CN113718030B - 与白血病诊疗相关的靶点pabpc1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与白血病诊疗相关的靶点PABPC1及其应用。本发明发现,PABPC1在体外可促进CML细胞系细胞周期与增殖、抑制细胞分化;敲低PABPC1组小鼠生存率显著提高;CML患者细胞中敲低PABPC1可显著抑制白血病细胞增殖与克隆形成、促进细胞凋亡;CML中PABPC1可通过直接结合其3’UTR、促进翻译起始因子的组装来促进Bcr‑Abl翻译;伊马替尼耐药CML细胞系中敲低PABPC1可抑制Bcr‑Abl翻译、抑制细胞周期与增殖、促进细胞凋亡;PABPC1可显著调控细胞周期相关基因的稳定性与翻译水平,为以PABPC1为诊疗靶点筛选小分子药物、解决CML急变及耐药问题奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及与白血病诊疗相关的靶点PABPC1及其应用。
背景技术
PABPC1(poly(A)binding protein cytoplasmic 1)是一种RNA结合蛋白,主要在细胞质中分布,可在细胞质与细胞核之间穿梭;PABPC1包含4个RRM(RNA识别结构域)和1个MLLE结构域(识别PAM2结构域),通过RRM结构域,识别AT富集的RNA序列。PABPC1可广谱结合mRNA的PolyA尾,维持特异mRNA稳定、防止其被核酸酶降解;同时其RRM2的N端可广谱结合mRNA的5’Cap帽结构,并可募集eIF4G,促进翻译起始复合物eIF4F形成,进而促进核糖体大小亚基募集及组装,促进mRNA翻译。同时,PABPC1还可通过其MLLE结构域识别RISC复合物,介导miRNA对其靶基因的调控。
目前,PABPC1的相关研究主要集中在其参与RNA代谢各个环节的调控机制,其在个体发育及疾病发生中的功能报道较少,在白血病中尚未有相关功能机制的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效治疗髓系白血病的靶向作用基因PABPC1,并阐释其发挥致病作用的机制。
第一方面,本发明保护抑制PABPC1蛋白活性的物质或降低PABPC1蛋白含量的物质或沉默或敲低或突变PABPC1基因的物质或抑制PABPC1基因表达的物质的新用途。
本发明保护抑制PABPC1蛋白活性的物质或降低PABPC1蛋白含量的物质或沉默或敲低或突变PABPC1基因的物质或抑制PABPC1基因表达的物质在如下a1)-a14)中任一种中的应用:
a1)制备治疗或辅助治疗白血病的产品;
a2)制备抑制白血病发生与发展的产品;
a3)制备抑制白血病细胞增殖和/或生长的产品;
a4)制备抑制白血病细胞周期的产品;
a5)制备促进白血病细胞分化的产品;
a6)制备促进或诱导白血病细胞凋亡的产品;
a7)制备促进或诱导白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞凋亡的产品;
a8)制备抑制白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞增殖和/或生长的产品;
a9)制备下调致病融合基因Bcr-Abl mRNA翻译水平的产品;
a10)制备抑制翻译起始因子互作的产品;
a11)制备抑制翻译起始复合物组装的产品;
a12)制备下调细胞周期相关基因的mRNA表达水平的产品;
a13)制备降低细胞周期相关基因的mRNA稳定性的产品;
a14)制备降低细胞周期相关基因的mRNA翻译水平的产品。
第二方面,本发明保护一种产品;所述产品的活性成分为抑制PABPC1蛋白活性的物质或降低PABPC1蛋白含量的物质或沉默或敲低或突变PABPC1基因的物质或抑制PABPC1基因表达的物质;所述产品的功能为如下b1)-b14)中任一种:
b1)治疗或辅助治疗白血病;
b2)抑制白血病发生与发展;
b3)抑制白血病细胞增殖和/或生长;
b4)抑制白血病细胞周期和/或细胞周期S期;
b5)促进白血病细胞分化;
b6)促进或诱导白血病细胞凋亡;
b7)促进或诱导白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞凋亡;
b8)抑制白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞增殖和/或生长;
b9)下调致病融合基因Bcr-Abl mRNA翻译水平;
b10)抑制翻译起始因子互作;
b11)抑制翻译起始复合物组装;
b12)下调细胞周期相关基因的mRNA表达水平;
b13)降低细胞周期相关基因的mRNA稳定性;
b14)降低细胞周期相关基因的mRNA翻译水平。
上述PABPC1蛋白作为靶点在开发或设计或筛选治疗或辅助治疗白血病的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述应用或产品中,所述a4)或b4)中,所述抑制白血病细胞周期为减少白血病细胞DNA合成期S期的比例和/或增加DNA合成前期G1期的比例。
所述a5)或b5)中,所述促进白血病细胞分化体现在促进白血病细胞向红系终末期分化和/或促进白血病细胞向巨核系终末期分化。所述促进白血病细胞向红系终末期分化具体体现在HBA和/或HBG表达水平增加和/或联苯胺染色阳性比例增加。所述促进白血病细胞向巨核系终末期分化具体体现在CD41a阳性细胞占比显著增加。
所述a6)或b6)中,所述促进或诱导白血病细胞凋亡为促进或诱导白血病细胞早期凋亡和/或晚期凋亡。所述促进或诱导白血病细胞早期凋亡和/或晚期凋亡具体体现在早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞和/或晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例增加。
所述a7)或b7)中,所述促进或诱导白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞凋亡为促进或诱导白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞早期凋亡和/或晚期凋亡。所述促进或诱导白血病患者造血干细胞和/或造血祖细胞早期凋亡和/或晚期凋亡具体体现在早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞和/或晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例增加。
所述a9)或b9)中,所述致病融合基因Bcr-Abl由22号染色体BCR(NC_000022.11)和9号染色体ABL(NC_000009.12)基因于特定内含子处断裂、染色体易位即费城染色体所造成,BCR第1-12外显子基因序列与ABL第2-12外显子基因序列融合后形成的致病基因。
所述a10)或b10)中,所述抑制翻译起始因子的互作为抑制翻译起始因子eIF4G与eIF4E相互作用。
所述a11)或b11)中,所述抑制翻译起始复合物组装为抑制翻译起始因子eIF4G与多聚核糖体大小亚基相互作用。所述多聚核糖体大小亚基为核糖体小亚基40S和/或游离核糖体80S。
所述a12)或b12)或a13)或b13)中,所述细胞周期相关为如下基因中任一种:MCM7(NC_000007.14)、CDC25A(NC_000003.12)、CCND2(NC_000012.12)、CCNA2(NC_000004.12)、CDK1(NC_000010.11)、EIF4EBP1(NC_000008.11)、MCM6(NC_000002.12)、MCM8(NC_000020.11)、POLA2(NC_000011.10)、POLE(NC_000012.12)、RBL1(NC_000020.11)、E2F1(NC_000020.11)、RPA2(NC_000001.11)、ZNF385A(NC_000012.12)或PPKDC(NC_000008.11)。
所述a14)或b14)中,所述细胞周期相关基因为如下基因中的任一种:ARHGAP45(NC_000019.10)、ARPC2(NC_000002.12)、CDCA5(NC_000011.10)、CDT1(NC_000016.10)、CENPT(NC_000016.10)、CKAP5(NC_000011.10)、FBXW5(NC_000009.12)、FZR1(NC_000019.10)、MZT1(NC_000013.11)、PSMB10(NC_000016.10)、PIAS4(NC_000019.10)、PLOD1(NC_000001.11)、PPP1R12A(NC_000012.12)、RAC3(NC_000017.11)或RCC2(NC_000001.11)。
上述任一所述应用或产品中,所述抑制PABPC1蛋白活性的物质或降低PABPC1蛋白含量的物质为抑制PABPC1蛋白合成或促进PABPC1蛋白降解或抑制PABPC1蛋白功能的蛋白质、多肽或小分子化合物。
所述沉默或敲低或突变PABPC1基因的物质或抑制PABPC1基因表达的物质为抑制PABPC1基因表达的shRNA。在本发明的具体实施例中,所述抑制PABPC1基因表达的shRNA的编码基因为序列1或序列2所示的核酸分子。
上述任一所述应用或产品中,所述白血病为慢性髓性白血病。
所述白血病细胞为慢性髓性白血病细胞或慢性髓性白血病耐药细胞。
所述慢性髓性白血病细胞具体为人成巨核细胞白血病细胞系MEG-01或人类红白血病细胞系K562。
所述慢性髓性白血病耐药细胞具体为人STI571耐药细胞株K562/G01(KG细胞)。
上述任一所述应用或产品中,所述产品为药物。
上述任一所述应用或产品中,所述PABPC1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_002559.2(polyadenylate-binding protein 1[Homo sapiens]),所述PABPC1基因序列的GenBank号为NG_027520.1。
本发明以血液肿瘤慢性髓性白血病CML为研究对象,分析公共数据GSE4170中CML慢性期与急变期患者基因差异表达,CML急变过程中PABPC1基因表达显著上调,治疗缓解期PABPC1基因表达显著下调。在CML细胞系(人类红白血病细胞系K562、人成巨核细胞白血病细胞系MEG-01、人STI571耐药细胞株K562/G01)体外细胞实验中发现,PABPC1蛋白质可促进CML致病Bcr-Abl融合基因mRNA翻译水平,使CML致病Bcr-Abl融合蛋白表达量上调,进而促进CML细胞周期G1-S期转换,抑制CML细胞分化及细胞凋亡,促进CML细胞增殖。在NOD/SCID(非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷)小鼠移植白血病细胞实验中发现,敲低PABPC1组小鼠较不易患CML,体内CML细胞增殖数量显著下降、小鼠生存率显著提高、生存期显著延长。在CML患者来源的白血病细胞中,抑制PABPC1表达,可显著抑制白血病细胞的增殖及克隆形成能力,并能显著促进白血病细胞凋亡。CML细胞系(对照组,PABPC1敲低组)经放线菌酮CHX处理10分钟,收集细胞样品进行Polysome profiling(多聚核糖体图谱)收集不同密度核糖体组分(Free、40S、60S、80S、Polysomes),浓缩沉淀蛋白后等体积上样进行Western Blot(蛋白质印迹法即免疫印迹)检测,同时CML细胞系(对照组,PABPC1敲低组)进行eIF4E抗体Co-IP(Co-Immunoprecipitation,免疫共沉淀)共同显示,PABPC1可通过结合Bcr-Abl mRNA的3’UTR、影响eIF4G与eIF4E等翻译起始因子互作及翻译起始复合物组装促进Bcr-Abl融合基因的翻译。Q-PCR检测经放线菌素D或CHX处理的K562细胞(对照组、PABPC1KD组)显示,PABPC1促进细胞周期相关基因的表达及细胞周期相关系列基因的翻译水平。本发明深入探索了致癌蛋白PABPC1在CML中促进白血病发生的功能,促进CML致病融合基因Bcr-Abl翻译的机理,并阐释了CML中PABPC1调控的基因表达图谱,为以PABPC1为药物作用靶点开发并筛选小分子药物奠定基础。
附图说明
图1为PABPC1在CML急变过程中表达上升。图1A为对57例CML慢性期患者与33例CML急变期患者差异表达较显著的1000个基因进行聚类分析。图1B对图1A中差异表达的基因进行GO功能富集分析。图1C为对57例CML慢性期患者、33例CML急变期患者以及4例CML急变治疗缓解期患者中407个人类RNA结合蛋白基因表达进行聚类分析。图1D为对差异表达显著的RBP基因进行相互作用的网络分析。图1E为对CML患者急变过程中PABPC1基因差异表达进行分析。图1F为AML患者预后生存期与PABPC1基因表达量相关性分析。
图2为PABPC1在体内外均促进CML疾病的发生发展。图2A为Westen Blot检测CML细胞系中PABPC1敲低后蛋白质表达水平。图2B为CCK8 Assay检测PABPC1敲低细胞的增殖生长能力。图2C为CFU Assay检测PABPC1敲低细胞的增殖生长能力。图2D为碘化丙啶PI染色法检测PABPC1敲低细胞的细胞周期变化。图2E为Annexin V-633检测PABPC1敲低细胞的凋亡水平。图2F为联苯胺染色、Q-PCR检测PABPC1敲低细胞向红系分化。图2G为CD41a流式检测PABPC1敲低细胞向巨核系分化。图2H为小鼠体内中CML细胞移植率和生存率检测。
图3为PABPC1敲低可抑制CML患者造血干/祖细胞生长。图3A为CCK8 Assay检测4例初治CML患者CD34+细胞中敲低PABPC1后的增殖生长能力。图3B为CFU Assay检测2例初治CML患者CD34+细胞中敲低PABPC1后的增殖生长能力。图3C为Annexin V检测4例初治CML患者CD34+细胞的凋亡水平。
图4为CML细胞中PABPC1直接结合并促进Bcr-Abl翻译。图4A为PABPC1蛋白eCLIP-seq分析Abl mRNA的3’UTR结合峰分布。图4B为Q-PCR和Western Blot检测Bcr-Abl的RNA和蛋白质表达水平。图4C为Polysome Profiling结合Q-PCR检测Bcr-Abl基因翻译水平。图4D、4E为蛋白免疫共沉淀Co-IP检测PABPC1与翻译起始因子的相互作用及PABPC1促进翻译起始因子之间的相互作用。图4F为多聚核糖体印迹Polysome Profiling结合Western Blot检测PABPC1促进翻译起始因子参与翻译起始。
图5为抑制PABPC1可阻碍TKI耐药细胞株K562/G01的生长。图5A为Annexin V检测TKI不促使K562/G01细胞凋亡。图5B为碘化丙啶PI染色法检测TKI不抑制K562/G01细胞的细胞S周期。图5C为CCK8 Assay检测PABPC1敲低细胞的增殖生长能力。图5D为CFU Assay检测PABPC1敲低细胞的增殖生长能力。图5E为碘化丙啶PI染色法检测PABPC1敲低细胞的细胞周期变化。图5F为Annexin V检测PABPC1敲低细胞的凋亡水平。图5G为Polysome Profiling结合Q-PCR检测Bcr-Abl基因翻译水平。
图6为PABPC1促进细胞周期相关基因的表达及细胞周期相关基因的翻译水平。图6A为PABPC1促进细胞周期相关基因的mRNA稳定性。图6B为PABPC1促进细胞周期相关基因的mRNA翻译水平。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
下述实施例中的慢性髓性白血病急变期细胞MEG-01和K562均是中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心的产品,资源编号分别为3111C0001CCC000521和3111C0001CCC000039。
STI571或伊马替尼耐药细胞株K562/G01记载于文献“文献-K562/G01耐药模型的建立、耐药性的克服及其分子机制,齐静,苏州大学”中,公众可从申请人处获得,该生物材料只为重复本发明的相关实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的PABPC1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_002559.2(polyadenylate-binding protein 1[Homo sapiens]),其编码基因(PABPC1)序列的GenBank号为NG_027520.1。
实施例1、PABPC1在CML急变过程中表达上升
一、PABPC1在CML急变过程中表达上升
1、CML患者急变过程中基因的差异表达分析
参考文献[Proc Natl Acad Sci U S A.2006Feb 21;103(8):2794-9.],对57例CML慢性期患者、33例CML急变期患者进行基因差异表达分析,选取前1000个显著差异表达的基因进行Heatmap热图可视化展示。结果如图1A所示,结果表明:CML由慢性期到急变期的急变过程中一系列基因的表达水平显著上调和下调。
2、GO功能富集分析
对急变过程中差异变化的基因进行GO功能富集分析,并进行Bubble chart可视化展示。
结果如图1B所示,结果表明:CML急变过程中显著上调基因的功能多与免疫应激下髓系细胞激活因子、多肽合成、RNA代谢相关。
3、人类RNA结合蛋白基因的差异表达分析
对57例CML慢性期患者、33例CML急变期患者以及4例CML急变治疗缓解期患者进行407个人类RNA结合蛋白(RBPDB)基因的差异表达分析,并进行Heatmap可视化展示。
结果如图1C所示,结果表明:CML急变过程中多个RNA结合蛋白基因的表达水平显著上调,治疗缓解期下调,其中包括PABPC1。
4、PABPC1基因的发现
根据公共数据及文献信息分析图1B中慢性期到急变期显著上调的RNA结合蛋白相关基因之间的相互作用关系。
结果如图1D所示,结果表明:慢性期到急变期显著上调的RNA结合蛋白之间存在复杂的相互作用,其中PABPC1位于网络的中心位置,与更多的RNA结合蛋白存在相互作用,可能发挥着更为重要的作用。
5、PABPC1基因差异表达分析
对57例CML慢性期患者、33例CML急变期患者以及4例CML急变治疗缓解期患者进行人类PABPC1基因的差异表达分析。
结果如图1E所示,纵坐标FPKM代表PABPC1表达量,结果表明:CML由慢性期到急变期的急变过程中PABPC1基因表达水平显著升高(p<0.001),由急变期到治疗缓解期PABPC1基因表达水平显著下降(p=0.06)。
二、AML患者预后生存期与PABPC1基因表达量相关性分析
TCGA数据库中下载119例AML患者基因表达数据进行差异基因表达分析,以PABPC1(ENSG00000070756)中值为界限,将患者分为PABPC1高表达组(n=59)和PABPC1低表达组(n=60),对AML患者预后生存期与PABPC1基因表达量进行相关性分析。
结果如图1F所示,结果表明:随着时间迁移,AML患者(n=119例)中PABPC1高表达的患者预后生存率较低,PABPC1的高表达与患者的生存显著相关。
实施例2、PABPC1体内外促进CML疾病的发生发展
一、PABPC1敲低的CML急变期细胞株K562、MEG-01的制备
1、慢病毒重组质粒的构建
(1)重组质粒的制备
设计并合成特异靶向于PABPC1的shPABPC1-1,其编码序列如下:
CCAGACCTCATCCATTCCAAACTCGAGTTTGGAATGGATGAGGTCTGG(序列1)。
设计并合成特异的靶向于PABPC1的shPABPC1-5,其编码序列如下:
AGCTGTTCCCAACCCTGTAATCTCGAGATTACAGGGTTGGGAACAGC(序列2)。
分别将上述shRNA的编码序列克隆至pLKO.1慢病毒质粒(Addgene)中,分别获得重组质粒shPABPC1-1和shPABPC1-2。
(2)重组质粒的鉴定
对重组质粒进行PCR鉴定,并将PCR鉴定正确的重组质粒进行测序验证。将含有shPABPC1-1编码序列的重组质粒命名为慢病毒重组质粒shPABPC1-1(PABPC1KD-1),将含有shPABPC1-2编码序列的重组质粒命名为慢病毒重组质粒shPABPC1-2(PABPC1KD-2)。同时将pLKO.1慢病毒质粒(Addgene)作为对照组,命名为对照质粒shCTR。
2、慢病毒重组质粒的包装
分别将慢病毒重组质粒shPABPC1-1、shPABPC1-2和对照质粒shCTR进行包装,分别得到慢病毒颗粒shPABPC1-1、shPABPC1-2和shCTR。具体步骤如下:
(1)将已长到80%-90%的293T细胞(1个10cm细胞培养皿)从37℃、5%CO2的细胞培养箱中取出,0.25%Trypsin-EDTA(GibcoTM,25200056)消化2min后,使用含1%Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)(GibcoTM,10378016)和10%FBS(Excell Bio,FND500)的DMEM培养基(GibcoTM,11965-084)终止消化,每10cm细胞培养皿中加入1/3细胞和9ml DMEM完全培养基,轻轻摇匀,放入37℃、5%CO2培养箱中培养。
(2)293T细胞传代14-16小时之间进行慢病毒包装,shPABPC1-1、shPABPC1-2和shCTR组分别加入如下试剂:400μl Opti-MEMTM(GibcoTM,31985062)、6μg慢病毒重组质粒、4.5μg psPAX2(武汉淼灵生物科技有限公司,P026)和1.5μg pMD2.G(广州吉赛生物科技股份有限公司,161220L08),向体系中加入12μl PLUSTMReagent(InvitrogenTM公司,15338100),混匀后室温静置5min;同时400μl Opti-MEMTM、30μL LTX Reagent(InvitrogenTM,15338100)混匀后室温静置5min;上述两个体系混匀,并将混合液室温静置30min。
(3)将293T细胞取出换上7mL含10%FBS的DMEM完全培养基,将混合液均匀滴加对应培养皿中,轻轻摇匀,放入培养箱中培养4-6小时后,加入12-15ml含1%Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)和30%FBS的DMEM完全培养基,继续培养。
(4)继续培养48h后收取培养上清并用0.45μm过滤器过滤到50ml离心管中,4℃、20400rpm高速离心2小时;弃上清液,1ml DMEM重悬病毒颗粒即为病毒浓缩液。
(5)将病毒浓缩液按200μl/管分装,另外留取10μl进行病毒滴度测定。将分装好的浓缩液置于-80℃冰箱保存。
3、慢病毒颗粒转染靶细胞K562、MEG-01
慢病毒颗粒shPABPC1-1、shPABPC1-2和shCTR感染靶细胞。具体步骤如下:
(1)将靶细胞从37℃、5%CO2的细胞培养箱中取出,5×106铺到10cm皿中,共铺3皿,每皿中含有10ml的含10%FBS、1%Penicillin-Streptomycin-Glutamine(100X)的RPMI1640培养基(GibcoTM,22400-089)。
(2)每皿加8μg/ml Polybrene(Sigma,H9268-5G),PABPC1敲低实验组加入350μlshPABPC1-1/2病毒浓缩液,对照组加入200μl shCTR病毒浓缩液,轻轻混匀。
(3)感染细胞24小时后换新鲜细胞培养基,感染细胞2-3天后,向细胞悬液中加入1μg/ml puromycin(GibcoTM,A1113803)至少24h来药筛感染慢病毒成功的细胞。
将转染慢病毒颗粒shPABPC1-1筛选获得的PABPC1敲低细胞株记作PABPC1敲低-1组(KD-1);
将转染慢病毒颗粒shPABPC1-2筛选获得的PABPC1敲低细胞株记作PABPC1敲低-2组(KD-2);
将转染慢病毒颗粒shCTR筛选获得的细胞株记作对照组细胞。
4、Western Blot检测靶细胞PABPC1蛋白的表达水平
(1)蛋白样品制备:每组取约1×106个细胞,PBS洗2遍后彻底去上清,加100μL含Protein cocktail(Roche,04693132001)的RIPA裂解液(碧云天,P0013K);冰上吹打裂解30min,4℃、12000rpm离心10min,收集上清;BCA蛋白浓度检测试剂盒(Solarbio,PC0020)检测上清中蛋白质浓度,加适量5×SDS-PAGE Loading Buffer(碧云天,P0015)和无菌去离子水将蛋白质浓度稀释至2μg/μl,煮沸10min,于-80℃保存。
(2)SDS-PAGE胶电泳:SDS-PAGE胶(8%分离胶、5%浓缩胶)、电泳液配制及详细操作步骤参照文献[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.],20ug蛋白质/孔进行上样,80-100V电泳至溴酚蓝指示剂距离底端0.5~1cm停止。
(3)转膜(0.45μm PVDF膜):电转液配制及详细操作步骤参照文献[Methods MolBiol.2015;1318:87-96.The Western Blot.],恒流260mA电转约120min。
(4)抗体杂交:5%脱脂奶(配制参照[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.])室温封闭1小时,一抗稀释液(碧云天,P0023A)2000倍稀释PABPC1抗体(Millipore,04-1467)、GAPDH抗体(Proteintech,10494-1-AP),根据蛋白质Marker保留PVDF膜,与对应一抗于4℃孵育过夜。
(5)显影:TBST(配制参照[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.The WesternBlot.])洗膜三次,每次5min;5%脱脂奶10000倍稀释鼠源(LABLEAD,S0100)、兔源抗体(LABLEAD,S0101),常温孵育1~2小时;用TBST洗膜3次,每次10min;ECL发光液(Millipore,WBKlS0100)显影并选择曝光时间。
结果如图2A所示,Western Blot检测结果显示,K562/MEG-01细胞中,相比于对照组CTR组,PABPC1敲低KD-1和KD-2组中的PABPC1蛋白表达水平显著下降,说明K562/MEG-01细胞中PABPC1成功被敲低,PABPC1敲低的CML急变期细胞株K562、MEG-01成功被构建。
二、CCK8 Assay检测细胞增殖
CCK8 Assay检测PABPC1敲低K562细胞和PABPC1敲低MEG-01细胞的增殖生长能力。
具体步骤如下:
1、取5个96孔板,分为0h、24h、48h、72h、96h组,每板中接种100μl细胞悬液(PABPC1敲低K562细胞、PABPC1敲低MEG-01细胞和对照组细胞),每组设5个复孔,每孔约5000个细胞,加入细胞悬液的孔周围使用100μl PBS缓冲液包围,培养箱(37℃、5%CO2)培养。
2、铺板后0h、24h、48h、72h、96h,向每100μl细胞悬液加10μl CCK8试剂(东仁化学,CK04),混匀,培养箱(37℃、5%CO2)孵育2h后,检测细胞悬液450nm、630nm波长的吸光度,并计算二者差值即细胞脱氢酶活性。三个生物学重复数值取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组细胞脱氢酶活性的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
结果如图2B所示,横坐标为检测吸光度的时间点,纵坐标为450nm、630nm波长的吸光度差值。结果表明:相比于对照组,CML急变期细胞系中敲低PABPC1后细胞脱氢酶活性显著下降。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞的增殖与生长。
三、CFU Assay检测细胞增殖
CFU Assay检测PABPC1敲低K562细胞和PABPC1敲低MEG-01细胞的增殖生长能力。
具体步骤如下:
1、取适量6孔板,分为对照组、PABPC1敲低-1组、PABPC1敲低-2组,每组设3个复孔,每孔约200个细胞,具体铺板操作参照甲基纤维素培养基(Stem Cell,MethoCultTMH4230)说明书,空白孔加入适量PBS,培养箱(37℃、5%CO2)培养。
2、铺板后10天左右,光学显微镜下记录细胞克隆数量,并拍照记录细胞克隆的大小、形状,三个生物学重复数值取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组细胞克隆数的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
结果如图2C所示,纵坐标数值为细胞克隆数量。结果表明:相比于对照组,CML急变期细胞系中敲低PABPC1后细胞克隆数显著减少。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞的增殖与生长。
四、碘化丙啶PI染色法检测细胞周期
碘化丙啶PI染色法检测PABPC1敲低K562细胞和PABPC1敲低MEG-01细胞的细胞周期。具体步骤如下:
1、对照组、PABPC1敲低-1组和PABPC1敲低-2组各收集5×105个细胞,设三个生物学重复,预冷EDTA-PBS洗细胞沉淀两次,每次1000rpm 3min,最后100μl EDTA-PBS重悬细胞沉淀,逐滴加入400μl预冷无水乙醇,边加边轻混,4℃放置4h至1周。
2、1000rpm离心3min,弃上清,预冷EDTA-PBS洗细胞沉淀两次,每次2000rpm 5min,100μl预冷EDTA-PBS重悬细胞沉淀,每组加入5μl 10mg/ml RNAase A溶液(Sigma,R5125),轻混后37℃孵育30min;样品置冰上结束酶消化,每组分别加入5μl 1mg/ml PI染液(东仁化学,25535-16-4),轻混后4℃孵育30min;每组加入400μl预冷EDTA-PBS,5μm滤膜过滤细胞为单细胞悬液。
3、立即流式检测,根据FSC、SSC圈取活细胞群(P1),每组检测20000个活细胞。
4、BD C6流式软件中输出FCS文件后,Modafit软件分析G0/G1、S、G2/M细胞期的细胞占活细胞总数的比例,三个生物学重复取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组细胞不同细胞周期占比的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
结果如图2D所示,纵坐标数值为处于各个细胞周期的相对细胞数量。结果表明:相比于对照组,CML急变期细胞系中敲低PABPC1后处于DNA合成期-S期的比例显著减少,处于DNA合成前期-G1期的比例显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞周期,尤其是S期。
五、Annexin V-633Apoptosis Detection Kit(东仁化学,AD11)检测细胞凋亡
Annexin V-633检测PABPC1敲低K562细胞和PABPC1敲低MEG-01细胞的凋亡水平。
具体步骤如下:
1、对照组、PABPC1敲低-1组和PABPC1敲低-2组各收集1×105个细胞,设未染、Annexin V单染、PI单染、Annexin V-PI双染组,每组设三个生物学重复,具体操作步骤参照试剂盒说明书,并在染色终止1h内进行流式检测。
2、BD C6流式软件中输出FCS文件后,Flow Jo软件分析所有细胞(活细胞、死细胞、细胞碎片)中Annexin V+PI-、Annexin V+PI+所占比例,三个生物学重复取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组早/晚期凋亡细胞比例的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
结果如图2E所示。结果表明:Annexin V-PI染色并流式检测显示,相比于对照组,CML急变期细胞系中敲低PABPC1后早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞、晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可促进CML细胞早/晚期凋亡。
六、联苯胺染色、Q-PCR检测细胞红系分化
联苯胺染色、Q-PCR检测PABPC1敲低K562细胞红系分化。具体步骤如下:
1、对照组、PABPC1敲低组K562细胞收集后制成新鲜涂片,加入15μl联苯胺溶液(联苯胺(Sigma,12115)0.3g、95%乙醇99ml、36%亚硝基铁氰化钠1ml),2min后加入10μl 3%H2O2,3min后加入1μl硝普钠溶液;10min后用水冲洗干净晾干,光学显微镜观察染色结果。
2、对照组、PABPC1敲低组K562细胞(PABPC1敲低-1/2组)每组收集(5-10)×105个细胞,向细胞沉淀加入500μl Trizol Reagent(InvitrogenTM,15596018)充分混匀按照说明书提取总RNA,使用Oligo dT(TTTTTTTTTTTTTTTTTT)、18S rRNA(TAATGATCCTTCCGCA)逆转录引物及M-MLV体系(InvitrogenTM,28025021)将总RNA逆转录为cDNA。Q-PCR检测HBA、HBG基因相对18S rRNA的mRNA表达水平,每组设三个生物学重复取Mean±SD并根据Ct值计算2^-ΔΔCt,Graphpad prism 6.0比较各组HBA/HBG相对表达水平的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。引物序列如下:
HBA Primer Forward:TCCTAAGCCACTGCCTGCT;
HBA Primer Reverse:ACGGTGCTCACAGAAGCCA;
HBG Primer Forward:CAAAGCACCTGGATGATCTCAA;
HBG Primer Reverse:TTGCCGAAATGGATTGCC;
18S rRNA Primer Forward:CGATAACGAACGAGACTCTGGC;
18S rRNA Primer Reverse:CGGACATCTAAGGGCATCACA。
反应条件如下:95℃预变性5min,95℃变性10s、60℃退火20s、72℃延伸20s,40循环,72℃终延伸2min,55-95℃缓慢升温5min生成溶解曲线。
结果如图2F所示,纵坐标数值为2^-ΔΔCt,即相对于对照组,PABPC1敲低组血红蛋白差异表达倍数。结果显示:相比于对照组,CML急变期细胞系K562中敲低PABPC1后联苯胺染色阳性比例、HBA/HBG(α-Hemoglobin/γ-Hemoglobin)表达水平显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可促进CML细胞向红系终末期分化。
七、CD41a染色检测细胞巨核系分化
CD41a染色检测PABPC1敲低MEG-01细胞巨核系分化。具体步骤如下:
1、对照组和PABPC1敲低MEG-01细胞株(PABPC1敲低-1/2组)经药筛24h后,设未染组和CD41a单染组,每组收集1×105个细胞,预冷PBS洗细胞沉淀两次,每次1000rpm 3min,100μl PBS重悬细胞沉淀,每组加入1μl CD41a-APC抗体(eBioscienceTM,17-0411-82),4℃孵育30min,1000rpm离心3min,去上清,200μl 4%多聚甲醛重悬固定细胞,5μm滤膜过滤制成单细胞悬液,根据FSC、SSC圈取活细胞群(P1),每组检测10000个活细胞。
2、BD C6流式软件中输出FCS文件后,Flow Jo软件分析各组活细胞中CD41a+细胞所占比例,三个生物学重复取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组CD41a+细胞占比的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
结果如图2G所示。结果表明:相比于对照组,CML急变期细胞系MEG-01中敲低PABPC1后CD41a阳性细胞占比显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可促进CML细胞向巨核系终末期分化。
八、小鼠体内建立白血病模型实验
1、供试材料
NOD/SCID小鼠:维通利华公司,4-6周龄雌鼠。
细胞悬液:PABPC1敲低K562细胞株(PABPC1敲低-1/2组)和对照组细胞各收集1×107个,PBS溶液(PH=7.4)洗细胞两次,每次1000rpm离心3min,最后PBS重悬细胞制备成1×106个/100μl的细胞悬液,置冰上立即尾静脉注射。
2、实验分组及方法
(1)实验分成四组,每组4-5只小鼠,250cGy半致死剂量照射γ射线后24h内进行尾静脉注射。具体处理方法如下:
野生型WT组(空白对照组):注射100μl PBS溶液(PH=7.4)/只;
CTR对照组:注射100μl对照组细胞悬液/只;
PABPC1KD-1组:注射100μl PABPC1敲低-1组细胞悬液/只;
PABPC1KD-2组:注射100μl PABPC1敲低-2组细胞悬液/只;
注射后称小鼠体重;之后每周两次称小鼠体重、统计每组小鼠数量变化。
(2)注射约3周后,小鼠体重开始骤降,提示小鼠白血病发病,流式检测CML细胞K562移植率;每只小鼠尾部采血约50μl,加100μl EDTA-PBS混匀,并参照红细胞裂解液(Solarbio,R1010)说明书获得单个核细胞;100μl PBS重悬细胞,加5μl CD33-APC(BDPharmingenTM,551378),4℃孵育30min,PBS洗细胞,450g离心10min,弃上清后5μm滤膜制备单细胞悬液后立即流式检测,根据FSC、SSC圈取活细胞群(P1),每组检测10000个活细胞;BDC6流式软件中输出FCS文件后,Flow Jo软件分析各组活细胞中CD33+细胞所占比例,组内数值取Mean±SD,Graphpad prism 6.0比较各组CD33+细胞占比的差异,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。
(3)CML细胞移植1个月期间统计各组小鼠存活数量,并绘成生存曲线。
结果如图2H所示,纵坐标数值为CD33+细胞所占比例。结果表明:相比于对照组,PABPC1敲低组K562在小鼠外周血中所占比例显著下降,PABPC1敲低组小鼠生存期显著延长、更不易患CML白血病。说明在小鼠体内抑制或敲低PABPC1可抑制CML疾病的发生与发展。
实施例3、抑制PABPC1表达的物质可抑制CML患者造血干/祖细胞增殖
一、CML病人骨髓细胞分选CD34+细胞及培养
分别从2例初治CML患者(分别记作1号慢性髓性白血病患者和2号慢性髓性白血病患者)中分离培养骨髓CD34阳性细胞,具体步骤如下:
1、配制试剂:分选buffer(PBS,2%FBS,0.4%0.5M EDTA,1%双抗)、细胞分选-磁珠CD34+(美天旎,130-046-702)、磁架(美天旎)、HISTOPAQUE-1077(Sigma,10771)、无血清细胞冻存液(ZENOAQ,Cell Banker 2-100)。
2、分离CML病人骨髓单细胞:4倍体积EDTA-PBS稀释CML病人骨髓血样,小心加在0.5血样体积的Ficoll上,室温、速度慢升慢降、680g离心20min;将白膜层及其上下部分液体吸出,分选buffer稀释并洗掉Ficoll,室温、1600rpm离心10min。
3、分选CD34+细胞(避光操作):每1×108个细胞加入300μl分选buffer、100ul阻断剂、100μl CD34+磁珠并充分混匀,4℃孵育30min;每1×108个细胞用40ml分选buffer洗一遍,1500rpm离心10min;磁力架上安装吸附柱,3ml分选buffer润洗柱子(避免有气泡,不能断流),2ml分选buffer重悬细胞过吸附柱,2ml分选buffer清洗吸附柱;卸下吸附柱,3ml分选buffer洗脱吸附柱两次来收集细胞。
4、CD34+细胞冻存:300g离心10min,获得细胞沉淀,每106个细胞加500μl CellBanker2重悬细胞,-80℃保存。
5、骨髓CD34阳性细胞培养:用于培养骨髓CD34阳性细胞的培养基配方如下:IMDM-Gluta MAX(Gibco,31980097)、10%FBS、1%Penicillin-Streptomycin(Gibco,10378016)、55μM 2-Mercaptoethanol(Sigma,M6250)、10ng/ml IL-6(Peprotech,AF-200-06)、20ng/mlIL-3(Peprotech,AF-213-13)、100ng/ml FLT3L(Peprotech,AF-300-19)、50ng/ml TPO(Peprotech,AF-300-18)、100ng/ml SCF(Peprotech,AF-300-07)。对骨髓CD34阳性细胞进行培养2-4天内进行实验处理。
二、PABPC1敲除对CML-CD34细胞增殖能力的影响
1、按照实施例2中的方法敲低步骤一获得的骨髓CD34+细胞的PABPC1,获得2例初治CML患者骨髓CD34+细胞中稳定敲低PABPC1的细胞。
2、采用CCK8 Assay、CFU Assay、Annexin V-633分别检测2例初治CML患者CD34+细胞敲低PABPC1后的增殖生长能力和凋亡水平,具体检测方法同实施例2中的步骤。
结果如图3所示。结果表明:CCK8 Assay、CFU Assay检测显示,相比于对照组,2例初治CML患者CD34+细胞中敲低PABPC1后,PABPC1敲低组细胞增殖生长能力受到显著抑制(图3A和图3B),说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML患者造血干/祖细胞增殖。Annexin V-633检测显示,相比于对照组,2例初治CML患者CD34+细胞中敲低PABPC1后早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞、晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例显著增加(图3C),说明抑制或敲低PABPC1可显著促进CML患者造血干/祖细胞早/晚期凋亡。
实施例4、PABPC1可通过结合并促进Bcr-Abl翻译进而产生CML致病融合蛋白Bcr-Abl慢性髓性白血病致病融合蛋白Bcr-Abl由22号染色体BCR(NC_000022.11)和9号染色体ABL(NC_000009.12)基因于特定内含子处断裂、染色体易位即费城染色体所造成,BCR第1-12外显子基因序列与ABL第2-12外显子基因序列融合后转录、翻译而成一种新的致病蛋白质。
一、eCLIP-seq分析PABPC1蛋白结合Bcr-Abl mRNA
1、K562细胞中PABPC1蛋白进行CLIP即紫外交联免疫沉淀结合高通量测序,免疫交联获得RNA建成cDNA文库进行Hiseq-PE150平台测序。
2、去除接头序列及低质量reads的处理,评估测序质量,序列比对全基因组,序列reads经过标准化以后获得每个基因上的数(normalized_count)即测序reads全转录组分布图,结合峰鉴定、结合峰基因元件分布、差异结合峰检测,差异结合峰相关基因GO功能富集分析、结合峰的motif进行可视化展示,其中ABL1mRNA 3’UTR有PABPC1蛋白结合峰(图4A)。说明PABPC1蛋白结合ABL1即Bcr-Abl mRNA的3’UTR。
二、Q-PCR和Western Blot检测Bcr-Abl表达水平
1、Q-PCR检测Bcr-Abl表达水平
Q-PCR分别检测实施例2中制备的对照组、PABPC1敲低组K562/MEG-01细胞中Bcr-Abl相对18S rRNA的mRNA表达水平,具体操作同实施例2中Q-PCR。每组设三个生物学重复取Mean±SD并根据Ct值计算2^-ΔΔCt,Graphpad prism 6.0比较各组Bcr-Abl相对表达水平的差异倍数,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001。引物序列如下:
Bcr-Abl Primer Forward:GCTTCTCCCTGACATCCGT;
Bcr-Abl Primer Reverse:AACGAGCGGCTTCACTCA。
2、Western Blot检测Bcr-Abl融合蛋白的表达水平
Western Blot分别检测实施例2中制备的对照组、PABPC1敲低组K562/MEG-01细胞中Bcr-Abl融合蛋白的表达水平,具体操作如下:
(1)蛋白样品制备:每组取约1×106个细胞,PBS洗2遍后彻底去上清,加100μL含Protein cocktail(Roche,04693132001)的RIPA裂解液(碧云天,P0013K);冰上吹打裂解30min,4℃、12000rpm离心10min,收集上清;BCA蛋白浓度检测试剂盒(Solarbio,PC0020)检测上清中蛋白质浓度,加适量5×SDS-PAGE Loading Buffer(碧云天,P0015)和无菌去离子水将蛋白质浓度稀释至2μg/μl,煮沸10min,于-80℃保存。
(2)SDS-PAGE胶电泳:SDS-PAGE胶(8%分离胶、5%浓缩胶)、电泳液配制及详细操作步骤参照文献[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.],20ug蛋白质/孔进行上样,80-100V电泳至溴酚蓝指示剂距离底端0.5~1cm停止。
(3)转膜(0.45μm PVDF膜):电转液配制及详细操作步骤参照文献[Methods MolBiol.2015;1318:87-96.The Western Blot.],恒流260mA电转约120min。
(4)抗体杂交:5%脱脂奶(配制参照[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.])室温封闭1小时,一抗稀释液(碧云天,P0023A)2000倍稀释Bcr-Abl融合蛋白抗体(Millipore,MABT203)、PABPC1抗体(Millipore,04-1467)、GAPDH抗体(Proteintech,10494-1-AP),根据蛋白质Marker保留PVDF膜,与对应一抗于4℃孵育过夜。
(5)显影:TBST(配制参照[Methods Mol Biol.2015;1318:87-96.The WesternBlot.])洗膜三次,每次5min;5%脱脂奶10000倍稀释鼠源(LABLEAD,S0100)、兔源抗体(LABLEAD,S0101),常温孵育1~2小时;用TBST洗膜3次,每次10min;ECL发光液(Millipore,WBKlS0100)显影并选择曝光时间。
结果如图4B所示。结果表明:相比于对照组,Western Blot检测结果显示CML急变期细胞系K562、MEG-01中敲低PABPC1后Bcr-Abl蛋白量显著下降,Q-PCR检测结果显示CML急变期细胞系K562、MEG-01中敲低PABPC1后Bcr-Abl mRNA相对表达水平显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞Bcr-Abl蛋白质表达、促进Bcr-Abl mRNA表达。
三、Polysome Profiling结合Q-PCR检测Bcr-Abl基因翻译水平
1、收集细胞:分别取1×107个实施例2中制备的对照组、PABPC1敲低组K562/MEG-01细胞(KD-2组)于完全培养基中,分别加入放线菌酮CHX-cycloheximide(CST,2112S)使其终浓度为100μg/ml,处理10min;DEPC-PBS(含100μg/ml CHX)洗两次细胞,1000rpm离心3min,去上清,各组细胞沉淀放置液氮1-2min后-80℃保存。
2、裂解细胞:每组细胞沉淀中加入400μl Lysis Buffer,冰上裂解细胞30min,4℃、5000rpm离心5min后再4℃、15000rpm离心10min,上清转移至新管(冰上),BCA法检测蛋白浓度、补适量Lysis Buffer使每组蛋白浓度相同,每组各取20μl裂解液作为Input,加入1ml Trizol Reagent混匀并按照说明书提取总RNA。
3、收集组分:(1)制备20-50%(质量体积比)密度梯度蔗糖溶液,每组上样等体积细胞裂解液,38000rpm,4℃离心180min(慢速加速,最大速减速)。(2)读取各梯度蔗糖溶液260nm波长吸光度并分取梯度组分(每组约290μl×38个组分)。(3)每个组分中加3倍体积Trizol LS Reagent(InvitrogenTM,10296028)充分混匀并按照说明书提取总RNA。
4、Q-PCR:M-MLV法将RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,Q-PCR检测各组分Bcr-Abl、18S rRNA表达量(方法同步骤一中Q-PCR检测Bcr-Abl表达量)。
根据Ct值计算各组内每个组分相对第一个组分的2^-ΔCt值,计算各组分2^-ΔCt值占所有38个组分的2^-ΔCt值总和的百分比,即组分内目的基因mRNA量占该基因mRNA总表达量的比例,并使用Graphpad Prism 6.0绘制成折线图,每个组分设有三个生物学重复取Mean±SD。
结果如图4C所示。结果表明:Polysome Profiling检测结果显示,相比于对照组,CML急变期细胞系K562、MEG-01中敲低PABPC1后游离核糖体RNA吸收峰显著增加、多聚核糖体RNA吸收峰显著降低。Q-PCR检测结果显示,相比于对照组,PABPC1敲低组各组分内参基因18S rRNA mRNA量占比无显著变化,即对照组与PABPC1敲低组总RNA量即内参一致;相比于对照组,PABPC1敲低组中反映翻译活跃水平的多聚核糖体上结合的Bcr-Abl mRNA量及所占比例减少,不直接参与翻译过程的核糖体大小亚基、游离及密度较小的核糖体上结合的Bcr-Abl mRNA量所占比例增加。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞Bcr-Abl融合基因的mRNA翻译水平。
四、蛋白免疫共沉淀Co-IP检测PABPC1与翻译起始复合物的相互作用及促进翻译起始因子之间的相互作用
1、蛋白免疫共沉淀Co-IP检测PABPC1与翻译起始复合物的相互作用
(1)收集细胞:取1×107个K562细胞,PBS洗细胞2次,1000rpm离心3min完全去上清后放置冰上,设三个生物学重复。
(2)裂解细胞:向细胞沉淀中加入1ml Lysis Buffer(现加蛋白酶抑制剂)冰上裂解细胞30min,每10min轻轻吹打,4℃、12000rpm离心15min后将上清转移至新管(冰上),取20μl裂解液作为Input,4℃旋转过夜。
(3)细胞裂解液孵育抗体:裂解液分为IgG、PABPC1IP组,分别加入5μg兔源IgG抗体(Millipore,12-370)和PABPC1抗体(Abcam,ab21060),4℃旋转孵育12-16h;5μg抗体对应50μl磁珠(InvitrogenTM,10002D),Wash Buffer洗磁珠3次,每次4℃旋转5min;磁珠均分至每个抗体组,4℃旋转孵育4-6h。
(4)洗脱提取蛋白:Wash Buffer洗孵育后磁珠2次,每次4℃旋转5min,100μl 2×SDS Loading Buffer重悬磁珠,Input组加适量5×SDS Loading Buffe将蛋白质浓度定为2μg/μl,同时煮沸10min。
(5)Western Blot检测:Input取2μg,IgG、IP组取10μl上样,检测eIF4G(CST,2469)、eIF4E、eIF4A1(CST,2490)、PABPC1、GAPDH蛋白量。
2、蛋白免疫共沉淀Co-IP检测PABPC1促进翻译起始因子之间的相互作用
(1)收集细胞:分别取1×107个实施例2制备的对照组、PABPC1敲低组K562细胞,PBS洗细胞2次,1000rpm离心3min去上清后细胞置冰上。
(2)裂解细胞:试剂及操作同上步Co-IP,BCA法检测、补加Lysis Buffer使每组蛋白浓度相同,每组各取20μl裂解液作为Input,4℃旋转过夜。
(3)细胞裂解液孵育抗体:对照组、PABPC1敲低组取相同体积裂解液分为IgG、eIF4E IP组,对应加入5μg兔源IgG抗体和eIF4E抗体(Abcam,ab245299),4℃旋转孵育12-16h;5μg抗体对应50μl磁珠,详细操作同上述Co-IP,4℃旋转孵育4-6h。
(4)洗脱提取蛋白:Input组和抗体组详细操作同上述Co-IP。
(5)Western Blot:Input取2μg,IgG、IP组取10μl上样,检测eIF4G、eIF4E、eIF4A1、PABPC1、GAPDH蛋白量。
结果如图4D和图4E所示。结果表明:CML急变期细胞系K562、MEG-01中PABPC1抗体免疫共沉淀成功获得目的蛋白以及与之互作的eIF4G、eIF4A1、eIF4E即eIF4F成员蛋白;CML急变期细胞系K562中eIF4E抗体免疫共沉淀成功获得目的蛋白以及与之互作的eIF4G、PABPC1蛋白,相比于对照组,PABPC1敲低组与eIF4E互作的eIF4G蛋白质量减少。说明抑制或敲低PABPC1可抑制CML细胞中eIF4G与eIF4E相互作用。
五、多聚核糖体印迹Polysome Profiling结合Western Blot检测翻译起始
1、收集Polysome Profiling组分:同上述Polysome Profiling组分收集。
2、根据吸光度将组分分为游离Free、核糖体小亚基40S、核糖体大亚基60S、游离核糖体80S、多聚核糖体P1、多聚核糖体P2、多聚核糖体P3共七份,参照文献[CurrentProtocols in Molecular Biology e79.Polysome Profiling Analysis of mRNA andAssociated Proteins Engaged in Translation.]中的方法提取各组蛋白质,100μl 1×SDS Loading Buffer重悬蛋白质沉淀,煮沸10min,取10μl上样进行Western Blot,检测eIF4G、eIF4E、PABPC1、RPL36(Proteintech,15145-1-AP),其中RPL36为内参蛋白。
结果如图4F所示。结果表明:相比于对照组,CML急变期细胞系K562中敲低PABPC1后游离eIF4G蛋白质(Free组)显著增多、与核糖体小亚基40S、游离/多聚核糖体相互作用的eIF4G蛋白质(40S、80S、P1组(P1组是指多聚核糖体依次均分3组检测蛋白质,P1为其中第1组))显著减少。说明抑制或敲低PABPC1可抑制翻译起始因子eIF4G与多聚核糖体大小亚基(40S、80S)互作,多聚核糖体结合翻译起始因子eIF4G减少,细胞翻译起始以及延伸受到显著抑制。
实施例5、抑制PABPC1表达的物质可显著抑制TKI耐药CML细胞生长
一、STI571耐药细胞株K562/G01对TKI-Imatinib耐药
1、Annexin V-633检测0.1%DMSO、1μM TKI(MCE,HY-15463)、2μM TKI处理K562细胞、K562/G01细胞(KG)48小时后的细胞凋亡水平,具体步骤参照实施例2。
结果如图5A所示。结果表明:相比于0.1%DMSO组,TKI处理K562细胞48小时后早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞、晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例显著增加;TKI处理K562/G01细胞48小时后早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞、晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例无显著变化。说明STI571耐药株K562/G01细胞对TKI-Imatinib促进细胞凋亡作用不敏感即耐药。
2、碘化丙啶PI染色检测0.1%DMSO、1μM TKI(MCE,HY-15463)、2μM TKI处理K562细胞、K562/G01细胞(KG)48小时后的细胞周期,具体步骤参照实施例2。
结果如图5B所示。结果表明:相比于0.1%DMSO组,TKI处理K562细胞48小时后处于DNA合成期-S期的比例显著减少,处于DNA合成前期-G1期的比例显著增加;TKI处理K562/G01细胞48小时后处于DNA合成期-S期、DNA合成前期-G1期的比例无显著变化。说明STI571耐药株K562/G01细胞对TKI-Imatinib抑制细胞周期作用不敏感即耐药。
二、PABPC1敲低的TKI耐药CML细胞株-KG的制备
按照实施例2中的方法分别将慢病毒颗粒shPABPC1-1、shPABPC1-2和shCTR转染KG细胞,分别获得PABPC1敲低-1组KG细胞(简称PABPC1敲低-1)、PABPC1敲低-2组KG细胞(简称PABPC1敲低-2)和对照组细胞。
三、CCK8 Assay检测细胞增殖
CCK8 Assay检测PABPC1敲低KG细胞的增殖生长能力,具体步骤参照实施例2。
结果如图5C所示。结果表明:相比于对照组,TKI耐药CML细胞中敲低PABPC1后增殖生长能力显著受抑制。说明抑制或敲低PABPC1可抑制TKI耐药CML细胞的增殖与生长。
四、CFU Assay检测细胞增殖
CFU Assay检测PABPC1敲低KG细胞的增殖生长能力,具体步骤参照实施例2。
结果如图5D所示。结果表明:相比于对照组,TKI耐药CML细胞中敲低PABPC1后增殖生长能力显著受抑制。说明抑制或敲低PABPC1可抑制TKI耐药CML细胞的增殖与生长。
五、碘化丙啶PI染色法检测细胞周期
碘化丙啶PI染色检测PABPC1敲低KG细胞的细胞周期,具体步骤参照实施例2。
结果如图5E所示。结果表明:相比于对照组,TKI耐药CML细胞中敲低PABPC1后处于DNA合成期-S期的比例显著减少,处于DNA合成前期-G1期的比例显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可抑制TKI耐药CML细胞的细胞周期,尤其是S期。
六、Annexin V-633Apoptosis Detection Kit检测细胞凋亡
Annexin V-633检测PABPC1敲低KG细胞的凋亡水平,具体步骤参照实施例2。
结果如图5F所示。结果表明:相比于对照组,TKI耐药CML细胞中敲低PABPC1后早期凋亡(Annexin V+PI-)细胞、晚期凋亡(Annexin V+PI+)细胞所占总细胞数的比例显著增加。说明抑制或敲低PABPC1可促进TKI耐药CML细胞早/晚期凋亡。
七、Polysome Profiling结合Q-PCR检测Bcr-Abl基因翻译水平
Polysome Profiling结合Q-PCR检测检测PABPC1敲低KG细胞中Bcr-Abl基因翻译水平,具体步骤参照实施例3。
结果如图5E所示。结果表明:Polysome Profiling检测结果显示,相比于对照组,TKI耐药CML细胞中敲低PABPC1后游离核糖体RNA吸收峰显著增加、多聚核糖体RNA吸收峰显著降低。Polysome Profiling结合Q-PCR检测结果显示,对照组与PABPC1敲低KG细胞组18SrRNA各组分相对表达量一致,证明该实验中对照组与实验组总RNA量即内参一致;相比于对照组,PABPC1敲低KG细胞组Bcr-Abl mRNA与核糖体大小亚基、翻译水平较弱/密度较小的核糖体复合物结合的比例增加,即Bcr-Abl基因的翻译水平显著下降。反映翻译活跃程度的多聚核糖体上结合的Bcr-Abl mRNA量及所占比例减少,不参与翻译过程的核糖体大小亚基及游离核糖体上结合的Bcr-Abl mRNA量及所占比例增加,即Bcr-Abl mRNA翻译水平受显著抑制。说明抑制或敲低PABPC1可抑制TKI耐药CML细胞Bcr-Abl融合基因的mRNA翻译水平。
实施例6、PABPC1促进细胞周期相关基因的表达及细胞周期相关系列基因的翻译水平
一、PABPC1促进细胞周期相关基因的表达
1、取1×107个实施例2中制备的对照组、PABPC1敲低K562细胞组(PABPC1敲低-2组),分别在各组细胞1640培养基中加入放线菌素D(Sigma,A4262)进行药物处理(使其终浓度均为5μg/ml),并分别于药物处理0h、0.5h、1h、3h、6h、9h时收集各组细胞;离心弃上清,Trizol Reagent提取总RNA,M-MLV法逆转录为cDNA,以cDNA为模板,Q-PCR检测细胞周期相关基因MCM7(NC_000007.14)、CDC25A(NC_000003.12)、CCND2(NC_000012.12)、CCNA2(NC_000004.12)、CDK1(NC_000010.11)、EIF4EBP1(NC_000008.11)、MCM6(NC_000002.12)、MCM8(NC_000020.11)、POLA2(NC_000011.10)、POLE(NC_000012.12)、RBL1(NC_000020.11)、E2F1(NC_000020.11)、RPA2(NC_000001.11)、ZNF385A(NC_000012.12)、PPKDC(NC_000008.11)相对内参基因18S rRNA的表达水平。
引物序列如下:
MCM7 Forward:GCCCAGCACATCACCTATG;
MCM7 Reverse:GTATGCTGCTGTGATGTAGTC;
CDC25A Forward:CCCAAACTCCACTACCCTG;
CDC25A Reverse:GCTCTTGGTGCGGAACTT;
CCND2 Forward:TGTGATGCCCTGACTGAG;
CCND2 Reverse:TCCAGTTCATCCTCCGAC;
CCNA2 Forward:GGACCTTCACCAGACCTACC;
CCNA2 Reverse:TGGGTTGAGGAGAGAAACAC;
CDK1 Forward:CAGGTCAAGTGGTAGCCAT;
CDK1 Reverse:TAAGCACATCCTGAAGACTGA;
EIF4EBP1 Forward:AGCCCAGAAGATAAGCGG;
EIF4EBP1 Reverse:GGTAGTGCTCCACACGATG;
MCM6 Forward:AGTCTGCTCCCAAAGCCT;
MCM6 Reverse:GTCCTCTTCTTCTTCCACCTT;
MCM8 Forward:TGAGCAACAGGTCAACAGC;
MCM8 Reverse:TCAAGAGGTAACCCTGGTC;
POLA2 Forward:CAGCCGAATACTCAAGCAC;
POLA2 Reverse:GCGTAAACATAGAACGACTCATAG;
POLE Forward:CGACCTGGACCTGTGTAA;
POLE Reverse:GAACTTCCACCAGCGTCA;
RBL1 Forward:CCGCACAAGAATGGGTCA;
RBL1 Reverse:GGTTCTCTGCTCACCTTGC;
E2F1 Forward:CTACTCAGCCTGGAGCAAGA;
E2F1 Reverse:GGGAAAGGCTGATGAACTC;
RPA2 Forward:GGAACTTTGGTGGGAATAGC;
RPA2 Reverse:GCTTGATTGAGGATACAGAC;
ZNF385A Forward:AAGGTCAACTCGGAGGTC;
ZNF385A Reverse:TGGAGAAAGTCAGCGTGC;
PPKDC Forward:CCAATGAAAGAAACGGGC;
PPKDC Reverse:CAGGTTCTGCCAAGGATG。
2、根据不同时间点各组样品基因表达Ct值,计算各组内样品不同时间点样品相对0h的2-ΔΔCt值,并将此值进行线性回归分析。
结果如图6A所示。结果表明:与对照组相比,PABPC1敲低组细胞在放线菌素D-ActD抑制转录过程中,细胞周期相关基因的mRNA量降解更快、半衰期更短。说明抑制或敲低PABPC1可下调细胞周期相关基因的mRNA表达水平,使细胞周期相关基因的mRNA稳定性下降。
二、PABPC1促进细胞周期相关基因的翻译水平
1、取1×107个实施例2中制备的对照组、PABPC1敲低K562细胞组(PABPC1敲低-2组),分别在各组细胞1640培养基中加入放线菌酮CHX(CST,2112S)进行药物处理(工作浓度均为100μg/ml),药物处理10min后收集各组细胞(具体方法同实施例3中PolysomeProfiling细胞样收集)。
2、采用Polysome Profiling结合Q-PCR检测细胞周期相关基因的翻译水平,具体方法同实施例3步骤二中的Polysome Profiling结合Q-PCR检测Bcr-Abl基因翻译水平。细胞周期相关基因为ARHGAP45(NC_000019.10)、ARPC2(NC_000002.12)、CDCA5(NC_000011.10)、CDT1(NC_000016.10)、CENPT(NC_000016.10)、CKAP5(NC_000011.10)、FBXW5(NC_000009.12)、FZR1(NC_000019.10)、MZT1(NC_000013.11)、PSMB10(NC_000016.10)、PIAS4(NC_000019.10)、PLOD1(NC_000001.11)、PPP1R12A(NC_000012.12)、RAC3(NC_000017.11)、RCC2(NC_000001.11)。引物序列如下:
ARHGAP45 Forward:TCTCATCGTCCACTACGG;
ARHGAP45 Reverse:GACACAACTCGGGATTCTC;
ARPC2 Forward:CACATCAAGTGCTCTAAGGC;
ARPC2 Reverse:GTTCCAGCCTTCAGTTGC;
CDCA5 Forward:CAGTGGTGTGCTCCAAAC;
CDCA5 Reverse:CTTCAAACTCGGCATTCAT;
CDT1 Forward:CGTCTTTGTGTCCGAACG;
CDT1 Reverse:CAGGTGCTTCTCCATTTCC;
CENPT Forward:GGTGTGAGTGTGAGTGAAATG;
CENPT Reverse:TGGAGGCCGACTCTGGACTT;
CKAP5 Forward:ATCCTGGACCACCTAACG;
CKAP5 Reverse:CATTCACTTTGGCCTTTGATG;
FBXW5 Forward:TTGACCTGCTGGTGTTCG;
FBXW5 Reverse:TTGACCACATCCTCGTGC;
FZR1 Forward:AGACGAGACCCTGAGGTTC;
FZR1 Reverse:TCCTGGTGAAGAGGTTGAG;
MZT1 Forward:GAATCTGAATGCGGTGCG;
MZT1 Reverse:TTCAGCAGCCTTCAGTGC;
PSMB10 Forward:CGAGATGACCACACGGAT;
PSMB10 Reverse:TGCGGTCCAGTCAGGTCTA;
PIAS4 Forward:ACCAACCGCATCACTGTC;
PIAS4 Reverse:TTCACCAGCGGACAGATG;
PLOD1 Forward:GAGGTATCCCATCTGAATGC;
PLOD1 Reverse:TTGCGCATGTAGAAGATGG;
PPP1R12A Forward:AAAGGCCACCCAGAGACAAG;
PPP1R12A Reverse:TCCTTTAGCCTCTGGTTGTC;
RAC3 Forward:GACAAGGACACCATTGAGC;
RAC3 Reverse:GCACTCCAGGTATTTCACAG;
RCC2 Forward:CCCAGGAGGTAAAGACTCTG;
RCC2 Reverse:CTCTTTCTCAGTCTCACTTTC。
结果如图6B所示,结果表明:Polysome Profiling结合qRT-PCR检测显示,相比于对照组,CML急变期细胞系K562中敲低PABPC1后细胞周期相关基因mRNA与核糖体大小亚基、翻译水平较弱/密度较小的核糖体复合物结合的比例增加,即细胞周期相关基因的翻译水平均显著下降。说明抑制或敲低PABPC1可降低细胞周期相关基因的mRNA翻译水平。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围,可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110>中国医学科学院基础医学研究所
<120>与白血病诊疗相关的靶点PABPC1及其应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>1
ccagacctca tccattccaa actcgagttt ggaatggatg aggtctgg 48
<210>2
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<400>2
agctgttccc aaccctgtaa tctcgagatt acagggttgg gaacagc 47
Claims (6)
1.敲低PABPC1基因的物质在如下a1)-a4)中任一种中的应用:
a1)制备治疗白血病的产品;
a2)制备抑制白血病发生与发展的产品;
a3)制备抑制白血病细胞增殖和/或生长的产品;
a4)制备促进或诱导白血病细胞凋亡的产品;
所述白血病为慢性髓性白血病。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述敲低PABPC1基因的物质为抑制PABPC1基因表达的shRNA。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:所述抑制PABPC1基因表达的shRNA的序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核酸分子。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述a3)中,所述促进或诱导白血病细胞凋亡为促进或诱导白血病细胞早期凋亡和/或晚期凋亡。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述a3)和a4)中,所述白血病细胞为
MEG-01或K562细胞或K562/G01细胞。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述产品为药物。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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