CN106924757A

CN106924757A - miR-449c-5p及其拟似物在制备治疗和预防心脏瓣膜疾病产品中的应用

Info

Publication number: CN106924757A
Application number: CN201511021479.8A
Authority: CN
Inventors: 戴建武; 杨赟; 肖志峰; 赵燕南; 陈冰
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2017-07-07
Anticipated expiration: 2035-12-31
Also published as: CN106924757B

Abstract

本发明公开了miR-449c-5p及与之相关的双链RNA拟似物在制备治疗和预防心脏瓣膜疾病产品中的应用。本发明所提供的应用中，miR-449c-5p为序列1所示的单链RNA；双链RNA的一条链序列为序列1，另一条链序列为序列2；双链RNA的拟似物是对双链RNA中序列1所示的单链RNA进行下述修饰得到产物：对3′末端的一个核糖核苷酸进行胆固醇修饰；对5′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；对3′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；对所有核糖核苷酸进行甲氧基修饰。实验证明，本发明的miR-449c-5p、双链RNA及其拟似物可以用于主动脉瓣膜钙化的治疗及相关药物的制备。

Description

miR-449c-5p及其拟似物在制备治疗和预防心脏瓣膜疾病产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中miR-449c-5p及与之相关的双链RNA拟似物在制备治疗和预防心脏瓣膜疾病产品中的应用。

背景技术

心血管疾病严重威胁着人类健康，已经超越肿瘤成为人类健康的第一杀手。其中，心脏瓣膜病是仅次于高血压和冠心病的第三大心血管疾病。随着人口老龄化的加剧，主动脉瓣狭窄和(或)关闭不全患者比例逐年上升，是当今老年人最常见的心脏瓣膜病。主动脉瓣狭窄和(或)关闭不全往往是由年龄的增长、心脏瓣膜结缔组织发生退行性病变及纤维化引起的瓣膜增厚、变硬、变形及钙化导致的。主动脉瓣狭窄和(或)关闭导致心脏血流动力学的异常，继而损害心脏功能。但目前临床上除了瓣膜置换仍然没有有效的药物治疗方法。

既往认为主动脉瓣膜钙化是钙磷等矿物质的被动沉积。近年来，大量研究表明主动脉瓣膜钙化是由细胞和信号通路介导的主动性过程，涉及慢性炎症反应、脂代谢异常、瓣膜间质细胞分化及重塑以及钙盐沉积，这一过程与骨形成相似。Mohle等从已发生钙化狭窄的主动脉瓣膜上分离出瓣膜间质细胞，发现该细胞表型在体外特定的诱导条件下可转化为成骨细胞样细胞特征，并能够形成钙化结节。相关活体动物实验也证实，促进表型可塑的瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化是导致瓣膜异位钙化的前提基础。

microRNA作为转录后的调控者参与了很多生理和病理性过程，包括细胞增殖、凋亡、分化，而microRNA的失调经常会导致细胞功能受损。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何治疗和/或预防心脏主动脉瓣膜钙化。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了下述a1)或a2)的应用：

a1)双链RNA或所述双链RNA的拟似物在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用；所述双链RNA的一条链序列为序列表中序列1，所述双链RNA的另一条链序列为序列表中序列2；

a2)miR-449c-5p在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用；miR-449c-5p为序列1所示的单链RNA；

上述应用中，所述双链RNA的拟似物可为对所述双链RNA进行下述A1)、A2)、A3)和/或A4)修饰得到的双链RNA修饰物：

A1)对3′末端的一个核糖核苷酸进行胆固醇修饰；

A2)对5′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；

A3)对3′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；

A4)对所有核糖核苷酸进行甲氧基修饰。

上述应用中，所述双链RNA的拟似物具体可为对所述双链RNA中序列1所示的单链RNA进行所述A1)、A2)、A3)和/或A4)修饰得到的双链RNA修饰物。

上述应用中，A2)可为对5′末端的两个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰；A3)可为对3′末端的四个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰。

上述应用中，所述双链RNA的拟似物可为miR-449c-5p拟似物agomir-449c-5p。所述miR-449c-5p拟似物agomir-449c-5p为上海吉玛制药技术有限公司，货号为B06002。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述b1)、b2)、c1)或c2)的用途：

b1)所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用；

b2)miR-449c-5p在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用；

c1)与miR-449c-5p相关的生物材料在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用，所述与miR-449c-5p相关的生物材料为下述B1)-B10)中的任一种：

B1)编码miR-449c-5p或其前体的DNA分子或cDNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

c2)与所述双链RNA相关的生物材料在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用，所述与所述双链RNA相关的生物材料为下述C1)-C10)中的任一种：

C1)编码所述双链RNA的DNA分子或cDNA分子；

C2)含有C1)所述DNA分子的表达盒；

C3)含有C1)所述DNA分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述DNA分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C9)含有C1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；

C10)含有C2)所述表达盒的转基因动物细胞系。

上述应用中，B2)所述的含有编码miR-449c-5p的DNA分子的表达盒(miR-449c-5p表达盒)是指能够在宿主细胞中表达miR-449c-5p的DNA，该DNA不但可包括启动miR-449c-5p或其前体转录的启动子，还可包括终止miR-449c-5p或其前体转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子。

可用现有的表达载体构建含有所述miR-449c-5p表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，B5)-B8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述应用中，B9)-B10)所述的转基因动物细胞系不包括繁殖材料。

上述应用中，C2)所述的含有编码所述双链RNA的DNA分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述双链RNA的DNA，该DNA不但可包括启动所述双链RNA转录的启动子，还可包括终止所述双链RNA转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子。

可用现有的表达载体构建含有所述双链RNA表达盒的重组载体。

上述应用中，C5)-C8)所述的微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

上述应用中，C9)-C10)所述的转基因动物细胞系不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述与miR-449c-5p相关的生物材料或所述与所述双链RNA相关的生物材料在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1)或X2)：

X1)治疗和/或预防心脏瓣膜疾病的药物，其活性成分为miR-449c-5p、所述与miR-449c-5p相关的生物材料、所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物、或所述与所述双链RNA相关的生物材料；

X2)用于治疗和/或预防所述心脏瓣膜疾病的物质Z，所述物质Z为miR-449c-5p、所述与miR-449c-5p相关的生物材料、所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物、或所述与所述双链RNA相关的生物材料。

本发明中，所述心脏瓣膜疾病为主动脉瓣狭窄和/或主动脉瓣关闭不全。

本发明中，所述心脏瓣膜疾病可为主动脉瓣膜钙化，如主动脉瓣膜钙结节的生成。所述主动脉瓣膜钙化可体现在主动脉流出道血流速度增加和主动脉瓣跨瓣压差增加上。

实验证明，本发明的miR-449c-5p及其拟似物可以抑制主动脉瓣膜钙结节的生成及主动脉瓣膜间质细胞的钙化：miR-449c-5p mimics、miR-449c-5p inhibitors处理后的钙结节数分别为12.46±4.98个/mm³和70.60±16.61个/mm³，阴性对照中的钙结节数为29.06±10.38个/mm³。

本发明的miR-449c-5p及其拟似物可以减轻主动脉瓣膜钙化，而miR-449c-5p抑制剂可以加重主动脉瓣膜钙化：未进行任何处理的主动脉瓣膜钙化动物(阴性对照组)的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1118±82mm/s和5.00±0.36mmHg；而miR-449c-5p拟似物处理的主动脉瓣膜钙化动物(拟似物组)的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为926±118mm/s和3.74±0.56mmHg，拟似物组动物的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差均显著低于阴性对照组；而miR-449c-5p抑制剂处理的主动脉瓣膜钙化动物(抑制剂组)的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1388±156mm/s和6.63±0.54mmHg，抑制剂组动物的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差均显著高于阴性对照组。表明，miR-449c-5p可以调控动物的主动脉瓣膜钙化，miR-449c-5及其拟似物能够显著减轻主动脉瓣膜钙化，可以用于主动脉瓣膜钙化的治疗及相关药物的制备。

附图说明

图1为芯片结果显示miR-449c-5p在主动脉瓣膜退行性钙化组织中低表达。正常表示正常主动脉瓣膜，钙化表示钙化主动脉瓣膜。

图2为定量PCR检测miR-449c-5p在主动脉瓣膜退行性钙化组织和正常主动脉瓣膜中的表达水平。正常表示正常主动脉瓣膜，钙化表示钙化主动脉瓣膜。

图3为钙结节染色结果。

图4为主动脉流出道血流速度和主动脉瓣跨瓣压差的结果。其中，A为主动脉流出道血流速度示意图；B为血流速度统计结果；C为主动脉瓣跨瓣压差统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的小鼠(balb/c)为北京维通利华实验动物技术有限公司产品，品系代码为211。

实施例1、miR-449c-5p在主动脉瓣膜退行性钙化组织中低表达

收集了正常主动脉瓣膜和钙化主动脉瓣膜的临床样本，通过miRNA芯片(联川生物技术公司)发现miR-449c-5p(3’-UAUUACUGUUAUUUAGUGACGGU-5’)在钙化主动脉瓣膜组织的表达相比正常主动脉瓣膜显著降低(图1)。

收集10例患者的主动脉瓣膜退行性钙化组织及这10例患者的正常主动脉瓣膜，检测这10个主动脉瓣膜退行性钙化组织样品和10个正常主动脉瓣膜样品中miR-449c-5p的表达量，具体方法如下：提取样品总RNA，运用荧光定量PCR(ABI公司)的方法利用TaqMan探针(Invitrogen公司产品，货号4427975)检测miR-449c-5p的表达量。结果显示，miR-449c-5p在主动脉瓣膜退行性钙化组织中低表达(图2)。

实施例2、miR-449c-5p可以抑制主动脉瓣膜的钙化

将实施例1的患者的正常主动脉瓣膜间质细胞在含有10％胎牛血清(invitrogen,26140111)的DMEM培养基(Invitrogen，11965-092)，中进行在37℃下原代培养7天后，加入BMP-2(R&D产品)进行成骨诱导，得到成骨诱导细胞。

通过RNAiMAX对上述成骨诱导细胞转染miR-449c-5p模拟物(上海吉玛制药技术有限公司，货号为B01001，miR-449c-5p模拟物为人工合成的反义链与miR-449c-5p序列一致的双链RNA,其正义链的序列为：5’AUAAUGACAAUAAAUCACUGCCA 3’(序列2),反义链的序列为5’UGGCAGUGAUUUAUUGUCAUUAU 3’(序列1))和miR-449c-5p抑制剂(上海吉玛制药技术有限公司，货号为B03001)，具体方法如下：

将上述成骨诱导细胞以1×10⁶个每孔接种到6孔板中，24小时后每孔使用8μl lipofectamin 2000转染试剂(Invitrogen,11668027)分别转染50nM miR-449c-5p模拟物或50nM miR-449c-5p抑制剂，将只用lipofectamin 2000转染试剂进行转染作为阴性对照。

转染后一周，通过von Kossa染色检测钙结节的生成(图2)，结果显示，miR-449c-5p模拟物、miR-449c-5p抑制剂处理后的钙结节数分别为12.46±4.98个/mm³和70.60±16.61个/mm³，阴性对照中的钙结节数为29.06±10.38个/mm³，说明miR-449c-5p模拟物可以抑制钙结节的生成，表明miR-449c-5p可以抑制主动脉瓣膜间质细胞的钙化。

实施例3、基于miR-449c-5p的主动脉瓣膜钙化治疗

vitamin D3诱导的主动脉瓣膜钙化模型小鼠(balb/c)的制备：6周龄的balb/c 小鼠经腹腔注射500000IU/kg的vitamin D3(sigma)，1IU vitamin D3的重量为0.025μg。vitamin D3的注射通过vitamin D3溶液(vitamin D3溶液为将vitamin D3溶解于7％乳化剂(alkamuls EL-620,Rhodia)中得到的vitamin D3浓度为1.65mg/ml的溶液)进行，每天1次，重复注射3次，得到主动脉瓣膜钙化模型小鼠。将6周龄的balb/c小鼠经腹腔注射乳化剂，每天1次，重复注射3次，得到假手术小鼠，乳化剂的注射体积与主动脉瓣膜钙化模型小鼠制备过程中vitamin D3溶液的注射体积相同。假手术小鼠与主动脉瓣膜钙化模型小鼠在相同时间制备。

将50只主动脉瓣膜钙化模型小鼠随机分为三组，分别为拟似物组、拟似物对照组、抑制剂组、抑制剂对照组和阴性对照组，每组10只。将miR-449c-5p拟似物agomir-449c-5p(上海吉玛制药技术有限公司，货号为B06002，miR-449c-5p拟似物agomir-449c-5p为对双链miR-449c-5p的反义链进行如下四种修饰得到的物质：对3′末端的一个核糖核苷酸进行胆固醇修饰，对5′末端的两个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰，对3′末端的四个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰，对所有核糖核苷酸进行甲氧基修饰。双链miR-449c-5p的反义链的序列为5’-UGGCAGUGAUUUAUUGUCAUUAU-3’(序列1)，正义链的序列为5’-AUAAUGACAAUAAAUCACUGCCA-3’(序列2))溶于生理盐水中，得到agomir-449c-5p浓度为10μM的拟似物溶液；将miR-449c-5p抑制剂antagomir-449c-5p(上海吉玛制药技术有限公司，货号为B05002)溶于生理盐水中，得到antagomir-449c-5p浓度为10μM的抑制剂溶液。将agomir阴性对照((上海吉玛，B04008)，该产品为与agomir-449c-5p的序列无同源性的随机合成的双链RNA)溶于生理盐水中，得到agomir阴性对照浓度为10μM的拟似物对照溶液；将antagomir阴性对照(上海吉玛，B04007)(该产品为与antamir-449c-5p的序列无同源性的随机合成的双链RNA)溶于生理盐水中，得到antagomir阴性对照浓度为10μM的抑制剂溶液。

将10只假手术小鼠不进行任何处理，分别对拟似物组每只小鼠通过静脉注射100μL拟似物溶液，分别对拟似物对照组每只小鼠通过静脉注射100μL拟似物对照溶液，分别对抑制剂组每只小鼠通过静脉注射100μL抑制剂溶液，分别对抑制剂对照组每只小鼠通过静脉注射100μL抑制剂对照溶液，分别对阴性对照组每只小鼠通过静脉注射100μL生理盐水，将注射当天记为注射第0天，在注射第28天检测各组中每只小鼠的主动脉瓣膜功能。

主动脉瓣膜功能的检测项目包括：利用超声心动的方法检测主动脉流出道血流速度和主动脉瓣跨瓣压差，结果如图4和表1所示。

表1、主动脉流出道血流速度和主动脉瓣跨瓣压差

组别	主动脉流出道血流速度(mm/s)	主动脉瓣跨瓣压差(mmHg)
			假手术组	799±60	2.54±0.25
阴性对照组	1118±82	5.00±0.36
			拟似物组	926±118	3.74±0.56
拟似物对照组	1380±95	5.65±0.70
			抑制剂组	1388±156	6.63±0.54
抑制剂对照组	1280±121	5.72±0.81

结果显示，miR-449c-5p拟似物可以减轻主动脉瓣膜钙化，而miR-449c-5p抑制剂可以加重主动脉瓣膜钙化：假手术组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为799±60mm/s和2.54±0.25mmHg；阴性对照组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1118±82mm/s和5.00±0.36mmHg；而拟似物组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为926±118mm/s和3.74±0.56mmHg；拟似物对照组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1380±95mm/s和5.65±0.70mmHg，拟似物组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差均显著低于阴性对照组；而抑制剂组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1388±156mm/s和6.63±0.54mmHg；抑制剂对照组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差分别为1280±121mm/s和5.72±0.81mmHg，抑制剂组小鼠的主动脉流出道血流速度和动脉瓣跨瓣压差均显著高于阴性对照组。表明，miR-449c-5p可以调控主动脉瓣膜钙化。

Claims

1.a1)或a2)：

a2)miR-449c-5p在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用；

miR-449c-5p为序列1所示的单链RNA。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述双链RNA的拟似物是对所述双链RNA进行下述A1)、A2)、A3)和/或A4)修饰得到的双链RNA修饰物：

A1)对3′末端的一个核糖核苷酸进行胆固醇修饰；

A2)对5′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；

A3)对3′末端的核糖核苷酸的磷酸骨架进行硫代磷酸修饰；

A4)对所有核糖核苷酸进行甲氧基修饰。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A2)为对5′末端的两个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰；A3)为对3′末端的四个核糖核苷酸的每个磷酸骨架分别进行硫代磷酸修饰。

4.权利要求1-3中任一所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用。

5.miR-449c-5p在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用。

6.c1)或c2)：

B1)编码miR-449c-5p或其前体的DNA分子或cDNA分子；

B2)含有B1)所述DNA分子的表达盒；

B3)含有B1)所述DNA分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述DNA分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

c2)与权利要求1中所述双链RNA相关的生物材料在制备治疗和/或预防心脏瓣膜疾病产品中的应用，所述与权利要求1中所述双链RNA相关的生物材料为下述C1)-C10)中的任一种：

C1)编码权利要求1中所述双链RNA的DNA分子或cDNA分子；

C2)含有C1)所述DNA分子的表达盒；

C3)含有C1)所述DNA分子的重组载体；

C4)含有C2)所述表达盒的重组载体；

C5)含有C1)所述DNA分子的重组微生物；

C6)含有C2)所述表达盒的重组微生物；

C7)含有C3)所述重组载体的重组微生物；

C8)含有C4)所述重组载体的重组微生物；

C9)含有C1)所述DNA分子的转基因动物细胞系；

C10)含有C2)所述表达盒的转基因动物细胞系。

7.权利要求6中所述与miR-449c-5p相关的生物材料或所述与所述双链RNA相关的生物材料在治疗和/或预防心脏瓣膜疾病中的应用。

8.根据权利要求1-7中任一所述应用，其特征在于：所述心脏瓣膜疾病为主动脉瓣狭窄和/或主动脉瓣关闭不全。

9.根据权利要求1-8中任一所述应用，其特征在于：所述心脏瓣膜疾病为主动脉瓣膜钙化。

10.下述X1)或X2)：

X1)治疗和/或预防权利要求1-9中任一所述心脏瓣膜疾病的药物，其活性成分为miR-449c-5p、权利要求6中所述与miR-449c-5p相关的生物材料、权利要求1-4中任一所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物、或权利要求6中所述与所述双链RNA相关的生物材料；

X2)用于治疗和/或预防权利要求1-9中任一所述心脏瓣膜疾病的物质Z，所述物质Z为miR-449c-5p、权利要求6中所述与miR-449c-5p相关的生物材料、权利要求1-4中任一所述双链RNA或所述双链RNA的拟似物、或权利要求6中所述与所述双链RNA相关的生物材料。