WO2018117573A1 - 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 - Google Patents

신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2018117573A1
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neural crest
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crest stem
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양영일
이원진
김종태
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인제대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a multi-layered cell sheet of adult peripheral nerve-derived neural crest stem cells (NCSCs) and a method of manufacturing the same, and to three-dimensional culture by incorporating adult peripheral nerve-derived neural crest stem cells in a hydrogel
  • the multi-layered cell sheet prepared by is applicable to the treatment of spinal cord injury disease or brain injury disease.
  • SCI Spinal cord injury
  • stem cell therapy for spinal cord protection and regeneration includes hematopoietic stem cells (HSCs), bone marrow, umbilical cord blood, mesenchymal stem cells (MSCs), Schwann cells; SCs), olfactory ensheathing cells (OECs), neural stem cells (NSCs), neural crest stem cells (NCSCs), etc., are reported to be applicable.
  • HSCs hematopoietic stem cells
  • MSCs mesenchymal stem cells
  • SCs olfactory ensheathing cells
  • NSCs neural stem cells
  • NCSCs neural crest stem cells
  • stem cell injection is mostly done through (1) direct injection into the spinal cord, (2) injection into the cerebrospinal fluid, and (3) intravenous injection.
  • the method of injecting stem cells directly into the spinal cord is most frequently performed because of the high rate of intracellular delivery of the administered cells.
  • such a direct injection method requires a needle to be inserted directly into the spinal cord, thereby causing additional damage as well as additional damage in proportion to the volume of the injected cell or drug.
  • the administered cells are damaged by excessive inflammatory reactions and free radicals in the damaged nerve tissue. Therefore, there is a need for a cell transplantation method capable of simultaneously increasing the delivery rate and survival rate of the damaged cells.
  • Epidural space has been used as a route of administration of various drugs since the late 19th century, and is still widely used as a route of administration of anesthetics and analgesics including painless delivery.
  • Drugs administered to the epidural space are known to have a central nervous system effect at the dose of about 1/10 as compared to intravenous administration. . Therefore, epidural administration is a method of selectively administering a high concentration of drugs to the spinal nervous system without direct contact and damage to the spinal nerves.
  • stem cell therapy in spinal cord injury is known to be the main mechanism of action of neuroprotection and regeneration by substances secreted from stem cells rather than direct cell replacement. It can be an effective way to deliver high concentrations of cell secretion without.
  • a support is most widely used as a carrier for local delivery of stem cell therapy to the spinal cord.
  • the scaffold can provide extracellular substrates essential for cell survival and function, thereby increasing the survival rate of cell therapy products.
  • the support is produced by using natural or synthetic polymers having biodegradation properties that are degraded in vivo in hydrogel and porous sponge types. Hydrogel is easy to manufacture in the desired shape and size compared to the porous sponge type support, there is an advantage that can be delivered by mounting the cell at a high density. On the other hand, due to its weak physical strength, it is difficult to fix it into the spinal cord, and it is the most widely used scaffold when mixed with stem cell therapy and injected into the spinal cord.
  • Porous sponge-type scaffolds are difficult to process in various sizes and shapes, but are easily applied to stem cell therapies when they are implanted into the spinal cord.
  • the porous sponge type scaffold is difficult to deliver high-density cells and has been suggested to cause foreign body reactions and inflammatory reactions due to crosslinking reactions to enhance physical properties.
  • a technique for preparing a stem cell therapeutic agent in the form of a cell sheet and delivering it locally in vivo has been reported.
  • a method of manufacturing a multi-layered cell sheet has been proposed by first stacking a single layered cell sheet recovered by using a pipette, a support membrane, a special manipulation device, and the like, in several layers.
  • the method of stacking monolayer cell sheets has been a problem that cell damage occurs due to limited supply of oxygen and nutrients to the inside of cell sheets when more than 5 layers are manufactured.
  • only multi-layer cell sheets having less than 5 layers have biological effectiveness. Turned out.
  • Overlapping process of monolayer cell sheet can be made by attaching three layers of cell sheets by stacking them at intervals of 4 to 5 days, but the total manufacturing time is 20 days or more, and the biological characteristics of the constituent cells in the cell sheet are changed. It may be possible, and the therapeutic effect of the multi-layered cell sheet may be obtained only through repeated transplantation after induction of angiogenesis in the three-layered cell sheet transplanted in vivo. In other words, when manufacturing a thick cell sheet by the known technology requires a lot of time and special culture vessels and manipulators, if not carefully manipulated during each process may damage the cell sheet, the process of detaching and moving the cell sheet The possibility of contamination in IAs is more likely than in a single culturing process, which may raise safety concerns.
  • the present invention provides a method for preparing a multilayer cell sheet through a three-dimensional single culture process by incorporating peripheral nerve-derived neural crest stem cells into a hydrogel using a biodegradable natural polymer hydrogel as a three-dimensional support.
  • the present invention is a hydrogel containing neural crest stem cells, the extracellular matrix secreted and accumulated by the neural crest stem cells, nerves including vascular growth factor, anti-inflammatory factor, neuroprotection / growth factor and neuroactive factor To provide a multi-layered cell sheet of ridge stem cells.
  • the present invention also provides a composition for treating spinal cord injury, a composition for treating brain injury, or a composition for treating peripheral nerve damage, comprising the multilayer cell sheet of the neural crest stem cells and a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention comprises the steps of (1) separating and culturing neural crest stem cells (NCSCs); (2) incorporating the cultured neural crest stem cells into a hydrogel; (3) culturing the hydrogel in which the neural crest stem cells are embedded under attachment culture conditions in which physical support is maintained; And (4) provides a method for producing a multi-layered cell sheet of neural crest stem cells comprising the step of culturing the hydrogel cultured in the step (3) in a floating culture condition that physical support is excluded.
  • NSCs neural crest stem cells
  • the present invention is a hydrogel containing neural crest stem cells, the extracellular matrix secreted and accumulated by the neural crest stem cells, nerves including vascular growth factor, anti-inflammatory factor, neuroprotection / growth factor and neuroactive factor
  • a multilayer cell sheet of ridge stem cells Provided is a multilayer cell sheet of ridge stem cells.
  • the present invention also provides a composition for treating spinal cord injury comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for treating brain damage comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a composition for treating peripheral nerve damage comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • the present invention relates to a multilayer cell sheet of neural crest stem cells and a method of manufacturing the same, using a biodegradable natural polymer hydrogel as a three-dimensional support, incorporating peripheral nerve-derived neural crest stem cells into a hydrogel three-dimensional single culture
  • a biodegradable natural polymer hydrogel as a three-dimensional support
  • peripheral nerve-derived neural crest stem cells into a hydrogel three-dimensional single culture
  • the neural crest stem cell multi-layered cell sheet can enhance physical properties through cell-cell junctions and cell-hydrogel polymers, and physiologically active factors and extracellular bioactive factors generated and secreted from neural crest stem cells during cell culture.
  • the substrate may be accumulated in the multilayer cell sheet to enhance the biological function of the multilayer cell sheet.
  • the multi-layered cell sheet of the present invention does not require any special apparatus to be manufactured, is easy to handle because of its good physical properties, and various growth and protection factors and extracellular matrix are sufficiently accumulated between cells to increase the survival rate of cells after transplantation. Due to the shrinkage caused by the thickness is also thin, nutrient transfer is easy. This seems to compensate most of the disadvantages of the existing cell sheet.
  • FIG. 1 shows a process for separating PN-NCSCs from peripheral nerves using collagen hydrogels.
  • Figure 2 shows the growth and migration of PN-NCSCs over time in the peripheral nerves embedded in collagen hydrogels.
  • FIG. 3 shows the results of staining the colony ability of PN-NCSCs obtained by selectively degrading collagen hydrogels with BMSC.
  • 4 is a graph showing the degree of clustering of PN-NCSCs and BMSC.
  • 5 shows the growth doubling time and cumulative graph of PN-NCSCs.
  • FIG. 7 shows the comparison of PC12 and BMSCs with no differentiated neuronal and glial specific immunoexpression properties of PN-NCSCs.
  • Figure 10 shows the results of comparing the embryonic neural crest cell specific mRNA expression of PN-NCSCs with PC12 and BMSC.
  • Figure 11 is a result of comparing the BMSC with the immune expression characteristics of neurons and glial cells after the formation of cell spheres to confirm the differentiation capacity of PN-NCSCs into in vitro neuronal cells.
  • Figure 13 is a comparison of the hydrogel composition for three-dimensional distribution and culture of PN-NCSCs.
  • Figure 14 shows the mRNA expression rate of uPA, tPA to mediate fibrinolysis of PN-NCSCs.
  • 17 is a result of comparing the apoptosis of the cells according to the three-dimensional culture environment of PN-NCSCs.
  • Figure 19 shows the cell layer overlapping in the multilayer cell sheet according to the number of cells of PN-NCSCs embedded in the hydrogel.
  • Figure 21 shows the accumulation of extracellular matrix (fibronectin, laminin, collagen type IV) in PN-NCSCs multilayer cell sheet.
  • FIG. 22 shows angiogenesis factor accumulation in PN-NCSCs multilayer cell sheet through mRNA expression.
  • FIG. 24 shows neuronal growth / protector accumulation in PN-NCSCs multilayer cell sheets via mRNA expression.
  • Figure 25 shows the neuroactivator accumulation in PN-NCSCs multilayer cell sheet through mRNA expression.
  • Figure 26 shows neuroactivator accumulation in PN-NCSCs multilayer cell sheet through mRNA expression.
  • FIG. 27 shows beta catenin and extracellular matrix binding (CD29) in PN-NCSCs multilayered cell sheets.
  • FIG. 28 is a result of comparing the survival rate of cells with BMSC after concentration-treated treatment of PN-NCSCs in SH-SY5Y cells treated with hydrogen peroxide to confirm the cytoprotective effect of PN-NCSCs.
  • FIG. 31 shows the results of immunostaining using BrdU antibody in comparison with BMSC to identify SH-SY5Y cells divided using a culture solution of PN-NCSCs.
  • FIG. 33 shows the results of comparing neurite outgrowths of SH-SY5Y cells treated with culture medium at different concentrations to confirm neurites and synapse formation of PN-NCSCs compared to NGF or BMSC.
  • FIG. 34 shows the neurite lengths of SH-SY5Y cells treated with the culture solution of PN-NCSCs compared to NGF or BMSC.
  • FIG. 35 shows the neurite connection of SH-SY5Y cells treated with the culture solution of PN-NCSCs compared to NGF or BMSC.
  • FIG. 36 shows the results of comparing the expression of TNF- ⁇ with BMSC by activating macrophages to confirm the inhibitory effect of PN-NCSCs and treating PN-NCSCs cultures at different concentrations.
  • Figure 37 shows the results of comparing the BMSC with reduced IL-1 ⁇ expression by activating the macrophages to determine the inflammation inhibitory effect of PN-NCSCs after treatment of PN-NCSCs culture medium by concentration.
  • 38 is a molecular image photograph showing the survival rate in the spinal cord at day 3 of the transplantation of PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted with spinal cord injury white paper, showing the result of increasing the number of cells remaining in the spinal cord in proportion to the number of PN-NCSCs cells.
  • FIG. 39 shows the result of PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted with spinal cord injury white paper attached to spinal cord and blood vessels in spinal cord growing into multilayer cell sheet.
  • FIG. 40 shows the results of survival for 3 days, 7 days, 14 days, and 28 days of PN-NCSCs multilayer cell sheets transplanted into the spinal cord of spinal cord injury rats.
  • Fig. 41 shows the differentiation characteristics of fibroblasts and vascular endothelial cells of PN-NCSCs multilayer cell sheets transplanted on injured spinal dura.
  • FIG. 47 shows axonal regeneration by morphometric measurement using Bodian's silver staining at 2 weeks of PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted into spinal cord outer membrane of spinal cord injury rats.
  • FIG. 48 shows the degree of neural circuit repair via neurograde neural tracing in the injured spinal cord at 4 weeks of transplantation of PN-NCSCs multilayered cell sheets implanted into the spinal cord outer membrane of spinal cord injury rats.
  • FIG. 49 shows the percentage of axons in the injured area through neuronal tracing in the injured spinal cord transplanted at 4 weeks of transplantation of the PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted into the spinal cord outer membrane of spinal cord injury white paper.
  • Figure 50 shows the inhibitory effect in the spinal cord through decreasing the expression of TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ of PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted into the spinal cord outer membrane of spinal cord injury rats.
  • FIG. 51 shows that the expression of neuroactive mRNA in the spinal cord after injury is increased in comparison with the spinal cord before injury of the PN-NCSCs multilayer cell sheets transplanted into the spinal cord outer membrane of spinal cord injury rats.
  • the present inventors have tried to improve the time and complicated process required in the production of thick multi-layered cell sheet by a known method, and to prevent various risks such as contamination.
  • Using a biodegradable natural polymer hydrogel as a three-dimensional support to provide a method for producing a multi-layered cell sheet through a three-dimensional single culture process by incorporating peripheral nerve-derived neural crest stem cells into the hydrogel.
  • the neural crest stem cell multilayer cell sheet can enhance physical properties through cell-cell junctions and cell-hydrogel polymers, and physiologically active factors and extracellular physiological factors generated and secreted from neural crest stem cells during cell culture.
  • the substrate may be accumulated in the multilayer cell sheet to enhance the biological function of the multilayer cell sheet.
  • the present invention has been completed by providing a method for enhancing spinal cord regeneration and spinal cord protection by increasing the delivery rate, survival rate, and engraftment rate of stem cell therapeutics through delivery to the spinal epidural.
  • the present invention (1) separating and culturing neural crest stem cells (NCSCs); (2) incorporating the cultured neural crest stem cells into a hydrogel; (3) culturing the hydrogel in which the neural crest stem cells are embedded under attachment culture conditions in which physical support is maintained; And (4) provides a method for producing a multi-layered cell sheet of neural crest stem cells comprising the step of culturing the hydrogel cultured in the step (3) in a floating culture condition that physical support is excluded.
  • NSCs neural crest stem cells
  • the neural crest stem cells may be isolated from a peripheral nerve (PN), but are not limited thereto.
  • PN peripheral nerve
  • the cultured neural crest stem cells may be mixed with a hydrogel in a solution state, and then converted into a gel state to uniformly distribute neural crest stem cells in a hydrogel in three dimensions.
  • the phase inversion of the hydrogel may be controlled from the solution state to the gel state within 30 seconds to 10 minutes.
  • the hydrogel may be made of a natural or synthetic polymer, fibrin, collagen, gelatin, chitosan, PLLA, PEG, peptide, etc. may be used, but is not limited thereto.
  • the polymer content in the three-dimensional hydrogel is composed of 0.1% to 5%, but preferably may be composed of less than 0.5% of the polymer.
  • the hydrogel may be a collagen and fibrinogen mixed hydrogel, and the collagen and fibrinogen mixed hydrogel may contain a final concentration of 0.1% to 1% collagen and a final concentration of 0.1% to 1% fibrinogen. .
  • the hydrogel is a cell-mediated contraction phenomenon in the adhesion environment culture using a hydrogel in which collagen with a low elastic modulus and a high elastic modulus fibrin are mixed. Hydrogel was prevented from falling off from the culture (mold).
  • the cultured neural crest stem cells of step (2) may be added to the thrombin and collagen mixed solution, but is not limited thereto.
  • the cultured neural crest stem cells of step (2) may be a density of 1 ⁇ 10 6 / ml to 1 ⁇ 10 8 / ml, but is not limited thereto.
  • the cells are phase-transformed into gel through polymerization / crosslinking process at 37 ° C. for 2 hours to uniformly form cells in three dimensions.
  • a multi-layered cell sheet of neural crest stem cells by delivering a dose of 150 ⁇ l / mm 2 to 250 ⁇ l / mm 2 at a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 / ml to 1 ⁇ 10 7 / ml.
  • a dose of 150 ⁇ l / mm 2 to 250 ⁇ l / mm 2 at a cell density of 2.5 ⁇ 10 6 / ml to 1 ⁇ 10 7 / ml. Through the control of the cell density and dose can be prepared a multi-layered cell sheet consisting of 10 to 50 layers.
  • the attachment culture conditions in which the physical support of step (3) is maintained under the conditions that the physical support by casting the hydrogel containing the neural crest stem cells into a mold of a circular, rectangular, or square shape Can be cultured.
  • the attachment culture conditions of step (3) may induce cell-cell junctions and cell-hydrogel polymer junctions.
  • the culture in the attachment culture conditions of step (3) is produced by the extracellular matrix (ECM), secreted from the neural crest stem cells (vascular growth factor, anti-inflammatory factor, neuroprotection / growth factor and Neuroactivators can accumulate in hydrogels.
  • ECM extracellular matrix
  • the extracellular matrix may be composed of fibronectin, laminin, and collagen type IV, but is not limited thereto.
  • the vascular growth factor is at least one selected from the group consisting of angiopoietin (ANGPT) -1, angiopoietin-2, angiopoietin-3 and angiopoietin-4 Angiopoietin family, vascular endothelial growth factor (VEGF) or platelet-derived growth factor (platelet-derived growth factor (PDGF)), but is not limited thereto.
  • ANGPT angiopoietin
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • the anti-inflammatory factor may be interleukin (IL) -6, IL-10 or transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), but is not limited thereto.
  • IL interleukin
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • the neuroactive factor is a nerve growth factor (NGF), brain-derived growth factor (BDNF), neurotrophin-3 (neurotrophin-3; NT-3) and Any one or more Neutropin family selected from the group consisting of NT-4 / 5; Any one or more GDNF family selected from the group consisting of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) or artemin (ARTN); At least one ephrin series selected from the group consisting of ephrin (EFN) A1, ephrin A2, ephrin A4, ephrin A5, ephrin B1, ephrin B2 and ephrin B3; At least one CNTF family selected from the group consisting of ciliary neurotrophic factor (CNTF), leukemia inhibitory factor (LIF) and IL-6; Glial maturation factor (GMF); It may be, but not limited to, neuregulin (NRG) or insulin-like
  • the neuroprotective / growth factor is fibroblast growth factor (FGF) -7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 and One or more FGF family selected from the group consisting of FGF-14, but is not limited thereto.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the suspension culture step (4) may induce cell-mediated hydrogel contraction, thereby releasing water in the hydrogel.
  • the multilayer cell sheet of the neural crest stem cells may be composed of 10 to 50 layers, but is not limited thereto.
  • the present invention is a hydrogel containing neural crest stem cells, the extracellular matrix secreted and accumulated by the neural crest stem cells, nerves including vascular growth factor, anti-inflammatory factor, neuroprotection / growth factor and neuroactive factor
  • a multilayer cell sheet of ridge stem cells Provided is a multilayer cell sheet of ridge stem cells.
  • the hydrogel may be a collagen and fibrinogen mixed hydrogel, but is not limited thereto.
  • the hydrogel in the multilayer cell sheet of the neural crest stem cells does not cause an inflammatory reaction and foreign body reaction in vivo, and has a biodegradation property that is completely degraded within 3 to 3 weeks in vivo.
  • the neural crest stem cells may be a density of 1 ⁇ 10 6 / ml to 1 ⁇ 10 8 / ml, but is not limited thereto.
  • the multilayer cell sheet of the neural crest stem cells may be composed of 10 to 50 layers, but is not limited thereto.
  • the multi-layered cell sheet of neural crest stem cells of the present invention is in a state in which the cell membrane is maintained intact, and has stable structural characteristics through support of hydrogel polymer and extracellular matrix, from excessive oxidative free radical mediated damage and inflammatory reaction mediators at the site of injury.
  • the survival rate of transplanted neural crest stem cells can be increased.
  • the present invention also provides a composition for treating spinal cord injury comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • the composition may enhance damaged nerve axon and myelin production, inhibit damaged nerve inflammatory response, and enhance damaged nerve angiogenesis.
  • the multilayered cell sheet of neural crest stem cells of the present invention is damaged spinal cord regeneration through an action mechanism that induces spinal cord tissue regeneration through inflammation inhibitory factor, neuronal activity / regenerative factor, neovascularization factor secreted from neural crest stem cells Provides cell therapies to restore function.
  • the multi-layered cell sheet of neural crest stem cells of the present invention can improve the delivery efficiency in the spinal cord by direct local transplantation to the injured spinal cord rather than systemically administered route, secondary spinal cord accompanying the injection process when injected into the spinal cord
  • spinal cord can improve the delivery efficiency in the spinal cord by direct local transplantation to the injured spinal cord rather than systemically administered route, secondary spinal cord accompanying the injection process when injected into the spinal cord
  • local delivery of the damaged spinal cord into or out of the surrounding dura or dura matter can prevent secondary spinal cord injury during transplantation.
  • the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells of the present invention to the local spinal cord can increase the retention site (engagement rate) and retention rate (engraftment rate) of the transplantation site, multi-layered cells of the neural crest stem cells delivered locally The sheets can survive for more than 4 weeks by fusion with peripheral tissues and blood vessels and continuously secrete anti-inflammatory factors, nerve regeneration / activators, and neovascular factors to promote impaired spinal cord regeneration and function recovery.
  • the present invention provides a composition for treating brain damage comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • the composition may inhibit neuronal damage and promote neuronal growth and differentiation.
  • the present invention also provides a composition for treating peripheral nerve damage comprising the multi-layered cell sheet of the neural crest stem cells or a culture thereof as an active ingredient.
  • NSCs Peripheral Nerve-derived Neural Crest Stem Cells
  • PN-NCSCs isolation was performed using the method presented in KR 10-1389851.
  • Peripheral nerves donated from brain lions were removed in 1 mm 3 sections after removal of peripheral soft tissues and neuroeural envelopes, and washed five times with Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) solution.
  • DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • Peripheral nerves were mixed with 0.2% collagen by mixing collagen solution (0.5% porcine skin derived collagen, Matrixen TM -PSC, Bioland, Daejeon, South Korea) with reconstitution buffer (50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW). The solution was prepared. After mixing 0.2% collagen solution and peripheral nerve sections, 10 mL of the mixed solution was transferred to a 100-mm culture vessel, and then reacted in a 37 ° C. incubator for 2 hours to form a gel. After the collagen hydrogel was formed, 10 ml cell culture was added.
  • Cell culture medium was 90% DMEM (Welljin, Gyeongsan, Korea), 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco, Seoul, Korea), 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF, Peprotech, Seoul, Korea), 2 ng / ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, Seoul, South Korea), 10 ng / ml insulin-like growth factor (IGF, Peprotech, Seoul, South Korea), 10 ⁇ g / ml gentamicin (Invitrogen) composition Prepared. Since the culture dish was incubated for 2 weeks while stirring at 30 rpm on an orbital shaker (orbital shaker). Fresh cell culture was changed every 2 days.
  • FBS fetal bovine serum
  • PN-NCSCs migrated and grown into collagen hydrogels from peripheral nerve sections were recovered using collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, USA) to decompose collagen hydrogels and recover free cells.
  • the recovered PN-NCSCs were amplified and cultured by conventional monolayer culture. Cells were subcultured with 0.05% trypsin / EDTA (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea) at 80% or higher density and then subcultured from the culture vessel.
  • the collagen was neutralized and then solidified collagen hydrogel was formed after reaction at 37 ° C. for 2 hours.
  • peripheral nerve tissue was three-dimensionally incorporated into the hydrogel.
  • collagen hydrogel-supported three-dimensional long-term culture method can induce cell migration and growth from the peripheral nerve and observed cell movement within 24 hours after incorporating three-dimensionally.
  • the number of cells migrated and grown from peripheral nerve tissue increased into hydrogel, and the number of cells migrated and grown from peripheral nerve increased proportionally as the culture period was increased.
  • Collagen hydrogels containing cells migrated from peripheral nerves were recovered by dissolving collagen hydrogels using 0.01% collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, USA) dissolved in DMEM: F12 medium.
  • the recovered PN-NCSCs were amplified and cultured in a conventional monolayer culture environment.
  • the cells were cultured after removing the cells from the culture vessel using 0.05% trypsin / EDTA (Sigma Aldrich, Seoul, Korea) at a density of 80% or more. After long-term incubation for 2 weeks, the cells migrated and grown were recovered from the hydrogel using 0.01% collagenase, a collagen degrading enzyme, and showed survival of 95% or more of the cells dissociated from the hydrogel. In monolayer cultures, PN-NCSCs grew into a typical fusiform shape.
  • Example 2> derived from adult peripheral nerves PN - Of NCSCs Growth characteristics, immunophenotype, mRNA Expression characteristics
  • PN-NCSCs The in vitro growth capacity of PN-NCSCs was assessed by colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs) and population doubling time (PDTs). Immunogenic properties of the isolated PN-NCSCs were analyzed by confocal laser scanning microscope after immunofluorescence staining. Antibodies used to evaluate immunoexpression characteristics were p75 NTR , nestin, sox-10, myelin protein 0 (P0), neuronal class III ⁇ -Tubulin (Tuj1), and glial markers.
  • GFAP fibrillary acidic protein
  • A2B5 lipocyte marker A2B5
  • Olig2 oligodendrocyte transcription factor
  • MBP myelin basic protein
  • CD105 and CD29 mesenchymal stem cell markers CD105 and CD29
  • CD45 hematopoietic stem cell marker CD45
  • vascular endothelial cell CD34 Immunoexpression characteristics were evaluated.
  • PN-NCSCs The self-replicating ability of PN-NCSCs was assessed by colony forming unit-fibroblasts (CFU-Fs) and population doubling time (PDTs).
  • CFU-Fs colony forming unit-fibroblasts
  • PDTs population doubling time
  • the CFU-F forming ability was measured using an image analysis program (Image J, NIH, Bethesda, MD) to measure the number of colonies of 2 mm or more, expressed as a percentage (%) by calculating the number of colonies per seeding cell number.
  • Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) were used as controls.
  • PN-NCSCs formed a plurality of colonies in a monolayer culture environment, and colonies were composed of a high density of fusiform cells. This confirmed that PN-NCSCs possess self-replicating ability.
  • the control group BMSC had low colony formation, and the fusiform cells constituting the colony were clustered at low density.
  • colonies were formed in less than 5% of cells seeded in BMSCs used as a control group, but in the case of PN-NCSCs, colonies were formed in 30% or more of the seeded cells. It was confirmed that the formation capacity was maintained in vitro high growth capacity.
  • PN-NCSCs In vitro growth capacity of PN-NCSCs was evaluated by estimating population doubling time (PDT) in monolayer culture. 1000 cells were seeded in 48-multiwell culture vessels and cultured for 3 days. Cells were lysed using CelLytic TM MT lysis reagent (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea), and the lysed DNA content was measured using Quant-iT TM PicoGreen reagent (Molecular probes, Eugene, OR). Fluorescence intensities were measured at a wavelength of 485 nm emission and 540 nm excitation using a fluorescent microplate reader (SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany).
  • PDT [(days in exponential phase) / ((logN2-logN1) / log2)] where N1 is the initial cell number of the exponential growth phase and N2 is the cell number at the end of the exponential growth phase.
  • PN-NCSCs were passaged more than 43 times in a monolayer culture environment. Up to 43 passages, PDN of PN-NCSCs showed excellent in vitro cell growth capacity within 13.5 ⁇ 15.8 hours on average. In addition, PDT increased slightly as the passage was longer, but the aging of the cells was not observed until the 43rd passage. It was confirmed that the cells isolated from peripheral nerve tissue had excellent self-replicating ability and growth ability.
  • Immunofluorescence staining was performed to analyze the immunophenotypic characteristics of PN-NCSCs.
  • Amplified cultured 3 ⁇ 10 4 cells in a monolayer culture were seeded on a 4-multiwell chamber slide (Lab-Tek TM II Chamber Slide TM System, Thermo Fisher Scientific, Seoul, Korea) and cultured for 1 day. Then, the length was fixed with acetone / methanol 1: 1 mixture.
  • 5% bovine serum albumin (bovine serum albumin, BSA; Fraction V, IgG-free, Thermo Fisher Scientific) was used for 30 minutes at room temperature.
  • Primary antibodies used to evaluate immunoexpression characteristics were p75 NTR , nestin, sox-10, neuronal class III ⁇ -tubulin (Tuj1), neuronal markers, and glial fibrillary acidic protein (GFAP), astrocyte markers.
  • A2B5 as lipocyte marker, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), Schwann cell marker as myelin protein 0 (P0), stromal cell marker as CD105 and CD29, hematopoietic stem cell CD45 as a marker and CD34 as a vascular endothelial cell marker were used as antibodies.
  • the primary antibody isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated IgG was then reacted for 45 minutes at room temperature to detect the signal.
  • Nuclei were stained with 10 ⁇ g / ml DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) solution and analyzed by confocal microscopy.
  • BMSC and neuronal ridge-derived tumor cell line PC12 was used as a control.
  • PN-NCSCs amplified in vitro by tomography cultured the neuronal ridge cell markers p75 NTR (95.6% ⁇ 2.67%), Sox-10 (88.2% ⁇ 3.6%), nestin (95.7% ⁇ 2.7%).
  • the neural crest-derived tumor cell line, PC12 expressed p75 NTR (90.3% ⁇ 5.2%), Sox-10 (81.2% ⁇ 5.5%), nestin (92.6% ⁇ 1.1%).
  • p75 NTR expressed 41.7% ⁇ 3.0% in BMSCs, but 2.2% ⁇ 1.4% in Sox-10 and 1.1% ⁇ 1.1% in nestin.
  • the above results can confirm that cells isolated from peripheral nerve tissue through the three-dimensional organ culture method has the same immunoexpression characteristics as cells of neural crest origin.
  • peripheral nerve-derived PN-NCSCs had the same immunoexpressive characteristics as those of undifferentiated neural crest-derived stem cells rather than mature neural crest cells.
  • CD29 and CD105 which are known as markers of stromal cells, were expressed by 95% or more in PC12, PN-NCSCs, and BMSCs. Like BMSCs, PC12 and PN-NCSCs were found to be substrate-dependent (substrate-dependent) cells.
  • the vascular endothelial cell marker CD34 and the hematopoietic cell marker CD45 were used to determine the contamination of hematopoietic and vascular cells derived from peripheral nerve-derived PN-NCSCs. .
  • the expression rates of CD34 and CD45 were less than 1% in all PC12, NCSCs, and BMSCs, indicating no contamination from hematopoietic and vascular cells.
  • the above results reflect the high purity PN-NCSCs without contamination of vascular endothelial cells and hematopoietic cells through the three-dimensional organ culture method.
  • RT-qPCR reverse-transcriptase quantitative polymerase chain reaction
  • PN-NCSCs migrated and grown from peripheral nervous tissues through three-dimensional organ culture were Sox-2, Sox-10, Dlx2, Tcfap2a, Erbb3, and Fgf5 mRNAs related to neural crest cells with PC12. mRNA was expressed.
  • the neural crest cell marker and ectoderm cell marker were not negatively expressed in the BMSCs used as a control. It was confirmed that the cells migrated and grown through the three-dimensional organ culture method using peripheral nerve tissues are cells derived from the neural crest.
  • Example 3> derived from adult peripheral nerves PN - Of NCSCs Nerve ridge Into lineage cells Diversification Capability
  • PN-NCSCs were seeded in 24-multiwell cell culture vessels (Ultra-Low attachment plates, Sigma-Aldrich), which inhibit cell adhesion, and cultured in a suspension culture environment. In suspension culture, PN-NCSCs were prevented from adhering to the culture vessel, whereas cell-cell junctions were induced to induce microsphere formation.
  • DMEM Dulbecco's Minimum Essential Medium
  • Sibco 1% calf serum
  • 0.1 ⁇ M dexamethasone Sigma-Aldrich
  • 50 ⁇ g / ml ascorbic acid Sigma- Aldrich
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the expression of cell-specific markers was evaluated for differentiation of neurons and glial cells of PN-NCSCs in microspheres.
  • Antibodies used to assess cell-specific marker expression were neuronal class III ⁇ -Tubulin (Tuj1), neurofilament-200 (NF200), astrocyte marker glial fibrillary acidic protein (GFAP), A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), and Schwann cell marker P0 were used.
  • PN-NCSCs in microspheres formed in a floating culture were positive for the neuronal markers Tuj1, NF200, astrocytic marker GFAP, lipocyte marker A2B5, Olig2, MBP, Schwann cell marker P0, and fibroblast marker SMA. It was expressed as having a differentiation ability to neurons and glial cells, such as stem cells derived from neural crest. On the other hand, in the BMSC used as a control, all the markers could not confirm the differentiation ability to the neural crest cells.
  • PN-NCSCs To assess the differentiation capacity of PN-NCSCs into fat, 200,000 cells were seeded in 24-multiwell cell culture vessels, followed by 10% calf serum and 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine in 90% DMEM. Sigma-Aldrich), 1 ⁇ M dexamethasone, 0.2 unit / ml insulin (Sigma-Aldrich) and 200 ⁇ M indomethacin (Sigma-Aldrich) were added and cultured for 2 weeks. Differentiation into adipocytes was assessed by the accumulation of fat in the cytoplasm, and analyzed using 0.5% Oil Red O (Sigma-Aldrich) staining.
  • PN-NCSCs To assess the differentiation capacity of PN-NCSCs into osteoblasts, 200,000 cells were seeded in 24-multiwell cell culture vessels and then 10% calf serum in 90% alpha-minimum essential medium ( ⁇ -MEM; Welgene). Differentiation medium of 0.1 ⁇ M dexamethasone, 10 mM ⁇ -glycerol phosphate (Sigma-Aldrich), 50 ⁇ M ascorbic acid composition was added and cultured for 2 weeks. Differentiation into osteoblasts was evaluated by mineral deposition. For this, alizarin red S (Sigma-Aldrich) staining was performed.
  • differentiation into adipocytes and osteoblasts was induced to evaluate the differentiation capacity of PN-NCSCs into mesenchymal cells isolated from peripheral nerve tissue.
  • lipid accumulation in the cytoplasm was observed in PN-NCSCs that induced differentiation into adipocytes, and confirmed by oil red O staining.
  • the cell morphology was cubic epithelial, and mineralization was confirmed by alizarin red S staining. It was confirmed that the cells migrated and grown through three-dimensional organ culture using peripheral nerve tissues had the ability to differentiate into neural crest series and mesenchymal series cells.
  • Fibrinogen derived from human plasma (green cross, Seoul, South Korea) was dissolved in DMEM medium containing 10 mM CaCl 2 to prepare a fibrinogen solution at a concentration of 0.5%.
  • Thrombin (Sigma, St. Louis, MI) was dissolved in DMEM to prepare a final thrombin solution of 0.25 unit / ml concentration.
  • One hundred thousand or one million PN-NCSCs were mixed with a thrombin solution in 1 ml to prepare a thrombin solution in which the PN-NCSCs were dispersed.
  • the fibrinogen solution and the thrombin solution containing PN-NCSCs were mixed in a 1: 1 ratio, and 100 ⁇ l was transferred to a 24-multiwell plate, and then crosslinked for 2 hours in a 37 ° C. incubator. Subsequently, 1% or 10% calf serum (CS) and 10 ⁇ g / ml gentamycin were added to DMEM. The culture dish was incubated for 1 day in an orbital shaker at 15 rpm.
  • CS calf serum
  • CS calf serum
  • the culture dish was incubated for 1 day in an orbital shaker at 15 rpm.
  • a plasminogen activator inhibitor PAI
  • the fibrin hydrogel containing no PAI was completely dissolved from the first day of culture due to fibrinolysis of PN-NCSCs to provide a three-dimensional substrate on which PN-NCSCs can attach and grow. I could't. Fibrin hydrogel lysis was proportional to the number of cells embedded in the hydrogel and the serum concentration. Fibrin hydrogels containing 100,000 PN-NCSCs did not dissolve on the first day of culture but provided a three-dimensional substrate regardless of serum concentration.However, the hydrogel began to dissolve on the second day of culture.
  • Fibrin hydrogels containing one million PN-NCSCs were unable to inhibit cell-mediated fibrinolysis through transexamic acid, regardless of serum concentration.
  • PN-NCSCs had significantly higher expression of urokinase type plasminogen activator (uPA) and tissue plasminogen activator (tPA) mRNAs that mediate fibrinolysis compared to BMSCs and fibroblasts.
  • uPA urokinase type plasminogen activator
  • tPA tissue plasminogen activator
  • the fibrin / collagen hydrogel containing PN-NCSCs was then fixed in 1% neutral formalin and a paraffin block was prepared. After obtaining paraffin sections, hematoxylin eosin staining was used to evaluate cellular expansion and cellular three-dimensional distribution.
  • PN-NCSCs into collagen or collagen / fibrin hydrogel.
  • hydrogel was a three-dimensional substrate of PN-NCSCs as a three-dimensional substrate during three days of culture. was maintained.
  • the collagen hydrogel containing PN-NCSCs was contracted by the hydrogel on the 1st day of culture and dropped from the O-ring and the culture vessel.
  • the hydrogel shrinkage increased as the incubation period increased.
  • the collagen / fibrin mixed hydrogel was stably attached to the O-ring and the culture vessel for 3 days of culture, and no shrinkage occurred due to shrinkage.
  • collagen hydrogels took an average of 48 minutes for the phase transition time of gel formation to sol, but collagen / fibrin mixed hydrogels had an average phase transition time of sol to gel within 5 minutes.
  • the three-dimensional distribution of PN-NCSCs embedded in the hydrogel was evaluated morphologically.
  • the PN-NCSCs in the collagen hydrogels were concentrated in the lower layer of the hydrogel, whereas the PN-NCSCs in the collagen / fibrin mixed hydrogels were Cell distribution according to layer was uniformly distributed in three dimensions without difference.
  • collagen hydrogel can provide a function as a support for three-dimensional culture of PN-NCSCs, but due to its late phase transition time, it cannot provide a uniform three-dimensional distribution of PN-NCSCs and is also vulnerable. Because of the physical properties, there was no resistance to cell-mediated contraction, and thus the problem of contraction caused by dropping from the O-ring and the culture vessel was confirmed. On the other hand, collagen / fibrin mixed hydrogels were able to achieve uniform three-dimensional cell distribution due to the fast phase transition time, and were confirmed to have physical properties showing resistance to cell-mediated hydrogel shrinkage.
  • the purpose of this study was to establish the culture environment and the culture period for the production of PN-NCSCs multilayer cell sheets.
  • a 0.5% collagen solution was mixed with reconstitution buffer (50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW) according to the method described in Example 4 to prepare a final 0.2% collagen solution.
  • Fibrinogen derived from human plasma Green Cross, Seoul, South Korea
  • thrombin Sigma, St. Louis, MI
  • PN-NCSCs cells 2 ⁇ 10 6 PN-NCSCs cells were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution, mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution and delivered into a 10-mm diameter O-ring attached to the culture vessel, followed by sol The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours to form a gel at. After hydrogel was formed, the collagen / fibrin mixed hydrogel containing PN-NCSCs was separated from the O-ring and cultured in an environment without physical support (floating culture conditions, floating culture conditions, non-stressed culture conditions). After casting into the O-ring and incubated for 3 days in an environment in which physical support was maintained (attached culture condition, attached culture condition, stressed culture condition).
  • DMEM fetal calf serum
  • CS calf serum
  • 100 ⁇ g / ml transexamic acid 100 ⁇ g / ml transexamic acid
  • 10 ⁇ g / ml gentamycin a culture solution containing 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamycin, and the dish was orbital at 15 rpm. shaker) for 3 days.
  • hydrogels were collected on the 1st, 2nd and 3rd day of culture, and fixed in 1% neutral formalin, and paraffin blocks and sections were prepared.
  • the survival rate of PN-NCSCs in hydrogel was evaluated after hematoxylin eosin staining.
  • the frequency of apoptosis in which cytoplasmic coagulation and nuclei were observed was higher in PN-NCSCs in hydrogels cultured in a floating culture than in PN-NCSCs in hydrogels cultured in an adhesion culture. Significantly increased.
  • the frequency of PN-NCSCs cell apoptosis of hydrogels cultured in a floating culture was 4.5% ⁇ 0.8% on day 1, 8.5% ⁇ 2.4% on day 2, and 12.7% ⁇ 2.6% on day 3.
  • the apoptosis frequency increased in proportion to the culture period in the floating culture.
  • the frequency of apoptosis of PN-NCSCs in hydrogels cultured in adherent culture environment was 0.3% ⁇ 0.1% on day 1, 0.6% ⁇ 0.3% on day 2, and 0.7% ⁇ 0.2% on day 3, respectively. Showed frequency.
  • the longer the culture period in the floating culture environment cell-mediated hydrogel shrinkage was increased, and as a result, it was confirmed that cell damage and cell death occurred by blocking nutrient and oxygen supply into the hydrogel.
  • the above results indicate that in order to prevent cell damage in the multi-layered cell sheet, hydrogel shrinkage is suppressed through physical support, and at the same time, an adhesion culture environment is required to continuously provide oxygen, nutrient, and metabolite exchange into the hydrogel. I could confirm it.
  • the above results can be seen that different deviations occur depending on the hydrogel, culture composition and culture environment for the three-dimensional distribution and culture of PN-NCSCs into the hydrogel.
  • 0.5% collagen solution was mixed with reconstitution buffer (50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW) according to the method described in Example 5 to prepare the final 0.2% collagen solution.
  • Fibrinogen derived from human plasma Green Cross, Seoul, South Korea
  • fibrinogen 0.5%)-collagen (0.2%) mixed solution in 0.2% collagen solution
  • thrombin Sigma, St. Louis, MI
  • PN-NCSCs cells were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution and mixed with the same amount of fibrinogen / collagen solution and then attached to the culture vessel. After transferring into a 10-mm diameter O-ring, the reaction was performed at 37 ° C. for one hour to form a gel in the sol. Subsequently, a medium containing 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamycin was added to DMEM, and the dish was an orbital shaker at 15 rpm. orbital shaker) for 1 day.
  • CS 1% calf serum
  • the hydrogel containing PN-NCSCs was removed from the O-ring and incubated for 2 hours in a floating environment.
  • the prepared PN-NCSCs multilayer cell sheets were fixed in 1% neutral formalin, and paraffin blocks were prepared. Paraffin sections were obtained and cell layers were evaluated by hematoxylin eosin staining.
  • PN-NCSCs embedded in collagen / fibrin hydrogels can be observed in cytoplasmic expansion after 6 hours of culture under phase contrast microscopy in an attachment culture environment. It can be seen that cytoplasmic expansion is made. In addition, the cell-cell junction increased with time, and it was confirmed that the intercellular junction increased with the incorporated cell density.
  • the cell layer in the hydrogel was increased in proportion to the density of PN-NCSCs embedded in the collagen / fibrin hydrogel.
  • PN-NCSCs multi-layer cell sheets 5 ⁇ 10 5 density of the case 15.3 ⁇ 3.2
  • 1 ⁇ 10 6 density of the multi-layer cell sheets is 21.7 cell layers ⁇ 4.2 cell layers
  • 4 ⁇ 10 6 density multi-layer cell sheets is 31.8 cell layers ⁇ 3.7 cell layers of
  • the 4 ⁇ 10 6 multi-layer cell sheets consisted of 43.9 cell layers ⁇ 5.1 cell layers. That is, it was confirmed that the cell layer in the multilayer cell sheet could be easily controlled by controlling the cell density in the hydrogel.
  • the present technology proposes a method of condensing collagen fibers in hydrogels through cell-mediated hydrogel shrinkage to release the moisture contained in the hydrogels to enhance physical properties.
  • Carried out by the method described in Example 5 2 ⁇ 10 6 PN-NCSCs cells to 50 ⁇ l Thrombin / Collagen and then a solution of the mixture by dispersing the same amount of collagen / p debris nojen solution and then a solution of the 10-mm diameter attached to the culture plate After delivery into O-ring, the reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours to form a gel in sol.
  • Collagen / fibrin mixed hydrogel containing PN-NCSCs was incubated for 1 day with O-ring and culture vessel attached.
  • PN-NCSCs incorporated into the hydrogel after adding a culture medium containing 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamicin to DMEM were added at 15 rpm. Incubations were made on an orbital shaker at speed. After 3 days of culture, the hydrogel was removed from the O-ring, and then cultured in a floating culture environment for 2 hours. After hydrogel was collected and fixed in 1% neutral formalin, paraffin blocks and sections were prepared. Masson trichrome staining was used to evaluate cell distribution and collagen fiber changes.
  • CS calf serum
  • the cell-mediated hydrogel contraction was induced in the suspension culture after one day of incubation in an attachment culture environment to induce binding of cell-cell and cell-collagen fibers.
  • Cell-mediated hydrogel contraction was able to release water in the hydrogel into the multilayer cell sheet and induce condensation of the hydrogel constituent polymer chains.
  • Hydrogels in PN-NCSCs multi-layer cell sheets before suspension culture contain water in the form of free sheep, but after 30 minutes of incubation in a floating culture, the water content decreases, and the hydrogel-constituting polymer chains condensate in the form of fibers. As a result, it can be seen that the spacing between cells is tight.
  • PN - NCSCs Multilayer Cell Sheet of mine Extracellular matrix Neuroprotective / growth factor, Angiogenesis factor Accumulation of anti-inflammatory and neuroactive factors
  • This embodiment provides a technique that can achieve the accumulation of extracellular matrix and neuroactive factors produced and secreted by the PN-NCSCs in the multilayered cell sheet in order to enhance the biological function of the PN-NCSCs multilayered cell sheet.
  • the 0.5% collagen solution was mixed with reconstitution buffer (50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW) according to the method described in Example 5 to prepare a final 0.2% collagen solution.
  • Fibrinogen derived from human plasma Green Cross, Seoul, South Korea
  • prepared a fibrinogen (0.5%)-collagen (0.2%) mixed solution in 0.2% collagen solution, and thrombin Sigma, St.
  • PN-NCSCs cells were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution, mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution and delivered into a 10-mm diameter O-ring attached to the culture vessel, followed by sol The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours to form a gel at. After hydrogel was formed, the collagen / fibrin mixed hydrogel containing PN-NCSCs was separated from the O-ring and cultured in an environment without physical support (floating culture conditions, floating culture conditions, non-stressed culture conditions).
  • RNA isolated from monolayer-cultured amplified PN-NCSCs, BMSCs, and spinal cords were used.
  • Nerve growth / protection mRNA is fibroblast growth factor (FGF) family of FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF- 9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-20, FGF-23 expression was evaluated.
  • Angiogenic mRNAs include angiopoietin (ANGPT) -1, -2, -4, platelet-derived growth factor (PDGF) -C, -D, and vascular endothelial. growth factor; VEGF) -A, -B, -C expression was evaluated.
  • Anti-inflammatory factor mRNA was evaluated for interleukin (IL) -6, 10 and transforming growth factor-b1 (TGFB1) expression.
  • Neuronal activators that increase the survival and protection of neurons, the growth of neurites, and the production of myelin are the neurotrophin family and the glial-Derived growth factor (GDNF) family.
  • MRNA expression of ephrin (EFN) family, ciliary neurotrophic factor (CNTF) family was evaluated.
  • Neurotrophin (NTF) family factors analyze the expression of nerve growth factor (NGF), brain-derived growth factor (BDNF) and neurotrophin (NTF) -3, 4/5 It was.
  • GDNF family factors were analyzed for GDNF and artemin (ARTN) expression.
  • EFN family factors were analyzed for EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3 expression.
  • CNTF family factors were analyzed by CNTF, leukemia inhibitory factor (LIF), IL-6 expression.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • NGF neutrophil growth factor
  • IGF insulin-like growth factor growth factor
  • PN-NCSCs As shown in FIG. 21, after incorporation of PN-NCSCs in collagen / fibrin hydrogel and cultured in an attachment culture environment for 3 days, extracellular matrix of basal lamina type such as fibronectin, laminin, collagen type IV in multi-layered cell sheets Fibrin fibrin was also detected, and fibronectin, laminin, and collagen type IV were generated from PN-NCSCs through in vitro culture and accumulated in multilayer cell sheets.
  • vascular growth factor mRNA in the multilayered cell sheet was significantly higher than that of BMSC after incubation in an attachment culture environment for 3 days.
  • ANGP-1, -2 and 4 mRNAs involved in the growth, migration, differentiation, and angiogenesis of vascular endothelial cells were 1.9, 45 and 31 times higher than BMSC.
  • PDGF-C and D also expressed 1.9-fold alc 4.8-fold higher, and VEGF-A, -B and C increased by 9.5, 1.8 and 1.3 fold.
  • the above results suggest that the PN-NCSCs multilayer cell sheet contains angiogenesis factors involved in the protection, growth, migration, differentiation and angiogenesis of vascular endothelial cells.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets were significantly higher.
  • Representative anti-inflammatory cytokines IL-6 and IL-10 were expressed 4.2 times and 30 times higher than BMSC, and TGF- ⁇ 1 was also expressed 1.3 times higher, and PN-NCSCs multilayer cell sheets were anti-inflammatory agents involved in inflammation and alleviation. Present what contains witnesses.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets suggest that they contain factors involved in the protection and growth of neurons.
  • PN-NCSCs multilayered cell sheets As shown in FIG. 25, it was confirmed that related mRNAs that induce proliferation, migration, differentiation, and protection of neurons in PN-NCSCs multilayered cell sheets, and promote neurites and myelin formation were significantly expressed.
  • Neurotrophin, GDNF, EFN, CNTF, NRG and IGF-1 mRNAs in PN-NCSCs multi-layered cell sheets are 1.2-fold and 51-fold higher than BMSCs, and N-NCSCs multi-layered cell sheets contain neuroactive factors. Present what is.
  • This embodiment provides a technique for inducing conjugation between PN-NCSCs cells in a multilayer cell sheet in order to enhance the structural safety of the PN-NCSCs multilayer cell sheet.
  • the 0.5% collagen solution was mixed with reconstitution buffer (50 mM NaHCO 3 , 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW) according to the method described in Example 5 to prepare a final 0.2% collagen solution.
  • Fibrinogen derived from human plasma Green Cross, Seoul, South Korea
  • thrombin Sigma, St. Louis, MI
  • PN-NCSCs cells 2 ⁇ 10 6 PN-NCSCs cells were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution, mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution and delivered into a 10-mm diameter O-ring attached to the culture vessel, followed by sol The reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours to form a gel at. After hydrogel was formed, the collagen / fibrin mixed hydrogel containing PN-NCSCs was separated from the O-ring and cultured in an environment without physical support (floating culture conditions, floating culture conditions, non-stressed culture conditions). After casting into the O-ring and incubated for 3 days in an environment in which physical support was maintained (attached culture condition, attached culture condition, stressed culture condition).
  • DMEM fetal calf serum
  • CS calf serum
  • 10 ⁇ g / ml gentamycin 100 ⁇ g / ml transexamic acid
  • 10 ⁇ g / ml gentamycin a culture solution containing 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamycin, and the dish was orbital at 15 rpm. shaker) for 3 days.
  • hydrogels were collected on the 1st, 2nd and 3rd day of culture, and fixed in 1% neutral formalin, and paraffin blocks and sections were prepared.
  • immunofluorescence staining was performed using anti- ⁇ -catenin and anti-CD29 antibodies.
  • ⁇ -catenin which is responsible for cell-cell junction, was expressed along the PN-NCSCs cell membrane, and expression increased with increasing incubation period in the adhesion culture.
  • CD29 which is related to cell-extracellular matrix junctions, also increased as the incubation period increased in the culture of adhesion, and was expressed linearly along the cell membrane.
  • PN - NCSCs From multilayer cell sheets Originated Of bioactive factors Neuroprotection, neuroproliferation, axon production, enhancement, anti-inflammatory effects
  • PN-NCSCs The protective, proliferative, axonal and anti-inflammatory effects of neurons of physiologically active factors secreted from PN-NCSCs multilayered cell sheets were evaluated.
  • 2 ⁇ 10 6 PN-NCSCs cells were dispersed and mixed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution according to the method described in Example 5, mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution, and then attached to the culture vessel 10-mm After the transfer into the O-ring of the diameter was reacted for 2 hours at 37 °C to form a gel in the sol. After the hydrogel was formed, the collagen / fibrin-mixed hydrogel containing PN-NCSCs was incubated for 2 hours in a floating culture environment after 3 days in the attachment culture environment to prepare a multilayer cell sheet.
  • the prepared PN-NCSCs multilayer cell sheet was transferred to a 100-mm culture vessel, and 5 mL of a culture solution consisting of 1% calf serum and 99% DMEM was added, followed by incubation for 24 hours to prepare a conditioned medium. After the culture was collected, centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes, the supernatant was transferred to a sterile tube, and the medium containing PN-NCSCs multilayer cell sheet-derived bioactive factor was stored frozen until the experiment.
  • BMSCs were prepared in the same manner, and conditions media containing bioactive factors derived from BMSCs multilayer cell sheet were prepared by the same method described above. It was.
  • the physiologically active factor derived from PN-NCSCs multi-layered cell sheet was evaluated for the protection of neurons by free radicals (Radical Oxygen Species, ROS).
  • ROS free radicals
  • Cultures containing physiologically active factors secreted from PN-NCSCs and BMSC multilayered cell sheets were added and reacted for 6 hours after addition of 3 mM H 2 O 2 to induce ROS mediated cell damage.
  • caspase 3/7 concentrations of SH-SY5Y cells were analyzed using an Apo 3/7 HTS TM assay kit (Cell Technology, Minneapolis, MN). After 6 hours of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) treatment, 100 ⁇ l of the sample in which SH-SY5Y cells were dissolved was reacted with the same amount of 2 ⁇ caspase 3/7 detection reagent for 30 minutes at 37 ° C., a fluorescent microplate reader (SpectraMax). M2, Molecular Devices) was used to measure the fluorescence intensity at a wavelength of emission of 488 nm and excitation of 530 nm. As a control, a culture solution containing 1% calf serum and 99% DMEM was used.
  • the conditioned media containing physiologically active factors derived from PN-NCSCs multilayered cell sheet at 10% concentration showed 84.4% ⁇ 3.2% survival rate at 92.4% ⁇ 2.5% when treated at 50% concentration and 99.9% at 100% concentration.
  • Bioactivator derived from PN-NCSC multilayer cell sheet at ⁇ 7.3% was able to confirm the concentration-dependent protection of ROS-mediated neurons.
  • Bioactive factors derived from PN-NCSCs multi-layered cell sheets were higher in neuroprotective capacity than BMSCs-derived bioactive factors, but there was no statistical significance.
  • caspase 3/7 As shown in FIG. 29, cell damage and death due to ROS treatment are mediated by caspase 3/7.
  • SH-SY5Y caspase 3/7 activity was analyzed after H 2 O 2 treatment to verify the cytoprotective ability of PN-NCSCs multilayered cell sheets. After H 2 O 2 treatment, caspase 3/7 activity in SH-SY5Y cells increased significantly.
  • Conditional medium containing PN-NCSCs multilayered cell sheet-derived physiologically active factors significantly reduced caspase 3/7 activity in SH-SY5Y (*, P ⁇ 0.05).
  • conditioned media containing BMSCs-derived physiological activators also reduced ROS-mediated caspase 3/7 activity in the same way as PN-NCSCs multilayered cell sheets, but the decrease was lower than that of PN-NCSCs multilayered cell sheets.
  • PN-NCSCs multilayered cell sheet-derived physiologically active factors 20,000 SH-SY5Y cells were seeded in 96-multiwell cell culture vessels and physiologically derived from PN-NCSCs or BMSCs Conditioned medium containing the activator was added at 10%, 50%, 100% concentration and incubated for 3 days.
  • BrdU at a concentration of 10 ⁇ M was added to the culture daily and then incubated for 3 days. After 3 days of culture, the cells were fixed with 2% buffered formalin solution and washed three times with PBS. In order to inhibit the nonspecific reaction of the antibody was treated for 30 minutes with 5% bovine serum albumin and then reacted for 2 hours at room temperature using the anti-BrdU primary antibody. After washing three times with PBS, the Dylight 488-conjugated secondary antibody was reacted for 30 minutes at room temperature, and the nuclei were stained with a 10 ⁇ g / ml DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) solution. Thereafter, the expression of BrdU was evaluated by confocal microscopy with ProLongGold antifade reagent (Molecular Probe). More than 1000 cells were analyzed to assess BrdU uptake expressed in the nucleus.
  • ProLongGold antifade reagent Molecular Probe
  • the DNA content was 126.2 ng / ml ⁇ 1.9 ng / ml (*, P ⁇ 0.01), 126.8 ng / ml ⁇ 8.6 ng / ml when treated with 100%, compared with the group containing no physiologically active factor derived from PN-NCSCs multilayered cell sheet or a culture containing physiologically active factor derived from BMSCs multilayered cell sheet Significantly increased the amount of DNA.
  • the BrdU uptake rate of SH-SY5Y cells when treated with conditioned medium containing PN-NCSCs multilayer cell sheet-derived physiological activator did not include bioactive factors (vehicle) and BMSCs multilayered cell sheet. Compared with the group treated with the derived physiologically active factor medium increased significantly.
  • BrdU uptake rate of SH-SY5Y cells significantly increased concentration-dependently as the concentration of conditioned medium containing PN-NCSCs multilayered cell sheet-derived bioactive factors increased (*, P ⁇ 0.05).
  • concentration of medium containing physiologically active factors derived from PN-NCSCs multilayer cell sheet is 50%
  • the BrdU uptake rate is 72.3% ⁇ 6.1% (*, P ⁇ 0.05), and at 100%, 69.7% ⁇ 5.1% (*, P ⁇ 0.05) was significantly higher than cells treated with culture medium containing no physiologically active factors.
  • the BrdU uptake rate was significantly higher than that of cells cultured with BMSCs multi-cell sheet-derived physiological medium, indicating that PN-NCSCs-derived physiological activator had the characteristics of enhancing neuronal growth. there was.
  • SH-SY5Y cell lines were seeded in 12-multiwell cell culture vessels at a density of 3,000 per cm 2 to multiply PN-NCSCs or BMSCs.
  • Cell sheet-derived condition medium was incubated at 10%, 50%, 100% concentration for 7 days.
  • the group treated with NGF (nerve growth factor) at a concentration of 50 ng / ml and the group treated with 1% calf serum and 99% DMEM medium were compared as a control group. After 7 days of culture, cells were fixed in 2% buffered formalin solution for 10 minutes and washed three times with PBS.
  • the conditioned medium containing the physiological activator derived from NCSCs multi-layered cell sheet significantly increased axon formation of SH-SY5Y cells.
  • the formation of axons of SH-SY5Y cells treated with BMSCs multilayer cell sheet-derived medium, control 1% calf serum or NGF was minimal.
  • axon formation of SY-SH5Y cells increased in a concentration-dependent manner when treated with PN-NCSCs multilayer cell sheet-derived medium.
  • the length of SH-SY5Y axons was significantly increased compared to 1% veal serum and BMSCs multilayer cell sheet-derived medium (*, P ⁇ 0.01 ).
  • the number of branching of axons of neurons was analyzed simultaneously.
  • the axon branching numbers of SH-SY5Y cells treated with 1% veal serum and BMSCs multilayer cell sheet derived from the control group were significantly increased in cells treated with NCSCs multilayered cell sheet derived from (*, P ⁇ 0.05, **, P ⁇ 0.01), the number of branching increased depending on the medium concentration.
  • the above results confirmed that the physiologically active factors derived from NCSCs multi-layered cell sheets possessed neuroactive ability to significantly increase neuronal protection, growth and axon formation.
  • Peritoneal monocytes from the abdominal cavity of rats were used to evaluate the inhibitory ability of physiologically active factors derived from PN-NCSCs multilayered cell sheets. Monocytes were isolated by centrifugation after injecting 30 ml of 0.9% saline (NaCl saline) into the abdominal cavity of Sprague Dawley rats. 4 x 10 5 monocytes were seeded in 96-multiwell cell culture vessels and treated with 1 ⁇ M lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich) for 24 hours.
  • LPS lipopolysaccharide
  • TNF- ⁇ tumor necrosis
  • factor-alpha factor-alpha
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • NCSC multi-cell sheet-derived condition medium was treated, and TNF- ⁇ secreted from monocytes was 2.1 ng / ml ⁇ 0.2 ng / ml when treated with 1% veal serum.
  • TNF- ⁇ content of NCSCs multilayer cell sheet-derived medium 10%, 50% and 100% was 1.6 ng / ml ⁇ 0.2 ng / ml, 1.0 ng / ml ⁇ 0.0 ng / m, 0.7 ng / ml ⁇ , respectively.
  • conditioned media containing physiologically active factors derived from PN-NCSCs multilayer cell sheets significantly inhibited IL-1 ⁇ secretion of monocytes.
  • concentration of IL-1 ⁇ in monocytes when treated with 10%, 50% and 100% medium containing physiologically active factors derived from PN-NCSCs multilayer cell sheets was 0.9 ng / ml ⁇ 0.1 ng / ml and 0.7 ng / ml, respectively.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheet-derived media significantly reduced monocyte TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ secretion compared to BMSCs multilayer cell sheet-derived media. The above results confirmed the ability of the physiologically active factor secreted from PN-NCSCs multi-layered cell sheet to inhibit the inflammatory response.
  • the spinal cord injury animal model used 240-260 g Sprague Dawley rats maintained in normal breeding conditions after approval from Inje University Animal Experiment Steering Committee.
  • Spinal cord injury involves the removal of the spinous process of the thoracic spine from 8 to 10, followed by an aneurysm clip (S & T Vascular Clamps; Fine Science Tools, British Columbia, 9) without damaging the dura mater at the 9 th thoracic spine. Canada) was used to injure the spinal cord (spinal cord) with a force of 10 g / mm 2 intensity for 1 minute.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets or BMSCs multilayer cell sheets were implanted onto the injured spinal cord.
  • gelatin sponges for hemostasis after spinal cord injury, gelatin sponges (Spongostan ® , Johnson & Johnson Medical, Skipton, UK) were covered and the incision was closed. After surgery, 50 ⁇ g gentamicin (Yuhan, Seoul, South Korea) was injected intramuscularly for 3 days, and 2 mg buprenorphine hydrochloride (Reckitt and Colman, Richmond, VA) for 2 days subcutaneous Injection. Urination was performed artificially by pressing the bladder twice a day.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner described in Example 5.
  • PN-NCSCs were labeled with 1 ⁇ M CM-DiI (Molecular Probe) to track implanted PN-NCSCs in vivo.
  • 2 ⁇ 10 6 or 2 ⁇ 10 7 PN-NCSCs labeled with CM-DiI were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution and then mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution. After the transfer into the O-ring of mm diameter it was reacted for 2 hours at 37 °C to form a gel in the sol.
  • the collagen / fibrin-mixed hydrogel containing PN-NCSCs was placed on an orbital shaker at a speed of 15 rpm under an O-ring physical support and incubated for 3 days.
  • the culture medium was cultured with 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamicin in DMEM.
  • CS calf serum
  • DMEM ⁇ g / ml transexamic acid
  • 10 ⁇ g / ml gentamicin multi-layer cell sheet was prepared.
  • images were acquired on the 3rd day of implantation using IVIS Lumina XR In Vivo Imaging System (Perkin Elmer, Seoul, Korea).
  • the transplanted spinal cord and multilayered cell sheets were collected, fixed in 2% neutral formalin, and paraffin blocks and sections were obtained.
  • immunofluorescence staining was performed using anti- ⁇ -smooth muscle actin (SMA) antibody, and isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody was used at room temperature.
  • SMA anti- ⁇ -smooth muscle actin
  • Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibody was used at room temperature.
  • the nuclei were stained with 10 ⁇ g / ml DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) solution. Afterwards, it was sealed with ProLong Gold antifade reagent (Molecular Probe) and evaluated for expression by confocal laser scanning microscope.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheet image obtained using the In Vivo Imaging System.
  • PN-NCSCs multilayered cell sheets were stably attached to the injured spinal cord, and the fluorescence intensity derived from the transplanted PN-NCSCs was increased in proportion to the number of cells. The above results confirmed that the PN-NCSCs could be stably implanted over the dura of the locally injured spinal cord through the multilayered cell sheet.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets were stably fused over the damaged spinal cord dura mater.
  • the injured spinal cord was well attached to the site of injury.
  • CMN-labeled PN-NCSCs in multilayer cell sheets transplanted over the dura were composed of more than 50%.
  • CM-DiI-positive cells were well maintained in their cytoplasm and nuclear structure. It was confirmed that microvascular vessels containing blood cells were formed into the multilayer cell sheet.
  • the SMA was used to label the vascular structure, and as a result of confirming that microvascular formation was made into the PN-NCSCs multilayer cell sheet, the transplanted PN-NCSCs multilayer cell sheet could be verified.
  • the microvessels formed in the PN-NCSCs multilayer cell sheet were positive for SMA, but CM-DiI was not expressed, indicating that the microvessels in the multilayer cell sheet originated from the recipient.
  • the transplanted PN-NCSCs multi-layered cell sheet was implanted in the damaged spinal cord region by the transplantation site and the vascular circulation.
  • transplanted PN-NCSCs multilayer cell sheets were observed only on the spinal epidural, and no migration was found into the injured spinal cord region.
  • PN-NCSCs were infected with lentivirus containing green fluorescent protein ( GFP ) gene, and PN-NCSCs containing GFP gene were used.
  • GFP green fluorescent protein
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner as described in Example 5. 2 ⁇ 10 6 PN-NCSCs containing the GFP gene were mixed and dispersed with 50 ⁇ l thrombin / collagen solution and then mixed with the same amount of collagen / fibrinogen solution, followed by a 10-mm diameter O-ring attached to the culture vessel. After delivery into, the reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours to form a gel in the sol.
  • the collagen / fibrin-mixed hydrogel containing PN-NCSCs was placed on an orbital shaker at a speed of 15 rpm under an O-ring physical support and incubated for 3 days.
  • the culture medium was cultured with 1% calf serum (CS), 100 ⁇ g / ml transexamic acid and 10 ⁇ g / ml gentamicin in DMEM.
  • CS calf serum
  • Paraffin fragments were immunostained using anti-GFP antibody, and then reacted with isotype matched HRP-conjugated secondary antibody at room temperature for 30 minutes and then developed using diaminobenzidine. The nuclei were then stained with hematoxylin. In addition, dual immunofluorescence staining was performed to evaluate the differentiation characteristics of transplanted PN-NCSCs in vivo.
  • the PN-NCSCs multilayer cell sheet transplanted over the dura of the damaged spinal cord At 3 days after transplantation, the density of GFP positive cells was highest on the dura mater, but the number of GFP positive cells decreased significantly over time. GFP positive cells migrated into the spinal cord could not be observed.
  • the density of GFP positive cells was 128.4 / mm 2 ⁇ 21.5 / mm 2 on day 3 of transplantation, but 98.1 / mm 2 ⁇ 12.1 / mm 2 on day 7 of transplantation, 56.2 / mm 2 ⁇ 9.8 / mm 2 on day 14 of transplantation, and 11.5 on day 28 of transplantation. / mm 2 ⁇ 3.6 / mm 2 .
  • GFP-positive cells on the dura were able to confirm that the cell structure was intact and alive, and had a morphological characteristic similar to that of fibroblasts with fusiform morphology.
  • PN-NCSCs transplanted onto the dura were characterized to differentiate into fibroblasts and vascular endothelial cells.
  • GFP-positive PN-NCSCs cover the lumen of the microvascular structure, and at the same time, CD34, a vascular endothelial cell marker, positively differentiates into vascular endothelial cells to form microvascular directly.
  • most GFP-positive cells were SMA-positive and had immunogenic properties similar to those of myofibroblasts during neurofibroblasts or wound repair.
  • a spinal cord injury model was prepared in the same manner as in Example 7, PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner as in Example 5, and then transplanted onto the damaged spinal cord dura mater.
  • the motor capacity of the spinal cord injury animals was assessed according to the Basso, Beattie and Bresnahan (BBB) evaluation system after placing the animals in a 100 cm ⁇ 100 cm box.
  • Animal performance was recorded by video and evaluated by two different researchers, based on joint movement, joint coordination, and weight support, from 0 to 21 points of hind limb movement. Animal groups treated with BMSCs multilayered cell sheets and animals without any treatment were used as controls.
  • a spinal cord injury model was prepared in the same manner as in Example 7, PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner as in Example 5, and then transplanted onto the damaged spinal cord dura mater.
  • the spinal cord injured animals were transferred into boxes made of 20 cm x 20 cm acrylic walls and wire mesh. The animals were allowed to acclimate for 15 minutes and then physically stimulated the plantar surface using a Dynamic Plantar Aesthesiometer (Ugo Basile, Comerio, Italy). The filament was passed through the wire mesh and weighed up to 50 g with the force of 2.5 g per second. Each leg was measured twice and a high score was applied and repeated four times to average. All measurements were performed weekly on day 0 postoperatively to determine the degree of response to determine the presence of physical allodynia.
  • the sensory capacity of the spinal nerve injury rats transplanted with PN-NCSCs multilayer cell sheets from 5 weeks after transplantation was compared with that of the spinal cord injury animals without the multilayer cell sheets and the animals with the BMSCs multilayer cell sheets.
  • Significantly improved (*, P ⁇ 0.05).
  • Allodynia developed in spinal cord injury animals treated with PN-NCSCs or BMSCs multilayer cell sheets up to 4 weeks after transplantation and showed excessive response to filaments.
  • the sensitive sensory response and allodynia to filaments were significantly alleviated, but the sensory ability of the rats decreased rapidly and showed severe allodynia in the animals without the multilayer cell sheet.
  • a spinal cord injury model was prepared in the same manner as in Example 7, PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner as in Example 5, and then transplanted onto the damaged spinal cord dura mater. Neurophysiological function of the animals was evaluated by placing the probe in the subcutaneous layer and the tibia of the head and assessing motor and sensory nerve conduction.
  • a spinal cord injury model was prepared in the same manner as in Example 7, PN-NCSCs multilayer cell sheets were prepared in the same manner as in Example 5, and then transplanted onto the damaged spinal cord dura mater. Spinal cord injury was obtained at 2 and 4 weeks after PN-NCSCs multilayered cell sheets were implanted in the spinal cord injury animals.
  • Cavity lesions were estimated using hematoxylin eosin staining slides, and demyelination lesions were measured using LFB staining. The lesions were 4 cm in the direction of the tail and 2 cm at the head. Peripheral cystic lesions and demyelinating lesions were expressed as percentages.
  • the structural morphological recovery of the spinal cord injury site of the injured animal was shown.
  • the spinal cord cavity size was 77.9% ⁇ 6.8%, but in the animals transplanted with PN-NCSCs multilayer cell sheets, the spinal cord cavity size after injury was significantly reduced to 55.9% ⁇ 4.3%.
  • the demyelination lesion was 73.0% ⁇ 9.1% in the control group, but significantly decreased to 58.1% ⁇ 5.5% in the animals treated with PN-NCSCs multi-layered cell sheets.
  • the spinal cord injury was significantly reduced in the spinal cord injury animals treated with PN-NCSCs multilayer cell sheets after 4 weeks of spinal cord injury. Compared to the second week of spinal cord injury, the size of the cavity decreased at 4 weeks and was replaced by a glial scar. The co-size of the spinal cord treated with PN-NCSCs multilayer cell sheets was significantly reduced compared to the control. Demyelination lesions were also reduced compared to 2 weeks, and myelin regeneration was significantly increased in the group treated with PN-NCSCs multilayer cell sheets.
  • Bodian's silver staining Two weeks after spinal cord injury, the number of axon fibers after Bodian's silver staining was confirmed at the site of injury.
  • Bodian's silver staining paraffin sections were reacted for 16 hours at 37 ° C using Protargol-S solution (Polysciences Inc., Warrington, PA) and then washed with distilled water. After reacting for 5 minutes using a reducing solution containing 0.1% hydroquinone (Sigma-Aldrich) and 0.05% sodium sulfite (Sigma-Aldrich), 5% of 0.5% gold chloride (Sigma-Aldrich) was sequentially added. Minutes, 0.5% oxalic acid (Sigma-Aldrich) was reacted for 10 minutes.
  • the reaction was sealed for 3 minutes with a 5% hypo solution containing 0.05% sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich) and then imaged using NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan).
  • the acquired images were selected in terms of the ventral horn, dorsal horn, and lateral gray matter regions of the spinal cord grey, and the density of the axons in the damaged area was expressed as a percentage.
  • the spinal cord axon was stained with Bodian's silver at 2 weeks of spinal cord injury.
  • regeneration of injured spinal cord axons was significantly increased in the anterior, posterior and lateral gray matter compared to the control.
  • the spinal cord treated with PN-NCSCs multi-layered cell sheets showed axonal regeneration in the center of injury, but it was difficult to observe axonal regeneration in the control group.
  • axon regeneration was evaluated by neural tracing.
  • 10 ⁇ l of 10% biotinylated dextran amine (BDA, 10,000 M.W., Molecular Probe) was injected into the motor neuronal cortex.
  • BDA biotinylated dextran amine
  • the damaged spinal cord was harvested, fixed in 4% neutral formalin for 6 hours, and paraffin blocks and sections were prepared. Paraffin sections were developed with DAB after reacting with HRP-polymerized streptavidin (innogenex). Images were obtained using NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan). The density occupied by the axons is expressed as a percentage.
  • PN-NCSCs multilayer cell sheets As shown in FIGS. 48 and 49, 4 weeks after spinal cord injury, axons containing BDA injected into the motor sensory cortex were significantly increased in animals transplanted with PN-NCSCs multilayer cell sheets. The density of BDA-positive axons in the center of spinal cord injury was decreased, and there was no significant difference according to the implantation of PN-NCSCs multilayer cell sheet. However, the BDA-positive axon density from the center of the spinal cord injury to the head and tail borders was significantly increased in animals transplanted with PN-NCSCs multilayered cell sheets. These results suggest that PN-NCSCs multi-layered cell sheets can alleviate cavities and demyelination caused by spinal cord injury, and at the same time, promote the formation of axons, thereby promoting the preservation and recovery of spinal cord structure.
  • the PN-NCSCs multilayered cell sheet was prepared in the same manner as in Example 5 and transplanted onto the damaged spinal cord dura mater. It was. Three days after transplantation of PN-NCSCs multilayered cell sheets, 1 cm long spinal cords were collected, including the center of the damaged spinal cord. Spinal cords were harvested using CelLytic TM MT reagent with 0.1 M phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich) and protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich).
  • the secretion of inflammatory cytokines in the spinal cord was significantly lower.
  • the spinal cord increased the secretion of TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ involved in the inflammatory response and TNF- ⁇ (55.9 pg / ml ⁇ 4.6 in animals transplanted with PN-NCSCs multilayered cell sheets compared to controls).
  • pg / ml, *, P ⁇ 0.05 and IL-1 ⁇ (261.8 pg / ml ⁇ 4.5 pg / ml, *, P ⁇ 0.05) contents significantly decreased.
  • the secretion of TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ was significantly decreased in the spinal cord injury animals treated with BMSCs multilayered cell sheets, similar to the PN-NCSC multilayered cell sheets. No difference was found.
  • neuroactive mRNA expression in the spinal cord after injury was increased compared to the spinal cord before injury.
  • GDNF, NT-3, and NT-4 mRNAs in the injured spinal cord implanted with PN-NCSCs multilayer cell sheets were significantly increased compared to the control and BMSCs multilayer cell sheets.
  • the results showed that the PN-NCSCs multi-layered cell sheet secreted anti-inflammatory and neuroactive factors into the damaged spinal cord to protect the damaged spinal cord and promote neuronal regeneration.

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Abstract

본 발명은 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 본 발명의 다층 세포 시트는 제조하는데 특수한 기구가 필요하지 않으며, 물리적 특성이 좋아 다루기도 쉬우며, 세포 사이에 각종 성장 및 보호 인자 와 세포외 기질이 충분히 축적되어 이식 후 세포의 생존율을 높이며, 세포에 의해 유발된 수축에 의해 두께 또한 얇아 영양분 이동 또한 용이하다. 따라서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 척수 손상 질환 또는 뇌 손상 질환 치료제로 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법
본 발명은 성인 말초신경 유래 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 성인 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내 함입시켜 다층으로 3차원 배양하여 제조된 다층세포시트는 척수 손상 질환 또는 뇌 손상 질환 치료제로 적용 가능하다.
척수 손상(Spinal cord injury; SCI)은 척수에 가해진 외상으로 인하여 정상적인 운동, 감각 및 자율 신경 기능에 이상이 생긴 상태를 말한다. 안타깝게도, 척수 손상 후 신경 기능의 회복은 제한적이며, 대부분의 SCI 환자들은 평생 동안 영구적인 신경 기능 장애에 직면하게 된다. SCI에 대한 치료 방법으로 약물치료, 감압 수술 등이 제시되고 있으나, 세포 사멸을 감소시키고, 2차 손상을 줄이며, 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 촉진할 수 있는 신경 보호 및 재생 기술의 필요성이 대두되면서, 세포치료제 혹은 줄기세포치료제 및 줄기세포치료기술-조직 공학적 제품을 포함한 치료방법이 부각되고 있다.
SCI 치료에 있어, 척수 보호 및 재생을 위한 줄기세포 치료에는 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs), 골수, 제대혈, 지방 조직 유래 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs), 슈반세포(Schwann cells; SCs), 후각초성세포(Olfactory ensheathing cells; OECs), 신경줄기세포(neural stem cells; NSCs), 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs) 등이 적용될 수 있다고 보고되고 있다.
현재 척수 손상을 대상으로 한 임상 및 전임상 시험에서, 줄기세포의 주입은 (1) 척수 내 직접 주사, (2) 뇌척수액에 주입, (3) 정맥 주사를 통해 대부분 이루어 지고 있다. 그 중 투여된 세포의 손상부위 내 전달율이 높다는 이유로 척수 내로 줄기세포를 직접 주사하는 방식이 가장 많이 시행되고 있다. 하지만, 이러한 직접 주사 방식은 척수에 직접 바늘을 삽입해야 하므로 주사 바늘에 의한 추가적인 손상이 생길 뿐만 아니라 주사된 세포나 약물의 용적에 비례하여 추가적인 손상이 생긴다. 또한 투여된 세포는 손상된 신경조직 내 과도한 염증반응 및 자유라디컬에 의하여 손상을 받게 된다. 따라서 투여한 세포의 손상부위로 전달율과 생존율을 동시에 높일 수 있는 세포 이식 방법이 요구되고 있다.
경막외공간은 19세기 후반부터 다양한 약물의 투여 경로로 사용되었으며, 현재에도 무통 분만을 비롯한 마취제 및 진통제의 투여 경로로 널리 사용되고 있다. 경막외공간에 투여된 약물은 주변 척수 및 척수 신경을 비롯한 주위 조직으로 확산하거나 전신 순환에 흡수되어 작용을 나타내며 정맥 투여와 비교하여 약 1/10의 용량으로도 동일한 중추신경계 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서 경막외투여는 척수 신경과 직접적인 접촉 및 손상 없이 척수신경계에 선택적으로 고농도의 약물을 투여할 수 있는 방법이다. 현재까지 척수 손상에서의 줄기세포 치료는 직접적인 세포 대체 효과 보다는 줄기세포에서 분비하는 물질에 의한 신경 보호 및 재생효과가 더 주된 작용 기전으로 알려져 있으므로, 경막외 세포 투여는 직접적인 척수 신경과의 접촉 및 손상없이 높은 농도의 세포 분비물을 전달할 수 있는 효과적인 방법일 수 있다.
종래에는 줄기세포치료제의 척수로의 국소전달을 위한 운반체로서 지지체가 가장 널리 사용하고 있다. 지지체는 세포의 생존과 기능유지에 필수적인 세포외기질을 제공할 수 있어 세포치료제 전달 시 생존율을 높일 수 있다. 지지체는 생체 내에서 분해되는 생분해 특성을 지닌 천연고분자 혹은 합성고분자를 하이드로젤 유형과 다공성 스펀지 유형으로 제조되어 사용되고 있다. 하이드로젤은 다공성 스펀지 유형의 지지체와 비교하여 원하는 모양과 크기로의 제조가 용이하며, 고밀도로 세포를 탑재하여 전달할 수 있는 장점이 있다. 반면 물리적 강도가 취약하여 척수로의 고정하기 어려워, 줄기세포치료제와 혼합한 후 척수 내로 주입 시 가장 널리 사용되는 지지체이다. 반면 다공성 스폰지 유형의 지지체는 다양한 크기와 모양으로 가공이 어려우나 물리적 강도 조절이 용이하여 줄기세포치료제를 척수로의 이식 시 운반체로 적용되고 있다. 그러나 다공성 스펀지 유형의 지지체는 고밀도의 세포를 전달하기 어렵고, 물리적 특성 강화를 위하여 가교반응에 따른 이물반응과 염증반응을 유발하는 단점이 제시되었다.
지지체를 통한 줄기세포치료제의 전달이 갖는 문제점을 극복하기 위하여 줄기세포치료제를 세포시트 형태로 제조하여 생체 내로 국소 전달하는 기술이 보고되고 있다. 종래, 다층세포시트를 제작하기 위해서는, 먼저 단층세포시트를 제작한 후 피펫, 지지막, 특수조작기 등을 이용하여 회수한 단층세포시트를 여러 겹으로 쌓아 다층세포시트를 제조하는 방법이 제시되었다. 단층세포시트를 층을 쌓는 방법은 5층 이상 제작 시 세포시트 내부로 산소 및 영양분 공급이 제한되어 세포손상이 발생하는 문제점이 대두되었으며, 그 결과 5층 미만의 다층세포시트만 생물학적 유효성을 지니는 것으로 밝혀졌다. 단층세포시트의 중첩과정은 3층의 세포시트를 4번 5일 간격으로 층을 쌓는 방법으로 부착하여 만들 수 있지만, 총 제작시간은 20일 이상 소요되며, 세포시트 내 구성 세포의 생물학적 특성이 변화될 가능성도 있을 수 있고, 생체 내로 이식한 3층의 세포시트 내 혈관생성을 유도 후 반복적인 이식을 통해야만 다층세포시트의 치료효과를 얻을 수 있다. 즉, 현재까지 알려진 기술로 두꺼운 세포시트를 제작할 경우 많은 시간과 특수 배양용기 및 조작기가 필요하며, 각 과정 동안 섬세하게 조작하지 않을 경우 세포시트에 손상이 있을 수 있으며, 세포시트의 탈부착 및 이동 과정에서 오염기회 가능성이 단일 배양 과정 보다 많아서 안전성 문제가 제기될 수 있다.
본 발명은 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물, 뇌 손상 치료용 조성물 또는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 신경능선줄기세포의 다층세포시트 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 신경능성줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 신경능선줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 물리적 특성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 신경능선줄기세포에서 생성, 분비 된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다. 본 발명의 다층 세포 시트는 제조하는데 특수한 기구가 필요하지 않으며, 물리적 특성이 좋아 다루기도 쉬우며, 세포 사이에 각종 성장 및 보호 인자 와 세포외 기질이 충분히 축적되어 이식 후 세포의 생존율을 높이며, 세포에 의해 유발된 수축에 의해 두께 또한 얇아 영양분 이동 또한 용이하다. 이는 기존의 세포 시트가 가지고 있던 단점을 대부분 보완한 것으로 사료된다.
도 1은 콜라겐 하이드로젤을 이용하여 말초신경에서 PN-NCSCs를 분리하는 과정을 나타낸다.
도 2는 콜라겐 하이드로젤에 함입된 말초신경에서 시간의 경과에 따른 PN-NCSCs의 성장 및 이동을 나타낸다.
도 3은 콜라겐 하이드로젤을 선택적으로 분해하여 얻은 PN-NCSCs의 군집형성능을 BMSC 와 비교 염색한 결과이다.
도 4는 PN-NCSCs와 BMSC의 군집형성 정도를 나타낸 그래프이다.
도 5는 PN-NCSCs의 증식배가시간과 누적그래프를 나타낸다.
도 6은 PN-NCSCs의 신경능선세포 특이적 면역표현 특성을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 7은 PN-NCSCs의 분화된 신경 및 신경아교세포 특이적 면역표현 특성이 없음을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 8은 PN-NCSCs의 기질세포 특이적 면역표현 특성을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 9는 PN-NCSCs의 혈관내피 내지 조혈계세포 특이적 면역표현 특성이 없음을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 10은 PN-NCSCs의 배아 신경능선세포 특이적 mRNA 발현을 PC12 및 BMSC와 비교한 결과이다.
도 11은 PN-NCSCs의 체외 신경계 세포로의 분화능력을 확인하기 위해 세포구를 형성하여 분화유도 후 신경 및 신경아교세포의 면역표현 특성이 있음을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 12는 PN-NCSCs의 체외 다분화 능력을 확인하기 위해 골 및 지방으로 분화유도 후 세포질 내 지방질이 축적되고 세포외부에 미네랄 침착을 보여 지방세포 및 조골세폴의 분화를 나타낸 결과이다.
도 13은 PN-NCSCs의 3차원 분포 및 배양을 위한 하이드로젤 조성을 비교한 결과이다.
도 14는 PN-NCSCs의 섬유소용해를 매개하는 uPA, tPA의 mRNA 발현율을 나타낸다.
도 15는 PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 하이드로젤 조성을 비교한 결과이다.
도 16은 PN-NCSCs를 함입하는 하이드로젤 조성에 따른 세포의 3차원적 분포를 비교한 결과이다.
도 17은 PN-NCSCs의 3차원 배양환경에 따른 세포의 자멸사를 비교한 결과이다.
도 18은 부착환경에서 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 세포 밀도에 따른 세포간 결합을 비교한 결과이다.
도 19는 하이드로젤 내 함입되는 PN-NCSCs의 세포 수에 따라 다층세포시트 내 중첩되는 세포층을 나타낸다.
도 20은 부유배양 시간에 따른 PN-NCSCs의 다층세포시트 내 섬유소의 응축과 수분 방출을 나타내는 결과이다.
도 21은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포외기질의 축적(fibronectin, laminin, collagen type IV)을 나타낸다.
도 22는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 혈관생성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 23은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 항염증인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 24는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포성장/보호인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 25는 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경활성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 26은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경활성인자 축적을 mRNA 발현을 통해 나타낸다.
도 27은 PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포간 결합(beta catenin)과 세포와 세포외기질 결합(CD29)을 나타낸다.
도 28은 PN-NCSCs의 세포보호효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSCs의 배양액을 농도별 처리 후 세포의 생존율을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 29는 PN-NCSCs의 세포사멸 억제효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSCs의 배양액을 농도별 처리 후 세포의 자멸사 인자인 caspase 3 및 caspase 7 억제능력을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 30은 PN-NCSCs의 신경세포 증식 효과를 확인하기 위해 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 SH-SY5Y 세포의 증식 정도를 DNA 농도로 나타낸 결과이다.
도 31은 PN-NCSCs의 배양액을 사용하여 분열한 SH-SY5Y 세포를 확인하기 위해 BrdU 항체를 이용한 면역염색 결과를 BMSC 와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 32는 도 21의 결과를 그래프로 나타낸 결과이다.
도 33은 PN-NCSCs의 신경돌기 및 시냅스 형성을 촉진함을 확인하기 위해 배양액을 농도별로 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 증가를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 34는 PN-NCSCs의 배양액을 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 길이를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 35는 PN-NCSCs의 배양액을 처리한 SH-SY5Y 세포의 신경돌기 연결 정도를 NGF 또는 BMSC와 비교하여 나타낸 결과이다.
도 36은 PN-NCSCs의 염증억제효과를 확인하기 위해서 대식세포를 활성화한 후 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 TNF-α의 발현이 감소됨을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 37은 PN-NCSCs의 염증억제효과를 확인하기 위해서 대식세포를 활성화한 후 PN-NCSCs 배양액을 농도별 처리하여 IL-1β의 발현이 감소됨을 BMSC와 비교한 결과이다.
도 38은 척수손상 백서로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 3일재 척수 내 잔존율을 나타낸 분자영상사진이며, PN-NCSCs 세포 수와 비례하여 척수 내 잔존하는 세포 수가 증가되는 결과를 나타낸다.
도 39는 척수손상 백서로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 척수와 부착하고 척수 내 혈관이 다층세포시트 내로 성장하여 생착되는 결과를 나타낸 결과이다.
도 40은 척수손상 백서의 척수로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 3일, 7일, 14일, 28일까지 생존하는 결과를 나타낸 결과이다.
도 41은 손상척수 경막 위에 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 섬유아세포 및 혈관내피세포로의 분화특성을 나타낸다.
도 42는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 운동기능 회복을 나타낸다.
도 43은 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 감각기능 회복을 나타낸다.
도 44는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 백서의 전기생리 기능 회복을 나타낸다.
도 45는 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 2주째 손상된 척수를 재생하는 능력을 나타낸다.
도 46은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 4주째 손상된 척수를 재생하는 능력을 나타내는 결과이다.
도 47은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 2주째 Bodian's silver 염색을 통한 형태계측 방법을 통하여 축삭 재생 작용을 나타내는 결과이다.
도 48은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 4주째 손상된 척수 내의 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 신경회로 복구 정도를 나타낸다.
도 49는 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 이식 4주째 이식한 손상된 척수 내의 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 나타낸다.
도 50은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 TNF-α 및 IL-1β의 발현양 감소를 통하여 척수 내 염증 억제효과를 나타낸다.
도 51은 척수손상 백서의 척수 외막으로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트의 손상 받기 전 척수와 비교하여 손상 후 척수 내 신경활성 mRNA 발현이 증가되는 것을 나타낸다.
이에, 본 발명자들은 현재까지 알려진 방법으로 두꺼운 다층세포시트 제작 시 요구되는 시간과 복잡한 과정을 개선하고, 오염 등 여러 위험성을 방지하고자 하였다. 생분해성 천연고분자 하이드로젤을 3차원 지지체로 이용하여, 말초신경 유래 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시켜 3차원 단일 배양과정을 통하여 다층세포시트를 제조하는 방법을 제공하고자 한다. 종래의 다층세포시트 제조 시 물리적 취약성으로 인하여 시트가 손상되는 문제 및 오염 위험성을 방지하며, 다단계 배양공정을 단일 배양공정으로 제조하는 방법을 통하여 제작시간을 단축할 수 있는 신경능성줄기세포 다층세포시트를 제조할 수 있는 새로운 방법을 제공하고자 한다. 더불어 신경능선줄기세포 다층세포시트는 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간의 결합을 통한 물리적 특성을 강화할 수 있으며, 세포배양 과정 중 신경능선줄기세포에서 생성, 분비된 생리활성인자 및 세포외기질을 다층세포시트 내 축적시켜 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화할 수 있다. 척수 경막외로의 전달을 통하여 줄기세포치료제의 전달율, 잔존율, 그리고 생착율 증대를 통하여 척수재생 및 척수보호를 증진시킬 수 있는 방법을 제공함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계; (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계; (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및 (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포는 말초신경(peripheral nerve, PN)으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계는 배양된 신경능선줄기세포를 용액 상태의 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시킬 수 있다. 바람직하게는 30초에서 10분 내로 용액 상태에서 젤 상태로 하이드로젤의 상전환을 조절할 수 있다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 천연 혹은 합성 고분자로 제조할 수 있으며, fibrin, collagen, gelatin, chitosan, PLLA, PEG, peptide 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 3차원 하이드로젤 내 고분자 함량은 0.1% ~ 5%로 구성되나, 바람직하게는 0.5% 미만의 고분자로 구성될 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤일 수 있으며, 상기 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 하이드로젤은 탄성계수(elastic modulus)가 낮은 콜라겐(collagen)과 탄성계수가 높은 피브린(fibrin)을 혼합한 하이드로젤을 사용하여 부착환경 배양 시 세포-매개 수축현상에 의하여 하이드로젤이 배양용기(mold)로부터 탈락되는 현상을 방지하였다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 트롬빈 및 콜라겐 혼합용액에 첨가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 본 발명에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 내 세포 세포층을 조절하기 위하여 용액 상의 하이드로젤 내 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml 밀도의 세포를 혼합하여 특정한 모양의 틀(mold/몰드)에 100 μl/mm2 내지 500 μl/mm2 용량을 전달한 후 37℃에서 2시간 동안 중합/가교과정을 거쳐 젤(gel)로 상전이 시켜 3차원적으로 균일하게 세포가 분포하도록 하며, 바람직하게는 2.5 × 106/ml 내지 1 × 107/ml 세포 밀도로 150 μl/mm2 내지 250 μl/mm2 용량을 전달하여 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제조할 수 있다. 세포밀도 및 용량의 조절을 통하여 10층 내지 50층으로 구성된 다층세포시트를 제조할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양할 수 있다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도할 수 있다. 상기 부착배양조건에서 1일 내지 5일간 배양을 통하여 하이드로젤 내 함입된 세포가 하이드로젤 섬유상 체인(fibrillary chain)에 부착하고, 세포질의 확장, 이동 및 세포간 접합을 유도하여 물리적 특성을 강화하는 방법이다.
바람직하게는, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 하이드로젤 내로 축적할 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 혈관성장인자는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안지오포이에틴 계열, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 또는 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 항염증인자는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 신경활성인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF), 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 및 NT-4/5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴트로핀 계열; 신경교세포주-유래 신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF) 또는 아테민(artemin; ARTN)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 GDNF 계열; 에프린(ephrin; EFN) A1, 에프린 A2, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 에프린 계열; 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 CNTF 계열; 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF); 뉴레귤린(neuregulin; NRG) 또는 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
보다 바람직하게는, 상기 신경보호/성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)-7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 및 FGF-14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 FGF 계열일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시킬 수 있다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 제공한다.
바람직하게는, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 내 하이드로젤은 생체 내 염증반응 및 이물반응을 유발하지 않으며, 생체 내 3일 내지 3주 이내에 완전히 분해되는 생분해 특성을 지닌다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 세포막이 온전히 유지된 상태이며, 하이드로젤 고분자 및 세포외기질 지지를 통하여 안정적 구조적 특성을 지녀, 손상 부위의 과도한 산화 자유 라디칼 매개 손상과 염증반응 매개체로부터 이식한 신경능선줄기세포의 생존율을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 손상된 신경 내 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 증진시킬 수 있고, 손상된 신경 내 염증반응을 억제시키며, 손상된 신경 내 혈관생성을 증진시킬 수 있다.
특히, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 신경능선줄기세포에서 분비되는 염증억제인자, 신경활성/재생인자, 신생혈관유도인자를 통하여 척수조직재생을 유도하는 작용기전을 통하여 손상된 척수재생과 기능을 회복시키는 세포치료법을 제공한다.
한편, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 전신적으로 투여하는 경로가 아니라 손상 척수부위로 직접 국소 이식하여 척수 내 전달효율을 증진시킬 수 있으며, 척수 내로 주입 시 주입과정에서 동반되는 이차적 척수손상을 방지하기 위하여, 손상된 척수를 싸고 있는 경질(dura 혹은 dura matter) 내 혹은 외로 국소 전달하여 이식 시 이차적 척수손상을 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 신경능선줄기세포의 다층세포시트를 척수로 국소 전달 시 세포의 이식 부위 정체률(retention ate)과 생착률(engraftment rate)을 높일 수 있으며, 국소 전달된 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 척수 주변조직 및 혈관과 융합하여 4주 이상 생존하여 지속적으로 항염증인자, 신경재생/활성인자, 신생혈관인자를 분비하여 손상된 척수재생과 기능회복을 증진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 치료용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 조성물은 신경세포 손상을 억제하고, 신경세포 성장 및 분화를 촉진할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 치료용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 성인 말초신경으로부터 PN-NCSCs 분리 및 배양
인제대학교 의과대학 윤리위원회 승인 후 성인 말초신경(peripheral nerve, PN)로부터 신경능선줄기세포(Peripheral Nerve-derived Neural Crest Stem Cell, NCSCs)를 분리하고자 하였다. PN-NCSCs 분리는 KR 10-1389851에 제시된 방법을 이용하였다. 뇌사자로부터 공여받은 말초신경은 주변 연부조직과 신경외막을 제거한 후 1 mm3 크기의 절편으로 절단한 후 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) 용액으로 5번 세척하였다. 말초신경은 콜라겐 용액(0.5 % porcine skin derived collagen, Matrixen™-PSC, 바이오랜드, 대전, 대한민국)을 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 0.2% 콜라겐 용액과 말초신경 절편을 혼합한 후 혼합액 10 mL을 100-mm 배양용기로 옮긴 후 겔이 형성되도록 37℃ 인큐베이터에서 2시간 동안 반응하였다. 콜라겐 하이드로젤이 형성된 후 10 ml 세포배양액을 첨가하였다. 세포배양액은 90% DMEM (웰진, 경산시, 대한민국), 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; Gibco, 서울, 대한민국), 10 ng/ml epidermal growth factor (EGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 2 ng/ml basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 ng/ml insulin-like growth factor (IGF, Peprotech, 서울, 대한민국), 10 μg/ml 젠타마이신(gentamicin, Invitrogen) 조성으로 제조하였다. 이후 배양접시는 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에서 30 rpm 속도로 교반 하면서 2주간 배양하였다. 신선한 세포배양액은 2일마다 교체하였다. 말초신경 절편에서 콜라겐 하이드로젤 내로 이동 성장한 PN-NCSCs는 collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, 미국)을 사용하여 콜라겐 하이드로젤을 분해한 후 유리되는 세포를 회수하였다. 회수된 PN-NCSCs는 통상적인 단층배양법으로 증폭 배양하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 떼어낸 후 계대 배양하였다.
도 1과 같이, 콜라겐은 pH를 중성으로 만든 후 37℃에서 2시간 반응 후 고형성 콜라겐 하이드로젤이 형성되었고, 그 결과 말초신경 조직을 하이드로젤 내에 3차원적으로 함입시켰다.
도 2에 나타난 바와 같이, 콜라겐 하이드로젤 지지 3차원 장기 배양법을 통하여 말초신경으로부터 세포의 이동, 성장을 유도할 수 있으며 3차원적으로 함입한 이후 24시간 이내에 세포의 이동을 관찰하였다. 배양 1주 후, 하이드로젤 내로 말초신경조직으로부터 이동, 성장한 세포가 증가하였고, 배양기간이 증가됨에 따라 말초신경으로부터 이동, 성장하는 세포 수가 비례하여 증가하였다. 말초신경으로부터 이동 성장한 세포가 함유된 콜라겐 하이드로젤은 DMEM:F12 배지 내에 용해된 0.01% collagenase type I (Worthington Biochemical, Lakewood, 미국)을 사용하여 콜라겐 하이드로젤을 분해한 후 유리되는 세포를 회수하였다. 회수된 PN-NCSCs는 통상적인 단층배양환경에서 증폭 배양하였다. 세포가 80% 이상의 밀집도 상태에서 0.05% 트립신/EDTA (시그마알드리치, 서울, 대한민국)를 사용하여 세포를 배양용기로부터 때어낸 후 배양하였다. 2주간 장기 배양 후 하이드로젤 내로 이동, 성장한 세포는 콜라겐 분해 효소인 0.01% collagenase를 사용하여 하이드로젤로부터 회수하였고, 하이드로젤로부터 해리된 세포 95% 이상 생존을 나타내었다. 단층배양환경에서 PN-NCSCs은 전형적인 방추상 모양으로 성장하였다.
< 실시예 2> 성인 말초신경 유래 PN - NCSCs의 성장특성, 면역표현형, mRNA 발현특성
PN-NCSCs의 체외 성장능력은 colony 형성도(colony forming unit-fibroblasts, CFU-Fs)와 세포배가시간(population doubling time, PDTs)로 평가하였다. 분리한 PN-NCSCs의 면역표현적 특성은 면역형광염색을 시행한 후 공초점 레이저스캔현미경으로 분석하였다. 면역표현특성을 평가하기 위하여 사용한 항체는 신경능선세포 표지자인 p75NTR, nestin, sox-10, myelin protein 0 (P0), 신경세포 표지자인 neuronal class III β-Tubulin (Tuj1), 신경교세포 표지자인 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자인 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), 중간엽줄기세포 표지자인 CD105 및 CD29, 조혈모세포 표지자인 CD45, 혈관내피세포자인 CD34를 이용하여 면역표현 특성을 평가하였다.
1) PN-NCSCs의 자기복제(self-renewal) 능력
PN-NCSCs의 자기복제 능력은 콜로니 형성 유닛-섬유아세포(colony forming unit-fibroblasts, CFU-Fs)와 군집배가시간(population doubling time, PDTs)으로 평가하였다. PN-NCSCs의 CFU-F의 형성능력을 평가하고자 단층배양법에 의해 증폭된 세포를 5 cells/cm2 밀도의 100-mm 배양 접시에 파종한 후 성장배양액을 첨가하였다. 배양 7일째, 2% 포르말린으로 10분간 세포를 고정한 후 0.1% crystal violet (LabChem Inc., Pittsburgh, PA)으로 염색하여 관찰하였다. 형성된 CFU-F 형성능력은 영상분석 프로그램(Image J, NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 2 mm 크기 이상의 콜로니 수를 측정하였으며, 파종세포 수 당 콜로니 수를 산정하여 백분율(%)로 표기하였다. 골수 유래 중간엽줄기세포(bone marrow-derived mesenchymal stem cells; BMSCs)를 대조군으로 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs는 단층배양환경에서 다수의 콜로니를 형성하였고, 콜로니는 방추상 모양의 세포가 고밀도로 군집되어 구성하였다. 이는 PN-NCSCs이 자기복제능력을 보유하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 대조군인 BMSC의 경우 콜로니 형성이 낮았으며, 또한 콜로니를 구성하는 방추상 모양의 세포는 저밀도로 군집하여 있었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 BMSC에서 파종한 세포의 5% 미만에서 콜로니를 형성하였으나, PN-NCSCs의 경우 파종한 세포의 30% 이상에서 콜로니를 형성하였고, 계대배양 33회 이상에서도 콜로니 형성능력이 유지되는 것은 체외에서 높은 성장능력을 지닌 것임을 확인할 수 있었다.
2) PN-NCSCs의 체외성장 능력
단층배양환경에서 세포배가시간(population doubling time, PDT)를 산정하여 PN-NCSCs의 체외성장 능력을 평가하였다. 1000개의 세포들을 48-멀티웰(multi-well) 배양용기에 파종하여 3일간 배양하였다. CelLyticTM MT lysis reagent (Sigma-Aldrich, Seoul, Korea)을 이용하여 세포를 용해하였고, 용해된 DNA 함량을 Quant-iT™ PicoGreen reagent (Molecular probes, Eugene, OR)을 이용하여 측정하였다. 형광 마이크로 플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광(emission) 485 nm, 여기(excitation) 540 nm 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도를 세포수로 전환하기 위해 말초신경조직으로부터 분리한 세포를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 이 표준곡선을 이용하여 샘플 내 형광강도를 세포수로 변환하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포 수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포 수이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 단층배양환경에서 PN-NCSCs는 43회 이상 계대배양이 가능하였다. 계대배양 43회까지 PN-NCSCs의 PDT는 평균 13.5~15.8 시간 이내로 뛰어난 체외 세포성장 능력을 보였다. 또한 계대배양이 길어짐에 따라서 PDT는 다소 증가하였지만, 계대배양 43번째까지 세포의 노화는 나타내지 않았다. 이는 말초신경조직으로부터 분리한 세포는 자기복제능력과 성장능력이 뛰어남을 확인하였다.
3) PN-NCSCs의 면역표현 특성
PN-NCSCs의 면역표현형 특성을 분석하기 위하여 면역형광염색을 시행하였다. 단층배양환경에서 증폭 배양한 3×104 세포를 4-멀티웰 챔버 슬라이드(Lab-Tek™ II Chamber Slide™ System, Thermo Fisher Scientific, Seoul, Korea)에 파종하여 1일간 배양하였다. 이후, acetone/methanol 1:1 혼합액으로 세로를 고정하였다. 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 5% 우혈청알부민(bovine serum albumin, BSA; Fraction V, IgG-free, Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 상온에서 30분간 반응하였다. 면역표현 특성을 평가하기 위하여 사용한 일차항체는 신경능선세포 표지자로 p75NTR, nestin, sox-10, 신경세포 표지자인 neuronal class III β-tubulin (Tuj1), 성상세포 표지자로 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자로 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), 슈반세포 (Schwann cell) 표지자로 myelin protein 0 (P0), 간질세포(stromal cell) 표지자로 CD105 및 CD29, 조혈모세포 표지자로 CD45, 혈관내피세포 표지자로 CD34를 항체를 이용하였다. 이후 해당 일차항체 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated IgG를 상온에서 45분간 반응하여 시그널을 검출하였다. 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색한 후 공초점 현미경으로 분석하였다. BMSC 및 신경능선 유래 종양세포주인 PC12를 대조군으로 사용하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 단층배양법에 의해 체외에서 증폭시킨 PN-NCSCs는 신경능선세포 표지자인 p75NTR (95.6% ± 2.67%), Sox-10 (88.2% ± 3.6%), nestin (95.7% ± 2.7%)의 발현율을 나타내었다. 신경능선 유래 종양세포주인 PC12는 p75NTR (90.3% ± 5.2%), Sox-10 (81.2% ± 5.5%), nestin (92.6% ± 1.1%)의 발현율을 나타내었다. 반면 BMSCs의 경우 p75NTR는 41.7% ± 3.0% 발현되었지만, Sox-10에서 2.2% ± 1.4%, nestin은 1.1% ± 1.1%으로 낮은 발현율을 나타내었다. 이상의 결과는 3차원 장기배양법을 통하여 말초신경조직으로부터 분리한 세포가 신경능선 기원 세포와 동일한 면역표현 특성을 지닌 것을 확인할 수 있다.
도 7에 나타난 바와 같이, 말초신경 유래 PN-NCSCs의 신경세포 및 신경교세포 표지자의 발현율을 분석하였다. 신경능선 유래 종양세포인 PC12는 신경세포 표지자인 Tuj1는 2.9% ± 0.9%, 성상세포 표지자인 GFAP는 32.5% ± 3.2%, 핍지세포 표지자인 A2B5는 69.9% ± 6.7%, MBP는 23.1% ± 1.1%로 발현율은 비록 낮지만 배양 과정 중 신경세포 및 신경교세포로 분화한 세포가 혼재되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 반면 PN-NCSCs 및 BMSC의 경우 신경세포, 성상세포, 핍지세포, 슈반세포 표지자 모두 1% 미만으로 검출되어, 신경세포 및 신경교세포 면역표현형을 지닌 세포는 검출되지 않았다. 이상의 결과는 말초신경 유래 PN-NCSCs은 성숙한 신경능선 세포가 아니라 미분화 상태의 신경능선 유래 줄기세포와 동일한 면역표현 특성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 기질세포의 표지자로 알려진 CD29와 CD105는 PC12, PN-NCSCs, BMSCs 모두에서 95% 이상 발현되었다. BMSCs와 동일하게 PC12와 PN-NCSCs은 기질-의존(substrate-dependent) 특성을 지닌 세포임을 확인할 수 있었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 혈관내피세포 표지자인 CD34, 조혈계세포 표지자인 CD45를 이용하여 말초신경 유래 PN-NCSCs 분리 배양과정 중 조혈계 세포 및 혈관세포로부터 유래한 세포의 오염 여부를 확인하고자 하였다. PC12, NCSCs, BMSCs 모두 CD34 및 CD45의 발현율은 1% 미만으로 발현되어, 조혈계 세포 및 혈관계 세포로부터의 오염이 없다는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 3차원 장기배양방법을 통하여 말초신경조직으로부터 이동, 성장한 세포는 혈관내피세포 및 조혈계 세포로의 오염이 없는 순도가 높은 PN-NCSCs임을 반영하는 결과이다.
4) 신경 유래 PN-NCSCs의 mRNA 발현특성
실시예 1과 같이, 말초신경으로부터 세포를 분리한 후, 2차원 단층배양법에 의해 세포를 증폭 배양하였다. 신경세포 특이 mRNA 발현 여부를 확인하기 위하여, TRI-reagent® (Thermo Scientific)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 신경능선 특이 유전자인 Sox-2, Sox-10, Fgf5 mRNA 발현을 평가하기 위하여 reverse-transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) 후 전기영동 분석을 통하여 판정하였다. PC12와 BMSCs를 대조군으로 사용하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, 3차원 장기배양법을 통하여 말초신경조직으로부터 이동, 성장해 온 PN-NCSCs는 PC12와 함께 신경능선세포와 관련된 mRNA인 Sox-2, Sox-10, Dlx2, Tcfap2a, Erbb3, Fgf5 mRNA가 발현되었다. 반면에 대조군으로 사용한 BMSCs에서는 신경능선세포 표지자 및 외배엽세포 표지자는 음성으로 발현이 되지 않았다. 이는 말초신경조직을 이용한 3차원 장기배양방법을 통하여 이동, 성장 해온 세포는 신경능선 유래 세포임을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3> 성인 말초신경 유래 PN - NCSCs의 신경능선 계열 세포로의 다분화능력
1) 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력
20만개의 PN-NCSCs를 세포부착을 억제하는 24-멀티웰 세포배양용기(Ultra-Low attachment plates, Sigma-Aldrich)에 파종하여 부유배양(suspension culture) 환경에서 배양하였다. 부유배양 환경에서 PN-NCSCs는 배양용기와의 부착이 방지되었고, 반면 세포-세포 간 접합이 유도되어 미세구(microsphere) 형성을 유도하였다. 신경세포 및 신경교세포로 분화를 유도하기 위하여 99% Dulbecco's Minimum Essential Medium (DMEM), 1% 송아지 혈청(calf serum; Gibco), 0.1 μM 덱사메타손(Sigma-Aldrich), 50 μg/ml 아스코르브산(Sigma-Aldrich), 0.1% dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) 조성의 분화배지를 첨가한 후 5일간 배양하였다. 부유배양환경에서 5일간 배양 후 미세구를 회수하여 4% 중성 포르말린으로 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록은 5 μm 두께로 파라핀 절편을 취득한 후 면역형광염색을 실시하였다. 세포특이 표지자 발현 여부로 미세구 내 PN-NCSCs의 신경세포 및 신경교세포 분화여부를 평가하였다. 세포-특이 표지자 발현 여부를 평가하기 위하여 사용한 항체는 신경세포 표지자인 neuronal class III β-Tubulin (Tuj1), neurofilament-200 (NF200), 성상세포 표지자인 glial fibrillary acidic protein (GFAP), 핍지세포 표지자인 A2B5, oligodendrocyte transcription factor (Olig2), myelin basic protein (MBP), Schwann 세포 표지자인 P0를 사용하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, 말초신경으로부터 분리한 PN-NCSCs 세포의 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력을 확인하고자 하였다. 부유배양환경에서 형성된 미세구 내 PN-NCSCs는 신경세포 표지자인 Tuj1, NF200, 성상세포 표지자인 GFAP, 핍지세포 표지자인 A2B5, Olig2, MBP, Schwann 세포 표지자인 P0, 섬유아세포 표지자인 SMA는 모두 양성으로 발현되어 신경능선 유래 줄기세포와 같이 신경세포 및 신경교세포로의 분화능력을 가진 것으로 확인하였다. 반면 대조군으로 사용한 BMSC에서는 해당 표지자가 모두 음성으로 신경능선 세포로의 분화능력을 확인할 수 없었다.
2) PN-NCSCs의 지방세포 및 조골세포로의 분화능력
PN-NCSCs의 지방으로의 분화능력을 평가하기 위해서 20만개의 세포를 24-멀티웰 세포배양용기에 파종한 뒤 90% DMEM에 10% 송아지혈청, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (Sigma-Aldrich), 1 μM 덱사메타손, 0.2 unit/ml 인슐린(Sigma-Aldrich), 200 μM 인도메타신(Sigma-Aldrich)으로 구성된 분화배지를 첨가한 후 2주간 배양하였다. 지방세포로의 분화는 세포질 내 지방축적 여부로 평가하였으며, 이를 위하여 0.5% Oil Red O (Sigma-Aldrich) 염색을 이용하여 분석하였다. PN-NCSCs의 조골세포로의 분화능력을 평가하기 위해서 20만개의 세포를 24-멀티웰 세포배양용기에 파종한 후 90% alpha-minimum essential medium (α-MEM; Welgene)에 10% 송아지혈청, 0.1 μM 덱사메타손, 10 mM β-글리세롤 인산(Sigma-Aldrich), 50 μM 아스코르브산 조성의 분화배지를 첨가한 후 2주간 배양하였다. 조골세포로의 분화는 미네랄의 침착여부로 평가하였으며, 이를 위하여 alizarin red S (Sigma-Aldrich)염색을 시행하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, 말초신경조직으로부터 분리한 PN-NCSCs의 중간엽계 세포로의 분화능력을 평가하고자 지방세포 및 조골세포로의 분화를 유도하였다. 배양 2주 후, 지방세포로 분화를 유도한 PN-NCSCs에서 세포질 내로 지방질의 축적을 관찰할 수 있으며, oil red O 염색을 통하여 확인할 수 있었다. 또한 조골세포로 분화가 유도된 PN-NCSCs에서는 세포의 형태가 입방상피 모양을 나타내었으며, 알리자린 레드(alizarin red S) 염색을 통하여 무기질 침착을 확인할 수 있었다. 이는 말초신경조직을 이용한 3차원 장기배양법을 통하여 이동, 성장한 세포는 신경능선 계열과 중간엽 계열 세포로의 다분화 능력을 보유한 것으로 확인할 수 있었다.
<실시예 4> PN-NCSCs 3차원 분포 및 배양을 위한 하이드로젤 조성
1) PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 피브린 하이드로젤 조성
인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 최종 0.5%의 농도에 피브리노겐 용액을 제조하였다. 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 DMEM에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 십만 개 혹은 백만 개 PN-NCSCs을 1 ml에 트롬빈 용액과 혼합하여 PN-NCSCs가 분산된 트롬빈 용액을 제조하였다. 이후 피브리노겐 용액과 PN-NCSCs가 포함된 트롬빈 용액을 1:1 비율로 혼합하여 100 μl를 24-멀티웰 플레이트에 옮긴 후 37℃ 인큐베이터에 넣어서 2시간 동안의 가교반응을 거쳤다. 이후 DMEM에 1% 혹은 10% 송아지 혈청(calf serum, CS)과 10 μg/ml 젠타마이신이 첨가된 배양액을 첨가하였다. 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 1일간 배양하였다. PN-NCSCs의 섬유소 용해 활성도와 이를 억제하는 PAI 역할을 평가하기 위하여 항섬유소용해제(plasminogen activator inhibitor, PAI)인 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 사용하였다. 섬유소용해제 억제제인 PAI를 넣지 않은 피브린 하이드로젤은 대조군으로 사용하였다.
도 13에 나타난 바와 같이, PAI가 포함되지 않은 피브린 하이드로젤은 PN-NCSCs의 섬유소용해 작용에 의하여 배양 1일째부터 하이드로젤이 완전히 용해되어 PN-NCSCs가 부착하고 성장할 수 있는 3차원적 기질을 제공하지 못하였다. 피브린 하이드로젤 용해는 하이드로젤 내 함입된 세포 수와 혈청농도와 비례하였다. 십만 개의 PN-NCSCs가 함유된 피브린 하이드로젤의 경우 혈청농도와 무관하게 배양 1일째는 용해되지 않고 3차원 기질을 제공하였으나, 배양 2일째부터 하이드로젤은 용해되기 시작하였으며, 배양액 내 10% 혈청을 함유한 경우 90% 이상의 하이드로젤이 용해되었으며, 배양액 내 1% 혈청을 함유한 경우에도 60% 이상의 하이드로젤이 용해되어 PN-NCSCs은 배양용기 바닥에 부착하여 2차원적으로 성장하였다. 반면 백만 개의 PN-NCSCs가 함유된 피브린 하이드로젤의 경우는 혈청농도와 무관하게 배양 1일째 하이드로젤이 용해되어 세포는 배양용기 바닥에 부착하여 2차원적으로 성장하였다. 반면 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid)을 배양액 및 하이드로젤 내로 첨가하여 PN-NCSCs의 섬유소용해 활성을 억제하였을 때 십만 개 세포가 함입된 피브린 하이드로젤은 혈청농도와 상관없이 세포-매개 섬유소용해 작용을 억제할 수 있었으며, 그 결과 피브린 하이드로젤의 3차원 기질로서의 기능은 유지될 수 있었다. 반면 백만 개의 PN-NCSCs이 함유된 피브린 하이드로젤은 혈청농도와 상관없이 트란제믹산(tranexamic acid)을 통한 세포-매개 섬유소용해 작용을 억제할 수 없었다.
도 14에 제시한 바와 같이, PN-NCSCs는 BMSC 및 섬유아세포와 비교하여 섬유소용해를 매개하는 urokinase type plasminogen activator (uPA) 및 tissue plasminogen activator (tPA) mRNA의 발현이 유의하게 높았으며, PN-NCSCs에서 생성되어 분비되는 uPA 및 tPA에 의하여 피브린 하이드로젤이 용해되는 것을 반영한다. 이상의 결과는 피브린 하이드로젤은 저밀도 PN-NCSCs의 3차원 배양은 가능하나, 고밀도 3차원 배양을 위한 하이드로젤로서는 적합하지 않다는 것을 확인할 수 있었다.
2) PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 콜라겐-피브린 하이드로젤 조성
PN-NCSCs의 3차원 배양을 위하여 0.2% 콜라겐(porcine skin derived collagen, Matrixen™-PSC, SK바이로랜드, 천안, 대한민국) 혹은 0.25% 피브리노겐(Greencross, 수원. 대한민국)와 0.2% 콜라겐이 혼합된 하이드로젤을 사용하였다. 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 이후 2 x 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 피브리노겐/콜라겐 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS)과 10 μg/ml 젠타마이신이 첨가된 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 이후 PN-NCSCs가 함입된 피브린/콜라겐 하이드로젤은 1% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 절편을 취득한 후 hematoxylin eosin 염색을 통하여 세포질의 확장 및 세포의 3차원 분포를 평가하였다.
도 15에서 제시하였듯이, 콜라겐 혹은 콜라겐/피브린 하이드로젤 내로 PN-NCSCs을 함입시킬 수 있었으며, 피브린 하이드로젤과 달리 3일 동안의 배양기간 중 하이드로젤은 PN-NCSCs의 3차원 기질로서 그 기능과 구조가 유지되었다. PN-NCSCs이 함입된 콜라겐 하이드로젤은 배양 1일째 하이드로젤이 수축되어 O-ring과 배양용기로부터 탈락되었으며, 배양기간이 길어질수록 하이드로젤 수축이 증가되었다. 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 배양 3일 동안 O-ring 및 배양용기에 안정적으로 부착되었고 수축되어 하이드로젤이 탈락되는 현상은 발생하지 않았다.
도 16에서 제시하였듯이, 콜라겐 하이드로젤은 sol에서 gel이 형성되는 상전이 시간은 평균 48분 소요되었으나, 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 sol에서 gel로의 상전이 시간은 평균 5분 이내로 이루어졌다. 하이드로젤 내로 함입된 PN-NCSCs의 3차원적 분포는 형태학적으로 평가하였으며, 콜라겐 하이드로젤 내 PN-NCSCs은 하이드로젤 하층에 밀집하여 분포하고 있었으나, 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤 내 PN-NCSCs은 층에 따른 세포분포는 차이가 없이 균일하게 3차원적으로 분포하고 있었다.
이상의 결과는 콜라겐 하이드로젤은 PN-NCSCs의 3차원 배양을 위한 지지체로서의 기능을 제공할 수 있으나, 상전이 시간이 늦는 특성으로 인하여 PN-NCSCs의 균일한 3차원 분포를 제공할 수 없었으며, 또한 취약한 물리적 특성을 지녀 세포-매개 수축에 대한 저항성이 없어 O-ring과 배양용기로부터 탈락되어 수축되는 문제점을 확인할 수 있었다. 반면 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 상전이 시간이 빨라 균일한 3차원적 세포분포를 이룰 수가 있었으며, 세포-매개 하이드로젤 수축에 대한 저항성을 띄는 물리적 특성을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> PN-NCSCs 다층세포시트의 제조
1) PN-NCSCs 다층세포시트 제조를 위한 배양환경
PN-NCSCs 다층세포시트 제조를 위한 배양환경과 배양기간을 설정하고자 하였다. 실시예 4에 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. Hematoxylin eosin 염색을 시행한 후 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 생존율을 평가하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 세포질의 응고 및 핵의 분절이 관찰되는 세포 자멸사(apoptosis) 빈도는 부유배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs에서 부착배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs 보다 유의하게 증가되었다. 부유배양환경에서 배양한 하이드로젤의 PN-NCSCs 세포 자멸사 빈도는 배양 1일째 4.5% ± 0.8%, 배양 2일째 8.5% ± 2.4%, 배양 3일째 12.7% ± 2.6%였다. 세포자멸사 빈도는 부유배양환경에서의 배양기간과 비례하여 증가하였다. 반면 부착배양환경에서 배양한 하이드로젤 내 PN-NCSCs 세포자멸사 빈도는 배양 1일째 0.3% ± 0.1%, 배양 2일째 0.6% ± 0.3%, 배양 3일째 0.7% ± 0.2%로 1% 미만의 세포자멸사 빈도를 보였다. 부유배양환경에서 배양기간이 길어질수록 세포-매개 하이드로젤 수축이 증가 되고, 그 결과 하이드로젤 내부로의 영양분 및 산소공급이 차단되어 세포손상 및 세포죽음이 발생한다는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 다층세포시트 내 세포손상을 방지하기 위해서는 물리적 지지를 통하여 하이드로젤 수축을 억제하며, 동시에 하이드로젤 내부로 산소, 영양분, 대사산물 교환을 지속적으로 제공할 수 있는 부착배양환경이 요구되는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 하이드로젤 내로 PN-NCSCs의 3차원 분포 및 배양을 위하여 하이드로젤, 배양액 조성 및 배양환경에 따라 상이한 편차가 발생하는 것을 확인할 수 있다.
2) PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포층 조절
실시예 5에 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 5 × 105, 1 × 106, 2 × 106, 4 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 피브리노겐/콜라겐 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 한 시간 동안 반응시켰다. 이후 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 1일간 배양하였다. 배양 1일 후 PN-NCSCs이 함유된 하이드로젤은 O-ring으로부터 떼어내 후 부유환경에서 2시간 배양하였다. 이후 제조된 PN-NCSCs다층세포시트는 1% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 절편을 취득한 후 hematoxylin eosin 염색을 통하여 세포층을 평가하였다.
도 18에 제시하였듯이, 부착배양 환경에서 위상차 현미경 관찰 상 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 함입된 PN-NCSCs는 배양 6시간 후 세포질의 확장을 관찰할 수 있으며, 이는 하이드로젤 내 고분자 체인과 세포가 부착하여 세포질 확장이 이루어 지는 것을 확인할 수 있다. 또한 세포-세포 간 접합이 시간이 경과할수록 증가되었으며, 함입된 세포밀도에 따라 세포간 접합이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
도 19에 제시하였듯이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 함입된 PN-NCSCs 밀도에 따라 하이드로젤 내 세포층은 비례하여 증가되었다. PN-NCSCs 다층세포시트는 5 × 105 밀도의 경우 15.3 ± 3.2, 1 × 106 밀도의 다층세포시트는 21.7 세포층 ± 4.2 세포층, 4 × 106 밀도의 다층세포시트는 31.8 세포층 ± 3.7 세포층, 4 × 106 밀도의 다층세포시트는 43.9 세포층 ± 5.1 세포층으로 구성되었다. 즉, 하이드로젤 내 세포밀도 조절을 통하여 다층세포시트 내 세포층을 용이하게 조절할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
3) 세포-매개 하이드로젤 수축을 통한 PN - NCSCs 다층세포시트의 물리적 특성 강화
하이드로젤의 취약한 물리적 특성에 따라 조작하기 어려운 단점이 제시되었다. 본 기술은 세포-매개 하이드로젤 수축을 통하여 하이드로젤 내 콜라겐 섬유를 응축시켜, 하이드로젤 내부에 함유된 수분을 방출시켜 물리적 특성을 강화하는 방법을 제시하고자 한다. 실시예 5에서 기술한 방법으로 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 O-ring과 배양용기에 부착한 상태로 1일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가한 후 하이드로젤 내로 함입된 PN-NCSCs은 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 배양하였다. 배양 3일 후 하이드로젤을 O-ring으로부터 떼어낸 후 부유배양환경에 2시간 동안 배양하였다. 이후 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. Masson trichrome 염색을 통하여 세포의 분포와 콜라겐 섬유질의 변화를 평가하였다.
도 20에서 나타난 바와 같이, 세포-세포 및 세포-콜라겐 섬유와의 결합을 유도할 수 있도록 부착배양환경에서 1일간의 배양한 후 부유배양환경에서 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하였다. 세포-매개 하이드로젤 수축은 하이드로젤 내 수분을 다층세포시트로 방출하고, 하이드로젤 구성 고분자 사슬의 응축을 유도할 수 있었다. 부유배양 전의 PN-NCSCs 다층세포시트 내의 하이드로젤은 유리양 모양으로 수분을 함유하고 있으나, 부유배양환경에서 배양 30분 후 수분의 함량이 감소하고, 하이드로젤 구성 고분자 사슬이 섬유양 모양으로 응축되고, 그 결과 세포 간 간격이 치밀해 치는 것을 확인할 수 있다. 부유배양환경에서 배양 2시간 후 고분자 사슬이 응축되어 섬유양 모양의 고분자 사슬이 두드러지며, 세포간 간격의 감소하고 치밀해 지는 것을 확인할 수 있다. 이상의 결과는 부착배양환경에서 세포간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 사슬과의 결합을 유도한 후 부유배양환경에서 배양을 통하여 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여 PN-NCSCs 다층세포시트의 물리적 특성을 강화할 수 있는 방법을 제시한다.
4) PN - NCSCs 다층세포시트 내 세포외기질 , 신경세포보호/성장인자, 혈관생성인자 , 항염증인자 및 신경활성인자의 축적
본 실시예는 PN-NCSCs 다층세포시트의 생물학적 기능을 강화하기 위하여 다층세포시트 내 PN-NCSCs가 생성하여 분비하는 세포외기질과 신경활성인자의 축적을 이룰 수 있는 기술을 제공한다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. 다층세포시트 내 세포외기질의 축적을 평가하기 위하여 anti-fibronectin, anti-laminin, ant-collagen type IV, anti-fibriongen 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 공초점현미경으로 관찰하였다. Hematoxylin eosin 염색을 시행한 후 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 생존율을 평가하였다.
PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경성장, 신경보호, 혈관생성, 항염증, 신경활성 관련 mRNA 발현을 평가하고자, PN-NCSCs 다층세포시트에서 RNA를 추출한 후 real time-quantitative PCR을 시행하였다. 대조군으로 단층배양 증폭된 PN-NCSCs, BMSC, spinal cord에서부터 분리한 RNA를 사용하였다. 신경성장/보호 mRNA는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF) 계열 mRNA인 FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-20, FGF-23 발현을 평가하였다. 혈관생성 mRNA는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, -2, -4, 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)-C, -D 및 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF)-A, -B, -C 발현을 평가하였다. 항염증인자 mRNA는 인터루킨(interleukin; IL)-6, 10 및 형질전환 성장인자(transforming growth factor-b1; TGFB1) 발현을 평가하였다. 신경세포의 생존과 보호, 신경돌기(neurite)의 성장, 수초(myelin)의 생성을 증가시키는 신경활성인자는 뉴트로핀(neurotrophin) 계열, 아교세포 유래 성장인자(glial-Derived growth factor; GDNF) 계열, 에프린(ephrin; EFN) 계열, 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF) 계열의 mRNA 발현을 평가하였다. 뉴로트로핀(Nurotrophin; NTF) 계열 인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF) 및 neurotrophin(NTF)-3, 4/5 발현을 분석하였다. GDNF 계열 인자는 GDNF 및 artemin(ARTN) 발현을 분석하였다. EFN 계열 인자는 EFNA1, EFNA2, EFNA3, EFNA4, EFNA5, EFNB1, EFNB2, EFNB3 발현을 분석하였다. CNTF 계열 인자는 CNTF, 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF), IL-6 발현을 분석하였다. 계열이 분류되지 않는 신경활성인자인 뉴레귤린(neuregulin; NRG)-1, 2, 3, 4, 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF)-B, G 및 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1 발현을 분석하였다.
도 21에 나타난 바와 같이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs을 함입시킨 후 3일간 부착배양환경에서 배양 후 다층세포시트 내 fibronectin, laminin, collagen type IV와 같은 basal lamina 유형의 세포외기질이 세포 사이로 축적되는 것을 확인할 수 있었으며, fibrin 섬유소도 함께 검출되어, 체외배양을 통하여 PN-NCSCs에서 fibronectin, laminin, collagen type IV이 생성되어 다층세포시트 내 축적시킬 수 있었다.
도 22에 나타난 바와 같이, 콜라겐/피브린 하이드로젤 내 PN-NCSCs을 함입시킨 후 3일간 부착배양환경에서 배양 후 다층세포시트 내 혈관성장인자 mRNA 발현이 BMSC 대비 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 혈관내피세포의 성장, 이동, 분화, 및 혈관생성에 관계되는 ANGP-1, -2 및 4 mRNAs는 BMSC 대비 1.9배, 45배, 31배 높게 발현되었다. PDGF-C 및 D 또한 1.9배 alc 4.8배 높게 발현되었으며, VEGF-A, -B 및 C는 9.5배, 1.8배, 1.3배 증가되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 혈관내피세포의 보호, 성장, 이동, 분화, 혈관생성에 관여하는 혈관생성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 23에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 염증반응을 완화하고 억제하는 항염증 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 대표적 항염증 사이토카인인 IL-6 및 IL-10은 BMSC 대비 4.2배, 30배 높게 발현되었으며, TGF-β1또한 1.3 배 높게 발현되어, PN-NCSCs 다층세포시트는 염증억제 및 완화에 관여하는 항염증인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 24에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포의 증식, 이동, 분화, 보호를 유도하는 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 신경세포 성장, 이동, 보호, 분화에 관계되는 FGF mRNA 아형인 FGF-1, 2, 4, 6, 7, 8, 10~14, 16, 18~20 및 23의 발현이 BMSC와 비교하여 유의하게 증가되어 있어, PN-NCSCs 다층세포시트는 신경세포의 보호 및 성장에 관여하는 인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 25에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경세포의 증식, 이동, 분화, 보호를 유도하고, 신경돌기 및 수초 형성을 증진하는 관련 mRNA가 유의하게 높게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 내 neurotrophin 계열, GDNF 계열, EFN 계열, CNTF 계열, NRG 및 IGF-1 mRNA는 BMSC 대비 1.2배에서 51배 높게 발현되어, N-NCSCs 다층세포시트는 신경활성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
도 26에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 내 신경재생, 신경성장, 신경보호 관련 mRNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. BMSC와 비교하여 BDNA, NT-3 및 NT-4 mRNA는 PN-NCSCs에서만 유의하게 발현되었으며, GDNF mRNA은 BMSC와 비교하여 발현율이 유의하게 높았다. 또한, 부착배양환경에서 배양기간에 따라 BDNF, NT-3, NT-4 mRNA 발현은 증가하였으나, GDNF 및 NGF mRNA은 배양기간과 관계없이 배양 1일째가 높은 발현되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 신경보호, 신경재생, 축삭돌기 생성에 관여하는 신경활성인자를 함유하고 있는 것을 제시한다.
5) PN-NCSCs 다층세포시트 내 세포-세포 간 및 세포-세포외기질 간 접합
본 실시예는 PN-NCSCs 다층세포시트의 구조적 안전성을 강화하기 위하여 다층세포시트 내 PN-NCSCs세포간 접합을 유도하는 기술을 제공한다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 0.5% 콜라겐 용액은 reconstitution buffer (50 mM NaHCO3, 40 mM HEPES, 0.01 N NaOH in DW)와 혼합하여 최종 0.2% 콜라겐 용액을 제조하였다. 인간혈장 유래 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 0.2% 콜라겐 용액에 피브리노겐(0.5%)-콜라겐(0.2%) 혼합 용액을 제조하였고, 트롬빈(Sigma, St.Louis, MI)은 0.2% 콜라겐 용액에 녹여 최종 0.25 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring에서 떼어낸 후 물리적 지지가 배제된 환경(부유배양환경, floating culture condition, non-stressed culture conditions)에서 배양한 군과 O-ring 내로 casting한 후 물리적 지지가 유지된 환경(부착배양환경, attached culture condition, stressed culture condition)에서 3일간 배양하였다. DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 첨가하였고, 배양접시는 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker)에서 3일간 배양하였다. 배양환경에 따른 하이드로젤 내 PN-NCSCs의 특성을 평가하기 위하여 배양 1일, 2일, 3일째 하이드로젤을 수거한 후 1% 중성포르말린에 고정하였고, 파라핀 블록과 절편을 제조하였다. 다층세포시트 내 세포-세포 간 접합과 세포-세포외기질 간 접합을 평가하기 위하여 anti-β-catenin 및 anti-CD29 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였으며, 공초점 현미경으로 관찰하였다.
도 27에서 나타난 바와 같이, 세포-세포 간 접합을 담당하는 β-catenin은 PN-NCSCs 세포막을 따라 발현하였으며, 부착배양환경에서 배양기간이 증가할수록 발현이 증가되었다. 또한 세포-세포외기질 간 접합에 관계하는 CD29 또한 부착배양환경에서 배양기간이 증가할수록 그 발현이 증가되었고, 세포막을 따라 선형으로 발현되었다. 이상의 결과는 부착배양환경에서 체외배양을 통하여 하이드로젤 내 PN-NCSCs와 하이드로젤 고분자 사슬과의 결합과 동시에 PN-NCSCs 세포-세포 간 접합을 유도하여 다층시트의 구조적 안전성을 강화할 수 있었다.
< 실시예 6> PN - NCSCs 다층세포시트로부터 유래한 생리활성인자의 신경보호, 신경증식, 축삭생성, 증진, 항염증 효과
1) PN-NCSCs 다층세포시트부터 분비된 생리활성인자를 함유한 조건배지 제조
PN-NCSCs 다층세포시트에서 분비된 생리활성인자의 신경세포의 보호, 증식, 축삭생성 및 항염증 효과를 평가하였다. 실시예 5에서 기술한 방법에 따라 2 × 106 PN-NCSCs 세포를 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤은 부착배양환경에서 3일간 이후 부유배양환경에서 2시간 배양하여 다층세포시트를 제조하였다. 제조한 PN-NCSCs 다층세포시트는 100-mm 배양용기에 옮긴 후 1% 송아지혈청과 99% DMEM으로 구성된 배양액 5 mL을 첨가한 후 24시간 배양하여 조건배지(conditioned media)를 제조하였다. 배양액은 수거한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후 상층액을 멸균 튜브에 옮긴 후 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지를 실험 전까지 냉동 보관하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 생물학적 능력을 비교하기 위하여 동일한 방법으로 BMSCs 다층세포시트를 제조하였고, 위 기재한 동일한 방법으로 BMSCs 다층세포시트에서 유래한 생리활성인자가 포함한 조건배지를 제조하였다.
2) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 보호능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 활성산소(Radical Oxygen Species, ROS)에 의한 신경세포 보호능력을 평가하였다. 신경모세포암 유래 세포주인 SH-SY5Y 세포 10만개를 24-멀티웰 배양용기에 파종하였다. PN-NCSCs와 BMSC 다층세포시트에서 분비된 생리활성인자가 함유한 배양액을 첨가하였고, ROS 매개 세포손상을 유도하기 위하여 3 mM H2O2를 첨가한 후 6시간 반응시켰다. 6시간 후 PBS로 3회 세척 후 세포 수를 CelLyticTM MT reagent (Sigma-Aldrich) 로 용해하여 세포수를 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent kit (Molecular probes, Eugene, OR)를 사용하여 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 480 nm, 여기(excitation) 520 nm 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도는 세포 수로 전환하기 위해서 송아지 흉선에서 얻은 DNA를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 샘플의 형광강도를 표준곡선을 이용하여 세포 수로 변환하였다. 세포죽음을 평가하기 위해서 SH-SY5Y 세포의 카스파제 3/7 농도를 Apo 3/7 HTSTM assay kit (Cell Technology, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. 과산화수소 (H2O2) 처리 6시간 후, SH-SY5Y 세포를 용해한 샘플 100 μl 를 동량의 2 × caspase 3/7 detection reagent 와 37℃에서 30분간 반응하여 형광 마이크로플레이트 리더기 (fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 488 nm, 여기(excitation) 530 nm의 파장에서 형광강도를 측정하였다. 대조군으로 1% 송아지 혈청과 99% DMEM이 함유한 배양액을 사용하였다.
도 28에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 과산화수소를 처리한 SH-SY5Y 세포에 PN-NCSC 다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 되도록 처리한 후 세포 생존율을 분석하였다. H2O2 처리 후에 SH-SY5Y 생존율은 80% 미만이었으나, PN-NCSCs 및 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지를 첨가 시 신경세포를 보호하는 효과를 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지를 10% 농도로 처리 시 생존율은 84.4% ± 3.2%, 50% 농도로 처리 시 92.4% ± 2.5%, 100% 농도로 처리 시 99.9% ± 7.3%로 PN-NCSC 다층세포시트로부터 유래한 생체활성인자는 농도-의존적으로 ROS-매개 신경세포 보호능력을 확인할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자는 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성 인자보다 신경세포 보호능력은 높았으나 통계적 유의는 없었다.
도 29에 나타난 바와 같이, ROS 처리로 인한 세포손상과 죽음은 caspase 3/7에 의하여 매개된다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 세포보호 능력을 검증하기 위하여 H2O2 처리 후에 SH-SY5Y caspase 3/7 활성도를 분석하였다. H2O2를 처리 후 SH-SY5Y 세포 내 caspase 3/7 활성도는 유의하게 증가하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지를 처리 시 SH-SY5Y내 caspase 3/7 활성도는 농도-의존적으로 유의하게 감소하였다 (*, P < 0.05). 또한 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지 역시 PN-NCSCs 다층세포시트와 동일하게 ROS 매개 caspase 3/7 활성도를 감소시켰으나, 그 감소 정도는 PN-NCSCs 다층세포시트보다 낮았다. 그러나 PN-NCSCs 다층세포시트 내 생리활성인자와 비교하여 caspase 3/7 활성 억제능력의 통계적 유의성은 없었다.
3) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 성장유도 능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 성장유도 능력을 평가하기 위해, 96-멀티웰 세포배양용기에 2만개의 SH-SY5Y 세포를 파종하였고, PN-NCSCs 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 첨가한 후 3일간 배양하였다. 배양 3일 후 세포 수를 측정하기 위하여 CelLyticTM MT reagent (Sigma-Aldrich)로 세포를 용해한 후 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA reagent kit (Molecular probes, Eugene, OR)를 사용하여 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)로 발광(emission) 480 nm, 여기(excitation) 520 nm의 파장에서 형광강도를 측정한 후 세포수를 산정하였다. 또한 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경세포 성장유도 능력을 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU; Sigma-Aldrich) uptake rate로 평가하였다. 배양액 내 10 μM 농도의 BrdU를 매일 배양액 내로 첨가한 후 3일간 배양하였으며, 배양 3일 후 세포는 2% 완충 포르말린 용액으로 고정한 다음 PBS로 3번 세척하였다. 항체의 비특이적 반응을 억제하기 위해서 5% bovine serum albumin으로 30분간 처리한 후 anti-BrdU 일차 항체를 사용하여 상온에서 2시간 반응 하였다. PBS로 3회 세척 후 Dylight 488-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응시키고 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색하였다. 이후 ProLongGold antifade reagent (Molecular Probe)로 봉입하여 공초점 현미경으로 BrdU의 발현여부를 평가하였다. 1000개 이상의 세포를 분석하여 핵에서 발현되는 BrdU uptake를 평가하였다.
도 30에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액 50%로 SH-SY5Y를 처리 시 DNA 함량은 126.2 ng/ml ± 1.9 ng/ml (*, P < 0.01), 100%로 처리 시 126.8 ng/ml ± 8.6 ng/ml로, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유하지 않은 배양액 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액을 처리한 군과 비교하여 유의하게 DNA양이 증가하였다. 그러나 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 배양액 10%로 SH-SY5Y를 처리 시 DNA 함량의 증가는 미미하였다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트에서 유래한 생리활성인자가 신경세포의 성장을 촉진하는 능력을 확인할 수 있었다.
도 31에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지로 처리 시 SH-SY5Y 세포의 BrdU uptake rate는 생리활성인자를 포함하지 않은 군(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자 함유 조건배지로 처리한 군과 비교하여 유의하게 증가하였다.
도 32에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 농도가 증가함에 따라서 SH-SY5Y 세포의 BrdU uptake rate가 유의하게 농도-의존적으로 증가하였다(*,P < 0.05). PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유한 조건배지 농도가 50%일 경우 BrdU uptake rate가 72.3% ± 6.1% (*, P < 0.05), 100%일 경우 69.7% ± 5.1% (*, P < 0.05)로 생리활성인자가 함유하지 않은 배양액으로 처리한 세포보다 유의하게 증가되었다. 또한 BMSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자 함유한 조건배지로 배양한 세포보다 BrdU uptake rate가 유의하게 높아, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 신경세포의 성장을 증진시키는 특성을 보유한 것을 확인할 수 있었다.
4) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지의 신경세포 축삭성장 과 시냅스 유도능력
PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 신경 축삭 형성에 대한 효과를 평가하기 위해서 cm2당 3천개의 밀도로 SH-SY5Y 세포주를 12-멀티웰 세포배양용기에 파종하여 PN-NCSCs 혹은 BMSC다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 처리하여 7일간 배양하였다. 신경성장인자인 NGF (nerve growth factor)를 50 ng/ml 농도로 처리한 군과 1% 송아지혈청과 99% DMEM 배양액으로 처리한 군을 대조군으로 비교하였다. 배양 7일 후 세포는 2% 완충 포르말린액으로 10분간 고정한 뒤 PBS 로 3번 세척하였다. 세포막을 투과시키는 0.1% Triton X-100 용액이 포함된 PBS 로 5분간 처리한 다음, 1 μg/ml 농도의 Oregon Green® 514-conjugated phalloidin (Molecular Probes)를 처리하여 세포질 내 actin filament를 염색하였다. 100개의 세포를 무작위로 선택하여 공초점 형광현미경으로 이미지화하여 축삭의 길이와 축삭 내 branching 수를 Image J 프로그램을 이용하여 평가하였다.
도 33에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지는 SH-SY5Y 세포의 축삭형성을 현저히 증가시켰다. 그러나 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지, 대조군인 1% 송아지혈청 혹은 NGF로 처리한 SH-SY5Y 세포의 축삭의 형성은 미미하였다.
도 34에서 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 경우 SY-SH5Y 세포의 축삭형성은 농도에 의존적으로 증가하였다. 100% PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 경우 SH-SY5Y 축삭의 길이는 1% 송아지혈청(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지와 비교하여 유의하게 증가하였다(*, P < 0.01).
도 35에 나타난 바와 같이, 신경세포의 축삭의 branching 수를 동시에 분석하였다. 대조군인 1% 송아지혈청(vehicle)과 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 SH-SY5Y 세포의 축삭 branching 수와 비교하여 NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지로 처리한 세포에서 유의하게 증가하였으며(*, P < 0.05, **, P < 0.01), 조건배지 농도 의존적으로 branching 수가 증가되었다. 이상의 결과는 NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자는 신경세포의 보호, 성장, 축삭형성에 유의하게 증가시키는 신경활성 능력을 보유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
5) PN - NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자가 함유된 조건배지의 항염증 능력
PN-NCSCs다층세포시트 유래 생리활성인자의 염증억제 능력을 평가하기 위해서, rat의 복강에서 얻은 peritoneal monocytes를 사용하였다. Sprague Dawley rat 의 복강에 0.9% 생리식염수(NaCl saline) 30 ml 주입한 후 다시 흡입하여, 원심분리를 통하여 monocyte를 분리하였다. 96-멀티웰 세포배양용기에 4 × 105 개의 monocyte를 파종하고, 1 μM 농도의 lipopolysaccharide (LPS; Sigma-Aldrich)를 24시간 처리하였다. LPS 처리시 PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지를 10%, 50%, 100% 농도로 동시에 첨가하여 1일간 배양하고, monocyte 에서 분비되는 염증성 사이토카인인 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) 및 IL-1β (interleukin-1β) 양을 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)을 사용하였으며, 염증성 사이토카인 함량은 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SpectraMax M2, Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
도 36 및 도 37에 나타난 바와 같이, NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자의 유의한 항염증효과를 검증할 수 있었다. LPS 처리를 통하여 monocyte의 활성화를 유도한 후 NCSC 다층세포시트 유래 조건배지를 처리하였고, monocyte에서 분비되는 TNF-α 함량은 1% 송아지혈청(vehicle)으로 처리시 2.1 ng/ml ± 0.2 ng/ml 였으나, NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지 10%, 50%, 100% 처리시 TNF-α 함량은 각각 1.6 ng/ml ± 0.2 ng/ml, 1.0 ng/ml ± 0.0 ng/m, 0.7 ng/ml ± 0.1 ng/ml으로 조건배지 농도가 증가함에 따라서 monocyte의 TNF-α 분비를 유의하게 억제시키는 것을 확인할 수 있었다(*, P < 0.05). 동시에 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지는 monocyte의 IL-1β 분비를 유의하게 농도 의존적으로 억제하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 유래 생리활성인자를 함유한 조건배지 10%, 50%, 100% 농도로 처리시 monocyte의 IL-1β 분비함량은 각각 0.9 ng/ml ± 0.1 ng/ml, 0.7 ng/ml ± 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml ± 0.1 ng/ml로 조건배지를 처리하지 않은 경우 IL-1β 분비함량인 1.1 ng/ml ± 0.2 ng/ml 보다 유의하게 낮았다. 또한 PN-NCSCs 다층세포시트 유래 조건배지는 BMSCs 다층세포시트 유래 조건배지보다 monocyte의 TNF-α 및 IL-1β 분비를 유의하게 감소시켰다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트에서 분비되는 생리활성인자는 염증반응을 억제하는 능력을 확인할 수 있었다.
< 실시예 7> 손상된 척수로의 PN - NCSCs 다층세포시트의 경막 외 이식 및 척수재생/보호 능력
1) 척수손상 동물모델
척수손상 동물모델은 인제대학교의 동물실험운영위원회의 승인을 얻은 후 일반사육 조건에서 유지되는 240-260 g의 Sprague Dawley rat을 사용하였다. 척수 손상은 8번에서 10번 흉추(thoracic spine)의 극돌기(spinous process)를 제거한 다음 9번 흉추 극돌기 위치에서 경막 (dura mater)의 손상 없이 동맥류 클립(S&T Vascular Clamps; Fine Science Tools, British Columbia, 캐나다)을 사용하여 1분간 10 g/mm2 강도의 힘으로 척수(spinal cord) 손상을 주었다. PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSCs 다층세포시트를 손상된 척수의 경막 위로 이식하였다. 척수손상 후 지혈을 위해서 젤라틴 스폰지(Spongostan®, Johnson & Johnson Medical, Skipton, UK)를 덮은 다음 절개부위를 봉합하였다. 수술 후 항생제로 50 μg 겐타마이신(유한, 서울, 대한민국)을 3일간 근육 내(intra muscular)로 주사하였고, 진통제로 2 mg buprenorphine hydrochloride (Reckitt and Colman, Richmond, VA)을 2일간 피하(subcutaneous)로 주사하였다. 하루에 2번 방광을 눌러 인위적으로 배뇨를 실시하였다.
2) 척수 내 PN-NCSCs 다층세포시트의 생착
실시예 5에 기술된 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 생체 내 이식한 PN-NCSCs을 추적하기 위하여 PN-NCSCs를 1 μM CM-DiI (Molecular Probe)로 표지하였다. CM-DiI로 라벨링된 2 × 106 혹은 2 × 107 PN-NCSCs은 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃ 에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring 물리적 지지 하에 부착배양환경에서 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓고 3일간 배양하였다. 배양액의 조성은 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 사용하였다. 이후 O-ring에서 떼어낸 후 부유배양환경에서 2시간 동안 배양 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 이후 손상된 척수부위로 이식한 후 이식 3일째 IVIS Lumina XR In Vivo Imaging System (Perkin Elmer, 서울, 대한민국)을 이용하여 영상을 획득하였다. 영상을 획득한 후 이식된 척수 및 다층세포시트를 회수하여 2% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록 및 절편을 취득하였다. 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트 내 혈관생성을 평가하기 위하여 anti-α-smooth muscle actin (SMA) 항체를 이용하여 면역형광염색을 시행하였고, isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응하였고, 10 μg/ml DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen) 용액으로 핵을 염색하였다. 이후 ProLong Gold antifade reagent (Molecular Probe)로 봉입하여 공초점 레이저주사현미경으로 발현여부를 평가하였다.
도 38에 나타난 바와 같이, In Vivo Imaging System을 이용하여 획득한 손상척수 및 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트 영상이다. PN-NCSCs 다층세포시트는 손상척수 부위에 안정적으로 부착되어 있었으며, 이식된 PN-NCSCs에서 유래한 형광강도는 세포 수와 비례하여 증가되었다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트를 통하여 국소적으로 손상된 척수의 경막 위로 안정적으로 이식할 수 있음을 확인하였다.
도 39에 나타난 바와 같이, 이식 3일 후에 PN-NCSCs 다층세포시트는 손상된 척수 경막 위로 안정적으로 융합되어 있었다. 손상된 척수는 손상부위에 잘 부착되어 있었다. 경막 위로 이식한 다층세포시트 내 CM-DiI로 라벨링된 PN-NCSCs는 50% 이상으로 구성되어 있었다. CM-DiI 양성 세포는 세포질과 핵 구조가 잘 유지되어 있어 생존하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 다층세포시트 내로 혈액세포를 함유한 미세혈관이 형성되는 것을 확인되었다. SMA를 이용하여 혈관구조를 표지하였으며, PN-NCSCs 다층세포시트 내로 미세혈관이 생성되는 것을 확인함에 따라 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 생착된 것을 검증할 수 있었다. PN-NCSCs 다층세포시트 내 형성된 미세혈관은 SMA에 양성이었지만, CM-DiI은 발현되지 않아 다층세포시트 내 미세혈관은 recipient에서 기원한 것을 반영하는 소견이다. 이는 이식한 세포의 혈관으로의 직접적인 분화가 아닌 다층세포시트로부터 분비된 생리활성인자에 의해서 주위 조직으로부터 이동, 성장해온 혈관임을 알 수 있다. 또한 이는 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트는 이식부위와 혈관순환이 이루어져 손상된 척수부위에 생착되었음을 알 수 있다. 또한 이식된 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수 경막 위에서만 관찰되었고, 손상된 척수 부위 내로 이주되는 것은 발견할 수 없었다.
3) 척수 내 PN-NCSCs 다층세포시트의 장기 생존율
척수 내 PN-NCSCs 다층세포시트로 이식한 PN-NCSCs 의 장기간 생존율을 평가하기 위하여 green fluorescent protein (GFP) 유전자를 함유한 lentivirus로 PN-NCSCs을 감염시켰고, GFP 유전자를 함유한 PN-NCSCs을 이용하여 실시예 5에 기술된 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. GFP 유전자를 함유한 2 × 106 PN-NCSCs은 50 μl 트롬빈/콜라겐 용액과 혼합하여 분산시킨 후 동량의 콜라겐/피브리노젠 용액과 혼합한 후 배양용기에 부착된 10-mm 직경의 O-ring 내로 전달한 후 sol에서 gel이 형성되도록 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 하이드로젤이 형성된 후 PN-NCSCs가 함입된 콜라겐/피브린 혼합 하이드로젤을 O-ring 물리적 지지 하에 부착배양환경에서 15 rpm 속도의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 위에 놓고 3일간 배양하였다. 배양액의 조성은 DMEM에 1% 송아지 혈청(calf serum, CS), 100 μg/ml 트란제믹산(tranexamic acid), 10 μg/ml 젠타마이신을 함유한 배양액을 사용하였다. 이후 O-ring에서 떼어낸 후 부유배양환경에서 2시간 동안 배양 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조하였다. 이후 손상된 척수부위로 이식한 후 이식 3일, 7일, 14일, 28일째 손상된 척수 부를 채취하여 2% 중성 포르말린에 고정하고, 파라핀 블록 및 절편을 취득하였다. 파라핀 절편은 anti-GFP 항체를 이용하여 면역화학염색을 시행하였고, isotype matched HRP-conjugated 이차항체를 상온에서 30분간 반응한 후 diaminobenzidine을 이용하여 발색하였다. 이후 hematoxylin으로 핵을 염색하였다. 또한 이식된 PN-NCSCs의 생체 내 분화특성을 평가하기 위하여 이중 면역형광염색을 시행하였다.
도 40에 나타난 바와 같이, 손상된 척수의 경막 위로 이식한 PN-NCSCs 다층세포시트가 잔존하는 것을 확인할 수 있었다. 이식 3일째 경막 위로 GFP 양성 세포의 밀도가 가장 높았으나, 시간이 경과할수록 GFP 양성 세포 수는 유의하게 감소되었다. 척수 내로 이동한 GFP 양성 세포는 관찰할 수 없었다. GFP 양성 세포의 밀도는 이식 3일째 128.4 /mm2 ± 21.5 /mm2이었으나, 이식 7일째 98.1 /mm2 ± 12.1 /mm2, 이식 14일째 56.2 /mm2 ± 9.8 /mm2, 이식 28일째 11.5 /mm2 ± 3.6 /mm2이었다. 경막 위의 GFP 양성 세포는 세포의 구조가 온전히 유지되어 생존하고 있는 것을 확인할 수 있었고, 방추상 모양으로 세포질의 경계는 명확하지 않은 섬유아세포와 유사한 형태학적 특성을 보였다.
도 41에 나타난 바와 같이 경막 위로 이식된 PN-NCSCs은 섬유아세포 및 혈관내피세포로 분화하는 특성을 나타내었다. 신경세포 표지자(Tuj1), 성상세포 표지자(GFAP), 핍지세포 표지자(A2B5 및 MBP), 슈반세포 표지자(MPZ)를 동시에 발현되는 GFP 양성 PN-NCSCs은 발견되지 않았다. 반면 GFP 양성 PN-NCSCs은 미세혈관 구조의 내강을 덮고 있으며 동시에 혈관내피세포 표지자인 CD34가 양성으로 혈관내피세포로 분화하여 미세혈관을 직접 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 동시에 대부분의 GFP 양성 세포는 SMA가 양성으로 신경 내 섬유아세포 혹은 창상수복 과정 중 나타나는 근섬유모세포(myofibroblast)와 유사한 면역표현 특성을 보였다.
<실시예 8> PN-NCSCs 다층세포시트의 척수기능 복구
1) 척수손상 동물의 운동능력 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 이식 후 84일 동안 척수손상 동물의 운동능력은 100 cm × 100 cm 박스에 동물을 위치한 후 Basso, Beattie 및 Bresnahan (BBB) 평가체제에 의거하여 평가하였다. 동물 별 운동능력은 비디오로 녹화하여 뒷다리의 운동을 최저 0점에서 최대 21점까지 관절의 움직임, 관절의 조화, 체중의 지지 정도에 따라 2명의 다른 연구자가 평가하였다. BMSCs 다층세포시트로 치료받은 동물군과 아무런 치료를 행하지 않은 동물군을 대조군으로 이용하였다.
도 42에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트 혹은 BMSC 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 운동기능 회복이 이식 7일째부터 유의하게 회복되었다. 이식 14일째 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 동물 혹은 아무런 치료를 받지 않은 동물과 비교하여 유의하게 운동기능의 회복이 관찰되었다. 이식 14일째 하지 관절 모두 움직임을 나타내었고, 이식 36일째 평균 14.7 점 ± 1.1 점수로 무게를 지탱할 수 있게 되었다. 이후 이식 63일째까지 PN-NCSCs로 치료받은 척수손상 동물에서 지속적인 운동기능 회복이 관찰되었으나, 그 이후 유의한 운동기능 회복은 관찰되지 않았다.
2) 척수손상 동물의 물리적 감각능력 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 동물의 감각능력 평가를 위해서, 척수손상 동물은 20 cm x 20 cm아크릴 벽과 바닥은 철망으로 제조된 박스 내로 옮겼다. 박스 내에서 동물은 15분간 적응시킨 다음 Dynamic Plantar Aesthesiometer (Ugo Basile, Comerio, Italy)을 사용하여 발바닥 표면에 물리적 자극을 주었다. 철망 사이를 통과하여 가는 필라멘트로 초당 2.5 g의 힘으로 최대 50 g의 무게를 밀어 올려 발을 떼는 순간을 무게를 측정하였다. 각 다리는 두 번씩 측정하여 높은 점수를 적용하고 네 번 반복하여 평균을 구하였다. 모든 측정은 수술 후 0일에서 매주 실시하여 반응 정도를 측정하여 물리적 이질통(allodynia) 유무를 확인하였다.
도 43에 나타난 바와 같이, 이식 5주 이후부터 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수신경 손상 백서의 감각능력은 다층세포시트를 이식하지 않은 척수손상 동물과 BMSCs 다층세포시트를 이식한 동물과 비교하여 유의하게 향상되었다(*, P < 0.05). 이식 4주까지 PN-NCSCs 혹은 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 이질통(allodynia)이 발생하였으며 필라멘트에 대한 과도한 반응을 보였다. 그러나 이식 5주 이후부터 필라멘트에 대한 과민한 감각반응과 이질통이 유의하게 완화되었으나, 다층세포시트를 이식하지 않은 동물에서 백서의 감각능력은 급격하게 감소하였으며 심각한 이질통을 나타내었다. 이러한 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트를 척수 손상모델에 이식하였을 때 감각능력이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
3) 척수손상 동물의 전기생리 기능 회복
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 동물의 신경생리 기능은 머리 부위의 피하층과 경골신경에 probe를 위치시킨 후 운동신경전도 및 감각신경전도를 평가하였다.
도 44에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 운동신경전도 기능의 유의한 회복을 관찰할 수 있었다. 척수손상 2주 후 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 동물에서 운동전기 신호는 75.8% 검출되었으나, 아무런 치료를 받지 않은 동물에서는 32.4%만 운동전기 신호가 검출되었다. 그러나 손상 4주 후 대조군과 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 군에 있어 운동전기 신호는 75%로 유의한 차이는 없었다. 또한 손상 2주째 PN-NSCS 다층세포시트로 치료받은 동물에서 유의하게 빠른 운동전기 신호 속도(latency)가 관찰되었으며, 손상 4주째 PN-NCSCs 다층세포시트 치료 동물에 있어 전기신호의 증폭(amplitude)가 유의하게 높았다. 그러나 대조군 혹은 PN-NCSCs 다층세포시트 치료동물 모두에서 감각신경 전기신호는 검출되지 않았다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수손상에 있어 운동기능, 감각기능, 그리고 전기생리 기능의 유의한 회복을 유도하는 치료효과를 확인할 수 있었다.
<실시예 9> PN-NCSCs 다층세포시트의 척수기능 복구
실시예 7와 동일한 방법으로 척수손상 모델을 제조하였으며, 실시예 5와 같이 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. 척수손상 동물에 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 후 2주 및 4주째 척수를 채취한 후 형태학적 방법으로 척수 손상과 재생 정도를 평가하였다.
1) PN-NCSCs 다층세포시트의 척수손상 보호작용
척수 손상 2주 및 4주째 척수를 손상부를 중심으로 꼬리쪽 4 mm와 머리쪽 4 mm를 포함한 척수를 채취하여 2% 중성포르말린에 6시간 고정한 후 종측 방향으로 파라핀 블록과 파라핀 절편을 취득하였다. 연속적 파라핀 절편을 이용하여 hematoxylin and eosin (H&E) 및 Luxol fast blue (LFB) 염색을 실시하였다. Luxon fast blue (LFB) 염색은 1 % 농도의 luxol fast blue (Solvent Blue 38; Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 56℃ 에서 2시간 반응하였다. 염료의 과염색을 제거하기 위해서 95% ethyl alcohol로 세척한 후 회질과 백질의 색상 대비를 증가시기키 위해서 0.05% lithium carbonate solution을 사용하여 30초간 반응 하였다. 70% ethyl alcohol로 30초간 상온에서 세척한 다음 crystal violet으로 핵을 염색하였다. 모든 염색을 종료한 후 슬라이드는 Malinol (Muto Chemical, Tokyo, Japan)을 사용하여 커버글라스를 봉입하고, 염색된 슬라이드는 NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 사용하여 영상을 이미지화하였다. 형태계측학적 측정은 Image J software (NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 손상된 척수 내 손상 정도를 분석하였다. 공동(cavity) 병변은 hematoxylin eosin 염색 슬라이드를 이용하여 면적을 산정하였고, 탈수초(demyelination) 병변은 LFB 염색을 이용하여 면적을 측정하였으며, 손상중심부에서 꼬리 방향으로 4 cm 그리고 머리부위로 2 cm에 해당하는 척수 전체 면적 당 낭 병변 및 탈수초 병변을 백분율로 표기하였다.
도 45에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트를 척수신경 손상 모델에 이식 후 2주째 손상 동물의 척수손상 부위의 구조형태학적 회복을 나타내었다. 아무런 치료를 받지 않은 척수손상 동물인 경우 척수 내 공동 크기는 77.9% ± 6.8%이었으나, PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 동물에서 손상 후 척수 내 공동 크기는 55.9% ± 4.3%로 유의하게 감소하였다. 또한 탈수초 병변은 대조군의 경우 73.0% ± 9.1%였으나, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 동물은 58.1% ± 5.5%으로 유의하게 감소하였다.
도 46에 표시한 바와 같이, 척수손상 4주 후 PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에 있어 대조군과 비교하여 척수손상 정도는 유의하게 감소되었다. 척수손상 2주째와 비교하여 4주째 공동의 크기는 감소하였으며 아교반흔으로 대체되었다. PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 척수의 공동크기는 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었다. 탈수초 병변도 2주째와 비교하여 감소하였으며, PN-NCSCs 다층세포시트로 치료받은 군에 있어 수초재생이 유의하게 증가되었다.
2) PN-NCSCs 다층세포시트의 손상된 척수 내 축삭재생 작용
척수 손상 2주 후 Bodian's silver 염색 후 축삭돌기 섬유의 수를 손상부위에서 확인하였다. Bodian's silver 염색은 파라핀 절편을 Protargol-S solution (Polysciences Inc., Warrington, PA) 을 사용하여 37℃에서 16시간 반응한 다음 증류수로 세척하였다. 0.1 % 농도의 hydroquinone (Sigma-Aldrich)과 0.05 % 농도의 sodium sulfite (Sigma-Aldrich)가 포함된 reducing solution 을 사용하여 5분간 반응한 후 차례대로 0.5 % 농도의 gold chloride (Sigma-Aldrich)를 5 분, 0.5% 농도의 oxalic acid (Sigma-Aldrich)를 10분간 반응하였다. 그런 다음 0.05% 농도의 sodium thiosulfate (Sigma-Aldrich)가 포함된 5% 농도의 hypo solution으로 3분간 반응 후 봉입하여 NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 이용하여 이미지화하였다. 획득한 영상은 척수 회질의 앞뿔(ventral horn), 뒷뿔(dorsal horn), 가쪽회질(lateral gray matter) 영역을 선정하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 표기하였다.
도 47에 나타난 바와 같이, 척수손상 2주째 척수 내 축삭을 Bodian's silver로 염색하였고, 형태계측 방법을 축삭 밀도를 평가한 결과이다. PN-NCSCs 다층세포시트를 이식한 척수손상 동물에서 손상된 척수 내 축삭의 재생성이 회질의 앞뿔, 뒷뿔, 그리고 가쪽회질 모두에서 대조군과 비교하여 유의하게 증가되었다. 특히 PN-NCSCs 다층세포시트를 치료받은 척수는 손상 중심부에 있어 축삭의 재생성이 관찰되었으나, 대조군의 경우 축삭의 재형성을 관찰하기 어려웠다.
3) PN-NCSCs 다층세포시트의 손상된 척수 내 신경회로 복구
축삭 재생 정도를 선행 신경추적(anterograde neural tracing)을 통하여 신경회로 복구 정도를 평가하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 이식 2주 후 대뇌의 운동신경 피질에 10% biotinylated dextran amine (BDA, 10,000 M.W., Molecular Probe) 10 μl를 주사하였다. BDA 주사 2주 후 손상된 척수를 채취하여 4% 중성포르말린에 6시간 고정한 후 파라핀 블록과 절편을 제작하였다. 파라핀 절편은 HRP가 중합된 streptavidin (innogenex)와 반응시킨 후 DAB로 발색하였다. NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Tokyo, Japan)을 이용하여 영상을 수득하였고, 획득한 영상은 척수 회질의 앞뿔(ventral horn), 뒷뿔(dorsal horn), 가쪽회질(lateral gray matter) 영역을 선정하여 손상부위에서 축삭이 차지하는 밀도를 백분율로 표기하였다.
도 48 및 도 49에 나타난 바와 같이, 척수손상 4주 후 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 동물에서 운동감각 피질에 주입한 BDA를 함유한 축삭이 유의하게 증가되었다. 척수손상 중심부의 BDA 양성 축삭의 밀도는 감소 되어 있었으며, PN-NCSCs 다층세포시트 이식여부에 따른 유의한 차이는 없었다. 그러나 척수손상 중심부에서 머리 쪽 그리고 꼬리 쪽 경계부의 척수 내로는 BDA 양성 축삭 밀도는 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식 받은 동물에 있어 유의하게 증가되었다. 이상의 결과는 척수손상 시 PN-NCSCs 다층세포시트는 척수손상으로 인한 공동형성과 탈수초를 완화시키며, 동시에 축삭의 형성을 촉진시켜 척수구조의 보존과 회복을 증진시키는 작용기전을 확인할 수 있었다.
<실시예 10> PN-NCSCs 다층세포시트의 항염증 및 신경활성 능력
PN-NCSCs 다층세포시트의 생체 내 염증 억제효과를 평가하기 위해서, 실시예 7과 같이 척추손상을 유도한 후 실시예 5와 동일한 방법으로 PN-NCSCs 다층세포시트를 제조한 후 손상된 척수 경막 위로 이식하였다. PN-NCSCs 다층세포시트 이식 3일 후 손상된 척수 중심부를 포함하여 머리 그리고 꼬리 쪽 1 cm 길이의 척수를 채취하였다. 채취한 척수는 0.1 M phenylmethylsulfonyl fluoride (Sigma-Aldrich)와 protease inhibitor cocktail (Sigma-Aldrich)을 첨가한 CelLyticTM MT reagent로 척수를 용해시켰다. 이후 4℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액 내 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β 함량을 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 분석하였다. 손상 척수 내 신경활성 유전자인 BDNF, GDNF, NGF, NT-3, NT-4 mRNA 발현은 실시간 중합효소반응(real time polymerase chain reaction) 방법으로 평가하였다. 척수손상 중심부를 포함한 머리 및 꼬리 쪽 1 cm 길이의 척수를 채취한 후 가위로 잘게 잘랐다. 이후 TRIzol에 넣은 후 조직분해를 시킨 후 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA는 역전사효소를 이용하여 보합 DNA를 제조한 후 PCR 반응을 하였다.
도 50에 나타난 바와 같이, PN-NCSCs 다층세포시트를 이식 받은 척수 내 염증성 사이토카인의 분비가 유의하게 낮게 측정되었다. 척수손상 3일 후에 척수는 염증반응에 관여하는 TNF-α 및 IL-1β의 분비가 증가되었으며, 대조군과 비교하여 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 동물에서 TNF-α (55.9 pg/ml ± 4.6 pg/ml, *, P < 0.05) 및 IL-1β (261.8 pg/ml ± 4.5 pg/ml, *, P < 0.05) 함량이 유의하게 감소하였다. PN-NCSC 다층세포시트와 동일하게 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 척수손상 동물에서 TNF-α 및 IL-1β의 분비가 대조군과 비교하여 유의하게 감소되어 있었으며, 다층세포시트 구성 세포원에 따라 유의한 차이는 발견할 수 없었다.
도 51에 나타난 바와 같이, 손상 받기 전 척수와 비교하여 손상 후 척수 내 신경활성 mRNA 발현은 증가하였다. 특히 PN-NCSCs 다층세포시트를 이식받은 손상척수 내 GDNF, NT-3 및 NT-4 mRNA는 대조군과 BMSCs 다층세포시트로 치료받은 군과 비교하여 유의하게 중가 하였다. 이상의 결과는 PN-NCSCs 다층세포시트는 손상된 척수 내로 항염증인자 및 신경활성인자를 분비하여 손상된 척수를 보호하고 신경재생을 증진시키는 약리작용을 지닌 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (28)

  1. (1) 신경능선줄기세포(neural crest stem cells, NCSCs)를 분리하여 배양하는 단계;
    (2) 상기 배양된 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내로 함입시키는 단계;
    (3) 상기 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건에서 배양하는 단계; 및
    (4) 상기 (3) 단계에서 배양된 하이드로젤을 물리적 지지가 배제된 부유배양조건에서 배양하는 단계를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포는 말초신경(peripheral nerve, PN)으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계는 배양된 신경능선줄기세포를 용액 상태의 하이드로젤에 혼합한 후, 젤 상태로 전환시켜 신경능선줄기세포를 하이드로젤 내에 3차원적으로 균일하게 분포시키는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤은 최종 농도 0.1% 내지 1%의 콜라겐 및 최종 농도 0.1% 내지 1%의 피브리노겐을 함유하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 트롬빈 및 콜라겐 혼합용액에 첨가된 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 배양된 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 물리적 지지가 유지되는 부착배양조건은 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤을 원형, 직사각형, 혹은 정사각형 형태의 몰드 내로 캐스팅(casting)하여 물리적으로 지지되는 조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건은 세포-세포 간 접합과 세포-하이드로젤 고분자 간 접합을 유도하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 부착배양조건에서의 배양은 신경능선줄기세포에서 생성되어 분비되는 세포외기질 (extracellular matrix, ECM), 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 하이드로젤 내로 축적하는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 세포외기질은 피브로넥틴(fibronectin), 라미닌(laminin) 및 콜라겐 타입 IV(collagen type IV)로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혈관성장인자는 안지오포이에틴(angiopoietin; ANGPT)-1, 안지오포이에틴-2, 안지오포이에틴-3 및 안지오포이에틴-4로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 안지오포이에틴 계열, 혈관내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 또는 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 항염증인자는 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10 또는 형질전환 성장인자(transforming growth factor-β; TGF-β)인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 신경활성인자는 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 뇌-유래 성장인자(brain-derived growth factor; BDNF), 뉴트로핀-3(neurotrophin-3; NT-3) 및 NT-4/5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 뉴트로핀 계열; 신경교세포주-유래 신경영양인자(glial cell line-derived neurotrophic factor; GDNF) 또는 아테민(artemin; ARTN)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 GDNF 계열; 에프린(ephrin; EFN) A1, 에프린 A2, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2 및 에프린 B3로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 에프린 계열; 섬모 신경 영양 인자(ciliary neurotrophic factor; CNTF), 백혈병 억제 인자(leukemia inhibitory factor; LIF) 및 IL-6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 CNTF 계열; 아교세포 성숙인자(glial maturation factor; GMF); 뉴레귤린(neuregulin; NRG) 또는 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor; IGF)-1인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 신경보호/성장인자는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF)-7, FGF-9, FGF-16, FGF-19, FGF-12, FGF-5, FGF-6 및 FGF-14로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 FGF 계열인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 (4) 단계의 부유배양조건은 세포-매개 하이드로젤 수축을 유도하여, 하이드로젤 내 수분을 방출시키는 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트 제조방법.
  18. 신경능선줄기세포가 함입된 하이드로젤, 상기 신경능선줄기세포에서 분비되어 축적된 세포외기질, 혈관성장인자, 항염증인자, 신경보호/성장인자 및 신경활성인자를 포함하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 하이드로젤은 콜라겐 및 피브리노겐 혼합 하이드로젤인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  20. 제18항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포는 1 × 106/ml 내지 1 × 108/ml의 밀도인 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 신경능선줄기세포의 다층세포시트는 10층 내지 50층으로 이루어진 것을 특징으로 하는 신경능선줄기세포의 다층세포시트.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 척수 손상 치료용 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 축색(axon) 및 수초(myelin) 생성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 치료용 조성물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 염증반응을 억제시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 치료용 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 손상된 신경 내 혈관생성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 척수 손상 치료용 조성물.
  26. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 뇌 손상 치료용 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 상기 조성물은 신경세포 손상을 억제하고, 신경세포 성장 및 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 뇌 손상 치료용 조성물.
  28. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 신경능선줄기세포의 다층세포시트 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 말초신경 손상 치료용 조성물.
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