CN102439136A - 产生用于疾病修饰的抑制性rna的间充质干细胞 - Google Patents

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Abstract

将siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸递送至靶细胞的组合物和方法，所述方法包括将所述靶细胞与间充质干细胞接触，该间充质干细胞包含表达所述siRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将所述siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通过细胞突起或微泡递送至靶细胞。

Description

产生用于疾病修饰的抑制性RNA的间充质干细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2009年3月26日提交的美国临时申请序列号61/163,845依照35 U.S.C.§119(e)的权益，所述临时申请的内容在此通过引用结合至本公开。
背景技术
亨廷顿氏病(HD)的病理是由可变大小的亨廷顿蛋白(huntingtin)(htt)基因的蛋白产物的多聚谷氨酰胺(PG)的扩展引起的。停止HD发展的最好希望是减少或消除感染的细胞中的突变htt蛋白。在动物模型中，小干扰RNA(siRNA)的直接注射已显示出对于降低htt水平和减轻疾病症状是有效的(DiFiglia等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A.104：17204-9和Wang等.(2005)Neurosci Res.53：241-249)。最近的数据显示，突变的htt mRNA可被特定地靶向，同时保留正常等位基因产生的转录本(Schwarz等.(2006)PLoS Genet.2：e1 40)。这项技术面临的挑战是以一种持续、安全且有效的方式将siRNA递送至人脑。直接的siRNA递送是对于问题有效的但稍纵即逝的答案。siRNA不会跨血脑屏障以治疗慢性中枢神经系统(CNS)疾病如亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和其他疾病。治疗治疗神经退行性疾病所需的长时间递送siRNA以沉默突变基因，仍然是当前阻碍有效治疗用途的关键的尚未解决的问题。有必要开发克服siRNA递送瓶颈的方法，并开发对于神经退行性疾病的持续治疗。
发明概述
申请人已发现，间充质干细胞，又称骨髓基质干细胞(MSC)，可以将siRNA和其他细胞组分直接注入到受损细胞中。申请人之前已通过十年之久的生物安全研究证明，遗传改造的人MSC是安全的。参见Bauer等.MoI Ther.2008；16：1308-1315。第三方的MSC注入的I/II期临床试验现在已对数百名患者进行实施，没有不利事件(早期结果参见Giordano(2007)J Cell Physiol.211：27-35和Salem等，Stem Cells2010，待出版)。申请人也已经显示，整合至免疫缺陷小鼠的组织中的MSC可以存活长达18个月，同时持续表达已被基因改造以产生的转基因产物(Dao等(1997)Stem Cells 15：443-453，Bauer等.(2008)MolTher.16：1308-1315，Meyerrose等.(2008)Stem Cells 26：1713-22。
提供的是一种间充质干细胞，它包含以下物质或基本由以下物质组成，或还进一步由以下物质组成：外源的siRNA、miRNA或dsRNA序列，或者与编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的DNA序列组合。还提供的是一种间充质干细胞，它包含以下物质或基本由以下物质组成，或还进一步由以下物质组成：单独的编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列或者编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列与该siRNA、miRNA或dsRNA序列的组合。另一方面，上文所述的MSC的每种都可以与靶细胞建立细胞突起(protrusion)，从而将所述多核苷酸和/或所述siRNA、miRNA或dsRNA递送至靶细胞。另一方面，所述MSC可以将所述多核苷酸和/或所述siRNA、miRNA或dsRNA或对其编码的多核苷酸通过微泡递送至靶细胞。另一方面，所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，所述间充质干细胞是分离的间充质干细胞，而另一方面，所述细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织(lipoaspirate)或骨髓样品中。
还提供的是一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤或基本由以下步骤组成，或还进一步由以下步骤组成：将靶细胞与间充质干细胞接触，该间充质干细胞包含表达siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞。不被理论束缚时，该递送可以通过或经由细胞突起和/或通过微泡独立发生或组合发生。另一方面，所述多核苷酸和/或siRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，所述间充质干细胞是分离的间充质干细胞，而另一方面，所述细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织或骨髓样品中。
还提供的是一种在受试者中治疗由存在突变的等位基因介导的遗传病症(例如患者的亨廷顿氏病)的方法，所述方法通过给予患者以下物质来进行：上述的MSC或包含间充质干细胞，或基本上由间充质干细胞组成或还进一步由间充质干细胞组成的组合物，其中所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA定向于突变的Htt基因，并且可将所述siRNA、miRNA或dsRNA递送至患者的靶神经细胞。不被理论束缚时，一方面，本发明的MSC是其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被单独地或共同地通过细胞突起和/或微泡递送，从而治疗疾病的那种。另一方面，所述多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，所述间充质干细胞是分离的间充质干细胞，而另一方面，所述细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织或骨髓样本中。
因此，本发明提供了以持续、安全且有效的方式将siRNA、miRNA或dsRNA递送至如脑的靶器官的组合物和方法，所述方式使用本文描述的方法和组合物。
附图简述
图1显示了从联合培养Alexafluor 547标记的siRNA转染的MSC和GFP+MSC在培养96小时后的代表性的视野。所示：eGFP-标记的MSC，其已从邻近的非GFP MSC将alexa-flour-标记的抗突变httsiRNA(如亮点周围的圆圈所示)转移至其中。颜色合并z-投影(Colormerged z-projection)。
图2显示了Alexafluor 547标记的siRNA转染的MSC(如亮点或亮区域周围的圆圈所示)和GFP+MSC培养24小时后的共培养。图2A显示单独GFP通道的极值(aximum)强度z-投影。图2B显示了单独Alexafluor 547标记的siRNA通道的最大强度z-投影。图2D是颜色合并的最大强度z-投影。图2F是图2D的放大(zoom)，以便更容易地看到遍及靶细胞的转移的siRNA的存在。
图3A显示接种至辐射的小鼠不同组织的IV注入的人MSC。通过在染色周围的圆圈指示GUSB酶的内生水平可视化，人细胞通过这些染色变得可视化，GUSB酶在NOD/SCID/MPSVII小鼠中不存在。图3B(组A至C)显示在移植之后MSC产生的β-葡糖苷酸酶(GUSB)分布。在组A中，在没有接受移植的4个月大的NOD/SCID/MPSVII小鼠的肝脏中没有可证实的GUSB活性。在组B中，低数量的GUSB阳性细胞(红染色)在接受表达增强的绿色荧光蛋白的对照MSC(MSC-eGFP)移植的4个月大的MPSVII小鼠肝脏中被观察到。GUSB阳性细胞的数量与定量聚合酶链反应检测的人细胞的数量在相同的范围。在组C中，在接受改造以分泌GUSB的MSC移植的4个月大MPSVII小鼠的肝脏中几乎每个细胞相对于载体产物都是阳性的。
发明详述
在本公开中，各种出版物、专利和公布的专利说明书通过识别引用而被引用。这些出版物、专利和公布的专利说明书的公开，在此通过引用以全文形式结合到本公开中。
在描述组合物和方法之前，应理解本发明不限于描述的特定方法学、方案、细胞系、分析以及试剂，因为它们可以变化。也应理解，本文使用的术语学将用于描述本发明的特定实施方案，并且绝不用于限制如所附的权利要求书中所述的本发明的范围。
除非另外指出，否则本发明的实践将使用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这些技术在本领域技术范围内。参见，例如，Sambrook和Russell编.(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版；Ausubel等编.(2007)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学当前实验方案)系列；Methods in Enzymology(酶学的方法)系列(Academic Press，Inc.，N.Y.)；MacPherson等.(1991)PCR 1：APractical Approach(PCR 1：一种实用的方法)(IRL Press at OxfordUniversity Press)；MacPherson等.(1995)PCR 2：A PracticalApproach(PCR 2：一种实用的方法)；Harlow和Lane编.(1999)Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)；Freshney(2005)Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique(动物细胞培养：基本技术手册)，第5版；Gait编.(1984)Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)；美国专利号4,683,195；Hames和Higgins编.(1984)Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)；Anderson(1999)Nucleic AcidHybridization(核酸杂交)；Hames和Higgins编.(1984)Transcriptionand Translation(转录和翻译)；Immobilized Cells and Enzymes(固定化的细胞和酶)(IRL Press(1986))；Perbal(1984)A Practical Guide toMolecular Cloning(分子克隆实用指南)；Miller和Calos编.(1987)Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(哺乳动物细胞基因转移载体)(Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides编.(2003)Gene Transferand Expression in Mammalian Cells(哺乳动物细胞中基因转移和表达)；Mayer和Walker编.(1987)Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology(细胞和分子生物学中免疫化学方法)(AcademicPress，London)；Herzenberg等.编(1996)Weir′s Handbook ofExperimental Immunology(实验免疫学Weir手册)；Manipulating theMouse Embryo：A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎：实验室手册)，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(2002))；Current Protocols InMolecular Biology(分子生物学当前实验方案)(F.M.Ausubel，等.编.，(1987))；Methods in Enzymology(酶学的方法)系列(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(PCR 2：一种实用的方法)(MJ.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编.(1995))；Harlow和Lane，编.(1988)Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)；Harlow和Lane，编.(1999)Using Antibodies，A Laboratory Manual(使用抗体，实验室手册)；Animal Cell Culture(动物细胞培养)(R.I.Freshney，ed.(1987))；Zigova，Sanberg和Sanchez-Ramos，编.(2002)Neural Stem Cells(神经干细胞)。
如pH、温度、时间、浓度和分子量的所有数值的名称(包括范围)是近似的，适当情况下它们是以0.1或1的增量(+)或(-)变化。这应被理解，虽然不总是明确地表述，但所有数值名称前面都有术语“约”。适当情况下，术语“约”除了“X”的较小增量如“X+0.1或1”或“X-0.1或1”，还包括准确值“X”。还应理解，虽然不总是明确地表述，但本文所述试剂只是示例性的且这些试剂的等价物在本领域是已知的。
定义
在用于说明书和权利要求书时，单数形式“a”，“an”和“the”包括复数引用，除非上下文明确地指示。例如，术语“a cell”包括复数个细胞，包括其混合物。
本文所用术语“包括”意指所述组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。“基本由...组成”当用于限定组合物和方法时，将意指不含出于所述目的的组合的任何基本显著的其他元素。因此，此处定义的基本由某些元素组成的组合物将不排除痕量污染物，所述污染物来自分离和纯化方法和药学可接受的载体，如磷酸盐缓冲液，防腐剂等。“由...组成”意指不包括多于痕量元素的其他成分和用于给予本发明的组合物的基本方法步骤或生产组合物或达到预期结果的程序步骤。这些过渡术语(transition terms)的每一种限定的实施方案都在本发明的范围内。
此处关于细胞、如DNA或RNA的核酸使用的术语“分离的”，是指分别与存在于大分子的天然来源中的其他DNA或RNA分离的分子。此处使用的术语“分离的”也指在通过重组DNA技术生产时基本不含细胞材料、病毒材料或培养基的核酸或肽，或在化学合成时基本不含化学前体或其他化学品。此外，“分离的核酸”是指包括非自然生成为片段且不会在自然状态被发现的核酸片段。术语“分离的”在此也用于指从其他细胞蛋白或组织分离的细胞或多肽。分离的多肽是指包括纯化的和重组的多肽两者。
关于细胞(特别是干细胞，例如间充质干细胞)使用的术语“分离的”，是指与存在于身体中的天然组织中的其他细胞或组织分离的细胞。
“受试者”，“个体”或“患者”在此可替换使用，此处是指脊椎动物，例如灵长类动物，哺乳动物或优选人。哺乳动物包括但不限于马、犬、牛、绵羊、鼠、大鼠、猿、人、家畜、体育动物(sport animal)和宠物。
术语“等位基因”在此与“等位基因变体”可替换使用，是指基因或其一些部分的可选择的形式。等位基因占据同源染色体上相同的位点或位置。当受试者有基因的两个相同的等位基因时，该受试者被认为对于该基因或等位基因是纯合的。当受试者有某基因的两个不同的等位基因时，该受试者被认为对于该基因是杂合的。特定基因的等位基因可以在单核苷酸或几个核苷酸上彼此不同，并可以包括核苷酸的替换、缺失和插入。基因的等位基因也可以为包含突变的基因形式。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在此可替换使用。应理解，这些术语不仅指特定受试者细胞，而且也指此细胞的后代或潜在的后代。由于在随后的代中可能会出现某些由于是突变或环境影响的修饰，事实上此种代可能与母细胞不同，但仍列入此处使用的术语范围内。
多核苷酸序列的“扩增”(″Amplify″″amplifying″or″amplification包括例如传统克隆方法、PCR、连接扩增(或连接酶链式反应，LCR)或其他扩增方法的方法。这些方法在本领域已知并被应用。参见，例如，美国专利号4,683,195和4,683,202和Innis等.(1990)Mol.CellBiol.10(11)：5977-5982(for PCR)；和Wu等.(1989)Genomics4：560-569(对于LCR)。通常，该PCR程序描述了基因扩增的方法，所述方法包括：(i)引物序列特异性杂交至在DNA样本(或文库)中的特定基因，(ii)随后的扩增，包括使用DNA聚合酶的多轮退火、延伸和变性，和(iii)筛选该PCR产物至正确大小的带。使用的引物为有足够长度和合适序列以提供起始聚合的寡核苷酸，即，每个引物是专门设计对于待扩增的基因组位点的每条链是互补的。
进行PCR的试剂和硬件设备为市售可得。用于扩增来自特定区域的序列的引物优选对于靶区域或其侧翼区的序列互补或特异性杂交。扩增产生的核酸序列可直接测序。或者该扩增序列可在序列分析前被克隆。酶扩增的基因组片段的直接克隆和序列分析的方法为本领域已知。
术语“基因型”是指一个完整的细胞、基因组的特定基因或特定核苷酸区域的特定的等位基因组分，而术语“表型”是指特定基因型的可检测的外在表现。
此处使用的术语“基因”或“重组基因”是指包含开放阅读框且包括至少一个外显子和(任选)内含子序列的核酸分子。基因也可指基因的多态形式或突变形式或等位基因。
“同源”或“同一性”或“相似性”是指在两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。同源性可通过比较可出于比较的目的被比对的每个序列中的位置而被测定。如果在比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据，则这些分子在该位置上是同源的。序列之间的同源性程度是这些序列共有的配对或同源位置的数量的函数。“无关的”或“非同源的”的序列与本发明的序列之一共享少于40％的同一性，但优选少于25％同一性。
多核苷酸或多核苷酸区域(或多肽或多肽区域)与另一序列有一定百分比(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指在比对时，在比较这两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可使用本领域已知的软件程序来测定，例如使用Ausubel等.编.(2007)Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学当前实验方案)描述的那些。优选地，默认的参数用于比对。一个比对程序是BLAST，使用默认参数。特别是，程序为BLASTN和BLASTP时，使用如下默认参数：Genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR。这些程序的详情可在如下网站中找到：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi，最近的访问是在2008年5月21日。生物学等价的多核苷酸是有特定百分比同源性并编码具有相同或相似的生物学活性的多肽的那些多核苷酸。
术语“等价的核酸”指具有以下核苷酸序列的核酸：该核苷酸序列与该核酸或其补体(complement)的核苷酸序列有一定程度的同源性。双链核酸的同系物将包括有以下核苷酸序列的核酸：所述核苷酸序列与其或其补体有一定程度的同源性。一方面，核酸的同系物(homolog)能够与该核酸或其补体杂交。
此处使用的术语“相互作用”是指包括分子之间的可检测的相互作用，如，可以使用例如杂交分析检测。术语相互作用也意欲包括分子之间的“结合”相互作用。相互作用本质上可为，例如蛋白-蛋白，蛋白-核酸或核酸-核酸的相互作用。
“杂交”是指其中一个或多个多核苷酸反应以形成杂交复合体的反应，所述杂交复合体通过核苷酸残基的碱基之间的氢键合被稳定化。所述氢键合可通过Watson-Crick碱基配对、Hoogstein键合或以任何其他的序列特异性方式形成。该复合体可包含形成二重结构的两条链，形成多链复合体的三条或更多条链，单独的自身杂交链或这些结构的任意组合。杂交反应可构成在更广泛的程序中的步骤，如PCR反应的启动，或通过核酶进行的多核苷酸酶切。
杂交反应可以在不同的“严格”条件下进行。通常，低严格的杂交反应在约40℃在约10×SSC或等价离子强度/温度的溶液中进行。中等严格的杂交通常在约50℃，约6×SSC中进行，而高严格的杂交反应通常在约60℃，在约1×SSC中进行。杂交反应也可在“生理学条件”下进行，该条件对于本领域技术人员是已知的。生理学条件的非限制性实例是通常在细胞中发现的温度、离子强度、pH和Mg2+浓度。
当杂交发生在两条单链多核苷酸之间的反平行结构中时，该反应被称为“退火”且这些多核苷酸被称为“互补的”。双链多核苷酸可对于另一多核苷酸是“互补的”或“同源的”一如果杂交可在该第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生。“互补”或“同源”(一种多核苷酸与另一种互补的程度)可按照以下方式量化：在依照通常可接受的碱基配对原则预期彼此形成氢键合的反向链中的碱基的比例来量化。
术语″错配″指不是100％同源的杂交的核酸二重结构。缺乏完全同源性可能是由于缺失，插入，倒置，替换或移码突变。
在此使用的术语“寡核苷酸”是指如脱氧核糖核酸(DNA)，且合适的时候指核糖核酸(RNA)的多核苷酸。该术语也应该理解为包括，作为等价物时，包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的衍生物、变体和类似物，并且在适用于所描述的实施方案时，包括单链(正义或反义的)和双链多核苷酸。脱氧核糖核酸包括脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷。出于清楚的目的，在此涉及核酸(其可为DNA或RNA)的核苷酸时，术语“腺苷”、“胞苷”、“鸟苷”和“胸苷”被使用。应理解，如果核酸是RNA，则具有尿嘧啶碱基的核苷酸是尿苷。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”替可换使用且指任意长度的核苷酸(脱氧核苷酸或核苷酸或其类似物)的聚合体形式。多核苷酸可具有任意三维结构且可执行任意的已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核酶RNA、核酶、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、重组体多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如存在，对核苷酸结构的修饰可在组装该多核苷酸之前或之后赋予。核苷酸序列可被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，例如通过与标记组分结合。该术语也指双链和单链分子。除非另有特别说明或要求，否则作为多核苷酸的本发明的任何实施方案都含有该双链形式和已知或预测组成该双链形式的的两种互补单链形式的每一种。
多核苷酸是由特定序列的四种核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；且在该多核苷酸为RNA时用尿嘧啶(U)替换胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的依字母顺序的表示。该依字母顺序的表示可被输入至具有中央处理器的计算机的数据库中，并且可用于生物信息学应用例如功能基因组学和同源性搜索。术语“多态性”指共存在多于一种形式的基因或其一部分。具有至少两种不同形式，即两种不同的核苷酸序列的基因的一部分被称为“基因的多态区域”。多态区域可为单核苷酸，在不同的等位基因中其同一性不同。
在此使用的术语“载体”包含任何标准载体，例如磷酸盐缓冲液、缓冲剂、水和乳液，例如油/水或水/油乳液和各种形式的湿润剂。该组合物也可包含稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和助剂的实例，参见前述的Sambrook和Russell(2001)。本领域技术人员会知道许多其他用于构建多核苷酸的合适载体，或能通过常规的实验确定同样的情况。本发明的一方面，该载体是缓冲溶液例如，但不限于，PCR缓冲溶液。
“基因递送工具”被定义为可携带插入的多核苷酸进入宿主细胞的任何分子。基因递送工具的实例为脂质体、生物可相容的聚合物，包括天然的聚合物和合成的聚合物；脂蛋白；多肽；多糖；脂多糖；人造病毒外壳；金属颗粒和细菌，或病毒，如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和其他重组工具通常用于我们已经描述的用于在多种真核和原核宿主中表达的领域，并可用于基因治疗以及用于单纯蛋白表达。
在此使用的“基因递送”、基因转移”等，是涉及将外源多核苷酸(有时称作“转基因”)引入至宿主细胞的术语，不考虑用于引入的方法。这样的方法包括多种已知的技术，例如载体介导的基因转移(通过，例如病毒转染，有时称作转导)、转染、转变或多种其他基于蛋白的或基于脂质的基因递送复合体)以及促进“裸体的”多核苷酸递送的技术(例如电穿孔、“基因枪”递送和多种其他用于多核苷酸引入的技术)。除非另有说明，否则术语转染的、转导的或转变的可在此替换使用以指示在细胞中外源多核苷酸或由其表达的多肽的存在。引入的多核苷酸可稳定地或短暂地保持在宿主细胞中。稳定地保持通常要求该引入的多核苷酸或者包含与宿主细胞兼容的复制的起源或者整合至宿主细胞的复制子例如染色体外的复制子(例如，质粒)或核的或线粒体的染色体。已知许多载体能够介导基因至哺乳动物细胞的转移，这是本领域已知的并在此描述。
术语“表达”是指基因产物的产生。在一些实施方案中，基因产物是多肽或蛋白。在一些实施方案中，基因产物是mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、dsRNA或siRNA。
“稳定表达”外源多肽的细胞是连续表达引入至该细胞的外源基因编码的多肽的那种，该表达在复制之后(如果该细胞正在分裂)或者持续多于一天，高至约一周、高至约两周、高至三周、高至四周、持续数周、高至一个月、高至两个月、高至三个月、持续数个月、高至一年或更多。
“病毒载体”被定义为重组产生的包含待递送至宿主细胞的病毒或病毒颗粒，体内、间接体内或体外递送。毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒(lentiviral)载体、腺病毒载体、腺相关的(adeno-associated)病毒载体、甲病毒(alphavirus)载体等。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于Sindbis病毒的载体，已经被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5：434-439和Ying，等.(1999；Nat.Med.5(7)：823-827。
在基因转移是通过逆转录病毒介导的方面，载体构建是指包含该逆转录病毒基因组或其部分和治疗基因的多核苷酸。此使用时，“逆转录病毒介导的基因转移”或“逆转录病毒转导”具有相同的意思，是指利用进入细胞并将其基因组整合至宿主细胞的病毒将基因或核酸序列稳定地转移至宿主细胞的程序。所述病毒可通过其正常的传染机制进入宿主细胞或被修饰以使其结合至不同的宿主细胞表面受体或配体以进入细胞。逆转录病毒以RNA的形式携带遗传信息；然而，一旦该病毒感染细胞，则其RNA被反转录为DNA形式，该DNA整合至被感染的细胞的基因组DNA。整合的DNA形式被称作前病毒。在此使用时，逆转录病毒载体是指能通过病毒或病毒类进入机制将外源核酸引入细胞的病毒颗粒。“慢病毒载体”是一类在本领域公知的逆转录病毒载体，它相对于其他逆转录病毒载体在转导未分裂的细胞方面具有确定的优势。参见，Trono D.(2002)Lentiviral vectors，NewYork：Sphng-Verlag Berlin Heidelberg。
在基因转移是通过DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺相关的病毒(AAV)介导的方面，载体构建是指包含该病毒基因组或其部分或转基因的多核苷酸。腺病毒(Ads)为相对良好特征化的病毒的同源组，包括超过50种血清型。参见，例如，国际PCT申请号WO 95/27071.Ads不需要整合至宿主细胞基因组。重组Ad衍生的载体，特别是减少野生型病毒的重组和产生的潜能的那些，也已经被构建。参见，国际PCT申请号WO 95/00655 and WO 95/11984。野生型AAV在整合至宿主细胞基因组方面有高度的传染性和特异性。参见，Hermonat和Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6466-6470和Lebkowski，等.(1988)MoI.Cell.Biol.8：3988-3996。
包含启动子和多核苷酸可被有效连接至其中的克隆位点的载体在本领域是公知的。这类载体能够体内或体外转录RNA，并且可商业得自例如Stratagene(La JoIIa，CA)和Promega Biotech(Madison，Wl)的来源。为了优化表达和/或体外转录，可能需要去除、添加或改变克隆的5′和/或3′未翻译部分，以消除额外的、潜在的不合适的选择性翻译起始密码子或其他可能会在转录或翻译水平干扰或减少表达的序列。或者，一致的核酶结合位点可被立即插入至起始密码子的5′端以增强表达。
“在转录条控制下”是本领域公知的术语，是指多核苷酸序列，通常为DNA序列的转录，依赖于其有效地连接至对起始或增强、转录有贡献的元素。“有效连接的”指该多核苷酸以使它们在细胞中发挥功能的方式被准备。
基因递送工具也包括几种非病毒的载体，包括DNA/脂质体复合体、和靶向的病毒蛋白-DNA复合体。也包含靶向抗体或其片段的脂质体可用于本发明的方法中。增强递送至细胞，本发明的核酸或蛋白可被结合至结合细胞表面抗原的抗体或其结合片段，所述抗原例如干细胞上发现的细胞表面标记物。
当用于多核苷酸操作的内容时“探针”指被用作通过与靶标杂交来探测潜在存在于目的样品中的靶标的试剂的寡核苷酸。通常，探针包含标记或方式，标记可通过该方式在杂交反应之前或之后被附着。合适的标记在此被描述并例示。
“引物”是短的多核苷酸，通常具有游离的3′-OH基，该3′-OH基通过与靶标杂交结合至可能存在于目的样品中的靶标或“模板”，由此促进与该靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链式反应”(“PCR”)是一种复制拷贝的反应，该拷贝使用由“上游”和“下游”引物组成“引物对”或“引物组”，和聚合催化剂例如DNA聚合酶且通常为热稳定的聚合酶自靶多核苷酸制成。用于PCR的方法是本领域公知的，且在例如M.MacPherson等.(1991)PCR：A PracticalApproach，IRL Press于Oxford University Press中指导。所有生产多核苷酸的复制拷贝的方法，例如PCR或基因克隆，在此共同地被称为″复制″。在杂交反应中引物也可用作探针，例如Southern或Northern印记分析。Sambrook等.，见上文。引物也可任选包含可检测的标记，并在此例示和描述。
在此使用的术语“标记”意指直接或间接地结合至待检测的组合物，例如多核苷酸或蛋白例如抗体以产生“标记的”组合物的可直接或间接检测的化合物或组合物。该术语也包括结合至将通过表达插入的序列提供信号的多核苷酸的序列，例如绿色荧光蛋白(GFP)等。该标记可通过自身被检测到(例如放射性同位素标记或荧光标记)或，在酶的标记情况下，可催化底物化合物或组合物的可检测的化学转变。该标记可适合小规模的检测或更适合高通量的筛选。同样地，合适的标记，包括但不限于，放射性同位素、荧光染料、化学发光的化合物、染料或包括酶的蛋白。该标记可被简单探测或其可被定量。简单检测的反应通常包含其存在仅被加强的反应，其中被定量的反应通常包含具有可量化(例如可用数字报告的)值例如强度、极化和/或其它特性的反应。在发光或荧光分析中，可检测的反应可直接使用与事实上包含于结合中的分析组分偶联的发光团或荧光团产生，或者使用与另一(例如报告子(reporter)或指示剂)组分偶联的发光团或荧光团直接产生。
产生信号的发光标记的实例包括，但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光反应通常包含发光信号的改变或发光信号的出现。合适的用于发光标记分析组分的方法和发光团为本领域已知的，描述于例如Haugland，Richard P.(1996)Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals(荧光探针和研究化学品手册)(第6版)。发光探针的实例包括但不限于，水母发光蛋白和荧光素酶。
合适的荧光标记的实例包括，但不限于，荧光素(fluorescein)、玫瑰红、四甲基玫瑰红、曙红、藻红(erythrosin)、香豆素、甲基香豆素、芘(pyrene)、孔雀石绿(Malacite green)、均二苯乙烯、荧光黄、CascadeBlue.TM.、和德克萨斯红(Texas Red)。其他合适的光学染料描述于Haugland，Richard P.(1996)(荧光探针和研究化学品手册)(第6版)。
另一方面，荧光标记被功能化以促进共价附着于存在于细胞或组织中或在细胞或组织表面的细胞组分，例如细胞表面标记物。合适的官能团，包括，但不限于，异硫氰酸脂基团、氨基基团、卤代乙酰基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺基脂和磺酰基卤化物，所有这些均可用于将荧光标记附着于第二分子上。荧光标记的官能团的选择将取决于附着于连接子、试剂、标记物或第二标记试剂的位点。
荧光标记的附着可为直接附着至细胞组分或化合物或者，可通过连接子附着。用于间接将荧光标记连接至媒介物的结合对包括，但不限于，抗原/抗体，例如，玫瑰红/抗-玫瑰红，生物素/卵蛋白和生物素/抗生物素蛋白链菌素(strepavidin)。
短语“固体载体”指非水性表面例如“培养盘”“基因芯片”或“微阵列”。此种基因芯片或微阵列可通过多种本领域技术人员已知的多种技术用于诊断和治疗的目的。在一种技术中，寡核苷酸在基因芯片上被附着并被分析用于通过杂交方法测定DNA序列，例如在美国专利号：6,025,136和6,018,041中列出。本发明的多核苷酸可被修饰为探针，该探针反过来可用于检测基因序列。这类技术已描述于例如，美国专利号：5,968,740和5,858,659中。探针也可被附着或附贴至电极表面用于电化学检测核酸序列，例如描述于Kayem等.美国专利号5,952,172和通过Kelley等.(1999)Nucleic Acids Res.27：4830-4837描述。
多种“基因芯片”或“微阵列”和类似的技术在本领域已知。这样的例子包括，但不限于，LabCard(ACLARA Bio Sciences Inc.)；GeneChip(Affymethc，Inc)；LabChip(Caliper Technologies Corp)；具有电化学传感的低密度阵列(临床微传感器(Clinical Micro Sensors))；LabCD系统(Gamera Bioscience Corp.)；Omni Grid(Gene Machines)；QArray(Genetix Ltd.)；具有液相表达技术高通量、自动化质谱系统(GeneTrace Systems，Inc.)；热喷射点系统(Hewlett Packard Company)；(Hewlett Packard Company)；Hyseq HyChip(Hyseq，Inc.)；BeadArray(lllumina，Inc.)；GEM(Incyte Microarray系统)；可分配12至64个点(spot)至多个载玻片上的高通量微阵列系统(IntelligentBio-Instruments)；Molecular Biology Workstation and NanoChip(Nanogen，Inc.)；微流体玻璃芯片(Orchid Biosciences，Inc.)；具有四个PiezoTip压电的根据需要滴加的(drop-on-demand)尖头的BioChipArrayer(Packard Instruments，Inc.)；FlexJet(Rosetta Inpharmatic，Inc.)；MALDI-TOF质谱仪(Sequnome)；ChipMaker 2和ChipMaker 3(TeleChem International，Inc.)；和GenoSensor(Vysis，Inc.)如鉴定和描述于Heller(2002)Annu.Rev.Biomed.Eng.4：129-153.“基因芯片”的实例或“微阵列”也描述于美国专利公开号：2007/0111322；2007/0099198；2007/0084997；2007/0059769和2007/0059765和美国专利号：7,138,506；7,070,740和6,989,267中。
一方面，包含与在此描述的多核苷酸同源的探针或引物的“基因芯片”或“微阵列”被制备。合适的样品得自患者，进行基因组DNA、RNA、蛋白或其任意组合的提取和扩增(如有需要)。将该样品在适合用于将目的基因或基因产物杂交至包含在基因芯片或微阵列上的探针或引物的条件下接触至基因芯片或微阵列控制板。该探针或引物可被可检测地标记，由此辨认目的序列。或者，可使用化学或生物学反应来辨认与目的基因的DNA或RNA杂交的探针或引物。然后在前述装置和方法的协助下患者的基因型或表型被测定。
“组合物”意指活性试剂和另外的化合物或组合物的组合，所述另外的化合物或组合物为惰性的(例如，可检测的试剂或标记)或活性的，例如助剂。
“药物组合物”将包括活性试剂与载体的组合，所述载体为惰性的或活性的，使该组合物适合用于体外、体内或间接体内使用的诊断治疗用途。
在此使用的术语“药学可接受的载体”包含任何标准药物载体，例如磷酸盐缓冲液、水和乳液，例如油/水或水/油乳液和各种形式的湿润剂。该组合物也可包含稳定剂和防腐剂。载体、稳定剂和助剂的实例参见Martin(1975)Remington′s Pharm.Sci.(Remington药物科学)，第15版(Mack Publ.Co.，Easton)。
对于局部使用，该药学可接受的载体适合用于生产乳剂、软膏、凝胶剂、胶、溶液、悬液等。此种载体为本领域常规的，例如用于与聚乙二醇(PEG)的局部给予。这些配方可任选包含其他药学可接受的成分例如稀释剂、稳定剂和/或助剂。。。。“基本同源”描述了其中多于约50％，或者多于约60％，或者多于70％，或者多于75％，或者多于80％，或者多于85％，或者多于90％，或者多于95％的细胞有相同或相似的表型的细胞群体。表型可通过预选择的细胞表面标记物或其他标记物，例如，肌球蛋白或肌动蛋白或基因或蛋白的表达，例如钙调控蛋白、t-微管蛋白或者，钙泵蛋白测定。另外的方面，基本同源的群体比野生型的对应的(counterpart)细胞或组织具有减少的(例如，少于约95％，或者少于约90％，或者少于约80％，或者少于约75％，或者少于约70％，或者少于约65％，或者少于约60％，或者少于约55％，或者少于约50％)正常水平的表达。
“神经退行性疾病”是其中大脑和脊髓的细胞丢失的病症。神经退行性疾病的实例包括但不限于，亨廷顿氏病、ALS和多发性硬化。大脑和脊髓由行使不同功能，例如控制运动、处理感觉信息和做决定的神经元组成。大脑和脊髓的细胞不是容易地全体再生，因此过度的损害可能是灾难性的。神经退行性疾病得自神经元或其髓鞘的劣化，随时间的延长将导致由此产生的机能障碍和无能。
诊断或治疗的“受试者”为细胞或包括人的哺乳动物。接受诊断或治疗的非人动物包括，例如，猿、鼠、豚鼠、犬(例如狗)、兔类(例如兔)、家畜(例如牛或猪)、体育动物和宠物。
“有效量”是足以达到有利的或想要的结果的量。有效量可以以一次或多次给予、应用或剂量给予，且可被本领域技术人员经验性地测定。
“对照”是出于对比目的用于试验的供选择的受试者或样品。对照可为“阳性”或“阴性”。例如，其中试验的目的是测定突变的等位基因与特定表型的相互关系，通常优选使用阳性对照(得自携带此种突变并表现需要的表型的受试者的样品)，和阴性对照(得自缺少该突变的等位基因并缺少该表型的受试者或样品)。
术语“癌”、“新生物(neoplasm)”和“肿瘤”可交替使用，并且以单数或复数形式使用，指以下细胞：已经历使其对于宿主生物体是病态的恶性转化。原代癌细胞(即，得自恶性转化的位点附近的细胞)可通过已建立的技术，特别是组织学检查容易地与非癌细胞相区别。在此使用的癌细胞的定义，不仅包括原代癌细胞，也包括任何得自癌细胞祖先的细胞。这包括转移的癌细胞，和体外培养物和得自癌细胞的细胞系。当涉及正常地显示为实体瘤的癌的类型时，“临床可检测的”肿瘤是可基于肿瘤团块(tumor mass)检测的那种；例如，通过例如CAT扫描、磁共振成像(MRI)、X-射线、超声或触诊的程序。单独的生化的或免疫学的发现可能不足以符合该定义。
新生物是一种不正常的细胞的团块或群体，所述细胞通过相对独立自主的组织的生长产生。大多数新生物源于已经历新生物转化的单细胞的克隆扩展。正常细胞至新生物细胞的转化可由直接且不可逆地改变细胞基因组的化学的、物理的或生物学试剂(或事件)引起。新生物细胞通过失去一些专门的功能和获得新的生物学特性，最重要的是相对独立自主(不受控制的)生长的特性，来表征。新生物细胞将它们的可遗传的生物学特性传递给后代细胞。
新生物的过去的、在的和未来的预测的生物学行为，或临床过程在此被进一步分类为良性的或恶性的，这是在诊断、治疗和预后方面的重要的区别。恶性的新生物显示较大程度的自主性，能够侵入和迁移扩展，可抗治疗，且可引起死亡。良性新生物具有较小程度的自主性，通常不入侵，不转移，且如果充分治疗通常不产生大的危害。
癌是恶性新生物的通称。退行(anaplasia)是癌细胞的独特性质，表示缺少正常结构和功能性特性(未分化)。
肿瘤字面上是任何类型的隆起，例如炎性或其它隆起，但调制器(modem)使用通常指新生物。后缀“-oma”是指肿瘤，且通常指良性新生物，如纤维瘤、脂肪瘤等，但有时意指恶性新生物，如所谓的黑素瘤、肝癌和精原细胞瘤，乃至非新生物的损伤，如血肿、肉芽肿或错构瘤。后缀″-blastoma″指胚胎细胞的新生物，例如肾上腺的成纤维细胞瘤或眼的视网膜成神经细胞瘤。
组织发生是组织的起源，且为基于起源的组织细胞对新生物分类的方法。腺瘤是腺上皮的良性新生物。癌(Carcinomas)是上皮的恶性肿瘤。肉瘤是间充质组织的恶性肿瘤。分类瘤形成(neoplasia)的系统利用通过生物学(临床的)行为(无论良性的或恶性的)和组织发生，通过组织学和细胞学检查测定的新生物的起源的起源的组织或细胞。新生物可在几乎任何包含能有丝分裂的细胞的组织中开始。新生物的组织发生分类是基于通过组织学和细胞学检查测定的起源的组织(或细胞)。
“抑制”肿瘤生长意指与没有任何治疗的增长相比的缩减的生长状态。瘤细胞生长可通过本领域已知的任何方法评估，所述方法包括但不限于，测量肿瘤尺寸、确定使用3H-胸苷合并的分析肿瘤细胞是否是多育的(proliferating)，或者对肿瘤细胞计数。“抑制”肿瘤细胞生长是指任意或全部以下状态：减慢、延迟，且“抑制”肿瘤生长是指当停止肿瘤生长，以及肿瘤收缩时缩减的生长状态。
SiRNA，dsRNA，miRNA
“RNA干扰”(RNAi)指由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性的或基因特异性的基因表达(蛋白合成)抑制。“短干扰RNA”(siRNA)指双链RNA分子(dsRNA)，通常来自能介导RNA干扰(RNAi)的长度约10至约30个核苷酸，或长度为11个核苷酸，长度为12个核苷酸，长度为13个核苷酸，长度为14个核苷酸，长度为15个核苷酸，长度为16个核苷酸，长度为17个核苷酸，长度为18个核苷酸，长度为19个核苷酸，长度为20个核苷酸，长度为21个核苷酸，长度为22个核苷酸，长度为23个核苷酸，长度为24个核苷酸，长度为25个核苷酸，长度为26个核苷酸，长度为27个核苷酸，长度为28个核苷酸或长度为29个核苷酸。此处使用的术语siRNA包括短发夹RNA(shRNA)。定向于基因或基因的mRNA的siRNA可为识别基因的mRNA并将RNA诱导的沉默复合体(RISC)引导至该mRNA导致该mRNA退化的siRNA。定向于基因或基因的mRNA的siRNA也可为识别mRNA并抑制该mRNA翻译的siRNA。
“双链RNA”(dsRNA)指可为任意长度且可被细胞内裂解为较小RNA分子，例如siRNA的双链RNA分子。在具有胜任的干扰素应答的细胞中，较长的dsRNA，例如长于约30个碱基对长度的那些，可触发该干扰素应答。在没有胜任的干扰素应答的其他细胞中，dsRNA可用于触发特定的RNAi。
siRNA可按照本领域已知的程序设计。参见，例如，Dykxhoorn，D.M.和Lieberman，J.(2006)″Running Interference：Prospects andObstacles to Using Small Interfering RNAs as Small Molecule Drugs，″Annu.Rev.Biomed.Eng.8：377-402；Dykxhoorn，D.M.等.(2006)″Thesilent treatment：siRNAs as small molecule drugs，″Gene Therapy，13：541-52；Aagaard，L.和Rossi，J.J.(2007)″RNAi therapeutics：Principles，prospects and challenges，″Adv.Drug Delivery Rev.59：75-86；deFougerolles，A.等.(2007)″Interfering with disease：a progress report onsiRNA-based therapeutics，″Nature Reviews Drug Discovery 6：443-53；Krueger，U.等.(2007)″Insights into effective RNAi gained fromlarge-scale siRNA validation screening，″Oligonucleotides 17：237-250；美国专利申请公开号：2008/0188430；和美国专利申请公开号：2008/0249055。
将siRNA递送至间充质干细胞以产生本发明的细胞，该递送可通过本领域已知的方法进行。参见，例如，Dykxhoorn，D.M.和Lieberman，J.(2006)″Running Interference：Prospects and Obstacles to Using SmallInterfering RNAs as Small Molecule Drugs，″Annu.Rev.Biomed.Eng.8：377-402；Dykxhoorn，D.M.等.(2006)″The silent treatment：siRNAsas small molecule drugs，″Gene Therapy，13：541-52；Aagaard，L.和Rossi，J.J.(2007)″RNAi therapeutics：Principles，prospects andchallenges，″Adv.Drug Delivery Rev.59：75-86；de Fougerolles，A.等.(2007)″Interfering with disease：a progress report on siRNA-basedtherapeutics，″Nature Reviews Drug Discovery 6：443-53；Krueger，U.等.(2007)″Insights into effective RNAi gained from large-scale siRNAvalidation screening，″Oligonucleotides 17：237-250；美国专利申请公开号：2008/0188430；和美国专利申请公开号：2008/0249055。
siRNA可被化学修饰以增加其稳定性和安全性。参见，例如Dykxhoorn，D.M.和Lieberman，J.(2006)″Running Interference：Prospects and Obstacles to Using Small Interfering RNAs as SmallMolecule Drugs，″Annu.Rev.Biomed.Eng.8：377-402和美国专利申请公开号：2008/0249055。
microRNA或miRNA是调节基因表达的长度为21-23个核苷酸的单链RNA分子。miRNA通过以下基因编码：它们转录自其DNA，但miRNA不被翻译成蛋白(非编码RNA)；相反每个初级转录本(ph-miRNA)被加工成称为前miRNA的短茎环结构，并最终加工成功能miRNA。成熟miRNA分子与一个或多个信使RNA(mRNA)分子部分互补，并且它们的主要功能是下游调节基因表达。
此处使用的siRNA载体、dsRNA载体或miRNA载体，指包含调节RNA表达的启动子的质粒或病毒载体。调节siRNA、dsRNA或miRNA表达的“siRNA启动子”或启动子为本领域已知，例如，描述于Miyagishi和Taira(2002)Nature Biotech.20：497-500中的U6启动子，和描述于Brummelkamp等.(2002)Science 296：550-3中的H1启动子。
干细胞
此处使用的“干细胞”定义在培养时有能力分裂无限周期并产生分化的细胞的细胞。此时并为了方便，干细胞被分类为体(成年)或胚胎的干细胞。体干细胞是发现于分化的组织中的未分化的细胞，其可自身更新(克隆的)且(具有一定限制)可分化以获得它所起源的组织的所有特化的细胞类型。胚胎干细胞是原代的(未分化的)细胞，其得自具有成为很多种特化的细胞类型潜能的胚胎。胚胎干细胞是已在允许增殖但不分化达数月至数年的体外条件下培养的那种。胚胎干细胞的非限制性实例是得自ESI，Singapore的HES2(也称为ES02)的细胞系和得自WiCeIIs，Madison，WI的H1(也称为WA01)细胞系。多能胚胎干细胞可通过使用标记物区别于其他类型的细胞，所述标记物包括，但不限于，Oct-4、碱性磷酸酶、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖细胞核因子、SSEA1、SSEA3，和SSEA4。
“间充质干细胞”或MSC，是可分化至多种细胞类型的多能干细胞。名称MSC也指术语“骨髓基质细胞”。MSC已显示出体外或体内分化成的细胞类型包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞。间充质是胚胎结缔组织，其得自中胚层并分化成造血组织和结缔组织，其中MSC不分化成造血细胞。基质细胞是形成支持结构的结缔组织细胞，其中该组织的功能细胞位于该支持结构中。虽然这是对MSC的一个功能的准确描述，但该术语不能传递相对最近发现的MSC在组织修复中的作用。申请人已描述了分离、繁殖和遗传上改造骨髓基质细胞/间充质干细胞(MSC)的方法超过二十年(参见Nolta，Genetic Engineering of Mesenchymal Stem Cells，Springer 2006)。分离此类细胞、繁殖和分化此类细胞的方法为本技术和专利领域已知的，例如美国专利申请号：2007/0224171，2007/0054399，2009/0010895，其通过引用以其全文结合至至此。
此处使用的“神经或神经元干细胞”指能够自我复制并产生多重特化的神经系统的细胞类型的细胞。一些方面，神经干细胞为在前脑侧脑室(LV)的亚室(subventricular)区域(SVZ)中的多能神经干细胞。
克隆或“克隆群体”是遗传上等同于起源细胞的细胞系；此种情况下，起源细胞为干细胞。“前体”或“祖先细胞”意指能分化呈特定类型的细胞的细胞。祖先细胞可为干细胞。祖先细胞也可为比干细胞更特化的细胞。祖先细胞可为单能的或多能的。与成年干细胞比较，祖先细胞可为细胞分化的母阶段。祖先细胞通常发现于成年生物钟，它们作为对身体的修复系统。祖先细胞的实例包括但不限于，发现于肌肉中的卫星细胞，在亚室区域中形成的中间祖先细胞，骨髓基质细胞，骨膜祖先细胞，胰脏祖先细胞和成血管或内皮祖先细胞。祖先细胞的实例也可包括但不限于，来自前脑侧脑室(LV)的室管膜细胞和神经干细胞。
术语“繁殖”指生长或改变细胞或细胞群体的表型。术语“生长”是指在支持培养基、营养素、生长因子、支持细胞或任何对于获得所需数量的细胞或细胞类型必需的化学或生物学化合物存在下细胞的增殖。一个实施方案中，细胞的生长导致组织的再生。
术语“培养”是指在多种培养基上或在多种培养基中体外繁殖细胞或组织。应理解培养时生长的细胞的后代可能与母细胞不完全相同(即，形态学上、遗传上或表型上)。“扩展的”是指细胞的任何增殖或分裂。
“克隆增殖”是指细胞群体通过单细胞连续分裂成两个相同的子细胞和/或相同细胞群体的生长。
此处使用的细胞的“谱系”定义为细胞的遗传，即其祖先和后代。细胞的谱系将该细胞置于发育和分化的遗传方案中。
细胞或细胞的群体的衍生物是分离的细胞或细胞群体的子细胞。衍生物包括从分离的干细胞或干细胞群体培养和繁殖的扩展的克隆细胞或分化的细胞。衍生物也包括已经衍生的干细胞或干细胞的群体。
“分化”描述的是其中非特化的细胞获得特化细胞例如心脏、肝脏或肌肉细胞的特征的过程。“定向分化”指控制干细胞培养条件以诱导分化至特定细胞类型。“分化的”定义在细胞谱系中恢复至较少定型的位置的细胞。此处使用的术语“分化或分化的”定义在细胞谱系中使用较多定型的(“分化的”)位置的细胞。此处使用的“分化成中胚层(或外胚层或内胚层)谱系的细胞”定义开始分别定型至特异的中胚层、外胚层或内胚层谱系的细胞。分化至中胚层谱系或产生特异的中胚层细胞的细胞实例包括，但不限于，成脂的，成平滑肌的(leiomyogenic)，成软骨的，心原的，皮原的，血细胞生成的，成血管的(hemangiogenic)，生肌的，生肾的，生殖器原的(urogenitogenic)，成骨的，成心包的(pericardiogenic)细胞。
此处使用的“多能细胞”定义可产生至少两种显著(基因型和/或表型上)进一步分化的后代细胞的较少分化的细胞。另一方面，“多能细胞”包括诱导的多能干细胞(iPSC)，其为人工衍生的来自非多能细胞的通过诱导表达一个或多个干细胞特异性基因产生的干细胞，该非多能细胞通常为成年体细胞。此类干细胞特异性基因包括，但不限于，八聚体转录因子家族，即Oct-3/4；Sox基因家族，即Sox1，Sox2，Sox3，Sox15和Sox18；Kif基因家族，即KIfI，Klf2，Klf4和Klf5；Myc基因家族，即c-myc和L-myc；Nanog基因家族，即OCT4，NANOG和REX1；或LIN28.iPSC的实例描述于Takahashi K.等.(2007)Celladvance online publication 20 November 2007；Takahashi K.&Yamanaka S.(2006)Cell 126：663-76；Okita K.等.(2007)Nature448：260-262；Yu，J.等.(2007)Science advance online publication 20November 2007；and Nakagawa，M.等.(2007)Nat.Biotechnol.Advance2007年11月30日在线公布。
“多谱系干细胞”或“多能干细胞”指从显著发育的谱系复制其自身和至少两种进一步分化的后代细胞的干细胞。该谱系可来自相同的胚层(即中胚层、外胚层或内胚层)，或来自不同的胚层。来自多谱系干细胞的分化的显著发育的谱系的两种后代细胞的实例为生肌细胞和成脂细胞(都来自中胚层，然而产生不同的组织)。另一实例是发生神经细胞(外胚层起源的)和成脂细胞(中胚层起源的)。
神经干细胞是可从成年的哺乳动物(包括人)中枢神经系统分离的细胞。它们已显示出产生神经元、迁移和长出轴突投射和树突投射并迁移进入预存在的神经元回路并对正常的脑功能有贡献。该领域的研究综述参见Miller(2006)The Promise of Stem Cells for Neural Repair，Brain Res.Vol.1091(1)：258-264；Pluchino等.(2005)Neural StemCells and Their Use as Therapeutic Tool in Neurological Disorders，BrainRes.Brain Res.Rev.，Vol.48(2)：211-219；and Goh，等.(2003)AdultNeural Stem Cells and Repair of the Adult Central Nervous System，J.Hematother.Stem Cell Res.，Vol.12(6)：671-679.
细胞的群体意指多于一种在表型和/或基因型方面相同的(克隆的)或非相同的细胞的集合。
此处使用的“细胞突起”是指不包含连接蛋白或间隙结合类型连接的细胞与细胞接触。一方面，细胞突起为细胞质延伸或广泛区域的细胞接触，如MSC和皮肤成纤维细胞之间观察到的，描述于Applicantsin Spees等.(2006)PNAS 103(5)：1283-8.另一方面，细胞突起是在MSC和心原细胞共培养时观察到的它们之间形成的通道微管，于Plofnikov等.(2008)J.Cell.MoI.Med.12(5A)：1622-31。一些实施方案中，细胞突起是细的、伸长的、活性丝足和层形足板、细胞管状构造(cytoneme)、细胞管状构造类突起、顶端围足部(peripodial)延伸、肌足(myopodia)、肌足类突起、细胞延伸或顶端或侧面细胞突起，描述于Gurke等.(2008)Histochem.Cell Biol.129：539-50。
“微泡”为在活动或编程死亡过程中从几乎所有细胞类型流出的100nm至700nm范围的质膜的片段。它们直接源自细胞的质膜并反映它们源自的细胞的抗原内容。
本发明的实施方式
亨廷顿氏病(HD)的病理是由亨廷顿蛋白(htt)基因的蛋白产物的可变大小的多聚谷氨酰胺(PG)的扩展引起的。Htt基因位于4号染色体短臂上。Htt包含三个DNA碱基-胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤(CAG)重复多次的序列，称作三核苷酸重复。通常地，人具有少于27个重复的谷氨酰胺。具有少于36个谷氨酰胺的Htt导致称作亨廷顿蛋白的细胞质蛋白的产生。然而，36个或更多的谷氨酰胺的序列导致具有不同特征的Htt形式的产生。这种改变的形式，被称为突变Htt或更通称被称为mHtt，其增加了确定类型的神经元的神经元衰退的比率和增加具有较高比例或从属于该神经元衰退的大脑区域。通常，CAG的数目与该程序被感染多少有关联，并与起始的年龄和症状的发展程度有关。例如，36-39次重复导致比平均值晚得多的起始和更慢的症状的发展，由此一些个体可能在他们正好显示亨廷顿病症状前死于其他原因；这被称为“减小的外显率”。具有非常大的重复数目，HD可在20岁的年龄下发生，那时被称为青少年HD，运动不能-僵硬的，或Westphal变体HD；这占HD携带者的约7％。
停止HD发展的最好的希望是减少或消除在感染的细胞中的突变htt蛋白。小干扰RNA(siRNA)已显示出在动物模型中对减少htt水平和改进疾病症状有效(DiFiglia等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A.104：17204-17209；Wang等.(2005)Neurosci Res.53：241-249).新的数据显示，突变的htt mRNA可被特定地靶向，同时保留正常等位基因产生的转录本(Schwarz(2006)PLoS Genet.2：e140)。这项技术面临的挑战是以一种持续、安全且有效的方式将siRNA递送至人类大脑。直接的siRNA传递是对于问题的有效的、但稍纵即逝的答案。siRNA不会跨越血脑屏障以治疗慢性中枢神经系统(CNS)疾病如亨廷顿氏病、阿尔茨海默氏症，ALS和其他疾病。治疗神经退行性疾病所需的长时间递送siRNA以沉默突变基因，仍然是当前阻碍有效治疗用途的关键的尚未解决的问题。本发明解决了该siRNA递送瓶颈，并开发出持续的对神经退行性疾病和其他通过基因或基因变异或基因突变介导的疾病的治疗。
本发明使用改造的(engineered)人间充质干细胞(MSC)以连续地将抗突变的htt siRNA递送至受损的或处于风险中的大脑中的神经元。申请人已在过去的21年里使用MSC，“身体的护理员”，以安全和有效地将许多分子系统地递送，并体内递送至多种器官，包括神经组织(Dao等.(1997)Stem Cells.15：443-454；Meyerrose等.(2007)StemCells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722；Nolta等.(1994)Blood.83：3041-3051；Tsark等.(2001)J Immunol.166：170-181；Wang等.(2003)Blood.101(10)4201-4208).在这些出版物中已报道MSC/骨髓基质细胞以持续的方式强大地产生用于体内递送至其他细胞中的产品。申请人也已显示MSC将siRNA和其他细胞组分直接注入受损的细胞中。使用该递送方法，不必采用频繁的siRNA重给予。使用该方法，开发出了基于成年干细胞治疗的递送策略，这对其中中毒的突变蛋白必须减少的任何神经退行性疾病由深远的影响。
预期将进行临床试验以使用纹状体内注射抗突变htt siRNA改造的MSC以治疗早期的HD，以预防进一步的神经元损失和衰弱(debilitation)。申请人刚结束十年之久的生物安全研究，该研究显示遗传改造的人MSC是安全的(Bauer等.(2008)MoI Ther.16：1308-1315)。对于第三方MSC注入的I/II期临床试验现已对数百患者进行过，没有不利事件(早期结果参见Giordano等.(2007)J Cell Physiol.211：27-35)。MSC已被成功注入ALS患者的脑中，没有不利事件(Mazzini等.(2003)Amyotroph Lateral Scler Other Motor NeuronDisord.4：158-161).由于HD患者不幸地基本没有其他选择，所以该未来试验的收益/风险比特别的高。
已有描述显示不同的干细胞群体对肌肉、肝脏、心和脉管系统的再生有贡献，尽管其实现机制还仍然没有被很好理解。然而，已知干细胞分泌多种具有旁分泌和自分泌活性的细胞因子和生长因子。通过成年的MSC的组织修复和再生的一种理论是该作用机理基于干细胞固有的功能：该注射的干细胞住在受伤的区域，特别是在含氧量低的、细胞凋亡的或炎症的区域，并释放促进内生修复的营养因子。这些分泌的生物活性因子抑制局部免疫系统，对于位于组织的干细胞增强血管发生，抑制纤维化和细胞凋亡，并刺激募集、驻留、有丝分裂和分化。这些营养效果不同于干细胞至待再生的组织的直接分化。MSC已显示出对以下情况的组织恢复有贡献：多重损伤模型，例如心肌梗塞(Laflamme & Murry(2005)Nat Biotechnol.23：845-856)，中风模型(Chen等.(2003)J Neurosci Res.73：778-786；Li等.(2005)GNa.49：407-417)，半月板损伤模型(Murphy等.(2003)Arthritis Rheum.48：3464-3474)，和下肢局部缺血(Rosova等.(2008)Stem Cells26：2173-2182).营养因子分泌和组织再生的总体增强已在心肌梗塞模型中有显示(Gnecchi等.(2006)Faseb J.20：661-669)，并且包括HGF，FGF-2，胰岛素生长因子-I(IGF-I)，和血管内皮生长因子(VEGF)的多重刺激生成血管的细胞因子的分泌已在MSC条件的培养基中检测到。据发现MSC分泌的营养因子的复合物组显示对损伤的组织体内修复有显著的贡献，该修复通过刺激血管生成和减少细胞凋亡进行。
脑中MSC的营养效果包括通过分泌的生长因子促进内源性神经元生长，分泌抗细胞凋亡因子和调节炎症。在缺乏酸的鞘磷脂酶的小鼠中，MSC的移植延迟了神经异常的发育的发生并显著延长了它们的寿命(Chen等.(2001)Stroke.32：1005-1011；Jin等.(2002)J ClinInvest.109：1183-1191)。由于MSC分泌的存活因子减少细胞死亡的预示，Mazzini等进行了证实在肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)患者中MSC移植的效果的临床研究(Mazzini等.(2003)Amyotroph LateralScler Other Motor Neuron Disord.4：158-161)。ALS引起导致肌肉功能性方面的累进的和致命的衰退的运动神经元的损失。七个ALS患者参加了MSC临床试验，他们的腿已经具有严重的功能障碍。扩展的(Expanded)MSC被移植至患者脊髓中。细胞移植三个月后，在四名患者的腿中观察到肌肉强度下降的慢化的趋势(Mazzini等.(2003)Amyotroph Lateral Scler Other Motor Neuron Disord.4：158-161).由于没有进行随机化的研究，因此该结果绝非确定的，但它们确实显示在具有一种形式的神经退行性的患者中MSC注入至脑脊液中是可以耐受的，没有不利事件。本发明不仅利用MSC固有的营养效果，也使用它们来作为递送工具以注入siRNA，该siRNA设计为攻击对HD中神经退行性疾病负责的突变RNA种类。
有许多好的转基因小鼠模型用于过表达不同形式的突变的htt蛋白，该蛋白具有可变长度的重复(参见，例如，Heng等.(2008)Neurobiol Dis.32：1-9；Ramaswamy等.(2007)Iiar J.48：356-373).然而，人细胞不能可靠地移植至这些具有完全免疫能力的种类(strain)中。因此使用慢病毒载体通过慢病毒转导鼠神经元的模型被使用，如最初描述于de Almeida等.(2002)J Neurosci.22：3473-3483。该作者进行了趋实体注射至左纹状体和右纹状体，以检验人htt蛋白的截短形式的慢病毒递送的效果，该人htt蛋白具有扩展的多聚谷氨酰胺区域(82个重复)。啮齿动物纹状体中的细胞在早至慢病毒转导后1周开始表达突变htt蛋白的包涵体。注射后4周内包涵体的数量和大小逐渐增加。神经元变性和棘神经元的缺失在注射的纹状体中被观察到((2002)JNeurosci.22：3473-3483)。本发明使用免疫缺陷小鼠并将第一次使对于人干细胞治疗的缺陷测试能治疗HD。
一方面，本发明提供一种用于将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的分离的间充质干细胞，所述分离的间充质干细胞包含或基本上由以下物质组成、或还进一步由以下物质组成：表达该siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，并且其通过细胞突起或微泡将该siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞。另一方面，多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，分离的间充质干细胞在适于通过细胞突起或微泡将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸转移至靶细胞的条件下置于与靶细胞的交流中。
还提供的是一种间充质干细胞，它包含或基本由以下物质组成，或还进一步由以下物质组成：外源的siRNA、miRNA或dsRNA序列，或者与编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的DNA序列组合。还提供的是一种间充质干细胞，它包含以下物质或基本由以下物质组成，或还进一步由以下物质组成：单独的编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列或者编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列与该siRNA、miRNA或dsRNA序列的组合。另一方面，上文所述的MSC的每种都可以与靶细胞建立细胞突出，从而将多核苷酸和/或siRNA，miRNA或dsRNA递送至靶细胞。另一方面，MSC可以将多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA或编码它的多核苷酸通过微泡递送至靶细胞。另一方面，多核苷酸和/或siRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，该间充质干细胞是一个分离的间充质干细胞，并且另一方面，该细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织或骨髓样本中。
本发明的MSC可通过细胞表面标记物识别，所述细胞表面标记物包括，但不限于，CD90+，CD105+，CD44+，CD73+，CD34-，CD45-。
另一方面，编码siRNA、miRNA或dsRNA的DNA序列被整合至MSC的基因组中。该DNA被有效连接并整合至表达和/或递送载体中。另一方面，该包含DNA序列的递送和/或表达载体包含调节DNA表达的启动子。启动子的非限制性实例为聚合酶-III启动子，例如H1-RNA基因启动子。
另一方面，siRNA、dsRNA或miRNA定向于介导疾病的基因，所述疾病例如遗传疾病，病毒疾病或癌。疾病的非限制性实例包括亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。在特定方面，该疾病为亨廷顿氏病且基因定向于突变Htt基因。一种siRNA定向的基因为363125_C-16。
作为siRNA、miRNA或dsRNA接受者的靶细胞非限制性地包括一种或多种神经细胞、心细胞(cardiac cell)、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞或视网膜细胞。该细胞可为在此鉴定为受试者的任何起源的，例如猿、牛、犬科动物、鼠或人。
本发明的细胞可与载体组合，所述载体例如固体支持物、载体或药学可接收的载体。另一方面，该组合物还包含干细胞衍生的神经元。在特定的方面，衍生自干细胞的神经元选自神经上皮干细胞、MSC、脂肪衍生的干细胞或iPSC。
包含多种以上描述的细胞的群体也被提供。该群体可对于MSC和/或靶细胞基本同源的或异种的。包含该群体的组合物还被提供，其中该群体与固体支持物、载体或药学可接受的载体组合。
上文所述的细胞和组合物，用于通过将靶细胞与本发明的MSC接触递送一种或多种siRNA、miRNA或dsRNA至靶细胞。因此，还提供的是一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤或基本上由以下步骤组成、或还进一步由以下步骤组成：将靶细胞与间充质干细胞接触，该间充质干细胞包含表达siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞。该MSC可被单独递送或者与药学可接受的载体组合递送。不被理论束缚时，该递送可以通过或经由细胞突起和/或微泡独立发生或组合发生。另一方面，多核苷酸和/或siRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。一方面，该间充质干细胞是一个分离的间充质干细胞，并且另一方面，该细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织或骨髓样本中。
还提供的是一种治疗受试者中由存在突变的等位基因介导的遗传病症(例如亨廷顿氏病)的方法，所述方法通过给予患者以下物质来完成：上述的MSC或包含间充质干细胞，或基本上由间充质干细胞组成或还进一步由间充质干细胞组成的组合物，其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA定向于突变的Htt基因编码的RNA，并且可将siRNA、miRNA或dsRNA递送至患者的靶神经细胞。不被理论束缚时，一方面，本发明的MSC是其中多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被单独地或共同地通过细胞突起和/或微泡递送，从而治疗疾病的那种。一方面，该间充质干细胞是一个分离的间充质干细胞，并且另一方面，该细胞存在于自合适的受试者分离的组织中，例如脂肪组织或骨髓样本中。
另一方面，DNA编码定向于突变Htt基因的siRNA，其实例为363125_C-16。该靶细胞可为神经元或干细胞衍生的神经元，其可得自一种或多种神经上皮干细胞、MSC、脂肪衍生的干细胞或iPSC。
通过该方法治疗的受试者包括猿、牛、马、犬、鼠或人患者。
一些实施方案中，本发明提供的是一种包含或基本上由以下物质组成、或还进一步由以下物质组成的间充质干细胞：单独或与编码siRNA、dsRNA或miRNA序列的外源DNA序列组合的外源siRNA、dsRNA或miRNA序列，其中所述间充质干细胞可将该序列或编码该序列的多核苷酸递送至靶细胞。不受理论限制时，一方面MSC建立了与靶细胞的细胞突起，由此递送多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA。另一方面，它们被通过微泡递送至靶细胞。另一方面，多核苷酸和/或siRNA、miRNA或dsRNA被通过任何方法递送至靶细胞，所述方法不包括通过连接蛋白的间隙连接。
本发明的MSC可通过细胞表面标记物识别，所述细胞表面标记物包括，但不限于，CD90+，CD105+，CD44+，CD73+，CD34-，CD45-。
一方面，DNA序列被整合至间充质干细胞的基因组中。另一方面，该DNA序列还包含表达或递送载体。另一方面，该表达或递送载体为慢病毒载体。还另一方面，该载体包含调节dsRNA，miRNA或siRNA表达的启动子。一方面，启动子为聚合酶-III H1-RNA基因启动子。一方面，该方法提供待整合至间充质干细胞基因组中的DNA序列。
为产生该细胞，间充质干细胞自合适的组织或其它源获得或分离，例如，自分化的胚胎干细胞或iPSC产生。siRNA，dsRNA，或miRNA使用化学或其它方法制备，并可被通过与SID-1 DNA共培养被动转移至干细胞或siRNA，dsRNA，或miRNA可被插入至合适的载体例如此处描述的具有合适的调节序列的慢病毒载体。在插入siRNA，dsRNA，或miRNA之后该细胞群体可被适当地扩展或分化。
一些实施方案中，SiRNA定向于介导疾病的基因。一方面，所述疾病选自遗传性疾病，其中所述患病者由存在突变等位基因、病毒感染或疾病、和癌或其它新生物引起。另一方面，所述疾病选自亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及其他。其中所述疾病为亨廷顿氏病，该siRNA，dsRNA或miRNA可定向于邻近CAG重复突变Htt基因，或任何突变Htt基因的单核苷酸多态性，或单siRNA，dsRNA或miRNA定向于Htt基因的多突变形式。一方面，所述siRNA为363125_C-16。
一些实施方案中，用于间充质干细胞的靶细胞选自神经细胞、心细胞、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞和视网膜细胞等。
一些实施方案中，间充质干细胞为哺乳动物来源的。一些实施方案中，哺乳动物来源为猿、牛、马、鼠或人。分离此种细胞的方法为本领域已知并且已经由申请人公布。
一些实施方案中，间充质干细胞与干细胞衍生的神经元或其它细胞组合，例如，神经上皮干细胞、野生型间充质干细胞、脂肪衍生的干细胞和用于该方法或组合物的诱导的多能干细胞。
一方面，用于插入siRNA、dsRNA或miRNA的间充质干细胞为与所有其他细胞组分分离的或者，仅与宿主分离(即仍保留在组织中)的间充质干细胞。一方面，本发明提供本发明的MSC和其它对于克隆繁殖或伸展或组织特异性分化必需的细胞。因此，另一方面，本发明提供由以下产生的扩展的或分化的群体：在合适的条件下生长或培养本发明的MSC以得到细胞群体，每个细胞中具有插入的siRNA，dsRNA，或miRNA，如同插入并存在于该群体起源的MSC中。
还提供的是本发明的间充质干细胞的群体，其为克隆衍生的因此基本同源。克隆地扩展MSC的方法是本领域已知的。另一方面，本发明提供扩展本发明的间充质干细胞非克隆的群体以及将它们分化至合适的组织类型的方法，所述方法通过使MSC在提供用于分化和扩展的适当条件下生长。此种通用方法在本领域已知。
还提供的是扩展性克隆的或分化的本发明的间充质干细胞的群体。
还提供的是包含本发明的间充质干细胞、本发明的间充质干细胞的群体或本发明的间充质干细胞扩展的群体，和载体的组合物。在一些实施方案中，所述载体为如上所述的药学可接受的载体。
还提供的是一种将siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括，或基本由以下组成，或另外由以下组成：将靶细胞与MSC的一个或多个接触，所述MSC为包含或基本由以下物质组成，或还进一步由以下物质组成的群体：MSC(克隆的或分化的)间充质干细胞，该间充质干细胞包含表达该siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将该siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通过细胞突起递送至靶细胞。
MSC可将该siRNA，dsRNA或miRNA通过细胞突起递送至靶细胞。一方面，所述细胞突起是细胞质延伸。另一方面，所述细胞突起是通道微管。还另一方面，该细胞突起选自广泛领域的细胞接触，细的、伸长的、活性丝足或层形足板、细胞管状构造(cytoneme)、细胞管状构造类突起、顶端围足部延伸、肌足、肌足类突起、细胞延伸或顶端或侧面细胞突起。
还提供的是一种将siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括，或基本由以下组成，或进一步由以下组成：将靶细胞置于与MSC，包含或基本由MSC(克隆的或分化的)间充质干细胞组成，或还进一步由MSC(克隆的或分化的)间充质干细胞组成的群体的任一种或多种，在适合将siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通过微泡转移至靶细胞的条件下交流，所述间充质干细胞包含表达该siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将该siRNA、dsRNA或miRNA多核苷酸通过微泡递送至靶细胞。
MSC和靶细胞之间的交流可为培养基、用于细胞生长的生物相容的支架，或例如动物身体或人身体的身体。因此MSC可被置于靶细胞的培养基中，以使MSC分泌的微泡可移至靶细胞并将siRNA，dsRNA或miRNA递送至靶。MSC也可被置于任何适合细胞生长、分化或迁移的平台，在该平台上MSC和靶细胞之间的微泡的移动式不受限制的。一些实施方案中，MSC被置于包含靶细胞的身体中，在此MSC可移到靶细胞附近并将多核苷酸经微泡递送至靶细胞。
适合将siRNA，dsRNA或miRNA多核苷酸经微泡从MSC转移至靶细胞的条件是指适合于细胞生长或迁移的条件。适合干细胞将多核苷酸递送至靶细胞的条件的实例包括Yuan等.(2009)PLoS ONE，4(3)：e4722，其通过引用以全文形式结合至此，以及包在前述段落中描述的那些。
微泡在多种情况下自许多细胞类型流出，通常是由于活化或细胞凋亡，但也作为它们活性的正常功能。已报导胚胎干细胞通过微泡将miRNA转移至邻近细胞(Yuan等.(2009)PLoS ONE，4(3)：e4722).申请人已观察到在正常培养基中MSC流出含siRNA的微泡。
另一方面，DNA序列还包含表达或递送载体。另一方面，该表达或递送载体是慢病毒。还另一方面，该载体包含调节siRNA表达的启动子。一方面，该启动子为聚合酶-III H1-RNA基因启动子。
一些实施方案中，siRNA定向于介导疾病的基因。一方面，所述疾病选自遗传疾病、病毒疾病和癌。另一方面，所述疾病选自亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)及其他。一方面，所述疾病是亨廷顿氏病。一方面，siRNA定位于突变Htt基因中邻近CAG重复的SNP。一特定方面，所述siRNA为363125 C-16。
一些实施方案中，所述靶细胞选自神经细胞、心细胞、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞或视黄醇(retinol)细胞。
一些实施方案中，所述间充质干细胞为哺乳动物来源的。一些实施方案中，所述哺乳动物来源为猿、牛、鼠或人。
一些实施方案中，间充质干细胞与干细胞衍生的神经元或其它干细胞类型共给予。一方面，所述干细胞选自神经上皮干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生的干细胞和诱导的多能干细胞。
一方面，该间充质干细胞是分离的间充质干细胞。
所述方法可在体外、体内或间接体内进行。体外进行时，MSC或包含本发明的MSC的组合物与靶细胞的培养在允许RNA转移至靶细胞中的条件下接触。该方法的体外操作提供了对可选择的方法和小分子的筛选。或者，该方法在间接体内通过采用原代细胞培养或在合适条件下共培养细胞进行。间接体内方法用于在给予至例如人类患者的受试者之前测试治疗。体内方法可被进行以产生动物模型来分析或视为受试者，也如在此提供的。
在体内操作时，该方法可用于治疗例如人类患者的受试者的亨廷顿氏病，所述治疗通过给予患者单独的MSC或与其它因子组合的MSC。MSC通过直接注射进入组织给予，对于所述组织RNA是待转移的。例如MSC可包含编码定位于突变Htt基因的siRNA、dsRNA，或miRNA序列的外源的DNA序列，并可将该siRNA、dsRNA，或miRNA通过细胞突起递送至受试者的靶神经细胞，由此治疗疾病。
一些实施方案中，该方法还包含对患者给予干细胞衍生的神经元。一方面，该干细胞衍生的神经元在给予间充质干细胞之前或之后给予。另一方面该干细胞衍生的神经元与间充质干细胞一起给予。
一些实施方案中，干细胞选自神经上皮干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生干细胞和诱导的多能干细胞。
一些实施方案中，所述给予包括注入至脑或其他CNS组织。一些实施方案中，所述给予包括静脉注射或直接注入脊髓，靶细胞侧的远端或近端。
一特定实施方案中，对于所述方法的受试者为马、牛、猿、犬或人患者。一更特定实施方案中，受试者为人类患者。
还提供的是将siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸跨过血脑屏障递送至患者的脑的方法，所述方法包括对患者给予间充质干细胞，该间充质干细胞包含表达该siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将该siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸通过细胞突起递送至脑中的靶细胞。
一方面，所述给予包括静脉注射、注射至脑，或注射至脊髓(靶细胞侧的远端或近端)。
还提供的是测定试验基因的表达是否为细胞功能所需的方法，所述方法包括将试验细胞与间充质干细胞接触，其中间充质干细胞包含编码定向于试验基因的siRNA，dsRNA，或miRNA序列的外源DNA序列，由此将siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸通过细胞突起递送至试验细胞，其中细胞功能的中断表示试验基因的表达是细胞功能所需的。
还提供的是递送siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸至靶细胞的试剂盒，所述试剂盒包含间充质干细胞和关于递送siRNA，dsRNA，或miRNA的使用说明书，所述间充质干细胞含有表达siRNA，dsRNA，或miRNA多核苷酸的外源DNA序列，其中所述间充质干细胞可与靶细胞建立细胞突起和/或微泡由此递送siRNA，dsRNA，或miRNA至靶细胞。靶细胞如上所述。该试剂盒还包含如上所述的基因递送载体和/或使用说明书。
示例性实施例
实施例1.MSC输入siRNA至靶细胞
据发现MSC可用于强壮地将siRNA体内递送至受损的细胞中。图1显示eGFP标记的MSC，它已将alexa-fluor标记的抗突变httsiRNA(红色)从邻近的非GFP MSC转移至其内部(也参见图3)。较亮的点在转移后并生至溶酶体中，但较小的siRNA数量在细胞质中是分散的。人间充质干细胞(MSC)可被转导以产生siRNA和其他RNA修饰部分(siRNA/miRNA杂交和其他)，以减少神经元中突变httRNA水平和蛋白水平。
据发现MSC可容易地将小RNA分子直接通过细胞-细胞接触转移。该细胞-细胞接触可包括细胞突起、细胞质延伸或通道微管。已证实MSC快速定位(home)于身体的受伤或不良应激的位点。MSC整合至免疫缺陷小鼠的组织存活高达18个月，并在该期间产生引入的转基因的产物。参见，例如，Dao等.(1997)Stem Cells.15：443-454；Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722；Nolta等.(1994)Blood.83：3041-3051；Tsark等.(2001)J Immunol.166：170-181；Wang等.(2003)Blood.101(10)4201-4208；Bauer等.(2008)MoI Ther.16：1308-1315；Rosova等.(2008)Stem Cells 26：2173-2182；和Wu等.(2003)Transplantation.75：679-685.在一项十年之久的研究中，在遗传修饰和移植之后，MSC已显示为安全的，且不引起不利事件或肿瘤(Bauer等.(2008)MolTher.16：1308-1315)。当前的递送方案显示，除了分泌蛋白产物之外，小干扰RNA可从MSC通过细胞-细胞接触直接分泌至靶细胞中(图1，图2)。除了MSC对修复受损的神经元的营养效果，MSC可对于HD发展的严重性有显著影响。
也发现MSC可通过MSC分泌的微泡转移小RNA分子。图1中显示siRNA出现在细胞外面的微泡中，如细胞外白圆圈所示。因此，MSC可递送siRNA至靶细胞，或者通过例如细胞突起的直接细胞-细胞接触，或者通过MSC分泌的微泡直接转移。
实施例2.MSC分离和转导
人MSC可从正常供体收集并在临床有关的条件下扩展。申请人之前已证实人MSC容易吸收病毒载体(参见，例如，Dao等.(1997)Stem Cells.15：443-454；Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose(2008)Stem Cells.26：1713-1722；and Nolta(1994)Blood.83：3041-3051)。慢病毒载体已被开发用于表达几种用于直接注入左纹状体和右纹状体的不同形式的突变htt蛋白，用于在允许的异种移植物背景下的开发。这些载体中的编码序列包括具有CAG重复长度为18(野生型，正常基因)、44和82的编码氨基酸1-400的Htt cDNA。当使用所述的病毒载体方案引入至啮齿类时，引入具有82个重复的基因导致快速开始包涵体形成和行为缺失，由44个重复的基因引起的情况有1-3周延迟(DiFiglia等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A.104：17204-17209)。
实施例3.等位基因特异性siRNA
在HD中siRNA敲减的目的是抑制突变蛋白并保留自正常等位基因转录的mRNA。Schwarz等于2006年首次证实亨廷顿蛋白mRNA表达的等位基因特异性抑制是可能的(Schwarz等.(2006)PLoS Genet.2：e140)。van Bilsen等证实直接从亨廷顿氏病患者分离的细胞中的内生性亨廷顿蛋白表达的等位基因特异性抑制(van Bilsen等.(2008)Hum Gene Ther.19：710-719)。van Bilsen等已证实SNP位于远离CAG重复区域定位的靶。已知可减少突变基因的siRNA可被引入至小鼠中，定向于SNP rs363125，其具有44个CAG密码子，对比野生型中19个CAG密码子。表达与van Bilsen的研究中试验的siRNA36125_C-16相同的序列的载体已被制造并可利用针对82重复的Htt等位基因的特异性siRNA。也预期可使用定向于Htt基因的不同突变形式的siRNA载体，其可用于大多数患者。
实施例4.siRNA转移分析
siRNA的转移已在体外完成，使用荧光标记的合成的siRNA。这些初始研究使用抗htt150序列。siRNA载体也可按如下制备：HttSiRNA的骨架是pCCLc-X，具有在“X”位置克隆的H1启动子(来自Oligoengine的pSuper载体)，操纵siRNA(不包括pCCLc-H1 p-Htt150siRNA)。U87细胞、自NOD/SCI D/MPSVII小鼠分离的皮成纤维细胞、神经干细胞、快速生长肿瘤系和HD患者iPS细胞可用于开发HD神经干细胞。正常细胞可有突变的人htt等位基因转移至其中，并且可作为受体细胞来试验MSC介导的siRNA转移和体外蛋白敲减的效率。供体和靶细胞可通过基于在MSC和神经细胞之间不同的细胞表面标记物的FACS干净地分离，或通过GUSB表达分离，且然后可通过FACS(对于荧光siRNA转移)和定量RT PCR、蛋白印迹(western blot)和用于蛋白水平的微阵列测试。在所有研究中，eGFP蛋白的敲减可通过MSC介导的抗-eGFP siRNA的转移来完成，抗-eGFP siRNA作为容易被FACS检测到的阳性对照。
实施例5.siRNA从MSC转移至靶细胞
alexa-fluor标记的抗突变htt siRNA从MSC至靶细胞中的转移已被检测。使用的htt siRNA为siRNA Htt150，最初描述于DiFiglia等.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A.104：17204-17209。转移率为直接可视化的(图2)。使用的设备为Deltavision去卷积显微镜，使用60X物镜并在0.2微米步骤采取60面(plane)。这些图像也可被旋转以确定siRNA已被转移至细胞中，并且不在表面。直接的标记的siRNA通过MSC的细胞-细胞的转移比例已被检测。用于产生图2中的数据的方法可用于体外测试每种新siRNA和siRNA/miRNA杂交结构的转移效率。FACS分析可确定从供体至靶细胞的转移程度，并且可评估通过慢病毒转导连续产生的MSC衍生的抗eGFP siRNA的eGFP蛋白的百分比敲减。eGFP水平的减少可使用靶神经细胞的FACS评估。
实施例6.体内测试人干细胞治疗的HD模型
为产生小鼠模型，NOD/SCID/MPSVII和NOG免疫缺陷小鼠可用编码突变的或野生型的htt蛋白的慢病毒载体注射至右纹状体和左纹状体。这些小鼠将被麻醉然后在头皮中切开小口，在该动物的颅骨中提供1mm粗边(burr)洞的空间。该突变的或野生型的慢病毒将以deAlmeida，等(de Almeida等.(2002)J Neurosci.22：3473-3483)描述的控制的速率被注射至纹状体。每个实验中将进行12只小鼠的组，4/上臂(4per arm)，并重复8次，使用来自不同供体的MSC。注射后，将骨蜡置于该粗边洞以控制流出，并且该洞上的头皮将用小的缝线闭合。注射病毒后一周开始，行为影响被评估。手术之前，小鼠将被训练通过一个横梁走至一个箱子。横梁将与纸排列以使小鼠的足可被墨水染色，使得能评估以其失足形式证实的行为缺失。开始注射四周后这些动物将被移植产生siRNA的MSC，对比乱序的产生iRNA的MSC，使用相同的纹状体内注射技术。另外，横梁测试将在手术后一周开始，以寻找小鼠步态的改变。适当的假对照和表达乱序siRNA的载体将用于确保任何观察到的改变都是由于治疗而不是手术自身的效果产生。小鼠将在不同的时间点被处死，它们的脑被取出用于评估，如以下进一步所述。
实施例7.从小鼠脑重获取人MSC人MSC
可使用GUSB FACS分选在特定的时间点之后从该脑组织重获取。这种分选方案使得能将自脑回收的活细胞分离成GUSB阳性(人)和阴性(鼠)，以评估每种中的siRNA水平。人供体GUSB+细胞将从小鼠脑通过FACS活性分离，使用可扩散的底物。在每次分析中迁移至组织的受伤区域的细胞数量和百分比可通过使用NOD/SCID/MPSVII小鼠快速定量。使用基于GUSB的流动分析结合对鼠MHC的细胞表面分析将确定酶没有被旁观者效应吸收也没有被宿主巨噬细胞吞入死细胞。酶标记是相当特异性的，并且即使释放的酶可被邻近的细胞吸收，它是以不再被组织化学或基于FACS分析检测到的处理过的形式(Sands等.(1997)Neuromuscul Disord.7：352-360；Wolfe等.(1992)Nature.360：749-753)。这将对于每种待检测的细胞群体进行验证。从脑回收的细胞将进行对htt蛋白和mRNA水平改变的评估，使用定量实时PCR和蛋白分析。使用NOD/SCI D/MPSVI I模型，来自小鼠组织的人细胞可被活性分离，这基于GUSB酶的亲脂底物。它们也可使用在人MSC上的CD105被分离。
获得的MSC然后可在单克隆分析中培养，以确保完整的遗传内容，或立即进行染色体分散和FISH(Wang等.(2003)Blood.101(10)4201-4208)。GUSB+细胞将被从来自脑的单细胞悬液分离，使用Influx细胞计数器进行。申请人已能够从注射后的肝脏中回收高达20％GUSB+人细胞，以及从后肢局部缺血的肌肉回收5％GUSB+人细胞。在移植后从脑也已经回收足够的水平。分离的数量对于所有分析是足够的。已将siRNA递送至脑的细胞将被回收并且将被分析htt蛋白水平的改变。大约10,000个细胞/分析对于最好的分析是需要的，并且较少的可以使用。
在该研究中，任何不利事件将被紧密检查，例如发生在小鼠脑中来自体内人MSC的异位异常组织分化或肿瘤形成，如已被报导的(Bauer等.(2008)MoI Ther.16：1308-1315)。用人骨髓和脂肪衍生的MSC的免疫缺陷小鼠研究将在FDA要求的GLP(药品安全性试验规范)条件下进行，以使他们对于基于MSC的组织修复治疗可被直接翻译。
实施例8.间充质干细胞改造和移植
在申请人早期的研究中已被证实MSC代表容易获得的且非常顺从于慢病毒或逆转录病毒转导的干细胞群体，使它们成为包括多种广泛的末端组织靶的基于细胞的治疗是良好的途径。载体沉默的证据未被观察到，而转基因产物高达18个月(实验期间)的持续和安全的体内表达已被报导(Dao等.(1997)Stem Cells.15：443-454；Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722；Nolta等.(1994)Blood.83：3041-3051)。
实施例9.人MSC体内定量以证实对于测定siRNA功效的足够细胞回收的可行性
使用双重qPCR系统通过同时测定鼠rapsyn和人β-珠蛋白基因以列举人MSC/器官的贡献(Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722)。在来自交互物种的100ng总DNA中有少至0.005ng的每个种类的DNA被检测到。静脉注射后MSC迁移至脑，并且在六个月之后仍存在。绝对的人供体细胞贡献/器官被计算为描述评估总存在的MSC(Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722)。直接注射入脑，这些细胞预期以更强健的数量存在并容易迁移通过该组织。也预期MSC可被注入脊髓。注入脊髓(脑中靶位点的远端或近端)之后，MSC可迁移至靶位点并递送siRNA至靶位点。
实施例10.用于人细胞的增强检测的改进的免疫缺陷小鼠模型
粘多糖增多症类型VII(MPSVII)由β-葡糖苷酸酶(GUSB)活性缺失引起。NOD/SCI D/M PSVII株使得能够快速显现相对于无该酶的小鼠组织背景的携带正常水平β-葡糖苷酸酶的人细胞。图3中显示将移植的人干细胞定位于鼠组织切片中的舒适和特异性的实例。该株(strain)已被用于突出显示受损的器官中人干细胞介导的组织修复区域(Meyerrose等.(2007)Stem Cells.25：220-227；Meyerrose等.(2008)Stem Cells.26：1713-1722；Hess等.(2008)Stem Cells 26：611-620).该酶反应之后，载玻片可用组织特异性蛋白标记物的抗体复染(Hess等.(2008)Stem Cells 26：611-620；Hofling等.(2003)Blood101：2054-2063).该酶染是相当特异性的，并且尽管该释放的酶可被邻近细胞吸收，但它处于不再被组织化学分析检测到的处理过的形式(Sands等.(1997)Neuromuscul Disord.7：352-360；Wolfe等.(1992)Nature.360：749-753).因此，该个体移植的人细胞相对于无GUSB鼠组织背景生动地突出。因此人细胞可被检测到，不依赖细胞表面标记物或引入的标记物基因的表达。流式细胞术分析也存在以重新分离人细胞，仅基于GUSB酶活性而不是细胞表面表型或其它特征。NOD/SCID MPSVII小鼠的新模型提供了显示、跟踪和在移植后回收人细胞的极好的机会，不依赖与表面蛋白或预期标记的表达。该系统对于以下特别有用：从小鼠脑中回收MSC、对于分析随时程连续的siRNA生产、对于分析安全性研究的遗传完整性，以及从小鼠细胞将它们干净分离以使得能直接测量在小鼠神经元中突变对于正常htt蛋白的量。
实施例11.双分支细胞治疗
用于HD的双分支细胞治疗方法被考虑。两种细胞类型可被共递送至新纹状体：使用hESC技术产生的棘神经元，联合MSC治疗以减少内生性的htt水平。该双分支方法可对处于该疾病的较高级阶段患者提供治疗，所述患者已失去显著数量的神经组织。MSC也将保护该移植的神经元免受免疫系统的排斥。该两种细胞类型可被共给予，或先后给予。
应理解虽然本发明已经结合上述实施方案被描述，但前述说明和实例意欲描述而非限制本发明的范围。其他方面，在本发明的范围内的优势和修改将对于本发明属于的领域技术人员是显而易见的。

Claims (67)

1.用于将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的分离的间充质干细胞，所述分离的间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，并且所述分离的间充质干细胞通过微泡或细胞突起将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至所述靶细胞。
2.包含外源siRNA、miRNA或dsRNA或编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的多核苷酸序列的分离的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞可分泌包含所述siRNA、miRNA或dsRNA的微泡。
3.包含编码siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列的分离的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞可将所述siRNA、miRNA或dsRNA递送至靶细胞。
4.权利要求1至3中任一项的分离的间充质干细胞，所述间充质干细胞在适于通过细胞突起或微泡将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸转移至靶细胞的条件下被处于与靶细胞的交流中。
5.权利要求1至4中任一项的间充质干细胞，其中所述DNA序列被整合至所述间充质干细胞的基因组中。
6.权利要求3的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞通过细胞突起或微泡递送所述外源DNA序列或所述siRNA、miRNA或dsRNA序列。
7.权利要求1至6中任一项的间充质干细胞，其中所述DNA序列还包含表达或递送载体。
8.权利要求7的间充质干细胞，其中所述载体还包含调节所述siRNA、miRNA或dsRNA表达的启动子。
9.权利要求7的间充质干细胞，其中所述启动子为聚合酶-III H1-RNA基因启动子。
10.权利要求1至9中任一项的间充质干细胞，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介导疾病的基因。
11.权利要求10的间充质干细胞，其中所述疾病选自遗传疾病、病毒疾病和癌。
12.权利要求10的间充质干细胞，其中所述疾病选自亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
13.权利要求10的间充质干细胞，其中所述疾病为亨廷顿氏病。
14.权利要求13的间充质干细胞，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于突变的Htt基因。
15.权利要求14的间充质干细胞，其中所述siRNA为363125_C-16。
16.权利要求1至9中任一项的间充质干细胞，其中所述靶细胞选自神经细胞、心细胞、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、视黄醇细胞和干细胞衍生的神经元。
17.权利要求15的间充质干细胞，其中所述干细胞衍生的神经元衍生自选自神经上皮干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生的干细胞和诱导的多能干细胞的干细胞。
18.权利要求1至16中任一项的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞为哺乳动物来源的。
19.权利要求18的间充质干细胞，其中所述哺乳动物来源为猿、牛、马、犬、鼠或人。
20.权利要求18的间充质干细胞，其中所述哺乳动物来源为人。
21.权利要求1至20中任一项的间充质干细胞的扩展的克隆的或分化的群体。
22.权利要求1至21中任一项的间充质干细胞的群体。
23.权利要求22的群体，其中所述间充质干细胞为基本同源的。
24.权利要求22的群体，其中所述间充质干细胞为异源的。
25.一种包含权利要求1至20中任一项的分离的间充质干细胞，或者权利要求21至24中任一项的群体，和载体的组合物。
26.权利要求25的组合物，其中所述载体是药学可接受的载体。
27.权利要求26的组合物，还包含干细胞衍生的神经元。
28.一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括将所述靶细胞与间充质干细胞接触，该间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源siRNA、miRNA或dsRNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至所述靶细胞。
29.权利要求28的方法，其中所述序列通过细胞突起被递送。
30.权利要求28的方法，其中所述DNA序列被整合至所述间充质干细胞的基因组中。
31.权利要求28的方法，其中所述DNA序列还包含表达或递送载体。
32.权利要求30的方法，其中所述载体包含调节所述siRNA、miRNA或dsRNA表达的启动子。
33.权利要求32的方法，其中所述启动子为聚合酶-III H1-RNA基因启动子。
34.权利要求28至33中任一项的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介导疾病的基因。
35.权利要求34的方法，其中所述疾病选自遗传疾病、病毒疾病和癌。
36.权利要求34的方法，其中所述疾病选自亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
37.权利要求34的方法，其中所述疾病为亨廷顿氏病。
38.权利要求37的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于突变的Htt基因。
39.权利要求38的方法，其中所述siRNA为363125_C-16。
40.权利要求28至34中任一项的方法，其中所述靶细胞选自神经细胞、心细胞、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞和视网膜细胞。
41.权利要求28至40中任一项的方法，其中所述间充质干细胞为哺乳动物来源的。
42.权利要求40的方法，其中所述哺乳动物来源为猿、牛、马、犬、鼠或人。
43.权利要求41的方法，其中所述哺乳动物来源为人。
44.权利要求28至43中任一项的方法，还包含给予干细胞衍生的神经元。
45.权利要求44的方法，其中所述神经元衍生自选自神经上皮干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生的干细胞和诱导的多能干细胞的干细胞。
46.权利要求28至45中任一项的方法，其中所述间充质干细胞为分离的间充质干细胞。
47.权利要求28至46中任一项的方法，其中所述接触为体外、体内或间接体内。
48.一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸递送至靶细胞的方法，所述方法包括将所述靶细胞与间充质干细胞在适于将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通过微泡转移至所述靶细胞的条件下处于交流，该间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸经所述微泡递送至所述靶细胞。
49.权利要求48的方法，其中所述DNA序列被整合至所述间充质干细胞的基因组中。
50.权利要求48或49的方法，其中所述siRNA、miRNA或dsRNA被定向于介导疾病的基因。
51.权利要求50的方法，其中所述疾病选自亨廷顿氏病(HD)、帕金森氏病(PD)、阿尔兹海默氏病(AD)、急性心肌梗塞(AMI)、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、老化相关的黄斑变性(AMD)、急性肺损伤(ALI)、严重急性呼吸综合征(SARS)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。
52.权利要求50的方法，其中所述疾病为亨廷顿氏病。
53.权利要求48至52中任一项的方法，其中所述靶细胞选自神经细胞、心细胞、肺细胞、肌肉细胞、皮肤细胞和视网膜细胞。
54.权利要求48至53中任一项的方法，其中所述接触为体外、体内或间接体内。
55.一种治疗患者的亨廷顿氏病的方法，所述方法包括给予所述患者间充质干细胞，该间充质干细胞包含编码定向于突变Htt基因的siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列，并可将所述siRNA、miRNA或dsRNA通过细胞突起递送至所述患者的靶神经细胞，由此治疗所述疾病。
56.权利要求55的方法，还包含将干细胞衍生的神经元给予至患者。
57.权利要求56的方法，其中所述干细胞衍生的神经元在给予所述间充质干细胞之前或之后给予。
58.权利要求56的方法，其中所述干细胞衍生的神经元与所述间充质干细胞一起给予。
59.权利要求56的方法，其中所述干细胞选自神经上皮干细胞、间充质干细胞、脂肪衍生的干细胞和诱导的多能干细胞。
60.权利要求55或56的方法，其中所述给予包含注射至脑。
61.权利要求55或56的方法，其中所述给予包含静脉注射，或注射入所述靶细胞侧的远端或近端的脊髓。
62.权利要求55至61中任一项的方法，其中所述患者为人患者。
63.一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸跨血脑屏障递送至患者脑的方法，所述方法包括将间充质干细胞给予所述患者，该间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通过细胞突起递送至脑中的靶细胞。
64.一种将siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸跨血脑屏障递送至患者脑的方法，所述方法包括将间充质干细胞给予所述患者，该间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通过微泡递送至脑中的靶细胞。
65.权利要求63或64的方法，其中所述给予包括经脉注射，注射入脑，或注射入所述靶细胞侧的远端或近端的脊髓。
66.一种测定试验基因的表达是否为细胞功能所需的方法，所述方法包括将试验细胞与间充质干细胞接触，该间充质干细胞包含编码定向于所述试验基因的siRNA、miRNA或dsRNA序列的外源DNA序列，由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸通过细胞突起递送至所述试验细胞，其中所述细胞功能的中断表示所述试验基因的表达是所述细胞功能所需的。
67.一种递送siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸至靶细胞的试剂盒，所述试剂盒包含间充质干细胞和关于递送所述siRNA、miRNA或dsRNA的使用说明书，其中所述间充质干细胞包含表达所述siRNA、miRNA或dsRNA多核苷酸的外源DNA序列，其中所述间充质干细胞可与所述靶细胞建立细胞突起由此将所述siRNA、miRNA或dsRNA递送至所述靶细胞。
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