CN112023048A

CN112023048A - 一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组b淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN112023048A
Application number: CN202010945737.6A
Authority: CN
Inventors: 张寒; 冯敏
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-09-10
Filing date: 2020-09-10
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明公开了一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用。实验证明，利用RNA干扰技术抑制白血病细胞中肿瘤抑制因子BACH2的表达，可抑制B‑ALL细胞发生凋亡，并降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，增加白血病细胞对阿糖胞苷的耐药性。本发明为白血病研究提供了一个对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系，该细胞系的建立有望为白血病耐药研究提供一个细胞系模型，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。

Description

一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

BTB与CNC同源蛋白2(BTB and CNC homology 2，BACH2)是B细胞特异性转录因子，由BACH2基因编码，在B细胞定向发育过程中发挥关键作用。在淋巴祖细胞阶段，BACH2抑制髓系发育程序，推动祖细胞向B细胞分化。在前B细胞阶段，BACH2与BCL6竞争性调控基因的启动子区，对B细胞进行阴性选择。在随后的B细胞成熟阶段，BACH2与BCL6进一步协作阻止B细胞向浆细胞分化，并调节人类体细胞高度突变和类别转换重组。近年研究表明，BACH2尚参与T细胞介导的免疫反应及T细胞静息状态的维持。由此可见，BACH2在淋巴细胞发育及分化过程中发挥重要的调节作用。

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。由于分化障碍、增殖失控、凋亡受阻等机制，恶性细胞在骨髓及其他造血组织中大量增殖，引起骨髓微环境改变，从而引发严重的临床症状及并发症。其中，急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童时期最常见的恶性肿瘤和主要死亡原因之一。随着联合化疗及支持疗法的应用，儿童ALL的治愈率在我国已达80％以上。尽管如此，白血病耐药和复发使得儿童ALL治疗进入瓶颈期，总体治愈率无明显提高。其中，最主要的原因之一是白血病发病与复发耐药机制不明。目前，儿童白血病的耐药与复发率高达15％-20％左右，已成为影响白血病患儿康复的最关键因素，不仅给患儿本身、而且给家庭及社会带来了不可弥补的严重伤害和不和谐因素。

在儿童白血病化疗方案中，阿糖胞苷(cytarabine，Ara-C)是一种作用于细胞S增殖期的嘧啶类抗代谢药物，通过抑制细胞DNA合成干扰细胞增殖。阿糖胞苷主要用于急性白血病，对急性粒细胞白血病、急性淋巴细胞白血病及急性单核细胞白血病均有疗效，并在这些疾病的治疗方案中属于诱导化疗的核心药物。尽管如此，长时间、大剂量应用阿糖胞苷容易使患儿出现耐药反应；此外，高危亚型的白血病患儿由于肿瘤恶性程度高，极易发生耐药反应与疾病复发，严重影响了白血病化疗方案的疗效与疾病转归。

发明内容

本发明首先提供了抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质的新用途。

本发明提供了抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在如下a1)-a3)中任一种中的应用：

a1)制备抑制白血病细胞凋亡的产品；

a2)制备降低白血病细胞对化疗药物的敏感性的产品；

a3)制备增加白血病细胞对化疗药物的耐药性的产品。

本发明又提供了一种产品，其活性成分为抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质；所述产品的功能为如下b1)-b3)中任一种：

b1)抑制白血病细胞凋亡；

b2)降低白血病细胞对化疗药物的敏感性；

b3)增加白血病细胞对化疗药物的耐药性。

上述任一所述应用或产品中，所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。

本发明还提供了上述抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在制备白血病耐药细胞中的应用。

本发明最后提供了一种白血病耐药细胞的制备方法。

本发明提供的白血病耐药细胞的制备方法包括如下步骤：抑制目的白血病细胞中BACH2蛋白的活性或降低目的白血病细胞中BACH2蛋白的含量或沉默或敲除或突变目的白血病细胞中的BACH2基因或抑制目的白血病细胞中BACH2基因的表达，得到重组白血病细胞；所述重组白血病细胞对化疗药物的耐药性高于所述目的白血病细胞。

上述方法中，所述重组白血病细胞对化疗药物的耐药性高于所述目的白血病细胞体现在所述重组白血病细胞的早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例低于所述目的白血病细胞和/或所述重组白血病细胞对化疗药物的IC₅₀高于所述目的白血病细胞。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质可为本领域技术人员公知的任一种可抑制BACH2蛋白合成或促进BACH2蛋白降解或抑制BACH2蛋白功能的物质，如蛋白质(如BACH2抗体)、多肽或小分子化合物(如BACH2抑制剂)等。

所述沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质可为本领域技术人员公知的任一种可使BACH2基因表达量降低或使BACH2基因发生缺失突变或插入突变或碱基替换的物质，如核酸分子(如miRNA、siRNA、dsRNA、shRNA等)或CRISPR/Cas9系统等。

在本发明的实施例中，所述抑制BACH2基因表达的物质为靶向肿瘤抑制因子BACH2的慢病毒介导的shRNA质粒，具体为靶向肿瘤抑制因子BACH2的Lenti-BACH2-shRNA-1质粒或Lenti-BACH2-shRNA-2质粒。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述化疗药物为阿糖胞苷。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述白血病细胞为人B淋巴细胞白血病细胞。进一步的，所述人B淋巴细胞白血病细胞为细胞系来源的人B淋巴细胞白血病细胞。更进一步的，所述细胞系来源的人B淋巴细胞白血病细胞为人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6。

上述任一所述应用或产品或方法中，所述BACH2蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列1，所述BACH2基因的核苷酸序列为序列表中的序列2。

按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞也属于本发明的保护范围。

按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞在白血病耐药研究中的应用也属于本发明的保护范围。

按照上述方法制备得到的白血病耐药细胞在筛选治疗或辅助治疗白血病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明利用慢病毒介导的shRNA质粒Lenti-BACH2-shRNA-1或Lenti-BACH2-shRNA-1，建立了稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-1及Nalm-6/BACH2^KD-2。WesternBlot检测稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-1、Nalm-6/BACH2^KD-2和对照组细胞中的BACH2表达水平结果表明：Nalm-6/BACH2^KD-1及Nalm-6/BACH2^KD-2中的肿瘤抑制因子BACH2表达水平明显低于对照组。流式细胞仪检测稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-2与对照组细胞的早晚期凋亡水平结果表明：经NS处理后，Nalm-6/BACH2^KD-2和对照组细胞的早期凋亡比例分别为1.85％和2.17％；晚期凋亡比例分别为1.45％和3.44％，总体凋亡比例分别为3.3％和5.61％；经化疗药物阿糖胞苷处理后，Nalm-6/BACH2^KD-2与对照组细胞早期凋亡比例分别为25.63％和35.24％；晚期凋亡比例分别为12.19％和25.44％；总体凋亡比例分别为37.82％和60.68％。

本发明证明干扰肿瘤抑制因子BACH2的表达可抑制B-ALL细胞发生凋亡，并降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，增加白血病细胞对阿糖胞苷的耐药性。本发明为白血病研究提供了一个对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系，该细胞系的建立有望为白血病耐药研究提供一个细胞系模型，在医学研究领域具有十分广阔的应用前景。

附图说明

图1为RNA干扰稳转重组白血病细胞中肿瘤抑制因子BACH2的Western Blot检测结果。其中，第一排为以BACH2单克隆抗体为一抗检测肿瘤抑制因子BACH2，第二排为以GAPDH单克隆抗体为一抗检测内参GAPDH。其中，BACH2^KD-1代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-1；BACH2^KD-2代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2；BACH2^Con代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^Con。

图2为流式细胞仪检测RNA干扰稳转重组白血病细胞中的7-AAD(-)/Annexin V(+)与7-AAD(+)/Annexin V(+)的细胞比例。其中，NS为生理盐水，Ara-C为化疗药物阿糖胞苷。其中，BACH2^KD-2代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2；BACH2^Con代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^Con。

图3为不同浓度药物处理后的稳转重组白血病细胞的存活率及药物半抑制浓度的统计图。其中，Ara-C为化疗药物阿糖胞苷，红色IC₅₀数值为BACH2^KD-2细胞的药物半抑制浓度，黑色IC₅₀数值为BACH2^Con细胞的药物半抑制浓度。其中，BACH2^KD-2代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2；BACH2^Con代表稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^Con。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的慢病毒介导的shRNA质粒Lenti-BACH2-shRNA-1、Lenti-BACH2-shRNA-2与Lenti-NS-shRNA均是美国GE Dharmacon公司的产品。其中，Lenti-BACH2-shRNA-1与Lenti-BACH2-shRNA-2的克隆号(Clone ID)分别为V3LHS_363286和V3LHS_409004。V3LHS_363286的成熟反义链序列：AAATTCTGAATACAGTCCA。V3LHS_409004的成熟反义链序列：ACTTCGGAACAGTATTGCT。

下述实施例中的慢病毒包装质粒pMD2.G与psPAX2均是美国Invitrogen公司的产品。

下述实施例中的人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6是德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)的产品。人肾上皮细胞系293T是中国科学院昆明动物研究所的产品。上述细胞系均通过细胞STR鉴定确认。

下述实施例中的急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)是赛德萨生产的注射用阿糖胞苷，生产批号为7ND5121。

下述实施例中的肿瘤抑制因子BACH2的氨基酸序列为序列表中的序列1，编码基因序列为序列表中的序列2。

下述实施例中的半抑制浓度(IC₅₀)是指50％肿瘤细胞生长受到抑制时的药物浓度。

实施例1、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰稳定转染细胞系的构建

一、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰慢病毒的包装与制备

1、转染用细胞的培养

转染前24小时，用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基在100mm培养皿、37℃和5％CO₂条件下培养人肾上皮细胞系293T达到60％～70％时进行转染。

2、慢病毒的包装与制备

将靶向肿瘤抑制因子BACH2的慢病毒shRNA质粒Lenti-BACH2-shRNA-1和Lenti-BACH2-shRNA-2，及非沉默对照的shRNA质粒Lenti-NS-shRNA分别转染步骤1培养的细胞，获得表达Lenti-BACH2-shRNA-1、Lenti-BACH2-shRNA-1与Lenti-NS-shRNA的病毒液。

上述转染的具体方法如下：

取两个无菌1.5ml EP管，其中一个EP管中加入300μl无血清DMEM培养基稀释12μg的Lenti-BACH2-shRNA-1或Lenti-BACH2-shRNA-2或Lenti-NS-shRNA质粒、6μg的包装质粒一pMD2.G及6μg的包装质粒二psPAX2；另一个EP管中加入300μl无血清DMEM培养基，加入72μl的Lipofectamine 2000试剂。将两管充分混匀，室温静置5分钟。将600μl的混合液逐滴加入100mm细胞培养皿中，轻轻摇动平皿混匀后转移至37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养。转染48小时后收集含有慢病毒的上清液，采用0.45μm滤器将上清液过滤至50ml无菌离心管中。采用4℃超速离心机，25000rpm离心90分钟后小心去除上清液，保留管底的病毒颗粒。在管底加入1ml预冷的1×PBS缓冲液，4℃冰箱过夜。次日，将溶解的病毒液分装冻存于-80℃低温冰箱供后续感染细胞使用。

二、肿瘤抑制因子BACH2的RNA干扰稳定转染细胞系的筛选与建立

将步骤一获得的病毒液分别感染人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6，建立稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-1、Nalm-6/BACH2^KD-2，及对照细胞系Nalm-6/BACH2^Con。具体步骤如下：

1、感染用细胞的培养

用含有10％FBS的RPMI-1640培养基在T-25透气细胞培养瓶、37℃和5％CO₂条件下培养人B淋巴细胞白血病细胞系Nalm-6。

2、慢病毒感染

计数步骤1培养的Nalm-6细胞密度，取含2×10⁶个细胞的培养液，1000rpm离心5分钟，去除培养基。采用10ml含有10％FBS的RPMI-1640培养基在100mm培养皿中重悬细胞。在细胞悬液中加入8μg/ml聚凝胺(polybrene)，放置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。1小时后取出细胞，加入300μl病毒液，室温2500rpm离心1小时，将细胞转移至T-25透气细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养24小时。

3、稳定转染(稳转)重组白血病细胞系的筛选与建立

取出步骤2中培养的细胞系，去除培养基，加入10ml新鲜的含有10％FBS的RPMI-1640培养基重悬细胞，继续放置37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。48小时后，将T-25培养瓶中的细胞转移至T-75透气细胞培养瓶中，补充10ml新鲜的含有10％FBS的RPMI-1640培养基继续培养。24小时后，去除培养基，更换20ml新鲜培养基重悬细胞，同时加入2μg/ml嘌呤霉素(puromycin)对细胞株进行筛选，每隔2-3天更换培养基，筛选10-14天。

三、Western Blot检测稳转重组白血病细胞系中肿瘤抑制因子BACH2的表达

取步骤二建立的稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-1、Nalm-6/BACH2^KD-2及Nalm-6/BACH2^Con，分别提取总蛋白，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参，进行Westernblot检测。检测肿瘤抑制因子BACH2的一抗为BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)，检测内参GAPDH的一抗为GAPDH单克隆抗体(购自美国Cell Signaling Technology公司)，结果如图1所示。

结果表明：采用Lenti-BACH2-shRNA-1质粒建立的稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-1与采用Lenti-BACH2-shRNA-2质粒建立的稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-2中的BACH2蛋白表达水平均明显低于对照Lenti-NS-shRNA慢病毒建立的稳转白血病细胞系Nalm-6/BACH2^Con。

上述提取总蛋白的具体方法如下：

90g离心5分钟收集稳定表达的白血病细胞，用预冷1×PBS缓冲液洗两遍，加150～300μl RIPA缓冲液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm离心30min；吸取上清，利用Bradford法进行蛋白定量；各取20μg总蛋白进行Western blot检测。

上述Western blot检测的具体方法如下：

1)电泳及转膜：对待测蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，先在电压80V下电泳30分钟，待染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120V继续电泳约1-1.5小时，直至溴酚蓝到达分离胶的底部。电泳结束后，用电转移法将分离的蛋白样品转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，400mA，2小时。

2)封闭膜：用PBS-T溶液洗(1×PBS缓冲液中加入2ml Tween-20，定容至1L)NC膜10-15分钟。将NC膜放入含5％BSA的PBS-T溶液中，室温封闭1小时。

3)免疫杂交A、一抗孵育：将BACH2(分子量130KDa)单克隆抗体(或GAPDH单克隆抗体)按1:1000稀释于PBS-T溶液中，4℃冷室中与NC膜在脱色摇床上孵育过夜，用5ml PBS-T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。

B、二抗孵育：将结合辣根过氧化物酶的羊抗兔IgG抗体按1:5000稀释在PBS-T溶液中，室温下与NC膜在脱色摇床上一起孵育约45分钟，用5ml PBS-T溶液洗NC膜10分钟，重复3次。

4)ECL试剂显色：使用ECL蛋白杂交检测试剂盒(美国BioRad公司)，参照操作说明进行NC膜显色反应。

实施例2、化疗药物处理的稳转重组白血病细胞的凋亡水平和存活率检测

一、化疗药物处理的稳转重组白血病细胞的凋亡水平检测

取实施例1中建立的稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-2与Nalm-6/BACH2^Con作为供试细胞，分别培养在3mL含有10％FBS的RPMI-1640培养基的6孔板中，细胞密度为5×10⁵个/孔，分别加入临床上常用的急性淋巴细胞白血病(ALL)化疗药物阿糖胞苷(Ara-C)20nM及生理盐水(NS)，48小时后收获细胞，采用流式细胞仪对细胞进行凋亡检测。细胞凋亡检测试剂盒为美国BD Biosciences公司的7-AAD/Annexin V细胞凋亡试剂盒。结果如图2所示。

结果表明：经Ara-C处理后，稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2及Nalm-6/BACH2^Con的早期凋亡比例分别为25.63％和35.24％；晚期凋亡比例分别为12.19％和25.44％；总体凋亡比例分别为37.82％和60.68％。经NS处理后，稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2及Nalm-6/BACH2^Con的早期凋亡比例分别为1.85％和2.17％；晚期凋亡比例分别为1.45％和3.44％，总体凋亡比例分别为3.3％和5.61％。

二、化疗药物处理的稳转重组白血病细胞存活率的检测

取实施例1中建立的稳转重组白血病细胞系Nalm-6/BACH2^KD-2与Nalm-6/BACH2^Con作为供试细胞，分别培养在1mL含有10％FBS的RPMI-1640培养基的24孔板中，细胞密度为5×10⁴个/孔，分别加入不同药物浓度的Ara-C(0、2.5nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM、500nM和1000nM)，48小时后收获细胞，采用美国Promega公司的CellTiter-Blue细胞活力测定试剂盒检测细胞存活率并计算药物的半抑制浓度(IC₅₀)。结果如图3所示。

结果表明：经不同浓度Ara-C处理后，稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2细胞对Ara-C的敏感性明显下降；稳转重组白血病细胞Nalm-6/BACH2^KD-2及Nalm-6/BACH2^Con对Ara-C的IC₅₀分别为191.44nM与22.68nM。

综上所述，干扰肿瘤抑制因子BACH2的表达可抑制B-ALL细胞发生凋亡，并降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，增加白血病细胞对化疗药物的耐药性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种对阿糖胞苷耐药的稳转重组B淋巴细胞白血病细胞系的构建方法及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 841

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ser Val Asp Glu Lys Pro Asp Ser Pro Met Tyr Val Tyr Glu Ser

1 5 10 15

Thr Val His Cys Thr Asn Ile Leu Leu Gly Leu Asn Asp Gln Arg Lys

20 25 30

Lys Asp Ile Leu Cys Asp Val Thr Leu Ile Val Glu Arg Lys Glu Phe

35 40 45

Arg Ala His Arg Ala Val Leu Ala Ala Cys Ser Glu Tyr Phe Trp Gln

50 55 60

Ala Leu Val Gly Gln Thr Lys Asn Asp Leu Val Val Ser Leu Pro Glu

65 70 75 80

Glu Val Thr Ala Arg Gly Phe Gly Pro Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Thr

85 90 95

Ala Lys Leu Leu Leu Ser Arg Glu Asn Ile Arg Glu Val Ile Arg Cys

100 105 110

Ala Glu Phe Leu Arg Met His Asn Leu Glu Asp Ser Cys Phe Ser Phe

115 120 125

Leu Gln Thr Gln Leu Leu Asn Ser Glu Asp Gly Leu Phe Val Cys Arg

130 135 140

Lys Asp Ala Ala Cys Gln Arg Pro His Glu Asp Cys Glu Asn Ser Ala

145 150 155 160

Gly Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Thr Met Asp Ser Glu Thr Ala

165 170 175

Lys Met Ala Cys Pro Arg Asp Gln Met Leu Pro Glu Pro Ile Ser Phe

180 185 190

Glu Ala Ala Ala Ile Pro Val Ala Glu Lys Glu Glu Ala Leu Leu Pro

195 200 205

Glu Pro Asp Val Pro Thr Asp Thr Lys Glu Ser Ser Glu Lys Asp Ala

210 215 220

Leu Thr Gln Tyr Pro Arg Tyr Lys Lys Tyr Gln Leu Ala Cys Thr Lys

225 230 235 240

Asn Val Tyr Asn Ala Ser Ser His Ser Thr Ser Gly Phe Ala Ser Thr

245 250 255

Phe Arg Glu Asp Asn Ser Ser Asn Ser Leu Lys Pro Gly Leu Ala Arg

260 265 270

Gly Gln Ile Lys Ser Glu Pro Pro Ser Glu Glu Asn Glu Glu Glu Ser

275 280 285

Ile Thr Leu Cys Leu Ser Gly Asp Glu Pro Asp Ala Lys Asp Arg Ala

290 295 300

Gly Asp Val Glu Met Asp Arg Lys Gln Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro

305 310 315 320

Thr Ala Pro Ala Gly Ala Ala Cys Leu Glu Arg Ser Arg Ser Val Ala

325 330 335

Ser Pro Ser Cys Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ile Thr Lys Ser Val Glu

340 345 350

Leu Ser Gly Leu Pro Ser Thr Ser Gln Gln His Phe Ala Arg Ser Pro

355 360 365

Ala Cys Pro Phe Asp Lys Gly Ile Thr Gln Gly Asp Leu Lys Thr Asp

370 375 380

Tyr Thr Pro Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Gln Pro His Val Gly Gln Lys

385 390 395 400

Glu Val Ser Asn Phe Thr Met Gly Ser Pro Leu Arg Gly Pro Gly Leu

405 410 415

Glu Ala Leu Cys Lys Gln Glu Gly Glu Leu Asp Arg Arg Ser Val Ile

420 425 430

Phe Ser Ser Ser Ala Cys Asp Gln Val Ser Thr Ser Val His Ser Tyr

435 440 445

Ser Gly Val Ser Ser Leu Asp Lys Asp Leu Ser Glu Pro Val Pro Lys

450 455 460

Gly Leu Trp Val Gly Ala Gly Gln Ser Leu Pro Ser Ser Gln Ala Tyr

465 470 475 480

Ser His Gly Gly Leu Met Ala Asp His Leu Pro Gly Arg Met Arg Pro

485 490 495

Asn Thr Ser Cys Pro Val Pro Ile Lys Val Cys Pro Arg Ser Pro Pro

500 505 510

Leu Glu Thr Arg Thr Arg Thr Ser Ser Ser Cys Ser Ser Tyr Ser Tyr

515 520 525

Ala Glu Asp Gly Ser Gly Gly Ser Pro Cys Ser Leu Pro Leu Cys Glu

530 535 540

Phe Ser Ser Ser Pro Cys Ser Gln Gly Ala Arg Phe Leu Ala Thr Glu

545 550 555 560

His Gln Glu Pro Gly Leu Met Gly Asp Gly Met Tyr Asn Gln Val Arg

565 570 575

Pro Gln Ile Lys Cys Glu Gln Ser Tyr Gly Thr Asn Ser Ser Asp Glu

580 585 590

Ser Gly Ser Phe Ser Glu Ala Asp Ser Glu Ser Cys Pro Val Gln Asp

595 600 605

Arg Gly Gln Glu Val Lys Leu Pro Phe Pro Val Asp Gln Ile Thr Asp

610 615 620

Leu Pro Arg Asn Asp Phe Gln Met Met Ile Lys Met His Lys Leu Thr

625 630 635 640

Ser Glu Gln Leu Glu Phe Ile His Asp Val Arg Arg Arg Ser Lys Asn

645 650 655

Arg Ile Ala Ala Gln Arg Cys Arg Lys Arg Lys Leu Asp Cys Ile Gln

660 665 670

Asn Leu Glu Cys Glu Ile Arg Lys Leu Val Cys Glu Lys Glu Lys Leu

675 680 685

Leu Ser Glu Arg Asn Gln Leu Lys Ala Cys Met Gly Glu Leu Leu Asp

690 695 700

Asn Phe Ser Cys Leu Ser Gln Glu Val Cys Arg Asp Ile Gln Ser Pro

705 710 715 720

Glu Gln Ile Gln Ala Leu His Arg Tyr Cys Pro Val Leu Arg Pro Met

725 730 735

Asp Leu Pro Thr Ala Ser Ser Ile Asn Pro Ala Pro Leu Gly Ala Glu

740 745 750

Gln Asn Ile Ala Ala Ser Gln Cys Ala Val Gly Glu Asn Val Pro Cys

755 760 765

Cys Leu Glu Pro Gly Ala Ala Pro Pro Gly Pro Pro Trp Ala Pro Ser

770 775 780

Asn Thr Ser Glu Asn Cys Thr Ser Gly Arg Arg Leu Glu Gly Thr Asp

785 790 795 800

Pro Gly Thr Phe Ser Glu Arg Gly Pro Pro Leu Glu Pro Arg Ser Gln

805 810 815

Thr Val Thr Val Asp Phe Cys Gln Glu Met Thr Asp Lys Cys Thr Thr

820 825 830

Asp Glu Gln Pro Arg Lys Asp Tyr Thr

835 840

<210> 2

<211> 2526

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atgtctgtgg atgagaagcc tgactccccc atgtatgtgt atgagtccac agtccactgc 60

accaacatcc tcctgggcct caatgaccag cggaaaaagg atattctctg tgacgtgact 120

ttgatcgtgg agaggaagga gttccgggcc caccgggctg tgctggccgc atgcagtgaa 180

tatttttggc aggcgctggt tggacagaca aaaaatgatt tggtggtcag cttgcctgag 240

gaggtcacag ccaggggctt tgggccgctg ttacagtttg cctacactgc caagctgtta 300

ctcagcagag aaaacatccg cgaggtcatc cgctgtgctg agttcctgcg catgcacaac 360

ctggaggact cctgcttcag cttcctgcag acccagctcc tgaacagtga ggatggcctg 420

tttgtgtgcc ggaaggatgc tgcgtgccag cgcccacacg aggactgcga gaactctgca 480

ggagaggagg aggatgaaga ggaggagacg atggattcag agacggccaa gatggcttgc 540

cccagggacc agatgcttcc agagcccatc agctttgagg ccgccgccat ccccgtagca 600

gagaaggaag aagccctgct gcccgagcct gacgtgccca cagacaccaa ggagagctca 660

gaaaaggacg cgttaacgca gtaccccaga tacaagaaat accagcttgc atgtaccaag 720

aatgtctata atgcatcatc acacagtacc tcaggttttg caagcacatt ccgggaagat 780

aactctagca acagcctcaa gccggggctt gccagggggc agattaaaag tgagccgccc 840

agtgaagaga atgaggaaga gagcatcacg ctctgcctgt ctggagatga gcctgacgcc 900

aaggacagag cgggggatgt cgagatggac cggaaacagc ccagccctgc ccctaccccc 960

acggccccag ctggggccgc ctgcctggag agatccagga gcgtggcctc gccctcctgc 1020

ttaaggtctc tgttcagcat aacgaaaagt gtggagctgt ctggcctgcc cagtacatct 1080

cagcagcact ttgccaggag tccagcctgc ccttttgaca aggggatcac tcagggtgac 1140

cttaaaactg actacacccc tttcacaggg aattatggac agccccacgt gggccagaag 1200

gaggtgtcca acttcaccat ggggtcgccc ctcagggggc ctgggttgga ggctctctgt 1260

aaacaggagg gagagctgga ccggaggagc gtgatcttct cctccagcgc ttgtgaccaa 1320

gtgagcacct cggtgcattc ttattctggg gtgagcagtt tggacaaaga cctctctgag 1380

ccggtgccaa agggtctgtg ggtgggagcc ggccagtccc tccccagctc gcaggcctac 1440

tcccacggtg ggctgatggc cgaccacttg ccaggaagga tgcggcccaa caccagctgc 1500

ccggtaccaa tcaaagtctg ccctcgctca ccccccttgg agaccaggac caggacttcc 1560

agctcctgct cttcctattc ctacgcggag gacgggagcg ggggctcacc ctgcagcctc 1620

cctctctgtg agttctcctc ctcgccctgt tcccagggag ccagattcct tgccacagaa 1680

catcaggaac caggcctgat gggagatgga atgtacaacc aagtgcggcc ccaaattaaa 1740

tgtgagcagt cttatggaac caactccagt gacgaatccg gatcgttctc ggaagcagac 1800

agtgagtcgt gtcctgtgca ggacaggggc caggaggtaa aacttccttt tcctgtagat 1860

caaatcacag atcttccaag gaacgatttc cagatgatga ttaaaatgca caagctaacc 1920

tcagaacagt tagagtttat tcatgatgtc cgacggcgca gcaagaaccg catcgcggcc 1980

cagcgctgcc gcaaaaggaa actggactgt attcagaatt tagaatgtga aatccgcaaa 2040

ttggtgtgtg agaaagagaa actgttgtca gagaggaatc aactgaaagc atgcatgggg 2100

gaactgttgg acaacttctc ctgcctttcc caggaagttt gccgagacat ccagagcccc 2160

gagcagatcc aggccctgca tcggtattgc cctgtcctca gacccatgga cttgcccacg 2220

gcctccagta ttaaccctgc gcccttgggt gctgagcaga acattgcggc ctcccaatgc 2280

gcagtggggg aaaacgtgcc ctgctgcttg gagccaggcg cggctccccc cggacccccc 2340

tgggcaccca gcaacacctc cgagaattgt acctctggga ggagactaga aggcactgac 2400

ccgggaacct tctcagagag aggacctcct cttgaaccca ggagccaaac agtgaccgtg 2460

gacttctgcc aggaaatgac tgataagtgt acaactgacg aacagcccag gaaagattat 2520

acctag 2526

Claims

1.抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在如下a1)-a3)中任一种中的应用：

a1)制备抑制白血病细胞凋亡的产品；

a2)制备降低白血病细胞对化疗药物的敏感性的产品；

a3)制备增加白血病细胞对化疗药物的耐药性的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。

3.一种产品，其活性成分为抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质；所述产品的功能为如下b1)-b3)中任一种：

b1)抑制白血病细胞凋亡；

b2)降低白血病细胞对化疗药物的敏感性；

b3)增加白血病细胞对化疗药物的耐药性。

4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于：所述抑制白血病细胞凋亡为降低白血病细胞早期凋亡比例和/或晚期凋亡比例。

5.权利要求1中所述的抑制BACH2蛋白活性的物质或降低BACH2蛋白含量的物质或沉默或敲除或突变BACH2基因的物质或抑制BACH2基因表达的物质在制备白血病耐药细胞中的应用。

6.一种白血病耐药细胞的制备方法，包括如下步骤：抑制目的白血病细胞中BACH2蛋白的活性或降低目的白血病细胞中BACH2蛋白的含量或沉默或敲除或突变目的白血病细胞中的BACH2基因或抑制目的白血病细胞中BACH2基因的表达，得到重组白血病细胞；所述重组白血病细胞对化疗药物的耐药性高于所述目的白血病细胞。

7.按照权利要求6所述的方法制备得到的白血病耐药细胞。

8.权利要求7所述的白血病耐药细胞在白血病耐药研究中的应用；

或，权利要求7所述的白血病耐药细胞在筛选治疗或辅助治疗白血病的药物中的应用。

9.根据权利要求1或2所述的应用或权利要求3或4所述的产品或权利要求5所述的应用或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述化疗药物为阿糖胞苷。

10.根据权利要求1或2所述的应用或权利要求3或4所述的产品或权利要求5所述的应用或权利要求6所述的方法，其特征在于：所述白血病细胞为人B淋巴细胞白血病细胞。