KR20170019639A - 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 유효성분으로서 쿠쿠르비타신(cucurbitacin), 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 심장비대(cardiac hypertrophy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 심장비대 치료제로서 본 발명의 쿠쿠르비타신은 심장비대 관련 질환 치료에 있어서 성공적인 결과를 제시한다. 본 발명의 따른 쿠쿠르비타신 I을 유효성분으로 하는 심장비대 조성물은 심근비대 관련 유전자 및 유전자 시그널링을 억제함으로써 심장비대증의 치료에 기여할 수 있다.

Description

심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Preventing or Treating Cardiac Hypertrophy-Related Diseases}

본 발명은 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

심장비대는 다양한 병리학적 자극(예컨대, 고혈압, 판막 질환 및 심근 경색)에 대한 심장의 적응 반응이다. 심장비대의 조절은 심근세포의 확대, 근섬유분질(sacomerid) 단백질의 축적 및 근섬유분질 재조직(reorganization)이 특징이다.¹ 심장비대는 초기 단계의 기계적 하중을 보상하기 위한 것으로 생각되어지지만, 지속적인 심장 비대는 중증 질병 상태에서 종종 진행된다. 따라서 심장비대는 심혈관 질병률 및 사망률에 대하여 주요 독립적인 위험인자이다.²

CCN2로 알려진, 결합조직 성장인자(CTGF)는 단백질의 CCN(Cyr61, CTGF 및 Nov) 패밀리의 세포외 기질(ECM)-분비 단백질이다.³ CTGF는 세포 증식, 세포 부착, 세포 이동 및 세포외 기질 생성에 참여하며 다수의 생물학적 작용(들)에서 나타난다. 구체적으로, CTGF는 조직 섬유증의 중요한 키(key) 및 생화학적 마커이다.⁴ 유사하게, CTGF가 결정적으로 심장 섬유증의 발병 과정에 기여하고 있음을 많은 연구들에서 증명하고 있다. CTGF는 심장의 프로-비대성 인자인다. CTGF는 심혈관 질환에서 상향 조절된다. 또한 CTGF는 수많은 MAPKs 및 ERK1/2, JNK 및 p38 키나아제를 포함하는 비대성 활성제를 활성화한다.⁵ 또한, 세포외 자극의 다양한 종류(예를 들어, TGF-β, 엔도텔린-1 및 VEGF)는 CTGF 발현을 상향 조절한다. 그 중, TGF-β 및 CTGF는 명백하게 심장 비대 및 섬유화를 유도 할 수 있는 협력 상호작용을 갖는다.⁶ 그 후, 활성화된 TGF-β는 Smad 단백질의 활성화를 통해 프로 비대성 시그널을 전파한다.⁷

최근, 자연적으로 많이 생성되는, 식물-유래 화합물은 암을 포함하는 다양한 질환, 염증성 질환 및 당뇨병 등의 치료를 위한 대안적 전략에서 성공적으로 이용되어왔다. 또한 수많은 천연 화합물들은 잠재적으로 심장비대, 심부전, 심근경색 및 다른 심장 질환의 관리를 위해 적용될 수 있다.^8,9 포도, 콩 및 레드 와인에서 발견되는 레스베라트롤(resveratrol) 및 폴리페놀(polypenol)은 강력한 항산화 및 신진 대사에 영향을 줄 뿐만 아니라¹¹ 심혈관 질환의 여러 동물 모델에서 나타나는 유익한 작용들을 집중적으로 연구 중 이다.¹⁰ 상기 보호 효과는 Sirt1 및 AMP 활성 단백질 키나아제(AMPK)의 활성에 의존하는 것으로 알려져 있다. 참고로, Sirt1은 지방분해, 지방산 산화, 미토콘드리아 바이오제네시스 및 글루코네오제네시스(gluconeogenesis)를 포함하는 치명적인 대사 과정의 조절에 필수적이다.^{11, 14, 15} 따라서, 우리는 새로운 천연 화합물이 새로운 심혈관 치료제의 개발을 위해 우수한 분자 수준의 기반을 제공할 것으로 기대하고 있다.

쿠쿠르비타신(cucurbitacins)은 다른 식물 유형(즉 오이, 멜론, 수박 및 호박)뿐만 아니라 박과 식물로부터 분리된 본래 고도로 산화된 트리테르페노이드(triterpenoids)의 그룹에 포함된다.^16,17 지금까지, 식물에서 40 가지 이상의 네이티브(native) 쿠쿠르비타신 및 이들의 유사체가 분리되었으며,¹⁵ 특별한 조사를 받은 쿠쿠르비타신 B, E, D, 및 I는 식물에 상대적으로 풍부하게 존재하기 때문이다.¹⁶ 쿠쿠르비타신은 생물학적 및 약제학적 작용, 항-암, 항-염증, 간 보호, 산화 방지제 및 세포독성 작용 등의 넓은 범위에서 나타난다.^18-21 이러한 작용들은 종양, 염증, 세포 증식 및 세포 분화에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 야누스 키나제/시그널링 변환기(Janus kinase/signal transducer) 및 전사 (JAK)/STAT3 시그널링 기작의 활성화 인자(activator)를 모두 매개한다.^22-24

본 연구에서, 우리는 쿠쿠르비타신 I이 심장비대 인 비트로 모델로 제공된 페닐에프린(Phenylephrine: PE)-자극된 심근세포에서 의미 있게 감소함을 확인하였다. 또한 심장비대성 심근세포에서 CTGF, 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 및 형질전환 성장 인자-β(TGF-β)/Smad 시그널링 이벤트를 손상시켰다. 따라서 본 발명에서는 쿠쿠르비타신 I(cucurbitacin I)의 심장비대 억제제로서의 신규한 용도를 제시하고자 한다. 또한 쿠쿠르비타신 I을 포함한 약제학적 조성물을 제공하고자 한다.

본 명세서는 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용을 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 쿠쿠르비타신(cucurbitacin)을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 개발하였으며, 상기 조성물이 심근세포 및 조직 크기의 억제 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 심장비대 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 유효성분으로서 쿠쿠르비타신(cucurbitacin), 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물; 및

(b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 심장비대(cardiac hypertrophy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 쿠쿠르비타신을 포함하는 약제학적 조성물을 개발하였으며 상기 조성물이 심근세포, 조직 크기 및 섬유증의 억제 효과가 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 용어 “쿠쿠르비타신(Cucurbitacin)”은 잠재적으로 유용한 약제학적 및 생물학적 활성을 많이 나타내는 박과(Cucurbitaceae family) 식물로부터 자연적으로 생성된 트리테르페노이드(triterpenoid) 천연물을 의미한다.

본 발명에서 유효성분으로 이용되는 쿠쿠르비타신을 천연에서 분리한 것 및 인위적으로 합성한 것을 모두 포함한다.

상기 쿠쿠르비타신은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 D, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 F, 쿠쿠르비타신 G, 쿠쿠르비타신 H, 쿠쿠르비타신 I, 쿠쿠르비타신 J, 쿠쿠르비타신 K, 쿠쿠르비타신 L, 쿠쿠르비타신 O, 쿠쿠르비타신 P, 쿠쿠르비타신 Q, 쿠쿠르비타신 R, 쿠쿠르비타신 S, 쿠쿠르비타신 T 및 20 여개의 변종이 있으며, 대부분 먹었을 때 쓴맛이 나고, 세포 독성을 나타낸다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 쿠쿠르비타신은 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 D, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 F, 쿠쿠르비타신 G, 쿠쿠르비타신 H, 쿠쿠르비타신 I, 쿠쿠르비타신 J, 쿠쿠르비타신 K, 쿠쿠르비타신 L, 쿠쿠르비타신 O, 쿠쿠르비타신 P, 쿠쿠르비타신 Q, 쿠쿠르비타신 R, 쿠쿠르비타신 S 또는 쿠쿠르비타신 T 이다.

보다 구체적으로, 상기 쿠쿠르비타신은 다음 화학식 1의 쿠쿠르비타신 I이다:

화학식 1

본 발명은 심장비대(cardiac hypertrophy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 상기 쿠쿠르비타신(cucurbitacin)을 유효성분으로, 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

상기 쿠쿠르비타신에 의해 심장비대가 억제되는데, 이는 심장비대 관련 마커 유전자 또는 단백질의 발현여부 또는 발현량을 측정함으로써 확인할 수 있다.

상기 심장비대 관련 유전자는 예컨대, ANF(atrial natriureticfactor), Nppa(natriuretic peptide precursor type A), β-MHC(β-myosin heavy chain), GATA4, MYPBC3(myosin-binding protein C), TNNT2(cardiac troponin T type 2), TNNI3(cardiac troponin I type 3), TNNC1(cardiac troponin C type 1 ), TPM1(α-tropomyosin gene), MYL2(myosin regulatory light chain 2), MYL3(myosin regulatory light chain 3), ACTC(cardiac actin gene), TTN(Titin gene), PRKAG2(2-regulatory subunit of AMPK gene) 및 CLP(cardiac muscle LIM protein gene)을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에 따르면, 상기 심장비대 관련 마커 유전자는 ANF 또는 β-MHC 이다.

쿠쿠르비타신에 의한 심장비대의 억제는 또한 섬유증(fibrosis) 및 심장비대에서 중요한 원인이 되는 인자들을 억제함으로써 확인될 수 있다.

상기 섬유증은 지속적인 감염, 자가 면역 반응, 알레르기성 반응, 화학적 손상, 방사선 및 조직 손상을 포함하는 다양한 자극에 의해 유도되는 만성 염증 반응의 최종 결과이다. 섬유증은 세포외 기질의 축적 및 재구성을 특징으로 한다.

상기 섬유증 및 심장 비대의 원인이 되는 인자에는 세포의 증식, 분화 및 조직화를 촉진하는 혈소판 유래 성장인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF), 형질전환 성장인자 베타(TGF-β), 형질전환 성장인자 알파(TGF-α), 표피 성장인자(EGF), 결합 조직 성장인자(CTGF) 및 CTGF-하위(downstream) 인자인 TGF-β/Smad 및 세포 신호 전달 과정에 중요한 역할을 하는 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK)을 포함하며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 섬유증 및 심장비대에 원인이 되는 인자는 CTGF, TGF-β1, MAPK 시그널링 및 TGF-β/Smad 시그널링이다.

본 명세서의 용어“결합 조직 성장인자(CTGF)”는 CTGF(인간), Cyr61(마우스), fisp-12(마우스), Cef10(닭) 및 Nov(닭) 등을 비롯한 성장 조절제족의 한 구성원이다. CTGF의 합성 및 분비는 상기 “TGF-β/Smad”에 의해 선택적으로 유도되며 잠재적으로는 TGF-β 단백질 거대족의 다른 구성원에 의해서도 유도된다. 당업계에 보고된 바와 같이, TGF-β/Smad는 연질 아가에서 정상 섬유아세포의 증식을 촉진할 수 있지만, CTGF 단독으로는 섬유아세포에서 이러한 성질을 유도할 수 없다. 그러나 CTGF의 합성 및 작용은 TGF-β/Smad에 의한 섬유아세포의 부착-비의존성 증식 촉진에 필수적인 것으로 밝혀졌다(Kothapa lli et al., Cell Growth & Differentation , 8(1):61-68 (1997) 및 Boes et al., Endocrinology 140(4):1575-1580 (1999)). 또한 병리학적으로, CTGF 분자는 결합 조직세포의 과다증식 및 세포외 매트릭스의 과다 침착이 있는 상태에 관여하는 것으로 보고되어 있다. 또한, CTGF는 혈관 내피세포 이동 및 증식 및 혈관신생에 관련된 상태와도 연관이 있는 것으로 당업계에 기재되어 있다. 이런 상태와 관련된 질병 및 장애에는 예를 들어, 피부 및 주요 기관의 섬유증, 암 및 관련 질병 및 장애 예를 들어, 전신 경화증, 혈관형성, 아테롬성경화증, 당뇨성 신증 및 신장성 고혈압 등이 있다(Toshifumi et al., Journal of Cellular Physiology 181(1):153-159 (1999), Shimo et al., Journal of Biochemistry 126(1):137-145 (1999), Murphy et al., Journal of Biological Chemistry 274(9): 5830-5834 (1999), Wenger et al., Oncogene 18(4):1073-1080 (1999), Frzier et al., International Journal of Biochemistry & Cell Biology 29(1):153-161 (1997), Oemar et al., Circulation 95(4): 831-839 (1997)).

본 명세서의 용어 “형질전환 성장인자 베타 1(TGF-β1)”은 신호전달체계의 주요 매개 인자로 성장 및 분화를 조절하는데 중요한 역할을 한다. TGF-β1의 과발현은 심근세포의 과도한 성장으로 특징지어지는 심근비대증 및 섬유증을 초래하는 반면(Rosenkranz S, Flesch M, Amann K, Haeuseler C, Kilter H, Seeland U, et al. Alterations of betaadrenergic signaling and cardiac hypertrophy in transgenic mice overexpressing TGF-beta(1). Am J Physiol Heart Circ Physiol, 283(3):H1253-62(2002)), 중화 항체를 상용한 TGF-β1 표적 붕괴 또는 차단은 심근 비대증을 억제한다(Zhao XY, Zhao LY, Zheng QS, Su JL, Guan H, Shang FJ, et al. Chymase induces profibrotic response via transforming growth factor-beta 1/Smad activation in rat cardiac fibroblasts. Mol Cell Biochem, 310(1-2):159-66(2008)).

본 명세서의 용어“미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK)”는 MAPK 단백질의 일종인 ERK-1 및 ERK-2 단백질, JNK 또는 p38 키나아제를 인산화하는 효소 단백질로, 세포 외부의 신호를 세포핵내로 전달하는 매개체로서 중요한 역할을 한다. 구체적으로 MAPK 단백질을 인산화하여 그의 활성을 조절함으로써 세포의 성장 및 분화 등을 포함한 다양한 형태의 생리적인 변화를 유도한다. MAPK는 세포 신호전달 과정에서 ERK1/2 단백질을 인산화시켜, ERK1/2 단백질을 활성화시킨다(Marshall, C. J., Cell, 80:179 (1995)). 한편, 또 다른 MAPK 단백질의 일종인 JNK(Jun kinase) 단백질은 세포가 자외선(ultraviolet light, UV)에 노출되는 경우에 전사인자인 c-Jun을 인산화시키는 단백질로 처음 발견되었다(Hibi, M. et al.,Genus Dev., 7:2135 (1993)). 가장 최근에 알려진 MAPK 단백질 p38 키나아제는 그람 음성균의 내부독소에 노출되는 경우 티로신 잔기가 인산화 되는 것으로 처음 밝혀졌다(Han, J. et al., Science, 265:808 (1994)). 이는 JNK 단백질과 마찬가지로 종양괴사인자, 인터루킨-1, 당지질(lipopolysaccharide, LPS) 또는 삼투압의 변화(osmotic stress) 등이 작용하여 활성화된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 쿠쿠르비타신에 의해 MAPK 시그널링이 억제되는 효과를 확인하기 위해 ERK-1/-2, JNK 및 p38 키나아제의 인산화가 감소됨을 확인한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 쿠쿠르비타신은 심장비대 억제 효과를 특징으로 하는 것으로서, 심장비대와 관련된 다양한 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 심장비대 관련 질환은 심장비대증, 심부전증, 심섬유증(cardiac fibrosis), 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 고혈압, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방 중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로는 상기 심장비대 관련 질환은 좌심실 비대증, 심부전증, 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 확장성 심근병증, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 우심실을 침범하는 심근병증, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증이며, 보다 구체적으로는 심장비대증, 심부전증 또는 심섬유증이다.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 쿠쿠르비타신은 심장비대 유전자인 ANF 및 β-MHC의 mRNA 발현을 크게 감소시키고, 섬유증 및 심장비대와 관련이 깊은 결합 조직 성장인자(CTGF), 미토겐-활성화된 단백질 키나아제(MAPK) 시그널링 및 TGF-β/Smad 시그널링을 억제하며, 결과적으로 조직의 비대 현상을 차단시켜 심장비대 관련 질환을 치료한다.

본 발명의 조성물이 심장비대 관련 질환의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 본 발명의 조성물은 단독 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 물리적 수술 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 심장비대 관련 질환을 치료할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 기작, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 예컨대 0.0001-1000 ㎎/㎏이다.

상기 조성물에 함유되는 천연물 또는 화합물의 유효 투여량 범위는 성별, 중증도, 연령, 투여방법, 표적세포 및 다양한 요소에 따라 달라질 수 있으며, 당업계의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(a) 본 발명은 쿠쿠르비타신(cucurbitacin)을 유효성분으로 포함하는 심장비대(cardiomegaly) 관련 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

(b) 심장비대 치료제로서 본 발명의 쿠쿠르비타신은 심장비대 관련 질환 치료에 있어서 성공적인 결과를 제시한다.

(c) 본 발명의 따른 쿠쿠르비타신 I을 유효성분으로 하는 심장비대 조성물은 심근비대 관련 유전자 및 유전자 시그널링을 억제함으로써 심장비대증의 치료에 기여할 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 배양된 신생아 랫트에서의 쿠쿠르비타신 I의 세포독성 효과를 보여준다. 세포 생존율은 DMSO(control) 또는 쿠쿠르비타신 I을 0.1, 0.5, 1, 5, 10 μ의 농도로 24시간(도 1a), 48시간(도 1b), 72시간(도 1c)동안 처리한 심근세포에서 측정하였다. 도 1d는 시간에 따른 각 농도에서의 세포 생존율을 보여준다. 결과는 세 개의 독립된 실험으로부터 평균 ±S.D.로 나타냈다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cu I, 쿠쿠르비타신 I(cucurbitacin I), Cont, 컨트롤(control)
도 2a 내지 도 2c는 쿠쿠르비타신 I이 PE-자극된 심근세포에서 비대성 반응을 약화시킴을 보여준다. 도 2a는 쿠쿠르비타신 I(1 μ을 전처리한 후에 PE(100 μ을 처리한 심근세포의 대표적인 사진이다. 심근세포의 근섬유분질 조직은 항-α-액틴 항체로 염색하여 가시화하였다. 근섬유분질 반응은 쿠쿠르비타신 I으로 전처리하여 완벽하게 차단되었다. 도 2b는 세포 표면 영역은 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다(n=100 세포). 스케일 바, 50 μ 도 2c는 쿠쿠르비타신 I-전처리된/PE-처리된 래트 심근세포에서 ANF 및 β-MHC mRNA 발현에 대한 정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다. 상기 RT-PCR 분석은 세 개의 독립적 시료로 3 번씩(triplicate) 실시하였다. 결과는 컨트롤 그룹과 비교하여 변화한 배수를 ±S.D.로 표현하였다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cu I, 쿠쿠르비타신 I, Cont, 컨트롤
도 3a 내지 도 3c는 쿠쿠르비타신 I이 비대성 심근세포에서 CTGF 발현 및 MAPK 시그널링을 억제함을 보여준다. 도 3a는 1, 6, 12, 및 24시간 동안 PE(100 μ로 자극한 비대성 심근세포의 CTGF mRNA 발현 레벨을 정량적 RT-PCR로 측정한 결과이다. 도 3b는 심근세포를 쿠쿠르비타신 I(1 μ으로 전처리하고, 6시간 동안 PE(100 μ로 자극하였다. 이어서, CTGF mRNA 발현 레벨을 정량적 RT-PCR에 의해 측정한 결과를 나타낸다. 도 3c는 50 ㎍의 심근세포 추출물로 CTGF 및 MAPK(ERK1/2, JNK, 및 p38) 단백질 발현 레벨을 웨스턴 블롯 분석을 통해 시험한 결과를 나타낸다. CTGF, MAPKs, 및 MAPKs의 인산화된 형태(p-ERK1/2, p-JNK, and p-p38 키나아제)의 발현 레벨을 NIH 이미지 J 소프트웨어로 밴드 밀도를 측정하여 추측한 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 컨트롤로 사용하였고, 웨스턴 블롯 분석은 3개의 독립적 시료로 3 번씩 실시하였다. 결과는 대조군에 비해 변화한 배수를 ±S.D.로 표현하였다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cont, 컨트롤; Cu I, 쿠쿠르비타신 I.
도 4은 쿠쿠르비타신 I이 비대성 심근세포에서 TGF-β/Smad 시그널링 기작을 블록킹함을 보여준다. 50 ㎍의 세포 추출물을 TGF-β 및 Smad(Smad2, 3, 및 7) 단백질 발현 레벨의 웨스턴 블롯 분석을 위하여 사용하였다. TGF-β, Smad2, 3, 및 7 및 Smad2 및 3의 인산화된 형태(p-Smad2 및 p-Smad3)의 발현 정도는 NIH 이미지 J 소프트웨어 밴드 밀도 측정하여 추측한 결과를 나타낸다. GAPDH는 로딩 컨드롤로 사용하였다. 그리고 웨스턴 블롯 분석은 세 개의 독립된 시료로 3 번씩 실시하였다. 결과는 대조군에 비해 변화한 배수를 ±S.D.로 표현하였다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cont, 컨트롤; Cu I, 쿠쿠르비타신 I.
도 5a 내지 도 5d는 쿠쿠르비타신 I의 항-비대성 영향이 CTGF-침묵, 비대성 심근세포에서 약화되는 결과를 보여준다. 도 5a는 컨트롤 또는 CTGF가 트랜스펙션된 심근세포에서 CTGF의 발현정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다. 도 5b는 스크램블된(scrambled) siRNA 또는 CTGF siRNA로 트랜스펙션하고 쿠쿠르비타신 I(1 μ을 전처리하고, 이어서 PE(100 μ노출 후의 심근세포의 대표 사진을 보여준다. 심근세포의 근섬유분질 조직은 항-α-액틴 항체로 염색하여 가시화하였다. 도 5c는 세포 표면 영역을 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정한 결과를 보여준다(n=100 세포). 스케일 바, 50 μ 도 5d는 쿠쿠르비타신 I 및/또는 PE가 처리된 스크램블된 siRNA 또는 CTGF siRNA-트랜스펙트된 심근세포에서 ANF 및 β-MHC의 mRNA 발현 정도를 정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다. 모든 실험은 세 개의 독립된 시료로 3 번씩 실시하였다. 결과는 대조군과 비교하여 변화한 배수를 ±S.D.로 표현하였다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cont, 컨트롤; Cu I, 쿠쿠르비타신 I; NS, 의미 없음(no significant).
도 6a 내지 도 6d는 쿠쿠르비타신 I의 항-비대성 영향이 TGF β1-침묵, 비대성 심근세포에서 약화되는 결과를 보여준다. 도 6a는 컨트롤 또는 TGF β1이 트랜스펙션된 심근세포에서 CTGF의 발현정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과를 보여준다. 도 6b는 스크램블된(scrambled) siRNA 또는 TGF β1 siRNA로 트랜스펙션하고 쿠쿠르비타신 I(1 μ을 전처리하고, 이어서 PE(100 μ노출 후의 심근세포의 대표 사진을 보여준다. 심근세포의 근섬유분질 조직은 항-α-액틴 항체로 염색하여 가시화하였다. 도 6c는 세포 표면 영역을 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정한 결과를 보여준다(n=100 세포). 스케일 바, 50 μ 도 6d는 쿠쿠르비타신 I 및/또는 PE가 처리된 스크램블된 siRNA 또는 TGF β1 siRNA-트랜스펙트된 심근세포에서 ANF 및 β-MHC의 mRNA 발현 정도를 정량적 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸다. 모든 실험은 세 개의 독립된 시료로 3 번씩 실시하였다. 결과는 대조군과 비교하여 변화한 배수를 ±S.D.로 표현하였다. 유의성은 two-way ANOVA로 실시하여 측정하였다. * P<0.05. Cont, 컨트롤; Cu I, 쿠쿠르비타신 I; NS, 의미 없음.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

세포 배양 및 PE 를 이용한 비대성 자극

신생아 래트 심근세포는 종래에 기술한 1 에서 2 일 올드 스프라그 돌리(old Spraque-Dawley) 래트로부터 수득하였다.²⁵ 간략하게 기술하면, 심실 조직을 효소로 분리하고, 생성된 세포 현탁액을 퍼콜(Percoll)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) 단계 구배(gradients)를 사용하여 심근세포로 농축하였다. 분리된 심근세포는 콜라겐-코팅된 배양 디쉬(dishes) 또는 커버슬립(coverslips)에 플레이팅하고, 10% 소 태아 혈청, 1% 항생제 칵테일(15240-062), 2 mM L-글루타민 및 100 μ5- 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine)(GIBCO-BRL)이 첨가된 DMEM으로 구성된 심근세포 배양액 내에서 배양하였다. 쿠쿠르비타신 I은 시그마(Sigma)로부터 구매하였고, DMSO(Sigma)에 용해시켰다. 신생아 래트 심근세포는 24 시간 동안 무 혈청 배지에 배양한 후에 아래에 기술한 바와 같이 세포 생존율 분석을 위해 쿠쿠르비타신 I을 처리하였다. 택일적으로, 상기 심근세포는 비대성 유도를 위해 지정된 시간 동안 PE(100 μ에 노출시킨 다음, 24 시간 동안 쿠쿠르비타신 I(1 μ으로 전처리하였다.

세포 생존율 분석

세포 생존율은 세포 카운팅 키드-8(CCK-8; Dojindo Laboratories) 분석을 사용하여 측정하였다. 간략하게, 신생아 래트 심근세포를 96-웰 플레이트에 2000 세포/웰의 밀도로 접종(seeding)하고 0.1, 0.5, 1, 5, 및 10 μ쿠쿠르비타신 I을 각각 트리플로 처리하였다. 24, 48, 및 72 시간 후, CCK-8 시약을 상기 배양 세포에 첨가하고, 심근세포를 추가로 4 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더기를 사용하여 450 nm로 측정하였다.

면역염색 및 세포 크기 측정

쿠쿠르비타신 I 및/또는 PE를 실험적 처리 후, 콜라겐-코팅된 커버 슬립에서 성장한 신생아 래트 심근세포를 10 분 동안 4% 파라포름알데이드를 사용하여 고정하고, 10분 동안 0.5% 트리톤 X-100을 포함한 PBS를 투과시키고, 실온에서 1 시간 동안 5% BSA로 블로킹하였다. 상기 세포를 4℃에서 α-액틴 항체(1:200으로 희석; A7811, Sigma)에 대응하는 특이적 일차 항체와 하룻밤동안 반응시키고, 이어서 실온에서 1시간 동안 Alexa 488-결합된 항-마우스 2차 항체(1:200)와 반응시켰다. 면역형광 염색은 40x 대물렌즈 및 표면 형광 필터(Olympus)가 장착된 현미경으로 관찰하였다. 세포 표면 영역은 NIH 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

정량적 실-시간(Quantitative real-time) PCR( QRT - PCR )

총 RNA를 TRI 시약(Sigma)을 사용하여 신생아 래트 심근세포로부터 분리하였다. 비대성 마커들(ANF 및 β-MHC) 및 CTGF의 mRNA 발현 수준의 측정을 위하여, 역-전사효소 반응을 올리고-DT 프라이밍(priming)과 ImProm II 역전사 효소(Promega)에 의해 실시하였다. qRT-PCR은 형광 다이(dye)인 SYBR Green(TaKara)과 TaKaRa Thermal Cycler Time System Single TP 815(TaKara)을 사용하여 실시하였다. 프라이머는 다음과 같다:

ANF 정방향 프라이머: 5’-ACCTGCTAGACCACCTAGAGG-3’,

ANF 역방향 프라이머: 5’- GCTGTTATCTTCCGTACCGG-3’;

b-MHC 정방향 프라이머: 5’-CAGACATAGAGACCTACCTTC-3’,

b-MHC 역방향 프라이머: 5’-CAGCATGTCTAGAAGCTCAGG-3’;

CTGF 정방향 프라이머: 5’-CAAGGACCGCACAGTGGTT-3’,

CTGF 역방향 프라이머: 5’-GCAGTTGGCTCGCATCATAG-3’; 및

GAPDH 정방향 프라이머: 5’-CTCTACCCACGGCAAGTTC-3’,

GAPDH 역방향 프라이머: 5’-GCCAGTAGACTCCACGACATA-3’.

웨스턴 블로팅 (Western blotting)

신생아 래트 심근세포를 쿠쿠르비타신 I 및/또는 PE를 처리하여 모으고 프로테아제 억제제 칵테일(Roche) 및 포스페타아제 억제제 칵테일(Sigma)을 포함하는 RIPA 완충액으로 용해시켰다. 단백질 균질 현탁액(homogenates)을 SDS-PAGE 겔에서 분리하고, PVDF 막(Bio-Rad)으로 이동시켰다. 1 시간 동안 5% 무-지방 스킨 밀크로 블로킹하고, 4℃에서 하룻밤 동안 CTGF(1:1000; SC-14939, Santa Cruz Biotechnology), TGF-β(1:1000; SC-146, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), extracellular regulated kinase1/2(ERK1/2 CST-9102, Cell Signaling, Beverly, USA), phosphorylated ERK1/2(p-ERK 1/2 1:1000, CST-9101, Cell Signaling), c-Jun N-terminal kinase(JNK 1:1000;CST-9252, Cell Signaling), p-JNK(1:1000; CST-9251, Cell Signaling), p38(1:1000;CST-9212, Cell Signaling), p-p38(1:1000; CST-9211, Cell Signaling), Smad2(1:1000; CST-3103, Cell Signaling), p-Smad2(1:1000; CST-3101, Cell Signaling),Smad3 (1:1000; CST-9523, Cell Signaling), p-Smad3(1:1000; CST-9520, Cell Signaling), Smad7(1:1000; 42-0400, Invitrogen), 또는 GAPDH(1:2000; ab37168, Abcam, Cambridge, MA, USA)에 대응하는 항체로 반응시켰다. 이어서, 상기 막을 적절한 HRP-결합된 이차 항체(1:10,000; rabbit, LF-SA5002; mouse, LF-SA5001; rat, LF-SA5003; AbFrontier, Seoul, South Korea)와 반응시키고, 화학 발광 기질 및 향상된 발광 키트(PerkinElmer)를 사용하여 확인하였다. 균등한 단백질 로딩은 같은 막에서 GAPDH를 프로빙하여 확인하였고, 각각의 단백질 강도는 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량하였다.

심근세포에 작은 간섭 RNA(small interfering RNA( siRNA ))의 트랜스펙션

CTGF 및 TGF-β1 siRNA 및 스크램블된 siRNA는 Dharmacon으로부터 구입하였다. 신생아 래트 심근세포는 최소 24 시간 동안 무-혈청 배지에서 배양하고, 각 siRNA(50 nM)를 제조사의 프로토콜에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 세포에 트랜스펙션하였다. 다시 24 시간 후에, 상기 심근세포를 쿠쿠르비타신 I을 전처리하고 이어서 비대성 자극을 위하여 PE에 노출시켰다.

통계 분석

모든 테이터는 ±평균(mean)S.D.로 기재하였다. 통계적 유의성은 Student's t test 또는 다중 비교를 위한 two-way ANOVA(Statview 5.0, SAS)를 사용하여 분석하였다. 모든 경우에서, P<0.05로 통계적 유의성을 고려하였다.

실험결과

배양된 신생아 래트 (rat) 심근세포에서 쿠쿠르비타신 I( cucurbitacin I)의 세포 독성 작용

배양된 신생아 래트 심근세포에서 쿠쿠르비타신 I의 세포독성 효과를 테스트하기 위해, 0.1, 0.5, 1, 5 및 10 μ의 쿠쿠르비타신 I을 24, 48 및 72시간 동안 처리한 후에 CCK-8 분석을 통해 세포의 생존율을 확인하였다. 0.1-1 μ의 쿠쿠르비타신 I에 노출시킨 심근세포의 세포 생존율에서는 시간에 따라 의미 있는 감소 효과가 유도되지 않았다(도 1a 내지 도 1c). 그러나 48 및 72시간에 대한 높은 농도(5 및 10 μ의 쿠쿠르비타신 I은 세포 생존율에 상당한 영향을 미쳤다. 예를 들어, 48 및 72시간 동안 5 μ의 화합물을 처리한 심근세포의 경우 컨트롤(DMSO-처리된)에서 배양한 값의 86% 및 74%로 각각 세포 생존율이 감소하였다. 유사한 결과로 48 및 72시간 동안에 10 μ의 화합물을 처리한 심근세포의 경우 대조군 값의 72% 및 64%로 각각 세포 생존율이 감소하였다(도 1a 내지 도 1c). 따라서, PE-자극된 심근세포에서의 비대성 반응에서 쿠쿠르비타신 I이 미치는 영향을 평가하기 위한 실험을 위하여 1 μ로 쿠쿠르비타신 I을 사용하였다.

쿠쿠르비타신 I은 PE -자극된 심근세포에서 비대성 반응을 약화시킨다.

쿠쿠르비타신 I이 심장비대를 완화할 수 있는지 확인하기 위하여, 신생아 래트 심근세포에 쿠쿠르비타신 I(1 μ을 첨가 또는 무첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 이어서 24시간 동안 상기 세포에 PE(100 μ를 추가로 처리하였다. 심근세포의 비대성 반응은 세포 크기 증가 및 확연한 근섬유분질(sarcomeric) 재배열, 비대성 마커들(예를 들어, ANF 및 β-ΝΘC)의 발현 유도의 특징이 있다. α-액틴 항체의 면역형광 염색은 베히클(vehicle)-처리된 컨트롤에 비해 PE-처리된 심근세포에서 근섬유분질 재배열과 눈에 띄게 더 큰 세포가 나타났다. 한편, 쿠쿠르비타신 I-전처리된/PE-처리된 심근세포에서는 세포 크기 증가 및 근섬유분질 재배열이 나타나지 않았다(도 1b). 또한, 세포 표면 영역의 정량은 베히클-처리된 컨트롤과 비교하여 PE-처리된 심근세포의 크기가 2.8-배 증가하였다. 그러나, 이러한 증가는 PE-처리된 세포에 쿠쿠르비타신 I를 전처리하였을 때 의미 있게 역전되었다.(도 1b).

정량적 RT-PCR은 ANF 및 β-MHC의 mRNA 발현이 컨트롤 세포와 비교하여 PE-처리된 세포에서 증가하는 결과가 추가로 나타났다. 그럼에도 불구하고, 상기 증가된 발현 레벨은 쿠쿠르비타신 I을 전처리한 경우 다시 의미 있게 억제되었다(도 1c). 종합적으로, 이러한 결과는 쿠쿠르비타신 I이 PE-자극된 심근세포의 비대성 반응을 예방할 수 있음을 보여준다.

쿠쿠르비타신 I은 PE -자극된 심근세포에서 CTGF 와 MAPK 시그널링을 억제한다.

CTGF는 결정적으로 심장비대의 진행에 관여하기 때문에, 본 발명자는 쿠쿠르비타신 I이 CTGF 발현/시그널링의 조절을 통해 심근세포에서 보호 작용 역할을 할 수 있음을 추론하였다. 상기 비대성 진행 동안에 CTGF 발현 프로필에서 쿠쿠르비타신 I의 영향을 실험하기 위하여, 신생아 래트 심근세포를 24시간 동안 쿠쿠르비타신 I(1 μ이 있는 조건 또는 없는 조건에서 배양하고, 다시 6시간 동안 PE(100 μ로 반응시키고, 정량 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, CTGF mRNA 발현 레벨은 쿠쿠르비타신 I이 없는 조건에서 PE를 추가하고 6시간 후에 가장 높은 레벨이 관찰된 PE-자극된 심근세포에서 점차 증가하였다(베히클-처리된 컨트롤 세포와 비교하여 1.5-배 증가; 도 2a). 이러한 증가는 쿠쿠르비타신 I에 의해 완벽하게 차단되었다; 또한 상기 화합물은 컨트롤 세포에서 GTGF mRNA 레벨을 감소시켰다(도 2b). 유사하게, 면역 분석으로 쿠쿠르비타신 I이 컨트롤 및 PE-처리된 세포에서 GTGF 단백질 레벨을 감소시킴을 확인하였다(도 2c).

종래의 연구는 심장 비대의 발병이 다수의 MAPKs 활성에 따라 달리 나타났고¹⁷, 최근 연구에서 CTGF가 ERK1/2, JNK, 및 p38 키나아제를 포함한 다수의 MAPKs를 활성화함을 검증하였다.¹⁸ 따라서, 쿠쿠르비타신 I은 비대성 심근세포에서 상기 MAPKs의 활성을 의미 있게 억제할 수 있다. 이러한 가설을 확인하기 위하여, ERK1/2, JNK 및 p38 키나아제에 대한 포스포-특이적 항체로 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다. 베히클-처리된 컨트롤 세포와 비교하여 PE-처리된 세포에서, p-ERK1/2, p-JNK 및 p-p38 키나아제 발현 정도가 각각 2.2-배, 9.5-배, 1.6-배 증가하는 것이 관찰됨으로서 세 개 모두의 MAPKs의 인산화는 PE-자극된 심근세포에서 의미 있게 증가되었다. CTGF의 접촉으로 관찰된 효과에 따라, PE-유도된 MAPK 인산화는 쿠쿠르비타신 I을 전처리한 경우 극적으로 감소하였다(도 2c). 따라서, 쿠쿠르비타신 I은 CTGF 접촉으로 유발된-비대 증가 및 PE-처리된 심근세포에서 MAPKs의 인산화-유도 활성을 효율적으로 억제한다.

쿠쿠르비타신 I은 비대성 심근세포에서 TGF -β/ Smad 섬유증 시그널링 기작을 차단한다.

TGF-β/Smad 시그널링 기작은 보고되기로 심장비대 및 심장섬유증의 진행에 기여한다.¹⁹ 따라서 본 발명자들은 쿠쿠르비타신 I이 PE-처리된 심근세포에서 TGF-β/Smad 시그널링 기작을 부정적으로 조절할 수 있음을 가정하여 연구하였다. 웨스턴 블롯 분석은 컨트롤 심근세포에 비해 PE-처리된 심근세포에서 TGF-β 발현이 2-배 높음을 나타낸다. 그러나 PE-유도된 TGF-β 레벨의 증가는 쿠쿠르비타신 I을 전처리함으로써 억제되었다(도 3). 동일한 방식으로, Smad2 및 3의 인산화는 PE-처리된 심근세포에서 의미 있게 상향 조절되었지만, 이러한 상향 조절은 쿠쿠르비타신 I을 전처리함으로써 예방되었다(도 3). 대조적으로 TGF-β/Smad 시그널링의 부정적인 조절자인, Smad7의 발현 정도는 PE를 처리한 또는 처리하지 않은 그리고 쿠쿠르비타신 I을 전처리한 심근세포에서 의미 있게 증가되었다. 반면에, Smad 7 레벨은 쿠쿠르비타신 I 처리 없이 PE-처리된 세포에서 변화 없이 유지되었다(도 3). 이러한 결과는 쿠쿠르비타신 I이 비대성 심근세포에서 TGF-β/Smad 시그널링 기작을 억제한다는 것을 나타낸다.

쿠쿠르비타신 I의 항 비대성 작용은 CTGF -침묵(silenced) 또는 TGF -β1-침묵 PE -처리된 심근세포에서 둔화된다 .

CTGF 시그널링이 쿠쿠르비타신 I의 항-비대성 작용을 위해 필요한지를 추가로 확인하기 위해서, CTGF 발현을 신생아 래트 심근세포에서 침묵(silenced)시켰다. CTGF-siRNA를 트랜스펙션시켰을 때 감소되는 CTGF 발현정도를웨스턴 블롯 분석을 통해 나타냈다(도 5a). 상기 CTGF-침묵 세포를 쿠쿠르비타신 I으로 전처리 및 PE로 자극하였다. CTGF 발현은 CTGF에 대한 siRNA의 트랜스펙션에 의해 폐지되었다. 일관되게, 상기 비대성 반응(확대된 세포 크기 및 ANF 및 β-MHC의 높은 발현에 의해 결정된)이 스크램블된 siRNA-트랜스펙션된, PE-처리된 세포와 비교하여 CTGF siRNA-트랜스펙션된, PE-처리된 심근세포에서 의미 있게 줄어들었다(도 5b, 5c, 및 5d). 또한, 쿠쿠르비타신 I은 CTGF siRNA-트랜스펙션된, PE-처리된 세포에서 항 비대성제로서 더 이상 효과가 없었으며, 세포 크기(도 5b, 및 5c) 또는 ANF 및 β-MHC 함량(도 5d)을 줄이는 것 또한 실패하였다. 유사한 연구에서, TGF-β1-침묵 세포를 또한 쿠쿠르비타신 I으로 전처리하고 이어서 PE 자극을 처리하였다. 그 결과, 의미있게 TGF-β1 siRNA를 트랜스펙션한 곳에서 비대성 반응이 억제되었다(도 6). 쿠쿠르비타신 I의 항-비대성 작용은 또한 TGF-β1 siRNA를 트랜스펙션하고 PE-처리한 세포에서 떨어지는 것을 발견하였다(도 6). 이러한 발견은 적어도 부분적으로는, CTGF 및 TGF-β1 발현/시그널링이 배양된 심근세포에 쿠쿠르비타신 I의 항-비대성 특성을 매개한다는 것을 제시한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (8)

1. (a) 유효성분으로서 쿠쿠르비타신(cucurbitacin), 그의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 또는 수화물; 및
   (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 심장비대(cardiac hypertrophy) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신은, 쿠쿠르비타신 A, 쿠쿠르비타신 B, 쿠쿠르비타신 C, 쿠쿠르비타신 D, 쿠쿠르비타신 E, 쿠쿠르비타신 F, 쿠쿠르비타신 G, 쿠쿠르비타신 H, 쿠쿠르비타신 I, 쿠쿠르비타신 J, 쿠쿠르비타신 K, 쿠쿠르비타신 L, 쿠쿠르비타신 O, 쿠쿠르비타신 P, 쿠쿠르비타신 Q, 쿠쿠르비타신 R, 쿠쿠르비타신 S, 쿠쿠르비타신 T인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신은 다음 화학식 1의 쿠쿠르비타신 I인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물:
   화학식 1
   

   

   
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신 I은 심장비대 관련 마커 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 심장비대 억제 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 심장비대 관련 마커 유전자는 ANF(atrial natriureticfactor) 또는 β-MHC(β-myosin heavy chain)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
6. 제 3 항에 있어서, 상기 쿠쿠르비타신 I은 CTGF, TGF-β1 및 MAPK 시그널링 작용 및 TGF-/Smad 시그널링 기작을 억제하는 것을 특징으로 하는 심장비대 억제 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 심장비대 관련 질환은 심장비대증, 심부전증, 심섬유증(cardiac fibrosis), 승모판막 폐쇄부전증, 대동맥판막 폐쇄부전증, 고혈압, 확장성 심근병증, 허혈성 심장 질환, 심실 중격 결손증, 삼첨판막 폐쇄부전증, 폐동맥판막 폐쇄부전증, 폐동맥 고혈압, 우심실 심근경색, 우심실을 침범하는 심근병증, 심방중격 결손증, 심방 세동, 비후성 심근증 또는 침윤성 심근증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   
8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 심근세포의 크기 증가 및 심장비대를 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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