CN102027113A - 用于诊断与治疗目的的微小rna(mirna)和下游靶标 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微小RNA的启动子区、微小RNA、特别是miR-21的用途、以及用于诊断的相关成分和用于制备治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病的药物的相关成分。另外，本发明涉及针对miR-21的靶标的反义寡核苷酸。还包括miR-21缺陷型细胞、启动子区和miR-21的靶标及其敲除生物。最后，本发明涉及用于诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的方法以及用于筛选用于治疗纤维变性和/或纤维变性相关疾病的有药物活性的化合物的方法。本发明还涉及用于治疗、改善和/或预防纤维变性的组合物。在某些实施方案中，所述组合物调节用于治疗、改善和/或预防纤维变性的miRNA的活性。在某些实施方案中，组合物抑制用于治疗、改善和/或预防纤维变性的miR-21的活性。

Description

用于诊断与治疗目的的微小RNA(MIRNA)和下游靶标
发明领域
本发明涉及用于诊断、预防和/或治疗纤维变性和其它疾病的微小RNA(miRNA)、特别是miR-21及其下游靶标的领域。本发明还涉及用于治疗纤维变性的组合物、方法和用途。这类方法包括调节和抑制患有纤维变性的受治疗者的miRNA活性。
发明背景
微小RNA是一大类小的非编码RNA，它控制多种生物过程，包括由调节互补的靶mRNA的表达而导致主要的信号转导途径(Ambros，2004)。在各种疾病实体中微小RNA的失调是由基因组改变(Mi等，2007)、差异性表达或者在某些情况下将微小RNA功能改变成为肿瘤抑制物或癌基因的病毒感染所引起的。最近在一系列精细的遗传学研究中，微小RNA涉及不同心脏功能的调节(Care等，2007；Yang等，2007)。虽然这些研究有助于勾画出微小RNA在心脏生理学、生长和形态发生中的作用，但是对微小RNA在体内疾病途径中的详尽分子机制的了解不多。研究表明，单链寡核苷酸微小RNA拮抗剂在体外和体内使内源微小RNA沉默，因而对靶mRNA和蛋白质水平及代谢产生作用(Kruetzfeldt等，2005；Esau等，2006)。这些研究结果表明微小RNA拮抗剂的应用在体内证实了微小RNA的功能，或许更重要的是成为新的治疗方式。
发明概述
本发明涉及微小RNA的启动子区(promoter region)、微小RNA、特别是miR-21的用途、以及用于诊断及用于制备治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病的药物的相关成分。另外，本发明涉及针对miR-21的靶标的各种反义寡核苷酸。还包括miR-21、启动子区和miR-21的靶标缺陷型细胞及其敲除生物。最后，本发明涉及用于诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的方法以及筛选用于治疗纤维变性和/或纤维变性相关疾病的有药物活性的化合物的方法。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA互补的核苷碱基(nucleobase)序列。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者；给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。
本文提供的方法包括给予有发生纤维变性风险的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，从而预防纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肝纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肺纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是皮肤纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是年龄相关性纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是心脏纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肾纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是脾纤维变性。
本文提供的方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。
本发明提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症选自心脏肥大、高血压性心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心脏相关性贮积病、心肌病、缩窄性心包炎、冠状动脉疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相关性纤维变性和心脏瓣膜疾病。
在某些实施方案中，心肌病选自扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、无梗阻肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病选自二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、三尖瓣狭窄和肺动脉瓣狭窄。
在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病选自二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣闭锁不全和肺动脉瓣闭锁不全。
在某些实施方案中，本文提供的方法还包括给予一种或多种另外的药物。
在某些实施方案中，给药改善心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低(impairment of fractional shortening)。
在某些实施方案中，给药防止心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低。
在某些实施方案中，给药改善心脏功能。
在某些实施方案中，给药包括静脉内给药、皮下给药、动脉内给药或心脏内给药。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种肝脏疾病或病症。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者患有至少一种肝脏疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是慢性肝损伤。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是肝炎病毒感染。在某些实施方案中，肝炎感染是丙型肝炎感染。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。在某些实施方案中，给药包括静脉内给药或皮下给药。在某些实施方案中，至少一种肝脏疾病或病症是肝硬化。在某些实施方案中，给药改善肝功能。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症。
本文提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。在某些实施方案中，至少另一种肺部疾病或病症是慢性阻塞性肺部疾病。在某些实施方案中，给药包括经肺给药。
本文提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，其中受治疗者患有至少另一种疾病或病症。
本发明提供的方法包括鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中受治疗者患有至少另一种疾病或病症；并且给予受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是肺动脉高压。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是血管相关性疾病。在某些实施方案中，血管相关性疾病选自动脉僵硬(arterial stiffness)、mediasclerosis和动脉硬化。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是肠硬化。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症是全身性硬皮病。在某些实施方案中，至少另一种疾病或病症选自腹膜后纤维变性、增生性纤维变性(proliferative fibrosis)、增殖性纤维变性(neoplastic fibrosis)、肾源性系统性纤维变性、充血性纤维变性(injection fibrosis)、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛综合征、类风湿性关节炎。
在某些实施方案中，给药改善纤维变性。在某些实施方案中，给药减缓纤维变性进一步发展。在某些实施方案中，给药终止纤维变性进一步进展。在某些实施方案中，给药减轻纤维变性。在某些实施方案中，给药减少胶原含量。
本文提供用于治疗纤维增生性疾病的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维增生性疾病的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补，从而治疗纤维增生性疾病。
在某些实施方案中，给药包括静脉内给药、皮下给药、经肺给药、动脉内给药或心脏内给药。
本文提供用于抑制成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补，从而抑制成纤维细胞增殖。
本文提供用于刺激成纤维细胞凋亡的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而刺激成纤维细胞凋亡。
本文提供增加成纤维细胞中的Sprouty 1蛋白的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA或其前体互补，从而刺激Sprouty 1蛋白表达。
本文提供用于抑制微小RNA的组合物。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与同miR-21或其前体有至少80％同一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miR-21具有如SEQ ID NO：1所示的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miR-21前体具有如SEQ ID NO：11所示的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由13个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由14个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15-24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由24个连接核苷组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列的错配不多于2个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列的错配不多于1个。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列无错配。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ IDNO：12的核苷碱基序列的至少15个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少16个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少17个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQID NO：12的核苷碱基序列的至少18个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少19个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少20个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少21个连续核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少22个连续核苷碱基。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列由SEQ ID NO：12的核苷碱基序列组成。
在某些实施方案中，化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中具有以下结构(III)：
(5’)QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L(3’)
(III)
其中
每个Q独立地为2’-O-甲基修饰核苷；
Figure BPA00001252154700071
A和B中的一个为S，而另一个为O；
y为
Figure BPA00001252154700072
z1、z2、z3和z4中的每一个独立地为x或y；
n＝6-17
L为
Figure BPA00001252154700081
其中：
X为N(CO)R7或NR7；
R1、R3和R9中的每一个独立地为H、OH或-CH2ORb，前提条件是R1、R3和R9中的至少一个为OH，且R1、R3和R9中的至少一个为-CH2ORb；
R7为Rd或者被NRcRd或NHC(O)Rd取代的C1-C20烷基；
Rc为H或C1-C6烷基；
Rd为糖基(carbohydrate radical)；或任选与至少一个糖基连接的类固醇基；和
Rb为
Figure BPA00001252154700082
其A和B中的一个为S，而另一个为O。
在某些实施方案中，Rd为胆固醇。在某些实施方案中，z1、z2、z3和z4中的每一个为
Figure BPA00001252154700083
其A和B中的一个为S，而另一个为O。
在某些实施方案中，R1为-CH2ORb。在某些实施方案中，R9为OH。在某些实施方案中，R1和R9为反式。在某些实施方案中，R1和R3为反式。在某些实施方案中，R3为-CH2ORb。在某些实施方案中，R1为OH。在某些实施方案中，R1和R3为反式。在某些实施方案中，R3和R9为反式。在某些实施方案中，R9为CH2ORb。在某些实施方案中，X为NC(O)R7。在某些实施方案中，R7为-CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd。
在某些实施方案中，至少一种核苷间键合(internucleoside linkage)为修饰核苷间键合。在某些实施方案中，每个核苷间键合都是修饰核苷间键合。在某些实施方案中，至少一个核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键合。在某些实施方案中，每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。在某些实施方案中，至少一个核苷包含修饰糖。在某些实施方案中，众多核苷包含修饰糖。在某些实施方案中，每个核苷都包含修饰糖。在某些实施方案中，每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。在某些实施方案中，众多核苷的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖且众多核苷的每一个都包含2’-氟糖。在某些实施方案中，每个修饰糖独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或二环糖部分。在某些实施方案中，至少一个核苷包含修饰核苷碱基。在某些实施方案中，修饰核苷碱基为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，至少一个核苷包含胞嘧啶，其中胞嘧啶为5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列有至少90％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列有至少95％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列有100％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列为全长互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有至少90％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有至少95％互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有100％互补。在某些实施方案中，miR-21核苷碱基序列由SEQID NO：1的核苷碱基序列组成。在某些实施方案中，前体核苷碱基序列由SEQ ID NO：11的核苷碱基序列组成。
在某些实施方案中，把包含修饰寡核苷酸的化合物制成药物组合物。在某些实施方案中，把修饰寡核苷酸制成药物组合物。
在某些实施方案中，化合物由修饰寡核苷酸组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸是单链修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸是反义寡核苷酸。
本文提供用于治疗、预防和/或改善纤维变性的组合物。本文还提供用于治疗、预防和/或改善纤维变性的包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA互补的核苷碱基序列。
本文提供用于制备治疗和/或预防纤维变性的药物的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
本文提供用于治疗和/或预防纤维变性的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
本文提供用于治疗纤维变性的miR-21和/或针对miR-21的反义寡核苷酸的用途。
本文提供用于诊断纤维变性的miR-21和/或针对miR-21的反义寡核苷酸的用途。
附图简述
图1.心脏疾病中miR-21失调与在心脏成纤维细胞内显著表达
(a)用微阵列对微小RNA表达进行的分析。在心力衰竭的早期(3月龄)、中期(6月龄)和晚期(12个月)，从心力衰竭鼠模型(β1AR-TG小鼠)的左心室心肌层分离出RNA。表达用相对于野生型对照的调节倍数表示。miR-21用红色标注。数据得自每组3-4次独立杂交。
(b)左图：在β1AR-TG小鼠心力衰竭不同时期对miR-21表达进行的RNA印迹分析。右图：上图数据的定量分析。
(c)左图：非衰竭性和衰竭性人左心室心肌层中miR-21表达的RNA印迹分析。右图：非衰竭性和衰竭性人左心室心肌层中miR-21成熟形式的定量分析。
(d)上图：用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的新生期心肌细胞(neonatal cardiomyocyte)及用合成miR(scrambled-miR)(对照-pre-miR，50nM，72小时)、合成miR-21(pre-miR-21，50nM，72小时)和miR-21抑制剂(anti-miR-21，50nM，72小时)转染后针对α-辅肌动蛋白的抗体。将心肌细胞在控制条件(参见补充方法)下培养，或者用FCS(5％)刺激48小时。下图：各心肌细胞大小的定量分析(直方图分析)。对每组n＞200个心肌细胞进行了分析。
(e)上图：在α-MHC启动子控制下表达miR-21的转基因小鼠的产生。中图：野生型(WT)和转基因(TG)动物中成熟miR-21的RNA印迹。下图：野生型和miR-21-转基因小鼠的染色心脏横截面，以确定基本形态(HE染色)和胶原沉积(Sirius red)。
(f)心脏成纤维细胞和心肌细胞中的miR-21表达。RNA印迹(上图)和定量实时PCR分析(下图)。所有误差棒均表示SEM。a-f的n＝3-6。
图2.通过miR-21抑制Sprouty1脱阻抑ERK-信号转导并提高成纤维细胞存活
(a)Spry1LacZ+/-小鼠心脏用X-gal染色。目测(上图)和显微镜(下图)分析显示在心脏成纤维细胞中检出LacZ。短的黑色条代表100μm。长的黑色条代表10μm。
(b、c)上图：人衰竭性左心室(b)和在共培养的心肌细胞和成纤维细胞用合成微小RNA(scrambled-microRNA)(Pre-miRTM阴性对照#2，50nM，72小时)、合成miR-21(pre-miR-21，50nM，72小时)或miR-21抑制剂(anti-miR-21，50nM，72小时)转染后检测SPRY1、ERK1/2和磷酸ERK1/2。下图：蛋白质印迹结果的定量分析。
(d)上图：在siRNA介导的SPRY1敲减(knockdown)(150nM，72小时)或用共培养心脏细胞的合成siRNA(150nM，72小时)治疗后检测SPRY1、ERK1/2、磷酸ERK1/2。下图：蛋白质印迹结果的定量分析。
(e)上图：在用合成微小RNA(对照-pre-miR，100nM，72小时)、合成miR-21(pre-miR-21，100nM，72小时)、miR-21拮抗剂(anti-miR-21，100nM，72小时)或相应的对照(100nM，72小时)治疗后，膜联蛋白V阳性心脏成纤维细胞的FACS分析。下图：在相应的治疗后，膜联蛋白V阳性细胞的定量分析。
(f)：在用合成微小RNA(对照pre-miR，100nM，72小时)、合成miR-21(pre-miR-21，100nM，72小时)或miR-21拮抗剂(anti-miR-21，100nM，72小时)治疗后(上图)，或者在siRNA介导的SPRY1敲减(150nM，72小时)或用合成siRNA(150nM，72小时)治疗后(下图)，培养的心脏成纤维细胞上清液中的FGF2浓度。所有误差棒表示SEM。a-f的n＝3-6。
图3.miR-21的治疗性沉默在体内防止心脏纤维变性和心力衰竭
(a)上图：在经由颈静脉注射Cy3标记的修饰寡核苷酸后，对左心室心脏组织中Cy3和DAPI染色的荧光显微镜检测。对照接受PBS注射。下图：进行主动脉缩窄术(transaortic constriction，TAC)或假手术(sham operation)的小鼠在手术后24小时注射对照(PBS，200μl)或antagomir-21(200μl；80mg/kg/天)，接连注射3天。
(b)上图：在TAC后未治疗(对照)和antagomir-21治疗小鼠中miR-21表达的RNA印迹分析。下图：心脏miR-21表达的定量分析。
(c)上图：在假手术后或在TAC后用对照或antagomir-21治疗的小鼠中SPRY1、ERK1/2和磷酸ERK1/2的蛋白质印迹分析。Gβ的表达作为持家基因对照(housekeeping control)显示。下图：蛋白质印迹结果的定量分析。
(d)心脏切片在Sirius red染色后用于检测对照治疗小鼠和antagomir-21治疗小鼠的心肌纤维变性。
(e)对照治疗小鼠和antagomir-21治疗小鼠中心肌纤维变性的定量分析(左图)和心脏重量/体重(右图)。
(f)上图：在假手术后或在TAC后用对照或antagomir-21治疗的小鼠心脏组织中小鼠基因组的整套转录物组分析。红色(绿色)区表示显著(p＜0.05)诱导(阻抑)的基因。下图：在TAC后通过antagomir-21治疗，编码参与心肌纤维变性的蛋白质的上调基因的归一化。
(g)超声心动描记术分析。LVD，左心室直径；FS，缩短分数(fractional shortening)。
(h)在通过miR-21介导的对SPRY1的抑制而对心脏ERK信号转导脱阻抑的基础上提出的机制。所有误差棒表示SEM，a-g的n＝3-6。
图4.miR-21的转录调节
(a)与人miR-21启动子相比，不同物种miR-21-启动子区内的序列保守性。条形柱表示保守程度。
(b)人miR-21-启动子构建体的萤光素酶活性。逐步缩短天然启动子使得能够鉴定出负责miR-21表达的117bp区。n＝3。
(c)在各个转录因子结合位点缺失/突变后人miR-21-启动子构建体的萤光素酶数据。n＝3。
图5.遍在表达的miR-21的敲减在斑马鱼中诱导心脏表型
(a)左图：MO对照胚胎和80hpf时的miR-21 morphants的侧面图。A，心房；V，心室；黑色箭头强调心包水肿。
右上图：在受精后80小时(80hpf)，对照-注射吗啉代(MO-对照)的心脏显示正常的心脏形态。心脏环化(loop)，心脏内层和心肌层发育良好，心室(V)和心房(A)被房室(AV)环隔开。下图：由于丧失心室收缩性，miR-21morphants(注射MO-1)发生心包水肿并显示尾部缩短，但是其它器官系统发育正常进行。
(b)两种不同的吗啉代修饰的反义寡核苷酸(MO-1，n＝496和MO-2，n＝460)对miR-21功能的抑制在＞90％经注射的胚胎中导致相同的表型。数据来自每组3次独立注射。
(c)用两种不同的吗啉代(MO-1，n＝8和MO-2，n＝8)注射的MO-对照(n＝6)和miR-21morphants的心室在48、72、96和120hpf时的缩短分数(FS)表示心肌功能。miR-21morphant心室的心室FS随时间急剧降低。
图6.在培养的心肌细胞中的转染率
(a)培养的新生期心肌细胞用Cy-3标记的miR-21(50nM，72小时，Ambion，USA)转染后，用DAPI染色(右图)。为了比较，培养的心肌细胞只用DAPI染色(左图)。
(b)在用合成微小RNA(对照-pre-miR，50nM，72小时)、miR-21抑制剂(anti-miR-21，50nM，72小时)或合成miR-21(pre-miR-21，50nM，72小时)转染后，培养的心肌细胞中miR-21表达的RNA印迹分析。
所有误差棒均表示SEM；a)和b)的n＝3-6。
图7.Spry1基因3’UTR内的微小RNA结合位点
上图：在Spry1基因3’UTR内具有结合位点的各种微小RNA表达的改变。
下图：灰色表示经微小RNA微阵列分析的3’UTR内具有结合位点的微小RNA。Cds＝编码序列。
图8.miR-21实时PCR表达数据
除通过RNA印迹法测定以外，在假手术、假手术+antagomir-21治疗、TAC和TAC+antagomir-21治疗(左图)后，以及在野生型小鼠和miR-21转基因小鼠(右图)的心脏中，通过实时PCR对小鼠左心室组织中miR-21的表达进行了分析。n＝4-6每组。
数据未显示：
对假设的miR-21靶标进行筛选，揭示22种已知可能的靶基因，研究表明其中8种在心脏组织内表达。3种不同靶标预测工具的组合将Spry1(sprouty1)鉴定为非常可能的候选靶标。
miR-21的转录调节
与人miR-21启动子相比，不同物种的miR-21-启动子区内存在序列保守性。在各转录因子结合位点缺失/突变后，人miR-21启动子构建体显示出萤光素酶活性。逐步缩短天然启动子使得能够鉴定出负责miR-21表达的117bp区。n＝3。
培养的心肌细胞中的转染率
培养的新生期心肌细胞用Cy-3标记的miR-21(50nM，72小时，Ambion，USA)转染，并用DAPI染色。为了比较，培养的心肌细胞只用DAPI染色。在用合成微小RNA(对照-pre-miR，50nM，72小时)、miR-21抑制剂(anti-miR-21，50nM，72小时)或合成miR-21(pre-miR-21，50nM，72小时)转染后，分析了培养的心肌细胞中miR-21表达的RNA印迹。
Spry1基因3’UTR内的微小RNA结合位点
在Spry1基因3’UTR内具有结合位点的各种微小RNA的表达中有改变。通过微小RNA微阵列对3’UTR内具有结合位点的微小RNA进行了分析。
miR-21实时PCR表达数据
除通过RNA印迹法测定以外，还在假手术、假手术+miR-21拮抗剂治疗、TAC和TAC+miR-21拮抗剂治疗后的小鼠左心室组织中，以及在野生型小鼠和miR-21转基因小鼠心脏中，通过实时PCR对miR-21的表达进行了分析。
发明详述
定义
“纤维变性”是指器官或组织中过量纤维性结缔组织的形成或发育。在某些实施方案中，纤维变性作为修复或反应性过程而发生。在某些实施方案中，纤维变性在响应损伤或损害时发生。术语“纤维变性”应理解为作为修复或反应性过程的器官或组织中过量纤维性结缔组织的形成或发育，与作为器官或组织正常组分的纤维性组织的形成相反。
反义寡核苷酸应理解为具有与另一序列互补的某一序列、尤其与miR-21互补的序列的寡核苷酸。miR-21的靶标也可理解为包括miR-21的下游靶标。重要的是注意，例如通过具有至少与miR-21互补的序列的寡核苷酸抑制miR-21，将使miR-21的靶标(如Sprouty等)脱阻抑甚至过量表达。
“受治疗者”是指被选择施以治疗或疗法的人或非人类动物。
“疑似患有......的受治疗者”是指表现出某一疾病或病症的一个或多个临床标志的受治疗者。
“疑似患有纤维变性的受治疗者”是指表现出纤维变性的一个或多个临床标志的受治疗者。
“预防”是指延缓或预先制止病症或疾病发生、发展或进展达一段时间，包括数周、数月或数年。
“治疗”是指应用一种或多种具体方法用于治愈或改善某一疾病。在某些实施方案中，所述具体方法是给予一种或多种药物。
“改善”是指减轻某一病症或疾病的至少一个标志的严重程度。在某些实施方案中，改善包括延缓或减慢某一病症或疾病的一个或多个标志的进展。标志的严重程度可以通过本领域技术人员已知的主观或客观测量法确定。
“有需要的受治疗者”是指被鉴定为需要某一疗法或治疗的受治疗者。
“给予”是指向受治疗者提供药物或组合物，包括但不限于通过医学专业人员给予和自我给予的给药。
“胃肠外给药”是指通过注射或输注给药。
胃肠外给药包括但不限于皮下给药、静脉内给药、肌内给药、动脉内给药和颅内给药。
“皮下给药”是指恰好在皮肤下给药。
“静脉内给药”是指给药到静脉中。
“动脉内给药”是指给药到动脉中。
“心脏内给药”是指给药到心脏中。在某些实施方案中，心脏内给药通过导管进行。在某些实施方案中，心脏内给药通过开心手术进行。
“经肺给药”是指给药到肺部。
“改善肝功能”是指肝功能向正常参数变化。在某些实施方案中，通过测量存在于受治疗者血液中的分子来评价肝功能。例如，在某些实施方案中，通过血液中肝转氨酶水平的降低来测定肝功能的改善。
“药物组合物”是指适于给予个体的包括药物的物质混合物。例如药物组合物可包含修饰寡核苷酸和无菌水溶液。
“药物”是指当给予受治疗者时提供治疗作用的物质。
“活性药物成分”是指提供所需作用的药物组合物中的物质。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”和“核酸靶”均指能够被反义化合物靶定的任何核酸。
“选靶(Targeting)”是指可与靶核酸杂交并诱导所需作用的核苷碱基序列的设计和选择过程。
“靶向(Targeted to)”是指具有可供与某一靶核酸杂交以诱导所需作用的核苷碱基序列。在某些实施方案中，所需作用是减少某一靶核酸。
“调节”是指功能或活性的波动。在某些实施方案中，调节是指基因表达的增加。在某些实施方案中，调节是指基因表达的减少。
“表达”是指将基因的编码信息转化成细胞内存在和运作的结构所凭籍的任何功能和步骤。
“5’靶位点”是指与特定寡核苷酸最5’端的核苷碱基互补的靶核酸的核苷碱基。
“3’靶位点”是指与特定寡核苷酸最3’端的核苷碱基互补的靶核酸的核苷碱基。
“区/区域”是指某一核酸内连接核苷的部分。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与靶核酸某一区域互补的核苷碱基序列。例如，在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与miRNA茎环序列的区域互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与miRNA茎环序列的区域100％互补。
“区段”是指某一区域的较小部分或亚部分。
“核苷碱基序列”是指以5’至3’方向的连续核苷碱基的顺序，与任何糖、键和/或核苷碱基修饰无关。
“连续核苷碱基”是指核酸中彼此紧邻的核苷碱基。
“核苷碱基互补性”是指两个核苷碱基通过氢键非共价配对的能力。
“互补”是指第一核苷碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷碱基的区域内与第二核苷碱基序列的互补序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或有100％同一性，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。在某些实施方案中，具有与miRNA或其前体有100％互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸，在全长修饰寡核苷酸内可能与miRNA或其前体并非100％互补。
“互补性”是指第一核酸和第二核酸之间的核苷碱基配对能力。
“全长互补性”是指第一核酸的每个核苷碱基能够与第二核酸相应位置上的每个核苷碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中每个核苷碱基与miRNA中的核苷碱基具有互补性的修饰寡核苷酸与miRNA具有全长互补性。
“百分比互补”是指核酸中互补核苷碱基的数目除以核酸的长度。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的百分比互补性是指与靶核酸互补的核苷碱基数目除以修饰寡核苷酸的核苷碱基数目。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的百分比互补性是指与miRNA互补的核苷碱基数目除以修饰寡核苷酸的核苷碱基数目。
“百分比结合区”是指与寡核苷酸区互补的区域百分比。百分比结合区用与寡核苷酸互补的靶区域的核苷碱基数目除以该靶区域的长度来计算。在某些实施方案中，百分比结合区为至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。
“百分比同一性”是指与第二核酸相应位置上的核苷碱基相同的第一核酸的核苷碱基数目除以第一核酸中的核苷碱基总数。
本文所使用的“基本同一性”可指第一核苷碱基序列与第二核苷碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷碱基的区域内有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性或100％同一性。
“杂交”是指通过核苷碱基互补性而产生的互补核酸的退火。
“错配”是指不能够与第二核酸相应位置上的核苷碱基配对的第一核酸的核苷碱基。
“非互补核苷碱基”是指不能够通过氢键配对的两个核苷碱基。
“同一”是指具有相同的核苷碱基序列。
“miRNA”或“miR”是指长度介于18和25个核苷碱基的非编码RNA，它与编码RNA杂交并调节编码RNA的表达。在某些实施方案中，miRNA是通过切酶切割pre-miRNA的产物。miRNA的实例可参见称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“Pre-miRNA”或“pre-miR”是指具有发夹结构并含有miRNA的非编码RNA。在某些实施方案中，pre-miRNA是通过称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶切割pri-miR的产物。
“茎环序列”是指具有发夹结构并含有成熟miRNA序列的RNA。Pre-miRNA序列和茎环序列可以重叠。茎环序列的实例可参见称为miRBase的miRNA数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/)。
“Pri-miRNA”或“pri-miR”是指非编码RNA，其具有作为双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物的发夹结构。
“miRNA前体”是指起源于基因组DNA的转录物，并包含含有一个或多个miRNA序列的非编码结构性RNA。例如，在某些实施方案中，miRNA前体为pre-miRNA。在某些实施方案中，miRNA前体为pri-miRNA。
“单顺反子转录物”是指含有单个miRNA序列的miRNA前体。
“多顺反子转录物”是指含有两个或更多个miRNA序列的miRNA前体。
“种子区(Seed region)”是指从成熟miRNA序列的5’端起第2-6个或第2-7个核苷酸。
“寡聚化合物”是指包含连接的单体亚基的聚合物的化合物。
“寡核苷酸”是指连接核苷的聚合物，其每一个都可以彼此独立地为修饰或未修饰的。
“天然存在的核苷间键合”是指核苷之间的3’～5’磷酸二酯键。
“天然糖”是指存在于DNA(2’-H)或RNA(2’-OH)中的糖。
“天然核苷碱基”是指相对于其天然存在的形式是未修饰的核苷碱基。
“核苷间键合”是指邻接核苷间的共价键。
“连接核苷”是指由共价键连接的核苷。
“核苷碱基”是指能够与另一个核苷碱基非共价配对的杂环部分。
“核苷”是指与糖连接的核苷碱基。
“核苷酸”是指具有与核苷的糖部分共价连接的磷酸基的核苷。
“miR拮抗剂”是指与miRNA或其前体互补的修饰寡核苷酸。例如，“miR-X拮抗剂”是指具有与miR-X互补的核苷碱基的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，拮抗剂为miR-21拮抗剂。
“修饰寡核苷酸”是指相对于天然存在的末端、糖、核苷碱基和/或核苷间键合具有一个或多个修饰的寡核苷酸。
“单链修饰寡核苷酸”是指未与互补链杂交的修饰寡核苷酸。
“修饰核苷间键合”是指自天然存在的核苷间键合产生的任何改变。
“硫代磷酸酯核苷间键合”是指其中非桥接原子之一是硫原子的核苷间之间的键合。
“修饰糖”是指来自天然糖的取代和/或任何改变。
“修饰核苷碱基”是指来自天然核苷碱基的任何取代和/或改变。
“5-甲基胞嘧啶”是指被连接在5’位的甲基修饰的胞嘧啶。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”是指2’位上具有O-甲基修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”是指2’位上具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2’-O-氟糖”或“2’-F糖”是指2’位上具有氟修饰的糖。
“二环糖部分”是指通过桥接两个非偕环原子而修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”是指具有2’-O-甲氧基乙基糖修饰的2’-修饰核苷。
“2’-氟核苷”是指具有2’-氟糖修饰的2’-修饰核苷。
“2’-O-甲基”核苷是指具有2’-O-甲基糖修饰的2’-修饰核苷。
“二环核苷”是指具有二环糖部分的2’-修饰核苷。
“基序(Motif)”是指寡核苷酸中修饰和/或未修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间键合的模式。
“完全修饰寡核苷酸”是指每个核苷碱基、每个糖和/或每个核苷间键合均是修饰的。
“一致修饰寡核苷酸”是指每个核苷碱基、每个糖和/或每个核苷间键合在整个修饰寡核苷酸中都有相同的修饰。
“稳定修饰”是指在核酸酶的存在下，相对于由磷酸二酯核苷间键合连接的2’-脱氧核苷提供的稳定性，对核苷的修饰使修饰寡核苷酸的稳定性提高。例如，在某些实施方案中，稳定修饰是稳定化核苷修饰。在某些实施方案中，稳定修饰是核苷间键合修饰。
“稳定化核苷”是指相对于由2’-脱氧核苷提供的稳定性，经修饰核苷使寡核苷酸对核酸酶稳定性提高。在一个实施方案中，稳定化核苷是2’-修饰核苷。
“稳定化核苷间键合”是指相对于磷酸二酯核苷间键合所提供的稳定性，使寡核苷酸对核酸酶稳定性提高的核苷间键合。在一个实施方案中，稳定化核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键合。
概况
本文发现，与miR-21互补的修饰寡核苷酸是用于抑制miR-21的药物。在某些实施方案中，将修饰寡核苷酸给予患有特征是miR-21上调的疾病的受治疗者。在某些实施方案中，所述疾病为癌症。在某些实施方案中，所述疾病是心力衰竭。在某些实施方案中，所述疾病是纤维变性。纤维变性由器官或组织在响应损伤或损害时产生过量纤维性结缔组织而引起。如果不治疗，则纤维变性可导致心、肺、肾、肝和皮肤等组织的多种疾病。
本文发现，来源于成纤维细胞的miR-21在纤维变性中起决定性作用。MiR-21水平的提高促进成纤维细胞存活，而抑制内源miR-21会诱导凋亡性细胞死亡。因此，本文鉴定的是miR-21调节成纤维细胞存活所凭籍的机制。异常的成纤维细胞增殖和存活可导致纤维变性。因此，与miR-21互补的修饰寡核苷酸是用于治疗纤维变性的药物。在某些实施方案中，与miR-21互补的修饰寡核苷酸是与miR-21互补的反义寡核苷酸。
本发明的发明人证实了来源于成纤维细胞的miR-21和SPRY1在心脏中的关键作用(图3h)。数据表明应激诱导的和miRNA介导的ERK-MAP激酶活性的活化可显著地调节心脏纤维变性。该研究代表疾病模型中微小RNA治疗应用的第一个实例。具体地讲，在鼠模型中拮抗miR-21，防止了结构和功能性恶化。这些研究结果表明用于心力衰竭的新的治疗切入点，并显示出微小RNA拮抗剂的广泛治疗潜力。
本发明的一个方面涉及miR-21、针对miR-21的反义寡核苷酸和/或miR-21的靶标在制备用于治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病的药物中的用途。
本发明尤其涉及牵涉纤维变性的特定心脏疾病(＝纤维变性相关疾病)，比如心脏肥大、高血压性心脏病、舒张性和收缩性心力衰竭；心脏相关性贮积病，例如法布莱病(M.Fabry)；心肌病，例如扩张型心肌病、伴有梗阻或无梗阻的肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和其它形式的心肌病，诸如糖尿病性心肌病、缩窄性心包炎、冠状动脉疾病、心肌梗死、急性和慢性右心衰竭、纤维变性引起的心律失常、心肌炎相关性纤维变性；导致瓣膜狭窄或功能不全的心脏瓣膜疾病(例如硬化症)，例如二尖瓣狭窄和/或功能不全、主动脉瓣狭窄和/或功能不全、三尖瓣狭窄和/或功能不全、肺动脉瓣狭窄和/或功能不全。
本发明进一步的方面涉及牵涉纤维变性的其它疾病(＝纤维变性相关疾病)，不过与心脏系统无关。非限制性实例为肺纤维变性；慢性阻塞性肺部疾病；肺动脉高压；毒性环境引起的肝纤维变性；肝炎和/或继发性右心衰竭；皮肤纤维变性，例如损伤后瘢痕瘤的发生；血管相关性疾病，例如年龄或高血压相关性动脉僵硬、mediasclerosis、动脉硬化；不同器官的年龄相关性纤维变性；肠硬化，例如克罗恩病期间；全身性硬皮病和CREST综合征等；肾纤维变性；增殖性纤维变性和/或类风湿性关节炎。
更多的众所周知的纤维变性相关性疾病和病症为例如心内膜心肌纤维变性和特发性心肌病、由肝纤维变性引起的肝硬化、肺部的特发性肺纤维变性、弥散性实质性肺疾病、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛综合征、腹膜后纤维变性和肾源性系统性纤维变性。
本发明的所有方面，特别是所附权利要求书中提及的方面均可用于诊断、治疗和/或预防以可能的实例给出的上述疾病、病症和病况。所列疾病不是限制性的。
在一个实施方案中，本发明涉及用于调节miR-21的策略。在另一个实施方案中，本发明涉及用于调节，例如过量表达和/或上调miR-21靶标的策略。可能的调节为可植入装置，比如病毒载体和脂质体制剂等；基因转移系统、海棉等。
本文把Sprouty(SPRY1)鉴定为miR-21的靶标。miR-21和SPRY1两者在心脏成纤维细胞连同其它细胞类型内表达。心脏成纤维细胞中miR-21表达增加，诱导对SPRY蛋白表达的强有力的阻抑，并且进一步提高ERK-MAP激酶活化。在一个优选的实施方案中，靶标选自Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和Rtn4。
本发明的一个方面涉及针对(或与之互补)SEQ ID NO：2～SEQID NO：4、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的反义寡核苷酸，其用于诊断、治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病。在某些方面，与选自Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的靶标互补的反义寡核苷酸，干扰微小RNA(例如miR-21)与靶位点结合以及抑制选定靶标表达的能力。在某些方面，这类反义寡核苷酸包含一个或多个核苷修饰。
本发明的一个方面涉及缺乏miR-21、SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的细胞。
本发明的一个方面涉及缺乏miR-21、SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的非人类哺乳动物敲除生物，其作为纤维变性和/或纤维变性相关疾病的疾病模型。还包括的有转基因动物，特别是过量表达miR-21的非人类哺乳动物。
本文发现，来源于成纤维细胞的miR-21对心力衰竭产生影响。对患有由特发性扩张型心肌病造成的终末期心力衰竭的受治疗者的左心室心脏组织样品进行的分析揭示，miR-21表达增加且SPRY1蛋白表达脱阻抑。另外，在这些受治疗者的样品中ERK-MAP激酶被激活，这由磷-ERK/ERK比提高所证实。本文发现，在心力衰竭动物模型中，给予与miR-21互补的修饰寡核苷酸导致心脏纤维变性显著减轻。心力衰竭的特征在于心脏纤维变性以及其它参数。因此，与miR-21互补的修饰寡核苷酸是用于治疗心脏纤维变性的药物。
本文还发现，在心力衰竭动物模型中，心脏纤维变性减轻伴有心脏重量增加的减缓。此外，通过超声心动描记术对心脏功能的评价揭示，给予与miR-21互补的修饰寡核苷酸阻止左心室扩张并使缩短分数参数正常化。心力衰竭的特征可在于心脏重量增加、左心室扩张和缩短分数的减低及其它参数。因此，与miR-21互补的修饰寡核苷酸是用于治疗、改善和预防心脏纤维变性相关的心力衰竭的治疗剂。
本发明的一个方面涉及用于诊断、预防和/或治疗纤维变性和/或纤维变性相关疾病的微小RNA(miRNA)的启动子区，所述微小RNA的启动子区包含钙/cAMP反应元件蛋白(CREB)和/或血清应答因子(SRF)结合位点的修饰。
在一个实施方案中，启动子区、mirR-21本身的基因和/或各种信使RNA的3’UTR可含有多态性、突变特别是点突变、缺失、截短和/或倒置。野生型序列的所有这些改变导致重新形成新的miR-21结合位点，或者导致miR-21结合位点缺失。在另一个实施方案中，启动子区的修饰选自点突变、截短、缺失和倒置。此外，启动子区可选自SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4。
诊断应用
本发明的一个方面涉及miR-21、针对miR-21的反义寡核苷酸和/或miR-21的靶标用于诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的用途。反义寡核苷酸应理解为具有与另一序列互补的某一序列，尤其与miR-21互补的序列的寡核苷酸。miR-21的靶标也可理解为包括miR-21的下游靶标。重要的是注意，例如通过具有至少与miR-21互补的序列的寡核苷酸抑制miR-21，将使miR-21的靶标(如Sprouty等)脱阻抑甚至过量表达。
在一个方面，本发明涉及用于诊断纤维变性和/或纤维变性相关疾病的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供被认为患有纤维变性和/或纤维变性相关疾病的患者的样品；
(b)测定miR-21、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的表达；
其中与对照样品相比，miR-21水平升高和/或Sprouty1(SPRY1)水平、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4水平降低表明纤维变性和/或纤维变性相关疾病或其诱因(predisposition)。
在一个方面，本发明涉及用于筛选治疗和/或预防纤维变性和/或纤维变性相关疾病或其诱因的有药物活性的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供含有miR-21、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的样品；
(b)使候选物质与样品接触；
(c)测定候选物质对样品的作用；
其中miR-21、Sprouty1(SPRY1)、特别是SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：8、Tgfbi、Krit1、Pitx2、Fasl、Nfib、Lnx1和/或Rtn4的变化表示有药物活性的化合物。
某些疾病或病症
本文提供用于治疗患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法。本文还提供用于治疗已鉴定为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法。在某些实施方案中，这类方法包括给予受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
本文还提供用于预防有发生纤维变性风险的受治疗者的纤维变性的方法。在某些实施方案中，这类方法包括给予有发生纤维变性风险的受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
在某些实施方案中，纤维变性是肝纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肺纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是皮肤纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是心脏纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肾纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是肺纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是年龄相关性纤维变性。在某些实施方案中，纤维变性是脾纤维变性。
在某些实施方案中，患有或疑似患有纤维变性的受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。在某些实施方案中，被鉴定为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。在某些实施方案中，这类方法包括给予受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症是心脏肥大。在某些实施方案中，心脏疾病或病症是心肌病。在某些实施方案中，心肌病是扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、无梗阻肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病或糖尿病性心肌病。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症是冠状动脉疾病。在某些实施方案中，心脏疾病或病症是心脏相关性贮积病、缩窄性心包炎、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、心律失常或心肌炎相关性纤维变性。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症是心力衰竭。在某些实施方案中，心力衰竭是高血压性心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭或右心衰竭。
在某些实施方案中，心脏疾病或病症是心脏瓣膜疾病。在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病是二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、三尖瓣狭窄或肺动脉瓣狭窄。在某些实施方案中，心脏瓣膜疾病是二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣闭锁不全或肺动脉瓣闭锁不全。
本文提供用于治疗患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，其中受治疗者患有肝脏疾病或病症。在某些实施方案中，被鉴定为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者患有至少一种肝脏疾病或病症。在某些实施方案中，这类方法包括给予受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。在某些实施方案中，肝脏疾病或病症是慢性肝损伤。在某些实施方案中，肝脏疾病或病症是肝炎病毒感染。在某些实施方案中，肝炎感染是丙型肝炎感染。在某些实施方案中，肝脏疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。在某些实施方案中，肝脏疾病或病症是肝硬化。
本文提供用于治疗患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，其中受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症。本文还提供用于治疗已鉴定为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，其中受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症。在某些实施方案中，这类方法包括给予受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。在某些实施方案中，肺部疾病或病症是慢性阻塞性肺部疾病。
本文提供用于治疗患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，其中受治疗者患有至少另一种疾病或病症。本文还提供用于治疗已鉴定为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，其中受治疗者患有至少另一种疾病或病症。在某些实施方案中，这类方法包括给予受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。在某些实施方案中，一种其它的疾病或病症是肺动脉高压。在某些实施方案中，一种其它的疾病或病症是血管相关性疾病。在某些这类的实施方案中，血管相关性疾病是动脉僵硬、mediasclerosis或动脉硬化。在某些实施方案中，一种其它的疾病或病症是肠硬化。在某些实施方案中，另一种疾病或病症是全身性硬皮病。在某些实施方案中，一种其它的疾病或病症是腹膜后纤维变性、增生性纤维变性、增殖性纤维变性、肾源性系统性纤维变性、充血性纤维变性、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛综合征或类风湿性关节炎。
本文提供用于治疗患有纤维增生性疾病的受治疗者的方法。在某些实施方案中，这类方法包括给予患有或疑似患有纤维增生性疾病的受治疗者修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
本发明还涉及基于miRNA-21的癌症治疗，它包括通过调节癌细胞中SPRY-1介导的ERK信号转导而靶向特定的癌症。已知miR-21在许多不同的癌症类型中过量表达，包括食道癌、结肠腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、卵巢癌、肝细胞癌、头颈部癌、慢性淋巴细胞白血病、胰腺癌等等，在此只列举所述癌症中的某些。
因此，本发明还涉及上述癌症类型的诊断、预防和/或治疗。权利要求书所提及的全部特征都可与这些癌症类型的公开内容结合起来。
某些给药途径
在某些实施方案中，给予受治疗者包括胃肠外给药。在某些实施方案中，给予受治疗者包括静脉内给药。在某些实施方案中，给予受治疗者包括皮下给药。
在某些实施方案中，给予受治疗者包括动脉内给药。在某些实施方案中，给予受治疗者包括心脏内给药。用于心脏内给药的合适方法包括使用导管或在开心手术期间给药。
在某些实施方案中，给药包括经肺给药。在某些实施方案中，经肺给药包括通过吸入法将雾化寡核苷酸递送到受治疗者的肺部。在受治疗者吸入雾化的寡核苷酸后，寡核苷酸散布在正常和发炎肺组织两者的细胞内，包括肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、上皮细胞、血管内皮细胞和支气管上皮细胞。用于递送包含修饰寡核苷酸的药物组合物的合适装置包括但不限于标准雾化器装置。使用雾化器装置调节液滴大小以靶向呼吸道和肺的特定部分的制剂和方法为本领域技术人员所熟知。其它合适的装置包括干粉吸入器或定量吸入器。
在某些实施方案中，给予药物组合物以达到局部而非全身暴露。例如，经肺给药将药物组合物递送到肺部，使全身暴露减至最小。
其它合适的给药途径包括但不限于口服、直肠、跨粘膜、肠、肠内、局部、栓剂、鞘内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肌内、髓内和瘤内。
某些临床结果
在某些实施方案中，本文的方法为患有或疑似患有纤维变性的受治疗者提供临床上所需要的结果。
在某些实施方案中，临床上所需要的结果是改善心脏重量增加。在某些这类的实施方案中，临床上所需要的结果是改善左心室扩张。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是改善缩短分数减低。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是预防心脏重量增加。在某些这类的实施方案中，临床上所需要的结果是预防左心室扩张。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是预防缩短分数的减低。
在某些实施方案中，临床上所需要的结果是改善心脏功能。
在某些实施方案中，临床上所需要的结果是改善纤维变性。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是减慢纤维变性进一步发展。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是终止纤维变性进一步发展。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是减少纤维变性。在某些实施方案中，临床上所需要的结果是减少胶原含量。
在某些实施方案中，治疗上所需要的结果是改善肝功能。肝功能可通过肝功能试验来评价，其检测肝转氨酶的血液水平以及其它参数。在某些实施方案中，肝功能异常的受治疗者的血液肝转氨酶升高。血液肝转氨酶包括丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)。在某些实施方案中，肝功能异常的受治疗者的血液胆红素升高。在某些实施方案中，受治疗者的血液白蛋白水平异常。在某些实施方案中，本文提供的方法改变血液中的ALT、AST、胆红素和/或白蛋白水平，使得这些水平中的一项或多项更接近正常极限值。
在某些实施方案中，受治疗者的肝功能通过Child-Pugh分类系统来评价，该系统界定了三类肝功能。在该分类系统中，对以下五个类别之一的测量值给出得分：胆红素水平、白蛋白水平、凝血酶原时间、腹水和脑病。存在以下特征中的每种各得1分：血液胆红素小于2.0mg/dl；血液白蛋白大于3.5mg/dl；凝血酶原时间小于1.7国际标准化比值(INR)；不存在腹水；或不存在脑病。存在下列特征中的每种各得2分：血液胆红素2-3mg/dl；血液胆红素3.5-2.8mg/dl；凝血酶原时间1.7-2.3INR；轻微至中等腹水；或轻微脑病。存在下列特征中每种各得3分：胆红素大于3.0mg/dl；血液白蛋白小于2.8mg/dl；凝血酶原时间大于2.3INR；严重至难治愈的腹水；或严重脑病。将分值相加，A类得分为5-6分，B类得分为7-9分，C类得分为10-15分。在某些实施方案中，本文提供的方法导致肝功能改善，这通过Child-Pugh分类系统测定。
某些细胞表型
本文提供用于抑制成纤维细胞增殖的方法。本文还提供用于刺激成纤维细胞凋亡的方法。本文还提供用于在成纤维细胞中增加Sprouty1蛋白的方法。在某些实施方案中，这类方法包括使成纤维细胞与包含修饰寡核苷酸并且具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列的化合物接触。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
在某些实施方案中，成纤维细胞是体外的成纤维细胞。在某些实施方案中，成纤维细胞是体内的成纤维细胞。在某些实施方案中，接触发生在体外。在某些实施方案中，接触发生在体内。在某些实施方案中，接触是离体发生的。
某些另外的疗法
对纤维变性的治疗可包括不止一种疗法。因此，在某些实施方案中，本文提供用于治疗患有或疑似患有纤维变性的受治疗者的方法，所述方法包括除给予修饰寡核苷酸以外还给予至少一种疗法，所述修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括给予一种或多种另外的药物。在某些实施方案中，另外的药物包括但不限于利尿药(例如螺内酯(sprionolactone)、依普利酮、呋塞米)、inotropes(例如多巴酚丁胺、米力农)、地高辛、血管扩张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂(例如为卡托普利、依那普利、赖诺普利、贝那普利、喹那普利、福辛普利和雷米普利)、血管紧张素II受体阻滞药(ARB)(例如坎地沙坦、厄贝沙坦、奥美沙坦、氯沙坦、缬沙坦、替米沙坦、依普罗沙坦)、钙通道阻滞药、硝酸异山梨酯、肼屈嗪、硝酸盐类(例如单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯)、肼屈嗪、β-阻滞药(例如卡维地洛、美托洛尔)和利尿纳肽(natriuretic peptide)(例如奈西立肽)。
在某些实施方案中，另外的疗法可以是提高机体免疫系统的药物，包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补充剂(例如抗氧化剂，包括维生素A、C、E、β-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10和echinacea)及疫苗，例如免疫刺激复合物(ISCOM)，它包含疫苗制剂，所述疫苗制剂将抗原的多聚体形式与佐剂组合。
在某些这类的实施方案中，选择另外的疗法以治疗或改进本发明一种或多种药物组合物的副作用。这类副作用包括而不限于注射部位反应、肝功能试验异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常和肌病。例如，血清转氨酶水平升高可表示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素升高可表示肝毒性或肝功能异常。
在某些实施方案中，在同一时间给予本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它的药物。在某些实施方案中，在不同时间给予本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它的药物。在某些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它的药物一起制备在单一制剂中。在某些实施方案中，将本发明的一种或多种药物组合物和一种或多种其它的药物分开制备。
某些药物组合物
在某些实施方案中，将本文所述的包含与miRNA或其前体互补的修饰寡核苷酸的化合物制成用于治疗纤维变性的药物组合物。在某些实施方案中，将包含具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸的化合物制成用于预防纤维变性的药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物以剂量单位的形式给予(例如片剂、胶囊剂、大丸剂(bolus)等)。在某些实施方案中，这类药物组合物包含修饰寡核苷酸的剂量选自25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg和800mg。在某些这类的实施方案中，本发明的药物组合物包含修饰寡核苷酸的剂量选自25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg和800mg。
在某些实施方案中，药物是无菌冻干的修饰寡核苷酸，其用合适的稀释剂复溶，稀释剂例如注射用无菌水或注射用无菌盐水。在盐水中稀释后，以皮下注射或以静脉内输给予复溶产品。冻干药物产品由修饰寡核苷酸组成，将修饰寡核苷酸在注射用水或注射用盐水中配制，配制过程中用酸或碱调节至pH 7.0-9.0，然后冻干。冻干的修饰寡核苷酸可以是25-800mg的修饰寡核苷酸。要理解的是这包括25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg和800mg的冻干修饰寡核苷酸。可将冻干药物产品包装在2mLI型透明玻璃小瓶(硫酸铵处理过)中，用溴化丁基橡胶塞塞住后，用铝
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顶封密封。
在某些实施方案中，本发明的组合物还可含有常用于药物组合物的其它辅助成分，使用水平是本领域已确定的。因此，例如组合物可含有另外相容的有药学活性的材料，例如止痒药、收敛药、局部麻醉药或抗炎药，或者可含有用于经物理方法配制本发明组合物的各种剂型的其它材料，例如染料、矫味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，这类材料当加入时，不应过多地干扰本发明组合物的成分的生物活性。可将制剂灭菌，且如有需要，跟不与制剂的寡核苷酸发生不利相互作用的辅料混合，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种修饰寡核苷酸和一种或多种赋形剂。在某些这类的实施方案中，赋形剂选自水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物采用已知技术制备，包括但不限于混合、溶解、制粒、制锭、研碎、乳化、包封、包埋或压片工艺。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物为液体(例如混悬剂、酏剂和/或溶液剂)。在某些这类的实施方案中，液体药物组合物使用本领域已知成分制备，包括但不限于水、二醇、油、醇、矫味剂、防腐剂和着色剂。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物为固体(例如散剂、片剂和/或胶囊剂)。在某些这类的实施方案中，包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物使用本领域已知成分制备，包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
在某些实施方案中，将本发明的药物组合物配制成长效制剂。某些这类长效制剂一般比非长效制剂的起效更长久。在某些实施方案中，这类制剂通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给予。在某些实施方案中，使用合适的聚合材料和疏水材料(例如可接受油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶衍生物(例如微溶盐)来制备长效制剂。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳液。某些递送系统用于制备某些药物组合物，所述药物组合物包括包含疏水化合物的药物组合物。在某些实施方案中，使用某些有机溶剂，例如二甲基亚砜。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含一种或多种组织特异性递送分子，该分子经设计以将本发明的一种或多种药物递送到特定的组织或细胞类型中。例如，在某些实施方案中，药物组合物包括包被有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含助溶剂系统。这类助溶剂系统的某些包括例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水溶性有机聚合物和水相。在某些实施方案中，这类助溶剂系统可用于疏水化合物。这类助溶剂系统的非限制性实例为VPD助溶剂系统，这是一种包含3％(重量/体积)苯甲醇、8％(重量/体积)非极性表面活性剂Polysorbate 80TM和65％(重量/体积)聚乙二醇300的纯乙醇溶液。这类助溶剂系统的比例可在相当大的范围内变化而不会显著改变其溶解度和毒性特征。此外，也可改变助溶剂组分本身(identity)：例如可使用其它表面活性剂代替Polysorbate 80TM；可以改变聚乙二醇的级分大小；其它生物相容性聚合物可替代聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；以及其它糖或多糖可替代葡萄糖。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包括缓释系统。这类缓释系统的非限制性实例为固体疏水聚合物的半渗透基质。在某些实施方案中，缓释系统可在数小时、数天、数周或数月的时间内释放药物，这取决于它们的化学性质。
在某些实施方案中，制备本发明的药物组合物用于口服给药。在某些这类的实施方案中，通过将包含修饰寡核苷酸的一种或多种化合物与一种或多种药学上可接受的载体混合来制备药物组合物。这类载体的某一些可供将药物组合物配制成由受治疗者口服摄取的片剂、丸剂、锭剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、混悬剂等。在某些实施方案中，通过将寡核苷酸和一种或多种固体赋形剂混合获得口服使用的药物组合物。合适的赋形剂包括但不限于填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施方案中，任选将这类混合物研磨，并任选添加辅料。在某些实施方案中，使药物组合物成形以获得片剂芯或锭剂芯。在某些实施方案中，添加崩解剂(例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，例如藻酸钠)。
在某些实施方案中，提供具有包衣的锭剂芯。在某些这类的实施方案中，可以使用浓缩糖溶液，它可任选含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、清漆溶液(lacquer solution)和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可将染料或色素加入片剂或锭剂包衣中。
在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物为明胶制成的推合式胶囊剂。这类推合式胶囊剂的某些包含本发明的一种或多种药物混合有一种或多种填充剂，例如乳糖、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石粉或硬脂酸镁)，任选稳定剂。在某些实施方案中，用于口服给药的药物组合物是明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的密封软质胶囊剂。在某些软质胶囊剂中，将本发明的一种或多种药物溶于或悬浮于合适的液体中，例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可加入稳定剂。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于口腔给药。某些这类药物组合物为按常规方式配制的片剂或糖锭剂。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过注射(例如静脉内、皮下、肌内等)给药。在某些这类的实施方案中，药物组合物包含载体并在水溶液(例如水)或生理相容的缓冲溶液(例如Hanks溶液、林格液)或生理盐水缓冲液中配制。在某些实施方案中，包括其它成分(例如有助于溶解或用作防腐剂的成分)。在某些实施方案中，使用合适的液体载体、悬浮剂等制备注射用混悬剂。某些用于注射的药物组合物以单位剂型提供，例如装入安瓿或在多剂量容器中。某些用于注射的药物组合物是油性溶媒或水性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂，并且可含有调配剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。某些适用于注射用药物组合物的溶剂包括但不限于亲脂性溶剂和脂肪油例如芝麻油、合成脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯和脂质体。水性注射混悬剂可含有增加混悬剂粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选这类混悬剂还可含有合适的稳定剂或增加药物溶解度的试剂以供制备高度浓缩溶液之用。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于粘膜给药。在某些这类的实施方案中，在制剂中使用适于待渗透屏障的渗透剂。这类渗透剂是本领域普通已知的。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于通过吸入法给药。以喷雾器(pressurized pack)或雾化器内的喷雾剂形式，制备用于吸入法的某些这类药物组合物。某些这类药物组合物包括抛射剂，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在某些实施方案中，使用压缩气雾剂，用递送某一计量的阀确定剂量单位。在某些实施方案中，可以配制用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒。某些这类制剂包含本发明药物的粉末混合物和合适的粉末基料，例如乳糖或淀粉。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于直肠给药，例如栓剂或滞留型灌肠剂。某些这类药物组合物包含已知成分，例如可可脂和/或其它甘油酯。
在某些实施方案中，制备药物组合物用于局部给药。某些这类药物组合物包含温和的湿润基料，例如软膏或乳膏。示例性的合适软膏基料包括但不限于矿脂、矿脂加挥发性硅氧烷、以及羊毛脂和油包水乳液。示例性的合适乳膏基料包括但不限于冷霜和亲水性软膏。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物包含治疗有效量的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，治疗有效量足以预防、减轻或改善疾病症状或延长待治疗的受治疗者的生存期。治疗有效量的确定尽在本领域技术人员能力范围之中。
在某些实施方案中，将本发明的一种或多种修饰寡核苷酸配制成前药。在某些实施方案中，在体内给予时，前药经化学方法转化成生物学上、药学上或治疗学上更高活性形式的修饰寡核苷酸。在某些实施方案中，前药是有用的，因为它们比相应的活性形式更容易给予。例如，在某些情况下，比起相应的活性形式，前药的生物利用度可能更高(例如通过口服给药)。在某些情况下，与相应的活性形式相比，前药的溶解度得到改进。在某些实施方案中，比起相应的活性形式，前药较不易溶于水。在某些情况下，其中水溶解性不利于移动的这类前药具有良好的跨细胞膜的传送。在某些实施方案中，前药为酯。在某些这类的实施方案中，酯在给药时经代谢水解成羧酸。在某些情况下，含羧酸化合物是相应的活性形式。在某些实施方案中，前药包含与酸基结合的短肽(聚氨基酸)。在某些这类的实施方案中，肽在给药时被裂解形成相应的活性形式。
在某些实施方案中，通过对有药物活性的化合物进行修饰而产生前药，使得体内给予时可产生活性化合物。可以设计前药以改变药物的代谢稳定性或转运特征、掩蔽副作用或毒性、改进药物味道或改变药物的其它特征或性质。通过了解药代动力学过程和药物体内代谢，本领域技术人员一旦了解某一化合物的药物活性，便可设计该化合物的前药(参见例如Nogrady(1985)Medicinal Chemistry A BiochemicalApproach，Oxford University Press，New York，第388-392页)。
某些化合物
在某些实施方案中，本文提供的方法包括给予包含修饰寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，化合物由修饰寡核苷酸组成。
在某些这类的实施方案中，化合物包含与互补链杂交的修饰寡核苷酸，即化合物包含双链寡聚化合物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与互补链的杂交形成至少一个平端。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸与互补链的杂交在双链寡聚化合物的每一端形成平端。在某些实施方案中，相对于互补链的连接核苷数，修饰寡核苷酸的末端包含一个或多个额外的连接核苷。在某些实施方案中，一个或多个额外的核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些实施方案中，一个或多个额外的核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。在某些实施方案中，一个或多个额外核苷的核苷的至少一个核苷碱基与靶RNA互补。在某些实施方案中，每一个或多个额外核苷的每个核苷碱基均与靶RNA互补。在某些实施方案中，相对于修饰寡核苷酸的连接核苷数，互补链的末端包含一个或多个额外的连接核苷。在某些实施方案中，一个或多个额外的连接核苷位于互补链的3’端。在某些实施方案中，一个或多个额外的连接核苷位于互补链的5’端。在某些实施方案中，两个额外连接核苷与末端连接。在某些实施方案中，一个额外核苷与末端连接。
在某些实施方案中，化合物包含与一个或多个部分缀合的修饰寡核苷酸，这提高了所得反义寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。在某些这类的实施方案中，所述部分是胆固醇部分或脂质部分。用于缀合的额外部分包括糖、磷脂、生物素、酚嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在某些实施方案中，缀合基团与修饰寡核苷酸直接连接。在某些实施方案中，缀合基团通过选自以下的连接部分与修饰寡核苷酸连接：氨基、羟基、羧酸、巯基、不饱和键(例如双键或三键)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺基酯(SMCC)、6-氨基己酸(AHEX或AHA)、取代的C1-C10烷基、取代或未取代的C2-C10烯基和取代或未取代的C2-C10炔基。在某些这类的实施方案中，取代基选自羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、巯基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些这类的实施方案中，化合物包含具有一个或多个稳定基团的修饰寡核苷酸，所述稳定基团与修饰寡核苷酸的一个或两个末端连接以提高例如核酸酶稳定性等性质。包括在稳定化基团中的有帽结构(cap structure)。这些末端修饰保护修饰寡核苷酸免于外切核酸酶降解，并可利于在细胞内的递送和/或定位。帽可存在于5′端(5′帽)或3′端(3′帽)上，或者可存在于两个末端上。帽结构包括例如反相脱氧基脱碱基帽(inverted deoxy abasic caps)。
合适的帽结构包括4′，5′-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤型呋喃糖基)核苷酸、4′-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1，5-失水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏型呋喃戊糖基核苷酸、无环的3′，4′-开环核苷酸、无环的3，4-二羟基丁基核苷酸、无环的3，5-二羟基戊基核苷酸、3′-3′-反向核苷酸部分、3′-3′-反向脱碱基部分、3′-2′-反向核苷酸部分、3′-2′-反向脱碱基部分、1，4-丁二醇磷酸酯、3′-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3′-磷酸酯、3′-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥接甲基膦酸酯部分和非桥接甲基膦酸酯部分、5′-氨基-烷基磷酸酯、1，3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1，2-氨基十二烷基磷酸酯、羟丙基磷酸酯、5′-5′-反向核苷酸部分、5′-5′-反向脱碱基部分、5′-氨基磷酸酯、5′-硫代磷酸酯、5′-氨基、桥接和/或非桥接5′-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和5′-巯基部分。
某些核苷碱基序列
本文提供用于治疗或预防纤维变性的方法。在某些实施方案中，所述方法包括给予包含修饰寡核苷酸的药物组合物。在某些实施方案中，所述方法包括给予包含修饰寡核苷酸的化合物。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的序列。在某些实施方案中，miRNA是miR-21。
本文所述的成熟miRNA及其相应的茎环序列的核苷碱基序列是可见于miRBase中的序列，miRBase是一种miRNA序列和注解的在线检索数据库，参见http://microrna.sanger.ac.uk/。miRBase序列数据库中的条目表示预测的miRNA转录物的发夹部分(茎环)，具有成熟miRNA序列的位置和序列的信息。数据库中miRNA茎环序列不是严格意义上的前体miRNA(pre-miRNA)，在某些情况下可包括pre-miRNA和假定的原始转录物的一些侧翼序列。本文所述miRNA核苷碱基序列包括任何形式的miRNA，包括miRBase序列数据库10.0版中所披露的序列和miRBase序列数据库任何早期版本所披露的序列。序列数据库版本可导致某些miRNA的重新命名。序列数据库版本可导致成熟miRNA序列的变化。本发明的化合物包括修饰寡核苷酸，所述修饰寡核苷酸是与本文所述miRNA互补的任何核苷碱基序列形式。
要了解的是，本发明所述的任何核苷碱基序列不依赖于对糖部分、核苷间键合或核苷碱基的任何修饰。还要了解的是，包含U的核苷碱基序列也包括其中在具有‘U’的一个或多个位置处‘U’被‘T’置换的同一核苷碱基序列。相反要了解的是，包含T的核苷碱基序列也包括其中在具有‘T’的一个或多个位置上‘T’被‘U’置换的同一核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体互补的核苷碱基序列，这是指修饰寡核苷酸的核苷碱基序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个核苷碱基的区域内与miRNA或其前体的互补序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性，或者两条序列在严格杂交条件下杂交。因此，在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列相对于其靶miRNA或靶miRNA前体序列可能具有一个或多个错配碱基对，并且能够与其靶序列杂交。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与miRNA或其前体100％互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA全长互补。
在某些实施方案中，miR-21具有核苷碱基序列5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’(SEQ ID NO：1)。在某些实施方案中，miR-21茎环序列具有核苷碱基序列5’-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3’(SEQ ID NO：11)。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与如SEQ ID NO：1所示的miR-21的核苷碱基序列互补的序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与如SEQ ID NO：11所示的miRNA茎环序列的核苷碱基序列互补的序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：11的核苷碱基8-29区域互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与SEQ ID NO：11的核苷碱基46-66区域互补的序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有包含核苷碱基序列5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’(SEQ ID NO：12)的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有由如SEQ ID NO：12所示核苷碱基序列组成的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与包含miR-21的pri-miR序列的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与同SEQ ID NO：1所示核苷碱基序列有至少80％同一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与同SEQ ID NO：1所示核苷碱基序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％同一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸与同SEQ ID NO：11所示miR-21茎环序列的核苷碱基序列有至少80％同一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸具有与同SEQ ID NO：11所示miR-21茎环序列的核苷碱基序列有至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％同一性的核苷碱基序列互补的核苷碱基序列。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与本文所列miRNA核苷碱基序列或其前体全长互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列相对于成熟miRNA或其前体的核苷碱基序列有一个错配。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列相对于miRNA或其前体的核苷碱基序列有两个错配。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列相对于成熟miRNA或其前体的核苷碱基序列有仅两个错配。在某些这类的实施方案中，错配核苷碱基是连续的。在某些这类的实施方案中，错配核苷碱基是不连续的。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由许多长度与它所互补的成熟miRNA相等的连接核苷组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比它所互补的成熟miRNA的长度少。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比它所互补的成熟miRNA的长度少一个。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在5’端少一个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在3’端少一个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在5’端少两个核苷。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸在3’端少两个核苷。具有小于miRNA长度的多个连接核苷的修饰寡核苷酸，其中所述修饰寡核苷酸的每个核苷碱基与miRNA相应位置上的每个核苷碱基互补，被视为具有与miRNA序列的部分100％互补的核苷碱基序列的修饰寡核苷酸。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比它所互补的miRNA的长度大。在某些这类的实施方案中，额外核苷的核苷碱基与miRNA茎环序列的核苷碱基互补。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比它所互补miRNA的长度多一个。在某些这类的实施方案中，额外核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些这类的实施方案中，额外核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的连接核苷数比它所互补的miRNA的长度多一个。在某些这类的实施方案中，两个额外核苷位于修饰寡核苷酸的5’端。在某些这类的实施方案中，两个额外核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。在某些这类的实施方案中，一个额外核苷位于5’端，另一个额外核苷位于修饰寡核苷酸的3’端。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的部分核苷碱基序列与miRNA的核苷碱基序列100％互补，但是修饰寡核苷酸在其全长范围内不是100％互补。在某些这类的实施方案中，具有100％互补部分的修饰寡核苷酸的核苷数目大于miRNA的长度。例如，由24个连接核苷组成、其中核苷1～23的核苷碱基各与长度为23个核苷碱基的miRNA的相应位置各自互补的修饰寡核苷酸，具有与miRNA的核苷碱基序列100％互补的23个核苷部分，并且与miRNA的核苷碱基序列的整体互补性约96％。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miRNA的核苷碱基序列的部分100％互补。例如，由22个连接核苷组成、其中核苷1～22的核苷碱基与长度为23个核苷碱基的miRNA的相应位置各自互补的修饰寡核苷酸，与22个miRNA的核苷碱基序列的核苷碱基部分100％互补。这类修饰寡核苷酸与整个miRNA的核苷碱基序列有约96％整体互补性，并且与miRNA的22个核苷碱基部分有100％互补性。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的核苷碱基序列的部分与miRNA的核苷碱基序列或其前体的部分为100％互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的15个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的15个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的16个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的16个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的17个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的17个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的18个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的18个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的19个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的19个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的20个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的20个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的22个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的22个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的23个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的23个连续核苷碱基互补。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的24个连续核苷碱基各自与miRNA或其前体的24个连续核苷碱基互补。
某些修饰寡核苷酸
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15-25个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19-24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21-24个连接核苷组成。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由12个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由13个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由14个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由15个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由16个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由18个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由19个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由21个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由22个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由24个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由25个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由26个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由27个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由28个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由29个连接核苷组成。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由30个连接核苷组成。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸包含选自SEQ ID NO：12的连续核苷碱基的连接核苷。
某些修饰
本发明的修饰寡核苷酸包括对核苷碱基、糖和/或核苷间键合的一种或多种修饰。因为所需性质例如细胞摄取增加、对其它寡核苷酸或核酸靶的亲和力提高和在核酸酶的存在下稳定性提高，所以可在未修饰形式上选择修饰的核苷碱基、糖和/或核苷间键合。
在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷。在某些这类的实施方案中，修饰核苷是稳定化核苷。稳定化核苷的实例为糖修饰的核苷。
在某些实施方案中，修饰核苷为糖修饰的核苷。在某些这类的实施方案中，糖修饰的核苷还可包括天然或修饰的杂环碱基部分和/或天然或修饰的核苷间键合，并且还可包括不依赖于所述糖修饰的修饰。在某些实施方案中，糖修饰的核苷为2’-修饰核苷，其中糖环在天然核糖或2’-脱氧-核糖的2’碳上被修饰。
在某些实施方案中，2’-修饰核苷具有二环糖部分。在某些这类的实施方案中，二环糖部分是α构型的D糖。在某些这类的实施方案中，二环糖部分是β构型的D糖。在某些这类的实施方案中，二环糖部分是α构型的L糖。在某些这类的实施方案中，二环糖部分是β构型的L糖。
在某些实施方案中，二环糖部分在2′-碳原子和4′-碳原子之间包含桥接基团(bridge group)。在某些这类的实施方案中，桥接基团包含1-8个连接的双游离基(biradical group)。在某些实施方案中，二环糖部分包含1-4个连接的双游离基。在某些实施方案中，二环糖部分包含2或3个连接的双游离基。在某些实施方案中，二环糖部分包含2个连接的双游离基。在某些实施方案中，连接的双游离基选自-O-、-S-、-N(R1)-、-C(R1)(R2)-、-C(R1)＝C(R1)-、-C(R1)＝N-、-C(＝NR1)-、-Si(R1)(R2)-、-S(＝O)2-、-S(＝O)-、-C(＝O)-和-C(＝S)-；其中每个R1和每个R2独立地为H、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代杂环基、杂芳基、取代杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、取代氧基(-O-)、氨基、取代氨基、叠氮基、羧基、取代羧基、酰基、取代酰基、CN、巯基、取代巯基、磺酰基(S(＝O)2-H)、取代磺酰基、次硫酸基(sulfoxyl)(S(＝O)-H)或取代次硫酸基；且每个取代基独立地为卤素、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、氨基、取代氨基、酰基、取代酰基、C1-C12氨基烷基、C1-C12氨基烷氧基、取代的C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷氧基或保护基。
在一些实施方案中，二环糖部分在2’和4’碳原子之间被选自以下的双游离基桥接：-O-(CH2)p-、-O-CH2-、-O-CH2CH2-、-O-CH(烷基)-、-NH-(CH2)p-、-N(烷基)-(CH2)p-、-O-CH(烷基)-、-(CH(烷基))-(CH2)p-、-NH-O-(CH2)p-、-N(烷基)-O-(CH2)p-或-O-N(烷基)-(CH2)p-，其中p为1、2、3、4或5，且每个烷基可被进一步取代。在某些实施方案中，p为1、2或3。
在某些实施方案中，2’-修饰核苷包括选自以下的2′-取代基：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-、S-或N(Rm)-烷基；O-、S-或N(Rm)-烯基；O-、S-或N(Rm)-炔基；O-烯基(alkylenyl)-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和每个Rn独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C1-C10烷基。这些2′-取代基可被一个或多个独立选自以下的取代基进一步取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、巯基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基和炔基。
在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH＝CH2、O-CH2-CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和N-取代乙酰胺(O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和每个Rn独立地为H、氨基保护基或者取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2′-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2和O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施方案中，2’-修饰核苷包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施方案中，糖修饰的核苷为4’-巯基修饰核苷。在某些实施方案中，糖修饰的核苷为4’-巯基-2’-修饰核苷。4′-巯基修饰核苷具有β-D-核糖核苷，其中4′-O被4′-S置换。4′-巯基-2′-修饰核苷为4′-巯基修饰核苷，其2′-OH被2′-取代基置换。合适的2’-取代基包括2′-OCH3、2′-O-(CH2)2-OCH3和2′-F。
在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键合为修饰核苷间键合。在某些实施方案中，修饰核苷间键合包含磷原子。
在某些实施方案中，本发明的修饰寡核苷酸包含至少一种硫代磷酸酯核苷间键合。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，修饰核苷间键合不含磷原子。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过短链烷基核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过环烷基核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过混合的杂原子和烷基核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过混合的杂原子和环烷基核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过一个或多个短链杂原子核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合通过一个或多个杂环核苷间键合形成。在某些这类的实施方案中，核苷间键合具有酰胺主链。在某些这类的实施方案中，核苷间键合具有混合的N、O、S和CH2组分部分。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个修饰核苷碱基。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含一个或多个5-甲基胞嘧啶。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个胞嘧啶都包括5-甲基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰核苷碱基选自5-羟甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤。在某些实施方案中，修饰核苷碱基选自7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。在某些实施方案中，修饰核苷碱基选自5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施方案中，修饰核苷碱基包括多环杂环。在某些实施方案中，修饰核苷碱基包括三环杂环。在某些实施方案中，修饰核苷碱基包括吩
Figure BPA00001252154700501
嗪衍生物。在某些实施方案中，吩
Figure BPA00001252154700502
嗪可被进一步修饰形成本领域称为G夹环(G-clamp)的核苷碱基。
某些寡核苷酸基序
用于本发明修饰寡核苷酸的合适基序包括但不限于全部修饰、一致修饰、位置修饰和gapmer。可以设计具有全部修饰基序(包括一致修饰基序)的修饰寡核苷酸，以靶向成熟miRNA。或者，可以设计具有全部修饰基序(包括一致修饰基序)的修饰寡核苷酸，以靶向pri-miRNA或pre-miRNA的某些位点，阻断miRNA前体加工成为成熟miRNA。具有全部修饰基序或一致修饰基序的修饰寡核苷酸是miRNA活性的有效抑制剂。
在某些实施方案中，完全修饰寡核苷酸包含每个核苷上的糖修饰。在某些这类的实施方案中，众多核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷，而其余核苷为2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，众多核苷的每一个都是2’-O-甲氧基乙基核苷，且众多核苷的每一个都是二环核苷。在某些这类的实施方案中，完全修饰寡核苷酸还包括至少一个修饰核苷间键合。在某些这类的实施方案中，完全糖修饰的寡核苷酸的每个核苷间键合为修饰核苷间键合。在某些实施方案中，完全糖修饰的寡核苷酸还包括至少一个硫代磷酸酯核苷间键合。在某些这类的实施方案中，完全糖修饰的寡核苷酸的每个核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，完全修饰寡核苷酸在每个核苷间键合上被修饰。在某些这类的实施方案中，完全修饰寡核苷酸的每个核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，一致修饰寡核苷酸包括在每个核苷上相同的糖修饰。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖修饰。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-O-甲基糖修饰。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸的每个核苷都包含2’-氟糖修饰。在某些这类的实施方案中，一致修饰寡核苷酸还包括至少一个修饰核苷间键合。在某些这类的实施方案中，由糖一致修饰的寡核苷酸的每个核苷间键合为修饰核苷间键合。在某些实施方案中，由糖一致修饰的寡核苷酸还包括至少一个硫代磷酸酯核苷间键合。在某些这类的实施方案中，由糖一致修饰的寡核苷酸的每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，一致修饰的寡核苷酸始终包括相同的核苷间键合修饰。在某些这类的实施方案中，一致修饰寡核苷酸的每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸在每个核苷上都包含相同的糖修饰，并且还包含一个或多个核苷间键合修饰。在某些这类的实施方案中，修饰寡核苷酸包括在5’端的1个修饰核苷间键合和在3’端的1个修饰核苷间键合。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含在5’端的2个修饰核苷间键合和在3’端的2个修饰核苷间键合。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含在5’端上的2个修饰核苷间键合和在3’端上的3个修饰核苷间键合。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含在5’端上的2个修饰核苷间键合和在3’端上的4个修饰核苷间键合。在某些这类的实施方案中，修饰核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸由下式III表示：
(5’)QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L(3’)
在某些这类的实施方案中，化合物用式III表示。在某些实施方案中，Q为2’-O-甲基修饰核苷。在某些实施方案中，x为硫代磷酸酯。在某些实施方案中，y为磷酸二酯。在某些实施方案中，z1、z2、z3和z4中的每一个独立地为硫代磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施方案中，n为6-17。在某些实施方案中，L为胆固醇。在某些实施方案中，n为12-17。
在某些实施方案中，x为
Figure BPA00001252154700531
A和B中的一个为S，而另一个为O；
y为
Figure BPA00001252154700532
z1、z2、z3和z4中的每一个独立地为x或y；
n＝6-17
L为
Figure BPA00001252154700533
其中：
X为N(CO)R7或NR7；
R1、R3和R9中的每一个独立地为H、OH或-CH2ORb，前提条件是R1、R3和R9中的至少一个为OH，且R1、R3和R9中的至少一个为-CH2ORb；
R7为Rd或被NRcRd或NHC(O)Rd取代的C1-C20烷基；
Rc为H或C1-C6烷基；
Rd为糖基；或任选与至少一个糖基连接的类固醇基；和
Rb为
Figure BPA00001252154700534
A和B中的一个为S，而另一个为O。
在某些实施方案中，Rd为胆固醇。在某些实施方案中，z1、z2、z3和z4中的每一个为
Figure BPA00001252154700541
其A和B中的一个为S，而另一个为O。
在某些实施方案中，R1为-CH2ORb。在某些实施方案中，R9为OH。在某些实施方案中，R1和R9为反式。在某些实施方案中，R9为OH。在某些实施方案中，R1和R3为反式。在某些实施方案中，R3为-CH2ORb。在某些实施方案中，R1为OH。在某些实施方案中，R1和R3为反式。在某些实施方案中，R9为OH。在某些实施方案中，R3和R9为反式。在某些实施方案中，R9为CH2ORb。在某些实施方案中，R1为OH。在某些实施方案中，R1和R9为反式。在某些实施方案中，X为NC(O)R7。在某些实施方案中，R7为-CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd。
在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包含连接核苷的区域，其中各区的每个核苷都包含相同的糖部分，并且其中各区的每个核苷都包含不同于邻接区糖部分的糖部分。
在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包含至少10个2’-氟修饰核苷。这类位置修饰寡核苷酸可用下式I表示：
5′-T1-(Nu1-L1)n1-(Nu2-L2)n2-Nu2-(L3-Nu3)n3-T2-3′，其中：
每个Nu1和每个Nu3独立地为稳定化核苷；
至少10个Nu2为2′-氟核苷；
L1、L2和L3中的每一个独立地为核苷间键合；
每个T1和每个T2独立地为H、羟基保护基，任选连接的缀合基团或封端基团；
n1从0到大约3不等；
n2为约14～约22；
n3从0到大约3不等；和
前体条件是如果n1为0，则T1不为H或羟基保护基，且如果n3为0，则T2不为H或羟基保护基。
在某些这类的实施方案中，n1和n3各自独立地为1～约3。在某些实施方案中，n1和n3各自独立地为2～约3。在某些实施方案中，n1为1或2，n3为2或3。在某些实施方案中，n1和n3各自为2。在某些实施方案中，n1和n3的至少一个大于零。在某些实施方案中，n1和n3各自大于零。在某些实施方案中，n1和n3之一大于零。在某些实施方案中，n1和n3之一大于1。
在某些实施方案中，n2为16-20。在某些实施方案中，n2为17-19。在某些实施方案中，n2为18。在某些实施方案中，n2为19。在某些实施方案中，n2为20。
在某些实施方案中，约2个～约8个Nu2核苷为稳定化核苷。在某些实施方案中，约2个～约6个Nu2核苷为稳定化核苷。在某些实施方案中，约3个～约4个Nu2核苷为稳定化核苷。在某些实施方案中，3个Nu2核苷为稳定化核苷。
在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的每一个被2个～约8个2’-氟核苷与Nu3稳定化核苷分隔开来。在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的每一个被3个～约8个2’-氟核苷与Nu3稳定化核苷分隔开来。在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的每一个被5个～约8个2’-氟核苷与Nu3稳定化核苷分隔开来。
在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含2～约6个Nu2稳定化核苷。在某些实施方案中，修饰寡核苷酸包含3个Nu2稳定化核苷。
在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的每一个在一个连续序列中连接在一起。在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的至少两个被至少一个2’-氟核苷分隔开来。在某些实施方案中，Nu2稳定化核苷的每一个都被至少一个2’-氟核苷分隔开来。
在某些实施方案中，Nu22’-氟核苷的至少两个连续序列被至少一个稳定化核苷分隔开来，其中每个连续序列具有相同数目的2’-氟核苷。
在某些实施方案中，T1和T2各自独立地为H或羟基保护基。在某些实施方案中，T1和T2中的至少一个为4，4′-二甲氧基三苯甲基。在某些实施方案中，T1和T2中的至少一个为任选连接的缀合基团。在某些实施方案中，T1和T2中的至少一个为封端基团。在某些实施方案中，封端基团为反相脱氧基脱碱基。
在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸包括至少一个修饰核苷间键合。在某些这类的实施方案中，位置修饰寡核苷(oligonucleoside)的每个核苷间键合为修饰核苷间键合。在某些实施方案中，位置修饰寡核苷酸的至少一个核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。在某些这类的实施方案中，位置修饰寡核苷酸的每个核苷间键合是硫代磷酸酯核苷间键合。
在某些实施方案中，位置修饰基序由下式II表示，该式表示由连接核苷组成的修饰寡核苷酸：
T1-(Nu1)n1-(Nu2)n2-(Nu3)n3-(Nu4)n4-(Nu5)n5-T2，其中：
Nu1和Nu5独立地为2’稳定化核苷；
Nu2和Nu4为2’-氟核苷；
Nu3为2’-修饰核苷；
n1和n5中的每一个独立地为0-3；
n2加n4的总和介于10和25之间；
n3为0至5；和
每个T1和每个T2独立地为H、羟基保护基、任选连接的缀合基团或封端基团。
在某些实施方案中，n2和n4的总和为16。在某些实施方案中，n2和n4的总和为17。在某些实施方案中，n2和n4的总和为18。在某些实施方案中，n1为2；n3为2或3；n5为2。
在某些实施方案中，Nu1和Nu5独立地为2’-修饰核苷。
在某些实施方案中，Nu1为O-(CH2)2-OCH3，Nu3为O-(CH2)2-OCH3、Nu5O-(CH2)2-OCH3，T1为H，T2为H。
在某些实施方案中，与miRNA互补并由22个连接核苷组成的修饰寡核苷酸具有选自表A的式II，其中每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。在某些实施方案中，具有选自表A的式II的修饰寡核苷酸具有SEQ ID NO：12的核苷碱基序列。
Figure BPA00001252154700571
具有gapmer基序的修饰寡核苷酸可具有由连接的2’-脱氧核苷酸组成的内部区域(internal region)和由连接的2’-修饰核苷组成的外部区域(external region)。可以设计这类gapmer以引发RNase H切割miRNA前体。内部2’-脱氧核苷区用作RNase H的底物，可供切割修饰寡核苷酸所靶定的miRNA前体。在某些实施方案中，每个外部区域的每个核苷包含相同的2’-修饰核苷。在某些实施方案中，一个外部区域一律由第一2’-修饰核苷组成，而另一个外部区域一律由第二2’-修饰核苷组成。
具有gapmer基序的修饰寡核苷酸在每个核苷上可具有糖修饰。在某些实施方案中，内部区域一律由第一2’-修饰核苷组成，且各侧翼(wing)一律由第二2’-修饰核苷组成。在某些这类的实施方案中，内部区域一律由2’-氟核苷组成，且每个外部区域一律由2’-O-甲氧基乙基核苷组成。
在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的2’-O-甲氧基乙基核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的2’-O-甲基核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由2’-氟核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由连接的二环核苷组成。
在某些实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含不同的2’-修饰。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含2’-氟核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含二环核苷。在某些这类的实施方案中，gapmer的一个外部区域的每个核苷都包含2’-O-甲基核苷，且另一外部区域的每个核苷都包含二环核苷。
在某些实施方案中，一个外部区域的核苷包含两个或更多个糖修饰。在某些实施方案中，每个外部区域的核苷包含两个或更多个糖修饰。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲氧基乙基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含二环糖部分。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含二环糖部分。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-O-甲基糖且同一外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖。在某些实施方案中，外部区域的至少一个核苷包含2’-氟糖且同一外部区域的至少一个核苷包含二环糖部分。
在某些实施方案中，gapmer的每个外部区域由相同数目的连接核苷组成。在某些实施方案中，gapmer的一个外部区域由不同于另一个外部区域的连接核苷数的多个连接核苷组成。
在某些实施方案中，外部区域独立包含1-6个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含1个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含2个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含3个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含4个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含5个核苷。在某些实施方案中，外部区域包含6个核苷。在某些实施方案中，内部区域由17-28个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由17-21个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由17个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由18个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由19个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由20个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由21个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由22个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由23个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由24个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由25个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由26个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由27个连接核苷组成。在某些实施方案中，内部区域由28个连接核苷组成。
某些定量测定法
可通过本领域已知的各种方法，对给予修饰寡核苷酸后对miRNA的反义抑制作用进行评价。在某些实施方案中，这些方法用来定量测定体外或体内的细胞或组织中的miRNA水平。在某些实施方案中，通过微阵列分析测定miRNA水平的改变。在某些实施方案中，通过若干种市售的PCR测定法，例如
Figure BPA00001252154700601
MicroRNA Assay(AppliedBiosystems)来测量miRNA水平的改变。在某些实施方案中，通过测量miRNA靶标的mRNA和/或蛋白质水平来评价对miRNA的反义抑制。对miRNA的反义抑制一般导致miRNA靶标的mRNA和/或蛋白质水平提高。
某些实验模型
在某些实施方案中，本发明提供在实验模型中使用和/或检验本发明的修饰寡核苷酸的方法。在某些实施方案中，采用实验模型以评价用于治疗纤维变性的本发明的修饰寡核苷酸的功效。本领域技术人员能够选择和修改用于这类实验模型的方案来评价本发明的药物。
首先可在培养细胞中检测修饰寡核苷酸。合适的细胞类型包括与需要体内递送修饰寡核苷酸的细胞类型有关的细胞。例如，用于研究治疗纤维变性的修饰寡核苷酸的合适细胞类型包括成纤维细胞、心肌细胞和星状细胞。
在某些实施方案中，在培养细胞中评价修饰寡核苷酸抑制miRNA的活性的程度。在某些实施方案中，可通过测量miRNA的水平来评价对miRNA活性的抑制。或者，可以测定经预测或经证实的miRNA靶标的水平。抑制miRNA活性可导致miRNA靶标的mRNA和/或蛋白质增加。此外，在某些实施方案中，可以测定某些表型结果。例如，合适的表型结果包括抑制细胞增殖、诱导细胞死亡和/或诱导凋亡。
在体外鉴定出有效抑制miRNA的活性的修饰寡核苷酸后，在体内实验模型中对修饰寡核苷酸进行进一步测试。
测试用于治疗纤维变性的药物(包括包含与miR-122互补的修饰寡核苷酸的药物)的合适的实验模型包括本文所述的压力超负荷诱发的肥大模型(pressure overload-induced hypertrophy model)。
测试用于治疗纤维变性的药物的其它实验模型包括但不限于甲硫氨酸胆碱缺陷型(MCD)饮食模型(参见例如Yamaguchi等，Hepatology，2008，47，625-635)。db/db小鼠自发地发生肥胖症、糖尿病和脂肪肝。在4-8周内给这类小鼠饲喂MCD饮食诱发非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和肝纤维变性。在该模型中测试具有与miRNA互补的核苷碱基的修饰寡核苷酸对肝纤维变性的作用。
为了更充分地说明本发明的某些实施方案而提供下列实施例。然而，这些实施例不应以任何方式解释为是对本发明广大范围的限制。
实施例
实施例1：miR-21在心脏病中的作用
心力衰竭转基因小鼠模型的微阵列分析(heart restrictedoverexpression of the β1-adrenergic receptor(β1-肾上腺素能受体的心脏受限过量表达)(Engelhardt等，1999))揭示了随着疾病严重程度渐增而心脏微小RNA表达特征逐步失调(图1a)。虽然在正常心肌中miR-21表达适中，但是在衰竭性心脏中，该微小RNA是受到最强调节的微小RNA之一。实际上，患终末期心力衰竭的小鼠中，miR-21是仅有的一个最强上调的微小RNA(图1a)。定量RNA印迹分析证实小鼠中miR-21上调，并且进一步揭示在人心力衰竭中显著上调(图1b、c)。通过RNA印迹法评价的miR-21前体表达增加提示了转录机制。因此，对人miR-21启动子进行了更详细的研究。在若干物种中鉴定出miR-21启动子区，并且miR-21启动子区高度保守(图4a)。对人miR-21表达的研究(图4a-c)证实其通过在心脏应激反应期间通常被激活的两个转录因子即钙/cAMP反应元件蛋白(CREB)和血清应答因子(SRF)进行转录调节。在miR-21启动子中CREB的缺失和SRF结合位点的突变导致miR-21表达在响应血清刺激时显著下降，这就说明了这两个转录因子在miR-21调节中的主要作用(图4c)。在敲减若干在斑马鱼中遍在表达的微小RNA的偏性筛选(biased screen)中，通过基于吗啉代的方法，检测miR-21在心脏形态和功能中的基本作用。对miR-21的敲减导致心脏结构和功能受到极大损害(图5)。如视像显微镜中测定，超过95％经注射的动物出现大量心包积液(图5a、插图和b)和心室功能受损(图5c)。
为了更详尽地研究miR-21在哺乳动物心脏中的这些基本功能，本发明的发明人在分离的心肌细胞中调节miR-21表达。本发明的发明人转染合成miR-21前体以及反义miR-21抑制剂，常规地达到＞95％寡核苷酸递送的转染率(图6a)。正如RNA印迹分析所测定的一样，miR-21的过量表达导致成熟miR-21稳固提高，而对miR-21的抑制则完全阻抑内源miR-21表达(图6b)。然而，心肌细胞中miR-21水平的提高或抑制都无法显著影响在静息条件下或在心肌细胞肥大条件下原代大鼠心肌细胞的形态、大小或数目(图1d)。比野生型同窝小鼠多25倍地过量表达miR-21的心肌细胞特异性miR-21转基因小鼠，不表现出具有左心室心肌层完整结构以及间质性纤维变性不存在的明显的心脏表型(图1e，下图)。与在衰竭性心脏中miR-21表达大为增加不同，这些数据表明，在分离的心肌细胞和心肌细胞特异性miR-21转基因小鼠模型中控制miR-21表达水平未能证实在斑马鱼中观察结果所表明的在心脏中miR-21的重要功能以及在衰竭性心脏中miR-21表达大大增加。因此，本发明的发明人接下来研究了miR-21在非心肌细胞的细胞类型(例如心脏成纤维细胞)中的可能作用。采用原位杂交，在正常心肌中检测到弱的miR-21信号，而在衰竭性心肌中，杂交信号大大增加。在高放大率下，杂交信号主要限于小间质细胞，据推测为心脏成纤维细胞。采用预接种步骤(pre-plating procedure)，本发明的发明人将新生期大鼠心脏分成心肌细胞部分和成纤维细胞部分。本发明的发明人的确检测到内源miR-21主要在心脏成纤维细胞中表达(图1f)。
实施例2：miR-21使心脏成纤维细胞ERK-信号转导脱阻抑
MiR-21表达在各种人类癌症选择性增加(Lu等，2005；Iorio等，2005)，研究表明在不同细胞内通过不同的机制对肿瘤生长和扩散产生影响。因为miR-21似乎以细胞类型特异性方式靶向独特的mRNA，本发明的发明人决定研究可能的心脏特异性miR-21靶标。应用生物信息学的方法，本发明的发明人对若干微小RNA数据库进行了潜在miR-21靶标的筛选，所述miR-21靶标具有包含3′UTR的种子序列和匹配的侧翼核苷酸，并将分析集中在据报道具有心脏表达的候选物上。有关概述见下表1。
表1
Figure BPA00001252154700631
对理论miR-21靶标的筛选揭示了22种已知的可能靶基因，之前的研究表明其中8种在心脏组织表达。3种不同靶标预测工具的组合鉴定出Spry1(sprouty1)为十分可能的候选物。Sprouty1(SPRY1)这种Ras/MEK/ERK途径的已知抑制剂(Hanafusa等，2002，Casci等，1999)，由于其得分高且在心脏中的显著表达水平而作为可能的靶标出现(表1)。Spry1mRNA的3’UTR含有若干预测的微小RNA结合位点，其中仅一种与心脏病期间微小RNA高度上调相对应(miR-21，见图7)。为了测定其中表达Spry1的细胞类型，本发明的发明人利用Spry1的等位基因，其中lacZ基因置换一部分Spry1编码序列。用于lacZ表达的测定法显示成年小鼠心脏中染色明显(图2a)。较高放大率确定源自间质成纤维细胞的Spry1表达的点状模式(图2a，下图)。因此，miR-21及其推定靶标Spry1在心脏成纤维细胞中共表达，但不在心肌细胞部分中共表达。与这些观察一致，在以心肌细胞特异性方式过量表达miR-21的转基因小鼠中发现SPRY1表达无可检测的下调。另外，心脏CREB这种miR-21表达的转录激活因子(图4)只定位于成纤维细胞中。然后，本发明的发明人测试了这些研究结果与人类疾病的关联。对得自由特发性扩张型心肌病所致终末期心力衰竭患者的左心室心脏组织样品进行的分析的确证实miR-21表达增加(图1c)，且SPRY1蛋白表达受明显阻抑(图2b)。这些研究结果伴随有ERK-MAP激酶的活化，正如磷酸ERK/ERK比提高所证实的一样(图2b)。
然后在间质成纤维细胞和心肌细胞的共培养物中对miR-21功能进行了表征以模拟完整心脏组织的组成成分。本发明的发明人通过合成miR-21前体分子或抑制剂的转染对miR-21功能进行了评价。增加的miR-21诱导对SPRY1蛋白表达的强阻抑并且增加ERK-MAP激酶活化(图2c)。SiRNA介导的Spry1沉默同样导致ERK-MAP激酶活化(图2d)。本发明的发明人接着评价了miR-21介导的成纤维细胞ERK-MAP激酶信号转导脱阻抑是否足以影响成纤维细胞存活。与ERK-MAP激酶信号转导在心肌纤维变性的潜在作用一致，miR-21水平的提高促进心脏成纤维细胞存活，而对内源miR-21的抑制诱导凋亡性细胞死亡(图2e)。本发明的发明人还发现，基于miR-21调节SPRY1表达对于心脏成纤维细胞的分泌功能是关键的，因为miR-21的过量表达以及siRNA介导的SPRY1表达沉默两者显著增加成纤维细胞生长因子2(FGF2)分泌到上清液中(图2f)。因此，该研究描述了衰竭性心脏中新的信号转导模式，其中在心脏病期间miR-21的再表达通过抑制SPRY1而提高ERK-MAP激酶活性。在哺乳动物心脏中，该机制可以调节成纤维细胞存活，从而决定性地控制间质性纤维变性的程度和心脏重塑。
实施例3：体内MiR-21的治疗性沉默
为了评价miR-21在体内的功能，在正常背景(setting)中以及在心力衰竭中，使用与miR-21互补的修饰寡核苷酸(miR-21拮抗剂)抑制miR-21活性。压力负荷过大诱发的肥大小鼠模型用作人心力衰竭的模型。在该模型中，通过主动脉弓缩窄(transverse aortic constriction，TAC)实现可再现的心脏应激反应。该模型由于其在全局表达谱中微小RNA和mRNA两者变化的匹配方式而十分类似于衰竭性人心脏(Thum等，2007)。
为了确定antagomir-21在心脏内的定位，将Cy-3标记的antagomir-21经由颈静脉导管注射到静脉内。观察到左心室心肌层普遍有深染色(图3a)，这表明了与miR-21互补的修饰寡核苷酸实现在心脏组织中的分布。miR-21拮抗剂包含在每个核苷上的2’-O-甲基糖、寡核苷酸最5’端的2个硫代磷酸酯核苷间键合、寡核苷酸最3’端的3个硫代磷酸酯核苷间键合以及通过羟脯氨醇(hydroxyprolinol)接头连接的胆固醇。miR-21拮抗剂具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：12的核苷碱基序列。未治疗(假手术)的小鼠或进行TAC手术的小鼠连续3天用antagomir-21或对照寡核苷酸治疗，剂量为80mg/kg。用antagomir-21治疗强有力地阻抑心脏miR-21表达升高长达3周，正如RNA印迹法(图3b)和实时PCR分析(图8)所测定的一样。该治疗完全逆转了在压力负荷过大期间TAC诱导的对SPRY1和ERK-MAP激酶活化下调至进行假手术小鼠中所观察到的水平(图3c)。未治疗小鼠中，在TAC后3周，间质性纤维变性和心脏重量显著增加，但是通过antagomir-21治疗的则大大减小(图3d、e)。实际上，通过antagomir-21治疗，心肌的胶原含量基本上达到正常。此外，其中在TAC后3周心脏重量加倍，antagomir-21治疗防止了肥大。在进行假手术的小鼠中，用antagomir-21治疗不会引起心脏重量或间质性纤维变性显著改变，这就表明了miR-21拮抗作用对正常心脏没有可检测的作用或无明显的antagomir-21治疗的心脏毒性。在TAC手术和antagomir-21治疗之后，全局转录物组分析揭示了各种失调基因正常化(图3f)。具体地讲，在miR-21的特异性抑制后，在心脏纤维变性期间极大上调的基因，例如胶原1α1、胶原3α1、双糖链蛋白多糖(biglycan)、纤调蛋白或结缔组织生长因子分别降低达42％、39％、44％、38％和37％(图3f下图)。在进一步的研究中，通过超声心动描记术对心脏功能进行了评价。在TAC后3周左室舒张末径(left ventricularend-diastolic diameter)显著增加，缩短分数减低(图3g)，正如在人心力衰竭中通常所观察到的一样。当与对照相比时，antagomir-21治疗防止左心室扩张并使缩短分数参数基本正常化至在进行假手术的动物中所观察到的水平(图3g)。异丙肾上腺素诱发的心脏病模型中用antagomir-21治疗观察到类似结果。
还进行了另外的实验，其中小鼠经过左心室遭受压力负荷过大3周后用antagomir-21治疗。在此期间，动物显示明显的左心室肥大、纤维变性和心脏功能受损。在此3周时间后，小鼠用antagomir-21治疗，并且再观察多3周。用对照治疗的动物显示左心室功能逐步受损以及间质性纤维变性和心脏肥大，而用antagomir-21治疗的动物显示心脏功能受损显著减轻以及心脏肥大和纤维变性消退。
这些数据证实来源于成纤维细胞的miR-21和SPRY1在心脏中的关键作用。miR-21在心脏成纤维细胞中的异常表达抑制SPRY1蛋白表达，导致ERK-MAP激酶活性增大。这进而提高了心脏成纤维细胞存活率，从而增加作为衰竭性心脏特征的间质纤维变性和心脏重塑。该模型(概括于图3h)指出在心肌疾病中对心脏成纤维细胞活化的主要作用。在心脏疾病鼠模型中拮抗miR-21防止了结构和功能的恶化。因此，本发明提供用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予与miR-21互补的修饰寡核苷酸。本发明还提供用于治疗与心脏病有关的纤维变性的方法，所述方法包括给予与miR-21互补的修饰寡核苷酸。
实施例4：胞外信号调节激酶MAPK途径的miR-21调节
由正常细胞向癌细胞的恶性转化需要若干致癌特性，例如不受控的细胞分裂、程序性细胞死亡(凋亡)抗性、侵袭和血管生成。遗传变异常常导致普遍的下游信号转导途径的组成型活化，例如包括c-RAF-1、MEK-1、ERK 1/2、p38和JNK等的促分裂原活化蛋白(MAP)激酶级联。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联是参与调节正常细胞增殖、存活和分化的关键的信号转导途径。MAPK级联的异常调节对癌症和其它人类疾病产生影响。胞外信号调节的激酶(ERK)MAPK途径特别成为深入研究的主题，导致了对用于治疗癌症的药理抑制剂的开发。已经十分确定的是，在正常细胞中，受体酪氨酸激酶例如EGF受体和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)通过Ras的活化而调节激酶ERK 1/2的活化，进而激活RAF-1/MEK-1/ERK 1/2级联。因为该信号转导途径在多种人癌症中是超活化的，所以受体酪氨酸激酶、Ras、c-RAF-1和MEK-1的抑制剂均已在进行研发，并处于研发的各个阶段。因此，通过给予有效量的RAF-1/MEK-1/P-ERK 1/2途径的抑制剂治疗癌症是可行的。
Sprouty(SPRY)是胞内蛋白质家族，是受体酪氨酸激酶途径(例如Ras/MAP激酶途径)的内源调节剂。哺乳动物物种表达4种Sprouty的同工型，Sprouty起生长因子诱导的细胞分化、迁移和增殖的抑制剂的作用。本发明的发明人将sprouty-1鉴定为可抑制ERK磷酸化，其可导致肿瘤形成的调节。本发明的发明人提出在多种人癌症中miR-21的上调抑制sprouty-1因而激活ERK，从而导致肿瘤形成增加且进展加快。因此，对miR-21的拮抗作用(例如通过antagomir-21)能够预防和/或减少肿瘤形成和/或进展。
实施例5：实验步骤
表达分析(微小RNA阵列、Affymetrix基因芯片分析、RNA印迹法、实时PCR)
从鼠左心室心肌层的RNA制备物产生微小RNA(Castoldi等，2007)和全局mRNA表达谱。通过RNA印迹法和茎环特异性实时PCR证实微小RNA失调。对于寡核苷酸阵列和斑点微小RNA阵列，应用如前所述(Thum等，2007)的得自Bioconductor方案的R软件包(www.bioconductor.org)进行了数据分析。
miR-21启动子分析
分离后24小时，采用已确立的脂质体转染方法(Lipofectamine，Invitrogen，USA)，用1μg报道质粒转染细胞。12小时后，培养基更换为无FCS培养基。24小时后，细胞用5％FCS处理8小时，而其它组在无FCS下进行培养。采用双重萤光素酶试剂盒(Dual Luciferase Kit)(Promega，Germany)，按照制造商的说明书，在细胞裂解物中测量萤光素酶活性。
心肌细胞分离、培养和转染实验
如之前的文献所述分离新生期心肌细胞(Merkle等，2007)。运用Axio Vision LE 4.1软件包(Carl Zeiss Vision GmbH，Jena，Germany)，从数字记录图像中测定心肌细胞大小。心肌细胞培养物用miR-21的前体和抑制剂(Ambion，USA)或针对sprouty1的siRNA(Promega，Germany)转染。本发明的发明人还采用适当的培养条件，用心脏成纤维细胞和成纤维细胞/心肌细胞共培养物进行了实验。
斑马鱼维持、吗啉代反义寡核苷酸的微注射和心脏功能的测定
标准吗啉代修饰的寡核苷酸用于成熟dre-miR-21(MO-1＝5’-GCCAACACCAGTCTGATAAGCTA-3’)，并且还使用多封闭(multi-blocking)吗啉代修饰的寡核苷酸干扰miR-21加工中的多个步骤和功能(MO-2＝5’-TGTAACAGCCAACACCAGTCTGATAAGCTAT-3’)。按与阴性对照相同的浓度注射标准对照寡核苷酸(MO-对照)(GENETOOLS，LLC)。将吗啉代微注射到野生型斑马鱼单细胞期胚胎中，在发育期间在若干时间点上，评价整体形态，尤其是心脏功能。记录图片和影片，基本按文献所述方法，测量48、72、80、96和120受精后小时(hpf)的心室缩短分数(Rottbauer等，2005)。
心脏肥大和衰竭的小鼠模型
按常规方法进行了主动脉缩窄术。β1-肾上腺素能受体转基因小鼠(TG4系)之前已有详细描述(Engelhardt等，1999)。
人心脏样品
本发明的发明人对因由扩张型心肌病所致的终末期心力衰竭而进行心脏移植术的患者心脏组织进行了研究，并且与健康成年心脏样品进行了比较。紧接移植之后，从左心室取出组织部分，将切离的组织在液氮中骤冻，并保存在-80℃下直到分析。
微小RNA靶标预测方法
应用微小RNA数据库和靶标预测工具miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)、PicTar(http://pictar.bio.nyu.edu/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/index.html)鉴定可能的微小RNA靶标。
蛋白质印迹法和心脏纤维变性的分析
按文献方法由移植心脏或共培养物制备蛋白质裂解物(Buitrago等，2005)，并按本文所述方法检测SPRY1、ERK1/2、磷酸ERK1/2和Gβ的表达。对于形态和纤维变性的分析，将心脏固定在4％福尔马林中，并用石蜡包埋。得自LV的组织切片(5μm)用苏木精和伊红或picrosirius red染色。使用配备滤光器以提供圆偏振照明的NikonECLIPSE 50i显微镜，分析Picrosirius red切片。用20X物镜获得组织图像，用制冷型数码相机(DS-5Mc，Nikon)记录，并运用SigmaScan Pro5.0图像分析软件(SPSS Inc.，USA)进行了分析。计算胶原含量，以各图像面积(用像素表示)的百分比表示。
αMHC-miR-21转基因小鼠
通过原核注射具有转基因构建体的FVB/N小鼠的受精卵母细胞，产生过量表达miR-21的转基因小鼠，所述转基因构建体含有在鼠α-肌球蛋白重链(αMHC)启动子控制下的成熟miR-21序列，两侧是天然前体序列的154bp上游和136bp下游。
得自Spry-lacZ小鼠心肌的X-gal染色
从Spry1-lacZ+/-小、鼠中收集心脏，在含有2％甲醛和0.05％戊二醛的PBS中固定2小时。随后，将心脏在0.01％去氧胆酸钠、0.02％诺乃P-40(Nonidet P-40)、2mM MgCl2和2mM EGTA的PBS溶液中漂洗4次达30分钟。对于β-半乳糖苷酶活性的检测，将心脏在含有0.5mg/ml X-gal、10mM K3Fe(CN)6和10mM、K4Fe(CN)6的漂洗溶液中在37℃下孵育。对于整个铺片分析，将心脏转移到30％甘油中，用Nikon数码相机DXM1200F和ACT-1软件拍摄数字图像。对于组织学分析，将心脏在异丙醇中脱水，在二甲苯中透明后，转移到石蜡中。采用标准方案制成10μm石蜡切片，并作记录。
修饰寡核苷酸的注射和检测
在TAC手术前，将颈静脉导管永久性地插入雄性C57/B16小鼠(10-12周龄)中。TAC后24小时，通过颈静脉导管每天注射80mg/kg/天的修饰寡核苷酸达3天。给作为有效递送(Cy3标记的修饰寡核苷酸)的阳性对照按80mg/kg注射入导管一次，3小时后取出心脏，固定，并通过荧光显微镜观察Cy3染色。
成纤维细胞凋亡和FGF2产生
在用miR-21前体、抑制剂或相应的对照治疗后，通过FACS分析(膜联蛋白-V-FLUOS试剂盒，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)测量膜联蛋白V阳性成纤维细胞。进行了酶联免疫吸附测定法(ELISA)以定量测定MiR-21调节的心脏成纤维细胞上清液中的FGF2浓度。按照制造商的说明书采用Quantikine FGF基础免疫测定试剂盒(R&D SYSTEMS，Minneapolis，USA)对FGF2进行了测定。
统计分析
平均数据用平均值±SEM表示。运用Prism软件(GraphPad，SanDiego，CA)或StatView(SAS Institute Inc.，Cary，USA)软件包进行了统计分析。适当时，应用ANOVA后接着是Bonferroni检验和学生t检验。当P＜0.05时，差异被视为显著，用星号表示。*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.005。
RNA分离、实时RT-PCR和RNA印迹法
对于从冷冻组织或细胞培养物中提取总RNA，按照制造商的说明书使用RNeasy小型试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)。通过TRIZOL(Invitrogen，Karlsruhe，Germany)或miRNA分离试剂盒(mirVanaTM，Ambion，USA)分离miRNA。按照文献(Thum和Borlak，2004)所述，用变性琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳(Bioanalyzer 2100；Agilent)证实了分离RNA的完整性。对于实时PCR，本发明的发明人采用iCycleriQTM实时PCR检测系统(BioRad，Germany)。
本发明的发明人使用靶标特异性茎环结构和反转录引物，在反转录后使用特异性TaqMan杂交探针对miR-21表达进行了定量测定(TaqMan miR-21微小RNA测定，Applied Biosystems，Foster City，USA)。使作为对照(TaqMan微小RNA试验对照，Applied Biosystems，Foster City，USA)的小RNA分子U6B小核(RNU6B)扩增。所有miRNA样品均得自包含相同总RNA浓度的分离物。
对于RNA印迹分析，将3μg的总RNA与适当的DNA标记一起加样到15％丙烯酰胺、6M脲和TBE凝胶中。电泳后，使用半干转移器(transfer)将RNA转印到尼龙膜(Qiabrane Nylon，Qiagen)上。然后使膜在杂交缓冲液(ULTRAhyb-Oligo杂交缓冲液，Ambion，USA)中在65℃下预杂交1小时。然后将之前用T4激酶(Exiqon)和32P-ATP标记的LNA寡核苷酸(miRCURY LNA阵列检测探针；Exiqon)加入缓冲液中，使膜在42℃下杂交过夜。随后，将印迹在室温下洗涤3次达3分钟(在0.2×SSC中)，接着在42℃下洗涤一次达15分钟。随后将膜暴露于磷光影像分析仪(phosphoimager)上。
微小RNA表达分析
对于微阵列微小RNA表达分析，本发明的发明人采用flashPAGE分馏器系统(Ambion，USA)，分别纯化微小RNA。按照制造商的说明书，使用mirVana微小RNA标记试剂盒(Ambion，USA)，将从8μg总RNA获得的微小RNA用染料Cy3(Molecular Probes，Carlsbad，Calif)标记。使各样品与不同的阵列杂交。按照Ambion mirVana指南(www.ambion.com/techlib/prot/)或按照文献2中所述进行微小RNA微阵列杂交、微小RNA纯化和富集、标记和微阵列杂交步骤。运用ScanAlyze软件(Eisen-Lab，Lawrence Berkeley National Lab(LBNL)，Berkeley，USA)进行数据采集。或者，5μg总RNA用Cy3缀合的RNA接头(Dharmacon，USA)标记，与用于miRNA基因组范围概况分析的微阵列平台(microarray platform)[miChip；固定在阵列上的俘获探针相当于(211人、51鼠)存入miRbase 6.1版的独特的人miRNA]杂交。采用Axon扫描仪(4000B，Molecular Dynamics)，用相同的光电倍增管设置获得杂交信号强度。应用Genepix 6(Molecular Dynamics)和Excel软件，进行了进一步分析。特异性TaqMan RT-PCR分析和RNA印迹分析证实了miR-21的表达。
全局转录物组分析
对于转录物组分析，按照Affymetrix方案(One-Cycle cDNA合成试剂盒，Affymetrix，USA)，自2μg总RNA开始进行了反转录、第二链合成和双链cDNA的清理(cleanup)(n＝4假手术后对照心脏，n＝4TAC和安慰剂治疗后左心室；n＝4TAC和miR21拮抗剂治疗后左心室)。采用IVT标记试剂盒(Affymetrix，USA)进行了生物素标记的cRNA的合成。测定了cRNA浓度，并通过凝胶电泳检查了cRNA片段大小的分布。15μg断裂的cRNA用于在小鼠基因组4302.0基因芯片(Affymetrix，USA)上杂交。采用得自Bioconductor方案(www.bioconductor.org)的阵列研究R软件包的数据分析。方差稳定性(variance stabilization)使所得信号强度归一化。应用limma(用于微阵列分析的线性模型)软件包检验了所有数据集质量并进行了统计分析，以选出差异性表达的基因。
心脏共培养实验和微小RNA/siRNA转染步骤
分离新生期大鼠的心肌细胞，并按照文献所述方法培养(Merckle等，2007)。对于分析miR-21对心肌细胞大小的调节，通过加入排除主要的非心肌细胞(例如成纤维细胞)污染的预接种步骤而使用纯的心肌细胞培养物。超过95％的培养心肌细胞呈辅肌动蛋白染色阳性，表明细胞培养物的高纯度。通过基于脂质体的方法(Lipofectamine，Invitrogen，USA；有关详情参见6)使合成miR(pre阴性对照#2，Ambion；50nmol/L，72小时)、miR-21前体分子(pre-MiR，Ambion；50nmol/L，72小时)或miR-21拮抗剂(anti-miR，Ambion；50nmol/L，72小时)。心肌细胞用低FCS(0.1％，对照条件)培养或者用高FCS(5.0％)培养48小时以诱发心肌细胞肥大。对于测定细胞大小，使用AxioVisonRel 4.4软件包(Carl Zeiss GmbH，Jena，Germany)计算在96孔板(接种密度40,000个细胞/孔)中新生期心肌细胞的表面积(转染后72小时)。数据用平均值±SEM表示。
为了模拟体内心脏条件，本发明的发明人使用心肌细胞和心脏成纤维细胞的共培养系统而忽略如上所述的预接种步骤。在此，本发明的发明人详细研究了合成miR(50nmol/L，72小时)、miR-21前体分子(50nmol/L，72小时)或miR-21拮抗剂(50nmol/L，72小时)转染后Spry-1的表达和Erk活化。在独立的实验中，将合成siRNA或针对Spry1的特异性siRNA混合物(3种不同的微小RNA，各16.7nmol/L)转染至共培养物中。通过实时PCR测量(TaqMan微小RNA测定法，Applied Biosystems)和RNA印迹监测转染率。
微小RNA靶标预测工具
应用miRanda算法(Griffiths-Jones等，2006)扫描人和鼠基因组3′UTR序列中潜在的miR-21结合位点。随后，进行了Karlin-Altschul归一化(miRBase Targets 4.0版；http://microrna.sanger.ac.uk/targets/v4/)。详细地讲，本发明的发明人利用miRBase数据库(4版，Sanger Institute；USA)，并且应用算法“高数目的保守物种；＞6”)，“低p值；＜0.001”和高miRBase分值；＞15，分选可能的miR-21靶标。该步骤表明22种已知基因是可能的miR-21靶标，之前的研究根据其GEO表达谱(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)表明其中8种在心脏组织内表达(见表1)。利用PicTar miRNA数据库9，5种基因另被预测为miR-21靶标(Krek等，2005)(http://pictar.bio.nyu.edu/)。运用TargetScan miRNA靶标预测软件(Whitehead Institute for Biomedical Research，USA，4.0版；2007年7月；http://www.targetscan.org/)，本发明的发明人确定了仅两个靶标对于miR-21具有8-mer种子匹配(8-mer seed matches)的保守位点的靶标。然后对Spry1进行了更详细的研究。
蛋白质印迹法
按照文献所述制备得自移植心脏或培养的成纤维细胞/心肌细胞中的蛋白质裂解物(Buitrago等，2005)。将提取物(20-50μg蛋白质/泳道)与加样缓冲液混合，在还原条件下在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离。将蛋白质电转移到PVDF膜(
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Bio-Rad)上。采用化学发光测定法(ECL Plus，Amersham)检测条带。本发明的发明人使用抗sprouty-1(Santa Cruz，sc-30048，稀释度1∶250-1∶500)、Erk1/2(CellSignaling，#9102，稀释度1∶1000)、磷酸Erk1/2(Cell Signaling，#9101，稀释度1∶1000)和G-β(Santa Cruz Biotechnology，sc-378，稀释度1∶1000)的第一抗体，以及合适的第二抗体(抗小鼠HRP(Cell Signaling，#7076，稀释度1∶10000；抗兔HRP(Cell Signaling，#7074，稀释度1∶10000)。
体内TAC模型和给予修饰寡核苷酸
本发明的发明人使用得自Charles River Laboratories(Sulzfeld，Germany)的雄性C57BL/6小鼠(10-12周龄，25g)。使用7-0缝线和27号针头在主动脉上缠绕两次进行主动脉缩窄术(TAC)。然后拔出针头，形成主动脉约80％缩窄。在同一手术期间，通过标准手术规程植入颈静脉导管。所述序列为：antagomir-21，5’-oUsoCsoAoAoCoAoUoCoAoGoUoCoUoGoUoAoAoGsoCsoUsoAs-Chol-3’。用于合成的所用核苷酸为2’-OMe修饰的(下标‘o’)。下标‘s’表示硫代磷酸酯键；“Cy3”表示位于寡核苷酸5’端的Cy3染料标记；“Chol”表示通过羟脯氨醇键连接的胆固醇。TAC后24小时开始治疗，动物通过植入的颈静脉导管接受PBS或miR-21拮抗剂注射(连续3天，颈静脉注射PBS或miR-21拮抗剂，剂量为80mg/kg体重，0.2ml/注射)。作为阳性对照，将有效心脏递送Cy-3标记的修饰寡核苷酸(antagomir-181a)(80mg/kg)注射入颈静脉导管，3小时后取出心脏，固定后，通过荧光显微镜观察Cy3染色。
心脏功能分析
TAC 3周后，小鼠用异氟烷麻醉，通过15MHz脉冲式多普勒超声心动描记术对心脏尺寸和功能进行了分析。然后取出心脏，取出心房后称重，并进行进一步的分析。使用异氟烷在浅麻醉具有自主呼吸的情况下进行了超声心动描记术研究。运行备有15MHz转换器的Toshiba Power Vision 6000，在啮齿动物成像方面有经验并且对实验组不知情的两位独立的超声图记录人员进行了超声心动描记术。记录在乳头肌水平上的2D左胸骨旁短轴观。在改变角度和头尾转换器移动后，通过左心室(LV)腔圆滑外观判断探头的正确旋转。通过心脏内边界的手工描迹图接着用Nice软件包(Toshiba Medical Systems)进行测面积，来计算LV舒张期末面积。用光标放在LV腔中部来记录同时发生的横向M模式描迹图。按照文献所述计算缩短分数(Collins等，2001)。
心脏纤维变性的检测
将小鼠心脏固定在4％缓冲的福尔马林中，并在石蜡中包埋。采用配备滤光器以提供圆偏振照明的Nikon ECLIPSE 50i显微镜，分析5μm picrosirius red切片(Whittaker等，1994)。将下层滤光器(lower filter)置于显微镜视野虹彩光圈环上，同时由四分之一波片的组合构成上层滤光器，所述四分之一波片置于排成线性的偏振器下，使得其透射轴与波片的快速轴成45°。这两个滤光器交叉，也就是说使之排列得使视场中的背景尽可能的暗。用20X物镜获取组织图像，用制冷型数码相机(DS-5Mc，Nikon)记录，并运用SigmaScan Pro 5.0图像分析软件(SPSS Inc.，USA)分析。原始(圆偏振)图像被各个精确地解析成其青色、黄色、品红色和黑色组分(采用通过图像分析提供的自动功能CYMK)。从偏振图像中减除黑色组分。在扣减前，适当调整黑色组分的亮度以确保排除胞间隙和非胶原组分而不是最薄的胶原纤维(通过检查确认)。然后采用图像软件所提供的自动功能HSV，将扣除图像进行最终颜色分离成为其色度、饱和度、亮度(HSV)分量。从清晰的8比特色度图像中获得色度频率的直方图，其含有256色。使用下列色度定义：红色2-9和230-256，橙色10-38，黄色39-51，绿色52-128。色度范围129-229由胞间隙和非双折射组织成分组成。测定了色度红色、橙色、黄色和绿色范围的多个像素，用胶原像素总数的百分比表示，胶原像素总数进而用图像中像素总数的百分比表示。
成纤维细胞凋亡和FGF-2产生
将在心肌细胞分离期间通过预接种步骤获得的心脏成纤维细胞进行培养直到分会合。根据用成纤维细胞标记抗大鼠脯氨酰基-4-羟化酶(Acris Antibodies，AF5110-1；数据未显示)染色，细胞纯度＞95％。在用miR-21前体、抑制剂或相应的对照治疗后(见上文)，通过FACS分析(膜联蛋白-VFLUOS试剂盒，Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany)测定膜联蛋白V阳性成纤维细胞。进行了酶联免疫吸附测定法(ELISA)以定量测定miR-21调节的心脏成纤维细胞上清液中的FGF-2浓度。按照制造商的说明书，使用Quantikine FGF基础免疫测定试剂盒(R&D SYSTEMS，Minneapolis，USA)，进行了FGF-2测定。
参考文献
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Claims (139)

1.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列。
2.一种方法，所述方法包括
鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者；和
给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
3.一种预防纤维变性的方法，所述方法包括给予有发生纤维变性风险的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列。
4.权利要求1、2或3的方法，其中所述纤维变性是肝纤维变性、心脏纤维变性、肾纤维变性、肺纤维变性、皮肤纤维变性、年龄相关性纤维变性或脾纤维变性。
5.一种方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症。
6.一种方法，所述方法包括
鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种心脏疾病或病症；和
给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
7.权利要求5或6的方法，其中所述心脏疾病或病症选自心脏肥大、高血压性心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、心脏相关性贮积病、心肌病、缩窄性心包炎、冠状动脉疾病、急性心肌梗死、慢性心肌梗死、右心衰竭、心律失常、心肌炎相关性纤维变性和心脏瓣膜疾病。
8.权利要求7的方法，其中所述心肌病选自扩张型心肌病、梗阻性肥厚型心肌病、无梗阻肥厚型心肌病、限制性心肌病、致心律失常性右室心肌病和糖尿病性心肌病。
9.权利要求7的方法，其中所述心脏瓣膜疾病选自二尖瓣狭窄、主动脉瓣狭窄、三尖瓣狭窄和肺动脉瓣狭窄。
10.权利要求7的方法，其中所述心脏瓣膜疾病选自二尖瓣闭锁不全、主动脉瓣闭锁不全、三尖瓣闭锁不全和肺动脉瓣闭锁不全。
11.权利要求5-10中任一项的方法，所述方法包括给予一种或多种另外的药物。
12.权利要求11的方法，其中一种或多种另外的药物选自利尿药、inotropes、地高辛、血管扩张药、血管紧张素II转化酶(ACE)抑制剂、血管紧张素II受体阻滞药(ARB)、钙通道阻滞药、硝酸异山梨酯、肼屈嗪、硝酸盐、肼屈嗪、β-阻滞药和利尿纳肽。
13.权利要求5-11中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、动脉内给药或心脏内给药。
14.权利要求5-13中任一项的方法，其中所述给药改善心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低。
15.权利要求5-14中任一项的方法，其中所述给药防止心脏重量增加、左心室扩张或缩短分数的减低。
16.权利要求5-15中任一项的方法，其中所述给药改善心脏功能。
17.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种肝脏疾病或病症。
18.一种方法，所述方法包括
鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种肝脏疾病或病症；和
给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
19.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是慢性肝损伤。
20.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是肝炎病毒感染。
21.权利要求20的方法，其中所述肝炎感染是丙型肝炎感染。
22.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是非酒精性脂肪性肝炎。
23.权利要求17或18的方法，其中至少一种肝脏疾病或病症是肝硬化。
24.权利要求17-23中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药或皮下给药。
25.权利要求17-24中任一项的方法，其中所述给药改善肝功能。
26.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症。
27.一种方法，所述方法包括
鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少一种肺部疾病或病症；和
给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
28.权利要求26或27的方法，其中至少另一种肺部疾病或病症是慢性阻塞性肺部疾病。
29.权利要求26-28中任一项的方法，其中所述给药包括经肺给药。
30.一种用于治疗纤维变性的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维变性的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成并且具有与miR-21或其前体互补的核苷碱基序列，其中所述受治疗者患有至少另一种疾病或病症。
31.一种方法，所述方法包括
鉴定患有或疑似患有纤维变性的受治疗者，其中所述受治疗者患有至少其它的疾病或病症；和
给予所述受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补。
32.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是肺动脉高压。
33.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是血管相关性疾病。
34.权利要求33的方法，其中所述血管相关性疾病选自动脉僵硬、mediasclerosis和动脉硬化。
35.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是肠硬化。
36.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症是全身性硬皮病。
37.权利要求30或31的方法，其中至少另一种疾病或病症选自腹膜后纤维变性、增生性纤维变性、增殖性纤维变性、肾源性系统性纤维变性、充血性纤维变性、纵隔纤维变性、骨髓纤维变性、输精管切除术后疼痛综合征、类风湿性关节炎。
38.权利要求33-37中任一项的方法，其中所述给药包括静脉内给药、皮下给药、动脉内给药、心脏内给药或经肺给药。
39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药改善纤维变性。
40.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药减缓纤维变性进一步发展。
41.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药终止纤维变性进一步发展。
42.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述给药减轻纤维变性。
43.一种用于治疗纤维增生性疾病的方法，所述方法包括给予患有或疑似患有纤维增生性疾病的受治疗者包含修饰寡核苷酸的化合物，所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而治疗纤维增生性疾病。
44.一种用于抑制成纤维细胞增殖的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而抑制成纤维细胞增殖。
45.一种用于刺激成纤维细胞凋亡的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而刺激成纤维细胞凋亡。
46.一种用于在成纤维细胞中增加Sprouty1蛋白的方法，所述方法包括使成纤维细胞与包含由12-30个连接核苷组成的修饰寡核苷酸的化合物接触，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体互补，从而刺激Sprouty1蛋白表达。
47.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由12-30个连接核苷组成。
48.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由12、13或14个连接核苷组成。
49.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由15-24个连接核苷组成。
50.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸由15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连接核苷组成。
51.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列的错配不多于2个。
52.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列的错配不多于1个。
53.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与miR-21或其前体的核苷碱基序列无错配。
54.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个或至少22个连续核苷碱基。
55.上述权利要求中任一项的方法，其中所述化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸。
56.上述权利要求中任一项的方法，其中所述配体是胆固醇。
57.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷间键合是修饰核苷间键合。
58.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷间键合都是修饰核苷间键合。
59.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷间键合为硫代磷酸酯核苷间键合。
60.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷间键合都是硫代磷酸酯核苷间键合。
61.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰糖。
62.上述权利要求中任一项的方法，其中众多核苷的每一个都包含修饰糖。
63.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷都包含修饰糖。
64.上述权利要求中任一项的方法，其中每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。
65.上述权利要求中任一项的方法，其中众多核苷的每一个都包含2’-O-甲氧基乙基糖，且众多核苷的每一个都包含2’-氟糖。
66.权利要求61-63中任一项的方法，其中每个修饰糖独立选自2’-O-甲氧基乙基糖、2’-氟糖、2’-O-甲基糖或二环糖部分。
67.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含修饰核苷碱基。
68.权利要求67的方法，其中所述修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
69.上述权利要求中任一项的方法，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
70.权利要求69的方法，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
71.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列有至少90％互补性或至少95％互补性。
72.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列有100％互补性。
73.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：1的核苷碱基序列具有全长互补性。
74.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有至少90％互补性或至少95％互补性。
75.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有100％互补性。
76.上述权利要求中任一项的方法，其中所述miR-21核苷碱基序列由SEQ ID NO：1的核苷碱基序列组成。
77.上述权利要求中任一项的方法，其中所述前体核苷碱基序列由SEQ ID NO：11的核苷碱基序列组成。
78.上述权利要求中任一项的方法，其中把包含修饰寡核苷酸的化合物制成药物组合物。
79.上述权利要求中任一项的方法，其中所述化合物由修饰寡核苷酸组成。
80.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸是单链修饰寡核苷酸。
81.上述权利要求中任一项的方法，其中所述给药减少胶原含量。
82.上述权利要求中任一项的方法，其中所述修饰寡核苷酸是反义寡核苷酸。
83.与miR-21互补的反义寡核苷酸在制备用于治疗和/或预防纤维变性的药物中的用途。
84.一种用于治疗和/或预防纤维变性的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
85.与miR-21互补的反义寡核苷酸在制备用于诊断纤维变性的药物中的用途。
86.一种用于诊断纤维变性的与miR-21互补的反义寡核苷酸。
87.一种用于诊断纤维变性的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供假定患有纤维变性的患者的样品；
b.测定miR-21的表达；
其中与对照样品相比miR-21水平升高，说明了纤维变性或其诱因。
88.一种用于筛选有药物活性的用于治疗和/或预防纤维变性或其诱因的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供含有miR-21的样品；
b.使候选物质与样品接触；
c.测定候选物质对样品的作用；
其中miR-21的改变表明有药物活性的化合物。
89.一种用于诊断、预防和/或治疗纤维变性的微小RNA(miRNA)的启动子区，所述启动子区包含钙/cAMP反应元件蛋白(CREB)和/或血清应答因子(SRF)结合位点的修饰，其中miRNA是miR-21，且纤维变性定义为作为修复或反应性过程的器官或组织中过量纤维性结缔组织的形成或发展。
90.权利要求89的启动子区，其中miRNA是SEQ ID NO：1。
91.权利要求89或90的启动子区，其中所述修饰选自点突变、截短、缺失和倒置。
92.前述权利要求中任一项的启动子区，其中所述启动子区选自SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4。
93.一种miR-21缺陷型细胞，其中所述细胞包含权利要求89的启动子区。
94.一种化合物，所述化合物包含与配体缀合的修饰寡核苷酸，其中所述化合物具有以下结构(III)：
(5’)QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L(3’)
(III)
其中
每个Q独立地为2’-修饰核苷；
x为
Figure FPA00001252154600091
A和B中的一个为S，而另一个为O；
y为
Figure FPA00001252154600101
z1、z2、z3和z4中的每一个独立地为x或y；
n＝6-17；
L为
Figure FPA00001252154600102
其中：
X为N(CO)R7或NR7；
R1、R3和R9中的每一个独立地为H、OH或-CH2ORb，前提条件是R1、R3和R9中的至少一个为OH，且R1、R3和R9中的至少一个为-CH2ORb；
R7为Rd或被NRcRa或NHC(O)Rd取代的C1-C20烷基；
Rc为H或C1-C6烷基；
Rd为糖基；或任选与至少一种糖基连接的类固醇基；
Rb为
其A和B中的一个为S，而另一个为O；
且其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有至少90％互补性。
95.权利要求94的化合物，其中Rd为胆固醇。
96.权利要求94或95的化合物，其中z1、z2、z3和z4中的每一个为
Figure FPA00001252154600111
其A和B中的一个为S，而另一个为O。
97.权利要求94的化合物，其中R1为-CH2ORb。
98.权利要求97的化合物，其中R9为OH。
99.权利要求98的化合物，其中R1和R9为反式。
100.权利要求94的化合物，其中R9为OH。
101.权利要求100的化合物，其中R1和R3为反式。
102.权利要求94的化合物，其中R3为-CH2ORb。
103.权利要求102的化合物，其中R1为OH。
104.权利要求103的化合物，其中R1和R3为反式。
105.权利要求102的化合物，其中R9为OH。
106.权利要求102的化合物，其中R3和R9为反式。
107.权利要求94的化合物，其中R9为CH2ORb。
108.权利要求107的化合物，其中R1为OH。
109.权利要求108的化合物，其中R1和R9为反式。
110.权利要求94的化合物，其中X为NC(O)R7。
111.权利要求110的化合物，其中R7为-CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd。
112.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷独立选自2’-O-甲氧基乙基核苷、2’-氟核苷、2’-O-甲基核苷或二环核苷。
113.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷都是2’-O-甲氧基乙基核苷。
114.上述权利要求中任一项的化合物，其中每个2’-修饰核苷都是2’-O-甲基核苷。
115.上述权利要求中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含修饰核苷碱基。
116.权利要求115的化合物，其中所述修饰核苷碱基是5-甲基胞嘧啶。
117.上述权利要求中任一项的化合物，其中至少一个核苷包含胞嘧啶，其中所述胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
118.权利要求117的化合物，其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
119.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有至少95％互补性。
120.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列与SEQ ID NO：11的核苷碱基序列有100％互补性。
121.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝15-23。
122.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝16。
123.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝17。
124.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝18。
125.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝19。
126.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝20。
127.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝21。
128.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝22。
129.上述权利要求中任一项的化合物，其中n＝23。
130.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少15个连续核苷碱基。
131.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少16个连续核苷碱基。
132.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少17个连续核苷碱基。
133.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少18个连续核苷碱基。
134.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少19个连续核苷碱基。
135.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少20个连续核苷碱基。
136.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少21个连续核苷碱基。
137.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列包含SEQ ID NO：12的核苷碱基序列的至少22个连续核苷碱基。
138.上述权利要求中任一项的化合物，其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列由SEQ ID NO：12的核苷碱基序列组成。
139.一种包含以下结构(III)的化合物：
(5’)QxQz1(Qy)nQz2Qz3Qz4Q-L(3’)
(III)
其中
每个Q独立地为2’-O-甲基修饰核苷；
x为
A和B中的一个为S，而另一个为O；
y为
Figure FPA00001252154600132
z1、z2、z3和z4中的每一个为x，其A和B中的一个为S，而另一个为O；
n＝15；
L为
Figure FPA00001252154600141
其中：
R1为CH2ORb；R9为OH；R1和R9为反式；X为N(CO)R7；
R7为-CH2(CH2)3CH2NHC(O)Rd；Rd为胆固醇基；
Rb为
Figure FPA00001252154600142
其A和B中的一个为S，而另一个为O；
且其中所述修饰寡核苷酸的核苷碱基序列由SEQ ID NO：12的核苷碱基序列组成。
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