CN110787188B - 小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用；并涉及一种制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物的方法。实验证明小鼠脐带间充质干细胞有效改善小鼠烫伤后血脑屏障通透性的改变。

Description

小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏 的应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用，特别是在小鼠皮肤烫伤后的血脑屏障功能保护的应用。

背景技术

间质干细胞最初是特指骨髓基质细胞，后来研究发现在胎儿肝脏、肺脏、心脏等实质脏器、脐带及脐带血中均提取到了与骨髓基质细胞生物学特性相似、免疫表型相同的干细胞，因此将间质组织来源的与骨髓MSCs生物学性状相似，具有多向分化潜能的细胞统称为间质干细胞。MSCs是多潜能的成体基质细胞，能分化为多种间质起源的组织，如成骨、软骨和脂肪细胞，在特殊环境下，还能横向分化为肌细胞、神经细胞、血管内皮细胞、肝胰细胞等多种其他组织细胞。MSCs分裂40代后仍能维持转染基因的表达，是基因治疗的优良载体。已有大量动物试验表明脐带MSCs移植治疗肝脏损伤、移植物抗宿主病、神经系统疾病、糖尿病、骨质缺损有效。但是人间质干细胞的获取量并不大，现有技术也未公开有脐带间充质干细胞针对皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的治疗技术。

小鼠是常用的实验动物，一直以来分离小鼠间充质干细胞是开展干细胞诱导分化、干细胞治疗实验、干细胞模型研究的前提条件，是拓展小鼠作为实验动物在医学研究中广泛应用的有效手段。另一方面，小鼠作为动物模型的常用对象，在建立各种试验模型时，自身病理变化过程或致病因素在一定条件下作用，使其组织、器官或全身出现一些非预期的病理损伤(如烧烫伤)，而这种非预期的病理损伤极大的影响了原模型试验的准确性，例如非预期的皮肤烫伤导致小鼠血脑屏障功能的损坏会影响预期的其他因素对血脑屏障破坏的试验研究；因此，如何对小鼠血脑屏障的非预期诱因——皮肤烫伤进行排除具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的应用。

小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案的所述小鼠脐带间充质干细胞采用以下方法制备：

(1)获取胎鼠的脐带；

(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2ml I型胶原酶，放入38摄氏度孵箱中孵育2小时；

(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2ml DMEM培养基，放入离心机中离心；

(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；

(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。

本发明所述间充质干细胞在进一步的方案中PN以P3-P4最为适宜。

本发明另一方面还公开了一种保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物的制备方法，包括下述步骤：

1)将P3代小鼠细胞使用细胞计数器计数，约为5-6*10⁶/ml；

2)2mlPBS清洗2遍，加入1ml胰酶，放入37氏度孵箱中孵育2分钟；

3)显微镜下观察细胞全部悬浮后，加入3mlDMEM混匀后，吸入15ml离心管中；

4)放入离心机中离心；

5)取出离心管，去除上清，加入500ul生理盐水，混匀，即得保护保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的注射剂。

本发明公开了小鼠脐带间充质干细胞在保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物应用的方法，包括下述步骤：

建立小鼠皮肤烫伤模型；

在小鼠烫伤后0-1小时内，注入50-200ul混有小鼠脐带间充质干细胞的生理盐水。

本发明另一方面对药物的施用时间进行限定，药物施用时间以小鼠烧伤后0-1小时为宜，以小鼠烧伤后1小时最佳。

本发明提出小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。实验证明可以有效改善小鼠烫伤后血脑屏障通透性的改变，采用小鼠脐带间充质干细胞制备得到的保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物帮助患者减少药物治疗的种类和数量以及药物带来的各种副作用；而小鼠脐带来源的间质干细胞培养技术可控，并安全性好，治疗费用的接受程度好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简要介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可根据这些附图获得其他的附图。

图1为10kDa荧光示踪剂测定对照组烧伤后不同时间BBB的通透性改变；

图2、图3为10kDa荧光示踪剂测定试验组烧伤后不同时间BBB的通透性改变。

具体实施方式

为了使本申请的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

实施例1小鼠脐带间质干细胞体外分离、培养

干细胞的来源为通过胎鼠来源细胞经体外扩增培养而成

(1)获取胎鼠的脐带；

(1.1)处死孕龄19-20天的C57孕鼠，将其浸泡酒精消毒；

(1.2)剪开小鼠腹部，暴露腹腔，分离胎鼠放置在无菌的培养皿或操作盘中；

(1.3)剪开胎膜暴露胎鼠及胎盘，暴露脐带，并用8cm止血钳固定脐带两端，在其外侧剪断脐带，并将分离后的脐带放入无菌培养皿中，重复上述步骤直到全部胎鼠脐带被分离；

(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2ml I型胶原酶，放入37摄氏度孵箱中孵育2小时；

(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2mlDMEM培养基，放入离心机中离心，离心转速为1000rpm，时间为5min；

(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；

(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。

上述步骤中的所述DMEM培养基含有10％胎牛血清及1％青链霉素。

上述步骤中的间充质干细胞的传代PN在一些示例中选用P3-P4。

在上述方法制备的小鼠脐带细胞还可通过下述方法进行冻存、复苏。

(6)小鼠脐带细胞冻存

消化贴壁细胞，加入0.1ml二甲基亚砜(DMSO)，0.9ml胎牛血清，移入细胞冻存管；

冻存细胞(4℃，1小时；-20℃，4小时；-70℃，12小时；液氮罐保存)。

(7)小鼠脐带细胞复苏

取出冻存管，立即放入37℃水浴中，摇动，迅速解冻；

吸管吸出细胞悬液，放入离心管，加入10ml PBS，吹打；

离心(常温，5min)，弃上清，重复一次；

加入L-DMEM完全培养液接种于培养瓶中。

对获取的小鼠脐带细胞进行鉴定。

(8)小鼠脐带细胞的鉴定

(8.1)细胞总数

测量细胞悬液的总体积。吸取0.1ml混匀的细胞悬液，滴于细胞计数板上，计数。计算出细胞总数。

(8.2)活细胞比例

进行台盼蓝染色，计数采集细胞中活细胞所占比例。

(8.3)流式细胞仪检测细胞表面标志

取各代MSCs与FITC或PE标记的CD14、CD29、CD14、CD44、CD45、CD105作用，流式细胞仪检测。结果显示CD14、CD14和CD45为阴性，CD29、CD44和CD105为阳性，呈现为间质干细胞的特征。

(8.4)脐带细胞染色体核型测定

实施例2治疗小鼠烫伤后血脑屏障通透性的小鼠脐带间充质干细胞药物的制备

1)将新鲜获取的P3代小鼠细胞或解冻后的P3代小鼠细胞使用细胞计数器计数，约为5-6*10⁶/ml；

2)2mlPBS清洗2遍，加入1ml胰酶，放入38摄氏度孵箱中孵育2分钟

3)显微镜下观察细胞全部悬浮后，加入3mlDMEM(含10％胎牛血清及1％青链霉素)混匀后，吸入15ml离心管中；

4)放入离心机中离心，离心转速1000rpm，离心时间5min；

5)取出离心管，去除上清，加入500ul生理盐水，混匀，即得保护保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的注射剂。

实施例3小鼠脐带间充质干细胞治疗小鼠烫伤后血脑屏障通透性改变的应用

1.建立小鼠烫伤模型

选择健康7周龄小鼠随机分为6组，每组6只。将小鼠麻醉后备皮，使用剃毛器剔除小鼠背部皮肤毛发，大小为直径2cm。然后采用恒温恒压烫伤仪，在90-94℃的烫伤温度对小鼠背部烫伤3s，烫伤压力为500g。

2、选取1组为对照组，对照组烫伤前经鼠尾静脉每只小鼠按0.5ml/kg注入10kDa荧光示踪剂，每组小鼠在烫伤后0、1、3、6、12小时通过股动脉放血活杀后取额叶皮质等部分的脑组织，测量对照组小鼠烧伤后各个时间点的Dextran含量；结果如图1所示。

图1所示为10kDa荧光示踪剂测定对照组小鼠烧伤后在不同时间点的Dextran含量测量值，结果表明，对照组烧伤后不同时间点的BBB通透性改变较大，其中6小时的Dextran含量最高，即6小时后BBB通透性增加最为显著。

3、其中5组小鼠为试验组，烫伤前经鼠尾静脉每只小鼠按0.5ml/kg注入10kDa荧光示踪剂，在试验组小鼠烫伤后的0min、、30min、、60min，120min的时间点分别注入100ul混有小鼠脐带间充质干细胞的生理盐水；每组小鼠在烫伤后6小时通过股动脉放血活杀后取额叶皮质等部分的脑组织，测量试验组小鼠烧伤后6小时的Dextran含量。

实验结果：图2-3所示为10kDa荧光示踪剂测定不同时间点注射MSC的试验组小鼠在6小时后的Dextran含量测量值，与未注射MSC的对照组小鼠在6小时后的Dextran含量测量值的对比；结果表明，烧伤后注射MSC对小鼠BBB的通透性改变较大，其中烧伤后1小时注射效果最为显著。

实验证明，小鼠脐带间充质干细胞可以有效改善小鼠烫伤后血脑屏障通透性。

以上所述的实施方式，并不构成对该技术方案保护范围的限定。任何在上述实施方式的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在该技术方案的保护范围之内。

Claims (9)

1.小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述小鼠脐带间充质干细胞采用以下方法制备：

(1)获取胎鼠的脐带；

(2)将胎鼠的脐带放入培养皿中，剪碎，并倒入1-2ml I型胶原酶，放入38摄氏度孵箱中孵育2小时；

(3)取出培养皿，将其内容物吸取到15ml离心管中，加入1-2mlDMEM培养基，放入离心机中离心；

(4)取出离心管，吸除上清，加入1mlDMEM培养基，将沉淀吹打均匀，吸出加入含有10mlDMEM培养基的培养皿中，并放入37摄氏度孵箱中孵育24小时为P1；

(5)24小时后，取出培养皿并换液，待细胞长到80％进行传代，直到传到PN，即可；其中，PN为P2、P3、P4、P5或P6。

3.根据权利要求2所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述步骤(1)具体步骤为：

(1.1)处死孕龄19-20天的C57孕鼠，将其浸泡酒精消毒；

(1.2)剪开小鼠腹部，暴露腹腔，分离胎鼠放置在无菌的培养皿或操作盘中；

(1.3)剪开胎膜暴露胎鼠及胎盘，暴露脐带，并用8cm止血钳固定脐带两端，在其外侧剪断脐带，并将分离后的脐带放入无菌培养皿中，重复上述步骤直到全部胎鼠脐带被分离。

4.根据权利要求2所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述步骤(3)中的离心转速为1000rpm，时间为5min；所述DMEM培养基含有10％胎牛血清及1％青链霉素。

5.根据权利要求2所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述PN为P3或P4。

6.根据权利要求1所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述药物的制备方法包括下述步骤：

1)将P3代小鼠细胞使用细胞计数器计数，约为5-6*10⁶/ml；

2)2mlPBS清洗2遍，加入1ml胰酶，放入37摄氏度孵箱中孵育2分钟；

3)显微镜下观察细胞全部悬浮后，加入3mlDMEM混匀后，吸入15ml离心管中；

4)放入离心机中离心；

5)取出离心管，去除上清，加入500ul生理盐水，混匀，即得保护保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的注射剂。

7.根据权利要求6所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述步骤3)中的离心转速为1000rpm，时间为5min。

8.根据权利要求6所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，所述DMEM培养基含有10％胎牛血清及1％青链霉素。

9.根据权利要求6所述小鼠脐带间充质干细胞在制备保护皮肤烫伤后血脑屏障功能损坏的药物中的应用，其特征在于，包括下述步骤：

建立小鼠皮肤烫伤模型；

在小鼠烫伤后0-1小时内，注入50-200ul混有小鼠脐带间充质干细胞的生理盐水。

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