CN115052590A - 包含8-氧代鸟嘌呤的RNA干扰诱导核酸、与包含8-氧代鸟嘌呤的microRNA结合的修饰的核酸及它们的用途 - Google Patents

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Abstract

在本发明中，已经证实，当产生下述RNA干扰诱导核酸并将其施用于细胞或小鼠时，会诱导各种病理生理现象，所述RNA干扰诱导核酸包含自核酸双链中至少一条单链的5'末端的第1至9个核苷酸中的至少一个8‑氧代鸟嘌呤(o8G)以及特异性结合microRNA并且其中自5'末端起的第1至第9个核苷酸中至少有一个鸟嘌呤(G)经8‑氧代鸟嘌呤(o8G)修饰的经修饰的核酸。此外，在通过逆转录microRNA产生的cDNA中已经鉴定了G>T修饰发生的位置以确认发生氧化修饰成8‑氧代鸟嘌呤的位置，所述microRNA中鸟嘌呤(G)在microRNA的种子区域中通过氧化应激由8‑氧代鸟嘌呤(o8G)氧化修饰。

Description

包含8-氧代鸟嘌呤的RNA干扰诱导核酸、与包含8-氧代鸟嘌呤 的microRNA结合的修饰的核酸及它们的用途
技术领域
本发明涉及包含8-氧代鸟嘌呤的RNA干扰诱导核酸、与包含8-氧代鸟嘌呤的microRNA特异性地结合的修饰的核酸及使用该核酸的药物组合物、重组动物模型、药物筛选方法、疾病诊断方法以及控制病理生理现象的方法。
背景技术
当细胞经历病理生理变化时，通常会发生氧化应激，从而生成活性氧(ROS)。生成的活性氧由于其高反应性而对各种生物结构进行修饰，其中RNA是最容易修饰的。特别是，在氧化修饰的RNA碱基中最容易发生的是，鸟嘌呤(G)碱基被氧化修饰并转化为8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
另一方面，心脏病是包括癌症在内的韩国成年人的三大死因之一，其始于发作过程中的各种病理应激，导致心脏组织大小发生变化并导致心脏肥大。心脏肥大的特征在于心肌细胞大小增加和蛋白质合成速率增加。心脏肥大会逐渐诱发心肌纤维化和心力衰竭(heart failure)，最终导致心功能衰竭(cardiac failure)(或心力衰竭)。特别是，在心力衰竭的情况下，由于50％左右的极高死亡率，正在进行研究以最终预防心脏肥大或者开发心脏肥大的治疗方法，因此有必要为此建立疾病模型。
韩国专利公开第1481007号
公开内容
技术问题
本发明人已经确认，当在microRNA的种子区中因氧化应激而发生鸟嘌呤(G)碱基氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)时，其通过o8G：A排列与目标序列结合，并且还通过鉴定通过microRNA的逆转录产生的cDNA中发生G＞T修饰的位置而确认了在产生的cDNA中发生氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤的位置。因此，确认了当产生其中microRNA中的鸟嘌呤(G)被替换为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA干扰诱导核酸并将其施用于细胞或小鼠时，会诱发各种病理生理现象，并以此为基础，完成本发明。
因此，在本发明中，诱导RNA干扰的核酸双链的至少一条单链的5’端第1至第9个核苷酸提供了包含至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA干扰诱导核酸。
此外，本发明提供了一种用于鉴定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的方法。
此外，本发明提供了一种修饰的核酸和包含编码该修饰的核酸的基因的重组载体，该修饰的核酸与其中5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的microRNA特异性地结合。
此外，本发明提供了一种包含修饰的核酸或重组载体的用于治疗心脏肥大的药物组合物，以及包含RNA干扰诱导核酸的用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物。
另一个实施方式提供了一种包含抗氧化剂作为活性成分的用于预防或治疗心脏肥大的药物组合物，以及用于诊断心脏肥大的信息提供方法。
另一个实施方式提供了一种用于产生抗心脏肥大的动物模型的方法和抗心脏肥大的动物模型。
另一个实施方式提供了一种用于筛选治疗心脏肥大的候选物质的方法。
本发明要实现的技术目的不限于上述目的，本发明所属领域的普通技术人员将通过以下描述清楚地理解其他未提及的目的。
技术方案
本发明提供了一种RNA干扰诱导核酸，其在核酸双链的至少一条单链的5’端第1至第9个核苷酸中包含至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
本发明的一个实施方式提供了一种RNA干扰诱导核酸，其中5’端第1至第9个核苷酸包含microRNA序列。
在本发明的另一个实施方式中，microRNA可以是以下第1组microRNA中的至少一种：
[第1组]
miR-1、miR-184、let-7f-5p、miR-1-3p、miR-122、let-7和miR-124。
在本发明的另一个实施方式中，RNA干扰诱导核酸可以识别靶位点，所述靶位点中o8G：A排列出现在8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置处。
在本发明的另一个实施方式中，核酸双链的至少一条单链可以包含以下第2组多核苷酸中的至少一个：
[第2组]
由SEQ ID NO：1(5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：2(5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：3(5’p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：65(5’p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：66(5’p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；和
由SEQ ID NO：67(5’p-UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’)的碱基序列组成的多核苷酸。
当将根据本发明的RNA干扰诱导核酸注入细胞中或动物体内时，可以诱导心脏肥大、肝癌细胞迁移抑制或凋亡。
本发明提供了一种包含上述RNA干扰诱导核酸和抗氧化剂的组合物。
此外，本发明提供了一种用于鉴定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的方法，包括：
(a)从细胞中提取RNA；
(b)使用抗o8G抗体通过免疫沉淀(IP)从提取的RNA分离包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA；
(c)通过逆转录包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的分离RNA产生cDNA，并产生和测序测序文库用于确定8-氧代鸟嘌呤的位置；和
(d)通过确认作为测序结果的鸟嘌呤(G)经胸腺嘧啶(T)修饰的位置，鉴定鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰的位置。
此外，本发明提供了一种特异性结合microRNA的经修饰的核酸，其中自5′末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰，
其中该修饰的核酸包含与从经修饰的microRNA 5’端第2和第3个核苷酸的任何一个开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，并且
所述经修饰的核酸包含腺嘌呤(A)作为核苷酸，其位于与自所述经修饰的microRNA的5′末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
在本发明的一个实施方式中，在与修饰的核酸特异性地结合的microRNA中，5’端第2、第3或第7个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)可以被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)，并且该修饰的核酸可以包含与从microRNA5’端第2或第3个核苷酸开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，并且腺嘌呤(A)作为核苷酸包括在内，其位于与自所述经修饰的microRNA的5′末端起的第2、第3或第7个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
在本发明的一个实施方式中，修饰的核酸可以包含5’-ACAUUCA-3’(SEQ ID NO：4)、5’-ACAUUAC-3’(SEQ ID NO：5)或5’-AAAUUCC-3’(SEQ ID NO：6)的碱基序列。
此外，本发明提供了一种包含编码上述修饰的核酸的基因的重组载体。
此外，本发明提供了一种用于治疗心脏肥大的药物组合物。该用于治疗心脏肥大的药物组合物包含经修饰的核酸，其与microRNA特异性结合并且其中来自自5′末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰，或包含编码所述经修饰的核酸的基因的重组载体，其中该修饰的核酸包含与从microRNA5’端第2和第3个核苷酸的任何一个开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，以及包含腺嘌呤(A)作为核苷酸，其位于与自所述microRNA的5′末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
在本发明的一个实施方式中，microRNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
作为本发明的一个实施方式，用于治疗心脏肥大的药物组合物还可以包含抗氧化剂。
此外，本发明提供了一种包含RNA干扰诱导核酸的用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物，其包含RNA干扰诱导核酸，所述RNA干扰诱导核酸包含自核酸双链的至少一条单链的5′末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
在本发明的一个实施方式中，在用于治疗肝癌的药物组合物中，microRNA可以是miR-122。
在本发明的另一个实施方式中，在用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物中，microRNA可以是let-7或miR-124。
在本发明的另一个实施方式中，用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物还可以包含抗氧化剂。
此外，本发明提供了一种包含抗氧化剂作为活性成分的用于预防或治疗心脏肥大的药物组合物，
其中该抗氧化剂抑制RNA 5’端第1至第9个核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
在本发明的一个实施方式中，抗氧化剂可以是N-乙酰半胱氨酸(NAC)或丁基羟基茴香醚(BHA)。
在本发明的另一个实施方式中，RNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
此外，本发明提供了一种用于诊断心脏肥大的信息提供方法，包括：
确定在动物心肌细胞中表达的microRNA的核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)是否被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)；和
当microRNA的核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(08G)时，将其分类为心脏肥大。
在本发明的一个实施方式中，核苷酸可以是microRNA 5’端的第1至第9个核苷酸。
在本发明的另一个实施方式中，核苷酸可以是microRNA 5’端的第2、第3或第7个核苷酸。
在本发明的另一个实施方式中，microRNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
此外，本发明提供了一种用于产生抗心脏肥大的非人动物模型的方法，以及通过该方法产生的抗心脏肥大的非人动物模型，包括：
(a)将编码修饰的核酸的基因与启动子可操作地连接以构建重组载体；
(b)将重组载体导入动物的受精卵中；和
(c)将受精卵移植到代孕母体内后产生受精卵以得到转基因动物模型。
此外，本发明提供了一种用于筛选治疗心脏肥大的候选物质的方法，包括：
(a)在心脏肥大动物模型的心肌细胞中处理候选物质；
(b)分析心脏肥大动物模型的心肌细胞中表达的microRNA的核苷酸中鸟嘌呤(G)修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的频率；和
(c)当与未处理的候选物质的情况相比8-氧代鸟嘌呤(o8G)减少时，选择该候选物质作为心脏肥大治疗剂。
在本发明的一个实施方式中，候选物质可以是抗氧化剂。
在本发明的另一个实施方式中，microRNA可以是miR-1。
此外，本发明提供了一种用于抑制心脏肥大的方法，包括将修饰的核酸施用于受试者。
此外，本发明提供了一种用于抑制肝癌转移的方法或用于治疗胶质母细胞瘤的方法，包括将RNA干扰诱导核酸施用于受试者。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗心脏肥大的方法，包括将包含抗氧化剂作为活性成分的组合物施用于受试者。
此外，本发明提供了修饰的核酸用于抑制心脏肥大的用途。
此外，本发明提供了RNA干扰诱导核酸用于抑制肝癌转移和治疗肝癌或胶质母细胞瘤的用途。
此外，本发明提供了包含抗氧化剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗心脏肥大的用途。
本发明还提供了抗氧化剂用于制备用于治疗心脏肥大的药物的用途。
有利作用
根据本发明的RNA干扰诱导核酸以及与其中5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的microRNA特异性地结合的修饰的核酸可以用于控制细胞或动物的病理生理现象。
具体而言，其可以用于心脏肥大、肝癌或胶质母细胞瘤的治疗剂的诊断和开发。
附图说明
图1A是每2日对小鼠(n＝7)腹膜内(I.P)注射75mg/kg异丙肾上腺素(ISO)并持续29天的示意图。
图1B是确认因ISO和NAC处理导致的小鼠心脏大小变化的图。
图1C是确认因ISO处理产生的ROS的RNA氧化作用的图。
图1D是显示在Ago2和o8G的免疫荧光染色中确认在rCMC细胞中同时出现根据PE或ISO处理的microRNA的o8G修饰的结果的图。
图1E是显示在H9c2中根据PE或ISO处理的o8G和Ago2的免疫荧光染色结果的图。
图1F是显示在H9c2和rCMC细胞中使用o8G特异性抗体的斑点印迹分析结果的图。
图1G是显示在PE处理的H9c2细胞(图1G上部)和ISO处理的小鼠心脏(图1G下部)的northwestern分析结果的图。
图1H是显示针对ISO处理的小鼠心脏使用凝胶提取的约20nt miRNA进行斑点印迹分析的结果的图。
图2A显示了o8G测序方法(o8G-miSeq)的示意图。
图2B是显示o8G的免疫沉淀(IP)优化方法的图。
图2C是显示通过优化的IP方法得到的o8G的量的图。
图2D是通过限制酶位点的序列特异性切割间接地(图2D上部)和通过测序直接地(图2D中部和下部)确认氧化的miRNA的cDNA中的G＞T突变的图。
图2E是显示H9c2细胞中的氧化的miRNA的o8G-miSeq结果的图。
图2F是显示H9c2细胞中的火山图分析结果的图。
图2G是显示rCMC细胞中的氧化的miRNA的o8G-miSeq结果的图。
图2H和2I是显示在将rCMC和H9c2细胞暴露于血清缺乏后的o8G-miSeq分析结果的图。
图2J显示了H2O2处理的H9c2细胞中氧化的miRNA的o8G-miSeq结果与Wang JX，2015的比较(Wang，J.X.等人，Oxidative Modification of miR-184Enables It to TargetBcl-xL and Bcl-w，Mol Cell 59，50-61)。
图3A是显示rCMC细胞中通过PE处理氧化诱导的miRNA的o8G的相对量的图。
图3B是显示小鼠心脏中通过ISO处理氧化诱导的miR-1的相对量和o8G IP中的miR-1的量的图。
图3C和3D是通过氧化的miR-1的o8G：A碱基排列确认目标沉默作用的图。
图3E是显示PE或H2O2处理的AC16中具有miR-1氧代位点的荧光素酶报告基因的分析结果的图。
图3F是显示在H9c2细胞中使用流式细胞术分析GFP中具有miR-1 7oxo位点的双荧光蛋白(dFP)报告基因的结果的图。
图3G是显示在H9c2细胞中使用流式细胞术分析在GFP中具有miR-1种子位点的双荧光蛋白(dFP)报告基因的结果的图。
图3H是显示AC16、H9c2、rCMC和小鼠心脏中的miR-1表达的图。
图3I是显示在H9c2细胞中使用流式细胞术分析GFP中具有miR-1 7oxo、3oxo和2oxo位点的双荧光蛋白(dFP)报告基因的结果的图。
图3J是显示H9c2细胞中包含miR-1 7oxo位点的GFP的大小(log10(FSC))和GFP值(log10(GFP))分布的图。
图3K是显示在H9c2细胞中使用流式细胞术进行的dFP报告基因定量结果的图。
图3L是在H92c细胞中使用dFP报告基因测定法确认miR-1：7o8G(RFP：GFP-7oxo与RFP：GFP，NT)的活性的图。
图3M是显示H9c2细胞中根据NAC处理的dFP报告基因分析结果的图。
图3N是显示在H9c2细胞中使用流式细胞术进行的RFP中具有miR-1 7oxo位点的dFP报告基因分析结果的图。
图3O是显示当仅考虑H9c2细胞中具有25％的最低报告值(RFP)的有限细胞群时的dFP报告分析结果的图。
图3P是显示在H9c2细胞中存在2o8G、3o8G、7o8G和miR-1时具有miR-1种子位点的荧光素酶报告基因分析结果的图。
图4A是确认了miR-1表达在PE处理或NAC处理的rCMC细胞中的作用的图。
图4B是确认了根据本发明实施方式用miR-1：o8G(miR-1：2o8G、miR-1：3o8G、miR-1：7o8G)或miR-1：2U、miR-1：3U、miR-1：7U转染的rCMC细胞中的细胞大小的图。
图4C是显示用氧化的miR-1(miR-1：2o8G、miR-1：3o8G、miR-1：7o8G)或miR-1：U(miR-1：2U、miR-1：3U、miR-1：7U)转染的H9c2的显微镜观察结果的图(比例尺，50μm)。
图4D是确认根据本发明实施方式通过PE和NAC处理导致心脏肥大标志物ANP的表达增加的图。
图4E是显示用miR-1：7U转染的H9c2细胞的大小分布的图。
图4F是显示根据本发明实施方式用miR-1：7o8G或miR-1：7U转染的rCMC细胞(图4F上部)和H9c2细胞(图4F下部)的延时图像的图。
图4G显示了当根据本发明实施方式将miR-1：7o8G经由尾静脉注射到小鼠体内时对体内心脏肥大的影响(图4H上部)和通过qPCR定量检查向心脏组织的递送的结果(图4H下部)。
图4H是显示根据本发明实施方式通过体内递送miR-1：7o8G的小鼠心脏的图。
图4I是确认当根据本发明实施方式将miR-1：7o8G注射到小鼠体内时心室间隔(IS)的免疫染色以及心肌细胞和ANP表达的结果的图。
图5A是显示了在靶位点上执行荧光素酶报告基因的结果与其中将miR-122从Huh7去除的细胞(Huh7：miR-122 KO)进行比较的图，其中该靶位点在肝癌细胞Huh7的第2碱基和第3碱基处发生miR-122的o8G修饰时能够被识别。
图5B是显示在胶质瘤细胞HS683中使用针对4氧代位点的荧光素酶报告基因确认存在修饰的let-7的结果的图，其中该位点在let-7的第4碱基被修饰为o8G时能够被识别。
图5C是显示当通过从胶质瘤细胞HS683移除胎牛血清来施加氧化应激时使用针对4氧代位点的荧光素酶报告基因确认存在修饰的mir-124的结果的图，其中该位点在miR-124的第4碱基被修饰为o8G时能够被识别。
图5D是显示当向肝癌细胞Huh7中导入miR-122的o8G氧化修饰时改变了细胞迁移以及在用抗氧化剂处理时miE-122：2，3o8G显示更有效作用的观察结果的图。
图5E是显示当在胶质瘤细胞HS683中导入let-7a：4o8G(其中let-7的第4碱基被修饰为o8G)时确认凋亡功能的结果的图。
图5F是显示当在胶质瘤细胞HS683中导入mir-124：4o8G(其中miR-124的第4碱基被修饰为o8G)时确认凋亡功能的结果的图。
图6A是显示来自人心肌病患者心脏的左心室的Ago HITS-CLIP的结果的图。
图6B是确认Ago-mRNA簇中的o8G：A结合频率的图。
图6C是显示根据本发明实施方式的抗种子和抗7oxo的碱基序列(图6C上部)及萤光素酶报告基因分析结果(图6C下部)的图。
图6D是显示根据一个实施方式的抗7oxo(9x)的miR-1 7oxo目标抑制活性的图。
图6E是确认根据一个实施方式将抗7oxo(4x)导入rCMC中时的心脏肥大抑制作用的图。
图6F是确认根据一个实施方式将抗7oxo(4x)RNA或α-MHC 13x注射到ISO处理的小鼠体内时出现的心脏肥大抑制作用的图。
图6G是确认心肌细胞大小(图6G上部)和miR-1：7o8G目标抑制作用(图6G下部)的图，该作用取决于根据一个实施方式进行的抗7oxo(α-MHC 13x)的施用。
图6H是确认根据一个实施方式施用抗7oxo(4x或13x)对ISO处理的小鼠心脏中ROS的增加有作用的图。
图6I是显示根据一个实施方式的设计用于产生表达抗7oxo(α-MHC 13x)的转化小鼠的重组载体的图。
图6J是确认用图5I的重组载体转化的小鼠中的抗7oxo(13x)的表达的图。
图6K是确认根据一个实施方式的用抗7oxo(13x)转化的小鼠的心脏大小的图。
图6L是确认根据一个实施方式的用抗7oxo(13x)转化的小鼠的miR-1：7o8G目标的总抑制的图。
图6M是确认根据一个实施方式的用抗7oxo(13x)转化的小鼠的心室间隔(IS)中心肌细胞尺寸减小的图。
图6N显示了ROS诱导的miR-1：7o8G的位点特异性氧化及其心脏肥大诱导过程的示意图。
图7A是确认在根据一个实施方式用于获得血浆样本的心脏肥大动物模型中成功诱导心脏肥大的图。
图7B是说明在固定图6A中的血浆样本之后进行实验的过程的图。
图7C是显示心脏肥大组及其对照组的血浆样本中的miRNA-l测量结果的图。
图7D是确认氧化修饰的microRNA-1(miR-1：o8G)在心脏肥大中增加的图，其通过心脏肥大组及其对照组的血浆样本中的o8G免疫沉淀来测量。
图8A是通过免疫染色确认通过抗氧化剂(N-乙酰半胱氨酸，以下称为NAC)处理减少了H9c2细胞中PE诱导的心脏肥大的图。
图8B是示出通过ISO和NAC处理的小鼠超声心动图的结果的图。
图8C是显示根据PE和NAC处理的rCMC和H9c2细胞中o8G的免疫荧光染色结果的图。
图8D是显示通过用BHA和Sigma-Aldrich公司的细胞培养抗氧化剂来处理经PE或ISO处理以诱导心肌细胞肥大的H9c2细胞抑制了心肌细胞肥大的结果的图。
图8E是确认当根据一个实施方式将用于抑制miR-1：7o8G的抗miR-1-7oxo导入用PE处理以诱导心肌细胞肥大的H9c2细胞中时在用抗氧化剂NAC处理的情况下完全抑制了心肌细胞肥大的图。
实施发明的最佳方式
如本文所用，术语“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。这些是核酸序列的单体单元。
在RNA中，糖是核糖，而在DNA中，其是脱氧核糖(缺失了核糖上存在的羟基的糖)。含氮杂环碱基可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的修饰衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的修饰衍生物或类似物。在本发明中，核苷酸的糖为核糖，碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)。
如本文所用，术语“靶位点”是指与microRNA 5’端第2至第8个碱基序列结合的目标碱基序列。
如本文所用，术语“种子区”是指介于microRNA 5’端第1位和第9位之间的碱基序列。
如本文所用，“细胞”的类型可以是脊椎动物，比如包括人类在内的哺乳动物(人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、牛等)，禽类(鸡、鸵鸟等)，两栖动物(蛙等)，以及鱼类或无脊椎动物(比如昆虫(比如蚕类、蛾类、果蝇等))，植物，微生物(比如酵母等)，理想地为包括人类在内的哺乳动物，但不限于对此。
在本发明中，“心脏肥大”是指心肌纤维增大、心脏重量增加、心室壁增厚的状态，其可能是心脏肥大、心力衰竭、心功能衰竭、纤维化、二尖瓣闭锁、主动脉瓣关闭不全、扩张型心肌病、缺血性心脏病、心室间隔缺损、三尖瓣关闭不全、肺功能不全、肺动脉高压、右心室心肌梗塞、累及右心室的心肌病、房间隔缺损、心房颤动、肥厚心肌病或浸润性心肌病的早期症状，但除上述疾病外，若该病与心肌肥厚有关，则不限类型。
如本文所用，术语“重组”指其中细胞复制异源核酸、表达核酸或表达肽、异源肽或由异源核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞可以以有义或反义形式表达在细胞的天然形式中不存在的基因或基因片段。此外，重组细胞可以表达在自然状态下存在于细胞中，但这些基因是经过修饰并通过人工方法重新导入细胞中的。
如本文所用，术语“载体”是指含有可操作地连接到能够影响DNA在合适宿主中表达的合适调节序列的DNA序列的DNA构建体。合适的调节序列可以包括影响转录的启动子、控制转录的任选操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。本发明的载体没有具体限制，只要能够在细胞内复制即可，可以使用本领域公知的任何载体，例如质粒、粘粒、噬菌体颗粒、病毒载体等。
在本发明中，术语“重组载体”可以用作当待表达的目标多肽的编码基因可操作地连接时能够在合适的宿主细胞中高效表达目标多肽的目标多肽的表达载体，并且该重组载体可以在宿主细胞中表达。宿主细胞可以理想地为真核细胞，并且可以根据宿主细胞的类型恰当地选择表达调控序列，比如启动子、终止子、增强子等、用于膜靶向或分泌的序列等，并且可以根据目的以各种方式组合。
在本发明中，术语“启动子”是指作为与转录调节因子结合的DNA碱基序列位点来调节基因表达的核酸序列，其旨在诱导目标基因的过表达。例如，本发明的重组载体可以包括选自αMHC(αMHC)启动子、βMHC(βMHC)启动子、Nkx 2.5启动子、心肌肌钙蛋白T(TNNT2)启动子、肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、人α-骨骼肌动蛋白(HAS)启动子以及可操作地连接以调节心肌细胞特异性表达的鼠干细胞病毒(MSCV)启动子。根据本发明的实施方式，αMHC(αMHC)启动子可以可操作地连接，但启动子的类型不受限制。
在本发明中，术语“心肌细胞特异性”是指在心肌细胞以外的细胞中不表达或表达程度低但在心肌细胞中表达程度非常高的特征。
如本文所用，术语“表达”是指从结构基因产生多肽的过程，并且该过程包括将基因转录成mRNA和将mRNA翻译成多肽。
在本发明中，术语“转化”是指通过以下方式导致的生物体遗传性质的变化：通过将载体形式的DNA直接通过物理化学方式导入细胞中，或通过用病毒感染宿主细胞以表达外源基因，即将基因转入宿主细胞，也就是将基因导入宿主细胞，使其在宿主细胞中表达。
在本发明中，“抗氧化剂”是防止活性氧过度产生的物质，用于防止细胞和组织中的氧化应激。抗氧化剂在细胞中引起有害反应的自由基攻击DNA或氧化脂质之前将其中和。此外，抗氧化剂具有高反应性，与体内有害物质发生反应，防止活性氧引起的连锁反应，从而保护细胞。
在本发明中，“预防”是指通过施用根据本发明的组合物来抑制或延迟目标病理生理现象的发作的任何作用。
在本发明中，“治疗”是指通过施用根据本发明的组合物来改善或有益地改变目标疾病的症状的任何作用。
microRNA(miRNA)是由约21个碱基组成的小分子RNA，其功能是诱导RNA干扰，从而在目标基因的转录后阶段抑制基因表达。microRNA通过主要位于5’端的种子区(第1～8位)的碱基序列识别数以百计的目标mRNA，然后进行碱基排列，并抑制其表达以调控生物学功能。因此，当在microRNA的种子区域发生鸟嘌呤(G)修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)时，通过因此启用的o8G：A碱基排列，可能会因为与其他mRNA的碱基排列抑制新的靶点，从而调节其他病理生理功能。
换言之，在种子区域中发生的氧化修饰可能是一种通过自然或病理性发生的microRNA来调节靶点识别的机制，在此基础上，有可能开发一种能够人为诱导或抑制病理生理学功能的技术。此前已知，RNA中的8-氧代鸟嘌呤修饰主要发生在与人体衰老过程(退行性疾病)相关的一组疾病(退行性疾病)中，心脏病也与此密切相关。因此，基于8-氧代鸟嘌呤修饰的核酸体具有调节多种疾病的潜力。
本发明提供了一种RNA干扰诱导核酸，其在核酸双链的至少一条单链的5’端第1至第9个核苷酸中包含至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
在核酸双链的一条单链中，5’端的第1至第9个核苷酸可以包含至少一个8-氧代鸟嘌呤，并且核酸双链的两条链，即两条单链都可以在5’端的第1至第9个核苷酸中包含至少一个8-氧代鸟嘌呤。
RNA干扰诱导核酸可以选自microRNA、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、DsiRNA、lsiRNA、ss-siRNA、piRNA、endo-siRNA和asiRNA，但不不限于以上类型，只要其是诱导RNA干扰的核酸即可。
例如，5’端第1至第9个核苷酸可以包含microRNA序列。
例如，microRNA可以是第1组的一种或多种microRNA：
[第1组]
miR-1、miR-184、let-7f-5p、miR-1-3p、miR-122、let-7和miR-124。
例如，microRNA可以是miR-1、miR-122、let-7或miR-124。
例如，8-氧代鸟嘌呤(o8G)可以存在于对应于microRNA 5’端第2、第3、第4、第7位或其组合的位置。
例如，RNA干扰诱导核酸的核酸双链的至少一条单链可以包含miR-1 5’端的第1至第9个核苷酸，其中至少一个鸟嘌呤(G)可以被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换，例如，8-氧代鸟嘌呤(o8G)可以存在于对应于miR-1 5’端第2、3和7位处或其组合。
例如，RNA干扰诱导核酸的核酸双链的至少一条单链可以包含miR-122 5’端的第1至第9个核苷酸，其中至少一个鸟嘌呤(G)可以被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换，例如，8-氧代鸟嘌呤(o8G)可以存在于对应于miR-122 5’端第2位和第3位处或其组合。
例如，RNA干扰诱导核酸的核酸双链的至少一条单链可以包含let-7或miR-124 5’端的第1至第9个核苷酸，其中至少一个鸟嘌呤(G)可以被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换，例如，8-氧代鸟嘌呤(o8G)可以存在于对应于let-7或miR-124 5’端第4位处。
在RNA干扰诱导核酸中，在8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置发生o8G：A排列以识别靶位点。
例如，RNA干扰诱导核酸可以包括以下第2组的一种或多种多核苷酸：
[第2组]
由SEQ ID NO：1(5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：2(5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：3(5’p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：65(5’p-Uo8Go8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；
由SEQ ID NO：66(5’p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’)的碱基序列组成的多核苷酸；和
由SEQ ID NO：67(5’p-UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’)的碱基序列组成的多核苷酸。
当将上述RNA干扰诱导核酸注射到细胞中或动物体内时，可以控制各种病理生理现象，例如，可以诱导心脏肥大、肝癌细胞迁移抑制或凋亡。
例如，包含miR-1 5’端第1至第9个核苷酸且其中至少一个鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换的RNA干扰诱导核酸在注入细胞中或动物体内时可诱导心脏肥大。
例如，当包含miR-1225’端第1至第9个核苷酸且其中至少一个鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换的RNA干扰诱导核酸被注射到肝癌细胞中时，可以诱导肝癌细胞迁移的抑制。
例如，当包含let-7或miR-1245’端第1至第9个核苷酸且其中至少一个鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换的RNA干扰诱导核酸被注射到胶质瘤细胞中时，可能会诱导凋亡。
本发明提供一种包含上述RNA干扰诱导核酸和抗氧化剂的组合物。
抗氧化剂可以阻止RNA干扰诱导核酸的进一步氧化，即阻止额外的鸟嘌呤(G)氧化成8-氧代鸟嘌呤(o8G)，从而使RNA干扰诱导核酸可以更有效地控制病理生理现象。作为抗氧化剂，可以使用本领域常用的所有抗氧化剂。
此外，本发明提供了一种鉴定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的方法，包括：
(a)从细胞中提取RNA；
(b)使用抗o8G抗体通过免疫沉淀(IP)从提取的RNA分离包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA；
(c)通过对分离的包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA进行逆转录以产生cDNA，产生用于确定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的测序文库并对该文库进行测序；和
(d)通过根据测序结果确认鸟嘌呤(G)被修饰为胸腺嘧啶(T)的位置来鉴定鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置。
与通过对RNA进行逆转录以制备cDNA并对其进行测序来鉴定位置的现有方法相比，该用于鉴定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的方法可以更准确地鉴定鸟嘌呤(G)修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置。
此外，本发明提供了一种修饰的核酸，该修饰的核酸与其中5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的microRNA特异性地结合。
修饰的核酸可以包括与从修饰的microRNA的5’端第2和第3个核苷酸的任何一个开始的6个或更多个(例如6个、7个或8个)连续多核苷酸互补的多核苷酸，并且
可以包含腺嘌呤(A)作为在与修饰的microRNA 5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置处的核苷酸。
例如，修饰的核酸可以与其中5’端第2、第3或第7个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的microRNA特异性地结合。
修饰的核酸可以包括与从修饰的microRNA 5’端第2或第3个核苷酸开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，并且
可以包含腺嘌呤(A)作为在与修饰的microRNA 5’端第2、第3或第7个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置处的核苷酸。
例如，修饰的核酸可以包括5’-ACAUUCA-3’、5’-ACAUUAC-3’和5’-AAAAUUCC-3’中的至少一个碱基序列，但不限于此。
此外，本发明提供了一种包含编码上述修饰的核酸的基因的重组载体。
重组载体可以包括DNA，该DNA可以包含与本发明的用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的多核苷酸互补的多核苷酸。例如，当用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的碱基是腺嘌呤(A)时，其可以包含胸腺嘧啶(T)碱基，当用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的碱基是鸟嘌呤(G)时，其可以包含胞嘧啶(C)碱基，当用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的碱基是胞嘧啶(C)时，其可以包含鸟嘌呤(G)碱基，当用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的碱基时是尿嘧啶(U)，其可以包含腺嘌呤(A)碱基。
此外，本发明提供了一种包含上述修饰的核酸或重组载体的用于治疗心脏肥大的药物组合物。
例如，用于治疗心脏肥大的药物组合物可以包含与其中5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)可以被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的microRNA特异性地结合的修饰的核酸。
与修饰的核酸特异性地结合的修饰的microRNA可以是其中对miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p中的任何一个进行修饰的microRNA。
修饰的microRNA可以是其中例如对应于miR-1 5’端第2、第3和第7位或其组合的位置处的鸟嘌呤(G)经过修饰的修饰的miR-1。
例如，用于治疗心脏肥大的药物组合物可以进一步包含抗氧化剂。作为抗氧化剂，可以使用本领域常用的所有抗氧化剂，例如NAC、BAH，或者还可以使用用于细胞培养的抗氧化剂(A1345；Sigma-Aldrich公司)，但不限于此。
此外，本发明可以提供一种包含上述RNA干扰诱导核酸的用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物。
例如，用于治疗肝癌的药物组合物可以包含如下的RNA干扰诱导核酸：其中核酸双链中的至少一条单链可以包含miR-1225’端第1至第9个核苷酸并且其中至少一个鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换。
例如，RNA干扰诱导核酸可以包含含有如下碱基序列的单链：其中miR-1225’端第1至第9个核苷酸的5’端第2和第3位处的鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)取代。
例如，用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物可以包含如下的RNA干扰诱导核酸：其中核酸双链中的至少一条单链可以包含let-7或miR-1245’端第1至第9个核苷酸且其中至少一个鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换。
例如，RNA干扰诱导核酸可以包括含有如下碱基序列的单链：其中位于let-7或miR-1245’端第1至第9个核苷酸的5’端第4位的鸟嘌呤(G)被8-氧代鸟嘌呤(o8G)替换。
例如，用于治疗肝癌的药物组合物除了RNA干扰诱导核酸之外还可以包含抗氧化剂，用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物除了RNA干扰诱导核酸之外还可以包含抗氧化剂。抗氧化剂是指通常使用的抗氧化剂，例如NAC和BAH，或者可以使用用于细胞培养的抗氧化剂(A1345；Sigma-Aldrich公司)，但不限于此。
用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物还包含抗氧化剂，从而防止RNA干扰诱导核酸中的其他鸟嘌呤(G)被细胞中的活性氧进一步氧化，从而使其功能最大化。
本发明的药物组合物可以按照常规方法配制成各种形式。例如，其可以配制成口服剂型，比如粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳液剂、糖浆剂、乳膏剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、wamings、洗剂、搽剂、pastas，或者其可以以皮肤外用制备物(比如糊剂等)、栓剂和无菌注射液的形式配制和施用。
根据本发明的药物组合物可以进一步包括通常用于制备药物组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。在这种情况下，组合物中包含的载体、赋形剂和稀释剂可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、寡糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。在配制剂的情况下，其是使用常用的稀释剂或赋形剂(比如填料、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂等)制备的。用于口服施用的固体配制剂可以包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等，这些固体配制剂可以在提取物中包含至少一种赋形剂，例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂外，还使用了比如硬脂酸镁滑石粉等润滑剂。除了常用的简单稀释剂水和液体石蜡、各种赋形剂(例如、湿润剂、增甜剂、香料、防腐剂等)之外，用于口服使用的液体配制剂还可以包括混悬剂、内服溶液、乳液剂、糖浆剂等。用于肠胃外施用的配制剂可以包括无菌的水溶液、非水溶液、混悬剂、乳液剂、冻干配制剂和栓剂。非水溶剂和悬浮剂可以包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油以及可注射酯如油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用Witepsol、聚乙二醇、吐温61、可可脂、月桂脂、甘油明胶等。
本发明的药物组合物可以根据需要的方法来口服或肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部应用)，并且剂量可以取决于患者状况和体重以及疾病程度、取决于药物形式以及施用路线和时间而变，但可以由本领域技术人员恰当地选择。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。在本发明中，“药学有效量”是指足以以适用于医学治疗的合理收益/风险比治疗疾病的量，有效剂量水平根据包括类型、严重程度、药物活性和患者疾病类型、对药物的敏感性、施用时间、施用途径和排泄率、治疗周期、同时用药以及医学领域中熟知的其他因素在内的多种因素来确定。根据本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂施用或可以与其他治疗剂组合施用，可以与常规治疗剂顺序或同时施用，并且可以单独或多次施用。考虑到所有上述因素，重要的是施用能够以最小量获得最大作用且没有副作用的量，这可以由本领域技术人员容易地确定。可以一天进行一次施用，或者可以以若干分开的剂量施用。
此外，本发明提供了一种包含抗氧化剂作为活性成分的用于预防或治疗心脏肥大的药物组合物，其中该抗氧化剂抑制microRNA 5’端第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
在本发明中，抗氧化剂用于抑制鸟嘌呤(G)碱基氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)，抗氧化剂可以是例如选自N-乙酰半胱氨酸(NAC)、丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸(维生素C)、谷胱甘肽、尿酸盐、胆红素、维生素E、类胡萝卜素、泛醌(ubizuinol，Co-Q10)、黄酮、抗氧化酶、SOD(超氧化物歧化酶)、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽转移酶、SOD模拟物(CuDIOS)、依布硒啉、lazaroids(21-氨基类固醇)、captodative烯烃、α-硫辛酸和二氢硫辛酸(DHLA)、5-HTP(羟色氨酸)、DHEA(脱氢表雄酮)、氨基酸、草本抗氧化剂和矿物质中的至少一种，根据本发明的实施方式，抗氧化剂可以是N-乙酰半胱氨酸(NAC)或丁基化羟基茴香醚(BHA)，但本发明不限于抗氧化剂的类型。
例如，microRNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
此外，本发明提供了一种用于诊断心脏肥大的信息提供方法，包括：
确定从动物心肌细胞分离的microRNA的核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)是否被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)；和
当microRNA的核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)时，分类为心脏肥大，
在本发明中，“诊断”是指确认病理状态的存在或特征。为本发明的目的，诊断是确定是否已经发生心脏肥大。
例如，核苷酸可以是microRNA 5’端的第1至第9个核苷酸。
例如，核苷酸可以是microRNA 5’端的第2、第3或第7个核苷酸。
例如，microRNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
此外，本发明提供了一种用于产生抗心脏肥大的非人动物模型的方法和通过该方法产生的抗心脏肥大的非人动物模型，其中该方法包括：
(a)可操作地将编码用于抑制心脏肥大的修饰的核酸的基因与启动子连接以构建重组载体；
(b)将重组载体导入动物的受精卵；和
(c)将受精卵移植到代孕母体内后产生受精卵以得到转基因动物模型。
例如，microRNA可以是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p，例如miR-1。
例如，动物可以是非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、兔子、马或牛。
根据本发明的实施方式，动物可以是小鼠，但如果是人以外的哺乳动物，则其种类没有特别限定。
在本发明中，将载体形式的DNA导入细胞的方法没有特别限制，并且可以例如通过以下方式进行：核转染，瞬时转染，细胞融合，脂质体介导转染，聚凝胺介导转染，磷酸钙转染(Graham，FL等人，Virology，52：456(1973))，DEAE葡聚糖转染，显微注射转染(Capecchi，MR，Cell，22：479(1980))，阳离子脂质转染(Wong，TK等人，Gene，1O：87(1980))，电穿孔(Neumann E等人，EMBO)J，1：841(1982))，转导或转染，或者如Basic Methods inMolecular Biology，Davis等人，1986和Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Davis等人，(1986)中描述的本领域技术人员熟知的方法。
此外，本发明提供了一种用于筛选用于治疗心脏肥大的候选物质的方法，包括：
(a)在心脏肥大动物模型的心肌细胞中处理候选物质；
(b)分析心脏肥大动物模型心肌细胞中表达的microRNA的核苷酸中鸟嘌呤(G)被修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的频率；和
(c)当与未处理的候选物质的情况相比8-氧代鸟嘌呤(o8G)减少时，选择该候选物质作为心脏肥大治疗剂。
在本发明中，候选物质是指用于筛选以检验其是否影响心脏肥大动物模型心肌细胞中多核苷酸与o8G：A排列靶位点的结合频率的未知物质，并且可以包括化学品、蛋白质、(多)核苷酸、反义RNA、siRNA(小干扰RNA)或天然产物提取物等，但不限于此。
在本发明中，候选物质可以是抗氧化剂，但不限于此。
此外，本发明提供了一种用于抑制心脏肥大的方法，该方法包括将修饰的核酸施用于个体。
此外，本发明提供了一种用于抑制肝癌转移或治疗胶质母细胞瘤的方法，该方法包括将RNA干扰诱导核酸施用于个体。
此外，本发明提供了一种用于预防或治疗心脏肥大的方法，该方法包括将包含抗氧化剂作为活性成分的组合物施用于个体。
在本发明中，“个体”是指需要施用包含用于抑制心脏肥大的修饰的核酸或RNA干扰诱导核酸或用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的抗氧化剂的组合物的受试者，更具体而言，是指哺乳动物，比如人或非人灵长类动物、小鼠、狗、猫、马和牛。
在本发明中，“施用”是指将本发明的包含用于抑制心脏肥大的修饰的核酸或用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的RNA干扰诱导核酸或抗氧化剂的组合物以任何合适的方式给予个体。
此外，本发明提供了修饰的核酸用于抑制心脏肥大的用途。
此外，本发明提供了RNA干扰诱导核酸用于抑制肝癌转移和治疗肝癌或胶质母细胞瘤的用途。
此外，本发明提供了包含抗氧化剂作为活性成分的组合物用于预防或治疗心脏肥大的用途。
具体实施方式
在下文中，提出优选的实施例以帮助理解本发明。然而，提供以下实施例仅为了更容易理解本发明，本发明的内容不受以下实施例的限制。
实施例1.细胞培养、药物处理及转染
1.细胞培养
大鼠心肌细胞系H9c2(H9c2(2-1)，ATCC CRL-1446；H9c2，韩国细胞系库)、人心室心肌细胞系AC16(由J.Han、H.W.Lee和W.J.Park提供)和人宫颈腺癌细胞线HeLa(ATCC CCL-2)在37℃和5％CO2培养条件下在补充有10％胎牛血清(FBS；Gibco)、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Welgene)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM；Hyclone)中生长。
为了结果的一致性，使用了在两个不同设施(ATCC和韩国细胞系库)下维持的几个不同批次的H9c2，并且从衍生自Dr.M.M.Davidson(scc109，Millipore)的不同批次中的每一个中获得了AC16。
根据制造商的方案，使用Neomyt试剂盒(nc-6031；Cellutron)制备大鼠新生心肌细胞(rCMC)的原代培养物，如Seok，H.Y.et al.Circ Res 114，1585-1595和Huang，Z.P.etal.Circ Res 112，1234-1243中所述。
即在出生后第1天(P1)收集衍生自Sprague Dawley大鼠心脏的心室组织，清洗并切成3至4mm块，并在50ml烧瓶中在37℃下搅动，并且将衍生自心室切片的细胞通过重复的酶促反应完全分离(溶液由Neomyt试剂盒提供)。使用滤网从获得的上清液中去除未消化的组织，然后铺板2小时以去除容易附着的非心肌细胞。最后，收获非粘附性rCMC，并在SureCoat(sc-9035；Cellutron)培养板中用10％FBS(Gibco)、5％马血清(HS；Welgene)、2％L-谷氨酰胺(Welgene)、0.1mM 5-溴-2’-脱氧尿苷(Sigma-Aldrich)、100U ml-1青霉素以及补充有100μg ml-1链霉素(Welgene)的DMEM：M199(Welgene)的4∶1混合物处理。
2.药物处理
为了诱导肾上腺素能肥大，除非另有说明，rCMC、H9c2或AC16通常用200μM去氧肾上腺素(PE)或10PM异丙肾上腺素(ISO)处理，并在处理后48小时进行测试。由于血清缺乏也用作心肌肥大的预处理条件，因此在处理前24小时更换不含FBS和HS的相同培养基。对于抗氧化剂处理，在PE或ISO处理期间应用2mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)。
3.转染
通常，根据制造商提供的通用方案，使用Lipofectamine 2000或3000(Invitrogen)将具有双miRNA的载体转染或共转染到H9c2、AC16、rCMC或HeLa细胞中，而使用RNAiMAX(Invitrogen)或Lipofectamine 3000(Invitrogen)进行miRNA或miRNA抑制剂(50nM)的转染。为了实现最大效率，使用Countess II自动细胞计数器(Invitrogen)计数正确数量的细胞，并在转染前将其等分到板中。
实施例2.ROS和细胞大小测量
对于细胞ROS水平的定量测量，流式细胞术基于ROS荧光染料，并使用Muse CellAnalyzer(Milipore)与Muse Oxidative Stress Kit(Milipore)应用二氢乙锭(DHE)。即，在药物处理前一天，以106个细胞/6孔板的密度等分H9c2或AC16细胞。在处理后10分钟至48小时，根据制造商的方案重复(n＝3)后收获、固定、染色和测量细胞。为了分析，对等分数量的细胞(n＝10,000)进行了ROS水平和细胞大小的定量。根据制造商的方案将前向散射光(FSC)测量为细胞大小(log10(FSC)，y轴；肥大，细胞大小＞3)。
为了确定心脏组织裂解物中ROS的量，使用了CM-H2DCFDA(Invitrogen)。使用Qubit Protein Assay Kit(Invitrogen)对在补充有蛋白酶抑制剂(cOmplete，Mini，无EDTA；Roche)和2.5mM甲磺酸去铁胺(DFOM；Sigma-A1drich)的1x RIPA裂解缓冲液中制备的均质裂解物进行蛋白质定量。将100μg裂解物用2μM CM-H2DCFDA在黑暗中在37℃下温育30分钟。荧光信号由Qubit 2.0荧光计(Invitrogen)检测。
为了可视化细胞ROS水平，使用了DHE(Invitrogen)。最初，将H9c2细胞血清饥饿24小时并用100μM PE处理直到指定的时间点。然后，将收获的细胞用无血清DMEM清洗并用10μM DHE在37℃温育10分钟，同时避光，并且温育后，再次用无血清DMEM清洗细胞。使用倒置荧光显微镜(Leica DMi8)获得ROS图像。
实施例3.免疫荧光染色
H9c2或rCMC在室温下用4％多聚甲醛(PFA；Biosesang)固定15分钟。在用含有0.1％NP-40(Sigma-Aldrich)的PBS(Biosesang)清洗两次后，在添加5％牛血清白蛋白(BSA；Bovogen)的情况下将样品在室温下温育1小时。然后，清洗两次，并且一抗在以下条件下温育；在具有0.1％NP-40和3％BSA的PBS中4℃下过夜；MF20(1∶1000，Developmentalhybridoma)、o8G(15A3，1∶1000，QED Bioscience)和Ago2(ab5072，1∶200，Abcam)。DAPI(1.5μg/ml，Vectorlab)用于核染色。由于H9c2心肌细胞的命运异质性程度不同(尽管所有H9c2细胞与心肌细胞在同一谱系中)，使用MF20对心肌细胞进行染色。对于RNase处理，在温育一抗之前在室温下使用10μg/ml RNaseA(Invitrogen)15分钟，Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(1∶1000，Abcam)和Alexa Fluor 594驴抗兔IgG(1∶1000，Abcam)在含有0.1％NP-40的PBS中用作二抗在室温下持续1小时。用倒置荧光显微镜(Leica DMi8)检查染色的细胞，用LeicaApplication Suite(LAS)分析，并用ImageJ(≥100个细胞，https：//imagej.nih.gov/)进行定量。
实施例4.细胞大小测量
使用ImageJ 1.51s软件(https：//imagej.nih.gov/)中的“测量”功能对来自培养物或组织切片的细胞大小进行定量。将所有图像转换为2560x1962像素的大小，相当于35.56x26.67英寸2，以便在多个图像之间进行一致的比较。然后，以英寸2(71.9像素/英寸)为单位测量转换图像中的细胞面积并用于下一次分析。
实施例5.RNA合成和修饰
使用来自TriLink Biotechnologies(美国)、Integrated DNA Technologies(美国)、ST Pharm(韩国)和Bioneer(韩国)的定制合成和修饰服务以生产具有各种修饰的RNA，并对其质量进行监测和确认。
将核糖核苷酸中的8-氧鸟嘌呤(o8G)引入miR-1(5’p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’；SEQ ID NO：7)的指定位置；miR-1：7o8G，5’p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ IDNO：3)；miR-1：2o8G，5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ ID NO：1)；和miR-1：3o8G，5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ ID NO：2)。
通过与合成的miR-1过客链(passenger strand)(5’p-ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA-3’(SEQ ID NO：8)，当确认转移时，将异硫氰酸荧光素(FITC)附接到5’-末端)退火，在以下条件下在体外产生含有氧化衍生物的miR-1双链体；90℃持续2分钟，30℃持续1小时，以及4℃持续5分钟。
此外，将核糖核苷酸中的8-氧鸟嘌呤(o8G)引入miR-122(5’p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’；SEQ ID NO：68)、let-7(5’-pUGAGUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’；SEQ ID NO：69)和miR-124(5’-p UAAGGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’；SEQ ID NO：70)的指定位置，如下：miR-122：2，3o8G，5’p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’(SEQ ID NO：65)；let-74o8G：5’p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’(SEQ ID NO：66)；miR-124：4o8G，和5’-pUAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’(SEQ ID NO：67)。
以与miR-1双链体相同的方法制备含有氧化衍生物的miR-122、let-7和miR-124的双链体。
还合成了在指定位置含有G＞U取代的miR-1(miR-1：2GU，5’p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ ID NO：9)；miR-1：3GU，5’p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ ID NO：10)；miR-1：7GU，和5’p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3’(SEQ ID NO：11))并与miR-1的过客链形成双链体。作为对照miRNA，将衍生自cel-miR-67(由D.Dharmacon提供为阴性对照的秀丽隐杆线虫特异性miRNA)的非靶miRNA(NT)(5’-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUA-3’；SEQ ID NO：12)合成为siRNA并用作双链体(向导链：5’p-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAdTdT-3’(SEQ ID NO：13)，过客链：5’p-UACUCUUUCUAGGAGGUUGUGAdTdT-3’(SEQ ID NO：14)，‘dT’代表胸苷脱氧核苷酸)。当排除种子介导的脱靶效应时，NT被进一步修饰以包含向导链和过客链中第6位处的dSpacer(无碱基脱氧核苷酸；
Figure BDA0003774195810000261
)，或如先前报道的在第1位和第2位处的2’-O-甲基。
为了确认o8G诱导的G＞T突变，39-oxo-R(o8G；5’-CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUo8GCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3’；SEQ ID NO：15)，其可能在RT-PCR期间通过o8G：A碱基结合生成EcoR1位点；并合成了的39R(G；5’-CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUGCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3’；SEQID NO：16)作为其对照。作为加标对照(spike-in control)，合成了o8G加标(5’p-Uo8Go8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’；SEQ ID NO：17)，G加标(5’p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’；SEQ ID NO：18)，和miRNA：o8G突入(5’p-UAAGo8GCACGCGGUGAAUGCCAA-3’；SEQ ID NO：19)。
对于竞争性miR-1和miR-1：7o8G抑制剂，合成了抗种子(2x：
Figure BDA0003774195810000271
(5’-ACAUUCC-3’是miR-1种子位点；SEQ ID NO：20))，抗7oxo(2x：
Figure BDA0003774195810000272
4x：5’-dTAAAUUCCAAAUUCCAGAAAUUCCACAAAUUCCAdT-3’，9x：
Figure BDA0003774195810000273
‘dN’代表脱氧核苷酸A、T、C或G(5’-AAAUUCC-3’是miR-1 7oxo位点；SEQ ID NO：6))，cont(抗NT；2x：
Figure BDA0003774195810000274
4x：5’-dTGGUUGUGGGUUGUGAGGGUUGUGACGGUUGUGAdT-3’，9x：
Figure BDA0003774195810000275
Figure BDA0003774195810000276
(5’-GGUUGUG-3’是cont NT位点；SEQ ID NO：21)。在抑制剂的5’-和3’-末端，有意附接“dT”或“dN”，有助于RNA稳定性。通过将脱碱基脱氧核苷酸
Figure BDA0003774195810000277
引入抗种子(2x)或抗7oxo(2x)中的靶位点接合处以通过接合处的推定序列防止脱靶效应，证实与没有脱碱基脱氧核苷酸的抑制剂的表型没有差异。序列中的下划线指示相应的靶抑制位点。
实施例6.RNA提取
使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)分离小(＜-200nt)和大(＞-200nt)RNA级分以根据制造商提供的方案根据大小纯化RNA。对于心脏组织样品，如先前报道，在补充有2.5mMDFOM(Sigma-Aldrich)的700μl Qiazol Lysis Reagent(Qiagen)存在下使用MinilysPersonal Homogenizer(Bertin)或玻璃均质器，以防止体外氧化。对于总RNA纯化，在添加20％氯仿(Merck)后，仅使用具有2.5mM DFOM的Qiazol Lysis Reagent，然后用异丙醇沉淀RNA，并用RQ1 RNase free DNase处理(37℃下30分钟；热灭活终止溶液，65℃持续10分钟；Promega)。为了准确定量RNA，使用了分光光度计(Denovix)和Qubit荧光定量(Invitrogen)。
为了纯化miRNA，从总RNA中进行了约20nt的凝胶提取。在凝胶上样缓冲液II(90℃下2分钟；Ambion)中变性的总RNA通过具有约20nt miRNA标志物(合成的miR-1)的标识的15％Urea-PAGE凝胶分离，并且其大小用14到30个ssRNA梯标志物(Takara)交叉确认。然后，在用SYBR Gold染色后，从凝胶上切下约20nt大小，在恒温混匀仪(Thriller，Peqlab)中用凝胶提取缓冲液(0.5M醋酸铵、10mM醋酸镁、0.1％SDS、1mM EDTA，pH8.0)在65℃下温育过夜，并用Oligo Clean&Concentrator试剂盒(Zymo)进一步纯化。
实施例7.通过ELISA进行o8G的定量
根据制造商的方案，使用OxiSelect Oxidative RNA Damage ELISA试剂盒(CellBiolabs)进行o8G的比色检测和定量。作为样品制备，纯化的小RNA或大RNA(0.4-5μg)在37℃下用核酸酶P1(Wako)处理1小时，通过乙醇沉淀提取，并添加以竞争o8G/BSA缀合物用于结合抗o8G抗体，预先包被在板上，然后与试剂盒中提供的HRP缀合二抗反应进行检测。用分光光度计(450nm，GloMax-Multi Detection System；Promega)测量样品的吸光度，通过与预定的o8G标准曲线比较估计o8G的浓度并表示为相对量。
实施例8.药物处理
所有实验规程均经韩国大学实验动物指导委员会批准，并按照动物保护和实验动物使用指南进行。为了诱导肾上腺素能心脏肥大，每2天通过腹膜内注射(IP)向8至12周龄雄性C57BL/6J小鼠(Koatech)施用ISO(75mg/kg)，共29天。
作为模拟注射对照，使用等体积的PBS，并施用100mg/kg NAC以研究抗氧化作用。根据注射的药物将小鼠分组(每个组n＝4，并根据先前研究中使用的最小数量来选择样品量(Lee，H.S.et al.Nature Communications 6，10154))：模拟品(Mock)、ISO、ISO+NAC和NAC。第一次注射后29天，通过测量每个心脏重量(HW)、体重(BW)和胫骨长度(TL)收集心脏组织，并将HW/BW或HW/TL用作归一化心脏大小。所有样品均在-80℃下贮存，直到分析ROS测量、CLEAR-CLIP和RNA提取，然后是o8G ELISA、斑点印迹、Northwestern、IP和qPCR。对于百草枯(Sigma-Aldrich)处理，每周通过IP向小鼠施用10mg/kg百草枯，共4周。然后，提取RNA并用于ELISA。在RNA-Seq的情况下，在第1、3和5天IP注射ISO 3次，并在一周后处死小鼠(n＝3)，并注射相同体积的PBS作为对照。所有样品均在-80℃下贮存，直到用于构建RNA-Seq文库和qPCR分析。
实施例9.超声心动图
超声心动图在三星医疗中心动物成像核心设施的控制下进行监测和记录。具体地，小鼠最初暴露于2％至5％异氟烷以诱导麻醉，并用1％的异氟醚维持同时测量超声心动图(Visual Sonics Vevo 2100Imaging System)约5分钟。在M模式跟踪下，应用2D短轴来固定单个记录位置，即小鼠的乳头区域。测量心率，包括舒张期和收缩期壁厚、左心室(LV)尺寸以及LV舒张末期和收缩末期腔室尺寸。
实施例10.斑点印迹和Northwestern印迹分析
对于斑点印迹，将大小特异性RNA(80-300ng)或凝胶纯化的miRNA(50ng)在Zeta-Probe印迹膜(Bio-Rad)上绘图，并通过UV照射在Spectrolinker XL-1000(Spectroline)上用最佳交联(120mJ/cm2)选项进行交联。对于Northwestern印迹，总RNA在凝胶上样缓冲液II中变性(90℃下2分钟；Ambion)，使用22nt miRNA大小标志物(合成的miR-1)用15％NovexTBE-Urea凝胶(Invitrogen)分离，转移到Zeta-Probe印迹膜上，并用UV(120mJ/cm2，Spectrolinker XL-1000)交联。将膜在室温下用1x TBST(Biosesang)和5％BSA封闭1小时，然后在1x TBST中与抗o8G抗体(15A3，1∶2000；QED Bioscience)在室温下温育1小时。然后，在室温下在TBST中使用HRP-缀合的山羊抗小鼠IgG(1∶5000，Pierce)1小时，然后与ECL(SuperSignal West Pico PLUS，Pierce)反应用于检测。当使用荧光团缀合二抗(AlexaFluor 680山羊抗小鼠IgG，在1xTBST中1∶15000，Invitrogen)时，阻断剂FL FluorescenceBlocking Buffer用于阻断和与抗o8G抗体温育。荧光信号由iBright FL100成像系统(Invitrogen)直接定量，并计算为相对于由SYBR Gold(1∶10000，Invitrogen)染色为斑点的RNA总量的强度。
实施例11.o8G免疫沉淀(IP)的优化
为了优化o8G针对抗o8G抗体(15A3，QED Bioscience)的免疫沉淀(IP)条件，o8G加标(5’p-Uo8Go8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)，合成的20nt长度的含有两个o8G碱基的RNA)与没有o8G的G加标(5’p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)进行比较。为了制备附有抗o8G抗体的珠，将2.5μg的抗o8G抗体(15A3，QED Bioscience)在25μl Dynabeads Protein G(Invitrogen)和200μl PBS中在室温下温育1小时。为了防止抗o8G抗体的非特异性相互作用，在珠制备过程中还测试了添加250μg脱氧鸟苷(dG，Sigma-Aldrich)。对于清洗和纯化，使用DynaMag-2磁体(Invitrogen)分离Dynabeads Protein G。用PBS清洗珠3次后，检查用于o8G与G加标(10pg或100pg，在300ng小RNA存在下)的不同条件的IP缓冲液；含有0.04％NP-40的PBS；低洗涤剂，含有0.004％NP-40的PBS；高洗涤剂，PXL(PBS，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐，0.5％NP-40)。作为参考，所有IP过程在2.5mM DFOM和40U重组RNase抑制剂(Takara)存在下在4℃下进行2小时。
还测试了清洗缓冲液的其他条件；高洗涤剂，IP缓冲液(2次)＞PXL(4次)＞PBS(2次)；添加盐，补充有100mM NaCl的PBS(3次)＞PBS(5次)；用高盐连续清洗，TE(15mM Tris-HCl pH7.5，5mM EDTA)＞含有高洗涤剂(1％TritonX-100、1％脱氧胆酸盐、0.1％SDS和2.5mM EGTA)和高盐(1M NaCl)的TE＞含有高洗涤剂和盐(120mM NaCl)的TE＞清洗缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5，1mM MgCl，150mM NaCl，0.05％NP-40)；用极盐连续清洗，TE＞含有高洗涤剂和高盐的TE＞含有高洗涤剂和极盐(2M NaCl)的TE＞含有高洗涤剂和盐的TE＞清洗缓冲液。使用700μl的补充有2.5mM DFOM和20％氯仿的Qiazol Lysis Reagent纯化珠中的RNA，并使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo)。由于加标对照的大小为22nt，通过miRNA的定量RT-PCR(qPCR)测量o8G加标和G加标的量，并使用它们的相对比率来估计信号：IP过程中的噪音。
实施例12.miRNA的定量RT-PCR(qRT-PCR)
为了定量miRNA，使用了miRNA qPCR方法或TaqMan MicroRNA测定法(AppliedBiosystems)。具体而言，使用Poly(A)Polymerase(Ambion)将1μg小RNA或通过miRNeasyMini Kit(Qiagen)纯化的IP纯化RNA聚腺苷酸化，总体积为10μl。随后，使用SuperScriptIII逆转录酶(Invitrogen)连同2μM寡核苷酸(dT)衔接物引物(5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTTTVN-3’；SEQ ID NO：22)对多腺苷酸化RNA进行逆转录。qPCR反应在SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)中用正向(与靶miRNA相同的序列)和反向引物(5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3’；SEQ ID NO：23)进行；循环条件(95℃持续5分钟；95℃持续15秒，55℃持续15秒，并72℃持续20秒，45个循环；并且72℃持续5分钟)。通常将U6 snRNA测量作为参考对照(正向：5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’(SEQ ID NO：28)，反向：5’-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’(SEQ ID NO：29))，除了使用o8G或G加标(正向：5’-TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT-3’(SEQ ID NO：24)，反向：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3’(SEQ ID NO：25))或miRNA：o8G加标(正向：5’-TAAGGCACGCGGTGAATGCCAA-3’(SEQ ID NO：26)，反向：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3’(SEQ ID NO：27))。
在使用TaqMan MicroRNA Assay时，按照制造商提供的方案进行。即，使用MicroRNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems)连同识别每个miRNA序列的特异性RT探针逆转录100ng的小RNA。使用RT产物，用特异质qPCR引物和TaqMan Universal PCR Master Mix(No AmpEraseUNG；Invitrogen)进行qPCR反应。用于检测特定miRNA的RT探针和qPCR引物由以下试剂盒提供：rCMC中的miR-1b和hsa-miR-1(ID：002222)；rCMC中的miR-1-3p和rno-miR-1(ID：002064)；rCMC中的miR-184与-miR-184(ID：000485)；rCMC中的let-7f和hsa-let-7f(ID：000382)；H9c2、AC16、rCMC和小鼠心脏中的miR-1和hsa-miR-1(ID：00222)；U6和U6 snRNA(ID：001973)；o8G或G加标，hsa-miR-1(ID：002222)；miRNA：o8G加标，mmu-miR-124a(ID：001182)；和NT，cel-miR-67-3p(ID：000224)。所有qPCR分析均由Rotor-GeneQ(Qiagen)进行，具有技术重复(n＝3)和没有逆转录酶的平行反应(阴性对照)。
实施例13.RT-PCR中o8G＞T转化的分析
由于o8G可以与A配对，基于合成的39-oxo-R中从GAAUo8GC到GAATTC(EcoRI位点)的变化研究了诱导G＞T转化的功效。o8G对照(39-oxo-R)和G对照(39R)的逆转录由SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)与RT引物(5’-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCGCTACCTCGAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQ ID NO：30)，Bioneer)进行。通过PCR反应(98℃持续10秒；98℃持续10秒，40℃持续30秒，72℃持续20秒的30个循环；和72℃持续10分钟)用Ex Taq(Takara)连同引物(正向：5’-CCTGGTCCCAGACTAAAGAAT-3’(SEQ ID NO：31)，反向：5’-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCG-3’(SEQ ID NO：32)；Bioneer)扩增cDNA。
用Oligo Clean&Concentrator试剂盒(Zymo)纯化后，RT-PCR产物用EcoRI(NEB)消化并在TBE中的12％PAGE凝胶上分离。
RT-PCR中o8G诱导的G＞T转化也通过测序直接得到证实。在每个连接步骤之后，根据用于构建具有修饰的小RNA-Seq文库的方案(参见示例14)，，除了使用RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo)，构建400ng的包括o8G的22nt合成的RNA(5’p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’；SEQ ID NO：33)的测序文库。特别地，可以通过计算由于5’衔接物中的简并条形码(4个随机核苷酸)导致的独特读段值来分析o8G位置的核苷酸频率，从而消除PCR扩增中的混杂偏差。
实施例14.o8G-miSeq
基于RT-PCR中o8G IP条件的优化和o8G诱导的G＞T转化，开发了测序方法(o8G-miSeq)来鉴定氧化的miRNA及其o8G位置。将12.5μg抗o8G抗体(15A3，QED)与125μlDynabeads Protein G(Invitrogen)在补充有1.2mg脱氧鸟苷(Sigma)的PBS(总体积500μl)中在室温下交替温育1小时制备附有抗体的磁珠。对于清洗和纯化，使用DynaMag-2磁体(Invitrogen)分离Dynabeads Protein G。用PBS清洗两次后，将从miRNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化的7至10μg小RNA样品与在200μl的含有2.5mM DFOM(Sigma)和40U重组RNase抑制剂(Takara)的PXL中制备的珠混合。在4℃下交替温育2小时后，用极盐进行一系列清洗；TE(15mM Tris-HCl pH7.5、5mM EDTA)；含有高洗涤剂(1％TritonX-100、1％脱氧胆酸盐、0.1％SDS和2.5m MEGTA)和高盐(1M NaCl)的TE；含有高洗涤剂和极盐(2M NaCl)的TE；含有高洗涤剂和盐(120mM NaCl)的TE；清洗缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、1mM MgCl、150mM NaCl、0.05％NP-40)。珠上纯化的氧化小RNA按原样或在提取后进行进一步处理。
对于完整珠的处理，用PNK缓冲液(50mM Tris-Cl pH7.4、10mM MgCl2、0.5％NP-40)清洗珠的RNA两次，使用8μl的在补充有1mg/ml BSA和40U重组RNase抑制剂(Takara)的80μl T4 RNA连接酶缓冲液(NEB)中的T4 RNA连接酶2裂解KQ(NEB)在70℃下温育2分钟，然后与0.25μM的3’衔接物(5’-(rApp)T(PMe)GGAATTCTCGGGTGCCAAGG(ddC)-3’(SEQ ID NO：34)；rApp：腺苷酸，PMe：甲基膦酸酯，ddC：双脱氧胞嘧啶；Trilink)，在冰上制备。
在恒温混均仪(Thriller，Peqlab)中于28℃温育1小时后，将珠用PXL(2.5mMDFOM)清洗一次，并用PNK缓冲液清洗两次。对于5’衔接物连接，将在70℃温育2分钟后在冰上制备的0.25μM 5’衔接物(5’-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN(2’-甲氧基-C)-3’(SEQID NO：35)；Trilink)在恒温混均仪(Thriller，Peqlab)中在总共80μl的由8μl T4RNA连接酶(Thermo)、1mg/mlBSA、和40U重组RNase抑制剂组成的T4 RNA连接酶缓冲液的珠上在28℃下与RNA温育1小时。在用PXL(2.5mM DFOM)和1x第一链缓冲液(Invitrogen)顺序清洗后，如下将珠上的RNA逆转录；1μl SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)、0.72μM RT引物(5’-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；SEQ ID NO：36)、375μM dNTP、7.25mM DTT和4U重组RNase抑制剂，总共40μl 1x第一链缓冲液；和55℃在恒温混均仪(Thriller，Peqlab)中温育1小时。将获得的cDNA通过PCR进一步扩增以构建测序文库。
同时，还用补充有输入小RNA(0.4-1μg；小RNA-Seq)或o8G IP(2.5mM DFOM和20％氯仿)的700μl Qiazol Lysis Reagent从珠中纯化cDNA测序文库，并且然后从RNA提取的产物中进行(用Clean&Concentrator-5试剂盒浓缩)。
首先，使用1μl T4 RNA连接酶2裂解KQ(NEB)在13μl总T4 RNA连接酶缓冲液(补充有20％PEG 8000和在冰上制备的20U重组RNase抑制剂)中连接0.25μM 3’衔接物(在70℃温育2分钟后在冰上制备)。在28℃下温育60分钟后，在65℃下灭活20分钟。然后，添加13μl的含有0.25μM 5’衔接物、2μl T4 RNA连接酶(ThermoFisher)、40U重组RNase抑制剂和1mg/mlBSA的T4 RNA连接酶缓冲液以连接5’衔接物，并在28℃下温育60分钟，在65℃下灭活20分钟。连接的总RNA样品用1μl的10μM RT引物在70℃下变性2分钟，放置于冰上1分钟，并按以下逆转录：1μl SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)，375μM dNTP，7.25mM DTT和4U重组RNase抑制剂，共40μl 1x第一链缓冲液；并且在55℃下温育1小时和在70℃下温育15分钟。所得的cDNA通过PCR进一步扩增以制备测序文库。
将制备的cDNA进一步处理以包括Truseq索引衔接物序列(Illumina)。首先，使用具有100nM通用正向引物(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3’；SEQ ID NO：37)的Q5高精度2x预混液(NEB)和100nM RT引物通过PCR扩增cDNA；98℃下30秒；98℃10秒、60℃30秒和72℃15秒的5个循环；并在72℃下持续10分钟。使用QIAquick PCRPurmcation Kit(Qiagen)纯化初级PCR产物后，使用洗脱物的部分通过将SYBR Geen I(1∶10000，Invitrogen)添加到Q5高精度2x预混液中进行qPCR(Rotor-GeneQ；Qiagen)洗脱的一部分，并确定达到线性扩增范围所需的循环数。使用Q5高精度2x预混液用一组最佳循环对剩余的纯化的初级PCR产物进行二次PCR以生成多重条形码(250nM通用正向引物，250nM条形码引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-6mer条形码-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3’；SEQ ID NO：38)。使用Pippin Prep(Sage Science)用15％Urea-PAGE凝胶提取(参见实施例6)或3％琼脂糖凝胶盒进一步纯化含有约20nt插入物的预期大小的PCR产物，使用Qubit RNA HS测定试剂盒(Invitrogen)和Fragment Analyzer(Advancedanalytical)以及交叉检查进行定量。最后，将制备的文库通过HiSeq 2500系统(Illumina)测序为50个单端读段，并使用CASAVA(Illumina)进行解复用。
实施例15.生物信息学和统计数据分析
对于生物信息学分析，主要使用了Python脚本(http：//clip.korea.ac.kr/oxog/)和UCSC基因组浏览器(http：//genome.ucsc.edu/)。使用Tuxedo Suite；TopHat2(http：//ccb.jhu.edu/software/tophat)、Cufflinks和Cuffdiff(http：//cole-trapnell-lab.github.io/cuffiinks/)进行RNA-Seq分析。使用Bowtie(http：//bowtie-bio.sourceforge.net)将测序读段定位到miRNA。通过CLIPick(http：//clip.korea.ac.kr/clipick/)处理了CLIP数据的峰分析。除非另有说明，使用具有默认参数的DAVID(http：//david.abcc.ncifcrf.gov/)进行GO分析，并用REVIGO(http：//revigo.irb.hr/)进行可视化。使用GSEA(http：//sofiware.broadinstitute.org/gsea/)分析了功能注释的强化。
标准实验室实践随机化规程用于细胞系组和相同年龄和性别的小鼠。在实验和结果评估期间，实验者没有得到任何关于他们的位置的信息。所有统计检验，包括Kolmogorov-Smirnov检验(KS检验)、t检验(未配对的双尾)和Fisher精确检验(相对于定位的总miR-1读段)，均从Scipy(http：//www.scipy.org/)或Excel(双面测试)获得。除非另有说明，值代表均值±s.d。统计显著性默认设置为P＝0.05，并且组间方差相似。
实施例16.o8G-miSeq数据分析
使用容忍两个不匹配的Bowtie(Bowtie--norc-1 7-n 2-a-f)对解复用的测序读段(FASTQ文件)进行比对，并对减少的测序读段进行索引(使用带默认参数的bowtie-build索引器)并通过miRBase(http：//www.mirbase.org/)中相同物种的成熟miRNA序列进行定位。通过过滤掉具有不匹配错误的读段进一步解析结果，导致质量评分低于20。每个miRNA的读段数被归一化为总读段(每百万总读段的读段；RPM)并用作log2值(例如，log2(输入)和log2(o8G IP))。特别地，o8G的富集是通过测量o8G IP测序(o8G IP)的RPM和输入小RNA-Seq的RPM(输入；miRNA频率)来估计的，以log2比率计算并在火山图分析中表示为显著性(-log10(P值)、t检验)。为了研究受miRNA序列中G频率影响的o8G IP偏差，通过热图分析可视化按序列中G含量(G数)和o8G富集值(bin大小＝1)分类的miRNA数量(Treeview，http：//rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm)。为了分析根据PE处理的差异o8G富集，相对o8G富集值是根据PE处理与模拟品(无处理)之间的o8G富集率计算的
仅考虑碱基调用中质量评分最高的不匹配情况，计算miRNA序列中每个位置发生的不匹配相对于总匹配频率的百分比：不一致性(％)。特别地，来自mir-1：2U和miiR-1：3U的种子序列与其他哺乳动物miRNA(n＝17,948；miRBase，http：//www.mirbase.org/)不重叠，除miR-1：7U与物种特异性miRNA之外，mdo-miR-12320-3p和mmu-miR-7216-3p(＜80个测序读段)显示非常低的表达，可以忽略不计。
实施例17.通过o8G IP和qPCR对氧化的miRNA进行定量
通过用100μM PE处理rCMC(n＝3)48小时或通过长期注射ISO(75mg kg-1)(n＝3)诱导小鼠心脏肥大后，使用miRNeasy Mini Kit(Qiagen)。然后，作为交叉确认，使用分光光度计(Denovix)和Qubit荧光定量(Invitrogen)准确测量的相同量的小RNA(2μg，PE处理与未处理)在10pg miRNA：o5G加标对照存在下用于o8G免疫沉淀。在使用Qiazol Lysis Reagent和RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo)从珠中提取RNA后，使用TaqMan MicroRNAAssay试剂盒(Applied Biosystems)评估o8G IP的特定miRNA的量。作为参考，逆转录前的所有规程均在2.5mM DFOM存在下进行，以防止RNA在体外氧化。为了归一化IP过程中的突变，通过qPCR测量o8G IP中miRNA：o8G加标的量，并用作分母来定量特定miRNA的相对o8G值。此外，通过测量o8G IP中的U6snRNA，估计相对水平并将其用于归一化以确认特定miRNA中氧化的富集。
实施例18.萤光素酶报告基因的构建
为了测量miRNA介导的基因抑制活性，使用了psiCheck-2(Promega)或pmirGLO载体(Promega)。特别是，在miR-1 oxo位点的情况下，通过并排重复靶位点(n＝5)并将其插入psiCheck-2的海肾萤光素酶(hRLuc)的3’UTR来提高检测灵敏性。
为了构建该载体，如指示，通过XhoI和NotI位点将含有各种miR-1 oxo位点的合成双链体寡核苷酸(Macrogen)克隆到psiCheck-2质粒中；miR-1-种子位点，正向：5’-TCGAGACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCGC-3’(SEQ ID NO：39)，反向：5’-GGCCGCGGAATGTG GAATGTGGAATGTGGAATGTGGAATGTC-3’(SEQ ID NO：40)；miR-1-2oxo位点，正向：5’-TCGAGAC ATTCAACATTCAACATTCAACATTCAACATTCAGC-3’(SEQ ID NO：41)，反向：5’-GGCCGCTGAATGTTG AATGTTGAATGTTGAATGTTGAATGTC-3’(SEQ ID NO：42)；miR-1-3oxo位点，正向：5’-TCGAGACA TTACACATTACACATTACACATTACACATTACGC-3’(SEQ ID NO：43)，反向：5’-GGCCGCGTAATGTGTA ATCTGTAATGTGTAATCTGTAATGTC-3’(SEQ ID NO：44)；miR-1-7oxo位点，正向：5’-TCGAGAAAT TCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCGC-3’(SEQ ID NO：45)，反向：5’-GGCCGCGGAATTTGGAA TTTGGAATTTGGAATTTGGAATTTC-3’(SEQ ID NO∶46)；miR-l对照位点，正向：5’TCGAGACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCGC-3’(SEQ ID NO：47)，反向：5’GGCCGCGGAAAGTGGAAAGTG GAAAGTGGAAAGTGGAAAGTC-3’(SEQ ID NO：48))。重要的是，由于具有相同的碱基，miR-1对照位点在miR-1种子位点的位置6(枢轴)处具有不匹配，据报道，受损的枢轴失去种子介导的靶标抑制，因此它被构建为用作阴性对照。
以与上述相同的方式，在miR-122、let-7和miR-124的种子位点处生成o8G修饰时可识别的序列是用A替代o8G修饰发生在基于5’端的第8个互补序列的位点来制备的。
为了灵敏地鉴定已鉴定的miR-1：7o8G靶mRNA中的7oxo位点，如下对psiCheck-2载体进行了修饰和亚克隆以包含2或3个靶位点的重复。首先，经由ApaI和XbaI，将含有预测的偏移7oxo位点(3：8)的萤火虫基因(hluc+)由缺少7oxo位点并位于pmirGLO载体(Promega)中的不同萤火虫基因(Luc2)替代。
实施例19.萤光素酶报告基因分析
将各种萤光素酶报告载体(pmirGLO、psiCheck-2或其含有期望位点的修饰质粒)和/或合成双链体miRNA(50-75nM，另有说明)转染到H9c2、rCMC和AC16中。转染后24小时，通常测量表达的萤光素酶的活性。在药物处理的情况下，在指定的时间处理指定浓度的PE、H2O2和/或NAC，从转染后24小时开始并在处理后获得。根据制造商的方案，使用具有GloMax-Multi检测系统(Promega)的双萤光素酶报告分析系统(Promega)在重复(n＝6)中测量相对活性(归一化至萤火虫萤光素酶的海肾萤光素酶活性)。为了评估miRNA介导的抑制效率，将不同浓度的miRNA(0到100nM)转染到HeLa中。然后，使用Scipy(scipy.optimize.curve_fit)，对S形函数进行非线性最小二乘拟合以计算IC50。如果最小二乘法不适合函数，则根据回归线计算近似IC50。
实施例20.双荧光报道基因制备
基于psiCheck-2(Promega)构建双荧光蛋白(dFP)报告基因载体，将萤光素酶基因替换为荧光蛋白基因。eGFP基因在pUlta(Addgene；由MalcolmMoore提供)中扩增，并且hRLuc通过NheI和XhoI位点替换；正向引物：5’-TAGGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGA-3’(SEQID NO：49)，反向引物：5’-GGGCTCGAGCGATCGCCTAGAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’(SEQ IDNO：50)。TurboRFP基因在pTRIPZ(ThermoScientific)中扩增，hluc+通过ApaI和XbaI位点替换(正向引物：5’-GAAGGGCCCTATGAGCGAGCTGATCAAGGAGA-3’(SEQ ID NO：51)，反向引物：5’-GACTCTAGAATTATTATCTGTGCCCCAGTTTGCTAG-3’(SEQ ID NO：52))，并进一步处理以通过PCR介导的缺失去除hluc+序列的残留33bp(正向引物：5’-GTACTGTTGGTAAAGCCACCATGAGCGAGCTGATCA-3’(SEQ ID NO：53)，反向引物：5’-TCCTTGATCAGCTCGCTCATGGTGGCTTTACCAACA-3’(SEQ ID NO：54))，然后去除未缺失的主链质粒(DpnI处理)。根据制造商的方案，使用PfuUltra高保真DNA聚合酶(Agilent Technologies)进行所有PCR反应。此外，使用了转化的dFP载体(Jens Gruber提供的p.UTA.3.0 Empty；Addgene质粒#82447)，它衍生自psiCheck-2载体，但acGFP替换了hluc+，RFP替换了hRLuc，就好像报告基因和对照荧光基因在dFP中交换。最后，根据用于psiCheck-2的相同亚克隆方法，将miR-1种子位点、7oxo位点、2oxo位点和3oxo位点插入dFP或转化的dFP载体(p.UTA.3.0)。
实施例21.使用流式细胞术的单个细胞报告基因检测
使用荧光蛋白报告载体以使用流式细胞术在单个细胞水平测量miRNA介导的基因抑制。首先，将含有miR-1种子、7oxo、3oxo或2oxo位点的dFP(RFP：GFP位点)或转化的dFP(GFP：RFP位点)转染到H9c2中，并在转染后24小时收集细胞。作为阳性对照，共转染每个靶位点的同源miRNA(50nM)。为了证实miR-1 oxo位点的抑制是由内源性miR-1介导的，从miRIDIAN microRNA发夹抑制剂(Dharmacon)获得的50nM miR-1特异性抑制剂也被共转染。
对于共转染，使用相同量的NT作为对照。对于药物处理，从转染时开始，将200μMPE(血清消减的H9c2)或2mM NAC处理24小时。在含有4％BSA(Bovogen)和5mM EDTA(Sigma)的PBS(Biosesang)中收获细胞并通过流式细胞术进行分析。
对于dFP(RFP：GFP位点)的转染H9c2，最初使用BD Accuri C6 Plus(BDBiosciences)以4-蓝色配置运行(仅蓝色激光设备，激发波长：488nm；标准滤光片，GFP：533/30，RFP：670LP)。在活单个细胞门控后(基于FSC和SSC)，根据由psi-Check2转染细胞估计的自发荧光的基础水平进一步过滤掉没有报告基因表达的细胞。然后，分析了GFP与RFP信号的散点图(n＝10,000个细胞)。H9c2的细胞大小由FSC值估计。为了测试PE处理对氧化miR-1介导的抑制的影响，通过比较PE处理与未处理，显示了根据GFP强度(log2(GFP))或相对GFP比率(log2(GFP/RFP))的细胞分布，并使用累积分数分析(Scipy，scypy.stats.ks_2samp)KS检验)进一步进行统计分析。
为了提高dFP(RFP：GFP位点)和转化dFP(GFP：RFP位点))的检测灵敏性，然后使用配备蓝色(488nm)和黄色(561nm)激光器的AttuneNxT流式细胞仪实现GFP和GFP以及GFP和RFP的完全激发。对于此分析，最初在散点图分析中选择了GFP和RFP信号的范围，并且报告基因值(dFP的log10(GFP)和dFP的log10(GFP))衍生自相似的载体表达范围(由log10估计(RFP)用于dFP和log10(GFP)用于转化的dFP；输入相同)log10(RFP))被平均和定量为相对比率。最终，通过将相对比例归一化为来自无位点的同一报告基因的值(例如，每个dFP和RFP值的每个bin中的GFP值的平均值表示为来自无位点的对照的值)来计算相对倍数变化。为了将分析范围缩小到报告基因表达中最低的25％，通过仅使用每个载体表达值的bin中报告基因值最低25％的细胞重新计算相对倍数变化。
实施例22.使用miR-1：o8G诱导心脏细胞肥大
根据制造商的方案用RNAiMax或Lipofectamine 3000(Invitrogen)将NT-
Figure BDA0003774195810000401
miR-1、miR-1：7o8G、miR-1：2o8G、miR-1：3o8G、miR-1：7U、miR-1：2U和miR-1：3U转染到H9c2或rCMC细胞，并且为了获得静止图像，使用了倒置显微镜(Leica DMi8)并用ImageJ(≥100个细胞，https：//imagej.nih.gov/)进行分析。为了生成延时图像，在用miR-1：7o8G或miR-1：7U转染后，在0到50小时之间以20分钟的间隔使用Lumascope 400(Etaluma)。
实施例23.向小鼠施用miRNA
进行了向小鼠体内递送miRNA。具体地，根据制造商的方案，使用体内jetPEI(N/P比＝5；Polyplus)，经由静脉注射(I.V.)将双链体miRNA(5mg kg-1)施用于12周龄雄性C57BL/6小鼠(Koatech)。通过根据注射的miRNA(NT vs.miR-1：7o8G，NT vs.miR-1：7U；n＝4)将小鼠分成两组，设计了两组实验。当注射miR-1：7o8G(4mg kg-1)或miR-1：7U(4mg kg-1)时，并且还注射NT(1mg kg-1)以确认递送至小鼠心脏。特别地，用于注射的miR-1：7o8G或miR-1：7U的双链体是通过使用5’末端含有FITC的miR-1过客链确认递送到心脏组织而生成的。在第1天和第2天进行两次注射，并在第7天处死小鼠。对于每次心脏测量，收集心脏组织：HW、BW和TL。切下的心脏组织立即用于RNA提取(小RNA和大RNA；miRNeasy Mini Kit，Qiagen)，并通过qPCR分析研究递送的NT的量(参见miRNA切片的qPCR的详细方法)，然后进行RNA-测序和qPCR。
切除的心脏的部分也被制备为载玻片上的组织切片用于免疫组织化学分析。
实施例24.mRNA的定量RT-PCR
通过使用无RNase DNase Set(Qiagen)的柱DNA消化，使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)分离总RNA。用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)和寡核苷酸(dT)引物进行逆转录。用SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)进行qPCR分析。用标准的两步循环方案一式三份进行所有反应，并使用ACTB和GAPDH作为对照通过ΔCT方法计算相对定量。
实施例25.心脏组织的免疫组织化学
将解剖的小鼠心脏组织固定(4％多聚甲醛，4℃过夜)，贮存(70％乙醇)，石蜡包埋，切片(横截面，连续切片；5μm宽)，并用苏木素和伊红(H&E)染色。石蜡包埋切片制备、H&E染色和Masson三色染色由心血管产品评估中心(延世大学医学院，韩国)或病理核心设施(首尔国立大学医学院，韩国)通过服务订购进行。然后，对制备的载玻片进行免疫荧光染色。在用Histo-Clear(National Diagnostics)对切片进行脱蜡后，用连续稀释的乙醇水解切片并贮存在PBS中。根据制造商的方案，使用BD Retrievagen Antigen RetrievalSystems(BD Biosciences)回收抗原。然后，按规定对由PAP笔(Sigma)定义的靶染色区域进行免疫染色；封闭溶液(具有10％正常山羊血清和1％BSA的PBS)，RT下1小时；MF20抗体(1∶200，发育杂交瘤)，封闭液，4℃过夜；Alexa Fluor 488驴抗小鼠IgG(1∶1000，Abcam)，封闭溶液，室温下1小时。此外，Alex Fluor594缀合WGA(50μg/ml；Invitrogen)和DAPI(1.5μg/ml；Vectorlab)分别用于可视化细胞膜和细胞核。用倒置荧光显微镜(Leica DMi8；放大20倍或40倍)观察染色组织，用Leica Application Suite(LAS)分析，并用ImageJ(≥100个细胞，https：//imagej.nih.gov/)进行定量。
实施例26.转化小鼠生成
为了产生心肌细胞特异性转化小鼠(TG)，使用BamHI消化抗7oxo(α-MHC13x)质粒以分离转化盒。在交配后，将凝胶纯化的转化盒注射到由超排卵C57BL/6雌性小鼠(由PMSG和HCG诱导)制备的小鼠受精卵的细胞核中。此后，将小鼠胚胎(受精的单细胞受精卵)移植到假孕雌性小鼠(Korea Bio Co.Ltd，Seoul，Korea)中。分娩后，使用对应于hGHpoly(A)的引物组(正向：5’-CCACCAGCCTTGTCCTAATAAA-3’(SEQ ID NO：55)，反向：5’-CAGCTTGGTTCCCAATAGA-3’(SEQ ID NO：56))，使用基因组DNA(从末端纯化)的PCR分析鉴定2只抗7oxo TG(+)小鼠。对于抗7oxo TG，建立并研究了四位独立创始者(F0；#44、#65、#68和#69)。所有小鼠都随意给予食物和水，并维持在12∶12小时的光照：黑暗循环中。
实施例27.RNA-Seq文库构建和分析
RNA-Seq文库是使用基于衔接物连接的方法或链置换终止/连接方法从整个或大RNA生成的。对于基于衔接物连接的方法，根据制造商的方案，使用NeoPrep(Illumina)将100ng总RNA(miRNeasy Mini Kit；从Qiagen纯化)应用于TruSeq Stranded mRNA LibraryPrep Kit(Illumina)；样品名称：H9C2-NT-N1、H9C2-miR-1-2o8G-N1和H9C2-miR-1-3o8G-N1。此外，TruSeq Stranded mRNA文库由Omega Bioservices(Norcross，GA，USA)构建、测序和解复用；样品名称：H9C2-NT-O1、H9C2-NT-O2、H9C2-miR-1-7o8G-O1和H9C2-miR-1-7o8G-O2。
其余样品使用链置换终止/连接方法如下处理。即，从1.5μg大RNA(＞200nt，RNeasy或miRNeasy Mini Kit；由Qiagen提取)中，根据制造商提供的方案，使用10μlDynabead Oligo(dT)25(Invitrogen)纯化多聚腺苷酸化的mRNA。然后，根据制造商的说明，使用SENSE Total RNA-Seq文库试剂盒(Lexogen)为10ng的纯化mRNA制备RNA-Seq文库。文库生成后，通过以最低的最佳循环的PCR进行扩增，最佳循环通过比较不同循环的结果或按照实施例14中o8G-miSeq的方法进行qPCR来确定。通过使用Fragment Analyzer(AdvancedAnalytical)进行大小分布和数量确认扩增文库的质量。
如有必要，进一步使用尿素-PAGE凝胶提取或Pippin Prep(Sage Science)进行大小选择。最后，使用Qubit RNA HS分析试剂盒(ThermoFisher)和Fragment Analyzer对制备的多路复用文库进行精确定量，并将其应用于通过HiSeq 2500系统(Illumina)测序为50个单末端读段。对于测序，使用了命名为H9C2-cont、H9C2-抗7oxo、mHT-ISO-cont、mHT-ISO-抗7oxo、mHT-ISO-抗7oxo-TG(-)和mHT-ISO-抗7oxo-TG(+)的样品和MiniSeq系统(Illumina)。为确保与HiSeq 2500系统结果的一致性，MiniSeq系统仅使用SE50信息。
使用具有RefSeq基因注释提要的TopHat2(tophat2-a4-g 1--b2-sensitive-r100--mate-std-dev＝50--library-type fr-firststrand)将解复用的测序读段(CASAVA；使用Illumina获得)与小鼠基因组(mm9)或大鼠基因组(rn5)进行比对。当使用链置换终止/连接方法制备测序文库时，根据制造商的说明，针对TopHat2修剪来自读段起始侧的前9个核苷酸。使用Cufflinks(cufflinks-N-b)定量转录水平，并在具有相同实验条件的组中通过Cuffdiff(Cuffdiff--FDR＝0.1-b-N--min-alignment-count＝10-library-norm-method＝geometric)与定位结果提要分析差异转录谱。除了倍数变化和统计显著性(p值)之外，仅选择和使用了有效的状态值。如果重复衍生自两种不同的文库构建方法(基于衔接物连接的方法和链置换终止/连接方法)，cufflinks仅用于相同类型的文库，然后从所有重复计算均值RPKM和p值(t检验，两个-尾方法)。
实施例28.累积分数分析
为了根据给定的miRNA或miRNA抑制剂测试推定的靶转录物抑制或去阻遏的倾向，分析了具有倍数变化的累积分数(log2比率)。推定的miR-1：o8G靶标被选为在3’UTR处含有miR-1 pxo位点的转录物(由从UCSC基因组浏览器下载的RefSeq定义)，其中通常调查miR-1：o8G的所有6mer匹配位置2-8(匹配o8G：A而不是o8G：C)，除非另有说明。“无位点”是指在mRNA序列中不包含miR-1种子位点和oxo位点的转录物。“Cont位点”是指在3’UTR中含有miR-1对照位点的转录物，并且将oxo位点中与o8G结合的核苷酸替换代为G，作为先前研究中用作阴性对照。使用Scipy(scypy.stats.ks_2samp)对总mRNA或cont位点进行KS检验。通过计算倍数变化和显著性(-log10(p值))来分析火山图，并且其中，使用截止值来选择差异表达基因(DEG)。
实施例29.Ago HITS-CLIP数据分析
从GEO数据库(GSE83410)检索心肌病患者左心室组织的Ago HITS-CLIP结果。通过来自Bowtie的“反向”定位(成熟miRNA序列与样品读段的比对)，含有miRNA序列的读段被鉴定为具有两个不匹配公差，并针对miR-1分析了miRNA读段的位置不匹配。对于miR-1 oxo位点的富集分析，与G∶U结合介导的miR-1种子位点相比，如先前的研究(Spengler，R.M.etal.，Nucleic Acids Res 44，7120-7131)提供的，分析了Ago2结合聚类。miR-124的种子位点是脑特异性miRNA，其用作阴性对照，因为它不存在于心脏组织中。miR-1的无核凸起部位也用作阴性对照。
为了鉴定心肌病患者中的miR-1 7oxo位点，Ago HITS-CLIP的原始测序数据由CLIPIck处理。具体地，FASTQ文件最初根据质量评分(fastq_filter.pl-fmean：0-24：20)进行过滤和减少(fastq2collapse.pl)。然后使用具有相同参数的NovoAlign程序(http：//www.novocraft.com)将预处理的读段与人基因组(hg19)对齐。从带注释的转录物(RefSeq)中选择读段后，使用BedTools和SAMtools(http：//samtools.sourceforge.net/)和人心脏(衍生自RNA-Seq Atlas，http：//medicalgenomics.org/rna_seq_atlas)用于表达谱提要的峰分析。为了可视化峰、所有编辑的读段和推定的miR-1 7oxo位点(位置2到8处的6mer)，应用了UCSC基因组浏览器(http：//genome.ucsc.edu/)。
实施例30.CLEAR-CLIP
将从ISO处理或PBS处理的小鼠解剖的小鼠心脏组织(约150mg)压碎，并通过UV照射(400mJ/cm2，3次；Spectrolinker XL-1000)在体内在RNA-蛋白质复合物中诱导共价交联。Ago相关片段mRNA，其通过在37℃下用50μU/μl RNAse A(Affymetrix)处理5分钟加工，用10μg附接至60mg Dynabeads Protein A(Invitrogen)的两种不同的抗Ago抗体进行免疫沉淀。通过用0.625U/μl T4 RNA连接酶1(NEB)处理在16℃下过夜进行连接以生成miRNA靶向mRNA嵌合体，并通过在3％DMSO(Sigma)和18％PEG8000(Sigma)的存在下用1U/μl T4 RNA连接酶1(NEB)在25℃下处理75分钟来进一步增强。通过操作NuPAGE 10％Bis-Tris Gel(Invitrogen)按大小分离同位素标记的RNA-蛋白质复合物，转移到硝酸纤维素膜(BA85；Whatman)，切割，用4mg/ml蛋白酶K(Roche)和7M尿素(Sigma)处理，并用酸性苯酚∶氯仿∶IAA(125∶24∶1；Invitrogen)和RNA Clean&Concentrator-5试剂盒(Zymo)提取。通过使用小RNA-Seq Library Prep试剂盒(Lexogen)，纯化的RNA经受衔接物连接和RT-PCR以生成用于高通量测序的文库，最后使用HiSeq 2500系统(Illumina)进行测序。
对测序读段进行预处理和定位，并且在去除衔接物序列后，通过“反向”定位鉴定包含miRNA序列的潜在嵌合读段，其中成熟的miRNA序列使用Bowtie与样品文库进行反向比对。然后将剩余的序列定位到小鼠基因组(mm9)，仅进一步选择与来自2A8和2E12抗体的组合外显子重叠的序列，并且最终仅关注包含嵌合读段的miR-1。对于miR-1种子和oxo位点调查，比较ISO注射和未注射小鼠心脏之间的富集结果，上游(5’，-)和下游(3’，+)从定位的嵌合读段延伸(-/+0，-/+25，-/+50，-/+100)。
实施例31.心肌细胞特异性miR-1：7o8G抑制剂的构建
为了特异性抑制心肌细胞中的miR-1：7o8G，基于携带心肌细胞特异性α-MHC启动子的pJG/ALPHA MHC质粒构建了含有多个miR-1 7oxo靶位点的竞争性抑制剂。将含有13个miR-1 7oxo位点(5’-AAAUUCC-3’；SEQ ID NO：6)或对照NT靶位点(5’-GGUUGUG-3’；SEQ IDNO：21)的合成双寡核苷酸(Macrogen)通过SalI和HindIII位点克隆到所指示的pJG/ALPHAMHC载体中；抗7oxo，α-MHC 13x，正向：5’-TCGACAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAAAAATTCCACAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAAT TCCAA-3’(SEQ ID NO：57)，反向：5’-AGCTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGA ATTTCTGGAATTTATGGAATTTGTGGAATTTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGAATT TG-3’(SEQ ID NO：58)；cont，抗NT，正向：5’-TCGACGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGT GACGGTTGTGAAGGTTGTGACGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGACG GTTGTGAA-3’(SEQ ID NO：59)，反向：5’-AGCTTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACAACCCTCACAACCATCACAACCGTCACAACCTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACA ACCG-3’(SEQ ID NO：60)。值得注意的是，对照载体(抗NT)与抗7oxo(α-MHC 13x)使用的质粒相同，只是它包含衍生自cel-miR-67(秀丽隐杆线虫)的非靶向siRNA(NT)的结合位点。pJG/ALPHA MHC载体由Jeffrey Robbins(Addgene质粒#55594)提供给Da-Zhi Wang博士。其他竞争性miRNA抑制剂由RNA合成(参见RNA合成方法)。
实施例32.向ISO处理的小鼠施用miRNA抑制剂
为了研究竞争性miR-1：7o8G抑制剂(抗7oxo)是否可以在体内减弱ISO诱导的心脏肥大，最初通过腹膜内注射(IP)向8至12周龄雄性C57BL/6J小鼠(Korea Bio Co.LTD)施用ISO(75mg kg-1)，并且此时，使用等体积的PBS作为对照(每组n＝5)。8小时后，使用体内jetPEI(Polyplus)以根据制造商的方案规定的量和比率向小鼠静脉注射抗7oxo或对照(抗NT)；抗7oxo(α-MHC13x)或cont(抗NT 13x)，1.9mg kg-1，N/P比率＝8；抗7oxo(4x)或cont(抗NT 4x)，5mg kg-1，N/P比率＝5。在第1、2、5天进行3次连续注射，并在第7天处死所有小鼠以检查心脏。进行了包括hGH poly(A)的抗7oxo转录物的RT-qPCR (正向：5’-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3’(SEQ ID NO：61)，反向：5’-CCAGCTTGGTTCCCAATAGA-3’(SEQID NO：62))，从而测量抗7oxo(a-MHC 13x)向心脏组织的递送率。为了确认抗7oxo(4x)向小鼠心脏的递送，用抗7oxo(4x)(正向，5’-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3’；SEQID NO：63)特异性引物进行基于poly(A)拖尾的miRNA qPCR方法(参见miRNA定量PCR方法)。
实施例33.ISO时间过程中miR-1：o8G的定量
为了研究ISO时间过程实验中氧化miR-1量的变化，通过IP注射向小鼠施用75mgkg-1ISO，并在从处理时间点起的第1、5和7天处死注射的小鼠(每个时间点n＝4)。还注射了等体积的PBS，立即处死小鼠并用作第0天的样品(n＝4)。解剖心脏后，使用miRNeasy MiniKit(Qiagen)提取小RNA。为了定量miR-1：o8G，如“通过o8G IP和qPCR对氧化的miRNA进行定量”方法中所述进行o8G IP和miR-1qPCR，但具有如下一些修改。在珠制备中，使用了在150μ1 PXL中的3μg抗o8G抗体(15A3，QED Bioscience)、30μl Dynabeads Protein G(Invitrogen)和300μg脱氧鸟苷(dG，Sigma-Aldrich)；并且在IP培养中，使用了在含有2.5mM DFOM和40U重组RNase抑制剂(Takara)的150μl PXL中的2μg小RNA样品和1pg o8dGRNA加标(miR-124-3p：4o8dG：5’p-UAAGo8dGCACGCGGUGAAUGCC-3’；SEQ ID NO：64)。
实施例34.3’UTR中miR-1靶位点的序列保守性分析
当计数3’UTR中保守序列的基序时，从UCSC基因组浏览器(http：//genome.ucsc.edu)获得哺乳动物的PhastCons结果，并且仅在评分大于或等于0.9时使用，并计算为保守率(保守的基序数/所有基序数；％)。所有3’UTR(由RefSeq定义)的保守率均用对miR-1的四个不同位点(种子、2oxo、3oxo和7oxo位点)保守的miRNA家族的种子位点(n＝103，位置2至8的6mer)计算。在大多数这些哺乳动物中序列是保守的(但通常不超出胎盘哺乳动物；http：//www.targetscan.org)。作为背景对照，还计算了所有6mer(n＝4098)的保守性。所得分布表示为总体的累积分数和比例。
实施例35.数据可用性
来自o8G-miSeq(SRP189806，SRP189807，SRP189808，SRP226125)，RNA-Seq(SRP189813，SRP189117，SRP189812，SRP189811，SRP189809，SRP213998，SRP214400，SRP228274)，and CLEAR-CLIP(SRP189810)的所有原始测序数据贮存在Sequence ReadArchives中。项目网站(http：//clip.korea.ac.kr/oxog/)上还提供了所有FASTQ文件，包括具有加标的08G IP的测序数据。
实施例36.心肌肥大动物模型血浆中miR-1：o8G的测量
以与实施例8(图6a)中所述相同的方式通过ISO注射诱导小鼠的心脏肥大。之后，从用PBS处理的3只对照动物和用ISO处理的3只动物各自采集700μl血液，然后通过在4度、1000x g下沉降并离心5分钟分离血浆。使用Qiagen的miRNeasy Serum/Plasma Kit从每组相同量的350 ul血浆中提取小RNA，并通过如实施例12所述进行qPCR用一定量的U6校正来定量提取的小RNA中miR-1的测量值。此外，如实施例11所述通过抗体沉淀(IP)从血浆中分离的100 ng小RNA中特异性分离o8G修饰的RNA，并通过qPCR对miR-1进行定量。此外，对于用o8G修饰的miR-1的定量，在使用8G抗体的免疫沉淀实验中添加1pg的miR-124-3p：4o8dG(UAAGo8dGCACGCGGUGAAUGCC-3-3’；SEQ ID NO：64)，其中o8G在第5次以DNA形式合成，通过qPCR进行测量并进行校正。
实验实施例1.ROS依赖性心脏肥大中的miRNA氧化
H9c2大鼠心肌细胞系用α-肾上腺素能受体(AR)激动剂(去氧肾上腺素；PE)处理，并证实了PE处理、ROS产生和miRNA氧化的病理生理性肥大刺激。作为使用ROS荧光染料(DHE)的流式细胞术(10,000个细胞，n＝3)进行分析的结果，证实了PE处理后细胞中ROS增加。特别是，用PE处理后产生的93％的肥大细胞在处理后显示ROS产生增加了1.8倍。血清缺乏是刺激肾上腺素能肥大的既定先决条件，也增强了具有高基础ROS水平的扩展表型。
进一步扩展到体内小鼠模型，长期施用β-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO)，如图1A所示，诱导心脏肥大(增加约13％)，如图1B所示。其中，病理经超声心动图证实，并且证实了用ISO处理时产生ROS。
接下来，研究了在心脏肥大的小鼠模型中RNA是否由ROS氧化，ROS与ISO一起施用。
根据大小(基于200个核苷酸)分离RNA，并通过ELISA使用o8G特异性抗体测量由ISO处理诱导的8-氧代鸟嘌呤(o8G)。作为测量的结果，证实了从小RNA产生的o8G比从大RNA产生的多约3.1倍，如图lC所示。这显示比大RNA更快(1.8倍)，即使大RNA受到百草枯(PQ)处理诱导的氧化应激。
基于作为RNA诱导沉默复合物的关键蛋白质的Argonaute2(Ago2)和o8G的共定位，小RNA的氧化进一步分解为miRNA，如图1D所示。将其量化和增加，它在PE处理的rCMC中量化和增加(约8倍)，如图1E所示，它在PE或ISO处理的H9c2中也有所增加(每个平面o8G+，Ago2；100个细胞，n＝4；P＝0.05)。
独立地，使用o8G特异性抗体的斑点印迹分析显示来自PE处理的H9c2和rCMC的小RNA(＜200nt)的氧化以氧化还原依赖性方式增加，如图1F所示。
当miRNA的氧化在PE处理的H9c2和ISO注射的小鼠心脏中得到证实时，如图1G所示，通过PE处理的H9c2(图1G顶部)和ISO注射小鼠心脏(图1G底部)的northwestern分析结果，以及在图1H中所示的凝胶提取的约20nt miRNA的斑点印迹分析，证实了分别通过PE和ISO处理从约20nt miRNA产生了o8G。
总结上述实验结果，心脏肥大是氧化还原依赖性的，并且能够产生ROS，从而诱导miRNA的o8G修饰。
实验实施例2：心脏miRNA中位点特异性o8G的测序
为了识别氧化的miRNA和相应的o8G位置，通过优化o8G的免疫沉淀(IP)和检测o8G诱导的G＞T碱基转换，开发了新的miRNA中o8G的测序方法(o8G-miSeq)，其示意图如图2A所示。
首先，通过采用用于CLIP的条件，对o8G的IP过程进行了广泛的改进，如图2B所示，并且优化后的IP，如图2C所示，与非特异性背景(非氧化G)相比，显示约3000倍的合成o8G的量。因为o8G可以与A配对，所以在cDNA中诱导G＞T突变的功效增强至约50至60％，这通过获得的限制酶位点的序列特异性切割得以间接证明(图2D的顶部)并通过测序得以直接证明(图2D的中间和底部)。
然后，如表1所示，o8G-miSeq最初应用于H9c2，就其基础表达而言，将miR-1b识别为氧化程度最高的miRNA(o8G富集，log2(IP/输入)＝7；由miRNA-Seq标准化)，o8G富集，即o8G IP的log比率相对于miRNA的输入读取计数进行标准化，根据miRNA频率用点表示，如图2E的左图所示，且序列中G的数量作为热图密度显示在图2E的右图中。
(表1)
Figure BDA0003774195810000501
证明IP是通过没有观察到任何来自miRNA的量和G含量的偏差来特异性地进行的，如图2F所示，其显示了显著性(-log10(P值))作为火山图，miR-1b中的o8G显著高(P＜0.01)，并且发现基于G＞T的突变率的种子区域(位置2、3和7)是显著的。此外，通过对rCMC的额外应用，如表2所示，如图2G所示，o8G-miSeq进一步表明miR-1b在PE处理后被优先氧化，在种子区域的识别位置(位置2、3和7)处o8G增加(图2G顶部)(相对o8G富集，log2(PE/模拟品)＝1.66；图2G底部)。
(表2)
Figure BDA0003774195810000511
然后，为了加剧rCMC的肥大表型，在将rCMC暴露于血清缺乏后进行o8G-miSeq分析的PE处理，如表3所示。结果，在位置7的o8G显著增加(miR-1：7o8G，约增加2倍)，如通过miR-1序列中的G＞T转换率所估计的，如图2H所示。除了观察到增强的miR-1b氧化外，如图2I和表4所示，对于其他miRNA，如miR-184、let-7f-5p和miR-1-3p也观察到显著氧化(P＜0.01)，具有显著量的o8G(log2(o8G-IP)＞10)。特别地，证实了miR-184与之前的H2O2处理结果相同，如图2J所示，且其他miRNA有一些不一致之处。
总体而言，通过使用o8G-miSeq，可以准确检测氧化的miR-1及其在心脏肥大期间的特异性o8G定位。
(表3)
Figure BDA0003774195810000512
(表4)
Figure BDA0003774195810000521
实验实施例3：通过氧化的miR-1的o8G：A碱基配对的靶沉默效应
如实验实施例2所证实的，氧化的miRNA(miR-1b、miR-1-3p、miR-184和let-7f)，如图3A所示，通过根据PE处理的o8G IP(miRNA：o8G)，在rCMC中观察到并证实了它们的量显著增加(P＜0.05，t检验)。其中，miR-1显示出最显著的改善(约2.5-5倍)，并且在ISO处理的肥大小鼠心脏中也得到证实，尽管在ISO处理后下调，如图3B所示。
研究了以miR-1为中心，在种子区域中识别的o8G位置(位置2、3和7)，miR-1(miR-1：2o8G、miR-1：3o8G和miR-1：7o8G)是否可以通过o8G：A碱基结合识别相应的新靶位点(2oxo、3oxo和7oxo位点)，结果如图3C所示。
通过进行萤光素酶报告基因分析，证实了合成的miR-1：2o8G、miR-1：3o8G和miR-1：7o8G可以沉默具有oxo位点(2oxo、3oxo和7oxo位点)的靶标，该oxo位点在相应的氧化修饰过程中可识别为G：A排列，其不受miR-1抑制。
确实如图3D所示，这些具有miR-1 oxo位点的萤光素酶报告基因在PE处理的rCMC中均被抑制，但在抗氧化剂NAC存在下被激活，这表明由rCMC的肾上腺素能刺激产生的内源性miR-1：o8G水平足以改变靶标识别并进行沉默。
而且，在用PE或H2O2处理后立即在AC16中观察到一致的结果，如图3E所示。
接下来，为了从细胞群的异质性中排除合成效应，使用双荧光蛋白(dFP)报告基因进行流式细胞术，如图3F所示：带有miRNA靶位点的绿色荧光蛋白基因(GFP)和没有这些位点的红色荧光蛋白基因(RFP)。通过对肥大H9c2中相对活性的累积分数的分析(P＝1.56x10-5，Kolmogorov-Smimov检验(KS检验)，GFP/RFP)观察dFP报告基因。
尽管内源性miR-1的表达水平低(可能由心肌细胞系的命运异质性引起，如图3H中所示)，但在单个H9c2细胞水平检测到miR-1：o8G依赖性抑制，如图3G所示。在图3I中证实了dFP报告基因的所有miR-1 oxo位点(7oxo、3oxo和2oxo位点)与o8G-miSeq观察到的miR-1：o8G位置(2、3和7)一致(图2F)并且被内源性抑制，具有检测由基础水平的miR-1：o8G介导的抑制的敏感性，并且通过转染miR-1抑制剂或同源miR-1变体进行识别。
此外，dFP报告基因检测到肥大H9c2中miR-17oxo位点的显著PE依赖性抑制，如图3J所示。
此外，随着两种荧光蛋白的完全激发的敏感性增加，与没有位点(RFP：GFP，NT)的dFP报告基因(RFP：GFP，NT)相比的值如图3K所示进行了比较，因此通过miR-1：7o8G的内源性水平验证miR-1的抑制(RFP：GFP-7oxo vs RFP：GFP，NT)来仔细检查该测定法，如图3L所示，且其通过NAC处理的激活(RFP：GFP-7oxo，模拟品vs.NAC)如图3M所示。
重要的是，这种相对抑制(通过在细胞中类似范围的对照荧光值(RFP)上平均报告物荧光值(GFP-7oxo)计算得出的)被认为是在报告物荧光值(GFP-7oxo)的最低25％时明显，这表明存在具有高水平miR-1：7o8G的细胞群。此外，如图3N中所示，dFP报告基因(其中交换报告基因和对照荧光蛋白)灵敏地检测到miR-1：7o8G的内源水平对miR-1 7oxo位点的抑制作用和抑制方面的PE依赖性增加。
此外，使用如图3O所示的交换的dFP报告基因，观察到当仅考虑具有25％最低报告值(RFP)的有限细胞群时，观察到PE诱导的miR-1 7oxo位点抑制更为显著，并且观察到报告基因活性(RFP)通过引入miR-1抑制剂而恢复进一步证实了miR-1 7oxo位点的PE依赖性抑制是由miR-1介导的。特别地，如图3P所示，引入氧化的miR-1(2o8G、3o8G和7o8G)不如未氧化的miR-1有效，但它可能会抑制萤光素酶报告基因中的种子位点，因为o8G：C碱基结合的保留活性。观察到miR-1：7 o8G经由o8G：A碱基结合沉默在肾上腺素能心脏肥大中获得的靶mRNA。
实验实施例4.miR-1：o8G心脏肥大诱导的确认
尽管据报道miR-1在肥大中具有负作用，但PE处理减少了miR-1诱导的rCMC萎缩，如图4A所示的rCMC细胞的显微镜观察和细胞大小量化结果所示。使用ImageJ量化细胞大小(英寸2，n＝100)。
在实验实施例2中，引入了合成miR-1：2o8G、miR-1：3o8G或miR-1：7o8G，其通过发现miR-1：o8G和PE诱导的肥大的氧化还原依赖性来维持，如图4B所示，观察到与PE处理相比rCMC的肥大显著更多地被诱导。
当引入由U取代o8G的合成的miR-1(miR-1：2U、miR-1：3U和miR-1：7U)时，这些效果得到了同样的体现，通过这种方式，肥大的发生取决于o8G：A碱基结合。
如图4C所示，在H9c2中也观察到了这种效果。
特别地，miR-1：7o8G或miR-1：7U诱导的肥大如图4D所示的qPCR测量结果所示，正如在PE处理中观察到的，显著增加了心房利钠肽(ANP)的表达，ANP被称为心脏肥大的标志物。这些结果通过图4E所示的流式细胞术分析和rCMC(图4F顶部)和H9c2(图4F底部)的延时图像得到进一步证实。
此外，还测试了miR-1：7o8G在体内对心脏肥大的影响。如图4G所示，miR-1：7o8G作为聚乙烯亚胺(PEI)复合物与非靶向对照(NT)经由尾静脉注射(图4G顶部)，并且递送至心脏组织通过定量PCR(qPCR)得到验证(图4G底部)。结果，至少约10％或更多的心脏大小显著增加(P＝0.001，n＝3)，如图4H所示，在H&E染色的心脏组织中对室间隔(IS)进行免疫染色，并对心肌细胞的大小进行量化，结果，观察到心肌细胞大小增加约19％，且ANP表达显著上调，如图4I所示。
这时，在图4J中，WGA(小麦胚芽凝集素)用于细胞边界染色，MF20用于心肌细胞，DAPI用于核染色。
总结上述实验结果，miR-1，特别是miR-1：7o8G的位点特异性氧化可以通过o8G：A碱基结合在体内充分诱导心脏肥大。
实验实施例5.氧化的miR-122、let-7和miR-124的发现和由此产生的功能的获取
除了心脏肥大，对于其他已知引起氧化应激的疾病，确认了几个microRNA从5′端到第8个末端的种子区处的o8G是否被修饰。
首先，在特异性表达大量miR-122的肝细胞来源的肝癌细胞系Huh7中，在已知自由基增加的肿瘤中，构建了萤光素酶报告基因，并确认了第二(2oxo)、第三(3oxo)或miR-122鸟嘌呤的第2和第3是否是经o8G修饰的(2oxo和3oxo)。此时，萤光素酶报告基因实验使用psi-check2(Promega)载体进行，包括5个靶位点，可通过与miR-122种子区域的o8G：A排列结合来识别，并在转染为Huh7后对其进行测量。此外，为了揭示相应位点的抑制是由miR-122直接引起的，在其中通过在Huh7中使用CRISPR/Cas9进行基因编辑去除了miR-122基因的细胞系(Huh7：miR-122 KO)与miRNA CRISPR敲除试剂盒(Canopy，Bioscience Inc.)一起使用，并在相同条件下一起测试。
上述实验的结果如图5A所示。
作为实验的结果，现有的mir-122识别的种子位点(种子：5′-ACACUCCA-3′)不仅受到抑制，而且第2 o8G修饰位点(2oxo：5′-ACACUCAA-3′)、第3 o8G修饰位点(3oxo：5′-ACACUACA-3′)以及第2和第3 o8G同时修饰位点(2oxo，3oxo：5′-ACACUAAA-3′)被抑制。
此外，在Huh7：miR-122KO中，观察到miR-122的第3o8G修饰位点(3oxo)和第2和第3o8G同时修饰位点(2oxo，3oxo)的抑制消失了，并且证明相应的抑制是由miR-122的转化引起的。
对于let-7，以与以前相同的方式制备第4 o8G位点(4oxo：5’-CUACAUCA-3’)的萤光素酶报告基因，并且作为使用它在胶质母细胞瘤肿瘤HS683中测量的结果，抑制作用小于let-7的种子位点(种子：5′-CUACCUCA-3′)，但与对照相比显示出显著的抑制作用(P＜0.01)，结果如图5B所示。
此外，为了了解已知在神经元和胶质母细胞中高表达的miR-124的种子区域是否也产生了o8G修饰，对miR-124的第4 o8G修饰靶位点(4oxo：5’-GUGCAUUA-3’)在胶质母细胞瘤HS683细胞中进行了萤光素酶报告基因实验，结果显示在图5C中。
作为实验的结果，miR-124的种子位点(种子：5′-GUGCCUUA-3′)被抑制，但未观察到4oxo位点的抑制。在肿瘤细胞的情况下，已知当营养或血液供应不足时，氧化应激增加并且细胞内氧化增加。因此，为了了解在这种情况下HS683中表达的miR-124的o8G修饰是否增加，在从细胞培养基中去除血清的情况下进行实验。在这种情况下，miR-124的4oxo位点被显著抑制(P＜0.01)。
通过以上实验结果证实，在肝癌细胞的miR-122中，第2、第3或第2和第3位一起被o8G修饰，在胶质母细胞瘤中，let-7的第4位碱基被o8G-修饰，并且当miR-124受到肿瘤细胞中可能发生的氧化应激时，如从培养物中去除血清，第4碱基的o8G修饰发生以抑制新识别的靶基因的表达。
为了从肝癌细胞转移，优先需要肝癌细胞的迁移能力，并且已知miR-122的表达抑制肝癌细胞的迁移。由于在肝癌细胞系Huh7中观察到miR-122的第2和第3被o8G-修饰(miR-122：2，38G)，为了检查相应的氧化miR-122是否影响肝癌细胞迁移能力，通过Trilink的RNA合成服务合成miR-122：2，3o8G(5’p-Uo8Go8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’，SEQ ID NO：65)、合成顺应链(has-miR-122-5p)和双链体，产生带有顺应链的双链体(has-miR-122-5p)并将其转染到Huh7中进行伤口愈合测定。
作为实验的结果，如图5D所示，当将miR-122：2，3o8G引入细胞时，证实与对照NT-6pi相比，Huh7的迁移迁移率受到显著抑制(cel-miR-67的所有第6个碱基由dSpacer替换)。
引入细胞的miR-122：2，3o8G还有这种可能，其他鸟嘌呤可能会被细胞中的自由基额外氧化，从而使其功能有所降低(见图8E)。因此，证实在用用于细胞培养的抗氧化剂(来自Sigma-Aldrich的抗氧化剂补充剂)处理后进行相同的伤口愈合测定时，miR-122：2，3o8G表现出更大的肝癌细胞迁移的抑制作用。也就是说，可以通过用抗氧化剂处理细胞来最大化o8G-修饰的microRNA的生物学效应。
此外，为了研究let-7：4o8G的功能，在胶质母细胞瘤中识别的o8G修饰microRNA，它以siRNA的形式合成(let-7：4o8G：5’-pUGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’，SEQ ID NO：66)并以双链体形式被引入HS683细胞中。引入HS683细胞后，使用eBioscience Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒(Invitrogen)通过Attune NxT流式细胞仪测量凋亡。
作为实验的结果，证实了HS683的凋亡显著增加，如图5E所示。
对miR-124：4o8G(5’p-UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’，SEQ ID NO∶67)的siRNA合成形式进行了与上述相同的实验，如图5F所示，观察到诱导的凋亡。
参考实验实施例1至5的实验结果，在几种microRNA的种子区(碱基至5′端的第8个碱基)发生的o8G修饰可以在合成和引入到细胞时展示多种病理生理功能。
实验实施例6.miR-1：7o8G和心肌病的功能丧失
通过分析从人心肌病患者心脏左心室获得的Ago HITS-CLIP结果来研究miR-1的氧化(n＝6，参见表5至表7)。
(表5)
Figure BDA0003774195810000571
(表6)
Figure BDA0003774195810000572
(表7)
Figure BDA0003774195810000573
结果，如图6A所示，虽然比率低，但在Ago相关的miR-1中检测到相同模式的G＞T突变(位置2、3和7)(图6A，左图)，并且聚集以包括具有最高频率的位置7的患者组(1、2、4和5)以及其他较小的位置(位置2、3和12；n＝4)的患者组。其他(3和6)仅在位置2处具有最高频率(n＝2)(图6A，右图)。在标准化的Ago-mRNA簇中，观察到由o8G通过位置2、3或7的结合表示的氧化的miR-1靶位点显著多于预期，如图6B所示(P＜0.01，卡方检验)，对应于比G∶U结合(约10％)和对照位点(约7％)多的平均值，其为约18％。
为了进一步解决miR-1：7o8G的生理相关性，评估了功能丧失。采用来自miRNA海绵(合成为RNA的竞争性抑制剂)的概念，以保留种子介导的靶位点的串联重复序列，如图6C所示，制备了miR-1(抗-种子)和miR-1：7o8G(抗-7oxo)(图6C顶部)并验证了它们的特异性抑制作用(图6C底部)。
如图6D所示，通过进行RNA-Seq(参见表8)，证实抗7oxo(9x)的抑制活性完全抑制血清缺陷型H9c2中的miR-1 7oxo靶标。
(表8)
Figure BDA0003774195810000581
然后，如图6E所示，将抗7oxo(4x)引入rCMC并显示减弱PE诱导的肥大。注射到ISO处理的小鼠中的两种抗7oxo(4x和α-MHC 13x)也作为合成的抗70xo(4x)RNA或作为含有13个有效拮抗肾上腺素能心脏肥大的靶位点的心肌细胞特异性表达载体(α-MHC 13x)，如图6F所示，且抗7oxo(α-MHC 13x)的递送程度得到证实，并观察到与它们的抑制活性相关。
抗7oxo(α-MHC 13x)的施用维持了心肌细胞大小，如图6G所示(图6G顶部)并完全抑制miR-1：708G靶标(参见图6G底部和表9)。然而，如图6H所示，对ISO处理的小鼠心脏的ROS增加没有影响。
(表9)
Figure BDA0003774195810000582
另外，如图6I所示，产生了表达抗-7oxo(α-MHC 13x)的转化小鼠(TG)，其表达如表10和图6J(RNA-Seq)所证实。
(表10)
Figure BDA0003774195810000591
结果，它们的心脏大小没有基础差异，如图6K所示(图6K顶部)，但在所有三种不同的TG模型中显著阻止了ISO诱导的心脏肥大(图6K底部)，miR-1：7o8G靶标的总体抑制显示在图6L中并且，即使存在ISO处理(TG(+)ISO vs.TG(-)ISO)，IS中心肌细胞的大小也减小，如6M所示。
总之，miR-1，特别是miR-1：7o8G的位点特异性氧化是心脏肥大和疾病的内源性驱动因素，表明它在心肌病患者中产生和改变靶标相互作用。对此，ROS诱导的本发明的miR-1：7 o8G的位点特异性氧化及其心脏肥大诱导过程的示意图在图6N中显示。
实验实施例7.心脏肥大动物模型血浆中miR-1：o8G增加的确认
观察到心脏肥大模型和心肌肥大患者心肌组织中miR-1的o8G修饰增加后，为了证实可以通过无创检测来诊断心肌肥大，对miR-1的o8G修饰旨在在心脏肥大诱导的小鼠血液中检测到。首先，确认是否通过ISO处理诱导了小鼠的心脏肥大。如图7A是通过ISO诱导的心肌肥大的代表性心脏照片，每组3只小鼠。与对照组相比，用ISO处理的实验组的心脏大小平均增加了约30％(36％H/B vs 32％H/T)。其细节记录在表11中。此外，为了确定是否在动物模型的血液中测量miR-1：o8G以及它是否富集于心肌肥大，分离血浆和对miR-1：o8G进行量化(n＝3)。
(表11)
Figure BDA0003774195810000592
然后，从各动物模型分离的血液中分离血浆并提取小RNA后，测定所分离的小RNA中的miR-1的量，同时通过o8G免疫沉淀测量测定o8G修饰的miR-1的量(图7B)。以等量从血浆中提取的RNA测定miR-1的量，可以确认实验组与对照组的测定结果无统计学意义，即血浆中存在miR-1，并且无论是否诱导心脏肥大，都存在相应的量(图7C)。
此后，对从血浆中分离的小RNA进行o8G-IP以确认miR-1：o8G存在于血浆中(图7B)。此时，为了校正和量化o8G-IP过程中的差异，在免疫沉淀之前，将在o8G的位置5合成为DNA的人miR-124-3p以相同的量添加到小RNA样品中并使用。结果，氧化修饰的miR-1：o8G在三只动物的每一种中，在心肌肥大血浆中观察到的平均增加约379％，并且通过Student′s t-检验证实这种变化具有统计学意义(p＝0.031)(图7D)。总之，通过qPCR在血浆中测量的microRNA-1显示心脏肥大与对照之间没有差异，但通过o8G-IP-qPCR测量的氧化修饰的microRNA-1(miR-1：o8G)显示心脏肥大显著增加，并由此观察到，可以通过基于血液的miR-1：o8G测量无创地诊断心脏肥大。
实验实施例8.抗氧化剂对心肌肥大的影响和改善心肌细胞肥大抑制能力的抗 miR-1-7oxo，其在抗氧化剂处理期间抑制miR-1：7o8G
当PE处理诱导的肥大细胞用抗氧化剂NAC处理时，如图8A所示，确认肥大减少(n＝4；英寸2，ImageJ)，如图8B所示，证实ISO和NAC的同时处理减弱了ISO诱导的心肌肥大。
另外，如图8C所示，证实了通过ISO或PE处理的o8G的增加随着NAC的处理而减少(比例尺，100μm)。也就是说，根据抗氧化剂NAC的处理减少了miRNA的氧化。
在观察了通过NAC处理的ISO对心肌肥大的抑制(图1B)之后，为了检查是否可以通过其他抗氧化剂处理以相同的方式抑制心肌肥大，用PE和ISO处理H9c2细胞以诱导心肌细胞肥大，和其他抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)和Sigma-Aldrich的抗氧化剂补充剂(A1345)，它们作为抗氧化剂出售用于细胞培养(图8D)。结果，无论抗氧化剂的种类如何，都证实了心肌细胞的大小减小了，特别是H9c2心肌细胞系的大小即使在PE或ISO处理时也完全没有增加，三个重复实验在统计学上显著(*，P＜0.01)。
此外，证实在大鼠胚胎中培养原代心肌细胞(rCMC)后通过PE处理在细胞中发生肥大(图8E，上图)。在此，当引入包含多个7oxo位点的抑制性抗7oxo(4x)识别miR-1以抑制o8G修饰形式(miR-1：7o8G)时，再次证实心肌细胞肥大在进展后被抑制，并且抗氧化剂NAC被额外处理时，观察到心肌细胞完全不增大的最大效果(图8E，中图)。这些结果可能是通过防止在抗7oxo(4x)中发生由于PE处理在将抗7oxo(4x)引入细胞后增加的自由基引起的o8G氧化而显示的效果。事实上，为了查明在人为引入细胞的RNA中是否发生额外的o8G产生并抑制作用，因此为了通过引入miR-1：7o8G而不是PE处理来诱导心肌细胞肥大，从而产生活性氧，并同时施加氧化应激，处理100μM过氧化氢(H2O2)(图8E，下图)。结果，观察到由现有的miR-1：7o8G表达引起的心肌细胞肥大由过氧化氢处理而抑制。相反，证实了当抗氧化剂NAC处理时，由miR-1：7o8G诱导的心肌细胞肥大表现更有效。
因此，基于这些结果，证实不仅NAC，而且BHA和其他用于细胞培养的一般抗氧化剂，如果抗氧化剂处理可以表现出抗氧化作用，则可能抑制心肌细胞肥大，并且发现抗氧化剂的治疗可以有效地防止o8G-修饰的microRNA或RNA中可能发生的额外氧化修饰，这些RNA抑制其通过人工RNA表达诱导心肌细胞大小的调节。。具体而言，心肌肥大的特征在于生理性和病理性肥大。当运动员或孕妇需要足够的血液供应时，根据情况，当心脏扩大以提供顺畅的供应时，可能需要暂时诱导其生理性肥大以增强心脏功能。因此，将miR-1：7o8G引入心肌细胞引起的心脏肥大可能起到生理性肥大的作用，这时，抗氧化处理可以有效地诱导心肌肥大的作用抑制病理性心肌肥大，通常可以通过防止引起病理现象的额外氧化应激来抑制病理性心脏肥大。
上述对本发明的描述是为了进行阐释，本发明所属领域的普通技术人员可以理解，在不改变本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以很容易地修改为其他具体形式。因此，应当理解，上述实施方式在所有方面都是阐释性的，而不是限制性的。
<110> 高丽大学校 产学协力团
<120> 包含8-氧代鸟嘌呤的RNA干扰诱导核酸、与包含8-氧代鸟嘌呤的microRNA结合的修饰的核酸及它们的用途
<130> OPP20205123KR
<150> 10-2019-0156147
<151> 2019-11-28
<160> 70
<170> koPatentIn 3.0
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<222> (23)..(24)
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gcgagcacag aattaatacg actcac 26
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<211> 22
<212> DNA
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<223> 8-oxoguanine or G spike-in forward primer
<400> 24
tggaatgtaa agaagtatgt at 22
<210> 25
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8-oxoguanine or G spike-in reverse primer
<400> 25
gcgagcacag aattaatacg actcac 26
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA:8-oxoguanine spike-in forward primer
<400> 26
taaggcacgc ggtgaatgcc aa 22
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miRNA:8-oxoguanine spike-in reverse primer
<400> 27
gcgagcacag aattaatacg actcac 26
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> control forward primer
<400> 28
cgcttcggca gcacatatac 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> control reverse primer
<400> 29
ttcacgaatt tgcgtgtcat 20
<210> 30
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT primer
<400> 30
acttcaaagc tcacggttcc gctacctcga gaagacggca tacga 45
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39-oxo-R or 39R forward primer
<400> 31
cctggtccca gactaaagaa t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 39-oxo-R or 39R reverse primer
<400> 32
acttcaaagc tcacggttcc g 21
<210> 33
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 22nt synthetic RNA
<220>
<221> misc_difference
<222> (7)
<223> 8-oxoguanine
<400> 33
uggaauguaa agaaguaugu au 22
<210> 34
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'adaptor : 5'-adenylation
<220>
<221> misc_difference
<222> (2)
<223> methyl-phosphonate guanine
<220>
<221> misc_difference
<222> (2)
<223> dideoxy-cytosine
<400> 34
tggaattctc gggtgccaag gc 22
<210> 35
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'adaptor
<220>
<221> misc_difference
<222> (31)
<223> 2'-methoxy-C
<400> 35
guucagaguu cuacaguccg acgaucnnnn c 31
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RT primer
<400> 36
gccttggcac ccgagaattc ca 22
<210> 37
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> universal forward primer
<400> 37
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga 50
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> barcode primer
<400> 38
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcctt ggcacccgag aattcca 57
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-seed site forward primer
<400> 39
tcgagacatt ccacattcca cattccacat tccacattcc gc 42
<210> 40
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-seed site reverse primer
<400> 40
ggccgcggaa tgtggaatgt ggaatgtgga atgtggaatg tc 42
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-2oxo site forward primer
<400> 41
tcgagacatt caacattcaa cattcaacat tcaacattca gc 42
<210> 42
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-2oxo site reverse primer
<400> 42
ggccgctgaa tgttgaatgt tgaatgttga atgttgaatg tc 42
<210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-3oxo site forward primer
<400> 43
tcgagacatt acacattaca cattacacat tacacattac gc 42
<210> 44
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-3oxo site reverse primer
<400> 44
ggccgcgtaa tgtgtaatgt gtaatgtgta atgtgtaatg tc 42
<210> 45
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-7oxo site forward primer
<400> 45
tcgagaaatt ccaaattcca aattccaaat tccaaattcc gc 42
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1-7oxo site reverse primer
<400> 46
ggccgcggaa tttggaattt ggaatttgga atttggaatt tc 42
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1 control site forward primer
<400> 47
tcgagacttt ccactttcca ctttccactt tccactttcc gc 42
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-1 control site reverse primer
<400> 48
ggccgcggaa agtggaaagt ggaaagtgga aagtggaaag tc 42
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NheI and XhoI site forward primer
<400> 49
taggctagcc accatggtga gcaagggcga 30
<210> 50
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NheI and XhoI site reverse primer
<400> 50
gggctcgagc gatcgcctag aattacttgt acagctcgtc catgc 45
<210> 51
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI and XbaI site forward primer
<400> 51
gaagggccct atgagcgagc tgatcaagga ga 32
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApaI and XbaI site reverse primer
<400> 52
gactctagaa ttattatctg tgccccagtt tgctag 36
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> residual 33bp of hluc+ sequences forward primer
<400> 53
gtactgttgg taaagccacc atgagcgagc tgatca 36
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> residual 33bp of hluc+ sequences reverse primer
<400> 54
tccttgatca gctcgctcat ggtggcttta ccaaca 36
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH poly (A) forward primer
<400> 55
ccaccagcct tgtcctaata aa 22
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH poly (A) reverse primer
<400> 56
cagcttggtt cccaataga 19
<210> 57
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-7oxo (alpha-MHC 13x) forward primer
<400> 57
tcgacaaatt ccaaaaattc cataaattcc agaaattcca caaattccaa aaattccaca 60
aattccataa attccagaaa ttccaaaaat tccataaatt ccagaaattc cacaaattcc 120
aa 122
<210> 58
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-7oxo (alpha-MHC 13x) reverse primer
<400> 58
agctttggaa tttgtggaat ttctggaatt tatggaattt ttggaatttc tggaatttat 60
ggaatttgtg gaatttttgg aatttgtgga atttctggaa tttatggaat ttttggaatt 120
tg 122
<210> 59
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cont (anti-NT 13x) forward primer
<400> 59
tcgacggttg tgaaggttgt gatggttgtg agggttgtga cggttgtgaa ggttgtgacg 60
gttgtgatgg ttgtgagggt tgtgaaggtt gtgatggttg tgagggttgt gacggttgtg 120
aa 122
<210> 60
<211> 122
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cont (anti-NT 13x) reverse primer
<400> 60
agctttcaca accgtcacaa ccctcacaac catcacaacc ttcacaaccc tcacaaccat 60
cacaaccgtc acaaccttca caaccgtcac aaccctcaca accatcacaa ccttcacaac 120
cg 122
<210> 61
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH poly (A) forward primer
<400> 61
taaattccaa attccagaaa ttccacaaat tccat 35
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH poly (A) reverse primer
<400> 62
ccagcttggt tcccaataga 20
<210> 63
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> anti-7oxo (4x) primer
<400> 63
taaattccaa attccagaaa ttccacaaat tccat 35
<210> 64
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8-oxo deoxyguanosine RNA spike-in
<220>
<221> misc_difference
<222> (5)
<223> 8-oxo deoxyguanosine
<400> 64
uaaggcacgc ggugaaugcc 20
<210> 65
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-122:2,3(8-oxoguanine)
<220>
<221> misc_difference
<222> (2)
<223> 8-oxoguanine
<220>
<221> misc_difference
<222> (3)
<223> 8-oxoguanine
<400> 65
ugggagugug acaauggugu uug 23
<210> 66
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7:4(8-oxoguanine)
<220>
<221> misc_difference
<222> (4)
<223> 8-oxoguanine
<400> 66
ugaguaguag guuguauag 19
<210> 67
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-124:4(8-oxoguanine)
<220>
<221> misc_difference
<222> (4)
<223> 8-oxoguanine
<400> 67
uaaggcacgc ggugaaugc 19
<210> 68
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-122
<400> 68
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 69
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> let-7
<400> 69
ugaguaguag guuguauag 19
<210> 70
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-124
<400> 70
uaaggcacgc ggugaaugc 19

Claims (30)

1.RNA干扰诱导核酸，其包含自核酸双链的至少一条单链的5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
2.如权利要求1的RNA干扰诱导核酸，其中所述5'末端的第1至第9个核苷酸包含microRNA的序列。
3.如权利要求2的RNA干扰诱导核酸，其中所述microRNA是以下第1组microRNA中的至少一种：
[第1组]
miR-1、miR-184、let-7f-5p、miR-1-3p、miR-122、let-7和miR-124。
4.如权利要求1的RNA干扰诱导核酸，其中所述RNA干扰诱导核酸识别靶位点，所述靶位点中o8G:A排列出现在8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置处。
5.如权利要求1的RNA干扰诱导核酸，其中包括以下第2组多核苷酸中的至少一种：
[第2组]
由SEQ ID NO:1的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)；
由SEQ ID NO:2的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’)；
由SEQ ID NO:3的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’)；
由SEQ ID NO:65的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-Uo8Go8GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3’)；
由SEQ ID NO:66的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-UGAo8GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3’)；和
由SEQ ID NO:67的碱基序列组成的多核苷酸(5’p-UAAo8GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3’)。
6.如权利要求1至5中任一项的RNA干扰诱导核酸，其中当将所述RNA干扰诱导核酸注射到细胞或动物中时，会诱导心肌肥大、抑制肝癌细胞迁移或凋亡。
7.组合物，其包含权利要求1的RNA干扰诱导核酸和抗氧化剂。
8.用于鉴定8-氧代鸟嘌呤(o8G)的位置的方法，其包括：
(a)从细胞中提取RNA；
(b)使用抗-o8G抗体通过免疫沉淀(IP)从提取的RNA中分离包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的RNA；
(c)通过逆转录包含8-氧代鸟嘌呤(o8G)的分离RNA产生cDNA，并产生和测序测序文库用于确定8-氧代鸟嘌呤的位置；和
(d)通过确认作为测序结果的鸟嘌呤(G)经胸腺嘧啶(T)修饰的位置，鉴定鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰的位置。
9.特异性结合microRNA的经修饰的核酸，其中自5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰，
其中所述经修饰的核酸包含与从自经修饰的microRNA的5'末端起的第二个和第三个核苷酸中的任一个开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，和
所述经修饰的核酸包含腺嘌呤(A)作为核苷酸，其位于与自所述经修饰的microRNA的5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
10.如权利要求9的经修饰的核酸，其中
在所述经修饰的microRNA中，自5'末端起的第2、第3或第7个核苷酸的至少一个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰，
所述经修饰的核酸包含与从自所述经修饰的microRNA的5'末端起的第2个或第3个核苷酸开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，和
腺嘌呤(A)作为核苷酸包括在内，其位于与自所述经修饰的microRNA的5'末端起的第2、第3或第7个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
11.如权利要求9的经修饰的核酸，其中
所述经修饰的核酸包含5’-ACAUUCA-3’、5’-ACAUUAC-3’或5’-AAAUUCC-3’的至少一种碱基序列。
12.重组载体，其包含编码权利要求9至11中任一项的经修饰的核酸的基因。
13.用于治疗心脏肥大的药物组合物，其包含
经修饰的核酸，其与microRNA特异性结合并且其中来自自5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰，或包含编码所述经修饰的核酸的基因的重组载体，
其中所述经修饰的核酸包含与从自所述microRNA的5'末端起的第二个和第三个中的任一个开始的6个或更多个连续多核苷酸互补的多核苷酸，以及包含腺嘌呤(A)作为核苷酸，其位于与自所述microRNA的5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)结合的位置。
14.如权利要求13的用于治疗心脏肥大的药物组合物，其中所述microRNA是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
15.如权利要求13的用于治疗心脏肥大的药物组合物，其进一步包含抗氧化剂。
16.用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物，其包含RNA干扰诱导核酸，所述RNA干扰诱导核酸包含自核酸双链的至少一条单链的5'末端起的第1至第9个核苷酸中的至少一个8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
17.如权利要求16的用于治疗肝癌的药物组合物，其中所述microRNA是miR-122。
18.如权利要求16的用于治疗肝癌的药物组合物，其中所述microRNA是let-7或miR-124。
19.如权利要求16的用于治疗肝癌或胶质母细胞瘤的药物组合物，其进一步包含抗氧化剂。
20.用于预防或治疗心脏肥大的药物组合物，其包含抗氧化剂作为活性成分，
其中所述抗氧化剂抑制自RNA 5'末端起的第1至第9个核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)氧化修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)。
21.如权利要求20的药物组合物，其中所述抗氧化剂是N-乙酰半胱氨酸(NAC)或丁基羟基茴香醚(BHA)。
22.如权利要求20药物组合物，其中所述RNA是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
23.提供用于诊断心脏肥大的方法的信息，其包括：
确定从动物的心肌细胞分离的microRNA的核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)是否经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰；和
当所述microRNA的核苷酸中的一个或多个鸟嘌呤(G)经8-氧代鸟嘌呤(o8G)修饰时，分类为心脏肥大。
24.如权利要求23的提供用于诊断心脏肥大的方法的信息，其中所述核苷酸是自所述microRNA的5'末端起的第1至第9个核苷酸。
25.如权利要求23的提供用于诊断心脏肥大的方法的信息，其中所述核苷酸是自所述microRNA的5'末端起的第2、第3或第7个核苷酸。
26.如权利要求23至25中任一项的提供用于诊断心脏肥大的方法的信息，其中所述microRNA是miR-1、miR-184、let-7f-5p或miR-1-3p。
27.产生抵抗心脏肥大的非人动物模型的方法，其包括：
(a)将编码权利要求8的经修饰的核酸的基因可操作地连接至启动子以构建重组载体；
(b)将所述重组载体引入动物的受精卵；和
(c)将所述受精卵移植到代孕母体中后产生受精卵以得到转基因动物模型。
28.通过权利要求27的方法产生的抵抗心脏肥大的非人动物模型。
29.筛选用于治疗心脏肥大的候选物质的方法，其包括：
(a)在心脏肥大的动物模型的心肌细胞中处理候选物质；
(b)分析所述心脏肥大的动物模型的心肌细胞中表达的microRNA的核苷酸中鸟嘌呤(G)修饰为8-氧代鸟嘌呤(o8G)的频率；和
(c)当与未处理所述候选物质的情况相比所述8-氧代鸟嘌呤(o8G)减少时，选择所述候选物质作为心脏肥大治疗剂。
30.用于筛选如权利要求29的用于治疗心脏肥大的候选物质的方法，其中所述候选物质是抗氧化剂。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104878117A (zh) * 2015-06-24 2015-09-02 青岛大学 一种氧化修饰的微小rna筛选方法
KR102012943B1 (ko) * 2018-05-31 2019-08-21 고려대학교 산학협력단 마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010111290A1 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 University Of Utah Research Foundation Methods and compositions related to modified guanine bases for controlling off-target effects in rna interference
KR101481007B1 (ko) 2012-07-19 2015-01-14 전남대학교산학협력단 심장 비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제
EP2754714A1 (en) * 2013-01-14 2014-07-16 Sarepta Therapeutics, Inc. Inhibitory oligonucleotides and their use in therapy
CN104940230A (zh) * 2015-06-24 2015-09-30 青岛大学 一种通过自由基攻击微小rna造成rna氧化损伤的方法
KR102129852B1 (ko) * 2016-10-11 2020-07-24 주식회사 인코드젠 Rna 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 hpv 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물
WO2018209288A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Massachusetts Institute Of Technology Argonaute protein-double stranded rna complexes and uses related thereto

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104878117A (zh) * 2015-06-24 2015-09-02 青岛大学 一种氧化修饰的微小rna筛选方法
KR102012943B1 (ko) * 2018-05-31 2019-08-21 고려대학교 산학협력단 마이크로rna의 비정규 표적을 억제하는 rna 간섭 유도 핵산 및 그 용도

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JIAN-XUN WANG等: "xidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w", OLECULAR CELL, vol. 59, no. 1, pages 54 *

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