CN115724997A - 一种抗cd97嵌合抗原受体、基因、表达载体、t细胞及应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种抗CD97嵌合抗原受体、基因、表达载体、T细胞及应用，涉及肿瘤治疗技术领域，该抗CD97嵌合抗原受体选择CD97作为脑胶质瘤的特异性抗原，并选择可以高效杀伤并清除实体肿瘤且还能有效抑制肿瘤的转移和复发的Th9细胞作为构建CAR‑T的细胞，得到的CD97‑CAR‑T细胞可以持久存在，CD97‑CAR‑T细胞可以靶向GSC实现精准治疗，实现对GBM的治疗作用，可以降低CAR‑T治疗的耐药性，提高CAR‑T对实体瘤的治疗效果。

Description

一种抗CD97嵌合抗原受体、基因、表达载体、T细胞及应用

技术领域

本申请涉及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及一种抗CD97嵌合抗原受体、基因、表达载体、T细胞及应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，CAR-T)对改善血液系统恶性肿瘤已经被证明具有良好效果，但目前对实体瘤的疗效欠佳。其中一个主要原因是识别肿瘤的特异性抗原特异性不强，而另一个原因在于输注CAR-T细胞的抗原丢失和持久性差，而造成CAR-T细胞持久性差的主要原因有两个：程序性细胞死亡和衰竭。因此，寻找实体肿瘤中的特异性靶点和改善CAR-T细胞的治疗效果对于实体肿瘤的治疗至关重要。

胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是最常见的恶性原发性脑肿瘤，GBM患者的中位总生存期小于16个月。大量分子水平上的研究结果表明GBM干细胞(glioblastoma stem cell，GSC)是引起抗癌药物耐药性、放疗抵抗性、侵袭和扩散的关键原因细胞。现有技术中GSC的常规靶点为CD133、CD44和CD15等，然而这些靶点存在特异性不强，表达不够稳定等缺点，不能很好的做为GSC的靶点。因此，选择合适GSC富集且稳定的标志物有利于构建靶向GSC的CAR-T细胞发挥功能。

发明内容

本申请的目的在于提供一种抗CD97嵌合抗原受体，该嵌合抗原受体选择以CD97做为GSC的特异性靶点，旨在解决现有的GSC靶点特异性不强，制备得到的CAR-T细胞治疗效果不好的问题。

为实现以上目的，本申请第一方面提供一种抗CD97嵌合抗原受体，所述抗CD97嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本申请第二方面还提供一种抗CD97嵌合抗原受体表达基因，所述基因编码上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

本申请第三方面还提供一种表达载体，所述表达载体插入有上述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得所述宿主细胞表达上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。

本申请第四方面还提供一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞，所述T细胞中能够表达如上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，所述T细胞为Th9细胞。

本申请第五方面还提供一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞的制备方法，包括：

构建抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒；

对所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒进行慢病毒包装；

极化得到Th9细胞；

将所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒转染所述Th9细胞。

本申请第六方面还提供一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括上述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞。

本申请第七方面还提供上述的抗CD97嵌合抗原受体、上述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因、上述的表达载体、上述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。

与现有技术相比，本申请的有益效果包括：

本申请提供的抗CD97嵌合抗原受体，选择CD97作为脑胶质瘤的特异性抗原，并选择可以高效杀伤并清除实体肿瘤且还能有效抑制肿瘤的转移和复发的Th9细胞作为构建CAR-T的细胞，得到的CD97-CAR-T细胞可以靶向GSC实现精准治疗，实现对GBM的治疗作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。

图1为本申请的抗CD97嵌合抗原受体的结构示意图；

图2为CD97与其他GSC标记物的流式细胞检测结果图；

图3A至图3F为GSC中CD97下游靶点的筛选结果图；

图4A至图4D为CD97通过mTORC2信号调节下游基因表达的结果图；

图5为CD97^high表达GSC和CD97^-/low表达GSC的作用结果图；

图6为CD97-CAR Th9在细胞水平的杀伤效果图；

图7为CD97-CAR Th9在动物水平的杀伤效果图；

图8为对比例1的CD97-CAR T细胞扩增结果图。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

本申请第一方面提供一种抗CD97嵌合抗原受体，如图1所示，包括：依次连接的CD8SP、scfv CD97、人CD8 hinge、人CD8TM、人4-1BB和人CD3ζ。所述抗CD97嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

其中，CD8 SP为信号肽，表达后位于细胞外，CD8 SP的作用为引导不同的蛋白质达到细胞的不同部位。CD8 SP的氨基酸序列为：MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO.2)。

其中，scfv CD97为抗CD97的单链抗体，表达后位于细胞外，抗CD97嵌合抗原受体通过scfv CD97可以靶向CD97，从而靶向CD97表达高的肿瘤细胞。scfv CD97的氨基酸序列为：DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGINVVWYQQKPGQSPKALIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEFFCQQYNSSPLTFGAGTKLELKSSGGGGSGGGGGGSSRSSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNIHWVKQTPGQGLEWIGAISPGNGDTSYNRKFKGKATLTADISSSTAYLQLSSLTSEDSAVYFCARFYGGSYWYFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO.3)。

其中，人CD8 hinge为CD8铰链区，表达后位于scfv CD97和细胞膜之间，此区段提供CAR分子更多的灵活性，方便结合靶点抗原；人CD8TM为CD8跨膜区，表达后位于细胞膜。人CD8 hinge+人CD8TM的氨基酸序列为：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO.4)。

其中，人4-1BB表达后位于细胞胞浆区，人4-1BB的氨基酸序列为：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO.5)。

其中，人CD3ζ表达后位于细胞胞浆区，人CD3ζ的氨基酸序列为：RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(SEQ ID NO.6)。

本申请第二方面还提供一种抗CD97嵌合抗原受体表达基因，所述基因编码上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，经过密码子优化后，所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

其中，CD8 SP的核苷酸序列为：ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG(SEQ ID NO.8)。

其中，scfv CD97的核苷酸序列为：GATATCGTGATGACCCAGAGCCAGAAGTTTATGTCCACATCCGTGGGCGATAGGGTGTCCGTGACATGCAAGGCCTCCCAGAACGTGGGCATCAACGTGGTGTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGAGCCCTAAGGCCCTGATCTACTCCGCCAGCTACAGATTCAGCGGCGTGCCTGACAGATTCACTGGCTCCGGCTCCGGCACCGATTTTACCCTGACCATCAGCAATGTGCAGTCCGAGGATCTGGCCGAGTTCTTTTGCCAGCAGTACAATAGCAGCCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAGAGCAGCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGAGGCGGAAGCTCCAGGAGCTCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGCCCGGCGCTGAGCTGGTGAAGCCTGGCGCTTCCGTGAAGATGAGCTGTAAGGCCAGCGGCTACACATTCACAAGCTACAATATCCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGCTATCTCCCCCGGCAATGGCGACACCTCCTACAATAGAAAGTTTAAGGGCAAGGCCACACTGACCGCCGACATCAGCTCCTCCACAGCCTACCTGCAGCTGTCCAGCCTGACCAGCGAGGATTCCGCCGTGTACTTCTGTGCCAGATTCTACGGCGGCTCCTACTGGTACTTCGACGTGTGGGGCGCCGGCACCACCGTGACAGTGTCCAGC(SEQ ID NO.9)。

其中，人CD8 hinge+人CD8TM的核苷酸序列为：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGC(SEQ ID NO.10)。

其中，人4-1BB的核苷酸序列为：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG(SEQ ID NO.11)。

其中，人CD3ζ的核苷酸序列为：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC(SEQ IDNO.12)。

本申请第三方面还提供一种表达载体，所述表达载体插入有上述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得所述宿主细胞表达上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，所述表达载体为慢病毒表达载体。

慢病毒载体是以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒表达载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

本申请第四方面还提供一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞，所述T细胞中能够表达如上述的抗CD97嵌合抗原受体。

优选地，所述T细胞为Th9细胞。

Th9细胞是一类具有显著抗实体肿瘤作用的CD4+T细胞亚群，CD4+T细胞按照功能的不同，可分为Th1、Th2、Th3、Treg、Tr1、Tfh、Th17、Th9和Th22等Th细胞亚群。其中Th9细胞不仅可以高效的杀伤并清除实体肿瘤，而且还能有效的抑制肿瘤的转移和复发，并且经研究发现不太容易耗竭，对肿瘤细胞具有充分的细胞溶解性。

本申请第五方面还提供一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞的制备方法，包括：

构建抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒；

对所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒进行慢病毒包装；

极化得到Th9细胞；

将所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒转染所述Th9细胞。

本申请第六方面还提供一种药物组合物，所述药物组合物的有效成分包括上述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞。

本申请第七方面还提供上述的抗CD97嵌合抗原受体、上述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因、上述的表达载体、上述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。

本申请提供的抗CD97嵌合抗原受体，选择CD97作为脑胶质瘤的特异性抗原，并选择可以高效杀伤并清除实体肿瘤且还能有效抑制肿瘤的转移和复发的Th9细胞作为构建CAR-T的细胞，得到的CD97-CAR-T细胞可以靶向GSC实现精准治疗，实现对GBM的治疗作用。

下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1 GSC表面标记物的鉴定和验证

1、GSC表面标记物的鉴定

采用流式细胞仪检测GSC表面标记物，将CD97表达与传统的GSC标记物进行了比较，如CD133、CD44和CD15，各个标记物的流式等高线结果如图2所示，其中，GSC1、GSC2、GSC3是不同患者来源的GSC细胞，U87是对照细胞，NT是空白对照未染色的细胞。

根据图2结果可知，一些GSC的CD133+比率在18％-51.9％之间，与之前报道的(10％-50％)相似。相反，GSC1只显示3.5％的CD133表达(图2)，GSC2不包含任何可检测到CD133表达的细胞，因此CD133不适宜做为GSC的表面标记物，其表达情况不稳定。CD44是另一种被报道的GSC标记物，其不仅在两种GSC中显示高表达，而且在一般胶质瘤细胞系(U87)中也显示高表达，因此，CD44作为GSC的表面标志物也是不合格的，其表达不具有特异性。CD15也被报道为GSC富集标记物，但在我们测试的GSC中未表达。

相比之下，在GBM细胞系中，GSC中CD97阳性细胞的比例通常显著较高，而在U87细胞中没有表达(图2)，这些结果表明CD97可能是GSC更好的表面标记物。

2、GSCs中CD97下游靶点的筛选

为了了解CD97的调节作用，采用综合方法通过CD97表达全面确定生物功能。在CD97敲除后，我们使用RNA测序(RNA-seq)对三个GSC进行转录组分析，发现在所有GSC中，共有131个基因因CD97敲低而显著下调(图3A)。

每一个在CD97敲除后被鉴定为下调的基因都被仔细检查其在生物学过程中的意义。因此，使用注释、可视化和集成发现数据库(DAVID)分析了这些常见下调基因的基因本体(GO)生物学过程。结果表明，细胞间粘附、含核碱基的化合物代谢过程和激素生物合成过程的正调控是CD97敲除的GSC中仅有的三条显著富集的信号通路(图3B)。其中，细胞间粘附的基因比率最高，包括聚(rC)结合蛋白1(PCBP1)、碱性蛋白(BSG)、Rho-GTPase激活蛋白1(ARHGAP1)、碱性亮氨酸拉链和含W2结构域的蛋白1(BZW1)、碱性亮氨酸拉链和含W2结构域的蛋白2(BZW2)和Drebrin(DBN1)(图3A和图3B)。

在CD97敲低的GSC中，这些细胞-细胞粘附相关基因的mRNA表达下调得到证实(图3C)。为了研究CD97与这些相关基因之间的可能关系，我们使用公开的GBM数据集分析了临床预后，发现CD97和ARHGAP1或BZW1或BZW2高水平的患者比同时低表达的患者预后差(TCGA数据库)(图3D)。

此外，为了评估细胞-细胞粘附相关基因的调节因子，我们使用基因集富集分析(GSEA)分析了50条具有转录组结果的标志性信号通路。在shCtrl组中富集的重要标志性信号通路中，我们观察到在shCtrl组中富集了mTOR信号通路(包括PI3K/AKT/mTOR，也称为mTORC1和mTORC2)(图3E和图3F)。因此，在候选基因中，我们发现CD97可以通过mTOR信号调节ARHGAP1、BZW1和BZW2的表达。

3、CD97通过mTORC2信号调节下游基因表达

为了检测CD97下游信号通路的功能，使用shRNA沉默CD97大大减弱了GSC中S6K(S371和T389)和AKT(T308和S473)的磷酸化(图4A)。同时，在CD97敲除的GSC中，ARHGAP1、BZW1和BZW2的表达水平显著降低(图4A)，这些结果促使我们研究CD97下游mTOR的潜在参与。

接下来，我们在GSC中进行小分子抑制剂治疗，以探索靶基因与GSC中mTOR信号的相关性。Torin1(mTORC1和mTORC2的抑制剂)和Akt抑制剂IV不仅诱导S6K(S371和T389)和Akt(T308和S473)的磷酸化降低，而且还诱导三个靶分子的表达降低。随后，为了了解CD97触发的信号传导对其靶基因的作用机制，我们用两类不同的mTOR特异性抑制剂(mTORC1抑制剂，雷帕霉素Rapamycin；mTORC2抑制剂JR-AB2-011)阻断了每个信号转导，并分析了GSC中每个通路的功能状态。

结果显示，雷帕霉素处理降低了S6K(S371和T389)的磷酸化，但没有改变三种靶蛋白的表达水平(图4B)。另一方面，JR-AB2-011处理影响AKT(S473)的磷酸化，并下调了三种靶蛋白的表达(图4B)。

这些结果表明，CD97在GSC中的表达通过激活mTORC2/AKT(S473)途径导致ARHGAP1、BZW1和BZW2相关的基因诱导。此外，基于细胞增殖试验和LDA，所有选择性抑制mTOR/AKT信号的抑制剂在治疗上阻断了GSC中的细胞生长和干性特性，进一步证明了CD97可以激活mTORC1和mTORC2信号，但只有mTORC2信号可以调控下游三个靶基因的表达(图4C和图4D)。

4、CD97 ^high表达细胞在调节GSC增殖、自我更新和致瘤性方面的作用

为了验证CD97识别GSC并在GBM启动中发挥功能作用的事实，我们检查了富含CD97的GSC的特征。根据CD97表达谱，GSC4可分为两个亚群；流式细胞术将顶部38.5％定义为CD97 ^high，底部18.8％定义为CD97^-/low(图5(A))。

与CD97^-/low亚群相比，分离的CD97 ^high GSC群体在mRNA和蛋白质水平上高度表达相关基因CD133、Nestin和CD44(图5(B)和(C))。如上所述，我们证明CD97 ^high GSC调节与mTORC2信号相关的AKT磷酸化(S473)，并诱导ARHGAP1、BZW1和BZW2的表达增加(图5(D))。

为了确定富含CD97的GSC的体内致瘤潜力，我们建立了涉及CD97^high和CD97^-/low细胞的原位移植模型。重要的是，肿瘤的发病速度明显加快，植入后70天的MRI成像显示，来自CD97 ^high细胞的肿瘤大小明显大于来自CD97^-/low细胞的肿瘤大小(图5(E))。因此，Kaplan-Meier图显示，与注射CD97^-/low细胞组(101.5天)相比，注射CD97 ^high细胞组(86.5天)的荷瘤动物的总生存期显著缩短(图5(F))。

这些结果表明，CD97 ^high肿瘤是由ARHGAP1、BZW1和BZW2增殖的。总的来说，这些数据强烈表明CD97 ^high细胞在体外具有GSC的特征，在体内具有高致瘤性。

实施例2 CD97-CAR Th9细胞的制备

1、构建CD97-CAR慢病毒质粒

利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段CD97-CAR。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列，使用该引物扩增目的基因片段，扩增产物5’和3’最末端的序列分别与线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提，获得高纯度质粒，用于下游病毒包装。

2、制备CD97-CAR慢病毒

①转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度约5x10⁶细胞/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养。24h待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。

②转染前2h更换为无血清培养基。

③向一灭菌离心管中加入所制备的质粒(GV载体质粒20μg、pHelper1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)，与转染试剂混合均匀，调整总体积为1ml，在室温下温育15min。

④混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，放于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。

⑤培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃。

⑥缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，放于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养48h。

⑦根据细胞状态，收集转染后48h(转染即可为0h计起)的293T细胞上清液，在4℃和4000g条件下离心10min，除去细胞碎片。

⑧以0.45μm滤器过滤上清液于超速离心管中，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃。

⑨离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬，经充分溶解后，按要求分装后进行转染或存放置于-80℃进行储存。

3、极化Th9细胞

①首先从人外周血液中将PBMC细胞进行分离，并通过分离CD4+T细胞的试剂盒(EasySep^TM Human CD4+T Cell Isolation Kit)将CD4+T细胞纯化出来。

②通过CD3(1μg/ml)和CD28(2μg/ml)两种因子对CD4+T细胞进行激活，并加入IL-4(10ng/ml)、TGF-β(1ng/ml)、IFN-Y(10μg/ml)三种因子培养5天将其极化为Th9细胞。

4、转染制备CD97-CAR慢病毒

通过293T将CD97-CAR的慢病毒产出，其次通过慢病毒转染的方式在24孔板中将CD97-CAR转染到28万的Th9细胞中，在慢病毒转染后的第四天通过倒置荧光显微镜观察GFP的表达，并进行扩增。

实施例3 CD97-CAR Th9在细胞水平的杀伤效果

首先通过RT-PCR检测IL-9的表达情况可以看出经极化后Th9细胞表达IL9可达到10000倍，证明我们成功极化的Th9细胞(图6(A))。

为了在细胞水平检测CD97-CAR Th9细胞是否具有特异性杀伤表达CD97肿瘤细胞的效果，通过将不表达CD97的U87细胞以及表达CD97的GSC和CD97-CAR Th9细胞以E:T＝0.5:1的比例共培后检测杀伤，发现CD97-CAR Th9细胞对表达CD97的肿瘤细胞有特异性杀伤(图6(B))。

实施例4 CD97-CAR Th9在动物水平的治疗效果

为了检测CD97-CAR Th9在体内的治疗效果，我们构建了原位异种移植模型，将GSC2-Lucifease过表达细胞10万/只注射到小鼠脑部，并且通过检测肿瘤的Luminescence达到1×10⁵时开始通过尾静脉注射1×10⁷CD97-CAR Th9细胞，并在第17天进行第二次尾静脉注射1×10⁷CD97-CAR Th9细胞，在此期间一直监测小鼠肿瘤的Luminescence变化情况，我们发现CD97-CAR Th9治疗对肿瘤的增长具有显著抑制作用(图7(A))。

此外通过监测小鼠的生存周期可以发现，CD97-CAR Th9治疗的小鼠中位生存期为35天，相对于对照组的中位生存期为22天，可以明显看出CD97-CAR Th9治疗可以延长小鼠的生存周期(图7(B))。

对比例1

与实施例2不同的是，对比例1的CD97-CAR慢病毒采用的是普通的T细胞，而不是Th9细胞，结果发现，虽然CD97-CAR在PBMC细胞中转染效率还不错(图8(A))，但是转染了CD97-CAR慢病毒的PBMC细胞(CD3+T细胞在PBMCs中占45-70％)无法正常进行生长，而没有进行任何处理的细胞以及转染的是没有CD97分子的CAR慢病毒也不会影响PBMC细胞的正常生长(图8(B))，说明本申请方案的CD97-CAR慢病毒只适用于Th9细胞，而不适用于普通的T细胞。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种抗CD97嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗CD97嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2.一种抗CD97嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的抗CD97嵌合抗原受体。

3.根据权利要求2所述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有权利要求2所述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因，并且该表达载体能够在转染宿主细胞后，使得所述宿主细胞表达权利要求1所述的抗CD97嵌合抗原受体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体。

6.一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞，其特征在于，所述T细胞中能够表达如权利要求1所述的抗CD97嵌合抗原受体。

7.根据权利要求6所述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞，其特征在于，所述T细胞为Th9细胞。

8.一种表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于，包括：

构建抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒；

对所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒进行慢病毒包装；

极化得到Th9细胞；

将所述抗CD97嵌合抗原受体表达基因的慢病毒质粒转染所述Th9细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的有效成分包括权利要求6或7所述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞。

10.如权利要求1所述的抗CD97嵌合抗原受体、权利要求2所述的抗CD97嵌合抗原受体表达基因、权利要求4所述的表达载体、权利要求6所述的表达抗CD97嵌合抗原受体的T细胞在制备治疗脑胶质瘤的药物中的用途。

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