体在遗传学上是不同的。
在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法利用本文公开的凋亡细胞或凋亡上清液以及一种或多种CTLA-4阻断剂诸如易普利姆玛(Ipilimumab)的联合治疗。在一个实施方案中，CTLA-4是T细胞活化的蛋白抑制剂，其有助于维持自身耐受性。在一个实施方案中，施用抗CTLA-4阻断剂(其在另一实施方案中是抗体)产生最终的T细胞活化效应。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法使用包含凋亡细胞、CAR T细胞以及一种或多种CTLA-4阻断剂的联合疗法。
在一些情况下，与未修饰的氨基酸序列相比，本文所公开的且用于本文所公开方法的多肽包含至少一个保守性氨基酸取代。在其他情况下，多肽包含非保守性氨基酸取代。在这种情况下，与缺乏这种氨基酸取代的多肽相比，具有这种修饰的多肽表现出增加的稳定性或更长的半衰期。
在一个实施方案中，本文所公开的方法可以表示为本文所述的组合物用于本文所述的各种治疗和预防目的的用途，或者可选地本文所述的组合物在制备药物或者治疗性组合物或者用于本文所述的各种治疗和预防目的的组合物中的用途。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物和方法包含各种组分或步骤。然而，在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法主要由各种组分或步骤组成，其中可以包括其他组分或步骤。在另一实施方案中，本文所公开的组合物和方法由各种组分或步骤组成。
在一些实施方案中，术语“包含”可以包括含有影响本领域已知的组合物功效的组合物的其他组分。在一些实施方案中，术语“主要由……组成”包含具有表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以及凋亡细胞或任何凋亡细胞上清液的组合物。然而，可以包括不直接参与组合物效用的其他组分。在一些实施方案中，在本文所述的任何形式或实施方案中，术语“由……组成”包括具有表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)以及本文所公开的任何形式或实施方案的凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物。
在一个实施方案中，“治疗”包含治疗性治疗，而“预防”包含预防性措施，其中目标是预防或减轻如上所述所靶向的病理性症状或异常。因此，在一个实施方案中，治疗可以包括直接影响或治愈、遏制、抑制、预防、减少疾病、障碍或病症或其组合的严重程度，延迟疾病、障碍或病症或其组合的发生率，减少与疾病、障碍或病症或其组合相关的症状。因此，在一个实施方案中，“治疗”、“改善”以及“减轻”特别指延迟进展、加速缓解、诱导缓解、增强缓解、加速恢复、提高功效或降低对替代疗法或其组合的耐药性。在一个实施方案中，“预防”特别指延缓症状的发作，防止疾病复发，减少复发发作的次数或频率，增加症状发作之间的潜伏期，或它们的组合。在一个实施方案中，“遏制”或“抑制”特别指减轻症状的严重性，减小急性发作的严重性，减少症状的数量，减少疾病相关症状的发生率，减少症状的潜伏期，改善症状，减少继发性症状，减少继发感染，延长受试者存活，或它们的组合。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物施用一次。在另一实施方案中，组合物施用两次。在另一实施方案中，组合物施用三次。在另一实施方案中，组合物施用四次。在另一实施方案中，组合物施用至少四次。在另一实施方案中，组合物施用超过四次。
在一个实施方案中，本文所公开的CAR T细胞施用一次。在另一实施方案中，CAR T细胞施用两次。在另一实施方案中，CAR T细胞施用三次。在另一实施方案中，CAR T细胞施用四次。在另一实施方案中，CAR T细胞施用至少四次。在另一实施方案中，CAR T细胞施用超过四次。
本领域技术人员将理解的是，术语“大约”可以包括与指示数字或数字在0.0001～5％的范围的偏差。还有，它可以包括与指示数字或数字在1～10％的范围的偏差。此外，它可以包括与指示数字或数字高达25％的偏差。
本领域技术人员将理解的是，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式，除非上下文中另有明确说明。例如，术语“药剂”或“至少一种药剂”可以包括多种药剂，包括它们的混合物。
在整个申请中，本文所公开的各实施方案可以以范围形式进行介绍。应当理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，不应该被解释为对本公开的范围不灵活的限制。因此，范围的描述应视为具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如1～6应当视为具体公开了子范围诸如1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6等等，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5以及6。无论范围的宽度如何这都适用。
无论本文何时指示数值范围，它意味着包括指示范围内的任何引用的数字(小数或整数)。短语“范围/范围在……之间”在第一指示数字和第二指示数字之间，以及“范围/范围从……”从第一指示数字到第二指示数字在本文中可互换地使用，并且意在包括第一指示数字和第二指示数字以及介于两者之间的所有小数和整数。
在一个实施方案中，本文所公开的组合物是治疗性组合物。在另一实施方案中，本文所公开的组合物具有治疗功效。
在一个实施方案中，本文公开一种组合物，其与单独包含CAR T细胞的组合物相比提供了减少的炎性细胞因子或趋化因子释放，但与单独包含CAR T细胞的组合物相比具有类似的细胞毒性。
实施例
实施例1：凋亡细胞生成过程
目的：生成用于本文所述方法的早期凋亡细胞。
方法：
在WO2014/087408号国际公开和US2015/0275175-A1号美国申请公开中详尽地记载了制备早期凋亡细胞群体的方法，参见例如在“ApoCell制备”和“凋亡细胞生成”的实施例前面的方法部分(第[0223]～[0288]段)，以及实施例11、12、13和14，它们全部并入本文。
图1所示的流程图提供了早期凋亡细胞群体生产过程中所使用的步骤的一个实施方案的概述，其中制备步骤中包括抗凝剂。在流程图中标示了生产过程中添加抗凝剂的时间点。如WO2014/087408号国际公开的实施例14和US2015/0275175-A1号美国申请公开中所详细描述的，其中在冷冻的时候、孵育的时候或者在冷冻的时候和孵育的时候添加抗凝剂来制备细胞群体。以总体积5％的ACD和0.5U/ml肝素的最终浓度，用10U/ml肝素补加入抗凝剂ACD制剂A。包括抗凝剂的方法稳定地产生至少40％的早期凋亡细胞，甚至在含有高甘油三酯浓度的血浆存在下也是如此。
上面引用的方法部分和实施11提供了在没有抗凝剂的情况下制备凋亡细胞群体的另一实施方案的细节。
结果：
在冷冻的时候和融化后孵育期间都添加抗凝剂导致最稳定的早期凋亡细胞高产量。即使在供体血浆中甘油三酯含量高的情况下，也产生了稳定的早期凋亡细胞的高产率(参见，WO2014/087408号国际公开中的实施例12和13以及US-2015-0275175-Al号美国申请公开)。注意，抗凝剂没有添加到用于配制输注的最终早期凋亡细胞剂量的PBS培养基中。
下面的表3示出了添加和没有添加抗凝剂的情况下制备的细胞群体(细胞批次)的比较。
表3：有和无抗凝剂情况下制备的批次之间细胞群体分析比较
不添加抗凝剂而制备早期凋亡细胞的方法产生具有至少40％早期凋亡细胞的早期凋亡细胞群体，通常具有至少50％早期凋亡细胞。
实施例2：凋亡细胞在体外细胞因子风暴模型中对细胞因子释放的影响
目的：检测凋亡细胞对在LPS不育的巨噬细胞活化综合征模型中诱发的细胞因子风暴的细胞因子风暴标记物(细胞因子IL-6、IL-10、MIP-1α、IL-8、TNF-α、ΜΙΡ-1β、MCP-1以及IL-9)水平的影响。
方法：
细胞系和培养试剂
人淋巴瘤细胞系Raji(eCACC,英国，查询号85011429)，人宫颈癌细胞系HeLa(ATCC，美国，编号CCL-2)和HeLa-CD19(ProMab公司，美国，目录号PM-Hela-CD19)被培养于添加有10％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，南美洲，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号35050-038)以及100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，ThermoFisher Scientific，美国，目录号15140-122)的RPMI 1640(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号31870-025)中，该RPMI 1640下文称为“完全培养基”。HeLa-CD19培养基进一步添加有1μg/ml嘌呤霉素(Sigma-Aldrich公司，美国，目录号P9620)作为标准培养期间的选择性抗生素。
所有细胞保持在近汇合状态。Raji细胞维持在0.3x106-2x106个细胞/ml的浓度范围。将HeLa和HeLa-CD19细胞在容器充填90％汇合时进行传代。
初级单核细胞是从献血者血液的血沉棕黄层(Sheba Medical Center，以色列)分离的。首先，在Ficoll梯度密度(Ficoll-Paque PLUS，GE医疗生命科学公司，英国，目录号17-1440-03)上分离外周血单核细胞(PBMC)。离心(800xg，2～8℃，20min，间断0)之后，将含有PBMC的界面层转移到新试管中并用添加有2mM L-谷氨酰胺(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-605E)和10mMHepes(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-737B)的RPMI-1640(Lonza公司，瑞士，目录号BE12-918F)清洗，下文称为“清洗培养基”，然后离心(650xg，2～8℃，10min)将沉淀的细胞重悬于“清洗培养基”至5x106个细胞/ml的浓度。以0.9ml的滴状将细胞接种在35-mm培养板(康宁公司，美国，目录号430165)的中央。将培养板在湿润培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1.5小时，使得单核细胞能进行粘附，然后用预热的PBS(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-516F)清洗3次，除去其他细胞类型。清洗之后，将细胞培养于2ml添加有10％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，南美洲，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号35050-038)以及100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号15140-122)的RPMI1640(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号31870-025)，亦称为“完全培养基”。
所有细胞系都在37℃且含有5％CO2的湿润培养箱中培养。
简言之，按照制造商的使用说明，将靶细胞(HeLa或HeLa-CD19)单独培养或与单核细胞联合培养。在靶细胞粘附到培养板上(6小时～过夜)后，将培养物暴露于y x106个ApoCells ApoCells细胞1小时，之后通过4～5次RPMI清洗来洗去这些细胞。在光学显微镜下视检确认除去ApoCells细胞。将10ng/ml LPS(Sigma-Aldrich，美国，目录号L4391)引入到共培养物并孵育1h。孵育之后，用RPMI3～5次清洗循环除去LPS。以指定的E/T比添加活的CD19-CAR T细胞或初始T细胞并孵育4h。为了收集培养液，在250xg、2～25℃、4min下将培养板进行离心(离心机5810R，Eppendorf公司，德国)以便使细胞沉降。从每个孔转移50μl上清培养液到新的平底96孔板微孔培养板(康宁公司，美国，目录号3596)，然后每个孔添加50μlCytoTox96试剂。在室温下将培养板在黑暗中孵育30min，之后每个孔添加50μl终止液来终止反应。使用酶标仪Infinite F50(Tecan公司，瑞士)在492nm处读取并用Magellan F50软件捕获吸光度。使用微软Excel2010进行数据分析和生成图表。
在与凋亡细胞孵育或与凋亡细胞上清液孵育后，使用Liminex技术进行细胞因子释放的分析。
结果：图9A至图9H显示由LPS在体外巨噬细胞活化综合征模型中诱发的细胞因子风暴标记物IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、ΜΙΡ-1β、MCP-1和IL-9的水平显著降低。虽然施用ApoCells以达到1:8的巨噬细胞:ApoCell比导致释放到培养基中的IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、ΜΙΡ-1β、MCP-1和IL-9的水平显著降低(图9A、9B、9C、9D、9E、9F、9G、9H)，而施用ApoCells以达到1:16的巨噬细胞:ApoCell比实际抑制或几乎抑制了该模型中细胞因子IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、ΜΙΡ-1β、MCP-1和IL-9的释放。
凋亡细胞的添加导致抑制了巨噬细胞活化中诱导的至少20种促炎细胞因子和趋化因子，样品的结果如图9A～9H所示。促炎细胞因子和趋化因子释放的共同机制是NF-κB抑制。
抑制促炎细胞因子和趋化因子的释放似乎是特异性的，因为在类似条件下对细胞因子IL-2R(IL-2受体)水平的检测表明，释放出的IL-2R水平没有以与促炎细胞因子相同的方式受到影响。(图9I)。添加凋亡细胞增加了比例在1:4和1:8时IL-2R的释放。还有，图9J示出了凋亡细胞对24小时时间段内IL-2的释放没有影响。IL-2受体的激活被认为在包括耐受在内的免疫系统关键功能中具有重要作用。
结论：在存在癌症和CAR-19的情况下在巨噬细胞活化综合征的细胞因子风暴模型中添加早期凋亡细胞导致显著减少甚至令人惊奇地抑制了促炎细胞因子例如IL-10、IL-6、MIP-1α、IL-8、TNF-α、ΜΙΡ-1β、MCP-1以及IL-9，同时增加或不影响细胞因子IL-2R的水平。因此，此处的结果表明虽然促炎细胞因子由于与凋亡细胞一起孵育而减少了，IL-2和IL-2R没有以与早期凋亡细胞孵育相同的方式受到影响。因此，T细胞相关的细胞因子不受CAR T细胞疗法+凋亡细胞的影响，而天然免疫细胞因子例如从单核细胞、巨噬细胞和树突细胞释放的细胞因子则受到影响。
实施例3：在对CAR T细胞功效没有负面影响的情况下凋亡细胞对细胞因子风暴的影响
目的：检测凋亡细胞或源自于凋亡细胞的上清液对细胞因子风暴标记物细胞因子的影响以及CAR T细胞对肿瘤细胞的功效。
方法：
T4+CAR T细胞
利用了被报道为在小鼠中诱发细胞因子风暴的实体瘤模型(van der Stegen等人，2013同上)。在此模型中，利用靶向某些ErbB二聚体的嵌合抗原受体(CAR)改造T细胞(T4+CAR-T细胞)，这些ErbB二聚体通常在特定的实体瘤(如头颈部肿瘤和卵巢癌)中高度上调。T细胞是用CD3微珠从分离自外周血的PBMC分离的。构建含有嵌合T4+受体的载体，并将其转导到分离的T细胞中，得到T4+CAR T细胞。对于本文所进行的实验而言，T4+CAR T细胞购自Creative Biolabs公司(美国纽约)或Promab Biotechnologies公司(美国加州)。图4代表用抗CD124单克隆抗体验证4αβ嵌合受体在T4+CAR T细胞表面表达的流式细胞术曲线(Wilkie等人，同上)。此外，进行PCR程序，验证载体在转导的T细胞中的存在。
SKOV3-luc细胞
SKOV3-luc卵巢腺癌组织培养细胞购自Cell BioLabs公司(目录号AKR-232)。SKOV3-luc高度表达ErbB受体且是T4+CAR-T细胞的靶标(van der Stegen等人，2013，同上)。对这些细胞进行了进一步的操纵以连续表达荧火虫萤光素酶基因，使得能追踪体外的细胞增殖以及体内的肿瘤生长和衰退。
凋亡细胞
按照实施例1制备凋亡细胞。
凋亡细胞上清液
在12孔板的每个孔中每次接种八百万个凋亡细胞。24小时之后离心细胞(290g、4℃、10min)。收集上清液并等分冻存于-80度备用。不同数量的细胞被用于制备上清液。一些等分含有浓缩的上清液。
单核细胞分离
用Ficoll(GE healthcare公司，英国)从获自于健康合格的献血者的外周血/血沉棕黄层分离PBMC。在RPMI1640(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州)中使细胞的浓度为15xl06个细胞/ml，然后以0.9ml滴状接种于35mm培养板的中央(康宁公司，美国纽约)。接下来将培养板在37℃、5％CO2下孵育1小时。在孵育结束时，用PBS(Biologicalindustries公司，以色列贝特哈尼克)清洗细胞三次，并用光学显微镜确定粘附情况。接下来将细胞用完全培养基(RPMI1640+10％热失活的FBS+1％Glutamax+1％PenStrep，所有都来自Gibco)孵育。
还使用了另一种单核细胞分离方法，其中通过密度梯度离心从肝素化的外周血分离人的单个核细胞。接下来将分离出的单个核细胞分成单核细胞、B细胞和T细胞群体，通过磁珠分离(MiltenyiBiotec，Auburn公司，美国加州)阳性选择单核细胞作为CD14+组分，阳性选择B细胞作为CD22+组分以及阴性选择T细胞作为CD14-CD22组分。单核细胞纯度大于95％。
对于巨噬细胞分化，在粘附结束时，用PBS清洗细胞三次，然后用RPMI1640+1％Glutamax+1％PenStrep和10％热灭活的人AB血清(Sigma公司，美国密苏里州)孵育。将细胞在37℃和5％下孵育7～9天，在第3天和第6天更换培养基。借助光学显微镜通过形态学来确定分化情况。
来自apo+单核细胞的上清液
将CD14+单核细胞与上述制备的凋亡细胞以1:16的比例一起培养24h。单核细胞的数量是12孔培养板每孔50万个细胞，凋亡细胞的数量是12孔培养板每孔8百万个细胞。孵育24小时之后离心细胞(290g、4℃、10min)。收集上清液并等分冻存于-80度备用。可以以不同的单核细胞:凋亡细胞比例和/或使用其他来源的细胞(诸如巨噬细胞和树突细胞)进行类似的过程。
体外培养条件
通过将SKOV3-luc癌细胞与凋亡细胞或凋亡上清液一起孵育1小时，然后与T4+CART细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)共培养48小时来进行初步实验。
为了模拟体内的条件，将1x105个THP-1细胞ml(HTCC USA)或单核细胞或巨噬细胞或树突细胞用200nM(123.4ng/ml)佛波酯(PMA)分化72小时，然后将在没有PMA的完全培养基中另外培养24h。接下来，将癌症或肿瘤细胞——例如SKOV3-luc细胞在24孔培养板中以5x105个SKOV3-luc细胞/孔接种在分化的THP-1细胞上。在癌或肿瘤细胞的初步培养之后，将4x105～8x105个凋亡细胞(ApoCell)添加到培养物中持续1～3h，以诱导免疫耐受环境。将针对每种细胞类型优化癌细胞与ApoCell的比例。清洗之后，用10ng/ml LPS对共培养物进行处理，之后将添加1x106个T4+CAR T细胞(或由效应物/靶标(E/T)比值图确定的量)。肿瘤细胞和T4+CAR T细胞的比例将会变化，以便针对每种肿瘤或癌细胞类型生成效应物/靶标(E/T)比值图。
为了测试SKOV3癌细胞毒性，制备裂解物，并在48小时的孵育时间之后测定荧光素酶活性。将进行其他实验针对其他癌细胞类型且在48小时的孵育时间内间隔地测定癌或肿瘤细胞毒性。或者，使用Promega公司的CytoTox96非放射性细胞毒性测定法(Promega公司，目录号G1780)。
裂解物制备
SKOV3-luc细胞裂解物通过用PBS清洗SKOV3-luc单层细胞除去任何残留血清并添加70μl CCLR裂解缓冲液xl/孔(针对24孔培养板)来制备。通过物理刮擦孔底进一步增强脱离。涡旋15秒之后，在4℃、12,000g下将裂解物离心2分钟。收集上清液并储存在-80℃。
体外荧光素酶活性
为了检测培养物中SKOV3-luc细胞的荧光素酶活性，使用萤光素酶测定系统(Promega公司，目录号E1501)。通过使用QuantiLum重组荧光素酶(Promega公司，目录号E170A)进行了该试剂盒与光度计读取仪(Core Facility,Faculty of Medicine,EinKerem,希伯来大学)的校准。612ag～61.2μg(10-20-10-9摩尔)被用于确定检测范围且符合制造商的使用说明。简而言之，将每份量为20μL体积的荧光素酶置于黑色96孔板(Nunc)的孔中。每个量进行三次。每个孔添加100μlLAR(来自萤光素酶测定系统试剂盒的荧光素底物)并在10秒曝光下立即读数。
对于荧光素酶活性的读取，在冰上解冻裂解物，将20μl样品置于黑色96孔板(Nunc)中。每个样品读取两次。添加100μl LAR，每隔2.5分钟读取曝光10秒时间的发光结果，持续25分钟，随后10分钟每隔40秒进行读取。
细胞因子分析
对IL-2、IL-2受体(IL-2R)、IL-6、IL-1α、IL-4、IL-2、TNF-α进行了初步测定。为了测定IL-2、IL-2受体(IL-2R)、IL-6、IL-1α、IL-4、IL-2、TNF-α以及其他细胞因子的细胞因子释放减少，收集上清液，并用Luminex MagPix读取仪和ELISA试验检测所选细胞因子。
结果：
SKOV3-luc生长
用荧光素酶活性作为指示追踪SKOV3-luc生长，以确定未来实验中的靶标SKOV3-luc细胞数量。将3.8x104-3.8x105个SKOV3-luc细胞/孔置于24孔培养板(康宁公司)中，连续3天每天监测荧光素酶活性。1.9x105个细胞/孔或更高的细胞数在接种2天达到汇合并呈现由荧光素酶活性指示的生长饱和(图5)。注意，接种三天之后3.8x104～1.1x105个SKOV3-luc细胞/孔仍处于线性或指数生长期(图5，标绘了橙色、青绿色和紫色)。阴性对照(3.8x105个SKOV3-luc细胞，没有LAR底物)仅显示本底水平的读数，表明来自SKOV3-luc细胞的生物发光读数由荧光素酶活性所引起。
验证T4+CAR-T细胞对SKOV3-luc肿瘤细胞的活性
为了证实T4+CAR-T细胞的活性，将单层的SKOV3-luc暴露于1,000,000(一百万)个T4+CAR-T细胞或1,000,000(一百万)个未转导的T细胞。孵育24小时之后，与未转导的T细胞对照相比，T4+CAR-T细胞降低了30％的SKOV3-luc增殖(图6)，显示T4+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
将独立的T4+CAR-T细胞对抗SKOV3-luc肿瘤细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性比较。
对凋亡细胞(ApoCell)和凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoMon Sup)进行检测以确定它们是否干扰T4+CAR-T的抗肿瘤活性。SKOV3-luc肿瘤细胞与凋亡细胞一起孵育一小时，随后添加T4+CAR-T细胞(500,000，50万)或T4+未转导的T细胞(500,000，50万)(T4+CAR-T细胞与凋亡细胞的比例为1:2)。然后将肿瘤细胞/凋亡细胞/T4+CAR T细胞共培养48h。将对照SKOV3-luc肿瘤细胞与T4+CAR-T细胞和哈特曼氏溶液(凋亡细胞的载体)而没有凋亡细胞共培养48h。
结果显示孵育48h之后，T4+CAR-T细胞抗肿瘤活性优于未转导T细胞的孵育。用凋亡细胞或凋亡细胞上清液进行类似的孵育。令人惊奇的是，T4+CAR T细胞抗肿瘤活性可与暴露或不暴露于凋亡细胞或凋亡细胞上清液相比。(图7)。
凋亡细胞对改善、减少或抑制由CAR-T细胞处理引起的细胞因子风暴的影响。
接下来研究凋亡细胞对减少细胞因子风暴的影响。IL-6是一种原型促炎细胞因子，其在细胞因子风暴中释放(Lee DW等人，(2014)Blood 124(2):188-195)且常用作细胞因子风暴应答的标志物。
建立了模拟体内CAR T细胞治疗环境的培养物。在人单核巨噬细胞和T4+CAR T细胞存在下对SKOV3-luc肿瘤细胞进行培养。培养基中测得的IL-6浓度约为500～600pg/ml。该IL-6浓度表示细胞因子风暴。
出乎意料的是，在SKOV3-luc肿瘤细胞、人单核细胞-巨噬细胞、T4+CAR-T细胞的培养基(其中肿瘤细胞先前与凋亡细胞一起孵育了1小时(T4+CAR-T细胞与凋亡细胞的比例为1:2))中测得的IL-6水平显著减小。类似地，在SKOV3-luc肿瘤细胞、人单核细胞-巨噬细胞、T4+CAR-T细胞的培养基(其中肿瘤细胞先前与凋亡细胞上清液一起孵育了1小时)中测得的IL-6水平也显著减小。IL-6浓度的降低表示细胞因子风暴降低(图8)。
结论是，凋亡细胞和凋亡上清液出乎意料地不抑制CAR-T细胞对肿瘤细胞增殖的影响，同时它们下调了促炎细胞因子诸如IL-6，IL-6被称为是导致发病的主要细胞因子。
使用更广泛的细胞因子进行分析
为了进一步评价对范围和水平可能更广泛的细胞因子的影响，将LPS(10ng/ml)添加到如上所述的SKOV3-LUC培养条件，这些细胞因子在实验过程中未产生，但在临床条件下在人细胞因子风暴期间出现了。预期LPS的添加会使细胞因子风暴水平呈指数增长。如所预期的，LPS的添加增加了细胞因子风暴效应，结果IL-6水平增加到约30,000pg/ml。已知在细胞因子风暴期间高水平表达的其他细胞因子显示出高水平，例如：TNF-α(250-300pg/ml)、IL-10(200-300pg/ml)、IL1-α(40-50pg/ml)和IL-18(4-5pg/ml)。如图10所示，即使在细胞因子风暴的指数状态期间，暴露于凋亡细胞也会使IL-6的水平显著降低到临床条件下可以看到而在CAR T细胞的实验过程中并不总是如此的几乎正常的水平。这种影响在其他促炎细胞因子TNF-α、IL-10、IL1-α、IL-1β以及IL-18中类似，显示有20～90％的减小。当使用凋亡细胞上清液代替凋亡细胞时，发现了类似的结果。
凋亡细胞对IL-2和IL-2R的影响
在SKOV3-luc细胞与T4+CAR T细胞一起孵育之后的培养上清液中测得的IL-2浓度为1084pg/ml。令人惊奇的是，当将SKOC3-luc细胞先与凋亡细胞然后与T4+CAR T细胞孵育时，IL-2的浓度增加到1190pg/ml。类似地，在SKOV3-luc细胞与T4+CAR T细胞一起孵育之后的培养上清液中测得的IL-2R浓度为3817pg/ml。令人惊奇的是，当将SKOC3-luc细胞先与凋亡细胞然后与T4+CAR T细胞孵育时，IL-2R的浓度增加到4580pg/ml。在单独的SKOV3-luc中IL-2的浓度为3.2pg/ml，而在添加了凋亡细胞的情况下浓度为10.6pg/ml。在单独的SKOV3-luc中IL-2R的浓度为26.3pg/ml，而在添加了凋亡细胞的情况下浓度为24.7pg/ml。
结论
CAR-T细胞疗法已被报道在相当数量的受试者中引起细胞因子风暴。这些结果表明，凋亡细胞和凋亡细胞上清液令人惊奇地降低了细胞因子风暴的细胞因子标记物，而不影响CAR-T细胞对肿瘤细胞的功效。而且，看起来凋亡细胞增加了细胞因子IL-2，其可以通过维持或增加CAR T细胞增殖来延长CAR T细胞疗法的持续时间。
实施例4：凋亡细胞疗法在施用CAR T细胞疗法的小鼠中预防细胞因子风暴
目的：检测凋亡细胞或凋亡细胞上清液在实体瘤模型(SKOV3卵巢腺癌)中的体内影响，以确定T4+CAR T细胞功效和细胞因子风暴标记物细胞因子的水平。
材料和方法
体外研究
各种体外方法均已在上述实施例1中进行了描述，包括上述制备、培养和对结果分析的方法，以及与识别ErbB靶抗原的T4+CAR T细胞(本文称为“T4+CAR T细胞”)、SKOV3-luc细胞、凋亡细胞、凋亡上清液、单核细胞、巨噬细胞的使用相关的方法。相同的方法被用于此处。
体内研究
小鼠
7～8周龄的SCID-beige小鼠和NSGS小鼠购自Harlan(以色列)，并饲养在SharettInstitute的SPF动物设施内。
将SKOV3-luc肿瘤细胞(1X106或者2X106个)通过于PBS中i.p.或者于200mlMatrigel(BD Biosciences公司)中s.c.接种到SCID beige小鼠或者NSGS小鼠中。在注射后大约14～18天，通过生物发光成像(BLI)证实了肿瘤移植物，并且在施用T细胞之前将具有相似信号强度的小鼠分组。
小鼠将在施用T4+CAR T细胞前24小时或与施用T4+CAR T细胞(10～30×106个T4+CAR T细胞)的同时接受30x106个凋亡细胞。通过生物发光成像(BLI)追踪肿瘤生长，而循环的细胞因子水平将通过Luminex来确定。
体内萤光素酶测定
通过萤火虫荧光素酶活性每周监测肿瘤生长。简而言之，将3mg的D-萤光素(E160，Promega公司，美国)/小鼠(30mg/ml的D-萤光素100μl)腹膜内注射到异氟醚麻醉的小鼠中，注射10分钟之后用IVIS成像系统和Live Image图像捕获软件(两个都来自美国的PerkinElmer公司)采集腹部图像。
通过给接受0.5x106个SKOV3-luc细胞/小鼠、注射D-荧光素后5分钟“自动”选项的小鼠成像，为每个图像会话选择图像采集参数。捕获参数设置为4单元划分、F/制光圈1.2和用24X镜头曝光2～4分钟。用Live Image软件进行数据分析和量化，用微软公司的Excel程序生成图表。
体内细胞毒性
为了评估T细胞的体内毒性，从小鼠中收集器官，福尔马林固定，并进行病理组织学分析。
细胞因子分析
用Luminex MagPix读取仪和/或ELISA试剂盒、流式微球阵列(Th1/Th2/Th17；BDBiosciences公司)按照生产商所描述的对上清液和血清进行分析。例如，可以针对促炎细胞因子进行分析，促炎细胞因子在一种情况下可以是IL-6，虽然在一个实施方案中可以在本文对表1和表2所列细胞因子或本领域已知的任一种进行分析。
结果
标定体内SKOV3-luc肿瘤
将0.5x106、lx106或4.5x106个SKOV3-luc细胞i.p.注射到SCID beige小鼠，每周进行生物发光成像(BLI)以便追踪肿瘤生长，如方法部分所描述的(数据未示出)。
小鼠的临床评分
小鼠在最初4周未表现出临床症状。然而，SKOV3-luc注射28天之后，接受高剂量(4.5x106，紫色线)的小鼠开始不断地减轻体重(图11A)，小鼠的整体外观恶化，表现为嗜睡、异常起搏和总体活力丧失。在第39天将该组选取出，并进行腹部解剖以露出肿瘤的外观和大小(图11B)。SKOV3-luc肿瘤大、实体、血管化，显现发白发亮的肤色。一个大的肿瘤在腹腔的尾侧部或头部的注射侧(左)占主导地位。该肿瘤包围了约25～75％的腹腔，并明确地压迫和扰乱肠道。在腹腔内的不同部位还观察到了较小的病灶。肿瘤被包含在腹腔内，在任何小鼠内的任何其他部位没有观察到其他肿瘤。接受低(0.5x106)或中等(1x106)剂量SKOV3-luc的小鼠在注射SKOV3-luc 40天后停止体重增加，并开始持续减轻体重。注射SKOV3-luc 50天后终止实验。
SKOV3-luc肿瘤动力学
将PBS注射到SKOV3-luc细胞的对照中，在整个实验期间这些小鼠没有表现出任何荧光素酶活性(图12，左图)。肿瘤的检测和生长呈剂量依赖性。较低剂量(0.5x106个SKOV3-luc细胞)在注射后25天开始显现肿瘤(4/5的动物)，中等剂量(1x106)注射在注射后18天显现肿瘤(4/5的动物)，而在较高剂量(4.5x106)下早在注射后11天即在3/5的动物检测到肿瘤，到第18天所有动物都显现非常明确的肿瘤(图12以及图13A～13D)。
CAR T细胞疗法诱发细胞因子释放综合征
对三组无肿瘤小鼠以及荷瘤小鼠施用(i.p.或者直接进入到肿瘤内)增加剂量的T4+CAR T细胞(3x106、10x106或30x106)。在最高剂量下，无瘤小鼠和荷瘤小鼠在24小时内表现出迟缓行为、竖毛和行动不便，伴随着快速体重减轻，随后在48小时内死亡。在施用最高剂量CAR T细胞的小鼠血液样品中，至少可检测到人干扰素-γ和小鼠IL-6。接受高剂量针对不同肿瘤抗原的CAR T细胞的小鼠没有表现出体重下降或行为改变。
凋亡细胞的施用抑制或减少了由CAR T细胞疗法诱发的细胞因子释放综合征的发生。
对施用最高剂量CAR T细胞的一组小鼠同时施用2.10x108个凋亡细胞/kg，这在先前被证明是安全和有效的剂量。接受人CAR T+凋亡细胞的小鼠具有显著降低的小鼠IL-6水平、较低的体重减轻以及降低的死亡率。
实施例5：联合免疫疗法对体外扩散肿瘤模型的影响
目的：检测凋亡细胞或源自于凋亡细胞的上清液在扩散肿瘤模型中的影响，以便确定CAR T细胞对癌细胞和细胞因子风暴标记物的细胞因子水平的功效，在该扩散肿瘤模型中癌症广泛扩散而不受局限或约束。
方法：
CD19+T4+CAR T细胞(“CD19+CAR T细胞”)
CD19特异性CAR T细胞购自ProMab公司(目录号012916)。T细胞为30％的CAR阳性(根据制造商的FACS数据-Fab染色)。简单来说，将细胞冻融于AimV+5％热灭活的FBS，离心(300g，5分钟，室温)，以及重悬于AimV。在实验的第6天，对每只小鼠IV注射20x106个细胞(70％Annexin PI阴性，其中30％的CAR阳性)。
表达CD19的重组Hela细胞将被用作细胞表面也表达CD-19的对照细胞类型。
CD123+CAR T细胞
还将用CAR靶向CD123表位改造T4+CAR T细胞(本文称为“CD123+CAR T细胞”)。
Raji细胞、表达CD19的Hela细胞以及表达CD123的白血病细胞
Raji细胞购自ECACC(目录号85011429)，在完全培养基(添加有10％H.I.FBS、1％Glutamax、1％青霉素/链霉素的RPMI-1640)中进行常规培养，并维持在3x105～3x106个细胞/ml的浓度.在实验的第1天，每只小鼠IV注射0.1x106个细胞。
类似地，表达CD19的Hela细胞将在实验室中产生并用作CD19+CAR T细胞的靶标。表达CD123的白血病细胞将被用作CD123+CAR T细胞的靶标。此外，原发性癌细胞将被用作CAR T细胞的靶标。
用本领域已知的方法制备表达CD19的Hela细胞。按本领域已知的那样对细胞进行培养。
CD123是膜生物标记物和血液学恶性疾病中的治疗靶标。将按本领域已知的那样对表达CD123的白血病细胞例如白血病母细胞和白血病干细胞进行培养。
凋亡细胞、凋亡细胞上清液和单核细胞分离将如实施例1中所描述地进行制备。所产生的早期凋亡细胞至少50％为膜联蛋白V阳性，少于5％为PI阳性细胞。
巨噬细胞是通过粘附从CD14阳性细胞产生的。
树突细胞是来源于在IL4和GMCSF存在下生长的CD14。
流式细胞术使用了以下下抗体：hCD19-PE(eBiosciences公司，目录号12-0198-42)；mIgG1-PE(eBiosciences公司,目录号12-0198-42)；hCD3-FITC(eBiosciences公司，目录号11-0037-42)；mIgG2a-FITC(eBiosciences公司，目录号11-4724-82)。使用BD公司的FACS Calibur进行采集。
初始T细胞。初始T细胞是用磁珠(BD)从血沉棕黄层分离的，并冷冻于90％人AB血清和10％DMSO中。解冻和注射与CAR T细胞相同。
体外培养条件
细胞系和培养试剂
将人淋巴瘤细胞系Raji(eCACC，英国，查询号85011429)、人宫颈腺癌细胞系HeLa(ATCC，美国，编号：CCL-2)以及HeLa-CD19(ProMab公司，美国，目录号PM-Hela-CD19)在添加有10％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，南美洲，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号35050-038)以及100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号15140-122)的RPMI1640(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号31870-025)中培养，后文称作“完全培养基”。在标准培养期间，HeLa-CD19培养基进一步添加有嘌岭霉素(Sigma-Aldrich，美国，目录号P9620)作为选择性抗生素。
所有细胞保持在近汇合状态。Raji细胞维持在0.3x106～2x106个细胞/ml的浓度。HeLa和HeLa-CD19细胞在容器填充至90％汇合时传代。
初级单核细胞是从捐赠血液的血沉棕黄层分离的(Sheba Medical Center，以色列)。首先，在Ficoll梯度密度(Ficoll-Paque PLUS，GE医疗生命科学公司，英国，目录号17-1440-03)上分离外周血单核细胞(PBMC)。离心(800xg，2～8℃，20min，间断0)之后，将含有PBMC的界面层转移到新试管中并用添加有2mM L-谷氨酰胺(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-605E)和10m MHepes(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-737B)的RPMI-1640(Lonza公司，瑞士，目录号BE12-918F)(后文称为“清洗培养基”)清洗，然后离心(650xg，2～8℃，10分钟)。将沉淀重悬于“清洗培养基”至浓度为15x106个细胞/ml。细胞以0.9ml的滴状接种在35mm培养板(Corning公司，美国，目录号430165)的中央。将平板在湿润的培养箱(37℃，5％CO2)中孵育1.5小时，使得单核细胞能够进行粘附，然后用预热的PBS(Lonza公司，瑞士，目录号BE17-516F)清洗3次，除去其他细胞类型。清洗之后，将细胞培养于2ml添加有10％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号12657-029)、2mM GlutaMAX(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号35050-038)以及100U/ml青霉素+100U/ml链霉素(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号15140-122)的RPMI1640(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号31870-025)，同上的“完全培养基”。
所有细胞系都培养于37℃并含有5％CO2的湿润培养箱中。
CD19-CAR T细胞(ProMab公司，美国，目录号FMC63)是在AIM-V培养基中或冷冻下运输的。将用于体外实验的冷冻保存的CAR T细胞在实验当天于35～38℃浴中解冻并立即浸泡在添加有5％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，南美洲，目录号12657-029)的预热AIMV培养基(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号12055-091)中。离心细胞(300xg，室温，5min)除去DMSO并重悬于预热的AIM V培养基中。CD19-CAR+细胞群体的浓度和存活率是通过抗FLAG(BioLegend公司，美国，目录号637310)染色以及通过膜联蛋白和PI染色(MEBCYTO细胞凋亡试剂盒，MBL公司，美国，目录号4700)利用FACSCalibur流式细胞仪(BD公司，USA)读取结果来确定的。
对于初始T细胞分离，PBMC要么是按照Leaukapheresis Unit's SOP用CobeSpectraTMapheresis apparatus(Gambro BCT公司，美国)提取自从Hadassah MedicalCenter(Ein Kerem Campus，耶路撒冷，以色列)知情同意的合格捐赠者收集的白细胞去除术组分，要么是提取自装载在Ficoll密度梯度上并进行800xg、2～8℃、20min离心的血沉棕黄层(Sheba Medical Center，以色列)。T细胞是用MagniSort人CD3阳性选择试剂盒(eBioscience公司，美国，目录号8802-6830-74)按照制造商的使用说明从阳性组分中分离的。将T细胞冻存于含有附加20％FBS(Gibco，赛默飞世尔科技公司，南美洲，目录号12657-029)和5％DMSO(CryoSure-DMSO，WAK-Chemie Medical GmbH公司，德国，目录号WAK-DMSO-70)的“完全培养基”(上文限定的)中，并在与CD19-CAR T细胞平行的实验当天解冻。
LDH细胞毒性测定
乳酸脱氢酶(LDH)是一种稳定的胞浆酶，由以相关方式裂解的细胞所释放。因此，培养基中的LDH水平可以用于量化细胞毒性活性。CytoTox96非放射性细胞毒性测定(Promega公司，美国，目录号G1780)是对培养基中的LDH水平进行量化的比色分析法。将过量四氮唑盐底物(碘硝基四氮唑紫，INT)引入培养基，LDH将底物转化成红色的甲臜产物。形成的红色的量与裂解的细胞数直接成正比。
简而言之，按照制造商的使用说明，将靶细胞(HeLa或HeLa-CD19)单独或连同单核细胞一起培养。在靶细胞粘附到培养板(6小时～过夜)之后，将培养物暴露于yx106个ApoCells细胞1小时，之后通过4～5次RPMI清洗将这些细胞洗脱。在光学显微镜下视检确认除去ApoCells细胞。将10ng/ml LPS(Sigma-Aldrich，美国，目录号L4391)引入到共培养物中并孵育1小时。孵育之后，通过3～5次用RPMI的清洗循环除去LPS。以指定的E/T比例添加存活的CD19-CAR T细胞或初始T细胞，并孵育4小时。为了收集培养基，将培养板在250xg、2～25℃下离心4min(离心机5810R，Eppendorf公司，德国)以沉降细胞。将来自各孔的50μl上清液培养基转移到新平底96孔微量培养板(Corning公司，美国，目录号3596)的孔中，然后每个孔添加50μl CytoTox96试剂。将培养板于黑暗中在室温下孵育30分钟，之后通过每孔添加50μl终止液来终止反应。使用Infinite F50(Tecan公司，瑞士)读取492nm处的吸光值，并用Magellan F50软件进行捕获。用微软Excel 2010进行数据分析和图表生成。
流式细胞术细胞毒性测定
用5μΜ的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，Life Technologies公司，美国，目录号CI157)对HeLa-CD19细胞(靶标)和HeLa细胞(对照)进行预染，混合在一起，然后接种在新培养板上或者覆盖有分离的原代单核细胞的培养板上。靶细胞粘附到培养板(6小时～过夜)之后，将培养物暴露于yx106个ApoCells持续1小时。用RPMI清洗培养板3～5次，视觉上确认洗掉了悬浮的ApoCells细胞。将10ng/ml LPS引入到共培养物并孵育1小时，之后通过3～5次用RPMI的清洗循环除去LPS。然后按由特定E/T比例所表示的将存活的CD19-CAR T细胞添加到共培养物中并孵育4小时。孵育之后，通过添加胰蛋白酶-EDTA(BiologicalIndustries公司，以色列，目录号03-052-1B)并在37℃孵育4分钟来收获细胞。为了终止酶活性，添加两倍至四倍体积的“完全培养基”。收集细胞，在200xg、室温下离心5分钟并重悬于100μl RPMI(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号15140-122)。首先针对抗CD19(eBioscience公司，美国，目录号12-0198-42)进行染色，在室温下于黑暗中孵育30分钟。离心(290xg，1min，2～8℃)并重悬于300μl RPMI之后，针对抗7AAD(eBioscience公司，美国，目录号00-6993-50)对细胞进行染色。在7ADD阴性细胞(活细胞)上开始进行分析，其中计算活的靶细胞(HeLa-CD19)和活的对照细胞(HeLa)。通过将活的靶细胞百分比除以活的对照细胞百分比来计算存活百分比。为了针对起始细胞数目的变化和自发靶细胞死亡进行校正，将存活百分比除以在没有效应细胞(CD19-CAR T细胞)的情况下培养的靶细胞百分比与对照组细胞百分比之比。最后，通过从100％2减去校正的存活百分比来确定细胞毒性百分比。
通过将Raji癌细胞与CD19+CAR T细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)一起孵育48小时来进行初步实验，以便确定CD19+CAR T细胞于靶标Raji癌细胞的最佳比例，从96孔培养板中的5x104个Raji细胞/孔开始。基于结果建立效应物/靶标(E/T)比例培养板。
通过将Raji癌细胞与凋亡细胞或凋亡上清液孵育1小时，随后与CD19+CAR T细胞(+/-单核细胞-巨噬细胞)共培养48小时，进行联合免疫治疗实验。
为了模拟体内的条件，将1x105个THP-1细胞/ml用200nM(123.4ng/ml)佛波酯(PMA)分化72小时，然后将在没有PMA的完全培养基中另外培养24h。接下来，将Raji癌细胞在24孔培养板中以5x105个Raji细胞/孔接种在分化的THP-1细胞上。
在Raji癌细胞的初始培养之后，将4x105～8x105个凋亡细胞(ApoCell)添加到培养物中持续1～3小时以诱导免疫耐受环境。针对每种细胞类型优化癌细胞与ApoCell之比。清洗之后，基于E/T比例图用预先确定数量的CD19+CAR-T细胞对共培养物进行处理。在某些实验中，在添加CD19+CAR T细胞之前将向培养基中添加10ng/mlLPS。在其他实验中，将在添加CD19+CAR T-cells.细胞之前向培养基中添加干扰素γ(IFN-γ)。预期LPS的添加会使细胞因子风暴水平呈指数增长。
为了测定Raji癌细胞的细胞毒性，制备裂解物，并在孵育48小时后确定存活率。将在48h孵育时间段内按间隔地进行附加的实验以测定Raji细胞的细胞毒性。可选地，将使用Promega公司的CytoTox96非放射性细胞毒性试验(Promega公司，目录号G1780)。
用表达CD19的Hela细胞和CD19+CAR T细胞进行类似的实验。
用表达CD123的白血病细胞和CD123+CAR T细胞进行类似的实验。
细胞因子分析
初步细胞因子测定检测了培养物上清液中MIP1a、IL-4、IL-2、IL-2R、IL-6、IL8、IL-9、IL-10、IL-13、IL-15、INF-γ、GMCSF、TNF-α的水平。
附加的细胞因子测定检测了细胞因子IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFNα、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1α、ΜΙΡ-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R或IL-7的水平，或者它们的组合。
建立模仿体内CAR T细胞治疗环境的培养。在不添加和加添凋亡细胞的情况下，在人单核细胞-巨噬细胞、LPS以及CD19+CAR T细胞的存在下对Raji伯基特氏淋巴瘤细胞进行培养。
在单核细胞和LPS存在下孵育Raji细胞，随后添加初始T细胞(Raji+初始T)，CD19+CAR T-细胞(Raji+CAR T)，CAR T细胞:ApoCells比例为1:8的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell1:8)，CAR T细胞:ApoCells比例为1:32的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell1:32)，以及CAR T细胞:ApoCells比例为1:64的CD19+CAR T细胞和凋亡细胞(ApoCell)(Raji+CAR T+ApoCell1:64)。依照GM-CSF和TNF-α(TNF-α)进行浓度测量。
为了测定IL-6、IL-8和IL-13以及其他细胞因子的细胞因子释放减少，将收集上清液，并使用Luminex MagPix读取仪和ELISA试验检测所选的细胞因子。可使用MAPIX系统分析仪(MereckMillipore公司)和MLIPLEX分析软件(Mereck Millipore公司)通过Luminex技术来对细胞因子(小鼠或人)进行评价。通过Quantikine ELISA(R&D systems公司)来评价小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)以及TGF-β1。
组织分析
用流式细胞术和免疫组织化学方法对骨髓和肝脏进行评价。处死之后，收集肝脏和骨髓用于病理组织学分析。将组织在4％福尔马林中于室温下固定48小时，然后提交给希伯来大学的动物设施进行处理。在处理之前对骨骼进行脱钙。将石蜡切片用于苏木素和伊红以及CD19染色。
IFN-γ效应
通过STAT1磷酸化和生物学产物来评价IFN-γ效应。
结果：
针对细胞毒性试验校准细胞数
为了确定体外模型中使用的Raji细胞数，评估了细胞毒性试验的灵敏度极限。将5x104～20x104个Raji细胞/孔接种于96孔培养板中，重复四个孔。对一组四个重复孔进行裂解，用于与仍然完全存活的细胞进行比较。裂解是瞬时的，在离心前立即添加裂解液以模拟部分细胞的细胞毒性。实际上，所有细胞数量都显示出远高于存活细胞的读数，其中5x104细胞数产生最大的相对读数(图14；数据外推)。因此，后续实验将使用该细胞数作为默认值，除非实验设计另有要求。
验证CD19+CAR-T细胞抗Raji伯基特氏淋巴瘤细胞的活性
为了证实CD19+CAR T细胞的活性，将单层的Raji癌细胞暴露于1,000,000(一百万)个CD19+CAR-T细胞或1,000,000(一百万)个未转导的T细胞。孵育24小时之后，CD19+CAR-T细胞降低了Raji癌细胞增殖，显示出CD19+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
将独立的CD19+CAR-T细胞抗Raji伯基特氏淋巴瘤细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性进行比较。
对凋亡细胞(ApoCell)和凋亡细胞上清液(ApoSup和ApoMon up)进行检测，以确定它们是否干扰CD19+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。将Raji伯基特氏淋巴瘤细胞于凋亡细胞一起孵育一小时，随后添加CD19+CAR-T细胞(500,000个)或者CD19+未转导T细胞(500,000个)(CD19+CAR-T细胞与凋亡细胞比例为1:2)。接下来将肿瘤细胞/凋亡细胞/CD19+CAR T细胞共培养48小时。将对照的Raji伯基特氏淋巴瘤细胞与CD19+CAR T细胞和哈特曼氏溶液(凋亡细胞的载体)而没有凋亡细胞共培养48小时。
结果显示孵育48h之后，CD19+CAR-T细胞抗肿瘤活性优于与未转导T细胞的孵育。用凋亡细胞上清液进行类似的孵育。令人惊奇的是，CD19+CAR T细胞的抗肿瘤活性可与暴露或不暴露于凋亡细胞或凋亡细胞上清液的情况相比。
没有看到在存在或不存在凋亡细胞、CAR T的E/T比结果相当的情况下，凋亡细胞对CAR修饰的T细胞在体外抗CD19的负面影响。
验证CD19+CAR-T细胞抗Hela白血病细胞的活性
HeLa细胞是特异性表达CD19的细胞，其使它们容易受到CARCD19+T细胞活性的影响。此外，与Raji细胞(其是非粘附细胞系)相反，HeLa细胞是粘附性的。
为了证实CD19+CAR T细胞的活性，将单层的HeLa癌细胞暴露于1,000,000(一百万)个CD19+CAR-T细胞或1,000,000(一百万)个未转导的T细胞。孵育24小时之后，CD19+CAR-T细胞降低了HeLa癌细胞的增殖，显示出CD19+CAR-T细胞的抗肿瘤活性(图15CD19++RPMI和CD19++CAR T-19细胞)
将独立的CD19+CAR-T细胞抗CD19+HeLa细胞的活性与暴露于凋亡细胞后的活性进行比较。
对凋亡细胞(ApoCell)进行检测，以确定它们是否干扰CD19+CAR-T细胞的抗肿瘤活性。将HeLa细胞于凋亡细胞一起孵育一个小时，随后添加CD19+CAR-T细胞(500,000个)或CD19+未转导T细胞(初始T细胞；)500,000个)(CD19+CAR-T细胞与凋亡细胞的比例为1:2)。接下来将肿瘤细胞/凋亡细胞/CD19+CAR T细胞共培养48小时。将对照的HeLa细胞与CD19+CAR T细胞和RPMI(凋亡细胞的载体)而没有凋亡细胞共培养48小时。CD19+CAR-T细胞:HeLa细胞比例(E/T比)在5～20的范围(图15)。
图15显示孵育48小时之后，CD19+CAR-T细胞的抗肿瘤活性优于与未转导T细胞(初始细胞)或仅仅缓冲液一起孵育。用凋亡细胞进行类似的孵育。令人惊奇的是，CD19+CAR T细胞的抗肿瘤活性可与暴露或不暴露于凋亡细胞或凋亡细胞上清液的情况相比。用凋亡细胞上清液进行类似的实验。图15显示了CAR T-CD19治疗在加或不加ApoCells的情况下相同的体外细胞毒性效应。
没有观察到在存在或不存在凋亡细胞、E/T比结果相当的情况下，凋亡细胞对CAR修饰的T细胞抗CD19+HeLa细胞的负面影响。
因此，观察到CD19+CAR T细胞在加或不加早期凋亡细胞的情况下相同的体外细胞毒性影响。
凋亡细胞对改善、减少或抑制由CAR T处理引起的细胞因子风暴的影响
在添加CD19+CAR T细胞之前和之后对培养基中的细胞因子IL-8和IL-13进行测量，显示了与细胞因子风暴相一致的浓度。凋亡细胞或凋亡细胞上清液的添加显示了培养基中IL-8和IL-13浓度的降低。
使用更广泛的细胞因子进行分析
为了进一步评价对范围和水平可能更广泛的细胞因子的影响，将LPS(10ng/ml)癌症和CAR-19存在下添加到如上所述的Raji培养条件，这些细胞因子在实验过程中未产生，但在临床条件下在人细胞因子风暴期间出现了。预期添加LPS会使细胞因子风暴水平呈指数增长。暴露于凋亡细胞显著降低了细胞因子的水平。图16和图17中所展示的结果表明，虽然添加CD19+CAR T细胞大大地增加了培养基中GM-CSF和TNF-α的细胞因子浓度(pg/ml)，但在凋亡细胞的存在下GM-CSF和TNF-α都显著降低了。细胞因子浓度的降低呈相对于CAR T细胞与凋亡细胞的凋亡细胞比的剂量依赖性。
结论：
凋亡细胞能下调与CAR T细胞临床过程相关联的细胞因子风暴的细胞因子标记物。明显地，凋亡细胞没有显示出对CAR T细胞肿瘤活性的影响。凋亡细胞降低了起源于先天免疫的促炎细胞因子并在不损害IFN-γ水平和CAR T细胞毒性的情况下抑制IFN-γ效应。
实施例6：凋亡细胞疗法在施用CAR T细胞疗法的体内模型中预防扩散癌症中的细胞因子风暴
目的：检测凋亡细胞或来自于凋亡细胞的上清液在扩散肿瘤模型中的影响，以便确定CAR T细胞对癌细胞和细胞因子风暴标记物的细胞因子水平的功效。
材料与方法
体外研究
参见实施例5中所描述的用于体外研究的方法。
细胞和细胞培养
按照制造商的使用说明培养Raji伯基特氏淋巴瘤细胞(Sigma-Aldrich目录号85011429)。CD19+CAR T细胞、细胞培养物、凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、单核细胞分离以及体外测量与上述实施例相同。所产生的早期凋亡细胞至少50％为膜联蛋白V阳性，少于5％为PI阳性细胞。
体内研究
小鼠
7～8周龄大的SCID beige小鼠购自Envigo(以前称作Harlan)。小鼠饲养在符合机构IACUC指南的无特定病原体的动物设施内。在实验过程中，每天监测小鼠，每周称重3次。将后肢瘫痪的小鼠处死。处死之后，收集骨髓和肝脏用于FACS分析和组织学处理，血清冻存在-80℃用于细胞因子分析。
体内实验
将SCID beige小鼠(C.B-17/IcrHsd-Prkdc-SCID-Lyst-bg，Harlan，以色列)饲养在耶路撒冷希伯来大学(EinKerem校区，以色列)动物设施管理局(The Authority forAnimal Facilities(AAF))的SPF条件下并遵照实验室动物护理评估和鉴定协会(theAssociation for Assessment andvAccreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC))。这些研究得到了希伯来大学动物实验伦理委员会的批准，动物遭受的痛苦被尽可能地最小化。
(图18A)对于弥散性肿瘤模型，每只7～8周的雌性SCID beige小鼠i.v.注射悬浮于200μl RPMI(Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国，目录号15140-122)的lx105个Raji细胞(第1天)。在第6天，相关组的小鼠每只i.v.接种于200μl哈特曼氏溶液乳酸钠林格注射液(Teva Medical公司，以色列，目录号AWN2324)中的30x106个细胞ApoCells。在第6天，相关组的小鼠每只i.v.接种于200μl AIM V中的10x106个活CD19-CAR T细胞或初始T细胞。对照小鼠每次处理接受相等体积的RPMI。
对小鼠进行临床适应证检查，每周称重两次，并在发生后肢瘫痪时处死。由耶路撒冷希伯来大学动物设施部制备骨骼和肝脏的病理样品，并针对人CD20(Cell Marque，美国，克隆L26，目录号120M-84)进行染色检测Raji细胞，针对人CD3(Cell SignalingTechnology公司，美国，目录号85061)进行染色检测人T细胞。
在某些实验中，将在添加CD19+CAR T细胞之前向动物受试者施用LPS。在其他实验中，将在添加CD19+CAR T细胞之前施用干扰素γ(IFN-γ)。预期添加LPS或IFN-γ会使细胞因子风暴水平呈指数增长。
细胞因子测定检测细胞因子包括但不限于IL-10、IL-1β、IL-2、IP-10、IL-4、IL-5、IL-6、IFNα、IL-9、IL-13、IFN-γ、IL-12p70、GM-CSF、TNF-α、MIP-1α、ΜΙΡ-1β、IL-17A、IL-15/IL-15R或IL-7的水平，或者它们的组合。可使用MAPIX系统分析仪(Mereck Millipore公司)和MLIPLEX分析软件(Mereck Millipore公司)通过Luminex技术来对细胞因子(小鼠或人)进行评价。通过Quantikine ELISA(R&D systems公司)来评价小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)以及TGF-β1。
组织分析
用流式细胞术和免疫组织化学方法对骨髓和肝脏进行评价。处死之后，收集肝脏和骨髓用于病理组织学分析。将组织在4％福尔马林中于室温下固定48小时，然后提交给希伯来大学的动物设施进行处理。在处理之前对骨骼进行脱钙。将石蜡切片用于苏木素和伊红以及CD19染色。
IFN-γ效应
通过STAT1磷酸化和生物学产物来评价IFN-γ效应。
结果
CAR T细胞疗法诱发细胞因子释放综合征
对三组无瘤小鼠以及荷瘤小鼠施用(i.p.或者直接到肿瘤)增加剂量的CD19+CART细胞(3x106个、10x106个或30x106个)。在最高剂量下，无瘤小鼠和荷瘤小鼠在24小时内表现出迟缓行为、竖毛和行动不便，伴随着快速体重减轻，随后在48小时内死亡。在施用最高剂量CD19+CAR T细胞的小鼠血液样品中，可检测到人干扰素-γ以及小鼠IL-6、IL-8和IL-13。接受高剂量的针对不同肿瘤抗原的CD19+CAR T细胞的小鼠没有表现出体重下降或行为改变。
凋亡细胞的施用抑制或减少了由CAR T细胞疗法诱发的细胞因子释放综合征的发生。
对施用最高剂量CD19+CAR T细胞的一组小鼠同时施用2.10x108个凋亡细胞/kg，这在先前被证明是安全和有效的剂量。接受人CD19+CAR T+凋亡细胞的小鼠具有显著降低的至少一种小鼠促炎细胞因子水平、较低的体重减轻以及降低的死亡率。
凋亡细胞施用联合CAR T细胞施用不影响CAR T细胞的抗肿瘤活性
图18B显示注射CD19+Raji细胞但未施用CD19+CAR T细胞的SCID小鼠的预期死亡时间为18～21天。40％接受CD19+CAR T细胞的小鼠存活至至少第30天(图18，蓝线和黄线)。存活百分比不依赖于凋亡细胞的添加(图18)。在第30天处死存活的小鼠。
结论：存活率相当，凋亡细胞对体内CAR修饰的T细胞抗CD19没有负面影响。
证实了促炎细胞因子包括IL-6、IP-10、TNF-α、MIP-1α、MIP-1β的显著下调(p<0.01)。IFN-γ没有被下调，但其对巨噬细胞和树突细胞的影响在磷酸化ST ATI水平和IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9表达上得到抑制。
结论：
凋亡细胞降低了起源于先天免疫的促炎细胞因子并在不损害IFN-γ水平和CAR T细胞毒性的情况下抑制了IFN-γ效应。
实施例7：凋亡细胞疗法在施用CAR T细胞疗法的实体瘤癌症体内模型中预防细胞因子风暴
目的：检测凋亡细胞或来自于凋亡细胞的上清液在实体肿瘤模型中的体内影响，以便确定CAR T细胞对癌细胞和细胞因子风暴标记物的细胞因子水平的功效。
]材料与方法
体外研究
细胞和细胞培养
使用了CD19+CAR T细胞、含有TMCD28的第二代CAR-T-CD19细胞，细胞培养、凋亡细胞、凋亡细胞的上清液、单核细胞分离以及体外测量与实施例1、3和5的相同。所产生的早期凋亡细胞至少50％为膜联蛋白V阳性，少于5％为PI阳性细胞。
体内研究
小鼠
7～8周龄的SCID-beige小鼠和NSGS小鼠购自Harlan(以色列)，并饲养在SharettInstitute的SPF动物设施内。
对SCID beige小鼠或NSGS小鼠接种能粘附于腹膜的表达CD19的Hela细胞，以便形成实体腹膜内肿瘤。在施用T细胞之前将小鼠分组。
i.v.接种六天后，在第5天有和没有进行凋亡细胞(ApoCell)预处理的情况下对小鼠施用10x106个CD19+CAR T细胞。对接受预处理的小鼠施用5x106个或30x106个ApoCells。每周对肿瘤进行调查，每周监测循环细胞因子水平并通过LUMEX系统测定。用Luminex技术评价了25种小鼠细胞因子和32种人细胞因子。实验结束之后，选取小鼠并(通过FACS和免疫组织化学法)检查器官(骨髓、肝脏和脾脏)肿瘤的存在情况/大小。
细胞因子测定检查了细胞因子的水平，包括但不限于GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、MIP-1α、TNFα、ΜΙΡ-1β、IFNα以及IP-10。可使用MAPIX系统分析仪(Mereck Millipore公司)和MLIPLEX分析软件(Mereck Millipore公司)通过Luminex技术来对细胞因子(小鼠或人)进行评价。通过Quantikine ELISA(R&D systems公司)来评价小鼠IL-6Rα、MIG(CXCL9)以及TGF-β1。
组织分析
用流式细胞术和免疫组织化学法对骨髓和肝脏进行评价。
IFN-γ效应
通过STAT1磷酸化和生物学产物来评价IFN-γ效应。
结果
CAR T细胞疗法诱发细胞因子释放综合征
对三组无瘤小鼠以及荷瘤小鼠施用(i.p.或者直接到肿瘤)增加剂量的CD19+CART细胞(3x106个、10x106个或30x106个)。在最高剂量下，无瘤小鼠和荷瘤小鼠在24小时内表现出迟缓行为、竖毛和行动不便，伴随着快速的体重减轻，随后在48小时内死亡。
图19A～19C以图表方式显示了甚至在CAR T细胞出现之前，肿瘤中IL-6、IP-10甚至TNF-α细胞因子释放水平的增加。图19A-19C显示，即使没有CAR T细胞疗法，肿瘤细胞的存在也会出人意料地增加IL-6、IP-10和TNF-α。在CAR T细胞疗法(Hela-CAR T细胞CD-19)的存在下，细胞因子的释放显著增强。这些结果表明肿瘤本身释放促炎细胞因子。
为了评价添加早期凋亡细胞的有益效果，在三个实验中测量了细胞因子GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、MIP-1α、TNFα、ΜΙΡ-1β、IFNα以及IP-10，其中结果表明巨噬细胞相关的细胞因子在施用ApoCell的存在下下调了，而T细胞相关的细胞因子水平没有显著变化(表4)。
表4：含有表达CD19的HeLa细胞实体肿瘤的腹膜内体内模型的细胞因子水平，+/-CAR T细胞CD19疗法，以及+/-ApoCell。
Pg/ml 肿瘤前Car或Apo 肿瘤后+CAR 肿瘤后，CAR，+ApoCell
GM-CSF 4±2 88±10 12±4
IFNy 4±1 5±8 5±21
IL-1β 8±3 14±6 16±3
IL-10 76±13 222±44 36±22
IL-12p70 5±1 188±22 12±11
IL-13 6±2 8±1 8±4
IL-15 4±2 6±2 8±2
IL-2 4±2 26±2 28±2
IL-4 1±2 16±4 18±6
IL-6 24±6 820±56 74±12
MIP-1α 8±5 99±13 18±8
TNFα 6±2 760±33 17±15
MIP-1β 7±1 144±21 21±10
IFNα 74±12 68±26 71±14
IP-10 8±4 188±33 21±16
表4示出了施用CAR T细胞+/-ApoCells二十四小时之后的细胞因子测量结果。由CAR T细胞疗法所产生的细胞毒性评价了包括GM-CSF、IL-10、IL-12p70、IL-6、MIP-1α、TNFα、MIP-1β以及IP-10在内的细胞因子，ApoCells存在下它们的水平显著下调(p&1t；0.05～0.0001)。这些细胞因子主要与巨噬细胞相关。相反，与T细胞相关的细胞因子诸如IL-2、IL-4、IL-13以及IL15的水平没有显著变化。
图19A～C和表4所展示的结果说明，癌症和CAR背景下的CRS具有若干种成分：能分泌细胞因子的肿瘤；对肿瘤和CAR以及其他因素应答的先天免疫；以及分泌细胞因子的CART细胞导致影响先天免疫的死亡的成分。ApoCells与主要是巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的先天免疫相互作用，以下调这些巨噬细胞、单核细胞和树突细胞的应答，而不与T细胞或CAR T细胞相互作用。
接受高剂量的针对不同肿瘤抗原的CD19+CAR T细胞的小鼠没有表现出体重下降或行为改变。
凋亡细胞的施用抑制或减少了由CAR T细胞疗法诱发的细胞因子释放综合征的发生。
对施用最高剂量CD19+CART细胞的一组小鼠同时施用2.10x108个凋亡细胞/kg，这在先前被证明是安全和有效的剂量。凋亡细胞在体外或体内对具有特异性的CAR修饰的T细胞抗CD19没有负面影响。在体外有无凋亡细胞时CAR T细胞的E/T比值相当，在体内存活曲线也相当(数据未示出)。
接受人CD19+CAR T+凋亡细胞的小鼠具体显著降低的至少一种小鼠促炎细胞因子水平、较低的体重减轻以及降低的死亡率。
没有看到在存在或不存在凋亡细胞、E/T比结果相当的情况下，凋亡细胞对CAR修饰的T细胞抗CD19的负面影响。
证实了包括IL-6、IP-10、TNF-a、MIP-1α、MIP-1β在内的促炎细胞因子的显著下调(p<0.01)。IFN-γ没有下调，但其对巨噬细胞和树突细胞的影响在磷酸化ST ATI水平和IFN-γ诱导的CXCL10和CXCL9表达上得到抑制。
结论：
CRS由多种因素演变而来，包括肿瘤生物学、与单核细胞/巨噬细胞/树突细胞的相互作用，以及作为对CAR T细胞效应和扩增的应答。凋亡细胞降低了起源于先天免疫的促炎细胞因子并在不损害IFN-γ水平或CAR T细胞毒性的情况下抑制了IFN-g对单核细胞/巨噬细胞/树突细胞的影响。因此，凋亡细胞降低了起源于先天免疫的促炎细胞因子并在不损害IFN-γ水平和CAR T细胞毒性的情况下抑制了IFN-γ效应。这些结果支持将ApoCells用于在临床研究中使用CAR T细胞疗法预防CRS的用途。
虽然本文已图示和描述了本文所公开的某些特征，然而，本领域技术人员可以想到很多修改、替换、变化和等同方式。因此，应当理解的是，所附的权利要求旨在覆盖落入到本文所公开的精神范围内的所有这种修改和变化。

Claims (20)

1.一种维持或增加表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T细胞)在CAR T细胞癌症疗法期间的增殖率的方法，该方法包括给经受CAR T细胞癌症疗法的受试者施用包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液的组合物的步骤，其中，与经受CAR T细胞癌症疗法但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中所述增殖率得以维持或增加。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法不降低或抑制所述CAR T细胞癌症疗法的功效。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，与未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率得以抑制或降低。
4.根据权利要求1所述的方法，其中包含所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的所述组合物的施用发生在CAR T细胞疗法之前、同时或之后。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与所述凋亡细胞，且所述白细胞选自由吞噬细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、B细胞、T细胞以及NK细胞组成的组。
6.根据权利要求1所述的方法，其中与经受CAR T细胞癌症疗法但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法维持或增加受试者中IL-2的水平。
7.一种增加嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)癌症疗法功效的方法，所述方法包括施用CAR T细胞和附加剂的步骤，所述附加剂选自包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物、或免疫调节剂，或其任何组合的组，其中与经受CAR T细胞癌症疗法但未施用所述附加剂的受试者相比，所述CAR T细胞癌症疗法的所述功效在受试者中得到增加。
8.根据权利要求7所述的方法，其中至少一种促炎细胞因子的产生水平与接受CAR T细胞癌症疗法但未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的所述促炎细胞因子水平相比是降低的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述促炎细胞因子包含IL-6。
10.根据权利要求7所述的方法，其中当施用凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，与经受CART细胞癌症疗法但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法维持或增加受试者中IL-2的水平。
11.根据权利要求7所述的方法，其中与未施用所述附加剂的受试者相比，所述受试者中细胞因子释放综合征(CRS)或细胞因子风暴的发生率得到抑制或降低。
12.根据权利要求7所述的方法，其中所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物或至少两种组合物中，当附加剂或其试剂的组合包含在不包括所述CAR T细胞的组合物中时，包含所述一种或多种试剂的所述组合物的施用发生在所述CAR T细胞施用之前、同时或之后。
13.根据权利要求7所述的方法，其中所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与所述凋亡细胞，且所述白细胞选自由吞噬细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、B细胞、T细胞以及NK细胞组成的组。
14.一种治疗、预防、抑制、降低受试者中癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻受试者中的癌症或肿瘤的方法，包含施用表达嵌合抗原受体的T细胞(CAR T)和附加剂的步骤，所述附加剂包含凋亡细胞、凋亡细胞上清液、CTLA-4阻断剂、α-1抗胰蛋白酶或其片段或其类似物、碲基化合物、或免疫调节剂，或其任何组合，其中与施用CAR T细胞但未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法治疗、预防、抑制、降低所述受试者中癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻所述受试者中的癌症或肿瘤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中与施用CAR T细胞但未施用所述附加剂的受试者相比，所述方法在治疗，预防，抑制，降低所述受试者中所述癌症或肿瘤的发生率，改善或减轻所述受试者中所述癌症或肿瘤中具有增加的功效。
16.根据权利要求14所述的方法，其中至少一种促炎细胞因子的产生水平与施用所述CAR T细胞但未施用包含所述试剂的组合物的受试者中的所述促炎细胞因子水平相比是降低的。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述促炎细胞因子包含IL-6。
18.根据权利要求14所述的方法，其中当所述附加剂包含凋亡细胞或凋亡细胞上清液时，且与施用所述CAR T细胞但未施用所述凋亡细胞或所述凋亡细胞上清液的受试者相比，所述方法增加了受试者中IL-2的水平。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述CAR T细胞和所述附加剂或其任何组合包含在单一组合物或至少两种组合物中，且当附加剂或其试剂的组合包含在不包含所述CAR T细胞的组合物中时，包含所述一种或多种试剂的所述组合物的施用发生在所述CAR T细胞施用之前、同时或之后。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述凋亡细胞上清液是凋亡细胞-白细胞上清液，其中在收集凋亡细胞-白细胞上清液前，共培养白细胞与所述凋亡细胞，所述白细胞选自由吞噬细胞、巨噬细胞、树突细胞、单核细胞、B细胞、T细胞以及NK细胞组成的组。
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