JP2023098926A - Ｔｕｔ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物 - Google Patents

Ｔｕｔ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物 Download PDF

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Abstract

【課題】癌予防又は治療用薬学的組成物を提供する。【解決手段】特定の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ、特定の塩基配列からなる核酸、及び特定の塩基配列群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ、の少なくとも1種を含む組成物を提供する。【効果】本発明は、ＴＵＴ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物を提供し、本発明の薬学組成物は、ＴＵＴ４／７の機能を抑制させることによって細胞分裂を防ぎ、癌発達を阻害させることができ、ｍｉＲ－３２４－５ｐの量を増やし、ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の機能を抑制させることができるので、これを効果的に癌の予防、治療又は診断に利用可能である。【選択図】図７

Description

発明の詳細な説明
〔技術分野〕
本発明は、ＴＵＴ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関し、より詳細には、ＴＵＴ４／７発現を調節する核酸配列を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関する。
本発明は、大韓民国保健福祉部の支援下で課題番号１７１１０７９０９８によってなされたものであり、この課題の研究管理専門機関は基礎科学研究院、研究事業名は“基礎科学研究院研究運営費支援”、研究課題名は“ＲＮＡによる細胞運命調節研究”、主管機関は基礎科学研究院、研究期間は２０１８．０１．０１．～２０１８．１２．３１．である。
本特許出願は、２０１９年２月２６日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０－２０１９－００２２５５１号に対して優先権を主張し、この特許出願の開示事項は本明細書に参照によって組み込まれる。
〔背景技術〕
マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）の生成過程は、ドロシャ（Ｄｒｏｓｈａ）とダイサー（Ｄｉｃｅｒ）による切断過程によって二重螺旋ＲＮＡを作り、これを構成する２本の鎖（５ｐと３ｐ）からいずれかの鎖を選択する過程を伴う。２本の鎖は厳格に異なる配列を持っており、異なる遺伝子の発現を調節できるため、いずれの鎖が選択されるかを決定する鎖選択（ｓｔｒａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）過程は生物学的に重要である。
一方、細胞類型によって主に選択されるｍｉＲＮＡ鎖が変わることがあるが、これを代案的鎖（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）選択（又は、“アームスイッチング（ａｒｍ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）”）と呼ぶ。代案的鎖選択は、組織分化と癌発達に影響を及ぼすことができる。しかしながら、このような代案的鎖選択がどのように調節を受けるかなどのその分子メカニズム及び生理的重要性は、依然として曖昧なままである。
〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明者らは、ＴＵＴ４及びＴＵＴ７（ＴＵＴ４／７）によるウリジン化現象がｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のダイサー切断位置を調節することによって機能の異なる３種のマイクロＲＮＡ（５ｐ及び２３ｐ異型体）を生成することを確認し、ＴＵＴ４／７の機能を抑制させて細胞分裂を防ぎ、癌発達を阻害させることができ、ｍｉＲ－３２４－５ｐの量を増やし、ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の機能を抑制させて同一の効果を示すことができることを糾明し、本発明を完成するに至った。
したがって、本発明の目的は、配列番号１及び２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）；配列番号４の塩基配列からなる核酸；及び配列番号５～２０からなる群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）；を含む癌予防又は治療用薬学的組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、配列番号１及び２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ
ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）；配列番号４の塩基配列からなる核酸；及び配列番号５～２０からなる群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）；を用いた癌治療方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、配列番号１及び２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）；配列番号４の塩基配列からなる核酸；及び配列番号５～２０からなる群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）；の癌治療用途を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ｍｉＲ－３２４－５ｐ又はｍｉＲ－３２４－３ｐ．１のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ｍｉＲ－３２４－５ｐ又はｍｉＲ－３２４－３ｐ．１のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用キットを提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＴＵＴ４（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ４）又はＴＵＴ７（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ７）の遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、ＴＵＴ４又はＴＵＴ７の遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルを測定する製剤を含む癌診断用キットを提供することである。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、ＴＵＴ４及びＴＵＴ７（ＴＵＴ４／７）によるウリジン化現象がｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のダイサー切断位置を調節することによって機能の異なる３種のマイクロＲＮＡ（５ｐ及び２３ｐ異型体）を生成することを確認し、ＴＵＴ４／７の機能を抑制させて細胞分裂を防ぎ、癌発達を阻害させることができ、ｍｉＲ－３２４－５ｐの量を増やし、ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の機能を抑制させて同一の効果を示すことができることを糾明した。
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明の一態様は、配列番号１及び２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）；
配列番号４の塩基配列からなる核酸；及び
配列番号５～２０からなる群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）；からなる群から選ばれる１種以上を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関する。
前記癌は、脳腫瘍、結腸癌、大腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、膵癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌及び／又は悪性黒色腫でよいが、それらに制限されるものではない。
本発明において、“マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）”とは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）部位との塩基結合によって転写後抑制子の役割を担う概ね２２ｎｔの非翻訳ＲＮＡのことを指し、遺伝子発現を調節する役割を担う。
本発明の前記マイクロＲＮＡは、配列番号１及び２の塩基配列を含むものでよい。
具体的に、前記マイクロＲＮＡ（５ｐ ｄｕｐｌｅｘ ｍｉＲＮＡ）は、前記配列番号１の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４－５ｐ）及び前記配列番号２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４－３ｐ．２）が互いに結合をなしている一つの複合体（ｄｕｐｌｅｘ）でよい。
前記配列番号１及び２の塩基配列の５’末端にはリン酸塩（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（５ｐｈｏｓ）が位置してもよい。
本発明において、“核酸”は、任意のＤＮＡ又はＲＮＡ、例えば、組織サンプルに存在する染色体、ミトコンドリア、ウイルス及び／又は細菌核酸を含む意味である。二重鎖核酸分子の１本又は２本の鎖を含み、無損傷核酸分子の任意の断片又は一部を含む。
本発明の核酸は、化学的に変形されたＤＮＡ又はＲＮＡを含むものと解釈される。当業者は当該技術分野に公知の方法を用いて所望の方式通りに前記核酸を合成し変形させることができる。
本発明の前記核酸は、配列番号４の塩基配列（ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧ）からなるものでよい。
本発明において、“短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）”は、二重鎖ＲＮＡがダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって切断されて生成される１８～２３ヌクレオチドサイズの小さいＲＮＡ片であり、相補的な配列を有するｍＲＮＡに特異的に結合して当該タンパク質の発現を抑制する役割を担う。
本発明のｓｉＲＮＡは、生体内核酸分解酵素による速い分解を防ぐために化学的に変形されたｓｉＲＮＡを含むものと解釈される。当業者は当該技術分野に公知の方法を用いて所望の方式通りに前記ｓｉＲＮＡを合成し変形させることができる。
本発明の組成物は、細胞内への導入効率を増強させるために公知の核酸伝達体と共に細胞内に導入されてよい。
本発明の前記短い干渉ＲＮＡは、配列番号５～２０の塩基配列を含むものでよい。
具体的に、前記短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＴＵＴ４）は、前記配列番号５～８のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ及び前記配列番号９～１２のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡが互いに結合をなしている一つの複合体でよい。
また、具体的に、前記短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＴＵＴ７）は、前記配列番号１３～１６のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ及び前記配列番号１７～２０のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡが互いに結合をなしている一つの複合体でよい。
本発明において、前記ｍｉＲＮＡ、核酸及び／又はｓｉＲＮＡの治療における有効量は、癌治療効果を期待するために投与に要求される量を意味する。したがって、疾患の種類、疾患の重症度、投与される核酸の種類、剤形、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路及び治療期間、同時に使用される化学抗癌剤などの薬物を含む様々な因子によって調節されてよい。
本発明の組成物は、経口、経皮、皮下、静脈又は筋肉を含む様々な経路で投与可能であり、そのために、本発明によるｍｉＲＮＡ、核酸及び／又はｓｉＲＮＡに他の添加剤をさらに含むことができる。
本発明による組成物の剤形は、錠剤、丸剤、散剤、サシェ（ｓａｃｈｅｔ）、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアゾール、カプセル剤、滅菌注射剤、滅菌散剤などの形態でよく、好ましくは、静脈注射、皮下注射、内皮注射、筋肉注射などの注射剤に製剤化される。
本発明の薬学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位容量の形態で製造されてもよく、或いは多回容量容器内に内入させて製造されてもよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、散剤、坐剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤又はカプセル剤の形態であってもよく、分散剤又は安定化剤をさらに含むことができる。
本発明の薬学的組成物に含み得る薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常用いられるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに限定されるものではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の他、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。好適な薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９ｔｈ ｅｄ．，１９９５）に詳細に記載されている。
本発明の薬学的組成物は、経口及び非経口で投与でき、例えば、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、硬膜内投与、眼球投与、皮膚投与及び経皮投与などで投与することができる。
本発明の薬学的組成物の適度な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によって様々であり、通常の熟練した医師は、希望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。
本発明の他の態様は、ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐ．１からなる群から選ばれる１種以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物に関する。
前記マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４－５ｐ）は、配列番号１の塩基配列を含むものでよく、前記マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１）は、配列番号３（ＡＣＵＧＣＣＣＣＡＧＧＵＧＣＵＧＣＵＧＧ）の塩基配列を含むものでよい。
具体的に、前記マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１）は、前記配列番号３の塩基配列を含むが、３’末端に１個又はそれ以上のウラシル（Ｕ）がさらに含まれるものでよい。
また、前記マイクロＲＮＡは、ＭＩＲ３２４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｍｂｅｒ：４４２８９８）から作られた一つの転写体（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）からドロシャ及びダイサーによって切断されて作られたものでよい。
本明細書において“診断”とは、特定の疾病又は疾患に対する一個体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一個体が特定の疾病又は疾患を現在持っているか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかった一個体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、又はセラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために個体の状態をモニタリングすること）を含む。
本明細書において“個体”、“対象”又は“患者”は、ヒト、ウシ、イヌ、ギニアピッグ、ウサギ、ニワトリ、昆虫などを含めて治療を要する任意の単一個体を意味する。また、任意の疾病臨床所見を示さない臨床研究試験に参加した任意の対象又は疫学研究に参加した対象又は対照群として用いられた対象が、対象に含まれる。
本明細書において別に断りのない限り、本明細書で使われる表現“ｍｉＲＮＡの発現レベル測定”は、該当の試料内で検出しようとする対象を検出することを意味する。
本発明で検出しようとする対象は、試料内該当のｍｉＲＮＡである。すなわち、ｍｉＲＮＡを検出することによって前記癌の発病有無が確認できる。
例えば、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルは、癌が疑われる患者の生物学的試料から測定できる。
本発明は、癌である場合がそうでない場合に比べて、生体内ｍｉＲ－３２４－５ｐの発現レベルが有意に減少し、ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の発現レベルが有意に増加する点を確認したことに基づき、ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐ．１は、癌の発病有無に対する診断マーカーとして用いられる。
本発明のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤は、癌が発病した場合、対象の生物学的試料の検体において発現レベルが減少するマーカーであるｍｉＲＮＡ及びさらに発現レベルが増加するマーカーであるｍｉＲＮＡの発現レベルを確認することによってマーカーの検出に用いることができる分子を意味する。
具体的に、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤は、前記ｍｉＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブでよい。
すなわち、核酸の検出は、遺伝子を暗号化する核酸分子又は前記核酸分子の相補物にハイブリッド化される一つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅反応によって行うことができる。
例えば、プライマーを用いたｍｉＲＮＡの検出は、ＰＣＲのような増幅方法を用いて遺伝子配列を増幅した後、当分野に公知の方法で遺伝子の増幅有無を確認することによって行うことができる。
プライマーは、短い自由３末端水酸基（ｆｒｅｅ ３’ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列であり、相補的なテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅ ｐａｉｒ）を形成でき、テンプレート鎖複写のための開始地点として働く短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度で重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素）のための試薬及び異なる４種のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でＤＮＡ合成が開始されてよい。本発明では、上の一つ以上のｍｉＲＮＡに特異的に結合するセンス及びアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行って発現レベルを確認することによって癌発病の有無が診断できる。ＰＣＲ条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知のものに基づいて変形させることができる。
プローブは、短くは数塩基から長くは数十塩基までに該当するＲＮＡ又はＤＮＡなどの核酸断片を意味し、ラベリングされている。プローブは、オリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）プローブ、単鎖ＤＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、二重鎖ＤＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）プローブ、ＲＮＡプローブなどの形態で作製可能である。本発明では、上の一つ以上のｍｉＲＮＡと相補的なプローブを用いて混成化を行って発現レベルを確認することによって癌発病の有無が診断できる。適当なプローブの選択及び混成化条件は、当業界に公知のものに基づいて変形させることができる。
このようなプライマー又はプローブは、公知の配列に基づいて当業者が適切にデザインすることができる。
例えば、プライマー又はプローブは、ホスホロアミダイト固体支持体方法、又はその他広く公知された方法を用いて化学的に合成することができる。また、このような核酸配列は当該分野に公知の様々な手段を用いて変形させることができる。このような変形の非制限的な例には、メチル化、“キャップ化”、天然ヌクレオチドの一つ以上の同族体への置換、及びヌクレオチド間の変形、例えば、非荷電した連結体（例：メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、カルバメートなど）又は荷電した連結体（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）への変形がある。
ｍｉＲＮＡの発現レベルは、バイオキット分野で通常用いられる方法によって測定できるが、例えば、逆転写酵素重合酵素反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競合的逆転写酵素重合酵素反応（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、実時間逆転写酵素重合酵素反応（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＰＡ；ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）又は遺伝子チップなどが含まれ、それらに制限されるものではない。
本発明のさらに他の態様は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。
前記キットには、前記ｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤の他、癌の診断キットに好適に用いられる当分野における通常の道具、試薬などが含まれてもよい。
前記道具又は試薬の一例として、適切な担体、検出可能な信号を生成できる標識物質、発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ）、溶解剤、洗浄剤、緩衝剤、安定化剤などが含まれるが、これに制限されない。標識物質が酵素である場合には、酵素活性を測定できる基質及び反応停止剤を含むことができる。担体は、可溶性担体、不溶性担体があり、可溶性担体の一例として、当分野に公知の生理学的に許容される緩衝液、例えばＰＢＳがあり、不溶性担体の一例として、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド、ラテックスに金属をメッキした磁性微粒子のような高分子、その他に紙、ガラス、金属、アガロース及びそれらの組合せでよい。
例えば、本発明の診断キットは、ＲＴ－ＰＣＲを行うために必要な必須要素を含むキットでよい。ＲＴ－ＰＣＲキットは、マーカーｍｉＲＮＡに対する特異的なそれぞれのプライマー対の他にも、テストチューブ又は他の適切なコンテナ、反応緩衝液（ｐＨ及びマグネシウム濃度は多様）、デオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）、Ｔａｑ－ポリメラーゼ及び逆転写酵素のような酵素、ＤＮａｓｅ、ＲＮＡｓｅ抑制剤、ＤＥＰＣ水（ＤＥＰＣ－ｗａｔｅｒ）、滅菌水などを含むことができる。
本発明のキットは、上述した組成物を構成として含むので、重複した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本発明のさらに他の態様は、ＴＵＴ４（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ４）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｍｂｅｒ：２３３１８）及びＴＵＴ７（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ７）（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｕｍｂｅｒ：７９６７０）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物に関する。
前記ＴＵＴ４遺伝子の塩基配列は配列番号２１に示されており、前記ＴＵＴ７遺伝子の塩基配列は配列番号２２に示されている。
本明細書において“診断”は、特定の疾病又は疾患に対する一個体の感受性を判定すること、一個体が特定の疾病又は疾患を現在持っているか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患にかかった一個体の予後を判定すること、又はセラメトリクス（例えば、治療効能に関する情報を提供するために個体の状態をモニタリングすること）を含む。
本明細書において“個体”、“対象”又は“患者”は、ヒト、ウシ、イヌ、ギニアピッグ、ウサギ、ニワトリ、昆虫などを含めて治療を要する任意の単一個体を意味する。また、任意の疾病臨床所見を示さない臨床研究試験に参加した任意の対象又は疫学研究に参加した対象又は対照群として用いられた対象が、対象に含まれる。
本明細書において別に断りのない限り、本明細書で使われる表現“遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベル測定”は、該当の試料内で検出しようとする対象を検出することを意味する。
本発明で検出しようとする対象は、試料内該当の遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質である。すなわち、ｍＲＮＡ又はそのタンパク質を検出することによって前記癌の発病の有無が確認できる。
例えば、前記ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルは、癌が疑われる患者の生物学的試料から測定することができる。
本発明は、癌である場合がそうでない場合に比べて、生体内ＴＵＴ４及びＴＵＴ７の発現レベルが有意に増加する点を確認したことに基づいて、ＴＵＴ４及びＴＵＴ７は癌の発病有無に対する診断マーカーとして用いられる。
本明細書において“遺伝子”は、タンパク質コーディング又は転写時に又は他の遺伝子発現の調節時に機能的役割を有する任意の核酸配列又はその一部を意味する。遺伝子は機能的タンパク質をコードする全ての核酸又はタンパク質をコード又は発現させる核酸の一部だけからなってよい。核酸配列は、エクソン、イントロン、開始又は終了領域、プロモーター配列、他の調節配列又は遺伝子に隣接した特有な配列内に遺伝子異常を含むことができる。
本発明の遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤は、癌が発病した場合、対象の生物学的試料の検体において発現レベルが増加するマーカーであるｍＲＮＡの発現レベルを確認することによってマーカーの検出に使用できる分子を意味する。
具体的に、前記ｍＲＮＡの発現レベルを測定する製剤は、前記ｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブでよい。
上述した“ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐ．１のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物”と重複する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
本明細書において“タンパク質”はまた、基準タンパク質と本質的に同じ生物活性又は機能を保有する、タンパク質の断片、類似体及び誘導体を含むことができる。
本発明のタンパク質レベルを測定する製剤は、癌が発病した場合、対象の生物学的試料の検体においてレベルが増加するマーカーであるタンパク質の発現レベルを確認することによってマーカーの検出に使用できる分子を意味する。
具体的に、前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体でよい。
本発明において“抗体”は最も広い意味で使われ、具体的に、無損傷モノクローナル（単一クローン）抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２個の無損傷抗体から形成された多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）及び目的とする生物学的活性を示す抗体断片を含む。
本発明のさらに他の態様は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットに関する。
前記キットには、前記遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルを測定する製剤の他、癌の診断キットに好適に用いられる当分野における通常の道具、試薬などが含まれてよい。
上述した“ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐ．１のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物；を含む癌診断用キット”と重複する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
〔発明の効果〕
本発明は、ＴＵＴ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関し、本発明の薬学組成物は、ＴＵＴ４／７の機能を抑制させることによって細胞分裂を防ぎ、癌発達を阻害させることができ、ｍｉＲ－３２４－５ｐの量を増やし、ｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の機能を抑制させることができるので、これを効果的に癌の予防、治療又は診断に用いることができる。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕ｍｉｒ－３２４アームスイッチング（Ａｒｍ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）結果であり、図１ＡはｍｉＲＮＡに対する５ｐ比率の中間絶対偏差の散点度（豊富でどこにでもあるｍｉＲＮＡ（両データセットにおいて＞１００ ｍｅｄｉａｎ ＲＰＭ、全てのサンプルにおいて＞０ ＲＰＭ）が分析に含まれる）、図１ＢはＡＱ－ｓｅｑによって測定されたＨＥＫ２９３ＴにおけるｍｉＲ－３２４のＩｓｏｍｉＲプロファイル（ＲＰＭ正規化読み取り回数は左側、５ｐ及び３ｐの参照シーケンスは灰色陰影で表示）、図１ＣはＡＱ－ｓｅｑによって測定されたマウス組織の指示されたパネルに対するｍｉｒ－３２４の鎖比（５ｐ／３ｐ．１）、及び図１Ｄはほ乳動物におけるｍｉＲ－３２４の５’－ｉｓｏｍｉＲの保存、を示す。
〔図２〕ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、図２Ａは９個のヒト細胞株及び１５個のマウス組織においてｍｉＲ－３２４－３ｐのウリジン化頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）とｍｉｒ－３２４の５ｐ／３ｐ．１比（ｒａｔｉｏ）間の陰性連関性（線形回帰は点線で表示。ｒｓ：スピアマン相関係数（Ｓｐｅａｒｍａｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ））、図２Ｂはマウス組織の指示されたパネルにおける相対ＴＵＴ４／７レベル及びｍｉｒ－３２４の５ｐ／３ｐ．１比（ｒａｔｉｏ）（ＴＵＴ４／７ｍＲＮＡレベル及び５ｐ／３ｐ．１比はそれぞれＲＴ－ｑＰＣＲ及びＡＱ－ｓｅｑによって定量化。ｒｓ：スピアマン相関係数）、図２ＣはＨＥＫ２９３ＴでＴＵＴ４／７のノックダウン後のＡＱ－ｓｅｑ結果（左側及び中間：ウリジン化生成頻度及びｍｉＲＮＡの５ｐ比率散布度。ｓｉＮＣ－形質注入されたサンプルにおいて豊富なｍｉＲＮＡ（＞１００ＲＰＭ）が分析に含まれる。右側：３個の５’－ｉｓｏｍｉＲの相対的豊富度及びｍｉｒ－３２４のｌｏｇ２－変形された５ｐ／３ｐ．１比）、図２ＤはＨＥＫ２９３ＴにおいてｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐのノーザンブロット（合成ｍｉｒ－３２４二重複合体（ｄｕｐｌｅｘ）をサイズ基準として使用）、及び図２ＥはマウスにおいてＴｕｔ４／７の二重ノックアウト後のｓＲＮＡ－ｓｅｑ結果（左側：骨髄においてＴＵＴ４／７劣化（ｄｅｐｅｔｉｏｎ）による５’－ｉｓｏｍｉＲの豊富度変化。対照群サンプルにおいて１０超過のＲＰＭを有する５’－ｉｓｏｍｉＲが分析に含まれる。ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔによるＰ－値。右側：ｍｉｒ－３２４のｌｏｇ２－変形された５ｐ／３ｐ．１比。棒は平均±ｓ．ｄ．。骨髄ｎ＝２；胚線維芽細胞ｎ＝２；胚幹細胞ｎ＝３；肝における対照群及びＴｕｔ４／７ｄＫＯはそれぞれｎ＝４及び３。ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔによる＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１ ＲＰＭ。ＲＰＭ：ｒｅａｄｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）を示す。
〔図３〕ウリジン化（Ｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ）によって誘導されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の代案的なダイサー切断結果であり、図３Ａは免疫精製されたダイサーによるｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）切断（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）（青色で表示された合成ｍｉＲ－３２４－５ｐ（２３ｎｔ）をサイズ基準として使用。主要切断産物及び該当の切断部位は矢尻で表示。＊：放射性標識された５’ホスフェート）、図３ＢはＨＥＫ２９３ＴにおいてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物、及び図３ＣはマウスにおいてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物（棒は平均。骨髄ｎ＝２；胚線維芽細胞ｎ＝２；胚幹細胞ｎ＝３；肝における対照群及びＴｕｔ４／７ｄＫＯはそれぞれｎ＝４及び３）を示す。
〔図４〕二重鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ｄｓＲＢＤ）によって促進された代案的なダイサー切断の結果であり、図４Ａは免疫精製されたダイサーによる野生型又はバルジのない（ｎｏ－ｂｕｌｇｅ）突然変異体ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）切断、図４Ｂ及び図４Ｃは免疫精製されたポケットダイサー突然変異体（図４Ｂ）又はｄｓＲＢＤ－削除突然変異体（図４Ｃ）によるｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）切断（主要切断産物及び該当の切断部位は矢尻で表示。＊：放射性標識された５’ホスフェート。†：３ｐ位置ｎｉｃｋｅｄ産物）、及び図４Ｄはｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のウリジン化－媒介代案的なダイサー切断のための提案されたモデルを示す。
〔図５〕代案的なダイサー切断によって誘導されたアームスイッチング結果であり、図５Ａは、非変形された及びウリジン化されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４から製造されたｍｉｒ－３２４二重複合体の鎖選択の概略図（点線四角形は各二重複合体の鎖選択を指示する終わりを示す）及び、図５Ｂは、２個のｍｉｒ－３２４二重複合体を用いたルシフェラーゼレポーター分析（左側：ｍｉＲ－３２４－５ｐ又は３ｐ．１の３個の８ｍｅｒ標的部位があるホタル（ｆｉｒｅｆｌｙ）レポーターｍＲＮＡの図。右側：ＨＥＫ２９３Ｔにおいて２個のｍｉｒ－３２４二重複合体に対するホタルルシフェラーゼの相対レポーター活性。ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのレポーター活性を対照群として使用。棒は平均±ｓ．ｄ．。（ｎ＝２、ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）。ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ ｔｅｓｔによる＊＊ｐ＜０．０１）を示す。
〔図６〕ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、図６Ａは膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）及び正常脳組織においてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物の比率（正常脳ｎ＝３；膠芽細胞腫ｎ＝６）、図６ＢはＯｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎデータベースの正常、低等級膠腫（ｇｌｉｏｍａ）及び膠芽細胞腫組織においてＴＵＴ４／７の発現レベル（正常ｎ＝７２３；１等級ｎ＝７４；２等級ｎ＝１３３；３等級ｎ＝１３２；膠芽細胞腫ｎ＝８６５。多重比較のためのｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ｗｉｔｈ Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔによる＊＊＊ｐ＜０．００１）、図６Ｃは膠芽細胞腫（黒色）と一致する正常脳組織（白色）においてＴＵＴ４／７発現レベルとｍｉＲ－３２４－５ｐ／３ｐ比間の負の相関関係（線形回帰は点線で表示。ｒｓ：スピアマン相関係数）、図６ＤはＡ１７２細胞においてｍｉｒ－３２４の合成５ｐ二重複合体（長いデュプレックス）又は３ｐ．１二重複合体（短いデュプレックス）を過発現した後、表示されたサイクリンタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイル、図６ＥはＡ１７２細胞においてロックト（ｌｏｃｋｅｄ）核酸アンチセンスオリゴヌクレオチドによってｍｉＲ－３２４を抑制した後、指示されたサイクリンタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイル、及び図６ＦはＡ１７２細胞においてＴＵＴ４／７をノックダウンした後、指示されたタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイル（＊：交差反応バンド。ＰＩ：ヨウ化プロピジウム。ＢｒｄＵ：ブロモデオキシウリジン）を示す。
〔図７〕ｍｉｒ－３２４アームスイッチングメカニズムモデルを模式化した図である。〔発明を実施するための形態〕
以下、本発明を下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されるものではない。
本明細書全体にわたって、特定物質の濃度を示すために使われる“％”は、別に断りのない場合、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
［準備例］
１．ＡＱ－ｓｅｑライブラリー
ＡＱ－ｓｅｑ（バイアスが最小化されたｓＲＮＡ－ｓｅｑ）ライブラリーは、以前研究（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に説明されている通り、１５個のマウス組織の全ＲＮＡを用いて構成された。
具体的に、総ＲＮＡ ５μｇを３０個の等モルのスパイクインＲＮＡ １０ｆｍｏｌｅ（バイアス評価に用いられるｍｉＲＮＡ－類似非ヒト／マウス／カエル／フィッシュＲＮＡ）と混合した。短いＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）は、１５％ウレア－ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたサイズ分別によって濃縮され、３’及び５’末端において無作為化されたアダプターに順次に連結された。結紮されたＲＮＡは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写され、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて増幅され、ＭｉＳｅｑプラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において大容量シーケンシング（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＨＴＳ）された。
２．ｍｉＲＮＡの大容量シーケンシング（ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）分析
マウスにおけるｓＲＮＡ－ｓｅｑ結果の読取り値がマウスゲノム（ｍｍ１０）にマップされた以外は、以前研究（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，２０１９）に説明された通りにデータを処理した。
具体的に、ｃｕｔａｄａｐｔ（Ｍａｒｔｉｎ，２０１１）を用いて読取り値（ｒｅａｄｓ）から３’アダプターをクリッピングした。ＡＱ－ｓｅｑデータの場合、４－ｎｔ変性配列をＦＮＴＸ－Ｔｏｏｌｋｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｈａｎｎｏｎｌａｂ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｆａｓｔｘ ｔｏｏｌｋｉｔ／）を用いてさらに除去した。ＦＡＳＴＸ－Ｔｏｏｌｋｉｔを用いて短くて品質の低い人工読取り値をフィルタリングした後、ＡＱ－ｓｅｑデータをまずスパイクインシーケンスに整列し、整列されていない読取り値を次のゲノムにマッピングし、他のｓＲＮＡ－ｓｅｑデータはＢＷＡを用いてゲノムにマッピングした（Ｌｉ ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ，２０１０）。次いで、３’末端不一致だけを許容する最上の整列点数を有する整列結果を選択した。ｍｉＲＮＡアノテーション（ｍｉＲＮＡ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）は、ＢＥＤＴｏｏｌｓ（Ｃｏｚｏｍａｒａ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ－Ｊｏｎｅｓ，２０１４；Ｑｕｉｎｌａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，２０１０）の交差道具でｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２１から検索した。
ｍｉＲＮＡ鎖比率（ｓｔｒａｎｄ ｒａｔｉｏ）の定量分析のために、まず、最も豊富に発現している細胞株又は組織において与えられた成熟ｍｉＲＮＡに対して最も豊富な５’－ｉｓｏｍｉＲを確認した。その後、全ての細胞株又は組織に対して５ｐ及び３ｐからｔｏｐ ５’－ｉｓｏｍｉＲ間の比を計算した。ｍｉＲＢａｓｅ ｒｅｌｅａｓｅ ２１において両側鎖が注釈処理された非反復ｍｉＲＮＡ遺伝子がこの分析に含まれた。
３．Ｔａｒｇｅｔｏｍｅ分析
修正されたバージョンのＡＧＯ ＣＬＩＰ－ｓｅｑ（ＣＬＥＡＲ－ＣＬＩＰ及びＣＬＡＳＨ）の結果を分析して、ｍｉＲ－３２４標的（ｔａｒｇｅｔ）を識別した（Ｈｅｌｗａｋ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
まず、ＣＬＥＡＲ－ＣＬＩＰの分析のために、ｃｕｔａｄａｐｔを用いて３’及び５’アダプターをクリッピングした後、ｍｉＲ－３２４配列を含む読取り値を抽出した。その後、標的ＲＮＡ配列をマウスゲノム（ｍｍ１０）にマッピングした。アノテーション（Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）は、ＢＥＤＴｏｏｌｓの交差道具でＧＥＮＣＯＤＥ ｒｅｌｅａｓｅ Ｍ１９から検索した。
次に、ＣＬＡＳＨの分析のために、プロトコルＥ４によって生成されたＣＬＡＳＨデータの補充ファイルが用いられた。ｍｉＲ－３２４－３ｐの標的遺伝子は、ｍｉＲ－３２４－３ｐ配列の５’末端にしたがって細分された。
４．プラスミド構築
野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）、５’ポケットダイサー突然変異体及び３’ポケットダイサー突然変異体の発現のためのプラスミドを構築するために、ヒトダイサーレファレンス（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿０３０６２１）のコーディング配列を、以前研究で導入された突然変異の存在又は不在の下に増幅させた（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．２０１１）。増幅されたＤＮＡをＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位においてｐＣＫ－ＦＬＡＧベクター（ＣＭＶプロモーター－駆動ベクター）でサブクローニングした。
二重鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ｄｓＲＢＤ）－削除ダイサーの場合、Ｖ１８４９－Ｓ１９２２アミノ酸に相応する配列を除くコーディング領域を増幅させ、同じ方式を用いてｐＣＫ－ＦＬＡＧベクター内にサブクローニングした。
ＴＲＢＰの場合、ヒトＴＲＢＰレファレンス（ＲｅｆＳｅｑ ＮＭ＿１３４３２３）のコーディング配列を増幅させ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位においてｐｃＤＮＡ３－ｃＭｙｃベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でサブクローニングした。
最後に、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）分析のためのプラスミドを構築するために、ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ又はｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の３個の８ｍｅｒ標的部位を含む合成ＤＮＡオリゴを増幅させ、ＸｈｏＩ及びＸｂａＩ部位においてｐｍｉｒＧＬＯ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。合成ＤＮＡオリゴ及びＰＣＲプライマーの配列は、下表１に示す。
Figure 2023098926000002
５．細胞培養及び形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
Ａ１７２及びＵ８７ＭＧは、韓国細胞株銀行から入手した。ＨＥＫ２９３Ｔ、Ａ１７２及びＵ８７ＭＧを１０％ウシ胎児血清（ＷＥＬＧＥＮＥ）が補充されたＤＭＥＭ（ＷＥＬＧＥＮＥ）で保持させた。膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）患者（ＴＳ１３－６４）から由来した１次腫瘍細胞は、延世大学校医科大学（４－２０１２－０２１２、４－２０１４－０６４９）の機関検討委員会によって承認された通り、新鮮な膠芽細胞腫組織標本から確立された。
腫瘍球（ｔｕｍｏｒｓｐｈｅｒｅ）培養のために、ＴＳ１３－６４細胞を１Ｘ Ｂ－２７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２０ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＤＭＥＭ（ＷＥＬＧＥＮＥ）で成長させた（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
ＴＵＴ４／７をノックダウンさせるために、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて２０～２２ｎＭ ｓｉＲＮＡで２回にわたって細胞に形質注入させ、第１形質注入４日後に収穫した。
ダイサーの過発現のために、リポフェクタミン３０００を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞にｐＣＫ－ＦＬＡＧ－ＤＩＣＥＲを形質注入させ、形質注入２日後に収穫した。
合成ｍｉＲＮＡ又は抑制剤を伝達するために、リポフェクタミン３０００を用いて２０ｎＭの合成ｍｉＲＮＡデュプレックス又は８０ｎＭのＬＮＡ ｍｉＲＮＡ抑制剤を細胞に形質注入させ、形質注入２日後に収穫した。
対照群ｓｉＲＮＡ（ＡｃｃｕＴａｒｇｅｔ陰性対照群ｓｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、対照群ｍｉＲＮＡ及び合成ｍｉｒ－３２４二重体はＢｉｏｎｅｒから入手した。対照群ｍｉＲＮＡ抑制剤（ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ抑制剤陰性対照群Ａ）及びｍｉＲ－３２４抑制剤（ｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｈｓａ－ｍｉＲ－３２４－３ｐ ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ ｍｉＲＮＡ抑制剤）をＱＩＡＧＥＮから得た。合成ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの配列は、下表２に示す。
Figure 2023098926000003
６．ノーザンブロット（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ）
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて総ＲＮＡを分離し、ｍｉｒＶａｎａ ｍｉＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で短いＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ＲＮＡ）（＜２００ｎｔ）を濃縮した。その後、ＲＮＡを１５％ウレア－ポリアクリルアミドゲルで分析した。合成ｍｉｒ－３２４二重複合体及びＤｅｃａｄｅ Ｍａｒｋｅｒｓ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｂｉｏｎ）をサイズマーカーとして用いた。ＲＮＡをＨｙｂｏｎｄ－ＮＸ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドで膜に架橋させた。アンチセンスプローブ５’末端は、Ｔ４ポリヌクレオチド（Ｔａｋａｒａ）によって［ γ-32Ｐ］ＡＴＰと放射性標識され、Ｐｅｒｆｏｒｍａ Ｓｐｉｎカラム（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて精製された。膜を、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ Ｐｌｕｓハイブリッド化バッファーで変成されたＵｌｔｒａＰｕｒｅ Ｓａｌｍｏｎ Ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に培養し、アンチセンスプローブとハイブリッド化した後、マイルド（ｍｉｌｄ）洗浄バッファー（０．０５％ ＳＤＳ及び２Ｘ ＳＳＣ）で洗浄し、ストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）洗浄バッファー（０．１％ ＳＤＳ及び０．１Ｘ ＳＳＣ）で洗浄した。放射能信号は、Ｔｙｐｈｏｏｎ ＦＬＡ ７０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって感知され、Ｍｕｌｔｉ Ｇａｕｇｅソフトウェア（ＦｕｊｉＦｉｌｍ）によって分析された。
ｍｉＲ－３２４－３ｐがまず検出され、プローブを剥がした後、ｍｉＲ－３２４－５ｐが検出された。ブロットからプローブを除去するために、膜を、あらかじめ沸かした０．５％ ＳＤＳに１５分間浸漬させた。合成ｍｉｒ－３２４二重複合体（ＡｃｃｕＴａｒｇｅｔ）は、Ｂｉｏｎｅｅｒから入手した。プローブの配列は、下表３に示す。
Figure 2023098926000004
７．定量的実時間ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
マウス組織においてｍＲＮＡレベルを測定するために、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウストータルＲＮＡマスターパネル（Ｍｏｕｓｅ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｍａｓｔｅｒ Ｐａｎｅｌ）（Ｔａｋａｒａ）のＲＮＡを逆転写し、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量的実時間ＰＣＲを行った。内部対照群にはＧＡＰＤＨが用いら、ｑＰＣＲプライマーの配列は、下表４に示す。
Figure 2023098926000005
ｍｉＲ－３２４－５ｐ／３ｐ鎖比を定量化するために、総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌを用いて分離した。その後、ＴａｑＭａｎ ｍｉＲＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成し、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現分析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムにおいて定量的実時間ＰＣＲを行った。内部対照群にはＵ６ ｓｎＲＮＡが用いられた。
８．試験管内（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ダイサー切断分析
ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４及びその変異体は、Ｔ４ポリヌクレオチドによって［γ-32Ｐ］ＡＴＰと放射性標識され、メーカーの指示にしたがってＯｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて精製された。
ＦＬＡＧ－ＤＩＣＥＲの免疫沈殿のために、ダイサータンパク質を過発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を溶解バッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）で溶解させ、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を用いて超音波処理した。遠心分離後、上澄液を１０μＬのＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に培養した。ビーズ（ｂｅａｄｓ）を溶解バッファーで２回、高塩バッファー（８００ｍＭ ＮａＣｌ及び５０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０））で４回、バッファーＤ（２００ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ）で４回洗浄した。
免疫精製されたダイサーは、総体積３０μＬ（２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、ＳＵＰＥＲａｓｅ Ｉｎ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）６０ｕｎｉｔ、５’－放射性標識されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４を含む）で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）反応を経た。ＲＮＡをフェノール抽出物又はＯｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒで精製し、１５％ウレア－ポリアクリルアミドゲルで分析した。合成ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びＤｅｃａｄｅ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｓｙｓｔｅｍをサイズマーカーとして使用した。合成ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４断片はＩＤＴから得られた。合成ｍｉＲ－３２４－５ｐは、Ｂｉｏｎｅｅｒから入手した。合成ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４断片及びｍｉＲ－３２４－５ｐの配列は、下表５に示す。
Figure 2023098926000006
９．デュアルルシフェラーゼレポーター分析
ｍｉＲ－１－３ｐ、ｍｉＲ－３２４－５ｐ又はｍｉＲ－３２４－３ｐ．１の３個の８ｍｅｒ標的部位を含有するｐｍｉｒＧＬＯを、対照ｍｉＲＮＡ又はｍｉｒ－３２４二重複合体と共にリポフェクタミン３０００を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質注入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）した。形質注入２日後に細胞を収穫し、レポーター分析を行った。レポーター活性はメーカーの指示（Ｐｒｏｍｅｇａ）にしたがってＳｐａｒｋ（登録商標）マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）でデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて測定された。ｍｉＲ－１－３ｐがＨＥＫ２９３Ｔでほとんど発現していないことを勘案し（ＡＱ－ｓｅｑで～８ＲＰＭ）、ｍｉＲ－１－３ｐの３個の８ｍｅｒ標的部位を有するｐｍｉｒＧＬＯがプラスミド対照群として用いられた。追加標準化のために対照群ｍｉＲＮＡが用いられた。
１０．膠芽細胞腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）患者データの遺伝子発現分析
Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｃｏｍ）からマイクロアレイを用いて前処理された遺伝子発現データを検索した（Ｌｅｅ ａｎｄ Ｃｈｏｉ，２０１７）。ＲＥＭＢＲＡＮＤＴ遺伝子発現データセット（Ｅ－ＭＴＡＢ－３０７３）は、ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ（Ｍａｄｈａｖａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９）から入手した。
ｍＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの同時プロファイリングを分析するために（Ｇｕｌｌｕｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０１８）、加工前マイクロアレイデータをＲのｌｉｍｍａパッケージを用いてＲＭＡ（ｒｏｂｕｓｔ ｍｕｌｔｉ－ａｒｒａｙ ａｖｅｒａｇｅ）で正規化した後、遺伝子発現分析に用いた。
１１．生存分析（Ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）
ＴＣＧＡ膠芽細胞腫患者に対するｌｅｖｅｌ ３ ｍｉＲＮＡ遺伝子定量化データ及び臨床データはそれぞれ、ＧＤＣ ｌｅｇａｃｙ ａｒｃｈｉｖｅ及びＧＤＣデータポータルから獲得した。患者たちは、ｍｉＲ－３２４－５ｐ／３ｐ比によって階層化され、また、上位及び下位４０％が分析に含まれた。患者の生存はＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ方法で推定し、Ｒの生存パッケージを用いて両側ログランク検定（ｔｗｏ－ｓｉｄｅｄ ｌｏｇ－ｒａｎｋ ｔｅｓｔ）でテストした。
１２．ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ抑制剤カクテルセットＩＩＩ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びフォスファターゼ抑制剤カクテルＩＩ（ＡＧ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が補充されたＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に溶解させた。ＢＣＡタンパク質分析キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でタンパク質濃度を測定し、同一量のタンパク質を４～１２％トリス－グリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から分離してＩｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ ＰＶＤＦ膜（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。膜を、５％脱脂乳が含まれたＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ（Ａｍｒｅｓｃｏ）＋０．１％ツイン２０（Ａｎａｔｒａｃｅ））と共に培養した後、一次抗体で処理した。ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、膜をＨＲＰ－接合二次抗体と共に培養した。タンパク質バンドは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ ＰＬＵＳ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出され、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によってスキャンされた。
ＴＵＴ４（１８９８０－１－ＡＰ、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１０５９８３２７、１：５００）及びＴＵＴ７（２５１９６－１－ＡＰ、１：５００）に対するラビット多クローン抗体は、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈから入手した。Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ（ｓｃ－２４７、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６２７３５７、１：１，０００）に対するマウス単一クローン抗体及びＣｙｃｌｉｎ Ａ（ｓｃ－７５１、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿６３１３２９、１：１，０００）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１（ｓｃ－７５２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０７２１３４、１：１，０００）及びＣｙｃｌｉｎ Ｄ１（ｓｃ－７５３、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２０７０４３３、１：１，０００）に対するウサギ多クローン抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。ＨＳＰ９０（４８７４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２１２１２１４、１：１，０００）に対するウサギ多クローン抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇから入手した。ウサギＩｇＧ（１１１－０３５－１４４、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３０７３９１、１：１０，０００）及びマウスＩｇＧ（１１５－０３５－１４６、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿２３０７３９２、１：１０，０００）に対するＨＲＰ－接合ヤギ多クローン抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから入手した。
１３．流細胞分析（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
細胞を３～８時間１０μＭ ＢｒｄＵと共に培養した後、冷たい（ｉｃｅ－ｃｏｌｄ）７０％エタノールで固定した。固定された細胞をＦＩＴＣ接合抗ＢｒｄＵ抗体（１１－５０７１－４２、ＲＲＩＤ：ＡＢ＿１１０４２６２７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に培養し、１０μｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下に２０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で追加染色した。その後、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ流細胞分析機を用いて検出した。細胞周期は、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６システムソフトウェアによって分析された。
［実施例］
１．ｍｉｒ－３２４の代案的鎖選択（又は、アームスイッチング（Ａｒｍ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ））
まず、鎖比率（ｓｔｒａｎｄ ｒａｔｉｏ）に大きい変化が見られるｍｉＲＮＡを検索した。鎖比率の正確な定量のために、ＡＱ－ｓｅｑライブラリープロトコルを用いた。鎖選択（ｓｔｒａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は、１５個の異なるマウス組織／発達段階によって推定された（図１Ａのｘ軸）。また、ヒトの鎖使用を比較するために、９個のヒト細胞株から得たｓＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを用いた。
図１Ａから確認できるように、ヒト及びマウスデータセットの両方とも、大部分のｍｉＲＮＡが鎖比率（～７９％、３％未満の中間分散）は変わらなかった。しかし、ｍｉｒ－３２４、ｍｉｒ－３６２、ｍｉｒ－１９３ａ及びｍｉｒ－１４０のように、変化が明確にみられるいくつかの事例を確認した。
特に、ｍｉｒ－３２４のアームスイッチングが細胞運命決定に実質的な影響を及ぼすと考えられ、ｍｉｒ－３２４の鎖変化に集中した。
図１Ｂ～図１Ｄから確認できるように、単一ＭＩＲ３２４遺伝子座で生成された５’－ｉｓｏｍｉＲｓ（５ｐ、３ｐ．１及び３ｐ．２）の３グループが検出された（図１Ｂ）。５ｐ鎖は、マウス胚及び神経組織において優勢であるが、主要（ｍａｊｏｒ）３ｐ異型体である３ｐ．１は、肝及び胃で優勢に現れた（図１Ｃ）。また、５’－ｉｓｏｍｉＲグループは哺乳類から発見され、これは、代案的鎖選択メカニズムが進化的に保存されるということを暗示する（図１Ｄ）。
２．ｍｉｒ－３２４アームスイッチングはＴＵＴ４及びＴＵＴ７によって調節される。
３ｐのウリジン化頻度（ｕｒｉｄｙｌａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は、５ｐ／３ｐ．１比（ｒａｔｉｏ）と負の相関関係があることを確認した（図２Ａ）。これによって、ウリジン化がアームスイッチングに関与できるという仮説を立てた。
一方、ターミナルウリジリルトランスフェラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）であるＴＵＴ４（ＺＣＣＨＣ１１及びＴＥＮＴ３Ａとも知られている）及びＴＵＴ７（ＺＣＣＨＣ６及びＴＥＮＴ３Ｂとも知られている）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡの特定セット（例えば、ｌｅｔ－７前駆体）を含む様々なＲＮＡ種のウリジン化を触媒することが知られている。ＴＵＴ４及びＴＵＴ７（ＴＵＴ４／７）は大部分の基質において重複的に作動する。
上記のような事実に基づき、マウス組織においてＴＵＴ４／７レベルを定量化（ＲＴ－ｑＰＣＲ）した結果、ＴＵＴ４及びＴＵＴ７レベルが比較的低い細胞類型において５ｐ／３ｐ．１比率がより高いことが分かった（図２Ｂ）。
ｍｉｒ－３２４成熟（ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）においてＴＵＴ４／７の関与を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＴＵＴ４／７を劣化させ（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）、ｓＲＮＡ－ｓｅｑ（ＡＱ－ｓｅｑ）を行った。
図２Ｃから確認できるように、ＴＵＴ４／７ノックダウンは、ｍｉＲ－３２４－３ｐを含め、ｍｉＲＮＡのウリジン化を減少させた（左上のパネル）。また、ＴＵＴ４／７ノックダウンは、３ｐ．１の減少、及び５ｐ及び補助（ｍｉｎｏｒ）異型体３ｐ．２の増加などのようにｍｉＲ－３２４の異型体組成の変化を招き、結果的に、主要異型体間（５ｐ／３ｐ．１）の比が増加した（右上及び右下のパネル）。
このようなシーケンシングデータは、ノーザンブロット結果（図２Ｄ）とも一致し、これはＴＵＴ４／７ノックダウン時にｍｉＲ－３２４異型体の量に変化が現れることを意味する。
また、図２Ｅから確認できるように、ＴＵＴ４／７二重ノックアウトマウスから公開されたｓＲＮＡ－ｓｅｑデータの再分析の結果、ＴＵＴ４／７ノックアウト時に、３ｐ．１レベルは減少するが、５ｐレベルは増加した（左パネル）。結果的に、検査された全ての組織／細胞類型（骨髄、胚線維芽細胞、胚幹細胞及び肝）においてＴＵＴ４／７二重ノックアウトによる鎖比率の変化が観察された（右パネル）。
３．ウリジン化はｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の代案的なダイサー切断を誘導する。
ＴＵＴ４／７は成熟ｍｉＲＮＡよりはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを変形させるものと知られている。そこで、ＴＵＴ４／７がｍｉｒ－３２４鎖選択をどのように調節するかを確認するために、合成ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４で試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ダイサー切断分析を行うことによって、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ切断に対するウリジン化の影響を確認した。
図３Ａから確認できるように、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４が３’末端に１個又は２個の余分のウリジン残基を保有するとき、ダイサー切断部位は３－ｎｔだけ移動した（図３Ａの位置Ａから位置Ｂに移動）。変形されていないｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４は、主に５ｐ及び３ｐ．２を含む、より長い二重複合体（黒い矢印）を放出するのに対し、ウリジン化されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４は代替位置（位置Ｂ）において割れ、より短い５ｐ及び３ｐ．１で構成されたより短い二重複合体を生成した（白い矢印）。したがって、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のＴＵＴ４／７－媒介ウリジン化は代案的なダイサー切断につながることが分かった。
また、図３Ｂ及び図３Ｃから確認できるように、ＴＵＴ４／７－劣化されたヒト及びマウス細胞からのシーケンシングデータは、３ｐ ｉｓｏｍｉＲｓ（３ｐ．１ ｖｓ． ３ｐ．２）の相対的豊富度がＴＵＴ４／７ノックダウン（図３Ｂ）及びノックアウト（図３Ｃ）によって変わり、これによってウリジン化がダイサー切断部位選択を変更させるという結論を裏付ける。
４．代案的なダイサー切断は二重鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）によって促進される。
まず、３－ｎｔ移動を担当する決定要因を確認するために、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４からＵバルジ（ｂｕｌｇｅ）を除去した。
図４Ａから確認できるように、“Ｕバルジのない（ｎｏ－ｂｕｌｇｅ）”突然変異体の場合、ダイサーの切断部位がウリジン化によってそれ以上位置Ｂへ突然に移動せず、ウリジン個数によって順次に移動した（レーン１０～１２）。したがって、Ｕバルジは、位置ＡとＢ間の部位における切断に対する反－決定要因（ａｎｔｉ－ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）であり、これによってダイサーの代案的な切断を担当するシス－作用（ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ）要素として働くことを確認した。
次に、５’－及び３’－カウンティング規則がｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４切断とどのような関連があるかを確認するために、５’又は３’ポケットにおけるダイサー突然変異体を活用した。
図４Ｂから確認できるように、５’ポケットダイサー突然変異体は位置Ａにおいてｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４を切断できなかったが、３’ポケット突然変異体は切断部位選択に影響を及ぼさない上に切断効率にやや影響を及ぼした。このような結果は、位置Ａにおける切断に対する５’ポケットの重要性を示唆する。
さらに、ダイサーにおいて他のドメインの寄与度を調べた。試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）ダイサーｄｓＲＢＤの役割を確認するために、ｄｓＲＢＤ－欠失突然変異体を生成した。
図４Ｃから確認できるように、ｄｓＲＢＤ欠失は、切断パターンに相当な変化をもたらした。すなわち、ｄｓＲＢＤがないと、ダイサーは主に位置Ａを切断し、これは、ｄｓＲＢＤが位置Ｂにおける切断を担当するということを示唆する。
要するに、図４Ｄから確認できるように、変形されていないｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４は、ダイサーのプラットホーム領域に存在する５’ポケットに依存して位置Ａが切断されることが分かる（左パネル）。しかし、ウリジン化すると、プラットホーム／ＰＡＺドメインに強固に固定されないため、最終構造（３－４ ｎｔ ３’突出部）は、ｄｓＲＢＤの助力によってｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４がダイサーにおいて再配置され、位置Ｂにおいて代案的な切断が可能になることが分かる（右パネル）。
５．代案的なダイサー切断はアームスイッチングを誘導する。
以上の実施例の結果によれば、図５Ａから確認できるように、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４が２つの代案的な形態の二重複合体、すなわち、長い二重複合体（位置Ａ；５ｐ／３ｐ．２）及び短い二重複合体（位置Ｂ；５ｐ／３ｐ．１）を生成できることが分かる。
そこで、細胞における鎖選択を確認するために、ｍｉＲ－３２４－５ｐ又はｍｉＲ－３２４－３ｐ．１に相補的な３’ ＵＴＲを含有するレポーターを構成し（図５Ｂの左パネル）、合成二重複合体（（５ｐ／３ｐ．２）又は（５ｐ／３ｐ．１））をレポーターと共同形質注入（ｃｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）させた。その結果、長い二重複合体は、３ｐ．１部位ではなく５ｐ補完部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｉｔｅｓ）があるレポーターを選択的に抑制した。これに対し、短い二重複合体は、３ｐ．１レポーターを下向き調節したが、５ｐレポーターは下向き調節しなかった（図５Ｂの右パネル）。
このような結果は、５ｐ及び３ｐ．１が、実際には、長い二重複合体及び短い二重複合体から別々に生成されることを示唆する。すなわち、長い二重複合体の場合、５ｐの５’末端が３ｐ．２の５’末端に比べて熱力学的に不安定なため、５ｐ鎖が選択されるのに対し（図５Ａ、青い点線四角形）、短い二重複合体の場合、３ｐ．１はＡＧＯによって選好される５’アデノシンから始まることが分かった（図５Ａ、赤い点線四角形）。
要するに、代案的なダイサー切断によってｍｉｒ－３２４のアームスイッチングが発生することが分かる。
６．ｍｉｒ－３２４アームスイッチングは細胞周期進行を調節する。
ヒト膠芽細胞腫（ＧＢＭ）においてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’末端変化が報告されたことがあり、図６Ａからも確認できるように、正常な脳組織（Ｎｏｒｍａｌ ｂｒａｉｎ）に比べて腫瘍（ＧＢＭ）において３ｐ．１の比率が実質的により高く現れた。
そこで、ＴＵＴ４／７－媒介ｍｉｒ－３２４成熟がＧＢＭにおいて個別に調節される可能性を調べるために、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎを用いて転写体データセットを分析した。
図６Ｂから確認できるように、ＴＵＴ４及びＴＵＴ７の両方ともＧＢＭにおいて大きく上向き調節された。
さらに、ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡの両方をプロファイリングする独立したデータセットを用いて正常サンプルと比較したとき、ＧＢＭにおいてＴＵＴ４／７量が上向き調節され、ｍｉＲ－３２４－５ｐ／３ｐ比が減少することを確認した。
図６Ｃから確認できるように、ＴＵＴ４／７レベルは、５ｐ／３ｐ比率と負の相関関係があることが分かった。このような結果は、ＧＢＭにおいてＴＵＴ４／７－媒介ｍｉｒ－３２４調節が生理学的に関連し得ることを示唆する。
上記の結果に基づき、ｍｉｒ－３２４アームスイッチングの機能を理解するために、ＧＢＭ細胞株においてｍｉｒ－３２４代案的鎖選択によって誘導される分子及び細胞表現型を調べた。
図６Ｄ及び図６Ｅから確認できるように、合成長い二重複合体（“５ｐ ｄｕｐｌｅｘ”）又は３ｐに対するアンチセンスオリゴ（“３ｐ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”）の形質注入は、サイクリンＤ及びＥの蓄積及びサイクリンＡ及びＢの減少を招いた（左パネル）。また、細胞周期プロファイリングによれば、細胞がＧ１段階で停止したことが分かった（右パネル）。
図６Ｆから確認できるように、ＴＵＴ４／７ノックダウンも同様に、サイクリン調節異常及びＧ１停止をもたらした。
要するに、ｍｉＲ－３２４ｉｓｏｍｉＲｓはＧＢＭ細胞増殖に対して反対機能を有していることが分かる。
［まとめ］
図７から確認できるように、末端ウリジン化酵素であるＴＵＴ４／７は、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４をウリジン化することによって、ｍｉｒ－３２４代案的鎖選択に主要プレーヤーとして働く。すなわち、ＴＵＴ４／７は、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４をウリジン化させ、ウリジン化現象がｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のダイサー切断位置を調節することによって、機能の異なる３種のマイクロＲＮＡ（５ｐ及び２３ｐ異型体）間の比率を変化させる。したがって、ウリジン化によるｍｉＲ－３２４調節を阻害させると、細胞分裂関連遺伝子の発現を抑制でき、膠芽細胞腫の成長を抑制させることができる。
本発明によれば、ＴＵＴ４／７によるマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ－３２４）の代案的鎖選択を調節できるので、これを効果的に癌（脳腫瘍）の予防、治療に用いることができる。〔産業上の利用可能性〕
本発明は、ＴＵＴ４／７発現調節因子を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関し、より詳細には、ＴＵＴ４／７発現を調節する核酸配列を含む癌予防又は治療用薬学的組成物に関する。
ｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ｍｉＲＮＡに対する５ｐ比率の中間絶対偏差の散点度を示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ＡＱ－ｓｅｑによって測定されたＨＥＫ２９３ＴにおけるｍｉＲ－３２４のＩｓｏｍｉＲプロファイルを示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ＡＱ－ｓｅｑによって測定されたマウス組織の指示されたパネルに対するｍｉｒ－３２４の鎖比を示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ほ乳動物におけるｍｉＲ－３２４の５’－ｉｓｏｍｉＲの保存を示す。 ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、９個のヒト細胞株及び１５個のマウス組織においてｍｉＲ－３２４－３ｐのウリジン化頻度とｍｉｒ－３２４の５ｐ／３ｐ．１比間の陰性連関性を示す。 ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、マウス組織の指示されたパネルにおける相対ＴＵＴ４／７レベル及びｍｉｒ－３２４の５ｐ／３ｐ．１比を示す。 ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ＨＥＫ２９３ＴでＴＵＴ４／７のノックダウン後のＡＱ－ｓｅｑ結果を示す。 ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、ＨＥＫ２９３ＴにおいてｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐのノーザンブロットを示す。 ＴＵＴ４／７によって調節されるｍｉｒ－３２４アームスイッチング結果であり、マウスにおいてＴｕｔ４／７の二重ノックアウト後のｓＲＮＡ－ｓｅｑ結果を示す。 ウリジン化によって誘導されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の代案的なダイサー切断結果であり、免疫精製されたダイサーによるｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内切断を示す。 ウリジン化によって誘導されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の代案的なダイサー切断結果であり、ＨＥＫ２９３ＴにおいてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物を示す。 ウリジン化によって誘導されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の代案的なダイサー切断結果であり、マウスにおいてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物を示す。 二重鎖ＲＮＡ結合ドメインによって促進された代案的なダイサー切断の結果であり、免疫精製されたダイサーによる野生型又はバルジのない突然変異体ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内切断を示す。 二重鎖ＲＮＡ結合ドメインによって促進された代案的なダイサー切断の結果であり、免疫精製されたポケットダイサー突然変異体によるｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内切断を示す。 二重鎖ＲＮＡ結合ドメインによって促進された代案的なダイサー切断の結果であり、ｄｓＲＢＤ－削除突然変異体によるｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４の非変形された、モノ－又はジ－ウリジン化された形態の試験管内切断を示す。 二重鎖ＲＮＡ結合ドメインによって促進された代案的なダイサー切断の結果であり、ｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４のウリジン化－媒介代案的なダイサー切断のための提案されたモデルを示す。 代案的なダイサー切断によって誘導されたアームスイッチング結果であり、非変形された及びウリジン化されたｐｒｅ－ｍｉｒ－３２４から製造されたｍｉｒ－３２４二重複合体の鎖選択の概略図を示す。 代案的なダイサー切断によって誘導されたアームスイッチング結果であり、２個のｍｉｒ－３２４二重複合体を用いたルシフェラーゼレポーター分析を示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、膠芽細胞腫及び正常脳組織においてｍｉＲ－３２４－３ｐの５’－ｉｓｏｍｉＲ組成物の比率を示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、Ｏｎｃｏｐｒｅｓｓｉｏｎデータベースの正常、低等級膠腫及び膠芽細胞腫組織においてＴＵＴ４／７の発現レベルを示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、膠芽細胞腫（黒色）と一致する正常脳組織（白色）においてＴＵＴ４／７発現レベルとｍｉＲ－３２４－５ｐ／３ｐ比間の負の相関関係を示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、Ａ１７２細胞においてｍｉｒ－３２４の合成５ｐ二重複合体又は３ｐ．１二重複合体を過発現した後、表示されたサイクリンタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイルを示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、Ａ１７２細胞においてロックト核酸アンチセンスオリゴヌクレオチドによってｍｉＲ－３２４を抑制した後、指示されたサイクリンタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイルを示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングによって調節される細胞周期進行結果であり、Ａ１７２細胞においてＴＵＴ４／７をノックダウンした後、指示されたタンパク質のウェスタンブロット及び細胞周期プロファイルを示す。 ｍｉｒ－３２４アームスイッチングメカニズムモデルを模式化した図である。

Claims (14)

  1. 配列番号１及び２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ；ｍｉＲＮＡ）；
    配列番号４の塩基配列からなる核酸；及び
    配列番号５～２０からなる群から選ばれる１個以上の塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ；ｓｉＲＮＡ）；からなる群から選ばれる１種以上を含む癌予防又は治療用薬学的組成物。
  2. 前記マイクロＲＮＡは、前記配列番号１の塩基配列を含むマイクロＲＮＡ及び前記配列番号２の塩基配列を含むマイクロＲＮＡが互いに結合した複合体（ｄｕｐｌｅｘ）形態である、請求項１に記載の癌予防又は治療用薬学的組成物。
  3. 前記短い干渉ＲＮＡは、配列番号５～８のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ及び前記配列番号９～１２のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡが互いに結合した複合体の形態；又は配列番号１３～１６のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡ及び前記配列番号１７～２０のいずれか一つの塩基配列を含む短い干渉ＲＮＡが互いに結合した複合体の形態である、請求項１に記載の癌予防又は治療用薬学的組成物。
  4. 前記癌は、脳腫瘍、結腸癌、大腸癌、肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、膵癌、胆嚢癌、腎臓癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、絨毛癌、卵巣癌、乳癌、甲状腺癌、脳癌、頭頸部癌及び悪性黒色腫からなる群から選ばれる、請求項１に記載の癌予防又は治療用薬学的組成物。
  5. 前記癌は脳腫瘍である、請求項１に記載の癌予防又は治療用薬学的組成物。
  6. ｍｉＲ－３２４－５ｐ及びｍｉＲ－３２４－３ｐ．１からなる群から選ばれる１種以上のｍｉＲＮＡの発現レベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物。
  7. 前記製剤は、前記一つ以上のｍｉＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブを含む、請求項６に記載の癌診断用組成物。
  8. 請求項６又は７の組成物を含む癌診断用キット。
  9. 前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲ、実時間ＲＴ－ＰＣＲ、ノーザンブロッティング、ＲＮＡ保護分析法又はマイクロアレイチップ用である、請求項８に記載の癌診断用キット。
  10. ＴＵＴ４（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ４）及びＴＵＴ７（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｕｒｉｄｙｌｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ ７）からなる群から選ばれる１種以上の遺伝子ｍＲＮＡ又はそのタンパク質のレベルを測定する製剤を含む癌診断用組成物。
  11. 前記遺伝子ｍＲＮＡのレベルを測定する製剤は、前記ＴＵＴ４及びＴＵＴ７のいずれか一つ以上のｍＲＮＡに特異的に結合するプライマー又はプローブを含む、請求項１０に記載の癌診断用組成物。
  12. 前記タンパク質のレベルを測定する製剤は、前記ＴＵＴ４及びＴＵＴ７のいずれか一つ以上のタンパク質に特異的に結合する抗体を含む、請求項１０に記載の癌診断用組成物。
  13. 請求項１０～１２のいずれか一項の組成物を含む癌診断用キット。
  14. 前記キットは、ＲＴ－ＰＣＲキット、ＤＮＡチップキット又はタンパク質チップ用である、請求項１３に記載の癌診断用キット。
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