KR101353358B1 - ｐ５３β를 발현하는 세포주 및 이의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 p53β를 발현하는 세포주, 상기 세포주를 생산하는 방법, p53β 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 p53β 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포주는 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주로서, 암세포 형성, 세포노화 과정 등에 관여하는 p53β의 기능, wtp53과의 상호 작용 등을 연구하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포주는 암 치료제 발굴과 세포노화 조절 물질 발굴 등을 위한 스크리닝 시스템 구축에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 p53β 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

ｐ５３β를 발현하는 세포주 및 이의 생산 방법{cell lines with p53β expression and method for producing the same}
본 발명은 p53β를 발현하는 세포주, 상기 세포주를 생산하는 방법, p53β 단백질의 억제제를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 및 p53β 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
암 억제 유전자로 잘 알려진 p53 단백질은 스트레스 신호에 의하여 수많은 유전자들의 전사를 조절하는 것으로 알려져 있으며, 특히 세포주기 정지, 세포사멸, DNA 복구 및 노화에 이르기까지 다양한 과정에 관여하여 궁극적으로 암을 억제하는 것으로 알려져 있다. 정상적으로 p53은 MDM2에 의하여 낮은 농도로 유지되고 있으며, p53 유전자가 생명유지 및 조절에 매우 중요한 역할을 담당하는 만큼 실제로 암 환자들에게서 p53의 돌연변이가 많이 발견되고 있다.
p53 유전자는 11개의 엑손으로 구성되어 있으며, TAD1(trans-activation domain1), TAD2(trans-activation domain2), DBD(DNA binding domain), NLS(nuclear localization signal) 및 OD(oligomerization domain)으로 이루어져 있다. 선택적 스플라이싱에 의하여 OD가 다른 p53, p53β 또는 p53γ 형태가 존재하며, 선택적 해독에 의하여 N 말단의 아미노산 39개가 짧은 △40p53, △40p53β 및 △40p53γ 형태, 내부 프로모터에 의하여 유도된 △133p53, △133p53β 및 △133p53γ 형태 등 총 9개의 p53 유사체(isoform) 형태가 발견되었다(Bourdon, J.C. et al., p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity, Genes & Dev. 19, 2122-2137).
p53 유사체들은 야생형 p53(wtp53)의 기능을 조절함으로써 스트레스에 의한 wtp53의 반응들을 방해할 수 있다. 최근에 C 말단의 스플라이싱에 의하여 생성된 p53β는 wtp53 의존적으로 세포사멸을 조절하는데 중요한 반면 이와 비슷하게 C 말단이 스플라이싱된 p53γ의 기능은 세포사멸에 중요하지 않는다는 보고가 있었다. 따라서, 이러한 p53 유사체들이 세포 내에 존재하는 wtp53의 기능에 중요한 영향을 미칠 것으로 보고 있다.
또한, 모든 p53 유사체가 핵에 존재하더라도 오직 wtp53만이 세포사멸을 유도하는데 작용한다. 나아가 wtp53만이 전사를 위한 요소들과 복합체를 이루거나 스트레스 상황하에서 미토콘드리아로 이동하나, 다른 p53 유사체들은 변화가 없으며, C 말단이 선택적 스플라이싱된 p53 유사체인 β, γ는 이러한 세포사멸 기능을 조절하지 못한다. 이는 OD(oligomerization domain)의 손실로 인하여 wtp53과 결합할 수 없어 p53에 의하여 인지되는 DNA 서열에 결합하지 못했기 때문일 것으로 보고 있다.
또한, p53β와 p53γ는 MDM2에 의한 프로테오솜 분해(proteosomal degradation) 뿐만 아니라, p53의 활성에 영향을 미치는 다른 조절인자와의 결합이 감소되었다. 그러므로 C 말단이 다양하게 스플라이싱된 p53 유사체들은 p53의 조절과 기능에 다양하게 관여할 것이다.
이와 같이 p53 유사체에 대한 연구가 진행되고 있으나, 각 p53 유사체들의 생물학적, 화학적 특성이 wtp53과 연관되거나 또는 독립적으로 어떠한 기능을 수행할 것이며, 어떠한 방식으로 조절이 되는 것인지에 대해서는 명확히 밝혀진 것이 없으며, 앞으로 연구되어야 할 필요가 있다. 특히, 종양의 형성 및 성장에 미치는 p53β의 영향은 전혀 알려진 바가 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 p53β의 인간 암세포에서의 기능을 확인하기 위하여, p53β를 지속적으로 발현하는 세포주를 대장암 세포주인 HCT116 p53+/+ 세포, HCT116 p53-/- 세포 및 폐 종양 세포주인 H1299 세포에 특이적으로 구축한 후, 상기 세포주를 이용하여 종양 형성에 미치는 p53β의 역할을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 p53β를 발현하는 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) p53β를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 레트로바이러스 벡터로 숙주세포를 형질감염시키는 단계; (c) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 레트로바이러스를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 레트로바이러스로 타겟 세포를 감염시키는 단계를 포함하는, p53β를 발현하는 세포주의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 p53β 단백질의 활성을 억제하는 물질은 p53β 단백질에 특이적인 항체 또는 이의 항원결합 부위를 포함하는 단편이며, 상기 p53β 단백질의 발현을 억제하는 물질은 p53β 단백질의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 p53β를 발현하는 세포주에서 p53β 유전자의 mRNA 또는 p53β 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 세포주에 시험물질을 처리하고, p53β 유전자의 mRNA 또는 p53β 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)에서 측정한 발현 수준보다 단계 (b)에서 측정한 발현 수준이 감소한 경우, 시험물질을 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질로 판단하는 단계를 포함하는, p53β 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 p53β를 발현하는 세포주를 제공한다.
p53 유사체들은 야생형 p53(wtp53)의 기능을 조절함으로써 스트레스에 의한 wtp53의 반응을 방해할 수 있는 것으로 여겨지고 있으나, 이에 대한 확인을 위하여는 p53 유사체를 안정적으로 발현하는 세포주가 필요하다. 이러한 요구에 따라 본 발명자들은 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하였다.
본 발명에서, "p53β"는 p53 유사체(isoform) 중 하나로서, p53 유전자의 올리고머화 도메인에 선택적 스플라이싱이 일어난 형태로 MDM2에 의한 프로테오솜 분해 뿐만 아니라, p53의 활성에 영향을 미치는 다른 조절인자와의 결합능이 wtp53에 비해 감소한 p53 유사체를 의미한다.
바람직하게 상기 p53β는 서열번호 1의 아미노산으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, p53β가 지속적으로 발현되는 세포주를 대장암 세포주인 HCT116 p53+/+ 세포, HCT116 p53-/- 세포 및 폐 종양 세포주인 H1299 세포에 특이적으로 구축하였으며, 각각의 세포주에서 p53β가 특이적으로 발현되고 있음을 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 통하여 확인하였다(도 2).
본 발명에서, "세포주"는 조직에서 분리 혹은 선택 및 클로닝에 의해서 확립된 세포의 계통으로 특정의 형질 또는 유전학적 표지를 갖는 배양세포계로서, p53β를 발현하는 세포주를 의미한다.
상기 세포주는 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주로서 암세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 대장암 세포주인 HCT116 세포 또는 폐암 세포주인 H1299 세포일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 p53β를 발현하는 HCT116 p53+/+ 세포주, p53β를 발현하는 HCT116 p53-/- 세포주 및 p53β를 발현하는 H1299 세포주로 이루어진 군에서 선택된 세포주 일 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 p53β를 발현하는 세포주의 생산방법은 (a) p53β를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 제조하는 단계; (b) 상기 레트로바이러스 벡터로 숙주세포를 형질감염시키는 단계; (c) 상기 숙주세포를 배양하여 재조합 레트로바이러스를 수득하는 단계; 및 (d) 상기 재조합 레트로바이러스로 타겟 세포를 감염시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로서, p53β를 코딩하는 뉴클레오티드의 중합체를 의미한다.
바람직하게, 상기 p53β를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, "형질감염"은 유전자를 숙주세포 내에 도입 후 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 목적 유전자가 도입된 벡터를 숙주세포 내로 형질감염시키는 방법은 염기를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
상기 레트로바이러스 벡터는 목적하는 p53β 유전자를 숙주세포 내에 효율적으로 도입시키기 위한 수단으로서, pBABE puro 벡터일 수 있으며, pBABE puro 벡터는 바이러스 입자를 만들고 증폭하기 위한 gag, pol, env 유전자를 가지고 있고, 선별 마커(selection marker)로 퓨로마이신(puromycin drug)을 이용하여 원하는 유전자가 삽입된 세포만을 얻을 수 있는 구조를 가진다(도 1의 A).
상기 숙주세포는 본 발명의 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 제조하기 위하여 목적 유전자가 도입된 벡터로 1차 형질감염시킨 세포를 의미한다. 상기 숙주세포는 당업계에 공지된 세포를 당업자에 의해 적절하게 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 HEK293 세포 유래의 Linx 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.
상기 타겟 세포는 p53β를 안정적으로 발현하도록 형질감염된 세포로서, p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 생산하기 위하여 당업계에 공지된 세포를 당업자에 의해 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
바람직하게, 상기 타겟 세포는 암세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 인간 대장암 세포인 HCT116 세포 또는 폐종양 세포인 H1299 세포일 수 있다.
또한, 보다 더 바람직하게, 상기 세포주는 p53β를 발현하는 HCT116 p53+/+ 세포주, p53β를 발현하는 HCT116 p53-/-세포주 및 p53β를 발현하는 H1299 세포주로 이루어진 군에서 선택된 세포주일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, p53β 유전자를 pBABE puro 레트로바이러스 벡터에 클로닝하고, 숙주세포로서 Linx 세포에 p53β 유전자를 포함하는 pBABE puro 벡터로 형질감염시켰다. 이후, Linx 세포를 배양하여 p53β 유전자를 포함하는 재조합 레트로바이러스를 수득하여 타겟 세포로서 HCT116 p53+/+, HCT116 p53-/- 및 H1299 세포에 재감염시켜, p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하였다. 이후, p53β 유전자가 타겟 세포로 제대로 끼어 들어간 세포들을 선별하기 위하여 퓨로마이신을 처리한 후, 생존한 세포들을 대상으로 RT-PCR 및 웨스턴 블랏을 수행하여 p53β가 발현됨을 RNA 수준 및 단백질 수준에서 확인하였다(도 2).
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 p53β 단백질의 활성을 억제하는 물질은 p53β 단백질에 특이적인 항체 또는 이의 항원결합 부위를 포함하는 단편이며, 상기 p53β 단백질의 발현을 억제하는 물질은 p53β 단백질의 발현을 억제하는 올리고 뉴클레오티드인 것인 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 약학적 조성물을 암이 발병한 또는 발병 가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서, "예방"이란 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서, "개체"란 암이 발병하였거나 발명할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
본원에서, "암"은 크게 고형암과 혈액암으로 분류될 수 있으며, 이 중 "고형암(Solid cancer)"은 유방 또는 전립선 등의 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하는 것을 말하며, 액체인 혈액에 영향을 끼치는 백혈병(leukemia)과 반대되는 개념이다. 구체적으로는 방광, 유방, 장, 신장, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 폐, 대장, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부(편평상피세포 암종 포함)와 같은 암종; 섬유육종 및 횡문근육종을 포함한 간충직 발원의 종양; 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종 및 신경초종을 포함한 중추 및 말초 신경계의 종양; 및 흑색종, 정상피종, 기형종, 골육종, 색소건피증, 각화극세포증, 갑상선 여포상암 및 카포시 육종을 포함한 기타 종양, 바람직하게는 폐암, 대장암을 포함하나, 반드시 이들로 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 종양의 성장을 억제하는 활성을 가지는 조성물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 혈철이 낮은 상태(스트레스 상황)에서 p53β에 의해 세포증식이 증가하였음을 크리스탈 바이올렛 분석을 통하여 확인하였고(도 5), 흡착 독립성 성장 분석을 통하여 p53β를 발현하는 세포에서 콜로니 형성수가 증가하였음을 확인하였으며(도 6의 A 내지 D), HCT116 p53-/- pBABE 세포와 HCT116 p53-/- p53β 세포를 Balb/c 누드 마우스에 이식한 후 종양 형성 및 성장 여부를 관찰한 결과, p53β에 의해 종양 형성 및 성장이 촉진됨을 관찰하였다(도 6의 E). 이러한 결과는 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질을 사용하여 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제함으로써 암을 예방하거나 치료할 수 있음을 나타낸다.
본 발명에서, p53β 단백질의 활성을 억제하는 물질은 p53β 단백질에 특이적인 항체 또는 이의 항원결합 부위를 포함하는 단편이며, 상기 항체는 p53β 단백질의 활성을 특이적으로 억제하는 다클론항체 뿐만 아니라 단일클론항체 및 이에 대한 카이메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함할 수 있고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술 분야에서 공지된 항체들도 포함할 수 있다.
상기 p53β 단백질의 활성을 억제하는 항체는 p53β 단백질에 특이적으로 결합하여 p53β 단백질의 활성을 효과적으로 억제할 수 있다. p53β 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법에 의해 제조하거나, 또는 상업적으로 이용가능한 항체를 구입하여 사용할 수 있다.
상기 항체는 p53β를 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 항원결합 부위를 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 상기 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일클론항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, p53β 단백질의 발현을 억제하는 물질은 p53β 단백질의 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드이며, 바람직하게 상기 올리고뉴클레오티드는 p53β 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(small hairpin RNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA, RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 p53β mRNA에 상보적이고 p53β mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, p53β mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.
안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나, 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.
상기 siRNA는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 약 20개의 뉴클레오티드로 구성된 길이의 이중가닥 RNA를 의미하며, shRNA는 siRNA 표적 서열의 센스 및 안티센스 서열이 5개 내지 9개의 염기로 구성된 루프(loop)를 사이에 두고 위치한 짧은 헤어핀 구조의 RNA를 의미한다. siRNA나 shRNA는 상보적인 서열을 갖는 표적 mRNA에 특이적으로 결합하여 표적 유전자의 mRNA의 절단을 통해 RNA 간섭(RNAi: RNA interference)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 p53β 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 서열을 가지는 siRNA 또는 shRNA를 사용하여 p53β 단백질의 발현을 억제함으로써 암을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 siRNA를 제조하는 방법은 siRNA를 직접 화학적으로 합성하거나(Sui G 등, (2002) Proc Natl Acac Sci USA 99:5515-5520), 인 비트로 전사를 이용하여 합성하는 방법(Brummelkamp TR 등, (2002) Science 296:550-553) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, shRNA는 siRNA의 고가의 합성비용, 낮은 형질감염 효율에 따른 RNA 간섭 효과의 짧은 지속시간 등을 극복하기 위해 이용되며, RNA 중합효소 III의 프로모터로부터 아데노바이러스, 렌티 바이러스, 및 플라스미드 발현 벡터 시스템을 이용하여 세포 내로 도입하여 발현시킬 수 있다. shRNA는 세포 내에 존재하는 siRNA 가공 효소(Dicer 또는 RNaseIII)에 의해 정확한 구조를 갖는 siRNA로 전환되어 표적 유전자의 침묵을 유도하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 목적 조직 또는 세포에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여, 세포 내 직간접 투여될 수 있으다. 이를 위하여 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 p53β를 발현하는 세포주에서 p53β 유전자의 mRNA 또는 p53β 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 세포주에 시험물질을 처리하고, p53β 유전자의 mRNA 또는 p53β 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (a)에서 측정한 발현 수준보다 단계 (b)에서 측정한 발현 수준이 감소한 경우, 시험물질을 p53β 단백질의 활성 또는 발현을 억제하는 물질로 판단하는 단계를 포함하는, p53β 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 p53β 단백질의 억제제를 스크리닝하는 방법은, 시험물질을 처리하기 전과 후의 본 발명에 따른 p53β를 발현하는 세포주에서 측정한 p53β의 발현 수준을 비교하여, 시험물질 처리에 따라 p53β의 발현 수준이 감소한 경우, 시험물질을 p53β 단백질의 억제제로 판단할 수 있다. 상기 시험물질은 p53β 단백질의 발현이나 활성을 억제하므로 암의 예방 및 치료를 위해 이용될 수 있다.
본 발명에서, "p53β 단백질의 억제제"는 p53β 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 p53β 단백질의 작용을 억제하는 물질을 의미한다.
상기 p53β를 발현하는 세포주는 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주로서 암세포일 수 있으며, 바람직하게는 인간 대장암 세포주인 HCT116 세포 또는 폐암 세포주인 H1299 세포일 수 있고, 보다 더 바람직하게는 p53β를 발현하는 HCT116 p53+/+ 세포주, p53β를 발현하는 HCT116 p53-/- 세포주 및 p53β를 발현하는 H1299 세포주로 이루어진 군에서 선택된 세포주일 수 있다.
상기 세포주에서 p53β 단백질의 발현 수준의 측정은 p53β 단백질 또는 그의 단편을 특이적으로 인식하는 항체에 의해 수행될 수 있으며, p53β 유전자의 mRNA의 발현 수준의 측정은 p53β 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 특이적으로 인식하는 프로브 또는 프라이머에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
표적 유전자 서열이 밝혀진 경우, 당해 분야의 평균적 기술자는 기존의 데이터베이스를 토대로 표적 유전자 내 서열간의 혼성화 정도 등의 변수를 고려하여, 특이성 및 민감성이 높은 다양한 프라이머 쌍의 조합을 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명에서, mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR , 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블롯팅, DNA 칩 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
또한, 단백질의 수준을 측정하기 위한 방법은 본 발명에 따른 간세포암 진단 마커 단백질과 그에 특이적인 항체 간의 "항원-항체 복합체" 형성량을 측정하는 방법을 포함할 수 있으며, 그 외에 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포주는 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주로서, 암세포 형성, 세포노화 과정 등에 관여하는 p53β의 기능, wtp53과의 상호 작용 등을 연구하기 위한 용도로 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포주는 암 치료제 발굴과 세포노화 조절 물질 발굴 등을 위한 스크리닝 시스템 구축에 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 p53β 단백질의 발현 또는 활성을 억제시킴으로써 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1의 A는 pBABE puro 레트로바이러스 벡터의 구조를 보인 도면이다.
도 1의 B는 본 발명의 세포주의 생산방법을 개략적으로 보인 도면이다.
도 1의 C는 p53 유사체의 단백질 구조를 보인 도면이다. p53 DO-1 항체는 TAD1에 결합하며, p53 ab17990 항체는 TAD2 및 PD에 결합한다.
도 2의 A는 pBABE p53β의 서열을 보인 도면이다.
도 2의 B는 H1299 세포주에서 p53β가 발현됨을 보인 RT-PCR 및 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸다.
도 2의 C는 HCT116 p53+/+ 및 HCT116 p53-/- 세포주에서 p53β가 발현됨을 보인 RT-PCR 및 웨스턴 블랏의 결과를 나타낸다.
도 3의 A는 p53-LUC, p21-LUC, BAX-LUC 루시퍼라제 리포터의 구조를 나타낸다. 모든 리포터는 p53 결합 부위(5'-PuPuPuC(A/T)(T/A)G PyPyPy-3') 및 반디불이 루시퍼라제를 포함하고 있다.
도 3의 B 내지 D는 각각 정상 상황, 혈청 스타베이션 상황 및 무-영양분 상황에서 p53, p21 또는 BAX의 전사활성에 미치는 p53β의 영향을 보이는 루시퍼라제 분석 결과를 나타낸다.
도 4는 HCT116 p53+/+ p53β 세포주의 mRNA 마이크로어레이 분석 결과를 나타낸다. 도 4a는 p53β를 발현하는 세포(n=3)와 대조군 세포(n=3) 사이에 2배 이상 발현 수준의 차이를 보이는 유전자의 heatmap을 나타낸다. p53β에 의하여 발현 수준이 증가한 유전자는 빨간색으로, 감소한 유전자는 녹색으로 표시하였다. 도 4b는 p53β를 발현하는 세포와 대조군 세포 사이에 2배 이상 발현 수준의 차이를 보이는 유전자에 대한 벤 다이어그램을 나타낸다. 도 4c는 상향조절된 생물학적 프로세스에 대한 리스트이다. 도 4d는 하향조절된 생물학적 프로세스에 대한 리스트이다. 도 4e는 대사 관련 유전자를 나타낸다. 도 4f는 대사 관련 유전자의 유효성 평가(validation)로서, HCT116 p53+/+ p53β 세포주로부터 분리한 RNA에 대한 RT-PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 p53β를 발현하는 세포주의 증식 분석 결과를 보인 그래프이다.
도 6의 A 및 B는 소프트-아가 콜로니 형성 분석 결과로서, HCT116 p53+/+(A) 및 HCT116 p53-/- (B) 세포의 성장에 미치는 p53β의 영향을 나타낸다.
도 6의 C 및 D는 (A) 및 (B) 세포에서 측정한 콜로니 수를 %로 나타낸 그래프이다.
도 6의 E는 HCT116 p53-/- pBABE 세포와 HCT116 p53-/- p53β 세포를 Balb/c 누드 마우스의 대퇴부에 피하주사한 후, 시간 경과에 따른 종양 크기의 변화를 나타낸다.
이하, 하기 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
참고예 1: 세포 배양
대장암 세포인 HCT116 p53+/+ 와 HCT116 p53-/- 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI (GIBCO BRL) 배지에서 37℃의 온도로 5% CO2에서 배양하였다. 세포가 배양접시 바닥에 80-90% 정도 채워졌을 때, 0.25% 트립신을 1 ㎖ 처리하여 세포를 배양접시에서 떼어낸 후 1,500 rpm에서 2분 30초 동안 원심분리 하여 세포를 얻었다. 상층액을 제거하고 새로운 DMEM 배지를 10 ㎖ 넣고 세포를 풀어준 다음 1/10 수준으로 100　mm 배양접시에 세포를 분주하였다. 혈청 스타베이션(Serum starvation)은 0.2 % FBS가 포함된 RPMI배지를 사용하였다. 내인성(Endogenous) p53이 없는 대장암 세포인 HCT116 p53-/- 세포주는 계명대학교 면역학 실험실의 권택규 박사님로부터 얻었다. H1299 세포도 상기와 같은 방식으로 보통 3-4일 마다 1/10 계대배양 하였다. 실험에 사용한 세포의 특성을 표 1에 나타내었다.
Figure 112011025960581-pat00001
실시예 1 : p53 β를 안정적으로 발현하는 세포주의 제조
1-1. p53 β 클로닝
HEK293T genomic DNA로부터 5' 프라이머(p53-E2; 서열번호 3: ATGGAGGAGCCGCAGTCAGAT)와 3' 프라이머(p53-Ri91; 서열번호 4: TTTCAACTTACGACGAGT)를 사용하여 95℃ 5분, 95℃ 30초, 43℃ 30초, 72℃ 45초, 72℃ 8분 과정을 30 회 반복하여 1차 PCR을 수행하였다. 주형으로 1차 PCR 산물을 사용하고 5' 프라이머(p53-E2 EcoRⅠ F; 서열번호 5: AGAGAATTCATGGAGGAGCCGCAGTCA)와 3' 프라이머(p53 beta BamHⅠ R; 서열번호 6: GCCCCTAGGGTATCAGGCAAAGTCATAG)를 사용하여 95℃ 5분, 95℃ 30초, 43℃ 30β초, 72℃ 45초, 72℃ 8분 과정을 30회 반복하여 2차 PCR을 수행하였다. 최종 산물의 크기는 1,127 bp였다. 2차 PCR 산물을 pCR2.1 TOPO 벡터에 TA 클로닝하였다. EcoRⅠ과 BamHⅠ을 처리하여 pCR2.1-p53 Exon2-β로부터 p53 exon2번부터 exonβ 까지 얻은 다음 레트로바이러스 벡터인 pBABE-puro 벡터(Dr. Xiang-Dong Fu)에 라이게이션 하여 pBABE-puro-p53 Exon2-β를 클로닝하였다.
1-2. 레트로바이러스 감염
Linx 세포의 DMEM(GIBCO) 배지를 제거하고 트립신(GIBCO) 1 ㎖를 처리(100 mm 배양접시)하고, 37 ℃ CO2 배양기에 2 분 동안 두었다. 새로운 배지 5 ㎖을 넣고 섞어준 후, 15 ㎖ 튜브에 넣고 1,500 rpm에서 3 분간 원심분리 하여 세포를 얻었다. 상층액을 제거하고 새로운 배지 10 ㎖을 넣고 세포를 풀어준 후 70-80%가 되는 수준으로 60 mm 배양접시에 접종하였다. 37 ℃ CO2 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, pBABE puro 벡터와 pBABE puro p53β 구조체를 4μg씩 형질감염(transfection)한 다음 37 ℃ CO2 배양기에서 6 시간 동안 배양하였다. 이후, 10 % FBS(GIBCO)를 포함하고 있는 DMEM 배지를 1 ㎖ 첨가하고, 37 ℃ CO2 배양기에서 24 시간 동안 키운 후 배지를 제거하고, 신선한 DMEM 배지 3 ㎖를 넣어준 후 32 ℃ CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 이때, 다음날 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 만들고자 하는 타겟 세포가 50 % 되도록 접종하였다. 48 시간 후 32 ℃ CO2 배양기에서 원하는 유전자를 도입한 후 반응시킨(pBABE puro 벡터와 pBABE puro p53β 구조체) Linx 세포를 꺼내고 바이러스가 포함되어 있는 상층액인 배지를 회수하였다. 1,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리 하여 배지에 남아 있는 세포의 잔해물들을 가라앉히고 상층액만을 다른 튜브로 옮기고, 0.45 ㎛ 필터 공극(filter pore) 크기로 모은 상층액을 거른 후, 필터링 한 바이러스 상층액 3 ㎖ 와 타겟 세포를 배양한 배지인 RPMI1640(GIBCO) 1 ㎖에 폴리브렌(Sigma) 10 ㎍/㎖를 섞어 상온에서 5 분간 안정화시키고, 전 날 접종하여 50 % 차있는 타겟 세포에 5 분간 안정시킨 혼합물을 넣어주었다.
이후, 32 ℃ CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하여 바이러스를 감염시킨 후, 다음날 신선한 RPMI1640 배지로 교체하여 37 ℃ CO2 배양기에서 하루 동안 감염시킨 세포를 안정화시켜 주었다. 바이러스 감염시킨 세포의 상태를 관찰하고 퓨로마이신 약제 내성 세포주를 선별하였다. 0.2 ㎍/㎖ 농도로 3일간, 0.4 ㎍/㎖의 농도로 3일간, 0.8 ㎍/㎖ 의 농도로 1주간 선별을 진행하다가 1 ㎍/㎖의 농도로 3일간 선별하였다. 최종 선별된 p53β를 안정적으로 발현하는 세포주를 0.8 ㎍/㎖ 농도의 퓨로마이신으로 약 2주간 유지하다가 퓨로마이신이 없는 RPMI 배지로 유지하였다. 선별된 세포를 배양하여 stock으로 보존하고 원하는 타겟 유전자가 제대로 삽입되어 발현되는지 RT-PCR과 웨스턴 블랏으로 확인하였다.
실시예 2 : p53 β를 안정적으로 발현하는 HCT116 p53 +/+ , HCT116 p53 -/- 및 H1299 세포주의 확인
Linx 세포로부터 얻은 p53β를 포함하는 재조합 바이러스 입자를 각각 HCT116 p53+/+, HCT116 p53-/- 및 H1299 세포에 재감염시키고, 퓨로마이신을 처리하여 재조합 레트로바이러스 구조체가 들어가 일정하게 발현되는 세포를 선별하였다. 선별 후 RNA의 지속적인 발현이 이루어지고 있음을 확인하기 위하여 RT-PCR을 하였고, 이때 p53β의 발현은 적은 농도로 이루어지므로 2차 PCR을 하였다. 또한, DO-1 항체를 사용하여 웨스턴 블랏 하여 p53β의 단백질로의 발현 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 2의 B에 나타난 바와 같이, RT-PCR 결과 p53β를 포함하는 재조합 바이러스 입자로 형질감염된 H1299 세포주는 pBABE 벡터 대조군보다 p53β RNA를 지속적으로 발현하였으며, 웨스턴 블랏 결과, p53β 단백질을 발현하고 있음을 확인할 수 있었다(도 2의 B).
또한, 도 2의 C에 나타난 바와 같이, RT-PCR 결과 p53β를 포함하는 재조합 바이러스 입자로 형질감염된 HCT116 p53+/+ 및 HCT116 p53-/- 세포주는 각각 p53β RNA를 지속적으로 발현하였으며, 웨스턴 블랏 결과, p53β 단백질을 발현하고 있음을 확인할 수 있었다(도 2의 C).
실시예 3 : p21 및 BAX 의 전사 활성에 미치는 p53 β의 영향 확인
p53 반응 부위(p53 responsive elements)를 지니는 p53의 대표적인 타겟 유전자인 p21, BAX 및 p53 반응 부위를 인위적으로 넣어 만든 p53 합성 리포터를 대상으로 이들의 전사 활성에 미치는 p53β의 영향을 확인하기 위하여 루시퍼라제 분석(luciferase assay)을 수행하였다(도 3의 A). 이를 위하여, p53β를 발현하는 세포주를 p53-LUC, p21-LUC 또는 BAX-LUC 루시퍼라제 리포터 및 레닐라 루시퍼라제 활성을 위한 pRL-TK 발현 벡터로 형질전환 하였다. 형질전환한 다음 16시간 후, 세포를 정상 혈청 배지(10% FBS), 무혈청 배지(0.2% FBS) 및 무-영양분 배지(Earle's Balanced Salt Solution, EBSS)에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 세포를 모으고, 루시퍼라제 활성을 레닐라 활성으로 정규화하였다. 상대적인 루시퍼라제 활성은 레닐라 루시퍼라제 활성을 정규화한 반디불이 루시퍼라제 활성으로 나타내었다.
p53β 세포주를 사용하여 p53 합성 리포터의 전사 활성을 관찰한 결과, 내인성 p53이 존재하는 HCT116 p53+/+ p53β 세포에서 p53의 전사 활성이 증가하였고(정상조건, 10% FBS), 스트레스 상황(serum starvation, 0.2% FBS)에서도 비슷한 현상을 보였으며, 무-영양분(nutrient free, EBSS)의 극단적인 스트레스 상황에서는 전사 활성이 현저히 증가하였다. 그러나, 이러한 현상은 HCT116 p53-/- p53β 세포에서는 관찰되지 않았다(도 3의 B).
p21 전사 활성은 상기 p53 합성 리포터 결과와 반대로 내인성 p53에 의하여 증가한 활성이 p53β에 의하여 감소하였고, 스트레스 상황(serum starvation)에서도 급격한 감소를 보였으며, 무-영양분 상황에서는 약한 감소를 나타내었다. 내인성 p53이 없는 HCT116 p53-/- 세포에서도 약한 감소를 보였으나, 스트레스 상황(serum starvation)이나 무-영양분 상황에서는 큰 변화가 관찰되지 않았다(도 3의 C).
또한, HCT116 p53+/+ p53β 세포와 HCT116 p53-/- p53β 세포에서 BAX의 전사 활성이 감소하였으나, 스트레스 상황(serum starvation)에서는 내인성 p53이 유무에 따라 전사 활성에 미치는 p53β 영향이 달라짐을 관찰하였다. 내인성 p53이 존재할 때는 스트레스 상황(serum starvation)을 주어도 변화가 없었으나, 내인성 p53이 없을 때에는 전사 활성이 약간 증가하였다. 무-영양분 상황에서는 p53β에 의해 BAX의 전사 활성이 좀 더 증가하였음을 관찰하였다(도 3의 D).
이러한 결과를 통하여, p53β는 내인성 p53의 유무에 따라 다르게 반응하지만, 혈청 스타베이션(serum starvation)이나 무-영양분이라는 세포 스트레스가 가해졌을 때에는 p21의 전사 활성은 감소시키고 BAX의 전사 활성은 증가시키는 등의 서로 다른 반응을 보인다는 점을 확인할 수 있었다.
실시예 4 : 대사 관련 mRNA 발현에 미치는 p53 β의 영향 확인
HCT116 p53+/+ p53β 세포에 트리졸(Trizol) 시약 (Molecular Research Center) 500 ㎕를 넣어 상온에서 5분간 반응시킨 후 1.5 ㎖ 튜브로 옮간 후, 클로로폼 100 ㎕를 첨가한 다음 15초 동안 볼텍싱하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심 분리하여 상층액 220 ㎕를 을 새로운 튜브로 옮기고 동량의 이소프로판올을 첨가하여 인벌팅(inverting) 하여 섞은 뒤 상온에서 10분간 반응시켰다. 4℃에서 13,000 rpm으로 30분간 원심 분리하여 상층액은 제거하고 남은 펠렛에 70% 에탄올 400 ㎕를 넣어 수세하였다. 4℃에서 13,000 rpm으로 15분간 원심분리를 통해 상층액을 제거한 후 공기-건조(air-dry)를 통해 남은 물기를 모두 제거하고 30 ㎕ DEPC-H2O에 녹여 정량하였다.
위와 같은 과정으로 대조군으로 사용할 세포인 HCT116 p53+/+ pBABE 3 샘플과 HCT116 p53+/+ p53β 3 샘플에서 RNA를 추출하여 Affymetrix whole human gene expression microarray (Agilent technologies)를 이바이오젠에 의뢰하여 수행하였다. 또한, 상기 추출한 RNA로 RT-PCR을 수행하였다.
그 결과, 2배 이상 발현에 변화가 있는 유전자를 대상으로 heatmap을 얻었다 (도 4a). 2배 이상 변화가 있는 전체 유전자 5,859개 중 2,273개 유전자가 증가(regulation) 하였고 3,586개 유전자가 감소(downregulation) 하였다(도 4b). 변화를 보이는 유전자가 세포 내의 어떤 과정에 관여하는지 유전자 온톨로지(gene ontology)에서 확인한 결과 대사 관련 프로세스들이 다수 확인되었다(도 4c 및 4d). 대사 프로세스 관련 유전자의 발현이 변화된 것이 맞는지 확인하기 위하여 몇몇 유전자를 선별하였고(도 4e), 이들 유전자의 발현이 증가 또는 감소되었는지 RT-PCR을 통해 확인한 결과, 마이크로어레이를 통해 얻은 값과 일치하는 결과를 얻을 수 있었다(도 4f).
실시예 5 : p53 β를 발현하는 HCT116 p53 +/+ , HCT116 p53 -/- 및 H1299 세포주의 증식 분석
5-1. 실험방법
p53의 경우 종양 억제인자로 DNA 손상, 대사 스트레스(metabolic stress; low oxygen, nutrient deprivation), 종양유발 스트레스(oncogenic stress; abberant proliferation)를 포함하는 다양한 자극에 의해 발현이 증가하여 타겟 유전자의 발현을 이끄는 것으로 잘 알려져 있다. p53β 역시 평상시에는 발현량이 현저히 적은 것으로 보아 특정 자극에 의해 발현이 될 것으로 생각되며, 상기 실시예 4에 나타난 바와 같이 마이크로어레이 결과를 보면 상당수가 대사 관련 유전자의 발현이 변화되는 것으로 확인되어, 대사 스트레스 상황이 주어졌을 때 세포의 증식에 어떠한 변화가 일어나는지 크리스탈 바이오렛 분석(crystal violet assay)을 통하여 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 12 웰 기준으로 HCT116 세포는 2 X 104 cells/well, H1299는 1 X 104 cells/well로 접종하고, 1일, 3일, 5일 기준으로 실험을 준비하였다. 대조군으로는 0일을 기준점으로 잡아 정량화하였다. 세포를 키우는 동안 2~3일에 한번 씩 신선한 RPMI1640 배지로 교체해 주었다. 해당하는 날짜에 트리플렛으로 준비한 세포를 다음과 같은 순서로 샘플링하였다. 먼저, 배지를 제거한 후 1X PBS로 1 번 세척하여 배지를 제거해 준 후 1X PBS에 녹여져 있는 1 % 글루타르알데히드로 상온에서 10 분 동안 고정시켜 주었다. 이후, 글루타르알데히드를 제거한 후 1X PBS로 2 번 세척하고, 0.2 % 크리스탈 바이올렛으로 상온에서 5 분 동안 염색하였다. 남은 크리스탈 바이올렛 액을 제거해준 후 3차 증류수로 2 번 세척하고, 염색된 플레이트를 공기 중에서 말려 다른 샘플들이 준비될 동안 보관하였다. 위와 동일한 조건으로 염색한 후 모든 샘플들이 준비되면 1 M 아세트산으로 크리스탈 바이올렛으로 염색된 것을 30분 이상 충분히 녹여져 나오게 하였다. 모든 샘플들에서 충분히 녹아져 나오면 1.5 ㎖ 튜브로 옮긴 후, 가장 높은 범위가 1.5를 넘지 않는 수준으로 1/10으로 희석하여 OD 600 nm 파장으로 흡광도를 측정하였다. 0일에 준비해 두었던 샘플로 모든 샘플들을 나누어 표준화하였다. 크리스탈 바이올렛은 DNA를 염색하므로 OD 600 nm의 수치는 세포수와 비례한다고 할 수 있어 OD 600 nm를 측정함으로써 세포의 증식 정도를 예측할 수 있다.
5-2: 실험결과
혈청 농도(대사 스트레스 상황)에 따라 p53β의 기능에 변화가 있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 5-1에 개시한 실험방법에 따라 혈청을 낮추는 조건으로 크리스탈 바이올렛 분석을 수행하였다.
그 결과, 스트레스가 없는 상황에서 HCT116 p53+/+ p53β 세포와 HCT116 p53+/+ pBABE 세포의 증식에 큰 차이가 없었지만, 내인성 p53이 없는 세포의 경우에는 HCT116 p53-/- pBABE 세포의 증식이 상당수 증가한 반면, HCT116 p53-/- p53β 세포의 경우는 증식이 감소하였음을 확인할 수 있었다. 스트레스 상황(serum starvation)에서는 HCT116 p53+/+ p53β 세포는 p53+/+ pBABE보다 증식되는 정도가 낮았으나, HCT116 p53-/- p53β 세포는 세포증식이 HCT116 p53-/- pBABE 세포보다 증가하였다(도 5의 A).
내인성 p53이 없는 H1299 세포에서는 스트레스가 없는 상황에서 p53β에 의한 증식차이가 없었으나, 혈청이 낮은 스트레스 상황에서는 H1299 p53β 세포의 증식이 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 5의 B).
실시예 6 : 종양 형성 촉진에 미치는 p53 β의 영향을 확인
6-1. 소프트-아가 콜로니 형성 분석
상기 실시예 5에 나타난 바와 같이, 혈철이 낮은 상태에서 p53β에 의해 세포증식이 증가하였음을 확인하여, 증가된 세포증식에 따른 종양 생성 촉진(tumor promotion)이 될 것으로 생각되어 흡착 독립성 성장 분석(anchorage independent growth assay)를 관찰할 수 있는 소프트-아가 콜로니 형성 에세이(soft-agar colony forming assay)를 수행하였다. 이를 위하여, 실험에 앞서 세포를 60∼70% 정도 배양접시 표면에 차도록 준비하였다. 바닥 용액이 될 2.4% low-melting 아가로스 용액을 녹여 준비하여 45℃ 항온조에 넣고 굳지 않게 하였다. 준비한 2.4% 아가로스 용액이 0.5%가 되도록 2X DMEM과 0.25 μM 필터로 정제한 3차 증류수와 혼합한 뒤 10% FBS가 되도록 FBS를 넣고 잘 섞어준 다음 이를 6 웰 플레이트에 분주하였다. 바닥층이 굳도록 상온에서 약 15분 정도 놓아두는 동안 세포에 트립신을 처리하고 세포수를 측정하였다. 위와 유사한 방법으로 상단 용액을 만들었으며, 이때 아기로스의 경우 최종 0.3%가 되도록 준비하였다. 상단 용액에 2 × 104 세포를 넣고 잘 섞어 바닥층 위에 고루 뿌려주었다. 이후, 1주에 한번 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 소량씩 첨가해 주었다.
그 결과, 도 6의 A 내지 D에 나타난 바와 같이, HCT116 p53+/+ 또는 p53-/- p53β 세포를 이용한 결과 p53β를 발현하는 세포에서 콜로니 형성수가 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 6의 A 내지 D).
6-2. 이종이식 동물 모델 실험
종양 형성 촉진에 미치는 p53β의 영향을 확인하기 위하여 이종이식 모델 실험을 수행하였다. 이를 위하여, HCT116 p53-/- pBABE 세포와 HCT116 p53-/- p53β 세포가 80∼90% 정도 배양접시 표면에 차도록 준비하고, 준비된 세포에 트립신을 처리하고 세포수를 측정하였다. Balb/c 누드 마우스의 좌측 대퇴부에 1×107 세포의 HCT116 p53-/- pBABE 세포를 피하주사하고, 우측 대퇴부에 동일한 세포수의 HCT116 p53-/- p53β 세포를 피하주사 하였다. 이종이식 모델(xenograft model)을 만든 시점으로부터 1달 동안 종양 크기(volume)를 측정하여 이를 그래프화 하였다.
그 결과, 도 6의 E에 나타난 바와 같이, 측정 2주차부터 p53β를 피하주사한 오른쪽 엉덩이 부분에서 종양 크기가 커져 측정 4주차에는 종양 크기가 약 6배 이상 증가하였음을 확인할 수 있었다(도 6의 E).
따라서, 도 6의 결과를 통하여 p53이 결여된 세포에서 p53β에 의해 종양 형성이 촉진됨을 확인할 수 있었다.
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  11. (a) p53β를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 레트로바이러스 벡터로 숙주세포를 형질감염시키는 단계;
    (b) 상기 숙주세포를 배양하여 수득한 재조합 레트로바이러스로 HCT116 p53-/- 세포를 감염시키는 단계를 포함하는,
    세포의 증식을 유도시키는 방법.
  12. 제11항에 있어서, (c) 세포 배양시 공급되는 혈청 농도를 낮추어 대사 스트레스를 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 유도된 세포 증식에 의해 종양 형성이 촉진되는 것을 특징으로 하는 방법.
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