KR20180111674A - 중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법 - Google Patents

중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출할 경우, 균일한 크기의 엑소좀을 보다 높은 수율로 수득할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명 따른 방법을 고순도, 고농도 엑소좀 추출방법으로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법{Media including mesenchymal stem cells derived high purity and high concentration exosome and the producing method thereof}
본 발명은 중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포 유래 고순도, 고농도 엑소좀을 포함하는 배양액에서 고순도, 고농도 엑소좀을 추출하는 방법 및 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 고순도, 고농도 엑소좀에 관한 것이다.
인간의 골수에는 몇 가지 종류의 전구세포(progenitor)가 존재하는 것이 발견되었으며, 이들 중 다분화능을 나타내는 전구세포를 중간엽줄기세포(Mesenchymal Stem Cells; MSC)라 칭한다. 중간엽줄기세포는 골수뿐 아니라 지방, 간, 근육 등 신체 대부분의 장기에 존재하는 것으로 알려져 있다. 중간엽줄기세포는 자가증식능이 있고, 골아세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 근세포(myocytes), 골수기질세포(marrow stromal cells), 건-인대 섬유아세포(tendonligamentfibroblasts), 지방세포(adipocytes) 등으로 분화할 수 있다.
이러한 중간엽줄기세포는 중간엽줄기세포 자체의 분화 기능보다는 중간엽줄기세포가 분비하는 여러 가지 인자들(paracrine/secretory factors), 예를 들어 케모카인(chemokine), 사이토카인(cytokine), 성장인자(growth factors) 등이 줄기세포의 효과를 대변하는 것으로 주목받고 있다. 또한, 중간엽줄기세포는 이러한 인자들뿐만 아니라 세포외 소포체(extracellular vesicle; EV)를 분비하는 것으로 알려져 있으며 세포외 소포체가 세포간의 신호전달을 통해 세포의 운명, 기능, 분화 등 다방면으로 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
한편, 세포외 소포체는 세포가 세포외로 분비하는 막 구조의 소포체의 총칭으로 마이크로소포체(microvesicle), 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 사멸체(apoptotic body) 등으로 구분된다. 이중 엑소좀은 약 40 ~ 150 nm의 직경과 1.09 ~ 1.18 g/ml의 밀도를 가지는 세포외 소포체로 정의되는데 다양한 종류의 세포 활성 기능이 있다. 엑소좀은 다양한 종류의 체액, 예를 들어 침, 소변, 혈장, 혈청, 양수로부터 분리할 수 있고 여러 종류의 세포배양 상층액에서도 분리가능하다.
아울러, 순수하게 분리한 엑소좀은 in vitro와 in vivo에서 임상적 치료효능이 있는 것으로 밝혀지고 있어 그동안 중간엽줄기세포를 이용하여 시도되던 여러 질환들에 대해 엑소좀이 새로운 대안으로 떠오르고 있다. 또한 엑소좀은 면역조절, 세포간 신호전달 역할을 하며 세포의 기능적 변화를 유도해 세포재생 프로그램을 활성화시키며, 무세포계(cell free system)이므로 종양 형성의 위험이 없고 동결보존제 없이 영하 20℃에서 6개월간 생물학적 활성이 유지되는 상태로 보존되며 캡슐화(encapsulation) 되어 있어 엑소좀 내 물질(cytokine, growth factor, mRNA, miRNA 등)이 분해되지 않는 장점이 있다.
다만, 엑소좀의 이러한 우수한 효과에도 불구하고 중간엽줄기세포 배양액에서 고순도의 엑소좀을 고농도로 분리하는 기술적 어려움이 존재하므로, 고순도의 엑소좀만을 고농도로 분리하는 기술이 요구되고 있다.
또한, 엑소좀 분리방법 중 가장 보편적으로 쓰이는 초원심분리 (Ultracetrifugation)는 한 번에 다량의 엑소좀을 분리할 수 있는 장점이 있지만, 고가의 장비가 필요하고 분리하는데 많은 시간이 소요되며 강한 원심분리로 인해 엑소좀에 물리적으로 손상이 발생할 수 있고, 특히 분리된 엑소좀의 순도가 떨어지는 등의 단점이 있다. 이러한 단점을 개선하기 위한 방법 중, 엑소좀의 막 (membrane)에 존재하는 단백질인 포스파티딜세린(phosphatidylserine, PS)에 특이적으로 결합하는 물질을 이용함으로써 분리되는 엑소좀의 순도를 높인 PS 친화성 방법 (PS affinity method)이 있다. 이는 초원심분리 방법에 비해 높은 순도의 엑소좀을 분리할 수 있지만 수율이 낮다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 중간엽줄기세포 배양액으로부터 고순도의 엑소좀을 높은 수율로 추출하기 위해 노력한 결과, 본 발명에 따라 3차원 배양방법으로 배양하여 중간엽줄기세포 배양액을 수득하고, PS 친화성 방법을 이용하여 고순도 및 고농도의 엑소좀을 추출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명에 따른 방법을 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 분리방법으로 이용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 등록특허 제10-1663912호
본 발명의 목적은 종래 중간엽줄기세포 배양액에서 엑소좀을 고순도로 분리하기 어렵고, 종래 엑소좀 분리방법으로 분리한 엑소좀의 순도 또는 수율이 낮다는 단점을 해결함으로써, 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀을 추출하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양하고 배양액을 수집하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 수집한 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법을 제공한다.
본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출할 경우, 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 경우보다 균일한 크기의 엑소좀을 보다 높은 수율로 수득할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 방법을 중간엽줄기세포로부터 고순도, 고농도의 엑소좀 추출방법으로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(3D) 및 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(2D)의 크기별 분포데이터를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(3D) 및 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(2D)의 농도를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양하고 배양액을 수집하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 수집한 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 "중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)"는 자기 증식이 가능하고 다분화능을 가지고 있으며, CD73+, CD90+, CD105+, CD14-, CD20-, CD34-, CD45-인 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미하고, 골수, 지방조직, 제대혈, 간 또는 근육 등에서 분리될 수 있으며, 보다 구체적으로 지방조직에서 분리될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 특히 지방유래 줄기세포는 비교적 접근이 수월하고 채취가 간단하며 한 개체로부터 다량을 얻을 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에서, 상기 "배양액"은 중간엽줄기세포 배양액으로 중간엽줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 중간엽줄기세포 배양액은 중간엽줄기세포의 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러가지 생리활성 물질을 함유하고 있다. 또한 상기 "생리활성 물질"은 세포나 신체의 기능에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인, 세포성장인자, 면역조절인자 등을 통칭하는 것으로, 생리활성 물질의 예로는 VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), TGF-beta(Tumor growth factor-beta), IGF(Insulin growth factor) 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소포체(vesicle)로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로 상기 엑소좀은 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 40 내지 180 nm의 지름을 가지는 것이 바람직하고, 45 내지 140 nm의 지름을 가지는 것이 보다 바람직하며, 90 내지 140 nm의 지름을 가지는 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 1)에서 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 실시함으로써, 세포배양을 위해 일반적으로 사용하는 플레이트를 사용하지 않고 간단한 형태의 바틀에서 배양이 가능하며, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포 배양액을 생산할 수 있다. 또한, 종래의 세포배양방법인 2차원 배양으로 생산된 배양액에 비해 균질한 크기의 고순도 엑소좀의 함량을 월등히 높일 수 있다.
상기 단계 1)에서 중간엽줄기세포는 다음 단계로 배양한 것이 바람직하다:
a) 중간엽줄기세포를 기질배지에서 배양한 후 증식배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 세포를 증식배지에서 계대 배양하는 단계.
상기 배양방법에 있어서, 상기 기질배지는 무혈청기질배지 또는 혈청기질배지일 수 있고, 보다 구체적으로 혈청기질배지일 수 있다. 또한, 상기 증식배지는 무혈청기질배지 또는 혈청기질배지 일 수 있고, 보다 구체적으로 혈청증식배지일 수 있다.
상기 배양방법에 있어서, 단계 b)에서 세포를 증식배지에서 1 계대 이상 배양하는 것이 바람직하고, 2계대 이상 배양하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 증식배지는 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하고, 구체적으로 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖ 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 bFGF는 0.3 ~ 10 ng/㎖, 상기 EGF는 1 ~ 10 ng/㎖ 첨가하는 것이 보다 바람직하며, 상기 bFGF는 0.5 ~ 5 ng/㎖, 상기 EGF는 3 ~ 7 ng/㎖ 첨가하는 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단계 1)에서 무혈청 배지에 bFGF 또는 EGF 중 어느 하나 이상을 첨가하는 것이 바람직하고, 구체적으로 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖ 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 bFGF는 0.3 ~ 10 ng/㎖, 상기 EGF는 1 ~ 10 ng/㎖ 첨가하는 것이 보다 바람직하며, 상기 bFGF는 0.5 ~ 5 ng/㎖, 상기 EGF는 3 ~ 7 ng/㎖ 첨가하는 것이 보다 더 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단계 1)에서 생체적합성 스캐폴드는 세포 접착성인 표면을 갖는 세포지지체로서, 구체적으로 세포와 친화성을 가지며 세포 접착성인 표면을 지닌 재료, 예컨대 천연 또는 합성 고분자로 만들어지며, 세포를 3차원적으로 부착하고 배양시킬 수 있는 지지체를 의미한다. 상기 천연 고분자는 예를 들어 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산 또는 셀룰로오스일 수 있고, 상기 합성 고분자는 예를 들어 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐 알콜), 또는 폴리안하이드라이드일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단계 1)에서 3차원 배양은 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하고, 구체적으로 2일 내지 4일 간격으로, 보다 구체적으로 3일 간격으로 배지를 교환하면서 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하다. 특히, 한정된 수의 세포에서 다량의 줄기세포 배양액을 얻고 배양액 중에 포함되어 있는 엑소좀의 함량을 높이기 위해서는 3회 이상 배양액을 얻는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 2)에서 엑소좀은 다음 단계로 추출될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다:
i) 상기 단계 1)에서 수집한 배양액을 여과하는 단계;
ii) 여과액을 필터가 장착된 원심분리 튜브에 첨가하고 원심분리하여 상등액을 획득하는 단계; 및
iii) 상등액에서 엑소좀을 추출하는 단계.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 i)에서 배양액을 0.10 내지 0.30 ㎛ 메쉬 필터로 여과하는 것이 바람직하고, 0.15 내지 0.25 ㎛ 메쉬 필터로 여과하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 필터가 0.15 ㎛ 메쉬 미만일 경우 여과액 내에 엑소좀이 포함되지 않을 수 있고, 상기 필터가 0.30 ㎛ 메쉬를 초과할 경우 엑소좀 이외 세포외 소포체들이 여과되어 엑소좀을 고순도로 분리하는 것이 어려울 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 단계 ii)에서 여과액을 필터가 장착된 원심분리 튜브에 첨가하고 원심분리함으로써, 여과액을 농축할 수 있고 이를 통해 고순도의 엑소좀을 고농도로 얻을 수 있다.
상기 단계 ii)에서 필터가 장착된 원심분리 튜브는 80 내지 120 kDa MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터가 장착된 원심분리 튜브인 것이 바람직하고, 90 내지 110 KDa MWCO를 갖는 필터가 장착된 원심분리 튜브인 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 상기 단계 ii)에서 원심분리는 2,000 내지 4,000×g에서 45 내지 75분간 수행하는 것이 바람직하고, 2,500 내지 3,500×g에서 50 내지 70분간 수행하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지는 않는다.
상기 단계 iii)에서 상등액에 대해 크기-배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation), 분별 원심분리(differential centrifugation), 초원심분리(ultrafilteration), 면역흡착포획(immunoabsorbent capture), 친화성 방법(affinity method), 예를 들어, 친화성 포획(affinity capture), 친화성 정제(affinity purification), 면역분석법(immunoassay), 미세유체 분리(microfluidic separation) 또는 이들의 조합을 수행하여 엑소좀을 추출할 수 있고, 구체적으로 친화성 방법을 수행하여 엑소좀을 추출할 수 있으며, 보다 구체적으로 포스파티딜세린(phosphatidylserin; PS) 친화성 방법을 수행하여 엑소좀을 추출할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 엑소좀 추출 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 David W.Greening et al., 2015 및 Wataru Nakai et al., 2016 논문에 개시되어 있다.
본 발명에 따른 방법으로 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 것보다 고순도 및 고농도의 엑소좀을 추출할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법으로 40 내지 180 nm의 지름을 가지는 고순도의 엑소좀을 추출할 수 있고, 보다 구체적으로 45 내지 140 nm의 지름을 가지는 고순도의 엑소좀을 추출할 수 있으며, 보다 더 구체적으로 90 내지 140 nm의 지름을 가지는 고순도의 엑소좀을 추출할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 본 발명에 따른 방법으로 고농도의 엑소좀을 0.5×107 particles/ml 이상 추출할 수 있고, 보다 구체적으로 1×107 particles/ml 이상 추출할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서 본 발명에 따른 중간엽줄기세포의 3차원 배양은 다음 과정에 따라 실시될 수 있으며, 세포배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지 않는다.
(1) 중간엽줄기세포의 배양
해당 조직에서 얻은 중간엽줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000~40,000 cells/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24시간 배양한다.
(2) 증식배지(expansion media)에서의 배양
기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성 세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1~100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 및/또는 0.1~100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 중간엽줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 대량으로 증가시키는 작용을 한다.
(3) 계대 배양
세포가 배양용기 바닥의 80 내지 90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3~1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.
(4) 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양
배양한 세포는 PBS로 3회 이상 세척하여 FBS를 제거해주고, 무혈청 배지(페놀레드 미포함)에서 생체적합성 스캐폴드에 부착된 형태로 배양한다. 생체적합성 스캐폴드에 부착된 형태로 배양하기 위해서는 배양한 세포의 현탁액과 생체적합성 스캐폴드 재료 현탁액을 혼합한 후, 상기 혼합 현탁액을 무균 바틀 또는 culture bag에 뿌려 3차원 구조의 응괴를 형성한다. 응괴가 완전히 경화하면, 0.1~100 ng/㎖ 농도의 EGF 및/또는 0.1~100 ng/㎖ 농도의 bFGF를 포함하는 무혈청 배지(페놀레드 미포함)로 배양한다. 스캐폴드 내에서의 세포배양은 통상적인 세포배양 용기를 필요로 하지 않으므로, 무균 바틀 또는 culture bag에서 다량으로 배양이 가능하여 보다 낮은 비용으로 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 상기와 같은 방법으로 3차원 배양한 후, 0.22 ㎛ 메쉬 크기 필터를 이용하여 여과하고, 여과 후 회수한 여과액을 100 kD MWCO를 갖는 필터가 장착된 원심분리 튜브를 이용해 원심분리하여 농축하였다. 농축 후 수득한 상등액에서 엑소좀을 추출하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명자들은 상기 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 비교한 결과, 본 발명에 따라 추출된 엑소좀의 크기가 대부분 100~140 nm 정도로 균질한 크기를 가지며, 농도 또한 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀보다 현저히 높은 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출할 경우, 균일한 크기의 엑소좀을 보다 높은 수율로 수득할 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명에 따른 방법은 엑소좀을 고순도 및 고농도로 추출하는 데 있어 유용하게 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 비교예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 비교예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 인간 지방유래 중간엽줄기세포의 배양 방법
지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방유래 중간엽줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3~4회 세척하였다. 그 다음, 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20℃, 1,200 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액인 지방층을 제거하고 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁한 후, 20℃, 1,200 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다.
상기 스트로마-혈관 분획을 기질배지로 현탁하여 배양용기에 접종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지(10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지), 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)가 1 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지, 또는 기질배지에 표피세포 성장인자(EGF)가 5 ng/㎖ 농도로 포함된 배지를 이용하여 증식시켰다. 지방유래 중간엽줄기세포가 배양용기의 80~90% 정도로 자라면 트립신을 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3~1:4로 희석하여 계대 배양을 실시하였다.
< 실시예 2> 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 피브린 글루와 3차원 배양하는 방법
인간 지방유래 중간엽줄기세포를 피브린 글루와 3차원 배양하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 계대 배양한 중간엽줄기세포를 트립신 처리하여 단일세포로 얻은 후, DMEM/F12 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 그 다음, 1.6 × 107 개/㎖ 줄기세포에 트롬빈 용액이 20% 포함된 DMEM/F12 배지(페놀레드(phenol red) 미포함)를 첨가하여 세포를 현탁하였다. 피브리노겐은 DMEM/F12 배지(페놀레드 미포함)으로 1:2의 비율로 희석하였다. 듀얼시린지를 이용하여 상기 세포현탁액과 피브리노겐 희석액이 혼합되도록 한 후 바틀 또는 culture bag에 뿌려 피브린 응괴를 만들었다. 25분 후 피브린 응괴가 완전히 굳으면 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 5 ng/ml 표피세포 성장인자(EGF)가 포함된 DMEM/F12 배지(페놀레드 미포함)를 세포 4 × 107 개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.
< 실시예 3> 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀( exosome ) 추출
3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 2>에서 회수한 중간엽줄기세포 배양액을 0.22 ㎛ 메쉬를 갖는 필터를 이용하여 여과하였다. 여과 후 여과액을 회수하고, 이를 100 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터가 장착된 원심분리 튜브를 이용하여 3,000×g에서 60분간 원심분리하여 150배 농축하였다. 농축 후 수득한 상등액을 PS 친화성(PS affinity) 엑소좀 분리 키트(WAKO cat no. 293-77601)를 이용하여 엑소좀을 추출하였다.
< 비교예 1> 2차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀 추출
종래 2차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 본 발명에 따른 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 비교하기 위하여, 종래 2차원 배양방법으로 인간 지방유래 중간엽줄기세포를 배양하고, 엑소좀을 추출하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에서 계대 배양한 중간엽줄기세포를 트립신 처리하여 단일세포로 얻은 후, DMEM/F12 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 1.6 × 107개/㎖ 줄기세포에 DMEM/F12 배지을 첨가하여 세포를 현탁하여 접종하였다. 그 다음, 1 ng/㎖ 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 5 ng/㎖ 표피세포 성장인자(EGF)가 포함된 DMEM/F12 배지를 세포 4.0 × 107개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.
그 다음, 상기 회수한 세포 배양액을 상기 <실시예 3>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 여과하고 농축한 후 엑소좀을 추출하였다.
< 실험예 1> 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 특성 분석
종래 2차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 본 발명에 따라 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 크기 및 농도를 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>의 3차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(3D) 및 상기 <비교예 1>의 2차원 배양방법으로 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀(2D)을 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 사용하여 크기 및 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 크기는 40~600 nm로 나타났고, 농도는 5×106 particles/mL로 나타났다. 이를 통해 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 경우 엑소좀 이외 다양한 크기의 세포외 소포(extracellular vesicle)가 많이 혼재되어 있음을 확인하였다.
반면, 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 크기는 40~290 nm로 나타났고, 대부분의 엑소좀이 100~140 nm의 크기로 나타났으며, 농도는 1×107 particles/mL로 나타났다. 이를 통해 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 경우 100~140 nm 크기의 균질한 엑소좀을 수득할 수 있음을 확인하였다(도 1 및 도 2).
상기와 같은 결과를 통해 본 발명에 따라 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출할 경우 균질한 크기의 엑소좀을 수득할 수 있고, 종래 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 경우보다 엑소좀의 수득율을 높일 수 있음을 확인하였다.

Claims (13)

1) 중간엽줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양하고 배양액을 수집하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)에서 수집한 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 중간엽줄기세포는 다음 단계로 배양한 중간엽줄기세포인 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법:
a) 중간엽줄기세포를 기질배지에서 배양한 후 증식배지에서 배양하는 단계; 및
b) 상기 세포를 증식배지에서 계대 배양하는 단계.
제2항에 있어서, 상기 증식배지는 기질배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 또는 EGF(epidermal growth factor) 중 어느 하나 이상을 첨가한 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 무혈청 배지에 bFGF 또는 EGF 중 어느 하나 이상을 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 bFGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖, 상기 EGF는 0.1 ~ 100 ng/㎖ 첨가된 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 생체적합성 스캐폴드는 세포 접착성인 표면을 갖는 세포지지체로서 천연 또는 합성 고분자인 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)에서 3차원 배양은 2 내지 4일 간격으로 배지를 교환하면서 3회 이상 줄기세포 배양액을 얻는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2)에서 엑소좀은 다음 단계로 추출되는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법:
i) 상기 단계 1)에서 수집한 배양액을 여과하는 단계;
ii) 여과액을 필터가 장착된 원심분리 튜브에 첨가하고 원심분리하여 상등액을 획득하는 단계; 및
iii) 상등액에서 엑소좀을 추출하는 단계.
제8항에 있어서, 상기 단계 i)에서 배양액을 0.10 내지 0.30 ㎛ 메쉬 필터로 여과하는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 ii)에서 필터가 장착된 원심분리 튜브는 80 내지 120 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 필터가 장착된 원심분리 튜브인 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 iii)에서 상등액에 대해 크기-배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation), 분별 원심분리(differential centrifugation), 초원심분리(ultrafilteration), 면역흡착포획(immunoabsorbent capture), 친화성 방법(affinity method), 예를 들어, 친화성 포획(affinity capture), 친화성 정제(affinity purification), 면역분석법(immunoassay), 미세유체 분리(microfluidic separation)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 수행하여 엑소좀을 추출하는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 40 내지 180 nm의 지름을 가지는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.
제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 2차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 추출한 엑소좀보다 고순도 및 고농도인 것을 특징으로 하는, 3차원 배양한 중간엽줄기세포로부터 고순도 및 고농도의 엑소좀 추출방법.

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