EA020335B1 - МИКРО-РНК (mi-РНК) И МИШЕНИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ - Google Patents

МИКРО-РНК (mi-РНК) И МИШЕНИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ Download PDF

Info

Publication number
EA020335B1
EA020335B1 EA201070992A EA201070992A EA020335B1 EA 020335 B1 EA020335 B1 EA 020335B1 EA 201070992 A EA201070992 A EA 201070992A EA 201070992 A EA201070992 A EA 201070992A EA 020335 B1 EA020335 B1 EA 020335B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
fibrosis
modified oligonucleotide
modified
rna
nucleic
Prior art date
Application number
EA201070992A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201070992A1 (ru
Inventor
Томас Тум
Йоханн Бауэрзахс
Штефан Энгельхардт
Карина Гросс
Original Assignee
Юлиус Максимилианс-Универзитет Вюрцбург
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Юлиус Максимилианс-Универзитет Вюрцбург filed Critical Юлиус Максимилианс-Универзитет Вюрцбург
Publication of EA201070992A1 publication Critical patent/EA201070992A1/ru
Publication of EA020335B1 publication Critical patent/EA020335B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/06—Antiarrhythmics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3233—Morpholino-type ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/345—Spatial arrangement of the modifications having at least two different backbone modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3517—Marker; Tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy

Abstract

Изобретение относится к промоторной области микро-РНК, к применению микро-РНК, в частности miR-21, и родственных элементов в диагностике и производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Кроме того, данное изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам против мишеней miR-21. Изобретение охватывает также клетки, дефицитные в отношении miR-21, дефицитные в отношении промоторной области и мишеней miR-21, а также организмы, нокаутные в отношении miR-21. Наконец, данное изобретение относится к способу диагностики фиброза и/или родственных фиброзу или связанных с фиброзом заболеваний и к способу скрининга фармацевтически активного соединения для лечения фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Кроме того, данное изобретение относится к композициям для лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции направлены на модуляцию активности miR-21 с целью лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции направлены на ингибирование активности miR-21 с целью лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза.

Description

(57) Изобретение относится к промоторной области микро-РНК, к применению микро-РНК, в частности ηιίΚ-21, и родственных элементов в диагностике и производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Кроме того, данное изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам против мишеней гшК-21. Изобретение охватывает также клетки, дефицитные в отношении гшК-21, дефицитные в отношении промоторной области и мишеней гшК-21, а также организмы, нокаутные в отношении гшК-21. Наконец, данное изобретение относится к способу диагностики фиброза и/или родственных фиброзу или связанных с фиброзом заболеваний и к способу скрининга фармацевтически активного соединения для лечения фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Кроме того, данное изобретение относится к композициям для лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции направлены на модуляцию активности πιίΚ-21 с целью лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанные композиции направлены на ингибирование активности гшК.-21 с целью лечения, улучшения состояния при фиброзе и/или профилактики фиброза.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области микро-РНК (т1-РНК), в частности тгК-21, и ее мишеням сигнального пути для диагностики, профилактики и/или терапии фиброза и других заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, способам и применениям для лечения фиброза. Такие способы включают модуляцию и ингибирование активности ιηί-РНК у индивида, страдающего фиброзом.
Уровень техники
Микро-РНК представляют собой широкий класс низкомолеклярных некодирующих РНК, которые контролируют различные биологические процессы, в том числе основные пути передачи сигналов, за счет регуляции экспрессии комплементарных мРНК-мишеней (АтЬгок, 2004). Нарушение регуляции микро-РНК при различных нозологических формах вызвано изменениями в геноме (Μι с1 а1., 2007), дифференциальной экспрессией или вирусными инфекциями, в некоторых случаях изменяющими функцию микро-РНК опухолевых супрессоров или онкогенов. В настоящее время в целой серии несложных генетических исследований было показано, что микро-РНК вовлечены в регуляцию разнообразных сердечных функций (Саге с1 а1., 2007; Уапд с1 а1., 2007). Несмотря на то что указанные исследования помогают обрисовать роль микро-РНК в сердечной физиологии, росте и морфогенезе, подробные молекулярные механизмы микро-РНК путей развития заболеваний ίη νίνο не до конца понятны. Было показано, что одноцепочечные олигонуклеотидные микро-РНК-антагонисты могут выключить эндогенные микро-РНК ίη νίίτο и ίη νίνο, вызывая эффекты в отношении мРНК-мишени, а также в отношении уровней и метаболизма белков (1<гие1хГе1й1 е1 а1., 2005; Екай е1 а1., 2006). Указанные обнаружения наводят на мысль о возможности использования антагонистов микро-РНК для подтверждения функции микро-РНК ίη νίνο и, возможно, еще более важно, в качестве новой терапевтической тактики лечения.
Краткое содержание изобретения
Настоящее изобретение относится к промоторной области микро-РНК, к применению микро-РНК, в частности тЖ.-21, и соответствующих элементов для диагностики и производства лекарственного средства для лечения и/или профилактики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Кроме того, настоящее изобретение относится к различным антисмысловым олигонуклеотидам против мишеней тгК.21. Изобретение также касается клеточного дефицита тгК.-21, дефицита промоторной области и мишеней тгК-21, а также организмов с нокаутом шгК.-21. Наконец, настоящее изобретение относится к способам диагностики фиброза и/или связанных с фиброзом или имеющих отношение к фиброзу заболеваний и к способам скрининга фармацевтически активного соединения для лечения фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний.
Настоящее изобретение относится к способам лечения фиброза, включающим введение индивиду с диагнозом фиброз или у которого подозревают фиброз соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную т1-РНК.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию больного с фиброзом или индивида с подозрением на наличие фиброза и введение указанному индивиду соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, при этом последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна т1-РНК или ее предшественнику.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим введение индивиду, подверженному риску развития фиброза, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную т1-РНК или ее предшественнику, таким образом, предотвращая развитие фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз печени. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз легких. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз кожи. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз у пожилых людей. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз сердца. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз почек. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз селезенки.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим введение индивиду, страдающему фиброзом, или индивиду с подозрением на наличие фиброза, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна т1-РНК или ее предшественнику, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно нарушение или заболевание сердца.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию больного с фиброзом или индивида с подозрением на фиброз, где у указанного индивида имеется по меньшей мере одно нарушение или заболевание сердца; и введение указанному индивиду соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, при этом последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна т1РНК или ее предшественнику.
- 1 020335
В некоторых вариантах осуществления нарушение или заболевание сердца выбрано из группы, состоящей из гипертрофии сердца, гипертензивной сердечной недостаточности, диастолической сердечной недостаточности, систолической сердечной недостаточности, сердечных болезней накопления, кардиомиопатии, констриктивного перикардита, болезни коронарных артерий, острого инфаркта миокарда, хронического инфаркта миокарда, недостаточности правых отделов сердца, сердечной аритмии, связанного с миокардитом фиброза и нарушения сердечного клапана.
В некоторых вариантах осуществления кардиомиопатия выбрана из группы, состоящей из дилятационной кардиомиопатии, гипертрофической кардиомиопатии с обструкцией, гипертрофической кардиомиопатии без обструкции, рестриктивной кардиомиопатии, кардиомиопатии правого желудочка с нарушением ритма и диабетической кардиомиопатии.
В некоторых вариантах осуществления нарушения сердечного клапана выбраны из группы, состоящей из стеноза митрального клапана, стеноза аортального клапана, стеноза трехстворчатого клапана и стеноза легочного клапана.
В некоторых вариантах осуществления нарушения сердечного клапана выбраны из группы, состоящей из недостаточности митрального клапана, недостаточности аортального клапана, недостаточности трехстворчатого клапана и недостаточности легочного клапана.
В некоторых вариантах осуществления представленные в настоящем описании способы дополнительно включают введение одного или нескольких дополнительных фармацевтических средств.
В некоторых вариантах осуществления указанное введение уменьшает увеличение веса сердца, расширение левого желудочка или расстройство фракции укорочения.
В некоторых вариантах осуществления указанное введение предотвращает увеличение веса сердца, расширение левого желудочка или расстройство фракции укорочения.
В некоторых вариантах осуществления указанное введение улучшает сердечную функцию.
В некоторых вариантах осуществления указанное введение включает внутривенное введение, подкожное введение, внутриартериальное введение или внутрисердечное введение.
Настоящее изобретении относится к способам лечения фиброза, включающим введение индивиду, страдающему фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна ηί-РНК или ее предшественнику, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию больного с фиброзом или индивидуума с подозрением на фиброз, причем у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени; и введение указанному индивиду соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, при этом последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени представляет собой хроническое повреждение печени. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени представляет собой вирусный инфекционный гепатит. В некоторых вариантах осуществления инфекционный гепатит представляет собой вирусный инфекционный гепатит С. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени представляет собой неалкогольный стеатогепатит. В некоторых вариантах осуществления указанное введение включает внутривенное введение или подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени представляет собой цирроз. В некоторых вариантах осуществления указанное введение улучшает функцию печени.
Настоящее изобретение относится к способам лечения фиброза, включающим введение индивиду, страдающему фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние легких.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию больного с фиброзом или индивида с подозрением на фиброз, причем у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние легких; и введение указанному индивиду соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, причем последовательность модифицированного олигонуклеотида комплементарна ηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние легких представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких. В некоторых вариантах осуществления указанное введение включает пульмональное введение.
Настоящее изобретение относится к способам лечения фиброза, включающим введение индивиду, страдающему фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов и имеющий после
- 2 020335 довательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние.
Настоящее изобретение относится к способам, включающим идентификацию больного с фиброзом или индивида с подозрением на фиброз, где указанный индивид имеет по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние легких; и введение указанному индивиду соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, причем последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние представляет собой легочную гипертензию. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно другое заболевание или состояние представляет собой заболевание, связанное с кровеносными сосудами. В некоторых вариантах осуществления указанное заболевание, связанное с кровеносными сосудами, выбрано из группы, состоящей из артериальной ригидности, медиасклероза и артериосклероза. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние представляет собой склероз пищеварительного канала. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние представляет собой склеродермию. В некоторых вариантах осуществления указанное по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние выбрано из группы, состоящей из ретроперитонеального фиброза, пролиферативного фиброза, неопластического фиброза, нефрогенного системного фиброза, инъекционного фиброза, медиастинального фиброза, миелофиброза, пост-вазэктомического болевого синдрома, ревматоидного артрита.
В некоторых вариантах осуществления указанное введение улучшает состояние при фиброзе. В некоторых вариантах осуществления указанное введение замедляет дальнейшее прогрессирование фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанное введение останавливает дальнейшее прогрессирование фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанное введение ослабляет фиброз. В некоторых вариантах осуществления указанное введение уменьшает содержание коллагена.
Настоящее изобретение относится к способам лечения фибропролиферативного расстройства, включающим введение индивиду, страдающему фибропролиферативным расстройством или с подозрением на наличие фибропролиферативного расстройства, соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, причем последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику, таким образом, осуществляя лечение фибропролиферативного расстройства.
В некоторых вариантах осуществления введение включает внутривенное введение, подкожное введение, пульмональное введение, внутриартериальное введение или внутрисердечное введение.
Настоящее изобретение относится к способам ингибирования пролиферации фибробластов, включающим приведение фибробластов в контакт с соединением, содержащим модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику, таким образом, осуществляя ингибирование пролиферации фибробластов.
Настоящее изобретение относится к способам стимуляции апоптоза фибробластов, включающим приведение фибробластов в контакт с соединением, содержащим модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику, таким образом, осуществляя стимуляцию апоптоза фибробластов.
Настоящее изобретение относится к способам повышения уровня белка 8ргон1у-1 в фибробластах, включающим приведение фибробластов в контакт с соединением, содержащим модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηί-РНК или ее предшественнику, таким образом, осуществляя стимуляцию экспрессии белка 8ргоШу-1.
Настоящее изобретение относится к композициям для ингибирования микро-РНК. В некоторых вариантах осуществления указанная ιηί-РНК представляет собой ιηίΡ-21. В некоторых вариантах осуществления указанный модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную последовательности нуклеиновых оснований, которая по меньшей мере на 80% идентична ιηίΡ-21 или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления ιηίΡ-21 имеет последовательность нуклеиновых оснований, представленную в виде 8ЕО Ш N0: 1. В некоторых вариантах осуществления предшественник ιηίΡ-21 имеет последовательность нуклеиновых оснований, представленную в виде 8ЕО Ш N0: 11.
В некоторых вариантах осуществления указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олиго- 3 020335 нуклеотид состоит из 15-24 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 соединенных друг с другом нуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет не более чем два несовпадения с последовательностью нуклеиновых оснований щтК.-21 или ее предшественником. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет не более чем одно несовпадение с последовательностью нуклеиновых оснований шЖ.-21 или ее предшественником. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида не имеет несовпадений с последовательностью нуклеиновых оснований тЖ.-21 или ее предшественником.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8ЕО Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 16 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8Еф Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 17 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8Еф Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 18 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8Еф Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8Еф Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований 8Е0 Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 21 смежное нуклеиновое основание последовательности нуклеиновых оснований 8Е0 Ш N0: 12. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 22 смежных нуклеиновых основания последовательности нуклеиновых оснований 8Е0 Ш N0: 12.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида состоит из последовательности нуклеиновых оснований 8Е0 Ш N0: 12.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, конъюгированный с лигандом. В некоторых вариантах осуществления оно имеет структуру (III) (5' ) (III) в которой каждое 0 независимо представляет собой 2'-0-метил-модифицированный нуклеозид; х представляет собой одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О; у представляет собой
О
II
- 4 020335 каждый из ζ1, ζ2, ζ3 и ζ4 независимо представляет собой х или у; п=6-17;
Ь представляет собой
в которой X представляет собой Ы(СО)К7 или ΝΚ7;
каждый из К1, Я3 и Я9 независимо представляет собой Н, ОН или -СН2ОЯЬ, при условии, что по
9 13 9 меньшей мере один из Я , Я и Я представляет собой ОН и по меньшей мере один из Я , Я и Я представляет собой -СН2ОЯЬ;
Я7 представляет собой Я1 или С1-С20-алкил, замещенный ΝΒΟΒ'1 или ΝΗ^Ο^0;
Яс представляет собой Н или С1-С6-алкил;
Я1 представляет собой углеводный радикал или стероидный радикал, который необязательно привязан по меньшей мере к одному углеводному радикалу;
Яь представляет собой
одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О.
В некоторых вариантах осуществления Я4 представляет собой холестерин. В некоторых вариантах осуществления каждый из ζ1, ζ2, ζ3 и ζ4 представляет собой
В где одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О.
В некоторых вариантах осуществления Я1 представляет собой -СН2ОЯЬ В некоторых вариантах осуществления Я9 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления Я1 и Я9 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления Я1 и Я3 представлены в трансконфигурациях. В некоторых вариантах осуществления Я3 представляет собой -СН2ОЯЬ. В некоторых вариантах осуществления Я1 является ОН. В некоторых вариантах осуществления Я1 и Я3 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления Я3 и Я9 представлены в трансконфигурациях. В некоторых вариантах осуществления Я9 представляет собой -СН2ОЯЬ. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой NС(Ο)Я7. В некоторых вариантах осуществления Я7 представляет собой -СΗ2(СΗ2)3Сн2NΗС(Ο)Яά.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах осуществления множество нуклеозидов содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид содержит модифицированный сахар. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид содержит 2'-Ометоксиэтил-сахар. В некоторых вариантах осуществления каждый из множества нуклеозидов содержит 2'-О-метоксиэтил-сахар, и каждый из множества нуклеозидов содержит 2'-фтор-сахар. В некоторых вариантах осуществления каждый модифицированный сахар независимо выбран из 2'-О-метоксиэтил-сахара, 2'-фтор-сахара, 2'-О-метил-сахара или бициклического фрагмента сахара. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание. В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5метилцитозин. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид содержит цитозин, где указанный цитозин является 5-метилцитозином. В некоторых вариантах осуществления каждый цитозин является 5-метилцитозином.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является по меньшей мере на 90% комплементарной последовательности нук
- 5 020335 леиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является по меньшей мере на 95% комплементарной последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является на 100% комплементарной последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет полноразмерную комплементарность последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 90% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 11. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 95% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 11. В некоторых вариантах осуществления модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 11. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований тЖ-21 состоит из последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 1. В некоторых вариантах осуществления предшественник последовательности нуклеиновых оснований состоит из последовательности нуклеиновых оснований 8ЕС ΙΌ N0: 11.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, получено в виде фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид получен в виде фармацевтической композиции.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид представляет собой одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Настоящее изобретение относится к композициям для применения при лечении, профилактике и/или улучшении состояния при фиброзе. Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям, содержащим модифицированные олигонуклеотиды, имеющие последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную Ш1-РНК, для применения при лечении, профилактике и/или улучшении состояния при фиброзе.
Настоящее изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, комплементарным шЖ-21, для производства лекарственного средства для лечения и/или предотвращения фиброза.
Настоящее изобретение относится к антисмысловым олигонуклеотидам, комплементарным шЖ-21, для применения при лечении и/или профилактике фиброза.
Настоящее изобретение относится к применению Ш1К-21 и/или антисмыслового олигонуклеотида против тЖ-21 для лечения фиброза.
Настоящее изобретение относится к применению Ш1К-21 и/или антисмыслового олигонуклеотида против ш1В-21 для диагностики фиброза.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Дизрегуляция ш1В-21 при кардиологическом заболевании и предоминантная экспрессия в сердечных фибробластах.
(a) Анализ экспрессии микро-РНК с помощью микрочипов. РНК выделяли из левого желудочка миокарда мышиной модели сердечной недостаточности (мыши β 1ЛВ-ТС) на ранней (трехмесячный возраст), умеренной (шестимесячный возраст) и поздней стадиях (двенадцатимесячный возраст) сердечной недостаточности. Экспрессия представлена в виде кратной регуляции по сравнению с таковой у контрольных животных дикого типа. Ш1К-21 отмечена красным цветом. Данные представлены на основе 3-4 независимых гибридизаций на группу.
(b) Слева назерн-блот-анализ экспрессии Ш1К-21 на различных стадиях сердечной недостаточности у мышей β 1ЛВ-ТС. Справа количественный анализ данных из расположенной выше панели.
(c) Слева назерн-блот-анализ экспрессии тЖ-21 у человека с отсутствием недостаточности и с недостаточностью левого желудочка миокарда. Справа количественный анализ зрелой формы тЖ-21 у человека с отсутствием недостаточности и с недостаточностью левого желудочка миокарда.
(б) Вверху неонатальные кардиомиоциты, окрашенные 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (ΌΑΡΙ) и антителом против α-актинина, после трансфекции скремблированной шЖ (контроль - пре-шЖ, 50 нМ, 72 ч), синтетической тЖ-21 (пре-тЖ-21. 50 нМ, 72 ч) и ингибитором тЖ-21 (анти-тЖ-21. 50 нМ, 72 ч). Кардиомиоциты культивировали в контролируемых условиях (см. вспомогательные методы) или стимулировали ЕС8 (5%) в течение 48 ч. Внизу количественный анализ размеров индивидуальных кардиомиоцитов (анализ гистограммы). N>200 кардиомиоцитов было проанализировано на группу.
(е) Вверху получение трансгенных мышей, экспрессирующих шЖ-21 под контролем альфа-МНСпромотора. Посередине назерн-блоттинг зрелой шЖ-21 у мышей дикого типа (^Т) и у трансгенных (ТС) животных. Внизу поперечные срезы участков сердца мышей дикого типа и шЖ-21-трансгенных мышей, окрашенные с целью определения общей морфологии (окрашивание гематоксилин-эозином) и отложе
- 6 020335 ний коллагена (сириус красный).
(ί) Экспрессия т1В-21 в сердечных фибробластах и кардиомиоцитах. Анализы назерн-блоттинга (вверху) и количественной ПЦР в масштабе реального времени (внизу). Все отрезки, характеризующие значение погрешности, означают 8ЕМ (стандартная ошибка среднего). п=3-6 для а-ί.
Фиг. 2. Ингибирование 8ргон1у-1 через ιηίΡ-21 приводит к дерепрессии передачи сигнала ЕВК и повышает выживаемость фибробластов.
(а) Сердца, полученные из организма мышей 8рту1Ьас2 +/-, окрашивали, используя Х-да1. Макроскопический (вверху) и микроскопический (внизу) анализы обнаруживают детектирование Ьас2 в сердечных фибробластах. Короткий черный отрезок соответствует 100 мкм. Большой черный отрезок соответствует 10 мкм.
(Ь, с) Вверху детектирование 8ΡΒΥ1, ЕВК1/2 и фосфо-ЕВК1/2 у человека с недостаточностью левого желудочка (Ь) и после трансфекции совместно культивируемых кардиомиоцитов и фибробластов со скремблированной микро-РНК (отрицательный контроль #2 пре-ш1В™, 50 нМ, 72 ч), синтетической Ш1В21 (пре-ш1В-21, 50 нМ, 72 ч) или с ингибитором Ш1В-21 (анти-ш1В-21, 50 нМ, 72 ч). Внизу результаты количественного анализа вестерн-блоттинга.
(б) Вверху детектирование 8ΡΒΥ1, ЕВК1/2 и фосфо-ЕВК1/2 после ЦРНК-опосредованного нокдауна 8ΡΒΥ1 (150 нМ, 72 ч) или обработки скремблированной ЦРНК (150 нМ, 72 ч) совместно культивируемых кардиальных клеток. Внизу результаты количественного анализа вестерн-блоттинга.
(е) Вверху БАС8-анализ аннексин У-положительных кардиальных фибробластов после обработки скремблированной микро-РНК (контроль пре-ш1В, 100 нМ, 72 ч), синтетической Ш1В-21 (пре-ш1В-21, 100 нМ, 72 ч), обработки антагонистами Ш1В-21 (анти-ш1В-21, 100 нМ, 72 ч) или соответствующими контролями (100 нМ, 72 ч). Внизу количественный анализ аннексин У-положительных клеток после соответствующих обработок.
(ί) Вверху концентрация ФРФ-2 в супернатантах культивируемых кардиальных фибробластах после обработки скремблированной микро-РНК (контроль пре-ш1В, 100 нМ, 72 ч), синтетической Ш1В-21 (преШ1В-21, 100 нМ, 72 ч) или обработки антагонистами Ш1В-21 (анти-т1В-21, 100 нМ, 72 ч) или (внизу) после 81РНК-опосредованного нокдауна 8ΡΒΥ1 (150 нМ, 72 ч) или обработки скремблированной м-РНК (150 нМ, 72 ч). Все отрезки, характеризующие значение погрешности, означают 8ЕМ. п=3-6 для а-ί.
Фиг. 3. Терапевтический сайленсинг Ш1В-21 ίη νίνο предотвращает фиброз сердца и сердечную недостаточность.
(a) Вверху детектирование методом флуоресцентной микроскопии Су3 и ΌΑΡΙ, окрашенных в ткани левого желудочка сердца после инъекции Су3-меченного модифицированного олигонуклеотида через яремную вену. Контроли получены путем инъекций РВ8. Внизу мышам, подвергнутым трансаортальной констрикции (ТАС) или ложной операции, делали контрольные инъекции (РВ8, 200 мкл) или инъекции антагониста Ш1-РНК, ап1адотп-21 (200 мкл; 80 мг/кг/день), через 24 ч после операции и в последующие три дня.
(b) Вверху назерн-блот-анализ экспрессии т1В-21 у необработанных мышей (контроль) и мышей, обработанных ап1адотп-21, после ТАС. Внизу количественный анализ экспрессии кардиального т1В-21.
(c) Вверху вестерн-блот-анализ 8ΡΒΥ1, ЕВК1/2 и фосфо-ЕВК1/2 у мышей после ложной операции или после ТАС, обработанных либо как в контроле, либо обработанных ап1адотл-21. Экспрессия С-бета была приведена в качестве контроля [генов] домашнего хозяйства. Внизу количественный анализ результатов Вестерн-блоттинга.
(б) Кардиальные срезы после окрашивания сириусом красным, предназначенные для детектирования миокардиального фиброза у мышей, обработанных как в контроле, и у мышей, обработанных ап1адотй-21.
(е) Количественный анализ миокардиального фиброза (слева) и отношения веса сердца к весу тела (справа) у мышей, обработанных как в контроле, и у мышей, обработанных антагонистом ап1адотп-21.
(ί) Вверху глобальный анализ транскриптома мышиного генома в сердечной ткани мышей после операции или ложной операции или после ТАС, обработанных либо как в контроле, либо обработанных антагонистом ап1адо1шг-21. Красными (зелеными) блоками показана статистическая значимость (р<0,05) индуцированных (репрессированных) генов. Внизу нормализация повышенной регуляции генов, кодирующих белки, участвующие в образовании фиброза миокарда после ТАС под действием обработки антагонистом ап1адотй-21.
(д) Эхокардиографический анализ. БУЭ. диаметр левого желудочка (1ей уеп1г!сн1аг б1аше1ет); Б8, фракция укорочения (Тгасбопа1 кйойешпд).
(11) Предложенный механизм, лежащий в основе депрессии передачи сигнала сердечной ЕВК (внеклеточная сигнал-регулируемая киназа) через т1В-21-опосредованное ингибирование 8ΡΒΥ1. Все отрезки, характеризующие значение погрешности, означают 8ЕМ. п=3-6 для а-д.
Фиг. 4. Регуляция транскрипции т1В-21.
(a) Консервативность последовательности внутри областей промотора т1В-21 у различных видов по сравнению с человеческим промотором т1В-21. Столбики соответствуют степени консервативности.
(b) Люциферазная активность конструктов человеческого промотора т1В-21. Прогрессивное укоро
- 7 020335 чение нативного промотора приводит к идентификации области в 117 п.н., которая ответственна за экспрессию Ш1К-21. п=3.
(с) Данные по люциферазной активности конструктов человеческого промотора тЖ-21 после делеции/мутации сайтов связывания индивидуальных факторов транскрипции. п=3.
Фиг. 5. Нокдаун повсеместно экспрессируемой тЖ-21 индуцирует сердечный фенотип у полосатой (зебровой) гиреллы.
(a) Слева латеральный вид МО-контрольных эмбрионов и тЖ-21 морфантов при 80 НрГ (йоига рай ίοΓίίΙίζαΙίοη. часы, прошедшие с момента оплодотворения). А, предсердие (а1тшт); V, желудочек (усШпс1с); темные стрелки указывают на перикардиальный отек. Справа вверху контроль - инъецированные морфолино сердца (МО-контроль) имеют нормальную морфологию сердца на сроке 80 часов после оплодотворения (НрГ). Сердца перекручены (запетлены), эндокардиальный и миокардиальный слои хорошо развиты, и желудочек (V) и предсердие (А) разделены атриовентрикулярным (Ανΐ-кольцом. Внизу у ш1В-21-морфантов (инъецированных МО-1) развивается перикардиальный отек за счет потери сократимости желудочка и проявляются укороченные хвосты, тогда как развитие других органных систем протекает нормально.
(b) Ингибирование функции ш1В-21 двумя различными морфолино-модифицированными антисмысловыми олигонуклеотидами (МО-1, п=496 и МО-2, п=460) приводит к образованию идентичного фенотипа > чем у 90% инъецированных эмбрионов. Данные представлены на основании 3 независимых инъекций на группу.
(c) Функция миокарда проявляется в виде фракции укорочения (Р8) вентрального отдела МОконтроля (п=6) и тЖ-21-морфантов, инъецированных двумя различными морфолинами (МО-1, п=8 и МО-2, п=8) на сроках 48, 72, 96 и 120 НрГ. Вентрикулярная фракция укорочения Р8 желудочков ш1В-21морфантов значительно уменьшается со временем.
Фиг. 6. Эффективность трансфекции в культивируемых кардиомиоцитах.
(a) Культивируемые неонатальные кардиомиоциты трансфицировали Су-3-меченной тЖ-21 (50 нМ, 72 ч, АшЬюп, ϋ8Α) и окрашивали ΌΑΡΙ (справа). Для сравнения культивируемые кардиомиоциты окрашивали только ΌΑΡΙ (слева).
(b) Назерн-блот-анализ экспрессии Ш1К-21 в культивируемых кардиомиоцитах после трансфекции скремблированной микро-РНК (контроль пре-ιηίΚ 50 нМ, 72 ч), трансфекции ингибитором тЖ-21 (анти-ш1В-21, 50 нМ, 72 ч) или синтетической тЖ-21 (пре-тЖ-21, 50 нМ, 72 ч).
Все отрезки, характеризующие значение погрешности, означают 8ЕМ. п=3-6 для а) и Ь).
Фиг. 7. Сайты связывания микро-РНК внутри 3'ИТВ гена 8рту1.
(а) Изменение в экспрессии различных микро-РНК с сайтами связывания внутри области 3'ИТВ гена 8рту1. Внизу микро-РНК с сайтами связывания внутри 3'ϋΤΚ, изучаемые с помощью микро-РНКмикрочипа, представлены в сером цвете. СЙ8=кодирующая последовательность.
Фиг. 8. Данные по экспрессии тЖ-2Р полученные методом ПЦР в масштабе реального времени.
Помимо определения путем Назерн-блоттинга, изучали экспрессию т1В-21 методом ПЦР в масштабе реального времени в ткани левого желудочка мышей после ложной операции; ложной операции + обработки антагонистом ап1адот1т-21, ТАС; и ТАС + обработки антагонистом ап1адот1т-21 (слева), а также в сердцах, полученных из мышей дикого типа и тЖ-21-трансгенных мышей (справа). п=4-6 на группу.
Не представленные данные.
Путем скрининга теоретических тЖ-21-мишеней было выявлено 22 известных потенциальных гена-мишени, из которых 8 генов, как было показано, экспрессировались внутри сердечной ткани. Путем комбинации трех различных подходов для предсказания мишеней идентифицировали 8рту1 (5ргон1у1) как весьма вероятного кандидата.
Регуляция транскрипции тЖ-21.
Имеется консервативность последовательности внутри областей промотора тЖ-21 у различных видов по сравнению с областями человеческого промотора тЖ-21. Была продемонстрирована люциферазная активность конструктов человеческого промотора тЖ-21 после делеции/мутации сайтов связывания индивидуальных факторов транскрипции. Прогрессивное укорочение нативного промотора приводит к идентификации области в 117 п.н., которая ответственна за экспрессию т1В-21. п=3.
Эффективность трансфекции в культивируемых кардиомиоцитах.
Культивируемые неонатальные кардиомиоциты трансфицировали Су-3-меченной тЖ-21 (50 нМ, 72 ч, ΑтЬ^оη, ϋδΑ) и окрашивали ΌΑΡΙ. Для сравнения культивируемые кардиомиоциты окрашивали только ΌΑΡΙ. Анализировали результаты назерн-блоттинга по экспрессии тЖ-21 в культивируемых кардиомиоцитах после трансфекции скремблированной микро-РНК (контроль пре-тЖ, 50 нМ, 72 ч), ингибитором тЖ-21 (анти-тЖ-21, 50 нМ, 72 ч) или синтетической тЖ-21 (пре-тЖ-21, 50 нМ, 72 ч).
Сайты связывания микро-РНК внутри 3'ϋΤΚ. гена 8рту1.
Имеет место изменение в экспрессии различных микро-РНК с сайтами связывания внутри области 3'ИТВ гена 8рту1. Микро-РНК с сайтами связывания внутри 3'ИТВ изучали с помощью микро-РНКмикрочипа.
- 8 020335
Данные по экспрессии Ш1К-21, полученные методом ПЦР в масштабе реального времени.
Помимо определения путем назерн-блоттинга, изучали экспрессию Ш1К-21 методом ПЦР в масштабе реального времени в ткани левого желудочка мышей после ложной операции, ложной операции + обработки антагонистом ап1адотй-21. после ТАС и ТАС + обработки антагонистом ап1адотй-21. а также в сердцах, полученных из организма мышей дикого типа и тгК.-21-трансгенных мышей.
Подробное описание изобретения
Определения.
Фиброзом называется образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани. В некоторых вариантах осуществления фиброз возникает в качестве репаративного или реактивного процесса. В некоторых вариантах осуществления фиброз возникает в ответ на повреждение или травму. Термин фиброз следует понимать как образование или развитие избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в результате репаративного или реактивного процесса, в отличие от образования фиброзной ткани в качестве нормальной составляющей органа или ткани.
Под антисмысловым олигонуклеотидом следует понимать олигонуклеотид, который имеет определенную последовательность, комплементарную другой последовательности, в частности последовательности, комплементарной тгК.-21. Мишень ιηίΡ-21 можно расценивать также как понятие, охватывающее низлежащую мишень ιηίΡ-21. Важно отметить, что ингибирование ттК.-21, например, с помощью олигонуклеотида с последовательностью, по меньшей мере, комплементарной тзК-21, будет приводить к дерепрессии или даже к повышенной экспрессии мишеней тзК-21, таких как 8ргои1у и т.п.
Индивид означает человека или отличного от человека животного, выбранного для лечения или терапии.
Индивид с подозрением на наличие... означает индивида, у которого проявляется одно или несколько клинических показателей заболевания или состояния.
Индивид с подозрением на наличие фиброза означает индивида, у которого проявляется одно или несколько клинических показателей фиброза.
Предотвращать или предотвращение относится к задержке или предупреждению запуска, развития или прогрессии болезненного состояния или заболевания на некоторый период, включая недели, месяцы или годы.
Лечение или лечить означает применение одной или нескольких специфических процедур, используемых для лечения или облегчения болезненного состояния при заболевании. В некоторых вариантах осуществления под специфической процедурой подразумевается введение одного или нескольких фармацевтических средств.
Облегчение означает уменьшение тяжести по меньшей мере одного из признаков болезненного состояния или заболевания. В некоторых вариантах осуществления облегчение включает отсрочивание или замедление прогрессии одного или нескольких признаков состояния или заболевания. Степень тяжести признаков может быть определена путем индивидивных или объективных оценок, которые известны специалистам в данной области.
Индивид, нуждающийся в... означает индивида, идентифицируемого как индивид, нуждающийся в терапии или лечении.
Введение означает снабжение индивида фармацевтическим средством или композицией и включает, но не ограничивается указанным, введение с помощью медицинского персонала и самостоятельное введение.
Парентеральное введение означает введение путем инъекции или инфузии.
Парентеральное введение включает, но не ограничивается перечисленным, подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение и внутричерепное введение.
Подкожное введение означает введение непосредственно под кожу.
Внутривенное введение означает введение в вену.
Внутриартериальное введение означает введение в артерию.
Внутрисердечное введение означает введение в сердце. В некоторых вариантах осуществления внутрисердечное введение осуществляют с помощью катетера. В некоторых вариантах осуществления внутрисердечное введение осуществляют путем открытой операции на сердце.
Пульмональное введение означает введение в легкие.
Улучшает функцию печени означает изменения в сторону нормализации ее параметров. В некоторых вариантах осуществления функцию печени определяют путем измерения молекул, находящихся в крови у индивида. Например, в некоторых вариантах осуществления улучшение функции печени определяют по снижению уровней трансаминазы в крови.
Фармацевтическая композиция означает смесь веществ, подходящих для введения индивиду, которая включает фармацевтическое средство. Например, фармацевтическая композиция может включать модифицированный олигонуклеотид и стерильный водный раствор.
Фармацевтическое средство означает вещество, которое при введении индивиду обеспечивает терапевтический эффект.
- 9 020335
Активный фармацевтический ингредиент означает вещество в составе фармацевтической композиции, которое обеспечивает требуемый эффект.
Нуклеиновая кислота-мишень, РНК-мишень РНК-транскрипт-мишень и нуклеиновокислотная мишень - все эти термины относятся к любой нуклеиновой кислоте, на которую могут быть нацелены антисмысловые соединения.
Нацеливание относится к процессу создания и селекции последовательности нуклеиновых оснований, которая будет гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывать требуемый эффект.
Нацеленный на означает имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая позволит осуществить гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью для индукции требуемого эффекта. В некоторых вариантах осуществления требуемым эффектом является сокращение количества нуклеиновой кислоты-мишени.
Модуляция относится к нарушению (изменению) функции или активности. В некоторых вариантах осуществления модуляция означает повышение экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления под модуляцией подразумевают уменьшение экспрессии гена.
Экспрессия означает любые функции и стадии, посредством которых кодируемая геном информация превращается в структуры, присутствующие и функционирующие в клетке.
5'-сайт-мишень относится к нуклеиновому основанию нуклеиновой кислоты-мишени, которое комплементарно самому крайнему 5'-нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.
3'-сайт-мишень относится к нуклеиновому основанию нуклеиновой кислоты-мишени, которое комплементарно самому крайнему 3 '-нуклеиновому основанию конкретного олигонуклеотида.
Область означает часть соединенных друг с другом нуклеозидов внутри нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна области нуклеиновой кислоты-мишени. Например, в некоторых таких вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид комплементарен области последовательности структуры типа стебель-петля Ш1-РНК. В некоторых таких вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид на 100% комплементарен области последовательности структуры типа стебель-петля Ш1-РНК.
Сегмент означает меньшую область или часть области.
Последовательность нуклеиновых оснований означает порядок следования смежных нуклеиновых оснований в ориентации от 5' к 3', независимо от какого бы то ни было сахара, связи и/или модификации нуклеиновых оснований.
Смежные нуклеиновые основания означает нуклеиновые основания, непосредственно прилегающие друг к другу в нуклеиновой кислоте.
Комплементарность нуклеиновых оснований означает способность двух нуклеиновых оснований нековалентно спариваться посредством водородной связи.
Комплементарный означает, что первая последовательность нуклеиновых оснований является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной или же является на 100% идентичной комплементу второй последовательности нуклеиновых оснований в пределах области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеиновых оснований, или что две указанные последовательности гибридизуются в жестких условиях гибридизации. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая на 100% комплементарна Ш1-РНК или ее предшественнику, может не быть на 100% комплементарна Ш1-РНК или ее предшественнику на всем протяжении полной длины модифицированного олигонуклеотида.
Комплементарность означает способность нуклеиновых оснований к спариванию первой нуклеиновой кислоты со второй нуклеиновой кислотой.
Полноразмерная комплементарность означает, что каждое нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты способно спариваться с каждым нуклеиновым основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, в котором каждое нуклеиновое основание комплементарно нуклеиновому основанию в Ш1-РНК, обладает полноразмерной комплементарностью в отношении Ш1-РНК.
Процент комплементарности означает число комплементарных нуклеиновых оснований в нуклеиновой кислоте, деленное на длину нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления процент комплементарности модифицированного олигонуклеотида означает число нуклеиновых оснований, которые комплементарны нуклеиновой кислоте-мишени, деленное на число нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления процент комплементарности модифицированного олигонуклеотида означает число нуклеиновых оснований, которые комплементарны Ш1-РНК, деленное на число нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида.
Процент связанной области означает процент, который составляет область, комплементарную области олигонуклеотида. Процент связанной области вычисляют путем деления числа нуклеиновых оснований области-мишени, которые комплементарны олигонуклеотиду, на длину области-мишени. В некоторых вариантах осуществления процент связанной области составляет по меньшей мере 80%, по мень
- 10 020335 шей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99 или 100%.
Процент идентичности означает число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте, которые идентичны нуклеиновым основаниям в соответствующих положениях второй нуклеиновой кислоты, деленное на общее число нуклеиновых оснований в первой нуклеиновой кислоте.
Используемое в настоящем описании выражение по существу, идентичный означает, что первая и вторая последовательности нуклеиновых оснований являются по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичными либо же на 100% идентичными на всем протяжении участка из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеиновых оснований.
Гибридизация означает выравнивание комплементарных нуклеиновых кислот, которое происходит на всем протяжении, где имеется комплементарность нуклеиновых оснований.
Несовпадение означает, что нуклеиновое основание первой нуклеиновой кислоты не способно спариваться с нуклеиновым основанием в соответствующем положении второй нуклеиновой кислоты.
Некомплементарное нуклеиновое основание означает, что два нуклеиновых основания не способны спариваться путем образования водородной связи.
Идентичный означает имеющий ту же самую последовательность нуклеиновых оснований.
т1-РНК или Ш1Я означает некодирующую РНК длиной от 18 до 25 нуклеиновых оснований, которая гибридизуется с кодирующей РНК и регулирует ее экспрессию. В некоторых вариантах осуществления Ш1-РНК является продуктом расщепления пре-ш1-РНК под действием фермента Б1сег. Примеры Ш1-РНК можно найти в базе данных ιηί-РНК, известной как тЖВаке (Ьйр://т1сгогпа.5апдег.ас.ик/).
Пре-т1-РНК или пре-т1Я означает некодирующую РНК, имеющую структуру шпильки, которая содержит т1-РНК. В некоторых вариантах осуществления пре-ш1-РНК представляет собой продукт расщепления при-ιηίΡ под действием рибонуклеазы, специфичной в отношении двухцепочечной РНК и известной как Бгокйа.
Последовательность стебель-петля означает РНК, имеющую структуру типа стебель-петля и содержащую последовательность ιηί-РНК. Последовательности пре-т1-РНК и последовательности типа стебель-петля могут перекрываться. Примеры последовательностей типа стебель-петля можно обнаружить в базе данных Ш1-РНК, известной как тЖВаке (Ы1р://т1сгогпа.5апдег.ас.ик/).
При-т1-РНК или при-т1Я означает некодирующую РНК, имеющую структуру шпильки, которая является субстратом для рибонуклеазы Бгокйа, специфичной в отношении двухцепочечной РНК.
Предшественник ιηί-РНК означает транскрипт, который происходит из геномной ДНК и который содержит некодирующую структурированную РНК, содержащую одну или несколько последовательностей т1-РНК. Например, в некоторых вариантах осуществления предшественник Ш1-РНК представляет собой пре-т1-РНК. В некоторых вариантах осуществления предшественник Ш1-РНК представляет собой при-т1-РНК.
Под моноцистронным транскриптом подразумевается предшественник ιηί-РНК, содержащий единственную последовательность ιιιί-РНК.
Под полицистронным транскриптом подразумевается предшественник ιιιί-РНК, содержащий две или более последовательностей ιιιί-РНК.
Область затравки относится к нуклеотидам от 2-го до 6-го или от 2-го до 7-го, считая от 5'-конца последовательности зрелой Ш1-РНК.
Олигомерное соединение означает соединение, содержащее полимер из связанных мономерных единиц.
Олигонуклеотид означает полимер из соединенных друг с другом нуклеозидов, каждый из которых, независимо друг от друга, может быть модифицирован или не модифицирован.
Природным образом возникающая межнуклеозидная связь означает 3'-5'-фосфодиэфирную связь между нуклеозидами.
Природный сахар относится к сахару, обнаруживаемому в ДНК (2'-Н) или РНК (2'-ОН).
Природное нуклеиновое основание относится к нуклеиновому основанию, которое является немодифицированным по сравнению с его формой, возникающей естественным образом.
Межнуклеозидная связь означает ковалентную связь между соседними нуклеозидами.
Соединенные нуклеозиды означает нуклеозиды, связанные ковалентной связью.
Нуклеиновое основание относится к гетероциклическому фрагменту, способному к нековалентному спариванию с другим нуклеиновым основанием.
Нуклеозид означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром.
Нуклеотид означает нуклеозид, содержащий фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарным участком нуклеозида.
Антагонист Ш1Я означает модифицированный олигонуклеотид, комплементарный Ш1-РНК или ее предшественнику. Например, антагонист Ш1Я-Х означает модифицированный олигонуклеотид, содержащий нуклеиновое основание, комплементарное Ш1Я-Х. В некоторых вариантах осуществления антагонист представляет собой антагонист Ш1Я-21.
- 11 020335
Модифицированный олигонуклеотид означает олигонуклеотид, содержащий одну или несколько модификаций по сравнению с возникающими природным образом концевым участком, сахаром, нуклеиновым основанием и/или межнуклеозидной связью.
Одноцепочечный модифицированный олигонуклеотид означает модифицированный олигонуклеотид, который не гибридизован с комплементарной цепью.
Модифицированная межнуклеозидная связь относится к любому изменению по сравнению с возникающей естественным образом межнуклеозидной связью.
Фосфоротиоатная межнуклеозидная связь означает связь между нуклеозидами, в которой один из не образующих мостик атомов является атомом серы.
Модифицированный сахар означает замену и/или любое изменение по сравнению с природным сахаром.
Модифицированное нуклеиновое основание означает любую замену и/или изменение по сравнению с природным нуклеиновым основанием.
5-метилцитозин означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в 5'положении.
2'-О-метил-сахар или 2'-ОМе-сахар относится к сахару, имеющему О-метильную модификацию в 2'-положении.
2'-О-метоксиэтил-сахар или 2'-МОЕ-сахар относится к сахару, имеющему О-метоксиэтильную модификацию в 2'-положении.
2'-О-фтор-сахар или 2'-Е-сахар относится к сахару, модифицированному фтором в 2'положении.
Бициклический фрагмент сахара относится к сахару, модифицированному образованием мостика между двумя атомами кольца, не присоединенными к одному и тому же атому.
2'-О-метоксиэтилнуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию 2'-О-метоксиэтилсахара.
2'-фторнуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию 2'-фторсахар.
2'-О-метильный нуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий модификацию 2'-О-метил-сахар.
Бициклический нуклеозид означает 2'-модифицированный нуклеозид, имеющий бициклический фрагмент сахара.
Мотив означает вид модифицированных и/или не модифицированных нуклеиновых оснований, сахаров и/или межнуклеотидных связей в олигонуклеотиде.
Полностью модифицированный олигонуклеотид означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеотидная связь модифицированы.
Одинаково модифицированный олигонуклеотид означает, что каждое нуклеиновое основание, каждый сахар и/или каждая межнуклеотидная связь имеют одну и ту же модификацию по всей длине модифицированного олигонуклеотида.
Стабилизирующая модификация означает модификацию нуклеозида, которая обеспечивает модифицированному олигонуклеотиду повышенную стабильность в присутствии нуклеаз по сравнению со стабильностью, обеспечиваемой 2'-дезоксинуклеозидами, связанными фосфодиэфирными межнуклеозидными связями. Например, в некоторых вариантах осуществления стабилизирующая модификация является стабилизирующей модификацией нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления стабилизирующая модификация является стабилизирующей модификацией межнуклеозидной связи.
Стабилизирующий нуклеозид означает нуклеозид, модифицированный с целью обеспечения олигонуклеотиду повышенной стабильности в отношении нуклеаз по сравнению со стабильностью, обеспечиваемой 2'-дезоксинуклеозидом. В одном из вариантов осуществления стабилизирующим нуклеозидом является 2'-модифицированный нуклеозид.
Стабилизирующая межнуклеозидная связь означает межнуклеозидную связь, которая обеспечивает олигонуклеотиду повышенную стабильность в отношении нуклеаз по сравнению со стабильностью, обеспечиваемой фосфодиэфирной межнуклеозидной связью. В одном из вариантов осуществления стабилизирующей межнуклеозидной связью является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
Общее представление.
В настоящем изобретении описано, что модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные ш1В-21, являются фармацевтическими средствами для ингибирования ш1В-21. В некоторых вариантах осуществления модифицированные олигонуклеотиды вводят индивиду, имеющему заболевание, характеризующееся повышенной регуляцией ιηίΒ-21. В некоторых вариантах осуществления указанным заболеванием является злокачественная опухоль. В некоторых вариантах осуществления указанным заболеванием является сердечная недостаточность. В некоторых вариантах осуществления указанным заболеванием является фиброз. Фиброз образуется в результате развития избыточной фиброзной соединительной ткани в органе или ткани в ответ на повреждение или травму. Оставшись нелеченым, фиброз может привести к различным болезненным состояниям, помимо прочих тканей, со стороны сердца, легких, по
- 12 020335 чек, печени и кожи.
В настоящем изобретении выяснено, что полученный из фибробластов Ш1Р-21 играет критическую роль в фиброзе. Повышение уровней Ш1Р-21 способствовало выживанию фибробластов, тогда как супрессия эндогенной Ш1К-21 индуцировала апоптотическую гибель клеток. Таким образом, в настоящем описании идентифицирован механизм, посредством которого Ш1Р-21 регулирует выживаемость фибробластов. Аберрантные пролиферация и выживаемость фибробластов могут приводить к фиброзу. Соответственно, модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные Ш1Р-21, являются фармацевтическими средствами для лечения фиброза. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, комплементарный Ш1Р-21, является антисмысловым олигонуклеотидом, комплементарным Ш1Р21.
Авторы изобретения продемонстрировали критическую роль полученных из фибробластов Ш1Р-21 и 8ΡΚΥ1 в ткани сердца (фиг. 3й). Полученные данные свидетельствуют о том, что индуцированная стрессом и опосредованная Ш1-РНК активация ЕРК-МАР-киназной активности может играть существенную роль в регуляции сердечного фиброза. Настоящее исследование представляет собой первый пример терапевтического применения микро-РНК в модели заболевания. Специфическим образом противодействуя Ш1Р-21, можно на мышиной модели предотвратить структурное и функциональное расстройство. Указанные открытия свидетельствуют о новом подходе к сердечной недостаточности и указывают на обширный терапевтический потенциал антагонистов микро-РНК.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению Ш1Р-21, антисмыслового олигонуклеотида против Ш1Р-21 и/или мишени Ш1Р-21 для производства лекарственного средства для лечения и/или предотвращения фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний.
Настоящее изобретение относится, в частности, к специфическим болезням сердца, включая фиброз (=связанные с фиброзом заболевания), таким как сердечная гипертрофия, гипертоническая болезнь сердца, диастолическая и систолическая сердечная недостаточность, связанным с сердцем застойным заболеваниям, таким как болезнь Фабри, к кардиомиопатиям, например, дилятационной кардиомиопатии, гипертрофической кардиомиопатии с обструкцией и без обструкции, рестриктивной кардиомиопатии, кардиомиопатии правого желудочка с нарушением ритма и другим формам кардиомиопатии, таким, например, как диабетическая кардиомиопатия, констриктивный перикардит, коронарная болезнь артерий, инфаркт миокарда, острая и хроническая правосторонняя сердечная недостаточность, сердечная аритмия за счет фиброза, связанный с миокардитом фиброз, нарушения сердечных клапанов, приводящие к стенозу или недостаточности клапанов (например, склероз), например стеноз и/или недостаточность митрального клапана, стеноз и/или недостаточность аортального клапана, стеноз и/или недостаточность трехстворчатого клапана, стеноз и/или недостаточность легочного клапана.
В дальнейшем аспекте настоящее изобретение относится к другим включающим фиброз заболеваниям (=связанным с фиброзом заболеваниям), не связанным с сердечной системой. Неограничивающими примерами являются фиброз легких, хроническое обструктивное заболевание легких, пульмональная гипертензия, вызванный отравлением фиброз печени, гепатит и/или вторичная правосторонняя сердечная недостаточность, фиброз кожи, например, развитие келоидов после повреждения, заболевания, связанные с кровеносными сосудами, такие как связанная с возрастом или с гипертонией артериальная жесткость (ригидность), медиасклероз, артериосклероз, фиброз различных органов у пожилых людей, склероз пищеварительного канала, например, во время болезни Крона, системного склероза и СРЕ8Тсиндрома и т.д., фиброз почек, неопластический фиброз и/или ревматоидный артрит.
Дальнейшими хорошо известными заболеваниями и расстройствами, связанными с фиброзом, являются, например, эндомиокардиальный фиброз и идиопатическая миокардиопатия, цирроз, который может развиться в результате фиброза печени, идиопатический пульмональный фиброз легкого, диффузное паренхиматозное заболевание легких, медиастинальный фиброз, миелофиброз, поствазэктомический болевой синдром, ретроперитонеальный фиброз и нефрогенный системный фиброз.
Все аспекты данного изобретения, в частности аспекты, упоминаемые в прилагаемой формуле изобретения, могут быть использованы для диагностики, лечения и/или профилактики указанных выше заболеваний, расстройств и состояний, которые приведены в виде возможных примеров. Указанный список не является ограничивающим.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к стратегиям модуляции Ш1Р-21. В другом аспекте изобретение относится к стратегиям модуляции, например, повышенной экспрессии и/или повышенной регуляции мишеней Ш1Р-21. Возможными путями модуляции являются имплантируемые средства, такие как векторы и липосомные композиции и т.д., системы переноса генов, тампоны и т.п.
Белок 8ртои1у (8ΡРΥ1) идентифицирован в настоящем описании как мишень Ш1Р-21. Как Ш1Р-21, так и 8ΡРΥ1 экспрессируются, помимо других типов клеток, в фибробластах сердца. Повышение экспрессии Ш1Р-21 в фибробластах сердца индуцируется сильным торможением экспрессии белка 8ΡРΥ и, кроме того, повышенной активацией ЕРК-МАР-киназы. В предпочтительном варианте осуществления указанная мишень выбрана из группы, состоящей из 8ртои1у1 (8ΡРΥ1), в частности, 8ЕО Ш N0: 7 или 5ЕО Ш N0: 8, Т§ТЫ, Ктй1, Рп.\2. РаД, ΝΤΛ, Ьих1 и РФ4.
В одном из аспектов настоящее изобретение касается антисмысловых олигонуклеотидов против
- 13 020335 (или комплементарным) 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-4, 8ргои1у1 (8ΡΒΥ1), в частности, 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, ТдГЬг Κτίΐΐ, Ρίίχ2, Еаз1, ΝΓίό. Ьих1 и/или К1п4 для диагностики, лечения и/или профилактики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. В определенных аспектах антисмысловой олигонуклеотид, комплементарный мишени, выбранной из группы, состоящей из 8ргон1у1 (8ΡΚΥ1), в частности, 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 или 8Е0 ΙΌ N0: 8, ТдГЫ, Кгй1, Ρίίχ2, Еаз1, ΝΕΕ Ьпх1 и/или Ши4, препятствует способности микро-РНК, такой как шгК.-21, связываться с участком-мишенью и ингибировать экспрессию выбранной мишени. В определенных аспектах такой антисмысловой олигонуклеотид содержит одну или несколько нуклеозидных модификаций.
В одном из аспектов настоящее изобретение касается клетки, дефицитной в отношении шгК.-21, 8ЕС) ΙΌ N0: 2-4, 8ргои1\1 (8Ρ.Υ1), в частности, 8ЕС ΙΌ N0: 7 или 8ЕС ΙΌ N0: 8, Т§ГЫ, Κη11, Ρίΐχ2, Еаз1, N66, Ьпх1 и/или К1п4.
В одном из аспектов настоящее изобретение касается нокаутного организма млекопитающего, не являющегося человеком, дефицитного в отношении Ш1К.-21, 8ЕЦ ΙΌ N0: 2-4, 8ргои(у1 (8ΡΒΥ1), в частности, 8Е0 ΙΌ N0: 7 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 8, ТдГЫ, Κήΐ1, Ρίΐχ2, Еаз1, N66, Ьпх1 и/или Βΐπ4, в качестве модели заболевания фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Сюда входят также трансгенные животные, в частности млекопитающие, не являющиеся человеком, которые в повышенном количестве экспрессируют Ш1К.-21.
В настоящем изобретении было обнаружено, что полученная из фибробластов шгК.-21 участвует в развитии сердечной недостаточности. Анализ образцов ткани левого желудочка сердца, полученных из организма индивидов с терминальной стадией сердечной недостаточности в результате идиопатической дилятационной кардиомиопатии, выявил наличие повышенной экспрессии шгК.-21 и подавление экспрессии белка 8ΡΚ.Υ1. Кроме того, ЕКΚ-ΜΑΡ-киназа была активирована в образцах, полученных от указанных индивидов, что следовало из повышенного отношения фосфор-ЕВК/ЕВК. В настоящем изобретении было обнаружено, что у животной модели сердечной недостаточности введение модифицированного олигонуклеотида, комплементарного ш1В-21, приводит к значительному ослаблению фиброза сердца. Сердечная недостаточность, помимо прочих признаков, характеризуется фиброзом сердца. Соответственно, модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные ш1В-21, являются фармацевтическими средствами для лечения фиброза сердца.
В изобретении обнаружено также, что у животной модели сердечной недостаточности ослабление фиброза сердца сопровождается уменьшением увеличения веса сердца. Кроме того, оценивая сердечную функцию методом эхокардиографии, выявили, что введение модифицированного олигонуклеотида, вдобавок к Ш1К.-21, предотвращает расширение левого желудочка и нормализует параметры фракции укорочения. Сердечная недостаточность может быть охарактеризована, помимо прочих признаков, увеличением веса сердца, расширением левого желудочка и расстройством фракции укорочения. Соответственно, модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные шгК.-21, являются терапевтическими средствами для лечения, ослабления и предотвращения сердечной недостаточности, ассоциированной с фиброзом сердца.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к области промотора микро-РНК (Ш1-РНК), содержащей модификацию сайта связывания белка кальций/цАМФ-ответного элемента (СКЕВ) и/или белка сывороточного ответа (8КЕ), для диагностики, профилактики и/или терапии фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний.
В одном из вариантов осуществления область промотора, ген ш1гВ-21 как таковой и/или 3'ЦТК. различных мРНК могут содержать полиморфизмы, мутации, в частности, точковые мутации, делеции, усечения и/или инверсию. Все указанные изменения последовательности дикого типа приводят к бе поуо образованию нового сайта связывания шгК.-21 или к делеции сайта связывания шгК.-21. В другом осуществлении модификация области промотора выбрана из группы, состоящей из точковой мутации, усечения, делеции и инверсии. Кроме того, область промотора может быть выбрана из группы, состоящей из 8ЕС ΙΌ N0: 2-4.
Применения в диагностике.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к применению шгК.-21, антисмыслового олигонуклеотида против ш1В-21 и/или мишени шгК.-21 для диагностики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний. Антисмысловой олигонуклеотид следует понимать как олигонуклеотид, который имеет определенную последовательность, комплементарную другой последовательности, в частности последовательности, комплементарной шгК.-21. Мишень шгК.-21 можно расценивать также как понятие, охватывающее низлежащую мишень шгК.-21. Важно отметить, что ингибирование Ш1К-21, например, с помощью олигонуклеотида с последовательностью, по меньшей мере комплементарной шгК.-21, будет приводить к дерепрессии или даже к повышенной экспрессии мишеней шгК.-21, таких как 8ргон1у и т.п.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу диагностики фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний, включающему следующие стадии:
(a) приготовление образца из организма пациента, у которого предполагается наличие фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний;
(b) оценка уровня экспрессии Ш1К.-21, 8ргон1у1 (8ΡΒΥ1), в частности, 8ЕЦ ΙΌ N0: 7 или 8ЕЦ ΙΌ
- 14 020335
N0: 8, ТдГЫ ΚπΐΕ Ρίίχ2, Еаз1, ΝΠό. Ьпх1 и/или Р1п4;
при этом повышенный уровень ιηίΡ-21 и/или пониженный уровень 8ргои1у1 (8ΡΚ.Υ1), в частности, 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е0 ГО N0: 8, ТдГЫ, Κτίΐΐ, Ρίίχ2, Еаз1. ΝΠΕ. Ьпх1 и/или И1п4. по сравнению с контрольным образцом указывает на наличие фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний или предрасположенности к ним.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу скрининга фармацевтически активного соединения для лечения или предотвращения фиброза и/или связанных с фиброзом заболеваний или предрасположенности к ним, включающему следующие стадии:
(a) приготовление образца, содержащего тЖ-21, 8ргои1у1 (8ΡΚ.Υ1), в частности, 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е0 ГО N0: 8, ТдГЬ1, Κτίΐ1, Ρίΐχ2, Еаз£ N66, Ьпх1 и/или К£п4;
(b) приведение вещества-кандидата в контакт с указанным образцом;
(c) определение влияния вещества-кандидата на указанный образец;
при этом изменение ιηίΡ-2Ε 8ргои1у1 (8ΡΚΥ1), в частности, 8Е0 ГО N0: 7 или 8Е0 ГО N0: 8, ТдГЬ1, Κπΐ1, Ρίΐχ2, Еаз1, N£16, Ьпх1 и/или К£п4, указывает на то, что соединение является фармацевтически активным.
Некоторые заболевания и болезненные состояния.
Настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фиброзом или с подозрением на наличие фиброза. Предложены также способы лечения индивида, идентифицируемого как индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на фиброз. В некоторых вариантах осуществления такие способы предусматривают введение индивиду модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанная ιηί-РНК представляет собой ιηίΡ-21.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способам профилактики фиброза у индивида, у которого есть риск развития фиброза. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду, у которого есть риск развития фиброза, модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанная ιηί-РНК представляет собой ιηίΡ-21.
В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз печени. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз легких. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз кожи. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз сердца. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз почек. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз у пожилых людей. В некоторых вариантах осуществления указанным фиброзом является фиброз селезенки.
В некоторых вариантах осуществления указанный индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, имеет по меньшей мере одно нарушение или заболевание сердца. В некоторых вариантах осуществления индивид, идентифицируемый как индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на фиброза, имеет по меньшей мере одно нарушение или заболевание сердца. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарных ηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления ιηί-РНК представляет собой ιηίΡ-21.
В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является гипертрофия сердца. В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является кардиомиопатия. В некоторых вариантах осуществления кардиомиопатия представляет собой дилятационную кардиомиопатию, гипертрофическую кардиомиопатию с обструкцией, гипертрофическую кардиомиопатию без обструкции, рестриктивную кардиомиопатию, кардиомиопатию правого желудочка с нарушением ритма или диабетическую кардиомиопатию.
В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является коронарная болезнь артерий. В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является связанная с сердцем болезнь накопления, констриктивный перикардит, острый инфаркт миокарда, хронический инфаркт миокарда, сердечная аритмия или связанный с миокардитом фиброз.
В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является сердечная недостаточность. В некоторых вариантах осуществления сердечная недостаточность является гипертензивной сердечной недостаточностью, диастолической сердечной недостаточностью, систолической сердечной недостаточностью или правосторонней сердечной недостаточностью.
В некоторых вариантах осуществления нарушением или заболеванием сердца является нарушение сердечного клапана. В некоторых вариантах осуществления нарушением сердечного клапана является стеноз митрального клапана, стеноз аортального клапана, стеноз трехстворчатого клапана или стеноз легочного клапана. В некоторых вариантах осуществления нарушением сердечного клапана является недостаточность митрального клапана, недостаточность аортального клапана, недостаточность трехстворчатого клапана или недостаточность легочного клапана.
Настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, при этом у указанного индивида имеется заболевание или болезненное
- 15 020335 состояние печени. В некоторых вариантах осуществления индивид, идентифицируемый как индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на фиброз, имеет по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние печени. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления ηί-РНК представляет собой ηίΚ-21. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или болезненным состоянием печени является хроническое повреждение печени. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или болезненным состоянием печени является вирусный инфекционный гепатит. В некоторых вариантах осуществления инфекционным гепатитом является вирусный инфекционный гепатит С. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или болезненным состоянием печени является неалкогольный стеатогепатит. В некоторых вариантах осуществления заболеванием или болезненным состоянием печени является цирроз.
Настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фиброзом или с подозрением на фиброз, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние легких. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, идентифицируемого как индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на фиброз, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно заболевание или болезненное состояние легких. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна ηίРНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления ηί-РНК представляет собой ηίΚ21. В некоторых вариантах осуществления заболевание или болезненное состояние легких представляет собой хроническую обструктивную болезнь легких.
Настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фиброзом или с подозрением на фиброз, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, идентифицируемого как индивид, страдающий фиброзом или с подозрением на фиброз, при этом у указанного индивида имеется по меньшей мере одно другое заболевание или болезненное состояние. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду модифицированного олигонуклеотида, имеющего последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна ηίРНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления ηί-РНК представляет собой ηίΚ21. В некоторых вариантах осуществления одним другим заболеванием или болезненным состоянием легких является легочная гипертензия. В некоторых вариантах осуществления одним другим заболеванием или болезненным состоянием является заболевание, связанное с кровеносными сосудами. В некоторых вариантах осуществления указанным заболеванием, связанным с кровеносными сосудами, является артериальная ригидность (жесткость), медиасклероз или артериосклероз. В некоторых вариантах осуществления одним другим заболеванием или болезненным состоянием является склероз пищеварительного канала. В некоторых вариантах осуществления другим заболеванием или болезненным состоянием является системная склеродермия. В некоторых вариантах осуществления одним другим заболеванием или болезненным состоянием является ретроперитонеальный фиброз, пролиферативный фиброз, неопластический фиброз, нефрогенный системный фиброз, инъекционный фиброз, медиастинальный фиброз, миелофиброз, пост-вазэктомический болевой синдром или ревматоидный артрит.
Настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фибропролиферативным расстройством. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают введение индивиду, страдающему фибропролиферативным расстройством или с подозрением на наличие фибропролиферативного расстройства, модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна ηί-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанная ηί-РНК представляет собой ηίΚ-21.
Кроме того, настоящее изобретение относится к лечению злокачественных опухолей на основе ηίРНК-21, при этом указанное лечение включает нацеливание на специфические злокачественные опухоли путем модуляции 8РРУ1-опосредованной передачи сигнала ЕКК в злокачественных клетках. Известно, что ηίΚ-21 экспрессируется в повышенных количествах во многих типах злокачественных клеток, включая клетки аденокарциномы пищевода, толстой кишки, рака молочной железы, глиомы, глиобластомы, рака яичника, гепатоцеллюлярного рака, рака головы и шеи, хронической лимфоцитарной лейкемии, рака поджелудочной железы, но не ограничиваясь перечисленным.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к диагностике, профилактике и/или лечению указанных выше типов злокачественных опухолей. Все признаки, указанные в формуле изобретения, могут быть объединены с описанием указанных типов злокачественных опухолей.
Некоторые пути введения.
В некоторых вариантах осуществления введение индивиду включает парентеральное введение. В некоторых вариантах осуществления введение индивиду включает внутривенное введение. В некоторых вариантах осуществления введение индивиду включает подкожное введение.
В некоторых вариантах осуществления введение индивиду включает внутриартериальное введение.
- 16 020335
В некоторых вариантах осуществления введение индивиду включает внутрисердечное введение. Подходящие способы внутрисердечного введения включают применение катетера или введение в процессе открытой операции на сердце.
В некоторых вариантах осуществления введение включает пульмональное введение. В некоторых вариантах осуществления пульмональное введение включает доставку олигонуклеотида, переведенного в состояние аэрозоля, в легкие индивида путем ингаляции. После ингаляции олигонуклеотида, переведенного в состояние аэрозоля, олигонуклеотид распределяется как между нормальными, так и между воспаленными клетками легочной ткани, включая альвеолярные макрофаги, эозинофилы, эпителиальные клетки, клетки эндотелия кровеносных сосудов и эпителиальные клетки бронхиолы. Подходящие устройства для доставки фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид, включают, но не ограничены перечисленным, устройство в виде стандартного небулайзера. Композиции и способы модуляции размера капелек, используемых в небулайзерный устройствах для доставки специфических порций в дыхательные пути и легкие, хорошо известны специалистам в данной области. Дополнительные подходящие устройства включают ингаляторы сухого порошка или ингаляторы с дозатором.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции вводят с целью достижения скорее локальных, чем системных эффектов. Например, пульмональное введение доставляет фармацевтическую композицию в легкое с минимальным системным эффектом.
Дополнительные подходящие пути введения включают, но не ограничены перечисленным, пероральное, ректальное, чресслизистое, интестинальное, энтеральное, местное введение, введение посредством суппозитория, интратекальное, интравентрикулярное, внутрибрюшинное, интраназальное, внутриглазное, внутримышечное, интрамедуллярное и внутриопухолевое введение.
Некоторые клинические исходы.
В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем описании способы обеспечивают индивиду, страдающему фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, клинически желательный исход. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение состояния при увеличении веса сердца. В некоторых вариантах таких осуществлений клинически желательным исходом является улучшение состояния при расширении левого желудочка. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение состояния при расстройстве фракции укорочения. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является профилактика увеличения веса сердца. В некоторых вариантах таких осуществлений клинически желательным исходом является профилактика расширения левого желудочка. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является профилактика расстройства фракции укорочения.
В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение функции сердца.
В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является улучшение фиброза. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является замедление дальнейшего прогрессирования фиброза. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является остановка дальнейшего прогрессирования фиброза. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является ослабление фиброза. В некоторых вариантах осуществления клинически желательным исходом является уменьшение содержания коллагена.
В некоторых вариантах осуществления терапевтически желательным исходом является улучшение функции печени. Функцию печени можно оценить по функциональным печеночным тестам, которые, помимо прочего, позволяют измерить уровни печеночной трансаминазы в крови. В некоторых вариантах осуществления индивид с аномальной функцией печени имеет повышенные уровни печеночной трансаминазы в крови. Печеночные трансаминазы крови включают аланиновую аминотрансаминазу (АЬТ) и аспартат-аминотрансаминазу (А8Т). В некоторых вариантах осуществления индивид с аномальной функцией печени имеет повышенные уровни билирубина в крови. В некоторых вариантах осуществления индивид имеет аномальные уровни альбумина в крови. В некоторых вариантах осуществления описанные в настоящем описании способы способствуют изменению уровней АЬТ, А8Т, билирубина и/или альбумина в крови таким образом, чтобы один или более из указанных уровней оказался ближе к границам нормы.
В некоторых вариантах осуществления функцию печени индивида устанавливают по системе классификации Чайльда-Пью (СЫ1й-РидЬ), которая дает возможность определить три класса функций печени. В указанной классификационной системе точкам соответствуют измерения одной из пяти категорий: уровней билирубина, уровней альбумина, протромбинового времени, асцита и энцефалопатии. По одной точке определяют на каждую из следующих характеристик: билирубин крови менее чем 2,0 мг/дл; альбумин крови более чем 3,5 мг/дл; протромбиновое время менее чем международное нормализованное отношение (ΙΝ.) 1,7; асцит отсутствует; или энцефалопатия отсутствует. По двум точкам определяют каждую из следующих характеристик: билирубин крови от 2 до 3 мг/дл; альбумин крови от 3,5 до 2,8 мг/дл; протромбиновое время от 1,7 до 2,3 ΙΝ.; асцит от слабого до умеренного; или энцефалопатия сла
- 17 020335 бая. По трем точкам определяют каждую из следующих характеристик: билирубин крови более чем 3,0 мг/дл; альбумин крови менее чем 2,8 мг/дл; протромбиновое время более чем 2,3 ШВ; асцит от тяжелого до рефракторного; или энцефалопатия тяжелая. Добавляется количество точек, и за классом А закрепляется шкала из 5-6 точек, за классом В закрепляется шкала из 7-9 точек, а за классом С закрепляется шкала из 10-15 точек. В некоторых вариантах осуществления указанные в настоящем описании способы обеспечивают улучшение функции печени, определяемой согласно классификационной системе Чайльда-Пью.
Некоторые клеточные фенотипы.
Настоящее изобретение относится к способам ингибирования клеточной пролиферации фибробластов. Настоящее изобретение также относится к способам стимуляции апоптоза в фибробластах. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам повышения белка 8ргои1у1 в фибробластах. В некоторых вариантах осуществления такие способы включают приведение фибробласта в контакт с соединением, содержащим модифицированный олигонуклеотид и имеющим последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна т1-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления тРРНК представляет собой ιηίΒ-21.
В некоторых вариантах осуществления фибробластная клетка находится ίη νίίΓΟ. В некоторых вариантах осуществления фибробластная клетка находится ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляется ίη νίίτο. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляется ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт осуществляется ех νίνο.
Некоторая дополнительная терапия.
Лечение фиброза может включать более чем одно терапевтическое лечение. Так, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам лечения индивида, страдающего фиброзом или с подозрением на наличие фиброза, включающим по меньшей мере одно терапевтическое лечение вдобавок к введению модифицированного олигонуклеотида, содержащего последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику.
В некоторых вариантах осуществления указанные в настоящем описании способы включают введение одного или нескольких добавочных фармацевтических средств. В некоторых вариантах осуществления добавочные фармацевтические средства включают, но не ограничены перечисленным, диуретики (например, спиронолактон, эплеренон, фуросемид), инотропы (например, добутамин, милринон), дигоксин, вазодилятаторы, ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента II (АСЕ) (например, каптоприл, эналаприл, лизиноприл, беназеприл, хинаприл, фозиноприл и рамиприл), блокаторы рецептора ангиотензина II (АКВ) (например, кандезартан, ирбезартан, олмезартан, лозартан, валзартан, телмизартан, эпрозартан), блокаторы кальциевых каналов, изосорбид-динитрат, гидралазин, нитраты (например, изосорбид-мононитрат, изосорбид-динитрат), гидралазин, бета-блокаторы (например, карведилол, метопролол) и натрийуретические пептиды (например, незиритид).
В некоторых вариантах осуществления добавочной терапией может служить фармацевтическое средство, которое усиливает иммунную систему организма, включая низкие дозы циклофосфамида, тимостимулин, витамины и пищевые добавки (например, антиоксиданты, включая витамины А, С, Е, бетакаротен, цинк, селен, глутатион, коэнзим ф-10 и эхинацею), а также вакцины, например, иммуностимулирующий комплекс (!8С0М), которые содержат вакцинную композицию, в которой сочетается мультимерное представление антигена и адъюванта.
В некоторых вариантах осуществления добавочную терапию выбирают для лечения или облегчения побочных эффектов одной или нескольких фармацевтических композиций согласно изобретению. Такие побочные эффекты включают, без ограничения, реакции на месте инъекции, аномалии функционального теста печени, аномалии функции почек, печеночную токсичность, почечную токсичность, аномалии центральной нервной системы и миопатии. Например, повышенные уровни аминотрансферазы в сыворотке могут указывать на печеночную токсичность или аномальную функцию печени. Например, повышенные уровни билирубина могут служить указателем печеночной токсичности или аномальной функции печени.
В некоторых вариантах осуществления одну или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств вводят в одно и то же время. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств вводят в разное время. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств составляют вместе в единую композицию. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько фармацевтических композиций согласно изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств составляют раздельно.
- 18 020335
Некоторые фармацевтические композиции.
В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем описании модифицированный олигонуклеотид, комплементарный ιηί-РНК или ее предшественнику, получают в виде фармацевтической композиции для лечения фиброза. В некоторых вариантах осуществления соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηί-РНК или ее предшественнику, получают в виде фармацевтической композиции для лечения фиброза.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию согласно изобретению вводят в виде лекарственной формы (например, таблетки, капсулы, болюса и т.д.). В некоторых вариантах осуществления такие фармацевтические композиции включают модифицированный олигонуклеотид в дозе, выбранной из 25 мг, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235,
240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 270, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345,
350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455,
460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565,
570, 575, 580, 585, 590, 595, 600, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675,
680, 685, 690, 695, 700, 705, 710, 715, 720, 725, 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785,
790, 795 и 800 мг. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит дозу модифицированного олигонуклеотида, выбранную из 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 и 800 мг.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическое средство представляет собой стерильный лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид, который восстановлен соответствующим разбавителем, например стерильной водой для инъекций или стерильным физиологическим раствором для инъекций. Восстановленный продукт после растворения в физиологическом растворе вводят в виде подкожной инъекции или в виде внутривенной инфузии. Лиофилизированный лекарственный продукт состоит из модифицированного олигонуклеотида, который получен в воде для инъекций или в физиологическом растворе для инъекций, доведенном в процессе получения до рН 7,0-9,0 кислотой или основанием, а затем лиофилизирован. Лиофилизированный модифицированный олигонуклеотид может составлять 25-800 мг модифицированного олигонуклеотида. Разумеется, что в указанный интервал входят 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775 и 800 мг модифицированного олигонуклеотида. Лиофилизированный лекарственный продукт может быть упакован в 2-миллилитровый флакон из чистого стекла типа II (обработанного сульфатом аммония), закрыт бромбутилкаучуковой пробкой и дополнительно укупорен алюминиевым съемным колпачком РЬ1Р-0РР(к).
В некоторых вариантах осуществления композиции согласно изобретению могут дополнительно содержать другие добавочные компоненты, обычно обнаруживаемые в фармацевтических композициях. Таким образом, композиции могут, например, содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие, например, как противозудные средства, вяжущее вещество, локальные анестетики или противовоспалительные средства, или же они могут содержать дополнительные материалы, применимые в различных физически составляемых лекарственных формах композиций согласно изобретению, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако такие материалы при их добавлении не должны излишне влиять на биологические активности компонентов композиций согласно изобретению. Композиции могут быть стерилизованы и, если это требуется, смешаны с добавочными средствами, например скользящими веществами, консервантами, стабилизаторами, увлажняющими средствами, эмульгаторами, солями для воздействия на осмотическое давление, буферами, подкрашивающими веществами, вкусовыми добавками и/или ароматизаторами и прочим, которые не оказывают вредного воздействия на олигонуклеотид(ы), входящий в состав композиции.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно изобретению включают один или несколько модифицированных олигонуклеотидов и один или несколько наполнителей. В некоторых вариантах осуществления наполнители выбраны из воды, солевых растворов, спирта, полиэтиленгликолей, желатина, лактозы, амилазы, стеарата магния, талька, кремниевой кислоты, вязкого парафина, гидроксиметилцеллюлозы и поливинилпирролидона.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию согласно изобретению получают с использованием известных технологий, включая, но не ограничиваясь перечисленным, процессы смешивания, растворения, гранулирования, изготовления драже, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, включения или таблетирования.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно изобретению представляют собой жидкость (например, суспензию, эликсир и/или раствор). В некоторых вариантах осуществления жидкую фармацевтическую композицию получают с использованием ингредиентов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленным, воду, гликоли, масла, спирты, вкусовые добавки, консерванты и окрашивающие средства.
- 19 020335
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению представлены в твердой форме (например, порошок, таблетка и/или капсула). В некоторых вариантах осуществления жидкую фармацевтическую композицию, содержащую один или несколько олигонуклеотидов, получают с использованием ингредиентов, известных в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленным, крахмалы, сахара, разбавители, гранулирующие средства, скользящие вещества, связующие вещества и дезинтеграторы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию согласно изобретению составляют в виде препарата пролонгированного действия. Некоторые такие препараты пролонгированного действия обычно действуют дольше, чем препараты непролонгированного действия. В некоторых вариантах осуществления такие препараты вводят путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. В некоторых вариантах осуществления препараты получают с использованием подходящих полимерных или гидрофобных материалов (например, эмульсия в приемлемом масле) или ионообменных смол, или в виде умеренно растворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит систему доставки. Примеры систем доставки включают, не ограничиваясь перечисленным, липосомы и эмульсии. Некоторые системы доставки используют для получения определенных фармацевтических композиций, включая композиции, содержащие гидрофобные соединения. В некоторых вариантах осуществления используются определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит одну или несколько молекул тканеспецифической доставки, созданных для доставки одного или нескольких фармацевтических средств согласно изобретению к специфическим тканям или типам клеток. Например, в некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции включают липосомы, покрытые тканеспецифическим антителом.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит систему вспомогательного растворителя. Некоторые из таких систем вспомогательных растворителей включают, например, бензиловый спирт, неполярное поверхностно-активное вещество, водорастворимый органический полимер и водную фазу. В некоторых вариантах осуществления такие системы вспомогательных растворителей используются для гидрофобных соединений. Неограничивающим примером такой системы вспомогательных растворителей является система сорастворителей νΡΌ, которая является раствором абсолютного этанола, содержащим 3% вес./об. бензилового спирта, 8% вес./об. неполярного поверхностно-активного вещества полисорбата-801™'1 и 65% вес./об. полиэтиленгликоля-300. Соотношения таких систем вспомогательных растворителей могут существенно варьироваться без значительного изменения их свойств, связанных с растворимостью и токсичностью. Кроме того, может меняться состав компонентов систем вспомогательных растворителей: например, вместо полисорбата-80(тм) могут быть использованы другие поверхностно-активные вещества; может варьироваться относительное содержание полиэтиленгликоля; полиэтиленгликоль могут заменить другие биосовместимые полимеры, например поливинилпирролидон; а другие сахара или полисахариды могут заменить декстрозу.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит систему непрерывного высвобождения. Неограничивающим примером такой системы непрерывного высвобождения является полупроницаемый матрикс из твердых гидрофобных полимеров. В некоторых вариантах осуществления системы непрерывного высвобождения могут, в зависимости от их химической природы, высвобождать фармацевтические средства в течение периода, измеряемого часами, днями, неделями или месяцами.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции согласно изобретению составляют для перорального применения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена путем комбинирования одного или нескольких соединений, содержащих модифицированный олигонуклеотид, с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями. Некоторые из таких носителей позволяют составить фармацевтические композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, пастообразных смесей, суспензий и пр. для перорального приема индивидом. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального приема получают путем смешивания олигонуклеотида и одного или нескольких твердых инертных наполнителей. Подходящие наполнители включают, но не ограничены перечисленным, такие наполнители, как сахара, включая лактозу, сахарозу, маннит или сорбит; целлюлозные добавки, такие, например, как кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовую камедь, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу и/или поливинилпирролидон (ΡνΡ). В некоторых вариантах осуществления такую смесь необязательно измельчают до порошкообразного состояния, и необязательно добавляют вспомогательные средства. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции составляют для получения сердцевины таблеток или драже. В некоторых вариантах осуществления добавляют дезинтеграторы (например, поперечно сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновую кислоту или ее соль, такую как альги
- 20 020335 нат).
В некоторых вариантах осуществления сердцевину драже покрывают дополнительными оболочками. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы концентрированные растворы сахаров, которые могут необязательно содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, лакирующие растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. К покрывающим слоям таблеток или драже могут быть добавлены подкрашивающие вещества или пигменты.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального применения набивают в капсулы, изготовленные из желатина. Некоторые из таким образом заполненных капсул содержат одно или несколько фармацевтических средств согласно изобретению в смеси с одним или несколькими наполнителями, такими как лактоза, связующими веществами, такими как крахмалы, и/или скользящими веществами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции для перорального применения представляют собой мягкие закупоренные капсулы, изготовленные из желатина и смягчителя, такого как глицерин или сорбит. В некоторых случаях в мягких капсулах растворено или суспендировано одно или несколько фармацевтических средств согласно изобретению в соответствующих жидкостях, таких как жирные масла, жидкий парафин или жидкие полиэтиленгликоли. Помимо этого, могут быть использованы стабилизаторы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции изготавливают для буккального введения. Некоторые из таких фармацевтических композиций представляют собой изготовленные соответствующим образом таблетки или пастилки.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции изготавливают для введения путем инъекции (например, внутривенной, подкожной, внутримышечной и т.д.). В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит носитель и составлена в водном растворе, таком как вода или физиологически совместимые буферы, такие как раствор Хенкса, раствор Рингера или забуференный физиологический раствор. В некоторых вариантах осуществления включены также и другие ингредиенты (например, такие, которые добавляют для повышения растворимости или которые служат в качестве консервантов). В некоторых вариантах осуществления инъецируемые суспензии получают с использованием соответствующих жидких носителей, суспендирующих средств и т.п. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в единичной дозированной лекарственной форме, например в ампулах или в содержащих многократные дозы контейнерах. Некоторые фармацевтические композиции для инъекций представлены в виде суспензий, растворов или эмульсий в масле или водных носителях и могут содержать композиционные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие вещества. Некоторые растворители, подходящие для применения в фармацевтических композициях для инъекций, включают, но не ограничены перечисленным, липофильные растворители и жирные масла, такие как кунжутное масло, искусственные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды, а также липосомы. Водные инъецируемые суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Такие суспензии могут, но необязательно, содержать соответствующие стабилизаторы или вещества, которые повышают растворимость фармацевтических средств, позволяя продуцировать высококонцентрированные растворы.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают в форме, пригодной для введения через слизистую. В некоторых вариантах осуществления в композиции используются проникающие вещества (пенетранты), подходящие для конкретного барьера, который предстоит преодолеть. Такие проникающие вещества общеизвестны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают в форме, пригодной для введения путем ингаляции. Некоторые из таких фармацевтических композиций для ингаляций изготавливают в виде аэрозольного спрея в герметичной упаковке или небулайзере. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат пропеллент, например дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторметан, диоксид углерода или другие подходящие газы. В некоторых вариантах осуществления, связанных с использованием аэрозоля в герметичной упаковке, единичная доза может определяться пневмораспределителем (клапаном), который обеспечивает высвобождение дозированного количества. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы капсулы и картриджи для применения в ингаляторе или в инсуффляторе. Некоторые из таких композиций содержат порошковую смесь фармацевтического вещества согласно изобретению и соответствующей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию получают в форме, пригодной для ректального введения, например, в виде суппозиториев или удерживающей клизмы. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат известные ингредиенты, такие как масло какао и/или другие глицериды.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию изготавливают для местного введения. Некоторые из таких фармацевтических композиций содержат успокаивающие увлажняю
- 21 020335 щие основы, такие как мази или крема. Примеры соответствующих основ для мазей включают, но не ограничены перечисленным, вазелиновое масло, вазелиновое масло плюс летучие силиконы, а также ланолин и воду, в составе масляных эмульсий. Примеры подходящих основ для крема включают, но не ограничены перечисленным, кольдкрем и мазь-эмульсию.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция согласно изобретению содержит модифицированный олигонуклеотид в терапевтически эффективном количестве. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективным количеством является количество, достаточное для предотвращения, облегчения симптомов заболевания или улучшения состояния при заболевании, или же для продления жизни индивида, подвергающегося лечению. Определение терапевтически эффективного количества полностью находится в рамках компетентности специалистов в данной области.
В некоторых вариантах осуществления один или несколько модифицированных олигонуклеотидов согласно изобретению составлены в виде пролекарства. В некоторых вариантах осуществления при введении ίη νίνο пролекарство химически превращается в биологически, фармацевтически или терапевтически более активную форму модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления пролекарства являются полезными в силу того, что их легче вводить, чем соответствующую активную форму. Например, в некоторых случаях пролекарство может быть формой, отличающейся большей биологической доступностью (например, при пероральном введении), чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях пролекарство может иметь лучшую растворимость по сравнению с соответствующей активной формой. В некоторых вариантах осуществления пролекарства являются менее водорастворимыми, чем соответствующая активная форма. В некоторых случаях, когда водорастворимость ухудшает мобильность, такие пролекарства могут обладать исключительным проникновением через клеточные мембраны. В некоторых вариантах осуществления пролекарством является сложный эфир. В некоторых вариантах осуществления сложный эфир при введении метаболически гидролизуется до карбоновой кислоты. В некоторых случаях соединение, содержащее карбоновую кислоту, представляет собой соответствующую активную форму. В некоторых вариантах осуществления пролекарство содержит короткий пептид (полиаминокислоту), связанный с кислотной группой. В некоторых вариантах осуществления указанный пептид при введении расщепляется до формы, соответствующей активной форме.
В некоторых вариантах осуществления пролекарство продуцируется под действием модифицирующего фармацевтически активного соединения, с тем, чтобы активное соединение могло быть восстановлено при введении ίη νίνο. Пролекарство может быть создано таким образом, чтобы оно могло изменять метаболическую стабильность или транспортные характеристики лекарственного средства, с тем, чтобы обеспечить защиту от побочных эффектов или токсичности, улучшить вкусовые свойства лекарственного средства или изменить другие характеристики или свойства лекарственного средства. На основании познаний, связанных с фармакодинамическими процессами и метаболизмом лекарственного средства ίη νίνο, специалисты в данной области, знакомые с фармацевтически активным соединениям, могут создать пролекарственные формы этого соединения (см., например, Νοβπιάν (1985), Меб1С1па1 С11сш151гу А Вюс11еписа1 Лрргоаск Οχίοτά ИпАегаку Рге§8, №\ν ΥογΚ. р. 388-392).
Некоторые соединения.
В некоторых вариантах осуществления представленные в настоящем описании способы включают введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления указанное соединение состоит из модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, гибридизованный с комплементарной цепью, т.е. соединение включает двухцепочечное олигомерное соединение. В некоторых вариантах осуществления гибридизация модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью приводит к образованию форм по меньшей мере с одним затупленным концом. В некоторых вариантах осуществления гибридизация модифицированного олигонуклеотида с комплементарной цепью приводит к образованию форм с затупленным концом на каждом конце двухцепочечного олигомерного соединения. В некоторых вариантах осуществления конец модифицированного олигонуклеотида содержит один или несколько дополнительных соединенных друг с другом нуклеозидов по сравнению с числом соединенных друг с другом нуклеозидов комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько дополнительных нуклеозидов расположены на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько дополнительных нуклеозидов расположены на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одно нуклеиновое основание нуклеозида из указанных одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно РНК-мишени. В некоторых вариантах осуществления каждое нуклеиновое основание каждого из указанных одного или нескольких дополнительных нуклеозидов комплементарно РНК-мишени. В некоторых вариантах осуществления конец комплементарной цепи содержит указанные один или несколько дополнительных соединенных друг с другом нуклеозидов по сравнению с числом соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько дополнительных соединенных друг с другом нуклеозидов расположены на 3'-конце комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления указанные один или несколько дополни
- 22 020335 тельных соединенных друг с другом нуклеозидов находятся на 5'-конце комплементарной цепи. В некоторых вариантах осуществления два дополнительных соединенных друг с другом нуклеозида связаны с концом цепи. В некоторых вариантах осуществления один дополнительный нуклеозид связан с концом цепи.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, конъюгированный с одним или несколькими фрагментами, которые повышают активность, доставку к клеткам или поглощение клетками результирующих антисмысловых олигонуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления указанным фрагментом является холестериновый фрагмент или липидный фрагмент. Дополнительные фрагменты для конъюгации включают углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. В некоторых вариантах осуществления группа конъюгата напрямую присоединена к модифицированному олигонуклеотиду. В некоторых вариантах осуществления группа конъюгата присоединена к модифицированному олигонуклеотиду посредством сшивающего фрагмента, выбранного из амино, гидроксила, карбоновой кислоты, тиола, ненасыщенных связей (например, двойных или тройных связей), 8амино-3,6-диоксаоктановой кислоты (ΑΌ0), сукцинимидил-4-(№малеимидометил)циклогексан-1карбоксилата (8МСС), 6-аминогексановой кислоты (АНЕХ или ΑΗΑ), замещенного С1-С10-алкила, замещенного или незамещенного С2-Сю-алкенила и замещенного или незамещенного С2-С10-алкинила. В некоторых вариантах осуществления замещенная группа выбрана из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро, тиола, тиоалкокси, галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
В некоторых вариантах осуществления указанное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, содержащий одну или несколько стабилизирующих групп, которые присоединены к одному или обоим концам модифицированного олигонуклеотида для усиления свойств, таких, например, как стабильность к действию нуклеаз. В состав стабилизирующих групп входят блокирующие кэпструктуры. Такие концевые модификации защищают модифицированный олигонуклеотид от деградации под действием экзонуклеаз, и кэп помогает в доставке и/или локализации внутри клетки. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп), или на З'-конце (3'-кэп), или же он может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры включают, например, инвертированные кэпы, лишенные азотистого основания.
Подходящие кэп-структуры включают 4',5'-метиленнуклеотид, 1-(бета-Ээритрофуранозил)нуклеотид, 4'-тионуклеотид, карбоциклический нуклеотид, 1,5-ангидрогекситолнуклеотид, Ь-нуклеотид, альфа-нуклеотид, нуклеотид с модифицированным основанием, фосфородитиоатную связь, трео-пентофуранозильный нуклеотид, ациклический 3',4'-секо-нуклеотид, ациклический 3,4-дигидроксибутилнуклеотид, ациклический 3,5-дигидроксипентилнуклеотид, 3'-3'-инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-3'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 3'-2'инвертированный нуклеотидный фрагмент, 3'-2'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 1,4-бутандиолфосфат, 3'-фосфорамидат, гексилфосфат, аминогексилфосфат, 3'-фосфат, 3'фосфоротиоат, фосфородитиоат, образующий мостик метилфосфонатный фрагмент и не образующий мостик метилфосфонатный фрагмент 5'-аминоалкилфосфат, 1,3-диамино-2-пропилфосфат, 3аминопропилфосфат, 6-аминогексилфосфат, 1,2-аминододецилфосфат, гидроксипропилфосфат, 5'-5'инвертированный нуклеотидный фрагмент, 5'-5'-инвертированный лишенный азотистого основания фрагмент, 5'-фосфорамидат, 5'-фосфоротиоат, 5'-амино, образующий мостик и/или не образующий мостик 5'-фосфорамидат, фосфоротиоат и 5'-меркапто-фрагмент.
Некоторые последовательности нуклеиновых оснований.
Настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики фиброза. В некоторых вариантах осуществления указанные способы включают введение фармацевтической композиции, содержащей модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления указанные способы включают введение соединения, содержащего модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, которая комплементарна ш1-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления указанная ш1-РНК представляет собой шЖ-21.
Описанные в настоящем описании последовательности нуклеиновых оснований зрелых ιιιί-РНК и соответствующие им последовательности стебель-петля являются последовательностями, обнаруживаемыми в шЖВаке, базе данных для поиска в диалоговом режиме последовательностей ιιιί-РНК и аннотаций, находящихся по адресу: ййр://ш1сгогиа.8аидег.ас.ик/. Вводимые в базу данных шЖВаке последовательности представляют собой предсказанную часть шпильки ш1-РНК-транскрипта (стебель-петля) с информацией по локализации и последовательности зрелой последовательности ш1-РНК. Последовательности стебель-петля ιηί-РНК в базе данных не являются точными предшественниками последовательностей ш1-РНК (пре-ш1-РНК) и в некоторых случаях могут включать пре-ш1-РНК и некую фланкирующую последовательность из предполагаемого первичного транскрипта. Описанные в настоящем описании последовательности нуклеиновых оснований ιιιί-РНК охватывают любую версию ил-РНК. включая последовательности, описанные в выпуске 10.0 базы данных последовательностей шЖВаке, и последовательности, описанные в любом из более ранних выпусков базы данных последовательностей ιιιίΚВаке. Серия выпусков базы данных может привести к тому, что будут изменены названия некоторых ш1
- 23 020335
РНК. Серия выпусков базы данных может привести к тому, что [между ними] будут иметь место вариации последовательности зрелой Ш1-РНК. Соединения согласно изобретению охватывают модифицированные олигонуклеотиды, которые комплементарны любой версии последовательности нуклеиновых оснований описанных в настоящем описании Ш1-РНК.
Понятно, что любая отраженная в настоящем описании последовательность нуклеиновых оснований не зависима от какой бы то ни было модификации фрагмента сахара, межнуклеотидной связи или нуклеинового основания. Кроме того, понятно и то, что последовательность нуклеиновых оснований, содержащая И (урацилы), охватывает также и такую же самую последовательность нуклеиновых оснований, в которой И заменено на Т (тимин) в одном или нескольких положениях, в которых стоит И. И наоборот, следует понимать, что последовательность нуклеиновых оснований, содержащая Т (тимины), охватывает также и такую же самую последовательность нуклеиновых оснований, в которой Т заменено на И в одном или нескольких положениях, в которых стоит Т.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна Ш1-РНК или ее предшественнику, что означает, что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида является по меньшей мере на 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 или 99% идентичной комплементу Ш1-РНК или ее предшественнику на участке из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более нуклеиновых оснований, или что указанные две последовательности гибридизуются в жестких условиях гибридизации. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида может иметь одно или несколько не совпадающих пар оснований по сравнению с ее т1-РНК-мишенью или с последовательностью-предшественником т1-РНК-мишени и способна к гибридизации с ее последовательностью-мишенью. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая на 100% комплементарна Ш1-РНК или ее предшественнику. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет полноразмерную комплементарность Ш1-РНК.
В некоторых вариантах осуществления Ш1Я-21 имеет последовательность нуклеиновых оснований 5'-иЛ6СииЛиСА6ЛСибЛибиибА-3' (8ЕО ΙΌ NΟ: 1). В некоторых вариантах осуществления последовательность стебель-петля Ш1Я-21 имеет последовательность нуклеиновых оснований 5'ибиСбббиАбСииАиСАбАСибАибиибАСибиибААиСиСАиббСААСАССАбиСблибббС иоиСибАСА-3' <8ео ιό 11).
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований Ш1Я-21, представленной как 8ЕО ΙΌ ^: 1.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований стебель-петля Ш1-РНК, представленной как 8ЕО ΙΌ NΟ: 11. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна области нуклеиновых оснований 8-29 последовательности 8ЕО ΙΌ NΟ: 11. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность, которая комплементарна области нуклеиновых оснований 46-66 последовательности 8ЕО ΙΌ NΟ: 11.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, содержащую последовательность нуклеиновых оснований 5'иСААСАиСАбиСибАиАА6СиА-3' (8ЕО ΙΌ ΝΌ: 12).
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, состоящую из последовательности нуклеиновых оснований, представленной как 8ЕО ΙΌ NΟ: 12.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований при-т1Я, содержащей Ш1Я-21.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности нуклеиновых оснований, представленной в последовательности 8ЕО ΙΌ NΟ: 1. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% идентичной последовательности нуклеиновых оснований, представленной в последовательности 8ЕО ΙΌ NΟ: 1.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 80% идентичной последовательности нуклеиновых оснований стебель-петля в Ш1Я21, представленной как 8ЕО ΙΌ NΟ: 11. В некоторых вариантах осуществления модифицированный оли
- 24 020335 гонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая комплементарна последовательности нуклеиновых оснований, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 96% или по меньшей мере на 98% идентичной последовательности нуклеиновых оснований стебель-петля в т1В-21, представленной в последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 11.
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет полноразмерную комплементарность указанной в настоящем описании последовательности нуклеиновых оснований тъРНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, имеющую одно несовпадение по сравнению с последовательностью нуклеиновых оснований зрелой т1РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, имеющую два несовпадения по сравнению с последовательностью нуклеиновых оснований зрелой шЕРНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, имеющую не больше двух несовпадений по сравнению с последовательностью нуклеиновых оснований зрелой ιιιί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления не совпадающие (несопряженные) нуклеиновые основания являются смежными основаниями. В некоторых вариантах осуществления не совпадающие (несопряженные) нуклеиновые основания не являются смежными основаниями.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из такого числа соединенных друг с другом нуклеозидов, которое равно длине зрелой т1-РНК, которой он комплементарен.
В некоторых вариантах осуществления число соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида составляет менее длины зрелой т1-РНК, которой он комплементарен. В некоторых вариантах осуществления число соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида составляет на один нуклеозид меньше, чем длина зрелой т1-РНК, которой он комплементарен. В некоторых вариантах такого рода осуществлений модифицированный олигонуклеотид содержит одним нуклеозидом меньше на своем 5'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одним нуклеозидом меньше на своем 3'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит двумя нуклеозидами меньше на своем 5'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит двумя нуклеозидами меньше на своем 3'-конце. Модифицированный олигонуклеотид, имеющий число соединенных друг с другом нуклеозидов, которое меньше, чем длина т1-РНК, где каждое нуклеиновое основание модифицированного олигонуклеотида комплементарно каждому нуклеиновому основанию в соответствующем положении т1-РНК, считается модифицированным олигонуклеотидом, имеющим последовательность нуклеиновых оснований, на 100% комплементарную части последовательности т1РНК.
В некоторых вариантах осуществления число соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида больше, чем длина ιηί-РНК, которой он комплементарен. В некоторых вариантах таких осуществлений нуклеиновое основание добавочного нуклеозида комплементарно нуклеиновому основанию последовательности стебель-петля в ιιιί-РНК. В некоторых вариантах осуществления число соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида составляет на один нуклеозид больше, чем длина т1-РНК, которой он комплементарен. В некоторых вариантах таких осуществлений добавочный нуклеозид находится на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах таких осуществлений добавочный нуклеозид находится на 3'-конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления число соединенных друг с другом нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида составляет на два нуклеозида больше, чем длина ιιιί-РНК, которой он комплементарен. В некоторых вариантах осуществления два нуклеозида расположены на 5'конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления два нуклеозида расположены на 5'-конце модифицированного олигонуклеотида. В некоторых вариантах осуществления один добавочный нуклеозид расположен на 5'-конце и один добавочный нуклеозид расположен на 3'конце модифицированного олигонуклеотида.
В некоторых вариантах осуществления часть последовательности нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований т1-РНК, тогда как по всей своей длине модифицированный олигонуклеотид не на 100% комплементарен. В некоторых вариантах осуществления число нуклеозидов модифицированного олигонуклеотида, имеющего на 100% комплементарную часть, больше, чем длина указанной ιιιί-РНК. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 24 соединенных друг с другом нуклеозидов, в котором каждое нуклеиновое основание нуклеозидов от 1 до 23 комплементарно соответствующему положению ιιιί-РНК, которая состоит из 23 нуклеиновых оснований в длину, имеет часть, состоящую из 23 нуклеозидов, которая на 100% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований ιιιί-РНК, что приблизительно составляет 96% его общей комплементарности последовательности нуклеиновых оснований ιιιί-РНК.
- 25 020335
В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна части последовательности нуклеиновых оснований ηί-РНК. Например, модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 22 соединенных друг с другом нуклеозидов, в котором каждое нуклеиновое основание нуклеозидов, от 1 до 22, комплементарно соответствующему положению ηί-РНК, которая состоит из 23 нуклеиновых оснований в длину, имеет 100% комплементарность части из 22 нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований ηί-РНК. Такой модифицированный олигонуклеотид приблизительно на 96% комплементарен полной последовательности нуклеиновых оснований ηί-РНК и на 100% комплементарен части ηί-РНК, составляющей 22 нуклеиновых основания.
В некоторых вариантах осуществления часть последовательности нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на 100% комплементарна последовательности нуклеиновых оснований ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 15 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 15 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 16 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 16 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 17 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 17 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 18 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 18 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 19 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 19 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 20 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 20 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 22 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 22 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 23 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 23 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника. В некоторых вариантах осуществления каждое из 24 смежных нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарно 24 смежным нуклеиновым основаниям ηί-РНК или ее предшественника.
Некоторые модифицированные олигонуклеотиды.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12-30 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15-25 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19-24 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21-24 соединенных друг с другом нуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 12 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 13 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 14 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 15 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 16 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 17 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 18 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 19 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 21 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 22 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 23 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 24 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 25 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 26 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 27 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 28 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состоит из 29 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид состо
- 26 020335 ит из 30 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит соединенные друг с другом нуклеозиды, выбранные из смежных нуклеиновых оснований последовательности 8ЕО ΙΌ N0: 12.
Некоторые модификации.
Модифицированные олигонуклеотиды согласно изобретению содержат одну или несколько модификаций нуклеинового основания, сахара и/или межнуклеозидной связи. Модифицированное нуклеиновое основание, сахар и/или межнуклеозидная связь могут быть выбраны из различных немодифицированных форм, в силу требуемых свойств, таких, например, как повышенное поглощение клетками, повышенная аффинность в отношении других олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот-мишеней и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид согласно изобретению содержит один или несколько модифицированных нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеозид является стабилизирующим нуклеозидом. Примером стабилизирующего нуклеозида является модифицированный сахаром нуклеозид.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный нуклеозид является модифицированным сахаром нуклеозидом. В некоторых вариантах осуществления модифицированный сахаром нуклеозид может дополнительно содержать природный или модифицированный фрагмент гетероциклического основания и/или природную или модифицированную межнуклеозидную связь и может дополнительно содержать модификации, независимо от модификаций сахара. В некоторых вариантах осуществления модифицированный сахаром нуклеозид представляет собой 2'-модифицированный нуклеозид, в котором сахарное кольцо модифицировано в положении 2'-углерода из природной рибозы или 2'-дезоксирибозы.
В некоторых вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид имеет бициклический фрагмент сахара. В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара представляет собой Ό-сахар в альфа-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара представляет собой Ό-сахар в бета-конфигурации. В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара представляет собой Ь-сахар в альфаконфигурации. В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара представляет собой Ь-сахар в бета-конфигурации.
В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара содержит мостиковую группу между 2'- и 4'-углеродными атомами. В некоторых вариантах осуществления указанная мостиковая группа содержит от 1 до 8 сопряженных бирадикальных групп. В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара содержит от 1 до 4 сопряженных бирадикальных групп. В некоторых вариантах осуществления бициклический фрагмент сахара содержит 2 или 3 сопряженные бирадикальные группы. В некоторых вариантах осуществления бициклический фрагмент сахара содержит 2 сопряженные бирадикальные группы. В некоторых вариантах осуществления указанная сопряженная бирадикальная группа выбрана из -0-, -8-, -Ν(Ρ,)-. -С(Р1)(Р2)-, -С(Р1)=С(Р1)-, -0(Κ1)=Ν-, -0(=ΝΚι)-, -81(Р1)(Р2)-, -8(=0)2-, -8(=0)-, -С(=0)- и -С(=8)-; каждый из Р1 и Р2 независимо представляет собой Н, гидроксил, С1-С12-алкил, замещенный С1-С12-алкил, С2-С12-алкенил, замещенный С2-С|2алкенил, С2-С12-алкинил, замещенный С2-С12-алкинил, С5-С20-арил, замещенный С5-С20-арил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, С5-С7алициклический радикал, замещенный С5-С7-алициклический радикал, галоген, замещенный окси(-О-), амино, замещенный амино, азидо, карбоксил, замещенный карбоксил, ацил, замещенный ацил, 0Ν, тиол, замещенный тиол, сульфонил (8(=0)2-Н), замещенный сульфонил, сульфонил(8(=0)-Н) или замещенный сульфонил; и каждая замещенная группа независимо представляет собой галоген, С1-С12-алкил, замещенный С1-С12-алкил, С2-С12-алкенил, замещенный С2-С12-алкенил, С2-С12-алкинил, замещенный С2-С12алкинил, амино, замещенный амино, ацил, замещенный ацил, С1-С12-аминоалкил, С1-С12-аминоалкокси, замещенный С1-С12-аминоалкил, замещенный С1-С12-аминоалкокси или защитную группу.
В некоторых вариантах осуществления указанный бициклический фрагмент сахара образует мостиковую связь между 2'- и 4'-углеродными атомами с бирадикальной группой, выбранной из -О-(СН2)р-, -ОСН2-, -О-СН2СН2-, -О-СН(алкил)-, -ΝΗ-(€Η2)ρ-, ^(алкил)-(СН2)р-, -О-СН(алкил)-, -(СН(алкил))-(СН2)р-, -NΗ-0-(СН2)ρ-, -^алкил)-О-(СН2)р- или -0-^алкил)-(СН2)р-, где р представляет собой 1, 2, 3, 4 или 5, и каждая алкильная группа может быть дополнительно замещена. В некоторых вариантах осуществления р является 1, 2 или 3.
В некоторых вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из галогена, аллила, амино, азидо, 8Η, 0Ν, 0СН СР3, 0СР3, 0-, 8- или ^Рт)-алкила; 0-, 8- или ^Рт)-алкенила; 0-, 8- или ^Рт)-алкинила; 0-алкиленил-О-алкила, алкинила, алкарила, аралкила, О-алкарила, О-аралкила, 0(СН2)28СН3, О-(СН2)2-0-^Рт)(Рп) или О-СН2-С(=0)-^Рт)(Рп), где каждый Рт и Рп независимо представляет собой Н, амино-защитную группу, либо замещенную, либо незамещенную С1-С10-алкилом. Указанные 2'-замещающие группы могут быть дополнительно замещены одной или несколькими защитными группами, независимо выбранными из гидроксила, амино, алкокси, карбокси, бензила, фенила, нитро (Ν02), тиола, тиоалкокси (8-алкил), галогена, алкила, арила, алкенила и алкинила.
- 27 020335
В некоторых вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из Ε, ΝΗ2, Ν3, ОСЕ3, О-СН3, О(СН2)31ХН2, СН2-СН=СН2, О-СН2-СН=СН2, ОСН2СН2ОСН3, О(СН2)28СН3, О-(СН2)2-О-^Вш)(Вп), -О(СН2)2О(СН2)^(СН3)2 и Ν-замещенного ацетамида (О-СН2-С(=О)-^К.ш)(Вп)), где каждый .ш и .η независимо представляет собой Н, амино-защитную группу, либо замещенную, либо незамещенную Ц-Сю-алкилом.
В некоторых вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из Ε, ОСЕ3, О-СН3, ОСН2СН2ОСН3, 2'-О(СН2)28СН3, О-(СН2)2-О^(СН3)2, О(СН2)2О(СН2)^(СН3)2 и О-СН2-С(=О)-^Н)СН3.
В некоторых вариантах осуществления 2'-модифицированный нуклеозид содержит 2'-замещающую группу, выбранную из Ε, О-СН3 и ОСН2СН2ОСН3.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный по сахару нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления модифицированный по сахару нуклеозид представляет собой 4'-тио-2'-модифицированный нуклеозид. 4'-тиомодифицированный нуклеозид содержит β-Ό-рибонуклеозид, в котором 4'-О заменено на 4'-8. 4'-тио-2'модифицированный нуклеозид представляет собой 4'-тио-модифицированный нуклеозид, в котором 2'ОН заменено 2'-замещенной группой. Подходящие 2'-замещенные группы включают 2'-ОСН3, 2'-О(СН2)2-ОСН3 и 2'-Ε.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит одну или несколько межнуклеозидных модификаций. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная модификация модифицированного олигонуклеотида представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь содержит атом фосфора.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного олигонуклеотида представляет собой фосфоротиоатную межнуклеозидную связь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированная межнуклеозидная связь не содержит атома фосфора. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована межнуклеозидной связью из алкила с короткой цепью. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована циклоалкильными межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована смешанной межнуклеозидной связью гетероатома и алкила. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована смешанными межнуклеозидными связями гетероатома и циклоалкила. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована одной или несколькими межнуклеозидными связями гетероатома с короткой цепью. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь образована одной или несколькими гетероциклическими межнуклеозидными связями. В некоторых вариантах осуществления межнуклеозидная связь имеет амидный остов. В некоторых вариантах осуществления в межнуклеозидной связи смешаны компоненты Ν, О, 8 и СН2.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит один или несколько 5-метилцитозинов. В некоторых вариантах осуществления каждый цитозин модифицированного олигонуклеотида содержит 5-метилцитозин.
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5гидроксиметилцитозина, 7-деазагуанина и 7-деазааденина. В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 7-деазааденина, 7-деазагуанозина, 2-аминопиридина и 2-пиридона. В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание выбрано из 5-замещенных пиримидинов, 6-азапиримидинов и Ν-2, Ν-6 и О-6-замещенных пуринов, включая 2аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит полициклический гетероцикл. В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит трициклический гетероцикл. В некоторых вариантах осуществления модифицированное нуклеиновое основание содержит производное феноксазина. В некоторых вариантах осуществления феноксазин может быть дополнительно модифицирован, с образованием нуклеинового основания, известного в данной области как С-кламп.
Некоторые олигонуклеотидные мотивы.
Подходящие мотивы для модифицированных олигонуклеотидов согласно настоящему изобретению включают, но не ограничены перечисленным, полностью модифицированные, одинаково модифицированные, позиционно модифицированные мотивы и олигомер с пропусками. Модифицированные олигонуклеотиды, имеющие полностью модифицированный мотив, включая одинаково модифицированный мотив, могут быть сконструированы таким образом, чтобы они были нацелены на зрелые ш1-РНК. Альтернативно, модифицированные олигонуклеотиды, имеющие полностью модифицированный мотив, включая одинаково модифицированный мотив, могут быть сконструированы таким образом, чтобы они
- 28 020335 были нацелены на определенные участки при-т1-РНК или пре-т1-РНК, с целью блокирования процессинга предшественников т1-РНК в зрелые т1-РНК. Модифицированные олигонуклеотиды, имеющие полностью модифицированный мотив или одинаково модифицированный мотив, являются эффективными ингибиторами активности т1-РНК.
В некоторых вариантах осуществления полностью модифицированный олигонуклеотид содержит модификацию сахара на уровне каждого нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления большинство нуклеозидов являются 2'-О-метоксиэтилнуклеозидами, а остальные нуклеозиды являются 2'фторнуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления каждый из большинства нуклеозидов является 2'-0-метоксиэтилнуклеозидом, и каждый из большинства нуклеозидов является бициклическим нуклеозидом. В некоторых вариантах осуществления полностью модифицированный олигонуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь олигонуклеотида, модифицированного полностью по сахару, является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления полностью модифицированный по сахару олигонуклеотид, модифицированный полностью по сахару, дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь модифицированного полностью по сахару олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
В некоторых вариантах осуществления полностью модифицированный олигонуклеотид является модифицированным на уровне каждой межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь полностью модифицированного олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
В некоторых вариантах осуществления одинаково модифицированный олигонуклеотид содержит одну и ту же модификацию сахара на уровне каждого нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модификацию 2'-О-метоксиэтилсахар. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модификацию 2'-0-метил-сахар. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид модифицированного олигонуклеотида содержит модификацию 2'-фтор-сахар. В некоторых вариантах осуществления одинаковым образом модифицированный олигонуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь одинаковым образом модифицированного по сахару олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления одинаковым образом модифицированный по сахару олигонуклеотид дополнительно содержит по меньшей мере одну фосфоротиоатную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь одинаковым образом модифицированного по сахару олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
В некоторых вариантах осуществления одниково модифицированный олигонуклеотид по всей длине содержит одну и ту же модификацию межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь одинаково модифицированного олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну и ту же модификацию сахара на уровне каждого нуклеозида и дополнительно содержит одну или несколько модификаций межнуклеозидной связи. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит одну модифицированную межнуклеозидную связь на 5'-конце и одну модифицированную межнуклеозидную связь на 3'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит две модифицированные межнуклеозидные связи на 5'-конце и две модифицированные межнуклеозидные связи на З'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит две модифицированные межнуклеозидные связи на 5'-конце и три модифицированные межнуклеозидные связи на З'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит две модифицированные межнуклеозидные связи на 5'-конце и четыре модифицированные межнуклеозидные связи на З'-конце. В некоторых вариантах осуществления модифицированной межнуклеозидной связью является фосфоротиоатная межнуклеозидная связь.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид представлен следующей формулой (III):
В некоторых вариантах осуществления соединение представлено формулой (III). В некоторых вариантах осуществления 0 является 2'-О-метил-модифицированным нуклеозидом. В некоторых вариантах осуществления х является фосфоротиоатом. В некоторых вариантах осуществления у является фосфодиоэфиром. В некоторых вариантах осуществления каждый из ζ1, ζ2, ζ3 и ζ4 независимо является фосфоротиоатом или фосфодиоэфиром. В некоторых вариантах осуществления η принимает значения от 6 до 17. В некоторых вариантах осуществления Ь является холестерином. В некоторых вариантах осуществления η принимает значения от 12 до 17.
- 29 020335
В некоторых вариантах осуществления х представляет собой
одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О; у представляет собой
каждый из ζ1, ζ2, ζ3 и ζ4 независимо представляет собой х или у; п=6-17;
Ь представляет собой
в которой X представляет собой Ν(00)Κ7 или Ν.7;
каждый из К1, .3 и К9 независимо представляет собой Н, ОН или -СН20Кь, при условии, что по
9 13 9 меньшей мере один из К , К и К представляет собой ОН и по меньшей мере один из К , К и К представляет собой -СН20Кь;
К7 представляет собой К.'1 или С1-С20-алкил, замещенный NКсК' или NНС(0)К';
Кс представляет собой Н или С1-С6-алкил;
К' представляет собой углеводный радикал или стероидный радикал, который необязательно привязан по меньшей мере к одному углеводному радикалу;
Кь представляет собой
где одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О.
В некоторых вариантах осуществления К' представляет собой холестерин. В некоторых вариантах осуществления каждый из ζ1, ζ2, ζ3 и ζ4 представляет собой
где одно из А и В является 8, тогда как другое представляет собой О.
В некоторых вариантах осуществления К1 представляет собой -СН20Кь В некоторых вариантах осуществления К9 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления К1 и К9 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления К9 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления К1 и К3 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления К3 представляет собой -СН20Кь В некоторых вариантах осуществления К1 является ОН. В некоторых вариантах осуществления К1 и К3 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления К9 представляет собой ОН. В некоторых вариантах осуществления К3 и К9 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления К9 представляет собой -СН20Кь. В некоторых вариантах осуществления К1 представляет собой 0Н. В некоторых вариантах осуществления К1 и К9 представлены в транс-конфигурациях. В некоторых вариантах осуществления X представляет собой ^(0)К7. В некоторых вариантах осуществления К7 представляет собой -СН2(СН2)зСН2NНС(О)К'.
В некоторых вариантах осуществления позиционно модифицированный олигонуклеотид содержит области соединенных друг с другом нуклеозидов, где каждый нуклеозид каждой области содержит один и тот же фрагмент сахара и где каждый нуклеозид каждой области содержит фрагмент сахара, отличный от такового смежной области.
В некоторых вариантах осуществления позиционно модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 10 2'-фтор-модифицированных нуклеозидов. Такой позиционно модифицированный
- 30 020335 олигонуклеотид может быть представлен следующей формулой (I):
в которой каждый Νηι и Νυ3 независимо представляет собой стабилизирующий нуклеозид;
по меньшей мере 10 Νυ2 представляют собой 2'-фтор-нуклеозиды;
каждый Ь1, Ь2 и Ь3 независимо представляет собой межнуклеозидную связь;
каждый Т1 и Т2 независимо представляет собой Н, гидроксильную защитную группу, необязательно присоединенную группу конъюгата или блокирующую кэп-группу;
щ принимает значения от 0 приблизительно до 3;
п2 принимает значения от приблизительно 14 примерно до 22;
п3 принимает значения от 0 приблизительно до 3;
при условии, что если щ равно 0, тогда Т1 не является Н или гидроксильной защитной группой, а если п3 равно 0, тогда Т2 не является Н или гидроксильной защитной группой.
В некоторых вариантах осуществления каждый из щ и п3 независимо принимают значения от 1 приблизительно до 3. В некоторых вариантах осуществления каждый из щ и п3 независимо принимают значения от 2 приблизительно до 3. В некоторых вариантах осуществления щ равно 1 или 2, а п3 равно 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления каждый из щ и п3 равны 2. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из щ и п3 больше нуля. В некоторых вариантах осуществления каждый из щ и п3 больше нуля. В некоторых вариантах осуществления один из щ и п3 больше нуля. В некоторых вариантах осуществления один из щ и п3 больше единицы.
В некоторых вариантах осуществления п2 принимает значения от 16 до 20. В некоторых вариантах осуществления п2 принимает значения от 17 до 19. В некоторых вариантах осуществления п2 равно 18. В некоторых вариантах осуществления п2 равно 19. В некоторых вариантах осуществления п2 равно 20.
В некоторых вариантах осуществления приблизительно от 2 примерно до 8 нуклеозидов Νυ2 являются стабилизирующими нуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления приблизительно от 2 примерно до 6 нуклеозидов Νυ2 являются стабилизирующими нуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления приблизительно от 3 примерно до 4 нуклеозидов Νυ2 являются стабилизирующими нуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления 3 нуклеозида Νυ2 являются стабилизирующими нуклеозидами.
В некоторых вариантах осуществления каждый из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 отделен от стабилизирующих нуклеозидов Νυ3 от 2 приблизительно до 8 2'-фторнуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления каждый из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 отделен от стабилизирующих нуклеозидов Νυ3 от 3 приблизительно до 8 2'-фторнуклеозидами. В некоторых вариантах осуществления каждый из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 отделен от стабилизирующих нуклеозидов Νυ3 от 5 приблизительно до 8 2'-фторнуклеозидами.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит от 2 приблизительно до 6 стабилизирующих нуклеозидов Νυ2. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид содержит 3 стабилизирующих нуклеозида Νυ2.
В некоторых вариантах осуществления каждый из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 соединены друг с другом в одну непрерывную последовательность. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 разделены по меньшей мере одним из 2'фторнуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления каждый из стабилизирующих нуклеозидов Νυ2 разделены по меньшей мере одним из 2'-фторнуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере две непрерывные последовательности Nи2-2'-фторнуклеозидов разделены по меньшей мере одним из стабилизирующих нуклеозидов, при этом каждая из указанных непрерывных последовательностей имеет одно и то же число 2'-фторнуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления каждый Т1 и Т2 независимо представляет собой Н или гидроксильную защитную группу. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из Т1 и Т2 представляет собой 4,4'-диметокситритил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из Т1 и Т2 является необязательно присоединенной группой конъюгата. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из Т1 и Т2 является блокирующей кэп-группой. В некоторых вариантах осуществления блокирующая кэп-группа представляет собой инвертированную группу дезоксирибозы с удаленными азотистыми основаниями.
В некоторых вариантах осуществления позиционно модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь позиционно модифицированного олигонуклеотида является модифицированной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна межнуклеозидная связь позиционно модифицированного олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления каждая межнуклеозидная связь позиционно модифицированного олигонуклеотида является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью.
В некоторых вариантах осуществления позиционно модифицированный мотив представлен следующей формулой (II), которая представляет собой модифицированный олигонуклеотид, состоящий из
- 31 020335 соединенных друг с другом нуклеозидов
Τι- (N111) ηί- (Ыи2) г>2- (Νιι3) пз“ (Ыи4) η4- (Νυ5) п5-Т2, в которой Ки1 и М15 независимо представляют собой 2'-стабилизирующие нуклеозиды;
№2 и Ищ являются 2'-фторнуклеозидами;
Ииз является 2'-модифицированным нуклеозидом;
каждый из п1 и п5 независимо принимает значения от 0 до 3; сумма п2 плюс п4 составляет от 10 до 25;
п3 принимает значения от 0 до 5; и каждый Т1 и Т2 независимо представляет собой Н, гидроксильную защитную группу, необязательно присоединенную группу конъюгата или блокирующую кэп-группу.
В некоторых вариантах осуществления сумма п2 и п4 составляет 16. В некоторых вариантах осуществления сумма п2 и п4 составляет 17. В некоторых вариантах осуществления сумма п2 и п4 составляет 18. В некоторых вариантах осуществления п1 равно 2; п3 равно 2 или 3; п5 равно 2.
В некоторых вариантах осуществления Ки1 и независимо представляют собой 2'модифицированные нуклеозиды.
В некоторых вариантах осуществления Ки1 представляет собой О-(СН2)2-ОСН3, №3 представляет собой О-(СН2)2-ОСН3, представляет собой О-(СН2)2-ОСН3, Т1 представляет собой Н и Т2 представляет собой Н.
В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, комплементарный ιηίРНК и состоящий из 22 соединенных друг с другом нуклеозидов, имеет формулу (II), выбранную из табл. А, в которой каждая межнуклеозидная связь является фосфоротиоатной межнуклеозидной связью. В некоторых вариантах осуществления модифицированный олигонуклеотид, имеющий формулу (II), выбранную из табл. А, имеет последовательность нуклеиновых оснований 8ЕО ГО N0: 12.
Таблица А
ηί п2 пЗ п5 Νυη Ыи3 Ыи5 Τί Т2
2 18 0 0 2 2’-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ Н н
2 2 2 14 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 21-МОЕ н н
2 3 2 13 2 2’-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 4 2 12 2 2’-МОЕ 2'-МОЕ 21-МОЕ н н
2 5 2 11 2 2’-МОЕ 2Х-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 6 2 10 2 21-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 7 2 9 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 8 2 8 2 2'-МОЕ 21-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 9 2 7 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 10 2 6 2 21-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 11 2 5 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ и н
2 12 2 4 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 13 2 3 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 14 2 2 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 2 3 13 2 2’-МОЕ 2’-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 3 3 12 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 4 3 11 2 2'-МОЕ 2 ' -МОЕ 2'-МОЕ н н
2 5 3 10 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 6 3 9 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 7 3 8 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 8 3 7 2 2'-МОЕ 21-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 9 3 6 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 10 3 5 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ и н
2 11 3 4 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2’-МОЕ н н
2 12 3 3 2 2'-МОЕ 2'-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 13 3 2 2 2'-МОЕ 2 '-МОЕ 2'-МОЕ н н
2 8 6 4 2 2’-МОЕ 2’-МОЕ 2'-МОЕ н н
Модифицированный олигонуклеотид, содержащий мотив олигомера с пропусками, может иметь
- 32 020335 внутреннюю область, состоящую из соединенных 2'-дезоксинуклеотидов, и наружные области, состоящие из соединенных 2'-модифицированных нуклеозидов. Такой олигомер с пропусками может быть сконструирован для того, чтобы вызвать расщепление РНКазой Н предшественника Ш1-РНК. Внутренняя 2'-дезоксинуклеозидная область служит в качестве субстрата для РНКазы Н, допуская расщепление предшественника Ш1-РНК, на который нацелен модифицированный олигонуклеотид. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид каждой наружной области содержит один и тот же 2'модифицированный нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления одна наружная область одинаковым образом состояла из первого 2'-модифицированного нуклеозида, а другая наружная область одинаковым образом состояла из второго 2'-модифицированного нуклеозида.
Модифицированный олигонуклеотид, содержащий мотив олигомера с пропусками, может иметь модификацию сахара на уровне каждого нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область одинаковым образом состоит из первого 2'-модифицированного нуклеозида, а каждая из боковых привесков одинаковым образом состоит из второго 2'-модифицированного нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область одинаковым образом состоит из 2'-фторнуклеозидов, а каждая наружная область одинаковым образом состоит из 2'-О-метоксиэтилнуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления каждая наружная область олигомера с пропусками состоит из соединенных 2'-О-метоксиэтилнуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления каждая наружная область олигомера с пропусками состоит из соединенных 2'-О-метилнуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления каждая наружная область олигомера с пропусками состоит из 2'-фторнуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления каждая наружная область олигомера с пропусками состоит из соединенных бициклических нуклеозидов.
В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит другую 2'-модификацию. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит 2'-О-метилнуклеозиды. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-Ометоксиэтилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит 2'-фторнуклеозиды. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-О-метилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит 2'фторнуклеозиды. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-О-метоксиэтилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит бициклические нуклеозиды. В некоторых вариантах осуществления каждый нуклеозид одной наружной области олигомера с пропусками содержит 2'-О-метилнуклеозиды, а каждый нуклеозид другой наружной области содержит бициклические нуклеозиды.
В некоторых вариантах осуществления нуклеозиды одной наружной области содержат две или более модификаций сахара. В некоторых вариантах осуществления нуклеозиды каждой наружной области содержат две или более модификаций сахара. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид наружной области содержит 2'-О-метоксиэтилсахар и по меньшей мере один нуклеозид той же самой наружной области содержит 2'-фторсахар. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид наружной области содержит 2'-О-метоксиэтилсахар и по меньшей мере один нуклеозид той же самой наружной области содержит бициклический фрагмент сахара. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид наружной области содержит 2'-О-метилсахар и по меньшей мере один нуклеозид той же самой наружной области содержит бициклический фрагмент сахара. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид наружной области содержит 2'-О-метилсахар и по меньшей мере один нуклеозид той же самой наружной области содержит 2'фторсахар. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один нуклеозид наружной области содержит 2'-фторсахар и по меньшей мере один нуклеозид той же самой наружной области содержит бициклический фрагмент сахара.
В некоторых вариантах осуществления каждая наружная область олигомера с пропусками состоит из одного и того же числа соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления одна наружная область олигомера с пропусками состоит из числа соединенных друг с другом нуклеозидов, которое отлично от такового другой наружной области.
В некоторых вариантах осуществления указанные наружные области независимо включают от 1 до 6 нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 1 нуклеозид. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 2 нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 3 нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 4 нуклеозида. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 5 нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления наружная область содержит 6 нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления наружная область состоит из 17-28 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления наружная область состоит из 17-21 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 17 соединен
- 33 020335 ных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 18 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 19 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 20 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 21 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 22 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 23 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 24 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 25 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 26 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 27 соединенных друг с другом нуклеозидов. В некоторых вариантах осуществления внутренняя область состоит из 28 соединенных друг с другом нуклеозидов.
Некоторые количественные анализы.
Эффекты антисмыслового ингибирования ιηί-РНК после введения модифицированных олигонуклеотидов могут быть оценены различными способами, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления указанные способы используются для количественной оценки уровней ιιιί-РНК в клетках или тканях ίη νίίτο или ίη νίνο. В некоторых вариантах осуществления изменения в уровнях т1РНК измеряют с помощью анализа с использованием микрочипа. В некоторых вариантах осуществления изменения в уровнях ιιιί-РНК измеряют с помощью одного из нескольких коммерчески доступных ПЦРанализов, таких как анализ микро-РНК ΤαςΜαη1'1'·' (ЛррНей Вю^уЛсиъ). В некоторых вариантах осуществления антисмысловое ингибирование ιιιί-РНК устанавливают путем измерения мРНК и/или уровень белка-мишени т1-РНК. Антисмысловое ингибирование т1-РНК обычно приводит к повышению уровня мРНК и/или белка-мишени т1-РНК.
Некоторые экспериментальные модели.
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам применения и/или тестирования модифицированных олигонуклеотидов согласно изобретению в экспериментальной модели. В некоторых вариантах осуществления экспериментальные модели используют для оценки эффективности модифицированных олигонуклеотидов согласно изобретению в отношении лечения фиброзов. Специалисты в данной области могут выбрать и модифицировать протоколы указанных экспериментальных моделей для оценки фармацевтического средства согласно изобретению.
Модифицированные олигонуклеотиды можно сначала тестировать на культивируемых клетках. Подходящие типы клеток включают клетки, родственные тому типу клеток, к которому требуется осуществить доставку модифицированного олигонуклеотида ίη νίνο. Например, подходящие типы клеток для изучения модифицированных олигонуклеотидов для лечения фиброза включают фибробласты, кардиомиоциты и звездчатые клетки.
В некоторых вариантах осуществления степень, в которой модифицированный олигонуклеотид ингибирует активность т1-РНК, устанавливают в культивируемых клетках. В некоторых вариантах осуществления ингибирование активности ιιιί-РНК может быть установлено путем измерения уровней т1-РНК. Альтернативно, может быть измерен уровень предсказанной или установленной т1-РНК-мишени. Ингибирование активности т1-РНК может привести к увеличению мРНК и/или белка т1-РНК-мишени. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления могут быть измерены некоторые фенотипические последствия. Например, применимые фенотипические последствия включают ингибирование клеточной пролиферации, индукцию клеточной гибели и/или индукцию апоптоза.
После идентификации ίη νίίτο модифицированного олигонуклеотида, который эффективно ингибирует активность т1-РНК, модифицированные олигонуклеотиды дополнительно тестировали на экспериментальных моделях ίη νίνο.
Подходящие экспериментальные модели для тестирования фармацевтических средств для лечения фиброза, включая фармацевтические средства, содержащие модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные т1В-122, включают представленную в настоящем описании модель гипертрофии, индуцированной избыточным давлением.
Дополнительные экспериментальные модели для тестирования фармацевтических средств для лечения фиброза включают, но не ограничены перечисленным, модель диеты, дефицитной в отношении метионинхолина (МСЭ) (см., например, УатадисЫ с1 а1., Неракк§у, 2008, 47, 625-635). У мышей ЙЬ/ЙЬ спонтанно развивается ожирение, диабет и жировой метаморфоз печени. Кормление таких мышей с соблюдением диеты МСЭ индуцирует у них в течение 4-8 недель неалкогольный стеатогепатит (ΝΆ8Η) и фиброз печени. Модифицированные олигонуклеотиды, обладающие комплементарностью нуклеиновых оснований в отношении т1-РНК, тестировали на этой модели с целью установления их воздействий на фиброз печени.
Последующие примеры приведены с целью более полной иллюстрации вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако они ни в коей мере не должны рассматриваться как ограничивающие объем, охватываемый настоящим изобретением.
- 34 020335
Примеры
Пример 1. Роль Ш1.-21 в заболевании сердца.
Анализ с использованием микрочипов на модели сердечной недостаточности у трансгенных мышей (локальное сердечное повышение экспрессии β 1-адренергического рецептора (ЕпдеШатб! е1 а1., 1999)) позволил выявить картину дизрегуляции экспрессии сердечной микро-РНК по мере увеличения тяжести заболевания (фиг. 1а). Тогда как в нормальном миокарде экспрессия Ш1К-21 была умеренной, указанная микро-РНК оказалась в числе наиболее жестко регулируемых микро-РНК при сердечной недостаточности. Фактически у мышей с конечной стадией сердечной недостаточности Ш1В-21 оказалась единственной микро-РНК с самым повышенным уровнем регуляции (фиг. 1а). Количественный анализ назернблоттинга подтвердил повышенную регуляцию ιηί.-21 у мышей и, кроме того, выявил его значительно повышенную регуляцию при сердечной недостаточности у человека (фиг. 1Ь, с). Повышенная экспрессия предшественника ш1В-21, установленная методом назерн-блоттинга, предполагает транскрипционный механизм. Таким образом, человеческий промотор Ш1.-21 изучали более подробно. Промотор Ш1.-21 идентифицировали и признали его высококонсервативным у целого ряда видов (фиг. 4а). Исследования уровней экспрессии человеческой Ш1.-21 (фиг. 4а-с) подтвердили регуляцию ее транскрипции двумя факторами транскрипции, белком кальций/цАМФ-ответного элемента (С.ЕВ) и фактором сывороточного ответа (8КТ), которые классическим образом активируются в процессе сердечной реакции стресса. Делеция СВЕВ и мутация сайтов связывания 8.Е в промоторе Ш1К-21 приводила к значительному снижению экспрессии в ответ на сывороточную стимуляцию, что указывает на значительную роль двух указанных факторов транскрипции в регуляции Ш1В-21 (фиг. 4с). Существенная роль ттК-21 в морфологии и функционировании сердца была определена при использовании подхода на основе морфолино в оценочном скрининге с целью нокдауна нескольких повсеместно экспрессируемых микро-РНК у полосатой (зебровой) гиреллы. Нокдаун Ш1.-21 приводил к драматическому ухудшению сердечной структуры и функции (фиг. 5). Более чем у 95% инъецированных проявлялись массивные перикардиальные экссудаты (фиг. 5а, вставка, и Ь) и ухудшенная вентрикулярная функция, определяемая методом видеомикроскопии (фиг. 5с).
Для того чтобы исследовать указанные важные функции Ш1.-21 в сердце млекопитающих в дальнейших подробностях, модулировали экспрессию ιηί.-21 в изолированных кардиомиоцитах. Авторы изобретения трансфицировали синтетические предшественники тЖ.-21, а также антисмысловые ингибиторы т1В-21, обычно достигая более чем >95% эффективности трансфекции по доставке олигонуклеотида (фиг. 6а). Повышенная экспрессия Ш1.-21 приводила к сильному повышению количества зрелой ιηί.21, тогда как ингибирование ιηί.-21 полностью подавляло экспрессию 11'11.-21, определяемую методом назерн-блоттинга (фиг. 6Ь). Однако ни повышение, ни супрессия уровней Ш1.-21 в кардиомиоцитах значительно не отражались ни на морфологии, ни на размере или числе первичных кардиомиоцитов крыс в состоянии покоя или в условиях гипертрофии кардиомиоцитов (фиг. 16). У кардиомиоцитспецифических Ш1.-21 -трансгенных мышей, у которых наблюдалась повышенная экспрессия ιηί.-21, в 25 раз превышающая таковую у однопометных животных дикого типа, не проявлялся четкий сердечный фенотип с интактной структурой левого желудочка миокарда и отсутствием интерстициального фиброза (фиг. 1е, внизу). В отличие от существенно повышенной экспрессии Ш1.-21 в случае сердечной недостаточности полученные данные показывают, что манипулирование уровнями экспрессии ιηί.-21 на изолированных кардиомиоцитах и кардиомиоцит-специфических ιηί.-21-трансгенных мышиных моделях не дает возможности подтвердить существенную функцию ιηί.-21 в сердце, на которую указывали эффекты, наблюдаемые у полосатой (зебровой) гиреллы, а также существенно повышенные уровни экспрессии ιηίΕ-21 при сердечной недостаточности. По этой причине авторы изобретения исследовали далее потенциальную роль 1111.-21 в клетках другого типа, отличного от кардиомиоцитов, например, в сердечных фибробластах. С помощью гибридизации ίπ δίΐιι в нормальном миокарде были детектированы слабые сигналы 1111.-21, тогда как при недостаточности миокарда сигнал гибридизации был существенно повышен. При большом усилении было показано, что сигнал гибридизации был ограничен прежде всего малыми интерстициальными клетками, преимущественно сердечными фибробластами. Используя пречашечный метод, авторы изобретения произвели фракционирование неонатальных сердец крыс на фракции кардиомиоцитов и фибробластов. И действительно, авторы изобретения показали, что эндогенная экспрессия Ш1.-21 обнаруживается прежде всего в сердечных фибробластах (фиг. 1Г).
Пример 2. тЖ-21 вызывает дерепрессию передачи сигнала ЕВК в сердечных фибробластах.
Экспрессия тЖ,-21 селективно повышается при различных злокачественных опухолях у человека (Ьи е1 а1., 2005; !ог1о е1 а1., 2005), и было показано, что она посредством различных механизмов в разных клетках участвует в росте и распространении опухолей. Поскольку предполагается, что в клетках различных типов т1В-21 нацелена на разные мРНК, авторы изобретения решили исследовать потенциальные, специфичные в отношении сердечной ткани, мишени тЖ.-21. Используя подходы биоинформатики, авторы изобретения осуществили скрининг нескольких баз данных микро-РНК на предмет поиска потенциальных мишеней тЖ,-21 с З'-ИТВ-содержащими последовательностями-затравками и комплементарных фланкирующих нуклеотидов и сосредоточили свой анализ на кандидатах с подтвержденной экспрессией в сердечной ткани. Полученные данные суммированы ниже в табл. 1.
- 35 020335
Таблица 1
Обозначение гена Название гена Кардиальная экспрессия (ссылочный 10} Число консервативных видов (база данных ΐΓΐιΒ.) Предсказанная мишень (база данных ιηίΚ) Предсказанная мишень (РдсТаг) Затравки, комплементарные ΓΠΪΚ- 21 (просмотр мишеней)
5ргу1 Гомолог Зргоику1 15306693 7 Да Да 8шег
Тд£Ы Трансформирующий фактор роста, бетаиндуциров. 10913330 7 Да Да 8тег
Кг ίίί КЯ1Т1, содержащийся в анкириновом повторе 16455310 7 Да Да 7тег
Ρίίχ2 Парообразный гомеодоменсодержащий транскрипционный фактор 2 16836994 7 Да Да 7тег
Раз! Газ-лиганд (6 член суперсемейства ΤΝΓ) 16698421 7 да Да 7тег
Ядерный Фактор Ι/Β 9056636 7 Да Нет 7тег
ίηχΐ Лиганд Белка ЫитЬ- XI 17118964 7 Да Нет 7тег
Κίη4 Ретикулон-4 16202479 8 Да Нет 7тег
Скрининг на предмет поиска теоретических мишеней ητΕ-Η позволил выявить 22 известных потенциальных гена-мишени, 8 из которых, как было показано ранее, экспрессируются в сердечной ткани. В результате комбинирования трех различных прицельных прогностических способов в качестве наиболее вероятного кандидата был идентифицирован ген 8ргу1 (кргои1у1). 8ргои(у1 (8РКУ1), известный ингибитор пути Как/МЕК/ЕКК (НапаГика с1 а1., 2002, Сакс1 с1 а1., 1999), выступил в качестве потенциальной мишени в силу его высокой балльной шкалы и значительного уровня экспрессии в сердце (табл. 1). 3'иТК мРНК 8ргу1 содержит несколько предсказанных сайтов связывания микро-РНК, из которых только один соответствует микро-РНК, уровень которой сильно повышается в процессе заболевания сердца (ιηίΡ-21, см. фиг. 7). Для определения типа клеток, в которых экспрессируется 8ргу1, авторы изобретения использовали аллель 8ргу1, в котором ген 1;·κΖ заменяет часть последовательности, кодирующей 8ргу1. Анализы экспрессии 1;κΖ обнаружили заметное окрашивание в сердце взрослой мыши (фиг. 2а). При большем усилении идентифицировали пятнистый характер экспрессии 8ргу1, связанной с интерстици- 36 020335 альными фибробластами (фиг. 2а, нижняя панель). Таким образом, как т1К-21, так и ее предполагаемая мишень, 8рту1, совместно экспрессируются в сердечных фибробластах, но не экспрессируются во фракции сердечных кардиомиоцитов. В соответствии с указанными наблюдениями никакого заметного понижения экспрессии 8ΡΡΥ1 не было обнаружено у трансгенных мышей с повышенной кардиомиоцитспецифической экспрессией т1К-21. Кроме того, кардиальный СКЕВ, активатор транскрипции экспрессии Ш1К-21 (фиг. 4), локализован исключительно в фибробластах. Затем авторы изобретения проверяли применимость указанных явлений к заболеванию человека. Действительно, анализ образцов ткани левого предсердия из организма пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности в результате идиопатической дилятационной кардиомиопатии позволил выявить повышенную экспрессию Ш1К-21 (фиг. 1с) и значительное уменьшение экспрессии белка 8ΡΚΥ1 (фиг. 2Ь). Указанные здесь изыскания сопровождались активацией ЕКК-МАР-киназы, что очевидно из увеличения отношения фосфоЕКК/ЕКК (фиг. 2Ь).
Затем функции М1К-21 охарактеризовывали при совместном культивировании интерстициальных фибробластов и кардиомиоцитов с целью имитации состава интактной сердечной ткани. Авторы изобретения определяли функцию Ш1К-21 путем трансфекции синтетических молекул-предшественников Ш1К21 или ингибиторов. Повышение уровня Ш1К-21 вызывало сильное торможение экспрессии белка 8ΡΕΥ1 и усиленную активацию ЕКК-МАР-киназы (фиг. 2с). Подобным образом опосредованный 81РНК сайленсинг 8ргу1 приводил к активации ЕКК-МАР-киназы (фиг. 2ά). Далее авторы изобретения оценивали то, достаточно ли будет ш1К-21-опосредованного торможения передачи сигнала ЕКК-МАР-киназы фибробластов для того, чтобы воздействовать на выживаемость фибробластов. В соответствии с потенциальной ролью передачи сигнала ЕКК-МАР-киназы при фиброзе миокарда, повышение уровней Ш1К-21 способствовало повышению выживаемости сердечных фибробластов, тогда как супрессия эндогенной Ш1К-21 вызывала апоптотическую гибель клеток (фиг. 2е). Авторы изобретения обнаружили также, что регуляция экспрессии 8РКΥ1 на основе Ш1К является критической для секреторной функции сердечных фибробластов, поскольку как повышенная экспрессии Ш1К-21, так и ыРНК-опосредованный сайленсинг экспрессии 8рту1 значительно усиливали секрецию фактора роста фибробластов 2 (ФРФ-2) в супернатант (фиг. 2Τ). Таким образом, настоящее исследование очерчивает контуры новой парадигмы передачи сигналов при сердечной недостаточности, когда возобновление экспрессии Ш1К-21 в процессе заболевания сердца усиливает активность ЕКК-МАР-киназы через ингибирование 8РКΥ1. В сердце млекопитающих такой механизм может регулировать выживаемость фибробластов и, таким образом, критически регулировать степень интерстициального фиброза и ремоделирования сердечной ткани.
Пример 3. Терапевтический сайленсинг Ш1К-21 ίη νίνο.
Чтобы оценить функцию Ш1К-21 ίη νίνο в нормальном состоянии и при сердечной недостаточности, активность Ш1К-21 ингибировали с помощью модифицированного олигонуклеотида, комплементарного Ш1К-21 (антагонист Ш1К-21). Мышиную модель гипертрофии, индуцированной избыточным давлением, использовали в качестве модели сердечной недостаточности у человека. В указанной модели достигали воспроизводимого ответа на сердечный стресс в результате косой трансаортальной констрикции (ТАС, ΐ^аη8νе^8е аο^ι^с ^ηδΐτκίίοη). Указанная модель в высшей степени сходна с сердечной недостаточностью у человека в силу совпадения характера изменений как микро-РНК, так и мРНК в профилях глобальной экспрессии (Т1шт е1 а1. 2007).
Чтобы определить в сердце локализацию антагониста ιηί-РНК, айа^тк^, Су3-меченный ал13§οωίτ-21 вводили внутривенно с помощью катетера яремной вены. Наблюдалось выраженное повсеместное окрашивание левого желудочка миокарда (фиг. 3а), указывающее на то, что модифицированные олигонуклеотиды, комплементарные т1К-21, успешно достигают сердечной ткани и распределяются внутри нее. Антагонист т1К-21 содержал 2'-О-метил-сахар у каждого нуклеозида, две фосфоротиоатные межнуклеозидные связи на самом 5'-конце олигонуклеотида, три фосфоротиоатные межнуклеозидные связи на самом 3'-конце олигонуклеотида и холестерин, связанный посредством гидроксипролинового линкера. Антагонисты т1К-21 имели последовательность нуклеиновых оснований 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1 или 8ЕЦ ГО ΝΟ: 12. Необработанных (ложно-оперированных) мышей или мышей, подвергнутых операции ТАС, в течение трех дней подряд обрабатывали антагонистом аηΐадοт^^-21 или контрольным олигонуклеотидом в дозах 80 мг/кг. Как было определено методами назерн-блоттинга (фиг. 3Ь) и ПЦР в масштабе реального времени (фиг. 8), обработка антагонистом айа^тк^ вызывала сильное торможение повышенной экспрессии сердечной т1К-21 в течение периода до трех недель. Такая обработка полностью восстанавливала ТАС-индуцированную пониженную регуляцию 8РКΥ1 и активацию ЕКК-МАР-киназы во время переизбытка давления до уровней, наблюдаемых у ложно-оперированных мышей (фиг. 3с). Уровень интерстициального фиброза и вес сердца были в течение трех недель после ТАС значительно повышены у необработанных мышей, однако указанные показатели были существенно ослаблены под действием антагониста айа§стк-21 (фиг. 3ά, е). Действительно, содержание коллагена в миокарде было в существенной степени нормализовано в результате обработки антагонистом айадстк^Т Кроме того, айаёстк-21 способствовал предотвращению гипертрофии сердца, вес которого в отсутствие антагониста айадοтк-21 через три недели после ТАС удваивался. У ложно-оперированных мышей обработка антагонистом айадοшк-21 не приводила к значительным изменениям веса сердца или области интерсти
- 37 020335 циального фиброза, что указывает на отсутствие выраженного эффекта антагониста т1В-21 в отношении нормального сердца или выраженной кардиотоксичности в результате обработки антагонистом ап1;щотй-21. После операции ТАС и обработки антагонистом ап1адош1г-21 путем глобального транскриптомного анализы была выявлена нормализация нарушенной регуляции различных генов (фиг. 3ί). В частности, гены с сильно повышенной регуляцией в процессе сердечного фиброза, такие как гены коллагена 1α1, коллагена 3α1, бигликана, фибромодулина или фактора роста соединительной ткани, были ослаблены в результате специфического ингибирования под действием тгК.-21 соответственно на 42, 39, 44, 38 и 37% (фиг. 3£, нижняя панель). В дополнительных исследованиях функцию сердца устанавливали методом эхокардиографии. Конечно-диастолические диаметры левого желудочка через три недели после ТАС значительно увеличивались, а фракция укорочения была ослаблена (фиг. 3д), что обычно наблюдается при сердечной недостаточности у человека. По сравнению с контролями обработка антагонистом ап1адо1шг-21 предотвращала дилятацию левого желудочка и способствовала нормализации параметров фракции укорочения в основном до уровней, наблюдаемых у ложно-оперированных животных (фиг. 3д). Сходные результаты были получены при обработке антагонистом ап1;що1шг-21 на модели заболевания сердца, индуцированного изопротеренолом.
Был предпринят дополнительный эксперимент, в котором мышей в течение трех недель до обработки антагонистом айадот1т-21 подвергали избыточному давлению левого желудочка. В течение указанного периода у животных возникали такие явления как значительная гипертрофия левого желудочка, фиброз и ослабление сердечной функции. После указанного трехнедельного периода мышей обрабатывали антагонистом ап1;що1шг-21 и вели наблюдения в течение последующих трех недель. Тогда как у обработанных контрольных животных развивалась прогрессивная недостаточность функции левого желудочка, а также интерстициальный фиброз и гипертрофия сердца, у животных, обработанных антагонистом ап1;щот1г-21. наблюдалось значительное ослабление недостаточности сердечной функции, а также уменьшение гипертрофии сердца и фиброза.
Полученные результаты свидетельствуют о критической роли полученных из фибробластов тгК.-21 и 8ΡΒΥ1 в сердечной ткани. Аномальная экспрессия ιηίΒ-21 в фибробластах сердца ингибирует экспрессию белка 8ΡΒΥ1, что приводит к повышению активности ΕΒΚ-ΜΑΡ-киназы. Это, в свою очередь, приводит к повышению выживаемости сердечных фибробластов и, следовательно, к интерстициальному фиброзу и ремоделированию сердца, что характерно для сердечной недостаточности. В представленной модели (которая суммирована на фиг. 3Ь) первостепенная роль при заболеваниях миокарда приписывается активации сердечных фибробластов. Противодействие т1В-21 в мышиной модели заболевания сердца позволяло предотвратить структурные и функциональные нарушения. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам лечения фиброза, предусматривающим введение модифицированного олигонуклеотида, комплементарного тгК.-21. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения фиброза, связанного с заболеванием сердца, включающим введение модифицированного олигонуклеотида, комплементарного ιηίΒ-21.
Пример 4. Регуляция пути ΜΑΡΚ-киназы, зависимой от внеклеточных сигналов, под действием т1В-21.
Злокачественная трансформация нормальных клеток в злокачественные клетки требует приобретения ими ряда онкогенных свойств, таких как неконтролируемое деление клеток, их резистентность к запрограммированной гибели (апоптозу), инвазия и ангиогенез. Генетические изменения часто приводят к конститутивной активации низлежащих общих путей передачи сигнала, таких как каскад митогенактивируемых протеинкиназ (ΜΑΡ), таких как е-ВАЕ-1, ΜΕΚ-1, ΕΒΚ 1/2, р38 и ΊΝΚ и другие. Каскады активируемых митогенами протеинкиназ (ΜΑΡΚ) являются ключевыми сигнальными путями, участвующими в регуляции пролиферации, выживания и дифференцировки клеток в норме. Аберрантная регуляция каскадов ΜΑΡΚ приводит к развитию злокачественных опухолей и другим заболеваниям у человека. В частности, путь регулируемой внеклеточными сигналами киназы (ΕΒΚ, ех1тасе11и1ат кщпа1теди1а1еб кзпаке) (ΜΑΡΚ) является предметом интенсивного изучения, результатом которого является развитие фармацевтических ингибиторов для лечения злокачественных опухолей. Твердо установлено, что в нормальных клетках активация киназы ΕΒΚ 1/2 регулируется рецепторами тирозинкиназ, такими как ΕΟΕ-рецепторы и рецепторы к фактору роста, полученному из тромбоцитов (ΡΌΟΕΒ), путем активации Вак, что, в свою очередь, активирует каскад ΒΑΡ-1/ΜΕΚ-1/ΕΒΚ 1/2. В связи с тем, что этот путь передачи сигнала гиперактивирован при многих злокачественные опухолях у человека, ингибиторы рецепторов тирозинкиназ Вак, с-ВАР-1 и ΜΕΚ-1 получили свое развитие и находятся на различных стадиях подготовки. Следовательно, лечение злокачественных опухолей может оказаться возможным путем введения эффективного количества ингибитора пути ΒΑΡ-1/ΜΕΚ-1/Ρ-ΕΒΚ 1/2.
8ртои1у (8ΡΒΥ) представляет собой семейство внутриклеточных белков, которые являются эндогенными регуляторами путей передачи сигнала рецепторами тирозинкиназ, таких как путь Вак/ΜΑΡкиназы. Виды млекопитающих экспрессируют четыре изоформы 8ртои1у, которые действуют в качестве ингибиторов индуцированной фактором роста дифференцировки, миграции и пролиферации клеток. Авторы изобретения установили способность кргои1у-1 ингибировать фосфорилирование ΕΒΚ, которое может приводить к модуляции опухолеобразования. Авторы изобретения предполагают, что повышение
- 38 020335 регуляции ш1К-21 во многих опухолях человека ингибирует 5ргон1у-1, активируя таким образом ЕКК, что приводит к повышенному опухолеобразованию и прогрессии опухолей. Следовательно, противодействие ш1К-21 (например, с помощью антагониста айадош1г-21) может предотвратить и/или ослабить опухолеобразование и/или прогрессию опухолей.
Пример 5. Методики экспериментов.
Анализы экспрессии (микро-РНК-микрочип, ЛГГутеίπx-анализ генных чипов, назерн-блоттинг, ПЦР в масштабе реального времени).
Профили экспрессии микро-РНК (Сайо1б1 е1 а1., 2007) и глобальной мРНК были получены на основе препаратов РНК, полученных из левого желудочка миокарда мышей. Дизрегуляция на уровне микроРНК была подтверждена методами назерн-блоттинга и ПЦР структуры типа стебель-петля в масштабе реального времени. Как в случае олигонуклеотидных зондов, так и в случае пятнистых микрочипов микро-РНК, анализ полученных данных производили с помощью описанных ранее К-пакетов программ ВюсопбисЮг рго)ес1 (\\л\л\\Ьюсопбис1ог.огд) (Τίπιιιι е1 а1., 2007).
Анализ промотора ш1К-21.
Через 24 ч после выделения клетки трансфицировали 1 мкг репортерной плазмиды с использованием известного метода липосомной трансфекции (Ыро£ес1аш1ие, Шуйгоден, υδΑ). Через 12 ч производили замену среды на бессывороточную среду. Еще через 24 ч часть клеток в течение 8 ч обрабатывали 5% ЭБС (эмбриональная бычья сыворотка), тогда как остальные клетки культивировали в отсутствие ЭБС. Люциферазную активность в клеточных лизатах измеряли с использованием набора Ииа1 ЬисгГегаке Κίΐ (Ргошеда, Сегшапу) в соответствии с рекомендациями производителя.
Эксперименты по выделению, культивированию и трансфекции кардиомиоцитов.
Неонатальные кардиомиоциты выделяли так, как было описано ранее (Мегк1е е1 а1., 2007). Размер кардиомиоцитов определяли путем цифровой регистрации изображений с помощью пакета программ Лх1оУыоп ЬЕ 4.1 (Саг1 2е188 Уыоп СшЬН, 1ена, Сегшапу). Культуры кардиомиоцитов трансфицировали предшественником и ингибиторами ш1К-21 (ЛтЬ^оп. υδΑ) или 81ΡΗΚ против 5ргон1у1 (Ргошеда, Сегтаиу). Используя соответствующие культуральные условия, авторы изобретения предприняли также эксперименты с сердечными фибробластами и с совместными культурами фибробластов/кардиомиоцитов.
Поддержание полосатой (зебровой) гиреллы, микроинъецирование антисмысловых морфолиноолигонуклеотидов и определение функции сердца.
Стандартный морфолино-модифицированный олигонуклеотид был направлен против зрелой бгеιιιίΚ-21 (М0-1 = 5'-СССΑΑСΑССΑСΤСΤСΑΤΑΑССΤΑ-3'), и был использован также мультиблокирующий морфолино-модифицированный олигонуклеотид для того, чтобы препятствовать многочисленным стадиям процессинга и функционирования ιιιίΚ-21 (М0-2 = 5'-ΤСΤΑΑСΑСССΑΑСΑССΑСΤСΤСΑΤΑΑС СΤΑΤ-3'). Стандартный контрольный олигонуклеотид (МО-контроль) (СЕNЕΤ00^δ, ЬЬС) инъецировали в той же концентрации, что и отрицательный контроль. Микроинъекции морфолинов производили на одноклеточной эмбриональной стадии полосатой (зебровой) гиреллы дикого типа, и в нескольких временных точках в процессе развития оценивали полную морфологию и в особенности функцию сердца. Были получены изображения и видеосъемки и измерены фракции укорочения желудочков через 48, 72, 80, 96 и 120 ч после оплодотворения (ИрГ), в основном, как описано КойЬаиег е1 а1., 2005.
Мышиные модели сердечной гипертрофии и недостаточности.
Трансаортальную констрикцию производили рутинными методами. Мыши, трансгенные в отношении бета-1-адренергического рецептора (полоса ТС4), были подробно описаны ранее Епде1Иагб1 е1 а1., 1999.
Образцы сердечной ткани человека.
Авторы изобретения изучали образцы сердечной ткани, полученные из организма пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности в результате дилятационной кардиомиопатии, и, для сравнения, образцы сердечной ткани здоровых взрослых людей. Сразу же после эксплантации кусочки ткани отделяли от левых желудочков, и удаленную ткань мгновенно замораживали в жидком азоте и до проведения анализа хранили при -80°С.
Способы предсказания микро-РНК-мишеней.
Базы данных по микро-РНК и базы данных шгЕВаке с инструментарием для предсказания мишеней (йΐίр://ш^с^о^иа.8аиде^.ас.ик/), ΡΕΤηγ (1Шр://р1с1аг.Ью.пуи.еби/) и Τа^деΐδсаи (1Шр://\у\у\у.ιа^деι5сап.о^β/^пάеx.1ит1) были использованы для идентификации потенциальных микроРНК-мишеней.
Вестерн-блоттинг и анализ сердечного фиброза.
Белковые лизаты из сердечных эксплантатов или совместных культур получали, как описано (Вш1гадо е1 а1., 2005), а экспрессию 8ргу1, ЕКК1/2, фосфо-ЕКК1/2 и С-бета детектировали так, как описано в настоящем изобретении. Для изучения морфологии и фиброза сердца фиксировали в 4% формалине и погружали в парафин. Срезы тканей (5 мкм) из левого желудочка (ЛЖ) окрашивали гематоксилином и эозином или пикросириусом красным. Срезы, окрашенные пикросириусом красным, изучали с помощью микроскопа №коп ЕСЫР8Е 501, снабженного фильтрами для обеспечения циркулярно-поляризованного
- 39 020335 света. Изображения ткани были получены с помощью линз объектива 20Х, записаны на охлаждаемую цифровую камеру (И8-5Мс, №кон) и подвергнуты анализу с помощью программного обеспечения 80та8саη Рго 5.0 для анализа изображений (8Р88 Фс., И8А). Содержание коллагена рассчитывали как процент от площади каждого изображения (выраженной в пикселях).
Трансгенные мыши аМНС-т1К-21.
Трансгенных мышей, экспрессирующих в повышенных количествах Щ1К-21, получали путем пронуклеарной инъекции оплодотворенных ооцитов, полученных из организма мышей РУВ/Н трансгенной конструкцией, содержащей зрелую последовательность Щ1К-21, фланкируемую на 154 п.н. выше и на 136 п.н. ниже последовательности нативного предшественника, под контролем мышиного промотора тяжелой цепи α-миозина (аМНС, туокт кеауу скат).
Х-да1-окрашивание миокарда из организма мышей 8ргу-1ас2.
Сердца мышей 8ргу1-1ас2 +/- собирали и фиксировали в течение 2 ч в РВ8, содержащем 2% формальдегид и 0,05% глутаральдегид. В дальнейшем указанные сердца 4 раза по 30 мин промывали в 0,01% №-дезоксихолате, 0,02% №шке1 Р-40, 2 мМ МдС12 и 2 мМ ЭГТА в РВ8. Для детектирования активности β-галактозидазы указанные сердца инкубировали в промывающем растворе, содержащем 0,5 мг/мл Xда1, 10 К3Ре(СН)6 и 10 мМ, К4ре(СХ)6 при 37°С. Для осуществления анализа тотального препарата сердца переносили в 30% глицерин, и цифровые изображения были получены с помощью камеры Мкои Ό0ίΕι1 Сатега ИХМ1200Р и программного обеспечения АСТ-1. Для гистологического анализа сердца дегидратировали в изопропаноле, очищали в ксилене и переносили в парафин. Согласно стандартным методам, получали и документировали 10-мкм парафиновые срезы.
Инъецирование и детектирование модифицированных олигонуклеотидов.
Перед процедурой ТАС в яремную вену самцов мышей С57/В16 (10-12-недельного возраста) устанавливали перманентный катетер. Через 24 ч после процедуры ТАС в течение 3 дней через катетер яремной вены вводили по 80 мг/кг/день модифицированного олигонуклеотида. В качестве положительного контроля эффективной доставки (Су3-меченный модифицированный олигонуклеотид) однократно инъецировали 80 мг/кг через указанный катетер, через 3 ч сердца удаляли, фиксировали и Су3-окрашивание изучали методом флуоресцентной микроскопии.
Апоптоз фибробластов и продуцирование ФРФ-2.
После обработки предшественниками тЖ.-21, ингибиторами или соответствующими контролями аннексин У-положительные фибробласты подвергали количественному РАС8-анализу (Аппехт-УРЬИ08 к11. Коске Оха^о^ск СтЬН, Маткет, Сегтацу). Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫ8А) был использован для количественного определения концентраций ФРФ-2 в супернатантах тгК-21-модулированных сердечных фибробластах. Анализ ФРФ-2 проводили с помощью набора биаткше РСР Вакю Iттиηοаккау кН (К&И 8уйетк, М^еароНк, И8А) в соответствии с рекомендациями производителя.
Статистический анализ.
Усредненные данные представлены в виде среднего ±8ЕМ. Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Рпкт (СгаркРак, 8ηη И1едо, СА) или пакетов программ 81а1У1е\у (8А8 ФкЕШе Фс., Сагу, И8А). В зависимости от ситуации, были использованы АN0УА с последующим тестом Бонферрони и ΐ-тестом Стьюдента. Различия считались значимыми при Р<0,05, и такие различия отмечены звездочкой. * означает, что р<0,05, ** означает, что р<0,01, *** означает, что р<0,005.
Выделение РНК, ОТ-ПЦР в масштабе реального времени и назерн-блоттинг.
Для экстракции тотальной РНК из замороженных тканей или клеточных культур использовали набор К№аку М1ш Κίΐ (Р1адещ НИкеи, Сети-шу) в соответствии с инструкциями производителя. М1РНК выделяли, используя ΤΚ[Ζ0Ε (Iην^ΐ^οдеη, Кагкгике, Сети-шу) или набор для выделения тъРНК (ти^Уат^М), АтЬющ И8А). Целостность выделенной РНК методами гель-электрофореза с денатурирующей агарозой или капиллярного электрофореза (Вюа1и11ужег 2100; АдПегИ), как описано (Ткит анк Вог1ак, 2004). Для ПЦР в масштабе реального времени авторы изобретения использовали систему 1Сус1ег ίρτΜ .еа1-Т1те РСК ^еΐесΐ^οη 8уκΐет (ВюКак, Сегпи-ту).
Авторы изобретения использовали специфичную в отношении мишени структуру стебель-петля и праймер обратной транскрипции, а после обратной транскрипции использовали специфические гибридизационные зонды Τа^Маη для количественной оценки экспрессии Ш1К-21 (Τа^Маη Ш1К-21 МюгоКЫА Аккау, Арркек Вюкук1етк, Рок1ег Ску, И8А). Малую молекулу РНК И6В низкомолекулярной ядерной РНК (КЫи6В) амплифицировали в качестве контроля (Τа^Маη МюгоКЫА Аккау Соп1го1к, Арркек Вюкукΐетк, Рок1ег СНу, И8А). Все образцы ιηί-РНК были получены из изолятов, содержащих одинаковую концентрацию тотальной РНК.
Для анализа назерн-блоттинга 3 мкг тотальной РНК наносили на 15% акриламид, 6М мочевину, и параллельно в ТВЕ-гели наносили соответствующие ДНК-маркеры. После электрофореза РНК переносили на нейлоновую мембрану ^аЬ^е ^^η, Р1адеи), используя метод полусухого переноса. Затем мембраны подвергали прегибридизации в течение 1 ч при 65°С в гибридизационном буфере (ИЬТКАкуЬ
- 40 020335 ϋΐίβο ΗνόπάζηΙίοη ВиГГег, Λιηόίοη. И8А). ΕΝΆ-олигонуклеотиды (ηίΚΕυΚΥ ΕΝΑ Аггау Йе1ес1юп ргоЬек; Εχίςοη). которые были предварительно мечены Т4-киназой (Εχίςοη) и 32Р-АТФ, были затем добавлены в буфер, и мембраны гибридизовали в течение ночи при 42°С. После этого блот трижды промывали при комнатной температуре в течение 3 мин (в 0,2х88С), а затем однократно при 42°С в течение 15 мин. Затем мембраны помещали в аппарат для фосфовизуализации.
Анализ экспрессии микро-РНК.
Для анализов экспрессии микро-РНК на микрочипах авторы изобретения отдельно очищали микроРНК с помощью фракционирующей системы ДазйРАСЕ (АшЬюп, И8А). Микро-РНК, полученную из 8 мкг тотальной РНК, метили красителем Су3 (Μο^ουΙαΓ РгоЬем СагПЬаД Са1гГ), используя набор щиУапа ιηίοΓοΚΝΑ ЬаЬеЕид ΚίΙ (АшЬюп И8А) и в соответствии с рекомендациями производителя. Каждый образец гибридизовали с отдельным чипом. Процедуры гибридизации микро-РНК на микрочипе, очистки и обогащения микро-РНК проводили в соответствии с руководствами АшЬюп шйУапа таηυа18 (Α\уу\у.атЬ^οη.сοт/ιес111^Ь/р^οι/) или как описано 2. Обработку данных производили с помощью программного обеспечения 8еапА1у^е (Ещеи-ЬаЬ, Ьа^гепсе Вегке1еу №11юпа1 ЬаЬ (ΕΒΝΕ), Вегке1еу, И8А). Альтернативно, 5 мкг тотальной РНК метили конъюгированным с Су3 РНК-линкером (^11аπηасοη. И8А) и гибридизовали с платформой микрочипа для масштабного профилирования ηί-РНК генома |1шС.'1пр; захваченные пробы, иммобилизованные на чипе (211 человеческих, 51 мышиных), соответствовали уникальным человеческим ηί-РНК, депонированным в базе данных ппКЬахе версии 6.1]. Интенсивности сигнала гибридизации были зарегистрированы с помощью сканера Αxοη (4000В, ΜοΠαιΡίΓ Оупа1шс5) с идентичными установками фотоумножителя. Кроме того, анализы производили с помощью программных обеспечений Сепер1х 6 (Μο^υ^ Оупа1шс5) и Ехсе1. Экспрессию ηίΚ-21 подтверждали с помощью специфических анализов ТадМап ОТ-ПЦР и анализов назерн-блоттинга.
Г лобальный анализ транскриптома.
Для анализов транскриптома были предприняты обратная транскрипция, синтез второй цепи и очистка двухцепочечной кДНК, в соответствии с протоколами ΑГГутеι^^x (Опе-Сус1е с^NΑ 5уп111ем8 Κίΐ, ΑГГушеι^^x. И8А), начиная с 2 мкг тотальной РНК (п=4 контрольных сердца после ложной операции, п=4 левых желудочка после ТАС и обработки плацебо; п=4 левых желудочка после ТАС и обработки антагонистом ηίΚ-21). Синтез биотин-меченной кРНК проводили с использованием набора ГУТ ЬаЬеНпд Κίΐ (АГр·!^!^ И8А). Определяли концентрацию кРНК и распределение фрагментов кРНК уточняли с помощью гель-электрофореза. 15 мкг фрагментированной кРНК использовали для гибридизации на мышином геноме 430 2.0 СепеСЫр (ΑГГутеΐ^^x, И8А). Был использован анализ данных, полученных при исследовании микрочипов, с помощью Κ-пакетов программ из Βίο^ηάυΛοτ рго)ес1 (\\·\\·\\·Είο^ηάικΙοΓ.οΓ§). Полученные в результате интенсивности сигналов были нормализованы путем стабилизации дисперсии. Качество всех наборов данных тестировали и статистический анализ предпринимали с помощью пакета Инина (Ьшеаг ΜοώιΚ Гот Мюгоаггау Апа1у818) для селекции дифференциально экспрессируемых генов.
Эксперименты по совместному культивированию клеток сердца и процедуры трансфекции микроРНК/м-РНК.
Кардиомиоциты из неонатальных крыс изолировали и культивировали, как описано Мегск1е е1 а1., 2007. Для анализа модуляции размера кардиомиоцитов ηίΚ-21 использовали чистые культуры кардиомиоцитов, добавляя стадии пречашечного метода, чтобы исключить преимущественное контаминирование некардиомиоцитами (например, фибробластами). Более чем 95% культивируемых кардиомиоцитов давали положительную окраску на актинин, что свидетельствует о высокой степени чистоты клеточных культур. Скремблированную-ηίΚ (пренегативный контроль #2, АшЬюп; 50 нмоль/л, 72 ч), молекулыпредшественники ηίΚ-21 (рге-ΜίΚ, АшЬюп; 50 нмоль/л, 72 ч) или антагонисты ηίΚ-21 (аηΐ^-т^Κ, АшЬюп; 50 нмоль/л, 72 ч) трансфицировали методом на основе липосом (^^рοίесΐат^ηе, Гпуйгодеп, И8А; подробнее см. 6). Кардиомиоциты культивировали при низком содержании ЭБС (0,1%, условия контроля) или 48 ч в присутствии высокой концентрации ЭБС (5,0%) для индукции гипертрофии кардиомиоцитов. Для определения размера клеток площадь поверхности неонатальных кардиомиоцитов (через 72 ч после трансфекции) вычисляли в формате 96-луночных планшетов (площадь посева 40000 клеток/лунку) с использованием пакета программ АхОУ^м КеГ 4.4 раскаде (Саг1 2е188 ОшЬН, 1епа, Селману). Данные выражали в виде среднего ±8ЕМ.
Для имитации условий сердечной ткани ίη νίνο авторы изобретения использовали систему совместного культивирования кардиомиоцитов и сердечных фибробластов, опуская стадию пречашечного метода, как описано выше. Авторы настоящего изобретения подробно изучали активацию экспрессии 8ргу-1 и Егк после трансфекции скремблированной-ηίΚ (50 нмоль/л, 72 ч), молекул-предшественников ηίΚ-21 (50 нмоль/л, 72 ч) или антагонистов ηίΚ-21 (50 нмоль/л, 72 ч). В отдельных экспериментах коктейль из скремблированной мРНК или специфической мРНК. против 8ргу1 (три различных микро-РНК, 16,7 нмоль/л каждой) трансфицировали в совместную культуру. Мониторинг эффективности трансфекции осуществляли путем измерений методами ПЦР в масштабе реального времени (ТадМап Μ^с^οΚNΑ Аз8ау8, АррИей Β^ο8у8ΐет8) и назерн-блоттинга.
- 41 020335
Инструментарий для предсказания микро-РНК-мишеней.
Алгоритм т1Вапба (СгТТййв-бопев е! а1., 2006) использовали для просмотра потенциальных сайтов связывания Ш1В-21 в 3'ИТВ-последовательностях человеческого и мышиного геномов. В дальнейшем была предпринята нормализация Каг1т-А1!всйи1 (т1ВВаве Тагде!в уегвюп 4.0;
Ы1р://т1сгота.вапдег.ас.икЛагде!в/у4/). Более подробно, авторы изобретения использовали базу данных т1ВВаве (Уегвюп 4, 8апдег 1пвб!и!е; И8А) и рассортировали потенциальные т1В-21-мишени с помощью алгоритмов большое количество консервативных видов; >6, малое значение р; <0,001 и обширная шкала ниВВаве; >15. В результате такой процедуры было выявлено 22 известных гена в качестве потенциальных мишеней т1В-21, для 8 из которых было ранее установлено, что они экспрессируются в сердечной ткани, на основе их профиля СЕО-экспрессии (Ы1р://ууу.псЬгп1т.шйдоу/део/) (см. табл. 1). Кроме того, 5 генов было предсказано в качестве мишеней т1В-21 на основании базы данных 9 ιιιί-РНК Р1сТаг (Кгек е! а1., 2005) (Ы1р://рю!аг.Ью.пуи.еби/). С использованием программного обеспечения Тагде!8сап, предназначенного для предсказаний т^ΒNΑ-мишеней (^Ы!ейеаб [пьНГиГе Тог Вютебюа1 ВевеагсЫ, И8А, Ве1еаве 4.0; би1у 2007; Ы1р://ууу.1агде!всап.огд/), авторы изобретения идентифицировали мишени с консервативными сайтами с совпадениями в затравках размером в 8-тег только для двух т1В-21мишеней. После этого более подробно изучали 8ргу1.
Вестерн-блоттинг.
Белковые лизаты из сердечных эксплантатов или культивируемых фибробластов/кардиомиоцитов получали, как описано Вийгадо е! а1., 2005. Экстракты (20-50 мкг белка на полосу) смешивали с образцом наносимого буфера, и в редуцирующих условиях производили разделение в 10% ДСНполиакриламидных гелях. Белки электрофоретически переносили на РУЭЕ-мембрану (1ттип-В1о!(В), В1о-Ваб). Полосы детектировали с помощью хемилюминесцентного анализа (ЕСЬ Р1ив, Атегвйат). Авторы изобретения использовали первичные антитела против вргои(у-1 (8ап!а Стих, вс-30048, разведение 1:250-1:500), Егк1/2 (клеточная сигнализация, #9102, разведение 1:1000); фосфо-Егк1/2 (клеточная сигнализация, #9101, разведение 1:1000) и С-β (8ап!а Сгих В1о!есйпо1оду, вс-378, разведение 1:1000), а также соответствующие вторичные антитела (противомышиные, НВР (клеточная сигнализация, #7076, разведение 1:10000; противокроличьи, НВР (клеточная сигнализация, #7074, разведение 1:10000).
1п νί уо модель ТАС и введение модифицированного олигонуклеотида.
Авторы изобретения использовали самцов мышей С57ВБ/6 (10-12-недельного возраста, 25 г) из питомника Сйаг1ев Вуег ЬаЬога!опев (8и1хТе1б, Сегтапу). Трансаортальную констрикцию (ТАС) выполняли, используя хирургический шовный материал 7-0, дважды обвязанный вокруг аорты, и полую иглу 27 калибра. В дальнейшем иглу осторожно оттягивали обратно, создавая приблизительно 80% сужение аорты. Во время таких же операций, используя стандартные хирургические процедуры, устанавливали катетер в яремную вену. Последовательности: ап!адот1г-21, 5'оивоСвоАоАоСоАоиоСоАоСоиоСоиоСоиоАоАоСвоСвоивоАв-С1о1-3'. Все используемые при синтезе нуклеотиды были 2'-ОМе-модифицированы (подстрочное о). Подстрочное в означает фосфоротиоатную связь; Су3 означает мечение красителем Су3 на 5'-конце олиго; СЫо1 означает холестерин, связанный посредством гидроксипролиновой связи. Обработку начинали через 24 ч после ТАС, и животные получали инъекции РВ8 или антагониста т1В-21 через имплантированный в яремную вену катетер; три дня подряд, инъекции в яремную вену РВ8 или антагониста т1В-21 в дозах 80 мг на кг веса тела, в объеме 0,2 мл на инъекцию. В качестве положительного контроля эффективной доставки Су3-меченный модифицированный олигонуклеотид (ап1адотп-181а) (80 мг/кг) инъецировали через катетер в яремную вену, через 3 ч сердца удаляли, фиксировали и Су3-окрашивание изучали методом флуоресцентной микроскопии.
Функциональный анализ сердца.
Через 3 недели после ТАС мышей анестезировали изофлураном и изучали сердечные показатели и функцию сердца методом Допплеровской эхокардиографии с пульсовой волной в 15 МГц. Затем сердца извлекали, взвешивали после удаления предсердий и подвергали дополнительному анализу. Эхокардиографические исследования проводили под действием световой анестезии со спонтанной респирацией с использованием изофлурана. Два независимых ультразвуковых обследования провели по визуализации грызунов и слепым методом предпринимали эхокардиографические исследования в экспериментальных группах, используя ТовЫЬа Роуег У1вюп 6000 с преобразователем в 15 МГц. Были получены 2Όизображения лево-парастернальной короткой оси на уровне папиллярных мышц. Правильность расположения образца определяли по округлой форме полости левого желудочка (ЛЖ) после ангуляции и смещений краниокаудального преобразователя. Крайнюю диастолическую область ЛЖ вычисляли вручную путем пересечения эндокардиального края с последующей планиметрией, осуществляемой с помощью пакета программ №се (ТовЫЬа Меб1са1 8ув!етв). Одновременное пересечение в М-образном режиме регистрировали курсором, помещенным в середину полости ЛЖ. Фракцию укорочения рассчитывали, как описано СоШпв е! а1., 2001.
Детектирование сердечного фиброза.
Мышиные сердца фиксировали в 4% забуференном формалине и погружали в парафин. 5-мкм срезы, окрашенные пикросириусом красным, изучали в микроскопе №коп ЕСПР8Е 501, снабженном фильт
- 42 020335 рами для обеспечения циркулярно поляризованного света (^Ийакет е! а1., 1994). Нижний фильтр помещали над зоной кольца ирисовой диаграммы микроскопа, тогда как верхний фильтр был сконструирован путем сочетания пластинки в четверть волны, помещенной ниже линейного поляризатора, расположенного таким образом, чтобы его ось пропускания была расположена под углом в 45° по отношению к оси распространения света волновой пластинки. Эти два фильтра пересекались, т.е. были сориентированы таким образом, чтобы фон в поле зрения был как можно темнее. Изображения ткани были получены с 20Х линзами объектива, запись изображений производилась цифровой охлаждаемой камерой (Б8-5Мс, №коп), а для анализа изображений использовали программное обеспечение 81дша8сап Рго 5.0 (8Р88 1пс., И8А). Конкретно, каждый компонент исходных (циркулярно поляризованных) изображений разрешался в своем циановом, желтом, маджентовом и черном цвете (с помощью автоматизированной функции СУМК, обеспечиваемой анализом изображений). Черный компонент удалялся из поляризованного изображения. Перед удалением черный компонент доводили до адекватной освещенности, чтобы убедиться, что удаляется интерстициальное пространство и неколлагеновые элементы, а не тончайшие коллагеновые волокна (подтверждали исследованиями). Затем после удаления изображение подвергали конечному цветовому разделению на их оттеночные, насыщающие, объемные (Н8У, 1ше, каЛта!юп, уа1ие) компоненты с помощью автоматизированной функции Н8У, обеспечиваемой программным обеспечением для анализа изображений. Гистограмму оттеночной частоты получали при разрешении оттеночного изображения в 8 бит, которое содержало 256 красок. Были использованы следующие определения: красный 2-9 и 230-256, оранжевый 10-38, желтый 39-51, зеленый 52-128. Интервал оттенков 129-229 состоял из интерстициального пространства и недвупреломляющих элементов ткани. Определяли число пикселей в интервалах оттенков красного, оранжевого, желтого и зеленого и выражали их в виде процента от общего числа коллагеновых пикселей, которое, в свою очередь, выражали в виде процента от общего числа пикселей на снимке.
Апоптоз фибробластов и продуцирование ФРФ-2.
Сердечные фибробласты, полученные на стадии пречашечного метода в процессе выделения кардиомиоцитов, культивировали до достижения субконфлуэнтного состояния. Чистота клеток составляла >95%, что определялось на основе окрашивания маркером фибробластов противокрысиной пролил-4гидролазой (Аст15 АпйЬойкк, ЛΕ5110-1; данные не представлены). После обработки предшественниками Ш1Я-21, ингибиторами или соответствующими контролями (см. выше) Аппехт У-положительные фибробласты подвергали количественному РАС8-анализу (Аппехт-УРЬиО8 кй, Яоске Б1адпокйск СтЬН, МаппНеип, Сегтапу). Твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А) проводили для количественного определения концентраций ФРФ-2 в супернатантах модулированных Ш1Я-21 сердечных фибробластов. Определение ФРФ-2 выполняли с помощью набора ОнапЦкте РСР Вакк 1шшипоаккау кй (Я&Б 8ук1етк, М1ппеаро118, И8А) и в соответствии с рекомендациями производителя.
Список литературы
АшЬгок, У. Т1е кипсйопк ок ап1ша1 ш^с^оЯNАк. №йиге 431, 350-355 (2004).
Вийтадо, М. е! а1. Тке 1гапкспр1юпа1 гергекког №1Ь1 1к а крес1йс тедиШог ок раЛо1одка1 сатФас курегйорйу. №11 Мей 11, 837-844 (2005).
Саге, А. е! а1. М^с^оКNА-133 соп1го1к сатФас йурейторйу. №1 Мей 13, 613-618 (2007).
Сакск Т., Уток, к & Ргеешап, М. 8ргоп1у, ап 1пйасе11и1ат 1пЫЬйот ок Яак 81дпа1тд. Се//96, 655-665 (1999). И30038.
Сак1о1йк М. е! а1. А кепкйкуе аггау ког т^с^оЯNА ехргеккюп ртокЛпд (т1СЫр) Ьакей оп 1оскей пискк ас1йк (1№). №А 12, 913-920 (2006).
СоШпк, К.А. е! а1. Ассигасу ок есйосатйюдгарЫс екйша1ек ок 1ек1 уепйки1ат шакк ш шке. Аш I РНукю1 Неай Спс Рйукю1 280, Н1954-Н1962 (2001).
ЕпдеЛатЛ, 8., Нет, Ь., ХУкктапп, Р. & Ьойке.МЭ. Ргодгекыуе йурейторйу апй йеай кайите ΐπ Ье!а 1айтепетдк гесерЮг йапкдепк шке. Ртосеейтдк ок Ле №йюпа1 Асайешу ок 8скпсек 96, 7059-7064 (1999).
СпГГцкк-Зопек, 8., Стососк, Я.к, уап Бопдеп, 8., Ва!етап, А. & ЕппдЫ, Ай. пйЯВаке: ш^с^оКNА кециепсек, !агде!к апй депе пошепс1аЛте. №.1с1ек Ас1йк Яекеагск 34, Б140-Б144 (2006).
Напакика, Н., Тот, 8., Уакипада, Т. & №к1пйа, Е. 8ргоы1у1 апй 8ргоп1у2 ргоу1йе а соп!го1 тескашкт ког Ле Яак/МАРК ыдпаШпд раЛтау. №11 Се11 Вю1 А, 850-858 (2002).
1опо, М.У. е! а1. М^с^оКNА Сепе Ехргеккюп Бетеди1айоп ш Нишап Вгеак! Сапсег. Сапсег Яек 65, 7065-7070 (2005).
КгиеШекЕ к, е! а1. 8йепстд ок т^с^оКNЛк т у1уо \νίΛ 'агИадоптк'. №Лге 438, 685-689 (2005).
Ьи, к е! а1. М^с^оЯNА ехргеккюп ртокйек с1акк1ку Нитап сапсегк. №1ите 435, 834-838 (2005). Мегк1е 8. е! а1. А Яо1е ког Сакраке-1 т Неай Райите. Спс Яек 100, 645-653 (2007).
М1, 8. е! а1. М^с^оЯNА ехргеккюп ЦдпаЛтек асспга!е1у й1ксптта1е аси!е 1утр1юЬ1ак1к 1еикет1а кгош аси!е шуе1о1й 1еикеш1а. Ртосеейтдк ок Ле №йюпа1 Асайешу ок 8скпсек 104, 19971-19976 (2007).
ЯойЬаиет, е! а1. УЕСР-РЬС{датша}1 раЛтау соп!го1к сатЛас сойтасЛйу ш Ле ешЬтуопк Неай.
Сепек Беу. 19, 1624-1634 (2005).
Т1шт, Т. & Вог1ак, к Мескашкйс го1е ок суЮскготе Р450 шопоохудепакек т оx^й^ζей 1о^-йепкйу Нроргокт-тйисей уакси1ат щиту: Легару Лтоидй ЬОХ-1 гесер!ог агИадошкт? Спс Яек 94, е1-13 (2004).
- 43 020335
Τΐιιιιη. Τ. с1 а1. МкгоВЫЛк ίη 1Не Нитап НеаЬ: А С1ие ΐο Ее1а1 Сепе Кергодгатттд ίη НеаЬ Еайиге. СЬсикПюп 116, 258-267 (2007).
Уапд, В. е1 а1. ТНе ти8с1е-8рес1Дс ткгоКЫА т1К-1 геди1а1е8 сагй1ас аггНиНтодешс ро1еп(1а1 Ьу 1агце1ίη§ С.1А1 апй КСМ2. Ыа1 Мей 13, 486-491 (2007).

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 15-24 соединенных друг с другом нуклеозидов, при этом указанный модифицированный олигонуклеотид содержит последовательность нуклеиновых оснований, комплементарную ιηίΒ-21 или ее предшественнику, для лечения, профилактики или диагностики фиброза или фибропролиферативного заболевания у индивидуума, где:
    (ί) последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований ЗЕО ГО N0: 12 или (ίί) последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ш1В-21 или его предшественнику и имеет не более двух различий по сравнению с последовательностью нуклеиновых оснований ιηίΒ-21 или его предшественника.
  2. 2. Соединение по п.1, где указанный фиброз представляет собой фиброз печени, фиброз сердца, фиброз почек, легочный фиброз, фиброз кожи, связанный с возрастом фиброз или фиброз селезенки.
  3. 3. Соединение по п.1 или 2, где указанный индивид страдает по меньшей мере одним заболеванием или состоянием, выбранным из нарушения или заболевания сердца, заболевания или болезненного состояния печени, заболевания или болезненного состояния легких и заболевания или болезненного состояния почек.
  4. 4. Соединение по любому из пп.1-3 в сочетании с одним или несколькими дополнительными фармацевтическими средствами для введения индивидууму.
  5. 5. Соединение по любому из пп.1-4, где при его введении индивидууму:
    a) уменьшается увеличение веса сердца, расширение левого желудочка или расстройство фракции укорочения;
    b) предотвращается увеличение веса сердца, расширение левого желудочка или расстройство фракции укорочения и/или
    c) улучшается сердечная функция.
  6. 6. Соединение по любому из пп.1-5, где при его введении индивидууму:
    a) улучшается состояние при фиброзе;
    b) замедляется дальнейшее прогрессирование фиброза;
    c) останавливается дальнейшее прогрессирование фиброза;
    й) ослабляется фиброз и/или
    е) уменьшается содержание коллагена.
  7. 7. Соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, состоящий из 12-30 соединенных нуклеозидов, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида комплементарна ιηίΒ-21 или ее предшественнику и имеет не более двух различий с последовательностью нуклеотидных оснований ιηίΒ-21 или его предшественника, для применения при приведении в контакт с фибробластами для:
    a) ингибирования пролиферации фибробластов;
    b) стимуляции апоптоза фибробластов и/или
    c) повышения экспрессии белка ЗргоШуЕ
  8. 8. Соединение по любому из пп.1-7, где указанный модифицированный олигонуклеотид состоит из 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 соединенных нуклеозидов и последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида содержит по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21 или по меньшей мере 22 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований ЗЕО ГО N0: 12.
  9. 9. Соединение по любому из пп.1-8, где указанное соединение содержит модифицированный олигонуклеотид, конъюгированный с лигандом, и где указанный лиганд необязательно является холестерином.
  10. 10. Соединение по любому из пп.1-9, где по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью или где каждая межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью и где модифицированная межнуклеозидная связь необязательно является фосфоротиоатной связью.
  11. 11. Соединение по любому из пп.1-10, где каждый из множества нуклеозидов содержит модифицированный сахар или где каждый нуклеозид содержит модифицированный сахар; где необязательно каждый модифицированный сахар независимо выбран из 2'-О-метоксиэтил-сахара, 2'-фтор-сахара, 2'-Ометил-сахара или бициклической сахарной группы.
    - 44 020335
  12. 12. Соединение по любому из пп.1-11, где по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание и где модифицированное нуклеиновое основание необязательно является 5-метилцитозином.
  13. 13. Соединение по любому из пп.1-12, где указанное соединение, содержащее модифицированный олигонуклеотид, представлено в виде фармацевтической композиции.
  14. 14. Соединение по любому из пп.1-12, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида имеет не более одного отличия от последовательности нуклеотидных оснований т1К-21 или его предшественника.
  15. 15. Соединение по любому из пп.1-12, где последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида не отличается от последовательности нуклеотидных оснований тЖ-21 или его предшественника.
  16. 16. Способ диагностики фиброза, включающий измерение уровня экспрессии тЖ-21 в биологическом образце, взятом у индивидуума, где повышенный уровень тЖ-21 указывает на наличие фиброза или предрасположенность к нему.
  17. 17. Способ скрининга на фармацевтически активное соединение для лечения и/или профилактики фиброза или предрасположенности к нему, включающий следующие стадии:
    (a) приведение вещества-кандидата в контакт с образцом, содержащим тЖ-21;
    (b) определение влияния вещества-кандидата на активность тЖ-21, при этом изменение активности тЖ-21 указывает на то, что соединение является фармацевтически активным.
EA201070992A 2008-02-27 2009-02-26 МИКРО-РНК (mi-РНК) И МИШЕНИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ EA020335B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3183508P 2008-02-27 2008-02-27
EP20080003570 EP2096171A1 (en) 2008-02-27 2008-02-27 MicroRNA (miRNA) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes
US3334008P 2008-03-03 2008-03-03
PCT/EP2009/051986 WO2009106477A1 (en) 2008-02-27 2009-02-19 Microrna (mirna) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes
PCT/EP2009/001590 WO2009106367A1 (en) 2008-02-27 2009-02-26 Microrna (mirna) and downstream targets for diagnostic and therapeutic purposes

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201070992A1 EA201070992A1 (ru) 2011-04-29
EA020335B1 true EA020335B1 (ru) 2014-10-30

Family

ID=39639202

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201070992A EA020335B1 (ru) 2008-02-27 2009-02-26 МИКРО-РНК (mi-РНК) И МИШЕНИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ

Country Status (24)

Country Link
US (9) US8236777B2 (ru)
EP (3) EP2096171A1 (ru)
JP (2) JP6033527B2 (ru)
KR (1) KR101697482B1 (ru)
CN (1) CN102027113B (ru)
AU (1) AU2009218704C1 (ru)
BR (1) BRPI0907565B1 (ru)
CA (2) CA2716643C (ru)
CY (1) CY1114426T1 (ru)
DK (1) DK2260101T3 (ru)
EA (1) EA020335B1 (ru)
ES (1) ES2436885T3 (ru)
HK (1) HK1150857A1 (ru)
HR (1) HRP20130766T1 (ru)
IL (1) IL207704A (ru)
ME (1) ME01600B (ru)
MX (2) MX2010009346A (ru)
MY (1) MY159454A (ru)
NZ (1) NZ588185A (ru)
PL (1) PL2260101T3 (ru)
PT (1) PT2260101E (ru)
SI (1) SI2260101T1 (ru)
UA (1) UA100727C2 (ru)
WO (2) WO2009106477A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712511C2 (ru) * 2014-09-08 2020-01-29 Мираген Терапеутикс, Инк. Миметики mir-29 и пути их применения

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2850323A1 (en) * 2004-11-12 2006-12-28 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna and mirna inhibitor molecules
EP2096171A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 Julius-Maximilians-Universität Würzburg MicroRNA (miRNA) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes
WO2011017697A1 (en) * 2009-08-07 2011-02-10 New York University Compositions and methods for treating inflammatory disorders
CN102038959B (zh) * 2009-10-26 2012-12-19 中国科学院上海生命科学研究院 let-7/miR-98家族在制备治疗FAS基因相关疾病的药物中的应用
WO2011126842A2 (en) * 2010-03-30 2011-10-13 Regulus Therapeutics Inc. Targeting micrornas for the treatment of cardiac disorders
US20130150256A1 (en) 2010-06-11 2013-06-13 Jane Synnergren Novel micrornas for the detection and isolation of human embryonic stem cell-derived cardiac cell types
US8815826B2 (en) 2010-07-23 2014-08-26 Regulus Therapeutics, Inc. Targeting microRNAs for the treatment of fibrosis
EA201370139A1 (ru) * 2010-12-15 2013-10-30 Мираген Терапеутикс Ингибиторы микро-рнк, содержащие закрытые нуклеотиды
LT2702155T (lt) * 2011-04-25 2017-05-10 Regulus Therapeutics Inc. Mikro rnr junginiai ir būdai mir-21 aktyvumo moduliavimui
CA3065098C (en) * 2011-09-06 2023-08-08 Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung Der Wissenschaften E.V. The mirna-212/132 family as a therapeutic target
KR20140091688A (ko) 2011-10-06 2014-07-22 미라젠 세러퓨틱스 인코포레이티드 마이크로rna 조절에 의한 전신 에너지 항상성의 제어
EP2592145A1 (en) * 2011-11-11 2013-05-15 Medizinische Hochschule Hannover Medicament for the treatment of cardiac disease
EP2783016A1 (en) * 2011-11-22 2014-10-01 Intermune, Inc. Methods of diagnosing and treating idiopathic pulmonary fibrosis
JP2015501843A (ja) * 2011-12-13 2015-01-19 オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション ｍｉＲ−２１およびｍｉＲ−２９ａ、エキソソーム阻害、およびがん転移に関する方法および組成物
JP2015518475A (ja) * 2012-04-10 2015-07-02 インサーム（インスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラルシェルシェ メディカル）Ｉｎｓｅｒｍ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｌａ Ｓａｎｔｅ Ｅｔｄｅ Ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌｅ） 非アルコール性脂肪性肝炎の治療方法
EP2841579B1 (en) 2012-04-25 2018-10-10 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
MX355408B (es) 2012-06-21 2018-04-18 Miragen Therapeutics Inc Inhibidores a base de oligonucleotidos que comprenden un motivo de acido nucleico bloqueado.
CA2782942C (en) 2012-07-12 2019-08-27 Canadian Blood Services Method for inducing immune tolerance using polymer-modified antigenic leukocytes
UA116639C2 (uk) 2012-10-09 2018-04-25 Рег'Юлес Терап'Ютікс Інк. Способи лікування синдрому альпорта
US11007221B2 (en) 2013-07-12 2021-05-18 Canadian Blood Services Acellular pro-inflammatory compositions, process for making same and methods of using same
WO2015061536A1 (en) 2013-10-25 2015-04-30 Regulus Therapeutics Inc. Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
EP3079727A1 (en) * 2013-12-12 2016-10-19 INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Methods for the prevention and treatment of diabetic cardiomyopathy using mir-424/322
US10561685B2 (en) 2014-07-10 2020-02-18 Canadian Bllood Services Combination therapy of acellular pro-tolerogenic and pro-inflammatory preparations for modulating the immune system
SG11201705907XA (en) 2015-01-20 2017-08-30 Miragen Therapeutics Inc Mir-92 inhibitors and uses thereof
CN106924757B (zh) * 2015-12-31 2020-07-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 miR-449c-5p及其拟似物在制备治疗和预防心脏瓣膜疾病产品中的应用
CN107034216A (zh) * 2016-02-04 2017-08-11 中国科学技术大学 miRancer分子的设计与应用
KR101835018B1 (ko) 2016-03-03 2018-03-06 고려대학교 산학협력단 엑소좀 또는 엑소좀 유래 리보핵산을 포함하는 간섬유증 예방 또는 치료용 조성물
US11236337B2 (en) 2016-11-01 2022-02-01 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer
US11667916B2 (en) 2017-09-08 2023-06-06 Korea University Research And Business Foundation Composition for preventing or treating liver fibrosis, containing exosome or exosome-derived ribonucleic acid
CN107858419A (zh) * 2017-11-10 2018-03-30 青岛大学 miRNA的应用、应用其的产品及检测方法
CN109498642A (zh) * 2018-12-21 2019-03-22 复旦大学附属中山医院 一种柯萨奇b3病毒感染导致的心脏微血管病变的靶向治疗药物
JP2023521785A (ja) 2020-04-09 2023-05-25 テクニッシェ ウニベルシタット ミュンヘン 肺線維症の治療のためのマクロファージへのｍｉＲ－２１阻害剤の標的送達
WO2022026851A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 The Scripps Research Institute Targeted rna degradation allows precision repurposing of protein-targeted small molecule medicines to rna
WO2022184888A2 (en) * 2021-03-05 2022-09-09 Proqr Therapeutics Ii B.V. Antisense oligonucleotides for use in the treatment of corneal dystrophies
KR102549208B1 (ko) * 2021-04-08 2023-06-30 연세대학교 산학협력단 심혈관 질환과 관련된 LncRNA 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070213292A1 (en) * 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
WO2007112754A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions comprising anti-mirna antisense oligonucleotides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004076622A2 (en) * 2003-02-10 2004-09-10 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Regulation of gene expression by dna interference
WO2004083430A2 (en) 2003-03-21 2004-09-30 Santaris Pharma A/S SHORT INTERFERING RNA (siRNA) ANALOGUES
EP2839832A3 (en) * 2003-11-17 2015-06-24 Novartis AG Use of dipeptidyl peptidase IV inhibitors
EP1784501B1 (en) 2004-05-14 2015-11-18 Rosetta Genomics Ltd VIRAL AND VIRUS ASSOCIATED MicroRNAS AND USES THEREOF
EP1827458A4 (en) * 2004-11-09 2010-02-17 Baylor College Medicine SELECTIVE INHIBITION OF ROCK 1 IN CARDIAC THERAPY
AU2007306594A1 (en) * 2006-10-09 2008-04-17 Julius-Maximilians-Universitat Wurzburg MicroRNA (miRNA) for the diagnosis and treatment of heart diseases
EP2104735A2 (en) * 2006-12-08 2009-09-30 Asuragen, INC. Mir-21 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009058818A2 (en) 2007-10-29 2009-05-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions comprising a micro-rna and methods of their use in regulating cardiac remodeling
EP2096171A1 (en) 2008-02-27 2009-09-02 Julius-Maximilians-Universität Würzburg MicroRNA (miRNA) and down-stream targets for diagnostic and therapeutic purposes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070213292A1 (en) * 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
WO2007112754A2 (en) * 2006-04-03 2007-10-11 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions comprising anti-mirna antisense oligonucleotides

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAL XUEZHONG et al.: Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA, 2004, vol. 10, No. 12: 1957-1966 *
CHAN A. JENNIFER et al.: MicroRNA-21 Is an Antiapoptotic Factor in Human Glioblastoma Cells. Cancer Res., 2005; 65: (14), с. 6029-6033, особенно с. 6029, 6032-6033 *
CHENG ANGIE M. et al.: Antisense inhibition of human miRNAs and indications for an involvement of miRNA in cell growth and apoptosis. Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, No. 4, c. 1290-1297, особенно с. 1290-1291, 1293-1294, 1296, Supplementary Material *
CHENG YUNHUI et al.: MicroRNAs Are Aberrantly Expressed in Hypertrophic Heart. The American Journal of Pathology. 2007, Vol. 170, No. 6, с. 1831-1840, с. 1831, 1833 *
KRUTZFELDT JAN et al.: Specificity, duplex degradation and subcellular localization of antagomirs. Nucleic Acids Research, 2007, Vol. 35, No. 9, c. 2885-2892 *
SI M.-L. et al.: miR-21-mediated tumor growth. Oncogene, 2006, с. 1-5 *
TATSUGUCHI MARIKO et al.: Expression of microRNAs is dynamically regulated during cardiomyocyte hypertrophy. Journal of Molecular and Cellular Cardiolog, 2007, 42, с. 1137-1141, особенно с. 1137, 1140 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2712511C2 (ru) * 2014-09-08 2020-01-29 Мираген Терапеутикс, Инк. Миметики mir-29 и пути их применения

Also Published As

Publication number Publication date
US20200069720A1 (en) 2020-03-05
EP2628800A1 (en) 2013-08-21
US9220722B2 (en) 2015-12-29
DK2260101T3 (da) 2013-08-19
AU2009218704A1 (en) 2009-09-03
US20140121264A1 (en) 2014-05-01
US20170304347A1 (en) 2017-10-26
KR20100126430A (ko) 2010-12-01
US20210113603A1 (en) 2021-04-22
CA2716643A1 (en) 2009-09-03
CN102027113A (zh) 2011-04-20
EA201070992A1 (ru) 2011-04-29
US20230028937A1 (en) 2023-01-26
AU2009218704C1 (en) 2015-01-29
CN102027113B (zh) 2017-08-18
NZ588185A (en) 2012-11-30
US20130018084A1 (en) 2013-01-17
US10028974B2 (en) 2018-07-24
US10434117B2 (en) 2019-10-08
US9663788B2 (en) 2017-05-30
MX336299B (es) 2016-01-14
US20180360866A1 (en) 2018-12-20
WO2009106477A1 (en) 2009-09-03
BRPI0907565A2 (pt) 2019-05-28
BRPI0907565B1 (pt) 2021-11-30
ME01600B (me) 2014-09-20
HRP20130766T1 (hr) 2013-10-25
CA2716643C (en) 2021-08-03
IL207704A (en) 2016-11-30
EP2096171A1 (en) 2009-09-02
EP2260101A1 (en) 2010-12-15
ES2436885T3 (es) 2014-01-07
US20160177302A1 (en) 2016-06-23
KR101697482B1 (ko) 2017-01-18
JP2011516410A (ja) 2011-05-26
CY1114426T1 (el) 2016-08-31
CA3123067A1 (en) 2009-09-03
PT2260101E (pt) 2013-09-05
WO2009106367A1 (en) 2009-09-03
MY159454A (en) 2017-01-13
SI2260101T1 (sl) 2013-10-30
EP2260101B1 (en) 2013-05-29
MX2010009346A (es) 2010-12-20
US20110071211A1 (en) 2011-03-24
JP2015107971A (ja) 2015-06-11
IL207704A0 (en) 2010-12-30
US8592389B2 (en) 2013-11-26
PL2260101T3 (pl) 2013-10-31
HK1150857A1 (en) 2012-01-13
JP6033527B2 (ja) 2016-11-30
AU2009218704B2 (en) 2014-09-18
US8236777B2 (en) 2012-08-07
UA100727C2 (ru) 2013-01-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020335B1 (ru) МИКРО-РНК (mi-РНК) И МИШЕНИ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ЦЕЛЕЙ
KR101965868B1 (ko) 대상에게서 ｓｍｎ２ 스플라이싱을 조정하기 위한 조성물 및 방법
TW201300404A (zh) 微型ｒｎａ化合物及調控ｍｉｒ－２１活性之方法
CN108271351A (zh) 用于调节血管紧张素原表达的化合物和方法
KR102208777B1 (ko) 마이크로 RNA miR-210 억제제를 유효성분으로 포함하는 노화 관련 대사질환 방지용 조성물 및 miR-210 억제제의 스크리닝 방법
AU2014256406A1 (en) MicroRNA (miRNA) and downstream targets for diagnostic and therapeutic purposes
WO2022026648A1 (en) Inhibition of incexact1 to treat heart disease
CN115052590A (zh) 包含8-氧代鸟嘌呤的RNA干扰诱导核酸、与包含8-氧代鸟嘌呤的microRNA结合的修饰的核酸及它们的用途
KR101353358B1 (ko) ｐ５３β를 발현하는 세포주 및 이의 생산 방법