KR20120126284A - 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물에 관한 것으로, (a) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계; (b) 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 3차원 배양하는 단계; 및 (c) 배양 배지를 수집하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법에 따르면, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포배양액을 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 줄기세포 배양액 조성물은 종래의 방법에 따라 생산된 조성물에 비해 세포성장인자의 함량이 획기적으로 증가되어 임상적 용도로 더욱 적합하고, 특히 상처 치유나 화장품 조성물을 포함하는 임상적 용도에서 우수성이 있다.

Description

고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물{METHOD FOR PREPARATION OF MESENCHYMAL STEM CELL CULTURE COMPRISING HIGH CONCENTRATION OF CELL GROWTH FACTORS AND COMPOSITION PREPARED THEREFROM}

본 발명은 고농도의 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell) 배양액의 제조방법 및 이로부터 얻어진 조성물에 관한 것으로, 기존의 2차원적 배양법을 개선하여 3차원적 배양법에 의해 무혈청 배지에서도 중간엽 줄기세포를 안정적으로 장기간 배양할 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

인간의 골수에는 몇 가지 종류의 전구세포(progenitor)가 존재하는 것이 발견되었으며, 이들 중 다분화능을 나타내는 전구세포를 중간엽 줄기세포라 칭한다. 중간엽 줄기세포는 골수뿐 아니라 지방, 간, 근육 등 신체 대부분의 장기에 존재하는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포는 자가증식능이 있고 골아세포(osteoblasts), 연골세포(chondrocytes), 근세포(myocytes), 골수기질세포(marrow stromal cells), 건-인대 섬유아세포(tendon-ligament fibroblasts), 지방세포(adipocytes) 등으로 분화할 수 있다.

또한, 중간엽 줄기세포는 배양 과정에서 다양한 성장인자 및 생리활성물질을 분비하는 것으로 알려져 있다. 중간엽 줄기세포가 분비하는 생물학적 활성인자들은 면역반응의 억제, 상처조직에서 섬유증(fibrosis)과 세포사멸(apoptosis)의 억제, 혈관형성 유도, 세포분열 자극 등의 기능을 가진다. 따라서, 줄기세포 배양액은 상처회복 촉진을 위한 의약품이나 화장품 조성물 등의 임상적 용도로 사용이 가능하다.

그러나, 중간엽 줄기세포를 배양하기 위해서는 통상적으로 소혈청을 사용하는데, 소혈청이 함유된 배양액은 임상적 적용이 부적당하다. 즉, 세포 배양액의 임상적 적용을 위해서는 소혈청과 같은 동물 유래 단백질의 사용이 제한되므로, 줄기세포의 배양에는 소혈청을 배제하는 것이 바람직하다.

소혈청 단백질은 줄기세포의 증식 및 유지를 위해서 반드시 필요하므로, 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 배양하면서도 고농도의 생리활성물질을 함유하는 배양액을 얻을 수 있는 방법이 요구된다.

국내 특허공개 제10-2009-0001163호(2009. 01. 08)는 인간의 골수, 제대혈 또는 태반 조직으로부터 수득한 중간엽 줄기세포를 혈청 배지에서 배양 후 무혈청 배지에서 계대배양하고, 배양한 줄기세포에 저산소 배양의 물리적 자극을 가하여, 중간엽 줄기세포로부터 bFGF 또는 TGF-β를 대량으로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 유사하게, 국제공개 WO 2007/086637호(2007. 08. 02)에서는 포유동물의 지방세포에서 추출한 성체 줄기세포를 혈청 배지에서 배양 후 무혈청 배지에서 계대배양하고, 배양한 줄기세포에 저산소 배양, 자외선 조사, 영양분 결핍, 또는 기계적 마찰과 같은 물리적 자극을 가하고, 비타민 A, B, C, 또는 D를 배양액에 첨가하여 중간엽 줄기세포로부터 bFGF, VEGF 또는 TGF-β를 대량으로 생산하는 방법을 개시하고 있다. 또한, 국내 특허공개 제10-2010-0008763호(2010. 01. 26)에서는 인간 지방 조직 펠렛을 FBS, NAC 및 아스코르빈산을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하고, FBS, NAC, 아스코르빈산, 칼슘, rEGF, 인슐린 및 하이드로코르티손을 함유하는 Keratinocyte-SFM 배지로 2일마다 교체하면서 계대배양하고, Keratinocyte-SFM 배지에 부착되어 있는 줄기세포를 분리하여, NAC, 아스코르빈산, 칼슘, rEGF, 인슐린 및 하이드로코르티손을 함유하는 Keratinocyte-SFM 배지에서 추가 배양한 후, 배지를 수거하여 원심분리 및 여과에 의해 순수 세포 배양물을 수득하는 방법을 개시하고 있다.

즉, 종래의 방법에서는 줄기세포를 단순히 2차원 배양하거나, VEGF 등의 함량을 높이기 위해 저산소 조건에서 2차원 배양을 실시하고 있을 뿐으로, 무혈청 배지에서는 줄기세포가 안정적으로 유지되기 어렵다는 점을 고려할 때 줄기세포 배양액의 생리적 활성도가 저하되는 문제점이 있었다. 즉, 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있으며, 줄기세포 배양액을 1회 밖에 얻을 수 없다는 등의 문제가 있다.

본 발명은 고함량의 사이토카인 및 세포성장인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액을 얻기 위한 것으로, 무혈청 배지에서 안정적으로 중간엽 줄기세포를 배양하는 방법 및 이로부터 얻어진 줄기세포 배양액을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 따라 얻어진 다량의 생물학적 활성인자를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액 조성물은 상처 치유, 화장품 조성물 등에 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 다음 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법을 제공한다:

(a) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;

(b) 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 수집하여 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 3차원 배양하는 단계; 및

(c) 배양 배지를 수집하는 단계.

여기에서, (a) 중간엽 줄기세포의 배양은 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대 배양하는 것이 바람직하고, (b) 중간엽 줄기세포의 3차원 배양은 3일 간격으로 배지를 교환하면서 적어도 3회 이상 줄기세포 배양액을 얻는 것이 바람직하다. 그리고, 상기 무혈청 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor) 중 적어도 하나를 첨가하여 배양할 수 있다.

또한, 생체적합성 스캐폴드는 세포 접착성인 표면을 갖는 세포 지지체로서 천연 및 합성 고분자일 수 있으며, 예를 들어 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐 알콜), 폴리안하이드라이드 등이 포함된다.

상기 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 조성물은, 상기 방법에 따라 제조되어 다량의 성장인자와 사이토카인을 함유하며, 특히 VEGF 및 EGF를 고농도로 함유하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 중간엽 줄기세포 배양액 조성물은 종래의 배양액 조성물에 비하여 VEGF는 4 배 이상, EGF는 17 배 이상 함유한다.

또한, 본 발명에서는 이와 같이 다량의 성장인자와 사이토카인을 함유하는 중간엽 줄기세포 배양액 조성물을 포함하는 상처 치료제 및 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명은 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 효과적으로 배양하여 얻어지는 다량의 생리활성물질을 함유하는 줄기세포 배양액을 제조하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 배양에 사용하는 중간엽 줄기세포는 골수, 제대혈, 지방조직 등으로부터 얻을 수 있다. 특히 지방 유래 줄기세포는 비교적 접근이 수월하고 채취가 간단하며 한 개체로부터 다량을 얻을 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 배양하는 데 있어서 기저배지, 증식배지를 적절히 사용하여 배양함으로써, 다량의 중간엽 줄기세포를 단기간 내에 효과적으로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에서는 배양액을 얻는 과정에서 무혈청 배지 중 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양을 실시함으로써, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포배양액을 생산할 수 있다. 이처럼 본 발명의 방법에 따라 생산된 줄기세포 배양액은 종래의 세포배양법인 2차원 배양으로 생산된 배양액에 비해 VEGF, EGF와 같은 성장인자의 함량이 월등히 높은 것을 특징으로 한다.

중간엽 줄기세포는 인간의 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 얻게 되므로 채취 가능한 양이 제한적이고, 이들 조직으로부터 얻어지는 중간엽 줄기세포의 양 또한 매우 한정적이다. 줄기세포 배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는, 한정된 수의 세포에서 다량의 줄기세포 배양액을 얻는 것과 배양액 중에 포함되어 있는 생리활성물질의 함량이 높은 것이 바람직하다.

일반적으로 중간엽 줄기세포를 배양하고 유지하기 위해서는 소 유래 혈청이 필요한데, 세포배양액을 임상적 용도로 사용하기 위해서는 배양액 중에 소 유래 혈청이 포함되지 않는 것이 바람직하다. 중간엽 줄기세포의 배양배지에 소 유래 혈청이 포함되지 않을 경우 세포를 안정적으로 유지하기 어렵다.

본 발명에서는 소 유래 혈청이 포함되지 않은 무혈청 배지에서 중간엽 줄기세포를 안정적으로 배양할 수 있는 방법을 제공한다. 이 방법에 따라 얻어진 배양액은 기존의 방법으로 생산된 배양액에 비해 매우 고함량의 성장인자를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 배양 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액 중 포함된 VEGF(vascular endothelial growth factor) 함량은 종래의 배양방법에 비해 약 4배 증가하여 현저히 개선된 효과를 제공하며, 따라서 임상적으로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 줄기세포를 피브린 글루와 같은 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 실시할 경우, 세포배양을 위해 일반적으로 사용하는 플레이트를 사용하지 않고 간단한 형태의 바틀에서 배양이 가능하므로 매우 경제적이고 대용량의 배양액을 손쉽게 얻을 수 있다. 뿐만 아니라, 2차원 배양에서는 세포배양면의 크기에 따라 세포수가 제한되므로 줄기세포에서 분비되는 생리활성물질의 함량도 제한적인 반면, 본 발명에 따른 3차원 배양을 실시할 경우 세포수를 조정할 수 있으므로 배양액 중의 생리활성물질의 농도를 필요에 따라 증가시키는 것이 가능하다.

일반적으로 중간엽 줄기세포는 무혈청 배지에서 플레이트 배양을 할 경우 안정적으로 유지되지 않고 세포배양면으로부터 탈락되어 사멸하게 된다. 본 발명에서는 중간엽 줄기세포를 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양함으로써, 부착하여 자라는 성질을 가진 중간엽 줄기세포가 3차원 스캐폴드 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 하였다. 생체적합성 스캐폴드의 한 예로서 피브린글루를 사용할 경우, 중간엽 줄기세포는 14일 동안 적어도 80% 이상의 생존율을 나타냈으며, 2차원 배양에 비해 고함량의 VEGF를 지속적으로 분비하였다.

또한, 본 발명의 방법에 따르면, 무혈청 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및/또는 EGF(epidermal growth factor)를 첨가하여 배양할 경우 세포의 안정성 및 배양액 중 분비되는 성장인자의 함량을 증가시킬 수 있다.

본 명세서에서 "중간엽 줄기세포(mesenchy stem cells)"는 자기 증식이 가능하고 다분화능을 가지고 있으며, CD73+, CD90+, CD105+, CD14-, CD20-, CD34-, CD45-인 세포 표현형을 나타내는 세포를 의미하고, 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 분리될 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 "생리활성물질"은 세포나 신체의 기능에 영향을 미칠 수 있는 사이토카인, 세포성장인자 등을 통칭하여 나타낸다. 생리활성물질의 예로는 VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), HGF(hepatocyte growth factor), TGF-beta(Tumor growth factor-beta), IGF(Insulin growth factor)등을 포함하며, 이에 한정되지는 않는다.

"줄기세포 배양액"은 줄기세포를 배양한 세포배양 상등액을 지칭한다. 줄기세포 배양액은 줄기세포 배양 과정에서 세포로부터 분비되는 여러 가지 생리활성 물질을 함유하고 있다.

“생체적합성 스캐폴드”는 세포와 친화성을 가지며 이른바 “세포 접착성”인 표면을 지닌 재료로 만들어지며 세포를 3차원적으로 부착하고 배양시킬 수 있는 지지체를 의미한다. 천연 유래 지지체의 예로는 알지네이트, 단백질, 콜라젠, 피브린, 히알루론산, 셀룰로오스 등이 있고 이에 한정되지는 않는다. 합성 고분자의 예를 들면 폴리(알파-하이드록시산) 계열, 폴리(비닐 알콜), 폴리안하이드라이드 등이 있으며 이에 한정되지는 않는다.

본 발명은 중간엽 줄기세포에서 줄기세포 배양액을 얻는 방법을 개시하고 있는데, 이와 관련된 방법은 이미 여러 문헌에 발표된 바 있다(Dermatol. Surg. 2008, 34:1323-1326; J. Dermatol. Sci. 2007, 48:15-24; 대한민국특허등록 제10-0899329호). 본 발명에서는 종래의 방법을 개선하여 임상적으로 유용한 생리활성물질을 고농도로 함유하는 줄기세포 배양액을 보다 간편하게 대량 생산할 수 있는 방법을 제시한다. 구체적으로, 종래의 방법에서는 단순히 2차원 배양을 실시하거나 VEGF 등의 함량을 높이기 위해 저산소 조건에서 2차원 배양을 실시한 반면, 본 발명에서는 피브린 글루와 같은 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양을 수행하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따르면, 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 배양할 때 피브린 글루와 함께 3차원 배양을 실시함으로써, 인간 유래 성장인자, 특히 VEGF, EGF의 함량을 획기적으로 증가시킬 수 있다. 즉 2차원 배양에서는 저산소 조건을 주더라도 배양액 중 함유되는 VEGF 등의 함량을 높이는 데 한계가 있으며, 줄기세포 배양액을 1회 밖에 얻을 수 없지만, 3차원 배양에서는 줄기세포가 안정적으로 유지되면서 고농도의 세포성장인자를 지속적으로 분비하므로 3일에 한번씩 배양배지를 교환하면서 최소 3회 이상 배양배지를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 배양 방법에 따르면, 종래의 플레이트 배양과 달리, 바틀에서 배양이 가능하므로 대용량 생산이 가능하다.

본 발명에서 중간엽 줄기세포는 골수, 지방조직, 제대혈 등에서 얻을 수 있는데, 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 중간엽 줄기세포의 배양은 다음 과정에 따라 실시될 수 있으며, 세포배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지 않는다.

(1) 중간엽 줄기세포의 배양

해당 조직에서 얻은 중간엽 줄기세포를 기질배지에 현탁시켜 10,000?40,000 cells/㎠의 농도로 배양용기에 접종한 후 배양한다. 기질배지는 10% 우혈청이 포함되어 있는 DMEM 또는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth) 배지로, 약 24 시간 배양한다.

(2) 증식배지(expansion media)에서의 배양.

기질배지를 제거한 후, 증식배지에서 배양하여 부착성 세포를 증식시킨다. 증식배지는 10% 우혈청, 0.1?100 ng/㎖ 농도의 EGF(epidermal growth factor) 및/또는 0.1?100 ng/㎖ 농도의 bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하는 DMEM 또는 DMEM/F12로, 부착성인 중간엽 줄기세포를 신속하게 증식시켜 세포 양을 단기간에 대량으로 증가시키는 작용을 한다.

(3) 계대 배양

세포가 배양용기 바닥의 80?90%를 채우면 증식배지를 제거하고 트립신 처리를 통해 세포를 배양용기에서 떼어낸다. 계대배양을 위해서는 세포를 1:3?1:4로 희석하여 새로운 배양용기에서 증식배지와 함께 배양한다. 이와 같은 방법으로 추가적인 계대배양이 가능하다.

(4) 생체적합성 스캐폴드와 함께 배양

배양한 세포는 PBS로 3회 이상 세척하여 FBS를 제거해주고, 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드에 부착된 형태로 배양한다. 스캐폴드 내에서의 세포배양은 통상적인 세포배양 용기를 필요로 하지 않으므로, 무균 바틀 또는 culture bag에서 다량으로 배양이 가능하여 보다 낮은 비용으로 편리하게 배양할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 방법에 따르면 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지 중 생체적합성 스캐폴드를 이용하여 3차원 배양을 실시함으로써, 장기간 동안 세포를 안정하게 유지할 수 있어 다량의 세포배양액을 생산할 수 있으며, 특히 VEGF, EGF와 같은 성장인자의 함량을 획기적으로 증가시킬 수 있다. 또한, 종래의 플레이트 배양과 달리, 바틀에서 배양이 가능하므로 간편하고 매우 경제적이면서 대용량의 배양액을 손쉽게 얻을 수 있다.

그리고, 본 발명의 방법에 따라 얻어지는 줄기세포 배양액 조성물은, 종래의 방법에 따라 생산된 조성물에 비해 세포성장인자의 함량이 획기적으로 증가되어 임상적 용도로 더욱 적합하며, 특히 상처 치유나 화장품 조성물을 포함하는 임상적 용도에서 우수성이 있다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 2차원 배양(2D) 또는 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일째에 얻은 지방 줄기세포 배양액 중 EGF, VEGF, HGF, TGF β1의 함량을 나타낸 그래프이다.
도 2는 섬유아세포 배양 배지에 3차원 배양에서 얻은 줄기세포 배양액을 용량별로 첨가하여 배양한 후 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 배양 방법

지방 조직은 보통 지방 흡입술로 얻을 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.

지방 흡입에 의해 얻어진 지방 조직으로부터 다음과 같이 지방 줄기세포를 분리하였다: 혈액을 제거하기 위해 지방 조직을 같은 부피의 KRB 용액으로 3?4 회 세척하였다. 지방 조직과 같은 부피의 콜라게나제 용액을 넣어 37 ℃ 수욕에서 반응시켰다. 이를 원심분리용 튜브에 옮겨 넣고 20 ℃, 1200 rpm에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액인 지방층을 제거하고, 아래층인 콜라게나제 용액을 흔들리지 않도록 조심해서 분리하였다. 기질배지를 넣어 현탁시킨 후, 20 ℃, 1200 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이때, 아래에 가라앉는 것이 스트로마-혈관 분획으로, 상층액을 제거하였다.

스트로마-혈관 분획을 기질배지에 현탁시켜 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양하였다. 배양액 제거 후 인산염 완충용액으로 세척하고, 기질배지(10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지), 또는 기질배지에 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖ 또는 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖, 또는 섬유아세포 성장인자(bFGF) 1 ng/㎖와 표피세포 성장인자(EGF) 5 ng/㎖ 농도로 포함된 증식배지를 이용하여 증식시켰다. 지방 줄기세포가 배양용기의 80-90% 정도로 자라면 트립신 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 얻어진 세포를 증식배지로 1:3?1:4로 희석하여 계대 배양을 실시하였다.

실시예 2: 인간 지방 줄기세포를 피브린 글루와 3차원 배양하는 방법

트립신 처리하여 단일세포로 얻어진 줄기세포를 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 배지로 3회 세척하여 FBS를 제거하였다. 1.3 × 10⁷ 개/㎖이 되도록 트롬빈 용액이 20% 포함된 DMEM/F12(페놀레드 미포함) 용액을 첨가하여 세포를 현탁하였다. 피브리노겐은 DMEM/F12(페놀레드 미포함)로 1:2의 비율로 희석하여 사용하였다. 듀얼시린지를 이용하여 세포현탁액과 피브리노겐 희석액이 혼합되도록 한 후 바틀 또는 culture bag에 뿌려 피브린 응괴를 만들었다. 20-30분 후 피브린 응괴가 완전히 굳으면 1 ng/ml 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF) 및 5 ng/ml 표피세포 성장인자(EGF)가 포함된 DMEM/F12(페놀레드 미포함)를 세포 4 × 10⁷ 개 당 500 ㎖가 되도록 첨가하였다. 72시간 후 세포 배양액을 회수하고 새 배지를 첨가하는 방법으로 2회 더 세포 배양액을 회수하여 냉장 보관하였다.

실시예 3: 줄기세포 배양액에 함유된 세포성장인자의 정량

줄기세포 배양액에 함유된 세포성장인자는 효소결합면역흡착법(ELISA)을 이용하여 분석하였다(R&D system). 96-웰 플레이트의 각 웰에 줄기세포 배양액 100 ㎕씩을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 필요한 경우 배양액을 1:10?1:100으로 희석하여 첨가하였다. 세척액으로 4회 세척한 후 성장인자를 인지할 수 있는 검출 항체 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 2시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 4회 세척한 후 streptavidin이 결합된 호스래디쉬-퍼옥시다제 용액을 100 ㎕씩 첨가한 후 실온에서 20분 동안 반응시키고 기질용액(H₂O₂ 및 테트라메틸 벤지딘)을 넣어 발색시켰다. 2N H₂SO₄ 용액을 넣어 발색반응을 멈춘 후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명에 따른 3차원 배양(3D)으로 얻은 줄기세포 배양액과, 종래의 플레이트 배양(2차원 배양, 2D)으로 배양 후 3일, 6일, 9일째 얻은 줄기세포 배양액에서 EGF, VEGF, HGF, TGF-beta 1을 정량한 결과를 다음 표 1과 도 1에 나타낸다.

다음 표 1은 3차원 배양(3D) 및 2차원 배양(2D) 후 줄기세포 배양액 중 함유된 세포성장인자의 함량을 나타낸 것이다.

		EGF	VEGF	HGF	TGF-β1
		pg/㎖/106 세포
3일째	2D	1092.35	6234.50	13201.55	2290.40
	3D	18339.38	22935.06	11638.45	1727.10
6일째	2D	72.99	3446.95	10006.48	1355.79
	3D	16162.13	16505.74	19368.41	1515.65
9일째	2D	2332.40	1737.33	6439.56	474.78
	3D	13249.88	7465.54	17960.75	1279.91

표 1에서 보듯이, 줄기세포를 3차원 배양하였을 때 줄기세포 배양액 중의 세포성장인자의 함량이 크게 증가하였으며, 특히 EGF와 VEGF의 농도가 크게 증가한 것을 알 수 있다. EGF의 경우, 3일, 6일, 9일째 배양액에서 2차원 배양법에 비해 각각 16.8배, 221.4배, 5.7배 증가하였고, VEGF는 각각 3.7배, 4.8배, 4.3배 증가하였다. HGF는 3차원 배양에서 얻은 배양액 중 함량이 2차원 배양법에 비해 3일째에는 다소 낮았으나 6일, 9일째에 각각 1.9배, 2.8배 증가하였다. TGF-β1 또한, 3차원 배양법으로 얻은 배양액 중 함량이 6일째에 1.1배, 9일째에 2.7배 더 높게 나타났다.

도 1은 지방 유래 중간엽 줄기세포의 2차원 배양(2D) 또는 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일째에 얻은 지방 줄기세포 배양액 중 EGF, VEGF, HGF, TGF β1의 함량을 나타낸 그래프이다. 도 1에서도 보듯이, 본 발명에 따른 배양 방법인 3차원 배양(3D) 후 3일, 6일, 9일에 얻은 배양액중 VEGF 함량은 각각 22900, 16500, 7470 pg/㎖/10⁶ 세포였고, 종래의 배양 방법인 2차원 배양(2D)에서 각각 6230, 3450, 1740 pg/㎖/10⁶ 세포였다.

따라서, 본 발명의 방법에 따르면 줄기세포 배양 후 3, 6, 9일에 얻을 수 있는 배양액 중 VEGF 함량을 약 4배 증가시키는 효과가 있다. 특히 3일 배양액에서 EGF(epidermal growth factor)의 함량은 종래 배양방법에 비해 약 17배 증가한 것을 볼 수 있다.

실시예 4: 줄기세포 배양액 함유 배지에서 섬유아세포의 콜라젠 분비량 측정

섬유아세포(CCD-986sk)를 48-웰 플레이트에 웰 당 5 × 10⁴ 개가 되도록 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 배지를 버리고 PBS로 세척한 후 줄기세포 배양액을 DMEM으로 0.1%, 1%, 10%가 되도록 희석하여 각 웰에 첨가하였다. 24시간 배양한 후 배양액을 채취하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 분석은 Procollagen type I peptide EIA kit(Takara)를 이용하여 실시하였으며, 줄기세포 배양액에 포함된 콜라겐 양으로 보정하였다. 다음 표 2는 줄기세포 배양액 함유량에 따른 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 나타낸 것이다.

		콜라겐의 상대적 증가량
대조군		1.00
EGF	10 ng/mL	1.31
3D 배양액	0.1%	1.63
	1.0%	2.03
	10.0%	3.45

표 2에 나타낸 바와 같이, 무혈청 DMEM 배지를 처리한 대조군에 비해 3차원 배양하여 얻은 줄기세포 배양액을 0.1%, 1.0%, 10.0% 첨가한 경우 콜라젠 합성량은 각각 1.63, 2.03, 3.45배 증가하였다. 양성 대조군으로 처리해준 EGF 10 ng/㎖와 비교하였을 때 줄기세포 배양액 0.1% 처리군의 효과가 더욱 우수하였다.

도 2는 섬유아세포 배양 배지에 3차원 배양에서 얻은 줄기세포 배양액을 용량별로 첨가하여 배양한 후 섬유아세포의 콜라젠 합성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

위 표 2 및 도 2에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 얻어진 줄기세포 배양액 조성물은 섬유아세포의 콜라젠 합성을 증가시키므로, 상처 치유를 목적으로 하는 의약품이나 화장품 조성물에 사용할 수 있다.

Claims (9)

1. (a) 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계;
   (b) 2 계대 이상 배양한 중간엽 줄기세포를 무혈청 배지에서 생체적합성 스캐폴드와 함께 3차원 배양하는 단계; 및
   (c) 배양 배지를 수집하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포 배양액의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, (a) 중간엽 줄기세포의 배양은 중간엽 줄기세포를 기질배지 및 증식배지에서 배양한 후 계대 배양하는 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, (b) 중간엽 줄기세포의 3차원 배양은 3일 간격으로 배지를 교환하면서 적어도 3회 이상 줄기세포 배양액을 얻는 것임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 무혈청 배지에 bFGF(basic fibroblast growth factor) 및 EGF(epidermal growth factor) 중 적어도 하나를 첨가하여 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 생체적합성 스캐폴드는 세포 접착성인 표면을 갖는 세포 지지체로서 천연 및 합성 고분자인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 따른 방법으로 제조된 다량의 성장인자와 사이토카인을 함유하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 종래의 배양액 조성물에 대하여 VEGF를 4 배 이상, EGF를 17 배 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 중간엽 줄기세포 배양액 조성물.
8. 제 6 항에 따른 중간엽 줄기세포 배양액 조성물을 포함하는 상처 치료제 조성물.
9. 제 6 항에 따른 중간엽 줄기세포 배양액 조성물을 포함하는 화장품 조성물.

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