CN108373995B

CN108373995B - 一种干细胞条件培养基、其制备方法和用途

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Publication number: CN108373995B
Application number: CN201810153151.9A
Authority: CN
Inventors: 朱丽萍; 陈露; 郭垚示; 项春生
Original assignee: Zhejiang Shengchuang Precision Medical Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Shengchuang Precision Medical Technology Co ltd
Priority date: 2018-02-14
Filing date: 2018-02-14
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2038-02-14
Also published as: CN108373995A

Abstract

本发明涉及一种干细胞条件培养基、其制备方法和用途。具体而言，其通过下述方法制备：(1)从经血获得宫血间充质干细胞；(2)将宫血间充质干细胞在不含抗生素的培养基中培养并传代至P5‑P10代；(3)将对数生长期的P5‑P10代宫血间充质干细胞在不含抗生素的无血清培养基中培养，在无血清饥饿条件下激活培养24‑48h；(4)取上清液过滤去除其中的宫血间充质干细胞，获得滤液，即干细胞条件培养基。本发明方法简单，不引入外源物，可以减少过敏等副作用。此外该条件培养基具有很好的体外，体内抗氧化衰老的作用。

Description

一种干细胞条件培养基、其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种干细胞条件培养基、其制备方法和用途。属于干细胞抗氧化衰老领域。

背景技术

皮肤指身体表面包在肌肉外面的组织，是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能。皮肤覆盖全身，它使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。随着年龄的增殖以及环境中有害因素的影响，皮肤会出现衰老、皱纹、暗沉、过敏、干燥、红血丝等一系列问题。皮肤衰老的表现主要有皮肤干燥、弹性减弱、表皮更新减慢、角质形成细胞活力下降、表皮受损后修复能力减弱等。皮肤衰老的主要原因之一是自由基过量，一方面受外界环境影响是皮肤自由基含量增多，另一方面随年龄增长，人体清除自由基能力下降，皮肤再生能力下降。

干细胞及其条件培养基已广泛显示出其在皮肤护理方面的应用。研究表面干细胞及其条件培养基具有显著的抗氧化能力，可有效清除过量的氧自由基，达到抗氧化衰老的效果。本发明人发现，使用无血清DMEM/F-12培养基培养宫血干细胞24h，饥饿状态可刺激宫血干细胞分泌多种细胞因子及外泌体等，这些细胞因子包括EGF、HGF、FGFs、PDGF、TGF-B、PGF、VEGF等。EGF，表皮细胞生长因子，能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。HGF、VEGF具有可抗血管内皮、心肌和肝细胞等凋亡，HGF还可抑制TGF-B表达抗纤维化。PDGF促进皮下血管形成，修复皮下血液微循环系统，促进胶原蛋白的合成，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，延缓衰老。

干细胞应用于护肤主要通过将干细胞制成冻干粉，再与其他多种化学成分混合制成，该种方法使干细胞的护肤功效大打折扣，且该种方法制成的护肤品多含有防腐剂、化学合成香精和着色剂、重金属、PEG人工合成乳化剂、从死亡动物身上提取的成分，长期使用会对人体产生伤害。

CN106967679A公开了一种抗衰老液的制备方法，所述抗衰老液为高浓度葡萄糖溶液激活的脐带间充质干细胞条件培养基，其特征为将间充质干细胞在终浓度为20～50mmol/L葡萄糖培养基中预处理48±2小时，收集所述间充质干细胞条件培养基，并浓缩纯化而制成。

但是，以CN106967679A为代表的传统的干细胞条件培养基制备方法多采用加入外源物(如高浓度葡萄糖，HCG等)刺激干细胞分泌细胞因子，且干细胞培养过程中使用抗生素，这会导致最终获得的条件培养基成分复杂，有抗生素残留，易引起过敏反应及其他副作用，缺乏安全性。

CN106318904A公开了间充质干细胞条件培养基用于美容品领域的用途。其将来源于脐带、胎盘、脂肪、骨髓、牙髓等组织，优选来源于脂肪的间充质干细胞先在含有青霉素和链霉素等抗生素的完全培养基中培养，然后在基础培养基中培养，离心、过滤从而得到间充质干细胞条件培养基。

但是，该专利申请所用间充质干细胞来源受到限制，在培养过程中使用抗生素，导致后期获得的条件培养基含有抗生素残留，造成过敏等不良副作用。同时，所获得的干细胞条件培养基的抗氧化活性尚有提高的余地。

CN106176563A公开了人脐带MSC无血清培养液脂质体冻干粉，其将人脐带间充质干细胞无血清培养液加入包含磷脂、胆固醇、脂溶性抗氧化剂等脂质体悬浮液中包封而成。但是其成分复杂，后期加工繁杂，而且在制备脂质体冻干粉的过程中使用35℃水浴及超声，这很容易导致人脐带MSC无血清培养液中有效成分失活。

由上可知，现有技术的干细胞条件培养基多来源于骨髓，脐带胎盘，脂肪干细胞等，存在取材困难、来源短缺、分化效率低等问题。

发明内容

本发明人通过采用宫血来源的间充质干细胞(以下可简称为宫血间充质干细胞或者宫血干细胞)，而克服了上述问题，并且意外地发现所获得的条件培养基具有比现有技术高得多的体外、体内抗氧化衰老的作用，由此完成本发明。

本发明的目的是制备一种宫血干细胞条件培养基，该培养基具有抗氧化衰老功效，可用于护肤或者应用于临床治疗体内的氧化损伤，如氧化应激引起的肺损伤。

本发明的干细胞条件培养基的制备方法，包括以下步骤：

(1)从经血获得宫血间充质干细胞；

(2)将步骤(1)获得的宫血间充质干细胞在不含抗生素的培养基中培养并传代至P5-P10代；

(3)将对数生长期的P5-P10代宫血间充质干细胞在不含抗生素的无血清培养基中培养，使之在无血清饥饿条件下激活培养24-48h；

(4)取上清液过滤去除其中的宫血间充质干细胞，获得滤液，滤液即所述干细胞条件培养基。

在一个实施方式中，在步骤(3)之前，通过对步骤(2)中获得的P5-P10代宫血间充质干细胞进行流式免疫表型检测、成骨成脂成软骨诱导分化检测和/或增殖能力检测，从而对所述宫血间充质干细胞进行选择。

在一个实施方式中，在所述流式免疫表型检测中，所选择的宫血间充质干细胞满足免疫表型CD29、CD44、CD73、CD90、CD105为阳性，且阳性率不低于90％；CD31、CD34、CD45、HLA-DR为阴性，阴性率不高于2％。

在一个实施方式中，在所述增殖能力检测中，所选择的宫血间充质干细胞的倍增时间为18小时以下。

在一个实施方式中，在步骤(2)中的所述不含抗生素的培养基为含10％FBS的DMEM/F-12培养基。

在一个实施方式中，在步骤(3)中的所述不含抗生素的无血清培养基为无血清DMEM/F-12培养基。

任选地，在上述步骤(3)中，在激活培养之前优选地将对数生长期的P5-P10代宫血间充质干细胞在不含抗生素的无血清培养基中低温静置一段时间，优选地，在无菌条件下于-2℃至-4℃下静止0.5-1.5小时，优选地1小时。进一步优选地，在低温静置之后和继续培养之前，将含宫血间充质干细胞的培养基逐渐升温至培养温度，例如1℃/min。

在一个实施方式中，在步骤(3)中的所述宫血间充质干细胞为P5代宫血间充质干细胞。

本发明还提供一种干细胞条件培养基，其通过权利要求1-7中任一项所述的方法制备。

本发明还提供上述干细胞条件培养基在制备用于抗氧化衰老的药物中的用途。

在一个具体实施方式中，本发明提供一种具有抗氧化衰老作用的干细胞条件培养基及其制备方法，所述条件培养基为宫血干细胞条件培养基，其特征为将汇合度达80％的P5代宫血干细胞在无血清培养基中处理24h，收集所述间充质干细胞条件培养基，离心去除死细胞，0.22μm滤膜过滤收集滤液所得。所述条件培养基可以制成冻干粉，更易于长久保存。

有益效果

本发明使用的宫血干细胞来源于18～45岁健康女性月经血，采用“月事杯”或“卫生棉”可轻松采集。宫血干细胞属于间充质干细胞的一种，数量为骨髓来源干细胞的30倍；其细胞活力更强，自我更新和增殖能力为骨髓干细胞的数十倍，分化潜能接近胚胎干细胞，具有更强的细胞因子分泌能力，只需无血清饥饿一定时间即可刺激其分泌大量细胞因子。且宫血干细胞在P2代及以后即采用无抗生素培养基培养，消除抗生素残留的可能。可以轻松有效解决以上问题。研究证明宫血干细胞在再生医学和美容行业具有巨大潜能，因此具有很大的应用价值。

本发明的优点具体可总结如下：

1.本发明采用宫血干细胞制备条件培养基，与骨髓、脐带胎盘和脂肪等来源干细胞比，宫血干细胞来源丰富，取材简单，分化能力强，分泌细胞因子能力强。

2.本发明使用无血清饥饿的方法制备条件培养基制，相对于现有的加入高浓度葡萄糖等各种试剂刺激的方法，该方法简单，易于操作，不引入外源物，可以减少过敏等副作用。

3.细胞试验和动物试验结果表明，该条件培养基具有很好的体外，体内抗氧化衰老的作用。

4.本发明所涉及的宫血干细胞条件培养基可制成冻干粉，应用于美容行业，有较好的抗氧化衰老作用。

5.本发明所涉及的宫血干细胞条件培养基可浓缩后，应用于再生医学，进一步研究后，用于治疗氧化应激造成的器官损伤，如肺损伤。

附图说明

图1：P5代宫血干细胞免疫表型检测结果

图2：成骨成脂成软骨诱导分化检测之前的未诱导宫血MSC形态

图3：成骨成脂成软骨诱导分化检测的成骨诱导结果

图4：成骨成脂成软骨诱导分化检测的成脂诱导结果

图5：成骨成脂成软骨诱导分化检测的成软骨诱导结果

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式详细地进行说明。

实施例1宫血干细胞的制备

一、细胞制备过程

25-35岁无妇科传染病的年轻女性使用月事杯或卫生棉条，收集经血(约8-10mL)。转移到经血采集液中，在获取样品后的24～48h内，送往处理实验室之前，置于4℃条件下进行运输或保存。在生物安全柜内用70微米滤网过滤，收集滤液，过滤后的全血2800rpm，升数5，降速1，离心10min，取上清5ml用于病原体检测，其余上清废弃，血细胞沉淀用一定体积的PBS(Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液)重悬(通常血细胞沉淀体积：PBS体积＝1∶1～1∶5)，将PBS和经血混合液用移液管小心轻轻的打入人外周血淋巴细胞分离液中，(两相千万不能相混)保证界面清晰明显，密度梯度离心，转速600-800g，升数5，降速1，离心14min，离心后小心吸取中间白膜部分于新的无菌的离心管中，1*PBS洗2次，1500rpm，离心6min。离心后弃上清，加入约5ml预热的含10％FBS的DMEM/F-12培养基，轻轻吹打混匀，移入培养瓶，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，代次计为P0。细胞融合度达80％以上时，吸出培养基，加入5ml PBS冲洗，吸出PBS，加入2ml胰酶，37℃消化2-5分钟；加入2ml含10％FBS的DMEM/F-12培养基中和胰酶，轻轻吹打几次，吸出细胞悬液至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟；离心后弃去上清，加入2ml含10％FBS的DMEM/F-12培养基，细胞计数，每瓶加入1×10⁶细胞/T₁₇₅瓶传代培养。

细胞常规培养至P5进行流式免疫表型检测，成骨成脂成软骨诱导分化检测，增殖能力检测，筛选出优质宫血干细胞，大量冻存，冻存同时进行微生物及内毒素检测。

二、检测结果

1.病原体及微生物检测

采用ELISA法、PCR法检测梅毒螺旋体、巨细胞病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒、EB病毒等特异性病毒，结果应为阴性；细胞按《中华人民共和国药典》2010年版三部附录XIIA规定的方法检测不得检出细菌、真菌，采用PCR法不得检出人型支原体，解脲支原体，细菌内毒素含量不得高于0.5EU/mL，细胞不得检出异性核型等。

2.流式表面marker检测

P5代宫血干细胞免疫表型CD29、CD44、CD73、CD90、CD105为阳性，阳性率应不低于90％，CD31、CD34、CD45、HLA-DR为阴性，阴性率应不高于2％。具体可参见图1。

3.成骨成脂成软骨诱导分化

可参见图2～图5。

由图看出，P5代宫血干细胞有较强的成骨成脂成软骨分化能力。

4.增殖能力检测

将生长良好的宫血干细胞经0.25％胰蛋白酶消化制成细胞悬液；计数后以2×10³/孔接种96孔培养板，每孔100μL，每块板设6个复孔；设空白对照，6个复孔，共7块板，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，分别在接种后的第24、48、72、96、120、144、168h，各取1板，每孔中加入CCK8溶液10μL，37℃，5％CO₂培养箱孵育4h，用酶标仪测定450nm和630nm波长下每孔吸光度值。同时1×10³cell/孔、2×10³cell/孔、4×10³cell/孔、8×10³cell/孔、1.0×10⁴cell/孔和2.0×10⁴cell/孔浓度铺入96孔细胞培养板，每孔100μL，共2块板，每个浓度6个复孔，用于绘制标准曲线。筛选出倍增时间18h以下的宫血干细胞作为优质细胞株。

实施例2宫血干细胞的条件培养基制备

取状态良好，免疫表型检测合格，三系分化能力强的P5代宫血干细胞，以1×10⁶cells/瓶接种至T₁₇₅细胞培养瓶，待细胞融合度达80％时，换新鲜无血清DMEM/F-12培养基，20ml/瓶，继续培养24h后收上清，离心除去死细胞，0.22μm滤膜过滤收集滤液，分装后存于-80℃冰箱或制成冻干粉。

实施例3人成纤维细胞培养

MRC-5，人胚肺成纤维细胞购自中科院上海细胞库，细胞汇合度达80％以上时0.25％胰酶消化1min左右镜下观察，消化时间为5min以内，70％细胞脱落后，加入含10％FBS的MEM培养基终止消化，轻轻吹打瓶壁，尽量减少细胞损失，收集细胞悬液，300g离心5min后弃上清，加入适量体积含10％FBS的MEM培养基重悬，进行传代扩增，冻存(冻存液配比MEM∶FBS∶DMSO＝7∶2∶1)或用于实验。培养基配比为MEM∶FBS＝9∶1。

实施例4具有抗氧化衰老作用的宫血干细胞的条件培养基功能验证

一、细胞试验

Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。取对数生长期MRC-5以5000个/孔接种于96孔板，分对照组、模型组和治疗组，每组6个复孔，贴壁过夜后模型组与治疗组加入终浓度80μM的H₂O₂，对照组不做处理，2h后，弃上清，对照组和模型组加入DMEM/F-12基础培养基，治疗组加入宫血干细胞条件培养基，100μl/孔，继续培养24h后弃上清，每孔加入100μl含10％CCK8检测液的DMEM/F-12基础培养基，孵育4h后于酶标仪检测450nm及630nm处吸光度值。

2.试验结果

活率计算公式：模型组活率＝OD模型组/OD对照组；治疗组活率＝OD治疗组/OD模型组

从上述结果可看出，模型组细胞活率75.22％，明显比对照组降低，表明H₂O₂处理造成了MRC-5活率降低，而治疗组细胞活率较模型组明显升高，并且平均OD值达到对照组水平，说明宫血干细胞条件培养基对H₂O₂造成的氧化应激损伤具有一定的治疗作用，表明宫血干细胞条件培养基具有抗氧化衰老的作用。

二、动物试验

C57BL/6J小鼠共60只，体重18±2g，随机分成3组。衰老模型制备及治疗：将60只小鼠分为3组，即正常对照组20只，给以相同体积生理盐水。衰老模型组20只，背部皮下注射D-半乳糖120mg/kg，1次/d，连续6周，造成衰老模型。治疗组20只，背部皮下注射D-半乳糖120mg/kg，1次/d，连续6周，造模第25d开始，每天静脉注射浓缩10倍后的干细胞条件培养基，300μl/次/只，6周后各组小鼠眼眶取血，3000rpm离心，10min，取血清，置于-20℃冰箱待测。按试剂盒说明书中方法测定血清中超氧化物歧化酶的活力和丙二醛的浓度。

从结果可以看出，模型组较对照组SOD水平降低，MDA水平升高，说明模型组小鼠体内存在氧化损伤，而使用宫血干细胞条件培养基治疗组较模型组SOD水平升高，MDA水平降低，基本达到对照组水平，说明宫血干细胞条件培养基有效降低了衰老小鼠体内的氧化损伤。

实施例5具有抗氧化衰老作用的宫血干细胞的条件培养基

取状态良好，免疫表型检测合格，三系分化能力强的实施例1所制备的P5代宫血干细胞，以1×10⁶cells/瓶接种至T₁₇₅细胞培养瓶，待细胞融合度达80％时，换新鲜无血清DMEM/F-12培养基，20ml/瓶。之后在无菌条件下于-2℃至-4℃下静止1小时，然后在1小时内逐渐升温至37℃后继续培养24h并收集上清，离心除去死细胞，0.22μm滤膜过滤收集滤液，分装后存于-80℃冰箱或制成冻干粉。

根据实施例4，同时对上述获得的条件培养基的功能进行验证，发现其平均OD值为0.7424，细胞活率为158.56％；SOD水平和MDA水平与实施例4中的治疗组相当。由于可见，经过培养前的低温静置，本发明条件培养基的活性显著增强。

在以上实施例中，本发明采用P5代宫血干细胞，待细胞融合度达80％时，换新鲜无血清DMEM/F-12培养基，在任选地低温静置后，继续培养24h后收上清，进一步处理后获条件培养基。但P6-P10代宫血干细胞也可用于条件培养基制备，其中换新鲜无血清DMEM/F-12培养基后也可培养48h收上清，获条件培养基。

本发明采用宫血干细胞制备条件培养基，与骨髓、脐带胎盘和脂肪等来源干细胞比，宫血干细胞来源丰富，取材简单。此外，本发明通过优质宫血干细胞筛选，筛选出免疫表型检测合格，三系分化能力强，细胞因子分泌能力强的宫血干细胞株。另外，本发明使用无血清饥饿的方法制备条件培养基，相对于现有的加入高浓度葡萄糖等各种试剂刺激的方法，该方法简单，易于操作，不引入外源物，可以减少过敏等副作用。细胞试验和动物试验结果表明，该条件培养基具有很好的体外，体内抗氧化衰老的作用。

Claims

1.一种抗氧化衰老的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从经血获得宫血间充质干细胞；

(3)将对数生长期的P5-P10代宫血间充质干细胞在不含抗生素的无血清培养基中培养，使之在无血清饥饿条件下激活培养24-48h，其中在激活培养之前将对数生长期的P5-P10代宫血间充质干细胞在不含抗生素的无血清培养基中无菌条件下于-2℃至-4℃下静置1小时；和

2.如权利要求1所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(3)之前，通过对步骤(2)中获得的P5-P10代宫血间充质干细胞进行流式免疫表型检测、成骨成脂成软骨诱导分化检测和/或增殖能力检测，从而对所述宫血间充质干细胞进行选择。

3.如权利要求2所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在所述流式免疫表型检测中，所选择的宫血间充质干细胞满足免疫表型CD29、CD44、CD73、CD90、CD105为阳性，且阳性率不低于90％；CD31、CD34、CD45、HLA-DR为阴性，阴性率不高于2％。

4.如权利要求2所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在所述增殖能力检测中，所选择的宫血间充质干细胞的倍增时间为18小时以下。

5.如权利要求1所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中的所述不含抗生素的培养基为含10％FBS的DMEM/F-12培养基。

6.如权利要求1所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中的所述不含抗生素的无血清培养基为无血清DMEM/F-12培养基。

7.如权利要求1所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中的所述宫血间充质干细胞为P5代宫血间充质干细胞。

8.如权利要求1所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，在低温静置之后和继续培养之前，将含宫血间充质干细胞的培养基逐渐升温至培养温度。

9.如权利要求8所述的干细胞条件培养基的制备方法，其特征在于，以1℃/min逐渐升温至培养温度。