KR20210066758A - 8-옥소구아닌을 포함하는 rna 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로rna와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용 - Google Patents

8-옥소구아닌을 포함하는 rna 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로rna와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용 Download PDF

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지성욱
석희영
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명에서는 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 제조하여 세포 또는 마우스에 투여하였을 때 다양한 병리생리학적 현상이 유도되는 것을 확인하였다.
또한, 산화 스트레스로 인해 마이크로RNA의 발단지역 (seed region)에서 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 산화 변형이 일어난 마이크로RNA의 역전사를 통해 제조된 cDNA에서 G>T로 변형이 일어난 위치를 동정하여, 8-옥소구아닌으로 산화 변형이 일어난 위치를 확인하였다.

Description

8-옥소구아닌을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로RNA와 결합하는 변형 핵산 및 이들의 이용 {NUCLEIC ACIDS INDUCING RNA INTERFERENCE INCLUDING 8-OXOGUANINE, MICRO RNA INCLUDING 8-OXOGUANINE, AND USE THEREOF}
본 발명은 8-옥소구아닌을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산, 8-옥소구아닌을 포함하는 마이크로RNA에 특이적으로 결합하는 변형 핵산 및 이들을 이용한 약학조성물, 재조합 동물 모델, 약물의 스크리닝 방법, 질병의 진단 방법 및 병리생리학적 현상을 조절하는 방법 등에 관한 것이다.
세포가 병리생리학적 변화를 겪게 되면, 일반적으로 산화스트레스가 발생하고 이로 인하여 활성산소 (reactive oxygen species; ROS)가 발생된다. 발생된 활성산소는 큰 반응성으로 인하여 여러 생물학적 구성체를 변형시키는데, 그 중에서 가장 손쉽게 변형되는 것이 RNA이다. 특히, 산화 변형되는 RNA 염기 중에서 가장 손쉽게 많이 일어나는 것이 구아닌(Guanine; G) 염기가 산화 변형되어 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되는 것이다.
한편, 심장 질환은 암을 포함하여 우리나라 성인의 3대 사망질환 중 하나로, 그 발병 과정의 여러 병리적 스트레스가 심장 조직의 크기에 변화를 일으켜 심비대증(cardiac hypertrophy)을 유발하는 것으로 시작하며, 심비대증은 심근세포의 크기, 단백질의 합성속도 증가 등의 특징을 나타낸다. 심비대증은 점차적으로 심근섬유화 및 심부전증을 유도하여, 최종적으로는 심장기능상실 (또는 심부전: heart failure)로 나타난다. 특히, 심부전의 경우는 특히 사망률이 50% 전후로 매우 높기 때문에 궁극적으로는 심근비대증을 예방하거나 치료법을 개발하려는 연구들이 진행되고 있으며, 따라서 이에 대한 질환 모델을 구축하는 것이 필요하다.
한국등록특허공보 제1481007호
본 발명자들은 산화 스트레스로 인해 마이크로RNA의 발단지역 (seed region)에서 구아닌 (Guanine; G) 염기가 8-옥소구아닌 (8-oxoguanine; o8G)으로 산화 변형이 일어난 경우, o8G:A 배열을 통해 표적 서열과 결합하는 것을 확인하였으며, 상기 마이크로RNA의 역전사를 통해 제조된 cDNA에서 G>T로 변형이 일어난 위치를 동정함으로써 8-옥소구아닌으로 산화 변형이 일어난 위치를 확인하였다.따라서, 이를 기반으로 마이크로RNA에서 구아닌(G)을 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환한 RNA 간섭 유도 핵산을 제조하여 세포 또는 마우스에 투여하였을 때 다양한 병리생리학적 현상이 유도되는 것을 확인하였으며, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서는 RNA 간섭을 유도하는 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산 및 상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 변형 핵산 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물 및 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 구현예는 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
또 다른 구현예는 심비대증 저항성 동물 모델의 제작방법 및 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
또 다른 구현예는 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번재 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상일 수 있다:
[그룹 1]
miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G :A배열이 일어나는 표적 사이트를 인식할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥은 하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
[그룹 2]
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5' p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'); 및
서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5' p- UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다:
(a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
(d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (Guanine; G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 변형 핵산과 특이적으로 결합하는 상기 마이크로RNA는 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 것이고,
상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 변형 핵산은 5’-ACAUUCA-3’(서열번호 4), 5’-ACAUUAC-3’(서열번호 5), 또는 5’-AAAUUCC-3’(서열번호 6)의 염기 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나로부터 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산 또는
상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는, 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 간암치료용 약학 조성물은 상기 마이크로RNA가 miR-122일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 교모세포종 치료용 약학 조성물은 상기 마이크로RNA가 let-7 또는 miR-124일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 항산화제는 RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화 변형을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 항산화제는 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입시키는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 대리모에 이식한 후 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법 및 상기 방법으로 제작된, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 후보물질은 항산화제일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 마이크로RNA는 miR-1일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 간암 전이 억제 또는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산의 심비대증 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 간암 전이 억제 및 간암 치료 또는 교모세포종 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 심비대증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제의, 심비대증 치료에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산 및 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA 핵산과 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 이용하여 세포 또는 동물의 병리생리학적 현상을 조절할 수 있다.
구체적으로는 심비대증, 간암 또는 교모세포종 등의 진단 및 치료제 개발 등에 활용할 수 있다.
도 1a는 마우스 (n=7)에 75mg/kg 이소프로테레놀(isoproterenol, ISO)를 2일마다 29일 동안 복강 내 (I.P) 주사한 것을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 1b는 ISO 및 NAC 처리에 의한 마우스 심장 크기 변화를 확인한 도면이다.
도 1c은 ISO 처리에 의해 생성된 ROS의 RNA 산화 작용을 확인한 도면이다.
도 1d는 rCMC 세포에서 PE 또는 ISO 처리에 따른 마이크로RNA의 o8G 변형을 Ago2와 o8G의 면역형광염색에서 함께 나타나는 것으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1e는 H9c2에서 PE 또는 ISO 처리에 따른 o8G 및 Ago2의 면역형광염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 1f은 H9c2 및 rCMC 세포에서 o8G 특이적 항체를 사용한 도트 블롯 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 1g는 PE 처리된 H9c2 세포 (도 1g의 상단) 및 ISO 처리된 마우스 심장 (도 1g의 하단)에서의 northwestern 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 1h는 ISO 처리된 마우스 심장에 대해 겔 추출된 ~20nt miRNA를 이용하여 도트 블롯 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a는 o8G 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2b는 o8G에 대한 면역 침강 (Immunoprecipitation, IP) 최적화 프로세스를 나타낸 도면이다.
도 2c는 최적화된 IP 프로세스에 의한 o8G의 양을 나타낸 도면이다.
도 2d는 산화된 miRNA의 cDNA에서 G>T 변이를 제한 효소 부위의 서열-특이적 절단에 의해 간접적으로 (도 2d의 상단) 및 시퀀싱에 의해 직접적으로 (도 2d의 가운데 및 하단) 확인한 도면이다.
도 2e는 H9c2 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 나타낸 도면이다.
도 2f는 H9c2 세포에서의 Volcano plot 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 2g는 rCMC 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 나타낸 도면이다.
도 2h 및 2i는 rCMC, H9c2 세포를 혈청 결핍에 노출시킨 후 o8G-miSeq 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2j는 H2O2 처리된 H9c2 세포에서 산화된 miRNA의 o8G-miSeq 결과를 Wang JX, 2015 년 결과 (Wang, J. X. et al. Oxidative Modification of miR-184 Enables It to Target Bcl-xL and Bcl-w. Mol Cell 59, 50-61)와 비교해 나타낸 도면이다.
도 3a는 rCMC 세포에서 PE 처리에 의해 산화 유도된 miRNA의 상대적인 o8G의 양을 나타낸 도면이다.
도 3b는 마우스 심장에서 ISO 처리에 의해 산화 유도된 miR-1의 상대적인 양 및 o8G IP에서의 miR-1의 양을 나타낸 도면이다.
도 3c 및 3d는 산화된 miR-1의 o8G:A 염기 배열을 통한 표적 침묵 효과를 확인한 도면이다.
도 3e는 PE 또는 H2O2 처리된 AC16에서 miR-1 oxo 사이트를 갖는 루시퍼라제 리포터의 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3f는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 7oxo 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3g는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 seed 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3h는 AC16, H9c2, rCMC, 마우스 심장에서의 miR-1 발현을 나타낸 도면이다.
도 3i는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 GFP에 miR-1 7oxo, 3oxo, 2oxo 사이트를 가지는 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3j는 H9c2 세포에서 miR-1 7oxo 사이트를 포함하는 GFP의 크기 (log10(FSC)) 및 GFP 값 (log10(GFP))의 분포를 나타낸 도면이다.
도 3k는 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용한 dFP 리포터 정량 결과를 나타낸 도면이다.
도 3l은 H9c2 세포에서 dFP 리포터 분석을 이용한 miR-1:7o8G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT)의 활성을 확인한 도면이다.
도 3m은 H9c2 세포에서 NAC 처리에 따른 dFP 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3n은 H9c2 세포에서 유세포 분석을 이용하여 RFP에 miR-1 7oxo 사이트를 가지는 dFP 리포터를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3o는 H9c2 세포에서 리포터 값 (RFP)이 25%로 가장 낮은 제한된 세포 집단만 고려할 때의 dFP 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 3p는 H9c2 세포에서 2o8G, 3o8G, 7o8G, 및 miR-1의 존재 하에 miR-1 seed 사이트를 가지는 루시퍼라제 리포터 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a는 PE 또는 NAC 처리된 rCMC 세포에서 miR-1 발현의 효과를 확인한 도면이다.
도 4b는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:o8G (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7o8G) 또는 miR-1:2U, miR-1:3U, miR-1:7U로 형질감염된 rCMC 세포에서 세포 크기를 확인한 도면이다.
도 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 산화된 miR-1 (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7o8G) 또는 miR-1:U (miR-1:2U, miR-1:3U, miR-1:7U)로 형질감염된 H9c2의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도면이다 (scale bar, 50μm).
도 4d는 본 발명의 일 구현예에 따른 PE 및 NAC 처리에 의한 심장 비대 마커 ANP의 발현 증가를 확인한 도면이다.
도 4e는 miR-1:7U로 형질감염된 H9c2 세포의 크기 분포를 나타낸 도면이다.
도 4f는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U로 형질감염 시킨 rCMC 세포 (도 4f의 상단) 및 H9c2 세포 (도 4f의 하단)의 시간 경과 이미지를 나타낸 도면이다.
도 4g는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입하였을 때 생체 내에서 심장 비대에 미치는 영향 (도 4h의 상단) 및 qPCR 정량을 통해 심장 조직으로의 전달을 확인한 결과 (도 4h의 하단)를 나타낸 도면이다.
도 4h는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G의 생체 내 전달을 통한 마우스 심장을 나타낸 도면이다.
도 4i는 본 발명의 일 구현예에 따른 miR-1:7o8G를 마우스에 주입하였을 때 심실중격 (IS)의 면역염색 결과 및 심근세포와 ANP 발현을 확인한 도면이다.
도 5a는 간암세포인 Huh7에서 miR-122의 o8G 변형이 2번째와 3번째 염기에서 발생했을 때 인식할 수 있는 표적 싸이트에 대한 루시퍼라제 리포터를 수행한 결과를 Huh7에서 miR-122를 제거한 세포(Huh7:miR-122 KO)와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 5b는 신경교종 세포인 HS683에서 let-7의 4번째 염기가 o8G로 변형되었을 때 인식할 수 있는 4oxo site에 대한 루시퍼라제 리포터를 사용하여, 변형된 let-7의 존재를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5c는 신경교종 세포인 HS683에서 우태혈청을 제거하여 산화스트레스를 주었을 때, miR-124의 4번째 염기가 o8G로 변형되었을 때 인식할 수 있는 4oxo site에 대한 루시퍼라제 리포터를 사용하여, 변형된 miR-124의 존재를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5d는 간암세포인 Huh7에 miR-122가 o8G로 산화 변형된 형태를 도입했을 때, 세포의 이동이 달라지는 것과 miR-122:2,3o8G이 항산화제와 함께 처리했을 때, 더 효율적인 효과를 나타내는 것을 관찰한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5e는 신경교종 세포인 HS683에서 let-7의 4번째 염기가 o8G로 변형된 let-7a:4o8G를 도입했을 때 세포사멸이 일어나는 기능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5f는 신경교종 세포인 HS683에서 miR-124의 4번째 염기가 o8G로 변형된 mir-124:4o8G를 도입했을 때 세포사멸이 일어나는 기능을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a는 인간 심근병증 환자 심장의 좌심실 유래 Ago HITS-CLIP 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 Ago-mRNA cluster에서 o8G:A 결합의 빈도를 확인한 도면이다.
도 6c는 본 발명의 일 구현예에 따른 anti-seed 및 anti-7oxo의 염기 서열 (도 6c의 상단) 및 이에 대한 루시퍼라제 리포터 분석 결과 (도 6c의 하단)를 나타낸 도면이다.
도 6d는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (9x)의 miR-1 7oxo 표적 억제 활성을 나타낸 도면이다.
도 6e는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (4x)를 rCMC에 도입했을 때 나타나는 심장 비대 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 6f는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (4x) RNA 또는 α-MHC 13x 를 ISO-처리된 마우스에 주입하였을 때 나타나는 심장 비대 억제 효과를 확인한 도면이다.
도 6g는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (α-MHC 13x)의 투여에 따른 심근 세포 크기 (도 6g의 상단) 및 miR-1:7o8G 타겟 억제 효과(도 6g의 하단)를 확인한 도면이다.
도 6h는 ISO 처리 마우스 심장에서 일 구현예에 따른anti-7oxo (4x 또는 13x) 투여가 ROS 상승에 미치는 영향을 확인한 도면이다.
도 6i는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (α-MHC 13x)를 발현하는 형질전환 마우스를 생성하기 위해 설계한 재조합 벡터를 나타낸 도면이다.
도 6j는 도 5i의 재조합 벡터로 형질전환시킨 마우스에서 anti-7oxo (13x) 발현을 확인한 도면이다.
도 6k는 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스에서 심장 크기를 확인한 도면이다.
도 6l은 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스에서 miR-1:7o8G 표적의 전체적인 억제를 확인한 도면이다.
도 6m은 일 구현예에 따른 anti-7oxo (13x)로 형질전환된 마우스의 심실 중격 (IS)에서 심근 세포의 크기 감소를 확인한 도면이다.
도 6n은 ROS에 의해 유도된 miR-1:7o8G의 위치 특이적 산화 및 이의 심장 비대 유도 과정에 대한 개략도를 나타낸 것이다.
도 7a 는 혈장 샘플을 얻기 위한 일 구현예에 따른 심비대증 동물 모델에서 심비대증이 성공적으로 유도되었음을 확인한 도면이다.
도 7b 는 도 6a에서 혈장 샘플을 확보한 후 실험을 진행하는 과정을 설명한 도면이다.
도 7c 는 심비대증 및 그 대조군의 혈장 샘플에서 miRNA-1을 측정한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7d 는 심비대증 및 그 대조군의 혈장 샘플에서 o8G 면역 침강을 통해 측정한 결과 심비대증에서 산화 변형된 microRNA-1 (miR-1:o8G)이 증가됨을 확인한 도면이다.
도 8a는 H9c2 세포에서 항산화제 (N-acetylcysteine, 이하 NAC) 처리에 따른 PE에 의해 유도된 심장 비대의 감소를 면역염색으로 확인한 도면이다.
도 8b은 ISO 및 NAC 처리에 의한 마우스 심초음파 결과를 나타낸 도면이다.
도 8c는 rCMC 및 H9c2 세포에서 PE 및 NAC 처리에 따른 o8G의 면역형광염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 8d는 PE 또는 ISO를 처리하여 심근세포 비대를 유도한 H9c2 세포에 BHA와 Sigma-Aldrich사의 세포배양용 항산화제를 처리하여 심근세포 비대를 억제한 결과를 관찰한 도면이다.
도 8e는 PE로 심근세포 비대가 유도된 H9c2세포에 miR-1:7o8G을 억제하는 일 구현예에 따른 anti-miR-1-7oxo를 도입하였을 때, 항산화제인 NAC를 처리한 경우 심근세포 비대가 완전히 억제되는 것을 확인한 도면이다.
본 발명에서 용어 "뉴클레오타이드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함한다. 이들은 핵산 서열의 단량체 유닛이다.
RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스에 존재하는 하이드록실기를 결여하는 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(Adenine; A) 및 구아닌(Guanine; G), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 사이토신(Cytosine; C), 티민(Thymine; T) 및 유라실(Uracil; U), 및 그들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 뉴클레오타이드의 당은 리보스이고, 염기로는 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 또는 유라실(U)을 포함한다.
본 발명에서 용어 "표적 사이트(target site)"는 마이크로 RNA의 5’ 말단을 기준으로, 2번째부터 8번째의 염기 서열과 결합하는 표적 염기 서열을 의미한다.
본 발명에서 "발단 지역(seed region)"은 마이크로RNA의 5' 말단 기준 1번째부터 9번째 사이의 염기 서열을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 “세포”의 종류는 척추동물, 예컨대 인간을 비롯한 포유동물(인간, 원숭이, 마우스, 래트, 햄스터, 소 등), 조류(닭, 타조 등), 양서류(개구리 등), 및 어류, 또는 무척추동물, 예컨대 곤충류(누에, 나방, 초파리 등), 식물, 효모와 같은 미생물 등이 포함되며, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "심비대증 (cardiac hypertrophy)"은 심근섬유가 비대한 결과, 심중량의 증가, 심실벽이 비후된 상태를 말하며, 심장비대증, 심부전증, 심섬유증 (cardiac fibrosis), 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증의 초기증상일 수 있으나, 상기 질환들 외에 심비대증과 관련된 질환이라면 그 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 수행할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 구조물을 의미한다. 적합한 조절 서열은 전사를 수행하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에서 용어 "재조합 벡터"는 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 바람직하게는 진핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promotor), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로모터 (promotor)"는 전사조절인자들이 결합하는 DNA 염기서열 부위로 유전자 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 목적 유전자의 과발현을 유도하기 위한 것이다. 예컨대, 본 발명의 재조합 벡터는 알파MHC (αMHC) 프로모터, 베타 MHC (β MHC) 프로모터, Nkx2.5 프로모터, 심근 트로포닌 T (cardiac troponin T; TNNT2) 프로모터, 근육 크레아틴 키나아제 (muscle creatine kinase; MCK) 프로모터, 인간 알파-골격 액틴 (human α-skeletal actin; HAS) 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스 (murine stem cell virus; MSCV) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터가 작동 가능하게 연결되어 심근 세포 특이적 발현을 조절할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 알파MHC (αMHC) 프로모터가 작동 가능하게 연결된 것일 수 있으나, 상기 프로모터의 종류에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 "심근 세포 특이적"이란 용어는 심근 세포 이외의 세포에서는 발현되지 않거나 낮은 정도로 발현되는 반면, 심근 세포에서는 매우 높은 정도로 발현되는 특징을 의미한다.
본 발명에서 용어 "발현"은 폴리펩타이드 (polypeptide)가 구조 유전자로부터 생산되는 과정을 지칭하며, 상기 과정은 유전자의 mRNA로의 전사, 및 이러한 mRNA의 폴리펩타이드(들)로의 해독을 포함한다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 벡터 형태의 DNA를 세포에 물리화학적으로 직접 도입하거나 바이러스를 숙주세포에 감염시켜 외래 유전자를 발현시킴으로써 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉, 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주 세포 내에서 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, "항산화제"는 활성산소의 과량 생산을 막아주는 물질로서 세포와 조직에 있어 산화적 스트레스를 방지하는 역할을 한다. 상기 항산화제는 세포 내에서 해로운 반응을 일으키는 free radical이 DNA를 공격하거나, 지질을 산화시키기 전에 그들을 중화시킨다. 또한, 항산화제는 반응성이 높아 체내 유해물질과 반응하여 활성산소에 의한 연쇄반응을 막아 주어 세포를 보호하는 역할을 한다.
본 발명에 있어서, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 타겟으로 하는 병리생리학적 현상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 타겟으로 하는 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
마이크로RNA(miRNA)는 ~21개의 염기로 구성된 작은 RNA로써, 표적 유전자의 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하는 기능을 한다. 마이크로RNA는 주로 5'말단에 위치하는 발단지역 (seed region, positions 1-8)의 염기서열을 통해 수백 개의 표적 mRNA를 인식하여 염기 배열하고 그 발현을 억제하여 생물학적 기능을 조절한다. 따라서, 마이크로RNA의 발단지역에 구아닌(Guanine; G)의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로의 변형이 발생할 경우, 이로 인해 가능하게 된 o8G:A 염기 배열을 통해 다른 mRNA와의 염기 배열로 인해 새로운 표적을 억제할 수 있으므로, 다른 병리생리학적 기능을 조절할 수 있다.
즉, 발단지역에 발생한 산화 변형은 자연적 또는 병리적으로 발생하는 마이크로RNA의 표적체 인식을 조절하는 기작일 수 있으며, 이를 기반으로 인위적으로 병리생리학적 기능을 유도하거나 억제할 수 있는 기술 개발이 가능하다. 이전부터 RNA에서 일어나는 8-옥소구아닌 변형은 주로 인체의 노화 과정과 관련된 질환군 (degenerative disease)에서 많이 발생한다고 알려져 왔으며, 심장질환 또한 이와 관련이 깊다. 따라서 8-옥소구아닌 변형을 기반으로 한 핵산체는 여러 다양한 질병을 조절할 수 있는 가능성이 있다.
본 발명은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
상기 핵산의 이중 가닥 중 하나의 단일 가닥에서 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌을 포함할 수 있고, 상기 핵산의 이중 가닥 모두, 즉 두 개의 단일 가닥 모두 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 8-옥소구아닌을 포함할 수 있다.
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA), DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA, 및 asiRNA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, RNA 간섭을 유도하는 핵산이라면 상기 종류에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상일 수 있다:
[그룹 1]
miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
예컨대, 상기 마이크로 RNA는 miR-1, miR-122, let-7 또는 miR-124일 수 있다.
일 예로, 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 4번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-1의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 miR-1의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 miR-122의 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 것일 수 있으며, 예컨대 상기 8-옥소구아닌(o8G)은 상기 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 4번에 해당하는 위치에 존재할 수 있다.
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G:A 배열이 일어나 표적 사이트(target site)를 인식할 수 있다.
일 예로, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
[그룹 2]
서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3');
서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p- UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
상술한 RNA 간섭 유도 핵산은 세포 또는 동물에 주입할 경우, 다양한 병리생리학적 현상을 조절할 수 있으며, 예를 들어, 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸(apoptosis) 등이 유도될 수 있다.
일 예로, miR-1의 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대가 유도될 수 있다.
일 예로, miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하고 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 간암세포에 주입할 경우 간암세포의 이동 억제가 유도될 수 있다.
일 예로, let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하고 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산은, 신경교종 세포에 주입할 경우 세포사멸이 유도될 수 있다.
본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 항산화제는 RNA 간섭 유도 핵산의 추가적인 산화, 즉 추가적인 구아닌(G)에서 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화를 방지하여 RNA 간섭 유도 핵산이 더욱 효과적으로 병리생리학적 현상을 조절할 수 있도록 한다. 상기 항산화제는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 항산화제를 모두 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)의 위치 동정 방법을 제공한다:
(a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌(o8G)의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
(d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (Guanine; G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
상기 8-옥소구아닌(o8G)의 위치 동정 방법은 RNA를 역전사하여 Cdna를 제조하고 이를 시퀀싱함으로써, 기존의 위치 동정 방법보다 정확하게 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 위치를 동정할 수 있다.
또한, 본 발명은 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 제공한다.
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상, 예를 들어, 6개, 7개 또는 8개 의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 변형 핵산은 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로 RNA와 특이적으로 결합할 수 있다.
상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 변형 핵산은 5’-ACAUUCA-3’, 5’-ACAUUAC-3’, 5’-AAAUUCC-3’중 하나 이상의 염기 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 DNA를 포함할 수 있으며, 상기 DNA는 본 발명의 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예컨대, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 아데닌(A)일 경우 티민(T) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 구아닌(G)일 경우 사이토신(C) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 사이토신(C)일 경우 구아닌(G) 염기, 심비대증 억제를 위한 변형 핵산의 염기가 유라실(U)일 경우 아데닌(A) 염기를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상술한 변형 핵산 또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 예로, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산을 포함할 수 있다.
상기 변형 핵산이 특이적으로 결합하는 상기 변형된 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p 중 어느 하나가 변형된 것일 수 있다.
상기 변형된 마이크로 RNA는, 예컨대 miR-1이 변형된 것일 수 있으며, 예컨대 miR-1의 5'말단으로부터 2번째, 3번째, 7번째 또는 이들의 조합에 해당하는 위치의 구아닌(G) 변형된 것 일 수 있다.
일 예로, 상기 심비대증 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 항산화제를 모두 사용할 수 있으며, 예컨대 NAC, BAH 또는 세포배양용 항산화제(A1345; Sigma-Aldrich)를 더 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상술한 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물을 제공할 수 있다.
일 예로, 상기 간암치료용 약학 조성물은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 miR-122의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 이들의 조합에 위치하는 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 염기 서열을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 교모세포종 치료용 약학 조성물은 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥이 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드를 포함하되, 이 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 RNA 간섭 유도 핵산을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 let-7 또는 miR-124의 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 5'말단으로부터 4번째에 위치하는 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 치환된 염기 서열을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 간암치료용 약학 조성물은 RNA 간섭 유도 핵산 이외에도 항산화제를 더 포함할 수 있으며, 상기 교모세포종 치료용 약학 조성물도 마찬가지로 RNA 간섭 유도 핵산 이외에 항산화제를 더 포함할 수 있다. 상기 항산화제는 일반적으로 사용되는 항산화제를 의미하며, 예컨대 NAC, BAH 또는 세포배양용 항산화제(A1345; Sigma-Aldrich)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물은 항산화제를 더 포함함으로써, RNA 간섭 유도 핵산이 세포내의 활성산소에 의해 다른 구아닌(G)이 추가적으로 산화하는 것을 방지하여 그 기능을 극대화할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 피부 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이 때, 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 항산화제는 마이크로RNA의 5’말단 기준 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 산화 변형을 억제하는, 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항산화제는 구아닌(G) 염기가 8-옥소구아닌(o8G)으로 산화 변형되는 것을 억제하는 역할을 하며, 예컨대 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC), 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA), 아스코르브산 (ascorbic acid, Vitamin C), 글루타티온 (glutathione), 우레이트 (urate), 빌리루빈 (bilirubin), 비타민 E, 카로티노이드 (carotenoids), 유비퀴논 (ubizuinol, Co-Q10), 플라보노이드 (flavonoids), 항산화효소인 SOD (superoxide dismutase), 카탈라제 (catalase), 글루타티온 퍼옥시다아제 (glutathione peroxidase, GSH-PX), 글루타티온 리덕타아제 (glutathione reductase), 글루타티온 트랜스퍼라아제 (glutathione transferase), SOD 모사체 (CuDIOS), 엡셀렌 (ebselen), 라자로이드 (lazaroids, 21-aminosteroids), 포획성 올레핀 (captodative olefins), α-리포산 (α-lipoic acid)과 디하이드로리포산 (dihydrolipoic acid)(DHLA), 5-HTP (hydroxytryptophan), DHEA (dehydroepiandrosterone), 아미노산, 본초 항산화제 (herbal antioxidants), 및 미네랄로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)일 수 있으나, 상기 항산화제의 종류에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 동물의 심근 세포로부터 분리된 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는,
심비대증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 심비대증의 발병 여부를 확인하는 것이다.
일 예로, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드일 수 있다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 상기 심비대증 억제를 위한 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
(b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입시키는 단계; 및
(c) 상기 수정란을 대리모에 이식한 후 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법 및 상기 방법으로 제작된 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델을 제공한다.
일 예로, 상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p일 수 있으며, 예컨대 miR-1일 수 있다.
예컨대, 상기 동물은 비-인간인 영장류, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 말 또는 소일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 동물은 마우스일 수 있으나, 인간을 제외한 포유류라면 그 종류에 특별히 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 벡터 형태의 DNA를 세포에 도입하는 방법으로는 특별히 제한이 없으며, 예컨대 뉴클레오펙션 (nucleofection), 일시적인 형질감염 (transient transfection), 세포 융합, 리포좀 매개된 형질감염 (liposem-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염 (polybrene-mediated transfection), 인산칼슘을 이용한 형질감염 (Graham, FL 등, Virology, 52:456(1973)), DEAE 덱스트란에 의한 형질감염, 미세주사에 의한 형질감염 (Capecchi, MR, Cell, 22:479(1980)), 양이온성 지질에 의한 형질감염 (Wong, TK 등, Gene, 10:87(1980)), 전기천공법 (Neumann E등, EMBO J, 1:841(1982)), 형질도입 또는 트랜스펙션과 같이 문헌 (Basic methods in molecular biology, Davis 등, 1986 및 Molecular cloning: A laboratory manual, Davis 등, 1986)에 기재된 바와 같이 본 발명이 속한 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 익히 공지되어 있는 방법들에 따라 이뤄질 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
(b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌(G)의 8-옥소구아닌(o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
(c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드의 o8G:A 배열 표적 사이트와의 결합 빈도에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미하며, 화학물질, 단백질, (폴리)뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA (small interference RNA), 또는 천연물 추출물 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 항산화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 억제 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간암 전이 억제 또는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 심비대증 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "개체"는 심비대증 억제를 위한 변형 핵산 또는 간암치료 또는 교모세포종 치료를 위한 RNA 간섭 유도 핵산 또는 항산화제를 포함하는 조성물의 투여를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서, "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 심비대증 억제를 위한 변형 핵산 또는 간암치료 또는 교모세포종 치료를 위한RNA 간섭 유도 핵산 또는 항산화제를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 변형 핵산의 심비대증 억제 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RAN 간섭 유도 핵산의 간암 전이 억제 및 간암 치료 또는 교모세포종 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 심비대증 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양, 약물 처리 및 형질감염
1. 세포 배양
랫트(rat) 심근 아세포주 H9c2 (H9c2(2-1), ATCC CRL-1446; H9c2, 한국 세포주 은행), 인간 심실 심근 세포주 AC16 (J. Han, H.-W. Lee, 및 W.J.Park 제공), 및 인간 자궁 경부 선암종 세포주 HeLa (ATCC CCL-2)를 10% 소 태아 혈청 (FBS; Gibco), 100 U/ml 페니실린(penicillin), 및 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin, Welgene)이 보충된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Hyclone)에서 37℃, 5% CO2 배양 조건으로 성장시켰다.
결과의 일관성을 위해 두 개의 서로 다른 시설 (ATCC 및 한국 세포주 은행)에서 유지되는 H9c2의 여러 가지 다른 무리(batch)를 사용하였으며, AC16은 Dr. M.M. Davidson으로부터 제공받아(scc109, Millipore) 유래된 각각 다른 무리로부터 얻었다.
랫트 신생아 심근 세포 (rCMC)의 1 차 배양은 제조사의 프로토콜에 따라 Neomyt kit (nc-6031; Cellutron)를 사용하여 Seok, H. Y. et al. Circ Res 114, 1585-1595. 및 Huang, Z. P. et al. Circ Res 112, 1234-1243.에 전술한 바와 같이 준비하였다.
즉, 출생 후 1 일 (P1)에 Sprague Dawley 랫트 심장 유래 심실 조직을 수집한 후, 세척하고 3 내지 4mm 조각으로 잘랐으며, 37℃에서50ml 플라스크에서 교반하고, 심실 조각 유래 세포를 반복된 효소 반응 (Neomyt kit에 의해 제공된 용액)에 의해 완전히 분리시켰다. 수득한 상층액에서 strainer를 이용하여 소화되지 않은 조직을 제거한 다음, 초기에 2 시간 동안 플레이팅하여 쉽게 부착되는 비 심근 세포를 제거하였다. 마지막으로, 부착되지 않은 rCMC를 회수하고 10% FBS (Gibco), 5% 말 혈청 (HS; Welgene), 2% L-glutamine (Welgene), 0.1mM 5-Bromo-2'-deoxyuridine (Sigma-Aldrich), 100 U ml-1 페니실린, 및 100 μg ml-1 스트렙토마이신(Welgene)이 보충된 DMEM:M199 (Welgene)의 4:1 혼합물과 함께 SureCoat (sc-9035; Cellutron) 배양 플레이트에서 유지하였다.
2. 약물 처리
아드레날린성 비대를 유도하기 위해, 달리 지시되지 않는 한, rCMC, H9c2 또는 AC16을 일반적으로 200μM 페닐에프린(phenylephrine, PE) 또는 10μM 이소 프로테레놀(isoproterenol, ISO)로 처리하고 처리 48시간 후에 검사하였다. 혈청 결핍이 심근비대에 대한 전처리 조건으로 사용되기도 하기 때문에, 처리 24시간 전에 FBS 및 HS가 없는 동일한 배지를 대체하였다. 산화 방지제를 처리하는 경우, PE 또는 ISO를 처리하는 동안 2mM N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine, NAC)을 적용하였다.
3. 형질 감염
일반적으로, H9c2, AC16, rCMC 또는 HeLa 세포 내로의 이중 miRNA를 갖는 벡터의 형질감염(transfection) 또는 동시형질감염(cotransfection)은 Lipofectamine 2000 또는 3000 (Invitrogen)을 사용하여 수행되는 반면, miRNA 또는 miRNA 억제제 (50nM)의 형질감염은 RNAiMAX (Invitrogen) 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)을 사용하여 제조업체가 제공한 일반적인 프로토콜에 따라 수행하였다. 최대 효율을 달성하기 위해, Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)를 사용하여 정확한 수의 세포를 계수하였으며 형질감염 전에 플레이트에 분주하였다.
실시예 2. ROS 및 세포 크기 측정
세포 ROS 수준의 정량적 측정을 위해, 유세포 분석법은 ROS 형광 염료에 기초하고, 다이하이드로에티디움(dihydroethidium, DHE)을 Muse Oxidative Stress Kit (Milipore)와 함께 Muse Cell Analyzer (Milipore)를 사용하여 적용하였다. 즉, 약물 처리 전날 H9c2 또는 AC16 세포를 106 cell/6 well-plate의 밀도로 분주하였다. 처리 후 10분부터 48 시간까지 세포를 회수하고, 고정, 염색하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 반복한 후 (n=3) 측정하였다. 분석을 위해, 동일한 수의 세포 (n=10,000)를 ROS 수준 및 세포 크기 모두에 대해 정량 하였다. FSC (Forward-Scattered Light)는 제조업체의 프로토콜에 따라 세포 크기로 측정되었다 (log10(FSC), y축; 비대, 세포 크기>3).
심장 조직 용해물에서 ROS의 양을 측정하기 위해, CM-H2DCFDA (Invitrogen)를 사용하였다. 프로테아제 억제제 (cOmplete, Mini, EDTA-free; Roche) 및 2.5 mM 데페록사민 메실레이트(deferoxamine mesylate, DFOM; Sigma-Aldrich)이 보충된 1x RIPA 용해 완충액 (DyneBio)에서 제조된 균질화된 용해물을 Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen)를 사용하여 단백질에 대해 정량화하였다. 100μg의 용해물을 어두운 곳에서 37℃로 30분 동안 2μM CM-H2DCFDA와 함께 배양하였다. 형광 신호는 Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen)에 의해 검출되었다.
세포 ROS 수준을 시각화하기 위해, DHE (Invitrogen)가 사용되었다. 처음에, 24 시간 동안 H9c2 세포의 혈청을 결핍시키고 지시된 시점까지 100 μM PE로 처리 하였다. 그리고 나서 회수된 세포를 무혈청 DMEM으로 세척하고 빛을 피하면서 10 분 동안 37℃에서 10 μM의 DHE와 함께 배양하였으며, 배양 후 세포를 무혈청 DMEM으로 다시 세척하였다. ROS 이미지는 역 형광 현미경 (Leica DMi8)을 사용하여 얻었다.
실시예 3. 면역형광염색 (Immunofluorescence staining)
H9c2 또는 rCMC를 4% paraformaldehyde (PFA; Biosesang)로 15 분 동안 실온에서 고정시켰다. 이를 0.1% NP-40 (Sigma-aldrich)을 함유하는 PBS (Biosesang)로 2 회 세척 한 후, 샘플을 5% 소 혈청 알부민 (BSA; Bovogen)을 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 배양하였다. 그런 다음 2 회 세척하고, 다음의 조건으로 일차 항체를 배양하였다; 0.1% NP-40 및 3% BSA를 포함하는 PBS에서 4℃로 밤새; MF20 (1:1000, Developmental hybridoma), o8G (15A3, 1:1000, QED Bioscience) 및 Ago2 (ab5072, 1:200, Abcam). DAPI (1.5μg/ml, Vector lab)는 핵 염색에 사용하였다. H9c2 심근 아세포에서 상이한 정도의 운명 이질성때문에 (모든 H9c2 세포가 심근 세포와 동일한 계통에 있음에도 불구하고), MF20을 사용하여 심근 세포를 염색하였다. RNase의 처리를 위해, 일차 항체를 배양하기 전에 10μg/ml의 RNaseA (Invitrogen)를 실온에서 15 분 동안 사용하였으며, Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (1:1000, Abcam) 및 Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG (1:1000, Abcam)는 0.1% NP-40을 포함하는 PBS에서 실온에서 1시간 동안 2차 항체로서 사용되었다. 염색된 세포는 역 형광 현미경 (Leica DMi8)으로 조사하고, Leica Application Suite (LAS)로 분석하였으며, ImageJ (≥100 cells, https://imagej.nih.gov/)로 정량화하였다.
실시예 4. 세포 크기 측정
배양액 또는 조직 절편으로부터의 세포 크기를 ImageJ 1.51s 소프트웨어 (https://imagej.nih.gov/)에서 "측정"기능을 사용하여 정량하였다. 모든 이미지를 여러 이미지에서 일관된 비교를 위해 35.56 x 26.67 inch2에 해당하는 2560 x 1962 픽셀 크기로 변환하였다. 이어서, 변환된 이미지에서 세포 면적을 inch2 (71.9 pixel/inch)의 단위로 측정하고 다음 분석에 사용하였다.
실시예 5. RNA 합성 및 변형
TriLink Biotechnologies (USA), Integrated DNA Technologies (USA), ST Pharm (Korea) 및 Bioneer (Korea)의 맞춤형 합성 및 변형 서비스를 사용하여 다양한 변형을 가진 RNA를 생산했으며, 그 품질을 질량 분석을 통해 모니터링 및 확인하였다.
리보뉴클레오티드 내의 8-옥소구아닌(o8G)을 miR-1(5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 7)의 표시된 위치에 도입하였다; miR-1:7o8G, 5'p- UGGAAUo 8 GUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 3); miR-1:2o8G, 5'p-Uo 8 GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 1); miR-1:3o8G, 5'p-UGo 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 2).
산화된 유도체를 포함하는 miR-1의 이중체(duplex)는 합성된 miR-1 passenger 가닥 (5'p-ACAUACUUCUUUAUAUGCCCAUA-3'(서열번호 8), 전달을 확인하는 경우, fluorescein isothiocyanate(FITC)가 5'말단에 부착됨)에 어닐링함으로써 in vitro에서 하기 조건으로 생성되었다; 90℃에서 2분, 30℃에서 1시간, 및 4℃에서 5분 동안.
또한, 리보뉴클레오티드 내의 8-옥소구아닌(o8G)을 miR-122(5'p-UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3';서열번호 68), let-7(5'-pUGAGUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'; 서열번호 69) 및 miR-124(5'-p UAAGGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3';서열번호 70)의 표시된 위치에 다음과 같이 도입하였다; miR-122:2,3o8G, 5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3'(서열번호 65); let-74o8G: 5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3'(서열번호 66); miR-124:4o8G, 5'-p UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3'(서열번호 67).
산화된 유도체를 포함하는 miR-122, let-7 및 miR-124의 이중체(duplex)는 miR-1의 이중체(duplex)와 동일한 방법으로 제작되었다.
표시된 위치에서 G>U로의 치환을 포함하는 miR-1도 합성하였으며 (miR-1:2GU, 5'p-UUGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 9); miR-1:3GU, 5'p-UGUAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 10); miR-1:7GU, 5'p-UGGAAUUUAAAGAAGUAUGUAU-3'(서열번호 11)) miR-1의 passenger 가닥으로 이중체화되었다. 대조군 miRNA로서, cel-miR-67 (D. Dharmacon에 의해 음성 대조군으로 제공된 C. elegans-특이적 miRNA)로부터 유래된 비표적 miRNA (NT) (5'-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUA-3'; 서열번호 12)를 siRNA로서 합성하고 이중체 (가이드 가닥: 5'p-UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAdTdT-3'(서열번호 13), passenger 가닥: 5'p-UACUCUUUCUAGGAGGUUGUGAdTdT-3'(서열번호 14), 'dT'는 thymidine deoxynucleotide를 나타낸다)로 사용하였다. seed-매개 오프-타겟 효과를 배제하는 경우, NT는 이전에 보고된 바와 같이 가이드 및 passenger 가닥 둘 다에서 6번 위치에서 dSpacer (abasic deoxynucleotide; Ψ)를 포함하거나 1번 및 2번 위치에서 2'-O-methyl을 포함하도록 추가로 변형되었다.
o8G 유도된 G>T 돌연변이를 확인하기 위해, o8G:A 염기 결합을 통해 RT-PCR 동안 잠재적으로 EcoR1 사이트를 생성하는 39-oxo-R (o8G; 5'- CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUo 8 GCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3'; 서열번호 15), 및 이의 대조군으로 39R (G; 5'-CCUGGUCCCAGACUAAAGAAUGCUUGACAGUUAUCUCGUAUGCCGUCUUCUCGAGGUAGCGGAACCGUGAGCUUUGAAGU-3'; 서열번호 16)을 합성하였다. Spike-in 대조군으로서 o8G spike-in (5'p-Uo 8 Go 8 GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 17), G spike-in (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 18), 및 miRNA:o8G spike-in (5'p-UAAGo 8 GCACGCGGUGAAUGCCAA-3'; 서열번호 19)을 합성하였다.
경쟁적인 miR-1 및 miR-1:7o8G 억제제의 경우, anti-seed (2x: 5'-dTdTΨACAUUCCAΨACAUUCCAΨdTdT-3' (5'-ACAUUCC-3'는 miR-1 seed site; 서열번호 20)), anti-7oxo (2x: 5'-dTdTΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨdTdT-3', 4x: 5'-dTAAAUUCC AAAUUCCAGAAAUUCCACAAAUUCCAdT-3', 9x: 5'-dNdNΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨAAAUUCCAΨdNdN-3'; 'dN'은 데옥시뉴클레오티드, A, T, C 또는 G를 나타낸다 (5'-AAAUUCC-3'는 miR-1 7oxo site; 서열번호 6)), cont(anti-NT; 2x: 5'-dTdTΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨdTdT-3', 4x: 5'-dTGGUUGUG GGUUGUGAGGGUUGUGACGGUUGUGAdT-3', 9x: 5'-dNdNΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨGGUUGUGAΨdNdN-3' (5'-GGUUGUG-3'는 cont NT site; 서열번호 21)을 합성하였다. 억제제의 5' 및 3' 말단 모두에서 "dT" 또는 "dN"을 의도적으로 RNA 안정성에 기여하도록 부착하였다. 접합(junction)에서 추정되는 서열을 통한 오프-타겟 효과를 막기 위해 anti-seed (2x) 또는 anti-7oxo (2x)에서 타겟 부위의 접합에 무염기(abasic) 데옥시뉴클레오티드 (Ψ)를 도입함으로써 무염기 데옥시뉴클레오티드가 없는 억제제로부터 표현형에 차이가 없음을 확인하였다. 상기 서열에서 밑줄은 상응하는 표적 억제부위를 나타낸다.
실시예 6. RNA 추출
크기에 따라 RNA를 정제하기 위해 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조업체에서 제공한 프로토콜에 따라 작은 (<~200nt) 및 큰 (>~200nt) RNA 분획을 분리하였다. 심장 조직 샘플의 경우, Minilys Personal Homogenizer (Bertin) 또는 유리 Homogenizer를 700μl Qiazol Lysis Reagent (Qiagen)의 존재 하에 사용하였고, 이전에 보고된 시험관 내 산화를 방지하기 위해 2.5mM DFOM (Sigma-aldrich)으로 보충하였다. 전체 RNA 정제를 위해, 2.5mM DFOM을 갖는 Qiazol Lysis Reagent만 20% 클로로포름 (Merck)을 첨가 한 후 사용하였고, 이어서 이소프로필 알코올로 RNA 침전시키고 RQ1 RNase free DNase (37℃에서 30분; 열 불활성화와 함께 용액 정지, 65℃에서 10분; Promega)를 처리하였다. RNA의 정확한 정량을 위해, 분광광도계 (Denovix) 및 Qubit 형광 정량 (Invitrogen)을 사용하였다.
miRNA를 정제하기 위해, 총 RNA로부터 ~20nt의 겔 추출을 수행하였다. 겔 로딩 완충제 II (90℃에서 2분; Ambion)에서 변성된 총 RNA를 ~20nt miRNA 마커 (합성된 miR-1)의 표시와 함께 15% Urea-PAGE 겔에 의해 분리하였으며, 그 크기는 14-30 ssRNA Ladder 마커 (Takara)로 교차 확인하였다. 그리고 나서 SYBR Gold로 염색한 후, 겔에서 ~20nt 크기를 잘라내고, 겔 추출 완충액 (0.5M 암모늄 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 0.1% SDS, 1mM EDTA, pH 8.0)과 함께 65℃에서 밤새 thermomixer (Thriller, Peqlab)에서 배양하였으며, Oligo Clean & Concentrator 키트 (Zymo)로 추가 정제하였다.
실시예 7. ELISA를 통한 o 8 G의 정량
o8G의 비색 검출 및 정량화는 제조사의 프로토콜에 따라 OxiSelect Oxidative RNA Damage ELISA kit (Cell Biolabs)를 사용하여 수행하였다. 샘플의 제조로서, 정제된 작은 RNA 또는 큰 RNA (0.4-5μg)를 37℃에서 1시간 동안 Nuclease P1 (Wako)로 처리하고, 에탄올 침전을 통해 추출하고, 항-o8G 항체의 결합을 위해, o8G/BSA 컨쥬 게이트와 경쟁하도록 첨가하고, 플레이트 상에 사전 코팅하였으며 이어서 검출을 위해 해당 키트에서 제공하는HRP결합된 이차 항체에 반응시켰다. 샘플의 흡광도는 분광 광도계 (450nm, GloMax-Multi Detection System; Promega)로 측정하였으며, o8G의 농도는 미리 결정된 o8G 표준 곡선과 비교하여 추정되었고 상대량으로 나타내었다.
실시예 8. 약물 처리
모든 실험 절차는 고려대학교 실험동물운영위원회의 승인을 받았으며 동물 보호 및 실험 동물 사용 가이드를 준수하여 수행하였다. 아드레날린성 심장 비대를 유도하기 위해, ISO (75 mg/kg)를 총 29일 동안 2 일마다 8 주에서 12 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스(Koatech)에 복강 내 주사(IP)를 통해 투여하였다. 모의-주입 대조군(Mock)으로서, 동일한 부피의 PBS를 사용하였으며, 항산화 효과를 조사하기 위해 100 mg/kg NAC를 투여하였다. 주사된 약물에 따라 마우스를 여러 그룹으로 나누었다 (각 그룹마다 n=4, 샘플 크기는 이전 연구(Lee, H. S. et al. Nature communications 6, 10154) 에서 사용된 최소 수에 기초하여 선택됨): Mock, ISO, ISO+NAC, 및 NAC. 처음 주사하고 29일 후, 각각의 심장 중량(heart weight, HW), 체중(body weight, BW) 및 경골 길이(tibia length, TL)를 측정하여 심장 조직을 수집하고; HW/BW 또는 HW/TL을 표준화된 심장 크기로 사용하였다. 모든 샘플은 ROS 측정, CLEAR-CLIP 및 RNA 추출에 이어서 o8G ELISA, 도트 블롯(dot blot), 노스웨스턴, IP 및 qPCR에 대해 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 파라콰트(paraquat) (Sigma-Aldrich) 처리를 위해, 10 mg/kg 파라콰트를 매주 총 4 주 동안 IP를 통해 마우스에 투여하였다. 그런 다음, RNA를 추출하여 ELISA에 사용 하였다. RNA-Seq의 경우, 1일, 3일 및 5일에 ISO를 3회 IP 주사하고 1 주일 후에 마우스 (n=3)를 희생시켰으며, 동일한 부피의 PBS를 대조군으로 주입하였다. RNA-Seq 라이브러리 및 qPCR 분석을 구축하는데 사용될 때까지 모든 샘플은 -80℃에서 보관하였다.
실시예 9. 심초음파
심장 초음파를 모니터링하고 삼성 의료 센터의 동물 이미징 핵심 시설의 통제 하에 기록하였다. 구체적으로, 마우스는 처음에 마취를 유도하기 위해 2~5% 이소 플루란(isoflurane)에 노출시키고 ~5분 동안의 심초음파 기록 (Visual Sonics Vevo 2100 Imaging System)을 측정하는 동안 1% 이소플루란으로 유지하였다. M-모드 tracing 하에서 2-D 짧은축(short-axis)은 개별 기록 위치, 마우스의 유두 영역을 고정시키기 위해 적용되었다. 이완기 및 수축기 벽 두께를 포함하는 심박수, 좌심실 (left ventricular, LV) 치수, 및 LV 말기-이완기 및 말기-수축기 챔버 치수를 측정하였다.
실시예 10. 도트 블롯(dot blot) 및 노스웨스턴 블롯(northwestern blot) 분석
도트 블롯의 경우, 크기별 RNA (80-300ng) 또는 겔 정제된 miRNA (50ng)가 Zeta-Probe 블롯팅 막 (Bio-Rad)에 점으로 표시되었고, Spectrolinker XL-1000 (Spectroline)에서 최적의 가교 (120mJ/cm2) 옵션으로 UV 조사에 의해 가교결합 되었다. 노스웨스턴 블롯의 경우, 총 RNA는 Gel Loading Buffer II (90℃에서 2 분; Ambion)에서 변성시키고, 22nt miRNA 사이즈 마커 (합성된 miR-1)를 사용하여 15% Novex TBE-Urea 겔 (Invitrogen)로 분리하였으며, Zeta-Probe 블롯팅 막으로 옮기고, UV (120mJ/cm2, Spectrolinker XL-1000)로 가교결합 시켰다. 상기 막은 실온에서 1시간 동안 5% BSA와 함께 1 x TBST (Biosesang)로 차단하고 실온에서 1 시간 동안 1 x TBST에서 항-o8G 항체 (15A3, 1:2000; QED Bioscience)와 함께 배양 하였다. 그런 다음, HRP가 결합된 goat anti-mouse IgG (1:5000, Pierce)를 실온에서 1시간 동안 TBST에서 사용하고, 이어서 검출을 위해 ECL (SuperSignal West Pico PLUS, Pierce)과 반응시켰다. 형광단이 결합된 2차 항체 (Alexa Fluor 680 Goat anti-mouse IgG, 1 x TBST에서 1:15000, Invitrogen)를 사용하는 경우, Blocker FL 형광 차단 버퍼 (ThermoFisher)를 차단 및 항-o8G 항체와 함께 배양하는데 둘 다에 사용하였다. 형광 신호를 iBright FL100 이미징 시스템 (Invitrogen)에 의해 직접 정량하고, SYBR Gold (1:10000, Invitrogen)에 의해 염색된 점으로 표시된 RNA의 총량에 대한 상대적인 강도로 계산하였다.
실시예 11. o 8 G 면역 침강(Immunoprecipitation, IP)의 최적화
항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)에 대한 o8G의 면역 침강 (IP) 조건을 최적화하기 위해, 2 개의 o8G 염기를 포함하는 합성 20nt-길이 RNA인 o8G spike-in (5'p-Uo8Go8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3')을 o8G가 없는 G spike-in (5'p-UGGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3')과 비교하였다. 항-o8G 항체가 부착된 비드(bead)를 제조하기 위해, 2.5 μg의 항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)를 실온에서 1 시간 동안 25 μl의 Dynabeads Protein G (Invitrogen)와 200 μl의 PBS에서 배양 하였다. 항-o8G 항체의 비특이적 상호 작용을 막기 위해, 250 μg의 데옥시구아노 신(deoxyguanosine) (dG, Sigma-Aldrich)의 첨가가 또한 비드(bead) 제조 동안 시험되었다. 세척 및 정제를 위해 DynaMag-2 magnet (Invitrogen)을 사용하여 Dynabeads Protein G를 분리하였다. PBS로 3번 비드를 씻은 후 o8G spike-in vs. G spike-in (10pg 또는 100pg, 300ng small RNA의 존재하에)을 위해 IP 버퍼의 다른 조건을 확인하였다; 0.04% NP-40를 함유한 PBS; 저세정제, 0.004% NP-40를 함유한 PBS; 고세정제, PXL (PBS, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate, 0.5% NP-40). 참고로, 모든 IP 공정은 2.5mM DFOM 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)의 존재 하에 4℃에서 2 시간 동안 수행되었다.
세척 완충제의 다른 조건들도 검사하였다; 고세정제, IP 버퍼 (2 회)> PXL (4회)> PBS (2회); 염 추가, 100mM NaCl로 보충된 PBS (3회)> PBS (5회); 고염으로 일련의 세척, TE (15mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM EDTA)> 고세정제를 함유한 TE (1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, 및 2.5mM EGTA) 및 고염 (1M NaCl)> 고세정제 및 염을 함유한 TE (120mM NaCl)> 세척 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM MgCl, 150mM NaCl, 0.05% NP-40); 극도의 염으로 일련의 세척, TE> 고세정제 및 고염을 함유한 TE> 고세정제 및 극도의 염 (2M NaCl)을 함유한 TE> 고세정제 및 염을 함유한 TE> 세척 버퍼. 비드 내의 RNA를 2.5mM DFOM 및 20% 클로로포름이 보충된 700μl의 Qiazol Lysis Reagent로 정제한 다음 RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용하였다. Spike-in control의 크기가 22nt이기 때문에, o8G spike-in 및 G spike-in의 양은 miRNA에 대한 정량적 RT-PCR (qPCR)에 의해 측정되었으며, 이의 상대적인 비율은 신호:IP 공정에서의 노이즈를 추정하는데 사용되었다.
실시예 12. miRNA에 대한 정량적 RT-PCR(qRT-PCR)
miRNA를 정량화하기 위해, miRNA qPCR 방법 또는 TaqMan MicroRNA 분석법 (Applied Biosystems)을 사용하였다. 구체적으로, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)에 의해 정제된 1μg의 small RNA 또는 IP 정제된 RNA는 Poly(A) Polymerase (Ambion)를 사용하여 총 10μl 부피로 폴리아데닐화 시켰다. 이어서 폴리아데닐화 된 RNA를 2μM의 올리고(dT) adaptor 프라이머 (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTVN-3′; 서열번호 22)와 함께 SuperScript III 역전사 효소(reverse transcriptase) (Invitrogen)를 사용하여 역전사 시켰다. qPCR 반응은 정방향 (표적 miRNA로서 동일한 서열) 및 역방향 프라이머 (5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′; 서열번호 23)와 함께 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)에서 수행되었다; 사이클링 조건 (95℃에서 5분; 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 및 72℃에서 20초의 45 cycles; 및 72℃에서 5분). U6 snRNA는 o8G 또는 G spike-in (forward: 5′-TGGAATGTAAAGAAGTATGTAT-3’(서열번호 24), reverse: 5′- GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC-3′(서열번호 25)) 또는 miRNA:o8G spike-in (forward: 5′-TAAGGCACGCGGTGAATGCCAA-3′(서열번호 26), reverse: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCAC -3′(서열번호 27))을 사용하는 것을 제외하고, 일반적으로 참조 대조군 (control, forward: 5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′(서열번호 28), reverse: 5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′(서열번호 29))으로서 측정되었다.
TaqMan MicroRNA Assay를 사용하는 경우, 제조업체가 제공한 프로토콜을 따라 수행하였다. 즉, 100ng의 small RNA를 각각의 miRNA 서열을 인식하는 특정 RT 프로브와 함께 MicroRNA 역전사 키트 (Applied biosystems)를 사용하여 역전사 시켰다. RT 산물과 함께, qPCR 반응을 특정 qPCR 프라이머와 TaqMan Universal PCR Master Mix (No AmpErase UNG; Invitrogen)에서 수행하였다. 특정 miRNA를 검출하는데 사용된 RT 프로브 및 qPCR 프라이머는 다음과 같은 키트에 의해 공급되었다; rCMC에서 miR-1b, hsa-miR-1 (ID: 002222); rCMC에서 miR-1-3p, rno-miR-1 (ID: 002064); rCMC에서 miR-184, has-miR-184 (ID: 000485); rCMC에서 let-7f, hsa-let-7f (ID: 000382); H9c2, AC16, rCMC 및 마우스 심장에서 miR-1, hsa-miR-1 (ID: 00222); U6, U6 snRNA (ID: 001973); o8G 또는 G spike-in, hsa-miR-1 (ID: 002222); miRNA:o8G spike-in, mmu-miR-124a (ID: 001182); NT, cel-miR-67-3p (ID: 000224). 모든 qPCR 분석은 기술적 복제물 (n=3) 및 역전사 효소 없이 동시 반응(parallel reaction) (음성 대조군)을 갖으며 Rotor-Gene Q (Qiagen)에 의해 수행되었다.
실시예 13. RT-PCR에서 o 8 G>T 전환 분석
o8G가 A와 쌍을 이룰 수 있기 때문에, 합성된 39-oxo-R에서 GAAUo8GC에서 GAATTC (EcoRI 부위)로의 변화에 기초하여 G>T 전환을 유도하는 효능을 조사하였다. RT 프라이머 (5'-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCGCTACCTCGAGAAGACGGCATACGA-3'(서열번호 30), Bioneer)와 함께 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen)에 의해 o8G 대조군 (39-oxo-R) 및 G 대조군 (39R)의 역전사를 수행하였다. cDNA는 PCR 반응 (98℃에서 10 초; 98℃에서 10초, 40℃에서 30초, 72℃에서 20초의 30 cycle; 및 72℃에서 10분)에서 프라이머 (forward: 5'-CCTGGTCCCAGACTAAAGAAT-3'(서열번호 31), reverse: 5'-ACTTCAAAGCTCACGGTTCCG-3'(서열번호 32); Bioneer)와 함께 Ex Taq (Takara)로 증폭시켰다. Oligo Clean & Concentrator 키트 (Zymo)로 정제한 후, RT-PCR 산물을 EcoRI (NEB)로 분해하고 TBE에서의 12% PAGE 겔 상에서 분리하였다.
RT-PCR에서 o8G 유도된 G>T 전환은 또한 시퀀싱에 의해 직접 확인되었다. 각 결찰 단계 후에, RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용한 것을 제외하고, 변형이 있는 small RNA-Seq 라이브러리 구축을 위한 프로토콜 (실시예 14 참조)에 따라 22nt 합성 RNA (5'p-UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3'; 서열번호 33)를 포함하는 400ng의 o8G에 대해 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다. 특히, 5' adaptor에서 퇴행(degenerate) 바코드 (4개 랜덤 뉴클레오티드)로 인해 고유 판독 값을 계산하여 o8G 위치의 뉴클레오티드 빈도를 분석할 수 있어, PCR 증폭에서 교란치우침(confounding bias)을 배제할 수 있다.
실시예 14. o 8 G-miSeq
RT-PCR에서 o8G IP 조건 및 o8G 유도 G>T 전환의 최적화에 기초하여, 산화된 miRNA 및 그의 o8G 위치를 식별하기 위한 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)이 개발되었다. 1.2mg의 데옥시구아노신(deoxyguanosine) (Sigma)이 보충된 PBS (총 부피 500μl)에서 Dynabeads Protein G (Invitrogen) 125μl와 함께 1시간 동안 실온에서 교대로 12.5μg의 항-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience)를 배양함으로써 항체가 부착된 마그네틱 비드(bead)를 제조하였다. 세척 및 정제를 위해, DynaMag-2 magnet (Invitrogen)을 사용하여 Dynabeads Protein G를 분리하였다. PBS 세척 2 회 후, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)로부터 정제된 7-10 μg의 small RNA 샘플을 2.5mM DFOM (Sigma) 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)를 포함하는 200μl의 PXL에서 준비된 비드와 혼합하였다. 4℃에서 교대로 배양하고 2시간 후, 극도의 염으로 일련의 세척을 적용하였다; TE (15mM Tris-HCl pH 7.5, 5mM EDTA); 고세정제 (1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS, 및 2.5mM EGTA) 및 고염 (1M NaCl)을 함유한 TE; 고세정제 및 극도의 염 (2M NaCl)을 함유한 TE; 고세정제 및 염 (120mM NaCl)을 함유한 TE; 세척 완충제 (50mM Tris-HCl pH 7.5, 1mM MgCl, 150mM NaCl, 0.05% NP-40). 비드상의 정제된 산화 small RNA는 그대로 또는 추출 후에 추가로 처리하였다.
온전한 비드로 처리하는 경우, 비드의 RNA를 PNK 버퍼 (50mM Tris-Cl pH 7.4, 10mM MgCl2, 0.5% NP-40)로 2 회 세척하고 1mg/ml BSA 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)가 보충된 80μl T4 RNA ligase 완충액 (NEB) 중 8μl의 T4 RNA ligase 2 절단 KQ (NEB)를 사용하여 70℃에서 2 분간 배양한 후 얼음 위에서 제조한 0.25μM의 3'adaptor (5'-(rApp)T(PMe)GGAATTCTCGGGTGCCAAGG(ddC)-3'(서열번호 34); rApp: adenylate, PMe: methyl-phosphonate, ddC: dideoxy-cytosine; Trilink)와 결찰하였다. 열 혼합기(thermomixer) (Thriller, Peqlab)에서 28℃로 1시간 동안 배양한 후, 비드를 PXL (2.5mM DFOM)로 1회, PNK 완충제로 2 회 세척하였다. 5' adaptor 결찰의 경우, 70℃에서 2분 동안 배양한 후 얼음 상에서 제조된 0.25 μM의 5'adaptor (5'-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUCNNNN (2'-methoxy-C)-3'(서열번호 35); Trilink)를 8μl의 T4 RNA ligase (Thermo), 1mg/ml BSA 및 40U 재조합 RNase 억제제로 구성된 총 80μl의 T4 RNA ligase 완충제의 비드 상에서 열 혼합기 (Thriller, Peqlab)에서 28℃로 1시간 동안 RNA와 함께 배양하였다. PXL (2.5mM DFOM) 및 1x 제1가닥 버퍼 (Invitrogen)로 순차적으로 세척한 후, 비드 상의 RNA를 다음과 같이 역전사 시켰다; 총 40 μl의 1x제1가닥 버퍼 중 1μl의 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen), 0.72μM RT 프라이머 (5'-GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열번호 36), 375μM dNTP, 7.25mM DTT 및 4U 재조합 RNase 억제제; 열 혼합기 (Thriller, Peqlab)에서 55℃로 1시간 동안 배양. 수득된 cDNA를 PCR에 의해 추가로 증폭시켜 시퀀싱 라이브러리를 구축하였다.
동시에, cDNA 시퀀싱 라이브러리는 또한 input samll RNA (0.4-1μg; small RNA-Seq) 또는 o8G IP (2.5mM DFOM 및 20% 클로로포름이 보충된 700μl의 Qiazol Lysis Reagent로 비드에서 정제되고, 이어서 RNA Clean & Concentrator-5 kit로 농축)로부터 추출된 생산물로부터 수행되었다. 처음, 20% PEG 8000 및 20U 재조합 RNase 억제제가 보충된 총 13μl의 T4 RNA ligase 버퍼에서 1μl의 T4 RNA ligase 2 절단 KQ (NEB)를 사용하여 0.25μM 3'adaptor (70℃에서 2분 동안 배양 후 얼음 상에서 제조됨)를 결찰시켰다; 28℃에서 60분 동안 배양한 후 65℃에서 20분 동안 불활성화함. 그런 다음, 0.25μM 5'adaptor를 포함하는 13μl의 T4 RNA ligase 버퍼, 2μl의 T4 RNA Ligase (ThermoFisher), 40U 재조합 RNase 억제제, 및 1mg/ml BSA를 첨가하여 5'adaptor를 결찰시켰으며, 이는 28℃에서 60 분 동안 배양하고 65℃에서 20분 동안 불활성화 하였다. 결찰된 총 RNA 샘플을 70℃에서 2분 동안 10μM RT 프라이머의 1μl와 함께 변성시키고, 얼음 상에 1분 동안 놓고, 다음과 같이 역전사 시켰다; 총 40μl의 1x 제 1 가닥 버퍼 중 1μl의 SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen), 375μM dNTP, 7.25mM DTT 및 4U 재조합 RNase 억제제; 55℃에서 1 시간 동안, 70℃에서 15 분 동안 배양. 생성된 cDNA를 시퀀싱 라이브러리를 제조하기 위해 PCR을 통해 추가로 증폭시켰다.
제조된 cDNA를 Truseq 인덱스 adaptor 서열 (Illumina)을 포함하도록 추가로 처리하였다. 먼저, 100nM universal forward 프라이머 (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA-3'; 서열번호 37) 및 100 nM RT 프라이머로 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스 (NEB)를 사용하여 PCR을 통해 cDNA를 증폭시켰다; 98℃에서 30초; 98℃에서 10초, 60℃에서 30초, 및 72℃에서 15 초의 5 cycles; 및 72℃에서 10분. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen)를 사용하여 1차 PCR 산물을 정제한 후, 용리의 일부를 사용하여 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스에 SYBR Geen I (1:10000, Invitrogen)을 첨가하여 qPCR (Rotor-Gene Q; Qiagen)을 수행하였으며, 증폭의 선형 범위에 도달하는데 필요한 사이클 수를 결정하였다. 정해진 최적 사이클 횟수로, 프라이머 세트와 함께 Q5 고-정확도 2x 마스터 믹스를 사용하여 multiplexing barcode (250nM universal forward primer, 250nM barcode primer: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-6mer barcode-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3'; 서열번호 38)를 생성하기 위해 나머지 정제된 1차 PCR 산물에 대해 2차 PCR을 수행하였다. ~ 20nt insert를 함유하는 PCR 산물의 예상 크기는 15% Urea-PAGE 겔 추출 (실시예 6 참조) 또는 3% agarose 겔 cassette와 함께 Pippin Prep (Sage Science)을 사용하여 추가로 정제되었으며, cross-check와 함께 Qubit RNA HS assay kit (Invitrogen) 및 Fragment Analyzer (Advanced analytical)를 이용하여 정량화하였다. 최종적으로, 상기 제조된 라이브러리를 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)에 의해 50 개의 단일-말단 판독으로서 시퀀싱하고 CASAVA (Illumina)를 이용하여 역 다중화시켰다.
실시예 15. 생물정보학 및 통계 데이터 분석
생물 정보학 분석을 위해, 주로 Python 스크립트 (http://clip.korea.ac.kr/oxog/)와 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/)를 사용하였다. RNA-Seq 분석은 Tuxedo Suite를 사용하여 수행되었다; TopHat2 (http://ccb.jhu.edu/software/tophat), Cufflinks 및 Cuffdiff (http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/). Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net)를 사용하여 miRNA에 대한 시퀀싱 리드의 맵핑을 수행하였다. CLIP 데이터의 피크(peak) 분석은 CLIPick (http://clip.korea.ac.kr/clipick/)에 의해 처리되었다. 별도의 표시가 없는 한 기본 매개 변수와 함께 DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)를 사용하여 GO 분석을 수행하고 REVIGO (http://revigo.irb.hr/)로 시각화하였다. 기능적 주석의 보강은 GSEA (http://software.broadinstitute.org/gsea/)를 사용하여 분석되었다.
표준 실험실 실습 무작위화 절차를 동일한 연령 및 성별의 세포주 그룹 및 마우스에 사용하였다. 실험자들은 실험 및 결과 평가 동안 배치에 대한 정보가 주어지지 않았다. Kolmogorov-Smirnov test (KS test), t-test (unpaired two-tailed) 및 Fisher's exact test (맵핑된 총 miR-1 판독값에 상대적)를 포함한 모든 통계적 테스트는 Scipy (http://www.scipy.org/) 또는 Excel (two-sided test)을 이용하여 수행하였다. 값은 달리 언급되지 않는 한 mean±s.d를 나타낸다. 통계적 유의성은 기본적으로 P=0.05로 설정되었으며, 분산은 그룹간에 유사했다.
실시예 16. o 8 G-miSeq 데이터 분석
역다중화된(demultiplexed) 시퀀싱 판독 (FASTQ 파일)은 2개의 불일치 (Bowtie --norc -l 7 -n 2 -a -f)를 허용하는 Bowtie를 사용하여 정렬되었으며, 축소된 시퀀싱 판독은 인덱싱 되었으며 (기본 매개변수와 함께 bowtie-build indexer 사용), miRBase (http://www.mirbase.org/)에서 동일한 종의 성숙 miRNA 서열에 의해 맵핑되었다. 불일치 오류가 있는 판독 값을 필터링하여 결과를 더 구문 분석했으며, 그 결과 품질 점수는 20 미만이었다. miRNA 당 판독 수는 총 판독 값 (총 판독 값 백만 당 판독 값; RPM)으로 정규화되고 log2 값 (예: log2 (입력(input)) 및 log2 (o8G IP))으로 사용되었다. 특히, 입력 small RNA-Seq (입력; miRNA 빈도)에서의 RPM으로 o8G IP 시퀀싱 (o8G IP)의 RPM을 매겨 o8G의 풍부도값(enrichment)를 추정하고 log2 비율로 계산하고 volcano plot 분석에서 유의성 (-log10 (P-value), t-test)으로 나타내었다. miRNA 서열에서 G의 빈도에 의해 영향을 받는 o8G IP bias를 조사하기 위해, 서열 (G의 수) 및 o8G 풍부도값 (bin size = 1)에서 G-함량에 의해 분류된 miRNA의 수는 열 지도 분석 (Treeview, http://rana.lbl.gov/EisenSoftware.htm)을 통해 시각화하였다. PE 처리에 따른 차등 o8G 풍부도를 분석하기 위해, 상대적인 o8G 풍부도값을 PE 처리 vs. mock (무처리) 사이의 o8G 풍부도 비율로부터 계산하였다. Base calling에서 최고 품질 점수를 갖는 불일치(mismatch)의 경우만을 고려하여, miRNA 서열의 각 위치에서 발생하는 불일치의 백분율은 총 match 빈도에 대해 상대적으로 계산되었다; 불일치 (%). 특히, miR-1:2U 및 miR-1:3U로부터의 seed 서열은 무시할 만한 것으로 취급될 수 있는 매우 낮은 발현을 나타내는 종-특이적 miRNA, mdo-miR-12320-3p 및 mmu-miR-7216-3p(<80 시퀀싱 판독값)를 가진 miR-1:7U를 제외하고 다른 포유 동물 miRNA (n=17,948; miRBase, http://www.mirbase.org/)와 중복되지 않는다.
실시예 17. o 8 G IP 및 qPCR에 의한 산화된 miRNA 정량
rCMC (n=3)를 100μM PE로 48시간 동안 처리하거나 ISO (75mg kg-1)를 만성 주사하여 마우스에서 비대성 심장을 유도한 후 (n=3), small RNA는 miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. 그런 다음, 교차-확인으로 분광 광도계 (Denovix) 및 Qubit 형광 정량화 (Invitrogen) 둘 다에 의해 정확하게 측정된 동일한 양의 small RNA (2μg, PE 처리 vs. 처리 없음)를 10pg miRNA:o8G spike-in 대조군의 존재하에 o8G 면역 침전에 사용 하였다. Qiazol Lysis Reagent 및 RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo)를 사용하여 비드에서 RNA를 추출한 후, TaqMan MicroRNA Assay 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 o8G IP의 특정 miRNA의 양을 평가하였다. 참고로, 역전사 전의 모든 과정은 2.5mM DFOM의 존재 하에 수행되어 시험관내 RNA의 산화를 방지 하였다. IP 공정으로부터의 변이를 정상화하기 위해, o8G IP에서 miRNA:o8G spike-in의 양을 qPCR로 측정하고 특정 miRNA의 상대적인 o8G 값을 정량하기 위한 분모로 사용하였다. 또한, o8G IP에서 U6 snRNA를 측정함으로써 상대적 수준을 추정하고 특정 miRNA에서 산화의 풍부함을 확인하기 위해 표준화에 사용하였다.
실시예 18. 루시퍼라제(luciferase) 리포터 제작
miRNA-매개 유전자 억제 활성을 측정하기 위해, psiCheck-2 (Promega) 또는 pmirGLO 벡터 (Promega)를 사용하였다. 특히 miR-1 oxo 부위의 경우, 표적 부위를 나란히 반복하고 (n=5) psiCheck-2의 Renilla luciferase (hRLuc)의 3'UTR에 삽입하여 검출 민감도를 증가시켰다.
이러한 벡터 구축을 위해, 다양한 miR-1 oxo 부위를 포함하는 합성 duplex oligos (Macrogen)를 지시된 바와 같이 XhoI 및 NotI 부위를 통해 psiCheck-2 플라스미드에 클로닝하였다; miR-1-seed site, forward: 5'-TCGAGACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCACATTCCGC-3'(서열번호 39), reverse: 5'-GGCCGCGGAATGTGGAATGTGGAATGTGGAATGTGGAATGTC-3'(서열번호 40); miR-1-2oxo site, forward: 5'-TCGAGACATTCAACATTCAACATTCAACATTCAACATTCAGC-3'(서열번호 41), reverse: 5'-GGCCGCTGAATGTTGAATGTTGAATGTTGAATGTTGAATGTC-3'(서열번호 42); miR-1-3oxo site, forward: 5'-TCGAGACATTACACATTACACATTACACATTACACATTACGC-3'(서열번호 43), reverse: 5'-GGCCGCGTAATGTGTAATGTGTAATGTGTAATGTGTAATGTC-3'(서열번호 44); miR-1-7oxo site, forward: 5'-TCGAGAAATTCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCAAATTCCGC-3'(서열번호 45), reverse: 5'-GGCCGCGGAATTTGGAATTTGGAATTTGGAATTTGGAATTTC-3'(서열번호 46); miR-1 control site, forward: 5'-TCGAGACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCACTTTCCGC-3'(서열번호 47), reverse: 5'-GGCCGCGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTGGAAAGTC-3'(서열번호 48)). 중요하게도, miR-1 control site는 동일한 염기를 가짐으로써 miR-1 seed site의 위치 6 (pivot)에서 미스매치를 가지며, 여기서 손상된 pivot은 seed-매개된 표적 억제를 상실하는 것으로 보고되고, 따라서 음성 대조군으로 사용되도록 구성하였다.
상기와 동일한 방식으로, miR-122, let-7, miR-124의 발단부분에 o8G 변형 생성시 인식할 수 있는 서열을 5'말단기준으로 8번째까지의 상보적인 서열에 o8G 변형이 일어난 부위에 대해서는 A로 치환하여 제작하였다,
확인된 miR-1:7o8G 표적 mRNA에서 7oxo 사이트를 민감하게 확인하기 위해, psiCheck-2 벡터를 다음과 같이 표적 사이트의 2 회 또는 3 회 반복을 포함하도록 변형시키고 서브클로닝 하였다. 먼저, 예측된 오프셋 7oxo 부위 (3:8)를 함유하는 반딧불 유전자 (hluc+)는 ApaI 및 XbaI 사이트를 통해 7oxo 사이트가 없고 pmirGLO 벡터 (Promega)에 위치한 상이한 반딧불 유전자 (Luc2)로 대체하였다.
실시예 19. 루시퍼라제(luciferase) 리포터 분석
다양한 루시퍼라제 리포터 벡터 (pmirGLO, psiCheck-2 또는 원하는 부위를 함유하는 이의 변형된 플라스미드) 및/또는 합성 duplex miRNA (50-75nM, 달리 명시됨)를 H9c2, rCMC 및 AC16에 형질감염 시켰다. 형질감염 24시간 후, 발현된 루시퍼라제의 활성을 일반적으로 측정하였다. 약물 처리의 경우, 명시된 농도의 PE, H2O2 및/또는 NAC를 명시된 시간 동안 처리하고, 형질감염 후 24 시간에 시작하여 처리 후 수득하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 복제물 (n=6)로 GloMax-Multi Detection System (Promega)과 함께 이중-루시퍼라제 리포터 분석 시스템 (Promega)을 이용하여 상대적 활성 (반딧불 루시퍼라제로 표준화된 Renilla 루시퍼라제 활성)을 측정하였다. miRNA-매개 억제의 효율을 평가하기 위해, 상이한 농도의 miRNA (0 내지 100nM)를 HeLa에 형질감염 시켰다. 그런 다음, Scipy (scipy.optimize.curve_fit)를 사용하여 시그모이드함수 (sigmoid function)에 대해 비선형 최소 제곱 피팅을 수행하여 IC50을 계산하였다. 최소 제곱이 함수에 맞지 않는 경우 회귀선에서 대략적인 IC50을 계산하였다.
실시예 20. 이중(dual) 형광 리포터 제조
이중 형광 단백질 (dFP) 리포터 벡터는 psiCheck-2 (Promega)에 기초하여 구축하였고, 루시퍼라제 유전자는 형광 단백질 유전자로 대체하였다. pUlta (Addgene; Malcolm Moore 제공)에서 eGFP 유전자를 증폭시키고 NheI 및 XhoI 사이트를 통해 hRLuc를 대체하였다; forward 프라이머: 5'-TAGGCTAGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGA-3'(서열번호 49), reverse 프라이머: 5'-GGGCTCGAGCGATCGCCTAGAATTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3'(서열번호 50). pTRIPZ (Thermo Scientific)에서의 TurboRFP 유전자를 증폭시키고, ApaI 및 XbaI 사이트 (forward 프라이머: 5'-GAAGGGCCCTATGAGCGAGCTGATCAAGGAGA-3'(서열번호 51), reverse 프라이머: 5'-GACTCTAGAATTATTATCTGTGCCCCAGTTTGCTAG-3'(서열번호 52))를 통해 hluc+를 대체하고, 추가로 처리하여 PCR-매개 결실을 통한 hluc+ 서열의 잔류 33bp를 제거하였으며 (forward 프라이머: 5'-GTACTGTTGGTAAAGCCACCATGAGCGAGCTGATCA-3'(서열번호 53), reverse 프라이머: 5'-TCCTTGATCAGCTCGCTCATGGTGGCTTTACCAACA-3'(서열번호 54)), 이어서 결실되지 않은 골격 플라스미드를 제거하였다 (DpnI 처리). 모든 PCR 반응은 제조사의 프로토콜에 따라 PfuUltra High-Fidelity DNA 중합효소 (Agilent Technologies)를 사용하여 진행하였다. 또한, 전환된 dFP 벡터 (Jens Gruber로부터 제공된 p.UTA.3.0 Empty; Addgene plasmid #82447)를 사용했는데, 이는 psiCheck-2 벡터에서 유래되었지만 acGFP는 hluc+를 대체하였고 RFP는 hRLuc를 대체하였다; 마치 리포터 및 대조군 형광 유전자가 dFP에서 교환된 것처럼. 마지막으로, miR-1 seed 사이트, 7oxo 사이트, 2oxo 사이트 및 3oxo 사이트는 psiCheck-2에 사용된 동일한 서브클로닝(subcloning) 방법에 따라 dFP 또는 전환된 dFP 벡터 (p.UTA.3.0)에 삽입되었다.
실시예 21. 유세포 분석기를 이용한 단일 세포 리포터 분석
유세포 분석기를 이용하여 단일 세포 수준에서 miRNA 매개 유전자 억제를 측정하기 위해 형광 단백질 리포터 벡터를 사용하였다. 먼저, miR-1 seed, 7oxo, 3oxo 또는 2oxo 사이트를 함유하는 dFP (RFP:GFP-site) 또는 전환된 dFP (GFP:RFP-site)를 H9c2에 형질감염 시키고 형질감염 후 24시간에 세포를 수집하였다. 양성 대조군으로서, 각 표적 사이트에 대한 동족의 miRNA (50nM)를 공동형질감염 시켰다. miR-1 oxo 사이트의 억제가 내인성 miR-1에 의해 매개됨을 확인하기 위해, miRIDIAN microRNA 헤어핀 억제제 (Dharmacon)로부터 얻은 50nM miR-1 특이적 억제제를 또한 공동형질감염 시켰다. 공동형질감염의 경우, 동일한 양의 NT를 대조군으로 사용하였다. 약물 처리를 위해, 200μM PE (혈청-고갈된 H9c2) 또는 2mM NAC를 형질감염 시점에서 시작하여 24시간 동안 처리하였다. 세포를 4% BSA (Bovogen) 및 5mM EDTA (Sigma)와 함께 PBS (Biosesang)에서 회수하고 유세포 분석기로 분석하였다.
dFP (RFP:GFP-site) 형질감염된 H9c2의 경우, 초기에 4-blue 구성으로 작동되는 BD Accuri C6 Plus (BD Biosciences)를 사용하였다 (오직 블루 레이저 장비를 갖춤, 여기 파장: 488nm; 표준 필터, GFP: 533/30, RFP: 670 LP). 살아있는 단일 세포를 게이팅한 후 (FSC 및 SSC에 기초하여), 리포터 발현이 없는 세포를 psi-Check2 형질감염된 세포에 의해 추정된, 자동 형광의 기초 수준에 기초하여 추가로 여과 제거하였다. 이어서, GFP vs. RFP 신호 (n=10,000 cells)의 산점도(scatter plots)를 분석하였다. H9c2의 세포 크기는 FSC 값에 의해 추정되었다. 산화된 miR-1 매개 억제에 대한 PE 처리의 효과를 시험하기 위해, PE 처리 vs. 무처리를 비교함으로써 GFP 강도 (log2(GFP)) 또는 상대적 GFP 비율 (log2 (GFP/RFP))에 따른 세포 분포를 나타내었으며, 누적 분율 분석 (Scipy, scypy.stats.ks_2samp)를 사용하여 수행된 KS test)에 의해 추가로 통계적으로 분석되었다.
dFP (RFP:GFP-site) 및 전환된 dFP (GFP:RFP-site) 모두에 대한 검출 민감도를 높이기 위해 이후 청색 (488nm) 및 황색 (561nm) 레이저가 장착된 Attune NxT 유세포 분석기를 사용하여 GFP및 RFP 모두의 완전 여기를 달성하였다. 상기 분석을 위해, GFP 및 RFP 신호의 범위는 초기에 산점도 분석에서 선택되었고, 유사한 범위의 벡터 발현 (dFP에 대한 log10(RFP) 및 전환된 dFP에 대한 log10(GFP)에 의해 추정됨; 동일하게 들어감)으로부터 유도된 리포터 값 (dFP에 대한 log10(GFP) 및 전환된 dFP에 대한 log10(RFP))을 평균화하여 상대적 비율로 정량화하였다. 궁극적으로 상대적인 fold 변화는 사이트가 없는 동일한 리포터에서 유래된 값 (예: dFP, RFP 값의 각 bin에 있는 GFP 값의 평균은 사이트가 없는 대조군에서 값으로 표시됨)으로 상대적 비율을 표준화하여 계산하였다. 리포터 발현에서 단지 가장 낮은 25%에 대해서만 분석 범위를 좁히기 위해, 각각의 벡터 발현 값의 bin에서의 리포터 값에서 가장 낮은 25%를 가진 세포만을 사용함으로써 상대적 배수 변화를 재계산하였다.
실시예 22. miR-1:o 8 G를 이용한 심장 세포 비대 유도
NT-6Ψ, miR-1, miR-1:7o8G, miR-1:2o8G, miR-1:3o8G, miR-1:7U, miR-1:2U, miR-1:3U를 제조사의 프로토콜에 따라 RNAiMax 또는 Lipofectamine 3000 (Invitrogen)에 의해 H9c2 또는 rCMC 세포로 형질감염 시켰으며, 정지 이미지를 얻기 위해, 도립현미경 (Leica DMi8)을 사용하고 ImageJ (≥100 세포, https://imagej.nih.gov/)로 분석하였다. Time-lapse 이미지를 생성하기 위해, miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U의 형질감염 후 Lumascope 400 (Etaluma)을 20분 간격으로 0에서 50h 사이로 사용하였다.
실시예 23. 마우스에 miRNA 투여
마우스로의 miRNA의 생체 내 전달을 수행하였다. 구체적으로, duplex miRNA (5mg kg-1)를 제조사의 프로토콜에 따라 생체 내 jetPEI (N/P 비율=5; Polyplus)를 사용하여 정맥 내 주사 (I.V.)를 통해 12 주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Koatech)에 투여하였다. 주입된 miRNA (NT vs. miR-1:7o8G, NT vs. miR-1:7U; n=4)에 따라 마우스를 2개의 그룹으로 분배함으로써 2세트의 실험을 설계하였다. miR-1:7o8G (4mg kg-1) 또는 miR-1:7U (4mg kg-1)를 주사하는 경우, NT (1mg kg-1)도 함께 주사하여 마우스 심장으로의 전달을 확인하였다. 특히, 주사에 사용된 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U의 이중체는 5'말단에 FITC를 함유하는 miR-1 passenger 가닥을 사용하여 심장 조직으로의 전달을 확인함으로써 생성되었다. 주사는 1일 및 2일에 2회 수행되었고 마우스는 7일에 희생되었다. 각각의 심장 측정으로 심장 조직을 수집하였다; HW, BW 및 TL. 절단된 심장 조직을 RNA 추출 (small RNA 및 large RNA; miRNeasy Mini Kit, Qiagen)에 즉시 사용하였고, 전달된 NT의 양을 qPCR (miRNA 섹션에 대한 qPCR의 상세한 방법 참조)에 이어서 RNA-Seq 및 qPCR 분석으로 조사하였다. 절단된 심장의 일부는 또한 면역조직화학 분석을 위해 슬라이드상의 조직 절편으로서 제조되었다.
실시예 24. mRNA에 대한 정량적 RT-PCR
RNase-Free DNase Set (Qiagen)를 이용한 컬럼의 DNA 분해를 통해 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. SuperScript III 역전사 효소 (Invitrogen) 및 올리고 (dT) 프라이머로 역전사를 수행하였다. qPCR 분석은 SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 수행하였다. 모든 반응은 표준 2 단계 사이클링 프로토콜로 3 회 수행하였으며, 대조군으로서 ACTB 및 GAPDH를 사용하여 ΔCT 방법에 의해 상대적 정량을 계산하였다.
실시예 25. 심장 조직의 면역조직화학
해부된 마우스 심장 조직을 고정시키고 (4% paraformaldehyde, 밤새 4℃), 저장하고 (70% 에탄올), 파라핀으로 포매하고, 절단한 후 (횡단면, 연속절편; 5μm 폭) haematoxylin 및 eosin (H&E)으로 염색하였다. 파라핀-포매한 절편 준비, H&E 염색, 및 Masson's trichrome 염색은 서비스 가입을 통해 심혈관 제품 평가 센터 (연세대학교 의과 대학, 한국) 또는 병리학 핵심 시설 (서울대학교 의과 대학, 한국)에 의해 수행되었다. 그런 다음, 제조된 슬라이드 상에서 면역형광염색을 수행하였다. Histo-Clear (National Diagnostics)로 절편을 탈파라핀한 후, 일련의 희석된 에탄올로 섹션을 가수 분해하고 PBS에 저장하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 BD Retrievagen Antigen Retrieval Systems (BD Biosciences)을 사용하여 항원을 회수하였다. 이어서, PAP pen (Sigma)에 의해 정의 된 표적 염색 영역을 명시된 바와 같이 면역염색 시켰다; 차단 용액 (10% 정상 염소 혈청 및 1% BSA를 함유한 PBS), 1시간 동안 RT; MF20 항체 (1:200, Developmental hybridoma), 차단 용액, 4℃에서 밤새; Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (1:1000, Abcam), 차단 용액, 실온에서 1시간. 또한, Alex Fluor 594 결합된 WGA (50μg/ml; Invitrogen)와 DAPI (1.5μg/ml; Vector lab)를 적용하여 세포막과 핵을 각각 시각화하였다. 염색된 조직을 도립 형광 현미경 (Leica DMi8; 20x 또는 40x 배율)으로 관찰하고, Leica Application Suite (LAS)로 분석하고 ImageJ (≥100 세포, https://imagej.nih.gov/)로 정량화 하였다.
실시예 26. 형질전환 마우스 생성
심근세포 특이적 형질전환 마우스 (TG)를 생산하기 위해, anti-7oxo (α-MHC 13x) 플라스미드를 BamHI를 사용하여 분해하여 형질전환 cassette를 분리하였다. 겔-정제된 형질전환 cassette를 교배 후 과배란된 C57BL/6 암컷 마우스 (PMSG 및 HCG에 의해 유도됨)로부터 제조된 마우스 수정란의 핵에 주사하였다. 그 후, 마우스 배아 (수정된 단세포 수정란)를 가임신 암컷 마우스 (Korea Bio Co. Ltd, Seoul, Korea)에 이식하였다. 전달 후, anti-7oxo TG(+) 마우스 모두 hGH 폴리 (A)에 상응하는 프라이머 세트(forward: 5'-CCACCAGCCTTGTCCTAATAAA-3'(서열번호 55), reverse: 5'-CAGCTTGGTTCCCAATAGA-3'(서열번호 56))를 사용하여 게놈 DNA (말단으로부터 정제됨)의 PCR 분석에 의해 확인하였다. anit-7oxo TG의 경우, 4 개의 독립적인 설립자 라인 (F0; #44, #65, #68, 및 #69)을 설정하고 연구하였다. 모든 마우스는 임의로 음식과 물을 허용하고 12:12 시간 light:dark 주기로 유지시켰다.
실시예 27. RNA-Seq 라이브러리 구축 및 분석
RNA-Seq 라이브러리는 어댑터 결찰 기반 방법 또는 가닥-변위 정지/결찰 방법을 사용하여 전체 또는 large RNA로부터 생성되었다. 어댑터 결찰 기반 방법의 경우, 100ng의 총 RNA (miRNeasy Mini Kit; Qiagen에서 정제됨)를 제조사의 프로토콜에 따라 NeoPrep (Illumina)을 사용하여 TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina)에 적용했다; 샘플 이름: H9C2-NT-N1, H9C2-miR-1-2o8G-N1, H9C2-miR-1-3o8G-N1. 또한, TruSeq Stranded mRNA Libraries는 Omega Bioservices (Norcross, GA, USA)에 의해 구축, 시퀀싱 및 역다중화되었다; 샘플 이름: H9C2-NT-O1, H9C2-NT-O2, H9C2-miR-1-7o8G-O1, H9C2-miR-1-7o8G-O2.
나머지 샘플은 다음과 같이 가닥 변위 정지/결찰 방법을 사용하여 처리되었다. 즉, 1.5μg의 large RNA (> 200nt, RNeasy 또는 miRNeasy Mini Kit; Qiagen에 의해 추출됨)로부터, 폴리아데닐화된 mRNA를 10μl의 Dynabead Oligo (dT)25 (Invitrogen)를 제조사가 제공한 프로토콜에 따라 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제된 mRNA 10ng에 제조사의 지시에 따라 SENSE Total RNA-Seq 라이브러리 키트 (Lexogen)를 사용하여 RNA-Seq 라이브러리를 제조하였다. 라이브러리가 생성된 후, 이들은 최적 사이클이 가장 낮은 PCR에 의해 증폭되었으며, 이는 상이한 사이클의 결과를 비교하거나 상기 실시예 14의 o8G-miSeq의 방법에 기재된 바와 같이 qPCR을 수행함으로써 결정되었다. 증폭된 라이브러리의 품질은 크기 분포 및 양에 대해 Fragment Analyzer (Advanced analytical)를 사용함으로써 확인되었다. 필요한 경우, urea-PAGE 겔 추출 또는 Pippin Prep (Sage Science)을 크기 선택을 위해 추가로 사용하였다. 마지막으로, Qubit RNA HS 분석 키트 (Thermo Fisher)와 Fragment Analyzer를 사용하여 준비된 다중화된 라이브러리를 정확하게 정량화하고, 50개의 단일-말단 판독으로서 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)에 의해 시퀀싱되도록 적용하였다. 시퀀싱하기 위해 H9C2-cont, H9C2-anti-7oxo, mHT-ISO-cont, mHT-ISO-anti-7oxo, mHT-ISO-anti-7oxo-TG(-) 및 mHT-ISO-anti-7oxo-TG(+)로 명명된 샘플, MiniSeq 시스템 (Illumina)을 사용하였다. HiSeq 2500 시스템의 결과와 일관성을 유지하기 위해 MiniSeq 시스템에는 SE50 정보만 사용되었다.
역다중화된 서열 분석 판독 (CASAVA; Illumina를 사용하여 획득)을 RefSeq 유전자 주석의 공급하에 TopHat2 (tophat2 -a 4 -g 1 --b2-sensitive -r 100 --mate-std-dev=50 --library-type fr-firststrand)를 사용하여 마우스 게놈 (mm9) 또는 랫트 게놈 (rn5)에 정렬하였다. 가닥 변위 정지/결찰 방법을 사용하여 시퀀싱 라이브러리를 제조한 경우, 판독의 시작 측으로부터 처음 9개의 뉴클레오티드를 제조사의 지시에 따라 TopHat2에 대해 트리밍 하였다. Cufflinks (cufflinks -N-b)를 사용하여 전사 수준을 정량화하고, 동일한 실험 조건을 가진 그룹에서의 맵핑 결과의 공급과 함께 Cuffdiff (Cuffdiff --FDR=0.1 -b -N --min-alignment-count=10 -library-norm-method=geometric)로 차등 전사 프로파일을 분석했다. 오직 유효한 상태의 값만 선택되고, 배수 변화 및 통계적 유의성 (p-value)에 추가로 사용되었다. 복제물이 두 가지 다른 라이브러리 구축 방법 (어댑터 결찰 기반 방법 및 가닥 변위 정지/결찰 방법)에서 파생된 경우 cufflinks는 동일한 유형의 라이브러리에만 사용된 다음, 중앙값 RPKM 및 p-value (t-test, two-tailed)를 모든 복제물로부터 계산하였다.
실시예 28. 누적 분율 분석
주어진 miRNA 또는 miRNA 억제제에 따라 추정되는 표적 전사체의 억제 또는 탈억제의 경향을 시험하기 위해, 배수 변화 (log2 비율)에 따른 누적 분율을 분석 하였다. 추정되는 miR-1:o8G 표적은 3'UTR (UCSC 게놈 브라우저에서 다운로드한 RefSeq에 의해 정의됨)에서 miR-1 oxo 사이트를 함유하는 전사체로서 선택되었으며, 여기서 miR-1:o8G의 위치 2-8에 매치되는 모든 6mer (o8G:C 대신 o8G:A의 매치)는 별도의 표시가 없는 한 일반적으로 조사되었다. "사이트 없음"은 mRNA 서열에서 miR-1 seed 사이트 및 oxo 사이트를 함유하지 않는 전사체를 나타낸다. "Cont 사이트"는 3'UTR에 miR-1 대조군 사이트를 함유하는 전사체를 나타내고, oxo 사이트에서 o8G와 결합하는 뉴클레오티드가 이전 연구에서 음성 대조군으로서 사용된 바와 같이 G로 치환되었다. KS test는 총 mRNA 또는 cont 사이트에 대해 Scipy (scypy.stats.ks_2samp)를 사용하여 수행하였다. 배수 변화 및 유의성 (-log10 (p-value))을 계산하여 Volcano plot 을 분석하였으며, 이 중 컷오프를 사용하여 차등적으로 발현된 유전자 (DEG)를 선택하였다.
실시예 29. Ago HITS-CLIP 데이터 분석
심근병증 환자의 좌심실 조직으로부터의 Ago HITS-CLIP 결과는 GEO 데이터베이스 (GSE83410)로부터 검색되었다. miRNA 서열을 포함하는 판독은 Bowtie (샘플 판독에 대한 성숙 miRNA 서열의 정렬)로부터의 '역방향'맵핑에 의해 2 개의 미스매치 허용과 함께 확인되었으며, miRNA 판독의 위치 미스매치가 miR-1에 대해 분석되었다. miR-1 oxo 사이트의 enrichment 분석을 위해, G:U 결합에 의해 매개된 miR-1 seed 사이트와 비교하여, 이전 연구 (Spengler, R. M. et al., Nucleic Acids Res 44, 7120-7131)에 의해 제공된 Ago2 결합 클러스터를 분석하였다. 뇌 특이적 miRNA인 miR-124의 seed 사이트는 심장 조직에서 존재하지 않기 때문에 음성 대조군으로 사용되었다. miR-1의 비-핵생성 융기(bulge) 사이트 또한 음성 대조군으로서 사용되었다.
심근병증 환자에서 miR-1 7oxo 사이트를 확인하기 위해, Ago HITS-CLIP의 로우 시퀀싱 데이터를 CLIPIck에 의해 처리하였다. 구체적으로, FASTQ 파일은 처음에 품질 점수 (fastq_filter.pl -f mean:0-24:20)에 기초하여 필터링되고 축소되었다 (fastq2collapse.pl). 그런 다음, 전처리된 판독값을 동일한 매개 변수로 NovoAlign 프로그램 (http://www.novocraft.com)을 사용하여 인간 게놈 (hg19)에 정렬하였다. 주석이 달린 전사체 (RefSeq)에서 판독값을 선택한 후 BedTools 및 SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/)를 사용하여 정렬된 Ago CLIP 판독값을 BED 또는 BAM 파일로 생성하고 인간의 심장 (RNA-Seq Atlas로부터 유래됨, http://medicalgenomics.org/rna_seq_atlas)에서 발현 프로파일 공급과 함께 피크 분석에 사용하였다. 피크(peak), 편집된 모든 판독값, 및 추정 miR-1 7oxo 사이트 (2-8 위치의 6mer)를 시각화하기 위해, UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu/)를 적용하였다.
실시예 30. CLEAR-CLIP
ISO 처리 또는 PBS 처리된 마우스로부터 해부된 마우스 심장 조직 (~150mg)을 분쇄하고 UV 조사 (400mj/cm2, 3회; Spectrolinker XL-1000)하여 생체 내(in vivo) RNA-단백질 복합체에서의 공유 가교결합을 유도하였다. 37℃에서 5분 동안 50μU/μl RNAse A (affymetrix)를 처리함으로써 프로세스된 Ago-관련 단편 mRNA는 60mg의 Dynabeads Protein A (Invitrogen)에 부착된 2개의 다른 anti-Ago 항체 (2A8; Diagenode, 2E12; Abnova) 10μg에 의해 면역 침전되었다. miRNA-표적 mRNA 키메라를 생성하기 위한 결찰은 16℃에서 밤새 0.625U/μl T4 RNA ligase 1 (NEB)을 처리함으로써 수행되었으며, 25℃에서 75 분 동안 3% DMSO (Sigma) 및 18% PEG8000 (Sigma)의 존재 하에 추가로 1U/μl T4 RNA ligase 1 (NEB)을 처리함으로써 강화되었다. 동위원소가 표지된 RNA-단백질 복합체는 NuPAGE 10% Bis-Tris Gel (Invitrogen)을 작동시켜 크기별로 분리하고, nitrocellulose막 (BA85; Whatman)으로 옮기고, 절단하고, 4mg/ml proteinase K (Roche) 및 7M urea (Sigma)로 처리하였으며, 산 페놀:클로로포름:IAA (125:24:1; Invitrogen) 및 RNA Clean & Concentrator-5 키트 (Zymo)로 추출하였다. 정제된 RNA는 어댑터 결찰 및 RT-PCR에 적용하여 small RNA-Seq Library Prep 키트 (Lexogen)를 사용함으로써 고 처리량 시퀀싱을 위한 라이브러리를 생성하였으며, 최종적으로 HiSeq 2500 시스템 (Illumina)으로 시퀀싱 하였다.
시퀀싱 판독을 전처리하고 맵핑하였으며, 어댑터 서열이 제거된 후, miRNA 서열을 함유하는 잠재적인 키메라 판독이 '역방향'맵핑에 의해 확인되었고, 여기서 성숙한 miRNA 서열은 Bowtie를 사용하여 샘플 라이브러리에 반대로 정렬되었다. 그런 다음, 나머지 서열을 마우스 게놈 (mm9)에 맵핑하고, 2A8 및 2E12 항체 둘 다로부터 조합된 엑손과 겹친 것만을 위해 추가로 선택하고 궁극적으로 키메라 판독을 포함하는 miR-1에만 초점을 맞추었다. miR-1 seed 및 oxo 사이트 조사에 있어서, ISO 주입 및 비주입 마우스 심장 사이의 강화 결과를 비교하여 맵핑된 키메라 판독으로부터 상류 (5', -) 및 하류 (3', +)가 확장되었다 (-/+ 0, -/+ 25, -/+ 50, -/+ 100).
실시예 31. 심근세포-특이적 miR-1:7o 8 G 억제제의 구축
심근 세포에서 miR-1:7o8G를 특이적으로 억제하기 위해, 심근 세포 특이적 α-MHC 프로모터를 보유하는 pJG/ALPHA MHC 플라스미드에 기초하여 다중 miR-1 7oxo 표적 사이트를 함유하는 경쟁적 억제제를 구축하였다. 13개의 miR-1 7oxo 사이트 (5'-AAAUUCC-3'; 서열번호 6) 또는 대조군 NT 표적 사이트 (5'-GGUUGUG-3'; 서열번호 21)를 포함하는 합성 이중 올리고 (Macrogen)를 SalI 및 HindIII 사이트를 통해 지시된 바와 같이 pJG/ALPHA MHC 벡터에 클로닝 하였다; anti-7oxo, α-MHC 13x, forward: 5'-TCGACAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAAAAATTCCACAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCAAAAATTCCATAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAA-3'(서열번호 57), reverse: 5'-AGCTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTGTGGAATTTTTGGAATTTGTGGAATTTCTGGAATTTATGGAATTTTTGGAATTTG-3'(서열번호 58); cont, anti-NT, forward: 5'-TCGACGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGACGGTTGTGAAGGTTGTGACGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGAAGGTTGTGATGGTTGTGAGGGTTGTGACGGTTGTGAA-3'(서열번호 59), reverse: 5'-AGCTTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACAACCCTCACAACCATCACAACCGTCACAACCTTCACAACCGTCACAACCCTCACAACCATCACAACCTTCACAACCG-3'(서열번호 60). 주목할 만한 것은, 대조군 벡터 (anti-NT)는 cel-miR-67 (C. elegans-)에서 유래한 비표적 siRNA (NT)의 결합 부위를 포함하는 것을 제외하고는 anti-7oxo (α-MHC 13x)에 사용된 것과 동일한 플라스미드였다. pJG/ALPHA MHC 벡터는 Jeffrey Robbins (Addgene plasmid #55594)으로부터 제공받아 Dr. Da-Zhi Wang에 의해 제공되었다.다른 경쟁적 miRNA 억제제는 RNA로 합성되었다 (RNA 합성 방법 참조).
실시예 32. ISO-처리된 마우스에 miRNA억제제의 투여
경쟁적 miR-1:7o8G 억제제 (anti-7oxo)가 생체 내에서 ISO-유도 심장 비대를 약화시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위해, ISO (75 mg kg-1)는 처음에 8 주 내지 12 주령의 수컷 C57BL/6J 마우스 (Korea Bio Co. LTD)로 복강 내 주사 (I.P)를 통해 투여되었고, 이 때 동일한 부피의 PBS를 대조군으로서 사용하였다 (각 세트에 대해 n=5). 8 시간 후, 제조사의 프로토콜에 따라 명시된 양 및 비율로 생체 내 jetPEI (Polyplus)를 사용하여 anti-7oxo 또는 대조군 (anti-NT)을 마우스에 정맥 주사 하였다; anit-7oxo (α-MHC 13x) 또는 cont (anti-NT 13x), 1.9 mg kg-1, N/P 비율=8; anti-7oxo (4x) 또는 cont (anti-NT 4x), 5 mg kg-1, N/P 비율=5. 연속 주사는 1일, 2일 및 5일에 3 회 수행되었으며, 7일째에 모든 마우스를 희생시키고 심장을 검사하였다. hGH poly (A) (forward: 5'-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3'(서열번호 61), reverse: 5'-CCAGCTTGGTTCCCAATAGA-3'(서열번호 62))를 포함하는 anti-7oxo 전사체의 RT-qPCR을 수행함으로써 심장 조직으로의 anti-7oxo (α-MHC 13x)의 전달율을 측정하였다. anti-7oxo (4x)가 마우스 심장으로 전달되는 것을 확인하기 위해, poly (A) tailing 기반 miRNA qPCR 방법 (miRNA에 대한 정량적 PCR의 방법 참조)을 anti-7oxo (4x) (forward, 5’-TAAATTCCAAATTCCAGAAATTCCACAAATTCCAT-3’; 서열번호 63) 특이적 프라이머로 수행하였다.
실시예 33. ISO 시간 코스에서 miR-1:o 8 G의 정량
ISO 시간 코스 (ISO time course) 실험에서 산화된 miR-1의 양의 변화를 조사하기 위해, 75 mg kg-1 ISO를 IP 주사를 통해 마우스에 투여하고, 주입된 마우스를 처리 시점으로부터 1일, 5일 및 7일에 희생시켰다 (각 시점에 대해 n=4). 동일한 부피의 PBS를 또한 주입하고 마우스를 즉시 희생시켜 0일째에 샘플로서 사용하였다 (n=4). 심장을 해부한 후, miRNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 small RNA를 추출하였다. miR-1:o8G를 정량하기 위해, "o8G IP 및 qPCR에 의한 산화된 miRNA의 정량화" 방법에 기술된 바와 같이 o8G IP 및 그 다음 miR-1 qPCR을 수행 하였지만, 다음과 같이 약간의 변형이 있었다; 비드 제조에서, 150μl의 PXL에서 3μg의 anti-o8G 항체 (15A3, QED Bioscience), 30μl의 Dynabeads Protein G (Invitrogen), 및 300μg의 deoxyguanosine (dG, Sigma-Aldrich); IP 배양에서, 2.5mM DFOM 및 40U 재조합 RNase 억제제 (Takara)를 포함하는 250μl의 PXL에서 2μg의 small RNA 샘플 및 1pg의 o8dG RNA spike-in (miR-124-3p:4o8dG: 5'p-UAAGo 8 dGCACGCGGUGAAUGCC-3'; 서열번호 64).
실시예 34. 3'UTR에서 miR-1 표적 사이트의 서열 보존 분석
3'UTR에서 보존되는 서열의 모티프를 카운팅 하는 경우, 포유류에 대한 PhastCons 결과는 UCSC 게놈 브라우저 (http://genome.ucsc.edu)로부터 얻어졌으며, 스코어가 0.9 이상이고 보존율 (보존된 모티프 수/모든 모티프 수; %)로 계산된 경우에만 사용되었다. 모든 3'UTR (RefSeq에 의해 정의됨)에서의 보존율은 miR-1의 4 개의 다른 부위 (seed, 2oxo, 3oxo 및 7oxo 부위)에 대해 보존된 miRNA 패밀리의 seed 사이트 (위치 2-8에서 n=103, 6mer)와 함께 계산되었다. 이 중 대부분의 포유동물에서 서열이 보존된다 (그러나 일반적으로 태반 포유동물을 넘어서는 안됨; http://www.targetscan.org). 백그라운드 대조군으로서, 모든 6-mer (n=4098)의 보존도 계산되었다. 결과 분포는 누적 분율 및 모집단의 비율로 표시되었다.
실시예 35. 데이터 가용성
o8G-miSeq (SRP189806, SRP189807, SRP189808, SRP226125), RNA-Seq (SRP189813, SRP189117, SRP189812, SRP189811, SRP189809, SRP213998, SRP214400, SRP228274) 및 CLEAR-CLIP (SRP189810)의 모든 로우 시퀀싱 데이터는 Sequence Read Archives에 보관되었다. Spike-in이 있는 o8G IP의 시퀀싱 데이터를 포함하여 모든 FASTQ 파일은 프로젝트 웹 사이트 (http://clip.korea.ac.kr/oxog/)에서도 제공된다.
실시예 36. 심비대증 동물 모델의 혈장 (plasma)에서 miR-1:o 8 G측정
실시예 8 에서 기술한 바와 같은 동일한 방법으로 ISO 주입을 통하여 마우스의 심비대증을 유도하였다 (도6a). 이후 PBS를 처리한 대조군 3마리와 과 ISO를 처리한 실험군 3마리에서 각각 700μl의 혈액을 채취한 뒤, 4도, 1000x g, 5분 간 원심분리기를 통해 침강시켜 혈장을 분리하였다. 각군당 350ul동량의 혈장으로 부터 Qiagen사의 miRNeasy Serum/Plasma Kit를 사용하여 small RNA를 추출하였고, 추출된 small RNA에서 miR-1의 측정은,실시예 12에서 기술한 바와 같이qPCR을 실시하여U6의 양으로 보정하여 정량하였다. 또한 혈장에서 분리한 100ng의 small RNA로 부터 실시예 11 에서 기술한 바와 같이 항체침강 (IP)을 통해 o8G 변형된 RNA를 특이적으로 분리하고, qPCR 방법을 통해 miR-1을 정량하였다. 또한, o8G 로 변형된 miR-1 정량은, 8G 항체를 이용한 면역침강 실험 시 o8G 가 DNA형태로5번째에 합성된 1pg의 miR-124-3p:4o8dG (UAAGo 8 dGCACGCGGUGAAUGCC-3'; 서열번호 64)을 함께 넣어주어 qPCR로 측정하여 보정하여 측정하였다.
실험예 1. ROS 의존성 심장 비대에서의 miRNA 산화
H9c2 랫트 심근 모세포 세포주에α-아드레날린성 수용체 (AR) 작용제 (페닐에프린; PE)를 처리하여 PE처리에 의한 병리생리학적 비대 자극 및 ROS 생성과 miRNA의 산화를 확인하였다. ROS 형광 염료 (DHE)를 사용하여 유세포 분석(10,000 cells, n=3)으로 분석한 결과, PE 처리 후 세포 내에서 ROS가 증가되었음을 확인하였으며,. 특히 PE로 처리된 후 발생한 비대 세포 중에서 93%는 처리 후 ROS의 생성이 1.8 배 증가하였다. 아드레날린성 비대를 자극하기 위해 확립된 전제 조건인 혈청 결핍도 높은 기저 ROS 수준으로 확대 표현형을 향상시킨다.
생체 내 마우스 모델로 더 확장하여, 도 1a에 나타낸 β-AR 작용제, 이소프로테레놀(isoproterenol, ISO)의 만성 투여는, 도 1b에 나타낸 바와 같이, 심장 비대 (~13% 증가)를 유도한다. 이 중 병리는 심초음파로 확인하였으며, 상기 ISO를 처리하였을 때 ROS를 생성하는 것을 확인하였다.
다음으로, 상기의 ISO를 투여한 심장 비대 마우스 모델에서 RNA가 ROS에 의해 산화되었는지 조사하였다.
크기(200 뉴클레오티드 기준)에 따라 RNA를 분리하여, ISO처리에 의해 유도된 8-옥소구아닌(8-oxoguanine, o8G)을 o8G 특이적 항체로 ELISA를 이용하여 측정하였다. 측정 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, small RNA 에서 large RNA보다 약 3.1배 더 많이 o8G가 생성되었음을 확인하였다. 이는 large RNA가 파라콰트(paraquat, PQ) 처리에 의해 유발되는 산화 스트레스를 받는 경우에도, large RNA (1.8 배)보다 더 급격한 것으로 나타났다.
small RNA의 산화는 도 1d에 나타낸 바와 같이 RNA 유도 침묵 복합체의 핵심 단백질인 Argonaute2 (Ago2)와 o8G의 공존 (colocalization)에 기초하여 miRNA로 추가로 해부되었고, 이는 PE-처리된 rCMC (~8 배)에서 정량화되어 증가되는 것을 확인하였으며, 도 1e에 나타낸 바와 같이 PE- 또는 ISO- 처리된 H9c2에서도 증가되는 것을 확인하였다 (plane 당 o8G+, Ago2+; 100 cells, n=4; P=0.05).
독립적으로, o8G 특이적 항체를 사용한 도트 블롯 분석은 도 1f에 나타낸 바와 같이, 산화환원반응-의존적 방식으로 PE-처리된 H9c2 및 rCMC로부터 small RNA (<200nt)의 산화가 증가하는 것으로 나타났다.
PE 처리된 H9c2 및 ISO 주입 마우스 심장에서 miRNA의 산화를 확인하였을 때, 도 1g에 나타낸 바와 같이 PE 처리된 H9c2 (도 1g의 상단) 및 ISO 주입 마우스 심장 (도 1g의 하단)에서의 northwestern 분석 결과, 및 도 1h에 나타낸 겔 추출 ~20nt miRNA의 도트 블롯 분석 결과를 통해 PE 및 ISO 각각의 처리에 의해 o8G는 ~20nt 크기의 miRNA에서 발행하는 것을 확인하였다.
상기 실험 결과들을 요약하면, 심장 비대는 산화환원반응-의존적이며, ROS의 생성을 가능하게 하고, 생성된 ROS는 miRNA의 o8G 변형을 유도한다.
실험예 2. 심장 miRNA에서의 위치-특이적 o 8 G의 서열 분석
산화된 miRNA 및 상응하는 o8G 위치를 확인하기 위해, o8G의 면역 침강 (IP)을 최적화하고 o8G-유도된 G>T 염기전환을 검출함으로써 miRNA 에서 o8G에 대한 새로운 시퀀싱 방법 (o8G-miSeq)을 개발하였으며, 이의 모식도를 도 2a에 나타내었다.
먼저, 도 2b에 나타낸 바와 같이 CLIP에 사용된 조건을 채택하여 o8G에 대한 IP 프로세스가 광범위하게 개선되었으며, 도 2c에 나타낸 바와 같이 최적화된 IP는 비특이적 배경(비산화된 G)에 비해 ~3000 배의 합성 o8G 양을 나타내었다. o8G가 A와 쌍을 이룰 수 있기 때문에, cDNA에서 G>T 변이를 유도하는 효능은 ~50-60%에 도달하도록 향상되었으며, 이는 도 2d에 나타낸 바와 같이 획득된 제한 효소 부위의 서열-특이적 절단에 의해 간접적으로 (도 2d의 상단) 및 시퀀싱에 의해 직접적으로 (도 2d의 가운데 및 하단) 입증되었다.
이어서, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 o8G-miSeq를 초기에 H9c2에 적용하고, miR-1b를 그의 기본 발현 (o8G enrichment, log2 (IP/input)=7; miRNA-Seq에 의해 표준화 됨)과 관련하여 가장 산화된 miRNA로서 확인하였고, o8G 풍부도 (enrichment), 즉 miRNA에 대한 input read count에 표준화된 o8G IP의 log 비율은 miRNA 빈도에 따라 점으로 표시하여 도 2e의 좌측 도면에 나타내었으며, 히트맵 밀도로서 서열에서의 G의 수를 도 2e의 우측 도면에 나타내었다.
Figure pat00001
IP는 miRNA의 양 및 G-함량으로부터 편향(bias)을 모두 관찰하지 않음으로써 구체적으로 수행되는 것으로 입증되었으며, Volcano plot으로서 유의성 (-log10(P-value))을 나타낸 도 2f에서와 같이 miR-1b에서 o8G는 유의적으로 높고 (P <0.01), G>T 돌연변이율에 기초하여 seed 영역 (위치 2, 3 및 7)에서 현저한 것으로 확인되었다. 또한, 하기 표 2와 같이 rCMC에 대한 추가 적용에 의해, 도 2g에 나타낸 바와 같이 o8G-miSeq는 seed 영역의 식별된 위치(위치 2, 3 및 7)에서 o8G의 증가 (도 2g의 상단)와 함께 PE 처리에 따라 miR-1b가 우선적으로 산화됨을 추가로 나타내었다 (상대적 o8G 풍부도, log2(PE/Mock)=1.66; 도 2g의 하단).
Figure pat00002
이어서, rCMC의 비대성 표현형을 악화시키기 위해 rCMC를 혈청 결핍에 노출시킨 후 하기 표 3에 나타낸 것과 같이 o8G-miSeq 분석을 위한 PE 처리를 수행하였다. 그 결과, 도 2h에 나타낸 바와 같이 miR-1 서열에서 G>T 전환율에 의해 추정된 바대로, 위치 7에서 o8G는 극적으로 증가하였으며 (miR-1:7o8G, ~2배 증가). 도 2i 및 표 4에 나타낸 바와 같이 강화된 miR-1b 산화를 관찰하는 것 외에도 상당한 양의 o8G (log2(o8G-IP)>10)와 함께 miR-184, let-7f-5p 및 miR-1-3p (P<0.01)와 같은 다른 miRNA에서도 유의적인 산화가 관찰되었다. 특히, miR-184는 도 2j에 나타낸 바와 같이 이전의 H2O2 처리결과와 동일하게 확인되었으며, 그 외의 다른 miRNA의 경우는 약간의 불일치가 있었다.
전반적으로, o8G-miSeq를 사용함으로써, 심장 비대 동안 산화된 miR-1 및 그의 특정 o8G 위치를 정확하게 검출할 수 있었다.
Figure pat00003
Figure pat00004
실험예 3. 산화된 miR-1의 o 8 G:A 염기쌍을 통한 표적 침묵 효과
상기 실험예 2에서 확인한 바와 같이 산화된 miRNA (miR-1b, miR-1-3p, miR-184 및 let-7f)에 대하여, 도 3a에 나타낸 바와 같이, PE 처리에 따른 o8G IP (miRNA:o8G)을 통해 이들의 양의 유의한 증가를 관찰하고 rCMC에서 이들을 검증하였다 (P<0.05, t-test). 그 중에서 miR-1은 가장 극적인 향상을 보였으며 (~2.5-5배), 도 3b에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 후 하향 조절에도 불구하고 ISO-처리된 비대성 마우스 심장에서도 확인되었다.
miR-1을 중심으로, seed 영역에서 식별된 o8G 위치 (위치 2, 3 및 7)가 miR-1 (miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 및 miR-1:7o8G)이 o8G:A 염기 결합을 통해 상응하는 새로운 표적 사이트 (2oxo, 3oxo 및 7oxo 사이트)를 인식할 수 있는지 여부를 조사하였고, 그 결과를 도 3c에 나타내었다.
루시퍼라제 리포터 분석을 수행함으로써, 합성된 miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 및 miR-1:7o8G가 해당 산화변형시 G;A염기배열로 인식할 수 있는 oxo 사이트 (2oxo, 3oxo 및 7oxo 사이트)를 가진 표적을 침묵시킬 수 있음을 확인하였으며, 이는 miR-1에 의해 억제되지 않았다.
실제로, 도 3d에 나타낸 바와 같이 miR-1 oxo 사이트를 갖는 이들 루시퍼라제 리포터는 모두 PE-처리된 rCMC에서 억제되었지만 항산화제 NAC의 존재 하에서 활성화 되었고, 이는 타겟 인식을 바꾸고 침묵을 수행하기에 충분한 rCMC의 아드레날린성 자극에 의해 생성된 내인성 miR-1:o8G의 수준을 시사한다.
또한, 도 3e에 나타낸 바와 같이 PE 또는 H2O2 처리 직후 AC16에서 일관된 결과를 관찰하였다.
다음으로, 세포 집단의 이질성으로부터 합성 효과를 배제하기 위해, 도 3f에 나타낸 바와 같이 이중 형광 단백질 (dFP) 리포터로 유세포 분석법을 수행하였다: miRNA 표적 사이트를 갖는 녹색 형광 단백질 유전자 (GFP) 및 사이트를 가지지 않는 적색 형광 단백질 유전자 (RFP). dFP 리포터는 비대성 H9c2에서 상대적 활성의 누적 분율 분석 (P=1.56 x 10-5, Kolmogorov-Smirnov test (KS test), GFP/RFP)에 의해 관찰된 것이다.
내인성 miR-1의 낮은 발현 수준(아마도 도 3h에 나타낸 심근 아세포주의 운명 이질성에 기인함)에도 불구하고 도 3g에 나타낸 바와 같이, 개별 H9c2 세포 수준에서 miR-1:o8G-의존적 억제를 검출할 수 있었다. dFP 리포터의 모든 miR-1 옥소 부위 (7oxo, 3oxo 및 2oxo 부위)는 o8G-miSeq (도 2f)에 의해 관찰 된 miR-1:o8G 위치 (2, 3 및 7)와 일치하여 miR-1:o8G의 기저 수준에 의해 매개된 억제를 검출하기 위한 민감도를 가지고 내생적으로 억제되는 것을 도 3i에서 확인하였으며, miR-1 억제제 또는 동족 miR-1 변이체를 형질 감염시킴으로써 확인되었다.
또한, dFP 리포터는 도 3j에 나타낸 바와 같이 비대 H9c2에서 miR-1 7oxo 사이트의 유의한 PE-의존적 억제를 검출하였다.
또한, 두 형광 단백질의 완전한 여기로부터의 감도가 증가함에 따라, 도 3k에 나타낸 바와 같이 사이트를 가지지 않는(no site) dFP 리포터 (RFP:GFP, NT)와 비교하여 값을 비교함으로써 도 3l에 나타낸 miR-1:7o8G (RFP:GFP-7oxo vs. RFP:GFP, NT) 및 도 3m에 나타낸 NAC 처리에 의한 이의 활성화 (RFP:GFP-7oxo, mock vs. NAC)의 내인성 수준에 의한 miR-1의 억제를 검증하여 분석을 면밀히 조사 하였다.
중요하게도, 세포에서 유사한 범위의 대조군 형광값 (RFP)으로 리포터 형광 값 (GFP-7oxo)을 평균화하여 계산된 이러한 상대적 억제는 리포터 형광값 (GFP-7oxo)의 가장 낮은 25% 일 때 두드러졌으며, 높은 수준의 miR-1:7o8G를 갖는 세포 집단의 존재를 암시하는 것으로 고려되었다. 또한, 도 3n에 나타낸 바와 같이 리포터와 대조군 형광 단백질이 상호 교환된 dFP 리포터는 miR-1:7o8G의 내인성 수준에 의한 miR-1 7oxo 사이트의 억제 및 억제의 PE 의존적 증가를 민감하게 검출하였다.
또한, 도 3o에 나타낸 바와 같이 전환된 dFP 리포터를 사용하여, 리포터 값 (RFP)이 25%로 가장 낮은 제한된 세포 집단만 고려할 때 miR-1 7oxo 사이트의 PE-유도 억제가 보다 실질적인 것으로 관찰되었으며, miR-1 억제제를 도입함으로써 회복된 리포터 활성 (RFP)의 관찰은 miR-1 7oxo 부위의 PE-의존적 억제가 miR-1에 의해 매개됨을 추가로 확인하였다. 특히, 도 3p에 나타낸 바와 같이 산화된 miR-1 (2o8G, 3o8G 및 7o8G)의 도입은 산화되지 않은 miR-1보다 덜 강력하지만, o8G:C 염기 결합의 유지된 활성때문에 루시퍼라제 리포터에서 seed 사이트를 억제할 수 있었다. miR-1:7o8G는 아드레날린성 심장 비대에서 획득된 o8G:A 염기 결합을 통해 표적 mRNA를 침묵시키는 것으로 관찰되었다.
실험예 4. miR-1:o 8 G의 심장 비대 유도 확인
miR-1이 비대에서 음성 기능을 하는 것으로 보고되었지만, PE 처리는 도 4a에 나타낸 rCMC 세포의 현미경 관찰 결과 및 세포 크기 정량 결과와 같이 rCMC의 miR-1-유도 위축을 감소시켰다. 세포 크기 (inch2, n=100)는 ImageJ를 이용하여 정량하였다.
상기 실험예 2에서의 miR-1:o8G의 발견과 PE 유도된 비대의 산화환원반응 의존성에 의해 지속된 합성 miR-1:2o8G, miR-1:3o8G 또는 miR-1:7o8G을 도입하여, 도 4b에 나타낸 바와 같이, PE 처리보다 실질적으로 rCMC의 비대가 더 유도되는 것을 관찰하였다.
이러한 효과는 o8G를 U로 치환한 합성 miR-1 (miR-1:2U, miR-1:3U 및 miR-1:7U)를 도입한 경우에도 대등하게 나타났으며, 이를 통해 비대 현상의 발생이 o8G:A 염기 결합에 의존한다는 것을 알 수 있다.
이러한 효과는 도 4c에 나타낸 바와 같이, H9c2에서도 동일하게 관찰되었다.
구체적으로, 도 4d에 나타낸 qPCR 측정 결과와 같이 miR-1:7o8G 또는 miR-1:7U에 의해 유도된 비대는 PE 처리에서 관찰된 바와 같이 심장 비대 마커로 알려진 심방 artrial natriuretic peptide (ANP)의 발현을 유의하게 증가시켰다. 이러한 결과는 도 4e에 나타낸 유세포 분석과 rCMC (도 4f의 상단) 및 H9c2 (도 4f의 하단)의 시간 경과 이미지에 의해 추가로 확인하였다.
또한, miR-1:7o8G가 생체 내에서 심장 비대에 미치는 영향에 대해 시험 하였다. 도 4g에 나타낸 바와 같이 miR-1:7o8G를 꼬리 정맥을 통해 비 표적화 대조군 (NT)을 갖는 polyethylenimine (PEI) 복합체로서 주사하고(도 4g의 상단), 정량적 PCR (qPCR)에 의해 심장 조직으로의 전달을 검증하였다(도 4g의 하단). 결과적으로, 도 4h에 나타낸 바와 같이 심장 크기의 적어도 ~10% 이상이 유의하게 증가하였으며 (P=0.001, n=3), 도 4i에 나타낸 바와 같이 H&E 염색한 심장 조직 중에서 심실중격 (interventricular septum, IS)을 면역염색하고 심근 세포의 크기를 정량한 결과 심근 세포 크기의 ~19% 증가 및 ANP 발현의 상당한 상향 조절을 관찰하였다. 이 때, 도 4j에서 WGA(wheat germ agglutinin)는 세포 경계, MF20은 심근세포, DAPI는 핵 염색에 사용하였다.
상기 실험 결과를 요약하면, miR-1, 특히 miR-1:7o8G의 위치-특이적 산화는 o8G:A 염기 결합을 통해 생체 내에서 심장 비대를 충분히 이끌어 낼 수 있다.
실험예 5. 산화된 miR-122, let-7 및 miR-124의 발견과 이로 인한 기능 획득
심근비대증 이외에도 산화스트레스가 발생되는 것으로 알려진 다른 질병에 대해서도 여러 마이크로RNA의 5'말단으로부터 8번째까지의 발단부분이 o8G 변형 여부를 확인하였다.
우선 활성산소가 증가된 것으로 알려진 종양 중, miR-122가 특이적으로 많이 발현되는 간세포에서 유래된 간암세포주인 Huh7에서, miR-122의 구아닌 중 2번째 (2oxo), 3번째 (3oxo), 또는 2번째와 3번째가 o8G 변형이 되어있는지 (2oxo, 3oxo) 루시퍼라아제 리포터를 제작하여 확인해보았다. 이때의 루시퍼라아제 리포터 실험은 miR-122의 발단부분에서 o8G:A 배열로 결합하여 인식할 수 있는 표적싸이트를 5개를 포함하도록 psi-check2 (Promega사) 벡터를 사용하여 제작한 후, Huh7에 트랜스팩션한 후 측정하였다. 또한, 해당 싸이트의 억제가 직접적으로 miR-122에 의한 것임을 밝히기 위해, Huh7에서 CRISPR/Cas9을 이용한 유전자 교정으로 miR-122 유전자를 없앤 세포주 (Huh7:miR-122 KO)를 miRNA CRISPR knockout kits (Canopy Bioscience사)를 사용하여 제작하여 동일한 조건에서 함께 실험하였다.
상기 실험에 의한 결과는 도 5a에 나타내었다.
실험 결과, 기존의 miR-122가 인식하는 발단 싸이트 (seed: 5'-ACACUCCA-3') 표적이 억제되었을 뿐만 아니라, 2번 o8G 변형 싸이트 (2oxo: 5'-ACACUCAA-3'), 3번 o8G 변형 싸이트 (3oxo: 5'-ACACUACA-3'), 2번과 3번이 동시에 o8G 변형된 싸이트 (2oxo, 3oxo: 5'-ACACUAAA-3' )가 억제되었다.
또한, Huh7:miR-122 KO 에서 miR-122의 3번 o8G 변형 싸이트 (3oxo), 2번과 3번이 동시에 o8G 변형된 싸이트 (2oxo, 3oxo)의 억제가 사라지는 것을 관찰하여, 해당 억제가 miR-122의 변형에 의한 것임을 증명하였다.
let-7에 대해서 4번째 o8G 싸이트(4oxo: 5'-CUACAUCA-3')에 대한 루시퍼라아제 리포트를 이전과 동일한 방법으로 제작하고 이를 이용하여 종양교모세포인 HS683에서 측정해본 결과 let-7의 발단 싸이트 (seed: 5'-CUACCUCA-3') 보다는 그 저해정도가 작지만, 대조군에 비하여 유의하게 억제되는 것 (P<0.01)을 확인하였으며, 그 결과는 도 5b에 나타내었다.
또한, 신경세포 및 교모세포에서 많이 발현되는 것으로 알려진 miR-124에 대해서도 동일하게 o8G 변형이 발단 지역에 생성되었는 지를 알아보기 위해서, miR-124의 4번째 o8G 변형 표적 싸이트 (4oxo: 5'-GUGCAUUA-3')에 대해서도 루시퍼라아제 리포터 실험을 교모세포종인 HS683 세포에서 실시하였으며, 그 결과는 도 5c에 나타내었다.
실험결과 miR-124의 발단 싸이트(seed: 5'-GUGCCUUA-3')는 억제가 되었으나, 4oxo 싸이트의 억제는 관찰되지 않았다. 종양세포의 경우 영양분이나 혈액공급이 부족할 경우 산화스트레스가 증가되어 세포내의 산화가 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, HS683에서 발현되는 miR-124의 o8G 변형이 이러한 상황에서 증가하는지를 알아보기 위해서, 세포배양 배지에 혈청을 없애고 실험을 진행해보았고, 이 때에는 miR-124의 4oxo 싸이트가 유의하게 (P<0.01) 억제되는 것을 발견하였다.
상기 실험 결과를 통하여, 간암 세포의 miR-122에서는 2번째, 3번째, 또는 2번째 3번째가 함께 o8G 변형이 되어 있다는 사실과, 교모세포종에서는 let-7의 4번째 염기가 o8G 변형이 되어 있고 miR-124는 배양액에서의 혈청 제거와 같이 종양 세포에서 일어날 수 있는 산화스트레스를 주었을 때 4번째 염기의 o8G 변형이 일어나, 이들이 새롭게 인식하는 표적 유전자에 대해서 그 발현을 억제할 수 있다는 것을 확인하였다.
간암세포에서 전이가 되기 위해서는 우선적으로 간암세포의 이동능력이 필요하고, 이 때 miR-122의 발현은 간암 세포의 이동을 억제하는 것으로 알려져 있다. 간암세포주인 Huh7에서 miR-122가 2번째와 3번째가 o8G 변형(miR-122:2,38G)이 되어 있는 것을 관찰하였으므로, 해당 산화 miR-122가 간암세포의 이동능력에 영향을 미치는지를 살펴보기 위해서, miR-122:2,3o8G (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3', 서열번호 65)를 Trilink사의 RNA합성 서비스를 통해 합성하고 이를 passenger strand(has-miR-122-5p)와 이중체를 만든 후 Huh7에 트랜스팩션 시킨 후 상처치유분석 (wound-healing assay) 실험을 진행하였다.
실험 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, 대조군인 NT-6pi (cel-miR-67의 6번째 염기를 모두 dSpacer로 치환한 것)에 비해서 miR-122:2,3o8G를 세포에 도입했을 때 Huh7의 이동능력이 현저하게 저해됨을 확인하였다.
이렇게 세포에 도입된 miR-122:2,3o8G는 세포내의 활성산소에 의해서 다른 구아닌이 추가적으로 산화되어 그 기능이 다소 줄어들 가능성이 있다(도 8e 참조). 따라서, 세포 배양용 항산화제(Sigma-Aldrich사의 antioxidant supplement)를 처리하고 동일하게 상처치유분석 실험을 진행해 보았을 때는, miR-122:2,3o8G의 간암세포 이동 억제능이 더 크게 나타남을 확인하였다. 즉 o8G 변형된 마이크로RNA의 생물학적인 효과는 해당 세포에 항산화제를 함께 처리함으로서 그 기능을 극대화 할 수 있다.
또한, 교모세포종에서 확인한 o8G 변형 마이크로RNA인 let-7:4o8G 의 기능을 조사하기 위해서, 이를 siRNA형태로 합성하고 (let-7:4o8G: 5'-pUGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3', 서열번호 66 ) duplex 형태로 HS683 세포에 도입한 후 세포사멸(apoptosis)을 eBioscience Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Invitrogen사)를 사용하여 Attune NxT 유세포 분석기를 통해 측정하였다.
실험 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, HS683의 세포사멸이 유의하게 증가되었음을 확인하였다.
상기와 동일한 실험을 miR-124:4o8G의 siRNA 합성 형태( 5'p- UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3', 서열번호 67) 에 대해서 수행하였고, 도 5f에 나타낸 바와 같이, 세포사멸이 유도됨을 관찰하였다.
실험예 1 내지 5의 실험 결과를 참조하면, 여러 마이크로RNA의 발단지역 (5'말단 기준 8번째까지의 염기)에 일어나는 o8G 변형은 합성하여 해당 세포내로 도입하였을 때 다양한 병리생리학적 기능을 나타낼 수 있음을 알 수 있다.
실험예 6. 심근병증에서 miR-1:7o 8 G 및 이의 기능 상실
인간 심근병증 환자 심장의 좌심실로부터 얻은 Ago HITS-CLIP 결과를 분석함으로써 miR-1의 산화를 조사하였다 (n=6, 표 5 내지 7 참조).
Figure pat00005
Figure pat00006
Figure pat00007
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 비록 비율은 낮았지만, Ago- 관련 miR-1에서 동일한 패턴의 G>T 돌연변이 (위치 2, 3, 7)가 검출되었고 (도 6a 좌측 도면), 주로 가장 높은 빈도의 위치 7과 더불어 다른 작은 위치 (위치 2, 3, 및 12; n=4)를 가진 환자 그룹 (1,2,4 및 5)을 포함하는 것으로 군집화되었다; 다른 하나 (3 및 6)는 위치 2에서 독점적으로 가장 높은 빈도를 가졌다 (n=2)(도 6a 우측 도면). 표준화된 Ago-mRNA 클러스터에서, 위치 2, 3, 또는 7을 통해 o8G:A 결합으로 나타나는 산화된 miR-1 표적 사이트는 도 6b에 나타낸 바와 같이 예상보다 현저하게 관찰되었으며 (P<0.01, chi-square test), G:U 결합 (~10%) 및 control 사이트 (~7%)를 초과하는 평균 ~18%에 해당한다.
miR-1:7o8G의 생리학적 관련성을 추가로 다루기 위해, 기능 손실을 평가 하였다. seed-매개된 표적 부위의 탠덤(tandem) 반복을 보유하기 위해 RNA로서 합성된 경쟁적 억제제인 miRNA sponge로부터의 개념을 채택하여, 도 6c에서와 같이 miR-1 (anti-seed) 및 miR-1:7o8G (anti-7oxo)를 준비하였으며 (도 6c의 상단), 이들의 특정 억제에 대해 검증하였다 (도 6c의 하단).
anti-7oxo (9x)의 억제 활성은 도 6d에 나타낸 바와 같이 RNA-Seq (표 8 참조)를 수행함으로써 혈청이 결핍된 H9c2에서 miR-1 7oxo 표적을 전체적으로 억제하는 것을 확인하였다.
Figure pat00008
이어서, 도 6e에 나타낸 바와 같이 anti-7oxo (4x)가 rCMC에 도입되고 PE-유도 비대를 약화시키는 것으로 나타났다. 또한 합성된 anti-7oxo (4x) RNA 로서 또는 13 개의 표적 부위를 함유하는 심근 세포-특이적 발현 벡터 (α-MHC 13x)로서 ISO-처리된 마우스에 주입된, anti-7oxo (4x 및 α-MHC 13x) 둘 다 도 6f에 나타낸 바와 같이 강력하게 아드레날린성 심장 비대에 길항작용을 하였으며, anti-7oxo (α-MHC 13x)의 전달 정도가 확인되고 이들의 억제 활성과 상관 관계가 있는 것으로 관찰되었다.
anti-7oxo (α-MHC 13x)의 투여는 도 6g에 나타낸 바와 같이 심근 세포 크기를 유지시켰고 (도 6g의 상단), miR-1:7o8G 타겟을 전체적으로 억제하였다 (도 6g의 하단 및 표 9 참조). 그러나, 도 6h에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 마우스 심장에서 ROS 상승에 미치는 영향은 없었다
Figure pat00009
또한, 도 6i에 나타낸 바와 같이, anti-7oxo (α-MHC 13x)를 발현하는 형질전환 마우스를 생성하였고 (TG), 표 10 및 도 6j에 나타낸 바와 같이 이의 발현이 확인되었다 (RNA-Seq).
Figure pat00010
그 결과, 도 6k에 나타낸 바와 같이 그들의 심장 크기에 기초적인 차이는 없었으나 (도 6k의 상단), ISO-유도된 심장 비대는 3 개의 상이한 TG 모델 모두에서 유의하게 예방되었고 (도 6k의 하단), 도 6l에 나타낸 바와 같이 miR-1:7o8G 표적의 전체적인 억제를 나타냈으며, 도 6m에 나타낸 바와 같이 ISO 처리 (TG(+)ISO vs. TG(-)ISO)의 존재 하에서도 IS에서 심근 세포의 크기가 감소하였다.
종합하면, miR-1, 특히 miR-1:7o8G의 위치-특이적 산화는 심장 비대 및 질병의 내인성 드라이버 역할을 하면서 심근병증 환자에서 표적 상호작용을 발생시키고 바꾸는 것을 시사함을 입증하였다. 이와 관련하여, ROS에 의해 유도된 본 발명에 따른 miR-1:7o8G의 위치 특이적 산화 및 이의 심장 비대 유도 과정에 대한 개략도를 도 6n에 나타내었다.
실험예 7. 심비대증 동물 모델의 혈장 (plasma)에서 miR-1:o 8 G 증가 확인
심비대증 모델 및 심근비대 환자의 심장조직에서 miR-1의 o8G 변형이 증가되는 것을 관찰한 후, 이를 비침습적으로 검출하여 심비대증을 진단할 수 있는지 확인하기 위해서, 심비대증을 유도시킨 마우스의 혈액에서 miR-1의 o8G 변형을 검출하고자 하였다. 우선 ISO 처리를 통해 마우스의 심비대증이 유도되었는지를 확인하였다. 도 7a는 ISO를 통하여 유도한 심비대증의 대표 심장 사진으로 각 군당 3마리이다. ISO 가 처리된 실험군의 심장이 대조군에 비해 평균적으로 약 30% (36% H/B vs 32% H/T) 로 심장 크기가 증가하였다. 이의 자세한 내용은 표 11에 기록하였다. 또한, 동물모델의 혈액에서 miR-1:o8G 가 측정되는지, 또한 심비대증에 enrichment 되는지 확인하기 위해, 혈장을 분리하고 miR-1:o8G 를 정량하였다 (n=3).
Figure pat00011
이어, 각 동물 모델로부터 분리한 혈액에서 혈장을 분리하고 small RNA를 추출한 후, 분리된 small RNA에서의 miR-1의 양을 측정하면서 동시에 miR-1이 o8G 변형된 양을 o8G 에 대한 면역침강을 통해 측정하였다 (도 7b). 동량의 혈장에서 추출된 RNA로부터 miR-1의 양을 측정한 결과, miR-1이 혈장에 존재하며, 해당 양은 심비대 유도와 상관없이 동량이 존재하는다는 것을 실험군과 대조군 사이의 측정 결과가 통계적으로 유의하지 않게 나오는 것으로 확인할 수 있었다 (도 7c).
이후 혈장에 존재하는 miR-1:o8G 를 확인하기 위해 혈장에서 분리한 small RNA에 대해 o8G-IP를 진행하였다 (도 7b). 이때 o8G-IP과정에서의 차이를 보정하여 정량하기 위해 o8G 가 5번 위치에 DNA로 합성된 human miR-124-3p를 면역침강 전에 small RNA 샘플에 동량을 넣어 사용하였다. 그 결과, 심비대증 혈장에서 관찰한 산화 변형된 miR-1:o8G 은 각 3마리의 경우 평균적으로 약 379% 증가하였으며, 이 변화는 통계적으로 유의미함을 Student's t-test 결과를 통해 확인하였다 (p= 0.031) (도 7d). 종합하여 보면, 혈장에서 qPCR을 통해 측정된 microRNA-1는 심비대증과 대조군에서 차이가 없지만, o8G-IP-qPCR 을 통해 산화 변형된 microRNA-1 (miR-1:o8G) 를 측정한 결과 심비대증에서 유의적으로 증가함을 확인하였으며, 이를 통해 비침습적으로 혈액을 기반으로 하여 miR-1:o8G 측정을 통해 심비대증을 진단할 수 있다는 점을 관찰하였다.
실험예 8. 심근 비대에 대한 항산화제의 효과 및 항산화제 처리 시 miR-1:7o 8 G를 억제하는 anti-miR-1-7oxo의 심근세포 비대 억제능 향상 확인 .
PE처리에 의해 유도된 비대 세포에 항상화제 NAC를 처리하면, 도 8a에 나타낸 바와 같이, 비대가 감소된 것을 확인하였으며 (n=4; inch2, ImageJ), 도 8b에 나타낸 바와 같이, ISO와 NAC의 공동 처리는 ISO-유도된 심장 비대를 약화시킴을 확인하였다.
또한, 도 8c에 나타낸 바와 같이, ISO 또는 PE 처리에 의한 o8G 증가가 NAC의 처리에 따라 감소하는 것을 확인하였다 (scale bar, 100μm). 즉 항산화제 NAC의 처리에 따라 miRNA의 산화가 감소하였다.
NAC처리에 의해서 ISO에 의한 심비대증이 억제되는 현상을 관찰한 후 (도 1b), 다른 항산화제 처리를 통해서도 동일하게 심비대증을 억제할 수 있는지를 확인하기 위해서, H9c2 세포에 PE와 ISO를 처리하여 심근세포의 비대를 유도시키면서 다른 항산화제인 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)과 세포배양용 항산화제로 판매되고 있는 Sigma-Aldrich사의 Antioxidant Supplement (A1345)를 처리해보았다 (도8d). 그 결과, 항산화제의 종류에 상관없이 모두 심근세포의 크기를 줄였으며, 특히 PE나 ISO를 처리하더라고 전혀 H9c2 심근세포주의 크기가 커지지 않는다는 것을 3번의 반복 실험으로 통계적으로 유의하게 확인하였다 (*, P<0.01).
또한, 쥐(rat) 배아에서의 일차심근세포(rCMC)를 배양한 후 PE처리에 의해서 해당 세포에서 비대증이 일어남을 확인하였다 (도 8e, 위 패널). 여기에 miR-1의 7번이 o8G 변형된 형태(miR-1:7o8G)를 억제하도록 이를 인식하는 7oxo site를 여러 개 포함하는 저해용 anti-7oxo(4x)를 도입했을 때, 심근세포의 비대가 진행되었다가 억제되는 것을 다시 확인하였으며, 추가적으로 항산화제인 NAC를 함께 처리하였을 때에는 심근세포가 전혀 비대해지지 않는 최대의 효과를 관찰할 수 있었다 (도 8e, 중간 패널). 이러한 결과는 항산화제의 효과가 anti-7oxo(4x)와 시너지하게 작용하여 일어나는 현상일 수 있으며, 또한 anti-7oxo(4x)를 세포에 도입 후 PE처리에 의해서 증가되는 활성산소에 의해서 추가적으로 일어날 수 있는 o8G 산화가 anti-7oxo(4x)에 일어나는 것을 막아서 나타내는 효과 일 수도 있다. 실제로 세포에 인위적으로 도입하는 RNA에서 추가적인 o8G 생성이 일어나서 그 효과가 저해되는 지를 알아보기 위해서, 이번에는 활성산소가 발생되는 PE처리가 아닌 miR-1:7o8G 도입으로 심근세포 비대를 유도하고 동시에 산화스트레스를 가하고자 100μM의 과산화수소(H2O2)를 처리해보았다 (도 8e, 아래 패널). 그 결과, 기존의 miR-1:7o8G 발현으로 인한 심근세포 비대 현상이 과산화수소 처리에 의해서 저해되는 것을 관찰하였으며, 이와는 반대로 항산화제인 NAC를 처리하였을 때는 miR-1:7o8G에 의해 유도되는 심근세포 비대가 보다 효율적으로 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 이러한 결과로 미루어 보아, 항산화제 처리는 NAC만이 아닌, BHA와 다른 일반적인 세포배양용 항산화제 등 항산화 효과를 나타낼 수 있다면 심근세포 비대를 억제할 수 있다는 사실을 확인했을 뿐만 아니라, 항산화제의 처리는 o8G 변형된 마이크로RNA 또는 이를 억제하는 RNA 에 일어날 수 있는 추가적인 산화변형을 막아 인위적인 RNA 발현을 통한 심근세포 크기의 조절을 효율적으로 유도할 수 있음을 알 수 있었다. 특히, 심비대증은 생리적 비대와 병리적 비대로 나타나는데, 생리적 비대는 운동선수나 임산부의 경우 충분한 혈액공급이 필요할 때 이를 원할하게 공급하기 위해서 심장을 비대하게 하는 경우로 상황에 따라서는 심장의 기능을 강화하기 위한 용도로 임시적으로 유도하는 것이 필요할 수 있다. 따라서 심근세포로의 miR-1:7o8G 도입으로 인한 심비대 유도는 이러한 생리적 비대로서 작용할 수도 있으며, 이때의 항산화제 처리는 심근세포 비대의 효과를 효율적으로 유도할 수 있을 뿐 아니라, 일반적으로 병리학적 현상을 일으키는 추가적인 산화스트레스를 막아 병리적 심비대증을 억제하는 효과를 나타낼 수도 있을 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Korea University Research and Business Foundation <120> NUCLEIC ACIDS INDUCING RNA INTERFERENCE INCLUDING 8-OXOGUANINE, MICRO RNA INCLUDING 8-OXOGUANINE, AND USE THEREOF <130> DPP20204247KR <150> 10-2019-0156147 <151> 2019-11-28 <160> 70 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1:2(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (2) <223> 8-oxoguanine <400> 1 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1:3(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (3) <223> 8-oxoguanine <400> 2 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1:7(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (7) <223> 8-oxoguanine <400> 3 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 4 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 2oxo site <400> 4 acauuca 7 <210> 5 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 3oxo site <400> 5 acauuac 7 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<210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA:8-oxoguanine spike-in <220> <221> misc_difference <222> (5) <223> 8-oxoguanine <400> 19 uaaggcacgc ggugaaugcc aa 22 <210> 20 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 seed site <400> 20 acauucc 7 <210> 21 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cont NT site <400> 21 gguugug 7 <210> 22 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo dT adaptor primer <400> 22 gcgagcacag aattaatacg actcactata ggtttttttt ttttvn 46 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA reverse primer <400> 23 gcgagcacag aattaatacg actcac 26 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-oxoguanine or G spike-in forward primer <400> 24 tggaatgtaa agaagtatgt at 22 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-oxoguanine or G spike-in reverse primer <400> 25 gcgagcacag aattaatacg actcac 26 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA:8-oxoguanine spike-in forward primer <400> 26 taaggcacgc ggtgaatgcc aa 22 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA:8-oxoguanine spike-in reverse primer <400> 27 gcgagcacag aattaatacg actcac 26 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control forward primer <400> 28 cgcttcggca gcacatatac 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control reverse primer <400> 29 ttcacgaatt tgcgtgtcat 20 <210> 30 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 30 acttcaaagc tcacggttcc gctacctcga gaagacggca tacga 45 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 39-oxo-R or 39R forward primer <400> 31 cctggtccca gactaaagaa t 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 39-oxo-R or 39R reverse primer <400> 32 acttcaaagc tcacggttcc g 21 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 22nt synthetic RNA <220> <221> misc_difference <222> (7) <223> 8-oxoguanine <400> 33 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'adaptor : 5'-adenylation <220> <221> misc_difference <222> (2) <223> methyl-phosphonate guanine <220> <221> misc_difference <222> (2) <223> dideoxy-cytosine <400> 34 tggaattctc gggtgccaag gc 22 <210> 35 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'adaptor <220> <221> misc_difference <222> (31) <223> 2'-methoxy-C <400> 35 guucagaguu cuacaguccg acgaucnnnn c 31 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT primer <400> 36 gccttggcac ccgagaattc ca 22 <210> 37 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal forward primer <400> 37 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ttcagagttc tacagtccga 50 <210> 38 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> barcode primer <400> 38 caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcctt ggcacccgag aattcca 57 <210> 39 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-seed site forward primer <400> 39 tcgagacatt ccacattcca cattccacat tccacattcc gc 42 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-seed site reverse primer <400> 40 ggccgcggaa tgtggaatgt ggaatgtgga atgtggaatg tc 42 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-2oxo site forward primer <400> 41 tcgagacatt caacattcaa cattcaacat tcaacattca gc 42 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-2oxo site reverse primer <400> 42 ggccgctgaa tgttgaatgt tgaatgttga atgttgaatg tc 42 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-3oxo site forward primer <400> 43 tcgagacatt acacattaca cattacacat tacacattac gc 42 <210> 44 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-3oxo site reverse primer <400> 44 ggccgcgtaa tgtgtaatgt gtaatgtgta atgtgtaatg tc 42 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-7oxo site forward primer <400> 45 tcgagaaatt ccaaattcca aattccaaat tccaaattcc gc 42 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1-7oxo site reverse primer <400> 46 ggccgcggaa tttggaattt ggaatttgga atttggaatt tc 42 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 control site forward primer <400> 47 tcgagacttt ccactttcca ctttccactt tccactttcc gc 42 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 control site reverse primer <400> 48 ggccgcggaa agtggaaagt ggaaagtgga aagtggaaag tc 42 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NheI and XhoI site forward primer <400> 49 taggctagcc accatggtga gcaagggcga 30 <210> 50 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NheI and XhoI site reverse primer <400> 50 gggctcgagc gatcgcctag aattacttgt acagctcgtc catgc 45 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApaI and XbaI site forward primer <400> 51 gaagggccct atgagcgagc tgatcaagga ga 32 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApaI and XbaI site reverse primer <400> 52 gactctagaa ttattatctg tgccccagtt tgctag 36 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> residual 33bp of hluc+ sequences forward primer <400> 53 gtactgttgg taaagccacc atgagcgagc tgatca 36 <210> 54 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> residual 33bp of hluc+ sequences reverse primer <400> 54 tccttgatca gctcgctcat ggtggcttta ccaaca 36 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH poly (A) forward primer <400> 55 ccaccagcct tgtcctaata aa 22 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH poly (A) reverse primer <400> 56 cagcttggtt cccaataga 19 <210> 57 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-7oxo (alpha-MHC 13x) forward primer <400> 57 tcgacaaatt ccaaaaattc cataaattcc agaaattcca caaattccaa aaattccaca 60 aattccataa attccagaaa ttccaaaaat tccataaatt ccagaaattc cacaaattcc 120 aa 122 <210> 58 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-7oxo (alpha-MHC 13x) reverse primer <400> 58 agctttggaa tttgtggaat ttctggaatt tatggaattt ttggaatttc tggaatttat 60 ggaatttgtg gaatttttgg aatttgtgga atttctggaa tttatggaat ttttggaatt 120 tg 122 <210> 59 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cont (anti-NT 13x) forward primer <400> 59 tcgacggttg tgaaggttgt gatggttgtg agggttgtga cggttgtgaa ggttgtgacg 60 gttgtgatgg ttgtgagggt tgtgaaggtt gtgatggttg tgagggttgt gacggttgtg 120 aa 122 <210> 60 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cont (anti-NT 13x) reverse primer <400> 60 agctttcaca accgtcacaa ccctcacaac catcacaacc ttcacaaccc tcacaaccat 60 cacaaccgtc acaaccttca caaccgtcac aaccctcaca accatcacaa ccttcacaac 120 cg 122 <210> 61 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH poly (A) forward primer <400> 61 taaattccaa attccagaaa ttccacaaat tccat 35 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hGH poly (A) reverse primer <400> 62 ccagcttggt tcccaataga 20 <210> 63 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-7oxo (4x) primer <400> 63 taaattccaa attccagaaa ttccacaaat tccat 35 <210> 64 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8-oxo deoxyguanosine RNA spike-in <220> <221> misc_difference <222> (5) <223> 8-oxo deoxyguanosine <400> 64 uaaggcacgc ggugaaugcc 20 <210> 65 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122:2,3(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (2) <223> 8-oxoguanine <220> <221> misc_difference <222> (3) <223> 8-oxoguanine <400> 65 ugggagugug acaauggugu uug 23 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7:4(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (4) <223> 8-oxoguanine <400> 66 ugaguaguag guuguauag 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124:4(8-oxoguanine) <220> <221> misc_difference <222> (4) <223> 8-oxoguanine <400> 67 uaaggcacgc ggugaaugc 19 <210> 68 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122 <400> 68 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 69 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> let-7 <400> 69 ugaguaguag guuguauag 19 <210> 70 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-124 <400> 70 uaaggcacgc ggugaaugc 19

Claims (30)

  1. 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 5'말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 서열을 포함하는 RNA간섭 유도 핵산.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 하기 그룹 1의 마이크로RNA 중 하나 이상인 RNA 간섭 유도 핵산:
    [그룹 1]
    miR-1, miR-184, let-7f-5p, miR-1-3p, miR-122, let-7, miR-124.
  4. 제1항에 있어서,
    8-옥소구아닌(o8G)의 위치에서 o8G:A 배열이 일어나 표적 사이트를 인식하는 RNA 간섭 유도 핵산.
  5. 제1항에 있어서,
    하기 그룹 2의 폴리뉴클레오타이드 중 하나 이상을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산:
    [그룹 2]
    서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-Uo8GGAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p-UGo8GAAUGUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5’p- UGGAAUo8GUAAAGAAGUAUGUAU-3’);
    서열번호 65의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-Uo 8 Go 8 GAGUGUGACAAUGGUGUUUG-3');
    서열번호 66의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p-UGAo 8 GUAGUAGGUUGUAUAGdTdT-3');
    서열번호 67의 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드 (5'p- UAAo 8 GGCACGCGGUGAAUGCdTdT-3').
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 RNA 간섭 유도 핵산을 세포 또는 동물에 주입할 경우 심근비대, 간암세포의 이동 억제 또는 세포사멸이 유도되는 RNA 간섭 유도 핵산.
  7. 제1항의 RNA 간섭 유도 핵산 및 항산화제를 포함하는 조성물
  8. 하기의 단계를 포함하는, 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)의 위치 동정 방법:
    (a) 세포로부터 RNA를 추출하는 단계;
    (b) 상기 추출한 RNA로부터 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된 RNA를 항-o8G 항체를 이용하여 면역침강법(IP)으로 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리한 8-옥소구아닌(o8G)이 포함된RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하고 8-옥소구아닌(o8G)의 위치를 파악하기 위한 시퀀싱 라이브러리를 제작하여 시퀀싱하는 단계; 및
    (d) 상기 시퀀싱 결과 구아닌 (G)이 티민 (Thymine; T)으로 변형된 위치를 확인하여 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌 (o8G)으로 변형된 위치를 동정하는 단계.
  9. 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
    상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 변형된 마이크로RNA는 5'말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌(G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 것이고,
    상기 변형 핵산은 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째 또는 3번째 중 어느 하나의 뉴클레오타이드에서 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 변형된 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(A)을 포함하는 변형 핵산.
  11. 제9항에 있어서,
    5’-ACAUUCA-3’, 5’-ACAUUAC-3’, 5’-AAAUUCC-3’중 하나 이상의 염기 서열을 포함하는 변형 핵산.
  12. 제9항 내지 제11항의 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형된 마이크로RNA와 특이적으로 결합하는 변형 핵산으로서,
    상기 변형 핵산은 마이크로RNA의 5'말단으로부터 2번째 및 3번째 중 어느 하나로부터 시작하여 6개 이상의 연속된 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 포함하고,
    상기 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 8-옥소구아닌(o8G)과 결합하는 위치의 뉴클레오타이드로 아데닌(Adenine; A)을 포함하는 변형 핵산 또는
    상기 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는
    심비대증 치료용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인 심비대증 치료용 약학 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    항산화제를 더 포함하는 심비대증 치료용 약학 조성물.
  16. 핵산의 이중 가닥 중 하나 이상의 단일 가닥에서, 5’ 말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드는 하나 이상의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)을 포함하는 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는, 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 마이크로 RNA는 miR-122인 간암치료용 약학 조성물.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 let-7 또는 miR-124인 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  19. 제16항에 있어서,
    항산화제를 더 포함하는 간암치료용 또는 교모세포종 치료용 약학 조성물.
  20. 항산화제를 유효성분으로 포함하는 심비대증 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
    상기 항산화제는 RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)의 8-옥소구아닌 (8-oxoguanine; o8G)으로의 산화 변형을 억제하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 항산화제는 N-아세틸시스테인 (N-acetylcysteine, NAC) 또는 부틸하이드록시아니솔 (Butylated hydroxyanisole, BHA)인 약학 조성물.
  22. 제20항에 있어서,
    상기 RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인 약학 조성물.
  23. 동물의 심근 세포로부터 분리된 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (Guanine; G)이 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로 변형되어 있는지 여부를 확인하는 단계; 및
    상기 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 하나 이상의 구아닌 (G)이 8-옥소구아닌(o8G)으로 변형되어 있는 경우 심비대증으로 분류하는 단계를 포함하는,
    심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 1번째 내지 9번째 뉴클레오타이드인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  25. 제23항에 있어서,
    상기 뉴클레오타이드는 마이크로RNA의 5’말단으로부터 2번째, 3번째 또는 7번째 뉴클레오타이드인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  26. 제23항 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 마이크로RNA는 miR-1, miR-184, let-7f-5p 또는 miR-1-3p인, 심비대증 진단을 위한 정보제공방법.
  27. (a) 제8항의 변형 핵산을 암호화하는 유전자를 프로모터에 작동 가능하게 연결하여 재조합 벡터를 제작하는 단계;
    (b) 상기 재조합 벡터를 동물의 수정란에 도입하는 단계; 및
    (c) 상기 수정란을 발생시켜 형질전환 동물 모델을 수득하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델의 제작 방법.
  28. 제27항의 방법으로 제작된, 인간을 제외한 심비대증 저항성 동물 모델.
  29. (a) 심비대증 동물 모델의 심근 세포에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 상기 심비대증 동물 모델의 심근 세포에서 발현되는 마이크로RNA의 뉴클레오타이드 중 구아닌 (Guanine; G)의 8-옥소구아닌(8-oxoguanine; o8G)으로의 변형 빈도를 분석하는 단계; 및
    (c) 상기 8-옥소구아닌(o8G)이 후보물질을 처리하지 않은 경우에 비해 감소할 경우, 상기 후보물질을 심비대증 치료제로 선별하는 단계를 포함하는, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 후보물질은 항산화제인, 심비대증 치료용 후보물질의 스크리닝 방법.
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