KR101481007B1 - 심장 비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에스트로겐-연관 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERR γ)의 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 심장비대(cardiomegaly) 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물에 포함된 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ의 하위 시그널 조절 또는 ERR γ의 직접적인 발현에 관여함으로써 ERR γ의 기능을 억제할 수 있다. 특히, 심장 비대 치료제로서 본 발명의 화합물 GSK5182 및 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ를 타겟으로 한 심장 비대 관련 질환 치료에 있어서 최초로 성공적인 결과를 제시한다. 따라서 본 발명에 따른 ERR γ작용 억제물질을 유효성분으로 하는 심장 비대 억제 조성물은 심근 비대 관련 유전자의 발현감소 및 심근 비대를 조절하는 효소의 활성을 억제함으로써 심장 비대증의 치료에 기여할 수 있다.

Description

심장 비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제{Pharmaceutical Compositions for Preventing Hypertrophy Cardiomyopathy and Therapeutic Drugs for the Same}

본 발명은 심장비대 억제 조성물 및 이를 포함하는 심장비대증 치료제에 관한 것이다.

심장비대증은 심근세포의 크기, 단백질의 합성속도 증가 등의 특징을 나타낸다. 이 질병은 심근경색, 고혈압, 대동맥 협착증, 판막 기능 장애와 같은 다양한 병리적인 상태에 의해 종종 발생된다. 심장비대증은 초기에는 이러한 생리적 또는 병리적인 자극에 대해 주로 적응반응을 나타내다가, 이러한 자극이 지속되었을 때 는 심부전으로 이행된다(Kee HJ et al., Circulation, 2006). 심부전은 특히 사망률이 50% 전후로 매우 높기 때문에 궁극적으로는 심근비대를 예방하거나 치료법을 개발하려는 연구들이 진행되고 있다. 심장비대증은 좌심실 비후의 특징을 보이며 이는 비만, 당뇨병 및 고콜레스테롤혈증과 관련이 있다고 보고된 바 있다(Lavie CJ et al., Am Heart J, 1997, de Simone G et al., Nutr Metabl Cardiovac Dis, 1998). 좌심실 비대증을 가지고 있는 환자는 뇌졸중, 울혈성 심부전 (congestive heart failure), 관상동맥 심장질환, 급사에 대한 위험도가 높다. 대한민국 공개특허 제 2000-0064848호 및 대한민국 공개특허 제 2001-0086070호에서 심비대증을 포함한 혈관 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 기술한 바와 같이, 좌심실비대에 대한 치료제로는 안지오텐신 변환효소 억제제(angiotensin-converting enzyme inhibitor), 안지오텐신 수용체 차단제(angiotensin receptor blockers, ARBs), 칼슘 채널 차단제 (calcium channelblockers, CCB), 이뇨제 등이 보고되었다(Artham SM et al., Progress in Cardiovascular Diseases, 2009 Yasunari K et al., Curr Med Chem Cardiovasc Hemato Agents. 2005).

대한민국 공개특허 제 2000-0064848호는 심부전, 허혈성 심질환 및 부정맥 등의 심장 병 발증의 원인인 심장 비대에 기인하는 심장병 치료용 의약조성물에 관한 것으로, NP 수용체인 GC-A에 결합하여, cGMP 생산을 항진시킬 수 있는 물질을 유효 성분으로 하는 심장비대에 기인하는 심장병 치료용 의약 조성물을 보고한다. 유효 성분의 구체예로서, 나트륨 이뇨 펩티드, 예를 들면 심방성 나트륨 이뇨 펩티드 및 뇌성 나트륨 이뇨펩티드를 들 수 있다.

에스트로겐-연관 수용체(Estrogen-related receptors, ERRs)는 에스트로겐과 밀접한 관련이 있는 고아 핵 수용체이다. 에스트로겐-연관 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERR-gamma)는 ERR의 세 번째 서브타입(subtype) 수용체로서, 인간과 마우스의 많은 조직, 예컨대 뇌, 골격근, 심장, 신장, 췌장, 망막 및 태반에서 발현될 뿐 아니라(Bonnelye et al., Mol Endo, 1997; Heard DJ et al., Mol Endocrinol 2000), 많은 생물학적 기능을 가진 것으로 알려져 있다(Alaynick WA et al., Cell Metab, 2007; Ariazi EA et al., Cancer Res, 2002; Cheung CP et al., J Clin Endocrinol Metab, 2005; Dufour CR et al., Cell Metab, 2007; Huss JM et al., J Biol Chem, 2002; Yu S et al., Cancer Res, 2007). 상기 ERR γ의 생물학적 기능을 연구하기 위해서는 ERR γ에 특이적이고 이들의 기능을 조절할 수 있는 소분자 조절자의 동정 또는 개발이 필요하다. 현재까지 여러 가지 아고니스트(agonist) 및 역 아고니스트가 보고되었지만[Horard B et al., J Mol Endo, 2003), 이들 리간드(ligand)는 다양한 유전자 산물과 비특이적으로 상호작용하거나, ERR γ 또는 다른 핵 수용체의 기능을 방해한다.

ERR γ는 자궁내막선암(M. GAO et al., International Journal of Gynecological Cancer, 2006) 및 유방암(Riggins RB et al., Cancer Res, 2008) 등과의 연관성은 밝혀진 바 있지만, 좌심실 비대증 및 심부전증과 같은 심장비대와의 관련성은 명확히 밝혀지지 않았다.

따라서 본 발명에서는 ERR γ의 기능을 조절하는 리간드로서, 소분자 화합물인 GSK5182（(Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐}-5-하이드록시-2-페닐펜트-1-에닐)페놀)의 심장비대 억제제로서의 신규한 용도를 제시하고자 한다. 상기 GSK5182는 ERR γ의 역 아고니스트로서, 아고니스트처럼 ERR γ에 결합하지만 아고니스트와 약리학적 반응은 반대로 나타낸다. 또한 ERR γ의 유전자를 타겟으로 하는 siRNA를 통하여 심장비대를 억제하는 약리학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 에스트로겐-연관 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERR-gamma)를 억제하는 화합물인 GSK5182（(Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐}-5-하이드록시-2-페닐펜트-1-에닐)페놀) 또는 ERR-gamma의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개발하였으며, 상기 조성물이 심근 세포 및 조직 크기의 억제효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 심장비대(cardiomegaly) 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유효성분으로서 에스트로겐-연관 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERR γ)의 억제 물질; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 심장비대(cardiomegaly) 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:

본 발명자들은 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 에스트로겐-연관 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERR-gamma)를 억제하는 화합물인 GSK5182（(Z)-4-(1-{4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐}-5-하이드록시-2-페닐펜트-1-에닐)페놀) 또는 ERR-gamma의 siRNA를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개발하였으며, 상기 조성물이 심근 세포 및 조직 크기의 억제효과가 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “에스트로겐-연관 수용체 감마(Estrogen-related receptor gamma, ERR-γ) 억제물질”은 (ⅰ) ERR-γ과 직접적으로 상호작용하는 물질, 또는 (ⅱ) ERR-γ의 발현 억제 물질을 의미한다. 상기 ERR-γ 억제물질은 다양한 유기 또는 무기 화합물, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 천연물 또는 항체일 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어 “상호작용(interaction)"은 상기 ERR-γ의 리간드-결합 영역(ligand-binding domain)에 선택적으로 결합하는 것을 의미하며, 바람직하게는 ERR-γ의 리간드-결합 영역에 결합하여 ERR-γ의 활성을 조절하는 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 ERR-γ의 역 아고니스트(inverse agonist)로서 ERR-γ 리간드-결합 영역에 결합하여 ERR-γ의 활성을 억제하는 것을 의미한다.

상기 ERR-γ과 직접적으로 상호작용하는 물질로서, ERR-γ의 역 아고니스트(inverse agonist)로 작용하는 화합물은 예컨대, 4-하이드록시타목시펜(hydroxytamoxifen), 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol), 캠퍼롤(kaempferol), 아피게닌(apigenin), 루테올린(luteolin), 페녹시 티아졸리딩디온(phenoxy thiazolidinedione) 또는 트로글리타존(troglitazone) 등이 있다. 본 발명에서는 상기 화합물 외에도 심장 비대와의 연관성이 밝혀지지 않은 화합물 중 효과가 우수한 것을 선별하여 심장 비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개발하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ERR γ 억제 물질은 다음 화학식 1의 화합물, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물이다:

화학식 1

상기 화학식 1의 화합물은 ERR γ의 리간드-결합 영역(ligand-binding domain)에 결합하여 ERR γ 신호전달 경로의 하위 조절자 발현을 증가 또는 억제시킬 수 있으며, 바람직하게는 ERR γ 신호전달 경로의 하위 조절자 발현을 억제한다.

상기 ERR γ 억제 물질에 의해 심장비대가 억제되는데, 이는 심장 비대 관련 유전자 또는 단백질의 발현여부 또는 발현량을 측정함으로써 확인할 수 있다. 상기 심장비대 관련 유전자는 예컨대, ANF (atrial natriuretic factor), Nppa (natriuretic peptide precursor type A), MYH7 (β-myosin heavy chain), GATA4, MYPBC3 (myosin-binding protein C), TNNT2 (cardiac troponin T type 2), TNNI3 (cardiac troponin I type 3), TNNC1 (cardiac troponin C type 1 ), TPM1 (α-tropomyosin gene), MYL2 (myosin regulatory light chain 2), MYL3 (myosin regulatory light chain 3), ACTC (cardiac actin gene), TTN (Titin gene), PRKAG2 (2-regulatory subunit of AMPK gene) 및 CLP (cardiac muscle LIM protein gene)을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ERR γ 하위 조절자로서 상기 심장비대 관련 유전자는 ANF (atrial natriuretic factor), Nppa (natriuretic peptide precursor type A), MYH7 (β-myosin heavy chain) 또는 GATA4이다.

ERR-γ의 기능을 억제하는 다른 접근 방식은 ERR-γ 유전자의 mRNA와 상보적인 염기서열을 가지고 있는 올리고뉴클레오타이드를 투여하는 것이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ 유전자의 서열 중 일부 서열을 타겟으로 하며, 상기 올리고뉴클레오타이드가 ERR γ 유전자 또는 mRNA에 결합하면 ERR γ의 발현이 억제된다.

본 명세서에서 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 “상보적”은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 올리고뉴클레오타이드가 ERR γ 타겟에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

상기 ERR-γ 억제물질 중 ERR-γ의 발현 억제 물질은 DNA, RNA 또는 단백질 수준에서 발현을 억제할 수 있는 물질을 총칭한다. 즉, 본 명세서에서 용어 “발현 억제”는 ERR-γ 유전자에 결합하여 ERR-γ 유전자의 전사를 억제하거나 단백질 발현을 억제하는 등 유전자 및 단백질 수준에서 ERR-γ의 발현을 조절하여 ERR-γ에 의한 시그널링 효과를 억제하는 것을 의미한다. ERR-γ의 발현이 증가 또는 억제되면, ERR-γ의 활성이 증가 또는 억제되어 ERR-γ의 시그널링 효과(signaling effects)를 조절할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “시그널링 효과(signaling effects)”란 ERR-γ의 하위 조절자 기능에 대한 증가 또는 억제 효과를 의미하며, ERR-γ의 하위 조절 유전자, 예컨대 GATA4 유전자의 프로모터의 활성을 억제하여 GATA4 전사를 하향 조절하거나, 상기 유전자의 전사 후 mRNA를 분해하거나, 단백질 번역을 저해하는 등의 모든 하향 조절을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 ERR γ 억제 물질은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 739번째 내지 757번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.

서열목록 제 1서열은 래트(Rattus Norvegicus)의 ERR γ 유전자 서열을 나타낸다. 서열목록 제 1서열에서 739번째 내지 757번째까지의 뉴클레오타이드 서열은 ERR γ의 씨드 서열 중 일부이다. 일반적으로 ERR γ의 씨드 서열은 리간드 결합에 매우 중요한 서열로서 다양한 종에 대하여 보존적(conserved)이다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ의 씨드 서열인 서열목록 제1서열의 739번째 내지 757번째까지의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지며, 이 상보적인 서열 만에 의해서도 ERR γ를 억제할 수 있다.

바람직하게는 상기 ERR γ 유전자 서열과 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열(즉, ERR γ의 유전자 서열) 중에서 700-800번째, 보다 바람직하게는 720-780번째, 보다 더 바람직하게는 730-760번째, 보다 더욱 더 바람직하게는 739-757번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명에서 올리고뉴클레오타이드는 다양한 분자를 포함한다. 본 발명에서 사용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드를 모두 포함하며, 길이는 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는 상기 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)이며, 보다 바람직하게는 리보뉴클레오타이드이다.

상기 리보뉴클레오타이드는 당업계에서 디자인, 제작할 수 있는 다양한 종류의 리보뉴클레오타이드를 포함하며, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (short interfering RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA)를 사용할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 타겟으로 하는 유전자 또는 RNA의 씨드 서열에 대한 상보적인 서열을 가지고 있어 DNA 또는 RNA와 이합체(duplex)를 형성할 수 있는 핵산-기반 분자를 포괄한다. ERR γ를 억제하기 위하여 적합하여 올리고뉴클레오타이드의 길이는 7-50 뉴클레오타이드, 바람직하게는 10-40 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15-30 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드, 보다 더욱 더 바람직하게는 15-20 뉴클레오타이드이다.

ERR γ 기능의 억제는 전형적인 올리고뉴클레오타이드를 투여하여 달성될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 올리고뉴클레오타이드는 심장 비대 억제 효과를 특징으로 하는 것으로서, 심장 비대와 관련된 다양한 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 심장 비대 관련 질환은 좌심실 비대증, 심부전증, 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 고혈압, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 심장 비대 관련 질환은 좌심실 비대증, 심부전증, 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 확장성 심근병증, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 우심실을 침범하는 심근병증, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증이며, 보다 바람직하게는 좌심실 비대증 또는 심부전증이다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 ERR-γ를 억제하여 심장비대 마커 유전자인 Nppa 및 Myh7의 프로모터 활성을 크게 감소시키며 심근세포의 단백질 합성을 억제하고, 결과적으로 심장 조직의 비대 현상을 차단시켜 심장 비대 관련 질환 특히 심실비대증을 치료한다.

본 발명의 조성물이 심장 비대 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 물리적 수술 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 심장 비대 관련 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약제학적 조성물은 복강 주입으로 투여한다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-1000 ㎎/㎏이며, 바람직하게는 30-50 mg/kg이다. siRNA 등의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우, 세포내에 투여될 siRNA 발현벡터 또는 siRNA의 적정 수는 상태에 따라 다르나 세포에서의 최종농도가 50 nM 내지 100 nM 정도로 하는 것이 바람직하다.

상기 조성물에 함유되는 화합물, 올리고뉴클레오타이드, 단백질 또는 그 저해제의 유효 투여량의 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여방법, 표적 세포, 발현 수준 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 에스트로겐-연관 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERR γ)의 억제 물질을 유효성분으로 포함하는 심장비대(cardiomegaly) 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 본 발명의 조성물에 포함된 화합물 또는 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ의 하위 시그널 조절 또는 ERR γ의 직접적인 발현에 관여함으로써 ERR γ의 기능을 억제할 수 있다.

(c) 심장 비대 치료제로서 본 발명의 화합물 GSK5182 및 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ를 타겟으로 한 심장 비대 관련 질환 치료에 있어서 최초로 성공적인 결과를 제시한다.

(d) 본 발명에 따른 ERR γ작용 억제물질을 유효성분으로 하는 심장 비대 억제 조성물은 심근 비대 관련 유전자의 발현감소 및 심근 비대를 조절하는 효소의 활성을 억제함으로써 심장 비대증의 치료에 기여할 수 있다.

도 1은 페닐에프린(phenylephrine, PE)은 심근세포의 크기를 증가시키지만, 에스트로겐-연관 수용체(ERR) γ의 억제제인 GSK5182는 심근세포의 크기를 증가시키지 않음을 나타낸 것이고,
도 2는 페닐에프린과 엔도세린(endothelin-1, ET-1) 그리고 이소프로테레놀(isoproterenol, ISP)이 심근내 단백질 합성을 증가시키고 ERR γ의 억제제인 GSK5182는 심근 내 단백질 합성을 증가시키지 않음을 나타내며,
도 3은 페닐에프린과 엔도세린이 3003 심방나트륨이뇨성인자(ANF, atrial natriuretic factor) 프로모터를 활성화시키고 ANF 단백질 발현을 증가시키며, 다시 ERR γ의 억제제인 GSK5182에 의해 발현 차단됨을 킴을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이고.
도 4는 대동맥 결절(Aortic banding, AB)로 심장크기가 커지지만, ERR γ의 억제제인 GSK5182를 처리했을 때 심장비대 현상이 완벽하게 차단됨을 확인한 결과이며,
도 5는 대동맥 결절된 쥐가 대조군 쥐에 비교해서 심장무게/체중 비(ratio)와 심장무게/경골 길이(tibia length) 비(ratio) 가 증가하지만, ERR γ 억제제인 GSK5182를 처리했을 때는 완벽하게 차단됨을 확인한 것이고,
도 6은 대동맥 결절된 쥐가 대조군 쥐에 비교해서 심실사이막(interventricular septum)과 좌심실 내벽 두께(left ventricular free wall thickness)가 커지지만 ERR γ 억제제인 GSK5182를 처리했을 때는 완벽하게 차단됨을 초음파로 확인한 것이며,
도 7은 대동맥 결절된 쥐가 대조군 쥐에 비교해서 심장비대 마커로 작용하는 ANF 단백질 발현이 증가하지만 ERR γ 억제제인 GSK5182를 처리했을 때는 완벽하게 차단됨을 확인한 결과이고,
도 8은 ERR γ 유전자 발현을 감소시키는 siRNA는 페닐에프린에 의한 심장비대 자극의 유무에 관계없이 류신 합성을 억제하는 것을 확인한 결과이며,
도 9는 ERR γ 유전자 발현을 감소시키는 siRNA는 심장비대 자극의 유무에 관계없이 -3003 Nppa 프로모터 활성을 차단시킴을 나타낸 것이며,
도 10은 ERR γ 유전자 발현을 감소시키는 siRNA는 페닐에프린에 의한 심장비대 자극에 의해 증가된 -3500 Myh7 프로모터 활성을 차단시킴을 확인한 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

초대배양 심근세포 배양

태어난 후 1-2일 된 랫트 (Sprague Dawley, 샘타코바이오코리아)의 심장에서 심방과 혈관을 제거한 후 심실부분만을 잘게 잘라 콜라게나아제(collagenase Type II, 0.1%/ADS 완충액 116 mM NaCl, 20 mM HEPES, 10 mM NaH₂PO₄, 5.5 mM 글루코스, 5 mM KCl, 0.8 mM MgSO₄, pH 7.4)에 넣고 37℃에서 15분 동안 진탕배양하였다. 상기 배양액을 정치시킨 후 세포 상등액을 모아 두고, 남은 조직에 다시 콜라게나아제 용액을 넣어 위의 과정을 총 3번 반복하여 세포 상등액을 수득하였다. 상기 세포 상등액에 10%(v/v) 소태아혈청(FBS)을 포함한 DMEM을 첨가하여 콜라게나아제 반응을 중지시켰다. 퍼콜 농도차(percoll, GE heathcare company)를 이용하여 세포 상등액에서 심근세포만을 분리하기 위해 37℃에서 30분간 원심분리한 후 퍼콜층에 걸려있는 심근세포를 모아 10% FBS/DMEM 배지로 세척하여 세포 침전물(pellet)을 얻었다. 섬유세포(fibroblast)는 평판 배양(pre-plating)으로 1 시간 동안 처리하여 제거한다. 심근세포를 카운팅하여(1.5x 10⁵ 세포/㎖) 콜라겐 코팅된 세포배양 플레이트에서 항생제와 10%(v/v) FBS를 포함한 DMEM 배지에서 유지시킨다.

실시예 1: GSK5182의 심장 비대 억제 효과 확인

1-1. 심근세포 크기 억제 효과

페닐에프린은 심근세포의 크기 증가시키게 되므로 페닐에프린으로 증가된 심근세포 크기를 ERR γ 억제제인 GSK5182가 조절하는지 확인 실험을 수행하였다. 즉, 초대 배양한 심근세포(primary neonatal cardiomyocyte)를 이용하여 페닐에프린(phenylephrine, PE) 100 μM과 GSK5182 1 μM을 400 ㎕/웰의 배지에 처리한 후에 세포의 크기를 측정하였다. 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, 페닐에프린만이 심근세포의 크기를 증가시키고, 페닐에프린에 GSK5182를 함께 처리한 경우는 심근세포의 크기를 증가시키지 못했다. 즉, ERR γ 작용 억제제인 GSK5182가 심근비대를 억제시키는데 작용한다는 것을 보여준다.

1-2. 심근 내 단백질 합성 억제 효과

초대 배양한 심근세포(primary neonatal cardiomyocyte)를 이용하여 페닐에프린 100 μM, 엔도세린(endothelin-1, ET-1) 10 nM, 이소프레테레놀(isoproterenol, ISP)과 GSK5182 각각 1 μM을 500 ㎕/웰로 처리한 후에 추가로 1.0 μCi/㎖ [³H]-류신(leucine)을 넣고 12시간 동안 반응시킨 후, 트리클로로아세테이트산(trichloroacetic acid) 10%(v/v)을 첨가하고 0.25 N NaOH로 중화시킨 후 방사능량을 측정하였다. 그 결과 도 2에서와 같이, 페닐에프린, 엔도세린 또는 이소프레테레놀과 같은 심장비대 자극에 의해 류신 합성이 증가되고, ERR γ 억제제인 GSK5182를 사용하면 류신 합성이 감소함을 알 수 있었다.

1-3. ANF 활성 억제 효과

페닐에프린에 의해 유도된 -3003 Nppa 프로모터 활성을 감소시키는 GSK5182가 심장비대 표현형에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 심장비대 마커 유전자인 Nppa (natriuretic peptide precursor type A) 프로모터 활성도를 측정하였다. 심근세포에 페닐에프린과 엔도세린 자극에 의해 증가된 3003 프로모터 활성이 ERR γ 억제제인 GSK5182에 의해 Nppa 프로모터 활성이 감소됨을 도 3에서 확인하였다.

또한, 심장비대마커 유전자인 심방 나트륨이뇨 펩티드(atrial natriuretic factor, ANF)의 단백질 발현을 웨스턴 블럿(WB, Western blot)으로 확인하였다. 초대배양 심근 세포에 100 μM 페닐에프린과 1 μM GSK5182를 처리 한 뒤에 1% NP-40 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 프로테아제 억제제)를 200 ㎕를 넣고 심근세포를 모은 뒤에 소니케이션 하고 15분간 반응시켰다. 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 회수하여, BCA 단백질 시약(Thermo Scientific)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 상기 단백질 50 ㎍을 취하여 SDS-PAGE 전기영동한 후에 폴리비닐아덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF membrane)로 옮겨 검출 대상 단백질에 특이적인 1차 항체(α-V5 (1:5000, Invitrogen), α-ANF (1:1000, Meridian), α-GAPDH (1:1000, Santa Cruz))로 하루 동안 반응시켰다. 이후 2차 항체(anti-mouse IgG, horseradish peroxidase(HRP)-linked antibody, 1:5000, Cell signaling company)로 1시간 반응시키고 TBST 완충액으로 3회 이상 세척하였다. 세척 후, Immobilion사(Millipore, USA)의 기질(Western Chemiluminescent HRP substrate)을 이용하여 단백질을 확인하였다. 그 결과, 페닐에프린과 엔도세린 처리 후에 ANF 발현이 증가된 반면, GSK5182를 처리한 경우에는 ANF 단백질 발현이 증가되지 않았다.(도 3)

실시예 2: 대동맥 결절된 마우스에서의 GSK5182 의 심장 비대 억제 효과 확인

2-1. 심장 크기 억제 효과

대동맥 결절 (Aortic banding, AB)에 의해 심장비대를 유도시킨 동물에서 ERR γ 억제제인 GSK5182에 의해 심장 비대 효과가 차단되는지 확인하였다. 심장비대를 유발하기 위해 7주령 마우스(ICR, 샘타코바이오코리아)에 대동맥결절 시술을 한 뒤, 다음날부터 GSK5182 (30 mg/kg/day)의 복강투여를 실시하였다. 상기 GSK5182 30 mg/kg/day을 200 ㎕씩 7일 동안 복강 투여 후 표현형을 분석하였다. 각각의 마우스에서 심장을 적출하여 크기를 확인 한 결과, 대동맥 결절은 마우스의 심장 무게를 증가시켜 심장비대가 유발되었지만, GSK5182에 의해 심장비대가 완벽히 억제됨을 확인하였다(도 4).

2-2. 경골길이, 심장무게 및 체중의 측정

대동맥 결절 후 GSK5182 30 mg/kg/day가 되도록 7일간 복강 내로 200 ㎕씩 투여한 뒤 각각의 마우스에서 심장을 적출하여 심장무게와 체중 그리고 뒷다리의 결장을 떼어낸 후 경골길이(tibia length)를 측정하였다. 심장무게와 체중측정은 정밀화학저울을 사용하였고, 경골길이의 측정은 mm 표시가 되어 있는 자를 이용하였다.

도 5에서 확인할 수 있듯이, 대동맥 결절한 마우스의 심장무게/체중과 심장무게/경골길이 비는 대조군에 비교하여 유의적으로 증가하였지만, GSK5182를 투여한 마우스에서는 증가를 나타내지 않았다. 또한 심장 초음파를 통해서 대동맥 결절한 쥐가 대조군 쥐에 비교해서 심실사이 막(interventricular septum)과 좌심실 내벽 두께(left ventricular free wall thickness)가 커지지만 ERR γ 억제제인 GSK5182를 처리했을 때는 완벽하게 차단함을 도 6에서 확인하였다.

2-3. 심장비대 마커 ANT 의 발현 확인

상기 실시예 2-2의 마우스 심장 조직을 이용하여, 심장비대마커 유전자인 심방 나트륨이뇨 펩티드(atrial natriuretic factor, ANF)의 단백질 발현을 웨스턴 블럿으로 확인하였다. 각각의 심장조직을 잘게 가위로 자른 후에 1% NP-40 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 mM NaF, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM PMSF, 프로테아제 억제제)를 1-2 ㎖ 첨가하고 15분간 반응시킨 후에 호모게나이저(homogenizer)로 분쇄하였다. 13,000rpm으로 15분 동안 원심분리한 후, 상층액을 회수하여 BCA 단백질 시약(Thermo Scientific)을 이용하여 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질 50 ㎍을 취하여 SDS-PAGE 전기영동한 후에 폴리비닐아덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF membrane)로 옮긴 후, 검출 대상 단백질에 특이적인 1차 항체(α-V5 (1:5000, Invitrogen), α-ANF (1:1000, Meridian), α-GAPDH (1:1000, Santa Cruz))로 하루동안 반응시켰다. 이후 2차 항체(anti-mouse IgG, horseradish peroxidase(HRP)-linked antibody, 1:5000, Cell signaling company)로 1시간 반응시키고 TBST 완충액으로 3회 이상 세척한 후에 Immobilion사(Millipore, USA)의 기질(Western Chemiluminescent HRP substrate)을 이용하여 단백질을 확인하였다. 그 결과, 대동맥 결절한 심장조직에서만 ANF 발현이 증가되고, GSK5182 30mg/kg/day를 7일 동안 투여한 심장조직에서는 증가되지 않았음을 확인하였으며(도 7), 이러한 결과는 GSK5182와 같은 ERR γ 억제제가 심장비대증을 치료하는 약제로 사용 가능하다는 것을 보여준다.

실시예 3: ERR γ 타겟의 siRNA 를 이용한 GSK5182 의 심장 비대 억제 효과 확인

3-1. 심근 내 단백질 합성 억제 효과

ERR γ를 표적으로 하는 siRNA 올리고머 및 대조군인 ERR γ 비 특이적 스크램블(scramble) 올리고머는 바이오니아에서 제작, 구입하였다. siRNA는 래트에서 추출한 심근에서 초대배양 심근세포를 추출하여 실험하였으므로 래트(Rattus Norvegicus)의 ERR γ 유전자를 타겟으로 하여 이중 가닥으로 디자인 하였다(센스: 5'-GACUUGGCUGAUCGAGAGU-3', 안티센스: 5'-ACUCUCGAUCAGCCAAGUC-3').

심근 세포에 스크램블 올리고머와 ERR γ siRNA를 제조사의 프로토콜에 근거하여 리포펙타민 RNAiMAX 시약(invitrogen)을 이용하여 형질 도입한 뒤, 하루 동안 소태아혈청이 없는 DMEM 배지에 배양하였다. 심근비대 자극 물질인 페닐에프린, 엔도세린 또는 소태아 혈청을 24시간 동안 처리하였다. 그 후 추가로 1.0 μCi/㎖ [³H]-류신을 넣고 하루 동안 반응시킨 후, 트리클로로아세테이트산 10%(v/v)을 첨가하고 0.25 N NaOH로 중화시킨 후 방사능량을 측정하였다. 그 결과 도 8에서와 같이, 페닐에프린, 엔도세린 및 소태아 혈청과 같은 심장비대 자극에 의해 류신 합성이 증가되고, GSK5182와 같은 억제제를 사용하면 류신 합성이 감소함을 알 수 있었다.

3-2. ERR γ 타겟의 siRNA 를 이용한 심장비대 마커 유전자의 활성 확인

리포펙타민 RNAiMAX 시약(invitrogen)을 이용하여 ERR γ siRNA를 심근세포에 형질 도입한 뒤 24시간 동안 배양한 후, 하루 동안 혈청이 없는 DMEM 배지에 배양하였다. pGL3 basic-3003 Nppa 프로모터 루시퍼라아제 컨스트럭트와 pGL3 basic 3500 Myh7 프로모터 루시퍼라아제 컨스트럭트 각각 100 ng 및 사이토메갈로바이러스(CMV)-β-갈락토시다아제 플라스미드 20 ng 을 리포펙타민 시약을 사용하여 심근세퐁[ 형질 도입 한 뒤에 하루 동안 소태아혈청이 없는 DMEM 배지에 배양하였다. 심근비대 자극 물질인 페닐에프린과 엔도세린을 24시간 동안 처리한 후에 프로모터 활성을 측정하기 위해 배지를 제거하였다. 세포용해 완충액(cell lysis buffer, 1% Triton X-100 포함, Promega)을 각각의 웰에 100 ㎕ 씩 넣고 30분 동안 격렬하게 흔들어 세포를 녹여낸 후에 일정량의 25 ㎕의 세포 용해물을 96 웰 플레이트(루미노미터 튜브)에 첨가하고 25 ㎕의 루시퍼라아제 분석 시약(Promega)을 넣고 루미노미터(luminometer)에서 측정하였다. 루시퍼라아제 활성값은 내부 표준물질(internal control)로 사용한 β-갈락토시다아제를 측정하여 보정하였다. 그 결과, ERR γ siRNA는 심장비대 자극에 유무에 관계없이 -3003 Nppa 프로모터 활성을 차단시켰음을 확인할 수 있으며(도 9), 페닐에프린 심장비대 자극에서도 -3500 Myh7 프로모터 활성을 차단시켰음을 확인할 수 있었다(도 10).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> University Industry Liaison office of CNU <120> Pharmaceutical Compositions for Preventing Hypertrophy Cardiomyopathy and Therapeutic Drugs for the Same <130> PN120257 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1308 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtcaaaca aagatcgaca cattgattcc agctgttcgt ccttcatcaa gacggaacct 60 tccagcccag cctccctgac ggacagcgtc aaccaccaca gccctggtgg ctcttcagac 120 gccagtggga gctacagttc aaccatgaat ggccatcaga acggacttga ctcgccacct 180 ctctaccctt ctgctcctat cctgggaggt agtgggcctg tcaggaaact gtatgatgac 240 tgctccagca ccattgttga agatccccag accaagtgtg aatacatgct caactcgatg 300 cccaagagac tgtgtttagt gtgtggtgac atcgcttctg ggtaccacta tggggtagca 360 tcatgtgaag cctgcaaggc attcttcaag aggacaattc aaggcaatat agaatacagc 420 tgccctgcca cgaatgaatg tgaaatcaca aagcgcagac gtaaatcctg ccaggcttgc 480 cgcttcatga agtgtttaaa agtgggcatg ctgaaagaag gggtgcgtct tgacagagta 540 cgtggaggtc ggcagaagta caagcgcagg atagatgcgg agaacagccc atacctgaac 600 cctcagctgg ttcagccagc caaaaagcca tataacaaga ttgtctcaca tttgttggtg 660 gctgaaccgg agaagatcta tgccatgcct gaccctactg tccccgacag tgacatcaaa 720 gccctcacta cactgtgtga cttggccgac cgagagttgg tggttatcat tggatgggcg 780 aagcatattc caggcttctc cacgctgtcc ctggcggacc agatgagcct tctgcagagt 840 gcttggatgg aaattttgat ccttggtgtc gtataccggt ctctttcgtt tgaggatgaa 900 cttgtctatg cagacgatta tataatggac gaagaccagt ccaaattagc aggccttctt 960 gatctaaata atgctatcct gcagctggta aagaaataca agagcatgaa gctggaaaaa 1020 gaagaatttg tcaccctcaa agctatagct cttgctaatt cagactccat gcacatagaa 1080 gatgttgaag ccgttcagaa gcttcaggat gtcttacatg aagcgctgca ggattatgaa 1140 gctggccagc acatggaaga ccctcgtcga gctggcaaga tgctgatgac actgccactc 1200 ctgaggcaga cctctaccaa ggccgtgcag catttctaca acatcaaact agaaggcaaa 1260 gtcccaatgc acaaactttt tttggaaatg ttggaggcca aggtctga 1308 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequences from Rattus norvegicus <400> 2 gacuuggcug aucgagagu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA sequences from Rattus norvegicus <400> 3 acucucgauc agccaaguc 19

Claims (11)

1. (a) 유효성분으로서 에스트로겐-연관 수용체 감마(estrogen-related receptor gamma, ERR γ)의 억제 물질인, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열 중 739번째 내지 757번째 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 심장비대(cardiomegaly) 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 ERR γ 신호전달 경로의 하위 조절자 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 ERR γ 신호전달 경로의 하위 조절자는 ANF (atrial natriuretic factor), Nppa (natriuretic peptide precursor type A), MYH7 (β-myosin heavy chain) 또는 GATA4인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드, 2‘-O-변형 올리고뉴클레오타이드, 포스포로티오에이트-백본 디옥시리보뉴클레오타이드, PNA(peptide nucleic acid) 또는 LNA(locked nucleic acid)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA (short interfering RNA) 또는 shRNA (small hairpin RNA)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 좌심실 비대증, 심부전증, 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 고혈압, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증의 예방 또는 치료용 조성물인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
11. 삭제

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