KR20150029280A

KR20150029280A - 당뇨성 창상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물

Info

Publication number: KR20150029280A
Application number: KR20130108214A
Authority: KR
Inventors: 이성구; 김미형
Original assignee: (주)안트로젠
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-03-18

Abstract

본 발명은 당뇨성 창상 치유를 위해 인간의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포(stromal stem cell)를 고농도의 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 현탁한 약학 조성물 및 이들 조성물을 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)와 함께 체내에 이식하는 기술에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 줄기세포배양액을 포함하는 줄기세포 조성물은 줄기세포를 단독으로 사용하는 것에 비해 세포성장인자, 특히 혈관재생과 관련된 VEGF의 함량이 획기적으로 증가되어 임상적 용도로 더욱 적합하고, 특히 창상 치유를 위한 이식용 지방줄기세포 조성물을 scaffold와 함께 자가 또는 동종이식에 이용할 경우, 이식부위에서 지방 유래 중간엽 줄기세포에 의해 면역반응이 억제되어 창상 치유, 특히 당뇨성 창상 치유 증진을 위한 임상적 용도가 우수하다.

Description

당뇨성 창상 치유를 위한 자가 및 동종의 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물{AUTOLOGOUS AND ALLOGENIC ADIPOSE TISSUE-DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS COMPOSITION FOR TREATMENT OF DIABETIC WOUND}

본 발명은 당뇨성 창상 치유를 위해 인간의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기세포(stromal stem cell)를 고농도의 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 현탁한 약학 조성물 및 이들 조성물을 생분해성 중합체(biodegradable scaffold)와 함께 체내에 이식하는 기술에 관한 것으로, 중간엽 줄기세포는 자가 및 동종의 지방조직으로부터 얻을 수 있다.

골수, 지방 조직, 진피/피부 등과 같은 다양한 조직으로부터 단리될 수 있는 줄기세포는 스스로를 치유하는 신체 본연의 능력을 증진시키는 미래 임상 요법제로서 매우 유망하다. 재생의학에 이용 가능한 성체 줄기세포의 주된 공급원 중 하나인 골수는 체외에서 증식이 가능하고 근육세포, 심근세포, 뼈세포, 지방세포, 연골세포, 신경세포 등 다양한 세포로 분화가 가능하다. 또한, 골수는 면역조절 기능을 갖기 때문에 동종의 골수이식, 상처 치유 및 자가면역질환 등에 면역억제제로 사용할 수 있다. 하지만 이러한 세포의 사용은 여러 가지 기술적인 장애로 인해 제한된다. 이들 세포의 사용과 관련된 단점의 하나는 이들이 매우 희귀하기 때문에 (2,000,000개의 세포 중 1개에 불과함) 이들을 수득하고 단리하는 임의의 공정이 까다롭고 비용이 많이 들뿐 아니라 침습적인 방법을 사용하여 제공자에게 보편적으로 고통스럽다는 점이다.

지방 조직 또한 줄기세포를 다량 포함하고 있어, 지방 조직 유래 줄기세포를 생체 이식 재료로 이용하고자 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 지방 조직에는 신체의 어느 부위보다 많은 줄기세포가 존재하고(동량의 골수에서 분리할 수 있는 줄기세포의 1,000배 이상), 지방 조직 유래 줄기세포 역시 골수 줄기세포와 같은 다분화능을 가지고 있어 연골, 뼈, 지방, 근육세포 등으로 분화할 수 있다. 또한 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포는 골수 유래 줄기세포와 세포 표면 마커의 발현 양상이 유사하고 배양 과정에서 다양한 성장인자 및 생리활성물질을 분비하는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포가 분비하는 생물학적 활성인자들은 면역반응의 억제, 상처조직에서 섬유증(fibrosis)과 세포사멸(apoptosis)의 억제, 혈관형성 유도, 세포분열 자극 등의 기능을 가진다. 따라서, 줄기세포 배양액은 상처회복 촉진을 위한 의약품이나 화장품 조성물 등의 임상적 용도로 사용이 가능하다.

당뇨병이란 우리 몸이 섭취한 음식물을 적절하게 사용하지 못하여 혈액 속의 포도당(혈당) 수치가 정상인보다 훨씬 높은 상태를 지칭한다. 당뇨성 창상은 당뇨병 환자에게 나타나는 주된 합병증으로 주로 발 부위에 발생하여 당뇨발 혹은 당뇨족이라고도 하는데, 당뇨병으로 인한 혈액순환장애와 혈관 속 높은 당 수치가 신경세포를 죽여 감각을 무뎌지게 해 발생한다. 당뇨성 창상 치유 과정은 염증, 세포 이동/증식, 세포외 기질 침착 등을 포함한 다단계 생물학적 및 분자적 과정이 관여된다. 이러한 복구 과정은 다양한 성장 인자 및 사이토카인, 즉 인슐린양 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), TGF-β(transforming growth factor beta), VEGF(vascular endothelial growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), 신경성장인자(nerve growth factor, NGF), GM-CSF(granulocyte-macrophage colony stimulating factor), EGF(epidermal growth factor), 간세포성장인자(hepatocyte growth factor) 등의 작용을 통하여 진행되며, 또한 염증성 세포, 섬유아세포, 케라티노사이트 및 내피 세포와 같은 상이한 형태의 세포들의 상호 작용을 통하여 진행된다.

일반적인 상처는 창상 치유 과정의 순차적인 진행을 통하여 쉽게 치유될 수 있으나, 당뇨병 환자에서의 만성 상처는 성장 인자의 생성 감소, 혈관신생 감소, 그리고 케라티노사이트와 섬유아세포의 이동 및 증식 악화 등 여러 요인이 당뇨성 만성 상처의 치유 결손에 영향을 미친다(Eur J Cell Biol 81:153-60, 2002; Br J Surg 90:133-46, 2003). 정상 상처 육아조직에서 증가되어 있는 VEGF mRNA가 당뇨병 동물의 상처에서는 감소되어 있고, VEGF를 통해서 TGF-β, KGF와 같은 다른 성장인자도 조절한다는 보고도 있다(Diabetes 50:667-74, 2001; J Biol Chem 270:12607-13, 1995).

최근 줄기세포 연구가 활발해지면서, 당뇨를 유발시킨 쥐의 창상 부위에 줄기세포를 이식하여 당뇨성 창상을 치료하는 방법이 시도되고 있다(J Diabetes Res . 2013;2013:647107, Diabetes . 2013 Jul;62(7):2588-94, Plast Reconstr Surg . 2011 Oct;128(4):872-80). Maharlooei MK 등(Diabetes Res Clin Pract . 2011 Aug;93(2):228-34)은 지방 조직으로부터 분리한 성체 줄기세포가 이식된 당뇨 쥐에서 창상 치유력이 증가되었음을 보여주었다. 또한, 당뇨발 궤양 환자를 대상으로 각 환자의 복부에서 지방 조직을 흡입한 후 지방 조직 세포를 추출해 배양하지 않은 상태로 창상 부위에 도포한 결과, 8주 내에 모든 환자의 창상 부위가 완전히 치유되었음이 보고되었다.

또한, 지방 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 중간엽 줄기세포는 비교적 체외배양이 용이한 것으로 알려져 있다. 그러나, 중간엽 줄기세포의 배양에는 통상적으로 소혈청이 사용되는데, 소혈청이 함유된 배양액은 임상적 적용이 부적당하다. 즉, 세포 배양액의 임상적 적용을 위해서는 소혈청과 같은 동물 유래 단백질의 사용이 제한되므로, 줄기세포의 배양에는 소혈청을 배제하는 것이 바람직하다.

소혈청 단백질은 줄기세포의 증식 및 유지를 위해서 반드시 필요하다. 따라서, 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양할 경우에도 고농도의 생리활성물질을 함유하는 배양액을 얻을 수 있는 방법이 요구된다. 종래의 방법에서는 줄기세포를 단순히 2차원 배양하거나, VEGF 등의 함량을 높이기 위해 저산소 조건에서 2차원 배양을 실시하고 있을 뿐이다. 따라서, 무혈청 배지에서는 줄기세포가 안정적으로 유지되기 어렵다는 점을 고려하면, 종래의 방법으로는 줄기세포 배양액의 생리적 활성도가 저하되는 문제점이 있었다. 즉, 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있으며, 줄기세포 배양액을 1회 밖에 얻을 수 없다는 등의 문제가 있다.

이와 같은 종래의 방법에 따른 문제점을 고려하여, 본 발명에서는 무혈청 배지에서도 안정적으로 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법을 연구하였으며, 이 방법에 의해 얻어지는 지방 유래 중간엽 줄기세포와 고함량의 사이토카인 및 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액을 당뇨성 창상 치료에 사용하고자 하였다.

본 발명은 인간의 지방 조직에서 분리한 중간엽 줄기세포를 창상 치유, 특히 당뇨성 창상 치유 증진을 위해 사용하고자 한 것으로, 고농도의 성장인자, 특히 혈관재생능력이 탁월한 VEGF가 고함량으로 함유된 지방 줄기세포 배양액을 포함하는 당뇨성 창상 치료를 위한 지방 줄기세포 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 동종 또는 자가의 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포와 지방 줄기세포 배양액를 포함하는 당뇨성 창상 치유를 위한 지방 줄기세포 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명에서는 상기 다른 목적을 달성하기 위해,

(a) 지방 유래 중간엽 줄기세포를 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대배양하는 단계;

(b) 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 3차원 배양하는 단계;

(c) 배양 배지를 수집하는 단계; 및

(d) 단계 (b)에서 수집한 중간엽 줄기세포를 단계 (c)의 배양 배지에 현탁하는 단계를 포함하는 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물의 제조방법을 제공한다.

여기에서, 증식배지는 EGF(epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 것임을 특징으로 한다.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 배양하는 데 있어서 기저배지, 증식배지를 적절히 사용하여 배양함으로써, 다량의 중간엽 줄기세포를 단기간 내에 효과적으로 얻을 수 있도록 하였다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면 배양액을 얻는 과정에서 무혈청 배지 중 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양을 실시함으로써, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포배양액을 생산할 수 있다. 이처럼 본 발명의 방법에 따라 생산된 줄기세포 배양액은 종래의 세포배양법인 2차원 배양으로 생산된 배양액에 비해 특히 VEGF, EGF와 같은 성장인자의 함량이 월등히 높은 것을 특징으로 한다.

중간엽 줄기세포는 인간의 골수, 지방 조직, 제대혈 등에서 얻게 되므로 채취 가능한 양이 제한적이고, 이들 조직으로부터 얻어지는 중간엽 줄기세포의 양 또한 매우 한정적이다. 줄기세포 배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는, 한정된 수의 세포에서 다량의 줄기세포 배양액을 얻는 것과 배양액 중에 포함되어 있는 생리활성물질의 함량이 높은 것이 바람직하다.

위에 언급한 바와 같이, 일반적으로 중간엽 줄기세포를 배양하고 유지하기 위해서는 소 유래 혈청이 필요하지만, 세포배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는 배양액 중에 소 유래 혈청이 포함되지 않는 것이 바람직하다. 중간엽 줄기세포의 배양 배지에 소 유래 혈청이 포함되지 않을 경우 세포를 안정적으로 유지하기 어렵다.

본 발명에서는 소 유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액은 종래의 방법에 의해 생산된 배양액에 비해 매우 고함량의 성장인자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 배양 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액 중 포함된 VEGF(vascular endothelial growth factor) 함량은 종래의 배양방법에 비해 약 4배 증가하여 현저히 개선된 효과를 제공하며, 따라서 임상적으로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 줄기세포를 피브린 글루와 같은 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 실시할 경우, 세포배양을 위해 일반적으로 사용하는 플레이트를 사용하지 않고 간단한 형태의 바틀에서 배양이 가능하므로 매우 경제적이고 대용량의 배양액을 손쉽게 얻을 수 있다. 뿐만 아니라, 2차원 배양에서는 세포배양면의 크기에 따라 세포수가 제한되므로 줄기세포에서 분비되는 생리활성물질의 함량도 제한적인 반면, 본 발명에 따른 3차원 배양을 실시할 경우 세포수를 조정할 수 있으므로 배양액 중의 생리활성물질의 농도를 필요에 따라 증가시키는 것이 가능하다.

지방 조직 유래 중간엽 줄기세포를 본 발명에 따른 방법으로 배양할 경우, 줄기세포의 doubling time은 평균 48시간으로, 종래의 배양방법(WO 2007/011797)에 따른 평균 72∼120 시간에 비해 현저히 개선된 효과를 제공한다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 기존 배양법으로 배양한 줄기세포에 비해 근세포, 뼈세포 등으로 분화되는 능력이 더 우수하게 나타난다. 또한, 본 발명의 방법으로 배양한 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포는 고유의 면역조절능을 잘 유지하면서 더욱 우수한 효과를 나타낸다. 즉, 본 발명에 따라 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor)를 추가로 포함하는 증식배지에서 배양할 경우, 줄기세포의 고유한 성질인 다분화능 및 면역조절능을 더욱 잘 유지하므로 임상적으로 우수하다.

지방 조직 유래 중간엽 줄기세포는 동종의 면역세포에 대해 면역반응을 유발하지 않고 오히려 유도된 면역반응을 억제하는 면역조절 기능이 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 당뇨성 창상 치유를 위해 동종의 지방 줄기세포를 사용할 수 있음을 제시한다.

본 발명에서 당뇨성 창상 내부에 이식하기 위해 사용하는 중간엽 줄기세포는 자기 증식이 가능하고 다분화능을 보유하고 있으며, CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD71, CD90, CD105, Oct 4에 대해 양성이고 CD34, CD45, CD104, CD106, Stro-1 에는 음성인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어는 다음 의미를 갖는다.

"줄기세포 배양액"은 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 줄기세포 배양액은 줄기세포 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러 가지 생리활성 물질을 함유하고 있다.

"생체적합성 스캐폴드"는 세포와 친화성을 갖고, 이른바 "세포 접착성"인 표면을 지닌 재료로 만들어지며 세포를 3차원적으로 부착하고 배양시킬 수 있는 지지체를 의미한다. 천연 유래 지지체의 예로는 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산, 셀룰로오스 등을 들 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 합성 고분자의 예를 들면 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐알콜), 폴리안하이드라이드 등이 있으며 이에 한정되지는 않는다.

"지방 유래 중간엽 줄기세포(adipose-derived stromal stem cells)"는 스트로마-혈관 분획에서 얻어지는 중간엽 줄기세포를 의미한다. 지방 유래 줄기세포 (adipose-derived stem cells, ASC), 지방 유래 성체 줄기세포(adipose-derived adult stem cells, ADAS), 지방 줄기세포와 동일하게 표현될 수 있다.

"동종 이식"은 타인 또는 같은 종의 다른 개체로부터 특정 조직이나 장기, 또는 세포를 이식받는 것으로, 자기 조직이나 장기, 세포를 사용하지 못할 경우 다른 사람이나 다른 동물로부터 조직이나 장기 또는 세포를 이식받는 것을 의미한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 배양은 다음 과정에 따라 실시될 수 있으며, 세포배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지 않는다.

(1) 중간엽 줄기세포의 배양

해당 조직에서 얻은 중간엽 줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000∼40,000 세포/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24 시간 배양한다.

(2) 증식배지(expansion media)에서의 배양.

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성 세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1∼100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 또는 0.1∼100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 지방 유래 중간엽 줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 다량으로 증가시키는 작용을 한다.

(3) 계대 배양

세포가 배양용기 바닥의 80∼90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3∼1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.

(4) 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양

배양한 세포는 PBS로 3회 이상 세척하여 FBS를 제거해주고, 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드에 부착된 형태로 배양한다. 스캐폴드 내에서의 세포배양은 통상적인 세포배양 용기를 필요로 하지 않으므로, 무균 바틀 또는 culture bag에서 다량으로 배양이 가능하여 보다 낮은 비용으로 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다.

동종의 지방 유래 중간엽 줄기세포는 그 종류(개체)에 따라 면역조절능이 다르게 나타나므로, 적어도 1계대 이상 계대배양한 지방 유래 중간엽 줄기세포의 면역조절능 및 분비되는 성장인자의 농도를 확인하여 면역억제능력이 뛰어난 동종의 지방 유래 중간엽 줄기세포를 선택하여 사용할 경우 자가세포에 비해 임상적으로 효과적이다.

본 발명에 따라, 인간의 지방 조직에서 유래한 지방 유래 중간엽 줄기세포를 고농도의 세포성장인자를 포함하는 줄기세포 배양액에 현탁한 약학 조성물은 다분화능과 염증조절능이 매우 우수하다. 특히, 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 중 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양을 통해 얻은 줄기세포 배양액은 VEGF, EGF와 같은 성장인자를 고함량 포함하고 있어 혈관재생능력이 매우 우수하다.

따라서, 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 지방 유래 중간엽 줄기세포 및 줄기세포 배양액을 포함하는 약학 조성물은 지방 줄기세포의 생물학적 기능과 지방 줄기세포 배양액의 혈관재생능력이 함께 작용하므로 상처 치유, 특히 당뇨성 창상 치유를 증진시키는데, 특히 지방 줄기세포 조성물을 스캐폴드와 함께 자가 또는 동종 이식에 이용할 경우 이식부위에서 지방 유래 중간엽 줄기세포에 의해 면역반응이 억제되어 창상 치유, 특히 당뇨성 창상 치유의 임상적 용도에서 우수성이 있다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 2차원 배양(2D) 또는 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일째에 얻은 지방 줄기세포 배양액 중 EGF, VEGF, HGF, TGF β1의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 섬유아세포 배양 배지에 3차원 배양에서 얻은 줄기세포 배양액을 용량별로 첨가하여 배양한 후 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 배양 방법

지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3∼4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다.

스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지(10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지), 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖ 또는 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖, 또는 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖와 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지를 이용하여 증식시켰다. 지방 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3∼1:4로 희석하여 계대 배양을 실시하였다.

실시예 2: 인간 지방 줄기세포를 피브린 글루와 3차원 배양하는 방법

트립신 처리하여 단일세포로 얻어진 줄기세포를 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 1.3 × 10⁷개/㎖이 되도록 트롬빈 용액이 20% 포함된 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 용액을 첨가하여 세포를 현탁하였다. 피브리노겐은 DMEM/F12(페놀레드 미포함)로 1:2의 비율로 희석하여 사용하였다. 듀얼시린지를 이용하여 세포현탁액과 피브리노겐 희석액이 혼합되도록 한 후 바틀 또는 culture bag에 뿌려 피브린 응괴를 만들었다. 20-30분 후 피브린 응괴가 완전히 굳으면 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 5 ng/ml 표피세포 성장인자(EGF)가 포함된 DMEM/F12(페놀레드 미포함)를 세포 4 × 10⁷개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.

실시예 3: 줄기세포 배양액에 함유된 세포성장인자의 정량

줄기세포 배양액에 함유된 세포성장인자는 효소결합면역흡착법(ELISA)을 이용하여 분석하였다(R&D system). 96-웰 플레이트의 각 웰에 줄기세포 배양액 100 ㎕씩을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필요한 경우 배양액을 1:10∼1:100으로 희석하여 첨가하였다. 세척액으로 4회 세척한 후 성장인자를 인지할 수 있는 검출 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 streptavidin이 결합된 호스래디쉬-퍼옥시다제 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 20분 동안 반응시키고 기질용액(H₂O₂ 및 테트라메틸 벤지딘)을 넣어 발색시켰다. 2N H₂SO₄ 용액을 넣어 발색반응을 멈춘 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명에 따른 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액과, 종래의 플레이트 배양(2차원 배양, 2D)으로 배양 후 3일, 6일, 9일째 얻은 줄기세포 배양액에서 EGF, VEGF, HGF, TGF-beta 1을 정량한 결과를 다음 표 1과 도 1에 나타낸다.

다음 표 1은 3차원 배양(3D) 및 2차원 배양(2D) 후 줄기세포 배양액 중 함유된 세포성장인자의 함량을 나타낸 것이다.

		EGF	VEGF	HGF	TGF-β1
		pg/㎖/10⁶ 세포
3일째	2D	1092.35	6234.50	13201.55	2290.40
3일째	3D	18339.38	22935.06	11638.45	1727.10
6일째	2D	72.99	3446.95	10006.48	1355.79
6일째	3D	16162.13	16505.74	19368.41	1515.65
9일째	2D	2332.40	1737.33	6439.56	474.78
9일째	3D	13249.88	7465.54	17960.75	1279.91

표 1에서 보듯이, 줄기세포를 3차원 배양하였을 때 줄기세포 배양액 중의 세포성장인자의 함량이 크게 증가하였으며, 특히 EGF와 VEGF의 농도가 크게 증가한 것을 알 수 있다. EGF의 경우, 3일, 6일, 9일째 배양액에서 2차원 배양법에 비해 각각 16.8배, 221.4배, 5.7배 증가하였고, VEGF는 각각 3.7배, 4.8배, 4.3배 증가하였다. HGF는 3차원 배양에서 얻은 배양액 중 함량이 2차원 배양법에 비해 3일째에는 다소 낮았으나 6일, 9일째에 각각 1.9배, 2.8배 증가하였다. TGF-β1 또한, 3차원 배양법으로 얻은 배양액 중 함량이 6일째에 1.1배, 9일째에 2.7배 더 높게 나타났다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 2차원 배양(2D) 또는 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일째에 얻은 지방 줄기세포 배양액 중 EGF, VEGF, HGF, TGF β1의 함량을 나타낸 그래프이다. 도 1에서도 보듯이, 본 발명에 따른 배양 방법인 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일에 얻은 배양액중 VEGF 함량은 각각 22900, 16500, 7470 pg/㎖/10⁶ 세포였고, 종래의 배양 방법인 2차원 배양(2D)에서 각각 6230, 3450, 1740 pg/㎖/10⁶ 세포였다.

따라서, 본 발명의 방법에 따르면 줄기세포 배양 후 3, 6, 9일에 얻을 수 있는 배양액 중 VEGF 함량을 약 4배 증가시키는 효과가 있다. 특히 3일 배양액에서 EGF(epidermal growth factor)의 함량은 종래 배양방법에 비해 약 17배 증가한 것을 볼 수 있다.

실시예 4: 줄기세포 배양액 함유 배지에서 섬유아세포의 콜라젠 분비량 측정

섬유아세포(CCD-986sk)를 48-웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴ 개가 되도록 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 후 줄기세포 배양액을 DMEM으로 0.1%, 1%, 10%가 되도록 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 24시간 배양한 후 배양액을 채취하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 분석은 Procollagen type I peptide EIA kit(Takara)를 이용하여 실시하였으며, 줄기세포 배양액에 포함된 콜라겐 양으로 보정하였다. 다음 표 2는 줄기세포 배양액 함유량에 따른 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 나타낸 것이다.

		콜라겐의 상대적 증가량
대조군		1.00
EGF	10 ng/mL	1.31
3D 배양액	0.1%	1.63
	1.0%	2.03
	10.0%	3.45

표 2에 나타낸 바와 같이, 무혈청 DMEM 배지를 처리한 대조군에 비해 3차원 배양하여 얻은 줄기세포 배양액을 0.1%, 1.0%, 10.0% 첨가한 경우 콜라젠 합성량은 각각 1.63, 2.03, 3.45배 증가하였다. 양성 대조군으로 처리해준 EGF 10 ng/㎖와 비교하였을 때 줄기세포 배양액 0.1% 처리군의 효과가 더욱 우수하였다.

도 2는 섬유아세포 배양 배지에 3차원 배양에서 얻은 줄기세포 배양액을 용량별로 첨가하여 배양한 후 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

위 표 2 및 도 2에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액 조성물은 섬유아세포의 콜라젠 합성을 증가시키므로, 상처 치유를 목적으로 하는 의약품이나 화장품 조성물에 사용할 수 있다.

Claims

동종 또는 자가의 지방 조직 유래 중간엽 줄기세포와 지방 줄기세포 배양액를 포함하는 당뇨성 창상 치유를 위한 지방 줄기세포 조성물.
(a) 지방 유래 중간엽 줄기세포를 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대배양하는 단계;
(b) 계대배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 3차원 배양하는 단계;
(c) 배양 배지를 수집하는 단계; 및
(d) 단계 (b)에서 수집한 중간엽 줄기세포를 단계 (c)의 배양 배지에 현탁하는 단계를 포함하는 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물의 제조방법.
제 2 항에 있어서, 증식배지는 EGF(epidermal growth factor) 또는 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 단계 (b)에서 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 따른 방법으로 제조된, 당뇨성 창상 치유를 위한 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물.
제 5 항에 있어서, 당뇨성 창상 내부에 투여하기 위한 것임을 특징으로 하는 지방 유래 중간엽 줄기세포 조성물.